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WO2024190866A1 - 処理方法及びキット - Google Patents

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Publication number
WO2024190866A1
WO2024190866A1 PCT/JP2024/009991 JP2024009991W WO2024190866A1 WO 2024190866 A1 WO2024190866 A1 WO 2024190866A1 JP 2024009991 W JP2024009991 W JP 2024009991W WO 2024190866 A1 WO2024190866 A1 WO 2024190866A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
liquid
holding tank
lectin
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/009991
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一史 青木
栄一郎 砂村
志乃 松廣
理子 妹尾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sekisui Medical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sekisui Medical Co Ltd filed Critical Sekisui Medical Co Ltd
Priority to JP2025506929A priority Critical patent/JPWO2024190866A1/ja
Publication of WO2024190866A1 publication Critical patent/WO2024190866A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase

Definitions

  • the present invention relates to a processing method and a kit for measurements using lectins.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2023-040387, filed on March 15, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Non-Patent Documents 1-2 Measuring anti-galactose-deficient IgG antibodies (CARF) in serum is useful for assisting in the diagnosis of rheumatoid arthritis and evaluating the state of the disease.
  • CARF anti-galactose-deficient IgG antibodies
  • the following method is known as an example of a method for measuring CARF.
  • a reagent in which galactose-deficient IgG is immobilized on insoluble beads is prepared and mixed with a sample, the CARF in the sample is captured by the beads via the galactose-deficient IgG ( Figure 2 (a)).
  • CARF has a sugar chain containing galactose.
  • a labeled galactose-binding lectin is added to this, the labeled lectin is captured by the beads via CARF and the galactose-deficient IgG ( Figure 2 (b)).
  • the CARF contained in the sample can be quantified by detecting the signal emitted by this labeled lectin.
  • "Picolumi CA/RF” manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd. is known as a certified in vitro diagnostic drug based on this measurement principle.
  • “Picolumi” is a registered trademark.
  • the lectin-binding substances in the specimen include not only the CARF to be measured, but also contaminants.
  • contaminants should not bind to a reagent in which galactose-deficient IgG is immobilized on insoluble beads.
  • contaminants remain in the measurement system, causing problems such as irregularly increasing the background of signal measurement.
  • measurement values fluctuating due to nonspecific adsorption of the substance to be measured within the measurement system.
  • One of the objectives of the present invention is to provide a processing method and kit that can improve the reproducibility or reliability of measurements using lectins.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a processing method for optically detecting a substance to be measured for lectin binding in a sample by a heterogeneous method comprising, in this order, a step of dispensing a pretreatment solution containing a nonionic surfactant into a liquid-holding tank that serves as both a reaction tank and a detection tank of a container, a step of dispensing a sample into the liquid-holding tank, and a step of dispensing a labeling solution containing a labeled lectin into the liquid-holding tank.
  • the processing method according to [1] further comprising the step of dispensing into the liquid holding tank a carrier solution containing an insoluble carrier having a substance that binds to the target substance immobilized thereon.
  • a processing method for optically detecting a substance to be measured for lectin binding in a sample by a heterogeneous method comprising, in this order, a step of dispensing a sample containing a nonionic surfactant into a liquid-holding tank serving as both a reaction tank and a detection tank of a container, and a step of dispensing a labeling solution containing a labeled lectin into the liquid-holding tank.
  • kits used for optically detecting a substance to be measured for lectin binding in a sample by a heterogeneous method comprising a sample processing reagent, an insoluble carrier reagent, and a labeled lectin reagent, the sample processing reagent comprising a nonionic surfactant.
  • the present invention provides a processing method and kit that can improve the reproducibility or reliability of measurements using lectins.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a procedure of the first embodiment according to the present invention.
  • 1 is a schematic diagram showing an example of a method for measuring CARF: (a) CARF binding to galactose-deficient IgG immobilized on beads through an antigen-antibody reaction, (b) lectin specifically binding to galactose in the sugar chain of CARF.
  • the first aspect of the present invention is a processing method for optically detecting a substance in a sample that is to be measured for lectin binding activity using a heterogeneous method.
  • a first embodiment of this aspect is a processing method including, in this order, a step of dispensing a pretreatment solution containing a nonionic surfactant into a liquid-holding tank that serves as both a reaction tank and a detection tank of a container (pretreatment step), a step of dispensing a sample into the liquid-holding tank (sample dispensing step), and a step of dispensing a labeling solution containing a labeled lectin into the liquid-holding tank (labeling step).
  • pretreatment step a step of dispensing a sample into the liquid-holding tank that serves as both a reaction tank and a detection tank of a container
  • sample dispensing step a step of dispensing a sample into the liquid-holding tank
  • labeling step labeling step
  • Pretreatment process A transparent plastic container is prepared, and the pretreatment liquid is dispensed into the liquid holding tank (inside the container) (FIG. 1(a)).
  • the liquid holding tank serves both as a reaction tank in which a primary reaction and a secondary reaction, which will be described later, are carried out and as a detection tank in which a signal is detected, which will be described later.
  • plastics include polyethylene, polypropylene, polystyrene, and acrylic resins.
  • the transparency of the transparent container is preferably such that the transmittance, expressed as the ratio of (intensity of outgoing light/incoming light) for visible light irradiated from the outer surface of the container, is, for example, 30 to 99%.
  • the volume of the liquid-holding tank is not particularly limited, and may be the same volume as that of a conventionally used cuvette, for example, 0.05 ml to 5.0 ml.
  • the shape of the liquid-holding tank is not particularly limited, and may be, for example, cylindrical, square or other columnar, similar to conventional cuvettes.
  • the pretreatment liquid contains a nonionic surfactant and water.
  • it may contain any other components such as physiological salts and pH buffers as long as they do not impair the spirit of the present invention.
  • a nonionic surfactant is a surfactant that does not have a functional group that ionizes in water.
  • Specific examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, etc.
  • polyoxyethylene ether is preferred because it particularly exhibits the effects of the present invention.
  • polyoxyethylene ether refers to a molecule in which a polyoxyethylene moiety is bonded to a hydrocarbon group via an ether bond. When the hydrocarbon group is an alkyl group, the molecule is called a polyoxyethylene alkyl ether.
  • the number of repeating units of the polyoxyethylene moiety may be, for example, in the range of 3 to 60, 5 to 50, 10 to 40, or 15 to 30.
  • the number of carbon atoms in the monovalent hydrocarbon may be, for example, in the range of 4 to 30, 5 to 25, 8 to 20, or 10 to 15.
  • the alkyl group may have, for example, 4 to 30 carbon atoms, 5 to 25 carbon atoms, 8 to 20 carbon atoms, or 10 to 15 carbon atoms.
  • Emulgen is a registered trademark.
  • Emulgen 120 the repeating number is 12, the alkyl group is a dodecyl group, and the HLB is 15.3
  • Emulgen 108 the repeating number is 6, the alkyl group is a dodecyl group, and the HLB is 12.1
  • Emulgen 420 the repeating number is 13, the hydrocarbon group is an oleyl group (a monovalent unsaturated hydrocarbon group having 18 carbon atoms), and the HLB is 13.6)
  • Emulgen 2020G the repeating number is 20, the alkyl group is an octyldodecyl group having 20 carbon atoms, and the HLB is 15.0
  • Emulgen 150 the repeating number is 47, the alkyl group is a dodecyl group, and the HLB is 18.4
  • the HLB value of the nonionic surfactant is preferably 12.0 to 18.5, more preferably 12.0 to 15.5, and even more preferably 13.0 to 14.0. When the HLB value is within this preferred range, the effects of the present invention are more pronounced.
  • the HLB value of a nonionic surfactant can be calculated by the Atlas method, the Griffin method, the Davis method, or the Kawakami method.
  • the content of the nonionic surfactant relative to the total mass of the pretreatment liquid is preferably from 0.01 to 2.0 mass %, more preferably from 0.05 to 1.5 mass %, and even more preferably from 0.10 to 1.2 mass %.
  • concentration is equal to or higher than the lower limit, the effect of suppressing non-specific adsorption of lectin-binding contaminants is enhanced, whereas when the concentration is equal to or lower than the upper limit, the interference with the binding of the labeled lectin to CARF can be suppressed, and this is economical.
  • the method of dispensing the pretreatment liquid into the liquid holding tank is not particularly limited, and for example, a predetermined amount may be injected using a known pipette or dispenser.
  • the temperature of the dispensed pretreatment liquid may be in the range of, for example, 4 to 37°C.
  • the amount of pretreatment liquid dispensed may be, for example, 10 to 90% of the volume of the liquid holding tank (100%).
  • sample dispensing process A sample is dispensed into a liquid-holding tank into which a pretreatment liquid has been dispensed in advance (FIG. 1(b)). At this time, it is preferable to dispense the sample into the pretreatment liquid while preventing the sample from coming into direct contact with the inner wall surface of the liquid-holding tank. Dispensing in this manner can reduce nonspecific adsorption of the measurement target substance and impurities in the sample to the inner wall surface.
  • the dispensed sample is mixed naturally or mechanically with the pretreatment liquid in the liquid-holding tank.
  • the mixed solution will be referred to as the mixed solution hereinafter.
  • the method of dispensing the sample into the liquid holding tank is not particularly limited, and for example, a predetermined amount may be injected using a known pipette or dispenser.
  • the volume of the mixed liquid is 100% or less of the volume of the liquid holding tank, and preferably 50% or less.
  • the amount of sample to be dispensed may be, for example, 1 to 200% relative to 100% of the volume of the pretreatment liquid, with 5 to 100% being preferred, and 10 to 50% being more preferred. With this mixture ratio, the nonionic surfactant acts well on the impurities in the sample, and nonspecific adsorption of the impurities to the inner wall surface of the liquid holding tank can be sufficiently reduced.
  • the temperature of the sample to be dispensed may be, for example, in the range of 4 to 37°C.
  • the incubation time may be, for example, 1 to 10 minutes, and the temperature may be, for example, 4 to 37°C.
  • the sample used in the sample dispensing step is a biological sample, and may be of human or animal origin.
  • the sample may be blood, culture supernatant, urine, stool, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, ascites, or cell or tissue extracts.
  • the blood may be whole blood, plasma, or serum, or may be a sample that has been subjected to any processing such as dilution or purification of blood.
  • a predetermined amount of carrier dispersion liquid (reagent solution: R2) containing a predetermined amount of magnetic particles carrying human galactose-deficient IgG is dispensed into the mixed liquid in the liquid holding tank (FIG. 1(c)).
  • a known carrier dispersion liquid can be used.
  • the magnetic particles contained in the carrier dispersion liquid are made of a magnetic material such as iron embedded in plastic resin, and when a magnet is brought close to the outer surface of the container, they are attracted to the inner wall surface of the liquid-holding tank by magnetic force.
  • the magnetic particles are also water-insoluble carriers.
  • human galactose-deficient IgG which binds to the CARF to be measured, is immobilized on the surface of magnetic particles by a known method.
  • a plurality of such magnetic particles are dispersed in an appropriate dispersion medium to obtain a carrier dispersion.
  • the dispersion medium include aqueous solutions containing physiological salts and pH buffers.
  • the dispensed carrier dispersion is mixed naturally or mechanically with the mixture in the liquid holding tank to form a primary reaction solution.
  • CARF that may be contained in the sample binds to human galactose-deficient IgG immobilized on the surface of the magnetic particles through protein-protein interactions. Incubation is preferable to ensure time for this binding reaction (primary reaction) to occur.
  • the time may be, for example, 1 to 10 minutes, and the temperature may be, for example, 4 to 37°C.
  • This type of washing makes it possible to separate (B/F separation) the CARF bound to the magnetic particles from the impurities other than CARF that are not bound to the magnetic particles.
  • a sample processing method involving B/F separation is called a heterogeneous method.
  • a labeling solution (reagent solution: R3) containing a predetermined amount of labeled lectin is dispensed into the liquid holding tank containing the washed magnetic particles (FIG. 1(e)). Any known labeling solution can be used.
  • the labeled lectin is a labeled lectin.
  • Lectins are generally known as proteins that have specific binding properties to sugar chains.
  • the lectin used in this embodiment is a lectin that specifically binds to sugar chains having galactose, preferably sugar chains having galactose at their terminals, among the sugar chains possessed by CARF.
  • Specific examples of lectins include lectins derived from castor seeds, peanuts, and soybeans. Among these, lectins derived from castor seeds are preferred because of their high specificity to terminal galactose monosaccharides. For example, commercially available RCA120 manufactured by Vector is preferred.
  • the label of the labeled lectin is a substance that can emit a signal indicating the presence of the labeled lectin, either by itself or via another substance.
  • Types of signals include, for example, luminescence, color change, staining, and radiation emission.
  • a specific label is preferably an enzyme. When an enzyme substrate is added to an enzyme-labeled lectin, the product of the enzyme reaction emits light, develops color, or changes color. These signals are appropriately selected based on known combinations of enzymes and substrates.
  • Specific examples of the label include alkaline phosphatase (ALP) and horseradish peroxidase (HRP). Among these, ALP is preferred because it has a constant reaction rate and the detection sensitivity is improved by extending the reaction time.
  • ALP ALP manufactured by Roche is preferred.
  • Methods for labeling lectins with enzymes that is, methods for binding enzymes to lectins, are known, and binding can be achieved, for example, by the use of so-called SATA reagents.
  • the dispensed labeling solution comes into contact with the magnetic particles in the liquid holding tank, and the magnetic particles are dispersed in the labeling solution, forming a secondary reaction solution.
  • CARF that may be bound to the magnetic particles binds to the labeled lectin in the labeling solution through specific glycan-lectin interactions. Incubation is preferable to ensure time for this binding reaction (secondary reaction) to occur.
  • the time may be, for example, 1 to 10 minutes, and the temperature may be, for example, 4 to 37°C.
  • the tank contains washed magnetic particles. If the sample contains CARF, the magnetic particles are bound to CARF and also to labeled lectin. The amount of signal emitted by the labeled lectin depends on the amount of CARF contained in the sample. The method for detecting and measuring the signal is appropriately selected from known methods depending on the type of label.
  • the label is ALP
  • a predetermined amount of enzyme substrate solution containing a luminescent substrate is dispensed into the liquid holding tank, and the magnet is removed to release the magnetic particles adsorbed to the inner wall surface of the liquid holding tank, which are dispersed in the enzyme substrate solution to obtain an enzyme reaction liquid ( Figure 1(g)).
  • the luminescence emitted by ALP as a result of decomposing the luminescent substrate is measured as a signal, and the CARF content in the sample can be calculated by quantifying this signal ( Figure 1(h)). It is preferable to use a standard sample whose CARF content is known in advance, and prepare a calibration curve showing the relationship between the quantification of the signal and the content.
  • a nonionic surfactant is blended in the pretreatment liquid, and the pretreatment liquid is dispensed in advance into the container.
  • This makes it possible to suppress nonspecific binding of lectin-binding impurities and CARF contained in the sample to be dispensed later to the inner wall surface of the liquid-holding tank and the magnetic particles.
  • it is possible to reduce the amount of lectin-binding impurities remaining in the liquid-holding tank (detection tank) until the signal measurement step and the amount of CARF nonspecifically adsorbed to the portion of the magnetic particles in the liquid-holding tank other than human galactose-deficient IgG, thereby improving the reproducibility or reliability of the measurement using lectin.
  • a nonionic surfactant is added to the pretreatment liquid.
  • a nonionic surfactant may be added to the sample, as in the processing method of the second embodiment described below.
  • the second embodiment is a processing method including, in this order, a step of dispensing a sample containing a nonionic surfactant into a liquid-holding tank that serves both as a reaction tank and a detection tank of a container (a pretreated sample dispensing step), and a step of dispensing a labeling solution containing a labeled lectin into the liquid-holding tank (a labeling step).
  • a pretreated sample dispensing step Prior to the pretreated sample dispensing step, a step of dispensing a solution for diluting the sample into the liquid-holding tank may be included.
  • a nonionic surfactant is added in advance to the sample dispensed into the liquid holding tank. That is, the sample dispensed into the liquid holding tank in this embodiment can be the same as the mixed liquid obtained in the sample dispensing step in the first embodiment.
  • the content of the nonionic surfactant relative to the total mass of the sample dispensed in the second embodiment can be, for example, 0.05 to 2.00 mass %, and is preferably 0.5 to 1.5 mass %.
  • the description of the nonionic surfactant used in this embodiment is the same as that in the first embodiment, so a duplicated description will be omitted.
  • the description of the transparent container used in this embodiment is the same as that of the first embodiment, so a duplicated description will be omitted.
  • the method of dispensing a sample into a liquid holding tank is the same as that in the first embodiment, and therefore a duplicated description will be omitted.
  • a non-ionic surfactant is added to the sample in advance, and at this stage, lectin-binding impurities contained in the sample interact with the non-ionic surfactant. It is speculated that the nonionic surfactant is adsorbed to the impurities.
  • the impurities no longer have the property of nonspecifically adsorbing to the inner wall surface of the liquid-holding tank, and the impurities can be prevented from nonspecifically binding to the inner wall surface of the liquid-holding tank or to the magnetic particles.
  • the amount of lectin-binding impurities remaining in the liquid-holding tank (detection tank) until the signal measurement step can be reduced, and the reproducibility or reliability of the measurement using lectins can be improved.
  • the second aspect of the present invention is a kit used for optically detecting a substance to be measured for lectin binding in a sample by a heterogeneous method, the kit including a sample processing reagent, an insoluble carrier reagent, and a labeled lectin reagent, the sample processing reagent including a nonionic surfactant.
  • the sample treatment reagent contains a non-ionic surfactant and water, and may contain other optional components such as physiological salts and pH buffers, without departing from the spirit of the present invention.
  • the sample treatment reagent is used for the purpose of being mixed with the sample, and may be used as a pretreatment liquid in the first embodiment described above, or may be used as a chemical agent added in advance to the sample in the second embodiment described above.
  • the insoluble carrier reagent includes an insoluble carrier carrying human galactose-deficient IgG, and may further include any other components such as water, physiological salts, pH buffers, etc., within the scope of the present invention.
  • the insoluble carrier the above-mentioned magnetic particles are preferable, but the insoluble carrier is not limited to this example, and may be any of various known insoluble carriers known as antibody carriers.
  • the insoluble carrier reagent can be used as the carrier dispersion in the first reaction step described above.
  • the labeled lectin reagent contains the labeled lectin, and may further contain any other components such as water, physiological salts, and pH buffers, without departing from the spirit of the present invention.
  • the labeled lectin reagent can be used as the labeling solution in the labeling step described above.
  • the container used in the following test examples is a transparent plastic liquid-holding tank (volume 0.5 ml).
  • the liquid-holding tank serves as both a reaction tank and a detection tank. Unless otherwise specified below, the temperature of each solution was 37°C.
  • a predetermined amount (0.1 mL in one example) of the pretreatment solution was dispensed into the liquid-holding tank, and the pretreatment solution was brought into contact with the inner wall surface of the liquid-holding tank.
  • a predetermined amount (10 ⁇ L in one example) of a sample solution that may contain CARF, a lectin-binding target substance, and may also contain lectin-binding impurities (non-target substances) was dispensed into the liquid-holding tank so as to be mixed with the pretreatment solution. A mixture of these was obtained in the liquid-holding tank. The mixture was incubated at a predetermined temperature for a predetermined time (37° C., 3.5 minutes in one example). Next, a predetermined amount (50 ⁇ L in one example) of carrier dispersion containing a predetermined amount of magnetic particles carrying human galactose-deficient IgG was dispensed into the liquid holding tank and thoroughly mixed with the mixture to obtain a primary reaction liquid.
  • a predetermined amount (0.1 mL in one example) of a labeling solution containing an enzyme-labeled lectin was dispensed into the liquid-holding tank, and the magnet was removed to release the magnetic particles that had been adsorbed to the inner wall surface of the liquid-holding tank and disperse them in the labeling solution, thereby obtaining a secondary reaction liquid.
  • a magnet was attached to the outer surface of the container again, and the magnetic particles were attracted to the inner wall surface of the liquid-holding tank by magnetic force.
  • the reaction liquid in the liquid-holding tank was aspirated to remove all the liquid.
  • a washing process in which a washing liquid was dispensed into the liquid-holding tank and aspirated was performed several times.
  • a predetermined amount 100 ⁇ L in one example
  • an enzyme substrate solution containing a luminescent substrate was dispensed into the liquid-holding tank, and the magnet was removed to release the magnetic particles that had been adsorbed to the inner wall surface of the liquid-holding tank and disperse them in the enzyme substrate solution, thereby obtaining an enzyme reaction solution.
  • the amount of luminescence generated when the enzyme decomposed the luminescent substrate in the enzyme reaction solution was measured. The amount of luminescence increased according to the amount of the substance to be measured contained in the sample.
  • a non-ionic surfactant is blended in the pretreatment liquid in order to reduce the adverse effects of the impurities. The methods and results of each test example are shown below, and the effects of various nonionic surfactants are demonstrated.
  • the antibody solution was added to a Protein G column (Cytiva) equilibrated with 0.1M acetate buffer (pH 5.0), and eluted with 0.1M glycine (pH 3.0).
  • the recovered antibody solution was dialyzed twice against carbonate buffer (0.1 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 9.5) to obtain a galactose-deficient IgG solution.
  • the mixture was washed twice with 0.75 mL of washing solution (50 mM Tris, 0.5% Tween 20, pH 8.0).
  • a magnetic particle dilution solution 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20, 0.33% sucrose, pH 8.0 was added so that the M280 concentration in the solution was 0.25 mg/mL, and a galactose-deficient IgG solid-phase magnetic particle suspension (hereinafter referred to as "standard R2”) was obtained.
  • Hydroxylamine solution 500 mM hydroxylamine, 20 mM PBS, 25 mM EDTA, pH 7.5
  • the reaction solution was added to a desalting column (NAP5 column, Cytiva) and eluted with PBS to obtain a thiol group-added RCA120 solution.
  • ALP-SMCC and thiol group-added RCA120 were mixed in a molar ratio of 1:5 and stirred at 25° C. for 1 hour.
  • the ALP-labeled RCA120 in the reaction solution was separated by gel filtration chromatography using AKTA pure TM 25 (Cytiva) and Superdex200 Increase 10/300GL (Cytiva), and diluted with diluent (25 mM MES, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 , 0.1 mM ZnCl2 , 0.01% Tween20, pH 6.5) to a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL to obtain an ALP-labeled RCA120 solution (hereinafter referred to as "R3").
  • sample preparation 490 ⁇ L of sample diluent 50 mM Tris-HCL, 10 mM EDTA-2Na, pH 8.0
  • sample preparation 490 ⁇ L of sample diluent 50 mM Tris-HCL, 10 mM EDTA-2Na, pH 8.0
  • sample preparation 490 ⁇ L of sample diluent 50 mM Tris-HCL, 10 mM EDTA-2Na, pH 8.0
  • RO water was also used as a sample.
  • the CARF concentration in the samples was measured using Picolumi CA-RF (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.), an approved reagent.
  • Example 1 1% Emulgen 108 (Kao Corporation)
  • Example 2 1% Emulgen 2020G (Kao Corporation)
  • Example 3 1% Emulgen 420 (Kao Corporation)
  • Example 4 0.1% Emulgen 120 (Kao Corporation)
  • Example 5 1% Emulgen 120 (Kao Corporation)
  • Example 6 1% Emulgen 150 (Kao Corporation) Comparative Example 1: No additional compound Comparative Example 2: 0.1% Blockmaster PA1080 (manufactured by JSR Life Sciences) Comparative example 3: 0.1% LIPIDURE-BL405 (manufactured by NOF Corporation) Comparative Example 4: 0.1% LIPIDURE-BL502 (manufactured by NOF Corporation) Comparative Example 5: 0.1% LIPIDURE-BL1002 (manufactured by NOF Corporation) Comparative example 6: 0.1% CHAPS Comparative
  • the additive used in each of the above examples was a nonionic surfactant, and the additive used in each of the comparative examples was an additive other than a "nonionic surfactant.”
  • the Emulgen series used in the above Examples 1 to 6 are all polyoxyethylene alkyl ethers.
  • STACIA fully automated clinical testing system
  • 10 ⁇ L of sample was mixed with 100 ⁇ L of R1 and incubated at 37° C. for 3.5 minutes.
  • 50 ⁇ L of the magnetic particle dilution was added to obtain a mock primary reaction without magnetic particles and incubated at 37° C. for 2.7 minutes.
  • 100 ⁇ L of R3 was added to obtain a secondary reaction solution, which was then incubated at 37° C. for 4.4 minutes.
  • ALP substrate solution was added and incubated for 2.7 minutes, after which chemiluminescence was detected.
  • Comparative Example 2 in which an amphiphilic polymer was added
  • Comparative Example 3 in which an anionic side chain polymer was added
  • Comparative Example 4 in which a cationic side chain polymer was added
  • Comparative Example 5 in which a hydrophobic side chain polymer was added
  • Comparative Example 6 in which an amphiphilic surfactant was added
  • Comparative Example 7 in which an anionic surfactant was added
  • Example 7 0.05% Emulgen 120 (Kao Corporation)
  • Example 8 0.20% Emulgen 120
  • Example 9 0.05% Emulgen 420
  • Example 10 0.10% Emulgen 420
  • Example 11 0.20% Emulgen 420
  • STACIA fully automated clinical testing system
  • 10 ⁇ L of sample was mixed with 100 ⁇ L of R1 and incubated at 37° C. for 3.5 minutes.
  • 50 ⁇ L of the antibody-unbound R2 was added to obtain a pseudo primary reaction containing magnetic particles without galactose-deficient IgG, and incubated at 37° C. for 2.7 minutes.
  • 100 ⁇ L of R3 was added to obtain a secondary reaction solution, which was then incubated at 37° C. for 4.4 minutes.
  • ALP substrate solution was added and incubated for 2.7 minutes, after which chemiluminescence was detected.
  • Standard R1 to which 1% Emulgen 420 (Kao Corporation) was added was used as R1 (pretreatment solution described above).
  • Standard R2 of 1-3 was used.
  • R3 of 1-5 was used as is.
  • Standard R1 was used as the "pretreatment solution.”
  • Magnetic particle dilution solution (without antibody) in 1-3 was used.
  • R3 in 1-5 was used as is.
  • Standard R1 was used as the "pretreatment solution”.
  • 1% Emulgen 420 (Kao Corporation) was added to the magnetic particle dilution solution (without antibody) in 1-3 and used.
  • R3 in 1-5 was used as is.
  • Standard R1 was used as the "pretreatment solution”.
  • Magnetic particle dilution solution 1-3 (without antibody) was used as is.
  • R3 1-5 was used with 1% Emulgen 420 (Kao Corporation) added.
  • Example 12 in which a nonionic surfactant was added to standard R1, the increase in counts due to nonspecific reactions was significantly suppressed compared to Comparative Example 8, in which no nonionic surfactant was added. In contrast, in Comparative Examples 9 and 10, in which nonionic surfactants were added to R2 and R3, the effect of suppressing nonspecific reactions was not sufficient.
  • Example 13 The samples of Example 13 were prepared as follows. A specimen diluent S was prepared by adding 1% Emulgen 420 to the specimen diluent (50 mM Tris-HCL, 10 mM EDTA-2Na, pH 8.0). 500 ⁇ L of specimen diluent S was added to 10 ⁇ L of the same serum as used in Example 12 above to prepare samples 16 to 24. RO water was also used as a sample. The CARF concentration in the samples was measured using Picolumi CA-RF (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • Example 12 The same sample as in 4-1 and the same reagent as in 4-2 were used, and the measurement was repeated using the same procedure as in 2-3.
  • Comparative Example 8 The same sample as in 4-1 and the same reagent as in 4-2 were used, and the measurement was repeated using the same procedure as in 2-3.
  • Example 13 Results The results of Example 13 are shown in Table 4 together with the results of Example 12 and Comparative Example 8, which were carried out again.
  • Example 13 in which a nonionic surfactant was added to the specimen diluent, the same effect of inhibiting nonspecific reactions was observed as in Example 12, in which a nonionic surfactant was added to the standard R1.
  • Sample preparation Samples 25 to 28 were prepared in the same manner as in 2-1.
  • Example 14 Measurement Reagent
  • R1 of Example 4 was used as the "pretreatment solution”.
  • R2 prepared in 1-3 was used.
  • R3 prepared in 1-5 was used.
  • R1 of Example 10 was used as the "pretreatment solution.”
  • R2 prepared in 1-3 was used.
  • R3 prepared in 1-5 was used.
  • Standard R1 was used as the "pretreatment solution”.
  • R2 prepared in 1-3 was used.
  • R3 prepared in 1-5 was used.
  • STACIA fully automated clinical testing system
  • 10 ⁇ L of sample was mixed with 100 ⁇ L of R1 and incubated at 37° C. for 3.5 minutes.
  • 50 ⁇ L of R2 was added to give the primary reaction and incubated at 37° C. for 2.7 minutes.
  • 100 ⁇ L of R3 was added to obtain a secondary reaction solution, which was incubated at 37° C. for 4.4 minutes.
  • CARF concentration in the sample was calculated from the detected chemiluminescence value using a calibration curve prepared by plotting the count value and CARF concentration when a sample with a known CARF concentration was measured.

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Abstract

試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法であって、容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む前処理溶液を分注する工程と、前記保液槽に試料を分注する工程と、前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程と、をこの順番で含む処理方法。

Description

処理方法及びキット
　本発明は、レクチンを用いた測定における処理方法及びキットに関する。本願は、２０２３年３月１５日に、日本に出願された特願２０２３－０４０３８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、関節リウマチ患者の血清中ＩｇＧは、健康人のＩｇＧと比較し、顕著にガラクトースを欠損していることが明らかとなっている（非特許文献１～２）。血清中の抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体（ＣＡＲＦ）を測定することは、関節リウマチの診断の補助や疾患状態の評価に有用である。ＣＡＲＦの測定方法の一例として次の方法が知られている。不溶性ビーズにガラクトース欠損ＩｇＧを固定した試薬を準備し、これを検体と混ぜると、検体中のＣＡＲＦがガラクトース欠損ＩｇＧを介してビーズに捕捉される（図２（ａ））。通常、ＣＡＲＦはガラクトースを有する糖鎖を備える。ここにガラクトース結合性の標識レクチンを添加すると、標識レクチンはＣＡＲＦ及びガラクトース欠損ＩｇＧを介してビーズに捕捉される（図２（ｂ））。この標識レクチンが発するシグナルを検出することにより、検体中に含まれていたＣＡＲＦを定量することができる。この測定原理に基づく体外診断用医薬品の既認証試薬として、積水メディカル社製の「ピコルミＣＡ・ＲＦ」が知られている。なお、「ピコルミ」は登録商標である。
Parekh R. B. et al ."Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG" Nature 316，452-457（1985） 水落次男ら、「早期リウマチにおけるリウマチ因子の測定」リウマチ科 12，337-343（1994）
　ところで、検体中のレクチン結合性の物質には、測定対象であるＣＡＲＦだけでなく、夾雑物質も含まれる。原理的には、不溶性ビーズにガラクトース欠損ＩｇＧを固定した試薬に夾雑物質は結合しないはずである。しかし実際には、何らかの理由により、夾雑物質が測定系に残存し、シグナル測定のバックグラウンドを不規則に高める問題があった。また、測定対象物質が測定系内に非特異的に吸着することにより測定値が変動するという問題もあった。
　本発明は、レクチンを用いた測定の再現性若しくは信頼性を高めることが可能な、処理方法及びキットを提供することを目的の一つとする。
　本発明者らが鋭意検討したところ、非イオン性界面活性剤を特定の方法で測定系に添加することにより、レクチン結合性の夾雑物質が非特異的に測定系内に吸着することを防止し、レクチンを用いた測定の再現性若しくは信頼性を高めることができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法であって、容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む前処理溶液を分注する工程と、前記保液槽に試料を分注する工程と、前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程と、をこの順番で含む処理方法。
［２］　前記保液槽に、前記測定対象物質に結合する物質を固定化した不溶性担体を含む担体溶液を分注する工程を含む［１］に記載の処理方法。
［３］　前記試料が、前記測定対象物質とは異なり、かつ、前記標識レクチンに結合可能な夾雑物質を含む［１］又は［２］に記載の処理方法。
［４］　前記標識レクチンが、レクチンを酵素標識した物質である［１］～［３］のいずれかに記載の処理方法。
［５］　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテルである［１］～［４］のいずれかに記載の処理方法。
［６］　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法であって、容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む試料を分注する工程と、前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程と、をこの順番で含む処理方法。
［７］　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するために使用されるキットであって、試料処理試薬、不溶性担体試薬、及び標識レクチン試薬を含み、前記試料処理試薬が非イオン性界面活性剤を含むキット。
　本発明によれば、レクチンを用いた測定の再現性若しくは信頼性を高めることが可能な、処理方法及びキットが提供される。
本発明に係る第一実施形態の手順の一例を示す概略図である。 ＣＡＲＦの測定方法の一例を示す概略図である。（ａ）ビーズに固定されたガラクトース欠損ＩｇＧにＣＡＲＦが抗原抗体反応により結合する様子。（ｂ）ＣＡＲＦが有する糖鎖のガラクトースにレクチンが特異的に結合した様子。
　本発明の第一態様は、試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法である。
＜第一実施形態＞
　本態様の第一実施形態は、容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む前処理溶液を分注する工程（前処理工程）と、前記保液槽に試料を分注する工程（試料分注工程）と、前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程（標識工程）と、をこの順番で含む処理方法である。
　以下、本実施形態の具体例を、図１を参照して説明する。
［前処理工程］
　プラスチック製の透明容器を準備し、保液槽（容器の中）に前処理液を分注する（図１（ａ））。
　保液槽は、後述の一次反応及び二次反応を行う反応槽と、後述のシグナル検出を行う検出槽とを兼ねる。
　プラスチックとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂等が挙げられる。
　透明容器の透明度としては、容器の外側面から照射した可視光線について、（出射光の強度／入射光の強度）の比率で表される透過率が例えば３０～９９％のものが好ましい。
　保液槽の容積は特に制限されず、従来から使用されているキュベットと同等の容積、例えば０．０５ｍｌ～５．０ｍｌが挙げられる。
　保液槽の形状は特に制限されず、従来から使用されているキュベットと同様に、例えば円柱、四角柱等の柱状が挙げられる。
　前処理液（試薬溶液：Ｒ１）は、非イオン性界面活性剤と、水とを含む。この他に、本発明の趣旨を損なわない範囲で、生理的塩類やｐＨ緩衝剤等の任意の成分を含んでもよい。
　非イオン性界面活性剤は、水中で電離する官能基を有しない界面活性剤である。
　非イオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられる。なかでも、本発明の効果が特に奏されることから、ポリオキシエチレンエーテルが好ましい。
　なお、ポリオキシエチレンエーテルは、ポリオキシエチレン部位と炭化水素基とがエーテル結合した分子をいう。炭化水素基がアルキル基である場合、ポリオキシエチレンアルキルエーテルと呼ばれる。
　ポリオキシエチレンエーテルにおいて、ポリオキシエチレン部位の繰り返し単位の繰り返し数は、例えば３～６０の範囲、５～５０の範囲、１０～４０の範囲、１５～３０の範囲のいずれであってもよい。
　ポリオキシエチレンエーテルにおいて、１価の炭化水素の炭素数は、例えば４～３０の範囲、５～２５の範囲、８～２０の範囲、１０～１５の範囲のいずれであってもよい。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテルにおいて、アルキル基の炭素数は、例えば４～３０の範囲、５～２５の範囲、８～２０の範囲、１０～１５の範囲のいずれであってもよい。
　ポリオキシエチレンエーテルの好ましい具体例としては、次のエマルゲン・シリーズ（花王社製）が挙げられる。なお、「エマルゲン」は登録商標である。
・エマルゲン１２０（前記繰り返し数は１２、前記アルキル基はドデシル基、ＨＬＢは１５．３）
・エマルゲン１０８（前記繰り返し数は６、前記アルキル基はドデシル基、ＨＬＢは１２．１）
・エマルゲン４２０（前記繰り返し数は１３、前記炭化水素基はオレイル基（oleyl基；炭素数１８の１価の不飽和炭化水素基）、ＨＬＢは１３．６）
・エマルゲン２０２０Ｇ（前記繰り返し数は２０、前記アルキル基は炭素数２０のオクチルドデシル基、ＨＬＢは１５．０）
・エマルゲン１５０（前記繰り返し数は４７、前記アルキル基はドデシル基、ＨＬＢは１８．４）
　非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、１２．０～１８．５が好ましく、１２．０～１５．５がより好ましく、１３．０～１４．０がさらに好ましい。この好ましい範囲であると、本発明の効果がより一層奏される。
　非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は製造元が公表している数値を引用することができる。非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値はアトラス法、グリフィン法、デイビス法又は川上法によっても算出することができる。
　前処理液の総質量に対する非イオン性界面活性剤の含有量は、０．０１～２．０質量％が好ましく、０．０５～１．５質量％がより好ましく、０．１０～１．２質量％がさらに好ましい。
　上記下限値以上であると、レクチン結合性の夾雑物質の非特異的な吸着を抑制する効果がより高まる。上記上限値以下であると、標識レクチンのＣＡＲＦに対する結合を妨害することを抑制できる。また、経済的である。
　保液槽に前処理液を分注する方法は特に制限されず、例えば公知のピペットやディスペンサーにて所定量を注入すればよい。分注する前処理液の温度は例えば４～３７℃の範囲とすればよい。分注する前処理液の量としては、保液槽の容積１００％に対して、例えば１０～９０％とすればよい。
［試料分注工程］
　予め前処理液を分注した保液槽に試料を分注する（図１（ｂ））。この際、試料が保液槽の内壁面に直接に接触することを防ぎながら、前処理液の中に試料を分注することが好ましい。このように分注すれば、試料中の測定対象物質及び夾雑物質が内壁面に非特異的に吸着することを低減することができる。分注した試料は保液槽中で前処理液と自然に又は機械的に混合される。混合された溶液を以下では混合液という。
　保液槽に試料を分注する方法は特に制限されず、例えば公知のピペットやディスペンサーにて所定量を注入すればよい。ここで、混合液の体積は、保液槽の容積の１００％以下とし、好ましくは５０％以下とする。分注する試料の量としては、前処理液の体積１００％に対して、例えば１～２００％が挙げられ、５～１００％が好ましく、１０～５０％がより好ましい。この混合割合であると、試料中の夾雑物質に対して非イオン性界面活性剤がよく作用し、夾雑物質が保液槽の内壁面に非特異的に吸着することを充分に低減することができる。分注する試料の温度は例えば４～３７℃の範囲とすればよい。
　保液槽にて前処理液と試料を混合し、混合液を得た後、非イオン性界面活性剤が夾雑物質に作用する時間を確保するために、インキュベーションすることが好ましい。その時間は例えば１～１０分とし、その温度は例えば４～３７℃とすればよい。
　試料分注工程で用いる試料は生体試料であり、ヒト由来であってもよいし、動物由来であってもよい。試料は血液であってもよいし、培養上清、尿、便、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等であってもよい。血液は全血であってもよいし、血漿であってもよいし、血清であってもよい、血液に対して希釈、精製など任意の処理が施された試料であってもよい。
［一次反応工程］
　保液槽内の混合液に、ヒトガラクトース欠損ＩｇＧを担持した磁性粒子を所定量で含む担体分散液（試薬溶液：Ｒ２）を所定量で分注する（図１（ｃ））。担体分散液は公知のものを適用できる。
　担体分散液に含まれる磁性粒子は、プラスチック樹脂に鉄等の磁性体が埋め込まれたものであり、容器の外側面に磁石を近づけると保液槽の内壁面に磁力で引き寄せられるものである。磁性粒子は、水に対する不溶性担体でもある。
　本実施形態においては、測定対象物質であるＣＡＲＦに結合する、ヒトガラクトース欠損ＩｇＧが磁性粒子の表面に公知方法で固定化されたものを用いる。この磁性粒子の複数を適当な分散媒に分散し、担体分散液が得られる。分散媒としては、例えば生理的塩類やｐＨ緩衝剤を含む水溶液が挙げられる。
　分注した担体分散液は保液槽中で前記混合液と自然に又は機械的に混合され、一次反応液となる。一次反応液において、試料に含まれている可能性のあるＣＡＲＦと、磁性粒子の表面に固定されたヒトガラクトース欠損ＩｇＧがタンパク質間相互作用により結合する。この結合反応（一次反応）が起こる時間を確保するために、インキュベーションすることが好ましい。その時間は例えば１～１０分とし、その温度は例えば４～３７℃とすればよい。
　インキュベーション後に、容器の外側面に磁石を近づけ、保液槽の内壁面に磁性粒子を磁力で吸引する。この状態で、保液槽内の反応液（液体）を吸引又はデカンテーションにより、全て除去する（図１（ｄ））。保液槽の内壁面やそこに吸引した磁性粒子に付着している夾雑物質を洗浄するために、保液槽内に洗浄液を分注し、その後に除去する。この洗浄処理を数回行うことが好ましい。この際、磁石を一時的に離して磁性粒子を洗浄液中に分散させると、洗浄効率を高められる。このような洗浄により、磁性粒子に結合したＣＡＲＦと、磁性粒子に結合しないＣＡＲＦ以外の夾雑物質とを分離（Ｂ／Ｆ分離）することができる。一般に、Ｂ／Ｆ分離を伴う試料の処理方法を、ヘテロジニアス法という。
［標識工程（二次反応工程）］
　洗浄した磁性粒子が入っている保液槽に、標識レクチンを所定量で含む標識溶液（試薬溶液：Ｒ３）を分注する（図１（ｅ））。標識溶液は公知のものを適用できる。
　標識レクチンは、標識されたレクチンである。レクチンは、一般に、糖鎖に対する特異的結合性を有するタンパク質として知られている。本実施形態で用いるレクチンは、ＣＡＲＦが有する糖鎖のうち、ガラクトースを有する糖鎖、好ましくは末端にガラクトースを有する糖鎖、に特異的に結合するレクチンである。
　具体的なレクチンとしては、ヒマシ種子由来のレクチン、ピーナッツ由来のレクチン、ダイズ由来のレクチン等が挙げられる。これらのうち、糖鎖末端ガラクトース単糖への特異性が高いことから、ヒマシ種子由来のレクチンが好ましい。例えば、市販のＶｅｃｔｏｒ社製のＲＣＡ１２０が好ましい。
　標識レクチンが有する標識は、標識レクチンの存在を、その標識単独で又は他の物質を介して、シグナルとして発しうる物質である。シグナルの種類としては、例えば発光、変色、着色、放射線放出等が挙げられる。具体的な標識としては酵素が好ましい。酵素標識されたレクチンに対して、酵素の基質を添加すると、酵素反応の生成物が発光したり、発色したり、変色したりする。これらのシグナルは、酵素と基質の公知の組み合わせに基づき、適宜選択される。
　具体的な標識としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。このうち、反応速度が一定であり、反応時間の延長で検出感度が向上されることから、ＡＬＰが好ましい。例えば、市販のＲｏｃｈｅ社製のＡＬＰが好ましい。
　なお、レクチンを酵素で標識する方法、すなわちレクチンに酵素を結合する方法は公知であり、例えばいわゆるＳＡＴＡ試薬により結合することができる。
　分注した標識溶液は保液槽中で前記磁性粒子と接触し、標識溶液中に前記磁性粒子が分散され、二次反応液となる。二次反応液において、前記磁性粒子に結合している可能性のあるＣＡＲＦと、標識溶液中の標識レクチンとが、糖鎖－レクチンの特異的相互作用により結合する。この結合反応（二次反応）が起こる時間を確保するために、インキュベーションすることが好ましい。その時間は例えば１～１０分とし、その温度は例えば４～３７℃とすればよい。
　インキュベーション後に、容器の外側面に磁石を近づけ、保液槽の内壁面に磁性粒子を磁力で吸引する。この状態で、保液槽内の反応液（液体）を吸引又はデカンテーションにより、全て除去する（図１（ｆ））。保液槽の内壁面やそこに吸引した磁性粒子に非特異的に付着している標識レクチンを洗浄するために、保液槽内に洗浄液を分注し、その後に除去する。この洗浄処理を数回行うことが好ましい。この際、磁石を一時的に離して磁性粒子を洗浄液中に分散させると、洗浄効率を高められる。このような洗浄により、磁性粒子に特異的に結合した標識レクチンと、磁性粒子に結合しない標識レクチンとを分離（Ｂ／Ｆ分離）することができる。
［シグナル測定工程］
　前段の工程の後、保液槽には洗浄した磁性粒子が入っている。試料にＣＡＲＦが含まれている場合、磁性粒子にはＣＡＲＦが結合し、さらに標識レクチンが結合している。標識レクチンが発するシグナルの量は、試料に含まれていたＣＡＲＦの量に依存する。
　シグナルの検出及び測定の方法は、標識の種類に応じて公知方法から適宜選択される。
　標識がＡＬＰである場合、保液槽に発光基質を含む酵素基質溶液の所定量を分注し、磁石を離して保液槽の内壁面に吸着していた前記磁性粒子を解放し、酵素基質溶液中に分散させ、酵素反応液を得る（図１（ｇ））。ＡＬＰが発光基質を分解して発した発光をシグナルとして測定し、これを定量することにより、試料中のＣＡＲＦの含有量を算出することができる（図１（ｈ））。予めＣＡＲＦの含有量が分かっている標準試料を用い、そのシグナルの定量と含有量との関係を示す検量線を準備しておくことが好ましい。
＜作用効果＞
　本実施形態にあっては、前処理液に非イオン性界面活性剤を配合しており、容器に予め前処理液を分注している。これにより、後から分注する試料に含まれるレクチン結合性の夾雑物質やＣＡＲＦが、保液槽の内壁面や磁性粒子に非特異的に結合することを抑制できる。この結果、シグナル測定工程まで保液槽（検出槽）内に残留するレクチン結合性の夾雑物質の量や、保液槽における磁性粒子上のヒトガラクトース欠損ＩｇＧ以外の部分に非特異的に吸着するＣＡＲＦの量を低減することができ、レクチンを用いた測定の再現性若しくは信頼性を高めることができる。
　以上で説明した第一実施形態の処理方法では、前処理液に非イオン性界面活性剤を配合した。これに代えて、次の第二実施形態の処理方法のように、試料に非イオン性界面活性剤を配合してもよい。
＜第二実施形態＞
　第二実施形態は、容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む試料を分注する工程（前処理済み試料の分注工程）と、前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程（標識工程）と、をこの順番で含む処理方法である。前処理済み試料の分注工程の前に、試料希釈用の溶液を保液槽に分注する工程を含んでもよい。
［前処理済み試料の分注工程］
　保液槽に分注する試料には、非イオン性界面活性剤を予め添加しておく。つまり、本実施形態で保液槽に分注する試料は、第一実施形態の試料分注工程で得られる混合液と同じものでありうる。
　第二実施形態で分注する試料の総質量に対する非イオン性界面活性剤の含有量は、例えば０．０５～２．００質量％とすることができ、０．５～１．５質量％が好ましい。
　本実施形態で使用する非イオン性界面活性剤の説明は第一実施形態の説明と同じであるので、重複する説明は省略する。
　本実施形態で使用する透明容器の説明は第一実施形態の説明と同じであるので、重複する説明は省略する。
　本実施形態において保液槽に試料を分注する方法の説明は第一実施形態の説明と同じであるので、重複する説明は省略する。
　第二実施形態において、第一実施形態の［一次反応工程］、［標識工程（二次反応工程）］、［シグナル測定工程］と同様に各工程を順に行うことが好ましい。
＜作用効果＞
　本実施形態にあっては、試料に非イオン性界面活性剤を予め添加している。この段階で、試料に含まれるレクチン結合性の夾雑物質が、非イオン性界面活性剤と相互作用する。
　推測であるが、夾雑物質に非イオン性界面活性剤が吸着すると考えられる。この状態の試料を保液槽に分注すると、前記夾雑物質はもはや保液槽の内壁面に非特異的に吸着する性質を失っており、前記夾雑物質が保液槽の内壁面や磁性粒子に非特異的に結合することを抑制できる。この結果、シグナル測定工程まで保液槽（検出槽）内に残留するレクチン結合性の夾雑物質の量を低減することができ、レクチンを用いた測定の再現性若しくは信頼性を高めることができる。
　本発明の第二態様は、試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するために使用されるキットであって、試料処理試薬、不溶性担体試薬、及び標識レクチン試薬を含み、前記試料処理試薬が非イオン性界面活性剤を含むキットである。
　試料処理試薬は、非イオン性界面活性剤と、水とを含む。この他に、本発明の趣旨を損なわない範囲で、生理的塩類やｐＨ緩衝剤等の任意の成分を含んでもよい。
　試料処理試薬は、試料と混合する目的で使用される。前述の第一実施形態の前処理液として使用してもよいし、前述の第二実施形態の試料に予め添加する薬剤として使用してもよい。
　不溶性担体試薬は、ヒトガラクトース欠損ＩｇＧを担持した不溶性担体を含み、この他に、本発明の趣旨を損なわない範囲で、水、生理的塩類やｐＨ緩衝剤等の任意の成分を含んでもよい。不溶性担体としては、前述の磁性粒子が好ましいが、この例に制限されず、抗体の担体として知られる種々の公知の不溶性担体であってもよい。
　不溶性担体試薬は、前述の一次反応工程の担体分散液として使用することができる。
　標識レクチン試薬は、前記標識レクチンを含み、この他に、本発明の趣旨を損なわない範囲で、水、生理的塩類やｐＨ緩衝剤等の任意の成分を含んでもよい。
　標識レクチン試薬は、前述の標識工程の標識溶液として使用することができる。
　以下、「％」や「部」の単位は、特に明記しない限り、質量基準の「質量％」や「質量部」を意味する。
［試験の概要］
　以下の試験例で用いる容器は透明プラスチック製の保液槽（容積０．５ｍｌ）を備える。保液槽は反応槽と検出槽を兼ねる。以下で特に明記しない限り、各溶液の温度は３７℃とした。
　まず、保液槽に前処理溶液の所定量（一例では０．１ｍＬ）を分注し、保液槽の内壁面に前処理液を接触させた。
　次に、レクチン結合性の測定対象物質であるＣＡＲＦを含む可能性があり、かつ、レクチン結合性の夾雑物質（非測定対象物質）を含む可能性がある試料溶液の所定量（一例では１０μＬ）を、前処理溶液と混合するようにして保液槽へ分注した。保液槽内にこれらの混合液が得られた。混合液を所定温度、所定時間（一例では３７℃、３．５分）でインキュベートした。
　続いて、ヒトガラクトース欠損ＩｇＧを担持した磁性粒子を所定量で含む担体分散液の所定量（一例では５０μＬ）を保液槽へ分注し、前記混合液とよく混ぜ、一次反応液を得た。
　ＣＡＲＦと前記ＩｇＧとが結合する一次反応のための所定の反応時間（一例では３７℃、２．７分）が経過した後、容器の外側面に磁石を付け、保液槽の内壁面に前記磁性粒子を磁力で吸引した。この状態で、保液槽内の反応液を吸引して、液体を全て除去した。保液槽内に洗浄液を分注し、吸引する洗浄処理を数回行った。
　次に、保液槽に酵素標識されたレクチンを含む標識溶液の所定量（一例では０．１ｍＬ）を分注し、磁石を離して保液槽の内壁面に吸着していた前記磁性粒子を解放し、標識溶液中に分散させ、二次反応液を得た。
　前記磁性粒子に前記ＩｇＧを介して結合したＣＡＲＦに対して、前記レクチンが結合する二次反応のための反応時間（一例では３７℃、４．４分）が経過した後、容器の外側面に再び磁石を付け、保液槽の内壁面に前記磁性粒子を磁力で吸着させた。この状態で、保液槽内の反応液を吸引して、液体を全て除去した。保液槽内に洗浄液を分注し、吸引する洗浄処理を数回行った。
　続いて、保液槽に発光基質を含む酵素基質溶液の所定量（一例では１００μＬ）を分注し、磁石を離して保液槽の内壁面に吸着していた前記磁性粒子を解放し、酵素基質溶液中に分散させ、酵素反応液を得た。
　最後に、前記酵素反応液中で、前記酵素が前記発光基質を分解する際の発光量を測定した。発光量は、前記試料に含まれる測定対象物質の含有量に応じて高くなる。ただし、この発光量は、前記夾雑物質が前記二次反応液に残存していると、真の測光値よりも高くなってしまう。
　本発明に係る実施例にあっては、前記夾雑物質による悪影響を低減するために、前処理液に非イオン性界面活性剤を配合している。
　以下で、各試験例の方法とその結果を示し、種々の非イオン性界面活性剤の効果を示す。
１　化学発光測定法試薬の調製
１－１　反応用緩衝液の調製
　反応用緩衝液（以降、Ｒ１と記載）として、以下の組成の溶液を用いた。
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
　当該組成の溶液を「標準Ｒ１」とする。
１－２　ガラクトース欠損ＩｇＧの調製
　ヒト精製ＩｇＧ抗体（Ｍｅｒｃｋ社製）を０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で透析した。１０ｍｇのヒトＩｇＧ抗体を含む溶液に１ＵのＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加し、３７℃で２４時間静置した。０．５ＵのＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、及び全液量と等量の０．１Ｍリン酸－クエン酸バッファー（９０ｍＭ　Ｎａ２ＨＣＯ３、１０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．０）を添加し、３７℃で４８時間静置した。０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（Ｃｙｔｉｖａ製）に抗体液を添加し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。回収した抗体液を炭酸バッファー（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）で２回透析してガラクトース欠損ＩｇＧ溶液を得た。
１－３　ガラクトース欠損ＩｇＧ固相磁性粒子懸濁液の調製
　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、以下「Ｍ２８０」と記載）２２．５ｍｇを炭酸バッファーで洗浄し、溶液を除去した。２８０ｎｍにおける吸光度が１．１２Ａｂｓとなるように炭酸バッファーで希釈したガラクトース欠損ＩｇＧ溶液０．７５ｍＬを洗浄済みのＭ２８０に添加して２５℃で１８時間撹拌した。２Ｍグリシンを１８７．４μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌した。洗浄液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）０．７５ｍＬで２回洗浄した。溶液中のＭ２８０濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬとなるよう、磁性粒子希釈液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．３３％　スクロース、ｐＨ　８．０）を添加し、ガラクトース欠損ＩｇＧ固相磁性粒子懸濁液（以降、「標準Ｒ２」と記載）を得た。
１－４　グリシン固相磁性粒子懸濁液の調整
　Ｍ２８０　２２．５ｍｇを炭酸バッファーで洗浄し、溶液を除去した。２Ｍグリシンを１８７．４μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌した。洗浄液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）０．７５ｍＬで２回洗浄した。溶液中のＭ２８０濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬとなるよう磁性粒子希釈液を添加し、抗体未結合磁性粒子溶液（以降、「抗体未結合Ｒ２」と記載）を得た。
１－５　ＡＬＰ標識ＲＣＡ１２０溶液の調製
　ＰＢＳで透析した、ヒマシ種子由来のレクチンであるＲＣＡ１２０（Ｖｅｃｔｏｒ社製）に，２０ｍＭ　Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＤＭＳＯで溶解、以下ＳＡＴＡと記載）を、モル比でＲＣＡ１２０：ＳＡＴＡ＝１：２．５となるように添加し、２５℃で３０分間撹拌した。ＲＣＡ１２０－ＳＡＴＡ反応液の液量の１０分の１量のＨｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ溶液（５００ｍＭ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ、２０ｍＭ　ＰＢＳ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を添加し、２５℃で２時間撹拌した。脱塩カラム（ＮＡＰ５カラム，Ｃｙｔｉｖａ社製）に反応液を添加し、ＰＢＳで溶出してチオール基付加ＲＣＡ１２０溶液を得た。ＰＢＳで透析したＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｈｉｇｈｌｙ　ａｃｔｉｖｅ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｒｏｃｈｅ社製、以下ＡＬＰと記載）に、１０ｍＭ　ＳＭ（ＰＥＧ）２（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ　ＳＭＣＣ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＤＭＳＯで溶解）を、モル比でＡＬＰ：ＳＭ（ＰＥＧ）２＝１：２．５となるように添加し、２５℃で３０分間撹拌した。反応液を脱塩カラム（ＮＡＰ５カラム，Ｃｙｔｉｖａ製）に添加し、ＰＢＳで溶出してＡＬＰ－ＳＭＣＣを得た。ＡＬＰ－ＳＭＣＣとチオール基付加ＲＣＡ１２０をモル比１：５で混合し、２５℃で１時間撹拌した。反応液中のＡＬＰ標識ＲＣＡ１２０を、ＡＫＴＡ　ｐｕｒｅＴＭ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　１０／３００ＧＬ（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離し、希釈液（２５ｍＭ　ＭＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２，０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ６．５）で終濃度０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＡＬＰ標識ＲＣＡ１２０溶液（以降、「Ｒ３」と記載）を得た。
２　標準Ｒ１への添加剤追加による非特異反応抑制効果の検証２－１　試料の調製
　互いに異なる検体から採取された血清１０μＬに、検体希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ８．０）４９０μＬを添加し、試料１～１０とラベルした。また、ＲＯ水も試料として用いた。試料中のＣＡＲＦ濃度は、既認証試薬であるピコルミＣＡ・ＲＦ（積水メディカル社製）を用いて測定した。
２－２　測定試薬
　標準Ｒ１に下記終濃度となるように下記の化合物を添加したものをＲ１（前記「前処理溶液」）として用いた。
実施例１：１％　エマルゲン１０８（花王社製）
実施例２：１％　エマルゲン２０２０Ｇ（花王社製）
実施例３：１％　エマルゲン４２０（花王社製）
実施例４：０．１％　エマルゲン１２０（花王社製）
実施例５：１％　エマルゲン１２０（花王社製）
実施例６：１％　エマルゲン１５０（花王社製）
比較例１：追加化合物なし
比較例２：０．１％　Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＰＡ１０８０（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）
比較例３：０．１％　ＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ４０５（日油社製）
比較例４：０．１％　ＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ５０２（日油社製）
比較例５：０．１％　ＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ１００２（日油社製）
比較例６：０．１％　ＣＨＡＰＳ
比較例７：０．０５％　ドデシル硫酸ナトリウム
　上記の各実施例で用いた添加剤は非イオン性界面活性剤であり、各比較例で用いた添加剤は「非イオン性界面活性剤」以外の添加剤である。
　上記の実施例１～６で用いたエマルゲンのシリーズは、いずれもポリオキシエチレンアルキルエーテルである。
２－３　測定方法
　全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（ＬＩＳメディエンス社製、以下ステイシア）を用いて、前述の「試験の概要」に沿って、以下の操作で測定した。
　１０μＬの試料と１００μＬのＲ１を混合し、３７℃で３．５分間インキュベートした。
　５０μＬの前記磁性粒子希釈液を添加し、磁性粒子を含まない疑似の一次反応液を得て、３７℃で２．７分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液（ＢＦ洗浄液（ステイシア用）、製品番号ＲＭ７５Ｗ－００７）で洗浄後、１００μＬのＲ３を添加し、二次反応液を得て、３７℃で４．４分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液で洗浄後、ＡＬＰ基質液を添加して２．７分間インキュベートした後、化学発光を検出した。
２－４　結果
　結果を表１に示す。測定系にはガラクトース欠損ＩｇＧ固相磁性粒子が存在せず、サンドイッチ検出系が成り立たないため、試料中にＣＡＲＦが存在している場合にもＲＯ水を測定した際と近しいカウントを示すことが望ましい。
　添加剤を加えていない比較例１では、有意なカウント上昇を認め、反応容器かつ検出容器であるキュベット（前記「保液槽」）にＣＡＲＦ、又は検体由来のＲＣＡ１２０結合性成分が吸着することによる非特異反応が生じていると考えられた。
　Ｒ１に非イオン性界面活性剤を添加した実施例１～６で、全試料において当該非特異反応によるカウント上昇が抑制され、比較例１と比べてカウントが１／２未満となった。特にＨＬＢが１６未満の非イオン性界面活性剤を添加した実施例１～５での非特異反応抑制効果が高かった。
　一方で、両親媒性ポリマーを添加した比較例２、アニオン性側鎖ポリマーを添加した比較例３、カチオン性側鎖ポリマーを添加した比較例４、疎水性側鎖ポリマーを添加した比較例５、両親媒性界面活性剤を添加した比較例６、陰イオン性界面活性剤を添加した比較例７では、全試料に一貫した非特異反応によるカウント抑制効果を認めなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３　Ｒ１への添加剤濃度による非特異反応抑制効果の検証３－１　試料の調製
　２－１と同様にして試料１１～１５を調製した。
３－２　測定試薬
　実施例３～５のＲ１をそのまま用いた。また、標準Ｒ１に、下記の終濃度となるように下記の化合物を添加したものをＲ１として用いた。
　実施例７：０．０５％　エマルゲン１２０（花王社製）
　実施例８：０．２０％　エマルゲン１２０
　実施例９：０．０５％　エマルゲン４２０
　実施例１０：０．１０％　エマルゲン４２０
　実施例１１：０．２０％　エマルゲン４２０
３－３　測定方法
　全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（ＬＩＳメディエンス社製、以下ステイシア）を用いて、前述の「試験の概要」に沿って、以下の操作で測定した。
　１０μＬの試料と１００μＬのＲ１を混合し、３７℃で３．５分間インキュベートした。
　５０μＬの前記抗体未結合Ｒ２を添加し、ガラクトース欠損ＩｇＧを有しない磁性粒子を含んだ疑似の一次反応液を得て、３７℃で２．７分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液で洗浄後、１００μＬのＲ３を添加し、二次反応液を得て、３７℃で４．４分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液で洗浄後、ＡＬＰ基質液を添加して２．７分間インキュベートした後、化学発光を検出した。
３－４　結果
　結果を表２に示す。測定系にはガラクトース欠損ＩｇＧ抗体が存在せず、サンドイッチ検出系が成り立たないため、試料中にＣＡＲＦが存在している場合にもＲＯ水を測定した際と近しいカウントを示すことが望ましい。
　添加剤を加えていない比較例１では、有意なカウント上昇を認め、キュベット（前記「保液槽」）や磁性粒子表面にＣＡＲＦ等が吸着することによる非特異反応が生じていると考えられた。
　実施例３～５および７～１１では当該非特異反応が抑制され、比較例１と比べてカウントが１／２未満となった。また、非イオン性界面活性剤添加濃度上昇に伴って非特異反応によるカウントは低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
４　Ｒ１～Ｒ３に添加剤を追加した際の非特異反応抑制効果の比較４－１　試料の調製
　２－１と同様にして試料１６～２４を調製した。
４－２　測定試薬
［実施例１２］
　標準Ｒ１に１％　エマルゲン４２０（花王社製）を添加したものをＲ１（前記「前処理溶液」）として用いた。１－３の標準Ｒ２を用いた。１－５のＲ３をそのまま用いた。
［比較例８］
　標準Ｒ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３の磁性粒子希釈液（抗体無し）を用いた。１－５のＲ３をそのまま用いた。
［比較例９］
　標準Ｒ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３の磁性粒子希釈液（抗体無し）に１％　エマルゲン４２０（花王社製）を添加して用いた。１－５のＲ３をそのまま用いた。
［比較例１０］
　標準Ｒ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３の磁性粒子希釈液（抗体無し）をそのまま用いた。１－５のＲ３に１％　エマルゲン４２０（花王社製）を添加して用いた。
４－３　測定方法
　４―２の試薬を用い、２－３と同様の操作で測定した。
４－４　結果
　結果を表３に示す。標準Ｒ１に非イオン性界面活性剤を添加した実施例１２では、非イオン性界面活性剤非添加の比較例８と比べて顕著に非特異反応によるカウント上昇が抑制された。これに対し、Ｒ２、Ｒ３に非イオン性界面活性剤を添加した比較例９、１０では非特異反応抑制効果が十分ではなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
５　検体希釈液への非イオン性界面活性剤添加による非特異反応抑制効果検証５－１　試料の調製
　実施例１３の試料の調製を次の通り行った。
　前記検体希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ８．０）に、１％エマルゲン４２０を添加した検体希釈液Ｓを準備した。
　前述の実施例１２で使用したのと同じ血清１０μＬに、検体希釈液Ｓの５００μＬをそれぞれ添加し、試料１６～２４とした。また、ＲＯ水も試料として用いた。試料中のＣＡＲＦ濃度はピコルミＣＡ・ＲＦ（積水メディカル社製）を用いて測定した。
５－２　測定試薬
５－３　測定方法
　次の試薬を用い、２－３と同様の操作で測定した。
［実施例１３］
　標準Ｒ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３の磁性粒子希釈液を用い、疑似の一次反応液を得た。１－５のＲ３をそのまま用い、二次反応液を得た。
［実施例１２（再試験）］
　４－１と同じ試料を用い、４－２と同じ試薬を用い、２－３と同様の操作で、再度測定した。
［比較例８（再試験）］
　４－１と同じ試料を用い、４－２と同じ試薬を用い、２－３と同様の操作で、再度測定した。
５－４　結果
　実施例１３の結果を、再度行った実施例１２、比較例８の結果と合せて、表４に示す。
　検体希釈液に非イオン性界面活性剤を添加した実施例１３で、標準Ｒ１に非イオン性界面活性剤を添加した実施例１２と同等の非特異反応抑制効果を認めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
６　非イオン性界面活性剤添加による同時再現性への影響検証６－１　試料の調製
　２－１と同様に試料２５～２８を調製した。
６－２　測定試薬
［実施例１４］
実施例４のＲ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３で調製したＲ２を用いた。１－５で調製したＲ３を用いた。
［実施例１５］
実施例１０のＲ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３で調製したＲ２を用いた。
１－５で調製したＲ３を用いた。
［比較例１１］
標準Ｒ１を前記「前処理溶液」として用いた。１－３で調製したＲ２を用いた。１－５で調製したＲ３を用いた。
６－３　測定方法
　全自動臨床検査システムＳＴＡＣＩＡ（ＬＩＳメディエンス社製、以下ステイシア）を用いて、前述の「試験の概要」に沿って、以下の操作で測定した。
　１０μＬの試料と１００μＬのＲ１を混合し、３７℃で３．５分間インキュベートした。
　５０μＬのＲ２を添加し、一次反応液を得て、３７℃で２．７分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液で洗浄後、１００μＬのＲ３を添加し、二次反応液を得て、３７℃で４．４分間インキュベートした。
　ＢＦ洗浄液で洗浄後、ＡＬＰ基質液を添加して２．７分間インキュベートした後、化学発光を検出した。
　ＣＡＲＦ濃度が既知の試料を測定した際のカウント値とＣＡＲＦ濃度をプロットして作成した検量線により、検出した化学発光値から試料中のＣＡＲＦ濃度を算出した。
６－４　結果
　表５に結果を示す。ＣＡＲＦ濃度が低い試料２５を含むすべての試料を測定した際の変動係数（Ｃ．Ｖ．）が、標準Ｒ１に非イオン性界面活性剤を添加した実施例１４、１５で良好であった。比較例１１ではＣＡＲＦ濃度が低い試料２５を測定した際に測定値のばらつきが大きかった。
　これらの結果から、本発明に係る実施例にあっては、非イオン性界面活性剤の添加による非特異吸着抑制により、測定値の同時再現性の向上効果が得られることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (7)

  1. 　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法であって、
    　容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む前処理溶液を分注する工程と、
    　前記保液槽に試料を分注する工程と、
    　前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程と、をこの順番で含む処理方法。
  2. 　前記保液槽に、前記測定対象物質に結合する物質を固定化した不溶性担体を含む担体溶液を分注する工程を含む請求項１に記載の処理方法。
  3. 　前記試料が、前記測定対象物質とは異なり、かつ、前記標識レクチンに結合可能な夾雑物質を含む請求項１に記載の処理方法。
  4. 　前記標識レクチンが、レクチンを酵素標識した物質である請求項１に記載の処理方法。
  5. 　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテルである請求項１に記載の処理方法。
  6. 　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するための処理方法であって、
    　容器の反応槽と検出槽とを兼ねる保液槽に非イオン性界面活性剤を含む試料を分注する工程と、
    　前記保液槽に標識レクチンを含む標識溶液を分注する工程と、をこの順番で含む処理方法。
  7. 　試料中のレクチン結合性の測定対象物質をヘテロジニアス法で光学的に検出するために使用されるキットであって、試料処理試薬、不溶性担体試薬、及び標識レクチン試薬を含み、前記試料処理試薬が非イオン性界面活性剤を含むキット。
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