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WO2013002193A1 - 界面活性剤を使用した非特異吸着防止処理がなされている分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ、当該センサーチップの製造方法、および当該センサーチップを使用する分子間相互作用測定方法 - Google Patents

界面活性剤を使用した非特異吸着防止処理がなされている分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ、当該センサーチップの製造方法、および当該センサーチップを使用する分子間相互作用測定方法 Download PDF

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WO2013002193A1
WO2013002193A1 PCT/JP2012/066209 JP2012066209W WO2013002193A1 WO 2013002193 A1 WO2013002193 A1 WO 2013002193A1 JP 2012066209 W JP2012066209 W JP 2012066209W WO 2013002193 A1 WO2013002193 A1 WO 2013002193A1
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WO
WIPO (PCT)
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sensor chip
surfactant
intermolecular interaction
measurement
measuring
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2012/066209
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English (en)
French (fr)
Inventor
義一 栗原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Advanced Layers Inc
Original Assignee
Konica Minolta Advanced Layers Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Advanced Layers Inc filed Critical Konica Minolta Advanced Layers Inc
Publication of WO2013002193A1 publication Critical patent/WO2013002193A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction

Definitions

  • the present invention relates to a non-labeled intermolecular interaction measurement method, particularly RIFS (Reflectometric Interference Spectroscopy) and non-specific adsorption to the sensor chip.
  • RIFS Reflectometric Interference Spectroscopy
  • a sensor chip in which one molecule (ligand, eg, antibody) involved in the intermolecular interaction is immobilized on the surface is used, and this ligand is involved in the intermolecular interaction.
  • the other molecule analyte, for example, antigen
  • various molecules other than the analyte contained in the sample solution are often non-specific on the surface of the sensor chip due to electrostatic interactions and hydrophobic interactions. Adsorbs. Such non-specific adsorption causes a signal that becomes noise in the measurement method based on the intermolecular interaction, and causes a decrease in measurement accuracy.
  • the surface of the sensor chip is treated with a substance for suppressing nonspecific adsorption (nonspecific adsorption inhibitor) before contacting the sample solution. ing.
  • Patent Document 1 proteins represented by BSA and the like are commonly used as non-specific adsorption inhibitors in intermolecular interaction measurement methods and measurement methods targeting other biological substances
  • Patent Document 2 heparin, dextran sulfate and the like have been proposed for use as blocking agents
  • Patent Document 3 Various polymers such as a specific acrylamide polymer (Patent Document 3) have also been proposed for use as non-specific adsorption inhibitors.
  • the ligand immobilized on a certain sample is used. After the analyte is bound and measured, the analyte bound to the ligand is peeled off using the regeneration solution, and the analyte is bound to the immobilized ligand for the next sample. In addition, measurement may be repeatedly performed using a single sensor chip.
  • Non-Patent Document 1 when conventional BSA or the like is used as a blocking agent, it is known that when a regeneration solution is added, not only the analyte peels from the ligand, but also the blocking agent partially peels from the sensor chip surface ( Non-Patent Document 1), the effect of the blocking agent is diminished, and the measurement value may be varied to impair measurement accuracy. In this case, it is conceivable to add a blocking treatment step to replenish the peeled blocking agent, but this is not preferable because it complicates the measurement step.
  • the blocking agent not only coats the site on the sensor chip surface where the ligand is not immobilized, but also coats the ligand in a superimposed manner. In exchange for the effect of preventing local adsorption, there is a possibility that the intermolecular interaction between the ligand and the analyte may be inhibited. Taking into consideration that a polymer is generally defined as having a molecular weight of 10,000 or more, it is considered that inhibition of intermolecular interaction occurs like a blocking agent such as BSA due to the size of the molecule.
  • the present invention provides improved non-specific adsorption prevention that does not cause problems such as peeling caused by contact with a regenerating solution and inhibition of intermolecular interaction between a ligand and an analyte, as seen with conventional blocking agents such as BSA. It is an object of the present invention to provide an intermolecular interaction measurement means that can use an agent.
  • the present inventors have used a surfactant, for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate known as a trade name “Tween 20” in general solutions in various solutions used in conventional methods for measuring intermolecular interactions. It has been found that by treating the surface of the sensor chip with an aqueous solution containing a concentration lower than the concentration, the surface can be coated with the surfactant and function as a nonspecific adsorption inhibitor. Furthermore, it has been found that such a surfactant as a nonspecific adsorption inhibitor does not cause problems such as peeling due to contact with a regeneration solution and inhibition of intermolecular interaction between a ligand and an analyte. It came to complete.
  • a surfactant for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate known as a trade name “Tween 20” in general solutions in various solutions used in conventional methods for measuring intermolecular interactions. It has been found that by treating the surface of the sensor chip with an aqueous solution containing a concentration lower than the
  • the present invention includes the following inventions.
  • the nonionic surfactant is selected from polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate and polyoxyethylene sorbitan trioleate.
  • each of the regeneration treatment step (B) and the further sample solution contact step (A) in which the regeneration solution for peeling the analyte bound to the ligand is brought into contact is performed at least once.
  • the intermolecular interaction according to [7] or [8], wherein the sample solution, the regeneration solution, or both further contains the surfactant described in any one of [1] to [3].
  • Action measurement method. [10] The method according to any one of [7] to [9], wherein the concentration of the surfactant contained in the sample solution, the regeneration solution, or both is 0.0001 wt% or more and 0.1 wt% or less.
  • the treatment of the sensor chip surface with the surfactant is first carried out as a predetermined non-specific adsorption prevention treatment step, but even after the regeneration treatment step, the surfactant coated on the sensor chip surface is Since it does not peel substantially (so as to affect the measurement value), the measurement can be continued using the same sensor chip without reducing the measurement accuracy without providing an additional non-specific adsorption prevention treatment step.
  • the intermolecular interaction between the ligand immobilized on the sensor chip surface and the analyte is not inhibited, so that the measurement sensitivity can be improved.
  • a surfactant having a molecular weight not as large as that of a protein such as BSA is used at a low concentration, so that there is no adverse effect on the measurement other than the aqueous solution used for the non-specific adsorption prevention treatment step. They may be used while dissolved in a sample solution or a stripping solution, and the effect of preventing nonspecific adsorption can be further maintained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of an embodiment of the present invention of an intermolecular interaction measurement method based on RIfS.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time of the measured value ( ⁇ ) obtained in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time of the measured value ( ⁇ ) obtained in Comparative Example 1.
  • the sensor chip for the intermolecular interaction measurement method used in the present invention is provided with a layer made of SiN, Ta 2 O 5 , Nb 2 O 5 , HfO 2 , ZrO 2 or ITO (indium tin oxide). is there. These layers refer to an optical thin film formed on the outermost surface of an unmodified sensor chip for RIfS.
  • the intermolecular interaction measurement method is not limited to RIfS, but “a layer made of SiN, Ta 2 O 5 , Nb 2 O 5 , HfO 2 , ZrO 2 or ITO (indium tin oxide). As long as the sensor chip is formed on the surface, the present invention can be applied to a method for measuring intermolecular interactions other than RIfS.
  • a ligand is immobilized on at least a part of the surface of a predetermined layer (optical thin film) as described above, and this measures a predetermined signal. It is considered as a measurement site.
  • non-specific adsorption prevention treatment is performed on such a measurement site by forming a film made of a surfactant (covering with a surfactant).
  • the method of non-specific adsorption prevention treatment that is, the method of forming a film comprising a surfactant is not particularly limited, but there is a method in which an aqueous solution of a surfactant is brought into contact with a measurement site according to the procedure described below. Is preferred.
  • a surfactant is used as a non-specific adsorbent, that is, a substance that covers the surface of the measurement member in order to prevent non-specific adsorption of a biological substance. Any one of the surfactants exemplified below may be used alone, or two or more thereof may be mixed and used as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Surfactants include ionic surfactants, including anionic (anionic) surfactants, cationic (cationic) surfactants and amphoteric surfactants, and nonionic (nonionic) surfactants.
  • a nonionic surfactant is suitable as the nonspecific adsorption inhibitor.
  • Nonionic surfactants include those of an ester ether type, an ester type, an ether type, etc. Among them, an ester ether type is preferable.
  • ester ether type nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., trade name “Tween 20”), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (“Tween 40”), poly Examples thereof include oxyethylene sorbitan monostearate (same “Tween 60”), polyoxyethylene sorbitan monooleate (same “Tween 80”), and polyoxyethylene sorbitan trioleate (same “Tween 85”).
  • ester ether type nonionic surfactant products have an average number of polyoxyethylenes in one molecule of about 20, and the number of polyoxyethylenes in one molecule is assumed to be 20.
  • the molecular weight is 2000 or less in all cases.
  • ether type nonionic surfactant examples include diethylene glycol monododecyl ether, ethylene glycol monododecyl ether, polyethylene glycol monocetyl ether (n ⁇ 23, where n is the number of oxyethylene units, the same applies hereinafter), polyethylene glycol Examples thereof include monododecyl ether (n ⁇ 25), polyethylene glycol mono-4-octylphenyl ether (n ⁇ 10), tetraethylene glycol monododecyl ether, and triethylene glycol monododecyl ether.
  • the sensor chip for the intermolecular interaction measurement method of the present invention that has been subjected to non-specific adsorption prevention treatment using a surfactant is the surface of the predetermined layer (optical thin film). It can be produced through a non-specific adsorption preventing treatment step in which the measurement site where the ligand is immobilized is brought into contact with the surfactant aqueous solution so that the measurement site is coated with the surfactant.
  • the surfactant as a nonspecific adsorption inhibitor as described above is designed to cover the measurement site by bringing the aqueous solution into contact with the measurement site and to exhibit the performance of preventing nonspecific adsorption. Become.
  • bringing the aqueous solution of the surfactant into contact with the measurement site is a method for preventing nonspecific adsorption of the measurement site by coating the measurement site with the surfactant.
  • the concentration of the surfactant aqueous solution used in the non-specific adsorption preventing treatment step can be appropriately adjusted according to the type of the surfactant and the length of the treatment time. % Or less, more preferably 0.05% by weight or less, preferably 0.01% by weight or less, and generally 0.0001% by weight or more, preferably 0.001% by weight or more.
  • concentration of the surfactant is lower than the above lower limit, or when the concentration is higher than the upper limit although the detailed reason is unknown, there is a possibility that the nonspecific adsorption preventing ability is not exhibited.
  • the concentration of the surfactant is higher than the above upper limit value, bubbles are likely to be generated in the closed flow path, which increases the possibility of adversely affecting the liquid feeding system.
  • aqueous solution of the surfactant there is no particular limitation on the method of bringing the aqueous solution of the surfactant into contact, and the aqueous solution may be brought into contact (moving down), or the aqueous solution may be brought into contact in a stationary state.
  • a sensor chip in use as shown in FIG. 1 is formed by immobilizing a ligand on the surface of an optical thin film and then forming an aqueous solution of a nonspecific adsorption inhibitor by a flow cell. It is preferable that the non-specific adsorption preventing treatment is performed by bringing it into contact with the surface of the sensor chip by introducing from the closed flow path.
  • Such an embodiment requires a shorter time to reach a sufficient level (equilibrium) with the non-specific adsorption preventing ability test substance (A) compared to the latter embodiment described below.
  • a sensor chip in which a ligand is immobilized on the surface of an optical thin film in advance may be simply immersed in an aqueous solution of a nonspecific adsorption inhibitor contained in a container.
  • the treatment time that is, the contact time between the sensor chip surface and the surfactant aqueous solution is not particularly limited, but the time until the sensor chip surface is sufficiently coated with the surfactant (saturation is reached). It is appropriate to ensure
  • the measurement value obtained by the intermolecular interaction measurement method starts to be acquired before the start of the processing step and continuously acquired thereafter.
  • the measured value changes with the lapse of processing time (normally the bottom peak wavelength shifts to the long wavelength side in RIfS), and through the observation of such change, the non-specific adsorption prevention process proceeds, and the surface of the sensor chip is exposed to the surfactant. It can be confirmed at any time how the film is formed. Eventually, the measured value will not change or the fluctuation will be sufficiently small, so that it can be determined that the surface of the sensor chip has reached the saturation point, and the non-specific adsorption prevention treatment process is completed. be able to.
  • the method for producing a sensor chip for the intermolecular interaction measurement method of the present invention which has been subjected to a nonspecific adsorption prevention treatment using a surfactant, is a nonspecific adsorption prevention treatment as described above.
  • various conventional steps can be included.
  • the surface of the sensor chip (optical thin film) is unmodified at the beginning of manufacture, and it is necessary to immobilize a ligand corresponding to the analyte prior to contact with the analyte.
  • the mode of the step of immobilizing the ligand on the surface of the sensor chip is not particularly limited, and can be performed by employing various known methods.
  • the surface of an unmodified optical thin film eg, SiN
  • a silane coupling agent having an amino group at the end to be modified with an amino group
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the sensor chip with the ligand immobilized on the surface is prepared by binding biotin to the amino group and reacting this biotin with avidin and then reacting with a biotinylated ligand (eg, antibody). can do.
  • a sensor chip having the ligand immobilized on the surface can also be produced by reacting an amino group-containing ligand (typically a protein such as an antibody). .
  • Various treatments for immobilizing such ligands are performed by setting a measuring member consisting of an unmodified sensor chip and flow cell on the detection device, and then sequentially feeding reagents and washing solutions for the treatment. It is also possible to carry out a part of the processing before setting the measurement member on the detection device and to perform the remaining processing after the setting.
  • the measuring device 1 for the intermolecular interaction measuring method mainly includes a measuring member 10, a white light source 20, a spectroscope 30, a light transmission unit 40, a control device 50, and the like.
  • the white light source 20, the spectroscope 30, the light transmission unit 40, and the like are preferably housed in the measurement device main body, and a control device 50 in the form of a PC (Personal Computer), for example, is controllably connected to the measurement device main body. Is done.
  • the measuring member 10 is generally rectangular, and preferably has a form that can be attached to and detached from the measuring apparatus main body.
  • the measurement member 10 is configured based on the sensor chip 12 including at least the substrate 12a and the optical thin film 12b formed on the substrate 12a. Usually, the measurement member 10 further sends various solutions such as the sample solution 60 including the analyte 62.
  • the flow cell 14 is loaded on the sensor chip 12 in order to form the sealed flow path 14b for liquid.
  • the measuring member 10 (sensor chip 12 and flow cell 14) can be of a disposable type.
  • the substrate 12a is typically a Si (silicon) substrate
  • the optical thin film 12b is typically a SiN (silicon nitride) film.
  • the substrate 12a is preferably made of, for example, Si (silicon).
  • the optical thin film 12b is formed of a material having a refractive index and a thickness that is selected according to the material (refractive index) of the substrate and has a bottom peak observed when white light is used. Is done.
  • the substrate 12a is a Si substrate
  • the optical thin film 12b is an oxide film or nitride film such as SiN, Ta 2 O 5 , Nb 2 O 5 , HfO 2 , ZrO 2 , ITO (indium tin oxide). Is preferable, and a SiN film is particularly preferable.
  • Each of these oxide films or nitride films has a refractive index of 1.8 to 2.4 in the visible light region (wavelength range of about 400 to 800 nm), and exhibits performance as an optical thin film formed on the upper layer of the Si substrate.
  • the optical thin film itself has an effect of suppressing nonspecific adsorption to some extent. For example, by setting the thickness of the SiN film to about 45 to 90 nm, the bottom peak can be adjusted to a range of about 400 nm to 800 nm.
  • the flow cell 14 is a transparent member made of, for example, silicone rubber (polydimethylsiloxane: PDMS), and can be brought into close contact with the sensor chip 12.
  • the flow cell 14 is formed with at least one groove 14a.
  • a sealed flow path 14b is formed. Both ends of the groove 14a are exposed from the surface of the flow cell 14, and one end is connected to a liquid feeding part (for example, a syringe pump) to function as an inlet 14c to which various solutions such as the sample solution 60 are supplied.
  • the other end is connected to the waste liquid section and functions as an outlet 14d for various solutions such as the sample solution 60.
  • a ligand 16 that binds to the analyte 62 is immobilized on at least a part of the surface of the sensor chip 12 (upper layer of the optical thin film 12b) located at the bottom of at least one groove 14a of the flow cell 14. Measurement is performed at.
  • an appropriate substance that specifically binds to the analyte 62 to be analyzed is selected.
  • the protein serving as its antibody is a nucleic acid having a complementary base sequence if the analyte 62 is a nucleic acid, and if the analyte 62 is a sugar, A binding lectin (protein) or the like is used as the ligand 16.
  • the light transmission unit 40 is a first optical fiber 41 serving as a first light transmission path for guiding white light from the white light source 20 to the measurement unit 200, and irradiation of white light from the first optical fiber 41.
  • a second optical fiber 42 as a second light transmission path for guiding the reflected light from the measurement unit 200 to the spectroscope 30.
  • the end of the first optical fiber 41 on the white light source 20 side is connected to the connection port of the white light source 20.
  • the optical fiber 41 connected to the connection port is arranged so that the light incident end face faces the halogen lamp 21.
  • the end of the second optical fiber 42 on the spectroscope 30 side is connected to a connection port that receives light from the spectroscope 30.
  • Each of the optical fibers 41 and 42 has a structure in which fine fibers are bundled. And the edge part by the side of the flow cell 14 of the 1st optical fiber 41 and the 2nd optical fiber 42 is faced compoundly so that each fine fiber may become one bundle. That is, the fine fibers constituting the first optical fiber 41 are distributed in the center on the end face on the flow cell 14 side, and the fine fibers constituting the second optical fiber 42 are bundles of fine fibers of the first optical fiber 41. It is distributed around it to surround it.
  • the white light source 20 is composed of a halogen lamp and a housing for storing the halogen lamp.
  • the housing is provided with a connection port for connecting the first optical fiber 41.
  • a white light source is used.
  • the present invention is not limited to this, and any light source may be used as long as it emits light distributed over a wavelength range where a change in reflectance minimum wavelength described later can be detected.
  • the white light source 20 When the white light source 20 is turned on, the white light is irradiated onto the measuring unit 200 via the first optical fiber 41, and the reflected light is guided to the spectroscope 30 via the optical fiber 42.
  • the spectroscope 30 detects the light intensity of the light at fixed wavelength intervals included in the light received by the light receiving unit, and outputs the light intensity to the control device 50 as the spectral intensity.
  • reflected light from the measurement member 10 is received by the spectroscope 30 (reflection type RIfS).
  • a light transmissive member is used as the measurement member 10 and the white light source 20 is used. It is also possible to arrange the spectroscope 30 so as to irradiate the measurement member 10 with the light and to receive the light transmitted through the measurement member 10 and to detect the spectral intensity of the transmitted light.
  • the control device 50 receives an input of detection operation execution from the operator, and outputs a detection operation control execution command to the measurement device 10. Thereby, the control apparatus 50 functions as a control part.
  • control device 50 also functions as a calculation unit.
  • the control device 50 acquires the spectral intensity data of the measurement light from the spectroscope 30 and calculates the reflectance for each wavelength band by dividing the spectral intensity of the measurement light by the spectral intensity of the white light as a reference.
  • the spectral intensity data of the reference light may be previously measured and held at the time of device assembly adjustment, or may be acquired by other means, for example, every measurement.
  • a reflection spectrum is created based on the calculated reflectance, and the reflectance minimum wavelength ( ⁇ ) is determined. It is also possible to obtain the measured change amount ( ⁇ ) of the minimum reflectance wavelength with respect to a certain minimum reflectance wavelength (baseline).
  • the waveform of the reflection spectrum usually has an irregular shape in which minute irregularities are repeated, and it may be difficult to calculate and specify the reflectance minimum wavelength.
  • the waveform is smoothed, and the solution (minimum value) is obtained from the high-order polynomial, and this can be specified as the value of the minimum reflectance wavelength. .
  • a microcomputer (not shown) performs control to switch on / off the white light source 20 according to a control command of the control device 50, or performs temperature control of a temperature control unit according to a set temperature command of the control device 50. To do.
  • the temperature adjusting means includes, for example, a temperature adjusting element that performs heating and cooling, such as a Peltier element, and a temperature detecting element, which are attached to the measuring member 10. And the control apparatus 50 detects the temperature of the measurement member 10 with a temperature detection element through a microcomputer, and performs temperature control so that it may become preset temperature by the heating or cooling by a temperature control element.
  • the measurement member 10 When performing detection, the measurement member 10 is warmed up in advance. That is, the control device 50 sends a command to the microcomputer so that the preset temperature is set in advance, and the microcomputer performs temperature control of the temperature control unit. The analysis is started after the temperature of the measurement member 10 is stabilized by the warm air.
  • Control device 50 determines whether or not to continue the measurement, and if not, ends the process.
  • the measurement time may be set in advance, and it may be determined whether or not the measurement time has elapsed, or the measurement end input is set as a setting for continuing the measurement until the measurement end input is received. The presence or absence may be determined.
  • the control device 50 periodically calculates the reflectance, creates a reflection spectrum and determines the minimum reflectance wavelength, and records the time-series change.
  • the intermolecular interaction measurement method is a sample solution contact step (A) in which a sample solution containing at least an analyte and a nonspecific adsorbate is brought into contact with a measurement site that has been subjected to nonspecific adsorption prevention treatment. including.
  • the analyte 62 is a substance that specifically binds to the immobilized ligand 16.
  • biomolecules such as proteins (including polypeptides, oligopeptides, etc.), nucleic acids (including DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc.), lipids, sugars, drug substances, endocrine disruptions
  • the analyte 62 can be a foreign substance that binds to a biomolecule such as a chemical substance, or other bio-related substance.
  • a tumor marker for example, ⁇ -fetoprotein
  • present in blood which is an important index in cancer diagnosis or the like, is an example of an important analyte.
  • the sample solution containing or possibly containing the analyte 62 to be used in the intermolecular interaction measurement method is generally prepared from a specimen collected from a living body.
  • specimens include blood (serum / plasma) collected from humans and non-human animals (eg, mammals), urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.) It is done.
  • a specimen may be mixed with various liquids (pure water, physiological saline, buffer solution, reagent solution, etc.) or used as a sample solution after purification treatment, if necessary.
  • Such sample solutions usually contain a wide variety of non-specific adsorbates, especially biomolecules.
  • Typical biomolecules as non-specific adsorbents include proteins, nucleic acids, sugars, and other various biological materials.
  • the surfactant used as the non-specific adsorption inhibitor in the present invention can prevent or sufficiently suppress non-specific adsorption of such a substance to the sensor chip surface.
  • the sample solution may further contain the same surfactant as that used in the non-specific adsorption prevention treatment step.
  • concentration of the surfactant contained in the sample solution is preferably adjusted as appropriate within the same range as the aqueous solution used in the non-specific adsorption prevention treatment step.
  • the regeneration solution as described above is known, and for example, a glycine-HCl solution can be used.
  • the regeneration solution may further contain the same surfactant as that used in the nonspecific adsorption prevention treatment step.
  • concentration of the surfactant contained in the regeneration solution is preferably adjusted as appropriate within the same range as the aqueous solution used in the non-specific adsorption prevention treatment step.
  • the regeneration process step (B) and the sample solution contact step (A) can be repeated to continue the measurement.
  • the regeneration solution contains a surfactant, even if a part of the surfactant covering the surface of the sensor chip is peeled off in the regeneration step, the surfactant in the regeneration solution immediately compensates for the peeling, It is possible to proceed to the next analyte contacting step in a state where the surfactant film is sufficiently formed (saturated state).
  • Example 1 (1. Production process of unmodified sensor chip) On the silicon wafer (100), SiN (silicon nitride) was deposited by CVD to a thickness of 66.5 nm to produce an unmodified sensor chip having an optical thin film made of SiN on the outermost surface.
  • SiN silicon nitride
  • the NHS manufactured by ThermoFisher Scientific KK
  • WSC manufactured by dojindo
  • 25 mM MES buffer pH 5.0
  • the sensor chip modified with the carboxyl group by the above process was immersed at room temperature for 20 minutes to produce a sensor chip in which the carboxyl group was activated esterified. After washing the sensor chip with ultrapure water, water droplets were removed by air blowing.
  • AFP anti- ⁇ fetoprotein
  • the RifS type intermolecular interaction measuring device (trade name “MI-Affinity”, manufactured by Konica Minolta Opto) was turned on and waited for about 20 minutes until the light source was stabilized.
  • a flow cell (manufactured by Konica Minolta Opto Co., Ltd.) having a groove 2.5 mm wide ⁇ 16 mm long ⁇ 0.1 mm deep and a through hole having a diameter of 1 mm at both ends of the groove on the antibody-immobilized sensor chip.
  • the measurement member in which the closed flow path was formed was constructed.
  • the measurement member is set in the measurement device, and a syringe pump (Econoflo 70-2205; manufactured by Harvard Apparatus) is used to send liquid from the outside of the measurement device to the sealed channel through the chip cover provided in the measurement device, The chip surface was brought into contact with the chip surface.
  • a treatment solution was prepared by adjusting “Tween 20” (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), which is a surfactant as a non-specific adsorption inhibitor, to a concentration of 0.001% by weight using the PBS buffer.
  • This non-specific adsorption inhibitor treatment solution was introduced into the closed flow path of the measurement member for 20 minutes at a liquid feed rate of 20 ⁇ L / min by the syringe pump, and the analyte (anti-AFP antibody) was immobilized by the above step.
  • a second analyte contact step was performed in the same manner as in the seventh step after 3000 seconds and 3600 seconds from the start of the measurement by the intermolecular interaction measuring apparatus.
  • a second regeneration solution treatment step was performed in the same manner as in the eighth step, 4200 seconds after the start of the measurement by the intermolecular interaction measuring apparatus.
  • FIG. 2 shows a graph showing the change over time of the measured value ( ⁇ ) obtained in Example 1 (7th to 10th steps).
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time of the measured value ( ⁇ ) obtained in Comparative Example 1 (seventh to tenth steps).
  • Example 1 (FIG. 3) using Tween 20 has a higher response ( ⁇ ) at the time of introduction of the analyte and higher sensitivity. You can see that. Further, in Comparative Example 1 (FIG. 2), the baseline after the treatment with the regeneration solution is lower than the initial baseline, and it can be seen that the BSA covering the surface of the sensor chip occurred. On the other hand, in Example 1 (FIG. 3), the baseline after the treatment with the regeneration solution is not lowered from the initial baseline, and is maintained at almost the same level, and the surfactant is peeled off. Even if peeling occurs, it is considered that the surfactant is immediately replenished by the surfactant contained in the treatment liquid. Therefore, it can be said that it is an excellent non-specific adsorption inhibitor that can withstand repeated use.

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Abstract

　本発明は、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさない、改善された非特異吸着防止剤を利用することのできる分子間相互作用測定手段を提供する。本発明に係る分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法は、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする。前記界面活性剤としてはノニオン性界面活性剤が好ましい。前記界面活性剤の水溶液の濃度は、０．０００１重量％以上０．１重量％以下が好ましい。

Description

界面活性剤を使用した非特異吸着防止処理がなされている分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ、当該センサーチップの製造方法、および当該センサーチップを使用する分子間相互作用測定方法
　本発明はノンラベルの分子間相互作用測定方法、特にＲＩｆＳ（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）と、そのセンサーチップに対する非特異吸着に関する。
　近年、ノンラベルの分子間相互作用測定方法、すなわち、生体分子や有機高分子などの分子間相互作用により発生するシグナルを測定することにより、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることなく、測定対象物を直接的かつ定量的に検出する方法の研究開発が進められている。たとえば、光学薄膜の干渉色変化を利用する検出法であるＲＩｆＳ（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）が提案され、実用化もされている。その他にも、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴）やＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance：水晶発振子マイクロバランス）などの分子間相互作用測定方法も知られている。
　上記のような分子間相互作用測定方法においては、分子間相互作用に関与する一方の分子（リガンド、たとえば抗体）を表面に固定化したセンサーチップが用いられ、このリガンドに分子間相互作用に関与するもう一方の分子（アナライト、たとえば抗原）を分子間相互作用により特異的に結合させるようにする。しかしながら、そのような所期の分子間相互作用以外にも、静電的相互作用や疎水性相互作用によって、試料溶液中に含まれるアナライト以外の各種の分子がしばしばセンサーチップの表面に非特異的に吸着する。このような非特異吸着は、分子間相互作用に基づく測定法においてノイズとなるシグナルを発生させ、測定精度を低下させる原因となる。そのため、従来は通常、センサーチップの表面にリガンドを固定化した後、試料溶液を接触させる前に、非特異吸着を抑制するための物質（非特異吸着防止剤）でセンサーチップの表面を処理している。
　分子間相互作用測定方法やその他の生体関連物質を対象とした測定方法において、非特異吸着防止剤としては、いわゆるブロッキング剤と呼ばれている、ＢＳＡに代表されるタンパク質などが慣用されており（たとえば特許文献１）、ヘパリンやデキストラン硫酸などもブロッキング剤としての利用が提案されている（特許文献２）。また、各種のポリマー、たとえば特定のアクリルアミド系ポリマー（特許文献３）なども非特異吸着防止剤としての利用が提案されている。
　さて、ＲＩｆＳ等の分子間相互作用検出法において、センサーチップ（ロット）ごとのばらつきによる測定結果への影響を抑制したり、コストを低減したりするために、あるサンプルについて固定化されたリガンドにアナライトを結合させて測定を行った後、再生溶液を用いてリガンドに結合したアナライトを剥離させて、次のサンプルについてまた固定化されたリガンドにアナライトを結合させて測定を行うというように、一枚のセンサーチップを用いて繰り返し測定を行う場合がある。しかしながら、従来のＢＳＡ等をブロッキング剤として使用した場合、再生溶液を添加すると、アナライトがリガンドから剥離するのみならず、ブロッキング剤も一部がセンサーチップ表面から剥離することが知られており（非特許文献１）、ブロッキング剤による効果が薄れるとともに、測定値を変動させて測定の正確性を損ねるおそれがある。この場合、剥離したブロッキング剤を補充するためにブロッキング処理工程を追加して行うことも考えられるが、測定工程の煩雑化を招くため好ましいことではない。
　また、従来のＢＳＡ等をブロッキング剤として使用した場合、そのブロッキング剤はセンサーチップ表面のリガンドが固定化されていない部位を被覆するのみならず、リガンドも重畳的に被覆してしまうため、非特異的吸着を防止する効果と引き替えに、リガンドとアナライトとの分子間相互作用を阻害してしまうおそれもある。ポリマーについても、一般的に分子量１万以上と定義されることを考慮に入れると、その分子の大きさから、ＢＳＡ等のブロッキング剤と同様に分子間相互作用の阻害が起こると考えられる。
特開平６－６６７９９号公報 特開２００３－３１５３３４号公報 特開２０１０－１６９６０４号公報
田中ら, BUNSEKI KAGAKU 56(9), pp.705-712 (2007)
　本発明は、ＢＳＡなどの従来のブロッキング剤について見られた、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさない、改善された非特異吸着防止剤を利用することのできる分子間相互作用測定手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、界面活性剤、たとえば商品名「Ｔｗｅｅｎ２０」として知られているポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートを、従来の分子間相互作用測定方法において用いられている各種の溶液における一般的な濃度よりも低い濃度で含有する水溶液で、センサーチップの表面を処理することにより、当該表面を当該界面活性剤で被覆し、非特異吸着防止剤として機能させることができることを見いだした。さらに、このような非特異的吸着防止剤としての界面活性剤が、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさないことを見いだし、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］　ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理が施されていることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［２］　前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤である、［１］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［３］　前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレアートからなる群から選ばれる少なくとも１種のエステルエーテル型ノニオン性界面活性剤である、［１］または［２］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［４］　前記分子間相互作用測定方法が反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［５］　ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、［１］～［３］のいずれか一項に記載された界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする、［１］～［４］のいずれか一項に記載された分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
［６］　前記界面活性剤の水溶液の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、［５］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
［７］　［１］～［４］のいずれか一項に記載されたセンサーチップを使用する分子間相互作用測定方法であって、非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含むことを特徴とする、分子間相互作用測定方法。
［８］　前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンドに結合したアナライトを剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）およびさらなる試料溶液接触工程（Ａ）それぞれを少なくとも１回ずつ繰り返す、［７］に記載の分子間相互作用測定方法。
［９］　前記試料溶液、再生溶液またはその両方が、さらに［１］～［３］のいずれか一項に記載された界面活性剤を含む、［７］または［８］に記載の分子間相互作用測定方法。
［１０］　前記試料溶液、再生溶液またはその両方に含まれる界面活性剤の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、［７］～［９］のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法。
　本発明において、界面活性剤によるセンサーチップ表面の処理は、最初に所定の非特異吸着防止処理工程として行われるが、その後、再生処理工程を行っても、センサーチップ表面を被覆した界面活性剤は実質的に（測定値に影響を与えるほど）剥離しないので、追加の非特異吸着防止処理工程を設けなくとも、測定精度を低下させることなく同じセンサーチップを用いて測定を継続することができる。
　しかも、ＢＳＡのような従来のブロッキング剤を用いる場合に比べて、センサーチップ表面に固定化されたリガンドとアナライトとの分子間相互作用を阻害しないので、測定感度を向上させることができる。
　さらに、本発明においては、ＢＳＡ等のタンパク質等ほど分子量が大きくない界面活性剤を低濃度で使用するので、非特異吸着防止処理工程のために用いる水溶液以外にも、測定に悪影響を及ぼすことなく、試料溶液や剥離溶液に溶解させたまま使用してもよく、非特異吸着防止効果をより一層持続させることができる。
図１は、ＲＩｆＳに基づく分子間相互作用測定方法の、本発明における実施形態の一例を示す概略図である。 図２は、実施例１で取得した測定値（Δλ）の経時変化を示すグラフである。 図３は、比較例１で取得した測定値（Δλ）の経時変化を示すグラフである。
　－センサーチップ－
　本発明で用いる分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層が設けられているものである。これらの層は、ＲＩｆＳ用の無修飾のセンサーチップにおいては、その最表面に形成されている光学薄膜を指す。ただし、本発明において、分子間相互作用測定方法はＲＩｆＳに限定されるものではなく、「ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層」が表面に形成されているセンサーチップを用いるものであれば、ＲＩｆＳ以外の分子間相互作用測定方法において本発明を応用することが可能である。
　一般的に、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、上記のような所定の層（光学薄膜）の表面の少なくとも一部にリガンドが固定化されており、そこが所定のシグナルを測定するための測定部位とされる。本発明では、そのような測定部位に対して、界面活性剤からなる被膜を形成する（界面活性剤で被覆する）ことによる非特異的吸着防止処理が施されている。非特異的吸着防止処理の方法、すなわち界面活性剤からなる被膜の形成方法は特に限定されるものではないが、後述するような手順にしたがって、界面活性剤の水溶液を測定部位に接触させる方法が好適である。
　・界面活性剤（非特異的吸着防止剤）
　本発明では、非特異的吸着剤、すなわち、生体物質の非特異的吸着を防止するために測定部材の表面を被覆する物質として、界面活性剤を用いる。以下に例示する界面活性剤は、いずれか１種を単独で用いても、本発明の作用効果を損なわない範囲において２種以上を混合して用いてもよい。
　界面活性剤には、アニオン（陰イオン）界面活性剤、カチオン（陽イオン）界面活性剤および両性界面活性剤を包含するイオン性界面活性剤と、ノニオン（非イオン）性界面活性剤が包含される。
　たとえば、静電的相互作用に起因する非特異的吸着を防止することを特に考慮する場合、非特異的吸着防止剤としてノニオン性界面活性剤が好適である。
　ノニオン性界面活性剤には、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型などのものが包含されるが、中でもエステルエーテル型のものが好ましい。エステルエーテル型のノニオン性界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（東京化成工業株式会社、商品名「Ｔｗｅｅｎ２０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（同「Ｔｗｅｅｎ４０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（同「Ｔｗｅｅｎ６０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（同「Ｔｗｅｅｎ８０」）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（同「Ｔｗｅｅｎ８５」）が挙げられる。なお、これらのエステルエーテル型のノニオン性界面活性剤の商品は、いずれも一分子中のポリオキシエチレン数の平均が約２０であり、仮に一分子中のポリオキシエチレン数を２０としたときの分子量は、いずれも２０００以下である。また、エーテル型のノニオン性界面活性剤としては、たとえば、ジエチレングリコールモノドデシルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリエチレングリコールモノセチルエーテル（ｎ≒２３、なおｎはオキシエチレンユニット数、以下同じ）、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｎ≒２５）、ポリエチレングリコールモノ-4-オクチルフェニルエーテル（ｎ≒１０）、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテルが挙げられる。
　－センサーチップの製造方法－
　・非特異的吸着防止処理工程
　界面活性剤を用いた非特異的吸着防止処理が施されている本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、前記所定の層（光学薄膜）の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、前記界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位を前記界面活性剤で被覆する、非特異的吸着防止処理工程を通じて製造することができる。
　すなわち、上記のような非特異的吸着防止剤としての界面活性剤は、その水溶液を測定部位に接触させることで、その測定部位を被覆し、非特異的吸着を防止する性能を発揮するようになる。
　換言すれば、前記測定部位に前記界面活性剤の水溶液を接触させることは、前記測定部位を前記界面活性剤で被覆することにより、前記測定部位の非特異的吸着を防止する方法となる。
　非特異的吸着防止処理工程に用いる界面活性剤の水溶液の濃度は、界面活性剤の種類や処理時間の長さに応じて適宜調整することも可能であるが、一般的には０．１重量％以下、より好ましくは０．０５重量％以下、好ましくは０．０１重量％以下であり、また一般的には０．０００１重量％以上、好ましくは０．００１重量％以上である。界面活性剤の濃度が上記下限値よりも低い場合、また詳細な理由は不明であるが上限値より高い場合も、非特異吸着防止能が発揮されないおそれがある。界面活性剤の濃度が上記上限値よりも高い場合は、密閉流路内で気泡が発生しやすくなり、送液系に悪影響を及ぼすおそれが高まる。
　界面活性剤の水溶液の接触のさせ方は特に限定されるものではなく、当該水溶液が移動（流下）している状態において接触させてもよいし、当該水溶液が静止した状態で接触させてもよい。前者の接触の態様としては、たとえば図１に示すような使用状態にあるセンサーチップに対して、光学薄膜の表面にリガンドを固定化した後、非特異的吸着防止剤の水溶液をフローセルにより形成される密閉流路から導入することにより、上記センサーチップの表面に接触させて非特異的吸着防止処理を施すことが好適である。このような態様は、次に述べる後者の態様に比べて、非特異吸着防止能被験物（Ａ）による被覆を十分な水準に到達させる（平衡させる）までの時間が短くて済む。また、後者の接触の態様として、あらかじめ光学薄膜の表面にリガンドが固定化されているセンサーチップを、容器内に収められた非特異的吸着防止剤の水溶液に単に浸漬するようにしてもよい。
　処理時間、すなわちセンサーチップ表面と界面活性剤の水溶液との接触時間は特に限定されるものではないが、センサーチップの表面が界面活性剤で十分に被覆される（飽和状態に達する）までの時間を確保することが適切である。
　非特異吸着防止処理工程が、前述したように、密閉流路に界面活性剤の水溶液を送液することでセンサーチップと接触させるような態様で行われる場合、適切な処理時間を判断するために、当該処理工程の開始前から分子間相互作用測定方法による測定値を取得し始め、以後連続的に取得し続けることが好適である。処理時間の経過と共に測定値が変化し（ＲＩｆＳにおいては通常ボトムピーク波長が長波長側に移る）、そのような変化の観察を通じて非特異吸着防止処理が進行し、センサーチップ表面に界面活性剤の被膜が形成されていく様子を随時確認することができる。やがて測定値は変化しなくなり、ないし変動が十分に小さくなり、それによってセンサーチップの表面における界面活性剤の被覆が飽和に達したものと判断することができ、非特異吸着防止処理工程を終了させることができる。
　・その他の工程
　界面活性剤を用いた非特異的吸着防止処理が施されている、本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法は、上記のような非特異的吸着防止処理工程以外に、従来と同様の各種の工程を含むことができる。
　たとえば、センサーチップ（光学薄膜）の表面は、製造当初は無修飾であり、アナライトとの接触に先だって、アナライトに応じたリガンドを固定化しておく必要がある。
　センサーチップ（光学薄膜）の表面にリガンドを固定化する工程の態様は特に限定されるものではなく、公知の各種の手法を採用して行うことができる。たとえば、無修飾の光学薄膜（たとえばＳｉＮ）の表面を、末端にアミノ基を有するシランカップリング剤で処理してアミノ基で修飾し、つづいてＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド）－ＰＥＧ４－ビオチンで処理して当該アミノ基にビオチンを結合させ、このビオチンにアビジンを反応させた後に、ビオチン化したリガンド（たとえば抗体）を反応させることにより、表面に当該リガンドが固定化されたセンサーチップを作製することができる。また、上記の手法において、末端にカルボキシル基を有するシランカップリング剤を用いることによりカルボキシル基で修飾し、つづいてＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride）およびＮＨＳで処理してそのカルボキシル基を活性エステル化した後、アミノ基を有するリガンド（典型的にはタンパク質、たとえば抗体）を反応させることによっても、表面に当該リガンドが固定化されたセンサーチップを作製することもできる。
　このようなリガンドを固定化するための各種の処理は、表面が無修飾のセンサーチップおよびフローセルからなる測定部材を検出装置にセットした後、その処理のための試薬や洗浄液を順次送液することによって行うこともできるし、測定部材を検出装置にセットする前に一部の処理を行っておき、セットした後に残りの処理を行うようにすることもできる。
　－ＲＩｆＳの実施形態－
　以下、図１を参照しながら、界面活性剤による非特異的吸着防止処理が施されている本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップを使用する、ＲＩｆＳに基づく分子間相互作用測定方法の一実施形態について説明する。
　分子間相互作用測定方法用の測定装置１は、主に、測定部材１０，白色光源２０，分光器３０，光伝達部４０，制御装置５０などから構成されている。白色光源２０，分光器３０，光伝達部４０などは、好ましくは測定装置本体に収容されており、この測定装置本体に、例えばＰＣ（Personal Computer）の形態をとる制御装置５０が制御可能に接続される。また、測定部材１０は、一般的には矩形であり、好ましくは上記測定装置本体に着脱可能な形態である。
　測定部材１０は、少なくとも基板１２ａと、その上に形成された光学薄膜１２ｂを含む、センサーチップ１２を基本として構成され、通常はさらに、アナライト６２を含む試料溶液６０等の各種の溶液を送液するための密閉流路１４ｂを形成するために、フローセル１４が当該センサーチップ１２に積載される。測定部材１０（センサーチップ１２およびフローセル１４）は、ディスポーザブルタイプのものとすることができる。基板１２ａは、代表的にはＳｉ（シリコン）製の基板であり、光学薄膜１２ｂは、代表的にはＳｉＮ（窒化シリコン）膜である。
　基板１２ａは、たとえばＳｉ（シリコン）製が好ましい。一方、光学薄膜１２ｂは、基板の材質（屈折率）に応じて選択される、白色光を用いたときに観測されるボトムピークが適切な範囲となるような屈折率および厚みを有する材質で形成される。たとえば、基板１２ａがＳｉ基板である場合、光学薄膜１２ｂは、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）などの酸化膜または窒化膜であることが好ましく、ＳｉＮ膜が特に好ましい。これらの酸化膜または窒化膜はいずれも、可視光領域（波長約４００から８００ｎｍの範囲）における屈折率が１．８～２．４で、Ｓｉ基板の上層に形成される光学薄膜としての性能を満たしており、なおかつ当該光学薄膜自体がある程度、非特異的吸着を抑制する効果を有している。たとえば、ＳｉＮ膜の膜厚を約４５～９０ｎｍとすることにより、ボトムピークをおよそ４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲に調節することができる。
　フローセル１４は、たとえばシリコーンゴム（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ）製の、透明な部材であり、センサーチップ１２に密着させることができる。フローセル１４には少なくとも１つの溝１４ａが形成されている。フローセル１４をセンサーチップ１２に密着させると、密閉流路１４ｂが形成される。溝１４ａの両端部はフローセル１４の表面から露出しており、一方の端部が送液部（たとえばシリンジポンプ）に接続されて試料溶液６０等の各種の溶液が供給される流入口１４ｃとして機能し、他方の端部は廃液部に接続されて試料溶液６０等の各種の溶液の流出口１４ｄとして機能するようになっている。
　フローセル１４の少なくとも１つの溝１４ａの底部に位置する、センサーチップ１２の表面（光学薄膜１２ｂの上層）の少なくとも一部には、アナライト６２と結合するリガンド１６が固定化されており、当該部位にて測定が行われる。
　リガンド１６には、分析の対象とするアナライト６２に応じて、それと特異的に結合する適切な物質が選択される。たとえば、アナライト６２が抗原となるタンパク質ないしペプチドであればその抗体となるタンパク質が、アナライト６２が核酸であればそれと相補的な塩基配列を有する核酸が、アナライト６２が糖であればそれと結合するレクチン（タンパク質）などが、リガンド１６として使用される。
　光伝達部４０は、白色光源２０からの白色光を測定部２００に導くための第一の光伝達経路としての第一の光ファイバ４１と、第一の光ファイバ４１からの白色光の照射による反射光を測定部２００から分光器３０に導くための第二の光伝達経路としての第二の光ファイバ４２とを備えている。第一の光ファイバ４１の白色光源２０側の端部は、当該白色光源２０の接続ポートに接続されている。接続ポートに接続された光ファイバ４１は光入射端面がハロゲンランプ２１に対向するように配置されている。第二の光ファイバ４２の分光器３０側の端部は、当該分光器３０の受光を行う接続ポートに接続されている。
　上記各光ファイバ４１，４２は、いずれも微細ファイバを束ねた構造となっている。そして、第一の光ファイバ４１と第二の光ファイバ４２のフローセル１４側の端部は、各々の微細ファイバが一つの束となるように複合的に寄り合わされている。即ち、第一の光ファイバ４１を構成する微細ファイバは、フローセル１４側の端面において中央に分布し、第二の光ファイバ４２を構成する微細ファイバは第一の光ファイバ４１の微細ファイバの束を取り囲むようにその周囲に分布している。
　白色光源２０は、ハロゲンランプと、これを格納する筐体とから構成されている。筐体には、第一の光ファイバ４１を接続するための接続ポートが設けられている。なお、本実施形態では白色光源を用いているが、これに限られるものではなく、後述する反射率極小波長の変化を検出しうる波長域にわたって分布する光を発光する光源であればよい。
　白色光源２０が点灯すると、その白色光が第一の光ファイバ４１を介して測定部２００に照射され、その反射光が光ファイバ４２を介して分光器３０に導かれる。この分光器３０は、受光部で受光する光に含まれる一定の波長間隔ごとの光について光強度を検出し、分光強度として制御装置５０に出力する。
　なお、本実施形態においては、測定部材１０からの反射光を分光器３０で受光するようにしているが（反射型ＲＩｆＳ）、測定部材１０として光透過性のものを用いて、白色光源２０からの光を測定部材１０に照射し、測定部材１０を透過してきた光を受光するように分光器３０を配置し、透過光の分光強度を検出するよう変形することも可能である。
　制御装置５０は、オペレータから検出動作の実行の入力を受け付けて、測定装置１０への検出動作制御の実行指令を出力する。これにより、制御装置５０は、制御部として機能する。
　また、制御装置５０は演算部としても機能する。制御装置５０は、分光器３０から測定光の分光強度のデータを取得し、各波長帯域ごとに、測定光の分光強度を基準となる白色光の分光強度で除して反射率を算出する。基準光の分光強度データは、あらかじめ装置組み立て調整時に測定して保有していたものでもよいし、その他の手段によりたとえば測定の都度取得したものでもよい。算出された反射率に基づき反射スペクトルが作成され、反射率極小波長（λ）が決定される。また、ある基準となる反射率極小波長（ベースライン）に対する、測定された反射率極小波長の変化量（Δλ）を取得することもできる。
　反射スペクトルの波形は、通常、微小な凹凸が繰り返されるような不規則な形状を呈しており、反射率極小波長を算出・特定するのが困難な状態となっている場合があるが、たとえば、公知の手法を用いて反射スペクトルを高次関数で近似することにより波形を滑らかにし、高次多項式からその解（最小値）を求めて、これを反射率極小波長の値として特定することができる。
　マイコン（図示せず）は、制御装置５０の制御指令に応じて白色光源２０の点灯と消灯を切り換える制御を行ったり、制御装置５０の設定温度指令に応じて温度制御部の温度制御を行ったりする。
　温度調節手段（図示せず）は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子と温度検出素子とを備え、これらは測定部材１０に併設される。そして、制御装置５０が、マイコンを通じて温度検出素子により測定部材１０の温度を検出し、温度調節素子による加温又は冷却によって、設定温度となるように温度制御を実行する。
　検出を行う際には予め測定部材１０の暖気が行われる。即ち、制御装置５０は、予め定めた設定温度となるようマイコンに指令を送り、マイコンは温度制御部の温度制御を実行する。暖気により測定部材１０の温度が安定してから、分析を始める。
　制御装置５０は、測定を継続するか判定を行い、継続しない場合には処理を終了する。かかる判定は、例えば、予め測定時間が設定され、当該測定時間が経過したか否かを判定してもよいし、測定の終了の入力を受けるまで測定を継続する設定として、測定終了の入力の有無を判定してもよい。測定を継続する場合には、再び、分光強度の測定が実行される。測定を繰り返すことにより、制御装置５０は、周期的に反射率の算出、反射スペクトルの作成および反射率極小波長の決定を行い、その時系列的な変化を記録する。
　・アナライト接触工程
　分子間相互作用測定方法は、非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含む。
　アナライト６２は、固定化されたリガンド１６と特異的に結合する物質である。たとえば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む），核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む），脂質，糖などの生体分子や、薬剤物質，内分泌錯乱化学物質などの生体分子と結合する外来物質、その他の生体関連物質などがアナライト６２となり得る。がんの診断等において重要な指標となる、血液中に存在する腫瘍マーカー（たとえばα－フェトプロテイン）は、重要なアナライトの一例である。
　分子間相互作用測定方法に供されるアナライト６２を含む、または含んでいる可能性のある試料溶液は、一般的に、生体から採取した検体から調製される。検体としては、たとえば、ヒトおよびヒト以外の動物（たとえばほ乳類）から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。このような検体は、必要に応じて、各種の液体（純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液等）と混合したり、精製処理をした上で試料溶液として用いてもよい。このような試料溶液は通常、多種多様な非特異吸着物、特に生体分子を含んでいる。非特異吸着物として典型的な生体分子には、タンパク質、核酸、糖、その他各種の生物由来物質が含まれる。本発明において非特異吸着防止剤として用いる界面活性剤は、このような物質のセンサーチップ表面への非特異吸着を防止ないし十分に抑制することができる。
　試料溶液は、さらに、前記非特異吸着防止処理工程において用いたものと同様の界面活性剤を含んでいてもよい。その場合の試料溶液に含まれる界面活性剤の濃度も、前記非特異吸着防止処理工程において用いた水溶液と同様の範囲内で適宜調節することが好ましい。試料溶液が界面活性剤を含む場合、もしもセンサーチップ表面を被覆している界面活性剤の一部が剥離したとしても（特にアナライト接触工程が２回目以降のときに、その前に行われた再生処理工程により）、当該試料溶液中の界面活性剤が直ちにその剥離を補填し、常に界面活性剤の被膜が十分に形成されている状態（飽和状態）で測定を行うことができる。
　・再生処理工程
　前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンド１６に結合したアナライト６２を剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）を行ってもよい。
　上記のような再生溶液は公知であり、たとえば、グリシン－ＨＣｌ溶液などを用いることができる。
　再生溶液は、さらに、前記非特異吸着防止処理工程において用いたものと同様の界面活性剤を含んでいてもよい。その場合の再生溶液に含まれる界面活性剤の濃度も、前記非特異吸着防止処理工程において用いた水溶液と同様の範囲内で適宜調節することが好ましい。
　このような再生処理工程（Ｂ）の後、再び試料溶液接触工程（Ａ）を行うことにより、センサーチップを交換することなく別の試料溶液についての測定を続けて行うことができる。さらにその後、再生処理工程（Ｂ）および試料溶液接触工程（Ａ）を繰り返し、測定を続けることが可能である。再生溶液が界面活性剤を含む場合、もしも再生工程においてセンサーチップ表面を被覆している界面活性剤の一部が剥離したとしても、当該再生溶液中の界面活性剤が直ちにその剥離を補填し、界面活性剤の被膜が十分に形成されている状態（飽和状態）で次のアナライト接触工程に移行することができる。
　［実施例１］
　（１．無修飾のセンサーチップの作製工程）
　シリコンウエハ（１００）の上に、ＳｉＮ（窒化ケイ素）を６６．５ｎｍの厚さになるようＣＶＤで蒸着し、ＳｉＮからなる光学薄膜を最表面に有する無修飾のセンサーチップを作製した。
　（２．センサーチップ表面のカルボキシル基修飾工程）
　１００μｌのＴｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｇｅｌｅｓｔ, Ｉｎｃ.製）を、０．１ｍｌ酢酸と１０ｍｌの超純水との混合溶液中に徐々に滴下し、室温にて１時間撹拌した。そこに上記工程で作製した無修飾のセンサーチップを浸漬し、更に室温にて１時間撹拌した。このようにして作製されたカルボキシル基修飾されたセンサーチップを、超純水で洗浄した後、空気ブローにより水滴を除去し、さらに８０℃の乾燥器内で１時間乾燥させた。
　（３．センサーチップ表面の抗体固定化工程）
　ＮＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｋ．Ｋ．製）、ＷＳＣ（ｄｏｊｉｎｄｏ製）がそれぞれ５０ｍＭ，２００ｍＭになるよう、２５ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．０）で調製した。そこに、上記工程によりカルボキシル基修飾されたセンサーチップを室温にて２０分間浸漬し、カルボキシル基が活性エステル化されたセンサーチップを作製した。センサーチップを超純水で洗浄後、空気ブローにより水滴を除去した。抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（ｃｌｏｎｅ１Ｄ５；ミクリ免疫研究所(株)製）を２０ｕｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で希釈した抗体希釈液に、センサーチップを室温にて３０分間浸漬させた。センサーチップを超純水で洗浄後、空気ブローにより水滴を除去し、最後に１Ｍエタノールアミン塩酸塩水溶液（ｐＨ８．５）に室温にて２０分間浸漬させることで、未反応の活性エステルのブロッキングを行い、抗体固定化センサーチップを得た。
　（４．測定準備工程）
　ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定装置（商品名「ＭＩ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ」、コニカミノルタオプト(株)製）の電源を入れて光源が安定するまで約２０分間待機した。
　上記の抗体固定化センサーチップに、幅２．５ｍｍ×長さ１６ｍｍ×深さ０．１ｍｍの溝及びこの溝の両末端にそれぞれ直径１ｍｍの貫通口を有するフローセル（コニカミノルタオプト(株)製）を積載して、密閉流路が形成された測定部材を構築した。この測定部材を上記測定装置にセットし、シリンジポンプ（Ｅｃｏｎｏｆｌｏ７０－２２０５；Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ製）により、上記測定装置が備えているチップカバーを通して、測定装置外部から密閉流路に液体を送液し、センサーチップ表面に接触させることが可能な状態にした。
　（５．非特異吸着防止剤処理工程）
　非特異吸着防止剤としての界面活性剤である「Ｔｗｅｅｎ２０」（東京化成工業株式会社）を、前記ＰＢＳバッファーを用いて０．００１重量％の濃度に調整した処理液を調製した。この非特異吸着防止剤処理液を、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で２０分間、測定部材の密閉流路に導入し、前記工程によりアナライト（抗ＡＦＰ抗体）が固定化されたセンサーチップの表面に接触させて、センサーチップの表面を上記界面活性剤で被覆し、測定基準となる分光反射率が最小となる波長λ0（ベースライン）が約５７０ｎｍ付近で安定するのを確認した。
　（６．非特異吸着防止確認工程）
　非特異吸着の防止効果を確認するために、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始後、６００ｓｅｃ後に、１０×ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｋ．Ｋ．製）を超純水により１０倍希釈して調製した１％ＢＳＡ溶液を２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程により界面活性剤による処理が施されたセンサーチップの表面に接触させて、非特異吸着による測定値（Δλ）の上昇がないことを確認した。
　（７．アナライト接触工程）
　上記非特異吸着防止剤処理液を用いて、アナライトとしてα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＧｍｂＨ製）を、それぞれ１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を調製した。この２種類の濃度のアナライト溶液を、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始後１２００ｓｅｃ、１８００ｓｅｃ後に、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程により界面活性剤による処理が施されたセンサーチップの表面に接触させて、センサーチップの表面に固定化されているリガンドにアナライトを結合させた。
　（８．再生溶液処理工程）
　再生溶液として１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．５）を、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから２４００ｓｅｃ後に、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程によりアナライトがリガンドと結合しているセンサーチップの表面に接触させて、当該アナライトおよびリガンドを解離させた。
　（９．２回目のアナライト接触工程）
　前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから３０００ｓｅｃ後、３６００ｓｅｃ後に、前記第７工程と同様にして、２回目のアナライト接触工程を行った。
　（１０．２回目の再生溶液処理工程）
　前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから４２００ｓｅｃ後に、前記第８工程と同様にして、２回目の再生溶液処理工程を行った。
　図２に、上記の実施例１（第７工程～第１０工程）で取得した測定値（Δλ）の経時変化を表すグラフを示す。
　［比較例１］
　前記第５工程「非特異吸着防止剤処理工程」を行う代わりに、前記第３工程「センサーチップ表面の抗体固定化工程」を経た前記抗体固定化センサーチップを１０×ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｋ．Ｋ．製）を超純水により１０倍希釈して調製した１％ＢＳＡ溶液に室温で３０分間浸漬させ、これを用いて前記第４工程「測定準備工程」において測定部材を構築するようにしたこと以外は、実施例１と同様にして第１工程～第１０工程を行った。
　図３に、上記の比較例１（第７工程～第１０工程）で取得した測定値（Δλ）の経時変化を表すグラフを示す。
　＜考察＞
　非特異吸着防止剤としてＢＳＡを使用した比較例１（図２）と比較して、Ｔｗｅｅｎ２０を使用した実施例１（図３）ではアナライトを導入時のレスポンス（Δλ）が高く、高感度化されていることが分かる。また、比較例１（図２）では、再生溶液での処理後のベースラインは当初のベースラインよりも下がっており、センサーチップ表面を被覆していたＢＳＡの剥離が起きたことが分かる。これに対して、実施例１（図３）では、再生溶液での処理後のベースラインは当初のベースラインよりも下がらず、ほぼ等しいレベルを維持しており、界面活性剤の剥離は起きていない、あるいは剥離が起きたとしても処理液中に含まれる界面活性剤によりすぐに補給されると考えられる。したがって繰り返しの使用に耐えうる優れた非特異吸着防止剤といえる。
　　１　　測定装置
　１０　　測定部材
　１２　　センサーチップ
　１２ａ　基板
　１２ｂ　光学薄膜
　１４　　フローセル
　１４ａ　溝
　１４ｂ　密閉流路
　１４ｃ　流入口
　１４ｄ　流出口
　１６　　リガンド
　２０　　白色光源
　３０　　分光器
　４０　　光伝達部
　４１　　第一の光ファイバ
　４２　　第二の光ファイバ
　５０　　制御装置
　６０　　試料溶液
　６２　　アナライト

Claims (10)

  1. 　ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理が施されていることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
  2. 　前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤である、請求項１に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
  3. 　前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレアートからなる群から選ばれる少なくとも１種のエステルエーテル型ノニオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
  4. 　前記分子間相互作用測定方法が反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
  5. 　ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、請求項１～３のいずれか一項に記載された界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載された分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
  6. 　前記界面活性剤の水溶液の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、請求項５に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載されたセンサーチップを使用する分子間相互作用測定方法であって、
    　非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含むことを特徴とする、分子間相互作用測定方法。
  8. 　前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンドに結合したアナライトを剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）およびさらなる試料溶液接触工程（Ａ）それぞれを少なくとも１回ずつ繰り返す、請求項７に記載の分子間相互作用測定方法。
  9. 　前記試料溶液、再生溶液またはその両方が、さらに請求項１～３のいずれか一項に記載された界面活性剤を含む、請求項７または８に記載の分子間相互作用測定方法。
  10. 　前記試料溶液、再生溶液またはその両方に含まれる界面活性剤の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、請求項７～９のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法。
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