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WO2015068772A1 - 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物 - Google Patents

分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物 Download PDF

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WO2015068772A1
WO2015068772A1 PCT/JP2014/079477 JP2014079477W WO2015068772A1 WO 2015068772 A1 WO2015068772 A1 WO 2015068772A1 JP 2014079477 W JP2014079477 W JP 2014079477W WO 2015068772 A1 WO2015068772 A1 WO 2015068772A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vesicle
antibody
nonionic surfactant
complex
washing
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2014/079477
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
寛也 藤井
素晶 水内
山口　哲司
弘喜 安倍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JSR Corp
JSR Life Sciences Corp
Original Assignee
JSR Corp
JSR Life Sciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by JSR Corp, JSR Life Sciences Corp filed Critical JSR Corp
Priority to US15/035,094 priority Critical patent/US10139402B2/en
Priority to CN201480060471.XA priority patent/CN105723221B/zh
Priority to JP2015546676A priority patent/JP6255035B2/ja
Publication of WO2015068772A1 publication Critical patent/WO2015068772A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a separation method, a detection method, a signal measurement method, a disease determination method, a drug efficacy evaluation method for a disease therapeutic drug, a kit, and a liquid composition. More specifically, a method for separating vesicles having a lipid bilayer such as exosome, a method for detecting nucleic acid or protein using the method, a signal measuring method, a method for determining a disease, a method for evaluating the efficacy of a disease therapeutic agent, a disease
  • the present invention relates to a determination or medicinal evaluation kit, and a liquid composition used in the separation method.
  • Vesicles have a structure encased in a lipid bilayer, and exosomes are known as vesicle granules existing in body fluids in the body among such vesicles. It is known that various membrane proteins exist on the surface of exosomes as well as general cell surfaces. On the other hand, in addition to various proteins such as cytokines, microRNA (miRNA) is present inside exosomes. Has also been found to be included.
  • miRNA microRNA
  • exosomes are secreted from various cells such as cells of the immune system and various cancer cells.
  • Relevance to other diseases has attracted attention and is being investigated.
  • EpCAM which is a tumor marker
  • exosomes are isolated from circulating blood of ovarian cancer patients, and there is already a relationship between the expression level of exosome-derived miRNA and the progression of ovarian cancer. It has been reported (Non-Patent Document 1).
  • Non-patent document 2 discloses that the amount of exosomes in the plasma of melanoma patients is normal. It has been reported that this can be detected and quantified with an antibody against CD63 and an antibody against tumor-related marker Caveolin-1. In addition, the plasma sample after centrifugation is reacted with a combination of CD63 antibody, antibodies against various membrane proteins, and the like, thereby quantifying and analyzing signals derived from exosomes in cancer patients (patents). Reference 1).
  • the reaction solution and washing solution of the solid phase carrier to which the antibody is bound, and the buffer function for suspending the antibody-bound particles reduce non-specific adsorption to the reaction container such as the plate and the particle surface and aggregation of particles generated during the reaction. Function is required.
  • the reaction container such as the plate and the particle surface and aggregation of particles generated during the reaction. Function is required.
  • vesicles covered with a lipid bilayer such as the exosome are captured by particles such as magnetic particles, not only the non-specific adsorption is likely to occur, but also aggregation of particles occurs. In some cases, the recovery rate of vesicles and the cleaning efficiency of particles may be adversely affected.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for separating vesicles having a lipid bilayer, which is excellent in the removal efficiency of contaminants, and is difficult to destroy vesicles having a lipid bilayer. .
  • the present inventors contacted a biological sample containing vesicles having a lipid bilayer membrane with a solid phase carrier bound with a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of the vesicles.
  • the present invention provides ⁇ 1> a biological sample containing vesicles having a lipid bilayer membrane and a solid phase carrier to which a ligand recognizing a surface antigen present on the surface of the vesicle is bound, A complex forming step for forming a complex of a vesicle and the solid phase carrier, and a washing step for washing the complex, wherein at least one of the complex forming step and the washing step is a nonionic surfactant
  • the present invention provides a method for separating vesicles having a lipid bilayer membrane, which is performed in the presence of an agent.
  • the present invention provides a method for detecting a nucleic acid in a vesicle, further comprising a nucleic acid detection step for detecting the nucleic acid in the vesicle after the separation method of ⁇ 2> and ⁇ 1> above. It is. Furthermore, the present invention includes a protein detection step of detecting a protein present on at least one of the inside and the surface of the vesicle after the separation method of ⁇ 3> and ⁇ 1> above. A method for detecting a protein is provided.
  • the present invention includes ⁇ 4> a signal derived from a vesicle characterized by further comprising a signal measuring step for measuring a signal intensity derived from a vesicle forming the complex after the separation method of ⁇ 1> above.
  • a measurement method is provided.
  • the present invention provides ⁇ 5> a method for determining whether or not a subject has developed a disease, the method for measuring a signal according to ⁇ 4> above, using a biological sample derived from the subject.
  • a method for determining a disease comprising a step of measuring a signal intensity derived from a vesicle formed with the complex.
  • the present invention provides ⁇ 6> a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease, wherein the biological sample derived from the subject before and after the administration of the therapeutic agent for the disease is used for the signal measurement method of ⁇ 4> above.
  • the present invention provides a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease, comprising a step of measuring a signal intensity derived from a vesicle forming the complex.
  • the present invention comprises ⁇ 7> a solid phase carrier to which a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle having a lipid bilayer is bound, and a liquid composition containing a nonionic surfactant.
  • the kit characterized by this is provided.
  • the present invention provides a biological sample comprising vesicles having ⁇ 8> lipid bilayer membranes and a solid phase carrier bound with a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of the vesicles, thereby
  • the complex used in a method for separating a vesicle having a lipid bilayer, comprising a complex formation step of forming a complex of a vesicle and the solid phase carrier, and a washing step of washing the complex
  • the present invention provides a liquid composition for washing a liquid composition characterized by containing a nonionic surfactant.
  • the method for separating vesicles having a lipid bilayer membrane of the present invention is excellent in the removal efficiency of contaminants, and vesicles having a lipid bilayer membrane are not easily destroyed. Moreover, when the kit and liquid composition of the present invention are used for separation of vesicles having a lipid bilayer membrane, contaminants are sufficiently removed, and vesicles having a lipid bilayer membrane are not easily destroyed.
  • the method for separating a vesicle having a lipid bilayer membrane according to the present invention is a solid phase carrier in which a biological sample containing a vesicle having a lipid bilayer membrane and a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of the vesicle are bound.
  • a complex forming step for forming a complex of the vesicle and the solid phase carrier, and a washing step for washing the complex, and at least one of the complex forming step and the washing step Is carried out in the presence of a nonionic surfactant.
  • Nonionic surfactant As the nonionic surfactant used in the separation method of the present invention, those which do not contain an aromatic group in the molecule are preferable.
  • a nonionic surfactant that does not contain such an aromatic group in the molecule impurities on the solid phase support can be obtained without causing the destruction of the lipid bilayer that constitutes vesicles such as exosomes. Non-specific adsorption can be reduced.
  • the reactivity of the capture reaction between the vesicle and the solid phase carrier is improved. Furthermore, the influence of the purified exosome on proteome analysis can be suppressed.
  • the polyethylene glycol type nonionic surfactant is not particularly limited as long as it has a polyethylene oxide chain as a hydrophilic group.
  • polyalkylene glycol ethylene oxide adduct, polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adduct examples include alcohol ethylene oxide adducts, fatty acid ethylene oxide adducts, higher alkylamine ethylene oxide adducts, fatty acid amide ethylene oxide adducts, and fat and oil ethylene oxide adducts.
  • polyalkylene glycol ethylene oxide adducts and polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adducts are preferred because of their non-specific adsorption reducing effect and little damage to vesicles.
  • the polyalkylene glycol ethylene oxide adduct is preferably a block copolymer type, and includes a block made of polyethylene oxide (hereinafter also referred to as block A) and a polyalkylene oxide, and the alkylene has 3 or more carbon atoms.
  • a block copolymer having a block (hereinafter also referred to as a block B) is more preferable.
  • the number of carbon atoms of the alkyleneoxy group contained in the block B is preferably 3 to 6, more preferably 3 or 4, and particularly preferably 3.
  • the thing of C3 of the alkyleneoxy group contained in the block B is a polypropylene glycol ethylene oxide adduct.
  • the total content of block A is preferably 15 to 99% by mass, more preferably 50 to 99% by mass, still more preferably 60 to 95% by mass, and particularly preferably 70 to 90% by mass in the block copolymer. preferable.
  • the total content of the block B is preferably 1 to 85% by mass, more preferably 1 to 50% by mass, further preferably 5 to 40% by mass in the block copolymer from the viewpoint of cytotoxicity. ⁇ 30% by weight is particularly preferred.
  • these content can be measured by NMR etc., and when there are two or more blocks A, it means the total value of each content of two or more blocks A. Similarly, when there are two or more blocks B, it is the total value of the contents of two or more blocks B.
  • an ABA type triblock copolymer having a structure in which a block B is sandwiched between two blocks A as exemplified by a pluronic type nonionic surfactant, etc. Coalescence is preferred.
  • polyalkylene glycol ethylene oxide adducts examples include Pluronic F-68 and Pluronic L-62 (both manufactured by ADEKA).
  • polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adduct an ethylene oxide adduct of sorbitan fatty acid ester and an ethylene oxide adduct of sorbitol fatty acid ester are preferable, and an ethylene oxide adduct of sorbitan fatty acid ester is more preferable.
  • the “fatty acid” in the polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adduct may be either an unsaturated fatty acid or a saturated fatty acid.
  • the fatty acid may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the carbon number of the fatty acid is preferably 8 to 18, more preferably 10 to 20, and still more preferably 12 to 18. Specific examples include lauric acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and the like.
  • Examples of commercially available polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adducts include Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, and Tween 85 (all manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
  • Polyhydric alcohol-type nonionic surfactants obtained by adding a hydrophobic group to polyhydric alcohol include glycerol fatty acid ester, pentaerythritol fatty acid ester, sorbitol or sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, Examples include alkyl ethers of polyhydric alcohols, fatty acid amides of alkanolamines, and the like. Among these, those having a fatty acid residue as a hydrophobic group are preferred.
  • the fatty acid residue is preferably the same as the fatty acid residue contained in the polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adduct. Among those having such a fatty acid residue, sorbitol or sorbitan fatty acid ester is preferable, and sorbitan fatty acid ester is more preferable.
  • polyethylene glycol type nonionic surfactants are preferable, a polyalkylene glycol ethylene oxide adduct and a polyhydric alcohol fatty acid ester ethylene oxide adduct are more preferable, and a polyalkylene glycol ethylene oxide adduct is still more preferable.
  • a nonionic surfactant may be used individually by 1 type, or may be used in combination of 2 or more type.
  • the nonionic surfactant other than the polyalkylene glycol ethylene oxide adduct has an HLB (Hydrophile-Lipophile Balance) value of preferably 13.1 or more, more preferably 13.5 or more.
  • HLB value means Hydrophile-Lipophile Balance by Griffin and is a value representing the degree of affinity of a surfactant to water or oil.
  • the HLB value of Tween 20 is 16.7
  • the HLB value of Tween 80 is 15.0.
  • Triton X-100 which is a nonionic surfactant containing an aromatic group, has an HLB value of 13.5
  • Nonidet P-40 has an HLB value of 13.1.
  • the weight average molecular weight of the nonionic surfactant is preferably 500 to 50,000, more preferably 1000 to 30,000, and still more preferably 2,000 to 20,000 from the viewpoint of cytotoxicity.
  • the weight average molecular weight can be measured by liquid chromatography, NMR, MALDI-TOF / MS, or the like.
  • the concentration of the nonionic surfactant is the final concentration with respect to the total amount of the liquid phase in the system (the amount obtained by removing the solid content such as the solid phase carrier from the total volume of the biological sample and buffer), preferably 0. 0.005% (w / v) or more, more preferably 0.01% (w / v) or more, still more preferably 0.015% (w / v) or more, particularly preferably 0.02% (w / v). Or more preferably 10% (w / v) or less, more preferably 5% (w / v) or less, still more preferably 3.5% (w / v) or less, particularly preferably 2% (w / V) or less.
  • the above final concentration is preferable in both the complex formation step and the washing step.
  • concentration of the nonionic surfactant is within the above numerical range, the nonspecific adsorption reducing effect is excellent, and when the solid support is a particle, the antiaggregation action is excellent. Also, it does not inhibit the binding between the ligand and the surface antigen.
  • either one of the complex formation step and the washing step may be performed in the presence of a nonionic surfactant, and both the complex formation step and the washing step are performed with a nonionic surfactant.
  • You may carry out in presence of an agent.
  • a composition such as a buffer containing a nonionic surfactant may be added in advance to the biological sample and used.
  • the solid support is in the form of a plate or fiber and does not disperse in the liquid phase, it can be used in the liquid phase during the complex formation process or in the cleaning liquid used in the cleaning process. It is sufficient that a surfactant is added to the system.
  • the solid support is in the form of particles such as magnetic particles and is dispersed in the liquid phase, it should be added in advance to the particle dispersion before being added to the biological sample as the specimen.
  • it is preferably added to a buffer for preparing a biological sample, a washing solution used in the washing step, or the like.
  • a nonionic surfactant for example, by adding a nonionic surfactant to the storage buffer for antibody-bound particles, the dispersibility of the particulate solid phase carrier is increased compared to BSA and other polymers, and the aggregation and storage containers and reaction containers are added. Non-specific adsorption of can be reduced.
  • nonionic surfactant in the washing buffer, it is possible to drastically reduce the adsorption of nonspecific components derived from specimens without destroying vesicles such as animal cells and exosomes. Even when a nonionic surfactant that does not contain any of the above molecules is used, the detergency of antibody-bound particles is equivalent to that of Triton X-100, which is a nonionic surfactant having an aromatic group. Can be raised.
  • a biological sample containing a vesicle having a lipid bilayer membrane is contacted with a solid phase carrier to which a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of the vesicle is bound, and the vesicle and the solid phase carrier are contacted. And forming a complex.
  • the vesicle is captured by the ligand, and a complex of the vesicle and the solid phase carrier is formed.
  • a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle having a lipid bilayer may coexist in the reaction system of the complex formation step.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it contains vesicles having lipid bilayer membranes, such as body fluid, fungal fluid, cell culture medium, cell culture supernatant, tissue cell disruption fluid, etc.
  • body fluids include whole blood, serum, plasma, blood components, various blood cells, blood clots, platelets, and other blood composition components, as well as urine, semen, breast milk, sweat, interstitial fluid, interstitial lymph fluid, bone marrow fluid, tissue fluid , Saliva, gastric juice, joint fluid, pleural effusion, bile, ascites, amniotic fluid, etc., preferably blood composition components and urine.
  • vesicles can be selectively and efficiently separated from a wide variety of biological samples. For example, nonspecific adsorption hardly occurs even when plasma or serum is used as the biological sample.
  • the blood composition component may be treated with an anticoagulant such as citric acid, heparin, EDTA or the like.
  • the biological sample may be pre-treated by adding it to a buffer composition containing a nonionic surfactant or the like, or it may be used as it is taken from a living body. That is, according to the separation method of the present invention, selective separation can be easily performed without pretreatment by a PEG precipitation method, an isolation method using an ultracentrifuge, or the like.
  • examples of the vesicle having the lipid bilayer include vesicles such as cells and exosomes released from the cells to the outside.
  • the separation method of the present invention can be used when the vesicles are exosomes. Particularly preferably used.
  • the solid support is in the form of particles such as magnetic particles
  • the particles tend to aggregate and the particles are redispersed.
  • aggregation of particles can be reduced by adding a nonionic surfactant.
  • the surface antigen present on the surface of the vesicle is not particularly limited as long as it is a substance present on the surface of the vesicle and is antigenic.
  • exosome surface antigens include tetraspanins such as CD9, CD63, and CD81; antigen presentation-related proteins such as MHCI and MHCII; adhesion molecules such as integrin, ICAM-1, and EpCAM; cytokines such as EGFRvIII and TGF- ⁇ / Cytokine receptors, enzymes and the like.
  • antigenic proteins present on the exosome surface are preferable.
  • the amount of the biological sample used is 1 to 90 at a final concentration relative to the total amount of the liquid phase in the system (the amount obtained by removing the solid content such as the solid phase carrier from the total volume of the biological sample and buffer). % (W / v) is preferable, and 10 to 50% (w / v) is more preferable.
  • the solid phase carrier used in the separation method of the present invention is not particularly limited as long as a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle is bound thereto.
  • a ligand an antibody that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle is preferable, and an antibody that recognizes an antigen protein present on the surface of an exosome is more preferable.
  • it may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, it is preferably a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody is not particularly limited, and a known method such as K.I. Watanabe et al.
  • Monoclonal antibodies that recognize tetraspanins such as exosome surface antigens CD9, CD63, and CD81 can be prepared with reference to International Publication No. 2013/099925.
  • the antibody class includes IgG and IgM, and IgG is preferred.
  • Examples of the material of the solid phase carrier to which the ligand is bonded include, for example, polystyrenes, polyethylenes, polypropylenes, polyesters, poly (meth) acrylonitriles, styrene-butadiene copolymers, poly (meth) acrylic esters, Polymer compounds such as fluororesin, crosslinked dextran, and polysaccharides; glass; metal; magnetic substance; resin composition containing magnetic substance; and combinations thereof.
  • the shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and examples thereof include a tray shape, a spherical shape, a particle shape, a fiber shape, a rod shape, a disc shape, a container shape, a cell, a microplate, and a test tube.
  • magnetic particles are preferred from the viewpoint of solid-liquid separation and ease of washing.
  • the magnetic particles include metals such as triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ), iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, nickel, cobalt, and chromium; cobalt, nickel And magnetic fine particles made of an alloy such as manganese; magnetic particles containing these magnetic substances in a resin.
  • the resin include a hydrophobic polymer and a hydrophilic polymer. Among these, magnetic particles containing a magnetic substance in a resin are preferable, and those in which a polymer layer is formed on the surface of mother particles containing superparamagnetic fine particles are more preferable.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of a mother particle containing superparamagnetic fine particles described in JP-A-2008-32411, and at least the surface has a glycidyl group on the first polymer layer.
  • Examples include magnetic particles in which a second polymer layer is formed and a polar group is introduced by chemically modifying the glycidyl group.
  • magnetite represented by Fe 3 O 4 include ⁇ -Fe 2 O 3, strong saturation magnetization, and residual magnetization is small in terms, It is preferable to contain either ⁇ -Fe 2 O 3 or Fe 3 O 4 .
  • the monomers for forming the hydrophobic first polymer layer are roughly classified into monofunctional monomers and crosslinkable monomers.
  • the monofunctional monomer include aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, and halogenated styrene; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, and cyclohexyl methacrylate.
  • ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomers such as isobornyl acrylate and isobornyl methacrylate.
  • crosslinkable monomer ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, dipentaerythritol hexa Examples include polyfunctional (meth) acrylates such as methacrylate; conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, as well as divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate.
  • the monomer for forming the second polymer layer is mainly intended to introduce a functional group to the particle surface and includes a glycidyl group-containing monomer.
  • a glycidyl group containing monomer 20 mass% or more is preferable in the monomer for forming a 2nd polymer layer.
  • examples of the copolymerizable monomer containing a glycidyl group include glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, and allyl glycidyl ether.
  • the polar group introduced by chemically modifying the glycidyl group of the second polymer layer is preferably a functional group capable of reacting with a ligand, and at least selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom Those containing one or more of one kind of atom are more preferable. Of these, an amino group, an aldehyde group, a carboxy group, and an active ester group are more preferable. In particular, when the second polymer layer of the magnetic particle has the polar group and 2,3-dihydroxypropyl group, the binding property to the ligand is good.
  • a chemical binding method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, or an ion bond method is used.
  • the physical adsorption method include a method of directly immobilizing a ligand on a solid phase carrier, a method of chemically binding to another protein such as albumin, and then adsorbing and immobilizing.
  • a chemical bonding method a method of directly bonding on a solid phase carrier using a functional group capable of reacting with a ligand introduced on the surface of the solid phase carrier, or a spacer molecule between the solid phase carrier and the ligand. Examples include a method of binding after introducing a carbodiimide compound (such as a carbodiimide compound), a method of binding a ligand to another protein such as albumin, and then chemically binding the protein to a solid phase carrier.
  • a carbodiimide compound such as a carbodiimide compound
  • the amount of the solid phase carrier to which the ligand is bound is the final concentration relative to the total amount of the liquid phase in the system (the amount obtained by removing the solid content such as the solid phase carrier from the total volume of the biological sample and buffer). 0.005 to 5% (w / v) is preferable, and 0.01 to 1% (w / v) is more preferable.
  • the complex formation step may be performed using salts, proteins such as albumin, surfactants other than the above-described nonionic surfactants, etc., if necessary. In view of the above analysis, it is preferable not to use proteins or nucleic acids.
  • the reaction temperature in the complex formation step is usually in the range of 2 to 42 ° C., and the reaction time is usually 5 minutes to 24 hours.
  • the reaction time is preferably about 8 to 30 hours, and when the reaction is performed at room temperature (20 ° C) to 42 ° C, the reaction time is preferably about 5 to 60 minutes.
  • the pH in the system is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 to 10, more preferably in the range of pH 6 to 8.
  • a buffer solution is usually used, and examples thereof include a phosphate buffer solution, a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, a HEPES buffer solution, and a MES buffer solution.
  • the washing step is a step of washing the complex of the vesicle formed in the complex forming step and the solid phase carrier. Thereby, unreacted components, unreacted labeling substances and the like are removed. You may wash
  • the washing step is usually divided into two types depending on the shape of the solid support.
  • the solid phase carrier is in the form of particles, such as magnetic particles
  • the washing step includes collecting the magnetic particles by a magnetic force to separate the magnetic particles from the liquid phase, and separating the magnetic particles separated in the collecting step in the washing liquid. It is preferable to include a dispersion step of dispersing in the water. As a result, unreacted substances and contaminants in the biological sample can be more efficiently washed and separated and removed from the surface of the magnetic particles. Specifically, a magnetic field was applied to the reaction vessel, and the magnetic particles were collected by adhering to the reaction vessel wall, and then the reaction supernatant was removed, and a washing solution was added as necessary to apply the magnetic field in the same manner. What is necessary is just to repeat the operation of removing the post-supernatant.
  • the washing liquid is preferably a washing liquid containing a nonionic surfactant that does not contain the aromatic group in the molecule and the buffer solution mentioned in the complex formation step.
  • the pH of the cleaning liquid is preferably in the range of pH 5 to 10, more preferably in the range of pH 6 to 8. Specific examples include TBS containing 0.01% nonionic surfactant.
  • the separation method of the present invention may have a dissociation step of dissociating the captured vesicle from the ligand after the washing step.
  • a dissociation step of dissociating the captured vesicle from the ligand after the washing step.
  • various conditions are known by affinity chromatography and the like (for example, “Affinity Chromatography principles & methods” Pharmacia) See LKB Biotechnology).
  • the dissociation step may be performed according to this.
  • acidic solutions such as hydrochloric acid, sulfuric acid, propionic acid, acetic acid, glycine / hydrochloric acid buffer
  • alkaline solutions such as sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, ammonia aqueous solution, diethylamine
  • High ionic strength solution such as 3M sodium chloride aqueous solution and 4.5M magnesium chloride aqueous solution
  • Surfactant-containing solution such as SDS, Triton X-100, Tween 20
  • Buffer containing a substance that lowers the polarity such as dioxane, ethylene glycol
  • Trichloro In addition to chaotropic ions such as acetic acid and thiocyanic acid, buffer solutions containing urea, guanidine hydrochloride and the like can be mentioned.
  • the method for detecting a nucleic acid in a vesicle of the present invention further comprises a nucleic acid detection step for detecting the nucleic acid in the vesicle after the separation method.
  • the method for detecting a protein derived from a vesicle of the present invention further comprises a protein detection step of detecting a protein present on at least one of the inside and the surface of the vesicle after the separation method.
  • nucleic acid or protein may be detected from the collected exosome according to a known method such as a PCR method, an electrophoresis method, a Western blotting method, an immunochemical method, or the like.
  • a known method such as a PCR method, an electrophoresis method, a Western blotting method, an immunochemical method, or the like.
  • the nucleic acid include miRNA and mRNA.
  • the nucleic acid detection method of the present invention detects exosome-derived nucleic acids (especially miRNA) and the like. By analyzing the above, it becomes possible to determine physiological phenomena and various diseases.
  • the vesicle-derived signal measurement method of the present invention further comprises a signal measurement step of measuring the signal intensity derived from the vesicles forming the complex after the separation method.
  • the signal intensity may be measured by immunoassay, for example, enzyme immunoassay (EIA), enzyme immunometric assay (ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), luminescence.
  • EIA enzyme immunoassay
  • ELISA enzyme immunometric assay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • luminescence luminescence
  • Examples include an immunoassay method, an immunoblot method, a Western blot method, and the like. From the viewpoint that an antibody can be easily detected with high sensitivity, the ELISA method is preferable.
  • the ELISA method include a competitive method and a sandwich method.
  • a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle is bound to a solid phase carrier, and then a biological sample containing a vesicle having a lipid bilayer is contacted to form a complex, followed by washing.
  • a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof or a labeled antibody obtained by modifying a disease-specific membrane protein antibody or an antibody fragment thereof is added to form a further complex.
  • the amount of label in the formed complex the amount of signal derived from vesicles contained in the biological sample and the amount of disease-specific vesicles contained in the biological sample can be measured.
  • a method for determining whether or not a subject of the present invention has developed a disease is a signal derived from a vesicle formed with the complex by the above signal measurement method using a biological sample derived from the subject. It includes a step of measuring strength (hereinafter also referred to as step (I)). Then, when the signal intensity measured in the step (I) is compared with the signal intensity of the biological sample derived from the control person, the signal intensity in the subject is recognized to be stronger than the signal intensity in the control person. What is necessary is just to determine with the examiner developing the disease (henceforth process (II)).
  • Diseases that can be determined by the disease determination method of the present invention include cancer diseases (colon cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, liver cancer, lung cancer, renal cancer, skin cancer. ), Inflammatory diseases (rheumatic, osteoarthritis, nephropathy, pancreatitis, hepatitis, allergy, etc.), neurodegenerative diseases such as Alzheimer, brain diseases, diseases related to immunodeficiency, infertility, depression, autism And psychiatric diseases such as Parkinson's disease, autoimmune diseases, cardiovascular diseases, blood diseases, gastrointestinal diseases, diseases associated with aging, infectious diseases and the like.
  • cancer diseases colon cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, liver cancer, lung cancer, renal cancer, skin cancer.
  • Inflammatory diseases rheumatic, osteoarthritis, nephropathy,
  • cancer diseases and immune system diseases are useful for determination of cancer diseases and immune system diseases, and particularly useful for determination of cancer diseases.
  • index of the immune activity of cytotoxic T cell (CTL) it can apply also to the effect determination with respect to the cancer disease of a cancer vaccine.
  • Step (I) may be performed according to a conventional method except that measurement is performed by the above signal measurement method.
  • step (II) the signal intensity measured in step (I) is compared based on a statistical analysis based on the signal of the biological sample derived from the control person.
  • the analysis method is not particularly limited, and a known method can be used. Further, in the subsequent determination, for example, when the signal of the biological sample derived from the subject is stronger than the signal of the control person, it is determined that the possibility of developing the disease is high.
  • the control person means the average of the same age and the same person as the subject who has not developed the disease, the signal intensity in the control person may be measured together with the signal intensity in the subject, A statistical value obtained from a separately measured value may be used.
  • the method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease is a signal intensity derived from a vesicle formed with a complex by a signal measurement method using a biological sample derived from a subject before and after administration of a therapeutic agent for a disease. It includes a step of measuring (hereinafter also referred to as step (A)). Then, it is recognized that the signal intensity derived from the complex in the biological sample derived from the subject after administration of the disease therapeutic agent is weaker than the signal intensity derived from the complex in the biological sample derived from the subject before administration of the disease therapeutic agent.
  • the therapeutic agent for the disease has a medicinal effect (hereinafter also referred to as step (B)).
  • the disease therapeutic drug include drugs for treating a disease that can be determined by the determination method.
  • Preferred specific examples are anticancer drugs and anti-immune disease drugs.
  • Step (A) may be performed according to a conventional method except that measurement is performed by the above signal measurement method.
  • the signal intensity measured in the step (A) is compared based on a statistical analysis based on the signal in the biological sample before administration of the disease therapeutic agent.
  • the analysis method is not particularly limited, and a known method can be used. Further, in the subsequent determination, for example, when the amount of signal in the biological sample after administration of the disease therapeutic drug is small compared to the amount of signal in the biological sample before administration, the drug may have an effect of suppressing the disease. It is judged that the nature is high.
  • exosomes are secreted from various cells such as cells of the immune system and various cancer cells, changes in blood exosomes before and after administration of disease therapeutic agents (in addition to increase / decrease in abundance, membrane proteins) It is considered possible to evaluate the drug efficacy in patients.
  • a ligand for a membrane protein specific for cancer cells and a ligand for a surface antigen of exosomes, it can be expected to improve the specificity of cancer diagnosis, identify the type of cancer, etc. It is considered possible to develop new diagnostic agents.
  • the kit of the present invention comprises a solid phase carrier to which a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of a vesicle having a lipid bilayer membrane is bound, and a liquid composition containing a nonionic surfactant. It is what. Such a kit is useful for the separation method, determination of the disease, and evaluation of the efficacy of the therapeutic agent for the disease.
  • the nonionic surfactant contained in the solid phase carrier and the liquid composition include the same as those used in the separation method.
  • the concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.005 to 10% (w / v), more preferably 0.02 to 2% (w / v) with respect to the total amount of the liquid composition.
  • the pH of the liquid composition is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 to 10, more preferably in the range of pH 6 to 8.
  • a buffer solution is usually used, and examples thereof include a phosphate buffer solution, a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, a HEPES buffer solution, and a MES buffer solution.
  • the liquid composition of the present invention is obtained by bringing a biological sample containing vesicles having a lipid bilayer membrane into contact with a solid phase carrier to which a ligand that recognizes a surface antigen present on the surface of the vesicle is bound, and fixing the vesicle with the solid composition.
  • a liquid for washing a complex which is used in a method for separating a vesicle having a lipid bilayer, comprising a complex formation step for forming a complex with a phase carrier and a washing step for washing the complex.
  • a composition comprising a nonionic surfactant.
  • the composition and pH of the liquid composition of the present invention are the same as those of the liquid composition provided in the kit of the present invention.
  • the liquid composition of the present invention is used in the separation method of the present invention.
  • TBS Tris-buffered saline
  • T / V nonionic surfactant
  • TBS Polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol Pluronic F-68 (ADEKA, hereinafter the same)) added to TBS (pH 7.4) was prepared.
  • anti-CD63 antibody-binding magnetic particles Exosome-Dynabeads Human CD63 Isolation / Detection, Ref 10606D manufactured by Life technologies are added to each of the buffers so that the concentration becomes 0.1% (w / v).
  • TBS TBS (pH 7.4) was used as a control buffer, and nonionic surfactants (polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (polyoxyethylene (160)) were used as buffers in Examples 2 to 7 to have concentrations shown in Table 2 below. 30) A solution obtained by adding glycol Pluronic F-68) to TBS (pH 7.4) was used as a buffer of Comparative Examples 1 and 2, and bovine serum albumin (BSA) was added to TBS (pH 7) to the concentrations shown in Table 2 below. 4) were added.
  • BSA bovine serum albumin
  • test was conducted in the same manner as in Test Example 2 except that the anti-EpCAM antibody was changed to an anti-CD9 antibody (abcam, ab2215 manufactured by Abcam, the same shall apply hereinafter) or an anti-CD63 antibody (manufactured by JSR Life Science, the same applies hereinafter). However, the same results as in Test Example 2 were obtained.
  • Magnetic particles (MS300 / Carboxyl manufactured by JSR Life Sciences) 0.05% (i) anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody or anti-EpCAM antibody bound to a 96-well white plate (Corning) of TBS containing 1.0% (w / v) of w / v) and a nonionic surfactant (Pluronic F-68), and (ii) an antibody labeled with alkaline phosphatase, the same antibody as in (i) above MES solution (1 ⁇ g / mL) and (iii) HT29 cell culture supernatant (100-fold concentrated solution diluted 100-fold with TBS) were added in an amount of 25 ⁇ L each and mixed.
  • MES solution 1 ⁇ g / mL
  • HT29 cell culture supernatant 100-fold concentrated solution diluted 100-fold with TBS
  • the concentration of the nonionic surfactant (Pluronic F-68) in the particle suspension of (i) is changed from 1.0% (w / v) to 0% (w / v), 0.01 % (W / v), 0.02% (w / v), 0.05% (w / v), 0.1% (w / v), 0.2% (w / v), 0.5
  • the luminescence intensity was measured in the same manner as described above.
  • magnetic particles MS300 / Carboxyl manufactured by JSR Life Sciences
  • washing buffer ((i) TBS, (ii) 0.01% (w / v) Triton X-100) Washing was performed twice with TBS containing or (iii) 0.01% (w / v) Pluronic F-68 containing TBS.
  • the antibody-bound magnetic particles are suspended in 20 ⁇ L of 1 ⁇ sample buffer (NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ⁇ ), Invitrogen Cat no. NP0008, hereinafter the same), and left at 95 ° C. for 5 minutes. did. The entire amount was applied to SDS-PAGE, and silver staining (Cosmo Bio) was performed. The results are shown in FIG.
  • the washing buffer containing nonionic surfactant not only adsorbs nonspecific components derived from the specimen, but also removes antigens (exosomes) specifically reacted with antibody-bound magnetic particles from the antibody.
  • protein detection by Western blot was performed according to the following procedure.
  • magnetic particles (MS300 / Carboxyl manufactured by JSR Life Sciences) to which anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody or anti-EpCAM antibody are bound 0.1% (w / v) and a nonionic surfactant ( 100 ⁇ L of TBS (pH 7.4) containing 0.1% (w / v) Pluronic F-68) and 100 ⁇ L of culture supernatant of HT29 cells containing exosome (100-fold concentrated solution diluted 10-fold with TBS) Mix in a 1.5 mL tube. After shaking at 25 ° C.
  • the culture supernatant was collected to remove the culture supernatant, and 0.5 mL of a washing buffer ((i) PBS containing 0.1% (w / v) BSA, or (ii) ) Washing was performed three times with 0.01% (w / v) nonionic surfactant (TBS containing Pluronic F-68). Then, after collecting the magnetic flux and discarding the washing solution, the antibody-bound magnetic particles were suspended in 1 ⁇ sample buffer 20 ⁇ L and allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes. A sample (20 ⁇ L) after washing with each washing buffer was applied to each antibody-bound magnetic particle, and SDS-PAGE was performed.
  • a washing buffer ((i) PBS containing 0.1% (w / v) BSA, or (ii) ) Washing was performed three times with 0.01% (w / v) nonionic surfactant (TBS containing Pluronic F-68). Then, after collecting the magnetic flux and discarding the washing solution, the antibody
  • the antibody-bound magnetic particles (anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody, anti-EpCAM antibody) after the reaction were mixed with 0.01% (w / v) nonionic surfactant (Pluronic F- 68) (FIG. 3, lane PLU), compared to washing with PBS containing 0.1% BSA (FIG. 3, lane BSA), it was confirmed that the exosome was not detached from the antibody. It was.
  • HT29 cells are cultured in (i) TBS (pH 7.4) or (ii) 0.1% (w / v) nonionic surfactant (Pluronic F-68) -containing TBS (pH 7.4).
  • the supernatant 100-fold concentrated solution was diluted 10-fold (10 ⁇ culture supernatant) and stored in a refrigerator for 3 days.
  • TritonX-100 HLB value 13.5
  • Nonidet P-40 HLB value 13.1
  • Anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody or anti-EpCAM antibody-bound magnetic particles (MS300 / Carboxyl manufactured by JSR Life Sciences) at a final particle concentration of 0.1% (w / v) and nonionic surface activity 100 ⁇ L of TBS (pH 7.4) containing 0.1% (w / v) of the agent (Pluronic F-68) and 100 ⁇ L of HT29 cell culture supernatant containing exosome were mixed in a 1.5 mL tube. . After shaking at 25 ° C.
  • FIG. 4 is a particle size distribution diagram of the eluted exosome when anti-CD63 antibody-bound magnetic particles are used.
  • a waveform of a particle size distribution having a peak around 100 nm was confirmed (FIG. 4).
  • the same particle size distribution was confirmed in all the eluted exosomes captured by the particles bound with the anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody or anti-EpCAM antibody (FIG. 5).
  • the magnetic particles bound with the anti-CD9 antibody the morphology of the eluted exosome prepared in the same manner as described above was directly observed with a transmission electron microscope. Negative staining with phosphotungstic acid or uranyl acetate was performed.
  • FIG. 6 a vesicle-like spherical structure (FIG. 6) and a lipid bilayer membrane of vesicles were confirmed (arrows in FIG. 6).
  • the vesicles captured by each antibody-bound magnetic particle have a particle size of around 100 nm as well as the previously reported exosome particle size, and the morphology is also in good agreement with the previously reported observation results, It was an exosome, and it was thought that the exosome was not destroyed by the capture process and the washing process.
  • Nucleic acids (total RNA) in vesicles captured by antibody-bound magnetic particles were detected using a microchip electrophoresis apparatus. Standard exosomes used as samples were separated from HT29 cell culture supernatant by ultracentrifugation, adjusted with PBS, and then subjected to protein quantification (BIO-RAD DC Protein Assay). The specific procedure is shown below.
  • Anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody or anti-EpCAM antibody-bound magnetic particles JSR Life Sciences MS300 / Carboxyl 0.1% (w / v) at the final particle concentration and nonionic surface activity 100 ⁇ L of TBS (pH 7.4) containing 0.1% (w / v) agent (Pluronic F-68) and 100 ⁇ L of PBS containing standard exosome (0 ⁇ g, 1 ⁇ g, 3 ⁇ g or 10 ⁇ g) in a 1.5 mL tube And mixed. This was shaken at 4 ° C.
  • RNA in vesicles captured by antibody-bound magnetic particles were measured by the following procedure using quantitative PCR.
  • antibody-binding magnetic particles (i) anti-CD63 antibody-binding magnetic particles, or (ii) anti-CD9 antibody-binding magnetic particles, anti-CD63 antibody-binding magnetic particles, anti-CD81 antibody-binding magnetic particles, and anti-EpCAM antibody antibody-binding magnetic particles
  • the total RNA was extracted in the same manner as in Test Example 9 except that the mixture (1: 1: 1: 1) was used at a final particle concentration of 0.1% (w / v).
  • microRNA let-7a-1 was quantified using miScript II RT kit (QIAGEN) and miScript SYBR Green PCR kit (QIAGEN). The results are shown in FIG. As a result, an amplification curve as shown in FIG. 8 was obtained, and specific microRNA could be detected from exosomes captured by antibody-bound magnetic particles.
  • various microRNAs derived from vesicles can be quantified and profiled using antibody-bound magnetic particles and used for disease determination.
  • the culture supernatant is collected to remove the culture supernatant, and 0.5 mL of a washing buffer (0.1% (w / v) nonionic surfactant (Pluronic F- 68) Washing was performed 3 times with TBS). Then, after collecting the magnetic flux and discarding the washing solution, the antibody-bound magnetic particles were suspended in 1 ⁇ sample buffer 20 ⁇ L and allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the detection of surface proteins (CD9, CD63, CD81, EpCAM) was performed by non-reduction treatment, and the detection of the inner protein (Alix, Hsp70) was performed by reduction treatment.
  • a total amount (20 ⁇ L) of each sample was applied, and SDS-PAGE was performed.
  • the gel was transferred to a PVDF membrane, and then shaken in a blocking buffer (TBS containing 1% (w / v) BSA and 0.1% (w / v) Tween 20) at 37 ° C. for 2 hours. This was washed with a washing buffer (TBS containing 0.1% (w / v) Tween 20), and the primary antibody and the labeled antibody were each reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • anti-CD9 antibodies (ab2215 manufactured by Abcam), anti-CD63 antibodies (MX-49.11299.5, Mouse IgG1, Santa Cruz sc-5275), anti-CD81 antibodies (Clone) are used as primary antibodies.
  • MRP Abnova MAB6435
  • anti-EpCAM antibody manufactured by JSR Life Sciences
  • anti-Alix antibody Alix (3A9) Mouse mAb, Cell signaling technology # 2171S
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Mouse ATRuTrU TruTu) : Anti-Mouse IgG HRP, Rockland 18-8817-33), respectively.
  • Proteins derived from vesicles in various cell culture supernatants and body fluids were detected using Western blotting.
  • serum 3 samples of healthy human serum (Serum A, Serum B, Serum C), and as plasma, 3 samples of healthy human heparin plasma (Plasma (Heparin) A, Plasma (Heparin) B, Plasma (Heparin) C) was used as urine, and three human healthy subject urine specimens (Urine D, Urine E, Urine F) were used. The specific procedure is shown below.
  • a washing buffer (0.1% (w / v) nonionic surfactant (Pluronic F- 68) Washing was performed 3 times with TBS). Then, after collecting the magnetic flux and discarding the washing solution, the antibody-bound magnetic particles were suspended in 1 ⁇ sample buffer 20 ⁇ L and allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes. A total amount (20 ⁇ L) of each sample was applied, and SDS-PAGE was performed. The gel was transferred to a PVDF membrane, and then shaken in a blocking buffer (TBS containing 1% (w / v) BSA and 0.1% (w / v) Tween 20) at 37 ° C. for 2 hours.
  • TBS blocking buffer
  • vesicle-derived surface protein (CD9) captured from all culture supernatants and body fluids was detected in the magnetic particles bound with anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, and anti-CD81 antibody (FIG. 11).
  • a surface protein (CD9) derived from vesicles was detected from the culture supernatant of EpCAM-producing cells HT29 and NCI-H520, but 293T and non-EpCAM-producing cells were detected.
  • No surface protein (CD9) derived from vesicles was detected from the body fluids (serum, plasma, urine) of all healthy subjects (FIG. 11).
  • vesicles derived from healthy individuals and affected individuals can be separated and detected by using particles to which a ligand for a disease-derived antigen such as a cancer marker is bound. Thereby, it can be determined that the subject has developed a disease by comparing the signal intensity of the biological sample derived from the subject with the signal intensity of the biological sample derived from the healthy subject.
  • the ratio of exosomes captured by magnetic particles to which anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, or anti-CD81 antibody is bound is high in the capture rate of NCI-H520 extracellular vesicles by anti-CD81 antibody-bound magnetic particles. It was different depending on the type of cancer cells (Tables 5 and 6). For this reason, by using particles that bind a ligand for antigen derived from a disease such as a common marker protein derived from vesicles (CD9, CD63, CD81, etc.) and a cancer marker (EpCAM, etc.), The vesicles can be separated and detected quantitatively by ELISA or the like.
  • the subject has developed a disease by comparing the signal intensity in the biological sample derived from the subject with the signal intensity of the biological sample derived from the healthy subject.
  • the drug efficacy of the disease therapeutic drug can be evaluated. it can.

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Abstract

　夾雑物の除去効率に優れ、かつ、脂質二重膜を有する小胞が破壊されにくい、脂質二重膜を有する小胞の分離方法を提供すること。　脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、非イオン性界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。

Description

分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物
　本発明は、分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物に関する。より詳細には、エクソソームなどの脂質二重膜を有する小胞の分離方法、該方法を利用した核酸又はタンパク質の検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、疾患判定又は薬効評価用キット、及び上記分離方法に用いる液状組成物に関する。
　小胞は脂質二重膜に包まれた構造を有するものであり、斯様な小胞のうち、生体内の体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、その一方で、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。
　また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のｍｉＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されている（非特許文献１）。
　また、エクソソーム上に発現する４回膜貫通型の膜タンパク質として、テトラスパニンファミリーに属するＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１があり、非特許文献２には、メラノーマ患者の血漿中のエクソソーム量が健常者のものと比べて高く、これがＣＤ６３に対する抗体や腫瘍関連マーカーのＣａｖｅｏｌｉｎ－１に対する抗体で検出・定量化できることが報告されている。また、遠心分離後の血漿サンプルに、ＣＤ６３抗体や種々の膜タンパク質に対する抗体等を組み合わせて反応させることで、癌患者におけるエクソソームに由来するシグナルを定量して解析することが行われている（特許文献１）。
国際公開第２０１０／０６５９６８号
Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３－２１（２００８） Ｍ．Ｌｏｇｏｚｚｉ．，ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　ＯＮＥ．，４，１－１０（２００９）
　ところで、抗体を結合した固相担体の反応液や洗浄液、抗体結合粒子を懸濁するバッファーの機能として、プレートなどの反応容器や粒子表面への非特異吸着や反応中に生じる粒子の凝集を低減する機能が要求される。
　しかしながら、上記エクソソームのような脂質二重膜に覆われた小胞を磁性粒子のような粒子で捕捉させた場合は、上記非特異吸着が起こりやすいというだけでなく、粒子同士の凝集が発生しやすく、小胞の回収率や粒子の洗浄効率に悪影響を及ぼす場合があった。反応後の抗体結合粒子の洗浄が不十分であると、検体由来の夾雑タンパク質が混入し、エクソソームの精製度が低下するという問題がある。
　そのため、脂質二重膜に覆われた小胞を分離しようとする場合であっても、固相担体への非特異吸着と粒子の凝集を低減でき、洗浄能の高いバッファーが求められる。
　しかるところ、一般に非特異吸着や粒子の凝集を抑えるために使用されているＢＳＡ等のタンパク質を粒子保存バッファーや反応バッファー等に添加しても、脂質二重膜に覆われた小胞を分離しようとする場合は粒子が凝集してしまい、更にその後に行われる精製エクソソームのプロテオーム解析等に影響を及ぼすことが判明した。
　また、脂質二重膜に覆われた小胞を分離するに際し、脂質二重膜を有する小胞の破壊が少ないことも要求される。
　本発明が解決しようとする課題は、夾雑物の除去効率に優れ、かつ、脂質二重膜を有する小胞が破壊されにくい、脂質二重膜を有する小胞の分離方法を提供することである。
　そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含む脂質二重膜を有する小胞の分離方法において、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、非イオン性界面活性剤の存在下で行うことによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、＜１＞脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、非イオン性界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする脂質二重膜を有する小胞の分離方法を提供するものである。
　また、本発明は、＜２＞上記＜１＞の分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むことを特徴とする小胞中の核酸の検出方法を提供するものである。
　更に、本発明は、＜３＞上記＜１＞の分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むことを特徴とする小胞由来のタンパク質の検出方法を提供するものである。
　更に、本発明は、＜４＞上記＜１＞の分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むことを特徴とする小胞由来のシグナル測定方法を提供するものである。
　更に、本発明は、＜５＞被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、被検者由来の生体試料を用いて、上記＜４＞のシグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする疾患の判定方法を提供するものである。
　更に、本発明は、＜６＞疾患治療薬の薬効評価方法であって、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、上記＜４＞のシグナル測定方法により、前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする疾患治療薬の薬効評価方法を提供するものである。
　更に、本発明は、＜７＞脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、非イオン性界面活性剤を含む液状組成物とを備えることを特徴とするキットを提供するものである。
　更に、本発明は、＜８＞脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体を洗浄するための液状組成物であって、非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする液状組成物を提供するものである。
　本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法は、夾雑物の除去効率に優れ、かつ、脂質二重膜を有する小胞が破壊されにくいものである。
　また、本発明のキット、液状組成物を、脂質二重膜を有する小胞の分離に用いた場合、夾雑物が十分に除去され、かつ、脂質二重膜を有する小胞が破壊されにくい。
粒子に結合した抗体とエクソソームとの反応に対する非イオン性界面活性剤の影響を示すグラフである。 非イオン性界面活性剤を含む洗浄バッファーの洗浄能を示す銀染色像である。 非イオン性界面活性剤を含む洗浄バッファーが、粒子に結合した抗体からエクソソームを剥離させにくいことを示すウェスタンブロット像である。 抗ＣＤ６３抗体を結合した磁性粒子で捕捉したエクソソームの粒径に問題にないことを示す粒度分布の波形である。 各抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームの粒径に問題にないことを示す粒度分布のグラフである。 抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームの形態に問題がないことを示す透過型電子顕微鏡像である。 抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームの中から核酸を検出することができたことを示すバイオアナライザの解析図である。 抗体結合磁性粒子から捕捉したエクソソーム中のｍｉｃｒｏＲＮＡを定量できることを示す増幅曲線である。 抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞から小胞由来の内側及び表面のタンパク質を検出できることを示すウェスタンブロット像である。 抗体結合磁性粒子による小胞の捕捉量が、反応させる小胞の量に比例することを示すウェスタンブロット像である。 各種培養上清及び体液から抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞由来の表面タンパク質を検出できたことを示すウェスタンブロット像である。
〔脂質二重膜を有する小胞の分離方法〕
　本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、非イオン性界面活性剤の存在下で行うことを特徴とするものである。
（非イオン性界面活性剤）
　本発明の分離方法で用いる非イオン性界面活性剤としては、芳香族基を分子中に含まないものが好ましい。このような芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤を使用することで、エクソソーム等の小胞を構成する脂質二重膜の破壊を招くことなく、固相担体への夾雑物の非特異吸着を低減できる。また、小胞と固相担体との捕捉反応の反応性が向上する。さらに、精製されたエクソソームのプロテオーム解析等への影響を抑えることもできる。
　上記のような芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤、グリセロールやペンタエリスリトールなどの多価アルコールに疎水性基を付加した多価アルコール型非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　上記ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレンオキサイド鎖を親水性基として有するものであれば特に限定されないが、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。
　これらの中では、非特異吸着低減効果や小胞へのダメージが少ないことから、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物が好ましい。
　上記ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物としては、ブロック共重合型のものが好ましく、ポリエチレンオキサイドからなるブロック（以下、ブロックＡともいう）と、ポリアルキレンオキサイドからなり前記アルキレンの炭素数が３以上であるブロック（以下、ブロックＢともいう）とを有するブロック共重合体がより好ましい。また、ブロックＢに含まれるアルキレンオキシ基の炭素数としては、３～６が好ましく、３又は４がより好ましく、３が特に好ましい。なお、ブロックＢに含まれるアルキレンオキシ基の炭素数が３のものは、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド付加物である。
　また、ブロックＡの合計含有量としては、ブロック共重合体中、１５～９９質量％が好ましく、５０～９９質量％がより好ましく、６０～９５質量％が更に好ましく、７０～９０質量％が特に好ましい。
　また、ブロックＢの合計含有量としては、細胞毒性の観点から、ブロック共重合体中、１～８５質量％が好ましく、１～５０質量％がより好ましく、５～４０質量％が更に好ましく、１０～３０質量％が特に好ましい。
　なお、これら含有量はＮＭＲ等で測定可能であり、ブロックＡが２つ以上ある場合は、２つ以上のブロックＡの各含有量の合計値を意味する。同様に、ブロックＢが２つ以上ある場合は、２つ以上のブロックＢの各含有量の合計値である。
　このようなポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物の中でも、プルロニック型非イオン性界面活性剤等に例示されるような、２つのブロックＡでブロックＢが挟まれた構造をもつ、ＡＢＡ型トリブロック共重合体が好ましい。
　ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物の市販品としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ－６２（いずれもＡＤＥＫＡ製）等が挙げられる。
　また、上記多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物としては、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物、ソルビトール脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物が好ましく、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物がより好ましい。
　また、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物における「脂肪酸」は、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸のいずれでもよい。また、脂肪酸は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくは直鎖状である。また、脂肪酸の炭素数は、好ましくは８～１８、より好ましくは１０～２０、更に好ましくは１２～１８である。具体的には、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等が挙げられる。
　多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物の市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５（いずれも和光純薬製）などが挙げられる。
　また、多価アルコールに疎水性基を付加した多価アルコール型非イオン性界面活性剤としては、グリセロールの脂肪酸エステル、ペンタエリスリトールの脂肪酸エステル、ソルビトール又はソルビタンの脂肪酸エステル、ショ糖の脂肪酸エステル、多価アルコールのアルキルエーテル、アルカノールアミン類の脂肪酸アミド等が挙げられる。これらの中でも、疎水性基として脂肪酸残基を有するものが好ましい。なお、脂肪酸残基は、上記多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物に含まれる脂肪酸残基と同様のものが好ましい。
　斯様な脂肪酸残基を有するものの中でも、ソルビトール又はソルビタンの脂肪酸エステルが好ましく、ソルビタン脂肪酸エステルがより好ましい。
　また、上記のような芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤の中でも、非特異吸着低減効果や小胞へのダメージが少ないことから、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物がより好ましく、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が更に好ましい。
　なお、非イオン性界面活性剤は、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物以外の非イオン性界面活性剤のＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅ）値は、好ましくは１３．１以上、より好ましくは１３．５以上である。
　なお、本明細書において、ＨＬＢ値は、ＧｒｉｆｆｉｎによるＨｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅを意味し、界面活性剤の水や油への親和性の程度を表す値である。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０のＨＬＢ値は１６．７であり、Ｔｗｅｅｎ８０のＨＬＢ値は１５．０である。また、芳香族基を含む非イオン性界面活性剤である、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＨＬＢ値は１３．５であり、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０のＨＬＢ値は１３．１である。
　また、非イオン性界面活性剤の重量平均分子量としては、細胞毒性の観点から、５００～５００００が好ましく、１０００～３００００がより好ましく、２０００～２００００が更に好ましい。
　なお、重量平均分子量は、液体クロマトグラフィー、ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ等で測定可能である。
　非イオン性界面活性剤の濃度は、系内の液相の総量（生体試料やバッファーなどの全容積から固相担体等の固形分を除いた量）に対して、終濃度で、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、特に好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは３．５％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下である。なお、複合体形成工程、洗浄工程いずれにおいても、上記の終濃度が好ましい。
　非イオン性界面活性剤の濃度が、上記の数値の範囲内であると、非特異吸着低減効果に優れ、固相担体が粒子の場合には凝集防止作用に優れる。また、リガンドと表面抗原との間の結合を阻害しない。
　また、本発明においては、複合体形成工程及び洗浄工程のうちいずれか一方を非イオン性界面活性剤の存在下で行ってもよく、複合体形成工程及び洗浄工程の両方を非イオン性界面活性剤の存在下で行ってもよい。また、複合体形成工程に先立ち、非イオン性界面活性剤を含むバッファーなどの組成物を生体試料に予め添加しておき、これを用いてもよい。
　具体的には、固相担体がプレートや繊維状で液相中に分散しない形状の場合には複合体形成工程の際の液相中や、洗浄工程で使用される洗浄液中などとして、非イオン性界面活性剤が系内に添加されていればよい。また、固相担体が磁性粒子のような粒子状で液相中に分散されるものの場合には、検体である生体試料に添加する前の粒子分散液に予め添加しておき、これを用いること、或いは生体試料を調整するバッファー中、洗浄工程で使用される洗浄液中等に添加されることが好ましい。
　例えば、抗体結合粒子の保存バッファーに非イオン性界面活性剤を添加することで、ＢＳＡやその他のポリマーと比較して粒子状の固相担体の分散性を高め、凝集及び保存容器や反応容器への非特異吸着を低減することができる。また、洗浄バッファー中に非イオン性界面活性剤を添加することで、動物細胞やエクソソーム等の小胞を破壊することなく、検体由来の非特異成分の吸着を激減させることができ、芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤を用いた場合であっても、抗体結合粒子の洗浄能を、芳香族基を有する非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００と同等のレベルまで上げることができる。
（複合体形成工程）
　複合体形成工程は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる工程である。上記接触により、リガンドに小胞が捕捉され、小胞と固相担体との複合体が形成される。なお、複合体形成工程の反応系には、上記固相担体に結合したリガンド以外に、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドも共存していてもよい。
　上記生体試料は脂質二重膜を有する小胞を含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。この中でも、体液、細胞培養上清が好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられ、好ましくは血液組成成分、尿である。本発明の分離方法によれば、広範な種類の生体試料から選択的かつ効率よく小胞を分離できる。例えば、生体試料として血漿や血清を用いた場合でも非特異吸着が起こりにくい。
　なお、血液組成成分は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
　上記生体試料は、非イオン性界面活性剤を含むバッファー組成物に添加しておくなどして予め前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。すなわち、本発明の分離方法によれば、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法等による前処理を行わず簡便に選択的な分離をすることも可能である。
　また、上記脂質二重膜を有する小胞としては、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソームのような小胞が挙げられるが、本発明の分離方法は、小胞がエクソソームである場合に特に好ましく用いられる。一般的には、固相担体が磁性粒子のような粒子状のものである場合、粒子に結合した抗体を介してエクソソームを捕捉した際に、粒子同士が凝集しやすくなり、粒子の再分散が困難になるため、夾雑物の洗い流しが困難になることがあるが、本発明においては、非イオン性界面活性剤を添加することで粒子同士の凝集を低減することができる。
　また、小胞の表面に存在する表面抗原は、小胞の表面に存在する物質で抗原性のあるものであれば特に限定されない。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ－１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ－βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質が好ましい。　
　また、上記生体試料の使用量は、系内の液相の総量（生体試料やバッファーなどの全容積から固相担体等の固形分を除いた量）に対して、終濃度で、１～９０％（ｗ／ｖ）が好ましく、１０～５０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
　また、本発明の分離方法に用いる固相担体は、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合したものであれば特に限定されない。
　リガンドとしては、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体が好ましく、エクソソームの表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体がより好ましい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
　上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ　ａｓ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８－９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号公報等を参照して作製できる。
　なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等が挙げられる。
　上記リガンドを結合させる固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
　また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等が挙げられる。
　本発明においては、固液分離や洗浄の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。
　上記磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
　中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８－３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
　ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５～２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ２Ｏ４（Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、γ－Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ－Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
　また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
　上記単官能性モノマーとして、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。
　また、上記架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
　また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
　第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
　リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
　また、上記リガンドが結合した固相担体の使用量は、系内の液相の総量（生体試料やバッファーなどの全容積から固相担体等の固形分を除いた量）に対して、終濃度で、０．００５～５％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０１～１％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
　複合体形成工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、塩類や、アルブミン等のタンパク質、前述した非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤等を用いて行ってもよいが、後の分析等を考慮すると、タンパク質や核酸は使用しない方が好ましい。
　複合体形成工程における反応温度は、通常２～４２℃の範囲内であり、反応時間は、通常５分～２４時間である。２～８℃で反応を行う場合、反応時間は好ましくは８～３０時間程度、室温（２０℃）～４２℃で反応を行う場合、反応時間は好ましくは５～６０分間程度である。
　複合体形成工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５～１０の範囲、より好ましくはｐＨ６～８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
（洗浄工程）
　洗浄工程は、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質等が除去される。複合体形成工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
　上記洗浄工程は、通常、固相担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、上記芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。
　また、固相担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の夾雑物を磁性粒子表面から更に効率よく洗浄・分離除去できる。
　具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。
　洗浄液としては、上記芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤と上記複合体形成工程で挙げた緩衝液を含む洗浄液が好ましい。洗浄液のｐＨは、好ましくはｐＨ５～１０の範囲、より好ましくはｐＨ６～８の範囲である。具体的には、０．０１％非イオン性界面活性剤含有ＴＢＳ等が挙げられる。
（解離工程）
　本発明の分離方法は、上記洗浄工程後、捕捉された小胞をリガンドから解離する解離工程を有していてもよい。
　リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合を解離される条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、“Ａｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　＆　ｍｅｔｈｏｄｓ”　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
〔核酸の検出方法及びタンパク質の検出方法〕
　本発明の小胞中の核酸の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むものである。
　また、本発明の小胞由来のタンパク質の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むものである。
　これら検出方法は、上記分離方法を行う以外は常法にしたがっておこなえばよい。上記脂質二重膜を有する小胞がエクソソームである場合、回収されたエクソソームから核酸やタンパク質を、ＰＣＲ法、電気泳動法、ウェスタンブロッティング法、免疫化学的方法等の公知の方法に従って検出すればよい。また、核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡが挙げられる。
　特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（特にｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
〔シグナル測定方法〕
　本発明の小胞由来のシグナル測定方法は、上記分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むものである。
　上記シグナル強度の測定は免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法等が挙げられ、簡便に感度よく抗体を検出できる点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。
　ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合の分離方法の一例を示す。まず、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドを固相担体に結合した後、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料を接触させて複合体を形成させ、その後洗浄する。そこに、モノクローナル抗体又はその抗体断片や疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を修飾した標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、生体試料に含まれる小胞に由来するシグナル量や、生体試料に含まれる疾患特異的小胞量を測定することができる。
〔疾患の判定方法〕
　本発明の被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法は、被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ｉ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
　そして、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者由来の生体試料のシグナル強度とを対比して、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい（以下、工程（ＩＩ）ともいう）。
　本発明の疾患の判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
　また、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性の指標に応用すれば、癌ワクチンの癌疾患に対する効果判定にも応用できる。
　工程（Ｉ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
　また、工程（ＩＩ）は、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度について、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
〔疾患治療薬の薬効評価方法〕
　本発明の疾患治療薬の薬効評価方法は、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により、複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
　そして、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい（以下、工程（Ｂ）ともいう）。
　上記疾患治療薬としては、上記判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
　工程（Ａ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
　また、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で測定されたシグナル強度について、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
　特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
〔キット〕
　本発明のキットは、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、非イオン性界面活性剤を含む液状組成物とを備えることを特徴とするものである。斯かるキットは、上記分離方法、上記疾患の判定、上記疾患治療薬の薬効評価に有用である。
　固相担体、液状組成物に含まれる非イオン性界面活性剤としては、上記分離方法で用いるものと同様のものが挙げられる。非イオン性界面活性剤の濃度は、液状組成物全量に対して、０．００５～１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０２～２％（ｗ／ｖ）がより好ましい。また、液状組成物のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５～１０の範囲、より好ましくはｐＨ６～８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
〔液状組成物〕
　本発明の液状組成物は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、複合体を洗浄するための液状組成物であって、非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
　本発明の液状組成物の組成、ｐＨは、上記本発明のキットが備える液状組成物と同様である。
　本発明の液状組成物は、本発明の分離方法に使用されるものである。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（試験例１　凝集確認試験（１））
　まず、コントロールのバッファーとして、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）を、実施例１のバッファーとして、濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８（ＡＤＥＫＡ、以下同じ））をＴＢＳ（ｐＨ７．４）に添加したものを、それぞれ準備した。
　次いで、上記各バッファーに、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子（Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　ＣＤ６３　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｒｅｆ　１０６０６Ｄ）を、濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように添加し、この粒子保存バッファー１００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで５倍希釈）１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。これを２５℃で１時間振とうした後、チューブの内壁面に付着した抗体結合磁性粒子の凝集体を目視で確認した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、ＴＢＳのみに磁性粒子を懸濁した場合（コントロール）は、磁性粒子凝集体の内壁面への付着が確認されたが、ＴＢＳに非イオン性界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）添加して磁性粒子を懸濁した場合（実施例１）には、この凝集体の付着は確認されなかった。
（試験例２　凝集確認試験（２））
　まず、コントロールのバッファーとしてＴＢＳ（ｐＨ７．４）を、実施例２～７のバッファーとして、下記表２に示す濃度になるように非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）をＴＢＳ（ｐＨ７．４）に添加したものを、比較例１及び２のバッファーとして、下記表２に示す濃度になるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＴＢＳ（ｐＨ７．４）に添加したものを、それぞれ準備した。
　次いで、上記各バッファーに、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製、以下同じ）を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、以下同じ）を、濃度が０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、この粒子保存バッファー１００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで５倍希釈）１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。これを２５℃で１時間振とうした後、チューブの内壁面に付着した抗体結合磁性粒子の凝集体を目視で確認した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子においても、ＴＢＳのみに懸濁した場合（コントロール）には、磁性粒子の凝集体が壁面に付着している様子が確認された。また、ＢＳＡを添加してもこの凝集は低減されなかった（比較例１、２）。
　一方、ＴＢＳに非イオン性界面活性剤を０．０２～１．０％（ｗ／ｖ）添加して懸濁した場合（実施例２～７）には、この凝集体の付着は確認されなかった。
　なお、抗ＥｐＣＡＭ抗体を、抗ＣＤ９抗体（アブカム社製　ａｂ２２１５、以下同じ）又は抗ＣＤ６３抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製、以下同じ）に変更した以外は上記試験例２と同様にして試験を行ったところ、試験例２と同様の結果が得られた。
（試験例３　非イオン性界面活性剤添加による反応への影響）
　９６ウェル白色プレート（コーニング社製）に、（ｉ）抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．０５％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）１．０％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳと、（ii）上記（ｉ）と同じ抗体をアルカリホスファターゼで標識した抗体のＭＥＳ溶液（１μｇ／ｍＬ）と、（iii）ＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで１００倍希釈）とを、それぞれ２５μＬずつ入れて混合した。これを、２５℃で２０分間振とうした後、集磁しながら洗浄バッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を用いて反応後の抗体結合磁性粒子を洗浄した。発光基質（ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。
　また、上記（ｉ）の粒子懸濁液における非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）の濃度を、１．０％（ｗ／ｖ）から、０％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）に変更して得た粒子保存バッファーについても、上記と同様にして発光強度を測定した。
　これら結果を図１に示す。
　図１に示すとおり、粒子保存バッファーに非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）を０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）（終濃度０．００３３～０．３３％（ｗ／ｖ））添加しても、磁性粒子に結合された４種の抗体とエクソソームとの反応は阻害されなかった。
（試験例４　洗浄能確認試験）
　抗体結合磁性粒子に検体（血清、血漿、尿）を反応させた場合、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）のみによる粒子洗浄では、検体由来の非特異吸着を十分に低減できないことをＳＤＳ－ＰＡＧＥの銀染色で確認した。特に、血清を用いた場合に非特異吸着が多かったため、非イオン性界面活性剤を含む粒子洗浄バッファーの洗浄能を、血清を用いて以下の手順で確認した。
　まず、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１５０μＬと、ヒト健常者由来の血清１５０μＬとを１．５ｍＬチューブに入れ、混合した。
　これを、２５℃で１時間振とうした後、集磁して血清を除去し、０．５ｍＬの洗浄バッファー（（ｉ）ＴＢＳ、（ii）０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００含有ＴＢＳ、又は（iii）０．０１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８含有ＴＢＳにて洗浄を２回行った。
　次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー（ＮｕＰＡＧＥ　ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　（４×），　ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｔ　ｎｏ．　ＮＰ０００８、以下同じ）２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置した。全量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにアプライし、銀染色（コスモバイオ社製）を行った。結果を図２に示す。
　図２に示すとおり、４種の抗体結合磁性粒子すべてにおいて、ＴＢＳのみによる洗浄（図２：レーンＴＢＳ）では、多量の血清由来成分が粒子に非特異吸着したままであったが、洗浄バッファーに０．０１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）を添加することで（図２：レーンＰＬ、レーンＴＸ）、非特異吸着は劇的に減少した。
　なお、芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）は、脂質二重膜への影響が少ないため、このような芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤が特に最適であると考えられる。
（試験例５　非イオン性界面活性剤含有洗浄バッファーによる特異的結合への影響）
　非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）含有洗浄バッファーによって、検体由来の非特異成分の吸着だけでなく、抗体結合磁性粒子に特異的に反応した抗原（エクソソーム）までもが抗体から剥がれていないかを確認するために、ウェスタンブロットによるタンパク質検出を以下の手順で行った。
　まず、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで１０倍希釈）１００μＬとを１．５ｍＬチューブに入れて混合した。
　これを、２５℃で１時間振とうした後、集磁して培養上清を除去し、０．５ｍＬの洗浄バッファー（（ｉ）０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳ、又は（ii）０．０１％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）含有ＴＢＳ）にて洗浄を３回行った。
　次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置した。各抗体結合磁性粒子に対する各洗浄バッファーによる洗浄後のサンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐａｃｋ　Ｍｉｄｉ　ｆｏｒｍａｔ，　０．２μｍ　ＰＶＤＦ（ＢＩＯ－ＲＡＤ，　Ｃｏｎｔｒｏｌ　４０００７２０１９））に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、一次抗体として、抗ＣＤ８１抗体（Ｃｌｏｎｅ　Ｍ３８、Ａｂｎｏｖａ　ＭＡＢ６４３５）を１μｇ／ｍＬ含む溶液（溶剤：０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＴＢＳ）、及び標識抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ　ＴｒｕｅＢｌｏｔ　ＵＬＴＲＡ：　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　１８－８８１７－３３）を１μｇ／ｍＬ含む溶液（溶剤：０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＴＢＳ）を、それぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ＃３４０９５）を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ－３０００，　ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図３に示す。
　図３に示すとおり、反応後の抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体）を０．０１％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）を含むＴＢＳで洗浄しても（図３、レーンＰＬＵ）、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳによる洗浄と比較して（図３、レーンＢＳＡ）、抗体からエクソソームが剥がれていないことが確認された。
（試験例６　安定性試験）
　抗体結合磁性粒子の反応時及び洗浄時に非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）が含まれていても、エクソソームが安定であることを確認するために、エクソソームの粒度分布を以下の手順で測定した。
　まず、（ｉ）ＴＢＳ（ｐＨ７．４）又は（ii）０．１％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）含有ＴＢＳ（ｐＨ７．４）にて、ＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液）を１０倍希釈し（１０×培養上清）、冷蔵で３日間保存した。その後、１０×培養上清をＴＢＳで１００倍希釈して、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０（ＮＡＮＯ　ＳＩＧＨＴ社）を用いてエクソソームの粒度分布を確認した。
　エクソソームを０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）を含むＴＢＳ中で保存しても、ＴＢＳのみによる保存と比較して、エクソソームの粒度分布に変化はみられなかった。このため、抗体結合磁性粒子の保存バッファー及び洗浄バッファー中に非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）を添加しても、エクソソームの安定性に影響はないと考えられた。
（試験例７　非イオン性界面活性剤）
　表３に示す各種非イオン性界面活性剤による反応時における影響を確認するために、各非イオン性界面活性剤存在下における抗体結合磁性粒子とエクソソームとの反応性を以下の手順で測定した。
　まず、（ｉ）抗ＣＤ８１抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．０５％（ｗ／ｖ）及び表３に示す非イオン性界面活性剤１．０％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）２００μＬ、又は（ii）抗ＣＤ８１抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．０５％（ｗ／ｖ）及びＢＳＡ０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳ２００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで１０倍希釈）１０μＬとを１．５ｍＬチューブに入れて混合し、２５℃で１時間振とうした。
　これを９６ウェル白色プレート（コーニング社製）に５０μＬ添加し、集磁しながら洗浄バッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を用いて反応後の抗体結合磁性粒子を洗浄した。これに、抗ＣＤ８１抗体をアルカリホスファターゼで標識した抗体のＭＥＳ溶液（１μｇ／ｍＬ）５０μＬを入れて混合した。
　これを２５℃で２０分間振とうした後、集磁しながら洗浄バッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を用いて反応後の抗体結合磁性粒子を洗浄した。発光基質（富士レビオ製、ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を表４に示す。
　表４に示すとおり、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ－６２）及びソルビタンの脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０）を添加しても、エクソソームの破壊による抗体結合磁性粒子との反応性の低下は確認されなかった。一方、芳香族基を含む非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＨＬＢ値１３．５）及びＮｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（ＨＬＢ値１３．１）では、エクソソームの破壊が原因と思われる反応性の低下が確認された。
　以上より、抗体結合磁性粒子の保存バッファー及び洗浄バッファー中に非イオン性界面活性剤（芳香族基を分子中に含まないもの）を添加しても、エクソソームの安定性及び抗体結合磁性粒子との反応性に影響はないと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（試験例８　捕捉小胞の確認）
　抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームが破壊されていないことを確認するために、粒度分布計及び透過型電子顕微鏡を用いて、エクソソームの粒径と形態を以下の手順で測定した。
　抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）を終粒子濃度で０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。これを、２５℃で１時間振とうした後、集磁して培養上清を除去し、０．５ｍＬの洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８含有ＴＢＳ）にて洗浄を３回行った。
　集磁して洗浄バッファーを除去し、エクソソーム溶出バッファー（ＪＳＲライフサイエンス社製　ＥｘｏＣａｐＴＭ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｋｉｔｓ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ）にて抗体結合磁性粒子を懸濁し、溶出エクソソームを調製した。その後、溶出エクソソームの粒度分布をナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０、ＮＡＮＯ　ＳＩＧＨＴ社）にて計測した。結果を図４及び図５に示す。なお、図４は、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を用いた場合の溶出エクソソームの粒度分布図である。
　その結果、１００ｎｍ前後にピークを有する粒度分布の波形が確認された（図４）。また、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した粒子で捕捉したすべての溶出エクソソームで同様の粒度分布が確認された（図５）。
　抗ＣＤ９抗体を結合した磁性粒子を用いて、上記と同様に調製した溶出エクソソームについて、透過型電子顕微鏡により形態を直接観察した。リンタングステン酸又は酢酸ウラニルによるネガティブ染色を行った。結果を図６に示す。
　その結果、小胞様の球形の構造体（図６）と小胞の脂質二重膜が確認された(図６中の矢印)。
　以上の結果から、各抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞は、既報のエクソソームの粒径と同様に１００ｎｍ前後の粒径を有し、且つ形態も既報の観察結果とよく一致しているため、エクソソームであり、捕捉工程と洗浄工程によりエクソソームが破壊されていないと考えられた。
（試験例９　小胞中の核酸の検出）
　抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞中の核酸（全ＲＮＡ）を、マイクロチップ型電気泳動装置を用いて検出した。サンプルとして使用するスタンダードエクソソームは、ＨＴ２９細胞の培養上清から超遠心法によりエクソソームを分離し、ＰＢＳで調整後、タンパク定量（ＢＩＯ－ＲＡＤ　ＤＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ）を行った。具体的手順を以下に示す。
　抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）を終粒子濃度で０．１％（ｗ／ｖ)及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬと、スタンダードエクソソーム（０μｇ、１μｇ、３μｇ又は１０μｇ）含有ＰＢＳ１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。これを、４℃で約１８時間振とうした後、集磁して未反応のエクソソームを除去し、１ｍＬの洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８含有ＴＢＳ）にて洗浄を３回行い、集磁して洗浄バッファーを除去した。
　抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームから、ＲＩＰ－Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＭＢＬ社製、２－ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ参照）を用いて、全ＲＮＡを抽出後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで調整した。
　抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームからの全ＲＮＡを、マイクロチップ型電気泳動装置バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて検出した。結果を図７に示す。
　図７に示すとおり、Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡとｍＲＮＡなどのピークが確認された。また、検出される核酸の量は、スタンダードエクソソーム量に比例して増加した。
（試験例１０　小胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡの検出）
　抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞中の核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を、定量ＰＣＲ法を用いて、以下の手順で測定した。
　まず、抗体結合磁性粒子として、（ｉ）抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、又は（ii）抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体抗体結合磁性粒子との混合物（質量比１：１：１：１）を、それぞれ終粒子濃度で０．１％（ｗ／ｖ)で用いた以外は試験例９と同様の方法で全ＲＮＡを抽出した。次いで、ｍｉＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）及びｍｉＳｃｒｉｐｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｌｅｔ－７ａ－１）を定量した。結果を図８に示す。
　その結果、図８に示すような増幅曲線が得られ、抗体結合磁性粒子で捕捉したエクソソームから、特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡを検出することができた。これにより、抗体結合磁性粒子を用いて小胞由来の各種ｍｉｃｒｏＲＮＡを定量し、プロファイリングすることで疾患の判定に利用できる。
（試験例１１　小胞由来のタンパク質の検出）
　抗体結合磁性粒子で捕捉した小胞の内側及び表面に存在する小胞由来のタンパク質を、ウェスタンブロット法を用いて検出した。
　まず、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬと、エクソソームを含むＨＴ２９細胞の培養上清（１００倍濃縮液をＴＢＳで１０倍希釈）０．１ｍＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。
　これを、２５℃で１時間振とうした後、集磁して培養上清を除去し、０．５ｍＬの洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）含有ＴＢＳ）にて洗浄を３回行った。
　次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置した。なお、表面タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＥｐＣＡＭ）の検出は非還元処理で、内側タンパク質（Ａｌｉｘ、Ｈｓｐ７０）の検出は還元処理で行った。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄し、一次抗体及び標識抗体をそれぞれ２５℃で１時間反応させた。
　なお、Ｈｓｐ７０以外のタンパク質の検出は、一次抗体として、抗ＣＤ９抗体（アブカム社製　ａｂ２２１５）、抗ＣＤ６３抗体（ＭＸ－４９．１２９．５、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ1、ＳａｎｔａＣｒｕｚ　ｓｃ－５２７５）、抗ＣＤ８１抗体（Ｃｌｏｎｅ　Ｍ３８、Ａｂｎｏｖａ　ＭＡＢ６４３５）、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）、抗Ａｌｉｘ抗体（Ａｌｉｘ　（３Ａ９）Ｍｏｕｓｅ　ｍＡｂ、Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　＃２１７１Ｓ）を、標識抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ　ＴｒｕｅＢｌｏｔ　ＵＬＴＲＡ：　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　１８－８８１７－３３）を、それぞれ使用した。また、Ｈｓｐ７０の検出は、Ａｎｔｉ－ＨＳＰ７０，Ｒａｂｂｉｔ－Ｐｏｌｙ,ｗｉｔｈ　ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＢＩ社製、ＥＸＯＡＢ－Ｈｓｐ７０Ａ－１）を使用した。
　上記一次抗体及び標識抗体の反応が終了した後、洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄し、発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｔ＃３４０９５）を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ－３０００，　ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図９に示す。
　その結果、すべての抗体結合磁性粒子において、捕捉したエクソソームから、小胞由来の表面タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＥｐＣＡＭ）及び内側タンパク質（Ａｌｉｘ、Ｈｓｐ７０）のバンドを目的のサイズで検出した（図９）。
　また、上記反応に使用したＨＴ２９細胞の培養上清０．１ｍＬを、スタンダードエクソソーム（１、３、１０μｇ）、ＨＴ２９細胞の培養上清１ｍＬにそれぞれ変えて、上記と同様の方法により、小胞由来のタンパク質の量（表面タンパク質ＣＤ９）を検出した。一次抗体として抗ＣＤ９抗体を使用した場合の結果を図１０に示す。
　その結果、反応させるスタンダードエクソソーム量（１、３、１０μｇ）及び培養上清の液量（０．１、１ｍＬ）に比例して、検出される小胞由来のタンパク質の量が増加した（図１０）。このため、小胞由来のタンパク質を定量することで、体液又は培養上清中の小胞の量を測定することができる。
（試験例１２　体液及び培養上清からの小胞の検出）
　各種細胞培養上清及び体液（血清、血漿、尿）中の小胞由来のタンパク質を、ウェスタンブロット法を用いて検出した。なお、血清として、ヒト健常者血清３検体（Ｓｅｒｕｍ　Ａ、Ｓｅｒｕｍ　Ｂ、Ｓｅｒｕｍ　Ｃ）を、血漿として、ヒト健常者ヘパリン血漿３検体（Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ）　Ａ、Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ）　Ｂ、Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ）　Ｃ）を、尿として、ヒト健常者尿３検体（Ｕｒｉｎｅ　Ｄ、Ｕｒｉｎｅ　Ｅ、Ｕｒｉｎｅ　Ｆ）を、それぞれ使用した。具体的手順を以下に示す。
　まず、（ｉ）抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬと、（ii）細胞培養上清（ＨＴ－２９、２９３Ｔ又はＮＣＩ－Ｈ５２０）又はヒト健常者由来の体液（血清、血漿又は尿（各３検体））１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに入れて混合した。
　これを、２５℃で２０分間振とうした後、集磁して未反応液を除去し、０．５ｍＬの洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）含有ＴＢＳ）にて洗浄を３回行った。
　次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した。
　一次抗体として抗ＣＤ９抗体、及び標識抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ　ＴｒｕｅＢｌｏｔ　ＵＬＴＲＡ：　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　１８－８８１７－３３）をそれぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ－３０００，ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１１に示す。
　その結果、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体を結合した磁性粒子において、すべての培養上清及び体液から捕捉した小胞由来の表面タンパク質（ＣＤ９）を検出した（図１１）。一方、抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合した磁性粒子においては、ＥｐＣＡＭ産生細胞のＨＴ２９及びＮＣＩ－Ｈ５２０の培養上清からは、小胞由来の表面タンパク質（ＣＤ９）を検出したが、ＥｐＣＡＭ非産生細胞の２９３Ｔ及びすべての健常者体液（血清、血漿、尿）から小胞由来の表面タンパク質（ＣＤ９）は検出されなかった（図１１）。
　このため、癌マーカーなど疾患由来の抗原に対するリガンドを結合した粒子を用いることで、健常者由来及び罹患者由来の小胞を分離し、検出することができる。これにより、被検者由来の生体試料におけるシグナル強度を健常者由来の生体試料のシグナル強度と対比することで、被検者が疾患を発症していることを判定することができる。
（試験例１３　ＥＬＩＳＡによる小胞の検出）
　小胞由来のシグナル強度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量的に検出した。具体的手順を以下に示す。
　９６ウェル白色プレート（コーニング社製）に、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合させた磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）０．１％（ｗ／ｖ）及び非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８）０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（ｐＨ７．４）と、細胞（２９３Ｔ、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＨＴ２９又は２２Ｒｖ－１）の培養上清とを、それぞれ２５μＬを入れて混合した。これを、２５℃で２０分間振とうした後、集磁しながら洗浄バッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を用いて反応後の抗体結合磁性粒子を洗浄した。集磁しながら洗浄バッファーを除去し、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体をアルカリホスファターゼで標識した抗体のＭＥＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）５０μＬを入れた。これを、２５℃で２０分間振とうした後、集磁しながら洗浄バッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）を用いて反応後の抗体結合磁性粒子を洗浄した。発光基質（富士レビオ製、ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。
　その後、癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＨＴ２９、２２Ｒｖ－１）由来の小胞から測定したシグナル強度を、２９３Ｔ細胞由来の小胞から測定したシグナル強度と対比した。結果を表５及び６に示す。
　その結果、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、又は抗ＣＤ８１抗体を結合させた磁性粒子では、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９抗体による検出（表５）及びＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体（表６）による検出ともに、癌細胞外小胞由来のシグナル強度は、２９３Ｔ細胞外小胞由来のシグナル強度と近接していた。一方、抗ＥｐＣＡＭ抗体を結合させた磁性粒子では、癌細胞外小胞由来のシグナル強度は、２９３Ｔ細胞外小胞由来のシグナル強度と対比して顕著に高かった。
　また、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、又は抗ＣＤ８１抗体を結合させた磁性粒子に捕捉されるエクソソームの割合は、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞外小胞の抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子による捕捉率が高いこと等、癌細胞の種類によって異なっていた（表５、表６）。
　このため、小胞由来の共通マーカータンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等）及び癌マーカーなど（ＥｐＣＡＭ等）疾患由来の抗原に対するリガンドを結合した粒子を用いることで、健常者由来及び罹患者由来の小胞を分離し、ＥＬＩＳＡ法等により定量的に検出することができる。これにより、被検者由来の生体試料におけるシグナル強度を健常者由来の生体試料のシグナル強度と対比することで、被検者が疾患を発症していると判定することができる。
　また、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料から、同様の方法で小胞由来のシグナル強度を検出し、対比することで、疾患治療薬の薬効を評価することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

Claims (20)

  1. 　脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、
    　前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、
    　前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、非イオン性界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、
    　脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
  2. 　前記非イオン性界面活性剤が、芳香族基を分子中に含まないものである、請求項１に記載の分離方法。
  3. 　前記非イオン性界面活性剤が、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物、ソルビタンの脂肪酸エステル、ソルビトールの脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物、及びソルビトール脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物よりなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載の分離方法。
  4. 　前記非イオン性界面活性剤が、ブロック共重合型のポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の分離方法。
  5. 　前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレンオキサイドからなるブロックと、ポリアルキレンオキサイドからなり前記アルキレンの炭素数が３以上であるブロックとを有するブロック共重合体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の分離方法。
  6. 　前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、請求項１～５のいずれか１項に記載の分離方法。
  7. 　前記小胞が、エクソソームである、請求項１～６のいずれか１項に記載の分離方法。
  8. 　前記表面抗原が、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質であり、前記リガンドが、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の分離方法。
  9. 　前記固相担体が、磁性粒子である、請求項１～８のいずれか１項に記載の分離方法。
  10. 　前記洗浄工程が、前記磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程を含む、請求項９に記載の分離方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
    　さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むことを特徴とする、
    　小胞中の核酸の検出方法。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
    　さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むことを特徴とする、
    　小胞由来のタンパク質の検出方法。
  13. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
    　さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むことを特徴とする、
    　小胞由来のシグナル測定方法。
  14. 　被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、
    　被検者由来の生体試料を用いて、請求項１３に記載のシグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、
    　疾患の判定方法。
  15. 　疾患治療薬の薬効評価方法であって、
    　疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、請求項１３に記載のシグナル測定方法により、前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、
    　疾患治療薬の薬効評価方法。
  16. 　脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、
    　非イオン性界面活性剤を含む液状組成物とを備えることを特徴とする、
    　キット。
  17. 　前記非イオン性界面活性剤が、芳香族基を分子中に含まないものである、請求項１６に記載のキット。
  18. 　疾患の判定用又は疾患治療薬の薬効評価用である、請求項１６又は１７に記載のキット。
  19. 　脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体を洗浄するための液状組成物であって、
    　非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする、
    　液状組成物。
  20. 　前記非イオン性界面活性剤が、芳香族基を分子中に含まないものである、請求項１９に記載の組成物。
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