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WO2011108540A1 - ヌクレオチドを識別する方法および装置、ならびにポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法および装置 - Google Patents

ヌクレオチドを識別する方法および装置、ならびにポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法および装置 Download PDF

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WO2011108540A1
WO2011108540A1 PCT/JP2011/054631 JP2011054631W WO2011108540A1 WO 2011108540 A1 WO2011108540 A1 WO 2011108540A1 JP 2011054631 W JP2011054631 W JP 2011054631W WO 2011108540 A1 WO2011108540 A1 WO 2011108540A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
value
nucleotide
current
mode
electrodes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/054631
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正輝 谷口
真楠 筒井
一道 横田
川合　知二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Priority to US13/992,328 priority Critical patent/US9194838B2/en
Publication of WO2011108540A1 publication Critical patent/WO2011108540A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/883,494 priority patent/US10202644B2/en
Priority to US16/234,908 priority patent/US10876159B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores

Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for identifying nucleotides by analyzing the nucleotides using amperometry.
  • the invention also relates to a method and apparatus for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide using amperometry.
  • the technology for analyzing the nucleotide sequence of DNA is not only applied to the field of academic research, but is also applied to fields such as medicine, drug discovery, and criminal investigation, and there is an increasing interest in the development of this technology. Yes.
  • the DNA sequencers that have been developed so far use a light measurement technique in which a label added to a nucleotide is identified by fluorescence, and does not directly identify the nucleotide itself.
  • a label added to a nucleotide it is necessary to chemically modify the nucleotide using PCR. This procedure not only requires a large number of reagents, but also takes a lot of time. Therefore, a large amount of money and time are required to perform DNA sequencing.
  • Nanopore a chemically designed ⁇ -hemolysin nanoscale pore
  • Non-Patent Documents 6 and 7 sequencing a single molecule of DNA by detecting the transient block of ionic current that occurs during the passage of a single-stranded DNA oligomer through a biological nanopore embedded in cyclodextrin.
  • Such solid and structured solid nanopores have attracted interest and have served as platforms for studying the dynamics of single biomolecules passing through the pores (Non-Patent Documents 1 and 2). 8-11).
  • DNA sequencing based on ion current using the above-described detector has the following problems: (1) limited pore size selection; (2) unstable system; There is no prospect of practical use of a sequencer using biological nanopores, and sequencing of DNA based on ion current having resolution of one molecule is still under investigation (see Non-Patent Documents 3 and 4). .
  • sequencing theory based on transverse electron transport has been proposed. This theory is based on the principle of detecting the lateral conductivity characteristic of each nucleotide as it passes through the nanoscale space between a pair of electrodes, as shown in FIG. The conductivity is related to the gap difference between HOMO and LUMO of each nucleotide). Specifically, when one DNA passes through the nanopore, each nucleotide is applied to an electrode pair (hereinafter referred to as “nanoelectrode pair”) having a nanoscale interelectrode distance provided at the end of the nanopore. If the current value of the generated tunnel current is measured, the nucleotide sequence can be read directly without labeling based on this current value.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to realize nucleotide identification and determination of a polynucleotide nucleotide sequence using amperometry.
  • the present inventors have found that the value obtained by statistically analyzing the maximum current value of the pulse of the tunnel current that changes with each measurement is a value unique to each nucleotide. The inventors have found that this value can be used as an index for identifying nucleotides, and have completed the present invention. Such statistical analysis has not received any attention in the prior art.
  • the method for identifying nucleotides includes a step of passing nucleotides between electrodes a plurality of times, a step of detecting a pulse of a tunnel current generated between electrodes when nucleotides pass, and a maximum current value in each pulse.
  • the method includes a step of calculating a mode value and a step of comparing the calculated mode value with a reference value.
  • the apparatus for identifying a nucleotide includes an electrode pair having a distance between electrodes through which a nucleotide can pass, a means for applying a voltage between the electrodes, a means for detecting a pulse of a tunnel current generated between the electrodes, Means is provided for calculating a mode value of the maximum current value in each pulse, and means for comparing the calculated mode value with a reference value.
  • the method for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the present invention comprises a step of passing a polynucleotide between electrodes, and a step of measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes.
  • the apparatus for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the present invention comprises an electrode pair having a distance between electrodes through which the polynucleotide can pass, means for applying a voltage between the electrodes, and a current of a tunnel current generated between the electrodes.
  • nucleotides can be identified directly and rapidly without labeling. Moreover, if this invention is used, the nucleotide sequence of a polynucleotide can be determined directly and rapidly, without labeling.
  • FIG. 1 is a functional block diagram schematically showing an example of an apparatus according to the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of a processing flow by the apparatus according to the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart showing another example of the flow of processing by the apparatus according to the present invention.
  • FIG. 4 is a functional block diagram schematically showing an example of another apparatus according to the present invention.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of the flow of processing by another apparatus according to the present invention.
  • FIG. 6 is a flowchart showing another example of the flow of processing by another apparatus according to the present invention.
  • FIG. 7 is a functional block diagram schematically showing an example of still another apparatus according to the present invention.
  • FIG. 1 is a functional block diagram schematically showing an example of an apparatus according to the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of a processing flow by the apparatus according to the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart showing another example of
  • FIG. 8 is a flowchart showing an example of the flow of processing by still another apparatus according to the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram for explaining the measurement of the tunnel current flowing in one molecule of nucleotide captured between a pair of gold nanoelectrodes.
  • FIG. 10 is a diagram showing the molecular structure of the nucleotide used in this example.
  • FIG. 11 is a scanning electron microscope photograph of a mechanically structurable nanoelectrode pair.
  • FIG. 12 is a curve showing the relationship between tunnel current (I) and time (t) obtained when guanosine monophosphate (GMP) is used as a nucleotide (hereinafter referred to as “It curve”). It is a graph which shows.
  • FIG. 10 is a schematic diagram for explaining the measurement of the tunnel current flowing in one molecule of nucleotide captured between a pair of gold nanoelectrodes.
  • FIG. 10 is a diagram showing the molecular structure of the nucleo
  • FIG. 13 is a diagram showing It curves obtained with respect to electrode distances (d gap ) under various conditions.
  • FIG. 14 is a diagram showing the result of measuring the maximum current value of GMP when the bias voltage (V b ) is 0.25V to 0.75V.
  • FIG. 15 is a graph showing a heterogeneous It curve of adenosine monophosphate (AMP) obtained when the interelectrode distance (d gap ) is relatively long (about 2.5 nm).
  • FIG. 16 is a diagram illustrating statistical identification of single nucleotides.
  • FIG. 17 is a diagram showing a histogram of conductance of nucleotides constituting DNA or RNA.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of measuring the tunnel current using DNA.
  • FIG. 19 is an enlarged view of a part of FIG.
  • FIG. 20 is an enlarged view of a part of FIG.
  • FIG. 21 is a schematic diagram for explaining a DNA sequencing method based on an ionic current.
  • the present invention provides a technique for identifying a single nucleotide and a technique for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide using the technique. Although these techniques are described with reference to an embodiment thereof, the present invention is not limited to these.
  • the present invention provides a method for identifying nucleotides.
  • the method of identifying nucleotides is a step of passing nucleotides between electrodes multiple times, a step of detecting a tunnel current pulse generated between electrodes when nucleotides pass, and a mode value of the maximum current value in each pulse. And a step of comparing the calculated mode value with a reference value.
  • nucleotides can be directly identified based on the electrical characteristics (mode value of the maximum current value) of the nucleotides, not based on the label added to the nucleotides. . Therefore, it is possible to identify nucleotides quickly and inexpensively.
  • the distance between the electrodes is important. If the distance between the electrodes is too longer than the molecular diameter of the nucleotide, it becomes difficult for a tunnel current to flow between the electrodes, or two or more nucleotides enter. On the other hand, when the distance between the electrodes is too shorter than the molecular diameter of nucleotides, nucleotides do not enter between the electrodes.
  • the distance between the electrodes is preferably slightly shorter than, equal to, or slightly longer than the nucleotide molecular diameter.
  • the distance between the electrodes is 0.5 to 2 times the nucleotide molecular diameter, preferably 1 to 1.5 times, and preferably 1 to 1.2 times longer. More preferably.
  • the molecular diameter of nucleotides is known to those skilled in the art, those skilled in the art who have come into contact with the present specification can appropriately select the optimum inter-electrode distance.
  • the distance between the electrodes is set to, for example, 0.5 nm to 2 nm, preferably 1 nm to 1.5 nm in order to pass a tunnel current through this nucleotide. More preferably, the thickness may be set to 1 nm to 1.2 nm.
  • the electrodes are too large, two or more nucleotides are captured between the electrodes even if the distance between the electrodes is the above-described length.
  • the length of the electrode in the direction in which the nucleotide passes or the length of the electrode in the direction perpendicular to the plane formed by the direction between the electrode and the direction in which the nucleotide passes is too longer than the molecular diameter of the nucleotide.
  • the distance between the electrodes is the length described above, two or more nucleotides are captured between the electrodes.
  • the size of the electrode is a little shorter than, equal to, or slightly larger than the molecular diameter of the nucleotide.
  • the electrode pairs described above can be manufactured by using a known nanofabricated mechanically-controllable break junction method.
  • This nano-machined mechanical fracture joining method is an excellent method capable of controlling the distance between electrodes excellent in mechanical stability with a resolution of picometer or less.
  • the material for the electrode include any metal such as gold.
  • an electrode pair can be produced by the following procedure.
  • a flexible metal substrate coated with polyimide by nano-scale gold bonding using a known electron beam lithography and lift-off technique using an electron beam lithography system (manufactured by JEOL Ltd., catalog number: JSM6500F). Patterned on top.
  • the polyimide under the bonding is removed by etching based on a known etching method (reactive ion etching method or the like) using a reactive ion etching apparatus (manufactured by Samco, catalog number: 10NR).
  • a nanoscale gold bridge with a structure folded at three points is fabricated by bending the substrate.
  • the distance between the electrodes of the electrode pair can be controlled with a resolution of a picometer or less by precisely operating the bending of the substrate using a piezo actuator (manufactured by CEDRAT, catalog number: APA150M).
  • the bridge Break part of the bridge. Further, the bridge is pulled, and the size of the gap (distance between the electrodes) generated by the breakage is set to be the length of the target nucleotide molecule (about 1 nm). In this case, the distance between the electrodes of the electrode pair can be accurately controlled by adjusting the bridge tension using the self-breaking technique developed in our laboratory (M. ⁇ Tsutsui, suiK. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008), and M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)).
  • a resistance feedback method (M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, using a data acquisition board (National Instruments, catalog number: NIPCIe-6321). 345 (2008), and M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)), with a resistance of 10 k ⁇ in series under the stretch rate of the programmed junction. Is used to apply a DC bias voltage (V b ) of 0.1 V to the bridge, pulling the gold nanojunction and breaking the bridge. Then, the bridge is further pulled, and the size of the gap (distance between the electrodes) generated by the breakage is set to be the length of the target nucleotide molecule. In this way, an electrode pair is formed.
  • V b DC bias voltage
  • the nucleotide to be identified in the present invention is not particularly limited, and may be any ribonucleotide or any deoxyribonucleotide.
  • the ribonucleotide is not particularly limited, but adenosine monophosphate (AMP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), guanosine monophosphate (GMP), guanosine diphosphate (GDP), Guanosine triphosphate (GTP), cytidine monophosphate (CMP), cytidine diphosphate (CDP), cytidine triphosphate (CTP), uridine monophosphate (UMP), uridine diphosphate (UDP), and uridine And triphosphate (UTP).
  • AMP adenosine monophosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • GMP guanosine diphosphate
  • GDP
  • Deoxyadenosine monophosphate dAMP
  • deoxyadenosine diphosphate dADP
  • deoxyadenosine triphosphate dATP
  • deoxyguanosine monophosphate dGMP
  • deoxyguanosine diphosphate Acid dGDP
  • deoxyguanosine triphosphate dGTP
  • deoxycytidine monophosphate dCMP
  • deoxycytidine diphosphate deoxycytidine triphosphate
  • deoxyuridine monophosphate dUMP
  • Examples include deoxyuridine diphosphate (dUMP), deoxyuridine diphosphate (dUTP), deoxythymidine monophosphate (dTMP), deoxythymidine diphosphate (dTDP), and deoxythymidine triphosphate (dTTP).
  • the above electrode pair may be held in a solution in which nucleotides are dissolved. If the electrode pair is held in this solution in this way, the nucleotide can be passed between the electrodes multiple times by utilizing the spontaneous movement of the nucleotide in the solution.
  • the solution for dissolving the nucleotide is not particularly limited, and examples thereof include ultrapure water.
  • Ultrapure water can be produced, for example, using Millipore's Milli-Q Integral 3 (device name) (Milli-Q Integral 3/5/10/15 (catalog number)). This water is referred to herein as “Mili-Q water”.
  • the concentration of the nucleotide in the solution is not particularly limited, but is, for example, 5 ⁇ M.
  • the nucleotide is captured between the electrodes when the nucleotide passes. While the nucleotide is captured between the electrodes (while the nucleotide stays between the electrodes), a tunnel current is generated between the electrodes. Nucleotides captured between the electrodes spontaneously dissociate from the electrodes after a predetermined time has elapsed. When the nucleotide is dissociated from between the electrodes, the tunnel current generated between the electrodes disappears. In this way, nucleotides are trapped between the electrodes and dissociated from the electrodes, thereby generating a tunnel current pulse.
  • the method for applying a voltage between the electrodes is not particularly limited.
  • a known power supply device may be connected to the electrodes, and a voltage (for example, a bias voltage) may be applied between the electrodes.
  • the voltage to be applied is not particularly limited, but is, for example, 0.25V to 0.75V.
  • the current value of the tunnel current generated between the electrodes may be measured for a predetermined time.
  • the current value of the tunnel current may be measured, for example, for 50 minutes.
  • the “pulse of the tunnel current due to nucleotides” means that when the tunnel current is measured for a predetermined time, the signal of the tunnel current until the tunnel current rises above the base level and returns to the base level again. Intended (see B in FIG. 12 described later). This increase in tunneling current indicates that nucleotides have been captured between the electrodes, and the return of the tunneling current to the basal level indicates that the captured nucleotides have dissociated from between the electrodes.
  • the “base level” is intended to mean an average value of noise.
  • “Noise” is intended to be a signal of the tunneling current that is observed when nucleotides are not trapped between the electrodes. For example, noise can be obtained by measuring a current value of a tunneling current that is generated when a voltage is applied between electrodes held in a solution in which nucleotides are not dissolved.
  • the current value of the tunnel current generated between the electrodes can be measured using a known ammeter. Further, the tunnel current signal may be once amplified using, for example, a current amplifier. By using a current amplifier, a weak tunnel current value can be amplified, so that the tunnel current can be measured with high sensitivity. Examples of the current amplifier include a commercially available variable high-speed current amplifier (Femto, catalog number: DHPCA-100).
  • the present inventors amplify a picoampere level current using a logarithmic amplifier produced uniquely, and then set the amplified current signal to a frequency exceeding 1 kHz. I read.
  • the current signal thus amplified can be recorded on a computer at a sampling rate of 2 kHz, for example, using a DAQ card (Nippon National Instruments, catalog number: NI USB-9234) having a resolution of 24 bits. it can.
  • the tunnel current pulse is detected by measuring the current value of the tunnel current flowing between the electrodes for a predetermined time and determining over time whether the current value of the tunnel current exceeds the base level. can do. Specifically, if the time when the tunnel current exceeds the basal level and the time when the tunnel current returns to the basal level again is specified according to the above-mentioned determination, the signal between these two times is attributed to the nucleotide. It can be detected as a pulse of tunneling current. Such a determination can be easily made visually by using a graph (for example, a curve graph) showing the relationship between the measured current value of the tunnel current and the measurement time of the tunnel current.
  • a graph for example, a curve graph
  • the pulse due to the nucleotide detected in this way has various height peaks. These peaks appear due to changes in the distance between the electrode and the nucleotide based on the movement of the nucleotide between the electrodes. That is, if the distance between the nucleotide and the electrode is shortened, a tunnel current is likely to be generated, so that the current value of the tunnel current increases. On the other hand, when the distance between the nucleotide and the electrode is increased, the tunnel current is less likely to be generated, so that the current value of the tunnel current is reduced. As described above, when the nucleotide moves between the electrodes, the distance between the electrode and the nucleotide changes, and the current value of the tunnel current increases or decreases, so that a plurality of peaks appear in the tunnel current pulse.
  • the mode value may be calculated by performing statistical analysis on each obtained maximum current value.
  • each pulse may be classified based on the maximum current value, and the mode value may be calculated based on the number of pulses belonging to each classified group and the maximum current value.
  • “Classifying each pulse based on the maximum current value” may be, for example, classifying pulses having the same or substantially the same maximum current value into the same group, or having a certain width. The pulses belonging to the range of the maximum current value may be classified into the same group.
  • “Pulse whose maximum current value is substantially the same” refers to a pulse having a maximum current value that is several percent different from a certain maximum current value. For example, the maximum current value is 90% to 110% of a certain maximum current. Having a pulse is intended.
  • the mode value can be calculated as follows. First, a histogram indicating the relationship between the maximum current value in each pulse and the number of pulses corresponding to the maximum current value is generated. The generated histogram is fitted to a predetermined function.
  • the mode value can be calculated by obtaining the peak value of the fitted function.
  • the function used for the fitting is a Gaussian function or a Poisson function, but is preferably a Gaussian function.
  • the number of samples (pulses) used for statistical analysis for calculating the mode value in this step is not particularly limited, and is, for example, 500 to 1000. If this number is used for statistical analysis, a statistically significant mode value can be calculated. Since such a mode value is unique to each nucleotide, this mode value can be used as an index for identifying the nucleotide.
  • mode values for GMP, dTMP, and CMP are 96 pA, 30 pA, and 42 pA, respectively, as shown in Examples and B or C of FIG. These mode values were calculated under the conditions of an interelectrode distance of 1 nm, a bias voltage of 0.75 V, and the number of samples (500 pieces) for statistical analysis. As shown in FIG.
  • the mode values of dCMP, dGMP, dAMP, dTMP, CMP, GMP, AMP, and UMP are respectively 60 pS, 87 pS, 67 pS, 39 pS, 64 pS, 123 pS, 92 pS, (Note that these mode values are calculated under the conditions of an interelectrode distance of 0.8 nm, a bias voltage of 0.4 V, and the number of samples for statistical analysis (1000 samples). .)
  • this mode value can be used as an index for identifying the nucleotide.
  • the step of comparing the calculated mode value with a reference value the mode value calculated in the above-described step is compared with a reference value relating to a known nucleotide (hereinafter referred to as “reference nucleotide”). If it is.
  • the tunnel current is greatly influenced by the distance between the electrodes, the concentration of nucleotides or polynucleotides in the solution, the shape of the prepared electrode, the voltage, and the number of samples for statistical analysis, so it is calculated from the tunnel current.
  • the mode is greatly affected by these factors. For example, as shown in the examples described later and FIGS. 6A to 6C, when the GMP mode value is calculated under the same conditions except for the bias voltage, the bias voltage is 0.25V, 0.50V, And 0.75V, the mode values are different.
  • the measured value of the tunnel current has a distribution from the mode value of the identified nucleotide, and the mode value calculated from the above measured value also has a distribution from the mode value of the identified nucleotide. is doing.
  • the distribution from the mode value of the identified nucleotide can be expressed as the full width at half maximum of the function used to calculate the mode value.
  • the mode value calculated in the above-mentioned “step of calculating the mode value” is included in the full width at half maximum centered on the mode value of the nucleotide to be identified.
  • the reference value for comparison with the mode value may be the mode value of the reference nucleotide, or the mode value of the reference nucleotide is calculated by setting the mode value of the reference nucleotide to x.
  • the half width at half maximum in the function used is y
  • the value may be in the range of x ⁇ y.
  • the mode value of the reference nucleotide was determined under the same conditions as those for determining the mode value for the nucleotide applied to the present invention. It is preferable.
  • the nucleotide applied to the present invention can be determined to be the reference nucleotide.
  • the mode value is included in the reference value, it can be determined that the nucleotide applied to the present invention is not this reference nucleotide. By such determination, the nucleotide applied to the present invention can be identified.
  • x when the reference nucleotide is dGMP, x is 87 pS and y is 22 pS.
  • x When the reference nucleotide is dAMP, x is 67 pS and y is 17 pS.
  • dCMP When the reference nucleotide is dCMP, x is 60 pS and y is 22 pS.
  • dTMP When the reference nucleotide is dTMP, x is 39 pS and y is 11 pS.
  • the reference nucleotide When the reference nucleotide is GMP, x is 123 pS and y is 53 pS.
  • the reference nucleotide is AMP When the reference nucleotide is AMP, x is 92 pS and y is 32 pS.
  • x When the reference nucleotide is CMP, x is 64 pS and y is 20.
  • UMP When the reference
  • the mode value is included in the range of 87 ⁇ 22 pS, it can be determined that the nucleotide is dGMP. If the mode is not included in the range of 87 ⁇ 22 pS, it can be determined that the nucleotide is not dGMP.
  • the mode value is included in the range of 67 ⁇ 17 pS, it can be determined that the nucleotide is dAMP. If the mode is not included in the range of 67 ⁇ 17 pS, it can be determined that the nucleotide is not dAMP.
  • the mode value is included in the range of 60 ⁇ 22 pS, it can be determined that the nucleotide is dCMP. If the mode is not included in the range of 60 ⁇ 22 pS, it can be determined that the nucleotide is not dCMP.
  • the mode value is included in the range of 39 ⁇ 11 pS, it can be determined that the nucleotide is dTMP. If the mode value is not included in the range of 39 ⁇ 11 pS, it can be determined that the nucleotide is not dTMP.
  • the mode value is within the range of 123 ⁇ 53 pS, it can be determined that the nucleotide is GMP. If the mode is not included in the range of 123 ⁇ 53 pS, it can be determined that the nucleotide is not GMP.
  • the mode value is included in the range of 92 ⁇ 32 pS, it can be determined that the nucleotide is AMP. If the mode is not included in the range of 92 ⁇ 32 pS, it can be determined that the nucleotide is not AMP.
  • the mode value is within the range of 64 ⁇ 20 pS, it can be determined that the nucleotide is CMP. If the mode is not included in the range of 64 ⁇ 20 pS, it can be determined that the nucleotide is not CMP.
  • the mode value is included in the range of 50 ⁇ 13 pS, it can be determined that the nucleotide is UMP. If the mode is not included in the range of 50 ⁇ 13 pS, it can be determined that the nucleotide is not UMP.
  • the mode value may be compared with one reference value or may be compared with a plurality of different reference values.
  • the mode value is compared with the first reference value, and if the mode value is not included in the first reference value, the mode value is The mode value may be compared with the reference value one by one. Further, the mode value may be compared with a plurality of different reference values in parallel, such as “compare the mode value simultaneously with a plurality of different reference values”.
  • the tunnel current is greatly influenced by various conditions, so the mode value calculated from the tunnel current is also greatly influenced by these. Therefore, by minimizing such influence, more accurate nucleotide identification can be realized.
  • the mode value may be divided by the mode value of the reference nucleotide. That is, the method of the present invention may further include a step of normalizing the mode value by dividing the mode value by the mode value of the reference nucleotide. Then, in the “step of comparing the calculated mode value with the reference value”, the standardized mode value is normalized with the mode value of the base nucleotide (the standardized reference value is referred to as the reference value). May be referred to)).
  • the nucleotide applied to the present invention is a reference nucleotide. Can be determined. Conversely, if the normalized mode value is not included in the normalized reference value, it can be determined that the nucleotide applied to the present invention is not a reference nucleotide. By such determination, the nucleotide applied to the present invention can be identified.
  • the reference nucleotide is not particularly limited, and any nucleotide can be used, but it is preferably the same as the nucleotide type applied to the present invention. That is, when the nucleotide applied to the present invention is deoxyribonucleotide, the reference nucleotide is preferably deoxyribonucleotide (for example, dGMP). In addition, when the nucleotide applied to the present invention is ribonucleotide, the reference nucleotide is preferably ribonucleotide (for example, GMP).
  • the standardized reference value when dGMP is used as the reference nucleotide and dGMP is used as the reference nucleotide is 1 ⁇ 0.25.
  • the standardized reference value when dGMP is used as the reference nucleotide and dAMP is used as the reference nucleotide is 0.77 ⁇ 0.20.
  • the standardized reference value when dGMP is used as the reference nucleotide and dCMP is used as the reference nucleotide is 0.69 ⁇ 0.25.
  • the standardized reference value when dGMP is used as the reference nucleotide and dTMP is used as the reference nucleotide is 0.45 ⁇ 0.12.
  • the standardized reference value when GMP is used as the reference nucleotide and GMP is used as the reference nucleotide is 1 ⁇ 0.44.
  • the standardized reference value when GMP is used as the reference nucleotide and AMP is used as the reference nucleotide is 0.75 ⁇ 0.27.
  • the standardized reference value when using GMP as the reference nucleotide and CMP as the reference nucleotide is 0.52 ⁇ 0.16.
  • the standardized reference value when GMP is used as the reference nucleotide and UMP is used as the reference nucleotide is 0.41 ⁇ 0.10.
  • the present invention provides an apparatus for identifying nucleotides. Since this apparatus executes the method for identifying nucleotides according to the present invention, the description of each member is referred to the description of each step in the above-described method, and the overlapping portions are omitted.
  • FIG. 1 is a functional block diagram schematically showing an example of an apparatus (apparatus 100) for identifying nucleotides according to the present invention.
  • the apparatus 100 includes an electrode pair 10 having a distance between electrodes through which nucleotides can pass, a means for applying a voltage between the electrodes (voltage applying unit) 20, and a means for measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes (current measurement).
  • Section) 30 means (detection section) 40 for detecting the pulse of the measured tunnel current, means (calculation section) 50 for calculating the mode value of the maximum current value in each pulse, and the calculated mode value as the reference value
  • a comparison means (comparison unit) 60 is provided.
  • the electrode pair 10 is electrically connected to the voltage application unit 20 so that a voltage can be applied by the voltage application unit 20. Further, the electrode pair 10 is electrically connected to the current measuring unit 30, and when a tunnel current is generated between the electrodes by applying a voltage from the voltage applying unit 20, the tunnel current is input to the current measuring unit 30. .
  • the current measurement unit 30 is electrically connected to the detection unit 40, and when the current measurement unit 30 measures the current value of the tunnel current, the current value information can be output to the detection unit 40.
  • the detection unit 40 is electrically connected to the calculation unit 50, and when the detection unit 40 detects each pulse, information on the pulse can be output to the calculation unit 50.
  • the calculation unit 50 calculates the mode value of the maximum current value based on the information of the pulse.
  • the calculation unit 50 is electrically connected to the comparison unit 60. When the calculation unit 50 calculates the mode value, the mode value information can be output to the comparison unit 60.
  • the electrode pair 10 may be an electrode configured using any metal such as gold.
  • a known power supply device can be used for the power supply unit 20.
  • a known ammeter can be used for the current measuring unit 30.
  • a conventionally known arithmetic device such as a computer can be suitably used.
  • the calculation unit 50 may include a first storage unit (a known memory or the like) that stores function data for statistically analyzing pulses.
  • the function data may include one function or a plurality of different functions.
  • the comparison unit 60 includes a second storage unit (known memory or the like) that stores reference value data for comparison with the mode value and data of known nucleotides (reference nucleotides) corresponding to the reference values. Also good.
  • the reference value data may include one reference value or a plurality of different reference values.
  • the apparatus 100 may further include an output unit (not shown) that outputs a determination result by the comparison unit 60. By providing the output unit, the user of the device 100 can easily confirm the determination result.
  • the output unit is not particularly limited, and a known display device can be used.
  • the apparatus 100 may include an input unit (not shown) for inputting various conditions (function, reference nucleotide, etc.) from the user.
  • the apparatus 100 holds the electrode pair 10 in a sample (for example, a solution in which a nucleotide to be analyzed is dissolved) (not shown).
  • the apparatus 100 applies a voltage to the electrode pair 10 using the voltage application unit 20.
  • a tunnel current is generated between the electrode pair 10 and input to the current measuring unit 30.
  • the current measurement unit 30 measures the current value of the tunnel current and outputs information on the current value to the detection unit 40.
  • the detection unit 40 detects a tunnel current pulse based on the current value. For example, the detection unit 40 specifies the time when the current value of the tunnel current exceeds the base level and the time when the current value returns to the base level again, and detects the signal of the tunnel current between these two times as a pulse. To do.
  • the detection unit 40 outputs information on each detected pulse to the calculation unit 50.
  • the calculation unit 50 obtains the maximum current value in each pulse based on the information of each pulse, and determines the mode value of the maximum current value. For example, the calculation unit 50 obtains the maximum current value in each pulse by subtracting the base level from the highest peak current value in each detected pulse. Then, the mode value is calculated by performing statistical analysis on each obtained maximum current value. For example, the calculation unit classifies each pulse based on the maximum current value, and calculates the mode value based on the number of pulses belonging to each classified group and the maximum current value.
  • the calculation unit 50 generates a histogram indicating the relationship between the maximum current value in each pulse and the number of pulses corresponding to the maximum current value.
  • the mode value is calculated by fitting the generated histogram to a function stored in the first storage unit and obtaining the peak value of the fitted function.
  • the calculation unit 50 may select a function according to an input from the user.
  • the calculation unit 50 outputs the calculated mode value information to the comparison unit 60.
  • the comparison unit 60 identifies nucleotides based on the mode information. For example, the comparison unit 60 compares this mode value with a reference value stored in the second storage unit. When the comparison unit 60 confirms that the mode value is included in the reference value, the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is a reference nucleotide corresponding to the reference value.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is not a reference nucleotide corresponding to the reference value.
  • the apparatus 100 includes an output unit (when the comparison unit 60 is connected to the output unit), information on a determination result by the comparison unit 60 is input to the output unit.
  • the output unit outputs the determination result, the user of the apparatus 100 can easily confirm the determination result.
  • the apparatus 100 can perform the following operations in addition to the above-described operations.
  • the comparison unit 60 checks whether another reference value different from the already compared reference value is stored in the second storage unit. When the comparison unit 60 confirms that another reference value is stored in the second storage unit, the comparison unit 60 compares the mode value with another reference value, and the mode value is different. It is confirmed whether it is included in the reference value.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is a reference nucleotide corresponding to this other reference value.
  • the comparison unit 60 confirms that the other reference value is not stored in the second storage unit (that is, the mode value is included in any of the reference values stored in the second storage unit). If not, the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is not any of the reference nucleotides corresponding to the reference value stored in the second storage unit.
  • the comparison unit 60 compares the mode value with the first reference value, and if the mode value is not included in the first reference value, the mode value is determined.
  • the mode value may be compared with the reference value one by one, such as “compare with the second reference value”. Further, the mode value may be compared with a plurality of different reference values in parallel, such as “compare the mode value simultaneously with a plurality of different reference values”.
  • the comparison unit 60 may be configured to normalize the mode value by dividing the mode value input from the calculation unit 50 by the mode value of the reference nucleotide. In this case, the comparison unit 60 compares the standardized mode value with the standardized reference value.
  • the standardized reference value may be obtained by dividing the reference value stored in the second storage unit by the comparison unit 60 by the mode value of the base nucleotide, or may be stored in the second storage. It may be stored in advance in the part.
  • the comparison unit 50 may select the reference nucleotide according to the input from the user.
  • nucleotide identification is performed using one reference value.
  • step 1 (hereinafter, “step” is described as “S”), the apparatus 100 holds the electrode pair 10 in the sample.
  • the voltage application unit 20 applies a voltage to the electrode pair 10.
  • the current measuring unit 30 measures the current value of the tunnel current generated by the processing in S2.
  • the detection unit 40 detects a pulse of the tunnel current based on the current value measured by the process of S3.
  • the calculation unit 50 calculates the mode value of the maximum current value based on the information of each pulse detected by the process of S4.
  • the comparison unit 60 compares the mode value calculated by the process of S5 with the reference value, and confirms whether or not the mode value is included in the reference value.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is a reference nucleotide corresponding to this reference value. Then, the process ends.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is not a reference nucleotide corresponding to this reference value. Then, the process ends.
  • the comparison unit 60 normalizes the mode value
  • a step in which the comparison unit 60 normalizes the mode value calculated by the process of S5 with the mode value of the reference nucleotide between S5 and S6 exists.
  • the comparison unit 60 compares the standardized value standardized by the process of S5 ′ with the standardized reference value, and the standardized mode value becomes the standardized reference value. Check if it is included. And the process of S7 and S8 is performed.
  • the above-described flow is such that the output unit displays the processing result of S7 after S7, and the output unit displays the processing result of S8 after S8. It may further include a step of performing.
  • nucleotide identification is performed using a plurality of different reference values.
  • the apparatus 100 holds the electrode pair 10 in the sample.
  • the voltage application unit 20 applies a voltage to the electrode pair 10.
  • the current measuring unit 30 measures the current value of the tunnel current generated by the processing in S102.
  • the detection unit 40 detects a pulse of the tunnel current based on the current value measured by the process in S103.
  • the calculation unit 50 calculates the mode value of the maximum current value based on the information of each pulse detected by the process of S104.
  • the comparison unit 60 compares the mode value calculated by the process of S105 with the reference value, and confirms whether the mode value is included in the reference value.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is a reference nucleotide corresponding to this reference value. Then, the process ends.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is not a nucleotide corresponding to the reference value, and the process proceeds to S109.
  • the comparison unit 60 checks whether another reference value different from the reference value is stored in the first storage unit.
  • the comparison unit 60 determines that the nucleotide under analysis is not any of the reference nucleotides corresponding to the reference value stored in the first storage unit. Then, the process ends.
  • the above-described flow is such that the output unit displays the processing result of S107 after S107, and the output unit displays the processing result of S110 after S110. It further includes the step of:
  • the mode value may be compared with one reference value (that is, the mode value may be compared with the reference value one by one), or the mode value may be different from one another.
  • the comparison may be performed simultaneously (in parallel) with the reference value.
  • the comparison unit 60 When the comparison unit 60 normalizes the mode value, a step in which the comparison unit 60 normalizes the mode value calculated by the processing of S15 with the mode value of the reference nucleotide between S15 and S16 (S15 ′ ) Exists.
  • the comparison unit 60 compares the mode value standardized by the process of S15 ′ with the standardized reference value (or another standardized standard reference value), and is standardized. It is checked whether or not the mode value is included in the standardized reference value (or another standardized reference value).
  • the comparison unit 60 confirms whether a standardized reference value different from the standardized reference value is stored in the first storage unit.
  • the present invention provides a method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide.
  • the method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide includes a step of passing a polynucleotide between electrodes, a step of measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through, and a step of measuring the maximum of the measured current value.
  • the step of calculating the mode value, the mode of standardizing the mode value of the current value by dividing the mode value of the current value by the mode value of the standard nucleotide, and the normalized mode value as the reference value A step of comparing is included.
  • the polynucleotide applied to the present invention consists of the same nucleotide. That is, it can be determined that the nucleotide sequence of the polynucleotide applied to the present invention consists of a single type of identified nucleotide.
  • the present invention includes a step of detecting a pulse of a tunnel current, a step of normalizing a current value by dividing a current value in the pulse by a mode value of a reference nucleotide, and a standardization The method further includes the step of comparing the current value with the reference value.
  • the nucleotide sequence of a polynucleotide can be determined by identifying the nucleotides constituting the polynucleotide and, if necessary, identifying the sequence of the nucleotides constituting the polynucleotide.
  • polynucleotide is used interchangeably with “oligonucleotide” or “gene” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • oligonucleotide is intended to consist of 2 to several tens of nucleotides, more specifically 2 to 50 nucleotides.
  • a “polynucleotide” is intended to be composed of several tens or more, specifically, more than 50 nucleotides.
  • the polynucleotide may be a deoxyribonucleotide (DNA) or a ribonucleotide (RNA).
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “base sequence” and is indicated as a deoxyribonucleotide or ribonucleotide sequence.
  • the distance between the electrodes and the size of the electrodes (for example, the length of the electrodes in the direction in which the polynucleotide passes, the plane formed by the direction between the electrodes and the direction in which the polynucleotide passes)
  • the length of the electrode in the direction perpendicular to Specifically, the distance between the electrodes and the size of the electrodes are preferably slightly shorter than, equal to, or slightly larger than the molecular diameter of the nucleotide.
  • the electrode pair described in the above-described method for identifying nucleotides can be used.
  • the polynucleotide passing between the electrodes is preferably in the form of a linear single strand.
  • the polynucleotide may be converted into a linear single-stranded form using a conventionally known method such as applying heat to the polynucleotide.
  • nucleotides may be bonded by intramolecular interaction, the single strand may be bent, and a double strand may be formed in a part of the single strand.
  • a non-linear single-stranded polynucleotide can be made linear by a conventionally known method such as applying heat to a single-stranded polynucleotide.
  • the “step of passing a polynucleotide between electrodes” in the present invention is not particularly limited, and the same operation as the “step of passing a nucleotide multiple times between electrodes” in the method for identifying nucleotides may be performed. .
  • the above electrode pair may be held in a solution in which a polynucleotide is dissolved. If the electrode pair is held in this solution in this way, the polynucleotide can pass between the electrodes by utilizing the spontaneous movement of the polynucleotide in the solution.
  • dissolves a polynucleotide The ultrapure water mentioned above is mentioned.
  • the concentration of the polynucleotide in the solution is not particularly limited, but is, for example, 5 ⁇ M.
  • the electrode pair If the electrode pair is held in a solution in which the polynucleotide is dissolved and a voltage is applied between the electrodes, the polynucleotide passes through and a tunnel current caused by the nucleotide constituting the polynucleotide is generated between the electrodes.
  • a mechanism for generating the tunnel current will be described below.
  • the first nucleotide constituting the polynucleotide is captured between the electrodes.
  • the first nucleotide is captured between the electrodes, a tunneling current due to the first nucleotide occurs between the electrodes.
  • the first nucleotide moves between the electrodes, and the second nucleotide enters between the electrodes.
  • the nucleotide captured between the electrodes changes from the first nucleotide to the second nucleotide, both a portion of the first nucleotide and a portion of the second nucleotide are captured between the electrodes.
  • a tunnel current caused by a part of the first nucleotide and / or a part of the second nucleotide is generated between the electrodes.
  • the first nucleotide completely passes between the electrodes, and the entire second nucleotide is captured between the electrodes.
  • the entire second nucleotide is captured between the electrodes, a tunneling current due to the second nucleotide occurs between the electrodes.
  • the polynucleotide enters and moves between the electrodes, the nucleotides constituting the polynucleotide are sequentially captured between the electrodes, a tunnel current caused by these nucleotides is generated between the electrodes, and the polynucleotide is moved between the electrodes.
  • the tunnel current disappears. That is, when the polynucleotide passes between the electrodes, a pulse of a tunnel current due to the polynucleotide is generated.
  • the “pulse of the tunnel current caused by the polynucleotide” is the same as the “pulse of the tunnel current caused by the nucleotide” described above, when the tunnel current is measured for a predetermined time.
  • a tunneling current signal is intended to rise above and return to the basal level again. This increase in tunneling current indicates that the first nucleotide constituting the polynucleotide has been captured between the electrodes, and that the tunneling current returns to the basal level indicates that the last captured nucleotide has dissociated from between the electrodes. It shows that.
  • the “base level” is intended to mean the average value of noise.
  • “Noise” is intended to be a signal of the tunneling current that is observed when nucleotides are not trapped between the electrodes. For example, noise can be obtained by measuring a current value of a tunnel current that is generated when a voltage is applied between electrodes held in a solution in which a polynucleotide is not dissolved.
  • the “step of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through” in the present invention a voltage is applied between the electrodes held in the solution in which the polynucleotide is dissolved in this way.
  • the current value of the tunnel current generated between the electrodes may be measured for a predetermined time.
  • the description of the method for identifying nucleotides can be used.
  • the mode value may be calculated by performing statistical analysis on the current value thus measured.
  • the current value may be classified based on the value, and the mode value may be calculated based on the number and current value belonging to each classified group.
  • “Classifying current values based on the values” may be, for example, classifying current values that are the same or substantially the same into the same group, It may be classified into the same group.
  • the “current value that is substantially the same” refers to a current value that is several percent different from a certain current value. For example, a current value that is 90% to 110% of a certain current value is intended.
  • the mode value can be calculated as follows. First, a histogram indicating the relationship between the number and current value belonging to each classified group is generated. The generated histogram is fitted to a predetermined function.
  • the mode value can be calculated by obtaining the peak value of the fitted function.
  • the function used for the fitting is a Gaussian function or a Poisson function, but is preferably a Gaussian function.
  • the histogram may be generated including the noise current value or may be generated without including the noise current value.
  • a histogram including a noise current value When a histogram including a noise current value is generated, a plurality of peaks are generally observed as shown in the left diagrams of FIGS.
  • the peak having the smallest value corresponds to the mode value of the noise current value, and the peak having a value larger than this peak corresponds to the mode value of the current value caused by the nucleotides constituting the polynucleotide.
  • a mode value corresponding to each peak is calculated by obtaining a plurality of peak values.
  • the mode value of the noise current value is preferably subtracted from the mode value of the current value caused by the nucleotide constituting the polynucleotide.
  • one peak is the mode value of the noise current value
  • the other peak is the nucleotide constituting the polynucleotide. This corresponds to the mode value of the current value caused by. That is, in this case, it can be determined that the nucleotides constituting the polynucleotide are composed of a single type of nucleotide. Moreover, when there are three or more peaks appearing in the generated histogram including the noise current value, it can be determined that the nucleotides constituting the polynucleotide are composed of a plurality of types of nucleotides.
  • a histogram that does not include noise current values can be generated as follows. First, a threshold value indicating noise is set. For example, the threshold value is the maximum current value of the tunnel current measured using a solution in which the polynucleotide is not dissolved. Next, this threshold value may be subtracted from the measured current value of the tunnel current. As a result, a histogram is generated using the obtained value. When there is one peak appearing in the histogram not including the noise current value, it can be determined that the nucleotides constituting the polynucleotide are composed of a single type of nucleotide. Further, when there are two or more peaks appearing in a histogram not including the noise current value, it can be determined that the nucleotides constituting the polynucleotide are composed of a plurality of types of nucleotides.
  • the nucleotides constituting the polynucleotide are composed of a single species or a plurality of species. Can do.
  • the current value mode value is normalized by the reference nucleotide.
  • the timing for standardization is not particularly limited. That is, after calculating the mode value in the “calculating step”, the current value of the pulse may be normalized in the “normalizing step”, or when the “polynucleotide passes” After measuring the current value of the tunnel current in the step of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes, normalize the current value in the step of normalizing, and then calculate the current value.
  • the mode value may be calculated from the standardized current value.
  • the reference nucleotide is not particularly limited, and any nucleotide can be used.
  • the reference nucleotide is preferably deoxyribonucleotide (eg, dGMP) when the polynucleotide is DNA, and is preferably ribonucleotide (eg, GMP) when the polynucleotide is RNA.
  • the mode value of the reference nucleotide a mode value calculated by the same method as the method for calculating the mode value described in the above-described method for identifying nucleotides can be used. That is, the mode value of the reference nucleotide is determined by passing the reference nucleotide between the electrodes a plurality of times, detecting a pulse of a tunnel current generated between the electrodes when the reference nucleotide passes, and the maximum current value in each pulse. Is obtained by calculating the mode value of.
  • the mode value of the reference nucleotide to be used is the same as the conditions used for the polynucleotide to be analyzed (for example, electrode conditions (distance between electrodes, electrode shape, etc., conditions of concentration in solution)). It is preferable that it is acquired under conditions.
  • the conditions of the concentration in the solution are the same in the polynucleotide and the reference nucleotide” means that the concentration of the polynucleotide in the solution and the concentration of the reference nucleotide in the solution are the same.
  • the mode value standardized as described above may be compared with the reference value.
  • the reference value used for comparison is, for example, the reference value described in the above method for identifying nucleotides (reference value normalized with reference nucleotides).
  • the nucleotide of this mode value is the reference nucleotide.
  • the normalized mode value is not included in the reference value, it can be determined that the mode nucleotide is not the reference nucleotide.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide applied to the present invention consists of the identified single type of nucleotide.
  • the polynucleotide applied to the present invention can be determined to be composed of a plurality of types of nucleotides.
  • a step of detecting a pulse of a tunnel current, by dividing the current value in the pulse by the mode value of the reference nucleotide, And a step of comparing the normalized current value with a reference value in order to determine the nucleotide sequence by determining the arrangement of a plurality of nucleotides, a step of detecting a pulse of a tunnel current, by dividing the current value in the pulse by the mode value of the reference nucleotide, And a step of comparing the normalized current value with a reference value.
  • the step of detecting a tunnel current pulse includes the tunnel current value measured in the above “step of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes when the polynucleotide passes through”. Determining over time whether the basal level is exceeded. According to this determination, if the time when the tunnel current exceeds the base level is specified, and the time when the tunnel current returns to the base level is specified again, the signal between these two times can be detected as a pulse of the tunnel current. it can. Such a determination can be easily made visually by using a graph (for example, a curve graph) showing the relationship between the measured value of the tunnel current due to the measured polynucleotide and the measurement time of the tunnel current.
  • a graph for example, a curve graph
  • the tunnel current is actually measured, as shown in FIGS. 18 and 19, a false pulse that does not correspond to the tunnel current pulse caused by the polynucleotide is also measured. For this reason, it is necessary to specify the pulse of the tunnel current caused by the polynucleotide from the pulses detected by the above method.
  • the identification of the pulse can be performed based on the time that the polynucleotide stays between the electrodes.
  • the time that the polynucleotide stays between the electrodes can be calculated from the time that one molecule of nucleotide stays between the electrodes.
  • the time during which one molecule of nucleotide stays between the electrodes is the time that the pulse of nucleotides described in the method for identifying nucleotides lasts.
  • the time that this pulse of nucleotides lasts (“td” in FIG. 12B described later) is not necessarily constant.
  • the inventor has found that by performing a statistical analysis on the duration of the nucleotide pulse, the duration of the nucleotide pulse exhibits a specific value. Specifically, if a histogram of the duration of the nucleotide pulse is created, a mode value of the duration of the nucleotide pulse can be calculated by fitting a function to the histogram.
  • the polynucleotide passes between the electrodes by spontaneous movement, it can be assumed that the speed of the polynucleotide passing between the electrodes is constant. If the condition for calculating the mode (distance between electrodes, etc.) is the same as the condition used for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide, and this assumption is applied, the polysynthesizing composed of n nucleotides will be performed.
  • the time during which the nucleotide stays between the electrodes is n times or more the mode value of the duration of the nucleotide pulse.
  • the nucleotide used for calculating the time during which the polynucleotide stays between the electrodes is the same type as the nucleotide constituting the polynucleotide to be analyzed.
  • the nucleotide used is deoxyribonucleotide
  • the nucleotide used is ribonucleotide.
  • the duration of the pulse of the tunnel current caused by the polynucleotide corresponds to the number of nucleotides constituting the polynucleotide, and when the number of nucleotides constituting the polynucleotide is n,
  • the pulse width can be divided into n equal parts. Each section of the divided pulse corresponds to each nucleotide constituting the polynucleotide.
  • the current value of the measured tunneling current is different when the nucleotide is different, the current value shown in the corresponding adjacent area is different when the adjacent nucleotide is different.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is made of GTG, the current value shown in the first G section is low in the second T section, and the third It is back in G area.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is TGT, the current value shown in the first T zone is higher in the second G zone and the third T It is back in the area.
  • a tunnel current pulse caused by a polynucleotide composed of a plurality of types of nucleotides shows a stepped signal.
  • the above-described detection was performed using two conditions: (1) the duration of the nucleotide pulse lasted for n times or more of the mode of duration, and (2) showing a stepped signal.
  • the pulse can be identified as a pulse of tunneling current due to the polynucleotide to be analyzed.
  • the current value in the pulse is normalized by the mode value of the reference nucleotide.
  • the timing for standardization is not particularly limited. That is, after detecting the pulse in the “step of detecting a pulse”, the current value of the pulse may be normalized in the “step of normalizing”, or when the “polynucleotide passes through” After measuring the current value of the tunnel current in the step of measuring the current value of the tunnel current generated between the electrodes, normalize the current value in the normalization step, and then detect the pulse. In the “step of performing”, a pulse may be detected from the normalized current value.
  • the reference nucleotide is not particularly limited, and is the reference nucleotide used in the above-described “step of normalizing the current value mode value by dividing the current value mode value by the reference nucleotide mode value”. is there.
  • the standardized current value as described above may be compared with the reference value.
  • the reference value used for comparison is, for example, the reference value used in the above “step of comparing the normalized mode value with the reference value”.
  • each section of the pulse of the tunnel current caused by the polynucleotide divided by the number of nucleotides constituting the polynucleotide corresponds to each nucleotide constituting the polynucleotide.
  • the pulse of the tunnel current caused by the polynucleotide composed of a plurality of kinds of nucleotides shows a stepped signal, as shown in FIG. 19C and FIG. 20D
  • the converted current value may be included in a plurality of reference values.
  • the normalized current value is included in a plurality of reference values, it can be said that the reference value of the nucleotide corresponding to this section is included for the longest time.
  • the “step of comparing the standardized current value with the reference value” it is preferable to specify the reference value in which the standardized current value of the pulse in one section is included for the longest time. Thereby, the nucleotides in this section can be identified.
  • the time during which the reference current value includes the normalized current value of the pulse in one section is measured. The longest time is determined by comparing each measured time. And if the reference value of the determined time is specified, it can identify that the nucleotide of this area is the nucleotide of this reference value.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined by identifying the nucleotides in each section.
  • a threshold may be set for “time during which the standardized current value of the pulse is included in the reference value”. If this threshold value is set, it can be considered that the current value is not included in the reference value unless the time is equal to or longer than the threshold value.
  • a person skilled in the art can set the threshold appropriately. If such a threshold is used, it may not be possible to specify a reference value that includes a normalized current value of a pulse in one section. In this case, it can be determined that the nucleotide in this section is unknown.
  • the present invention provides an apparatus for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide. Since this apparatus executes the method for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the present invention, the description of each step in the above-described method can be used for the description of each member.
  • FIG. 4 is a functional block diagram schematically illustrating an example of the apparatus (apparatus 200) according to the embodiment.
  • This apparatus 200 includes an electrode pair 11 having a distance between electrodes through which a polynucleotide can pass, means for applying a voltage between the electrodes (voltage applying unit) 21, means for measuring a current value of a tunnel current generated between the electrodes (current) (Measuring unit) 31, means (calculating unit) 51 for calculating the mode value of the measured current value, the mode value of the current value by dividing the mode value of the current value by the mode value of the reference nucleotide Means (standardizing unit) 71 and means (comparing unit) 61 for comparing the normalized mode value with a reference value.
  • the electrode pair 11 is electrically connected to the voltage application unit 21 so that a voltage can be applied by the voltage application unit 21.
  • the electrode pair 11 is electrically connected to the current measuring unit 31, and when a tunnel current is generated between the electrodes due to application of a voltage by the voltage applying unit 21, the tunnel current is input to the current measuring unit 31. .
  • the current measurement unit 31 is electrically connected to the calculation unit 51, and when the current measurement unit 31 measures the current value of the tunnel current, the current value information can be output to the calculation unit 51.
  • the calculation unit 51 is electrically connected to the normalization unit 71. When the calculation unit 51 calculates the mode value, the mode value information can be output to the normalization unit 71.
  • the normalization unit 71 is electrically connected to the comparison unit 61. When the normalization unit 71 normalizes the mode value, the normalized mode value can be output to the comparison unit 61.
  • the electrode pair 10 can be used as the electrode pair 11.
  • the power supply unit 21 can be the power supply unit 20.
  • the current measurement unit 30 can be the current measurement unit 30.
  • a conventionally known arithmetic device such as a computer can be suitably used for the calculation unit 51, the normalization unit 71, and the comparison unit 61.
  • the calculation unit 51 may include a third storage unit (a known memory or the like) that stores data of a function for statistically analyzing the current value.
  • the function data may include one function or a plurality of different functions.
  • the normalization unit 71 may include a fourth storage unit (a known memory or the like) that stores reference nucleotide data for normalizing the mode value.
  • the reference nucleotide data may include one reference nucleotide or a plurality of different reference nucleotides.
  • the comparison unit 61 includes a fifth storage unit (known memory or the like) that stores reference value data for comparison with the mode value and data of known nucleotides (reference nucleotides) corresponding to the reference values. Also good.
  • the reference value data may include one reference value or a plurality of different reference values.
  • the apparatus 200 may further include an output unit (not shown) that outputs a determination result by the comparison unit 61. By providing the output unit, the user of the apparatus 200 can easily confirm the determination result.
  • the output unit is not particularly limited, and a known display device can be used.
  • the apparatus 200 has an input unit (not shown) for inputting various conditions (function, reference nucleotide, duration of nucleotide pulse, number of nucleotides constituting the polynucleotide to be analyzed, etc.) from the user. You may have.
  • the apparatus 200 holds the electrode pair 11 in a sample (for example, a solution in which a polynucleotide to be analyzed is dissolved) (not shown).
  • the apparatus 200 applies a voltage to the electrode pair 11 using the voltage application unit 21.
  • a tunnel current is generated between the electrode pair 11 and input to the current measuring unit 31.
  • the current measurement unit 31 measures the current value of the tunnel current and outputs information on the current value to the calculation unit 51.
  • the calculation unit 51 calculates the mode value of the current value.
  • the calculation unit 51 calculates the mode value by performing statistical analysis on the current value.
  • the calculation unit 51 classifies the current value based on the value, and calculates the mode value based on the number and current value belonging to each classified group.
  • the calculation unit 51 generates a histogram indicating the relationship between the number and current value belonging to each classified group.
  • the mode value is calculated by fitting the generated histogram to the function stored in the third storage unit and obtaining the peak value of the fitted function.
  • the calculation unit 51 may select a function according to an input from the user.
  • the calculation unit 51 outputs the calculated mode value information to the normalization unit 71.
  • the normalization unit 71 normalizes the mode value of the current value by dividing the input mode value by the mode value of the reference nucleotide stored in the fourth storage unit. In this case, the normalization unit 71 may select the mode value of the reference nucleotide according to the input from the user. Next, the normalization unit 71 outputs the normalized mode value information to the comparison unit 61.
  • the comparison unit 61 identifies nucleotides constituting the polynucleotide based on the normalized mode information. For example, the comparison unit 61 compares the standardized mode value with the reference value stored in the fifth storage unit. When the comparison unit 61 confirms that the normalized mode value is included in the reference value, the comparison unit 61 determines that the normalized mode value nucleotide is a reference nucleotide corresponding to the reference value. . On the other hand, when the comparison unit 61 confirms that the normalized mode value is not included in the reference value, the comparison unit 61 determines that the normalized mode value nucleotide is not a reference nucleotide corresponding to the reference value. To do.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of the same nucleotide. And the comparison part 61 determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide consists of the identified single kind of nucleotide.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of different nucleotides. In this case, the comparison unit 61 determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide cannot be determined.
  • the apparatus 200 includes an output unit (when the comparison unit 61 is connected to the output unit), information on determination by the comparison unit 61 is input to the output unit.
  • the output unit outputs the determination information, the user of the apparatus 200 can easily confirm the determination by the comparison unit 61.
  • the apparatus 200 can perform the following operations in addition to the operations described above.
  • the comparison unit 61 checks whether another reference value different from the already compared reference value is stored in the fifth storage unit. And when the comparison part 61 confirms that another reference value is preserve
  • the comparison unit 61 determines that the nucleotide under analysis is a reference nucleotide corresponding to this other reference value.
  • the comparison unit 61 confirms that the other reference value is not stored in the second storage unit (that is, the mode value is included in any of the reference values stored in the second storage unit). If not, the comparison unit 61 determines that the nucleotide under analysis is not any of the reference nucleotides corresponding to the reference value stored in the second storage unit.
  • the comparison unit 61 compares the mode value with the first reference value, and if the mode value is not included in the first reference value, the mode value is determined.
  • the mode value may be compared with the reference value one by one, such as “compare with the second reference value”. Further, the mode value may be compared with a plurality of different reference values in parallel, such as “compare the mode value simultaneously with a plurality of different reference values”.
  • nucleotide sequence of a polynucleotide by the apparatus 200 is determined using one reference value.
  • the apparatus 200 holds the electrode pair 11 in the sample.
  • the voltage application unit 21 applies a voltage to the electrode pair 11.
  • the current measurement unit 31 measures the current value of the tunnel current generated by the process of S202.
  • the calculation unit 51 calculates the mode value of the current value measured by the process in S203.
  • the comparison unit 61 compares the standardized value normalized by the process of S205 with the reference value, and confirms whether the standardized mode value is included in the reference value.
  • the comparison unit 60 determines that the normalized mode nucleotide is a reference nucleotide corresponding to the reference value.
  • the comparison unit 61 confirms whether there is a further normalized mode value to be compared. In S208, when the comparison unit 61 confirms that there is no further standardized mode value to be compared (NO), the process proceeds to S209. On the other hand, when it is confirmed in S208 that there is a further normalized mode value to be compared by the comparison unit 61 (in the case of YES), the process proceeds to S210.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a single kind of nucleotide, and the nucleotide sequence of the polynucleotide is composed of the reference nucleotide identified by the process of S206. Determine that there is. Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a plurality of types of nucleotides, and determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide cannot be determined. Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of an unknown nucleotide, and determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide cannot be determined. Then, the process ends.
  • the above-described flow is such that the output unit displays the processing result of S209 after S209 and the processing result of S210 after S210. And the step of the output unit displaying the processing result of S211 after S211.
  • nucleotide identification is performed using a plurality of different reference values.
  • the apparatus 200 holds the electrode pair 11 in the sample.
  • the voltage application unit 21 applies a voltage to the electrode pair 11.
  • the current measurement unit 31 measures the current value of the tunnel current generated by the processing in S302.
  • the calculation unit 51 calculates the mode value of the current value measured by the process in S303.
  • the standardization unit 71 normalizes the mode value calculated by the process in S304.
  • the comparison unit 61 compares the standardized value normalized by the processing in S305 with the reference value, and confirms whether the standardized mode value is included in the reference value.
  • the comparison unit 61 determines that the normalized mode nucleotide is a reference nucleotide corresponding to the reference value.
  • the comparison unit 61 confirms whether there is a further normalized mode value to be compared. In S308, when the comparison unit 61 confirms that there is no further normalized mode value to be compared (NO), the process proceeds to S309. On the other hand, when it is confirmed in S308 that there is a further normalized mode value to be compared by the comparison unit 61 (in the case of YES), the process proceeds to S310.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a single kind of nucleotide, and the nucleotide sequence of the polynucleotide is composed of a reference nucleotide identified by the processing in S307. Determine that there is. Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a plurality of types of nucleotides, and determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide cannot be determined. Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the normalized mode nucleotide is not a nucleotide corresponding to the reference value, and the process proceeds to S312.
  • the comparison unit 61 confirms whether another reference value different from the reference value is stored in the fifth storage unit.
  • the comparison unit 61 confirms that the other reference value is stored in the fifth storage unit (in the case of YES)
  • the process returns to S306.
  • the comparison unit 61 compares the mode value with the other reference value to check whether the mode value is included in another reference value.
  • the comparison unit 61 confirms that the other reference value is not stored in the fifth storage unit (that is, which of the reference values has the mode value stored in the fifth storage unit). ), The process proceeds to S313.
  • the above-described flow is such that the output unit displays the processing result of S309 after S309 and the output unit displays the processing result of S310 after S310. And a step in which the output unit displays the processing result of S313 after S313.
  • the mode value may be compared with one reference value (that is, the mode value may be compared with the reference value one by one), or the mode value may be different from one another.
  • the comparison may be performed simultaneously (in parallel) with the reference value.
  • FIG. 7 is a functional block diagram schematically illustrating an example of the apparatus (apparatus 200) according to the embodiment.
  • This apparatus 300 is the same as the apparatus 200 of the first embodiment, except that the means (detector) 41 for detecting the pulse of the tunnel current, the current value in the pulse is divided by the mode value of the reference nucleotide, thereby standardizing the current value And a means for comparing the normalized current value with a reference value (further comparing section 62).
  • the apparatus 300 will be described below, but the description of the parts overlapping with the apparatus 100 will be omitted.
  • the comparison unit 61 is electrically connected to the detection unit 41. Therefore, when the comparison unit 61 identifies a plurality of types of nucleotides, the comparison unit 61 instructs the detection unit 41 to detect a pulse of the tunnel current.
  • the detection unit 41 is electrically connected to a further normalization unit 72, and when the detection unit 41 detects a pulse, information on this pulse can be output to the further normalization unit 72.
  • the further normalization unit 72 is electrically connected to the further comparison unit 62. When the normalization unit 72 normalizes the current value of the pulse, the information about the normalized current value is output to the further comparison unit 72. Can do.
  • the detection unit 41 for example, a conventionally known arithmetic device such as a computer can be suitably used.
  • the detection unit 41 may include a sixth storage unit (a known memory or the like) that stores data on the duration of the nucleotide pulse.
  • the normalization unit 71 may also serve as the further normalization unit 72, and the normalization unit 71 and the further normalization unit 72 may be different devices.
  • the comparison unit 61 may also serve as the further comparison unit 62, and the comparison unit 61 and the further comparison unit 62 may be different devices.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of the same nucleotide. And the comparison part 61 determines that the nucleotide sequence of this polynucleotide consists of the identified single kind of nucleotide.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of different nucleotides. In this case, the comparison unit 61 instructs the detection unit 41 to detect a tunnel current pulse.
  • the detection unit 41 receives the instruction from the comparison unit 61 and detects a pulse of the tunnel current. For example, the detection unit 41 instructs the current measurement unit 31 to output data of the measured current value of the tunnel current to the detection unit 41.
  • the current measurement unit 31 outputs current value data to the detection unit 41 based on an instruction from the detection unit 41.
  • the detector 41 detects a tunnel current pulse from the input current value data.
  • the detection unit 41 has the following two conditions: (1) lasting for n times or more the mode value of the duration of the nucleotide pulse, and (2) showing a stepped signal. One condition is used to detect a pulse of tunneling current due to the polynucleotide to be analyzed. Then, the detection unit 41 outputs the detected pulse information to the further normalization unit 72.
  • the further normalization unit 72 normalizes the current value by dividing the input current value of this pulse by the mode value of the reference nucleotide.
  • the normalization unit 71 outputs the normalized current value information to the further comparison unit 62.
  • the further comparison unit 62 determines the arrangement of nucleotides constituting the polynucleotide based on the normalized current value information. For example, the further comparison unit 62 divides the pulse by the number of nucleotides constituting the polynucleotide. Next, the reference value in which the normalized current value of the pulse in the divided section is included for the longest time is specified. The further comparison unit 62 identifies the nucleotides in this section as reference nucleotides corresponding to the identified reference value.
  • the further comparison unit 62 can identify the reference value including the standardized current value of the pulse in one section based on the threshold of the time when the standardized current value of the pulse is included in the reference value. If not, it is determined that the nucleotide in this interval is unknown.
  • the number of nucleotides constituting the polynucleotide and the threshold value may be input from the user via the input unit.
  • the apparatus 300 holds the electrode pair 11 in the sample.
  • the voltage application unit 21 applies a voltage to the electrode pair 11.
  • the current measurement unit 31 measures the current value of the tunnel current generated by the process of S402.
  • the calculation unit 51 calculates the mode value of the current value measured by the process in S403.
  • the comparison unit 61 compares the standardized value normalized by the processing in S405 with the reference value, and confirms whether the standardized mode value is included in the reference value.
  • the comparison unit 61 determines that the normalized mode nucleotide is a reference nucleotide corresponding to this reference value.
  • the comparison unit 61 confirms whether there is a further standardized mode value to be compared. In S408, when the comparison unit 61 confirms that there is no further normalized mode value to be compared (NO), the process proceeds to S409. On the other hand, when it is confirmed in S408 that there is a further normalized mode value to be compared by the comparison unit 61 (in the case of YES), the process proceeds to S410.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a single kind of nucleotide, and the nucleotide sequence of the polynucleotide is composed of a reference nucleotide identified by the processing in S407. Determine that there is. Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the polynucleotide applied to the present invention is composed of a plurality of types of nucleotides.
  • the comparison unit 61 confirms whether another reference value different from the reference value is stored in the fifth storage unit. In S411, when the comparison unit 61 confirms that the other reference value is stored in the fifth storage unit (in the case of YES), the process proceeds to S412. On the other hand, when the comparison unit 61 confirms in S411 that the other reference value is not stored in the fifth storage unit (that is, which of the reference values has the mode value stored in the fifth storage unit). , The process proceeds to S423.
  • the comparison unit 61 compares the further standardized mode value confirmed by the process of S411 with another reference value, and whether or not the further standardized mode value is included in another reference value. Confirm.
  • the comparison unit 61 confirms that the further normalized mode value is included in the reference value in S412 (in the case of YES)
  • the process proceeds to S413.
  • the comparison unit 61 confirms that the mode value is not included in the reference value (NO)
  • the process proceeds to S415.
  • the comparison unit 61 determines that the further normalized mode value nucleotide is another reference nucleotide corresponding to another reference value.
  • the comparison unit 61 confirms whether there is a further normalized mode value to be compared. In S414, when the comparison unit 61 confirms that there is no further normalized mode value to be compared (NO), the process proceeds to S417. On the other hand, when it is confirmed in S414 that there is a further normalized mode value to be compared by the comparison unit 61 (in the case of YES), the process returns to S411.
  • the comparison unit 61 determines that the further normalized mode nucleotide is not a reference nucleotide corresponding to another reference value, and the process proceeds to S416.
  • the comparison unit 61 confirms whether another reference value different from the reference value is stored in the fifth storage unit.
  • the comparison unit 61 confirms that the other reference value is stored in the fifth storage unit (in the case of YES)
  • the process returns to S412.
  • the comparison unit 61 compares the mode value with the another reference value to check whether the mode value is included in another reference value.
  • the comparison unit 61 confirms in S412 that the other reference value is not stored in the fifth storage unit (that is, which of the reference values has the mode value stored in the fifth storage unit). , The process proceeds to S423.
  • the comparison unit 61 instructs the detection unit 41 to detect a pulse of the tunnel current.
  • the detection unit 41 detects a pulse of the tunnel current.
  • the further normalization unit 72 normalizes the current value of the pulse detected by the processing in S418.
  • the further comparison unit 62 compares the current value normalized by the processing in S419 with the reference value to determine the arrangement of nucleotides constituting the polynucleotide (determines the nucleotide sequence of the polynucleotide). Then, the process ends.
  • the comparison unit 61 determines that the normalized mode nucleotide is not a reference nucleotide corresponding to the reference value, and the process proceeds to S422.
  • the comparison unit 61 confirms whether another reference value different from the reference value is stored in the fifth storage unit.
  • the comparison unit 61 confirms that the other reference value is stored in the fifth storage unit (in the case of YES)
  • the process returns to S406.
  • the comparison unit 61 compares the mode value with the another reference value to check whether the mode value is included in another reference value.
  • the comparison unit 61 confirms in S406 that the other reference value is not stored in the fifth storage unit (that is, which of the reference values has the mode value stored in the fifth storage unit). , The process proceeds to S423.
  • the apparatus 300 includes the above-described additional members, so that the nucleotide sequence of a polynucleotide composed of a single kind of nucleotide can be determined, and the polynucleotide comprising a plurality of kinds of nucleotides can be determined.
  • the nucleotide sequence can also be determined.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the mode value is generated as a histogram indicating the relationship between the maximum current value in each pulse and the number of pulses corresponding to the maximum current value, and the generated histogram is used as a predetermined function. It is preferable to calculate by fitting and obtaining a peak value of the fitted Gaussian function. This function is preferably a Gaussian function.
  • the distance between electrodes is preferably 0.5 to 2 times the nucleotide molecular diameter.
  • the method for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention comprises a step of detecting a pulse of a tunnel current, and a step of normalizing the current value by dividing the current value in the pulse by the mode value of the reference nucleotide. And a step of comparing the normalized current value with a reference value.
  • the apparatus for determining the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention comprises means for detecting a pulse of a tunnel current, means for normalizing the current value by dividing the current value in the pulse by the mode value of the reference nucleotide. And a means for comparing the normalized current value with the reference value.
  • the distance between the electrodes is preferably 0.5 to 2 times the molecular diameter of the nucleotide.
  • Example 1 In the following examples, as shown in FIGS. 9 and 10, deoxythymidine 5 ′ monophosphate (dTMP), guanosine 5 ′ monophosphate (GMP), adenosine 5 ′ monophosphate based on the measurement of tunnel current Statistical identification of (AMP) and cytidine 5 ′ monophosphate (CMP) is described.
  • a method for solving the problem of electron transport through one molecule for performing such discrimination is that nucleotides dissolved in Milli-Q water are trapped between the electrodes of the gold nanoelectrode shown in FIG. Therefore, it is based on the observation of a temporary change of the tunnel current (I) generated between two electrodes (M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 9, 1659 (2009), M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)).
  • FIG. 9 is a schematic diagram for explaining the measurement of a tunnel current flowing in one molecule of nucleotide captured between electrodes of a gold nanoelectrode when a DC bias (V b ) is applied in water.
  • FIG. 10 shows the molecular structure of each nucleotide used in this example.
  • FIG. 11A shows a nanoscale gold bond fabricated on a flexible metal substrate coated with polyimide. This gold bond is not supported.
  • B and C in FIG. 11 are enlarged views of the narrowest constriction of the nanoscale junction.
  • Such a nanoelectrode pair was produced as follows.
  • the main requirement for measuring the conductance of a single nucleotide molecule is to form an electrode pair with an interelectrode distance comparable to the length of the nucleotide (about 1 nm).
  • Such an electrode pair was formed using a nano-machined mechanical fracture joining method (MCBJ).
  • nano-scale gold bonding is performed using polyimide (Industrial Summit Technology) using standard electron beam lithography and lift-off technology using an electron beam lithography system (manufactured by JEOL Ltd., catalog number: JSM6500F). (Catalog No. Pyre-Ml) and patterned on a flexible metal substrate.
  • the polyimide under the bonding was removed by etching based on the reactive ion etching method using a reactive ion etching apparatus (manufactured by Samco, catalog number: 10NR).
  • a nanoscale gold bridge having a structure folded at three points was fabricated by bending the substrate. Such bending of the substrate was performed using a piezo actuator (manufactured by CEDRAT, catalog number: APA150M).
  • the nanoelectrode pair was formed by pulling the bridge and breaking a part of the bridge.
  • a resistance feedback method is used to reduce a series resistance of 10 k ⁇ under the programmed junction stretching speed.
  • Vb DC bias voltage
  • the bridge was further pulled, and the size of the gap (distance between the electrodes) generated by the breakage was set to be the length of the target nucleotide molecule (about 1 nm).
  • a nanoelectrode pair was obtained by such a procedure.
  • the nanoelectrode pair thus prepared was immersed in Milli-Q water in which nucleotides were dissolved, and the tunnel current (I) generated when nucleotides were trapped between the nanoelectrode pairs was measured.
  • a tunnel current (I) across a nanoelectrode pair having a distance between electrodes formed with a length of 1 nm was amplified using a home-made logarithmic amplifier. By using this logarithmic amplifier, a picoampere level current can be read at> 1 kHz.
  • the amplified current signal was recorded on a computer at a sampling rate of 2 kHz using a DAQ card (Nippon National Instruments, catalog number: NI USB-9234) having a resolution of 24 bits.
  • the current (I) was continuously measured for 50 minutes for each of the nanoelectrode pairs produced as described above. Each time a sample was measured, the sample was replaced with a new one.
  • a tunnel current (I) when a bias voltage of 0.75 V is applied between a pair of nanoelectrodes whose electrode distance is adjusted to 1 nm is measured over 3000 seconds (50 minutes). The measured tunnel current was plotted against time (seconds). A part of the “curve (It curve) showing the relationship between tunnel current and time (second)” obtained by the plot is shown in FIG.
  • a signal with an asterisk in A of FIG. 12 is enlarged and shown in B of FIG. I p shown in FIG. 12B is defined as the maximum value of the height in the pulse-like signal, and t d is defined as the maximum value of the pulse width in the pulse-like signal.
  • FIG. 12A it can be seen that several pulse-like signals having various heights appear irregularly over time.
  • the small offset of about 80 pA and the noise at the level of about ⁇ 10 pA are due to the ionic nature of polarized GMP in the solvent.
  • This It curve is characterized in that there are a plurality of pulses having “maximum current values (I p ) in pulses” of different sizes.
  • the pulse widths were different by enlarging the current pulse.
  • the tunnel current rapidly increases from the base level and then decreases rapidly to the base level. Such a rapid increase in current indicates that GMP1 molecules have been captured between the nanoelectrode pairs, and a rapid decrease in current indicates that the captured GMP has dissociated. can do.
  • FIG. 13 shows the It curve obtained for the interelectrode distance (d gap ) under various conditions.
  • FIG. 13A is a diagram showing an example of an It curve measured when d gap is adjusted to about 2.5 nm. As shown in FIG. 13A, when the distance between the electrodes of the nanoelectrode is longer than the molecular diameter of the nucleotide (about 1 nm for GMP), the characteristics seen in A or B of FIG. The characteristic signal disappeared and a characteristic curve without a tunnel current pulse appeared.
  • FIG. 13B a characteristic pulse-like signal indicating one nucleotide molecule captured between the electrodes was observed only when d gap was set near the molecular diameter of the nucleotide (about 1.0 nm).
  • FIG. Pulse-like signals tend to appear as several populations at relatively long (50-1000 second) time intervals. This indicates that nucleotides are adsorbed on the surface of the gold electrode. The affinity of this nucleotide for gold has been well studied (K. A. Brown, S. Park, K. Hamad-Schifferli, J. Phys. Chem. C 112, 7517 (2008)).
  • nucleotides When nucleotides adsorb in the vicinity of the gap region of the electrode pair, the electrons begin to pass through the potential barrier through the nucleotides, and the tunneling current until the gold-nucleotide bond is thermally dissociated. Of pulses occur. After desorption, no signal is generated until the next molecule approaches the space between the electrodes of the nanoelectrode pair.
  • FIG. 13C is a diagram showing one of the peak groups shown in FIG. 13B in more detail. Pulses of tunneling current with various heights appear irregularly with time.
  • the bias voltage (V b ) was expanded to the range of 0.25V to 0.75V, and the tunnel current was measured over time. The results are shown on the left of FIGS.
  • the left panels of FIGS. 14A to 14C are part of an It curve showing tunnel current pulses obtained when V b is 0.25 V, 0.50 V, and 0.75 V, respectively. .
  • a pulse-like signal with I p was detected in each of the measured V b conditions, and these signals were similar to the signals shown in FIG.
  • I p -V b The characteristics of I p -V b were investigated by statistically analyzing the tunnel current pulses. Histograms were generated from 500 obtained Ip data. The created histogram of I p is shown in the right panels of FIGS. By examining the histogram of the I p, it revealed that distributed over a wide range of I p is greater than an order of magnitude.
  • the electrostatic force induced by the transverse field is expected to affect the duration of nucleotides trapped in the nanoscale gap between the electrode pair (M. Tsutsui, M. Taniguchi, T Kawai, Nano Lett. 9, 1659 (2009)).
  • the scatter diagram of I p -t d shows that V b does not clearly depend on t d . Therefore, the transverse electric field greatly contributes to the electrical detection of a single nucleotide by sorting the possible conformations of the molecule and giving a well-defined I p.
  • An It curve was generated for AMP when the distance between electrodes (d gap ) was relatively long (approximately 2.5 nm).
  • the prepared It curve is shown in FIG.
  • the vertical axis is nA.
  • This It curve is characterized by a large offset of about 10 nA and irreversible up and down fluctuations in current.
  • AMP has complicated characteristics, and the It curve for AMP is characterized by a high current base level (> 500 pA) and a lot of noise, as shown in FIG.
  • Such a characteristic of the It curve was observed even when the distance between the electrodes was longer than 2 nm.
  • the AMP when the distance between the electrodes was further expanded beyond 5 nm, the tunnel current was smoothly reduced as the d gap increased.
  • Adenine has been shown to bind nonspecifically to a relatively high degree to gold (J. Kundu, O. Neumann, BG Janesko, D. Zhang, S. Lal, A. Barhoumi, GE Scuseria , NJ Halas, J. Phys. Chem. ASAP article, KA Brown, S. Park, K. Hamad-Schifferli, J. Phys. Chem. C 112, 7517 (2008)).
  • This unique affinity of adenine makes it difficult to prevent unintentional excessive adsorption of AMP to gold and interferes with the electrical detection of a single nucleotide molecule through the measurement of Ip .
  • FIG. 16A shows an It curve obtained for dTMP and CMP when Vb is 0.75 V ( note that the result of GMP is also shown).
  • FIG. 16B shows that for dTMP, CMP, and GMP, the corresponding Ip histograms have a single peak, suggesting an effective effect of the transverse electric field on the suppression of the distortion of the molecular structure. is doing.
  • the solid line shown in B of FIG. 16 indicates fitting using a Gaussian function for the histogram.
  • the peaks (mode) of dTMP, CMP, and GMP are 96 pA, 30 pA, and 42 pA, respectively.
  • GMP, CMP, and dTMP can be identified based on the value of the horizontal axis (tunnel current) of the peak of I p . Further, based on these I p peaks, the order of conductivity of one molecule can be determined as GMP>CMP> dTMP.
  • This result can be qualitatively interpreted as reflecting the difference in the gap between the DNA nucleotides HOMO and LUMO as guanine ⁇ cytosine to thymine (M. Zwolak, M. Di Ventra, Nano Lett. 5, 421 (2005), M. Taniguchi, T. Kawai, Physica E 33, 1 (2006)) supporting our claim for tunnel-based electron transport through a single nucleotide ing.
  • nucleotides constituting DNA dCMP, dGMP, dAMP and dTMP
  • CMP, GMP, AMP and UMP nucleotides constituting RNA
  • a distance between electrodes of 0.8 nm and a voltage of 0.4 V were used.
  • a pulse of the tunnel current (I) was observed.
  • a conductance histogram was created using 1000 samples, and fitting using a Gaussian function was performed.
  • the results of nucleotides constituting DNA are shown in FIG. 17A, and the results of nucleotides constituting RNA are shown in FIG. 17B.
  • the solid lines shown in A and B of FIG. 17 indicate fitting using a Gaussian function for the histogram.
  • the conductance histogram of each nucleotide has a single peak.
  • the peaks (modes) of dCMP, dGMP, dAMP, and dTMP are 60 pS, 87 pS, 67 pS, and 39 pS, respectively.
  • the peaks (modes) of CMP, GMP, AMP, and UMP are 64 pS, 123 pS, 92 pS, and 50 pS, respectively.
  • Identifying a molecule of nucleotides is an important issue for DNA sequencing through the detection of tunneling currents.
  • the peak of I p (or the conductance peak) of nucleotides varies from nucleotide to nucleotide, whereas when the histograms are overlaid, the distribution of I p (conductance distribution) is significantly overlapping. It was clearly demonstrated that This reveals that single shot measurements are definitely insufficient to identify the type of nucleotide.
  • it is highly possible to collect a statistical average of the tunneling current over the period of reading the DNA nucleotide sequence so that data is collected at high speed while the DNA nucleotide sequence moves through the nanoscale gap of the electrode pair.
  • Example 2 DNA based on the measurement of tunnel current (DNA consisting of a nucleotide sequence of GTG (hereinafter referred to as “GTG”), DNA consisting of a nucleotide sequence of TGT (hereinafter referred to as “GTG”)
  • GTG DNA consisting of a nucleotide sequence of TGT
  • GGG GGG nucleotide sequence
  • the nanoelectrode pair used in Example 1 was immersed in Milli-Q water in which any one of the above three types of DNA was dissolved. Then, the tunnel current generated between the electrodes of the nanoelectrode pair was measured by the same method as in Example 1, and the conductance was calculated from the current value. The voltage applied between the nanoelectrodes was 0.4V. The calculated conductance was divided by the mode (87 pS) of deoxyguanosine monophosphate (dGMP) described above shown in FIG. The result of such an experiment is shown in FIG. A, B, and C in FIG. 18 show the results when GTG, TGT, and GGG are used, respectively.
  • dGMP deoxyguanosine monophosphate
  • nucleotide type> The “dGMP relative mode value” obtained by dividing the dGMP mode value (87 pS) shown in FIG. 17A by this dGMP mode value (87 pS) was determined as 1.
  • the full width at half maximum of the Gaussian function fitted to the dGMP histogram shown in FIG. 17A was determined as 44 pS.
  • the full width at half maximum was divided by the mode value of dGMP.
  • “full width at half maximum centered on the relative mode of dGMP” was obtained as 44 pS.
  • full width at half maximum centered on the relative mode value of dGMP and the “full width at half maximum centered on the relative mode value of dGTP” indicate the same value. Therefore, “full width at half maximum centered on relative mode of dGMP” can be used as an index of “dGTP.
  • “ full width at half maximum centered on relative mode of dGMP ” is This is referred to as “range indicating dGTP”.
  • the “dGMP relative mode value” obtained by dividing the dTMP mode value (39 pS) shown in FIG. 17A by the dGMP mode value (87 pS) was obtained as 0.45.
  • the full width at half maximum of the Gaussian function fitted to the dTMP histogram shown in FIG. 17A was determined as 22 pS.
  • “full width at half maximum centered on the relative mode value of dTMP” was obtained as 22 pS.
  • the “full width at half maximum centered on the relative mode value of dTMP” and the “full width at half maximum centered on the relative mode value of dTTP” indicate the same value.
  • “full width at half maximum centered on the relative mode value of dTMP” can be used as an index of “dTTP.
  • “ full width at half maximum centered on the relative mode value of dTMP ” is This is referred to as “range indicating dTTP”.
  • the area indicated by the shaded “G” is the range indicating the dGTP.
  • the area indicated by the shaded area “T” is a range indicating the dTTP.
  • the left graph is a histogram of conductances of all measured tunnel currents
  • the right graph is a graph showing the relationship between conductance divided by the mode value of dGMP (614 pS) and time (seconds). It is.
  • the vertical axis is the relative conductance
  • the horizontal axis is the measured conductance count.
  • the vertical axis is relative conductance
  • the horizontal axis is time (ms).
  • the three peaks that appear in the histogram were confirmed from the histogram shown on the left graph.
  • the lowest peak in the histogram (the mode value is the smallest) was taken as the baseline (noise) conductance.
  • each peak was set as the center and fitting was performed with a Gaussian function, and the value of each peak (mode of conductance) was obtained.
  • the lowest peak value (I0) was 52 pS
  • the middle peak value (I1) was 271 pS
  • the uppermost peak value (I2) was 666 pS.
  • the relative mode value for the top peak is included in the range indicating the above-mentioned dGTP, and this relative mode value is the mode of “deoxyguanosine triphosphate (G)”. It was determined to be a frequent value.
  • the relative mode value of the middle peak is included in the range indicating the above dTTP, and this relative mode value is the mode of “deoxythymidine triphosphate (T)”. It was determined to be a value.
  • the graph on the left is a histogram of the conductance of all measured tunnel currents, and the graph on the right shows the relationship between the tunnel current divided by the mode value of dGMP (123 pS) and time (seconds). It is a graph to show.
  • the histogram shown in the left graph is divided into three regions based on the peak, and the mode of conductance (baseline conductance) in the region including the lowest peak is obtained.
  • the conductance mode (I4) (53 pS) in the region including the middle peak
  • the conductance mode (I5) (143 pS) in the region including the top peak were determined.
  • the graph on the left is a histogram of conductances of all measured tunnel currents, and the graph on the right shows the relationship between the tunnel current divided by the mode value of dGMP (230 pS) and time (seconds). It is a graph to show.
  • the histogram shown in the left graph is divided into two regions based on the peak, and the mode value of conductance (baseline conductance) in the region including the lowest peak. (I6) (83 pS), the mode value (I7) (313 pS) of conductance in the region including the top peak was determined.
  • the relative conductance in the right graph can be classified into a range indicating dGTP and a range indicating dTTP.
  • the relative conductance in the right graph can be classified into a range indicating dGTP and a range indicating dTTP. That is, it can be seen from A and B in FIG. 18 that the nucleotides of the DNA used consist of G and T.
  • FIG. 19 shows an enlarged view of a part of the graph on the right side of A in FIG.
  • FIG. 20 shows an enlarged view of a part of the graph on the right side of B in FIG.
  • FIG. 19A is an enlarged view of a part of the graph on the right side of FIG. 18A.
  • B of FIG. 19 is obtained by smoothing the curve of A of FIG. 19 by performing adjacent averaging.
  • the range indicating dGTP is indicated by dark shades
  • the range indicating dTTP is indicated by light shades.
  • FIG. 19C is an enlarged view of a part of B of FIG.
  • 20A is an enlarged view of a part of the graph on the right side of FIG. 18B.
  • B of FIG. 20 is obtained by smoothing the curve of A of FIG. 20 by performing adjacent averaging.
  • the range indicating dGTP is indicated by dark shades
  • the range indicating dTTP is indicated by light shades.
  • 20C is an enlarged view of a part of B in FIG.
  • nucleotide indicated by the “relative conductance” included in the range indicating dGTP was determined to be dGTP. Further, as shown in FIG. 19B and FIG. 20B, nucleotides having a “relative conductance” included in the range indicating dTTP were determined to be dTTP.
  • Example 2 Determination of nucleotide sequence>
  • a histogram of td was created based on the graph showing the relationship with Ip-td as shown in B of FIG. This td represents the time during which one nucleotide stays between the nanoelectrodes.
  • the mode value of td was obtained as about 1 ms. This revealed that in the experimental system used in Example 2, one nucleotide stays between the nanoelectrodes for about 1 ms.
  • a time-current signal pulse of DNA consisting of three nucleotides shows three step-like signals (condition 2).
  • the pulse in the first G section has a shape in which the normalized current value rises from the base level, passes the T reference value, and then shows the G reference value. is there.
  • the reference value containing the longest normalized current value was the G reference value, so the nucleotide in the first zone could be identified as G.
  • the pulse in the second T section has a shape in which the standardized current value falls from the G reference value, shows the T reference value, and then rises again to show the G reference value.
  • the reference value containing the longest normalized current value for the longest time is the T reference value, so the nucleotide in the second zone could be identified as T.
  • the pulse in the third G section has a shape in which the normalized current value shows the G reference value for a certain period, then passes through the T reference value and falls to the base level.
  • the reference value containing the longest normalized current value is the G reference value, so the nucleotide in the third zone can be identified as G.
  • the nucleotide sequence of the DNA from which this pulse was derived could be determined to be GTG.
  • the pulse in the first T section has a shape in which the normalized current value rises from the base level and indicates the T reference value.
  • the reference value that contained the normalized current value for the longest time was the T reference value, so the nucleotide in the first zone could be identified as T.
  • the pulse in the second G area has a shape in which the standardized current value rises from the T reference value, shows the G reference value, and then falls to show the T reference value again.
  • the reference value containing the longest normalized current value is the G reference value, so the nucleotide in the second zone could be identified as G.
  • the pulse in the third T area has a shape in which the standardized current value shows the reference value of T for a certain period and then falls to the base level.
  • the reference value containing the longest normalized current value for the longest time is the T reference value, so the nucleotide in the third zone could be identified as T.
  • the nucleotide sequence of the DNA from which this pulse was derived could be determined to be TGT.
  • the present invention can identify this molecule by analyzing one molecule using amperometry.
  • the present invention is a basic principle of a next-generation sequencer promoted by the National Institutes of Health (NIH), and can be applied to a next-generation sequencer that does not require DNA amplification by PCR and chemical modification of DNA.
  • the present invention can be applied to a high-sensitivity sensor that detects biomolecules such as influenza viruses and allergens with a single molecule.

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Abstract

　本発明は、電流測定を利用して、ヌクレオチドを識別する技術およびポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する技術を提供する。本発明は、分析すべきヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが通過した際に電極間に生じるトンネル電流の最頻値を算出し、算出した最頻値を利用するものである。これによって、本発明は、ヌクレオチドの識別およびポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定を、標識することなく直接的に迅速に実施することができる。

Description

ヌクレオチドを識別する方法および装置、ならびにポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法および装置
　本発明は、電流測定を用いてヌクレオチドを分析することによって、このヌクレオチドを識別する方法および装置に関する。また、本発明は、電流測定を用いてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法および装置に関する。
　ＤＮＡのヌクレオチド配列を分析する技術は、単に学術的な研究の分野に留まらず、医療、創薬、および犯罪捜査などの分野にまで応用されておりこの技術の発展にますます関心が集められている。
　これまでに開発されたＤＮＡのシーケンサーは、ヌクレオチドに付加した標識を蛍光によって識別するという光測定技術を利用しており、ヌクレオチドそのものを直接的に識別するものではない。ヌクレオチドに標識を付加するためには、ＰＣＲを用いてヌクレオチドを化学修飾する必要がある。この手順には、多数の試薬が必要となるだけでなく、多くの時間も費やされる。それ故、ＤＮＡのシーケンシングを行うには、多大な資金と時間とが必要になる。
　このような状況の中、過去十数年の間に、個々のゲノムのシーケンシングに向けた一歩として、１分子に基づくＤＮＡのシーケンシング技術に著しい進歩があった。この進歩によってもたらされた最近の際立った成果としては、化学的に設計されたαヘモリシンのナノスケールのポア（以下、「ナノポア」と称する。）を利用した検出器が挙げられる（非特許文献１～５参照）。
　この検出器では、シクロデキストリンに埋め込まれた生物学的なナノポアを一本鎖ＤＮＡのオリゴマーが通過する間に起こる、イオン電流の一時的な遮断を探知することによってＤＮＡ１分子のシーケンシングを行うことができる（非特許文献６、７参照）。このような、強固で構造化可能な固体のナノポアが関心を集めており、ポアを通過する単一の生体分子の動態を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たしていた（非特許文献１、２、８～１１参照）。しかしながら、上述の検出器を用いたイオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングは、（１）ポアサイズの選択が限定されている、（２）システムが不安定である、という問題点を有しており、生物学的なナノポアを利用したシーケンサーの実用化の目処は立っておらず、１分子の分解能を有する、イオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングは未だに検討中である（非特許文献３、４参照）。
　このイオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシングに代わる手法として、横方向の電子輸送（transverse electron transport）に基づくシーケンシング理論が提案された。この理論は、図２１に示すように、一対の電極の間のナノスケールの空間をヌクレオチドが通過するときに、各ヌクレオチドに特有の横方向の導電率を検出するという原理に基づいている（この導電率は各ヌクレオチドのＨＯＭＯとＬＵＭＯとの間のギャップの違いに関連する。）。具体的には、１つのＤＮＡがナノポアを通過する際に、ナノポアの端に設けられたナノスケールの電極間距離を有する電極対（以下、「ナノ電極対」と称する。）に、各ヌクレオチドを介したトンネル電流が生じ、生じたトンネル電流の電流値を測定すれば、この電流値に基づいて、標識することなく、ヌクレオチド配列を直接的に読み取ることが可能となるという考えである。
　このような横方向の電子輸送に基づくシーケンシングを行えば、１時間当たり４００キロベースを超える、極めて速いシーケンシングのスピードにてＤＮＡ１分子のヌクレオチド配列を直接的に読むことができると予想されている（非特許文献５、１２、１３参照）。このような理論的な見込みに基づき、いくつかのグループが、マイクロメートルまたはナノメートルの大きさの流体チャネルにナノ電極対を埋め込むことによって、この予想を実証するためのシステムを開発した（非特許文献１６～１９参照）。
J. Li, D. Stein, C. McMullan, D. Branton, M. J. Aziz, J. A. Golovchenko, Nature 412, 166 (2001) A. J. Storm, J. H. Chen, X. S. Ling, H. W. Zandbergen, C. Dekker, Nature Mat. 2, 537 (2003) C. Dekker, Nat. Nanotechnol. 2, 209 (2007) D. Branton, D. W. Deamer, A. Marziali, H. Bayley, S. A. Benner, T. Butler, M. Di Ventra, S. Garaj, A. Hibbs, X. Huang, S. B. Jovanovich, P. S. Krstic, S. Lindsay, X. S. Ling, C. H. Mastrangelo, A. Meller, J. S. Oliver, Y. V. Pershin, J. M. Ramsey, R. Riehn, G. V. Soni, V. Tabard-Cossa, M. Wanunu, M. Wiggin, J. A. Schloss, Nat. Biotech. 26, 1146 (2008) M. Zwolak, M. Di Ventra, Rev. Mod. Phys. 80, 141 (2008) J. Clarke, H.-C. Wu, L. Jayasinghe, A. Patel, S. Reid, H. Bayley, Nat. Nanotechnol. 4, 265 (2009) D. Stoddart, A. J. Heron, E. Mikhailova, G. Maglia, H. Bayley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7702 (2009) D. Fologea, M. Gershow, B. Ledden, D. S. McNabb, J. A. Golovchenko, Li J., Nano Lett. 5, 1905 (2005) U. F. Keyser, B. N. Koeleman, S. V. Dorp, D. Krapf, R. M. M. Smeets, S. G. Lemay, N. H. Dekker, C. Dekker, Nat. Phys. 2, 473 (2006) E. H. Trepagnier, A. Radenovic, D. Sivak, P. Geissler, J. Liphardt, Nano Lett. 7, 2824 (2007) S. van Dorp, U. F. Keyser, N. H. Dekker, C. Dekker, S. G. Lemay, Nat. Phys. 5, 347 (2009) M. Zwolak, M. Di Ventra, Nano Lett. 5, 421 (2005) J. Lagerqvist, M. Zwolak, M. Di Ventra, Byophys. J. 93, 2384 (2007) J. He, L. Lin, P. Zhang, S. Lindsay, Nanno Lett. 7, 3854 (2007) S. Chang, J. He, A. Kibel, M. Lee, O. Sankey, P. Zhang, S. Lindssay, Nat. Nanotechnol. 4, 297 (2009) M. D. Fischbein, M. Drndic, Nano Lett. 7, 1329 (2007) X. Liang, S. Y. Chou, Nano Lett. 8, 1472 (2008) T. Maleki, S. Mohammadi, B. Ziaie, Nanotechnol. 20, 105302 (2009) M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 9, 1659 (2009)
　しかしながら、上述したように、横方向の電子輸送に基づくシーケンシングの原理を実証するためのシステムが開発されたが、用いたヌクレオチドが同一の場合であっても、測定毎にトンネル電流の値が変動するため、この値を指標としてヌクレオチドを識別することはできなかった。また、ヌクレオチドの識別ができない以上、複数のヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することも実現されていなかった。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、電流測定を用いたヌクレオチドの識別およびポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定を実現することにある。
　本発明者らは、測定毎に変化するトンネル電流のパルスの最大電流値を統計的に分析することによって得られた値が、各ヌクレオチドに固有の値であることを見出した。そして、ヌクレオチドを識別するための指標としてこの値を使用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。このような統計的分析は従来技術において全く着目されていない。
　すなわち、本発明に係るヌクレオチドを識別する方法は、ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させる工程、ヌクレオチドが通過した際に電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する工程、各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する工程、および算出した最頻値を参照値と比較する工程を包含することを特徴としている。
　また、本発明に係るヌクレオチドを識別する装置は、ヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対、該電極間に電圧を印加する手段、該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する手段、各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する手段、および算出した最頻値を参照値と比較する手段を備えていることを特徴としている。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、ポリヌクレオチドを、電極間を通過させる工程、該ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、測定した電流値の最頻値を算出する工程、該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する工程、および規格化した最頻値を参照値と比較する工程を包含しており、該基準ヌクレオチドの最頻値は、該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させること、該基準ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出することによって取得されたものであることを特徴としている。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置は、ポリヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対、該電極間に電圧を印加する手段、該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段、測定した電流値の最頻値を算出する手段、該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する手段、および規格化した最頻値を参照値と比較する手段を備えており、該基準ヌクレオチドの最頻値は、該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させること、該基準ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出することによって取得されたものであることを特徴としている。
　本発明を用いれば、標識することなく直接的に迅速にヌクレオチドを識別することができる。また、本発明を用いれば、標識することなく直接的に迅速にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
図１は、本発明に係る装置の一例を模式的に示した機能ブロック図である。 図２は、本発明に係る装置による処理のフローの一例を示すフローチャートである。 図３は、本発明に係る装置による処理のフローの別の一例を示すフローチャートである。 図４は、本発明に係る別の装置の一例を模式的に示した機能ブロック図である。 図５は、本発明に係る別の装置による処理のフローの一例を示すフローチャートである。 図６は、本発明に係る別の装置による処理のフローの別の一例を示すフローチャートである。 図７は、本発明に係るさらなる別の装置の一例を模式的に示した機能ブロック図である。 図８は、本発明に係るさらなる別の装置による処理のフローの一例を示すフローチャートである。 図９は、金のナノ電極対の間に捕捉されたヌクレオチド１分子に流れるトンネル電流の測定を説明する模式図である。 図１０は、本実施例に使用したヌクレオチドの分子構造を示す図である。 図１１は、機械的に構造化可能なナノ電極対の走査電子顕微鏡の写真である。 図１２は、ヌクレオチドとしてグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を用いた場合に得られたトンネル電流（Ｉ）と時間（ｔ）との関係を示す曲線（以下、「Ｉ－ｔ曲線」と称する。）を示すグラフである。 図１３は、種々の条件の電極距離（ｄgap）について得られたＩ－ｔ曲線を示す図である。 図１４は、バイアス電圧（Ｖｂ）が０．２５Ｖ～０．７５Ｖであるときに、ＧＭＰの最大電流値を測定した結果を示す図である。 図１５は、電極間距離（ｄgap）が比較的長い（約２．５ｎｍ）ときに得られた、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の異質なＩ－ｔ曲線を示す図である。 図１６は、単一ヌクレオチドの統計的識別を説明する図である。 図１７は、ＤＮＡまたはＲＮＡを構成するヌクレオチドのコンダクタンスのヒストグラムを示す図である。 図１８は、ＤＮＡを用いてトンネル電流を測定した結果を示す図である。 図１９は、図１８の一部を拡大した図である。 図２０は、図１８の一部を拡大した図である。 図２１は、イオン電流に基づくＤＮＡのシーケンシング方法を説明する模式図である。
　本発明は、単一ヌクレオチドを識別する技術、および該技術を利用してポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する技術を提供する。これらの技術について、その一実施形態を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　〔１．ヌクレオチドを識別する方法〕
　本発明は、ヌクレオチドを識別する方法を提供する。ヌクレオチドを識別する方法は、ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させる工程、ヌクレオチドが通過した際に電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する工程、各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する工程、および算出した最頻値を参照値と比較する工程を包含している。
　このような本発明によれば、ヌクレオチドに付加した標識に基づいて識別するのではなく、ヌクレオチドの電気特性（最大電流値の最頻値）に基づいて、ヌクレオチドを直接的に識別することができる。よって、安価で迅速なヌクレオチドの識別を行うことができる。
　従来のシーケンシングは、ＰＣＲおよびヌクレオチドへの標識の付加といった化学反応が必要であったため、ポリヌクレオチドの中でも化学反応に安定なＤＮＡを対象としていた。本発明は、このような化学反応が不要であるため、ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドだけでなく、化学反応に不安定なＲＮＡのリボヌクレオチドも識別の対象とすることができる。このため、このような本発明をシーケンシングに応用すれば、ＤＮＡだけでなくＲＮＡも対象とするシーケンシングを実現することができる。
　本実施形態の本発明を実施するには、ヌクレオチドが通過した際に電極間にトンネル電流を生じさせることが必要である。このようなトンネル電流が生じるには電極間距離が重要である。電極間距離がヌクレオチドの分子直径よりも長すぎると、電極間にトンネル電流が流れにくくなったり、２つ以上のヌクレオチドが入り込んだりする。反対に、電極間距離がヌクレオチドの分子直径よりも短すぎると、電極間にヌクレオチドが入り込まなくなる。
　このように、電極間距離がヌクレオチドの分子直径よりも長すぎたり、短すぎたりすると、ヌクレオチド１分子を介したトンネル電流に由来するパルスを検出することが困難になる。また、電極間に分子全体が入らなくても、電極間にヌクレオチドの一部が入れば、トンネル電流が流れる。よって、電極間距離は、ヌクレオチドの分子直径よりも少し短いか、等しいか、またはそれよりも少し長い程度であることが好ましい。例えば、電極間距離は、ヌクレオチドの分子直径の０．５倍～２倍の長さであり、１倍～１．５倍の長さであることが好ましく、１倍～１．２倍の長さであることがより好ましい。
　ヌクレオチドの分子直径は当業者に公知であるため、本明細書に接した当業者であれば、最適な電極間距離を適宜選択することができる。例えば、一リン酸の形態のヌクレオチドの分子直径は約１ｎｍであるため、このヌクレオチドを介してトンネル電流を流すには、電極間距離を、例えば０．５ｎｍ～２ｎｍ、好ましくは１ｎｍ～１．５ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ～１．２ｎｍに設定すればよい。
　また、電極が大きすぎれば、電極間距離が上述した長さであっても、電極間に２分子以上のヌクレオチドが捕捉されてしまう。例えば、ヌクレオチドが通過する方向の電極の長さや、電極間の方向とヌクレオチドが通過する方向とによって形成される平面に垂直な方向の電極の長さが、ヌクレオチドの分子直径よりも長すぎれば、電極間距離が上述した長さであっても、電極間に２分子以上のヌクレオチドが捕捉されてしまう。このように、電極間に、ヌクレオチドが２分子以上捕捉された場合、２分子を介してトンネル電流が流れてしまい、１分子を介したトンネル電流を測定することが困難になる。よって、電極の大きさは、ヌクレオチドの分子直径よりも少し短いか、等しいか、それよりも少し大きい程度であることが好ましい。
　上述した電極対は、公知のナノ加工機械的破断接合法（nanofabricated mechanically-controllable break junctions）を用いることによって作製することができる。このナノ加工機械的破断接合法は、ピコメーター以下の分解能にて、機械的安定性に優れた電極間距離を制御することができる優れた方法である。ナノ加工機械的破断接合法を用いた電極対の作製方法は、例えば、J. M. van Ruitenbeek, A. Alvarez, I. Pineyro, C. Grahmann, P. Joyez, M. H. Devoret, D. Esteve, C. Urbina, Rev. Sci. Instrum. 67, 108 (1996)またはM. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008)に記載されている。電極の材料としては、金などの任意の金属が挙げられる。
　例えば、以下に示す手順によって電極対を作製することができる。
　まず、ナノスケールの金の接合を、電子線描画装置（日本電子社製、カタログ番号：JSM6500F）を用いて、公知の電子ビームリソグラフィーおよびリフトオフ技術によって、ポリイミドでコーティングされた可撓性の金属基板上にパターン成形する。次いで、この接合の下にあるポリイミドを、反応性イオンエッチング装置（サムコ社製、カタログ番号：10NR）を用いて、公知のエッチング法（反応性イオンエッチング法など）に基づくエッチングによって取り除く。
　そして、基板を折り曲げることによって、３点にて折り曲げられた構造のナノスケールの金のブリッジを作製する。この場合、ピエゾアクチュエータ（CEDRAT社製、カタログ番号：APA150M）を用いて基板の折曲げを精密に操作することによって、電極対の電極間距離をピコメーター以下の分解能にて制御することができる。
　次いで、作製したこのブリッジを引っ張り。ブリッジの一部を破断させる。さらにブリッジを引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が目的のヌクレオチド分子の長さ（約１ｎｍ）になるように設定する。この場合、本発明者らの研究室において開発された自己破断技術を利用してブリッジの引っ張りを調節することによって電極対の電極間距離を正確に制御することができる（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008)、およびM. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)参照）。
　具体的には、データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NIPCIe-6321）を用いて、レジスタンスフィードバック法（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008)、およびM. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)参照）によって、プログラミングされた接合の引き延ばし速度の下で、１０ｋΩの直列の抵抗を用いて、０．１ＶのＤＣバイアス電圧（Ｖｂ）をこのブリッジに印加して、金のナノ接合を引っ張り、ブリッジを破断させる。そして、ブリッジをさらに引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が目的のヌクレオチド分子の長さになるように設定する。このようにして、電極対を形成する。
　上述した技術を用いれば、単一の原子同士のコンタクトを自己破断させた後に、電極間距離が０．６±０．０５ｎｍの範囲に狭く分布したナノ電極対を再現性よく作製することができる。
　また、本発明の識別の対象となるヌクレオチドは、特に限定されず、任意のリボヌクレオチドであってもよいし、任意のデオキシリボヌクレオチドであってもよい。リボヌクレオチドとしては、特に限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）などが挙げられる。デオキシリボヌクレオチドとしては、特に限定されないが、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などが挙げられる。
　以下、各工程についてさらに説明する。
　本発明における「ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させる工程」では、例えば、上述の電極対をヌクレオチドが溶解した溶液中に保持すればよい。このように電極対をこの溶液中に保持すれば、溶液中のヌクレオチドの自発的な運動を利用して、ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させることができる。
　ヌクレオチドを溶解する溶液としては、特に限定されないが、例えば、超純水が挙げられる。超純水は、例えば、ミリポア社のMilli-Q Integral 3（装置名）（Milli-Q Integral 3/5/10/15（カタログ番号））を用いることによって作製することができ、この装置によって作製された水を本明細書において「Mili-Q水」と称する。溶液中のヌクレオチドの濃度は、特に限定されないが、例えば５μＭである。
　上述のように電極対をヌクレオチドが溶解した溶液中に保持し、電極間に電圧を印加すれば、ヌクレオチドが通過するときに、電極間にヌクレオチドが捕捉される。電極間にヌクレオチドが捕捉されている間（電極間にヌクレオチドが滞在する間）、電極間にトンネル電流が生じる。電極間に捕捉されたヌクレオチドは、所定の時間が経過すると自発的に電極間から解離する。ヌクレオチドが電極間から解離することによって、電極間に生じていたトンネル電流が消失する。このように、ヌクレオチドが電極間に捕捉されて、電極間から解離することによって、トンネル電流のパルスが発生する。なお、ヌクレオチドが電極間に捕捉されている時間は極めて短いため、本明細書において、「ヌクレオチドが電極間を通過すること」と、「ヌクレオチドが電極間に捕捉されて、電極間から解離すること」とは同義である。
　電極間に電圧を印加する方法は、特に限定されず、例えば、公知の電源装置を電極に接続して、電極間に電圧（例えば、バイアス電圧）を印加すればよい。印加する電圧は、特に限定されないが、例えば、０．２５Ｖ～０．７５Ｖである。
　本発明における「ヌクレオチドが通過した際に電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する工程」では、例えば、このようにして、ヌクレオチドが溶解した溶液中に保持された電極間に電圧を印加して、これによって電極間に生じたトンネル電流の電流値を所定の時間測定すればよい。トンネル電流の電流値は、例えば、５０分間測定すればよい。
　本明細書において「ヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルス」は、トンネル電流を所定の時間測定したときに、トンネル電流が基底レベルを超えて上昇し、再び基底レベルに戻るまでのトンネル電流のシグナルが意図される（後述する図１２のＢ参照）。このトンネル電流の上昇は、ヌクレオチドが電極間に捕捉されたことを示しており、トンネル電流が基底レベルに戻ることは、捕捉されたヌクレオチドが電極間から解離したことを示している。本明細書において「基底レベル」は、ノイズの平均値が意図される。「ノイズ」は、ヌクレオチドが電極間に捕捉されていないときに観察されるトンネル電流のシグナルが意図される。例えば、ノイズは、ヌクレオチドが溶解していない溶液中に保持された電極間に電圧を印加したときに、生じるトンネル電流の電流値を測定することによって得ることができる。
　電極間に生じたトンネル電流の電流値の測定は、公知の電流計を用いて測定することができる。また、例えば電流増幅器を用いてトンネル電流のシグナルを一旦増幅してもよい。電流増幅器を用いることによって、微弱なトンネル電流の値を増幅することができるため、トンネル電流を高感度に測定することが可能となる。電流増幅器としては、例えば、市販の可変高速電流アンプ（Femto社製、カタログ番号：DHPCA-100）が挙げられる。
　なお、後述する実施例にて説明するように、本発明者らは、独自に作製した対数増幅器を用いて、ピコアンペアレベルの電流を増幅した後、増幅した電流のシグナルを１ｋＨｚを超える周波数にて読み取った。このようにして増幅した電流のシグナルは、２４ビットの分解能を有するＤＡＱカード（日本ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NI USB-9234）を用いてコンピュータに例えば２ｋＨｚのサンプリングレートにて記録することができる。
　このように、電極間に流れるトンネル電流の電流値を所定の時間測定して、トンネル電流の電流値が基底レベルを超えているか否かを経時的に判定することによって、トンネル電流のパルスを検出することができる。具体的には、上述の判定にしたがって、トンネル電流が基底レベルを超えた時間を特定し、そして再び基底レベルに戻った時間を特定すれば、これらの２つの時間の間のシグナルをヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスとして検出することができる。測定したトンネル電流の電流値とトンネル電流の測定時間との関係を示すグラフ（例えば、曲線グラフ）を用いれば、このような判定を目視にて容易に行うことができる。
　このようにして検出したヌクレオチドに起因するパルスには、種々の高さのピークが存在する。これらのピークは、電極間におけるヌクレオチドの運動に基づく電極とヌクレオチドとの距離の変更に起因して出現する。すなわち、ヌクレオチドと電極との距離が短くなれば、トンネル電流が生じやすくなるため、トンネル電流の電流値が増加する。一方、ヌクレオチドと電極との距離が長くなれば、トンネル電流が生じにくくなるため、トンネル電流の電流値が減少する。このように、ヌクレオチドが電極間において運動することによって、電極とヌクレオチドとの距離が変化し、トンネル電流の電流値が増減するため、トンネル電流のパルスに複数のピークが現れる。
　本発明における「各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する工程」では、このようにして検出した各パルス内の最も高いピークの電流値から基底レベルを引くことによって「各パルスにおける最大電流値」を求めればよい。そして、求めた各最大電流値に対して統計分析を行うことによって最頻値を算出すればよい。
　例えば、最大電流値に基づいて各パルスを分類し、分類した各群に属するパルスの数および最大電流値に基づいて最頻値を算出すればよい。「最大電流値に基づいて各パルスを分類すること」は、例えば、最大電流値が同一または実質的に同一であるパルスを同一の群に分類することであってもよいし、一定の幅を有する最大電流値の範囲に属するパルスを同一の群に分類することであってもよい。なお、「最大電流値が実質的に同一であるパルス」は、ある最大電流値と数％異なる最大電流値を有するパルスをいい、例えば、ある最大電流の９０％～１１０％の最大電流値を有するパルスが意図される。
　より具体的には、最頻値を以下のようにして算出することができる。まず、各パルスにおける最大電流値と、最大電流値に対応するパルスの数との関係を示すヒストグラムを生成する。生成したヒストグラムを所定の関数にフィッティングする。
　そして、フィッティングした関数のピーク値を求めることによって、最頻値を算出することができる。フィッティングに用いる関数は、ガウス関数またはポアソン関数であるが、ガウス関数であることが好ましい。ガウス関数を用いることによって、データ処理速度を速くすることができるという利点が得られる。
　本工程において最頻値を算出するための統計分析に用いる標本（パルス）の数は、特に限定されず、例えば５００個～１０００個である。この程度の数を統計分析に用いれば、統計的に有意な最頻値を算出することができる。このような最頻値は各ヌクレオチドにとって固有の値であるため、この最頻値をヌクレオチドの識別のための指標に使用できる。
　本発明者らは、後述する実施例および図１６のＢまたはＣに示すように、ＧＭＰ、ｄＴＭＰ、およびＣＭＰについての最頻値がそれぞれ９６ｐＡ、３０ｐＡ、および４２ｐＡであることを実証した（なお、これらの最頻値は、１ｎｍの電極間距離、０．７５Ｖのバイアス電圧、統計分析のための標本の数（５００個）という条件で算出された。）。また、図１７のＡまたはＢに示すように、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＡＭＰ、およびＵＭＰの最頻値が、それぞれ６０ｐＳ、８７ｐＳ、６７ｐＳ、３９ｐＳ、６４ｐＳ、１２３ｐＳ、９２ｐＳ、および５０ｐＳであることを実証した（なお、これらの最頻値は、０．８ｎｍの電極間距離、０．４Ｖのバイアス電圧、統計分析のための標本の数（１０００個）という条件で算出された。）。このように、最頻値は各ヌクレオチドにとって固有の値であるため、この最頻値をヌクレオチドの識別のための指標に使用できる。
　本発明における「算出した最頻値を参照値と比較する工程」、上述の工程において算出した最頻値を、既知のヌクレオチド（以下、「参照ヌクレオチド」と称する。）に関する参照値と比較するものであればよい。
　ここで、トンネル電流は、電極間距離、溶液中のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの濃度、作製した電極の形状、電圧、統計分析のための標本の数から大きく影響を受けるので、トンネル電流から算出される最頻値もこれらの影響を大きく受ける。例えば、後述する実施例および図６のＡ～Ｃに示すように、バイアス電圧以外の条件は同一である条件においてＧＭＰの最頻値を算出した場合、バイアス電圧が０．２５Ｖ、０．５０Ｖ、および０．７５Ｖのとき、最頻値はそれぞれ異なる。
　このため、トンネル電流の測定値は、識別されるヌクレオチドの最頻値から分布を有しており、上記測定値から算出される最頻値も、識別されるヌクレオチドの最頻値から分布を有している。識別されるヌクレオチドの最頻値からの分布は、この最頻値を算出するために用いた関数の半値全幅として表すことができる。このように、上述の「最頻値を算出する工程」において算出した最頻値は、識別されるヌクレオチドの最頻値を中心とした半値全幅の範囲に含まれる。
　したがって、最頻値と比較するための上記参照値は、参照ヌクレオチドの最頻値であってもよいし、参照ヌクレオチドの最頻値をｘとし、該参照ヌクレオチドの最頻値を算出するために用いた関数における半値半幅をｙとした場合、ｘ±ｙの範囲の値であってもよい。また、最頻値が上述したように種々の条件から影響を受けるので、参照ヌクレオチドの最頻値は、本発明に適用したヌクレオチドについての最頻値を決定した条件と同一の条件によって決定されたものであることが好ましい。
　最頻値と参照値との比較の結果、最頻値が上記参照値に含まれていれば、本発明に適用したヌクレオチドが、この参照ヌクレオチドであると判定することができる。反対に、最頻値が参照値に含まれていなければ、本発明に適用したヌクレオチドがこの参照ヌクレオチドでないと判定することができる。このような判定によって、本発明に適用したヌクレオチドを識別することができる。
　例えば、上記図１７によれば、参照ヌクレオチドがｄＧＭＰである場合、ｘが８７ｐＳであり、ｙが２２ｐＳである。参照ヌクレオチドがｄＡＭＰである場合、ｘが６７ｐＳであり、ｙが１７ｐＳである。参照ヌクレオチドがｄＣＭＰである場合、ｘが６０ｐＳであり、ｙが２２ｐＳである。参照ヌクレオチドがｄＴＭＰである場合、ｘが３９ｐＳであり、ｙが１１ｐＳである。参照ヌクレオチドがＧＭＰである場合、ｘが１２３ｐＳであり、ｙが５３ｐＳである。参照ヌクレオチドがＡＭＰである場合、ｘが９２ｐＳであり、ｙが３２ｐＳである。参照ヌクレオチドがＣＭＰである場合、ｘが６４ｐＳであり、ｙが２０である。参照ヌクレオチドがＵＭＰである場合、ｘが５０ｐＳであり、ｙが１３ｐＳである。
　上記最頻値が、８７±２２ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがｄＧＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、８７±２２ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがｄＧＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、６７±１７ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがｄＡＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、６７±１７ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがｄＡＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、６０±２２ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがｄＣＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、６０±２２ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがｄＣＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、３９±１１ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがｄＴＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、３９±１１ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがｄＴＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、１２３±５３ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがＧＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、１２３±５３ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがＧＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、９２±３２ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがＡＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、９２±３２ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがＡＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、６４±２０ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがＣＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、６４±２０ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがＣＭＰでないと判定することができる。
　上記最頻値が、５０±１３ｐＳの範囲に含まれていれば、ヌクレオチドがＵＭＰであると判定することができる。上記最頻値が、５０±１３ｐＳの範囲に含まれていなければ、ヌクレオチドがＵＭＰでないと判定することができる。
　また、「算出した最頻値を参照値と比較する工程」では、最頻値を１つの参照値と比較してもよいし、複数の異なる参照値と比較してもよい。
　最頻値を複数の異なる参照値と比較する場合、「最頻値を第１の参照値と比較し、最頻値が第１の参照値に含まれていなければ、最頻値を第２の参照値と比較する」というように、最頻値を参照値と１つ１つ比較してもよい。また、「最頻値を複数の異なる参照値と同時に比較する」というように、最頻値を複数の異なる参照値と並列的に比較してもよい。
　また、上述したように、トンネル電流は、種々の条件から大きく影響を受けるので、トンネル電流から算出される最頻値もこれらの影響を大きく受ける。そこで、このような影響を最小限に留めることによって、より正確なヌクレオチドの識別を実現することができる。上述の影響を最小限に留めるには、上記最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値で除すればよい。つまり、本発明の方法は、上記最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、最頻値を規格化する工程をさらに含んでいてもよい。そして、「算出した最頻値を参照値と比較する工程」では、規格化した最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で規格化した上記参照値（規格化した参照値を、参照値と称することもある。）と比較すればよい。
　規格化した最頻値と規格化した参照値との比較の結果、規格化した最頻値が規格化した参照値に含まれていれば、本発明に適用したヌクレオチドが、参照ヌクレオチドであると判定することができる。反対に、規格化した最頻値が規格化した参照値に含まれていなければ、本発明に適用したヌクレオチドが参照ヌクレオチドでないと判定することができる。このような判定によって、本発明に適用したヌクレオチドを識別することができる。
　基準ヌクレオチドは、特に限定されず、任意のヌクレオチドを用いることができるが、本発明に適用したヌクレオチドの種類と同一であることが好ましい。すなわち、本発明に適用したヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドある場合、基準ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＧＭＰ）であることが好ましい。また、本発明に適用したヌクレオチドがリボヌクレオチドある場合、基準ヌクレオチドがリボヌクレオチド（例えば、ＧＭＰ）であることが好ましい。
　例えば、上記図１７によれば、基準ヌクレオチドとしてｄＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてｄＧＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、１±０．２５である。基準ヌクレオチドとしてｄＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてｄＡＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．７７±０．２０である。基準ヌクレオチドとしてｄＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてｄＣＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．６９±０．２５である。基準ヌクレオチドとしてｄＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてｄＴＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．４５±０．１２である。基準ヌクレオチドとしてＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてＧＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、１±０．４４である。基準ヌクレオチドとしてＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてＡＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．７５±０．２７である。基準ヌクレオチドとしてＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてＣＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．５２±０．１６である。基準ヌクレオチドとしてＧＭＰを用い、参照ヌクレオチドとしてＵＭＰを用いた場合の規格化した参照値は、０．４１±０．１０である。
　〔２．ヌクレオチドを識別する装置〕
　本発明は、ヌクレオチドを識別する装置を提供する。この装置は、本発明に係るヌクレオチドを識別する方法を実行するものであるため、各部材の説明については、上述の方法における各工程の説明を援用することとし、重複する部分は省略する。
　本発明に係るヌクレオチドを識別する装置の一実施形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本発明に係るヌクレオチドを識別する装置（装置１００）の一例を模式的に示した機能ブロック図である。この装置１００は、ヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対１０、電極間に電圧を印加する手段（電圧印加部）２０、電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段（電流測定部）３０、測定したトンネル電流のパルスを検出する手段（検出部）４０、各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する手段（算出部）５０、および算出した最頻値を参照値と比較する手段（比較部）６０を備えていることを特徴としている。
　各部材の関係は以下のとおりである。
　電極対１０は、電圧印加部２０によって電圧を印加することができるように電圧印加部２０と電気的に接続されている。また、電極対１０は、電流測定部３０に電気的に接続されており、電圧印加部２０による電圧の印加によって電極間にトンネル電流が発生すると、このトンネル電流が電流測定部３０に入力される。
　電流測定部３０は検出部４０に電気的に接続されており、電流測定部３０がトンネル電流の電流値を測定すると、この電流値の情報を検出部４０に出力することができる。検出部４０は算出部５０に電気的に接続されており、検出部４０が各パルスを検出すると、このパルスの情報を算出部５０に出力することができる。算出部５０は、このパルスの情報に基づき最大電流値の最頻値を算出する。算出部５０は比較部６０に電気的に接続されており、算出部５０が最頻値を算出すると、この最頻値の情報を比較部６０に出力することができる。
　電極対１０は、金などの任意の金属を用いて構成された電極を用いることができる。電源印加部２０には、公知の電源装置を用いることができる。電流測定部３０には、公知の電流計を用いることができる。検出部４０、算出部５０、および比較部６０には、例えば、従来公知のコンピュータ等の演算装置を好適に用いることができる。
　算出部５０は、パルスを統計的に分析するための関数のデータを保存した第１の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。関数のデータは、関数を１つ含んでいても良いし、異なる関数を複数含んでいてもよい。
　比較部６０は、最頻値と比較するための参照値のデータ、および参照値に対応する既知ヌクレオチド（参照ヌクレオチド）のデータを保存した第２の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。参照値のデータは、参照値を１つ含んでいてもよいし、異なる参照値を複数含んでいてもよい。
　装置１００は、比較部６０による判定結果を出力する出力部（図示しない）をさらに備えていてもよい。出力部を備えることによって、装置１００の使用者は判定結果を容易に確認することができる。出力部としては、特に限定されず、公知の表示装置が挙げられる。
　装置１００は、使用者から種々の条件（関数、基準ヌクレオチドなど）が入力されるための入力部（図示しない）を備えていてもよい。
　装置１００の動作の一例を、図１を参照して説明する。
　まず、装置１００は、電極対１０をサンプル（例えば、分析対象のヌクレオチドが溶解した溶液）中に保持する（図示しない）。次いで、装置１００は、電極対１０に対して、電圧印加部２０を用いて電圧を印加する。この電圧の印加によって、電極対１０の間にトンネル電流が発生し、電流測定部３０に入力される。トンネル電流が電流測定部３０に入力されると、電流測定部３０はトンネル電流の電流値を測定し、この電流値の情報を検出部４０に出力する。この情報が検出部４０に入力されると、検出部４０はこの電流値に基づいてトンネル電流のパルスを検出する。例えば、検出部４０は、トンネル電流の電流値が基底レベルを超えた時間と、再び基底レベルに戻った時間とを特定して、これらの２つの時間の間のトンネル電流のシグナルをパルスとして検出する。
　そして、検出部４０は、検出した各パルスの情報を算出部５０に出力する。算出部５０は、これらの各パルスの情報に基づき各パルスにおける最大電流値を求め、最大電流値の最頻値を決定する。例えば、算出部５０は、検出された各パルス内の最も高いピークの電流値から基底レベルを引くことによって各パルスにおける最大電流値を求める。そして、求めた各最大電流値に対して統計分析を行うことによって最頻値を算出する。算出部は、例えば、最大電流値に基づいて各パルスを分類し、分類した各群に属するパルスの数および最大電流値に基づいて最頻値を算出する。
　より具体的には、算出部５０は、各パルスにおける最大電流値と、最大電流値に対応するパルスの数との関係を示すヒストグラムを生成する。次いで、生成したヒストグラムを第１の記憶部に保存された関数にフィッティングし、フィッティングした関数のピーク値を求めることによって、最頻値を算出する。この場合、算出部５０は、使用者からの入力にしたがって関数を選択してもよい。
　最後に、算出部５０は、算出した最頻値の情報を比較部６０に出力する。比較部６０は、この最頻値の情報に基づいてヌクレオチドを識別する。例えば、比較部６０は、この最頻値を、第２の記憶部に保存されている参照値と比較する。そして、最頻値が参照値に含まれることを比較部６０が確認した場合、比較部６０は分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると判定する。
　反対に、最頻値が参照値に含まれないことを比較部６０が確認した場合、比較部６０は分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドでないと判定する。
　なお、装置１００が出力部を備えている場合（比較部６０が出力部と接続されている場合）、比較部６０による判定結果の情報が出力部へ入力される。出力部が判定結果を出力することによって、装置１００の使用者は、判定結果を容易に確認することができる。
　また、第２の記憶部に参照値が複数保存されている場合、装置１００は上述した動作に加えて以下の動作を行うことができる。比較部６０は、既に比較した参照値とは異なる別の参照値が第２の記憶部に保存されているか否かを確認する。そして、別の参照値が第２の記憶部に保存されていることを比較部６０が確認した場合、比較部６０は上記最頻値を別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれるか否かを確認する。
　最頻値が別の参照値に含まれることを比較部６０が確認した場合、比較部６０は分析中のヌクレオチドがこの別の参照値に対応する参照ヌクレオチドであると判定する。
　一方、上記別の参照値が第２の記憶部に保存されていないことを比較部６０が確認した場合（すなわち、最頻値が第２の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれない場合）、比較部６０が分析中のヌクレオチドが第２の記憶部に保存された参照値に対応する参照ヌクレオチドのどれでもないと判定する。
　このような複数の異なる参照値を用いる場合、比較部６０は、「最頻値を第１の参照値と比較し、最頻値が第１の参照値に含まれなければ、最頻値を第２の参照値と比較する」というように、最頻値を参照値と１つ１つ比較してもよい。また、「最頻値を複数の異なる参照値と同時に比較する」というように、最頻値を複数の異なる参照値と並列的に比較してもよい。
　また、比較部６０は、算出部５０から入力された最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、最頻値を規格化するように構成されていてもよい。この場合、比較部６０は、規格化した最頻値を、規格化された参照値と比較する。規格化された参照値は、比較部６０が第２の記憶部に保存されていた参照値を基準ヌクレオチドの最頻値除することによって取得されたものであってもよいし、第２の記憶部に予め保存されていたものであってもよい。比較部５０は、使用者からの入力にしたがって基準ヌクレオチドを選択してもよい。
　装置１００によるヌクレオチドを識別する動作のフローの一例を図２に示すフローチャートを参照して説明する。このフローでは、１つの参照値を用いてヌクレオチドの識別が行われる。
　ステップ１（以下、「ステップ」を「Ｓ」と記載する。）では、装置１００が電極対１０をサンプル中に保持する。
　Ｓ２では、電圧印加部２０が電極対１０に対して電圧を印加する。
　Ｓ３では、電流測定部３０がＳ２の処理によって発生したトンネル電流の電流値を測定する。
　Ｓ４では、検出部４０がＳ３の処理によって測定された電流値に基づいてトンネル電流のパルスを検出する。
　Ｓ５では、算出部５０がＳ４の処理によって検出された各パルスの情報に基づき最大電流値の最頻値を算出する。
　Ｓ６では、比較部６０がＳ５の処理によって算出された最頻値を参照値と比較して、最頻値が参照値に含まれているか否かを確認する。
　Ｓ６において最頻値が参照値に含まれていることを比較部６０が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ７に進む。一方、Ｓ６において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６０が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ８に進む。
　Ｓ７では、分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると比較部６０が判定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ８では、分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドでないと比較部６０が判定する。そして、処理が終了する。
　また、比較部６０が最頻値を規格化する場合、Ｓ５とＳ６との間に、比較部６０がＳ５の処理によって算出された最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値によって規格化するステップ（Ｓ５’）が存在する。この場合、Ｓ６では、比較部６０が、Ｓ５’の処理によって規格化された最頻値を規格化された参照値と比較して、規格化された最頻値が規格化された参照値に含まれているか否かを確認する。そして、Ｓ７およびＳ８の処理が行われる。
　なお、装置１００が出力部をさらに備えている場合、上述したフローは、上記Ｓ７の後にＳ７の処理結果を出力部が表示するというステップ、および上記Ｓ８の後にＳ８の処理結果を出力部が表示するというステップをさらに含んでいてもよい。
　装置１００によるヌクレオチドを識別する動作の別のフローの一例を図３に示すフローチャートを参照して説明する。このフローでは、複数の異なる参照値を用いてヌクレオチドの識別が行われる。
　Ｓ１０１では、装置１００が電極対１０をサンプル中に保持する。
　Ｓ１０２では、電圧印加部２０が電極対１０に対して電圧を印加する。
　Ｓ１０３では、電流測定部３０がＳ１０２の処理によって発生したトンネル電流の電流値を測定する。
　Ｓ１０４では、検出部４０がＳ１０３の処理によって測定された電流値に基づいてトンネル電流のパルスを検出する。
　Ｓ１０５では、算出部５０がＳ１０４の処理によって検出された各パルスの情報に基づき最大電流値の最頻値を算出する。
　Ｓ１０６では、比較部６０がＳ１０５の処理によって算出された最頻値を参照値と比較して、最頻値が参照値に含まれているか否かを確認する。
　Ｓ１０６において最頻値が参照値に含まれていることを比較部６０が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ１０７に進む。一方、Ｓ１０６において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６０が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ１０８に進む。
　Ｓ１０７では、分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると比較部６０が判定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ１０８では、分析中のヌクレオチドがこの参照値に対応するヌクレオチドでないと比較部６０が判定し、Ｓ１０９に進む。
　Ｓ１０９では、比較部６０が上記参照値とは異なる別の参照値が第１の記憶部に保存されているか否かを確認する。
　Ｓ１０９において、上記別の参照値が第１の記憶部に保存されていることを比較部６０が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ１０６に戻る。この場合、上記Ｓ１０６における処理と同様に、比較部６０は上記最頻値を上記別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれているか否かを確認する。一方、Ｓ１０９において、上記別の参照値が第１の記憶部に保存されていないことを比較部６０が確認した場合（すなわち、最頻値が第１の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれていない場合）、Ｓ１１０に進む。
　Ｓ１１０では、比較部６０が分析中のヌクレオチドが第１の記憶部に保存された参照値に対応する参照ヌクレオチドのどれでもないと判定する。そして、処理が終了する。
　なお、装置１００が出力部をさらに備えている場合、上述したフローは、上記Ｓ１０７の後にＳ１０７の処理結果を出力部が表示するというステップ、および上記Ｓ１１０の後にＳ１１０の処理結果を出力部が表示するというステップをさらに含んでいる。
　また、上記Ｓ１０６では、最頻値を１つの参照値と比較してもよいし（つまり、最頻値を参照値と１つ１つ比較してもよいし）、最頻値を複数の異なる参照値と同時に（並列的に）比較してもよい。
　比較部６０が最頻値を規格化する場合、Ｓ１５とＳ１６との間に、比較部６０がＳ１５の処理によって算出された最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値によって規格化するステップ（Ｓ１５’）が存在する。この場合、Ｓ１６では、比較部６０が、Ｓ１５’の処理によって規格化された最頻値を規格化された参照値（または規格化された別の参照値）と比較して、規格化された最頻値が規格化された参照値（または規格化された別の参照値）に含まれているか否かを確認する。また、Ｓ１９では、比較部６０が規格化された参照値とは異なる別の規格化された参照値が第１の記憶部に保存されているか否かを確認する。
　Ｓ１９において、上記別の規格化された参照値が第１の記憶部に保存されていることを比較部６０が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ１６に戻る。この場合、上記Ｓ１６における処理と同様に、比較部６０は上記規格化された最頻値を上記別の規格化された参照値と比較して、規格化された最頻値が別の規格化された参照値に含まれているか否かを確認する。一方、Ｓ１９において、上記別の規格化された参照値が第１の記憶部に保存されていないことを比較部６０が確認した場合（すなわち、規格化された最頻値が第１の記憶部に保存された規格化された参照値のどれにも含まれていない場合）、上記Ｓ２０に進む。
　〔３．ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法〕
　本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、ポリヌクレオチドを、電極間を通過させる工程、ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、測定した電流値の最頻値を算出する工程、電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値の最頻値を規格化する工程、および規格化した最頻値を参照値と比較する工程を包含している。
　上述したように、トンネル電流が種々の条件から大きく影響を受けるので、上記「最頻値を算出する工程」にて算出したトンネル電流の電流値の最頻値を用いてポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別することは困難である。しかし、上記「最頻値を規格化する工程」にて、トンネル電流の電流値の最頻値を基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、この影響を最小限に留めることができる。このため、上記「規格化した最頻値を参照値と比較する工程」にて、ポリヌクレオチドのヌクレオチドを識別することが可能になる。
　ここで、単一種のヌクレオチドしか識別されなかった場合、本発明に適用したポリヌクレオチドは同一のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。すなわち、本発明に適用したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、識別された単一種のヌクレオチドからなるものであると決定することができる。
　一方、複数種のヌクレオチドが識別された場合、本発明に適用したポリヌクレオチドは異なるヌクレオチドからなるものであると判定することができる。この場合、本発明に適用したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するには、ヌクレオチドの並びを特定することが必要となる。この特定を行うために、本発明は、トンネル電流のパルスを検出する工程、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する工程、および規格化した電流値を参照値と比較する工程をさらに包含している。
　このように、本発明では、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別し、必要に応じて、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの並びを特定することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定が実現される。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」、「遺伝子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。なお、本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、２～数十個、より具体的には、２～５０個のヌクレオチドからなるものが意図される。「ポリヌクレオチド」は、数十個以上、具体的には、５０個よりも多くのヌクレオチドからなるものが意図される。
　ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなるもの（ＤＮＡ）であってもよいし、リボヌクレオチドからなるもの（ＲＮＡ）であってもよい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列として示される。
　なお、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、上述したヌクレオチドを識別する方法と類似しているので、ヌクレオチドを識別する方法における説明を適宜援用することができる。
　本実施形態の本発明を実施するには、ポリヌクレオチドが通過した際に、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド１分子を介したトンネル電流を生じさせることが必要である。このようなトンネル電流が生じさせるには電極間距離および電極の大きさ（例えば、ポリヌクレオチドが通過する方向の電極の長さや、電極間の方向とポリヌクレオチドが通過する方向とによって形成される平面に垂直な方向の電極の長さ）が重要である。具体的には、電極間距離および電極の大きさは、ヌクレオチドの分子直径よりも少し短いか、等しいか、それよりも少し大きい程度であることが好ましい。このような電極対としては、上述したヌクレオチドを識別する方法にて説明した電極対を用いることができる。
　また、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド１分子を介したトンネル電流を電極間に生じさせるには、電極間を通過させるポリヌクレオチドは、線状の一本鎖の形態であることが好ましい。ポリヌクレオチドが二本鎖の形態である場合、ポリヌクレオチドに熱を加えるなどの従来公知の方法を用いて、線状の一本鎖の形態に変換すればよい。なお、一本鎖のポリヌクレオチドは、分子内相互作用によってヌクレオチド同士が結合して、一本鎖が折れ曲がり、一本鎖の一部に二本鎖が形成されていることがある。このように、線状でない一本鎖のポリヌクレオチドは、一本鎖のポリヌクレオチドに熱を加える等の従来公知の方法によって線状にすることができる。
　以下、各工程についてさらに説明する。
　本発明における「ポリヌクレオチドを、電極間を通過させる工程」は、特に限定されず、上記ヌクレオチドを識別する方法における「ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させる工程」と同様の操作を行えばよい。具体的には、上述の電極対をポリヌクレオチドが溶解した溶液中に保持すればよい。このように電極対をこの溶液中に保持すれば、溶液中のポリヌクレオチドの自発的な運動を利用して、ポリヌクレオチドを、電極間を通過させることができる。ポリヌクレオチドを溶解する溶液としては、特に限定されないが、上述した超純水が挙げられる。溶液中のポリヌクレオチドの濃度は、特に限定されないが、例えば５μＭである。
　電極対をポリヌクレオチドが溶解した溶液中に保持し、電極間に電圧を印加すれば、ポリヌクレオチドが通過することによって、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じる。トンネル電流が生じるメカニズムを以下にて説明する。
　ポリヌクレオチドが電極間に進入すると、まず、ポリヌクレオチドを構成する１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉される。１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉されたときに、１番目のヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じる。
　ポリヌクレオチドの電極間の移動に伴い、１番目のヌクレオチドが電極間を移動し、２番目のヌクレオチドが電極間に進入する。電極間に捕捉されるヌクレオチドが１番目のヌクレオチドから２番目のヌクレオチドへ変わるときには、電極間に、１番目のヌクレオチドの一部と、２番目のヌクレオチドの一部との両方が捕捉される。この場合、１番目のヌクレオチドの一部と２番目のヌクレオチドの一部との両方またはどちらか一方に起因するトンネル電流が電極間に生じる。
　その後、１番目のヌクレオチドが電極間を完全に通過し、２番目のヌクレオチドの全体が電極間に捕捉される。２番目のヌクレオチドの全体が電極間に捕捉されたときに、２番目のヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じる。
　最後に、ポリヌクレオチドが電極間を通過すると（ポリヌクレオチドを構成する最後のヌクレオチドが電極間から解離すると）、電極間に生じていたトンネル電流が消失する。
　このように、ポリヌクレオチドが電極間に進入し移動すると、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが順番に電極間に捕捉され、これらのヌクレオチドに起因するトンネル電流が電極間に生じ、ポリヌクレオチドが電極間から解離すると、トンネル電流が消失する。つまり、ポリヌクレオチドが電極間を通過すると、このポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスが生じる。
　本明細書において、「ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルス」は、上記「ヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルス」と同様に、トンネル電流を所定の時間測定したときに、トンネル電流が基底レベルを超えて上昇し、再び基底レベルに戻るまでのトンネル電流のシグナルが意図される。このトンネル電流の上昇は、ポリヌクレオチドを構成する１番目のヌクレオチドが電極間に捕捉されたことを示しており、トンネル電流が基底レベルに戻ることは、捕捉された最後のヌクレオチドが電極間から解離したことを示している。
　「基底レベル」は、ノイズの平均値が意図される。「ノイズ」は、ヌクレオチドが電極間に捕捉されていないときに観察されるトンネル電流のシグナルが意図される。例えば、ノイズは、ポリヌクレオチドが溶解していない溶液中に保持された電極間に電圧を印加したときに、生じるトンネル電流の電流値を測定することによって得ることができる。
　本発明における「ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程」では、このようにして、ポリヌクレオチドが溶解した溶液中に保持された電極間に電圧を印加して、これによって電極間に生じたトンネル電流の電流値を所定の時間測定すればよい。電極間に電圧を印加する方法および電極間に生じたトンネル電流の電流値を測定する方法は、上記ヌクレオチドを識別する方法における説明を援用することができる。
　本発明における「測定した電流値の最頻値を算出する工程」では、このようにして測定した電流値に対して統計分析を行うことによって最頻値を算出すればよい。
　例えば、電流値をその値に基づいて分類し、分類した各群に属する数および電流値に基づいて最頻値を算出すればよい。「電流値をその値に基づいて分類すること」は、例えば、同一または実質的に同一である電流値を同一の群に分類することであってもよいし、一定の範囲に属する電流値を同一の群に分類することであってもよい。なお、「実質的に同一である電流値」は、ある電流値と数％異なる電流値をいい、例えば、ある電流値の９０％～１１０％の電流値が意図される。
　より具体的には、最頻値を以下のようにして算出することができる。まず、分類した各群に属する数および電流値との関係を示すヒストグラムを生成する。生成したヒストグラムを所定の関数にフィッティングする。
　そして、フィッティングした関数のピーク値を求めることによって、最頻値を算出することができる。フィッティングに用いる関数は、ガウス関数またはポアソン関数であるが、ガウス関数であることが好ましい。
　ヒストグラムは、ノイズの電流値を含めて生成してもよいし、ノイズの電流値を含めずに生成してもよい。ノイズの電流値も含めてヒストグラムを生成した場合、図１８のＡ～Ｃの左図に示すように、一般的には複数のピークが観察される。最も値の小さいピークがノイズの電流値の最頻値に対応し、このピークよりも値が大きいピークが、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに起因する電流値の最頻値に対応する。このように複数のピークが観察された場合、複数のピーク値をそれぞれ求めることによって、各ピークに対応する最頻値を算出する。
　複数のピーク値を求めるには、生成したヒストグラムをピークを中心に設定してガウス関数でフィッティングする。
　ノイズの電流値の最頻値を算出した場合、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに起因する電流値の最頻値からこのノイズの電流値の最頻値を減ずることが好ましい。
　なお、ノイズの電流値も含めて生成したヒストグラムに現れたピークが２つであった場合、一方のピークがノイズの電流値の最頻値であり、他方のピークが、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに起因する電流値の最頻値に対応する。つまり、この場合、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが単一種のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。また、ノイズの電流値も含めて生成したヒストグラムに現れたピークが３つ以上であった場合、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが複数種のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。
　また、ノイズの電流値を含まないヒストグラムは以下のようにして生成することができる。まず、ノイズであることを示す閾値を設定する。例えば、閾値は、ポリヌクレオチドを溶解していない溶液を用いて測定したトンネル電流の最大電流値である。次いで、測定したトンネル電流の電流値からこの閾値を減ずればよい。この結果、得られた値を用いてヒストグラムを生成する。ノイズの電流値を含まないヒストグラムに現れたピークが１つであった場合、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが単一種のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。また、ノイズの電流値を含まないヒストグラムに現れたピークが２つ以上であった場合、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが複数種のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。
　このように、ヒストグラムのピークの数（算出した最頻値の数）に基づいて、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが単一種からなるものであるのか、複数種からなるものであるのかを判定することができる。
　本発明における「電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値の最頻値を規格化する工程」では、電流値の最頻値が基準ヌクレオチドによって規格化されればよく、規格化を行う時期は特に限定されない。すなわち、上記「算出する工程」にて、最頻値を算出してから、上記「規格化する工程」にてパルスの電流値を規格化してもよいし、上記「ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程」にてトンネル電流の電流値を測定してから、この「規格化する工程」にてこの電流値を規格化し、そして、「算出する工程」では、この規格化された電流値から最頻値を算出してもよい。
　基準ヌクレオチドには、特に限定されず、任意のヌクレオチドを用いることができる。基準ヌクレオチドとしては、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、デオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＧＭＰ）であることが好ましく、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、リボヌクレオチド（例えば、ＧＭＰ）であることが好ましい。
　基準ヌクレオチドの最頻値は、上述したヌクレオチドを識別する方法にて説明した最頻値を算出する方法と同様の方法によって算出されたものを用いることができる。すなわち、基準ヌクレオチドの最頻値は、基準ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させること、基準ヌクレオチドが通過した際に電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出することによって取得されたものである。
　また、用いる基準ヌクレオチドの最頻値は、分析の対象であるポリヌクレオチドに対して用いられる条件（例えば、電極の条件（電極間距離、電極の形状など）、溶液中の濃度の条件）と同じ条件で取得されたものであることが好ましい。なお、「溶液中の濃度の条件がポリヌクレオチドと基準ヌクレオチドとにおいて同一である」とは、溶液中のポリヌクレオチドの濃度と、溶液中の基準ヌクレオチドの濃度とが同一であることをいう。
　本発明における「規格化した最頻値を参照値と比較する工程」では、上述のようにして規格化した最頻値を参照値と比較すればよい。比較のために用いる参照値は、例えば、上記ヌクレオチドを識別する方法にて説明した参照値（基準ヌクレオチドで規格化した参照値）である。
　規格化した最頻値と参照値との比較の結果、規格化した最頻値がこの参照値に含まれていれば、この最頻値のヌクレオチドが、参照ヌクレオチドであると判定することができる。反対に、規格化した最頻値が参照値に含まれていなければ、この最頻値のヌクレオチドがこの参照ヌクレオチドでないと判定することができる。このような判定によって、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別することができる。
　単一種のヌクレオチドしか識別されなかった場合、本発明に適用したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、識別された単一種のヌクレオチドからなるものであると決定することができる。
　一方、複数種のヌクレオチドが識別された場合、本発明に適用したポリヌクレオチドは複数種のヌクレオチドからなるものであると判定することができる。この場合、複数種のヌクレオチドの並びを決定してヌクレオチド配列を決定するために、トンネル電流のパルスを検出する工程、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する工程、および規格化した電流値を参照値と比較する工程をさらに実行する。
　本発明における「トンネル電流のパルスを検出する工程」は、上記「ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程」にて測定されたトンネル電流の電流値が基底レベルを超えているか否かを経時的に判定することを含んでいる。この判定にしたがって、トンネル電流が基底レベルを超えた時間を特定し、そして再び基底レベルに戻った時間を特定すれば、これらの２つの時間の間のシグナルをトンネル電流のパルスとして検出することができる。測定したポリヌクレオチドに起因するトンネル電流の電流値とトンネル電流の測定時間との関係を示すグラフ（例えば、曲線グラフ）を用いれば、このような判定を目視にて容易に行うことができる。
　しかし、トンネル電流を実際に測定すると、図１８および図１９に示すように、ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスに該当しない偽のパルスも測定されてしまう。このため、上述の方法によって検出したパルスの中から、ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスを特定することが必要になる。パルスの特定は、ポリヌクレオチドが電極間に滞在する時間に基づいて実施することができる。
　ポリヌクレオチドが電極間に滞在する時間は、１分子のヌクレオチドが電極間に滞在する時間から算出することができる。１分子のヌクレオチドが電極間に滞在する時間は、上記ヌクレオチドを識別する方法にて説明したヌクレオチドのパルスが持続する時間である。このヌクレオチドのパルスが持続する時間（後述する図１２のＢの「ｔｄ」）は、必ずしも一定ではない。しかし、ヌクレオチドのパルスが持続する時間に対して統計分析を行うことによって、ヌクレオチドのパルスが持続する時間が特定の値を示すことを本発明者は見出した。具体的には、ヌクレオチドのパルスが持続する時間のヒストグラムを作成すれば、このヒストグラムに対して関数をフィッティングすることによって、ヌクレオチドのパルスが持続する時間の最頻値を算出することができる。
　ここで、ポリヌクレオチドは、自発的な運動によって電極間を通過するため、電極間を通過するポリヌクレオチドの速度は一定であると仮定することができる。この最頻値を算出するための条件（電極間距離等）と、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定に使用する条件とを同一にし、この仮定を適用すれば、ｎ個のヌクレオチドから構成されたポリヌクレオチドが電極間に滞在する時間（ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスの持続時間）は、上記ヌクレオチドのパルスが持続する時間の最頻値のｎ倍以上になる。
　なお、ポリヌクレオチドが電極間に滞在する時間を算出するために用いるヌクレオチドは、分析対象のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドと同じ種類であることが好ましい。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、用いるヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、用いるヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
　また、換言すれば、ポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスの持続時間は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数に対応することになり、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数がｎ個である場合、パルスの幅をｎ等分することができる。そして、この分割したパルスの各区域が、ポリヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドに対応する。
　複数種のヌクレオチドから構成されたポリヌクレオチドの場合、隣り合うヌクレオチドが異なるペアが少なくとも１つ存在する。ヌクレオチドが異なれば、測定されるトンネル電流の電流値も異なるので、隣り合うヌクレオチドが異なる場合、対応する隣り合う区域にて示される電流値も異なる。例えば、図１９のＣにて示すように、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がＧＴＧからなる場合、１番目のＧの区域にて示される電流値は、２番目のＴの区域では低くなり、３番目のＧの区域にて元に戻っている。図２０のＣにて示すように、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がＴＧＴからなる場合、１番目のＴの区域にて示される電流値は、２番目のＧの区域では高くなり、３番目のＴの区域にて元に戻っている。
　このように、複数種のヌクレオチドから構成されたポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスは、階段状のシグナルを示す。
　よって、（１）ヌクレオチドのパルスが持続する時間の最頻値のｎ倍以上の間持続すること、および（２）階段状のシグナルを示すこと、の２つの条件を用いて、上記検出されたパルスが、分析対象のポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスであると特定することができる。
　本発明における「パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する工程」では、パルスにおける電流値が基準ヌクレオチドの最頻値によって規格化されればよく、規格化を行う時期は特に限定されない。すなわち、上記「パルスを検出する工程」にて、パルスを検出してから、上記「規格化する工程」にてパルスの電流値を規格化してもよいし、上記「ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程」にてトンネル電流の電流値を測定してから、上記「規格化する工程」にてこの電流値を規格化し、そして、「パルスを検出する工程」では、この規格化された電流値からパルスを検出してもよい。
　基準ヌクレオチドは、特に限定されず、上述した「電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値の最頻値を規格化する工程」にて用いる基準ヌクレオチドである。
　本発明における「規格化した電流値を参照値と比較する工程」では、上述のようにして規格化した電流値を参照値と比較すればよい。比較のために用いる参照値は、例えば、上記「規格化した最頻値を参照値と比較する工程」にて用いた参照値である。
　上述したように、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数で分割したポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスの各区域が、ポリヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドに対応している。ここで、複数種のヌクレオチドから構成されたポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスは階段状のシグナルを示すので、図１９のＣおよび図２０のＤに示すように、１つの区間におけるパルスの規格化した電流値が複数の参照値に含まれることがある。しかし、規格化した電流値が複数の参照値に含まれる場合、この区間に対応するヌクレオチドの参照値に最も長い時間含まれるといえる。
　よって、「規格化した電流値を参照値と比較する工程」では、１つの区間におけるパルスの規格化した電流値が、最も長い時間含まれている参照値を特定することが好ましい。これによって、この区間のヌクレオチドを識別することができる。
　具体的には、１つの区間におけるパルスの規格化した電流値が各参照値に含まれている時間を測定する。測定したそれぞれの時間を比較することによって、最も長い時間を決定する。そして、決定した時間の参照値を特定すれば、この区間のヌクレオチドがこの参照値のヌクレオチドであると識別することができる。
　このようにして、各区間のヌクレオチドを識別することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの並びを決定することができる。
　「規格化した電流値を参照値と比較する工程」では、「パルスの規格化した電流値が参照値に含まれている時間」に閾値を設定してもよい。この閾値を設定すれば、閾値以上の時間でなければ、電流値が参照値に含まれていないとみなすことができる。閾値は当業者が適宜設定することができる。このような閾値を用いれば、１つの区間におけるパルスの規格化した電流値が含まれた参照値を特定できないことがある。この場合、この区間のヌクレオチドが不明であると判定することができる。
　〔４．ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置〕
　（実施形態１）
　本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置を提供する。この装置は、本発明に係るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を実行するものであるため、各部材の説明については、上述の方法における各工程の説明を援用することができる。
　本実施形態のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置について、図４を参照しながら説明する。図４は、実施形態の装置（装置２００）の一例を模式的に示した機能ブロック図である。この装置２００は、ポリヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対１１、電極間に電圧を印加する手段（電圧印加部）２１、電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段（電流測定部）３１、測定した電流値の最頻値を算出する手段（算出部）５１、電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する手段（規格化部）７１、および規格化した最頻値を参照値と比較する手段（比較部）６１を備えていることを特徴としている。
　各部材の関係は以下のとおりである。
　電極対１１は、電圧印加部２１によって電圧を印加することができるように電圧印加部２１と電気的に接続されている。また、電極対１１は、電流測定部３１に電気的に接続されており、電圧印加部２１による電圧の印加によって電極間にトンネル電流が発生すると、このトンネル電流が電流測定部３１に入力される。
　電流測定部３１は算出部５１に電気的に接続されており、電流測定部３１がトンネル電流の電流値を測定すると、この電流値の情報を算出部５１に出力することができる。算出部５１は規格化部７１に電気的に接続されており、算出部５１が最頻値を算出すると、この最頻値の情報を規格化部７１に出力することができる。規格化部７１は比較部６１に電気的に接続されており、規格化部７１が最頻値を規格化すると、この規格化した最頻値を比較部６１に出力することができる。
　電極対１１には上記電極対１０を用いることができる。電源印加部２１には上記電源印加部２０を用いることができる。電流測定部３１には上記電流測定部３０を用いることができる。算出部５１、規格化部７１、比較部６１には、例えば、従来公知のコンピュータ等の演算装置を好適に用いることができる。
　算出部５１は、電流値を統計的に分析するための関数のデータを保存した第３の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。関数のデータは、関数を１つ含んでいてもよいし、異なる関数を複数含んでいてもよい。
　規格化部７１は、最頻値を規格化するための基準ヌクレオチドのデータを保存した第４の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。基準ヌクレオチドのデータは、基準ヌクレオチドを１つ含んでいてもよいし、異なる基準ヌクレオチドを複数含んでいてもよい。
　比較部６１は、最頻値と比較するための参照値のデータ、および参照値に対応する既知ヌクレオチド（参照ヌクレオチド）のデータを保存した第５の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。参照値のデータは、参照値を１つ含んでいてもよいし、異なる参照値を複数含んでいてもよい。
　装置２００は、比較部６１による判定結果を出力する出力部（図示しない）をさらに備えていてもよい。出力部を備えることによって、装置２００の使用者は判定結果を容易に確認することができる。出力部としては、特に限定されず、公知の表示装置が挙げられる。
　装置２００は、使用者から種々の条件（関数、基準ヌクレオチド、ヌクレオチドのパルスが持続する時間、分析対象のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数など）が入力されるための入力部（図示しない）を備えていてもよい。
　装置２００の動作の一例を、図４を参照して説明する。
　まず、装置２００は、電極対１１をサンプル（例えば、分析対象のポリヌクレオチドが溶解した溶液）中に保持する（図示しない）。次いで、装置２００は、電極対１１に対して、電圧印加部２１を用いて電圧を印加する。この電圧の印加によって、電極対１１の間にトンネル電流が発生し、電流測定部３１に入力される。トンネル電流が電流測定部３１に入力されると、電流測定部３１はトンネル電流の電流値を測定し、この電流値の情報を算出部５１に出力する。電流値の情報が算出部５１に入力されると、算出部５１はこの電流値の最頻値を算出する。例えば、算出部５１は、電流値に対して統計分析を行うことによって最頻値を算出する。算出部５１は、例えば、電流値をその値に基づいて分類し、分類した各群に属する数および電流値に基づいて最頻値を算出する。
　より具体的には、算出部５１は、分類した各群に属する数および電流値との関係を示すヒストグラムを生成する。次いで、生成したヒストグラムを第３の記憶部に保存された関数にフィッティングし、フィッティングした関数のピーク値を求めることによって、最頻値を算出する。この場合、算出部５１は、使用者からの入力にしたがって関数を選択してもよい。
　算出部５１は、算出した最頻値の情報を規格化部７１に出力する。規格化部７１は、入力されたこの最頻値を、第４の記憶部に保存された基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値の最頻値を規格化する。この場合、規格化部７１は、使用者からの入力にしたがって基準ヌクレオチドの最頻値を選択してもよい。次いで、規格化部７１は、規格化した最頻値の情報を比較部６１に出力する。
　比較部６１は、この規格化した最頻値の情報に基づいてポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドを識別する。例えば、比較部６１は、この規格化した最頻値を、第５の記憶部に保存されている参照値と比較する。そして、規格化した最頻値が参照値に含まれることを比較部６１が確認した場合、比較部６１は規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると判定する。反対に、規格化した最頻値が参照値に含まれないことを比較部６１が確認した場合、比較部６１は規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドでないと判定する。
　このような判定の結果、比較部６１が単一種のヌクレオチドしか識別しなかった場合、比較部６１は、本発明に適用したポリヌクレオチドは同一のヌクレオチドからなるものであると判定する。そして、比較部６１は、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、識別された単一種のヌクレオチドからなるものであると決定する。
　一方、比較部６１が複数種のヌクレオチドを識別した場合、比較部６１は、本発明に適用したポリヌクレオチドは異なるヌクレオチドからなるものであると判定する。この場合、比較部６１は、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。
　なお、装置２００が出力部を備えている場合（比較部６１が出力部と接続されている場合）、比較部６１による決定の情報が出力部へ入力される。出力部が決定の情報を出力することによって、装置２００の使用者は、比較部６１による決定を容易に確認することができる。
　また、第５の記憶部に参照値が複数保存されている場合、装置２００は上述した動作に加えて以下の動作を行うことができる。比較部６１は、既に比較した参照値とは異なる別の参照値が第５の記憶部に保存されているか否かを確認する。そして、別の参照値が第５の記憶部に保存されていることを比較部６１が確認した場合、比較部６１は上記最頻値を別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれるか否かを確認する。
　最頻値が別の参照値に含まれることを比較部６０が確認した場合、比較部６１は分析中のヌクレオチドがこの別の参照値に対応する参照ヌクレオチドであると判定する。
　一方、上記別の参照値が第２の記憶部に保存されていないことを比較部６１が確認した場合（すなわち、最頻値が第２の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれない場合）、比較部６１が分析中のヌクレオチドが第２の記憶部に保存された参照値に対応する参照ヌクレオチドのどれでもないと判定する。
　このような複数の異なる参照値を用いる場合、比較部６１は、「最頻値を第１の参照値と比較し、最頻値が第１の参照値に含まれなければ、最頻値を第２の参照値と比較する」というように、最頻値を参照値と１つ１つ比較してもよい。また、「最頻値を複数の異なる参照値と同時に比較する」というように、最頻値を複数の異なる参照値と並列的に比較してもよい。
　装置２００によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する動作のフローの一例を図５に示すフローチャートを参照して説明する。このフローでは、１つの参照値を用いてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定が行われる。
　Ｓ２０１では、装置２００が電極対１１をサンプル中に保持する。
　Ｓ２０２では、電圧印加部２１が電極対１１に対して電圧を印加する。
　Ｓ２０３では、電流測定部３１がＳ２０２の処理によって発生したトンネル電流の電流値を測定する。
　Ｓ２０４では、算出部５１がＳ２０３の処理によって測定した電流値の最頻値を算出する。
　Ｓ２０５では、規格部７１がＳ２０４の処理によって算出した最頻値を規格化する。
　Ｓ２０６では、比較部６１がＳ２０５の処理によって規格化した最頻値を参照値と比較して、規格化した最頻値が参照値に含まれているか否かを確認する。
　Ｓ２０６において最頻値が参照値に含まれていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ２０７に進む。一方、Ｓ２０６において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６１が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ２１１に進む。
　Ｓ２０７では、規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると比較部６０が判定する。
　Ｓ２０８では、比較部６１が、比較すべきさらなる規格化した最頻値があるか否かを確認する。Ｓ２０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値がないことを確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ２０９に進む。一方、Ｓ２０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値があることを確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ２１０に進む。
　Ｓ２０９では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは単一種のヌクレオチドからなるものであると判定して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、Ｓ２０６の処理によって識別された参照ヌクレオチドからなるものであると決定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ２１０では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは複数種のヌクレオチドからなるものであると判定して、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ２１１では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは未知のヌクレオチドからなるものであると判定して、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。そして、処理が終了する。
　なお、装置２００が出力部をさらに備えている場合、上述したフローは、上記Ｓ２０９の後にＳ２０９の処理結果を出力部が表示するというステップ、および上記Ｓ２１０の後にＳ２１０の処理結果を出力部が表示するというステップ、および上記Ｓ２１１の後にＳ２１１の処理結果を出力部が表示するというステップをさらに含んでいてもよい。
　装置２００によるヌクレオチドを識別する動作の別のフローの一例を図６に示すフローチャートを参照して説明する。このフローでは、複数の異なる参照値を用いてヌクレオチドの識別が行われる。
　Ｓ３０１では、装置２００が電極対１１をサンプル中に保持する。
　Ｓ３０２では、電圧印加部２１が電極対１１に対して電圧を印加する。
　Ｓ３０３では、電流測定部３１がＳ３０２の処理によって発生したトンネル電流の電流値を測定する。
　Ｓ３０４では、算出部５１がＳ３０３の処理によって測定した電流値の最頻値を算出する。
　Ｓ３０５では、規格部７１がＳ３０４の処理によって算出した最頻値を規格化する。
　Ｓ３０６では、比較部６１がＳ３０５の処理によって規格化した最頻値を参照値と比較して、規格化した最頻値が参照値に含まれているか否かを確認する。
　Ｓ３０６において最頻値が参照値に含まれていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ３０７に進む。一方、Ｓ３０６において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６１が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ３１１に進む。
　Ｓ３０７では、規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると比較部６１が判定する。
　Ｓ３０８では、比較部６１が、比較すべきさらなる規格化した最頻値があるか否かを確認する。Ｓ３０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値がないことを確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ３０９に進む。一方、Ｓ３０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値があることを確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ３１０に進む。
　Ｓ３０９では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは単一種のヌクレオチドからなるものであると判定して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、Ｓ３０７の処理によって識別された参照ヌクレオチドからなるものであると決定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ３１０では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは複数種のヌクレオチドからなるものであると判定して、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ３１１では、規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応するヌクレオチドでないと比較部６１が判定し、Ｓ３１２に進む。
　Ｓ３１２では、比較部６１が上記参照値とは異なる別の参照値が第５の記憶部に保存されているか否かを確認する。Ｓ３１２において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ３０６に戻る。この場合、上記Ｓ３０６における処理と同様に、比較部６１は上記最頻値を上記別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれているか否かを確認する。一方、Ｓ３１２において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていないことを比較部６１が確認した場合（すなわち、最頻値が第５の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれていない場合）、Ｓ３１３に進む。
　Ｓ３１３では、比較部６１が規格化した最頻値のヌクレオチドが第５の記憶部に保存された参照値に対応する参照ヌクレオチドのどれでもないと判定して、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。そして、処理が終了する。
　なお、装置２００が出力部をさらに備えている場合、上述したフローは、上記Ｓ３０９の後にＳ３０９の処理結果を出力部が表示するというステップ、および上記Ｓ３１０の後にＳ３１０の処理結果を出力部が表示するというステップ、上記Ｓ３１３の後にＳ３１３の処理結果を出力部が表示するというステップをさらに含んでいる。
　また、上記Ｓ３０６では、最頻値を１つの参照値と比較してもよいし（つまり、最頻値を参照値と１つ１つ比較してもよいし）、最頻値を複数の異なる参照値と同時に（並列的に）比較してもよい。
　（実施形態２）
　本実施形態のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置について、図７を参照しながら説明する。図７は、実施形態の装置（装置２００）の一例を模式的に示した機能ブロック図である。この装置３００は、上記実施形態１の装置２００において、トンネル電流のパルスを検出する手段（検出部）４１、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する手段（さらなる規格化部）７２、および規格化した電流値を参照値と比較する手段（さらなる比較部６２）をさらに備えていることを特徴としている。装置３００について以下に説明するが、装置１００と重複する部分の説明は省略する。
　装置３００では、比較部６１は検出部４１に電気的に接続されている。このため、比較部６１が複数種のヌクレオチドを識別した場合、比較部６１が検出部４１に対して、トンネル電流のパルスを検出するように指示を与える。検出部４１はさらなる規格化部７２に電気的に接続されており、検出部４１がパルスを検出すると、このパルスの情報をさらなる規格化部７２に出力することができる。さらなる規格化部７２は、さらなる比較部６２と電気的に接続されており、規格化部７２がパルスの電流値を規格化すると、規格化した電流値の情報をさらなる比較部７２に出力することができる。
　検出部４１、さらなる規格化部７２、およびさらなる比較部６２には、例えば、従来公知のコンピュータ等の演算装置を好適に用いることができる。検出部４１は、ヌクレオチドのパルスが持続する時間のデータを保存した第６の記憶部（公知のメモリ等）を備えていてもよい。また、規格化部７１がさらなる規格化部７２を兼ねていてもよいし、規格化部７１とさらなる規格化部７２とは異なるデバイスであってもよい。また、比較部６１がさらなる比較部６２を兼ねていてもよいし、比較部６１とさらなる比較部６２とは異なるデバイスであってもよい。
　装置３００の動作の一例を、図７を参照して説明する。電極対１１～比較部６１の動作は、上記装置２００と同様である。
　比較部６１が単一種のヌクレオチドしか識別しなかった場合、比較部６１は、本発明に適用したポリヌクレオチドは同一のヌクレオチドからなるものであると判定する。そして、比較部６１は、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、識別された単一種のヌクレオチドからなるものであると決定する。
　一方、比較部６１が複数種のヌクレオチドを識別した場合、比較部６１は、本発明に適用したポリヌクレオチドは異なるヌクレオチドからなるものであると判定する。この場合、比較部６１が検出部４１に対して、トンネル電流のパルスを検出するように指示する。
　検出部４１は、比較部６１の指示を受けて、トンネル電流のパルスを検出する。例えば、検出部４１は、上記電流測定部３１に対して、測定したトンネル電流の電流値のデータを検出部４１に出力するように指示する。電流測定部３１は、検出部４１からの指示に基づいて、電流値のデータを検出部４１に出力する。検出部４１は、入力された電流値のデータからトンネル電流のパルスを検出する。具体的には、検出部４１は、上述した（１）ヌクレオチドのパルスが持続する時間の最頻値のｎ倍以上の間持続すること、および（２）階段状のシグナルを示すこと、の２つの条件を用いて、分析対象のポリヌクレオチドに起因するトンネル電流のパルスを検出する。そして、検出部４１は、検出したパルスの情報をさらなる規格化部７２に出力する。
　さらなる規格化部７２は、入力されたこのパルスの電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する。次いで、規格化部７１は、規格化した電流値の情報をさらなる比較部６２に出力する。
　さらなる比較部６２は、この規格化した電流値の情報に基づいてポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの並びを決定する。例えば、さらなる比較部６２は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数でパルスを分割する。次いで、分割した区間におけるパルスの規格化した電流値が、最も長い時間含まれている参照値を特定する。さらなる比較部６２は、この区間のヌクレオチドが、特定した参照値に対応する参照ヌクレオチドであると識別する。
　また、さらなる比較部６２が、パルスの規格化した電流値が参照値に含まれている時間の閾値に基づいて、１つの区間におけるパルスの規格化した電流値が含まれた参照値を特定できなかった場合、この区間のヌクレオチドが不明であると判定する。
　なお、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数および閾値は、使用者から入力部を介して入力にされたものであり得る。
　装置３００によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する動作のフローの一例を図８に示すフローチャートを参照して説明する。
　Ｓ４０１では、装置３００が電極対１１をサンプル中に保持する。
　Ｓ４０２では、電圧印加部２１が電極対１１に対して電圧を印加する。
　Ｓ４０３では、電流測定部３１がＳ４０２の処理によって発生したトンネル電流の電流値を測定する。
　Ｓ４０４では、算出部５１がＳ４０３の処理によって測定した電流値の最頻値を算出する。
　Ｓ４０５では、規格部７１がＳ４０４の処理によって算出した最頻値を規格化する。
　Ｓ４０６では、比較部６１がＳ４０５の処理によって規格化した最頻値を参照値と比較して、規格化した最頻値が参照値に含まれているか否かを確認する。
　Ｓ４０６において最頻値が参照値に含まれていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ４０７に進む。一方、Ｓ４０６において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６１が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ４２１に進む。
　Ｓ４０７では、規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドであると比較部６１が判定する。
　Ｓ４０８では、比較部６１が、比較すべきさらなる規格化した最頻値があるか否かを確認する。Ｓ４０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値がないことを確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ４０９に進む。一方、Ｓ４０８において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値があることを確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ４１０に進む。
　Ｓ４０９では、比較部６１が、本発明に適用したポリヌクレオチドは単一種のヌクレオチドからなるものであると判定して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、Ｓ４０７の処理によって識別された参照ヌクレオチドからなるものであると決定する。そして、処理が終了する。
　Ｓ４１０では、比較部６１は本発明に適用したポリヌクレオチドが複数種のヌクレオチドからなるものであると判定する。
　Ｓ４１１では、比較部６１が上記参照値とは異なる別の参照値が第５の記憶部に保存されているか否かを確認する。Ｓ４１１において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ４１２に進む。一方、Ｓ４１１において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていないことを比較部６１が確認した場合（すなわち、最頻値が第５の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれていない場合）、Ｓ４２３に進む。
　Ｓ４１２では、比較部６１がＳ４１１の処理によって確認されたさらなる規格化した最頻値を別の参照値と比較して、さらなる規格化した最頻値が別の参照値に含まれているか否かを確認する。Ｓ４１２においてさらなる規格化した最頻値が参照値に含まれていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ４１３に進む。一方、Ｓ４１２において、最頻値が参照値に含まれていないことを比較部６１が確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ４１５に進む。
　Ｓ４１３では、さらなる規格化した最頻値のヌクレオチドが別の参照値に対応する別の参照ヌクレオチドであると比較部６１が判定する。
　Ｓ４１４では、比較部６１が、比較すべきさらなる規格化した最頻値があるか否かを確認する。Ｓ４１４において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値がないことを確認した場合（ＮＯの場合）、Ｓ４１７に進む。一方、Ｓ４１４において、比較部６１が比較すべきさらなる規格化した最頻値があることを確認した場合（ＹＥＳの場合）、Ｓ４１１に戻る。
　Ｓ４１５では、さらなる規格化した最頻値のヌクレオチドが別の参照値に対応する参照ヌクレオチドでないと比較部６１が判定し、Ｓ４１６に進む。
　Ｓ４１６では、比較部６１が上記参照値とは異なる別の参照値が第５の記憶部に保存されているか否かを確認する。Ｓ４１６において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ４１２に戻る。この場合、上記Ｓ４１２における処理と同様に、比較部６１は上記最頻値を上記別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれているか否かを確認する。一方、Ｓ４１２において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていないことを比較部６１が確認した場合（すなわち、最頻値が第５の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれていない場合）、Ｓ４２３に進む。
　Ｓ４１７では、Ｓ４１４の処理の結果、比較部６１が検出部４１に対して、トンネル電流のパルスを検出するように指示する。
　Ｓ４１８では、Ｓ４１７の処理の結果、検出部４１がトンネル電流のパルスを検出する。
　Ｓ４１９では、さらなる規格化部７２がＳ４１８の処理によって検出されたパルスの電流値を規格化する。
　Ｓ４２０では、さらなる比較部６２がＳ４１９の処理によって規格化した電流値を参照値と比較して、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの並びを決定する（ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する）。そして、処理が終了する。
　Ｓ４２１では、規格化した最頻値のヌクレオチドがこの参照値に対応する参照ヌクレオチドでないと比較部６１が判定し、Ｓ４２２に進む。
　Ｓ４２２では、比較部６１が上記参照値とは異なる別の参照値が第５の記憶部に保存されているか否かを確認する。Ｓ４２２において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていることを比較部６１が確認した場合（ＹＥＳの場合）、上記Ｓ４０６に戻る。この場合、上記Ｓ４０６における処理と同様に、比較部６１は上記最頻値を上記別の参照値と比較して、最頻値が別の参照値に含まれているか否かを確認する。一方、Ｓ４０６において、上記別の参照値が第５の記憶部に保存されていないことを比較部６１が確認した場合（すなわち、最頻値が第５の記憶部に保存された参照値のどれにも含まれていない場合）、Ｓ４２３に進む。
　Ｓ４２３では、比較部６１が規格化した最頻値のヌクレオチドが第５の記憶部に保存された参照値に対応する参照ヌクレオチドのどれでもないと判定して、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定不可能であると決定する。そして、処理が終了する。
　このように、本実施形態の装置３００では、上述したさらなる部材を備えているので、単一種のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができるし、複数種のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列も決定することができる。
　なお、本発明には以下の態様も包含される。
　本発明のヌクレオチドを識別する方法において、最頻値は、各パルスにおける最大電流値と、最大電流値に対応するパルスの数との関係を示すヒストグラムを生成し、生成したヒストグラムを所定の関数にフィッティングして、フィッティングしたガウス関数のピーク値を求めることによって、算出することが好ましい。この関数は、ガウス関数であることが好ましい。
　また、本発明のヌクレオチドを識別する装置において、電極間距離が、ヌクレオチドの分子直径の０．５倍～２倍の長さであることが好ましい。
　また、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、トンネル電流のパルスを検出する工程、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する工程、および規格化した電流値を参照値と比較する工程をさらに包含していもよい。
　また、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置は、トンネル電流のパルスを検出する手段、パルスにおける電流値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、電流値を規格化する手段、および規格化した電流値を参照値と比較する手段をさらに備えていてもよい。この装置において、電極間距離が、前記ヌクレオチドの分子直径の０．５倍～２倍の長さであることが好ましい。
　本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　〔実施例１〕
　以下の実施例では、図９および図１０に示すように、トンネル電流の測定に基づく、デオキシチミジン５’一リン酸（ｄＴＭＰ）、グアノシン５’一リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）、およびシチジン５’一リン酸（ＣＭＰ）の統計的識別について説明する。このような識別を行うための１分子を介した電子輸送の問題を解決する方法は、Milli-Q水に溶解されたヌクレオチドが、図９に示される金のナノ電極の電極間に捕捉されることよって、２つの電極間に生じるトンネル電流（Ｉ）の一時的な変化の観察に基づいている（M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 9, 1659 (2009)、M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)参照）。
　なお、図９は、水中において、ＤＣバイアス（Ｖｂ）を印加したときに、金のナノ電極の電極間に捕捉されたヌクレオチド１分子に流れるトンネル電流の測定を説明する模式図である。また、図１０には、本実施例に使用された各ヌクレオチドの分子構造を示す。
　（ナノ電極対の作製）
　金のナノ電極対を作製し、この作製したナノ電極対をヌクレオチドが溶解したMilli-Q水に浸して、ナノ電極対の電極間に生じるトンネル電流を測定した。作製したナノ電極対の走査電子顕微鏡の写真を図１１に示す。図１１のＡは、ポリイミドによってコートされた可撓性の金属基板上に作製されたナノスケールの金の接合を示す図である。この金の接合は支持されていない。また、図１１のＢおよびＣは、ナノスケールの接合の最も狭いくびれを拡大した図である。このようなナノ電極対を以下のようにして作製した。
　ヌクレオチド１分子のコンダクタンスを測定するための主要な要件は、ヌクレオチドの長さ（約１ｎｍ）に匹敵する電極間距離を有する電極対を形成することである。このような電極対は、ナノ加工機械的破断接合法（ＭＣＢＪ）を用いて形成した。
　具体的には、まず、ナノスケールの金の接合を、電子線描画装置（日本電子社製、カタログ番号：JSM6500F）を用いて、標準の電子ビームリソグラフィーおよびリフトオフ技術によって、ポリイミド（Industrial Summit Technology社製、カタログ番号：Pyre-Ml）でコーティングされた可撓性の金属基板上にパターン成形した。次いで、この接合の下にあるポリイミドを、反応性イオンエッチング装置（サムコ社製、カタログ番号：10NR）を用いて、反応性イオンエッチング法に基づくエッチングによって取り除いた。そして、基板を折り曲げることによって、３点にて折り曲げられた構造のナノスケールの金のブリッジを作製した。このような基板の折曲げは、ピエゾアクチュエータ（ＣＥＤＲＡＴ社製、カタログ番号：APA150M）を用いて行った。
　その後、このブリッジを引っ張り、ブリッジの一部を破断させることによって、ナノ電極対を形成した。具体的には、データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NI PCIe-6321）を用いて、レジスタンスフィードバック法によって、プログラミングされた接合の引延し速度の下で、１０ｋΩの直列の抵抗を用いて、０．１ＶのＤＣバイアス電圧（Ｖｂ）をこのブリッジに印加して、ブリッジを引っ張り、ブリッジを破断させた。そして、ブリッジをさらに引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が目的のヌクレオチド分子の長さ（約１ｎｍ）になるように設定した。
　このような手順によって、ナノ電極対を得た。
　（ナノ電極対の間に生じるトンネル電流の測定）
　このようにして作製したナノ電極対をヌクレオチドが溶解したMilli-Q水に浸して、ヌクレオチドがナノ電極対の間に捕捉されたときに生じるトンネル電流（Ｉ）を測定した。
　１ｎｍの長さにて形成された電極間距離を有するナノ電極対を横切るトンネル電流（Ｉ）を、自家製の対数増幅器を用いて増幅した。この対数増幅器を用いることによって、＞１ｋＨｚにおいてピコアンペアレベルの電流を読むことができる。次いで、増幅した電流のシグナルを、２４ビットの分解能を有するＤＡＱカード（日本ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NI USB-9234）を用いて２ｋＨｚのサンプリングレートにてコンピュータに記録した。
　上述のようにして作製したナノ電極対のそれぞれについて、５０分間連続的に電流（Ｉ）を測定した。サンプルを１つ測定するごとに、サンプルを新しいものと取り替えた。
　まず、ヌクレオチドとしてＧＭＰを用いて、電極距離が１ｎｍに調節されたナノ電極対の間に０．７５Ｖのバイアス電圧を印加したときのトンネル電流（Ｉ）を３０００秒（５０分間）にわたって測定し、測定したトンネル電流を時間（秒）に対してプロットした。そのプロットによって得られた「トンネル電流と時間（秒）との関係を示す曲線（Ｉ－ｔ曲線）」の一部を図１２のＡに示す。また、図１２のＡ中のアスタリスクを付けたシグナルを拡大して図１２のＢに示す。図１２のＢに示したＩｐは、パルス様シグナルにおける高さの最大値として規定され、ｔｄは、パルス様シグナルにおけるパルス幅の最大値として規定される。
　図１２のＡによれば、種々の高さを有するパルス様シグナルがいくつか時間と共に不規則的に現れていることが分かる。約８０ｐＡの小さいオフセットおよび約±１０ｐＡのレベルのノイズは、溶媒中の分極したＧＭＰのイオン性質に起因するものである。このＩ－ｔ曲線は、異なる大きさの「パルスにおける最大電流値（Ｉｐ）」を有するパルスが複数存在することが特徴である。
　図１２のＢに示すように、電流のパルスを拡大することによって、パルスの幅が異なっていることが明らかになった。また、図１２のＢから分かるようにトンネル電流は基底レベルから急激に上昇し、そして基底レベルへと急激に下降する。このような電流の急激な上昇は、ナノ電極対の間にＧＭＰ１分子が捕捉されたことを示しており、電流の急激な下降は、捕捉されたＧＭＰが解離したことを示している、として解釈することができる。
　また、図１２のＢに示すように、ＧＭＰ分子がナノ電極対の間に捕捉されると、電流が次第に不安定になることに注目すべきである。このことは、おそらく、ナノ電極対の間における、移動性のヌクレオチド分子の原子的な運動に起因すると考えられる（M. Zwolak, M. Di Ventra, Nano Lett. 5, 421 (2005)、J. Lagerqvist, M. Zwolak, M. Di Ventra, Byophys. J. 93, 2384 (2007)）。本実験条件では、ＧＭＰ分子が任意の化学的な結合を介して金属の電極に強く結合しない場合、ＧＭＰ分子の立体配座のわずかな変化でさえも、電極とＧＭＰ分子との距離が変更されるため、トンネル電流の大幅な変動を引き起こしてしまうことが予期される。電極間距離が長くなることによって、電極とＧＭＰ分子との電子的な結合がより弱くなり、これに伴ってトンネル電流が低減する。反対に、電極間距離が短くなることによって、電極とＧＭＰ分子との電子的な結合がより強くなり、これに伴ってトンネル電流が増加する。
　ナノ電極対として、電極間距離がヌクレオチドの分子直径（ＧＭＰについては約１ｎｍである。）よりも広いものを用い、ヌクレオチドとしてＧＭＰを用いて、トンネル電流を測定した。種々の条件の電極間距離（ｄgap）について得られたＩ－ｔ曲線を図１３に示す。
　図１３のＡは、ｄgapを約２．５ｎｍに調整したときに測定されたＩ－ｔ曲線の例を示す図である。図１３のＡに示すように、ナノ電極の電極間距離が、ヌクレオチドの分子直径（ＧＭＰについては約１ｎｍである。）よりも長くなった場合、図１３のＡまたはＢにおいて見られていた特徴的なシグナルは消失し、トンネル電流のパルスを示さない特徴のない曲線が現れた。
　一方、図１３のＢは、ｄgapをヌクレオチドの分子直径（約１．０ｎｍ）の近くに設定したときのみ、電極間に捕捉されたヌクレオチド１分子を示す特徴的なパルス様シグナルが観察されたことを示す図である。パルス様シグナルは、比較的長い（５０～１０００秒の）時間間隔でいくつかの集団として現れる傾向がある。このことは、ヌクレオチドが、金電極の表面に吸着することを示している。このヌクレオチドの金に対するアフィニティーは十分に研究されている（K. A. Brown, S. Park, K. Hamad-Schifferli, J. Phys. Chem. C 112, 7517 (2008)）。ヌクレオチドが電極対のギャップの領域の近傍に吸着した場合、電子は、ヌクレオチドを介してポテンシャル障壁を通過することを開始する、そして、金とヌクレオチドとの結合が熱的に解離するまで、トンネル電流のパルスが生じる。脱離した後、次の分子がナノ電極対の電極間の空間に近づくまで、シグナルは発生しない。
　図１３のＣは、図１３のＢに示したピークの集団の１つをより詳細に示す図である。種々の高さを有するトンネル電流のパルスが、時間と共に不規則的に現れている。
　さらに、ヌクレオチドが溶解していない溶媒を用いてトンネル電流を測定した。その結果、図１２のＡまたはＢに示すような特徴がみられないＩ－ｔ曲線が得られた。
　次いで、Ｉｐのバイアス電圧の依存性を調査することによって、ヌクレオチド１分子における電子輸送のメカニズムを調べた。バイアス電圧（Ｖｂ）を０．２５Ｖ～０．７５Ｖの範囲に拡張して、トンネル電流を経時的に測定した。その結果を図１４のＡ～Ｃの左に示す。図１４のＡ～Ｃの左パネルはそれぞれ、Ｖｂが０．２５Ｖ、０．５０Ｖ、および０．７５Ｖであるときに得られた、トンネル電流のパルスを示すＩ－ｔ曲線の一部である。図１４のＡ～Ｃの左パネルに示すように、Ｉｐを有するパルス様シグナルが、測定したＶｂの各条件において検出され、これらのシグナルは図１２に示したシグナルに類似していた。
　そして、トンネル電流のパルスを統計的に分析することによってＩｐ－Ｖｂの特徴を調査した。５００個の得られたＩｐのデータからヒストグラムを作成した。作成したＩｐのヒストグラムを、図１４のＡ～Ｃの右パネルに示す。このＩｐのヒストグラムを調べることによって、Ｉｐが一桁を超える広範囲にわたって分布することが明らかになった。
　このことは、電極のギャップ内における移動性のＧＭＰの分子の立体配座が上述したように多様であることに関連して、電極と分子との接触長が多種多様であることに起因している。しかし、図１４のＡ～Ｃの右のパネルに示されるように、Ｉｐの分布において、十分に規定される単一のピークのプロフィールが現れている。図１４のＡの右のパネルにおけるピークは２７ｐＡであり、Ｂの右のパネルにおけるピークは５７ｐＡであり、Ｃの右のパネルにおけるピークは７４ｐＡである。この単一のピークの構造は、電界における、の電極対のナノスケールのギャップの空間に存在する、ＧＭＰ分子の好ましい立体配座を示している。このことは、分子シミュレーションによって示唆されたような、Ｖｂによって誘導された静電ポテンシャルの勾配に沿ってヌクレオチドが整列したことに部分的に起因すると考えられる（M. Zwolak, M. Di Ventra, Rev. Mod. Phys. 80, 141 (2008)）。
　Ｉｐの単一のピークは、特定の立体配座を有するＧＭＰ１分子のコンダクタンスに関連し、本実験において統計的な有意性を有していると考えられる。図１４のＡ～Ｃの右パネルにおける実線にて示すように、ヒストグラムに対するガウス関数のフィッティングを行い、このＩｐの単一ピークを抽出した。そして抽出したそれぞれのＩｐのピークを、図１４のＤに示すようにＶｂの関数としてプロットした。このプロットによれば、Ｖｂの増加に伴ってＩｐも直線的に増加することが明確に示された。このＩｐとＶｂとの依存性に基づいて、ヌクレオチドにおける電子輸送の可能性のあるメカニズムについて推論した。第１に、電極と分子との界面において、電荷の注入を妨げる無視できないバリアが存在すると仮定した。B3LYP functional および6-31G** 基底系を用いて、分子のフロンティア軌道のレベルをＤＦＴ計算（Gaussian03, revisionC.02; M. J. Frisch et al., Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2003）によって大まかに見積もったところ、金とグアニンとの接点における、電荷の注入を妨げるバリアのエネルギーが、約２．６ｅＶであることが分かった。なお、電極のフェルミ準位は、分子のＨＯＭＯとＬＵＭＯとのギャップの中間点と一致していると仮定した。この仮定は、分子が電極と弱く相互作用する場合にのみ、金－ＧＭＰ－金の系について有効であるべきである。
　したがって、電子は、Ｖｂが０．７５Ｖの場合でも、金とグアニンとの結合における２ｅＶを超えるエネルギーのバリアを乗り越えざるを得ない。コヒーレントトンネル効果が、このような環境下において当然に疑われる（A. Troisi, M. A. Ratner, Small 2, 172 (2006)）。シモンズモデルによれば、電界によって加速された電子の運動エネルギー（ｅＶｂ）が、トンネル効果のバリアと比べて無視できないくらいに小さい場合、トンネル電流はバイアス電圧（Ｖｂ）とともに直線的に変更される（ｅは電子の電荷である）（J. G. Simmons, J. Appl. Phys. 34, 1793 (1963)、W. Wang, T. Lee, M. A. Reed, Phys. Rev. B 68, 035416 (2003)）。このように、ＩｐとＶｂとの直線的な特徴は、１分子のコンダクタンスが約０．１ｎＳであるＧＭＰを介した、コヒーレントトンネル効果を示唆し、このことは、第１原理計算と一致し得る。
　横電場（Transverse-field）によって誘導された静電力は、電極対の間のナノスケールのギャップに捕捉されるヌクレオチドの期間に影響を与えることが期待される（M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 9, 1659 (2009)）。しかし、図１４のＥに示すように、Ｉｐ－ｔｄの散布図は、Ｖｂがｔｄに明確に依存していないことを表している。それ故、横電場は、分子の可能性のある立体配座を選別して、十分に規定されたＩｐを与えることによって、単一のヌクレオチドを電気的に検出することに、大きく寄与しているものの、移動の期間を制御することに横電場を利用することを期待できない。
　ＤＮＡのシーケンシングに向けて、残りのヌクレオチド（つまり、ＡＭＰ、ｄＴＭＰ、およびＣＭＰ）の評価を試みた。
　電極間距離（ｄgap）が比較的長い（約２．５ｎｍである）場合の、ＡＭＰについてのＩ－ｔ曲線を作成した。作製したＩ－ｔ曲線を、図１５に示す。なお、縦軸はｎＡである。このＩ－ｔ曲線は、約１０ｎＡという大きなオフセット、および電流の不可逆的な上下の変動によって特徴付けられる。このように、ＡＭＰは、複雑な特徴を示し、ＡＭＰについてのＩ－ｔ曲線は、図１５に示すように、電流の基底レベルが高く（＞５００ｐＡ）、ノイズが多いことを特徴としていた。このようなＩ－ｔ曲線の特徴は、電極間距離を２ｎｍよりも長くしたときでさえも観察された。また、ＡＭＰについて、電極間距離を５ｎｍを超えてさらに拡張すると、ｄgapの増加と共にトンネル電流は滑らかに低減した。
　アデニンは、金に対して比較的高い程度で非特異的に結合することが示されている（J. Kundu, O. Neumann, B. G. Janesko, D. Zhang, S. Lal, A. Barhoumi, G. E. Scuseria, N. J. Halas, J. Phys. Chem. ASAP article、K. A. Brown, S. Park, K. Hamad-Schifferli, J. Phys. Chem. C 112, 7517 (2008)）。アデニンのこの特有のアフィニティーによって、金に対するＡＭＰの意図しない過剰な吸着を防止することが困難となり、Ｉｐの測定を介してヌクレオチド１分子を電気的に検出することが妨害されてしまう。
　また、他の２つのヌクレオチド（ｄＴＭＰおよびＣＭＰ）について、特徴的なトンネル電流（Ｉ）のパルスを観察することに成功した。図１６のＡに、Ｖｂが０．７５Ｖであるときに、ｄＴＭＰおよびＣＭＰについて得られたＩ－ｔ曲線を示す（なお、ＧＭＰの結果も示す）。図１６のＢに示すように、ｄＴＭＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰに関して、対応するＩｐのヒストグラムは、単一のピークを有しており、分子構造のひずみの抑制に対する横電場の有効な効果を示唆している。図１６のＢに示した実線は、ヒストグラムに対するガウス関数を用いたフィッティングを示す。ｄＴＭＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰのピーク（最頻値）はそれぞれ９６ｐＡ、３０ｐＡ、および４２ｐＡである。
　よって、このようなＩｐのピークの横軸（トンネル電流）の値に基づいて、ＧＭＰ、ＣＭＰおよびｄＴＭＰを識別することができる。また、これらのＩｐのピークに基づいて、１分子の導電率の順番をＧＭＰ＞ＣＭＰ＞ｄＴＭＰに決定することができる。この結果は、ＤＮＡのヌクレオチドのＨＯＭＯとＬＵＭＯとのギャップにおける差異がグアニン＜シトシン～チミンであることを反映しているとして定性的に解釈することができ（M. Zwolak, M. Di Ventra, Nano Lett. 5, 421 (2005)、M. Taniguchi, T. Kawai, Physica E 33, 1 (2006)）、１つのヌクレオチドを介した、トンネル効果に基づく電子輸送についての本発明者らの主張を裏付けている。
　また、ＤＮＡを構成するヌクレオチド（ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＡＭＰおよびｄＴＭＰ）ならびにＲＮＡを構成するヌクレオチド（ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＡＭＰおよびＵＭＰ）のそれぞれについて、０．８ｎｍの電極間距離、０．４Ｖの電圧を用いて、トンネル電流（Ｉ）のパルスを観察した。そして、１０００個の標本を用いてコンダクタンスのヒストグラムを作成し、ガウス関数を用いたフィッティングを行った。ＤＮＡを構成するヌクレオチドの結果を図１７のＡに示し、ＲＮＡを構成するヌクレオチドの結果を図１７のＢに示す。図１７のＡおよびＢに示した実線は、ヒストグラムに対するガウス関数を用いたフィッティングを示している。
　図１７のＡおよびＢから分かるように、各ヌクレオチドのコンダクタンスのヒストグラムは、単一のピークを有している。ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＡＭＰ、およびｄＴＭＰのピーク（最頻値）は、それぞれ６０ｐＳ、８７ｐＳ、６７ｐＳ、および３９ｐＳである。また、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＡＭＰ、およびＵＭＰのピーク（最頻値）は、それぞれ６４ｐＳ、１２３ｐＳ、９２ｐＳ、および５０ｐＳである。
　１分子のヌクレオチドを識別することは、トンネル電流の検出を介したＤＮＡのシーケンシングにとって重要な問題である。図１６のＣおよび図１７に示すように、ヌクレオチドのＩｐのピーク（またはコンダクタンスのピーク）が各ヌクレオチドによって異なる一方、ヒストグラムを重ね合せた場合、Ｉｐの分布（コンダクタンスの分布）は著しく重複していることが明確に実証された。このことは、シングルショット測定が、ヌクレオチドの種類を特定するに確実に不十分であることを明らかにしている。さらに、ＤＮＡのヌクレオチド配列が電極対のナノスケールのギャップを移動する間に、データを高速で収集するようにＤＮＡのヌクレオチド配列を読み取る期間にわたって、トンネル電流の統計的平均を収集することが非常に必要とされていることを示唆している（J. Lagerqvist, M. Zwolak, M. Di Ventra, Byophys. J. 93, 2384 (2007)）。すなわち、１塩基レベルにおいてＤＮＡの配列を特定するためには、トンネル電流の統計的平均値（最頻値）を比較することが必要であるといえる。
　このような、究極的な１分子に基づく技術は、ナノ電極対の近傍におけるＤＮＡの動態を正確に制御することを必要としているが、１分子レベルにおいて分子の移動を操作することができる有望なツールは、既に開発されている（U. F. Keyser, B. N. Koeleman, S. V. Dorp, D. Krapf, R. M. M. Smeets, S. G. Lemay, N. H. Dekker, C. Dekker, Nat. Phys. 2, 473 (2006)、H. Peng, X. S. Ling, Nanotechnol. 20, 185101 (2009)）。
　なお、本実施例における上述した実験の全ては、アルゴンガス流の下で、５μＭのヌクレオチドのMilli-Q水溶液を用いて室温にて実施した。ヌクレオチドは、何れも東京化成工業株式会社から購入した。
　〔実施例２〕
　以下では、図１８～図２０に示すように、トンネル電流の測定に基づくＤＮＡ（ＧＴＧのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（以下、「ＧＴＧ」と記載する。）、ＴＧＴのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（以下、「ＴＧＴ」と記載する。）、ＧＧＧのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（以下、「ＧＧＧ」と記載する。））のヌクレオチド配列の統計的な決定について説明する。
　実施例１にて用いたナノ電極対を、上記３種類のＤＮＡのいずれか１つが溶解したＭｉｌｌｉ－Ｑ水に浸した。そして、実施例１と同様の方法で、ナノ電極対の電極間に生じるトンネル電流を測定し、電流値からコンダクタンスを算出した。なお、ナノ電極間に印加した電圧は０．４Ｖであった。算出したコンダクタンスを、図１７のＡに示す上述したデオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）の最頻値（８７ｐＳ）で除した。このような実験の結果を、図１８に示す。図１８のＡ、ＢおよびＣは、それぞれＧＴＧ、ＴＧＴ、およびＧＧＧを用いた場合の結果を示している。
　＜１．ヌクレオチドの種類の決定＞
　図１７Ａに示すｄＧＭＰの最頻値（８７ｐＳ）をこのｄＧＭＰの最頻値（８７ｐＳ）で除した「ｄＧＭＰの相対的な最頻値」を１として求めた。次いで、図１７のＡに示すｄＧＭＰのヒストグラムにフィッティングしたガウス関数の半値全幅を４４ｐＳとして求めた。この半値全幅をｄＧＭＰの最頻値で除した。これによって、「ｄＧＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を４４ｐＳとして取得した。この「ｄＧＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」と、「ｄＧＴＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」とは同一の値を示す。よって、「ｄＧＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を、「ｄＧＴＰの指標とすることができる。以下、「ｄＧＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を、「ｄＧＴＰを示す範囲」と称する。
　同様に、図１７のＡに示すｄＴＭＰの最頻値（３９ｐＳ）をｄＧＭＰの最頻値（８７ｐＳ）で除した「ｄＧＭＰの相対的な最頻値」を０．４５として求めた。次いで、図１７のＡに示すｄＴＭＰのヒストグラムにフィッティングしたガウス関数の半値全幅を２２ｐＳとして求めた。これによって、「ｄＴＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を２２ｐＳとして取得した。この「ｄＴＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」と、「ｄＴＴＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」とは同一の値を示す。よって、「ｄＴＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を、「ｄＴＴＰの指標とすることができる。以下、「ｄＴＭＰの相対的な最頻値を中心とした半値全幅」を、「ｄＴＴＰを示す範囲」と称する。
　図１８のＡ～Ｃにおいて、「Ｇ」の網掛けで示す領域は、上記ｄＧＴＰを示す範囲である。また、図１８のＡおよびＢにおいて、「Ｔ」の網掛けで示す領域は、上記ｄＴＴＰを示す範囲である。
　図１８のＡにおいて、左側のグラフは測定した全てのトンネル電流のコンダクタンスのヒストグラムであり、右側のグラフはｄＧＭＰの最頻値（６１４ｐＳ）で除したコンダクタンスと時間（秒）との関係を示すグラフである。左側のグラフにおいて、縦軸は相対的なコンダクタンスであり、横軸は測定したコンダクタンスのカウントである。右側のグラフにおいて、縦軸は相対的なコンダクタンスであり、横軸は時間（ｍｓ）である。
　左側のグラフにて示すヒストグラムを、ヒストグラムに現れる３つのピークを確認した。そして、ヒストグラムにおける一番下のピーク（最頻値が最も小さい）を、ベースライン（ノイズ）のコンダクタンスとした。
　次いで、各ピークを中心に設定してガウス関数でフィッティングを行い、各ピークの値（コンダクタンスの最頻値）を求めた。その結果、一番下のピークの値（Ｉ０）は、５２ｐＳであり、真ん中のピークの値（Ｉ１）は、２７１ｐＳであり、一番上のピークの値（Ｉ２）は、６６６ｐＳであった。
　次いで、Ｉ２からＩ０を減じたもの（６１４）を、このＩ２からＩ０を減じたもの（６１４）で除することによって、一番上のピークについての相対的な最頻値を１として求めた（すなわち、一番上のピークについての相対的な最頻値＝Ｉ２－Ｉ０／Ｉ２－Ｉ０）。また、Ｉ１からＩ０を減じたもの（２１９）を、Ｉ２からＩ０を減じたもの（６１４）で除することによって、真ん中のピークについての相対的な最頻値を０．３５として求めた（すなわち、真ん中のピークについての相対的な最頻値＝Ｉ１－Ｉ０／Ｉ２－Ｉ０）。
　そして、一番上のピークについての相対的な最頻値が、上記ｄＧＴＰを示す範囲に含まれることを確認し、この相対的な最頻値が「デオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）」の最頻値であると判定した。同様に、真ん中のピークについての相対的な最頻値が、上記ｄＴＴＰを示す範囲に含まれることを確認し、この相対的な最頻値が「デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）」の最頻値であると判定した。
　図１８のＢにおいて、左側のグラフは、測定した全てのトンネル電流のコンダクタンスのヒストグラムであり、右側のグラフはｄＧＭＰの最頻値（１２３ｐＳ）で除したトンネル電流と時間（秒）との関係を示すグラフである。上記図１８のＡと同様に、左側のグラフにて示すヒストグラムを、ピークに基づいて３つの領域に分割して、一番下のピークを含む領域におけるコンダクタンス（ベースラインのコンダクタンス）の最頻値（Ｉ３）（２０ｐＳ）、真ん中のピークを含む領域におけるコンダクタンスの最頻値（Ｉ４）（５３ｐＳ）、一番上のピークを含む領域におけるコンダクタンスの最頻値（Ｉ５）（１４３ｐＳ）を求めた。
　次いで、Ｉ５からＩ３を減じたもの（１２３）を、このＩ５からＩ３を減じたもの（１２３）で除することによって、一番上のピークについての相対的な最頻値を１として求めた（すなわち、一番上のピークについての相対的な最頻値＝Ｉ５－Ｉ３／Ｉ５－Ｉ３）。また、Ｉ４からＩ３を減じたもの（３３）を、Ｉ５からＩ３を減じたもの（１２３）で除することによって、真ん中のピークについての相対的な最頻値を０．２７として求めた（すなわち、真ん中のピークについての相対的な最頻値＝Ｉ４－Ｉ３／Ｉ５－Ｉ３）。
　そして、一番上のピークについての相対的な最頻値が、上記ｄＧＴＰを示す範囲に含まれることを確認し、この相対的な最頻値が「Ｇ」の最頻値であると判定した。同様に、真ん中のピークについての相対的な最頻値が、上記ｄＴＴＰを示す範囲に含まれることを確認し、この相対的な最頻値が「Ｔ」の最頻値であると判定した。
　図１８のＣにおいて、左側のグラフは、測定した全てのトンネル電流のコンダクタンスのヒストグラムであり、右側のグラフはｄＧＭＰの最頻値（２３０ｐＳ）で除したトンネル電流と時間（秒）との関係を示すグラフである。上記図１８のＡと同様に、左側のグラフにて示すヒストグラムを、ピークに基づいて２つの領域に分割して、一番下のピークを含む領域におけるコンダクタンス（ベースラインのコンダクタンス）の最頻値（Ｉ６）（８３ｐＳ）、一番上のピークを含む領域におけるコンダクタンスの最頻値（Ｉ７）（３１３ｐＳ）を求めた。
　次いで、Ｉ７からＩ６を減じたもの（２３０）を、このＩ７からＩ６を減じたもの（２３０）で除することによって、一番上のピークについての相対的な最頻値（１）を求めた（すなわち、一番上のピークについての相対的な最頻値＝Ｉ７－Ｉ６／Ｉ７－Ｉ６）。そして、一番上のピークについての相対的な最頻値が、上記ｄＧＴＰを示す範囲に含まれることを確認し、この相対的な最頻値が「Ｇ」の最頻値であると判定した。
　図１８のＡの左側のグラフと右側のグラフとを参照すると、右側のグラフにおける相対的なコンダクタンスを、ｄＧＴＰを示す範囲と、ｄＴＴＰを示す範囲とに分類することができる。図１８のＢも同様に、右側のグラフにおける相対的なコンダクタンスを、ｄＧＴＰを示す範囲と、ｄＴＴＰを示す範囲とに分類することができる。すなわち、図１８のＡおよびＢから、用いたＤＮＡのヌクレオチドがＧおよびＴからなることが判明する。
　図１８のＣの左側のグラフと右側のグラフとを参照すると、右側のグラフにおける相対的なコンダクタンスのほとんどを、ｄＧＴＰを示す範囲に分類することができる。すなわち、図１８のＣから、用いたＤＮＡのヌクレオチドがＧのみからなることが判明する。この結果から、このＤＮＡのヌクレオチド配列が、Ｇからなるものであると決定することができる。
　図１８のＡの右側のグラフの一部の拡大図を図１９に示す。図１８のＢの右側のグラフの一部の拡大図を図２０に示す。
　図１９のＡは、図１８のＡの右側のグラフの一部を拡大したものである。図１９のＢは、隣接平均を行うことによって図１９のＡの曲線を平滑化したものである。図１９のＢにおいて、ｄＧＴＰを示す範囲を濃い色の網掛けで示し、ｄＴＴＰを示す範囲を薄い色の網掛けで示す。図１９のＣは、図１９のＢの一部の拡大図である。
　図２０のＡは、図１８のＢの右側のグラフの一部を拡大したものである。図２０のＢは、隣接平均を行うことによって図２０のＡの曲線を平滑化したものである。図２０のＢにおいて、ｄＧＴＰを示す範囲を濃い色の網掛けで示し、ｄＴＴＰを示す範囲を薄い色の網掛けで示す。図２０のＣは、図２０のＢの一部の拡大図である。
　図１９のＢおよび図２０のＢに示すように、ｄＧＴＰを示す範囲に含まれる「相対的なコンダクタンス」が示すヌクレオチドをｄＧＴＰと判定した。また、図１９のＢおよび図２０のＢに示すように、ｄＴＴＰを示す範囲に含まれる「相対的なコンダクタンス」がヌクレオチドをｄＴＴＰと判定した。
　＜２．ヌクレオチドの配列の決定＞
　次いで、実施例２において、図１２のＢに示すようなＩｐ－ｔｄとの関係を示すグラフに基づいて、ｔｄのヒストグラムを作成した。このｔｄは、１個のヌクレオチドがナノ電極間に滞在する時間を表す。そして、このｔｄのヒストグラムにガウス関数をフィッティングすることによって、ｔｄの最頻値を約１ｍｓとして求めた。これによって、実施例２にて用いた実験系では、１個のヌクレオチドがナノ電極間に約１ｍｓ間滞在することが明らかとなった。
　したがって、実施例２にて用いた３つのヌクレオチドからなるＤＮＡはナノ電極間に約３ｍｓ間以上滞在するので、図１８および１４にて示される目的のＤＮＡを示す時間－電流のシグナルのパルスは、約３ｍｓ間以上持続する（条件１）。また、３つのヌクレオチドからなるＤＮＡの時間－電流のシグナルのパルスは、３つの階段状のシグナルを示す（条件２）。
　上記条件１および条件２に基づいて、図１９のＢに示されたシグナルの中から３ｍｓ間以上持続し、かつ階段状のパルスを抽出した。その結果を図１９のＣに示す。
　図１９のＣに示すように、１番目のＧの区域におけるパルスは、規格化した電流値が基底レベルから上昇して、Ｔの参照値を通過した後、Ｇの参照値を示すという形状である。１番目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＧの参照値であるので、１番目の区域のヌクレオチドは、Ｇであると識別することができた。
　２番目のＴの区域におけるパルスは、規格化した電流値がＧの参照値から下降し、Ｔの参照値を示した後、再びＧの参照値を示すように上昇した形状である。２番目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＴの参照値であるので、２番目の区域のヌクレオチドは、Ｔであると識別することができた。
　３番目のＧの区域におけるパルスは、規格化した電流値がＧの参照値を一定期間示した後、Ｔの参照値を通過して、基底レベルへ下降するという形状である。３番目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＧの参照値であるので、３番目の区域のヌクレオチドは、Ｇであると識別することができる。
　このような手順にしたがって、このパルスが由来するＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧＴＧであると決定することができた。
　同様に、上記条件１および条件２に基づいて、図２０のＢに示されたシグナルの中から３ｍｓ間以上持続し、かつ階段状のパルスを抽出した。その結果を図２０のＣに示す。
　図２０のＣに示すように、１番目のＴの区域におけるパルスは、規格化した電流値が基底レベルから上昇して、Ｔの参照値を示すという形状である。１番目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＴの参照値であるので、１番目の区域のヌクレオチドは、Ｔであると識別することができた。
　２番目のＧの区域におけるパルスは、規格化した電流値がＴの参照値から上昇し、Ｇの参照値を示した後、再びＴの参照値を示すように下降した形状である。２目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＧの参照値であるので、２番目の区域のヌクレオチドは、Ｇであると識別することができた。
　３番目のＴの区域におけるパルスは、規格化した電流値がＴの参照値を一定期間示した後、基底レベルへ下降するという形状である。３番目の区域において、規格化した電流値が最も長い時間含まれている参照値はＴの参照値であるので、３番目の区域のヌクレオチドは、Ｔであると識別することができた。
　このような手順にしたがって、このパルスが由来するＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＧＴであると決定することができた。
　本発明は、電流測定を用いて１つの分子を分析することによって、この分子を識別することができる。本発明は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）が進める次々世代シーケンサーの基本原理であり、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅およびＤＮＡの化学修飾が不要な次々世代シーケンサーに応用することができる。また、本発明は、インフルエンザウイルスやアレルゲンなどの生体分子を１分子にて検出する高感度センサーへ応用することができる。
　１００　　装置
　２００　　装置
　３００　　装置
　１０　　　電極対
　１１　　　電極対
　２０　　　電圧印加部（電極間に電圧を印加する手段）
　２１　　　電圧印加部（電極間に電圧を印加する手段）
　３１　　　電流測定部（電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段）
　３１　　　電流測定部（電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段）
　４０　　　検出部（トンネル電流のパルスを検出する手段）
　４１　　　検出部（トンネル電流のパルスを検出する手段）
　５０　　　算出部（各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する手段）
　５１　　　算出部（測定した電流値の最頻値を算出する手段）
　６０　　　比較部（算出した最頻値を参照値と比較する手段）
　６１　　　比較部（規格化した最頻値を参照値と比較する手段）
　６２　　　比較部（規格化した電流値を参照値と比較する手段）
　７１　　　規格化部（電流値の最頻値を規格化する手段）
　７２　　　規格化部（電流値を規格化する手段）

Claims (10)

  1. 　ヌクレオチドを、電極間を複数回通過させる工程、
    　該ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する工程、
    　各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する工程、および
    　算出した最頻値を参照値と比較する工程、
    を包含していることを特徴とするヌクレオチドを識別する方法。
  2. 　前記最頻値は、前記各パルスにおける前記最大電流値と、該最大電流値に対応するパルスの数との関係を示すヒストグラムを生成し、生成した該ヒストグラムを所定の関数にフィッティングして、フィッティングした該関数のピーク値を求めることによって、算出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　前記所定の関数は、ガウス関数であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 　ヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対、
    　該電極間に電圧を印加する手段、
    　該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出する手段、
    　各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出する手段、および
    　算出した最頻値を参照値と比較する手段
    を備えていることを特徴とするヌクレオチドを識別する装置。
  5. 　前記電極間距離が、前記ヌクレオチドの分子直径の０．５倍～２倍の長さであることを特徴とする請求項４に記載の装置。
  6. 　ポリヌクレオチドを、電極間を通過させる工程、
    　該ポリヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する工程、
    　測定した電流値の最頻値を算出する工程、
    　該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する工程、および
    　規格化した最頻値を参照値と比較する工程、
    を包含しており、
    　該基準ヌクレオチドの最頻値は、
    　　該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させること、
    　　該基準ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および
    　　各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出すること
    によって取得されたものである
    ことを特徴とするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法。
  7. 　前記トンネル電流のパルスを検出する工程、
    　該パルスにおける電流値を、前記基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値を規格化する工程、および
    　規格化した電流値を前記参照値と比較する工程
    をさらに包含していることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 　ポリヌクレオチドが通過可能な電極間距離を有する電極対、
    　該電極間に電圧を印加する手段、
    　該電極間に生じるトンネル電流の電流値を測定する手段、
    　測定した電流値の最頻値を算出する手段、
    　該電流値の最頻値を、基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値の最頻値を規格化する手段、および
    　規格化した最頻値を参照値と比較する手段
    を備えており、
    　該基準ヌクレオチドの最頻値は、
    　　該基準ヌクレオチドを、該電極間を複数回通過させること、
    　　該基準ヌクレオチドが通過した際に該電極間に生じるトンネル電流のパルスを検出すること、および
    　　各パルスにおける最大電流値の最頻値を算出すること
    によって取得されたものである
    ことを特徴とするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する装置。
  9. 　前記トンネル電流のパルスを検出する手段、
    　該パルスにおける電流値を、前記基準ヌクレオチドの最頻値で除することによって、該電流値を規格化する手段、および
    　規格化した電流値を前記参照値と比較する手段
    をさらに備えていることを特徴とする請求項８に記載の装置。
  10. 　前記電極間距離が、前記ヌクレオチドの分子直径の０．５倍～２倍の長さであることを特徴とする請求項８または９に記載の装置。
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