WO2001077374A2 - Verfahren zur identifizierung und isolierung von genomfragmenten mit kopplungsungleichgewicht - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht, wobei man bei nicht miteinander verwandten sowie bei miteinander verwandten Individuen Bereiche des Genoms isoliert, welche Kandidatengenbereiche enthalten, die sich im Kopplungsungleichgewicht mit ihrer engeren DNA-Umgebung befinden. Die im Vergleich zu anderen Verfahren frühere Durchführung des Klonierungsschritts ermöglicht eine mengenunabhängige Gewinnung der DNA-Fragmente und ersetzt weiterhin den in anderen Verfahren durchgeführten Methylierungsschritt. Außerdem wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Verwendung eines Pflanzenenzym eine weitaus höhere Spezifität des Verfahrens gegenüber solchen bewirkt, bei denen der Mut S,H,L-Komplex verwendet wird.

Description

Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht .

Moderne Tierzucht macht sich seit einigen Jahren die molekularbiologische Analytik zu Nutze. Große Hoffnungen knüpfte man an die Strategie der markerunterstützten Züchtung. Zielgebiet dieser Bemühungen sind neben den klinisch und genetisch oft genau beschriebenen monogen vererbten Krankheiten die wirtschaftlich hochattraktiven QTL's. Es handelt sich hierbei um sogenannte multifakto- rielle Merkmale, die gleichzeitig durch mehrere genetische, aber auch äußere Einflußfaktoren gesteuert werden. Es sind im weitesten Sinne Leistungsparameter der Tierzucht. Die vordergründig attraktivsten sind beispielsweise Milchleistung, Fleischmenge, Wachstum und Fertilität. In den ersten 5 Jahren weltweiter systematischer Anwendung der markerunterstützten Züchtung sind die Ergebnisse jedoch eher enttäuschend; die Methode besitzt offensichtlich enge prinzipielle Grenzen und ist sehr aufwendig.

Den seit langem ausgeübten Selektionsstrategien der Nutztierzucht steht seit einigen Jahren eine auf molekularbiologischen Methoden beruhende Alternative gegenüber, die man Marker-unterstützte Selektion nennt (im englischen Sprachgebrauch: marker-assisted-selection oder abgekürzt MAS) . Es handelt sich hierbei im Kern um die Anwendung der Kopplungsstrategie mit polymorphen DNA- Markern. Letztere hat sich bei der Erforschung monogener Erbkrankheiten des Menschen als sehr erfolgreich erwiesen. Die Strategie ist systematisch weltweit als eine erste Stufe des Human Genome Programms (HGP) angewendet worden. Ihre theoretische Grundlage sind die Betrachtungen von Botstein et al., 1980. Die enormen Anstrengungen des HGP lieferten schließlich die technische und intellektuelle Basis dafür, dass für die wichtigen Nutztierspezies Rind, Schwein und Schaf eine Markerkarte erstellt werden konnte. Im Rindergenom stehen nun rund 2000 lokalisierte polymorphe Marker zur Verfügung. Im Schweinegenom sind es mehr als 1200. Es handelt sich dabei meist um Mikrosatelliten. Mit einem Sortiment von 300 dieser Marker, die möglichst gleichmäßig über das ganze Genom verteilt sind, besitzt man ein Instrument, welches praktisch jedes monogen vererbte und phänotypisch klar beschriebene Merkmal zu lokalisieren gestattet. Dafür müssen jedoch mit diesem Markersatz mehrere hundert betroffene Tiere typisiert werden, das heißt es müssen für die Tiere alle 300 Markergenloci analysiert werden. Mit Hilfe aufwendiger Berechnungen findet man in aller Regel den Ort des Verursachergens im Genom. Ein typisches Ergebnis solcher Berechnungen ist, dass man den Genort auf 20-25 cM einengt, was 20-25 Megabasen entspricht. Als ein eingeschränkt praktisch verwertbares Ergebnis findet man zudem, dass innerhalb einer Familie bestimmte Allele der am nächsten gelegenen Markerloci zusammen mit dem interessanten Phänotyp vererbt werden. In einer anderen Familie kann es ein anderes Allel des gleichen Markergenortes sein. Innerhalb einer Familie kann man diesen Umstand jedoch diagnostisch nutzen, da ein solches Allel in dieser Familie genetische Vorhersagen über den zu erwartenden Phänotyp gestattet. Eine solche Aussage ist jedoch durch das Phänomen der Rekombination zwischen zwei Genorten mit einer erheblichen Unsicherheit behaftet. Diese Unsicherheit kann man verringern, indem man Marker sucht, die näher beim Verursachergen liegen. In aller Regel wird man auf dieser Suche schließlich zu Markergenorten gelangen, die unmittelbar am oder im Gen selbst liegen. Zwischen diesen Markergenorten und dem Gen geschehen nahezu keine Rekombinationen mehr. Lässt sich der interessierende Gendefekt auf einen Vorfahren zurückverfolgen, ist also dieser Defekt bei einem einzigen Vorfahren passiert und hat dieser sich von dort aus auf eine bestimmte Population verbreitet, so wird man die am und im Gen beobachtete Markerallelkombination in identischer Form bei allen betroffenen Genen dieser Population finden. Man spricht dann davon, dass sich die Marker im Kopplungsungleichgewicht mit dem Verursachergen befinden. Eine solche Markerallelkombination ist von außerordentlicher praktischer Bedeutung, denn über Familiengrenzen hinweg gestattet sie die erwünschte Voraussage des Phänotyps. Von großem Nachteil ist hierbei aber, dass der Weg von der 25 mB großen Kopplungsgruppe bis hin zum Gen sehr mühseliger ist und unter Umständen Jahre dauern kann, da 25 Millionen Basenpaare studiert werden müssen.

Die Strategie ist auch auf polygen vererbte Merkmale anwendbar, wie z.B. auf die sogenannten QTL's der Nutztierzucht. Die Situation ist nun aber wesentlich schwieriger, nicht nur weil man es mit mehreren Verursachergenen zu tun hat, bei denen man den Weg zum Gen bzw. Kopplungsungleichgewicht gehen muss, sondern auch weil die einzelnen Gene einen ganz unterschiedlich starken Einfluß auf den Phänotyp haben und weil dem auf die Genetik entfal- lenden Einfluß auf den Phänotyp ein starker Umwelteinfluß gegenübersteht. So ist das bisherige Ergebnis einiger gezwungenermaßen sehr groß angelegter TL-Studien mit jeweils oft mehreren Tausend Tieren die Identifikation mehrerer Kopplungsgruppen, die meist 30-40 cM groß sind. Diagnostischen, aber damit auch züchterischen Wert besitzen sie im Grunde nur in Familien. Das bedeutet eine e- norme Einschränkung der MAS. Das letztendliche Ziel all dieser molekularbiologischen Anstrengungen, nämlich die Isolierung der für die QTL' s verantwortlichen Gene ist von dieser Basis aus praktisch nicht zu erreichen.

Nachdem in zahlreichen Arbeitsgruppen experimentell belegt werden konnte, dass man mit der Kopplungsstrategie nicht nur analog zur Arbeit im menschlichen Genom monogen vererbte Krankheitsgene lokalisieren und dadurch für die Tierzucht verwertbar machen konnte, sondern auch die genetisch komplexen QTL's im Genom lokalisieren konnte, wurden die großen internationalen Züchtungsprogramme auf die zu erwartenden Ergebnisse der molekularen QTL-Suche eingestellt. Hierbei_wurde fast ausschließlich die gegenüber der konventionellen Strategie extrem verkürzte Zeitspanne bis zum Einsatz des als getestet anzusehenden Bullen in den Mittelpunkt der züchterischen Betrachtung gestellt (M. Georges, (1998) Mapping genes underlying pro- duction traits in livestock. P. 77-101. In Animal Breed- ing: Technology for the 21st Century. Ed. J. Clark, har- wood Academic Publishers) .

Die aufgrund der hohen Anforderungen an die Zahl der zu untersuchenden Tiere zwangsläufig sehr großen QTL- Suchprogramme werden nahezu alle nach einem Schema durch- geführt, das man Granddaughterdesign (GDD) nennt (Geldermann, Theor. Appl. Genet., 46, 319-330 (1975); J. L. Weller, Y. Kashy, M. Soller; J. Dairy Sei., 73, 2525-2537 (1990) ) .

Hierbei werden nur die beiden ersten Generationen genoty- pisiert, während die Phänotypisierung in der dritten Generation stattfindet.

An einem Beispiel aus der Rinderzucht soll im Folgenden der Umfang einer solchen Untersuchung illustriert werden: Eine typische Zahl für die zu untersuchenden Tiere ist hierbei: 10-20 Bullen, 50-100 Söhne von jedem dieser Bullen sowie 50-100 Töchter pro Sohn.

Das bedeutet, dass bis zu 250.000 Genotypanalysen hierbei erforderlich.

Die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ist zum ersten Mal von M. Georges gezeigt worden (M. Georges, D. Nielsen, M. Makinnon; Genetics, 139, 907-920 (1995) . Die Studie wurde bei Genmark (USA) mit 1.518 Bullen in 14 Holstein-Familien mit 159 Markern durchgeführt.

In Tabelle 1 sind die 1998 in Arbeit befindlichen GDD- Studien aufgeführt. Tabelle 1

Da die meisten Studien von kommerziellen Einrichtungen durchgeführt werden, ist davon auszugehen, dass viele Ergebnisse nicht veröffentlicht werden. Grundsätzlich besteht für die identifizierten QTL' s ein Problem: Die meisten von ihnen sind nicht genauer als ca . 30 - 40 cM im Genom zu lokalisieren; prinzipiell ist mit den gegen- wärtigen Suchstrategien nicht mehr als ca. 20 cM zu erreichen. Wobei die Unsicherheit der Lokalisierung umso größer ist je geringer die Heretabilität ist. So kommt es, dass trotz der gewaltigen Anstrengungen nur verhältnismäßig wenige QTL's als sicher molekular erfasst gelten. Im Jahre 1998 konnten 14 QTL's, belegt durch meist mehrere einander bestätigende Publikationen, als molekularbiologisch abgesichert gelten.

Entsprechend wird inzwischen allgemein als Dilemma erkannt, dass wegen der geringen Auflösung und Genauigkeit der jetzt verfügbaren Strategien zur QTL-Suche, das erwünschte effektive MAS-Verfahren definitiv nicht in Sicht ist. Diese in zahlreichen Diskussionen des letzten Jahres auf höchstem wissenschaftlichem Niveau zum Ausdruck gebrachte Erkenntnis formuliert Michel Georges in seinem im August 1998 in Warschau gehaltenen Vortrag mit den Worten:

„We are of the opinion tha t present mapping resolution is inadequa te for the effective marker selection (MAS) and defini tely insufficient for posi tional candida te cloning. Therefore, novel approaches have to be developed to re- fine the QTL map position . "

Die momentane Situation ist vor allem deswegen so unbefriedigend, da gerade ein besonders großes Interesse besteht, die zahlreichen Merkmale mit niedriger Heretabilität mit MAS zu bearbeiten. Ein zusätzliches experimentelles Problem ist hierbei auch noch die Tatsache, dass eine Kopplungsgruppe mit einem Merkmal niedriger Erblichkeit durch die vielfältigen und schwerwiegenden exogenen Ein- flüsse sehr viel schwerer aufzudecken ist als eines mit hoher Erblichkeit.

Von besonderem Interesse wäre also eine Methode, die dieses prinzipielle Hindernis der zu ungenau lokalisierbaren Kopplungsgruppe überwindet. Dadurch könnte auch in einem ganz anderen qualitativen Sinne die molekulare, moderne Nutztierzucht verändert werden, da dann nämlich auch die besonders interessierenden QTL's bearbeitet werden könnten.

Ein Weg das Problem zu lösen führt über das Kopplungsungleichgewicht. Findet man nämlich Marker, die im Kopplungsungleichgewicht zu den jeweiligen Verursachergenen stehen, so wird die Vorhersagesicherheit erheblich größer wegen der fehlenden Rekombination und man kann ü- ber die Familiengrenzen hinaus im Bereich großer Populationen im oben geschilderten Sinne erfolgreich arbeiten (H. Bovenhuis, R. J. Spelman, 49th Annual Meeting Europe- an Association for Animal Production, August 24-27 (1998), Warsaw, Poland) .

Die gleiche Problematik findet sich im menschlichen Genom bei der Suche nach Verursachergenen für polygen vererbte Krankheiten. Da Defekte in mehreren, oft in sehr vielen Genen den Phänotyp der Krankheit erzeugen, sind diese so häufig, dass man sie Volkskrankheiten nennt. Obwohl mit Milliardenaufwand seit einigen Jahren die Kopplungsstrategie auf die Probleme von Diabetes, Herzkreislauferkrankungen oder erblicher Fettleibigkeit angewandt wird, gibt es noch bei keiner dieser Krankheiten einen umfassenden Erfolg. N. Risch, K. Merikangas; Science, 273, 1516-1517 (1996) haben diesen Umstand aus der Sicht des Biostatistikers untersucht und sind zu dem Ergebnis gekommen, dass man gewaltige Zahlen von Patienten und Teile ihrer Familien mit dichten Markerkarten untersuchen müsste, um den gewünschten Effekt zu bekommen. Diese Untersuchungen wären so umfangreich, dass man auch bei noch so großer finanzieller Anstrengung das Ziel nicht erreichen würde. Die Bemühungen sind jenseits der finanziellen Betrachtung auch deswegen zum Scheitern verurteilt, weil das notwendige, extrem sorgfältige Katalogisieren der phänotypi- schen Heterogenität bei den großen Probandenzahlen kaum zu bewältigen ist. Die Autoren ziehen in ihrer Situationsbeschreibung, die mit dem Titel „Future of Genetic Studies of Complex Human Diseases" überschrieben ist, den Schluß: Entweder die Technik der Genotypisierung muss einen Qualitätssprung machen oder man muss eine Strategie finden, die direkt die Verursachergene oder die entsprechenden Kopplungsungleichgewichte aufzufinden gestattet.

Ein weiteres Verfahren stellt die kürzlich mehrfach beschriebene Methode des Genomic-Mismatch-Scanning (GMS) dar. Mit Hilfe dieses Konzeptes kann man wie mit der Kopplungsstrategie Regionen in einem Genom lokalisieren, die für bestimmte genau umschriebene genetische Merkmale verantwortliche Gene enthalten. Die Suchoperation muss dabei in einer Population stattfinden, bei der das interessierende Merkmal, z.B. eine genetische Erkrankung, auf einen einzigen Vorfahren zurückzuführen ist. Das entsprechende Verursachergen und seine Umgebung im Genom bei allen Betroffenen der betrachteten Population stammen damit von diesem einen Vorfahren und sind in allen Sequenzeinzelheiten miteinander identisch. Im Angelsächsischen hat man dafür den Fachausdruck „Identity by Descent" (IBD) geprägt.

Mit der GMS-Methode werden Kopplungsgruppen aber auch Kopplungsungleichgewichte isoliert. Dafür wurden zwei unterschiedliche Wege beschritten. Beim ersten Weg definiert man einen interessierenden Phänotyp und studiert diesen mit Hilfe von Paaren, von denen beide Individuen aus einer Familie stammen und einen eindeutig beschriebenen Verwandtschaftsgrad haben, wobei die einzelnen Paare aus jeweils genetisch heterogenen Populationen oder Familien stammen können.

Das Beschreiten des zweiten Weges setzt die Annahme voraus, dass in einer großen Population die interessierenden phänotypischen Eigenschaften auf dieselben Vorfahren zurückgehen. Hier bildet man Paarungen, die aus nicht miteinander verwandten Individuen bestehen.

Auf dem ersten Wege isoliert man Kopplungsgruppen, auf dem zweiten Wege genomische Regionen, die ein Kopplungsungleichgewicht zwischen dem interessierenden Gen und einem aus mehreren polymorphen Genorten bestehenden Mikrohaplotyp darstellen.

Bis auf eine Ausnahme wurden bisher GMS-Protokolle nur auf monogen vererbte Erkrankungen angewendet. Um die Ausbeute und Zuverlässigkeit der Isolation von IBD-Fragmenten zu studieren, wurde eine Reihe von Mikro- satellitenloci in einem Experiment der GMS-Prozedur unterworfen. Damit wurde im Prinzip schon das Arbeiten an polygen vererbten Merkmalen simuliert. Alle bisher publizierten Arbeiten enden jedoch mit der Lokalisierung bzw. der Bestätigung einer schon mit anderen Methoden vorgenommenen Lokalisierung der isolierten IBD's, also der GMS-Produkte.

Die Basis für alle diese GMS-Arbeiten stellt die Publikation von Nelson aus dem Jahre 1993 dar. Hier wurde zum _*

/ ersten Male von einer erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls auf die Lokalisierung von Genen am Beispiel der Hefe berichtet.

Die erste erfolgreiche Anwendung beim Menschen wurde 1997 veröffentlicht. F. Mirzayans ) F. Mirzayans, A. J. Mears, W. Guo, W. G. Pearce, M. A. Walter; Am. J. Hum. Genet, 61, 439-448 (1997)) identifizierte die chromosomale Region, die den Genort für die Iridogoniodysgenesis (IGDA) beherbergen sollte. Der Befund wurde parallel mit der Kopplungsanalyse und der GMS erarbeitet. Bei der Krankheit handelt es sich um eine sehr seltene autosomal dominante Augenkrankheit. Für die Kopplungsanalyse untersuchte man eine Familie mit 80 Mitgliedern, von denen 40 erkrankt sind. Das ganze Genom ist dabei mit 300 Mikrosa- telliten untersucht worden (F. Mirzayans, W. G. Pearce, I. M. MacDonald, M. A. Walter; Am J. Hum. Genet., 57 (3), 539-548 (1995)). Danach war das IGDA-Gen auf 6p lokalisiert. In einer nächsten Lokalisierungsrunde verwendete man 29 Mikrosatelliten-Marker des Chromosom 6. Der Genort wurde damit auf 6p25 weiter eingegrenzt.

Mit einem im Wesentlichen gegenüber dem von Nelson unveränderten GMS-Protokoll isolierte man IBD-Fragmente von zwei Cousins 5. Grades aus der erwähnten Familie. Die Durchführung einer PCR mit den entsprechenden Primern zeigte, dass von den 7 erhaltenen positiven PCR-Signalen (7 Mikrosatelliten) 5 aus einer chromosomalen Region stammten, die auch mit der konventionellen Kopplungsanalyse eine signifikante Kopplung aufwiesen. Die hintereinander liegenden IBD-Fragmente mit positivem PCR-Signal und signifikanter Kopplung erstreckten sich über einen Bereich von 6,9 cM.

Als interne Kontrolle des GMS-Experimentes wurde parallel zu Chromosom 6 das Chromosom 12 untersucht. Letzteres ergab kein positives Signal.

Das entscheidende Motiv für diese erfolgreiche Arbeit von Mirzayans et al. war der Versuch, GMS als ein Verfahren zu etablieren, mit dessen Hilfe der Genort einer seltenen Erkrankung ohne Durchführung und Auswertung tausender von Mikrosatelliten-Typisierungen zu lokalisieren ist.

Entscheidende Voraussetzung für solch ein erfolgreiches Experiment an einem einzelnen Paar von Indexpersonen ist die Auswahl des Verwandtschaftsgrades der beiden Individuen.

Sind die beiden Individuen zu nah verwandt, muss man mit sehr großen IBD's rechnen, im Grenzfall (s. u.) 80% eines Chromosoms oder mehr. Daneben wird es IBD's geben, die nichts mit dem interessierenden Merkmal zu tun haben. Ist dagegen der Verwandtschaftsgrad zu gering, kann der IBD-Bereich wegen seiner geringen Größe mit dem Lokalisierungsinstrument nicht mehr entdeckt werden, weil dieses eine zu geringe Auflösung hat. Der von Mirzayans et al. verwendete Markersatz besitzt eine Auflösung von 10 cM. Das zeigt die enorme Bedeutung des Lokalisierungsinstruments im GMS-Protokoll.

Die Grenzen des beschriebenen Verfahrens sollen im Folgenden diskutiert werden.

Bei der Isolierung von IBD' s treten falsch-negative und falsch-positive Resultate auf. Allgemein werden die falsch negativen Resultate nicht diskutiert, wobei ihr Auftreten jedoch nicht überraschend ist. Nach dem ursprünglichen Protokoll setzt man 5 μg DNA jedes Indexindividuums ein. Obwohl Mirzayans et al. die Einsatzmenge auf 100 μg erhöhten, wird auch bei einem Reaktionsansatz in dieser Größe die Ausbeute vermutlich nicht mehr als 100 ng betragen. Dabei handelt es sich aber um eine Population von ca. 500-1000 verschiedenen Fragmenten, so dass man nicht sicher sein kann, dass alle amplifiziert werden können.

Darüber hinaus kann das Reannealing sequenzabhängig unvollkommen sein und so ein mutationsbedingtes Mismatch vortäuschen.

Für falsch-negative Ergebnisse gibt es einige Ursachen. So weiß man, dass Mut S keine C-C-Mismatches erkennt, und es ist bekannt, dass Mut S zur Erkennung eines Mismatches ein methyliertes GATC-Motiv in dessen Nachbarschaft benötigt. Letzteres ist natürlich nicht immer gegeben. Ebenso ist die Funktion von Mut L,H nicht ganz geklärt.

Als Ergebnis dieses Komplexes theoretischer und experimenteller Arbeiten, die letztlich in die Arbeit von Mirzayans einmünden, ist festzuhalten, dass ein monogenes, erbliches Merkmal in einem einzigen GMS-Experiment im menschlichen Genom zu lokalisieren ist. Die Ausdehnung der nachgewiesenen Kopplungsgruppe ist dabei 6, 9 cM. Die Markerkarte hat eine Auflösung von 10 cM und es steht eine Index-Familie zur Verfügung, welche die Analyse von Cousins 5. Grades zulässt.

Nachteilig ist jedoch, dass das Verfahren in erheblichem Maße falsch-positive und falsch-negative Signale zeigt, die offensichtlich bei der im zur Verfügung stehenden GMS-Protokoll vorgegebenen Enzymausstattung und den vorgeschlagenen Anreicherungsschritten unvermeidlich sind. Die Anwendung der bisher beschriebenen Arbeitsvorschriften auf multifaktorielle bzw. auf polygen vererbte Merkmale erscheint deshalb wenig vielversprechend.

Die zweite mit der GMS verfolgte genetische Zielrichtung ist der Versuch direkt Bereiche zu isolieren, die Kopplungsungleichgewicht zeigen. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist die Arbeit von Vivian G. Cheung (1998). Hier wird das die Krankheit verursachende Gen des autosomal- rezessiv vererbten congenitalen Hyperinsulinismus lokalisiert. Die Krankheit kommt mit einer vergleichsweise hohen Frequenz bei den Ashkenazi Juden vor. Deswegen kann man in dieser Bevölkerungsgruppe von einem Foundereffekt ausgehen. Das Gen kodiert für den Sulfonylharnstoffrezep- tor. Es ist mit Hilfe konventioneller Methoden auf dem Chromosom llpl5.1 lokalisiert worden.

Es wurden insgesamt 8 betroffene Personen aus 4 Familien in zwei unterschiedlichen Ansätzen untersucht. Im ersten wurde aus Geschwistern einer Familie Paare gebildet, im zweiten geschah die Paarbildung zwischen Betroffenen aus unterschiedlichen Familien. Die Lokalisierung der IBD's wurde auf einem Glaschip vorgenommen, der nach chromoso- maler Lokalisierung geordnete inter-Alu-Banden von YAC- und PAC Banken von Chromosom 11 enthielt.

Bei den Geschwistern erhielt man so eine IBD-Strecke, die ca. 80% des Chromosom 11 enthielt, wobei die theoretische Erwartung 75% beträgt. Die Auflösung der Bank betrug außerhalb des bereits vorher bekannten Genortes des SUR1- Gens 2 cM, in der Gegend von llpl5.1 war sie ca. 0,25 cM. Es wurden die Hybridisierungsdaten der aus 9 unterschiedlichen Paarungen unverwandter Personen gezeigt. Die Signale erstrecken sich über rund 2,5 cM mit unterschiedlichen Ausdehnungen bei den einzelnen Paarungen. Dagegen besitzen 8 Paarungen ein Signal bei einem Klon, in den beiden benachbarten Klonen finden sich jeweils Signale von 7 Paarungen. Daraus leitet man im günstigsten statistischen Falle ein Lokalisierungsgenauigkeit von 500 bp ab. Bei 4 Paarungen findet man einige positive Signale völlig außerhalb der SURl-Region.

Das wichtigste Ergebnis im Zusammenhang mit dem vorliegenden Projekt ist die Erkenntnis, dass das Kartieren von Genorten über Kopplungsungleichgewicht mit GMS möglich ist. V. Cheung et al. (V. Cheung, J. P. Gre'gg, K. J. Go- golin-Ewns, J. Bandong, C. A. Stanley, L. baker, M. J. Higgins, N. J. Nowak, T. B. Shows, W. J. Ewens, S. F. Nelson, R. S. Spielman; Nature Genetics, 18, 3, 225-230 (1998b)) räumen ein, dass ohne die vorher bekannte Lokalisation des Gens einige Paarungen mehr hätten untersucht werden müssen, um statistisch völlig abgesicherte Ergebnisse zu erhalten. Das Ermitteln von Kopplungsungleichgewicht ist überaus bedeutsam. Die bisher mit Hilfe der Kopplungsstrategie identifizierten QTL' s sind häufig nicht brauchbar, weil die mit den interessierenden Merkmalen gekoppelten Mar- ker-Loci eben nur Kopplung und keine Assoziation zeigen. Das bedeutet, dass man sie nur für eine indirekte Genanalyse benutzen kann. Das heißt natürlich auch, dass sie für einen umfassenden Gebrauch nicht geeignet sind. Bis man aber zu assoziierten Haplotypen vorgedrungen ist, wird, wie man von den entsprechenden Problemen aus der Humangenetik weiß, sehr lange dauern. Es ist zu vermuten, dass es in vielen Fällen unmöglich sein wird, wenn man weiterhin die bisher bekannten Strategien nutzt (Risch et al., 1996).

In V. Cheungs Arbeit wird in besonderem Maße klar, welch entscheidende Rolle die schnelle und genaue Lokalisierung spielt und dass dafür augenblicklich der geeignetste Ansatz die Chip-Hybridisierung einer guten genomischen Bank mit hoher Auflösung ist.

Leider lassen auch die hier beschriebenen Verfahren ein wesentliches Problem ungelöst, nämlich das der verfügbaren DNA-Menge. Alle theoretischen und praktischen Betrachtungen der Ausbeute am Ende einer GMS-Prozedur erlauben keinen allzu großen Optimismus; man wird sich immer an der Grenze der Nachweisbarkeit der gegenwärtig zur Verfügung stehenden Amplifikationsstrategien bewegen, wie weiter unten mit einigen Zahlen belegt wird.

Es gibt in der internationalen wissenschaftlichen Gemeinschaft keinen Zweifel daran, dass eine in allen Punkten befriedigende GMS oder ähnliche Genom-Scanning-Methode bei der Aufklärung komplexer genetischer Merkmale die jetzige Kopplungsstrategie ablösen wird. In ihrer modellhaft angelegten Studie prüfte V.Cheung (V. Cheung; Geno- mics, 47, 1-6 (1998a)) eine Reihe von Parametern, die den Erfolg der Anwendung einer GMS-Prozedur auf polygene Merkmale charakterisieren könnten.

In der Arbeit sind insgesamt 25 getrennte GMS-Experimente an 14 unterschiedlichen Großeltern-Enkelpaaren aus CEPH- Familien durchgeführt worden. Dabei sind die einzelnen Paare mit bis zu 33 verschiedenen Mikrosatelliten-Loci untersucht worden. Die Ergebnisse sind in Wiederholungsexperimenten reproduziert worden.

Der hauptsächlichste Parameter ist der Anreicherungsfaktor des IBD-Allels. Jeder Genort weist ein Allel auf, welches entweder nur von dem väterlichen Großvater oder von der väterlichen Großmutter ererbt worden sein kann. Dieses Allel ist das jeweilige IBD-Fragment oder IBD- Allel. An zwei Positionen des GMS-Experimentes wird eine quantitative Messung (Fläche unter dem Fluoreszenzsignal- Peak des Mikrosatellitenlocus in der Messung mit einem automatischen Sequenziergerät) durchgeführt; zum einen an der Gesamtpopulation der Heterohybride nach der Restrik- tions- und Exo III-Verdauung der Homohybride und zum anderen an den verbliebenen Heterohybriden nach Abtrennung der die Fehlpaarungen-enthaltenden Heterohybridfraktion.

Man definiert dann den gesuchten Anreicherungsfaktor wie folgt: Den Nenner dieses Verhältniswertes bildet das Verhältnis aus IBD-Allel zum Nicht-IBD-Allel in der Gesamtpopulation der Heterohybride; den Zähler bildet das ent- sprechende Verhältnis in der komplett matchenden GMS- Fraktion.

Man unterscheidet drei Gruppen von Anreicherungsvermögen, nämlich > 10, 2-10 und < 2. Dies über alle verwendeten Mikrosatelliten und alle Genotypisierungen (122) betrachtet, ergab 29% hohe Anreicherung, 45% mittlere Anreicherung und 26% niedrige Anreicherung. Bezieht man die Beobachtung dagegen auf die einzelnen verwendeten Genorte (33) , so erkennt man unveränderlich in jedem Experiment bei 7 Markern (21%) hohe Anreicherung, bei 4 Markern (12%) mittlere Anreicherung und bei 7 Markern (21%) niedrige Anreicherung. Bei 9 Markern erhielt man im Laufe der wiederholten Experimente variable Anreicherung, d.h. niedrige bis hohe. Bei 6 Markern erhielt man gar keine Anreicherung.

Offensichtlich ist die Gesamtprozedur in hohem Maße reproduzierbar. Die Anreicherung, also der Erfolg der GMS- Prozedur ist sequenz- und damit genortabhängig, da rund 18% der verwendeten Markerloci keine Anreicherung zeigen. Daraus ist allerdings noch keine allgemeingültige Effizienzbewertung des Verfahrens abzuleiten, da ausschließlich Pst I-Fragmente untersucht wurden.

Die Auswahl der Restriktionsspaltung stellt ein Optimierungsproblem dar, welches von mindestens zwei Einflußgrößen abhängig ist. Jedes DNA-Molekül, das im Laufe der GMS entfernt werden soll, muss mindestens ein GATC-Motiv tragen. Je kleiner die Fragmente sind, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass kein GATC vorhanden ist. Umgekehrt finden in der FPERT-Hybridisierung komplementäre DNA-Stränge umso schlechter zueinander je mehr repetitive Fragmente sie enthalten. Die Wahrscheinlichkeit dafür steigt mit der Fragmentlänge. Fragmente >20 kb werden offensichtlich schon während des Reannealings abgebaut.

Überhaupt ist mit den gegenwärtigen Protokollen die Ausbeute der verschiedenen Präparationsstufen im Vergleich zum ursprünglichen Hefeexperiment unbefriedigend.

Dies ist nicht überraschend, weil das Hefegenom 240 mal weniger komplex als das menschliche ist, da es viel weniger repetitive Sequenzen enthält und es weit mehr natürliche Sequenzpolymorphismen trägt als das menschliche Genom.

Das alles führt dazu, dass die FPERT-Stufe weniger effizient ist. Während man bei einem GMS-Experiment an Hefe rund 50% der eingesetzten DNA nach der FPERT als Doppelstrangmoleküle wiederfindet (jeweils ca. 50% Heterohybride und Homohybride), sind es beim Menschen nur 10%. Das bedeutet, in einem typischen Experiment gewinnt man ca. 1 μg DNA. Nach Verdauung der Homohybride verbleiben ca. 500 ng. Daraus werden die IBD-Fragmente abgetrennt und es kann sich dabei entsprechend nur noch um einige Nanogramm handeln, umso weniger je schärfer die GMS selektiert. Auch die vorgeschlagene und in einem Fall durchgeführte PCR-Amplifikation über inter-Alu-Motive befindet sich damit im problematischen Grenzbereich von 1 ng pro Fragment (Nelson et al. , 1989) .

Die bis heute verwendeten Verfahren (GMS) zur Isolierung von IBD (Identity by Descent) -Bereichen des Erbmaterials weisen also eine Reihe von prinzipiellen Schwierigkeiten auf, die insbesondere die ihrer Anwendung auf komplexe genetische Merkmale entgegenstehen und im Folgenden noch einmal aufgeführt sind:

• Die zur physikalischen Abtrennung der Homohybride erforderliche Methylierung der DNA des einen Hybridisie- rungspartners ist nur schwer steuerbar, weil wesentliche Teile jedes Genoms methyliert sind. Das kann zu erheblichen Ausbeuteverlusten beim Restriktionsverdau der nichtmethylierten DNA führen.

• Es ist nicht klar, inwieweit der Restriktionsverdau der methylierten Fraktion vollständig ist.

• Der Mut S, H, L- Komplex fordert für seine Reaktion der Erkennung und des Schnitts eine Methylierung in Nachbarschaft eines GATC-Sequenzmotivs.

• Mut S erkennt nicht alle möglichen Mismatch- Kombinationen.

• Der Enzymkomplex fordert die Nachbarschaft eines GATC- Motivs.

• An zwei Stellen des beschriebenen GMS-Verfahrens muss einzelsträngige DNA mit BNCD isoliert werden, womit verlustreiche Reinigungsschritte verbunden sind.

• Die größte Beschränkung stellt die geringe Ausbeute der gesamten Prozedur dar. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Nachteile des Stands der Technik überwindet.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens gelöst, das der Isolation von IBD- Fragmenten bei polygen vererbten Merkmalen dient. Das Verfahren weist Verbesserungen gegenüber allen vorher beschriebenen Protokollen auf und kann u. a. zur Lösung der oben geschilderten Probleme in der Tierzucht beitragen. Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt eine dem GMS- Konzept ähnelnde Basis zugrunde.

Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens gegeben.

Die DNA von zwei Indexindividuen wird extrahiert und gereinigt. Beide DNA-Fraktionen werden mit dem gleichen Restriktionsenzym verdaut. Im weiter unten in Figur 2 beispielhaft erörterten Fall handelt es sich um das Restriktionsenzym Eco RI. Die restringierte DNA von Individuum 1 wird mit einem Linker versehen, der an beiden Seiten Fragmentenden ohne Überhang erzeugt (s. Fig. 2). Die restringierte DNA von Individuum 2 wird ebenfalls mit einem Linker versehen, der an beiden Seiten Fragmentenden ohne Überhang erzeugt (s. Fig. 2).

Für beide Individuen sind die Linker so gestaltet, dass für Heterohybride aus der DNA beider Individuen keine Selbsligation zur Ringbildung möglich ist, dass sie aber Ringbildung mit entsprechend geschnittenem Vektor zulassen.

Die DNA beider Individuen wird nun denaturiert und die denaturierte DNA beider Individuen gemischt. Die Mischung wird der sogenannten FPERT-Reaktion zur Rückbildung dop- pelsträngiger DNA ausgesetzt. Am Ende dieser Reaktion besteht die Reaktionsmischung aus drei Molekülpopulationen, nämlich aus den zurückgebildeten doppelsträngigen DNA- Molekülen von Individuum 1 (Homohybride) , den doppelsträngigen DNA-Molekülen von Individuum 2 (Homohybride) und den doppelsträngigen DNA-Molekülen, die aus einem von Individuum 1 herrührenden DNA-Strang und einem von Individuum 2 herrührenden DNA-Strang bestehen (Hetereo- hybride) .

Ein geeigneter Plasmidvektor wird einem Doppelverdau z.B. mit den Restriktionsenzymen Nco I und dem Restriktionsenzym Nsp I ausgesetzt. Dabei entstehen auf dem gleichen Strang in entgegengesetzter Orientierung überstehende GTAC-Enden (s. Fig. 2). Die Mischung der neu entstandenen Doppelstrangmoleküle wird mit der geschnittenen Vektor- DNA zusammengegeben. Hierbei können nur die Heterohybride mit den Vektormolekülen einen Ringschluß bilden. Anschließend werden die DNA-Fragmente mit einer Ligase- Reaktion kovalent verknüpft.

Nach dieser Reaktion sind also drei Molekülpopulationen entstanden. Es handelt sich dabei um die Homohybride der beiden Individuen 1 und 2 und die Heterohybriden, die aus einem Strang von Individuum 1 und dem komplentären Strang von Individuum 2 bestehen. Die Heterohybride ihrerseits bestehen aus der sehr großen Gruppe der Moleküle, die einzelne Fehlpaarungen aufweisen und der wesentlich kleineren Molekülgruppe, die keinerlei Fehlpaarungen haben. Letztere Gruppe enthält die interessierenden Fragmente, nämlich die IBD-Bereiche.

Mit Hilfe einer CEL I-Reaktion werden alle Basenfehlpaa- rungen erkannt und an einem Strang aufgeschnitten. Die geöffneten, ungepaarten Bereiche der Fehlpaarungen werden dann mit Hilfe eines Exonuklease III Schrittes abgebaut. Ohne weitere Vorreinigung wird der gesamte Ansatz zur Transformation geeigneter Bakterien vorbereitet und die transformierten Bakterien werden in entsprechendem Selektionsmedium ausplattiert.

Die DNA der einzelnen Plasmidpräparationen stellt jeweils ein Fragment dar, welches „identical by descent" (IBD) ist.

Die erhaltene DNA wird auf einem DNA-Chip lokalisiert.

Eine verhältnismäßig einfache Anwendung ist die Identifizierung und die Isolierung des Gens für die ererbte Af- terlosigkeit beim Hausschwein. Mit dem oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren erhält man mehrere IBD- Fragmente. Diese Fragmente lassen sich mit dem DNA-Chip lokalisieren. Mit hoher Wahrscheinlickeit ergeben sich dabei mehrere Genorte. Diese werden auf ihre Aussagefähigkeit hin geprüft mit betroffenen und nicht betroffenen Tieren. Die informativen Orte können für diagnostische und weitergehende wissenschaftliche Zwecke genutzt werden.

Fig. la und 1b zeigen schematisch den Gang des Genomic- Mismatch-Scanning-Verfahrens .

Fig. 2a und 2 b stellen das erfindungsgemäße Verfahren dar.

In Fig. la stellt 1 das Chromosom eines Vorfahren mit einigen Zwischengenartionen dar, auf welchem eine mit einer Krankheit assoziierte Mutation (X) auftrat. 2 sind die Chromosomen der heutigen nicht verwandten Individuen mit derselben Krankheit. 3 stellt die Region dar die „ident- cal by decent" (IBD) ist und den Krankheitsort einschließt. In Fig. lb stellt 11 die Pstl- Fragemente des ersten Individuums und 12 die methylierten Pstl-Fragmente des zweiten Individuums dar. 13 sind dann die unmethy- lierten, 14 die hemimethylierten und 15 die methylierten Homohybride. 16 sind schließlich die hemimethylierten Heterohybride und 17 die IBD-Fragmente. Dabei werden die Rekationsschritte A, B, C und D durchgeführt, wobei A eine Denaturierung und ein Reannealing ist, in B die Homohybride entfernt werden, mittels methylierungssensitiven Restriktionsenzymen / Exo III-Verdau, C Depletierung der mismatch enthaltenden Heterohybride mit E. coli mismatch repair Proteinen / Exo III-Verdau und D Mappen der Genom- lokation der GMS selektierten IBD-Fragmente auf einem Microarray.

In den Figuren 2a und 2b ist das erfindungsgemäße Verfahren schematische dargestellt. 21 bedeutet dabei das erste Idividuuum, 23 das zweite Individuuum, 22 das erste Individuum + Linker und 24 das zweite Individuum + Linker. 30 bezeichnet den Vektor. Die Verfahrensschritte sind mit El bis E4 bezeichnet und haben die folgende Bedeutung: El ist der Eco Rl-Verdau, E2 ist das Naturieren, E3 ist das Mischen des ersten und des zweiten Individuums mit Renaturierung (FPERT) und E4 bezeichnet den Ringschluss.

Überraschender Weise wurde also gefunden, dass die Durchführung eines frühen Klonierungsschritts im erfindungsgemäßen Verfahren eine mengenunabhängige Gewinnung der DNA- Fragmente ermöglicht und weiterhin den in anderen Verfahren durchgeführten Methylierungsschritt ersetzt. Außerdem wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Verwendung eines Pflanzenenzym eine weitaus höhere Spezifität des Verfahrens gegenüber solchen bewirkt, bei denen der Mut S, H,L-Komplex verwendet wird.

Die Aufgabe der Erfindung wird also durch ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht gelöst, wobei man bei nicht miteinander verwandten sowie bei miteinander verwandten Individuen Bereiche des Genoms isoliert, welche Kandidatengenbereiche enthalten, die sich im Kopplungsungleichgewicht mit ihrer engeren DNA-Umgebung befinden.

Bevorzugt ist es, dass man Kandidatengene isoliert, die komplexe genetische, also polygen vererbte Merkmale steuern.

Insbesondere bevorzugt ist es, dass man die mit Restriktionsenzymen geschnittenen DNA-Proben von zwei Indexindi- viduen mit jeweils unterschiedlichen Linkern versieht die an beiden Enden der Restriktionsfragmente Enden ohne Ü- berhang erzeugen und die an Heterohybride aus den einander komplementären, jeweils zu Individuum 1 oder 2 gehörenden Fragmentenden der DNA-Stränge Überhänge bilden, welche die sich am gleichen Strang befinden und deren Sequenz am 5' -Ende 5' CATG 3' und am 3' -Ende 5' CATG 3' ist, man im Folgenden durch Denaturierung der Fragmente eine Mischung erhält, die einzelsträngige DNA-Fragmente von beiden Individuen erhält und man im nächsten Schritt Pufferbedingungen eingestellt werden, welche die Renaturierung von doppelsträngigen DNA-Molekülen zulässt (FPERT-Reaktion) , man drei Molekülpopulationen erhält, von denen die erste die wiederhergestellten Doppelstrangmoleküle (Homohybride) von Individuum 1 darstellt, die zweite die wiederhergestellten Doppelstrangmoleküle (Homohybride) von Individuum 2 und die dritte die Population der zueinander komplementären, jeweils dem einen und dem anderen Individuum zugehörenden Doppelstrangmolekülen (Heterohybride) darstellen, man anschließend Pufferbedingungen einstellt, die einen Ringschluß der entstandenen Moleküle zulassen, man bei der Eco Rl-Verdauung einen geeigneten Klonierungsvektor einem Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen Nco I und Nsp I aussetzt, man anschließend die so behandelte Vektor-DNA mit der Reaktionsmischung aus dem Schritt zuvor mischt, einen Linker mit einer solch spezifischen Konstruktion verwendet , dass nur die Heterohybride den Ringschluß mit den Vektormolekülen vollziehen, man dass mit Hilfe einer Ligase-Reaktion die ringförmig miteinander verknüpften DNA-Fragmente kovalent verbindet, man ringförmige Moleküle erhält, die aus zwei Populationen bestehen, nämlich aus derjenigen mit ein o- der mehr Basenfehlpaarungen und aus derjenigen ohne jede Fehlpaarung, welche die IBD (identity by descent) - Bereiche enthält man nun die Reaktionsmischung unter geeigneten Pufferbedingungen mit dem Enzym CEL I versetzt, wobei CEL I jede Fehlpaarung erkennt und einen der beiden DNA-Stränge an der Position der Fehlpaarung schneidet und anschließend dieser Reaktionsmischung nach Einstellen geeigneter Pufferbedingungen die Nuklease Exo III hinzugefügt und dadurch die durch CEL I- Verdau partiell ein- zelsträngigen Ringe abbaut.

Es ist weiterhin vorteilhaft, dass man diese Reaktionsmischung zur Transformation geeigneter Bakterien einsetzt.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die transformierten Bakterien nach Selektion und Vereinzelung kultiviert und dass die per Plasmidpräparation gewonnenen DNA- Fragmente, welche die IBD-Bereiche enthalten isoliert und im Genom lokalisiert werden.

Es ist weiterhin vorteilhaft, dass man bei Verwendung eines anderen Enzyms als Eco RI Überhänge einer anderen Sequenz erhält, die jedoch die gleiche Orientierung aufweist .

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht, wobei man bei nicht miteinander verwandten sowie bei miteinander verwandten Individuen Bereiche des Genoms isoliert, welche Kandidatengenbereiche enthalten, die sich im Kopplungsungleichgewicht mit ihrer engeren DNA-Umgebung befinden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Kandidatengene isoliert, die komplexe genetische, also polygen vererbte Merkmale steuern.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man a) die mit Restriktionsenzymen geschnittenen DNA- Proben von zwei Indexindividuen mit jeweils unterschiedlichen Linkern versieht die an beiden Enden der Restriktionsfragmente Enden ohne Überhang erzeugen und die an Heterohybride aus den einander komplementären, jeweils zu Individuum 1 oder 2 gehörenden Fragmentenden der DNA-Stränge Überhänge bilden, die die sich am gleichen Strang befinden und deren Sequenz am 5'-Ende 5' CATG 3' und am 3' -Ende 5' CATG 3' ist, b) durch Denaturierung der Fragmente eine Mischung erhält, die einzelsträngigen DNA-Fragmente von beiden Individuen erhält und im nächsten Schritt Pufferbedingungen eingestellt werden, die die Renaturierung von doppelsträngigen DNA-Molekülen zulässt (FPERT- Reaktion) , c) drei Molekülpopulationen erhält, von denen die erste die wiederhergestellten Doppelstrangmoleküle (Homohybride) von Individuum 1 darstellt, die zweite die wiederhergestellten Doppelstrangmoleküle (Homohybride) von Individuum 2 und die dritte die Popula- tion der zueinander komplementären, jeweils dem einen und dem anderen Individuum zugehörenden Doppelstrangmolekülen (Heterohybride) darstellen, d) Pufferbedingungen einstellt, die einen Ringschluß der entstandenen Moleküle zulassen, e) bei der Eco Rl-Verdauung einen geeigneten Klonie- rungsvektor einem Doppelverdau mit den Restriktions- enzymen Nco I und Nsp I aussetzt, ) weiterhin die so behandelte Vektor-DNA mit der Reaktionsmischung aus Schritt e) mischt, g) Linker mit einer solch spezifischen Konstruktion verwendet , dass nur die Heterohybride den Ringschluß mit den Vektormolekülen vollziehen h) mit Hilfe einer Ligase-Reaktion die ringförmig miteinander verknüpften DNA-Fragmente kovalent verbindet, i) ringförmige Moleküle erhält, die aus zwei Populationen bestehen, nämlich aus derjenigen mit ein oder mehr Basenfehlpaarungen und aus derjenigen ohne jede Fehlpaarung, welche die IBD (identity by descent) - Bereiche enthält, j ) nun die Reaktionsmischung unter geeigneten Pufferbedingungen mit dem Enzym CEL I versetzt, wobei CEL I jede Fehlpaarung erkennt und einen der beiden DNA- Stränge an der Position der Fehlpaarung schneidet und k) dieser Reaktionsmischung nach Einstellen geeigneter Pufferbedingungen die Nuklease Exo III hinzugefügt und dadurch die durch CEL I- Verdau partiell einzelsträngigen Ringe abbaut.

Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Reaktionsmischung zur Transformation geeigneter Bakterien einsetzt.

Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die transformierten Bakterien nach Selektion und Vereinzelung kultiviert und dass die per Plas- midpräparation gewonnenen DNA-Fragmente, welche die IBD-Bereiche enthalten isoliert und im Genom lokalisiert werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man bei Verwendung eines anderen Enzyms als Eco RI Überhänge einer anderen Sequenz erhält, die jedoch die gleiche Orientierung aufweist.