DE19530336C2 - Sequentielle Hybridisierung von Pilzzellen-DNA sowie Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von Pilzzellen in klinischem Material - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von Pilzzellen in klinischem Material.

Derartige Verfahren sind z. B. in den Veröffentlichungen "De­ tection of various fungal pathogenes in blood samples" von Einsele et al. in: EBMT 1995, Vol. 15, Suppl. 2, März 1995, Abstract Book, Abstract 432, S. 103 und "Rapid, polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species" von Niesters et al. (1993), Journal of Clinical Microbiology, Seiten 904-910, beschrieben.

Aus der Veröffentlichung von Einsele et al. ist es bekannt, ein DNA-Segment eines Pilz-Genes mittels des Polymerase-Ketten­ reaktion-Verfahrens zu amplifizieren, um eine Vielzahl von Pilz- Pathogenen im Blut zu identifizieren. Durch zusätzliche Hybri­ disierung mit speziesspezifischen Oligonukleotiden konnten ferner verschiedene Pilzspezies voneinander unterschieden werden.

In dieser Publikation wird allerdings nicht offenbart, wie das Verfahren genau durchgeführt werden soll, und es werden keine Sequenzen für spezifische Hybridisierungssonden angegeben.

Weitere, aus der Praxis bekannte Verfahren beruhen standardmäßig auf einer Anzüchtung von Pilzspezies aus klinischem Material auf entsprechenden Nährmedien.

Durch diese Anzüchtung z. B. in Petrischalen und den Nachweis anhand der gewachsenen oder auch nicht gewachsenen Kolonien sind die Nachweisgeschwindigkeit sowie -empfindlichkeit insbe­ sondere wegen des langsamen Wachstumes der Pilzspezies stark beeinträchtigt. Die Diagnose der invasiven Pilzinfektion wird daher häufig erst durch eine äußerst komplikationsträchtige Biopsie eines Organes oder sogar erst nach dem Tod des Patienten gestellt.

Das Interesse an Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen ist vor dem Hintergrund zu sehen, daß insbesondere in den letzten Jahren Pilzspezies als bedeutende nosokomiale Pathogene eine erhebliche Bedeutung für immunsupprimierte Patienten erlangt haben. Vor allem nach Knochenmarkstransplantationen (KMT), aber auch nach Leber-, Nieren-, Pankreas-, Herz- und Herz-Lungen- Transplantationen haben invasive Pilzinfektionen erheblich zugenommen. So ist es z. B. im Jahr 1994 vor allem in französi­ schen KNT-Zentren zu einer solchen Häufung vor allem von Aspergillusinfektionen gekommen, daß diese Zentren mehrere Monate geschlossen werden mußten.

Neben den organtransplantierten Patienten sind aber auch Patienten mit Krebserkrankung, vor allem nach Chemotherapie oder chirurgischen Eingriffen, Verbrennungspatienten sowie Patienten auf chirurgischen und neonatalen Intensivstationen zunehmend von invasiven Pilzinfektionen betroffen. Sobald es bei diesen Patientenkollektiven zu einer Beteiligung eines Organsystemes oder gar mehrerer Organsysteme kommt, beträgt die Sterblichkeit an dieser infektiösen Komplikation zwischen 80 und 100%.

Nur durch eine frühzeitige Diagnose kann hier der Behandlungs­ erfolg verbessert werden. Wegen der mit den eingangs erwähnten Standardnachweisverfahren verbundenen Nachteile werden intensive Bemühungen unternommen, eine frühzeitige Sicherung der Diagnose einer systemischen Pilzinfektion zu ermöglichen.

Neue, auf molekularbiologischen Verfahren beruhende Techniken haben zwar bei einer Reihe von anderen Erregern bereits eine sensitivere Diagnostik und damit teilweise auch ein früh­ zeitigeres Erkennen und Behandeln der Infektionserkrankungen ermöglicht, bei Pilzinfektionen war dies bisher jedoch noch nicht möglich.

Die wesentlichen Probleme des Nachweises von Pilzinfektionen mit Hilfe molekularbiologischer Techniken sind dabei auf die sehr komplexe Zusammensetzung der Pilzzellenwand zurückzuführen, die bisher zeitaufwendige aber auch teure Extraktionsverfahren erforderlich machen.

Ein weiteres Problem besteht darin, daß eine zunehmende Zahl von Pilzspezies bei den immunsupprimierten Patienten bedrohliche Infektionen auslösen kann, woraus die Notwendigkeit resultiert, eine Fülle von verschiedenen Pilzgattungen und -stämmen bei diesen Patienten erfassen und bestimmen zu müssen. Da sich die Therapie der Infektionen bei verschiedenen Pilzspezies nämlich unterscheidet, ist es folglich erforderlich, nicht nur alle Pilzspezies erfassen, sondern diese auch differenzieren und identifizieren zu können.

Bei dem aus der eingangs genannten Veröffentlichung von Niesters et al. bekannten Verfahren wird zunächst das gesamte 18ssu rRNA- Gen amplifiziert, danach werden spezifische Bereiche daraus reamplifiziert und durch verschiedene Techniken analysiert. Durch Sequenzierung der Polymerase-Kettenreaktion-Produkte, Restriktionskartierungen, oder Hybridisierung der Polymerase- Kettenreaktion-Produkte mit spezifischen Sonden können vier verschiedene Candida-Spezies voneinander unterschieden werden.

Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß zwei Polymerase-Ketten­ reaktion-Reaktionen nacheinander durchgeführt werden müssen, wodurch das Verfahren zeit- und kostenintensiv wird. Wenn die Polymerase-Kettenreaktion-Produkte sequenziert oder durch Restriktionskartierung analysiert werden, so bedeutet dies einen erheblichen Aufwand bei der Durchführung und Auswertung. Bei der Analyse durch Hybridisierung mit den in der Veröffentlichung angegebenen Sonden treten andererseits Kreuzreaktionen auf, so daß die verschiedenen pathogenen Pilzspezies nicht zuverlässig und eindeutig voneinander unterschieden werden können. Darüber hinaus ist es mit dem in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren nicht möglich, Candida-Spezies von den klinisch immer wichtiger werdenden Aspergillus-Spezies zu unterscheiden.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Sonden vorzugsweise für ein Verfahren von der in der Veröffentlichung von Einsele et al. beschriebenen Art bereitzu­ stellen, um eine frühzeitige und zuverlässige Diagnose einer Pilzinfektion und die Identifizierung möglichst vieler verschie­ dener Pilzspezies zu ermöglichen. Ferner soll das bekannte Verfahren entsprechend weitergebildet werden.

Die Bestimmung der Pilzspezies soll dabei insbesondere für die Diagnostik schnell und so einfach durchzuführen sein, daß sie auch im Klinikalltag und ggf. von angelerntem Personal durchge­ führt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 - SEQ ID-No: 8 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll gelöst.

Sie wird außerdem durch die Verwendung einer oder mehrerer dieser Nucleotidsequenzen als DNA-Sonde zum Identifizieren von Pilz­ spezies gelöst.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hierdurch vollkommen gelöst, der Erfinder hat nämlich erkannt, daß durch die Verwendung der 6 angegebenen Nucleotidsequenzen als Hybri­ disierungs-Sonden spezifisch sämtliche klinisch interessierenden Pilzspezies voneinander unterschieden werden können.

Die Nucleotidsequenz SEQ ID-No: 3 dient dabei zum Nachweis der Pilzspezies Candida albicans, SEQ ID-No: 4 zum Nachweis von Candida glabrata, SEQ ID-No: 5 zum Nachweis von Candida krusei, SEQ ID-No: 6 zum Nachweis von Candida tropicalis, SEQ ID-No: 7 zum Nachweis von Candida parapsilosis und SEQ ID-No: 8 zum Nachweis von Pilzspezies der Gattung Aspergillus, wobei ins­ besondere A. fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans und A. terreus nachgewiesen werden.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, mit den Schritten

• a) Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollbut,
• b) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz-DNA unter Verwendung von spezi­ fischen Primern, und
• c) Hybridisierung der in der Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten DNA mit DNA-Sonden,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß in Schritt b) als Primer die Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll und daß in Schritt c) als DNA- Sonden eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen SEQ ID-Nr.: 3 bis SEQ ID-No: 8 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll verwendet werden.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auch auf diese Weise vollkommen gelöst. Es wird nämlich ein Verfahren geschaf­ fen, das bei hoher Sensitivität den sehr frühen Nachweis und die Identifizierung von Pilzinfektionen durch Analyse pilz­ spezifischer DNA ermöglicht. Weil der Nachweis auf der DNA-Ebene durchgeführt werden kann, lassen sich hoch empfindliche, gut etablierte und schnell durchzuführende Verfahren einsetzen. Dabei ist darauf zu achten, daß die Freisetzung und Reinigung der Pilz-DNA nicht nur rasch, sondern auch nahezu vollständig und relativ rein erfolgen muß, um eine hohe Sensitivität zu gewährleisten und eine schnelle Diagnose zu ermöglichen.

Das erfindungsgeinäße Verfahren hat den Vorteil, daß die Diagnose der spezifischen Pilzinfektion auf der DNA-Ebene sehr rasch durchzuführen ist, für eine Vielzahl von Pilzspezies sensitiv ist und mit wenigen Verfahrensschritten die Pilzspezies auch identifiziert werden können.

Die zu spezifizierende Pilz-DNA wird für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise so extrahiert bzw. isoliert, wie es in der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 332.6 mit dem Titel "Extraktion von Pilzzellen-DNA" beschrieben ist. Es ist jedoch auch möglich, die Pilz-DNA z.B durch geeignete Dichtegradienten-Zentrifuga­ tion, spezifische Fällungsschritte mit DNA-Sonden etc. zu gewinnen.

Ob in der so behandelten Lösung dann tatsächlich auch Pilz-DNA enthalten ist, wird vorteilhafterweise so nachgewiesen, wie es in der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 333.4 mit dem Titel "Amplifikation von Pilzzellen-DNA" beschrieben ist.

Die gemäß dem hier interessierenden Verfahren zu spezifizierende Pilz-DNA wird zwar vorteilhaft zum Zwecke der Diagnostik von Pilzinfektionen herangezogen, sie kann jedoch auch anderweitig weiterverarbeitet werden. Die Pilz-DNA kann dafür über Agar­ platten oder aus dem Blut von Tieren gewonnen werden, die speziell mit den interessierenden Pilzspezies infiziert wurden. Aus der so gewonnene Pilz-DNA können nach genauer Spezifizierung dann z.B DNA-Sonden herausgeschnitten werden, die für Nachweis­ reaktionen verwendet oder in Plasmide eingebaut werden können. Es sind dabei Anwendungen im ganzen Bereich der Grundlagen­ forschung, Diagnostik, Therapeutik, industriellen Gentechnologie etc. denkbar.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in Schritt b) eine Polymerase-Kettenreaktion mit der in Schritt a) gewonnenen Pilz- DNA durchgeführt, wobei als Primer die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll verwendet werden. Diese Primer binden an die DNA von einer Vielzahl von Pilzspezies.

Dies ist ein sehr einfaches Verfahren, um Segmente der zu Spezifizierenden Pilz-DNA in ausreichender Menge zur Verfügung zu stellen.

Hier ist weiter von Vorteil, daß durch lediglich zwei Primer sämtliche interessierenden Pilzspezies bzw. Segmente von deren DNA hochverstärkt werden können, so daß der Schritt b) sehr schnell und einfach durchzuführen ist.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Polymerase-Ketten­ reaktion mit folgendem Zyklus durchgeführt wird:

• b1) Denaturieren für 0,3-1 min, vorzugsweise für 0,5 min bei 90-96°C, vorzugsweise bei 94°C;
• b2) Hybridisieren für 0,5-1,5 min, vorzugsweise für 1,0 min bei 58-64°C, vorzugsweise bei 62°C; und
• b3) Extension für 1,5-2,5 min, vorzugsweise für 2,0 min bei 68-75°C, vorzugsweise bei 72°C.

Es hat sich herausgestellt, daß dieser Polymerase-Kettenreaktion- Zyklus hochspezifisch nur die Segmente der Pilz-DNA hoch­ verstärkt.

Das auf diese Weise erzeugte Amplicon weist eine gut handzu­ habende Sequenzlänge von ca. 500 Basenpaaren auf.

Außerdem werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt c) die Pilz-DNA oder Segmente der Pilz-DNA mit DNA-Sonden hybridisiert, die einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 aus dem beiliegenden Sequenz­ protokoll entsprechen. Diese Sonden sind für bestimmte Pilzstämme und/oder -spezies spezifisch, so daß der Test der erfolgten Hybridisierung damit zur Identifizierung der Pilzspezies führt. Die Sonden erkennen für verschiedene Pilzspezies charakteri­ stische Segmente aus dem 18ssu rRNA-Gen.

Hier ist von Vorteil, daß ein sehr schnell und einfach durchzu­ führendes Hybridisierungsverfahren zum Nachweis verwendet wird. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Sonden sind für verschiedene Pilzspezies spezifisch und binden ausschließlich an die ampli­ fizierten Segmenten dieser Pilzspezies. Derartige Verfahren lassen sich z. B. auf Gelen durchführen, wobei die Hybride dann durch Anfärben kenntlich gemacht werden. Ein weiteres Verfahren besteht darin, die optisch unterschiedlichen Verhaltensweisen von Einzelsträngen und doppelsträngigen Regionen, z. B. in der optischen Dichte, im Dichroismus oder ähnlichem auszunutzen.

Es ist dabei vorteilhaft, wenn zum Testen der erfolgten Hybridisierung die Sonden mit Digoxigenin markiert und die Hybride z. B. nach der Southern Blot-Methode nachgewiesen werden.

Durch diesen Schritt vereinfacht sich das Verfahren noch einmal, die Sonden selbst sind bereits mit dem entsprechenden Marker versehen, der mit einem bekannten Verfahren nach der Hybridisierung durch eine vorteilhafterweise sogar visuell zu erkennende Farbstoffreaktion die Hybridbildung anzeigt.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die DNA-Sonden sequentiell nach­ einander in der Reihenfolge SEQ ID-No: 3, SEQ ID-No: 8, SEQ ID-No: 6, SEQ ID-No: 7, SEQ ID-No: 4 und SEQ ID-No: 5 eingesetzt werden und jeweils die Hybridisierung getestet wird.

Durch dieses sequentielle Hybridisieren können die einzelnen Pilzspezies in der Reihenfolge ihrer Häufigkeit getestet werden, so daß sich das Nachweisverfahren deutlich beschleunigen läßt.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zum Identifizieren von Pilzspezies in klinischem Material durch Extrahieren von DNA aus Vollblut, Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion der extrahierten DNA unter Verwendung von spezifischen Primern und Hybridisierung der in der Polymerase-Kettenreaktion amplifizier­ ten DNA mit DNA-Sonden, der als DNA-Sonden eine oder mehrere der Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 - SEQ ID-No: 8 aus dem Sequenzprotokoll enthält.

Hier ist von Vorteil, daß ein derartiger Kit entweder nur mit den DNA-Sonden oder aber zusätzlich mit weiter erforderlichen Lösungen bereitgestellt werden kann, so daß im Laboralltag sämtliche erforderlichen Stammlösungen etc. direkt aus diesem Kit genommen werden können. Dadurch vereinfacht sich der Nachweis, bzw. die Identifizierung der jeweiligen Pilzspezies erheblich, da die einzelnen Stammlösungen nicht mehr gesondert im Labor hergestellt werden müssen. Es kann aber auch möglich sein, in diesen Kit nur die Sonden und ggf. die Primer und Enzyme/Stammlösungen für die Polymerase-Kettenreaktion aufzunehmen, so daß im übrigen auf standardmäßig vorhandene Stammlösungen zurückgegriffen wird.

Die Ausgestaltung und Weiterbildung des ersten Verfahrens­ schrittes, also der Extraktion von Pilz-DNA aus Vollblut ist Gegenstand der bereits erwähnten parallelen deutschen Patentan­ meldung "Extraktion von Pilzzellen-DNA". Bei den einzelnen Schritten des dort beschriebenen neuen Verfahrens waren viele Probleme zu überwinden, die sich zum Teil aus der Zusammensetzung der Pilzzellenwand und aus der Tatsache ergaben, daß ein Großteil der Pilzzellen sich nicht im Vollblut frei in Lösung sondern nach Phagozytose in verschiedenen Blutzellpopulationen befindet, vor allem in Granulozyten und Makrophagen. Gemäß dieser Anmeldung ist es bevorzugt, wenn der Schritt des Extrahierens von Pilz-DNA aus Vollblut die Schritte umfaßt:

• - Isolation intakter Pilzzellen aus dem Vollblut, vorzugsweise durch
  • - Aufschließen der im Vollblut befindlichen Blutzellen; und
  • - Trennung überwiegend intakter Pilzzellen von zellulärer DNA; und
• - Extraktion von DNA aus den isolierten Pilzzellen, vorzugs­ weise durch
  • - Aufschließen der isolierten Pilzzellen; und
  • - Isolation der Pilz-DNA.

Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn folgende Schritte durchgeführt werden:

• - Lysis der roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse;
• - enzymatisches Aufschließen der weißen Blutkörperchen;
• - Zentrifugation des so behandelten Vollblutes und Verwendung des Pellet in den nächsten Verfahrensschritten;
• - alkalisches Lysieren der Pilzzellen, Neutralisation der Lösung und Zymolyase-Behandlung; und
• - Präzipitationo der Pilz-DNA.

Die Ausgestaltung und Weiterbildung des zweiten Verfahrens­ schrittes, nämlich des Nachweises der extrahierten Pilz-DNA, ist Gegenstand der bereits erwähnten parallelen deutschen Patentanmeldung "Amplifikation von Pilzzellen-DNA".

Gemäß dieser Anmeldung sind bezüglich des Nachweisens der extrahierten Pilz-DNA die folgenden Schritte bevorzugt:

• - Amplifikation zumindest eines Segmentes der isolierten Pilz-DNA; und
• - Nachweis der Amplifikationsprodukte.

Die Amplifikation kann dabei mittels der Polymerase-Ketten­ reaktion (PCR), Klonierung, DNA-abhängigen DNA-Polymerasen etc. erfolgen, wobei der Nachweis über Gelelektrophorese, optische Dichte, Anfärben mit spezifisch an Nukleinsäure bindenden Markern etc. erfolgen kann.

In einer Weiterbildung erfolgt die Amplifikation dann mittels PCR unter Verwendung von zwei Primern, die für eine Vielzahl von verschiedenen Pilz-DNA verwendbar sind. Die Primer sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 angegeben.

Auf diese Weise ergibt sich ein identisches Nachweisverfahren für alle vorkommende Pilz-DNA, da die beiden Primersequenzen so ausgewählt wurden, daß sie in dem PCR-Schritt Verstärkungs­ produkte mit einer Länge von ca. 500 Basen erzeugen, die auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten Gel leicht nachzuweisen sind.

Hierdurch wird auf einfache Weise DNA in ausreichender Menge erzeugt, die dann verwendet werden kann, um die betreffenden Pilzspezies so zu identifizieren, wie es in der hier vorliegenden Anmeldung beschrieben und beansprucht ist.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiele für die Durchführung der einzelnen Verfahrensschritte sowie die Anwendung des Verfahrens im Rahmen eines klinischen Untersuchungsprogrammes sind in der folgenden Beschreibung angegeben.

Ein besonderer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß es mit Vollblut durchgeführt wird, daß also z. B. keine Biopsie erforderlich ist oder noch herzustellendes Serum verwendet wird.

Mit dem Vollblut wird zunächst eine Trennung der Pilzzellen von zellulärer DNA vorgenommen. Dies ist erforderlich, damit die ggf. nur in geringer Menge vorliegende Pilz-DNA nicht vor dem Hintergrund der in sehr viel höherer Konzentration vorhan­ denen zellulären DNA nachgewiesen werden muß. Dadurch wird also die Spezifität des Nachweisverfahrens erhöht. Zu diesem Zweck werden als erstes die roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse lysiert und dann die weisen Blutkörperchen enzymatisch aufgeschlossen. Diese beiden Verfahrensschritte sind so aus­ gewählt, daß durch sie die Pilzzellen selbst noch nicht beschädigt werden und daß ggf. phagozytierte Pilzzellen unbeschädigt wieder freigesetzt werden, so daß auch sie für den weiteren Nachweis zur Verfügung stehen.

Beispiel 1 Lysis roter Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse

Die Lyse der roten Blutkörperchen erfolgt mit Hilfe einer hypotonen Lösung. Dazu wird folgender Puffer mit folgenden Endkonzentrationen verwendet:

Tris pH 7,6|10 mM
MgCl₂	5mM
NaCl	10 mM

Die Lösung wird für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, und danach zentrifugiert.

Für diesen ersten Schritt ist eine Menge von 3 ml Vollblut ausreichend.

Beispiel 2 Enzymatisches Aufschließen weißer Blutkörperchen

Die weißen Blutkörperchen, die ggf. Pilzzellen enthalten, werden vorsichtig aufgebrochen, indem die Zellen mit Proteinase K (200 µg/ml) der Firma Böhringer, Mannheim in folgendem Puffer mit den angegebenen Endkonzentrationen enzymatisch angedaut werden, in dem das Pellet aus Beispiel 1 aufgenommen wird:

Tris pH 7,6|10 mM
EDTA pH 8,0	10 mM
NaCl	50 mM
SDS	0,2%
Proteinase K	200 µg/ml

Dieser Puffer wird für zwei Stunden bei 65°C inkubiert.

Beispiel 3 Trennung überwiegend intakter Pilzzellen vor allem von zellulärer DNA

Nachdem wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben die Blutzellen aufgeschlossen wurden, so daß die zelluläre DNA freigegeben wurde, erfolgt ein Zentrifugationsschritt bei 5000 Um­ drehungen/min, der zu einem erheblichen Verlust an zellulärer DNA führt, die bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht sedimentiert.

Im Sediment befinden sich jetzt vollständig die freien oder freigesetzten Pilzzellen, die für die weitere Verarbeitung in einem Puffer (Agua bidest) aufgenommen werden.

Beispiel 4 Aufschließen der Pilzzellen

Als nächstes werden die Pilzzellen alkalisch lysiert und enzymatisch behandelt, um die Pilz-DNA freizusetzen.

Dazu erfolgt zunächst eine Alkalilyse mit 200 ml 50 mM NaOH für 10 min bei 95°C.

Daraufhin erfolgt ein Neutralisationsschritt mit 1 M Tris-HCl pH 7,0.

Als nächstes werden 500 µl Zymolyase von Sigma (300 µg/ml) zugegeben und die Lösung für 60 min bei 37°C inkubiert, um die Pilzzellen enzymatisch aufzuschließen.

Daraufhin werden 500 µl Tris/EDTA und 50 µl 10%iger SDS zugegeben und die Lösung bei 65°C für 20 min inkubiert, um das Protein zu denaturieren.

Beispiel 5 Isolation der Pilz-DNA

In der nunmehr vorliegenden Lösung befinden sich Trümmer der Pilzzellen sowie freie Pilz-DNA, die nun isoliert werden muß.

Hierzu erfolgt zunächst eine Proteinpräzipitation mit 5 M Kaliumazetat, woraufhin der Überstand abgenommen und die DNA dann durch Zugabe von eiskaltem Isopropanol ausgefällt wird. Dieses Fällungsprodukt wird dann für die weiteren Verfahrens­ schritte verwendet.

Durch die in den Beispielen 1-5 angegebenen Verfahrensschritte ist es also möglich, aus Vollblut hoch-selektiv Pilz-DNA zu extrahieren, die nun als Präzipitat vorliegt und nur gering mit zellulärer DNA verunreinigt ist, wodurch der jetzt erfolgende Nachweis sehr sensitiv und hochspezifisch erfolgen kann.

Beispiel 6 Amplifikation eines pilzspezifischen DNA- Segmentes

In diesem Verfahrensschritt soll zunächst nachgewiesen werden, ob in dem Präzipitat aus dem Verfahrensschritt in Beispiel 5 überhaupt Pilz-DNA vorhanden ist. Dabei wird ausgenutzt, daß die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 angegebenen DNA-Sequenzen spezifisch an Bindungsstellen auf dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA vieler Pilzstämme und -spezies binden.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß dieses Pilz-Gen bei den verschiedenen Pilz-Stämmen und -Gattungen ein derartiges Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungsregionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und -Gattungen identisch sind, daß aber andererseits die Sequenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, daß sie zum Nachweis der einzelnen Pilzspezies und -Gattungen verwenden werden kann.

Die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 1 bindet dabei an den sense-Strang, während die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 2 an den anti-sense-Strang bindet, wobei der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen ca. 500 Basenpaare beträgt. Diese beiden DNA-Sequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 eignen sich damit als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in der folglich Verstärkungs­ produkte (Amplicon) mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren erzeugt werden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Lage der Primer und die Länge des jeweiligen Amplicons angegeben.

Tabelle 1

Von Pilz-Pathogenen erhaltene Amplicons

Durch diese beiden Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 lassen sich also für alle relevanten Pilzspezies der Gattungen Candida und Aspergillus durch das PCR-Verfahren Amplicons von ca. 500 Basenpaaren in ausreichender Menge herstellen.

Die PCR-Bedingungen sind dabei die folgenden:

Puffer (50 µl):
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl₂
0,2 mg/ml BSA
Polymerase
je 0,5 mM Nukleotide
je 100 pM Primer
Anfängliche Denaturierung: 3 min bei 94°C
Zyklus-Denaturierung: 0,5 min bei 94°C
Annealing: 1 min bei 62°C
Extension: 2 min bei 72°C
Terminale Extension: 5 min bei 72°C
Zykluszahl: 34

Die hohe Magnesiumkonzentration im Puffer sorgt für eine hohe Spezifität der Polymerase, die mit 72°C im Extensions-Schritt bei ihrem Temperaturoptimum arbeiten kann.

Mit diesen Primern konnte insgesamt 40 Stämme von Candida albicans, 10 Stämme von Candida tropicalis, 6 Stämme von Candida parapsilosis, 11 Stämme von Candida glabrata, 8 Stämme von Candida krusei, 8 Stämme von Aspergillus fumigatus, 6 Stämme von Aspergillus flavus, 5 Stämme von Aspergillus terreus, 7 Stämme von Aspergillus niger, 5 Stämme von Aspergillus nidulans und 3 Stämme von Aspergillus versiculor erfolgreich amplifiziert werden.

Beispiel 7 Nachweis der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6

Im nächsten Schritt soll jetzt nachgewiesen werden, ob bei der PCR-Reaktion aus Beispiel 6 auch tatsächlich DNA-Segmente mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren hochverstärkt wurden. Diese Detektion der pilzspezifischen DNA-Segmente erfolgt durch Ethidiumbromid-Färbung der spezifischen Bande in einem 2%igen Agarose-Gel.

Ist hier die spezifische Bande zu erkennen, so kann von einer Pilzinfektion ausgegangen werden, da die Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 an alle oben erwähnten Pilzstämme binden. Sollte also durch die Verfahrensschritte aus den Beispielen 1-5 Pilz- DNA extrahiert worden sein, so wird sie durch den PCR-Schritt des Beispiels 6 so weit hochverstärkt, daß sie hier durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden kann.

Beispiel 8 Zuordnung der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6 zu einzelnen Pilzspezies

Für eine spezifische Therapie ist es jetzt noch erforderlich, die im Schritt 7 bereits nachgewiesene Pilzinfektion genauer zu spezifizieren. Hier zeigt sich jetzt ein weiterer Vorteil des PCR-Schrittes aus Beispiel 6. Dort wurde nämlich so viel pilzspezifisches DNA-Segment erzeugt, daß jetzt weitere Nachweis­ verfahren zur Bestimmung der Pilzspezies möglich sind.

Hierzu werden die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotid­ sequenzen SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 herangezogen, die als Spezies-spezifische Sonden dienen, die mit einem Sequenzabschnitt des in Beispiel 6 erzeugten DNA-Segmentes spezifisch hybridi­ sieren.

Es wurde gefunden, daß die Sonde SEQ ID-No: 3 mit Candida albicans, SEQ ID-No: 4 mit Candida glabrata, SEQ ID-No: 5 mit Candida krusei, SEQ ID-No: 6 mit Candida tropicalis, SEQ ID-No: 7 mit Candida parapsilosis und SEQ ID-No: 8 mit Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans und A. terreus hybridisieren. Die Nucleotidseguenz SEQ ID-No: 8 ist also eine allgemeine Aspergillus-Sonde, während die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 - SEQ ID-No: 5 Pilzspezies der Gattung Candida voneinander unterscheiden können.

Um die erfolgte Hybridisierung nachweisen zu können, werden die Sonden mit dem Transferase-Kit der Firma Böhringer, Mannheim mit Digoxigenin markiert, wobei der Nachweis nach dem Southern Blot-Verfahren mit der üblichen Farbreaktion erfolgt.

Mit Hilfe dieser Sonden erfolgt eine sequentielle Hybridisierung, die nach der Häufigkeit der einzelnen Pilzspezies gestaffelt ist, so daß zunächst mit SEQ ID-No: 3 (C. albicans), dann mit SEQ ID-No: 8 (Aspergillus), SEQ ID-No: 6 (C. tropicalis), SEQ ID-No: 7 (C. parapsilosis), SEQ ID-No: 4 (C. glabrata) und schließlich mit SEQ ID-No: 5 (C. krusei) hybridisiert wird.

Auf diese Weise ist es also möglich, an Hand der im Schritt­ beispiel 6 erzeugten Amplifikationsprodukte durch sequentielles Hybridisieren die Pilzspezies zu identifizieren und anschließend eine gezielte Therapie einzuleiten.

Beispiel 9 Nachweis ausgesäter Pilzzellen in Blut

Mit Hilfe der spezifischen Amplifikation und sequentiellen Hybridisierung gelang es, Pilzspezies mit einer Sensitivität von 1-3 Pilzzellen reproduzierbar nachzuweisen. Durch Aussaat von Pilzspezies in Blutproben konnte nachgewiesen werden, daß das obige Verfahren eine Sensitivität von einer sog. CFU (colony forming unit)/ml-Blut erreicht. Diese Nachweisgrenze liegt weit unterhalb derjenigen, die bei einer klinisch relevanten Pilzaus­ saat in Blut erwartet werden kann.

Beispiel 10 Klinisches Untersuchungsprogramm

In einem groß angelegten klinischen Untersuchungsprogramm konnte eine hohe Spezifität des neuen Verfahrens bei der Analyse von 165 Blutproben von 65 gesunden Probanden gezeigt werden. Alle 165 Blutproben sind negativ geblieben.

94 immunsupprimierte Patenten mit unklarem Fieber wurden daraufhin auf die Präsenz einer Pilzinfektion untersucht. Von 69 Patienten, bei denen keine invasive Pilzinfektion vorlag, waren weit über 200 Blutproben (bis auf eine Ausnahme) ebenfalls negativ.

Dagegen konnten alle 25 Patienten mit invasiver Pilzinfektion bereits innerhalb der ersten Woche als positiv identifiziert werden. Bei allen Patienten gelang darüber hinaus die Zuordnung zu dem verursachenden Pilzerreger.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 3 aus dem Sequenzprotokoll) TCTGGGTAGC CATTTATGGC GAACCAGGAC.

2. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 4 aus dem Sequenzprotokoll) TTCTGGCTAA CCCCAAGTCC TTGTGGCTTG.

3. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 5 aus dem Sequenzprotokoll) GTCTTTCCTT CTGGCTAGCC TCGGGCGAAC.

4. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 6 aus dem Sequenzprotokoll) GTTGGCCGGT CCATCTTTCT GATGCGTACT.

5. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 7 aus dem Sequenzprotokoll) TTTCCTTCTG GCTAGCCTTT TTGGCGAACC.

6. Oligonucleotid gemäß folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 8 aus dem Sequenzprotokoll) CATGGCCTTC ACTGGCTGTG GGGGGAACCA.

7. Verwendung eines oder mehrerer der Oligonucleotide aus den Ansprüchen 1 bis 6 als DNA-Sonde zum Identifizieren von Pilzspezies.

8. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 1 zum Nachweis der Pilzspezies Candida albicans.

9. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 2 zum Nachweis der Pilzspezies Candida glabrata.

10. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 3 zum Nachweis der Pilzspezies Candida krusei.

11. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 4 zum Nachweis der Pilzspezies Candida tropicalis.

12. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 5 zum Nachweis der Pilzspezies Candida parapsilosis.

13. Verwendung des Oligonucleotids aus Anspruch 6 zum Nachweis von Pilzspezies der Gattung Aspergillus.

14. Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von Pilzzellen in klinischem Material, mit den Schritten

• a) Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollbut,
• b) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz-DNA unter Verwendung von spezifischen Primern, und
• c) Hybridisierung der in der Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten DNA mit DNA-Sonden,

dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) als Primer die Oligonucleotide ATTGGAGGGC AAGTCTGGTG und CCGATCCCTA GTCGGCATAG und daß in Schritt c) als DNA-Sonden eines oder mehrere der Oligonucleotide gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sonden sequentiell nacheinander, vorzugsweise in der Reihenfolge Anspruch 8, Anspruch 13, Anspruch 11, Anspruch 12, Anspruch 9 und Anspruch 10 eingesetzt werden und jeweils die Hybridisierung getestet wird.

16. Kit zum Identifizieren von Pilzspezies in klinischem Material durch Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut, Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten DNA unter Verwendung von spezifischen Primern, und Hybridisierung der in der Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten Pilz-DNA mit DNA-Sonden, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er als DNA-Sonden ein oder mehrere der Oligonucleotide aus den Ansprüchen 1 bis 6 enthält.