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WO1999035271A2 - Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y metodos de obtencion - Google Patents

Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y metodos de obtencion Download PDF

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WO1999035271A2
WO1999035271A2 PCT/CU1998/000008 CU9800008W WO9935271A2 WO 1999035271 A2 WO1999035271 A2 WO 1999035271A2 CU 9800008 W CU9800008 W CU 9800008W WO 9935271 A2 WO9935271 A2 WO 9935271A2
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WO
WIPO (PCT)
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vaccine strain
vibrio cholerae
vaccine
gene
belonging
Prior art date
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PCT/CU1998/000008
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WO1999035271A3 (es
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Javier Campos Gomez
Rafael Alfredo Fando Calzada
Boris Luis Rodriguez Gonzalez
Talena Yamile Ledon Perez
Edgar Valle Diaz
Anisia Juana Silva Cabrera
Jorge Antonio Benitez Robles
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Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
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Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • ctx ⁇ virus the nucleus-protein particle produced by Vibrio cholerae that has the ability to transfer to other vibrations the DNA with an acid inside that comprises the genes of the cholera toxin.
  • Cholera toxin is understood to be that protein that when produced by the microorganism is the factor responsible for the clinical symptoms of this disease.
  • toxin genes that accompany the phage ctx ⁇ genome, in addition to cholera toxin genes; that of the ZOT protein, whose activity is responsible for the destruction of the tight junctions between the cells of the epithelium of the intestine; and that of the ACE protein, whose activity is accessory to that of a cholera toxin
  • hemagglutinin protease that protein secreted by Vibrio choierae that has dual activity; one of them manifested in its ability to agglutinate the erythrocytes of certain species and the other in its property of degrading or processing other proteins such as mucin and cholera toxin.
  • ce / A nucleotide sequence encoding that pa 'to the synthesis of the endoglucanase A protein produced by Clostridium thermocellum strains, whose essential characteristic is their ⁇ -glucan hydrolase activity glucan (1-4) which confers ability to digest Cellulose and its derivatives.
  • Thymidylate synthase is understood as the protein that catalyzes the reductive methylation of deoxyuracil 5'-monophosphate (dUMP) by N 5 -N 10 methylenetetrahydrofolate to produce 2'-deoxythymidine-5'-monophosphate (dTMP) and dihydrofolate.
  • dUMP deoxyuracil 5'-monophosphate
  • dTMP 2'-deoxythymidine-5'-monophosphate
  • the term "sufficiently pure DNA” refers to DNA that is free of sequences immediately adjacent to the 5 'or 3' terminal ends of the thyA gene, in the natural structure of the genome of the microorganism to which this invention refers.
  • the term derived sequences includes, for example, a rscombinant DNA incorporated into a vector, cell line or plasmid strain, or existing as an independent molecule (eg, cDNA, restriction or PCR fragment). It also includes recombinant DNA molecules that are part of a hybrid gene encoding additional sequences.
  • homologous sequences refers to DNA sequences or proteins that share similar or identical residues, being nucleotides or amino acids, respectively, at identical positions of two or more given chains. The greater the number of identical / similar residues, the greater the percentage of identity / similarity between the two given chains.
  • Cholera is an acute diarrheal disease caused by an oral infection with the bacterium Vibrio cholerae.
  • the first cholera vaccine was a classic vaccine ('885, 1892), consisting of the injection of "attenuated” whole cells, which was limited in efficacy and very reagenic (Finkelstein RA, International Symposium on Cholera on the America Continent. Sao Paulo, SP, Brazil, 1992).
  • 1892 vaccination with a live "attenuated" strain of Vibio cholerae administered orally was tested for the first time, but the inadequate interpretation of the results did not allow us to understand the effectiveness of oral vaccination with live strains.
  • oral vaccination studies with live bacteria in the vaccine development center of the United States of America were resumed in the 1970s-1980s.
  • a live vaccine is available and marketed to orally immunize against cholera, strain CVD103-HgR, which has been recently licensed. It's a vaccine
  • the present invention describes a method for obtaining a harmless, genetically defined and stable strain of Vibrio cholerae, which is useful as a live vaccine to induce immune protection against cholera in humans when orally supplied.
  • Said strain is derived from a non-toxigenic mutant of Vibrio cholerae and safety is obtained by inactivating the hemagglutinin protease gene (h) by inserting the marker gene ce / A into its coding sequence.
  • the vaccine strain belongs to either of the two serotypes included in the biotype El Tor de Vibrio cholerae or to serogroup 0139
  • said strain is derived from a non-toxigenic mutant of Vibrio cholerae obtained by genetic engineering techniques and is marked with the insertion of the ce / A gene into the hap gene. More preferably, the strain is 638, 1333, or L91 1
  • the invention further includes a method for reducing the environmental impact of any live vaccine strain or of any base strain used for the production of dead vaccines.
  • the method involves cloning and "in vitro" genetic manipulation of the thyA gene to remove an internal fragment and subsequent replacement of the natural gene of the microorganism on the chromosome by a mutated copy.
  • the mutant is a derivative of 81, 413 or SG251a, and most preferably the mutant is 638T or the thyA ' derivatives of strains 1333 or L91 1. Similarly this innocuous and contained version of Non-toxigenic strains is useful as a carrier of heterologous antigens to the mucosal immune system.
  • the invention offers sufficiently pure DNA encoding the thyA gene. This DNA is understood as the sequence shown in the sequence list (SEQ ID NO: 1) and the fragments, deletions, interruptions and derived homologous sequences.
  • the construction of the vaccine strains described herein involves the exchange of the wild chromosomal gene encoding HA / P for an allele interrupted by ce / A in non-toxigenic Vibrio cholerae mutants devoid of all genes comprised in the ctx ⁇ virus. These mutants are well defined genetically and are stable in the defect of proteolytic activity produced by the inactivation of hap. Said mutants are equally stable in the expression of cellulolytic activity conferred by the ce / A gene inserted into the chromosome after passing through the intestine of lactating or human mice.
  • the construction of its derivatives characterized by a lower environmental impact involves the introduction of a genetic deletion in the thyA gene to obtain an auxotrophic mutant to thymidine.
  • the triple mutant obtained is well defined genetically and is stable.
  • the mutation in this confers resistance to the trimethoprim antibiotic in the presence of thymidine. Such resistance is unlikely to be incorporated into other bacterial strains by horizontal transfer due to its recessive nature.
  • the present invention protects non-toxigenic and harmless, genetically defined and stable strains that are useful as live vaccines to induce oral immune protection against cholera in humans.
  • non-reagenic or harmless vaccine candidates we have relied on the consideration of reactogenicity as an inflammatory process resulting from the interaction of cholera vibrations with enterocytes.
  • reactogenicity as an inflammatory process resulting from the interaction of cholera vibrations with enterocytes.
  • the inactivation of the majority soluble protease, responsible for the degradation of mucin, in a strain of vibrio devoid of toxin genes would produce a derived strain that would inefficiently penetrate the thick layer of mucin that covers the enterocytes, so that it would still be able to penetrate the thin layer that covers the M cell and reach ha:; ta it to induce a strong immune response.
  • Hemagglutinin / protease was the major protease with digestive activity on mucin found in C72 8, C6706 and SG25-1.
  • the celfi gene was introduced into the hap gene of the Vibrio cholerae chromosome. This mutation comb anything with the deieissus of the accompanying genes of the phage ctx ⁇ allowed to obtain vaccine candidates with excellent properties marked for vaccinating human you against the disease.
  • Table 1 a we describe the non-toxigenic mutants of V.
  • Non-toxigenic mutants are specifically characterized by the absence of all ctx ⁇ phage coding sequences in the chromosome and by the single-copy Dresden of the RS1 element, whose nucleotide sequence has been verified by DNA sequencing. The methods used in obtaining the mutants do not Toxigenics are well described elsewhere. (Archives of Medical Research, 27, No 3, pp 275-283)
  • Table 1 a Non-toxigenic strains useful for the construction of innocuous strains, affected in the expression of HA / P.
  • Table 1b shows defective strains in the expression of hemagglutinin / protease useful for constructing affected derivatives in thyA expression that have better biosafety attributes.
  • each derivative was checked for the correct expression of lipopolysaccharide corresponding to the starting serotype.
  • the colulas were collected from a fresh plate, resuspended in saline (NaCI, 0 9%) and immediately examined with a Difco agglutination serum, specific for vibrating serotyping Ogawa, Inaba or 0139.
  • the majority immune response in the vaccinated is against LPS.
  • the expression of the antigen corresponding to each of the strains presented in this invention was confirmed by agglutination with the specific antisera.
  • the electrophoretic pattern of the LPS in polyacrylamide gels analysis of Western blot remained unchanged. Colonization test of the infant mouse.
  • the colonization assay of the lactating mouse (Herrington et al., J. Exper Med 168 1487-1492, 1988) was used to know the colonizing properties of each strain.
  • Table 2 shows the colonizing capacity of the vaccine strains described in this invention. Except for L911, the rest of the 5 strains are good colonizers of the gastrointestinal tract of lactating mice. The correlation between the colonization of the intestine of this animal model and that of the human intestine by strains of Vibrio cholera is well known.
  • the 638T mutant is thymidine dependent for growth. This mutation invalidates this strain for multiplication in the environment, where the source of pyrimidines is scarce, if any.
  • LB plates supplemented with 1.5% milk were used to detect the proteolytic activity existing in the supernatant of vibrios grown in TSB.
  • quantification was performed using azocasein substrate.
  • a volume of 200 ⁇ l of culture supernatant was mixed with 1.1 ml of reaction buffer (CaCl 2 , 1mM; Tris, 0.2 M pH 7.2; Azocasein 1%) and incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the non-transformed substrate was precipitated with 83 ⁇ l of 40% trichloroacetic acid for 10 minutes, followed by centrifugation for an additional 10 minutes at 12,000 rpm.
  • the reaction product which is colored and remains in solution, was neutralized with NaOH and read at 450 nm.
  • One unit of enzymatic activity was defined as the amount of enzyme that increases the net optical density of the sample by one during one hour of reaction.
  • the defective vaccine candidates for the expression of HA / P developed here show a reduction in their proteolytic activity equivalent to 60-80% of the total exhibited by their non-toxigenic parents.
  • Vibration detection expressing the endo ⁇ lucanase A marker Vibration detection expressing the endo ⁇ lucanase A marker.
  • Thymidine auxotrophy was analyzed by colony replication from plaques of
  • strains contained in this invention are prototrophic with the exception of 638T, the property of which is further claimed, which depends on thymidine or thymine for growth.
  • 638T When strain 638T is supplemented with one of these compounds, it manifests the property of resistance to trimethoprim (200 ⁇ g / ml), which is conferred by the mutation introduced into the thyA gene.
  • Cells from a well insulated colony are loaded at the tip of a platinum handle from a master plate to a plate for motility detection (LB, 0.4% agar), introducing the tip of the handle 2-3 mm into the agar.
  • the dispersion diameter of each colony in the soft agar is measured at 24 hours of incubation at
  • the motility criterion is taken as follows. A bacterial strain that reaches a diameter of 3 mm or less from the point of inoculation is considered non-mobile. A bacterial strain that is dispersed in a diameter greater than 3 mm is considered mobile. All strains contained in this invention were found to be mobile, with the exception of L911, according to the results obtained in soft agar.
  • the mobile or non-mobile strains were tested for the presence of scourge by electron microscopy.
  • the vibrios were grown for 4 hours at 37 ° C in agar for expression of colonization factors (CFA agar,
  • the presence of the pili corrected with the toxin in the vaccine strains obtained was analyzed by electron immunomicroscopy.
  • the cells were cultured as for the scourge test.
  • Fresh suspensions of the vibrios (10 ⁇ l) were deposited on a nickel grid covered with coal, fixed for 1 minute by exposure to a 60 watt lamp and excess liquid removed on a filter paper.
  • the grid was inverted in a drop of serum specific for TCP diluted in saline solution containing 1% BSA and 0.05% tween-80; incubated for 15 minutes, washed with saline-BSA-Tween and incubated for 15 minutes with the gold-labeled conjugate diluted in the same buffer. After washing the samples three times in saline-BSA-tween, they were stained for 1 minute with a 1% solution of ammonium molybdate.
  • Vibrio cholerae belonging to three serotypes were used to insert the ce / A gene into their chromosome aimed at disrupting the hemagglutinin protease gene in order to substantially decrease the ability of the bacterium to degrade mucin.
  • Strains 638, 1333, L911 and 638T described here can be used to confer adequate immunological protection against cholera in humans, since being administered orally in volunteers obtained high percentages of seroconversion against homologous LPS and adverse reactions. They were despicable.
  • Vaccine strains were grown in traditional media used for vibrio (LB). In the case of thyA mutants, the medium was supplemented with thymidine 50 ⁇ g / ml. 271
  • the bacteria for inoculum are collected in saline solution either from a fresh plate and administered to the volunteers in a dose of 10 7 -1 () 9 cells in 2% sodium bicarbonate. Alternatively, some volunteers may receive more than one dose.
  • Strain 638 has been evaluated in human trials involving 42 volunteers between 18 and 40 years old. Table 3 shows a summary of the clinical results obtained after ingestion of strain 638 and placebo. All clinical manifestations observed were mild and of very short duration. In the data presented, no significant statistical differences were found between the inoculated groups. and the placebo. The most frequent reactions reported in volunteers regardless of dose were meteorism and abdominal cramping. In four volunteers there were mild diarrhea, three of these volunteers received the maximum dose and one the intermediate dose. One of the volunteers who received the maximum dose had five bowel movements (72 hours after inoculation) for a total of 680 grams. Two volunteers had two bowel movements at 28 and 72 hours , after inoculated for a total of 220 and 500 grams respectively. The other volunteer had a diarrhea of 300 grams at 72 hours of inoculation. Bacteriological isolation of the vaccine strain.
  • strain 638 was recovered in 37 of the 42 inoculated volunteers (88%). In the case of the highest dose, excretion of the vaccine strain tended to peak at 72 hours after inoculation. Three of the four cases of diarrhea occurred at that time. Of the 37 volunteers who excreted vibrios, 12 excreted for at least four days, 19 for at least 3 days and 28 for 2 days. The number of volunteers who excreted strain 638 and the mean value of vibrios / g of feces decreased at the lowest dose.
  • Strain 638 induced an immune response of consistency and significance in terms of serum vibriocidal antibodies, igG or IgA against Ogawa LPS and IgA antibody-producing cells specific for LPS of the Ogawa biotype (tables 5 and 6). Although the reciprocal of the geometric mean of the titles (1 / G) had a peak at 14 days after inoculation, seroconversion was obtained on day 7 and the titles remained high until day 28. The degrees of seroconversion, the 1 / G peak, and ELISA titers were dose dependent. However, even for the smallest doses, strain 638 reached significant vibrating antibody titres compared to the placebo group.
  • Pre-inoculation 47 (0-160) 32 (0-40) 33 (0-40) 37 (0-320) Post-inoculation 873 639 389 46 peak (14 days) (0-20480) (0-2560) ( 40-2560) (0-320) Positive with 10/24 4/5 4/5 0 titles> 1024
  • Example 1 Construction of harmless strains from non-toxigenic strains.
  • each starting strain was manipulated in the same manner.
  • the pGPH6 suicide vector ( Figure 4) containing the hap gene inactivated by the insertion of the reporter gene ce / A was transferred from E. coli SMIO ⁇ pir to the non-toxigenic starting strain to produce an ampicillin-resistant cointegrate.
  • a Southern hybridization showed that the co-gradation contained the inactivated hap gene by insertion of ce / A separated from its natural allele by vector DNA.
  • the previous cointegrad, ampicillin-resistant was cultured in the absence of selective antibiotic pressure, a condition that allows its segregation. Ampicillin-sensitive colonies designated 638, 1333 and L911 were characterized by Southern analysis, demonstrating that they contain the hapv.celA mutated gene.
  • Example 2 Creation of the defective 638T mutant in the thvA gene of Vibrio cholerae by in vitro mutagenesis.
  • the thyA gene was first cloned and sequenced.
  • the thyrio gene of Vibrio cholerae was cloned by complementation of a spontaneous mutant of strain 81 resistant to trimethoprim and thymidine-dependent (mutant 815).
  • the deletion comprises the nucleotides between the restriction sites BglW and Mlu ⁇ and eliminates the DNA fragment that codes for amino acids from 7 to 105 of the TSase protein.
  • the resulting genetic construct is unable to complement the defect in Thymidylate Syntase of the spontaneous mutant 815 of Vibrio cholerae.
  • This fragment was cloned into the Sacl site of plasmid pCVD442 to obtain plasmid pEST ( Figure 5), whose replication depends on the ⁇ protein of the Lambda-pir phage.
  • Vibrio cholerae is not a permissive host for pEST-dependent pi replication, since it does not naturally express such protein.
  • this plasmid when used to transform a Vibrio cholerae strain, the transformation frequency is low and the transformants obtained result from its integration into the bacterial chromosome that makes its replication dependent on chromosomal replication.
  • An additional feature of said plasmid is the presence of the sacB gene, whose expression is toxic to Vibrio cholerae in the presence of sucrose.
  • the pEST was used to construct strain 638T and will be useful for constructing strains 1333T and L91 1T or other additional thyA defect derived from any Vibrio cholerae strain. With that objective, the pEST was transferred from E. coli SMI O ⁇ pir to Vibrio cholerae 638, and then selected an ampicillin resistant cointegrada.
  • Figure 1 Detection of Vibrios labeled with the ce / A gene by means of a plaque assay using indicator agar with carboxymethylated cellulose.
  • Figure 2. Detection of the scourge in strain L911.
  • Figure 3 Detection of TCP on the bacterial surface of the 638T mutant.
  • Figure 4. Scheme depicting the structure of the pGPH6 suicide vector, used to construct vaccine strains with the hapv.celA mutation.
  • Figure 5. Genetic structure of plasmid pEST. Windows
  • the present invention provides us with a method to create harmless Vibrio cholerae mutants, useful as vaccines, by inactivating the hemagglutinin / protease gene in non-toxigenic mutants.
  • L91 1 are similar to those presented in WO 95/18633. Additionally, these strains have a marker that distinguishes them and are representative of poop one of the biotypes and serotypes that circulate in the current pandemic as well as the new serogroup 0139.
  • the mutations used to construct the strains described in this invention are well defined, either by deletion of restriction fragments or by insertion of heterologous genes.
  • This invention also provides a method for improving the environmental Godliness of live cholera vaccines that are used orally. This improvement is obtained by introducing a mutation that disables the thymidylate synthase coding gene.
  • the improved 638T vaccine strain in its environmental biosecurity attribute, described in the invention, has thymine or thymidine requirements for its growth, which limits its proliferation in the environment where the source of free pyrimids is scarce, if any.
  • the resistance to trimethoprim generated by the mutation of the thyA gene is recessive and its transmission to other bacteria by horizontal transfer mechanisms has no effect.
  • the expression of resistance to tnmetop ⁇ ma requires the presence of thymidine or thymine, scarce compounds of free form in nature. In these mutants the reacquisition of toxic genes and other mechanisms of horizontal transfer of information is superfluous and can be used without the current concerns regarding their biosecurity. V. Deposits
  • the data of the collection numbers are pending.

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Abstract

En la presente invención se describen nuevas cepas vacunales de Vibrio cholerae en las cuales se ha eliminado la actividad mucinasa codificada por el gen de la hemaglutinina proteasa. Dicho gen ha sido interrumpido con la inserción de un gen marcador. Se describe otro mutante de Vibrio cholerae con mejores atributos de bioseguridad.

Description

NUEVOS CANDIDATOS VACUNALES DE VIBRIO CHOLERAE Y MÉTODOS DE
OBTENCIÓN
Sector técnico El campo de esta invención es el de la biotecnología y más espec ticamente la obtención de vacunas contra el cólera y los procedimientos de ingeniería genética empleados para obtener dichas vacunas. Técnica anterior
Durante la descripción de la invención se utilizan algunos término.-; específicos de la temática cólera, cuyo significado relacionamos a continuación:
Entiéndase por virus ctxΦ la partícula núcleo-proteica producida por el Vibrio cholerae que tiene la capacidad de transferir a otros vibrios el DNA con enido en su interior que comprende los genes de la toxina del cólera.
Entiéndase por toxina del cólera aquella proteína que cuando es producida por el microorganismo es el factor responsable de los síntomas clínicos de esta enfermedad.
Entiéndase por genes de las toxinas que acompañan el genoma del fago ctxφ, además de los genes de la toxina del cólera; el de la proteína ZOT, cuya actividad es responsable de la destrucción de las uniones estrechas entre las células dol epitelio del intestino; y el de la proteína ACE, cuya actividad es accesoria a la de a toxina del cólera
Entiéndase por cepas o vacunas no toxigénicas de Vibrio chole-ae aquellas cepas desprovistas de los genes de las toxinas mencionadas, que puedsn ser útiles como vacunas pero que por lo general manifiestan reactogenicidad residual. Entiéndase por cepas o vacunas inocuas de Vibrio cholerae εiquellas que mediante algún procedimiento han sido desprovistas del grueso de la reactogenicidad residual anteriormente mencionada.
Entiéndase por hemaglutinina proteasa (HA/P), aquella proteína secretada por Vibrio choierae que tiene actividad dual; manifestada una de ellas en su capacidad para aglutinar los eritrocitos de determinadas especies y la otra en su propiedad de degradar o procesar otras proteínas como la mucina y la toxina del cólera. Entiéndase por ce/A aquella secuencia nucleotídica que codifica pa'a la síntesis de la endoglucanasa A, proteína producida por cepas de Clostridium thermocellum, cuya característica esencial es su actividad β(1-4) glucan-glucano hidrolasa que le confiere capacidad para digerir la celulosa y sus derivados. Entiéndase por timidilato sintasa aquella proteína que cataliza la metilación reductora del 5'-monofosfato de desoxiuracilo (dUMP) por el N5-N10 metilentetrahidrofolato para producir 2'-desoxitimidina-5'-monofosfato (dTMP) y dihidrofolato.
El término DNA suficientemente puro se refiere al DNA que está libre de secuencias inmediatamente contiguas por los extremos 5' o 3' terminales del gen thyA, en la estructura natural del genoma del microorganismo al cual se refiere esta invención. El término secuencias derivadas incluye, por ejemplo, un DNA rscombinante incorporado en una cepa vector, línea celular o plásmido, o existente como una molécula independiente (por ejemplo, cDNA, fragmento de restricción o de PCR). También incluye moléculas de DNA recombinante que formen parte de un gen híbrido codificador de secuencias adicionales.
El término secuencias homologas se refiere a secuencias de DNA o proteínas que comparten residuos similares o idénticos, siendo nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en posiciones idénticas de dos o más cadenas dadas. A mayor número de residuos idénticos/similares mayor será el porciento de identidad/similitud entre las dos cadenas dadas.
El cólera es una enfermedad diarreica aguda causada por una infección oral con la bacteria Vibrio cholerae. Actualmente, después de 100 años de investigaciones sobre el cólera, todavía no existe una vacuna segura y eficaz contra la enfermedad. La humanidad ha sido testigo de siete pandemias, las primeras seis fueron causadas por cepas del biotipo clásico y la séptima está caracterizada por el predominio de cepas de biotipo El Tor. Recientemente, a principios de enero de 1991 , la última pandemia se extendió hasta América del Sur, causando más de 25 000 casos y por encima de 2000 muertes en Perú, Ecuador y Chile. En Noviembre de 1992, un nuevo serogrupo de Vibrio cholerae apareció en la India y Bangladesh, el 0139, mostrando un gran potencial epidémico que generó una gran amenaza para los países del tercer mundo. Los hechos anteriores refuerzan la necesidad de obtener una vacuna efectiva contra los serogrupos 01 (biotipo El Tor) y 0139 de Vibrio cholerae.
Al terminar un episodio de cólera el ser humano permanece inmunizado contra su agente causal por un período mínimo de tres años. Basado en este conocimiento, se han hecho múltiples esfuerzos para atenuar el microorganismo y obtener una vacuna viva que al ser inoculada por vía oral asemeje el proceso infeccioso naturεil y produzca una sólida respuesta inmune sin causar reacciones adversas en los vacunados Dichas vacunas contienen mutaciones del tipo de las deleciones en su cromosoma que desproveen al microorganismo de los genes tóxicos codificados en el genoma del profago CTXφ. Ver patentes de James B. Kaper, WO 91/18979 y John Mekalanos WO 9518633 de los años 1991 y 1995, respectivamente.
La primera vacuna contra el cólera fue una vacuna clásica (' 885, 1892), consistente en la inyección de células completas "atenuadas", la cual resultó limitada en eficacia y muy reactogénica (Finkelstein R. A., International Symposium on Cholera on the America Continent. Sao Paulo, SP, Brasil, 1992). En 1892 se ensayó por primera vez la vacunación con una cepa viva "atenuada" de Vibio cholerae administrada por vía oral, pero la interpretación inadecuada de los resultados no permitió comprender la efectividad de la vacunación oral con cepas vivεs. Luego de volver a estudiar la vacunación oral e inyectada, con células muertas o iníictivadas, en la década del 1970-80 se retomaron los estudios de vacunación oral con la bacteria viva en el centro de desarrollo de vacunas de Los Estados Unidos de América Las primeras variantes utilizaron microorganismos obtenidos por técnicas de mutagénesis química y por tanto estaban muy poco definidos genéticamente, ODservándose reversión a la virulencia en aislados del microbio obtenidos de las heces focales de los voluntarios inmunizados (Levine y cois., Infect and Imm, N°2, 1984; Finkelstein y cois, patente US 4,328,209). El auge de la ingeniería genética durante esos años permitió obtener microorganismos "atoxigénicos" con variaciones genéticas bien definidas e imposibilitados de revertir al estado virulento que fueron ensayados en la vacunación, y mostraron muy buena protección contra la enfermedad (Kaper J. B / Levine M Patentes US 06,472,276 y 581 ,406). Sin embargo, el principal obstáculo para el uso de dichos microorganismos "atoxigénicos" ha sido la inducción de reacciones adversas inaceptables durante la vacunación (Levine y cois., Infect. and Imm. Vol 56, N°1 , 1988) ''"i" - PCT/CU98/00008
De acuerdo con los datos anteriores el principal problema a solucionar durante la obtención de una vacuna efectiva contra el cólera es su inocuidad. En la actualidad se ha enfatizado en la existencia de mecanismos de transferencia horizontal de la información genética en las bacterias y es necesario atender también a los atributos de
5 bioseguπdad de la vacuna relacionados con el impacto ambiental. Paralelamente debe cuidarse su estabilidad y su inmunogenicidad.
En la actualidad existe una vacuna oral contra el cólera que utiliza células muertas suplementadas con subunidad B de la toxina del cólera (Holmgren y cois., Current topics in Microbiology and Immunology, Vol. 146, 1989). Dicha vacuna es
10 inocua y efectiva pero debido a su naturaleza muerta, requiere dos o más dosis para generar una respuesta inmune equivalente a la de una infección por colera, lo que encarece mucho su preparación.
Existe y se comercializa una vacuna viva para inmunizar oralmente contra el cólera, la cepa CVD103-HgR, que ha sido licenciada recientemente. Es una vacuna
15 efectiva, inocua y barata; sin embargo su pertenencia al biotipo clásico condiciona que su eficacia protectora frente al biotipo El Tor y el serotipo 0139 de Vibrio cholerae, que circulan de forma predominante en la pandemia actual, sea baja. (Cons ltar patente USA, 5399494).
Otros candidatos vacunales vivos para inmunizar contra el cólera han sido 0 descritos en la patente WO 95/18633. Estos mutantes han sido generados a partir de cepas de los biotipos y serotipos de Vibrio cholerae que circulan en la pandemia actual y cubren efectivamente todos los serotipos de microorganismos, incluyendo el 0139 Estas cepas son inocuas, baratas de producir y preliminarmente eficaces, sin embargo no han sido suficientemente ensayadas como la CVD103-HgR. Adicionalmente son 5 microorganismos prototróficos con capacidad para sobrevivir en el medio ambiente y son mutantes no mótiles generados espontáneamente, aunque en esta nvención se describe una metodología para obtener en lo adelante mutantes no mótiles por supresión de naturaleza definida. La propiedad que hace a estos microorganismos inocuos es su naturaleza no mótil, que les impide llegar eficientemente a la superficie ) del enterocito e inducir las reacciones adversas que inducen sus parentale;;.
Robert y cois., Vacctne, vol 14 N°16, 1517-22, 1996, demostraron que es factible insertar un gen marcador en el gen de la hemaglutinina proteasa (hap) de Vibrio cholerae sin detrimento de sus propiedades colonizadoras, con el objetivo de distinguir inequívocamente el mismo de otros aislados ambientales. La colonización del intestino delgado humano por el Vibrio cholerae es un factor importante para inducir una respuesta inmune local de anticuerpos IgA en la mucosa intestinal. Dicha respuesta es necesaria para la defensa efectiva contra el agente etiológico del cólera en futuras exposiciones, así como para despertar una memoria inmunológica su ciente para lograr una protección duradera (Taylor y cois., The Journal of Infectious Diseases, 1994, 170 1518-23).
El Doctor J Mekalanos de la Universidad de Harvard ha planteado que la internalización de la bacteria Vibrio cholerae a través las placas de Peyer en el intestino es una consecuencia favorable del proceso de colonización, que no produce un síndrome clínico adverso y es un paso esencial en la producción de una respuesta inmune local. Por el contrario, la interacción del microorganismo con los enterocitos, las células más abundantes en la superficie del epitelio del intestino, genera efectos adversos en el organismo humano (Mekalanos J. y cois. Bull Inst, Pasteur, 93. 255-262, 1995) Por tanto, la interacción con las placas de Peyer es una propiedad deseada en una vacuna viva anti-cólera, pero la interacción con los enterocitos es indej.eada
Descripción de la invención. La presente invención describe un método para obtener una cepa inocua, genéticamente definida y estable de Vibrio cholerae, la cual es útil como vacuna viva para inducir protección inmunológica contra el cólera en humanos al ser suministrada oralmente. Dicha cepa deriva de un mutante no toxigénico de Vibrio cholerae y la inocuidad es obtenida inactivando el gen de la hemaglutinina proteasa (hí\p) mediante la inserción del gen marcador ce/A en su secuencia codificadora. Er inclusiones preferidas de este documento la cepa vacunal pertenece a cualquiera de los dos serotipos comprendidos en el biotipo El Tor de Vibrio cholerae o al serogrupo 0139 Preferiblemente dicha cepa deriva de un mutante no toxigénico de Vibrio cholerae obtenido mediante técnicas de ingeniería genética y está marcada con la inserción del gen ce/A dentro del gen hap. De modo más preferible la cepa es 638, 1333, o L91 1
La invención incluye adicionaimente un método para disminuir el impacto ambiental de cualquier cepa vacunal viva o de cualquier cepa base utilizada para la producción de vacunas muertas. El método implica la clonación y la manipulación genética "in vitro" del gen thyA para delecionarle un fragmento interno y el posterior remplazamiento del gen natural del microorganismo en el cromosoma por una copia mutada. Entre las inclusiones preferidas de esta invención resulta cualquier cepa vacunal de Vibrio cholerae de los biotipos y serotipos existentes o cualquier cepa no toxigénica de otro serotipo emergente que haya sido manipulada genéticamente para mutar el gen hap y el gen thyA y crear un doble mutante de reducido impacto ambiental para propósitos vacunales. De forma más preferible, el mutante es un derivado de 81 , 413 o SG251a, y de la forma más preferible aún el mutante es 638T o los derivados thyA' de las cepas 1333 o L91 1. De igual forma esta versión inocua y contenida de cepas no toxigénicas es útil como un portador de antígenos heterólogos ai sistema inmune de mucosas.
Se ha encontrado que las cepas anteriores han sido poco reactogénicas en ensayos de laboratorio y clínicos. También se ha demostrado su capacidad para despertar una fuerte respuesta inmune contra Vibrio cholerae luego de inoculación de voluntarios sanos por vía oral. Como resultado estos mutantes imposibilitados en su capacidad de expresar la hemaglutinina proteasa (HA/P) así como la cepa derivada comparten las características de una vacuna oral contra el cólera en humanos. En un aspecto adicional la invención ofrece DNA suficientemente puro codificador del gen thyA. Entiéndase por este DNA la secuencia mostrada en la lista de secuencias (SEQ ID NO: 1 ) y los fragmentos, deleciones, interrupciones y secuencias homologas derivadas.
La construcción de las cepas vacunales descritas aquí involucra el intercambio del gen cromosómico salvaje que codifica la HA/P por un alelo interrumpido por ce/A en mutantes no toxigénicos de Vibrio cholerae desprovistos de todos los genes comprendidos en el virus ctxφ. Estos mutantes están bien definidos genéticamente y son estables en el defecto de la actividad proteolítica producido por la inactivación de hap. Dichos mutantes son igualmente estables en la expresión de la actividad celulolítica conferida por el gen ce/A insertado en el cromosoma luego de pasar por el intestino de ratones lactantes o humanos. La construcción de sus derivados caracterizados por un menor impacto ambiental, involucra la introducción de una deleción genética en el gen thyA para obtener un mutante auxotrófico a la timidina. El triple mutante obtenido está bien definido genéticamente y es estable. La mutación en este confiere resistencia al antibiótico trimetoprima en presencia de timidina. Dicha resistencia es poco probable que se incorpore a otras cepas bacterianas por transferencia horizontal debido a su naturaleza recesiva.
La presente invención protege cepas no toxigénicas e inocuas, genéticamente definidas y estables que son útiles como vacunas vivas para inducir protección inmunológica por vía oral contra el cólera en humanos. Para el diseño de candidatos vacunales no reactogénicos o inocuos nos hemos apoyado en la consideración de la reactogenicidad como un proceso inflamatorio resultante de la interacción de los vibriones del cólera con los enterocitos. Razonamos que la inactivación do la proteasa soluble mayoritaria, responsable de la degradación de la mucina, en una cepa de vibrio desprovista de los genes de la toxina, produciría una cepa derivada que penetraría ineficientemente la gruesa capa de mucina que cubre los enterocitos, perc que todavía sería capaz de penetrar la fina capa que cubre la célula M y llegar ha:;ta ella para inducir una fuerte respuesta inmune. La hemaglutinina/proteasa fue la proteasa mayoritaria con actividad digestiva sobre la mucina encontrada en C72 8, C6706 y SG25-1. Con el objetivo de inactivar la hemaglutinina proteasa el gen celfi se introdujo en el gen hap del cromosoma de Vibrio cholerae. Esta mutación comb nada con la deieción de los genes acompañantes del fago ctxφ permitió obtener candidatos vacunales marcados con excelentes propiedades para la vacunación de ¡os humanos contra la enfermedad. Como ejemplo, más que con el interés de limitarnos, en la tabla 1 a describimos los mutantes no toxigénicos de V. cholerae útiles para construir derivados inocuos desprovistos de hemaglutinina/proteasa con el propósito de utilizarse como vacunas. Los mutantes no toxigénicos están caracterizados específicamente por la ausencia de todas las secuencias codificadoras del fago ctxφ en el cromosoma y por la Dresencia de una sola copia del elemento RS1 , cuya secuencia nucleotídica ha sido verificada por secuenciación de DNA. Los métodos empleados en la obtención de los mutantes no toxigénicos están bien descritos en otro lugar. (Archives of Medical Research, 27, No 3, pp 275-283)
Tabla 1 a Cepas no toxigénicas útiles para la construcción de cepas inocuεs, afectadas en la expresión de HA/P.
Candidato vacunal Biotipo/Serotipo Genotipo
81 El Tor/Ogawa Δctxφ
413 El Tor/lnaba Δctxφ
SG25-1 a 0139 Δctxφ
Todas las cepas y los métodos de hacerlas aparecen descπtos en Archives of Medical Research, Vol 27, No 3, pp 275-283, 1996. 81 y 413 deπvan de C7258 y C6706, respectivamente; siendo aislamientos clínicos de Perú, 1991 SG25-1 a es un derivado 0139 del aislado SG25-1 , de Calcutta, La India 1993
De manera similar en la tabla 1b aparecen las cepas defectuosas en la expresión de la hemaglutinina/proteasa útiles para construir derivados afectados en la expresión de thyA que poseen mejores atributos de bioseguridad.
Tabla 1b. Cepas afectadas en la expresión de HA/P, útiles en la construcción de mutantes thyA.
Candidato vacunal Propiedades relevantes
638 81 hap. :ceϊÁ
1333 413 hap::celA
L911 SG251a hap::celA
Caracterización de las cepas inocuas v de un derivado obtenido mediante mutación en el gen thvA.
Caracterización serolóqica
Luego de la introducción de cada mutación en las cepas vacunales descritas en este documento, cada derivado fue chequeado para la expresión correcta del lipopolisacáridico correspondiente al serotipo de partida. Para ello las colulas fueron recogidas de una placa fresca, resuspendidas en salina (NaCI, 0 9%) e inrrediatamente examinadas con un suero de aglutinación de la firma Difco, específico para el serotipaje de vibrios Ogawa, Inaba u 0139.
La respuesta inmune mayoritaria en los vacunados es contra el LPS La expresión del antígeno correspondiente a cada una de las cepas presentadas en esta invención fue confirmada por la aglutinación con los antisueros específicos Por otra parte el patrón electroforético de los LPS en geles de poliacrilamida análisis de Western blot se mantuvo inalterado. Ensayo de colonización del ratón lactante.
El ensayo de colonización del ratón lactante (Herrington y cois., J. Exper Med 168 1487-1492, 1988) fue utilizado para conocer las propiedades colonizadoras de cada cepa. Un inoculo de 105 -106 vibrios en un volumen final de 50 μl fue suministrado por inoculación orogástrica a grupos de al menos 5 ratones lactantes. Luego de 18-24 horas de incubación a 30°C los ratones fueron sacrificados, el intestino fie disectado, homogenizado y diluciones apropiadas fueron plaqueadas en medio bacteriológico con los suplementos necesarios para el crecimiento de los mutantes.
En la tabla 2 puede observarse la capacidad colonizadora do las cepas vacunales descritas en esta invención. Excepto la L911 , el resto de Ia 5 cepas son buenas colonizadoras del tracto gastrointestinal de ratones lactantes. Es bien conocida la correlación existente entre la colonización del intestino de este modelo animal y la del intestino humano por cepas de Vibrio cholera.
El mutante 638T, es dependiente de timidina para su crecimiento. Esta mutación invalida a esta cepa para su multiplicación en el medio ambiente, donde la fuente de pirimidinas es escasa, si existe alguna.
Tabla 2. Capacidad colonizadora de las cepas vacunales.
Figure imgf000011_0001
Detección de la actividad proteasa.
Placas de LB suplementadas con leche al 1 ,5 % fueron utilizadas para detectar la actividad proteolítica existente en el sobrenadante de vibrios cultivados en TSB. Alternativamente, la cuantificación se realizó utilizando como sustrato azocaseína. Para ello, un volumen de 200 μl de sobrenadante de cultivo fue mezclado con 1.1 mi de buffer de reacción (CaCI2, 1mM; Tris, 0.2 M pH 7.2; Azocaseína 1 %) e incubado durante 1 hora a 37°C. El sustrato no transformado fue precipitado con 83 μl de ácido tricloroacético al 40% durante 10 minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos adicionales a 12 000 rpm. El producto de reacción, que es coloreado y permanece en solución, fue neutralizado con NaOH y leído a 450 nm. Una unidad de actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima que incrementa la densidad óptica neta de la muestra en uno durante una hora de reacción. Los candidatos vacunales defectivos de la expresión de la HA/P desarrollados aquí, presentan una reducción en su actividad proteolítica equivalente al 60-80% del total que exhiben sus parentales no toxigénicos.
Detección de los vibrios expresando el marcador endoαlucanasa A.
Para detectar la actividad de la endoglucanasa A, los vibrios fueron crecidos en placas de LB durante 24 horas, cubiertos por una pequeña capa de agar indicador- CMC, e incubados durante 3 horas a 60°C. Las colonias positivas para la expresión de la endoglucanasa A aparecen como colonias rojas con un halo transparente sobre un fondo rojo, luego de la tinción con Rojo Congo. El agar indicador-CMC se compone de 0.7% agarosa, 0.5% de CM-celulosa en buffer fosfato-citrato a pH 6.3 y la solución de tinción fue 1 % de Rojo Congo en agua. Como resultado de este ensayo se obtiene que el marcador ce/A se expresa establemente, no es tóxico en cepas de Vibrio cholerae y permite distinguir las cepas vacunales de otros vibrios (figura 1 ).
Análisis de la auxotrofía a timidina en cepas vacunales generadas por mutaqénesis supresora dirigida al gen thvA.
Se utilizó medio mínimo suplementado con glucosa, como única fuente de carbono, y timidina (200 μg/ml) para crecer los mutantes afectados en la expresión de timidilato sintasa imposibilitados de crecer en medio mínimo. Placas de LB suplementadas con timidina (200 μg/ml) fueron utilizadas para chequear la resistencia a trimetoprima de las cepas con mutaciones en el gen thyA. La estabilidad de la auxotrofía a timidina fue analizada mediante replicación de colonias desde placas de
M9-glucosa-timidina hacia M9-glucosa.
Todas las cepas contenidas en esta invención son prototróficas con excepción de la 638T, cuya propiedad se reivindica además, que depende de la timidina o timina para el crecimiento. Cuando la cepa 638T es suplementada con uno de estos compuestos manifiesta la propiedad de resistencia a trimetoprima (200 μg/ml) que le confiere la mutación introducida en el gen thyA.
Ensayo de motilidad.
Las células de una colonia bien aislada se cargan en la punta de una asa de platino desde una placa maestra hacia una placa para detección de la motilidad (LB, agar 0.4%), introduciendo la punta del asa 2-3 mm en el agar. El diámetro de dispersión de cada colonia en el agar suave se mide a las 24 horas de incubación a
30°C. El criterio de motilidad se toma como sigue. Una cepa bacteriana que alcance un diámetro de 3 mm o menos desde el punto de inoculación es considerada no mótil. Una cepa bacteriana que se dispersa en un diámetro mayor de 3 mm es considerada mótil. Todas las cepas contenidas en esta invención resultaron ser mótiles, con la excepción de la L911, según los resultados obtenidos en agar suave.
Ensayo para detección del flagelo.
Las cepas mótiles o no mótiles fueron ensayadas para la presencia de flagelo mediante microscopía electrónica. Para ello, los vibrios fueron crecidos durante 4 horas a 37°C en agar para expresión de factores de colonización (agar CFA,
Casaminoácidos, 1 %; Extracto de levadura, 0.15%; Sulfato de Magnesio, 0.05%;
Cloruro de Manganeso, 0.005%), resuspendidos y lavados en salina. Las bacterias fueron teñidas negativamente con acetato de uranilo (1 %) durante 3 minutos y analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión.
La presencia del flagelo bacteriano fue demostrada en todas las cepas vacunales, haciendo especial énfasis en la cepa no mótil L911 (figura 2).
Ensayo para el TCP
La presencia del pili corregulado con la toxina en las cepas vacunales obtenidas fue analizada por inmunomicroscopía electrónica. Las células fueron cultivadas igual que para el ensayo del flagelo. Suspensiones frescas de los vibrios (10 μl) fueron depositadas en una rejilla de nickel cubierta con carbón, fijadas durante 1 minuto mediante exposición a una lámpara de 60 watts y el exceso de líquido eliminado sobre un papel de filtro. La rejilla fue invertida en una gota de suero específico para el TCP diluido en solución salina conteniendo 1% BSA y 0.05% tween-80; incubada durante 15 minutos, lavada con salina-BSA-Tween e incubada durante 15 minutos con el conjugado marcado con oro diluido en el mismo buffer. Luego de lavar las muestras tres veces en salina-BSA-tween, fueron teñidas durante 1 minuto con una solución al 1 % de molibdato de amonio.
La expresión de pili corregulado con la toxina (TCP), fue visualizada en la superficie bacteriana de todas las cepas analizadas (638, 1333, L911 y 638T) mediante inmunomicroscopía electrónica (figura 3). Adicionalmente la expresión de este importante factor de colonización fue evaluado por Western blot.
Varias cepas de Vibrio cholerae pertencecientes a tres serotipos fueron utilizadas para insertar el gen ce/A en su cromosoma dirigido a interrumpir el gen de la hemaglutinina proteasa con el objetivo de disminuir sustancialmente la capacidad de la bacteria para degradar la mucina.
La ausencia de un gen hap funcional en cepas de Vibrio debe disminuir la reactogenicidad de las mismas por la causa expresada anteriormente, sin embargo el cumplimiento o no de esta hipótesis no impide el uso de las cepas 638, 1333, L911 y 638T como vacunas. Cepas vacunales vivas.
Las cepas 638, 1333, L911 y 638T descritas aquí, pueden ser utilizadas para conferir una adecuada protección inmunológica contra el cólera en los humanos, ya que al ser administradas oralmente en voluntarios se obtuvo altos porcientos de seroconversión contra el LPS homólogo y las reacciones adversas fueron despreciables.
De acuerdo con la epidemilogía relevante del lugar donde se utilizará la vacuna, pudiera emplearse una de las cepas anteriores o combinaciones de ellas. Metodología de cultivo de las cepas vacunales
Las cepas vacunales fueron cultivadas en los medios tradicionales utilizados para el vibrio (LB). En el caso de los mutantes thyA el medio fue suplementado con timidina 50 μg/ml. 271
PCT/CU98/00008
Dosis.
Las bacterias para inoculo son recolectadas en solución salina esté ni a partir de una placa fresca y administradas a los voluntarios en una dosis de 107-1()9 células en bicarbonato de sodio al 2%. Alternativamente algunos voluntarios pudieran recibir más de una dosis.
Evaluación clínica de 638.
La cepa 638 ha sido evaluada en ensayos en humanos que involucraron 42 voluntarios de entre 18 y 40 años. En la tabla 3 se muestra un resumen de los resultados clínicos obtenidos luego de la ingestión de la cepa 638 y el placebo Todas las manifestaciones clínicas observadas fueron leves y de muy corta duración En los datos presentados no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los grupos inoculados y el placebo. Las reacciones más frecuentes reportadas en los voluntarios independientemente de la dosis fueron meteorismos y cólicos abdominales. En cuatro voluntarios se presentaron diarreas leves, tres de estos voluntari os recibieron la máxima dosis y uno la dosis intermedia. Uno de los voluntarios que recibió la máxima dosis tuvo cinco deposiciones (72 horas después de la inoculación) para un total de 680 gramos. Dos voluntarios tuvieron dos deposiciones a las 28 y 72 horas, después de inoculados para un total de 220 y 500 gramos respectivamente. El otro vcluntario tuvo una diarrea de 300 gramos a las 72 horas de inoculado. Aislamiento bacteriológico de la cepa vacunal.
Como se indica en la Tabla 4, la cepa 638 fue recuperada en 37 de los 42 voluntarios inoculados (88%). En el caso de la dosis más alta, la excreción de la cepa vacunal tendió a un pico a las 72 horas después de la inoculación. Tres de los cuatro casos de diarrea ocurrieron a ese tiempo. De los 37 voluntarios que excreí aron vibrios, 12 excretaron por lo menos durante cuatro días, 19 por lo menos durante 3 días y 28 durante 2 días. El número de voluntarios que excretaron la cepa 638 y el valor medio de vibrios/g de heces disminuyeron en la dosis más baja.
Los vibrios aislados de las heces de los voluntarios producían endoglucanasa A indicando que el gen reportero celA era mantenido establemente durante el crecimiento en el intestino delgado humano. PCT/CU98/00008
Respuesta inmune contra la cepa vacunal.
La cepa 638 indujo una respuesta inmune de consistencia y significación en términos de anticuerpos vibriocidas en el suero, igG ó IgA contra el LPS Ogawa y células productoras de anticuerpos IgA específicas para el LPS del biotipo Ogawa (tablas 5 y 6). A pesar de que el recíproco de la media geométrica de los títulos (1/G) tuvo un pico a los 14 días después de la inoculación, la seroconversión fue obtenida al día 7 y los títulos permanecieron altos hasta el día 28. Los grados de seroconversión, el pico de 1/G, y los títulos por ELISA fueron dependientes de la dosis. No cbstante, aún para las dosis más pequeñas la cepa 638 alcanzó títulos de anticuerpos vibπocidas significativos comparados con el grupo placebo. Una proporción importante de voluntarios que experimentaron seroconversión desarrollaron títulos vibπocida relativamente altos, > 1024, (tabla 6). El alto porcentaje de respondedores en la evaluación de células productoras de anticuerpos (tabla 5) refleja una efectiva estimulación de la inmunidad mucosal, principalmente IgAs, por la capa 638 en correspondencia con los elevados títulos de IgA anti-LPS encontrados a los 14 días después de la inoculación. Uno de los voluntarios que recibió el placebo c mple con el criterio de seroconversión pero se explica teniendo en cuenta los bajos ni /eles de IgG anti-LPS antes de la inoculación. Otro de los voluntarios de este grupo alcanzó el nivel umbral de células productoras de anticuerpos, lo cual es explicable por las mismas razones. Con estos resultados concluimos que la cepa 638 induce ura respuesta inmune significativa en humanos.
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Figure imgf000017_0001
Dosis alta (1-2 x109) 7/29 10/29 16/29 15/29 10/29 28/29 4.4x10°
Dosis media (2x108) 6/6 5/6 4/6 4/6 3/6 6/6 5.5x10
Dosis baja 1/7 2/7 2/7 2/7 2/? 3/y 2 f (4x107)
Figure imgf000017_0002
/35271
PCT/CU98/00008
Tabla 6 Respuesta de anticuerpos en suero de voluntarios inoculados oralmente con la cepa 638 El Tor Ogawa.
Grupo de voluntarios
Respuesta Dosis alta Dosis media Dosis Baja Placebo
Anticuerpos vibriocida
Porciento de
Seroconversión 24/29 (82) 5/6 (83) 5/7 (71) 0/14 (0)
1(%)
GMT (rango):
Pre-inoculación 47 (0-160) 32 (0-40) 33 (0-40) 37 (0-320) Post-inoculación 873 639 389 46 pico (14 days) (0-20480) (0-2560) (40-2560) (0-320) Positivos con 10/24 4/5 4/5 0 títulos > 1024
IgG contra el LPS Ogawa
Porciento de seroconversion 2 23/29 (79) 4/6 (67) 3/7 (44) 1/14 (7)
(%)
Logaritmo del recíproco del título3 ± SD:
Pre-inoculación 0.12 ± 0.25 0.12 ± 0.29 0 0.03 ± 0.12
Pp°co'"° day n 1-« ± 1.12 1.59 ± 1.49 1.07 ± 1.36 Q.19 ± 0.S7 IgA contra el LPS Ogawa
Seroconversión 26/29 (90) 6/6 (100) 5/7 (71) 0/14 (0)
Logaritmo del recíproco del título3 ± SD:
Pre-inoculación 0.1 ± 0.37 0 0.27 ± 0.37 0.13 ± 0.39
Figure imgf000018_0001
Notas- 1 Número de voluntarios con aumento de 4 veces en el título/total, 2Número de voluntarios con incremento de dos veces en el título/total, 3Logaritmo del recíproco del título. Abreviaciones: GMT, Media geométrica del título, SD, desviación estándar de la media. IV Ejemplos.
Los ejemplos que mostraremos aquí tienen el objetivo de ilustrar la invención y no deben limitar la esencia de la misma.
Ejemplo 1. Construcción de cepas inocuas a partir de cepas no toxigénicas.
Para construir una cepa afectada en la expresión de HA/P a partir de las cepas no toxigénicas descritas en la tabla 1 a, cada cepa de partida fue manipulada de igual modo. Primero, el vector suicida pGPH6 (figura 4), conteniendo el gen hap inactivado por la inserción del gen reportero ce/A fue transferido de E. coli SMIOλpir hacia la cepa no toxigénica de partida para producir un cointegrado resistente a ampicillina. Segundo, una hibridación de Southern demostró que el cointegrado contenía el gen hap inactivado por inserción de ce/A separado de su alelo natural por DNA del vector. Tercero, el cointegrado anterior, resistente a ampicillina fue cultivado en ausencia de presión selectiva del antibiótico, condición que permite la segregación del mismo. Las colonias sensibles a ampicillina designadas 638, 1333 y L911 fueron caracterizadas por análisis de Southern, demostrando que contienen el gen mutado hapv.celA.
Ejemplo 2: Creación del mutante 638T defectivo en el gen thvA de Vibrio cholerae por mutagénesis in vitro. Para construir mutantes de Vibrio cholerae afectados en la expresión de la timidilato sintasa, el gen thyA fue primero clonado y secuenciado. El gen thyA de Vibrio cholerae fue clonado por complementación de un mutante espontáneo de la cepa 81 resistente a trimetoprima y dependiente de timidina (mutante 815).
La complementación se realizó utilizando una genoteca de la cepa C7258 construida en el plásmido pBR322. Se escogió un clon plasmídico, se purificó y el inserto contenido se subclonó en pUC19, el cual sirvió de molde para facilitar la secuenciación con el uso de oligonucleótidos universales. La secuencia nucleotídica del gen thyA y la secuencia polipeptídica predicha para la proteína timidilato sintasa (TSasa) se muestran en la lista de secuencias (SEQ ID NO: 1 ). Para construir la cepa vacunal defectiva en Timidilato Sintasa se delecionó in vitro un fragmento de restricción interno del marco abierto de lectura del gen thyA. La deleción comprende los nucleótidos entre los sitios de restricción BglW y Mlu\ y elimina el fragmento de ADN que codifica para los aminoácidos desde el 7 al 105 de la proteína TSasa. La construcción genética resultante está incapacitada para complementar el defecto en Timidilato Sintasa del mutante espontáneo 815 de Vibrio cholerae. Este fragmento fue clonado en el sitio Sacl del plásmido pCVD442 para obtener el plásmido pEST (figura 5), cuya replicación depende de la proteína π del fago Lambda-pir. Vibrio cholerae no es un hospedero permisivo para la replicación pi dependiente del pEST, dado que no expresa de forma natural dicha proteína. Consecuentemente, cuando este plásmido es utilizado para transformar una cepa de Vibrio cholerae, la frecuencia de transformación es baja y los transformantes que se obtienen resultan de su integración al cromosoma bacteriano que hace su replicación dependiente de la replicación cromosómica. Una característica adicional de dicho plásmido es la presencia del gen sacB, cuya expresión es tóxica para Vibrio cholerae en presencia de sacarosa. El pEST fue utilizado para construir la cepa 638T y será útil para construir las cepas 1333T y L91 1T u otra adicional defectiva en thyA derivada de cualquier cepa de Vibrio cholerae. Con ese objetivo, el pEST fue transferido de E. coli SMI Oλpir hacia Vibrio cholerae 638, para luego seleccionar un cointegrado resistente a la ampicillina. Mediante análisis de Southern se demostró que el cointegrado había sido originado por integración del plásmido en el gen thyA. Dicho cointegrado fue crecido en un medio libre de antibiótico y suplementado con timidina (50 μg/ml) para permitir su resolución. Las colonias resistentes a sacarosa obtenidas a partir del cultivo anterior fueron seleccionadas en LB agar suplementado con sacarosa y timidina. Una colonia con requerimiento de timidina y sensible a la ampicillina fue designada 638T y caracterizada por Southern demostrándose que la cepa retuvo el alelo mutado del gen thyA.
A continuación sigue una descripción de las figuras:
Figura 1. Detección de Vibrios marcados con el gen ce/A mediante un ensayo en placa empleando agar indicador con celulosa carbóximetilada. Figura 2. Detección del flagelo en la cepa L911.
Figura 3. Detección del TCP en la superficie bacteriana del mutante 638T. Figura 4. Esquema representando la estructura del vector suicida pGPH6, empleado para construir cepas vacunales con la mutación hapv.celA. Figura 5. Estructura genética del plásmido pEST. Ventaias
La presente invención nos provee con un método para crear mutantes inocuos de Vibrio cholerae, útiles como vacunas, mediante la inactivación del gen de la hemaglutinina/proteasa en mutantes no toxigénicos. Las características de inmunogenicidad e inocuidad de las cepas 638, 1333 y
L91 1 son similares a las de las presentadas en WO 95/18633. Adicionalneπte dichas cepas poseen un marcador que las distingue y son representativas de caca uno de los biotipos y serotipos que circulan en la pandemia actual así como del nuevo serogrupo 0139. Las mutaciones empleadas para construir las cepas descritas en ej;ta invención están bien definidas, ya sea por deleción de fragmentos de restricción o por inserción de genes heterólogos.
Esta invención también provee un método para mejorar la Dioseguπdad ambiental de las vacunas vivas de cólera que son utilizadas por vía oral Dicho mejoramiento se obtiene introduciéndoles una mutación que inhabilita el gen codificador de la Timidilato Sintasa.
Las cepa vacunal 638T mejorada en sus atributo de bioseguridad ambiental, descrita en la invención tienen requerimientos de timina o timidina para su crecimiento, lo que limita su proliferación el medio ambiente donde la fuente de pirimidi as libres es escasa, si existiera. La resistencia a trimetoprima generada por la mutación del gen thyA tiene carácter recesivo y su transmisión a otras bacterias por mecanismos de transferencia horizontal no tiene efecto. Adicionaiemete la expresión de la resistencia a tnmetopπma requiere de la presencia de timidina o timina, compuestos escasos de forma libre en la naturaleza. En estos mutantes la readquisición de los genes tóxicos y otros mecanismos de transferencia horizontal de la información es superflua y podrán ser usados sin las actuales preocupaciones referentes a su bioseguridad. V. Depósitos
Los datos de los números de colección están pendientes.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para obtener a partir de una cepa no toxigénica de Vibrio cholerae un derivado inocuo para inmunizar contra el cólera, caracterizado por la inactivación del gen de la hemaglutinina proteasa, bien sea por deleción, por insorción u otra manipulación genética definida e irreversible.
2. Una cepa vacunal de Vibrio cholerae, obtenida a partir de un mutante no toxigénico de Vibrio cholerae, caracterizada por tener inactivado el gen de la hemaglutinina proteasa, sea bien por deleción, inserción u otra manipulación genética definida e irreversible.
3. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada pertenecer al biotipo Clásico.
4. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por pertenecer al biotipo El Tor.
5. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por pertenecer a los serotipos Inaba u Ogawa dentro del biotipo El Tor.
6. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por pertenecer al serogrupo 0139. 7. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por pertenecer a cualquier serogrupo emergente contra el cual la vacunación actual sea inefectiva.
8. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque la cepa inocua resultante es 638, 1333 o L911 de Vibrio cholerae.
9. Un método para obtener derivados bioseguros a partir de cepas vacunales inocuas de Vibrio cholerae, caracterizado por comprender la introducción de una mutación supresora definida e irreversible en el gen codificador de la timidilato sintasa.
10. Una cepa vacunal de Vibrio cholerae derivada de una cepa vacunal inocua, caracterizada por tener inactivado el gen codificador de la timidilato sintasa, sea por inserción, deleción u otra manipulación genética definida e irreversible. 11. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por pertenecer al biotipo Clásico. 71
PCT/CU98/00008
13. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por pertenecer a los serotipos Inaba u Ogawa dentro del biotipo El Tor.
14. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por pertenecer al serogrupo 0139. 15. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por pertenecer a cualquier serogrupo emergente contra el cual la vacunación actual sea inefectiva.
16. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque la cepa vacunal resultante es 638T, o un derivado de 1333 o L911 de Vibrio cholerae.
17. Una cepa vacunal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por ser utilizada como base para la producción de una vacuna muerta.
18. El ADN puro, caracterizado por comprender la secuencia nucleotídica codificadora del gen natural thyA de Vibrio cholerae mostrada en la lista de secuencias (SEQ ID NO: 1 ), útil para obtener mutantes mejorados en sus atributos de bioseguridad ambiental. 19. El ADN de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque su secuencia nucleotídica comprenda una deleción, disrupción o cualquier otra manipulación genética definida de dicho ADN que inactive la función del gen. 20. El ADN de acuerdo con la reivindicación 18 o su variante reivindicada en 19, caracterizado por estar contenido en una célula. 21. El ADN de acuerdo con las reivindicaciones 18, 19, o 20, caracterizado por estar contenido en un plásmido.
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