ES2303727T3

ES2303727T3 - Candidatos de vacuna de vibrio cholerae y procedimientos para su construccion.

Info

Publication number: ES2303727T3
Application number: ES98964347T
Authority: ES
Inventors: Javier Campos Gomez; Rafael Alfredo Fando Calzada; Boris Luis Rodriguez Gonzalez; Talena Yamile Ledon Perez; Edgar Valle Diaz; Anisia Juana Silva Cabrera; Jorge Antonio Benitez Robles
Original assignee: CNIC CT NAC INVESTIGACIONES; Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
Current assignee: CNIC CT NAC INVESTIGACIONES; Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
Priority date: 1997-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2008-08-16
Anticipated expiration: 2018-12-30
Also published as: BR9814600A; WO1999035271A2; AU1959199A; EP1099759A2; US6723323B1; CU22661A1; DE69839161T2; DK1099759T3; JP2002500047A; EP1099759B1; CN1301301A; DE69839161D1; CN100372936C; WO1999035271A3; ATE386797T1

Abstract

En la presente invención se describen nuevas cepas vacunales de Vibrio cholerae en las cuales se ha eliminado la actividad mucinasa codificada por el gen de la hemaglutinina proteasa. Dicho gen ha sido interrumpido con la inserción de un gen marcador. Se describe otro mutante de Vibrio cholerae con mejores atributos de bioseguridad.

Description

Candidatos de vacuna de Vibrio Cholerae y procedimientos para su construcción.

Campo técnico

El campo de la invención es el de la biotecnología y, más específicamente, la generación de vacunas de Vibrio cholerae y los procedimientos de construcción de las mismas usando herramientas de ingeniería genética.

Antecedentes de la invención

A continuación, se enumera una breve explicación de la terminología utilizada en el texto de la invención.

Por virus ctx\Phi quiere decirse la partícula de ADN recubierto con proteína, producida por ciertas cepas de Vibrio cholerae, que puede transducir su ADN, que comprende genes de la toxina colérica, a otras cepas de Vibrio cholerae.

Por toxina colérica, quiere decirse la proteína responsable de los síntomas clínicos de los tipos de cólera que están producidos por las bacterias.

Por genes de toxina codificados por ctx\Phi quiere decirse, además de los genes de la toxina colérica, genes zot y ace, que codifican para la "toxina de zónula occludens" y para la "enterotoxina colérica accesoria", respectivamente.

Para cepas no toxinógenas de Vibrio cholerae, ha de entenderse cualquier cepa que carece de los genes que codifican para las toxinas anteriores, que son también, útiles como vacunas pero que todavía producen un síndrome reactogénico no deseado.

La expresión vacuna segura o cepa segura se refiere a una cepa de este tipo que carece de la reactogenicidad residual de las cepas no toxinógenas de Vibrio cholerae.

Por hemaglutinina/proteasa, quiere decirse la proteína que manifiesta una doble función, siendo una de ellas la capacidad para aglutinar eritrocitos de ciertas especies y la otra, la propiedad para degradar proteínas tales como mucina.

El término celA se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína endoglucanasa A. Esta proteína se produce de manera natural en cepas de Clostridium thermocellum y presenta una actividad hidrolítica de \beta(1-4)glucan-glucano que puede degradar la celulosa y sus derivados.

Por timidilato sintasa, quiere decirse la proteína que puede catalizar la metilación reductora de desoxiuracilo monofosfato (dUMP) mediante N^{5}-N10-metilen-tetrahidrofolato para proporcionar 2,5-desoxitimidina fosfato (dTMP) y dihidrofolato.

ADN sustancialmente puro es ADN que está libre de ambas secuencias codificantes inmediatamente contiguas al extremo 5' o el extremo 3' de la secuencia codificante de thyA, en el genoma que se produce de manera natural del microorganismo a partir del que se deriva el ADN de la invención. El término del mismo incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en vector, cepa, línea celular o plásmido, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, fragmento de PCR, restricción o ADNc). También incluye moléculas de ADN recombinante que son parte de un gen híbrido que codifica para secuencias adicionales.

Secuencias homólogas se refiere a secuencias de proteína o ADN que comparten residuos similares o idénticos que son nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en posiciones idénticas de dos o más cadenas dadas. Cuanto mayor es el número de residuos idénticos/similares en cierta posición, mayor es el porcentaje de identidad/similitud entre dos de ellas.

El cólera clínico es una enfermedad diarreica aguda que resulta de una infección oral con la bacteria Vibrio cholerae. Después de más de 100 años de investigación sobre el cólera, sigue existiendo la necesidad de una vacuna eficaz y segura. La humanidad ha sido testigo de siete pandemias de cólera; las seis primeras estuvieron producidas por cepas del biotipo clásico y la séptima pandemia actual se caracteriza por el predominio de vibriones que pertenecen al biotipo El Tor. Recientemente, comenzando en enero de 1991, esta pandemia se ha extendido hasta Sudamérica, produciendo un número superior a 25.000 casos y más de 2.000 muertes en Perú, Ecuador, Colombia y Chile. Hacia noviembre de 1992, surgió un nuevo grupo serológico en India y Bangladesh, el O139, que mostraba un gran potencial epidémico que llegó a ser una nueva causa de preocupación en todo el mundo en vías de desarrollo. Estas experiencias recientes reafirman la necesidad de vacunas contra el cólera eficaces contra la enfermedad producida por V. cholerae de grupos serológicos O1 (El Tor) y O139.

Debido a que la convalecencia del cólera va seguida por un estado de inmunidad que dura al menos 3 años, gran parte de los esfuerzos en la vacunología contra Vibrio cholerae se han realizado para producir vacunas contra el cólera vivas, atenuadas que imitan estrechamente las propiedades de inmunización de la enfermedad tras la administración oral, pero que no resultan reactogénicas para los individuos que las ingieren. Las vacunas de este tipo implican mutaciones por deleción de todos los genes de toxina codificados por el fago ctx\varphi de Vibrio. Véanse las patentes de Kaper, J. et al.; el documento WO 91.18979 y Mekalanos, J., documento WO 95.18633).

La primera vacuna que se sometió a ensayo contra el cólera data de 1885-1892. Era una vacuna tradicional que comprendía la administración por vía parenteral de vibriones "atenuados". Resultó tener una eficacia limitada y ser inaceptablemente reactogénica (Finkelstein R. A., International Symposium on Cholera on the America Continent. Sao Paulo, SP Brasil, 1992). La vacunación oral se intentó por primera vez en 1892, usando cepas de Vibrio cholerae atenuadas. Los resultados de este intento se malinterpretaron y se abandonó inmediatamente la estrategia. La vacunación oral se rescató más tarde en 1970-1980 en el Centro para el Desarrollo de Vacunas de Maryland, EE.UU. usando vibriones mutagenizados químicamente como agentes de inmunización. La reversión a la virulencia de estos mutantes impidió una difusión adicional de la estrategia (Levine et al., Infect and Imm, Nº2, 1984; Finkelstein et al., patente US 4.328.209) e indujo a los investigadores a generar mutantes no toxinógenos genéticamente definidos que no podían revertir. Aunque se ha demostrado que estos mutantes confieren una sólida protección inmunológica frente a la enfermedad (Kaper J. B. y Levine M. patentes US 06.472.276 y 581.406), el inconveniente esencial para su utilización es el alto nivel de reacciones adversas que producen en las personas vacunadas (Levine et al., Infect. and Imm. Vol 56, Nº1, 1988). Según estos datos, la principal cuestión que ha de superarse cuando se produce una vacuna eficaz contra el cólera es la seguridad. Adicionalmente, los investigadores de todo el mundo están preocupados actualmente con respecto a la transferencia horizontal de información genética entre bacterias, por tanto es necesario prestar atención a este aspecto cuando se diseñan vacunas de bacterias vivas, con el objetivo de mejorar el impacto ambiental durante la vacunación. También es necesario conseguir buenos niveles de estabilidad e inmunogenicidad.

Está disponible una vacuna contra el cólera inactivada que consiste en células completas complementadas con la subunidad B de la toxina colérica (Holmgren et al., Current topics in Microbiology and Immunology, Vol. 146, 1989). Una vacuna de este tipo es segura y eficaz pero requiere múltiples dosis para generar una respuesta inmunitaria equivalente a la de una infección de cólera y, por consiguiente, es muy cara.

Otra alternativa para la vacunación contra el cólera es la CVD103-HgR recientemente autorizada, una vacuna contra el cólera viva que pertenece al biotipo clásico. Es segura, eficaz y barata; sin embargo su eficacia de protección frente a los vibriones El Tor y O139 circulantes actualmente no es tan buena como frente a los vibriones clásicos (véase la patente USA, 5399494).

Se han descrito otros candidatos de vacuna viva en la patente WO 95/18633. Tales mutantes representan todos los serotipos de la pandemia actual, incluyendo el O139. Son seguras, su producción es barata y se ha demostrado que son eficaces de forma preliminar; sin embargo no se han sometido a prueba de manera tan extensa como CVD103-HgR. Todos estos candidatos son bacterias protótrofas que pueden sobrevivir a las condiciones naturales del entorno. Adicionalmente, aunque en el documento se describe un procedimiento para obtener mutantes definidos, los candidatos propuestos constituyen mutantes espontáneos inmóviles. Los inventores han propuesto que la naturaleza inmóvil de estos candidatos de vacuna limita su capacidad para alcanzar la superficie de los enterocitos e impide la provocación de la respuesta reactogénica característica de sus cepas originales.

Robert et al., Vaccine, Vol, 14, Nº16, 1517-22, 1996, demostraron la viabilidad de usar el locus de la hemaglutinina/proteasa para la inserción de etiquetas heterólogas, sin perjudicar la capacidad de colonización de los vibriones. La colonización del intestino delgado humano por Vibrio cholerae es esencial para inducir una fuerte respuesta inmunitaria localizada de IgA secretada en la mucosa intestinal y para producir una inmunidad de larga duración frente al cólera (Taylor et al., The Journal of Infectious Diseases, 1994, 170: 1518-23).

El Dr. Mekalanos ha sostenido prudentemente que la captación de bacterias por las placas de Peyer es una consecuencia del proceso de colonización que no conduce a reactogenicidad y se considera una etapa esencial en la ruta de respuesta inmunitaria localizada. Por el contrario, la interacción de las bacterias con los enterocitos da como resultado reacciones adversas inaceptables para fines de vacuna (Mekalanos J. et al., Bull. Inst, Pasteur, 93: 255-262, 1995). Según estos criterios, las mutaciones que interfieren con la capacidad de los vibriones para alcanzar los enterocitos son características deseadas de las vacunas contra el cólera.

Descripción de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento de producción de una cepa de vacuna adecuada para la administración oral a seres humanos para inducir protección inmunológica frente al cólera, caracterizado porque la reactogenicidad residual se elimina o se reduce hasta un nivel aceptable a partir de un mutante no toxinógeno de Vibrio cholerae mediante la interrupción del gen de la hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador ceiA, y caracterizado además porque se introduce una mutación definida e irreversible en su gen thyA mostrado en la SEC. ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa de Vibrio cholerae, mediante lo cual se limita la proliferación en ecosistemas naturales. Se dan a conocer la cepa de vacuna que pertenece a cualquiera de los dos serotipos del biotipo El Tor o al serotipo O139 de Vibrio cholerae. Preferiblemente, esta cepa se deriva de un mutante no toxinógeno de Vibrio cholerae, obtenido por medio de herramientas de ingeniería genética y se marca con el gen marcador celA dentro del locus de hap. Del modo más preferido, la cepa es 638, 1333 o L911.

Puede manipularse cualquier cepa de vacuna de Vibrio cholerae que pertenece a biotipos y serotipos existentes o cualquier serotipo emergente contra el que las vacunas actuales no son eficaces, mediante ingeniería genética en los genes que codifican para HA/P y timidilato sintasa, para proporcionarle a un mutante doble características de bioseguridad ambiental mejoradas. Más preferiblemente, el mutante es un derivado de 81, 413 o SG251a, y del modo más preferible la cepa, es 638T o los derivados de thyA^{-} de 1333 y L911. También esta versión contenida de cepas de vacuna es útil como entidad para el suministro de antígenos al sistema inmunitario de la mucosa.

Se ha descubierto que los mutantes de este tipo son poco reactogénicos en pruebas clínicas y/o de laboratorio, aunque aún pueden provocar fuertes respuestas inmunitarias cuando se administran por vía oral. Como resultado, estos mutantes defectuosos con respecto a hemaglutinina/proteasa y sus derivados adicionales comparten las propiedades deseables para una vacuna contra el cólera en seres humanos.

Adicionalmente, se da a conocer ADN sustancialmente puro que codifica para el gen thyA para timidilato sintasa de Vibrio cholerae. Por ADN de thyA, quiere decirse la secuencia de ADN mostrada en la figura 1, SEC. ID. No 1.

La construcción de cepas de vacuna descrita en la presente memoria supone la sustitución del gen cromosómico que codifica para la hemaglutinina/proteasa de tipo natural por un alelo interrumpido con celA en mutantes no toxinógenos de Vibrio cholerae a los que se les ha delecionado todos los genes que engloban el profago ctx\varphi. Estos mutantes están bien definidos genéticamente y son muy estables en su defecto proteolítico, sin mostrar una reversión detectable en 10^{9} células. Los mutantes de este tipo son igualmente estables en su actividad celulolítica conferida por el marcador cromosómico celA, incluso tras el paso por el intestino de ratones o seres humanos, y supone además introducir una deleción genética en el gen thyA mostrado en la SEC ID No 1 del mutante, para obtener un derivado auxótrofo de timina/timidina. El triple mutante resultante está bien definido genéticamente y es estable. Como consecuencia de esta mutación, se proporciona a la cepa un marcador de resistencia al antibiótico trimetoprima, que está condicionado a la presencia de timina/timidina. Es improbable que un marcador de este tipo transforme otras bacterias mediante transferencia horizontal debido a su naturaleza recesiva.

Se dan a conocer mutantes no toxinógenos, genéticamente definidos, estables y seguros de Vibrio cholerae que son útiles como vacunas orales vivas para inducir protección inmunológica frente al cólera en seres humanos. Cuando se diseñaron estos candidatos de vacuna contra el cólera no reactogénica, se ha estado ciñéndose a la idea de reactogenicidad como consecuencia de la interacción entre Vibrio cholerae y los enterocitos. Se ha razonado que la inactivación de la principal proteasa secretada, responsable de la degradación de mucina, produciría una cepa de Vibrio cholerae ineficaz en la penetración de la gruesa capa mucosa de los enterocitos, pero inalterada en la capacidad para alcanzar la superficie de las células M y provocar una fuerte respuesta inmunitaria. Se descubrió que la principal proteasa que degrada mucina secretada en las cepas C7258, C6706 y SG25-1 era la hemaglutinina/proteasa soluble, un supuesto factor de virulencia descrito por Finkelstein, et al. Journal of Bacteriology, Vol. 173, Nº 11, págs. 3311-3317, 1991. En paralelo a la inactivación del gen de la hemaglutinina/proteasa, se insertó un fragmento de ADN que codifica para la endoglucanasa A de Clostridium thermocellum en el cromosoma de Vibrio cholerae. Esta mutación combinada con la deleción de genes de toxina colérica del genoma de ctx\varphi dio como resultado candidatos de vacuna marcados con excelentes propiedades como agentes de inmunización para vacunar seres humanos contra el cólera.

Como ejemplo, en lugar de como interés de ser limitante; los mutantes no toxinógenos de Vibrio cholerae útiles para construir mutantes seguros defectuosos en la expresión de hemaglutinina/proteasa para fines de vacuna, se describen en la tabla 1 a. Los mutantes no toxinógenos se caracterizan específicamente por la ausencia de las secuencias codificantes de ctx\phi en su cromosoma y por la presencia de un solo elemento RS1, cuya secuencia de nucleótidos se confirmó mediante secuenciación del ADN. Los procedimientos de producción de los mutantes no toxinógenos de Vibrio cholerae se describen bien en otra parte (Archives of Medical Research, 27, Nº 3, págs. 275-283).

TABLA 1a Cepas de partida para construir mutantes defectuosos con respecto a HA/P

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De modo similar, la tabla 1b proporciona los mutantes de hemaglutinina/proteasa útiles para construir los derivados defectuosos con respecto a thyA con mejores características de bioseguridad.

TABLA 1b Mutantes de hemaglutinina/proteasa útiles para construir mutantes de thyA

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Caracterización de vacunas no toxinógenas con mutaciones adicionales destinadas a mejorar su bioseguridad Caracterización serológica

Tras introducirse cualquier nueva mutación en las cepas de vacuna descritas en la presente memoria, se demostró que el derivado conservaba el serotipo esperado. Se recogieron células de una placa, suspendidas en solución salina y se sometieron a prueba inmediatamente con suero de tipificación de Difco específico para Inaba, Ogawa u O139.

La principal respuesta inmunitaria provocada por las vacunas se dirige contra el LPS de la bacteria. Todas las cepas que se hacen públicas en la presente invención conservaron la expresión del O-antígeno esperado, tal como se confirmó mediante pruebas serológicas. Adicionalmente, los perfiles de LPS permanecieron inalterados en electroforesis en gel de poliacrilamida e inmunotransferencia de tipo Western.

Ensayo de colonización en ratón recién nacido

Se utilizó el ensayo de colonización en ratón recién nacido (Herrington et al, J. Exper. Med. 168:1487:1492, 1988) para evaluar las propiedades de colonización de cada mutante. Se administró por vía intragástrica un inóculo de 10^{5}-10^{6} vibriones en un volumen final de 50 \mul a grupos de al menos cinco ratones. Tras 18-24 horas a 30ºC, se sacrificaron los ratones, se diseccionó el intestino, se homogeneizó y se sembró en placa sobre medios bacteriológicos que contenían complementos apropiados para soportar el crecimiento de mutantes. Se sometieron a prueba las colonias que crecieron tras la incubación durante la noche, para determinar marcadores adicionales.

En la tabla 2, puede observarse la capacidad de las cepas doble y triplemente mutadas (\Deltactx\phi, HA/P)/(thyA^{-}) de Vibrio cholerae para colonizar el intestino de ratones lactantes. Las cepas 638, 1333 y 638T son buenos colonizadores del intestino delgado de los ratones. Se acepta ampliamente que la colonización del tracto gastrointestinal de ratones recién nacidos se correlaciona bien con la colonización del intestino humano, lo que es necesario para sensibilizar el sistema inmunitario de la mucosa e inducir una fuerte respuesta secretora de IgA. Aunque L911 lo coloniza de manera menos eficaz que el resto, todavía puede colonizarlo.

Debe observarse que 638T es un mutante thyA^{-} de 638. La mutación introducida en esta cepa produce una dependencia de timina o timidina que reduce la capacidad de esta cepa para multiplicarse en entornos naturales en los que normalmente están ausentes las pirimidinas libres.

TABLA 2 Capacidades de colonización de cepas de vacuna hap::celA

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Detección de actividad proteasa

Se utilizaron placas de leche-LB para detectar las actividades proteolíticas en sobrenadantes de vibriones hechos crecer en TSB. Para la cuantificación de la actividad proteasa, se adaptó el método de azocaseína a partir de Ginther CL., Antimicrob. Agents Chemother. 15, 522-526, 1979. Brevemente, se mezclaron 1,1 ml de tampón (CaCl_{2} 1 mM; Tris 0,2 M, pH 7,2; azocaseína al 1%) con 200 \mul de sobrenadante de cultivo y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Se precipitó el sustrato sin reaccionar con 83 \mul de TCA al 40% durante 10 min. seguido por centrifugación durante 10 min. a 12000 rpm. Se neutralizó el producto coloreado que permaneció en disolución con NaOH y se hizo una lectura a 450 nm. Se definió una unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que producía un aumento neto de uno en la densidad óptica de la muestra en una hora de reacción.

La mutación introducida en el gen de la hemaglutinina/proteasa de las cepas dadas a conocer en la presente memoria, representa una reducción del 60-80% de la actividad proteolítica, tal como se observó en los mutantes en comparación con las cepas originales no toxinógenas.

Detección de vibriones que expresan el marcador endoglucanasa A

Para la detección de la actividad de CelA, se hicieron crecer vibriones en placas de LB durante 24 horas, recubiertos con agar indicador-CMC y se incubaron durante 4 horas a 60ºC. Se visualizaron las colonias positivas para la endoglucanasa A tras tinción con rojo Congo y lavado, como colonias rojas rodeadas por un halo transparente en el fondo rojo de la placa. El agar indicador-CMC se componía de un 0,7% de agarosa, un 0,5% de CM-celulosa en tampón fosfato-citrato, pH 6,3 y la disolución de tinción era un 1% de rojo Congo en agua.

El marcador celA usado para distinguir de manera inequívoca la vacuna se expresa de manera estable y se hereda en Vibrio cholerae. En la figura 2, puede observarse el aspecto de los vibriones marcados.

Puntuación para una auxotrofía de timidina en cepas de vacuna generadas mediante mutagénesis específica de un gen thyA

Se usaron sales M9 complementadas con glucosa como fuente de carbono y timina/timidina (200 \mug/ml) para detectar el crecimiento de mutantes defectuosos con respecto a thyA afectados en el crecimiento en medio de sales M9-glucosa. Se utilizaron placas de LB complementadas con 200 \mug/ml de timidina para comprobar la resistencia a trimetoprima en los mutantes de thyA generados. Se analizó la estabilidad de la auxotrofía de timidina mediante replicación en placas de colonias de M9-glucosa-timidina en placas de M9-glucosa.

Las cepas 638, 1333 y L911 son bacterias protótrofas que pueden crecer en sales minerales empleando glucosa como la única fuente de carbono. La cepa 638T requiere la adición de timidina o timina para el crecimiento en medio mínimo. Cuando está presente uno de estos complementos, 638T es resistente hasta 200 \mug/ml de trimetoprima.

Ensayo para determinar la movilidad

Se cogieron células de colonias individuales bien aisladas de una placa maestra con la ayuda de la punta de una aguja de platino y se inocularon mediante inserción (2-3 mm) en una placa de agar de movilidad (LB; agar al 0,4%). Se registró el diámetro en el que se extendió cada colonia a través del agar blando a las 24 horas de incubación a 30ºC. Los criterios para la movilidad fueron los siguientes. Una extensión de la cepa bacteriana de 3 mm o menos desde el punto de aplicación se consideró inmóvil. Una extensión de la cepa bacteriana > 3 mm más allá del punto de inoculación se consideró móvil.

Se encontró que todas las cepas bajo el alcance de esta patente, menos L911 eran móviles. L911 es un derivado de SG251, que en estos ensayos, resultó inmóvil cuando se sometió a ensayo en agar de movilidad.

Ensayo para determinar flagelos

Se sometieron a ensayo bacterias móviles e inmóviles para determinar la presencia de flagelos mediante microscopía electrónica. Brevemente, se hizo crecer Vibrio cholerae durante 4 horas a 37ºC sobre agar con antígeno del factor de colonización (CFA, casaminoácidos, 1%; extracto de levaduras, 0,15%; sulfato de magnesio, 0,05%; cloruro de magnesio, 0,005%), se recogieron y se lavaron con solución salina (NaCl, 0,9%). Se tiñeron negativamente las bacterias con 1% de acetato de uranilo durante 3 min. y se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión.

También se demostró la naturaleza flagelada de las bacterias para todas las cepas de vacuna como anteriormente, con mayor énfasis sobre la cepa de O139 inmóvil, L911 (figura 3). Todas las cepas descritas en la presente memoria mostraron que eran flageladas, incluyendo la L911 inmóvil.

Ensayos para determinar TCP

Se examinaron las cepas mutantes para determinar la presencia de pilosidades correguladas con toxina sobre la superficie bacteriana mediante microscopía electrónica con marcaje inmunológico con oro. Se cultivaron las células como para el ensayo de los flagelos. Se depositaron suspensiones recién recogidas de vibriones (10 \mul) sobre una rejilla de níquel recubierta con carbono, se fijaron durante 1 min. exponiendo la rejilla a una lámpara de 60 vatios y se eliminó el exceso de líquido sobre una almohadilla filtrante. Se invirtió la rejilla en una gota de sueros específicos de TCP diluidos en solución salina, un 1% de BSA, un 0,05% de tween-80, se incubó durante 15 min. para la reacción y se lavó con solución salina-BSA-Tween. Se incubaron las rejillas lavadas con el conjugado marcado con oro diluido con el mismo tampón, se dejaron en reposo durante 15 min. y se lavaron 3 veces con solución salina-BSA-Tween. Tras el lavado, se tiñeron las muestras durante 1 min. con una disolución de molibdato de amonio al 1%.

Las características más importantes de las vacunas contra el cólera son la seguridad y la antigenicidad. Mediante manipulación genética, se hacen seguras las cepas de V. cholerae, pero debe tenerse cuidado para que conserven su antigenicidad inalterada. Se evaluaron las cepas de Vibrio cholerae dadas a conocer en la presente solicitud de patente para determinar la expresión de los antígenos más destacados en la bacteria. Se visualizó TCP sobre la superficie bacteriana mediante microscopía electrónica con marcaje inmunológico con oro. Alternativamente, se detectó la expresión de este factor de colonización clave mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Todas las cepas analizadas (por ejemplo, 638, 1333, L911 y 638T) produjeron niveles normales de proteína TCP y se ensamblaron en grandes apéndices sobre la superficie bacteriana (figura 4).

Cepas de vacuna vivas

Pueden utilizarse las cepas 638, 1333, L911 y 638T descritas en la presente memoria, para lograr una protección inmunológica adecuada frente al cólera en seres humanos, siempre que provoquen altas tasas de seroconversión y produzcan bajos niveles de reacciones adversas cuando se administran por vía oral a voluntarios humanos. Dependiendo de la epidemiología local relevante, podría utilizarse una única cepa o combinaciones de ellas para la inmunización.

Capacidad de cultivo de la cepa bacteriana

Se cultivaron las cepas de vacuna en medio de laboratorio habitual. Se añadieron complementos de timidina (200 \mug/ml) cuando fue necesario para el crecimiento, pero no se incluyeron complementos en el inóculo.

Dosificación

Se administró una dosis oral única de la vacuna viva a personas en tampón bicarbonato (2%) tras recoger las bacterias de una placa nueva en solución salina aséptica (NaCl al 0,9%). Un inóculo útil son 10^{7}-10^{9} células por dosis de inmunización. Alternativamente, pueden administrarse más de una dosis, separadas 7-28 días, a cada sujeto. Preferiblemente, los vibriones pueden liofilizarse en una formulación que conserve la viabilidad y mezclarse con bicarbonato antes de la inoculación.

Pruebas clínicas de 638

Se ha sometido a prueba la cepa 638 en ensayos con seres humanos en los que participaron 42 voluntarios con edades comprendidas entre 18-40 años. En la tabla 3, se muestra un resumen de los hallazgos clínicos tras la ingestión de la cepa 638 y placebo. Todas las manifestaciones clínicas observadas fueron leves y de corta duración. No pudo demostrarse significación estadística entre los grupos inoculados y de placebo con los presentes datos. Los dolores abdominales y el ruido de gorgoteo fueron las reacciones notificadas más frecuentemente por los voluntarios, independientemente de la dosis. Cuatro voluntarios desarrollaron diarrea leve (grado 3). Tres de estos voluntarios recibieron la dosis alta y uno la dosis media. Un voluntario que recibió la dosis alta, defecó 5 veces heces blandas (72 h tras la inoculación) y una cantidad total de 680 g. Dos voluntarios defecaron 2 veces heces blandas 28 y 72 h tras la inoculación con cantidades totales de 220 y 500 g, respectivamente. El otro voluntario defecó una única vez una cantidad de diarrea de 300 g 73 h tras la inoculación.

Aislamiento bacteriológico de la cepa de vacuna

Tal como se indica en la tabla 4, se recuperó la cepa 638 en 37 de 42 voluntarios inoculados (88%). Para la dosis superior, la excreción de la cepa de vacuna tendía a ser máxima a las 72 h tras la inoculación. Tres de los 4 casos de diarrea se produjeron en este momento. De los 37 voluntarios que excretaron vibriones, 12 los excretaron al menos en 4 días, 19 al menos en 3 días y 28 en 2 días. El número de voluntarios que excretaron la cepa 638 y el número medio de vibriones/g de heces disminuyeron en la dosis inferior. Los vibriones aislados de las heces de los voluntarios produjeron endoglucanasa A, lo que indica que el gen indicador celA se mantuvo de manera estable durante el crecimiento en el intestino humano. Se concluye que la cepa 638 es un buen colonizador del intestino delgado humano.

Respuesta inmunitaria a la cepa de vacuna

La cepa 638 provocó una respuesta inmunitaria sistemática y significativa en cuanto a los anticuerpos vibriocidas séricos, IgG o IgA anti-LPS de Ogawa séricos y ASC de IgA específica de LPS de Ogawa (tablas 5 y 6). Aunque la inversa de la MGT tuvo un máximo a los 14 días tras la inoculación, se obtuvo seroconversión en el día 7 y los títulos siguieron siendo altos hasta el día 28. Las tasas de seroconversión, inversa de la MGT máxima y los títulos de ELISA fueron dependientes de la dosis. Sin embargo, incluso con la dosis menor, la cepa 638 provocó una respuesta de anticuerpos vibiocidas significativa en comparación con el placebo. Una proporción significativa de los voluntarios que experimentaron seroconversión desarrollaron títulos vibriocidas relativamente altos (\geq 1024) (tabla 6). El alto porcentaje de sujetos que respondieron en la evaluación de las ASC (tabla 5) refleja una estimulación eficaz de la inmunidad de la mucosa, principalmente de sIgA, por la cepa 638 en correspondencia con los títulos elevados de IgA anti-LPS encontrados 14 días tras la inoculación. Un voluntario que ingirió placebo experimentó seroconversión para IgG anti-LPS. Este voluntario tenía un valor de IgG sérica anti-LPS antes de la inoculación muy bajo, que aumentó hasta el valor de corte en el día 7 y permaneció constante posteriormente. Otro voluntario que ingirió placebo alcanzó el valor de corte de las ASC. De manera similar, este voluntario tuvo un número antes de la inoculación muy bajo de ASC específicas de LPS. Se concluye que la cepa 638 provoca una respuesta inmunitaria significativa.

TABLA 3 Frecuencia de aparición de reacciones adversas tras la ingestión de la cepa 638 de vacuna candidata de El Tor Ogawa

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TABLA 4 Recuperación de la cepa 638 de Vibrio cholerae a partir de las heces de voluntarios

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TABLA 5 Respuesta de ASC de IgA anti-LPS en sangre periférica de voluntarios tras la ingestión de la cepa 638 de Vibrio cholerae

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TABLA 6 Respuestas de anticuerpos séricos en voluntarios a los que se administra por vía oral la cepa 638 El Tor Ogawa de Vibrio cholerae

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IV Ejemplos

Los ejemplos descritos en la presente memoria se concibieron para ilustrar en vez de limitar la invención.

Construcción de candidatos de vacunas seguros a partir de cepas originales no toxinógenas

Para construir derivados defectuosos con respecto a hemaglutinina/proteasa a partir de los mutantes no toxinógenos descritos en la tabla 1 a, se procesó de igual manera cada cepa original. En primer lugar, se transfirió el vector suicida pGPH6 (figura 5) que contenía el gen de la HA/P (hap), inactivado mediante la inserción del gen indicador celA, de E. coli SM10\lambdapir al mutante no toxinógeno para producir un vector cointegrado resistente a la ampicilina. En segundo lugar, la hibridación de tipo Southern demostró que el vector cointegrado contenía el gen hap inactivado por inserción (hap::celA) y su alelo de tipo natural (hap) separado por ADN de vector. En tercer lugar, se permitió que el vector cointegrado resistente a la ampicilina anterior se segregara en un medio sin antibióticos y se seleccionaron las colonias sensibles a la ampicilina. Las colonias sensibles a la ampicilina designadas como 638, 1333 y L911, se caracterizaron mediante análisis de tipo Southern y demostraron que contenía el alelo mutante hap::celA.

Construcción de 638T, un derivado defectuoso con respecto a timidilato sintasa de cepas 638 de Vibrio cholerae

Para construir mutantes de Vibrio cholerae que eran defectuosos en la expresión de la timidilato sintasa, se clonó en primer lugar su gen codificante thyA y se secuenció. Se clonó el primer lugar el gen thyA de Vibrio cholerae complementando un mutante espontáneo que requiere timidina, resistente a trimetoprima de la cepa 81, con una biblioteca genómica de la cepa C7258 construida en pBR322. Se seleccionó un clon, se purificó y se llevó el inserto a pUC19 que sirvió como molde para facilitar la secuenciación con cebadores universales. En la figura 1, SEC ID No 1, se muestran la secuencia de nucleótidos del gen thyA y su polipéptido previsto de la proteína ThyA.

Para construir una cepa de vacuna defectuosa con respecto a timidilato sintasa, se delecionó "in vitro" un fragmento de restricción interno del marco de lectura abierto de thyA. La deleción comprendía los nucleótidos entre los sitios de restricción Mlul y BglII y eliminó las secuencia de ADN que codifican para el aminoácido 7 al aminoácido 105 de la proteína ThyA. El constructo génico resultante estaba alterado en su capacidad para complementar el defecto de thyA del mutante espontáneo de Vibrio cholerae 815.

Se clonó este fragmento en el sitio de restricción Sacl único de pCVD442 para obtener pEST (figura 6). Se transfirió este plásmido de E. coli SM10\lambdapir Vibrio cholerae cepa 638 y se seleccionó un vector cointegrado resistente a la ampicilina. El análisis de tipo Southern del vector cointegrado demostró que pEST estaba integrado específicamente dentro del gen thyA. Se permitió que se segregara el vector cointegrado resistente a la ampicilina en medio sin antibioticos complementado con timidina. Se seleccionaron las colonias resistentes a la sacarosa en presencia de timidina. Se caracterizó una colonia sensible a la ampicilina, que requería timidina designada como 638T, mediante análisis de tipo Southern y demostró que contenía el alelo de thyA disfuncional. Se utilizó pEST para construir 638T y también será útil para construir 1333T y L911 T o cualquier otra cepa de V. cholerae con derivado defectuoso de thyA definido adicional.

Sigue una breve descripción de los dibujos.

Figura 1. Secuencia de nucleótidos del gen thyA y secuencia de aminoácidos prevista del polipéptido codificado.

Figura 2. Detección de vibriones del cólera marcados con celA en ensayos en placa que emplean agar indicador-CMC.

Figura 3. Detección de flagelos en el mutante L911 de Vibrio cholerae del serogrupo O139.

Figura 4. Detección de TCP sobre la superficie bacteriana de 638T.

Figura 5. Representación esquemática del vector suicida pGPH6 utilizado para construir mutantes hap::celA de V. cholerae.

Figura 6. Representación esquemática del vector suicida de pEST utilizado para construir mutantes de thyA.

Ventajas

Esta invención proporciona un enfoque para producir mutantes más seguros de Vibrio cholerae mediante inactivación del gen de la hemaglutinina/proteasa de los mutantes no toxinógenos. Tales derivados son útiles como vacunas.

La seguridad e inmunogenicidad de las cepas 638, 1333 y L911 son similares a las presentadas en la patente WO 95/18633. Adicionalmente, son representativas de todas las cepas de Vibrio cholerae circulantes durante la pandemia actual y del nuevo serogrupo O139. Dichas cepas también se marcan con un marcador distinguible para facilitar la toma de muestras ambiental de la vacuna. Todas las mutaciones introducidas para construir las vacunas descritas en la presente memoria están bien definidas como deleciones génicas o como inserciones génicas de naturaleza conocida. Esta invención también da a conocer un procedimiento para mejorar la bioseguridad ambiental de las cepas de cólera vivas que van a utilizarse como vacunas orales. Se logra esta mejora produciendo una mutación definida en el gen thyA que también se describe en la presente memoria.

La cepa de vacuna 638T se caracteriza por su bioseguridad ambiental mejorada. Presenta una auxotrofía de timidina que limita su proliferación en ecosistemas naturales, en los que son escasas las pirimidinas libres, si acaso existen.

Es improbable que la resistencia a trimetoprima conferida al candidato de vacuna de Vibrio cholerae 638T por su gen thyA mutante se transmita a otras bacterias debido a su naturaleza recesiva. Adicionalmente, la resistencia a trimetoprima está condicionada a la presencia de timina o timidina en un cultivo.

La readquisición de los genes de toxina colérica u otro ADN por medio de transferencia génica horizontal es superflua en estas cepas, puesto que no proliferan fuera del laboratorio.

INFORMACIÓN GENERAL

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SOLICITANTE

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	NOMBRE: Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
	CALLE: Avenida 25, esquina a 158.
	CIUDAD: Ciudad de La Habana.
	PROVINCIA: Ciudad de La Habana.
	PAÍS: Cuba.
	CÓDIGO POSTAL: 12 100.
	TELÉFONO: 218066, extensión 248.
	FAX: 537 330497
	E-MAIL: "Rafael Fando" <Fando@biocnic.cneuro.edu.cu>

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TÍTULO: Candidatos de vacuna de Vibrio cholerae novedosos y procedimientos para su construcción.

NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

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	DESTINATARIO: Consultores de Marcas y Patentes "CLAIMS".
	CALLE: 14 #308 e/ 3ra y 5ta Ave. Miramar, Playa.
	CIUDAD: Ciudad Habana.
	PROVINCIA: Ciudad de La Habana.
	PAÍS: Cuba.
	CÓDIGO POSTAL: 11 300.

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DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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	NÚMERO DE SOLICITUD: 142/97
	FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de diciembre de 1997.

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INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

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	NOMBRE: Maria Lourdes Ruiz Sotolongo.
	NÚMERO DE REGISTRO: 5

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INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº: 1

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CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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	LONGITUD: 852 pares de bases.
	TIPO: Ácido nucleico.
	TIPO DE CADENA: Sencilla.
	TOPOLOGÍA: lineal.

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TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico.

FUENTE:

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	MICROORGANISMO: Vibrio cholerae.
	CEPA: C7258

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CARACTERÍSTICA:

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	NOMBRE: secuencia codificante del gen thyA.
	UBICACIÓN: 1-852

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CARACTERÍSTICA:

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	NOMBRE: Polipéptido deducido a partir de la secuencia codificante de thyA.
	UBICACIÓN: 1-284.
	DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Centro Nacional de Investigaciones Científicas

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<120> Candidatos de vacuna de Vibrio cholerae novedosos y procedimientos para su construcción.

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<130> incierto

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<140> Documento PCT/CU 98/00008

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<141> 30-12-1998

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<150> Documento CU 142/97

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<151> 30-12-1997

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 852

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<212> ADN

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<213> Vibrio cholerae

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).(852)

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<223> Secuencia de nucleótidos de thyA

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<400> 1

9

10

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<210> 2

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<211> 284

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<212> PRT

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<213> Vibrio cholerae

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<400> 2

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Claims

1. Procedimiento de producción de una cepa de vacuna adecuada para la administración oral a seres humanos para inducir una protección inmunológica frente al cólera, caracterizado porque la reactogenicidad residual se elimina o se reduce hasta un nivel aceptable a partir de un mutante no toxinógeno de Vibrio cholerae mediante la interrupción del gen de la hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador celA, y caracterizado además porque se introduce una mutación definida e irreversible en su gen thyA mostrado en la SEC ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa de Vibrio cholerae, mediante lo cual se limita la proliferación en ecosistemas naturales.

2. Utilización de una o más cepas de vacuna de Vibrio cholerae derivadas de cepas originales no toxinógenas en las que el nivel de reactogenicidad residual se ha eliminado o reducido hasta un nivel aceptable mediante la interrupción del gen de hemaglutinina/proteasa (hap) con el gen marcador celA, en la fabricación de una preparación farmacéutica adecuada para la administración oral a seres humanos para inducir una protección inmunológica frente al cólera y en la que dicha cepa o dichas cepas de vacuna de Vibrio cholerae están caracterizadas además porque presentan una mutación definida e irreversible introducida en su gen thyA mostrado en la SEC ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa, mediante lo cual se limita la proliferación en ecosistemas naturales.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicha(s) cepa o cepas de vacuna de Vibrio cholerae se mezcla(n) con un 2% de tampón bicarbonato.

4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3, de una formulación liofilizada.

5. Preparación farmacéutica con bioseguridad ambiental mejorada adecuada para la administración a seres humanos para inducir protección inmunológica frente al cólera que comprende como componente esencial una o más cepas de vacuna de Vibrio cholerae derivada(s) de una cepa original no toxinógena, estando la cepa o cepas caracterizadas porque presentan un nivel aceptable de reactogenicidad residual debido a la presencia de un gen de hemaglutinina/proteasa (hap) disfuncional que resulta de la interrupción del gen hap con el gen marcador celA y porque presenta además una mutación definida e irreversible introducida en el gen thyA mostrado en la SEC ID nº:1 que codifica para timidilato sintasa, mediante lo cual se limita la proliferación en ecosistemas naturales.