ES2199944T3 - Procedimiento para la elaboracion de una cepa mutante geneticamente estable de vibrio cholerae. - Google Patents
Procedimiento para la elaboracion de una cepa mutante geneticamente estable de vibrio cholerae.Info
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Abstract
LA INVENCION OFRECE ESPECIES MUTANTES ESTABLES GENETICAMENTE NO TOXIGENICOS DE V. CHOLERAE Y UN METODO PARA HACER QUE SEAN UTILES COMO VACUNAS ORALES, VIVAS PARA INDUCIR LA PROTECCION INMUNOLOGICA CONTRA EL COLERA. LAS ESPECIES MUTANTES SON MUTANTES GENETICAMENTE DISEÑADAS, EN LAS CUALES LA CARENCIA DE ADN CODIFICA UNA SUBUNIDAD CTXA FUNCIONAL QUE ES LA RESPONSABLE DE MUCHOS DE LOS SINTOMAS DEL COLERA. A LAS ESPECIES TAMBIEN LES FALTAN SECUENCIAS ATTRS1 FUNCIONALES QUE SE REQUIEREN PARA LA RECOMBINACION Y AMPLIACION DEL ELEMENTO GENETICO CTX. ESTAS ESPECIES SON SEGURAS PORQUE NO PUEDEN RECOMBINARSE CON LOS MEDIOS QUE CONTIENEN ATTRS1 DE TIPO SILVESTRE QUE INCLUYEN EL ADN QUE CODIFICA CTXA.
Description
Procedimiento para la elaboración de una cepa
mutante genéticamente estable de Vibrio cholerae.
El campo de la invención son las vacunas de
Vibrio cholerae. Tras más de 100 años de investigaciones
sobre el cólera existe todavía la necesidad de una vacuna contra el
cólera eficaz. Ha habido seis pandémicos de esta enfermedad
provocados por tipos de cólera V que pertenecen al biotipo
"clásico". Los agentes etiológicos del pandémico actual (el
séptimo) pertenecen al biotipo "El Tor" (Finkelstein, Crit.
Rev. Microbiol 2:553-623, 1973, Wachsmuth y otros,
The Lancet 337:1097-1098, 1991). Recientemente, el
séptimo pandémico se ha extendido a un nuevo escenario, el de
Sudamérica. A principios de Enero de 1991, una epidemia de cólera
provocó más de 250.000 casos y más de 2.000 muertes en Perú,
Ecuador, Colombia, y Chile. Antes de esta epidemia se estimó que se
producían más de 200.000 casos de cólera por año, principalmente en
la India, Bangladesh, África y el Oeste de Asia (Tacket y otros,
Cholera Vaccines. En Vaccines: New Approaches to Immunological
Problems, Ellis, R. W., editor,
Butterworth-Heinemann, Boston, 1992).
En Noviembre de 1992, una forma
non-01 de V. cholerae antigénicamente
distinta emergió en la India y en Bangladesh y en ocho meses
provocó unos 500.000 casos estimados y 6.000 muertes. El potencial
pandémico de esta nueva cepa, designada como serogrupo 0139
sinónimo "Bengal", parece asegurado y es un nuevo motivo de
preocupación en todo el mundo en desarrollo. Estas recientes
experiencias destacan la necesidad de unas vacunas efectivas del
cólera contra enfermedades debidas a El Tor 01 y a los serotipos
0139 Bengal del V. cholerae.
Debido a que la infección natural del cólera y la
recuperación de la misma de éste induce una inmunidad que dura por
lo menos 3 años (Tacket y otros, Supra; Levine y otros, J, Infect.
Dis. 143:818-820, 1981; Cash y otros, J. Infect.
Dis. 130: 325-333, 1974), se ha realizado un gran
esfuerzo para producir vacunas de cólera atenuado de virus vivos que
al administrarse por vía oral imitarían la enfermedad en sus
propiedades de inmunización pero no producirían los síntomas o
reacciones adversos en el individuo inmunizado (es decir, mostrar
una baja reactogenicidad). Las vacunas de este tipo suponen la
eliminación de mutaciones que inactivan el gen que codifica la
subunidad A de la toxina del cólera, una proteína que es
responsable de la mayoría de las diarreas que se dan en esta
enfermedad (Mekalanos y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:151-155, 1982; Mekalanos y otros, Nature
306:551-557, 1983; Kaper y otros, Nature
308:655-658, 1984; Kaper y otros, Biotecnología
2:345, 1984; Pierce y otros, Infect. Immun.
55:477-481, 1987; Taylor y otros, Vaccine
6:151-154, 1988; Levine y otros, Infn. Immun. 56;
161-167, 1988; Herrington y otros J. Exper. Med.
168:1487-1492, 1988; Levine y otros, Lancet
ii:467-470, 1988; Koper y otros, Res. Microbiol.
141:901-906, 1990; Pearson y otros, Res. Microbiol.
141:893-899, 1990). Véase también Mekalanos,
Patentes americanas Nos. 5.098.998 y 4.882.278, y Koper y otros,
patente americana No. 4.935.364, que se incorporan aquí por
referencia. Aunque se han desarrollado vacunas de virus muertos con
células enteras de administración oral y diversas vacunas de virus
vivos de cólera atenuado, la más prometedora de éstas proporciona
una pequeña protección contra el biotipo El Tor del V.
cholerae y probablemente ninguna protección contra el serotipo
0139. La principal cuestión asociada a las vacunas del cólera es la
seguridad, la estabilidad y su grado de antigenicidad.
Con relación a los genes de la toxina de V.
cholerae, la diversidad genética entre cepas toxicógenas y no
toxicógenas ha sido examinada por Chen y otros (1991, Epidemiol.
Infect. 107:225). Mekalanos (1983, Cell 35:253) informa acerca de
la duplicación y amplificación de los genes de la toxina de V.
cholerae, Millar y otros (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:3471) expone la regulación trascripcional de los genes de
toxina. Otros genes del V. cholerae, cuyos productos pueden
desempeñar un papel en la patogenicidad de este organismo, incluyen
los genes "pilus" corregulados por toxina (Shaw y otros, 1990,
Infect. Immun. 58:3042; Sharma y otros, 1989, Vaccine, 7:451; Sun
y otros, 1990, J. Infect. Dis. 161:1231; Hall y otros, 1991,
Infect. Immun. 59:2508; Taylor y otros, 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:2833), y el gen que codifica el factor de
colonalización (Taylor y otros, 1988, Vaccine 6:151).
La invención presenta, en un aspecto, cepas
mutantes genéticamente estables y no toxicógenas de V.
cholerae que resultan útiles como vacunas orales de virus vivos
para inducir las cepas mutantes estables inmunológicas del V.
cholerae que son útiles como vacunas de administración oral de
virus vivos para inducir una protección inmunológica contra el
cólera. Las cepas mutantes son mutantes modificados genéticamente
que carecen del ADN que codifica una subunidad ctxA
funcional y también carecen de cualquier secuencia attRS1
funcional. Se entiende por secuencia attRS1 una secuencia de
17 pares de bases contenida en el elemento genético CTX que se
requiere para la recombinación y amplificación del elemento
genético CTX, o suficiente de esa secuencia para permitir tal
recombinación y amplificación. Mutantes que "carecen de cualquier
secuencia attRS1 funcional" son aquellos que
substancialmente no pueden experimentar una recombinación en un
punto específico con vehículos que contienen attRS1, debido
a que las secuencias attRS1 de tipo salvaje están totalmente
suprimidas o están lo suficientemente suprimidas o mutadas como
para evitar tal recombinación. En consecuencia, dichas cepas de
V. cholerae son más seguras debido a que no pueden
recombinarse con vehículos que contienen attRS1 de tipo
salvaje que incluyen el ADN que codifica ctxA.
La invención también presenta, en otro aspecto de
la misma, un procedimiento para la producción de las cepas de
V. cholerae descritas anteriormente. El procedimiento
implica la introducción de un plásmido en V. cholerae de
tipo salvaje que contiene un fragmento de ADN de V. cholerae
que incluye una mutación en las secuencias ctxA y
attRS1. El fragmento de ADN de V. cholerae es capaz de
recombinarse con ADN de V. cholerae de tipo salvaje dentro
del organismo para generar la cepa mutante.
\newpage
Aunque puede utilizarse cualquier serotipo de
V. cholerae, en realizaciones preferidas, la cepa mutante de
V. cholerae pertenece al serotipo El Tor, y más
preferiblemente, al serotipo Inaba u Ogawa o el serotipo
non-01 de V. cholerae, preferiblemente el
serotipo "Bengal" 0139. Preferiblemente, los mutantes carecen
de todo el núcleo CTX y secuencias attRS1 y más
preferiblemente la cepa mutante es Perú-2, Band-2,
Bah-2, o un derivado del serotipo Bengal, tal como
Bengal-2 ("Beng-2") o
Bengal-3 ("Beng-3") tal como se
describe a continuación.
Nuestras cepas mutantes incluyen opcionalmente
mutaciones adicionales introducidas para mejorar la seguridad y/o
la inmunogenicidad de la vacuna. Dichas mutaciones adicionales
incluyen, pero no se limitan a ellas, la inactivación de uno o más
genes implicados en la recombinación de ADN, por ejemplo el gen
recA codificado por la cepa, y la introducción de genes
adicionales que puede introducirse en el cromosoma del V.
cholerae, preferiblemente en el gen lacZ V.
cholerae. Genes adicionales preferidos incluyen un gen que
codifica la subunidad B del V. cholerae o cualquier antígeno
heterólogo tal como la subunidad B de toxina de tipo Shiga, o un
gen que codifica el antígeno CFA E. coli, o un antígeno de
VIH antigénico. Se entiende por antígeno heterólogo cualquier
antígeno que no se expresa normalmente por V. cholerae. Por
ejemplo, el antígeno heterólogo puede ser antígeno lipopolisacárido
Shigella (LPS), toxina Shiga, diversos antígenos CFA de cepas de
E. coli enterotoxigénico, toxina de ántrax, endotoxina A
pseudomonas, fragmentos antigénicos de cápside de VIH, toxina
pertussis, toxina tetánica; antígenos del virus del Herpes, virus
de la rubéola, virus de la gripe, virus de las paperas, virus del
sarampión, virus de la poliomielitis; y polipéptidos inmunógenos de
parásitos eucariotas que provocan la malaria, neumonía
Pneumocystis, y toxoplasmosis, pueden expresarse en una vacuna de
virus vivos de V cholerae. Preferiblemente, la cepa mutante
que presenta mutaciones adicionales es Perú-14, Perú-3, Perú- 4,
Perú-5, Bang-3, Bang-5,
Bah-3, Bah-4, Bah-5
o un derivado atenuado de Bengal.
Se entiende por subunidad ctxA la
subunidad A de la toxina del cólera que es responsable, si es
funcional, de muchos de los síntomas del cólera (por ejemplo,
náuseas, diarrea, etc). Más preferiblemente, las cepas incluyen la
supresión de todo el denominado "elemento genético central",
que incluye no solamente la ctxA/B, sino también la zona
conocida como ICF (Factor de Colonización Intestinal, probablemente
equivalente al CEP "pilin central codificado") y ZOT, que se
describe en mayor detalle a continuación.
En otro aspecto, la invención presente una cepa
mutante genéticamente estable no toxicógena de V. cholerae
que es útil como vacuna de administración oral de virus vivos para
inducir una protección inmunológica contra el cólera. La cepa
mutante es un mutante modificado genéticamente al que le falta ADN
que codifica una subunidad ctxA funcional. La cepa también
puede ser deficiente a la penetración de agar blando. Por
deficiente a la penetración de agar blando se entiende que no tiene
la capacidad de penetrar un medio de alta viscosidad tal como se
mide in vitro por aglomeración sobre y en el medio agar que
es entre un 0,25 y un 0,4% de agar. La cepa preferible puede ser
también filamentosa, es decir, un 25% o más células mayor de 15 nM
de longitud bajo condiciones de crecimiento logarítmico. En
realizaciones preferidas la cepa es también ATT-.
En realizaciones preferidas, nuestra vacuna
comprende por lo menos dos cepas diferentes de V. cholerae
que son mutantes genéticamente estables no toxicógenas los cuales
carecen del ADN que codifica una subunidad ctxA funcional y
son también deficientes a la penetración del agar blando. Una de
las dos cepas se deriva preferiblemente de la cepa Perú y la otra
se deriva de la cepa Bengal. Cada una de las cepas componente puede
ser ctx^{-}, att^{-}, y recA^{-}.
Dependiendo de la epidemiología local relevante, las cepas de la
vacuna pueden administrarse juntas en una única dosis, o más
preferiblemente, de manera separada con un intervalo de 7 a 28
días. Si el único de los serotipos presenta un tratamiento de una
enfermedad, puede ser preferible administrar un régimen de vacunas
que comprenda solamente una cepa.
La invención presenta también, en otro aspecto de
la misma, una vacuna de cólera de administración oral de virus
muertos que comprende por lo menos una primera y una segunda cepa
V. cholerae en la que por lo menos dos de las cepas son
serotipos distintos y todas las cepas de la mezcla carecen de ADN
que codifica una subunidad ctxA funcional. La vacuna
contiene también una subunidad B de toxina del cólera producida por
al menos uno de los serotipos. Preferiblemente, uno de los
serotipos de la vacuna es un serotipo Ogawa y otro de los serotipos
es un serotipo Inaba. Más preferiblemente, la vacuna de
administración oral de virus muertos comprende Bah-3
y Peru-3 o bien Bang-3, o tanto
Perú-3 como Bang-3, tal como se define a
continuación. Cualquiera de las combinaciones de vacuna de
administración oral puede incluir también células del serotipo
Bengal, tal como se define a continuación, incluyendo
Bengal-2 y Bengal-3. Las cepas
pueden administrarse individualmente, juntas, o en dosis
consecutivas con un intervalo de 7 a 28 días.
La invención también presenta, en otro aspecto de
la misma, un procedimiento para la elaboración de una vacuna V.
cholerae de virus muertos. El procedimiento supone el
crecimiento de por lo menos una primera y una segunda cepa de V.
cholerae, en el que cada cepa de la mezcla carece de ADN que
codifica una subunidad ctxA funcional. Las cepas se recogen
después del medio de crecimiento y las células se matan. La
subunidad B de la toxina del cólera, producida por al menos una de
las cepas se obtiene del medio en el cual la cepa se propagó y se
añade a las células muertas. La mezcla de bacterias muertas y la
subunidad B de la toxina del cólera se suspende entonces en un
portador farmacéuticamente aceptable.
Mutantes tales como los descritos anteriormente
resultan útiles como vacunas de cólera y se han mejorado sus
propiedades genéticas en comparación con vacunas anteriores.
\newpage
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción de
realizaciones preferidas de la misma.
Primero se describirán brevemente los
dibujos.
La figura n° 1 es un diagrama esquemático de los
elementos genéticos CTX de cepas de V. cholerae toxicógeno
P27459-Sm, C6709-Sm y
E7946-Sm. Los cuadros llenos representan secuencias
RS1. Entre las secuencias RS1 se encuentra una zona mostrada como
un cuadro abierto (denominada zona central) que contiene los genes
ctxAB y genes que codifican zot, el factor de
colonización intestinal (ICF). En los extremos de RS1 las
secuencias están rellenas en círculos que representan copias de
secuencias que corresponden a 16 de 17 bases con la secuencia de 17
pares de bases attRS1 (CCTAGTGCGCAATTATGT) [SEC. ID. N° 1]. Aunque
los elementos CTX de las tres cepas varían en su estructura en base
al número de copias de las zonas RS1 y central, debería indicarse
que estos elementos se encuentran insertados en el mismo sitio
cromosómico en todas las cepas El Tor del V. cholerae.
La figura n° 2 (A) es un mapa de restricción del
cromosoma que contiene la zona CTX de la cepa
C6709-Sm con el elemento CTX mostrado
esquemáticamente como en la figura n° 1. No se muestran los mapas
de restricción de la cepa P27459-Sm y
E7946-Sm que son las mismas excepto para la
variación observada en sitios que se aplican dentro del núcleo del
elemento CTX o secuencias RS1 tal como se ha designado
esquemáticamente en la figura n° 1. (B) mapa de restricción de la
zona cromosómica correspondiente de la cepa Bang-1,
Bah-1, y Perú-1.
La figura n° 3 (A) mapa de restricción del
plásmido pGP60 que lleva un fragmento de ADN insertado
correspondiente al cromosoma que contiene la zona CTX de la cepa
P27459-Sm con el elemento CTX mostrado
esquemáticamente como en la figura n° 1. Por debajo de éste existe
una flecha de dos puntas que designa el ADN que se ha suprimido en
el plásmido pAR62. (B) El mapa de restricción de la zona CTX de la
cepa P27459-Sm se muestra incluyendo los sitios de
restricción que se encuentran fuera de la zona clonada en el
plásmido pGP60. (C) Una demostración de los casos de recombinación
(líneas a trazos) entre el plásmido pAR62 y el cromosoma que
producía la supresión Tipo-2 que dio lugar, en cepas
parenterales C6709-Sm, P27459-Sm y
E7946-Sm, a la supresión de mutantes Perú-2,
Bang-2, y Bah-2, respectivamente.
(D) Mapa de restricción del cromosoma de las cepas Perú-2,
Bang-2, y Bah-2.
La figura n° 4 es una representación esquemática
de la configuración del plásmido pGP52.
La figura n° 5 es una representación esquemática
de la generación de pJM84.1 y pJM84.2. Se generó, mediante PCR, un
fragmento de 0,6 kb que codifica una subunidad B sin estimulación.
Este ADN fue ligado en pCR100 y digerido con SpeI/EcoRI. El
fragmento de restricción de 0,6 kb resultante fue ligado en
vectores pVC100 y pRT41 digeridos EcoRI/XbaI, produciendo pJM1001 y
pJM411, respectivamente. Cada plásmido fue digerido con
BamHI/EcoRI, tratado con Klenow, flanqueado con elementos de enlace
XbaI, y digerido con XbaI. Los fragmentos purificados fueron
ligados a pGP84 digerido XbaI, produciendo pJM84.1 y pJM84.2.
La figura n° 6 es una representación esquemática
de la inserción de la ctxB en el cromosoma. Se integró
pJM84.1 no replicativo en Perú-2, Bang-2 o
Bah-2 por recombinación homóloga. Posteriormente se
recubrieron colonias recombinantes resistentes a la ampicilina en
un medio que contenía estreptomicina sin ampicilina, reduciendo,
de este modo, la presión selectiva para la resistencia a la
ampicilina. Las colonias resultantes sensibles a la ampicilina se
aislaron y fueron seleccionadas para la extirpación del ADN
flanqueado por secuencias de ADN recA homólogo.
Contemplamos el uso de cepas atenuadas de V.
cholerae que pueden utilizarse como vacunas de administración
oral de virus vivos o bien de virus muertos para proteger a las
personas contra el cólera y potencialmente otras enfermedades.
En Perú en 1991 se elaboraron derivados atenuados
de una cepa de V. cholerae C6709-Sm aislada
de un paciente de cólera las cuales pueden utilizarse como vacunas
de administración oral del cólera con virus vivos. Los derivados
Perú-1 y Perú-2, llevan deleciones pequeñas de
tipo-1 (núcleo) y deleciones grandes de
tipo-2, respectivamente, que extraen el ADN que
codifica la toxina del cólera además del ADN que codifica
zot, un factor de colonización intestinal (ICF) que no está
relacionado con la toxina del cólera. Debido a que una excesiva
colonización intestinal puede ser responsable de efectos
secundarios negativos observados en humanos administrados con
anteriores vacunas prototipo del cólera de virus vivos, la
supresión de genes que codifican tanto la toxina del cólera como el
ICF en Perú-1 y Perú-2 hará que estas cepas sean menos
reactogénicas en vacunas a la vez que retienen sus propiedades
inmunógenas y, por lo tanto, protectoras.
La deleción grande de tipo-2
presente en el Perú-2 también elimina una secuencia de tipo
inserción denominada RS1 que está presente en dos o más copias como
parte de un segmento de ADN mayor denominado elemento genético CTX.
La secuencia RS1 codifica un sistema de recombinación en un punto
específico que puede duplicarse a una elevada frecuencia y provocar
la inserción del elemento CTX en el cromosoma del V.
cholerae en un sitio de destino de 17 pares de bases denominado
attRS1. En los extremos de las secuencias RS1 existen unas
secuencias casi idénticas a attRS1 (y recombinantemente
activas aparentemente). Estas secuencias son como sigue:
5'-
TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGCATTATGTATGTTATGTTAAAT-3'
[SEC. ID. N° 2]
5'-TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGCATTATGTGGCGCGGCAT...RS1...
-3' [SEC. ID. N° 3]
5'-AAACCCTAGATTCCGCCGCCTTAGTGCGCATTATGTATGTTATGTTAAAT-3'
[SEC. ID. N° 4]
Se han subrayado la secuencia attRS1 y una
similar presentes en los extremos de la RS1. Nótese que la
secuencia cromosómica que flanquea la attRS1 está presente
en el lado izquierdo y en el lado derecho de la RS1, encontrándose
la única superposición en una secuencia de 17 pares de bases que es
idéntica a la attRS1 del extremo izquierdo de la RS1 y una
secuencia de 18 pares de bases que coincide con 17/18 pares de
bases con la attRS1.
Las vacunas del cólera atenuado de virus vivos
modificado genéticamente son teóricamente seguras solamente si no
pueden volver, o de otra manera, recuperar la capacidad para
producir la toxina del cólera. Las cepas que llevan una única copia
de la secuencia attRS1 pueden adquirir eficazmente una nueva
copia del elemento CTX a través de una transferencia de ADN a
través de la conjugación del factor P o bien por transducción
bacteriófaga. De este modo, las deleciones que hacen que el V.
cholerae carezca de secuencias RS1 y attRS1 pueden
evitar que una cepa para vacunas vuelva a adquirir el elemento
genético CTX en naturaleza a través de su propio sistema de
recombinación de sitio específico. Dicha deleción se encuentra
presente en la cepa Perú-2 y sus derivados.
Se han elaborado seis cepas mutantes de V.
cholerae con propiedades similares pero no idénticas. Se
elaboraron cuatro cepas que llevan los mismos dos tipos de
deleciones (Tipo-1 y Tipo-2) como
cepas Perú-1 y Perú-2 en cepas de V. cholerae aislado de
pacientes en Bangladesh (P27459-Sm) y Bahrain
(E7946-Sm). Estos cuatro derivados,
Bang-1, Bang-2,
Bah-1 y Bah-2 son también el objeto
de la invención ya que varían en colonización y/o otras
propiedades (por ejemplo, serotipo) y son, por lo tanto,
potencialmente más apropiadas que las cepas Perú correspondientes
para la utilización como vacunas en otras zonas del mundo.
Aunque la deleción Tipo-1 más
pequeña presente en las tres cepas Peru-1,
Bang-1 y Bah-1 no elimina todas las
copias de RS1, esta particular deleción afecta a las propiedades de
colonización intestinal de algunas de estas cepas de una manera más
severa que la deleción mayor presente en Perú-2,
Bang-2 y Bah-2.
Una deleción de Tipo-2 elimina
todas las secuencias que corresponden al elemento genético CTX
incluyendo las secuencias RS1 y todas las copias de la secuencia
attRS1 (figura n° 1). La deleción de Tipo-2
se elaboró a través de la recombinación entre el cromosoma del
V. cholerae y las secuencias del plásmido clonado sobre el
plásmido pAR62 tal como se muestra en la figura n° 3. El plásmido
pAR62 es una derivado del plásmido pGP60 y lleva una deleción de
Tipo-2 en la que se suprimió el fragmento mostrado
en la figura n° 3. El plásmido pGP60 se elaboró en primer lugar
generando una librería de genomas de la cepa P27459 mediante la
inserción de fragmentos parcialmente digeridos de
20-30 kb Sau3A en el sitio BamHI del plásmido
pLAFR2 (Friedman y otros, 1982, Gene 18:289). Las colonias fueron
examinadas mediante hibridación utilizando unas sondas derivadas de
la zona ctx (Mekalanos, 1983, Cell 35:253). Se recogió una
colonia positiva y el plásmido que se aisló de la misma se
denominó pGP60. Un análisis de enzimas de restricción de este
plásmido confirmó que contenía todas las secuencias de elementos
CTX y ADN de flanqueo adicional. El plásmido pGP60 codifica una
resistencia a la tetraciclina. Este plásmido se introdujo en una
cepa de V. cholerae por conjugación o electroporación
seguido de una selección sobre un medio que contenía 3 \mug/ml de
tretraciclina. Dicha cepa que lleva el plásmido fue examinada
mediante hibridación de colonias con una sonda L-3
radioactiva preparada tal como se describe en Goldberg y Mekalanos
(J. Bacterial. 165:723-731, 1986). Las colonias que
llevan la deleción de Tipo-1 insertada en el
cromosoma no hibridizada la sonda L-3 y,
sorprendentemente, sucedía en una elevada frecuencia (es decir,
alrededor de un 1% de las colonias examinadas). Se utilizó un
ensayo Southern Blot para confirmar la presencia de las deleciones
esperadas en estas cepas.
Una "deleción central" solamente elimina
secuencias que corresponden al núcleo del elemento CTX pero deja
detrás una copia del elemento RS1 en el cromosoma (Goldberg y
otros, J, Bacteriol. 165:723-731, 1986) (Figura n°
2). Estas deleciones suceden de manera espontánea a través de la
recombinación homóloga entre las secuencias RS1 situadas en el lado
derecho y en el lado izquierdo de la zona central tal como se
muestra en la figura n° 2. Las colonias de V. cholerae que
contienen deleciones centrales pueden identificarse de dos maneras.
En primer lugar, si la cepa lleva un marcador seleccionable tal
como un gen que codifica resistencia a la Kanamicina insertado en
la zona central, entonces la deleción central hace que dicha cepa
sea sensible a la kanamicina (Goldberg y otros, J. Bacteriol.
165:723-731, 1986). En segundo lugar, las colonias
que contienen la deleción central también pueden ser identificadas
por hibridación de colonias utilizando una sonda
CT-1 radioactiva que no hibridice a las cepas que
llevan esta deleción (Golberg y otros, J. Bacteriol.
165:723-731, 1986). A través de cualquier método,
las colonias que llevan estas deleciones se produjeron en una
frecuencia de alrededor de un 1 por 1000 colonias examinadas. Se
utilizó entonces un análisis por hibridación Southern Blot para
confirmar las deleciones esperadas en estas cepas.
El plásmido pGP52 es un plásmido suicida que
solamente es capaz de replicarse en cepas de E. coli tales
como SM10\lambdapir (Pearson y otros, 1990, Res. Microbiol.
141:893). El plásmido pGP52 se elaboró digiriendo en primer lugar
el plásmido pGP7 (Mekalanos, 1983, Cell 35:253) con CLAI y SphI.
Este plásmido contiene dos secuencias RS1 (designadas como RS1 y
RS2) derivadas de la cepa de V. cholerae
E7946-Sm. Se clonó un fragmento de ADN que contenía
las secuencias RS1 en pBR322 y el plásmido resultante se denominó
pGP20. Este plásmido fue digerido después con EcoRV (que se corta
en las secuencias RS1). Cuando este plásmido quedó religado se
generó un nuevo plásmido designado como pGP20R que contenía una
versión híbrida de RS2 denominada RS2*, en la que las secuencias
RS2 híbridas estaban flanqueadas por secuencias centrales. Se
subclonó después un fragmento SspI-SphI de RS2 en el
plásmido suicida pJM703.1 que había sido digerido con NruI y SphI.
El plásmido pJM703.1 se describe en Millar y otros (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3471). El plásmido resultante se denominó pGP52.
En la figura n° 4 se muestra un diagrama que representa la
configuración del pGP52.
Cuando el pGP52 es transferido por conjugación a
cepas de V. cholerae que contienen secuencias attRS1,
se integra en el cromosoma del V. cholerae mediante un
evento de recombinación en un sitio específico entre la secuencia
attRS1 en el cromosoma y la secuencia attRS1 presente
en el plásmido. Los eventos de integración tales como éstos pueden
ser cuantificados determinando el número de colonias que mantienen
de manera estable (es decir, son no seleccionadas) la resistencia a
la ampicilina debido a que la resistencia a la ampicilina se
codifica mediante pGP52. La confirmación de la integración puede
obtenerse en experimentos de hibridación Southern Blot. Si la cepa
del V. cholerae a analizar presenta secuencias attRS1
funcionales entonces la integración se observará en el análisis.
Si la cepa no contiene secuencias attRS1 funcionales, la
integración no tendrá lugar.
Con el fin de evaluar la capacidad de los
distintos candidatos de vacuna para servir como destinatarios para
el pGP52, se llevaron a cabo los siguientes experimentos. Se mezcló
una cepa E. coli donante SM10\lambdapir pGP52 con la cepa
de la vacuna de ensayo del V. cholerae destinatario en 5 ml
de un medio Luria broth a una concentración de 10^{7} células de
cada cepa por cultivo. La mezcla se incubó a 37°C durante 5 horas
en cuyo momento se diluyó 1:100 en un medio fresco Luria broth que
contenía 100 \mug/ml de estreptomicina. La finalidad de la
estreptomicina es seleccionar contra la cepa donante de E.
coli matándola. De esta manera, solamente las cepas
destinatarias del V. cholerae resistente a la estreptomicina
son capaces de crecer. Este cultivo se incubó hasta que la
velocidad de crecimiento de las células alcanzó la saturación. Los
cultivos se diluyeron nuevamente y se incubaron también hasta que
cada célula se había replicado un total de 20 veces en ausencia de
cualquier selección positiva para el pGP52. Este cultivo se diluyó
y se cubrió después sobre dos composiciones del medio separadas con
el fin de cuantificar el número de colonias viables. Uno de estos
medios es medio Luria broth que no contiene ningún antibiótico. El
número de colonias que aparecen en estos recubrimientos representa
el número total de células en el cultivo. El otro medio es Luria
broth que contiene ampicilina. El número de colonias que aparece en
estos revestimientos representa el número de eventos de
integración que se producen tras la conjugación. Los resultados se
expresan como una relación de integración estable de eventos/número
total de células viables y se presenta a continuación en la Tabla
1.
| Cepa | Eventos de integración estable/# total de células viables | |
| Perú-1 | \hskip-2.3cm 5,2 x 10^{-5} | |
| Perú-2 | No detectable (< 5 x 10^{-8}) | |
| Perú-3 | No detectable (< 5 x 10^{-8}) | |
| Perú-4 | No detectable (< 5 x 10^{-8}) | |
| Perú-5 | No detectable (< 5 x 10^{-8}) |
En base a estos datos es evidente que la cepa
Perú-1, que contiene dos copias de las secuencias attRS1 es
capaz de integrar el plásmido pGP52 en su cromosoma en una
frecuencia que es por lo menos 1000 pliegues más alta que
cualquiera de las otras cepas analizada, todas las cuales carecen
de secuencias attRS1.
Las cepas de vacuna Perú-2,
Bang-2, y Bah-2 se caracterizaban
además en términos de sus propiedades sexológicas y de
colonización. Los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que
cada derivado retenía su serotipo esperado (es decir, el serotipo
de cada una de su respectiva cepa parental mutante) cuando se
analizaron células bacteriales recién cosechadas por aglutinación
sobre un portaobjeto utilizando un suero de tipificación Inaba u
Ogawa Difco V. cholerae 01. Este resultado indica que estas
cepas todavía expresan antígenos LPS. Otras pruebas demostraron que
estas cepas mutantes eran móviles, prototróficas, y todavía expresan
pili Tcp. De este modo, los mutantes expresan una serie de
propiedades que son importantes para su capacidad para ser útiles
como cepas de vacuna de virus vivos.
Para analizar las propiedades de colonización de
estas cepas de vacuna, se utilizó un ensayo de competencia
intestinal de ratones tal como se describe en Taylor y otros (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 84:2833-2837, 1987) que se ha
mostrado que se relaciona con exactitud con las propiedades de
colonización de las cepas mutantes cuando se analizan
posteriormente en voluntarios humanos (Herrington y otros, J.
Exper. Med. 168:1487-1492, 1988). El ensayo mide
diferencias en la colonización de una cepa mutante comparando su
capacidad para competir por el crecimiento y supervivencia con otra
cepa estrechamente relacionada o isogénica. En este ensayo, las
cepas mutantes y competidoras se mezclaron en una proporción de
aproximadamente 1:1 y después se introdujeron aproximadamente un
millón de células de esta mezcla al estómago de ratones lactantes
CD-1 de 3-5 días. Tras 24 horas,
los ratones fueron sacrificados, se disecaron, se homogeneizaron, y
se recubrieron sobre un medio bacteriológico que contenía
estreptomicina que se selecciona para ambas cepas. A las colonias
que crecieron tras la incubación durante la noche se analizó
entonces los marcadores adicionales que diferencian la cepa mutante
de la cepa competidora (es decir, resistencia a la kanamicina o
hibridación con sondas de ADN radioactivo apropiadas; véase leyenda
de la Tabla 3).
Tal como se muestra en la Tabla 3, el
Bang-2 y el Bah-2 mostraron ambos
un defecto de suave colonización intestinal que produjo una
recuperación mayor de aproximadamente 4-13 pliegues
de las cepas competidoras isogénicas que las cepas mutantes tras 24
horas de crecimiento en el intestino del ratón. En la Tabla 3
también se muestran los resultados de los ensayos de competición
que implican cepas mutantes de deleción central Perú-1,
Bang-1 y Bah-1. Al igual que las
cepas de deleción de Tipo-2 Bang-2
y Bah-2, estos mutantes de deleción central fueron
deficientes en la colonización respecto a sus cepas competidoras
isogénicas. Debido a que las deleciones centrales eliminan las
secuencias correspondientes al núcleo del elemento CTX (figuras n°
1 y 3), estos datos sugieren que el núcleo del elemento CTX
codifica un "factor de colonización intestinal" o ICF. La
toxina del cólera por sí misma no es un ICF. Las cepas SM44 y SM115
que son deficientes en la producción de la toxina del cólera debido
a una deleción de los genes ctx y la inserción de un gen que
codifica resistencia a la kanamicina tal como se describe en
Goldberg y Mekalanos (J. Bacteriol. 165:723-731,
1986) compiten sus respectivas cepas mutantes
(Bang-1, Bang-2 y
Bah-1, Bah-2) en el ensayo de
competencia intestinal. De este modo, resulta evidente que el SM44
y el SM115 generan el ICF si bien no producen la toxina del cólera,
mientras que los mutantes no. Además, debido a que la zona central
CTX era el único ADN que se suprime en el núcleo así como las
deleciones de Tipo-2 y mutantes que llevan ambos
tipos de deleciones eran similarmente deficientes en la
colonización, puede concluirse también que el ICF se codifica por
la zona central del elemento CTX tal como se muestra en la figura
n° 1.
Recientemente, se ha encontrado que una nueva
toxina denominada ZOT se codificada por la zona central (Baudry y
otros, 1992, Infect. Immun. 60:428-434). Hemos
demostrado que los mutantes del gen ZOT no producen el defecto de
colonización observado en los mutantes de deleción de
Tipo-1 y Tipo-2. En consecuencia, el
ICF se designa como una propiedad independiente y distinta del ZOT.
Las cepas de vacuna que se describen aquí que llevan deleciones de
Tipo-1 o Tipo-2 son deficientes en
ICT.
En cambio, la cepa Perú-2 no presentó una
deficiencia importante en la colonización intestinal respecto a su
cepa competidora C6709-Sm (Tabla 2). Sin embargo, la
producción total de células de cada cepa C6709-Sm o
Perú-2 en los ratones fue típicamente de 10-100
pliegues menor que las cepas SM44 o SM115, lo que sugiere que la
cepa Perú C6709-Sm y su derivada Perú-2 ya pueden
llevar un defecto de colonización no definido. Debido a que la
deleción del núcleo de todo o parte del elemento CTX no provocó un
defecto adicional en la colonización o en la cepa Perú-1 o bien
Perú-2, puede concluirse que la cepa C6709-Sm ya es
parcialmente deficiente en ICF si bien lleva secuencias de ADN que
corresponden con la zona central CTX. La deleción de toda la zona
CTX tal como se define por las mutaciones de Tipo-2
presentes en las cepas Perú-2, Bang-2 y
Bah-3 asegura que los genes para el ICF no pueden
reactivarse y llegar a ser funcionales en los derivados de la
vacuna. La deleción de Tipo-2 de los genes ICF
provoca aparentemente un suave defecto de colonización. Éste puede
ser útil como mutación atenuante en el desarrollo de la vacuna del
cólera, debido a que el ICF de tipo salvaje puede ser responsable
de unos niveles indeseables de toxicidad.
| Cepas Mutantes | Cepa parental(*) | Serotipo | Tipo de deleción |
| Perú-2 | C6709-Sm | Inaba | Tipo-2 |
| Bang-2 | P27459-Sm | Ogawa | Tipo-2 |
| Bah-2 | E7946-Sm | Inaba | Tipo-2 |
(*) Nótese que la designación "Sm" detrás
del nombre de la cepa se refiere a la resistencia a la
estreptomicina. Ésta es una cepa seleccionada de manera espontánea
que es resistente a 100 \mug/ml de estreptomicina y fue el
resultado de una mutación puntual espontánea en el gen para una
proteína ribosómica. Este indicador de resistencia no está asociado
a un plásmido o transposón y por consiguiente no es transmisible a
la flora entérica. Debido a que todas las cepas mutantes derivan de
las cepas parentales indicadas, todas las cepas mutantes también
son resistentes a la estreptomicina.
| Cepa | Cepa | Relación de entrada | Relación de salida |
| Mutante | competidora | cepa mutante/competidora | cepa mutante/competidora |
| Bang-2 | SM44^{b} | 0,61 | 0,16 |
| Bah-2 | SM115^{c} | 0,92 | 0,07 |
| Perú-2 | C6709-Sm^{d} | 0,74 | 0,65 |
| Bang-1 | SM44^{b} | 0,85 | 0,05 |
| Bah-1 | SM115^{c} | 0,61 | 0,04 |
| Perú-1 | C6709-Sm^{d} | 0,89 | 0,94 |
^{a}Los ensayos de colonización de llevaron a
cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en Taylor y otros
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:2833-2837, 1987).
La relación de cepas se determinó por sensibilidad diferencial a
los antibióticos o bien mediante hibridación con sondas apropiadas
tal como se describe a continuación en las notas a pie de página
adicionales.
^{b}La cepa SM44 se ha descrito en Goldberg y
Mekalanos (J. Bacteriol. 165:723-731, 1986) y es un
derivado resistente a la kanamicina de la cepa parental
P27459-Sm. El gen que codifica la resistencia a la
kanamicina en SM44 se insertó en el locus ctx. Debido a que
el Bang-1 y el Bang-2 eran
derivados del P27459-Sm, la competición con SM44
mide las diferencias de colonización que pueden ser atribuidas al
efecto del Tipo-2 en lugar de una pérdida de
ctx. Las cepas Bang-1 y
Bang-2 eran sensibles a la kanamicina y se
diferenciaron del SM44 en estos ensayos de competición por colonias
de marcado para la resistencia a 30 \mug/ml de kanamicina.
^{c}La cepa SM115 se ha descrito en Goldberg y
Mekalanos (J. Bacteriol. 165:723-731, 1986) y es el
derivado resistente a la kanamicina de la cepa parenteral
E7946-Sm. El gen que codifica la resistencia a la
kanamicina en SM115 se insertó en el locus ctx. Debido a que el
Bah-1 y el Bah-2 son derivados del
P27459-Sm, la competición con SM115 mide las
diferencias de colonización que pueden ser atribuidas al efecto de
la deleción Tipo-2 en lugar de una pérdida de ctx.
Las cepas Bah-1 y Bah-2 eran
sensibles a la kanamicina y se diferenciaron del SM115 en estos
ensayos de competición por colonias de marcado para la resistencia
a 30 \mug/ml de kanamicina.
^{d}La cepa C6709-Sm es la cepa
parenteral de Perú-1 y Perú-2. El Perú-2 lleva una deleción de
Tipo-2 mientras que el Perú-1 lleva una deleción
central. Ambas deleciones eliminan los genes ctx y, de este
modo, tanto Perú-1 como Perú-2 fueron negativos en los ensayos blot
de hibridación de colonias cuando se analizaron con la sonda
CT-1 descrita en GHoldberg y Mekalanos (J.
Bacteriol. 165:723-731, 1986) mientras que la cepa
C6709-Sm fue positiva utilizando la misma sonda. De
este modo, tanto Perú-1 como Perú-2 se diferenciaban de
C6709-Sm en estos ensayos de competencia en unas
colonias de marcado para la hibridación con la sonda
CT-1.
Las cepas mutantes descritas pueden mejorarse más
como candidatos de vacunas creando mutaciones adicionales dentro
de cada cepa que servirán para aumentar la seguridad y la
inmunogenicidad de la vacuna.
Con relación a la seguridad, puede introducirse
una segunda mutación en el gen recA de cualquiera de las
cepas descritas anteriormente, cuya mutación está diseñada para
inactivar ese gen recA. Dichas cepas mutantes dobles serán,
por lo tanto, deficientes en la recombinación y no podrán
recombinarse con cepas de tipo salvaje de V. cholerae en el
entorno. De este modo, no podrán adquirir genes de toxina de tipo
salvaje y expresar el elemento CTX. La inmunogenicidad también
puede mejorarse introduciendo mutaciones adicionales en cada cepa
que permitirán que esa cepa exprese antígenos asociados a la
toxina del cólera (por ejemplo, la subunidad B de la toxina del
cólera) u otros antígenos heterólogos, por ejemplo, la unidad B no
tóxica de la toxina de tipo Shiga o diversos antígenos de cepas de
E. coli enterotoxicógeno, toxina Shiga, toxina del ántrax,
endotoxina A pseudomonas, toxina pertussis, toxina tetánica;
antígenos del virus del Herpes, virus de la rubéola, virus de la
gripe, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la
poliomielitis; fragmentos antigénicos de cápside de VIH; y
polipéptidos inmunógenos de parásitos eucariotas que provocan la
malaria, neumonía Pneumocystis, y toxoplasmosis (karjalainen
y otros, 1989, Infect. Immun. 57:1126; Pérez-Casal
y otros, 1990, Infect. Immun. 58:3594). De este modo, pueden ser
útiles también en la invención una serie de derivados mutados, cada
uno incorporando propiedades adicionales que hagan que las cepas
sean más seguras, genéticamente más estables y más ampliamente
inmunógenas. La elaboración de tales derivados se describe a
continuación.
Se conoce que la subunidad B de la toxina del
cólera es una molécula no tóxica y altamente inmunógena que es
capaz de inducir anticuerpos de neutralización de la toxina del
cólera. Con el fin de generar más cepas de vacuna inmunónegas se
introdujo una nueva copia del gen ctxB en las cepas de
vacuna que contenían las deleciones de Tipo-2
descritas anteriormente (debido a que las deleciones de
Tipo-2 eliminan toda la secuencia de codificación
para la subunidad B de la toxina del cólera). Esto se llevó a cabo
en una serie de etapas que se describen a continuación.
En primer lugar, se elaboró una copia del gen
ctxB utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Para la reacción PCR, el iniciador curso abajo se diseñó
para que la secuencia que codifica el ctxB pudiera
sintetizarse de tal manera que eliminara el sitio attRS1 que
existe justo curso debajo del codón de terminación del gen
ctxB. Este iniciador tenía la siguiente secuencia:
5'-GGGCTAAAGTTAAAAGACAAATATTTTCAGGC-3'
[SEC. ID. N°: 5]. El iniciador curso arriba se diseñó de manera que
solamente los últimos 24 residuos de aminoácido carboxiterminales
de la subunidad A2 pudieran codificarse a través del producto de
la reacción. Este iniciador tenía la siguiente secuencia:
5'-GGGTAGAAGTGAAACGGGGTTTACCG-3'
[SEC. ID. N°: 6]. Todos los otros nucleótidos del ADN que codifica
la subunidad A fueron excluidos de la reacción. El ADN que
codifica los aminoácidos carboxiterminales de la CtxA2 fueron
retenidos en el producto final para permitir el acoplamiento de
traslación de la expresión del gen ctxB. Debido que la
actividad tóxica asociada a la toxina del cólera deriva del
polipéptido CtxA1, todas las secuencias que codifican el
polipéptido A1 fueron excluidas de la reacción PCR.
La reacción PCR se realizó utilizando los
iniciadores ctxB tal como se ha descrito anteriormente
utilizando ADN del V. cholerae de la cepa peruana,
C6709-Sm (figura n° 5), El producto de la reacción,
un fragmento de 0,6 kilobase par, fue clonado en plásmido pCR100.
Este fragmento fue suprimido del plásmido como un fragmento de
SpeI-EcoRI de 0,6 kilobase par y fue clonado en dos
plásmidos aceptadores individuales, pRT41 digerido con
XbaI-EcoRI y pVC100 digerido con
XbaI-EcoRI. Los plásmidos resultantes, pJM411 y
pJM1001, codifican cada uno entonces una copia del gen ctxB
bajo el control del activador ctx (ctxP) o bien el activador
htpG (hptP) del V. cholerae, respectivamente. Estos
plásmidos fueron transferidos después a la cepa no toxicógena del
V. cholerae 0395-NT (Mekalanos y otros,
1983, Nature 306:551 y patente americana n° 4.935.364), generando
dos nuevas cepas denominadas 0395-NT pJM411 y
0395-NT pJM1001. La cantidad de subunidad B del
cólera producida por cada cepa se midió a través de GMI ELISA. La
cepa 0395-NT pJM411 produjo 30 \mug/ml, mientras
que la cepa 0395-NT pJM1001 produjo 100 \mug/ml
en fluidos sobrenadantes de cultivo LB. Estos resultados demuestran
que el producto de la reacción PCR era un gen ctxB funcional
que codifica una subunidad B del cólera antigénica capa de unirse a
un gangliósido GMI y por lo tanto similar al segregado por el V.
cholerae normal de tipo salvaje.
En la siguiente etapa, fragmentos EcoRI- BamHI de
ADN que especifican las configuraciones activador-ctxB
fueron subclonados en el plásmido suicida recA pGP84. Este
plásmido contiene un inserto de ADN cromosómico de V.
cholerae que corresponde al ADN que flanquea el gen recA
del V. cholerae (es decir, una deleción interna de
recA). El plásmido pGP84 es un derivado del plásmido suicida
pJM703.1 (Miller y otros, 1988, J. Bacteriol. 170:2575) y codifica
secuencias que corresponden a las zonas flanqueadoras del gen
recA del V. cholerae (Goldberg y otros, 1986, J.
Bacterial. 165:715) incluyendo un fragmento
BglII-PvuII en el lado izquierdo y un fragmento
XbaI-EcoRI en el lado derecho. Entre estos dos
fragmentos se encuentra situado un fragmento de 1,3 kb que codifica
la resistencia a la kanamicina. El plásmido pGP84 también contiene
un fragmento NruI-BamHI que codifica la
sensibilidad a la estreptomicina. Este último fragmento se deriva
del plásmido pNO1523 (Dean, 1981, Gene 15:99). Cuando el pGp84 se
digiere con XbaI, el fragmento de 1,3 kb se elimina y pueden
insertarse otros fragmentos de XbaI en esta zona recA
suprimida. La subclonación se realizó tal como sigue: cada uno de
los dos fragmentos EcoRI-BamHI que especifican las
configuraciones del ctxB activador se modificó mediante la
adición de elementos de enlace XbaI. Fueron unidos de manera
individual al pGP84 digerido con XbaI para generar dos nuevos
plásmidos pJM84.1 y pJM84.2, cada uno de los cuales contiene ADN
que especifica las configuraciones htpP-ctxB y
ctxP-ctxB respectivamente (figura n° 6).
Después, los plásmidos pJM84.1 y pJM84.2 fueron
transferidos a las cepas del V. cholerae Perú-2,
Bang-2 y Bah-2 y se seleccionaron
colonias resistentes a la ampicilina. Debido a que estos plásmidos
son incapaces de una replicación en el V. cholerae, se
integran en el cromosoma de la célula hospedadora por recombinación
homóloga generando la estructura mostrada en la figura n° 6. Ambos
plásmidos también codifican un gen para la sensibilidad de la
estreptomicina que permite una selección positiva contra un caso de
integración de plásmidos en cepas que son resistentes a la
estreptomicina (es decir, cepas Perú-2, bang-2 y
Bah-2). De este modo, cuando las cepas que tienen
un plásmido integrado en el ADN cromosómico crecen en un medio que
contiene 2 mg/ml de estreptomicina, pueden aislarse las colonias
que han vuelto a la sensibilidad a la ampicilina. Las cepas que
ahora habían cruzado el plásmido integrado para abandonar detrás de
la mutación de la deleción recA junto con la configuración
ctxB se seleccionaron entonces de entre estas últimas cepas.
Estas cepas fueron identificadas fácilmente como que presentaban
las siguientes propiedades.
1. Eran sensibles a la ampicilina.
2. Se eliminaron en presencia de 0,1 ml de metil
metano sulfonato por ml de LB, un fenotipo característico de las
células recA^{-}.
3. Produjeron la subunidad B del cólera tal como
se mide a través de GMI-ELISA.
4. Un análisis Southern Blot utilizando sondas
recA y ctxB confirmó que contenían fragmentos de ADN
consistentes con la presencia de la configuración ctxB y la
deleción de las secuencias recA apropiadas.
Las cepas bacterianas que fueron aisladas
siguiendo el procedimiento descrito anteriormente son como
sigue:
| Cepa | Genotipo |
| Perú-3 | deleción attRS1, recA::htpP-ctxB, str |
| Perú-4 | deleción attRS1, recA::ctxP-ctxB, str |
| Bang-3 | deleción attRS1, recA::htpP-ctxB, str |
| Bah-3 | deleción attRS1, recA::htpP-ctxB, str |
| Bah-4 | deleción attRS1, recA::ctxP-ctxB, str |
La mutación recA contenida en las cepas de
vacuna descritas anteriormente hace que las cepas sean deficientes
en la recombinación homóloga. Con el fin de producir vacunas
candidato que todavía sean capaces de una recombinación homóloga,
el gen ctxB se insertó en el gen lacZ del V.
cholerae tal como se describe a continuación.
El plásmido pCG698 de codificación del gen
lacZ del V. cholerae, contiene un lugar HpaI único en
el medio de la secuencia que codifica el lacZ. El plásmido
pCG698 se elaboró tal como sigue: el gen
\beta-galactosidasa del V. cholerae fue
clonado a partir de un banco de fragmentos de ADN cromosómico de la
cepa E7946 tal como se describe (Mekalanos, 1983, Cell 35:253). Se
encontró que expresa la \beta-galactosidasa y la
siguiendo una representación de enzimas de restricción se encontró
que contenía un inserto de 6 kb que tiene 2 sitios HpaI en el gen
lacZ cada uno de los cuales estaba separado por 2,1 kb de
ADN. Este plásmido fue linearizado con HpaI y los elementos de
enlace XbaI fueron ligados a los extremos. Se eliminó del pJM411 un
fragmento de EcoRI-BamHI que contenía la
configuración ctxP-ctxB, tal como se ha descrito
anteriormente, los extremos fueron modificados mediante la adición
de elementos de enlace XbaI y el fragmento fue ligado al pCG698
modificado de manera similar. El plásmido resultante pJM6891
contenía ahora la estructura ctxP-ctxB insertada en
el parte central del gen lacZ. Este plásmido fue transferido
a las cepas del V. cholerae Perú-2, Bang-2 y
Bah-2 y se examinó el crecimiento de cada cepa
resultante en presencia de X-gal. Se recogieron y se
purificaron colonias blancas que contenían un gen lacZ
inactivado. Las cepas que contenían una copia integrada de las
secuencias lacZ::ctxP-ctxB en el cromosoma de
la célula huésped se obtuvieron mediante el curado de bacterias de
pJM6891 por el crecimiento en la ausencia de ampicilina. Se confirmó
la presencia de las secuencias apropiadas a través de un análisis
Southern Blot y la capacidad de estas bacterias para producir la
subunidad B de la toxina del cólera se confirmó a través de
GMI-ELISA. Las cepas bacterianas asiladas siguiendo
este procedimiento son como sigue:
| Cepa | Genotipo |
| Perú-5 | deleción attRS1, lacZ::ctxP-ctxB, str |
| Bang-5 | deleción attRS1, lacZ::ctxP-ctxB, str |
| Bah-5 | deleción attRS1, lacZ::ctxP-ctxB, str |
Con el fin de caracterizar algunos de estos
candidatos portadores de la vacuna del cólera respecto a la
colonización de ratones, los ratones fueron infectados con las
cepas que se relacionan a continuación. La cepa TCP2, un derivado
de la 0395-N1 que contiene una deleción TcpA y no
coloniza el intestino de los voluntarios humanos, sirvió como
control. Se utilizaron cinco ratones para cada cepa. A las 24 horas
post infección, el intestino superior se eliminó de cada ratón, se
homogeneizó y se analizó el número de V. cholerae presente
utilizando un ensayo de recubrimiento simple. Los resultados se dan
en la tabla que sigue a continuación. Esencialmente, no se
detectaron bacterias TCP2 en los intestinos de ratones infectados
con TCP2 y, por consiguiente, los valores que se dan a continuación
representan el número de bacterias de cada cepa que colonizaron el
intestino de los ratones por encima de un nivel de fondo de
cero.
| Cepa | UFC por ratón^{a} | Genotipo/estructura^{b} | |
| Perú-3 | 9,4 x 10^{5} | deleción attRS1 #2, recA::htpG-ctxB | |
| Perú-2 | 2,5 x 10^{6} | deleción attRS1 #2 | |
| Perú-4 | 6,0 x 10^{6} | deleción attRS1 #2, recA::ctx-ctxB | |
| Perú-5 | 6,6 x 10^{6} | deleción attRS1 #2, LacZ::ctx-ctxB | |
| Bang-2 | 9,9 x 10^{6} | deleción attRS1 #2 | |
| Bang-3 | 2,7 x 10^{7} | deleción attRS1 #2, recA::htpG-ctxB |
^{a}Unidades de formación de colonias
recuperadas por ratón (promedio de cinco ratones).
^{b} La estructura deleción att
RS1 #2 es una deleción de Tipo-2 elaborada con un
plásmido pAR62, descrito en la Figura n° 3.
La estructura
recA::htpG-ctxB es una deleción del gen
recA y una inserción de la subunidad B de la toxina del
cólera bajo el control del estimulador del choque térmico derivado
de la htpG del V. cholerae.
La estructura
recA::htpG-ctxB es una deleción del gen
recA y una inserción de la subunidad B de la toxina del
cólera bajo el control del estimulador de la toxina del cólera
derivado del gen ctx de una cepa hipertoxicógena 569B del V.
cholerae.
La estructura
LacZ::ctx-ctxB es una inserción en el gen
LacZ del V. cholerae que está compuesto por la
subunidad B de la toxina del cólera bajo el control del estimulador
de la toxina del cólera derivado del gen ctx de una cepa
hipertoxicógena 569B del V. cholerae.
Los resultados sugieren que la presencia del
alelo recA::htpP-ctxB sirve para reducir la
capacidad de las cepas derivadas del Perú para colonizar el
intestino (compárese, por ejemplo, Perú-3 con Perú-4). Sin embargo,
el efecto de esta estructura sobre la colonización de la cepa
derivada del Bang fue menos notable (compárese
Bang-3 con Bang-2). En general, la
introducción de las estructuras en las que el ctxB se
encuentra bajo el control de su propio estimulador presenta un
menor efecto sobre la colonización que la estructura en la que se
colocó bajo el control del estimulador de choque térmico. Debería
notarse que las cepas Perú-2, Perú-3 y Bang-3
varían en sus propiedades de colonización en un intervalo de 28
pliegues. En la técnica está bien seguir los protocolos descritos
anteriormente para aislar los candidatos de vacuna adicionales que
varían incluso más ampliamente en sus propiedades de
colonización.
En resumen, los datos demuestran la viabilidad de
utilizar técnicas de ingeniería genética para generar nuevas cepas
de V. cholerae que contienen ctxB en las que la
expresión del gen ctxB se coloca bajo el control de
cualquiera de los dos estimuladores V. cholerae (ctxP
y htpP). Los genes modificados pueden ser recombinados en el
cromosoma V. cholerae en genes de destino tales como el
recA o el lacZ para generar cepas que expresan de
manera estable grandes cantidades de subunidad B de la toxina del
cólera (por ejemplo, cepas Perú-3, Perú-4 y Perú-5).
Los mutantes de V. cholerae que son
deficientes en la penetración del agar blando pueden ser útiles en
la producción de vacunas. La razón para utilizar estas cantidades
es como sigue. Se piensa que la capa mucosa del intestino es
viscosa y los mutantes deficientes en la penetración del agar
blando podrían ser eficaces en la penetración de esta mucosa.
Aunque son deficientes en la penetración a través de la mucosa,
estos mutantes pueden presentar todavía un antígeno a las placas de
Peyer que no están cubiertas por un denso gel mucoso y que incluyen
células de muestra de antígenos específicas para la producción de
anticuerpos IgA. En consecuencia, está previsto que los mutantes
deficientes a la penetración presenten una baja reactogenicidad
que, sin embargo, es altamente antigénica, y estas características
son deseables para una vacuna de virus vivos. Aunque los mutantes
no móviles son una clase de mutantes deficientes en la penetración
del agar blando, otros tipos de mutaciones también pueden producir
un fenotipo deficiente en la penetración de agar blando (es decir,
un fenotipo de agrupamiento) y pueden resultar útiles para las
vacunas. Manteniendo esta línea de razonamientos, los mutantes no
totalmente móviles, es decir, aquellos mutantes que no son capaces
de agruparse en un medio sin agar, pueden resultar útiles para las
vacunas candidato.
Para obtener tales mutantes, el agar blando puede
utilizarse para evaluar la capacidad de las bacterias para penetrar
un medio de alta viscosidad (un medio de agar blando que es un 0,25
- 0,4% agar), tal como se describe a continuación. Una de dichas
vacunas deficientes en la penetración del agar blando con un
elevado valor terapéutico es el Perú-14.
El Perú-14 es deficiente en la penetración del
agar blando y, además, más de un 50% de las células Perú-14 son
filamentosas, con una apariencia a modo de espiral y que presenta
una longitud de célula mayor de 5 longitudes celulares normales (25
nM, al contrario que la longitud de las células de tipo salvaje de
5nM).
Se aisló el Perú-14 como derivado deficiente a la
penetración del agar blando de la cepa Perú triplemente suprimida
(Perú-3) (ctxA^{-}, att^{-}, y recA^{-}) que no presentaba
efectos secundarios pero todavía tenía retenida la capacidad para
colonizar vacunados tal como se muestra a continuación (Tabla
7).
Aunque el Perú-14 se aisló en base a lo que se ha
indicado anteriormente, esta teoría de función puede o no puede
explicar de manera precisa y completamente la efectividad del
Perú-14 como vacuna. La utilidad del Perú-14 como vacuna eficaz no
depende de lo correcta que sea esta teoría.
| Dosis (UFC) | # voluntario | Síntomas | Deposición | Duración de la excreción |
| día | (días)/máx. | |||
| 2 x 10^{6} | 28 | Gas | Formada | |
| 3/3 | 29 | Retorcijones | Formada | |
| 14/2 | 30 | Ninguno | Formada | |
| - | 33 | Ninguno | Formada | |
| 4/4 | 34 | Ninguno | 336 g* | |
| 4/1 | 35 | Ninguno | Formada | |
| 3/3 | Formada | |||
| 9 x 10^{8} | 25 | Ninguno | Formada | |
| 25/1 | 26 | Gas | Formada | |
| 3/1 | 27 | Dolor cabeza | Formada | |
| 2/2 | 31 | Nausea, pérdida apetito | Formada | |
| 7/4 | ||||
| 5/3 | 32 | Ninguno | Formada | |
| 35/1 | 36 | Retorcijones | 63 g+ | |
| *El voluntario tuvo deposiciones semisólidas indoloras a 72 horas de la post-inmunización. Las depo- | ||||
| siciones eran cultivo negativo para el Perú-14. | ||||
| +El voluntario tuvo dos pequeñas deposiciones a 48 horas de la post-inmunización. Las deposiciones | ||||
| eran cultivo positivo para el Perú-14. |
En particular, la cepa deficiente en la
penetración del agar blando se produjo como sigue. El Perú-3 creció
durante la noche en un medio LB que contenía 100 \mug de sulfato
de estreptomicina a 30°C. El cultivo se diluyó a aproximadamente a
2000 UFC/ml y 0,1 ml recubierto sobre las placas LB que contenían
100 \mug de estreptomicina. Tras incubar las placas durante la
noche a 30°C, aproximadamente 1000 colonias se inocularon con unos
palillos en unas placas de agar blando (medio LB + un 0,45% de
Bacto-agar) y se incubaron durante la noche a 30°C.
La inoculación con palillos se inserta solamente 1-2
mm en la superficie de la placa de agar blando. De las 1000
colonias recogidas, 25 parecieron ser no penetrantes. Los aislados
no penetrantes aparecen como colonias de aproximadamente 2 mm de
diámetro, mientras que los aislados penetrantes se aglutinan en el
agar hasta un diámetro mayor de 5 mm. Estas colonias se volvieron a
recoger de nuevo en agar blando junto con una cepa de cólera no
móvil y no penetrante y la cepa original Perú-3. Una colonia de las
25 fue no penetrante en el agar blando (si se compara con los
controles). Esta colonia, designada Perú-14, era todavía Inaba
positiva con sueros de aglutinación, y producía el mismo nivel de
toxina de subunidad B que el Perú-3 al analizarla en la subunidad B
ELISA. Los procedimientos descritos anteriormente pueden
utilizarse para aislar mutantes deficientes a la penetración del
agar blando de cualquier cepa del V. cholerae. Los mutantes
deficientes a la penetración no reversible, tales como las que
albergan una deleción genética, pueden producirse utilizando los
procedimientos descritos anteriormente.
Recientemente se ha descubierto que una cepa
virulenta non-01 muy poco común es la responsable de
una epidemia del cólera en el subcontinente indio. Los
supervivientes de las epidemias de serogrupo 01 anteriores no están
inmunológicamente protegidos contra esta cepa.
Esta cepa se ha depositado con la American Type
Culture Collection (ATCC) en Rockville, MD. El Bengal puede
atenuarse tal como se ha descrito anteriormente para las otras
cepas, por ejemplo, mediante una o más de las siguientes
mutaciones: ctx^{-}, att^{-}, o recA^{-}, o un fenotipo
deficiente a la penetración del agar blando,
Bengal-2 ("Beng-2") y
Bengal-3 ("Beng-3"), son
genéticamente equivalentes al Perú-2 y Perú-3. Dicha cepa Bengal
atenuada puede combinarse con una de las cepas Perú atenuadas
descritas anteriormente para proporcionar una vacuna de cepas del
cólera múltiple o dual.
Se llevaron a cabo estudios en humanos de la
eficacia del Perú-3 y Perú-5 tal como sigue.
Se extrajeron muestras de sangre de voluntarios
antes de la inmunización y a 7, 14, 21 y 28 días post
inmunización. Se midieron los anticuerpos del V. cholerae en
su flujo sanguíneo y los niveles se muestran en la Tabla 4. La
inmunogenicidad de los prototipos de vacuna Perú-3 y Perú-5 se
evaluó en estudios sobre voluntarios humanos. Los voluntarios
ingirieron Perú-3 y Perú-5 recién cosechado en 3 dosis diferentes
en 100 ml de 10% de bicarbonato sódico. El Perú-3 y el Perú-5
mostraron también que inducían anticuerpos de antitoxinas (Tabla
5). Además, el Perú-3 y el Perú-5 mostraron que protegían a los
voluntarios de la agresión con un V. cholerae El Tor de tipo
salvaje (cepa N16961, Tabla 6). Concluimos que el Perú-3 en
particular provoca una reacción inmunológica (Tablas 4 y 5) y
confiere protección del cólera en estudios en humanos (Tabla
6).
| Cepa | (UFC) | Voluntario | Pre | 7 | 14 | 21 | 28 | máximo |
| Perú-3 | (4x10^{6}) | 1 | 50 | 1600 | 6400 | 6400 | 6400 | 6400 |
| 2 | <100 | 50 | 100 | 50 | 100 | 100 | ||
| 5 | <100 | 1600 | 6400 | 400 | 400 | 6400 | ||
| Perú-3 | (1x10^{8}) | 7 | <100 | 400 | 1600 | 400 | 400 | 1600 |
| 12 | <100 | 400 | 800 | 50 | 200 | 100 | ||
| 13 | <100 | 3200 | 6400 | 3200 | 1600 | 6400 | ||
| Perú-3 | (2x10^{6}) | 11 | <100 | 1600 | 6400 | 3200 | 6400 | 6400 |
| 14 | <100 | 200 | 6400 | 3200 | 1600 | 6400 | ||
| 15 | <100 | 800 | 6400 | 1600 | 3200 | 6400 |
Se diluyeron en serie muestras de suero activado
por calor en las cavidades de un microtitulador, se mezclaron con
V. cholerae de fase logarítmica (concentración final del
11%) y se incubaron a 37°C durante una hora.
Se añadió entonces un medio de cultivo de
infusión corazón y cerebro a las placas y se incubó a 37°C durante
2,75 horas. Los valores de la tabla representan los tituladotes
recíprocos en los cuales la eliminación mediada por anticuerpos del
V. cholerae fue de un 50% o más.
| Cepa | (UFC) | Voluntario | 0.2 | 7 | 14 | 21 | 28 | Aumento máximo |
| (pliegues) | ||||||||
| Perú-3 | (4x10^{6}) | 1 | 8 | 8 | 32 | 32 | 32 | 4 |
| 2 | <2 | <2 | <2 | <2 | <2 | Ninguno | ||
| 5 | <2 | 64 | 64 | 2 | 256 | 14 | ||
| Perú-3 | (4x10^{8}) | 7 | 2 | 2 | 4 | 4 | 4 | 2 |
| 12 | <2 | 2 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
| 13 | <2 | <2 | <2 | <2 | <2 | Ninguno | ||
| Perú-3 | (2x10^{6}) | 11 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | Ninguno |
| 14 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Ninguno | ||
| 15 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | Ninguno |
Se diluyeron en serie muestras de suero en las
cavidades de un microtitulador de 96 cavidades cubiertas con una
subunidad B de toxina gangliósida/cólera precalentadas y se
incubaron a 37°C durante 30 minutos. Tras 3 lavados con PBS, se
dispuso un conjugado de fosfatasa (1/1000) de anticuerpo alcalino
de cabra antihumano PBS y se incubó a 37°C durante 30 minutos.
Tras 3 lavados con PBS, se añadió 2 mg/ml PNPP a cada cavidad y se
incubó durante 15 minutos. La reacción se detuvo con 0,1 M de
K_{2}PO_{4}y se leyó en un O. D. de 405 nm. Los valores de la
tabla representan los tituladotes recíprocos y el incremento del
día 2 en comparación con el titulador máximo.
| Número del | Vacunación | Dosis | Síntomas | Diarrea | Aparición |
| sujeto | previa | inicial | (gramos) | de síntomas | |
| 1 | Perú-3 | 6 logs | Ninguno | Formada | |
| 2 | Perú-3^{\bullet} | 6 logs | Cansado, | 534 | 18-48 horas |
| sofocado | |||||
| 5 | Perú-3 | 6 logs | Ninguno | 3 | |
| 7 | Perú-3 | 8 logs | Ninguno | 23 | 36 horas |
| 11 | Perú-5 | 6 logs | Ninguno | Formada | |
| 12 | Perú-3 | 8 logs | Ninguno | Formada | |
| 14 | Perú-5 | 6 logs | Ninguno | Formada | |
| 15 | Perú-5 | 6 logs | Ninguno | Formada | |
| 22 | Control | T 100.7 | 1443 | 24 horas | |
| F, HA, náusea | |||||
| LOA, sofocado, | |||||
| retorcijones | |||||
| 23 | Control | Ninguno | 769 | 24 horas | |
| 24 | Control | T 99.6 F, HA, | 904+ | 40 horas | |
| malestar, | |||||
| sofocado, | |||||
| retorcijones | |||||
| ^{\bullet} No colonizó o seroconvirtió posteriormente tras la vacunación | |||||
| +Dos deposiciones líquidas no pesadas por motivos de urgencia |
Los procedimientos descritos anteriormente pueden
aplicarse por cualquier experto en la materia para la elaboración
de derivados del Perú-2, Bang-2,
Bah-2, Perú-14, y cepas relacionadas que sean
capaces de expresar una amplia variedad de antígenos heterólogos,
por ejemplo, antígenos que no se expresan normalmente en el V.
cholerae. Si dichos derivados se utilizan como vacunas de virus
vivos se esperaría que indujeran una reacción inmunológica tanto
contra los antígenos del V. cholerae como contra el antígeno
externo que codifica. Es probable que se induzcan tanto la reacción
inmunológica sistémica como la local debido a que la vacunación con
otras vacunas del V. cholerae prototipo ha provocado la
inducción de anticuerpos IgG circulantes y IgA locales que son
específicos los antígenos de células enteras (por ejemplo, LPS) y
así como proteínas individuales tales como la subunidad B de la
toxina del cólera (Herrington y otros, 1988, J. Exp. Med.
168:1487-1492). Se esperaría que un antígeno
externo expresado por el V. cholerae provocara una respuesta
inmunológica similar a la de las proteínas del cólera
individuales.
Los procedimientos útiles para la introducción de
antígenos heterólogos en el V. cholerae son similares a los
descritos anteriormente para la reintroducción del gen ctxB
en las cepas de vacuna Perú-3, Perú-4, Perú-14, Perú-5,
Bang-3, Bah-3 y
Bah-4. Virtualmente cualquier antígeno heterólogo
puede insertarse en el V. cholerae utilizando estos
procedimientos.
Puede utilizarse el mismo protocolo empleado para
elaborar las cepas que contienen ctxV bajo un nuevo
activador para elaborar derivados del Perú-2, Bang-2
y Bah-2 que son capaces de expresión virtualmente
cualquier antígeno o antígeno heterólogo normalmente codificado por
cualquier bacteria, virus, o parásito. Los procedimientos
descritos en la invención señalan por consiguiente la generación de
una "cepa portadora" de la vacuna V. cholerae
multivalente que puede ser manipulada para codificar y expresar
otros antígenos y puede ser administrada a los humanos con el fin
de inmunizarlos no solamente contra el cólera, sino también contra
otros agentes patógenos.
Se ha demostrado que las vacunas de Vibrio
cholerae que provocan los anticuerpos contra la toxina del
cólera (TT) confieren una protección cruzada a los humanos
vacunados contra las cepas de toxina lábiles al calor (TL) que
producen E. coli enterotoxicógeno (ETEC) (Svennerholm, J.
Infect. Dis., 149:884-893,1984). Sin embargo, las
vacunas eran todavía vulnerables a la toxina estable al calor (TS)
produciendo cepas de ETEC. Puede utilizarse una cepa atenuante de
Vibrio cholerae, el Perú-3, como un vector de vacuna que
alberga genes externos derivados del ETEC que codifican la
subunidad principal del fimbriae CFA/IV del antígeno factor de
colonización, y un toxoide genético de ST. Dicho vector de vacuna
provocará i) anticuerpos antifimbriales, impidiendo la unión de las
cepas ETEC patógenas al epitelio intestinal humano, y ii)
anticuerpos anti-TS; invalidando los efectos
diarreicos del ST. El resultado es una vacuna ETEC de virus vivos
dirigida de V. cholerae atenuado administrada por vía oral
de dosis única.
La vacuna ETEC dirigida de V. cholerae
atenuado puede presentar una o más de las siguientes ventajas: i)
puede liofilizarse para almacenamiento a largo plazo, ii) no
requiere cadena de frío, iii) se administra por vía oral, iv)
solamente requiere una única dosis, v) es económica, y vi) protege
contra muchas cepas ETEC.
Una vacuna de virus vivos de administración oral
de dosis única contra los agentes patógenos entéricos, V.
cholerae y el E. coli enterotoxicógeno (ETEC) se elabora
mediante la modificación genética de secuencias que codifican
antígenos de las cepas de vacuna E. coli en V.
cholerae. En la elaboración de dichas cepa de vacuna es
deseable neutralizar tanto la colonización como la producción de
toxinas. Esto puede conseguirse modificando una cepa atenuada de
V. cholerae, Perú-3 tal como se ha descrito
anteriormente.
La cepa Perú-3 ya expresa la subunidad B de la
toxina del cólera que es casi idéntica a la subunidad B de la
toxina lábil al calor ETEC, y provoca anticuerpos de protección
cruzada. La cepa puede modificarse para expresar antígenos
fimbriales de ETEC y una proteína quimérica formada por el dominio
de oligomerización de la subunidad A de la toxina del cólera y una
forma mutante de la toxina estable al calor ETEC. De esta manera
puede lograrse la inducción de la inmunidad tanto del V.
cholerae como del E. coli.
La generación de la cepa de la vacuna V.
cholerae/ETEC se consigue utilizando técnicas comunes en
microbiología y biología molecular. La capacidad de la cepa para
colonizar animales e inducir una reacción inmunológica puede
analizarse en un modelo establecido de infección entérica de
conejos.
La capacidad del ETEC para colonizar el epitelio
intestinal de los humanes está mediada por fimbriae serológicamente
distintos conocidos como antígenos de factor de colonización (CFA)
y factores de colonización putativa (PCFs). El fimbriae CFA/4 es el
principal factor de colonización identificado aproximadamente de
una cuarta parte a una tercera parte de todos los aislados clínicos
ETEC. El gen que codifica la subunidad principal de un miembro
prototipo del grupo (CS6) ha sido clonado y secuenciado por
otros.
El gen CS6 clonado que va en un plásmido de gran
número de copias se introdujo en el Perú-3 por
electrotransformación y se mantuvo mediante cultivo en un medio
Luria-Bertani que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina. Se analizó la expresión del antígeno proteína de lisados
de células enteras de Perú-3 que contenían las secuencias CS6 por
desnaturalización de electroforesis en gel de poliacrilamida e
inmunoelectro transferencia utilizando suero de conejo policlonal
anti-CS6. Los inmunoblots se desarrollaron
utilizando el conjugado anticonejo IgG alcalino fosfatasa y BCIP.
La expresión del gen CS6 se detectó como producción de una proteína
de 17 kiloDaltons. De este modo, el antígeno de CS6 puede
expresarse en el Perú-3 para la formulación de una vacuna.
Sin embargo, para generar la cepa de la vacuna
candidata es deseable tener el gen CS6 mantenido de manera estable
en ausencia de selección antibiótica y tenerlo expresado a partir
de un activador que sea trascrito activamente por el V.
cholerae. Con este fin, la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) puede utilizarse para amplificar específicamente el gen CS6
que va en un plásmido y crear sitios de endonucleasa de restricción
únicos y sus terminales para la posterior clonación en un vector
"suicida" sensible a la estreptomicina y resistente a la
ampicilina que permita la integración en el cromosoma del V.
Cholerae. En particular, al ADN CS6 generado por PCR flanqueado
con un sitio 5' PacI y un sitio 3' NotI puede ligarse
con ADN pJM6891 que ha sido digerido con PacI y NotI,
colocando el gen CS6 bajo el control del activador de la toxina del
cólera. La mezcla de ligadura puede introducirse por
electrotransformación en la cepa E. coli SM10pir que
proporciona una proteína de trascripción, conocida como pi,
requerida por el pJM6891 para la replicación. Sin embargo, cuando
el pJM6891 y sus derivados se introducen en el V. cholerae
(que carece de la proteína pi), la selección para la resistencia a
50 \mug/ml de ampicilina requiere que el plásmido se integre en
el cromosoma. El sitio de integración viene determinado por la
presencia de secuencias de ADN lacZ V. cholerae que
flanquean la CS6 las cuales son idénticas a las secuencias en el
cromosoma V. cholerae y permiten que se produzca una
recombinación homóloga. La progenie resultante es resistente a la
ampicilina y alberga una copia integrada del plásmido y secuencias
CS6 rodeadas de secuencias de ADN repetidas del gen
lacZ.
Las repeticiones pueden resolverse para eliminar
las secuencias vector (incluyendo el determinante resistente a la
ampicilina) dejando el gen CS6 bajo el control del activador de la
toxina. Esto se lleva a cabo cultivando la cepa en presencia de 2
mg/ml de estretomicina, seleccionando para el alelo de resistencia
a la estreptomicina nativo al Perú y contra el alelo de
sensibilidad a la estreptomicina introducido por el plásmido. Tras
el crecimiento durante la noche en presencia de estreptomicina, el
cultivo se recubre para colonias únicas en agar LB que contiene 100
\mug/ml de estreptomicina, y se marcan para la sensibilidad a 50
\mug/ml de ampicilina. Los aislados que son sensibles a la
estreptomicina y resistentes a la ampicilina se analizarán mediante
ensayos Southern Blot de ADN cromosómico para determinar si se ha
producido la integración esperada y los casos de escisión.
El nivel de producción de antígenos de estos
aislados puede analizarse utilizando técnicas de inmunoelectro
transferencia. La producción del antígeno fimbrial CS6 puede
evaluarse bajo una variedad de condiciones de crecimiento que se
sabe que afectan a la trascripción del activador de la toxina del
cólera. Puede determinarse el efecto del pH del medio (6,5 contra
8,0), la temperatura (30°C contra 37°C), la concentración de NaCl
(50 respecto 500 mM) y la concentración de aminoácidos (0 respecto
a 25 mM) sobre el nivel de la expresión de la CS6.
La cepa de la vacuna candidata Perú-3/CS6 puede
utilizarse entonces en un conejo modelo para demostrar la seguridad
y la inmunogenicidad. Debido que los aislados clínicos humanos de
EFEC que producen antígenos CFA son típicamente no patógenos a los
animales de laboratorio, puede elaborarse otro derivado Perú-3 que
exprese el antígeno fimbrial AF/R1 de la cepa E. coli
RDEC-1 para demostrar la seguridad y la
inmunogenicidad. Este antígeno media la adherencia al epitelio del
intestino, provocando una enfermedad diarreica en los conejos. El
gen que codifica el AR/R1, que va en el plásmido pW1, puede
amplificarse por PCR, clonarse en pJM6891 e integrarse en el
cromosoma de la misma manera que para la CS6. El nivel de expresión
de AR/R1 puede evaluarse por inmunoelectro transferencia. Aunque
esto no producirá candidatos de vacuna para humanos, puede servir
como modelo para demostrar la expresión de un antígeno heterólogo
mediante cepas Perú-3 modificadas y la inducción de la protección
de agresión por un organismo heterólogo.
El gen AF/R1 que lleva un plásmido de alto número
de copias también se introdujo en el Perú-3 por
electrotransformación y se mantuvo en cultivo en un
medioLuria-Bertani que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina. Se analizó la expresión del antígeno proteína de lisados
de células enteras de Perú-3 que contenían las secuencias AF/R1
mediante desnaturalización de electroforesis en gel de
poliacrilamida e inmunoelectro transferencia utilizando suero de
conejo policlonal anti-AF/R1. Los inmunoblots se
desarrollaron utilizando el conjugado anticonejo IgG alcalino
fosfatasa y BCIP. La expresión del gen AF/R1 se detectó como
producción de una proteína de aproximadamente 18 kiloDaltons. De
este modo, el antígeno de AF/R1 puede expresarse en el Perú-3 para
la formulación de una vacuna.
Utilizando estrategias similares, puede
prepararse una cepa de vacuna que expresa antígenos protectores de
Shigella, tales como el lipopolisacárido (LPS) y la proteína
invasora derivada del plásmido, que proteja contra la diarrea
infecciosa provocada por especies infecciosas de Shigella,
tales como S. sonnei.
En la S. sonnei, solamente existe el
serotipo de LPS y es el principal determinante antigénico en la
protección contra estas bacterias. La introducción de un clon de
plásmido que codifica el operón LPS en E. coli produce la
expresión de LPS y es suficiente para conferir sobre el E.
coli la capacidad para ser aglutinado mediante anticuerpos LPS
anti-S. sonnei. El mismo plásmido introducido en la cepa
mutante de deleción del Perú-3 hace que sea aglutinable. Otros
análisis del operón indicaron que un fragmento de EcoRI/BamHI de 18
kilobase de este plásmido subclonado en pBR322 todavía confería el
fenotipo de aglutinación. Este fragmento puede introducirse
entonces al cromosoma en el gen lacZ del V. cholerae
tal como se ha descrito anteriormente.
El ETEC provoca diarrea mediante la colonización
y la producción de dos toxinas distintas. La toxina lábil al calor
(TL) es casi idéntica en secuencia, estructura y actuación
biológica a la toxina del cólera (TC). Por esta razón la producción
de (TC) por los derivados del Perú-3 es suficiente para inducir
anticuerpos capaces de neutralizar ambas toxinas. Sin embargo, la
inmunización con TC no puede conferir protección de la toxina
estable al calor ETEC (TS) que es un polipéptido muy pequeño (19
aminoácidos) producido por muchos aislados clínicos, algunos de los
cuales no producen la TL. Por consiguiente, un elemento crítico en
la vacuna candidato del cólera/ETEC es la inclusión de secuencias
de TS en el Perú-3 con el fin de inducir los anticuerpos a esta
toxina.
Se han generado una serie de derivados bien
definidos de TS que carecen de actividad de toxina (SToxoides).
Estos derivados son típicamente fragmentos de la toxina o mutaciones
de sustitución en residuos de cisteína que forman los tres enlaces
disulfuro de la proteína. Puede elaborarse un SToxoide compuesto
por todo el polipéptido maduro con cisteína a las mutaciones de
alanina en los residuos 5 y 10 para minimizar o eliminar la
actividad tóxica. El gen que codifica este SToxoide puede
prepararse completamente a partir de oligonucleótidos
complementarios producidos con un sintetizador de ADN. El gen
sintético puede estar flanqueado por sitios de nucleasa de
restricción únicos para la posterior subclonación en vectores de
plásmidos.
El tamaño de la TS (19 aminoácidos) hace que sea
un inmunógeno inherentemente pobre. Si se acoplan químicamente o
genéticamente TS intactas o incluso fragmentos péptidos pequeños a
otras proteínas mayores (un portador), la TS se convierte en un
inmunógeno mucho mejor y puede inducir anticuerpos neutralizadores.
El principal portador utilizado fue la subunidad B de TL o TC.
Debido a que las proteínas externas fusionadas a la subunidad A2 de
la toxina del cólera (el dominio de la subunidad enzimática que
permitía que el fragmento A se oligomerizara con el pentámero de la
subunidad B) pueden enlazarse al pentámero y formar complejos de
tipo holotoxina, estos complejos quiméricos i) son segregados por
el V. cholerae, ii) pueden enlazarse al receptor
gangliósido, y iii) son inmunoreactivos.
El gen sintético que codifica el SToxoide puede
fusionarse, en cuadro, al extremo 5' del gen que codifica la TC A2
creando una quimera de SToxoide-A2. La estructura
de la fusión del gen puede integrarse en el cromosoma Perú-3 tal
como se ha descrito anteriormente. Si se coexpresa con una
subunidad B TC, esta proteína puede formar complejos de tipo
holotoxina que carecen de la actividad biológica tanto de la TS
como de la TC y son capaces de enlazar los receptores gangliósidos.
Las cepas que expresan la proteína quimérica
SToxoide-A2 pueden analizarse a través de
inmunoblots utilizando antisuero anti-TS para
determinar si las mutaciones de substitución se traducen en una
proteína antigenéticamente asociada. Los SToxoides también pueden
compararse para determinar la toxicidad en el ensayo de ratones
lactantes.
El ensayo de ratones lactantes se realiza como
sigue. Se inyectan intragástricamente ratones de
2-3 días de vida con extractos de proteínas
derivados de estas cepas de vacuna (o TS purificada como control),
se sacrifican 2-3 horas tras la inyección y se
examina su relación del peso del intestino respecto al peso
corporal. Puede analizarse entonces la inmunogenicidad en conejos
de las quimeras del SToxoide candidato que muestran la toxicidad
más baja.
Puede realizarse una prueba inicial del Perú-3
que expresa AF/R1 en conejos. Las bacterias pueden administrarse
por vía oral en dosis de 2 x 10^{2}, 2 x 10^{4}, 2 x 10^{6}, y
2 x 10^{8} a conejos blancos de Nueva Zelanda. Pueden recogerse
muestras de deposiciones y cultivarlas en placas de agar LB con 100
\mug/ml de estreptomicina para enumerar la colonización y el
desprendimiento de las bacterias. Puede extraerse sangre antes de la
administración de la vacuna así como 7, 14, 21 y 28 días
siguientes a la administración. Pueden prepararse sueros y analizar
la presencia de anticuerpos específicos para la proteína AF/R1
mediante un ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA)
utilizando AF/R1 purificado unido a placas microtituladoras, y la
capacidad para aglutinar bacterias RDEC-1.
Los animales que reciben la cepa Perú-3/AF/R1
pueden ser agredidos posteriormente con una cepa patógena de
RDEC-1. Puede administrarse por vía oral una dosis
agresora de 2 x 10^{6} organismos a conejos inmunizados y que no
han recibido tratamiento y observar muestras de deposiciones de
diarrea (definida como deposición húmeda y suelta que mancha la
zona rectal de diarrea en el fondo de la jaula). La diarrea se
produce típicamente en 3-4 días en animales no
inmunes. Para analizar la colonización, se cultivan muestras
rectales en placas de agar MacConkey de lactosa y las colonias
positivas de lactosa se marcan para una reacción positiva con
anticuerpos anti-RDEC-1 en una
prueba de aglutinación en portaobjetos. La protección puede
definirse tanto por inhibición de la diarrea como por colonización
bacterial tras el día cuatro.
Puede realizarse una prueba inicial de las cepas
de Perú-3 que expresan S6 y SToxoide-A2 tal como se
ha descrito anteriormente. Pueden prepararse sueros y analizar la
presencia de anticuerpos específicos para la proteína quimérica CS6
o bien la SToxoide-A2 mediante un ensayo de
inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) utilizando CS6 purificado
unido a placas microtituladoras. También puede analizarse la
presencia de anticuerpos en los sueros anti-CS6
capaces de fijar un complemento y lisar CS6 que produce E.
coli. En este análisis, las bacterias que llevan CS6 se mezclan
con suero y se añade un medio LB de complemento cobaya y las
bacterias se cubren en el agar LB. La actividad bactericida produce
una disminución de los cómputos viables recuperados. Finalmente,
en los sueros anti-SToxoide-A2
pueden analizarse los anticuerpos capaces de neutralizar la
actividad del TS en el análisis de toxicidad de ratones
lactantes.
Puede utilizarse una aproximación similar a la
descrita anteriormente para elaborar una cepa de vacuna de V.
cholerae que expresa antígenos del Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (VIH).
Se elaboró un plásmido lanzadera del cólera que
contenía una unidad de trascripción de bacterial que incluye el
activador de la proteína de choque térmico, htp, y el gen
CT-B del cólera. La unidad de trascripción está
flanqueada por las secuencias de ADN derivadas del locus del
recA del cólera de manera que el gen
CT-B y su activador pueden integrarse en el
cromosoma del cólera por la recombinación homóloga entre la
presencia de la secuencia del ADN tanto en el locus del recA
del genoma del cólera como en el plásmido. El plásmido
lanzadera contiene también un gen que codifica la resistencia a la
ampicilina y un gen que codifica la sensibilidad de la
estreptomicina como marcadores de selección.
La proteína de envoltura del
VIH-1 puede expresarse como parte del holotoxoide
del V. cholerae recombinante segregado por las bacterias, en
forma de proteína de fusión tipo "sándwich", en la que el
antígeno del VIH va precedido de las secuencias de señal del
polipéptido TC-A y seguida del dominio
TC-A2. Las secuencias de señal del
TC-A y su zona no traducida curso arriba son
necesarias para la expresión y segregación del antígeno del
VIH-1 en las bacterias. El dominio
TC-A2 fusionado al antígeno del
VIH-1 es requerido por la proteína de fusión para
ensamblarse con las proteínas TC-B para formar un
holotoxoide del cólera recombinante. El plásmido descrito
anteriormente puede modificarse de manera que un fragmento de PCR
que contenga las secuencias Shine-Dalgano (SD) y
las secuencias de señal del gen TC-A, y un sitio
único PmeI de endonucleasa de restricción de VIH para la inserción
del antígeno del VIH-1 se inserte en este sitio
PacI. El plásmido puede modificarse, además, de manera que un
segundo fragmento PCR que contiene tanto el dominio
TC-A2 como el gen TC-B sustituya el
gen TC-B. La orientación de la inserción de ADN y
la unión del fragmento de PCR puede confirmarse por secuenciación
de ADN.
El antígeno del VIH-1 utilizado
en este estudio forma parte de la glucoproteína de recubrimiento de
VIH-1 que contiene el dominio de neutralización
principal (PND). Estudios anteriores demuestran que un grupo de
péptidos sintéticos derivados del PND pueden provocar la
neutralización de anticuerpos en animales. Un fragmento de ADN
derivado del gen de recubrimiento del VIH que incluye el PND, pero
sin las secuencias de señal y los primeros 120 aminoácidos, se
clona en el sitio PmeI del plásmido descrito anteriormente el cual
contiene tanto el dominio TC-A2 como el gen
TC-B. La fusión en cuadro del antígeno del
VIH y el péptido de señal TC-A y el dominio
TC-A2 pueden confirmarse mediante secuenciación de
ADN.
Para elaborar una cepa de cólera atenuado
genéticamente que lleve el antígeno VIH-1, Perú-2 se
utiliza la cepa parental. El plásmido que contiene las secuencias
de VIH puede introducirse en la cepa Perú-2 a través de enlace. Se
produjo una cepa recombinante de V. cholerae que contiene
deleciones de locus ctx y recA y expresa una proteína
de fusión recombinante no tóxica del antígeno del VIH y se denominó
Perú101. Puede utilizarse un análisis Southern Blot para confirmar
que el Perú101 contiene el ADN para el antígeno del
VIH-1 y puede utilizarse un análisis Southern Blot
para demostrar la expresión de la proteína de fusión
VIH-A2 por bacterias recombinantes. Un ELISA
utilizando tanto anticuerpos
anti-TC-B como
anti-VIH puede analizar si las bacterias segregan
el holotoxoide del cólera recombinante.
Para analizar la inmunogenicidad del Perú101
recombinante de V. cholerae como vacuna profiláctica de
VIH-1, a cada uno de seis monos Rhesus hembra
adultos (Macaca mulatta) se les puede proporcionar 2 x 10^{6} UFC
de bacterias vivas recién preparadas en 30 ml de agua
bicarbonadata. Se les puede dar a dos animales adicionales de la
misma edad y grupo sexual la misma dosis de Perú 2 como control.
Las muestras de deposiciones de los animales pueden analizarse dos
días después de la vacunación para detectar la multiplicación de
Vibrio cholera en los intestinos mediante la determinación
de la unidad de formación de colonias en las placas de
estreptomicina LB. Los anticuerpos vaginales, rectales, salivales y
de suero, incluyendo IgA y IgG, que son específicos al VIH1 y al
TC-B, pueden examinarse bisemanalmente
post-vacunación. La proliferación de células T de
los animales hospedadoras y las reacciones del CTL que son
específicas al antígeno del VIH1 de entrada también pueden
examinarse. Pueden ser necesarios uno o varios refuerzos por
administración oral o mediante inyección intramuscular o
intravenosa de antígeno de VIH1 purificado, dependiendo del nivel
de las reacciones inmunológicas iniciales de los animales
vacunados.
Si el Perú101 es capaz de estimular los animales
para generar anticuerpos anti-VIH o reacciones
inmunológicas específicas de VIH mediadas por células, la eficacia
del Perú101 como vacuna de VIH1 puede analizarse agrediendo los
animales con "stocks" de SVIH-LAI vivos a
través de infusión vaginal. Los dos animales Perú 2 (los monos que
recibieron la cepa Perú2) y dos de los seis animales Perú101 (los
monos que recibieron Perú101) pueden ser agredidos por una dosis de
2x VI-AID_{50}. Dos de los otros animales Perú101
recibirán 10x VI-AID_{50} y el resto de los monos
Perú101 recibirán un máximo de 50x VI-AID_{50} de
dosis. Las muestras sanguíneas periféricas pueden tomarse cada dos
semanas post infección para determinar si el animal se ha llegado a
infectar mediante la detección del antígeno vírico en el PBMC
cultivado. Si la vacuna presenta un efecto profiláctico sobre los
animales contra la agresión por el SVIH que lleva el gen de
recubrimiento del VIH1 homólogo, el SVIH-Eli, que
contiene un recubrimiento VIH1 heterólogo, puede utilizarse para
reagredir a los animales.
Las cepas mutantes del V. cholerae Perú-1,
Perú-2, Bang-1, Bang-2,
Bah-1, Bah-2, Bengal- 2, Bengal- 3,
Perú-14, y los mutantes adicionales descritos anteriormente
resultan útiles como fuentes de protección inmunológica contra el
cólera y otras enfermedades toxicógenas relacionadas si se utilizan
como vacuna de virus vivos. Otras de dichas enfermedades incluyen,
pero no se limitan a éstas, las inducidas por el E. coli
enterotoxicógeno y otras bacterias que producen toxinas que son
neurológicamente neutralizables de manera cruzada con la subunidad
B del cólera.
Si las cepas mutantes del V. cholerae son
inoculadas en el intestino de un animal o humano experimental,
éstas deberían estimular e inducir una fuerte reacción
inmunológica contra todos los componentes bacterianos que son
elaborados por estas cepas incluyendo, aunque no limitándose a
ellos, los antígenos 01 LPS Ogawa e Inaba, antígenos flagella, los
dominios de antígenos de los pili Tcp, y las proteínas de la
membrana exterior. En base a estudios publicados con otras vacunas
del cólera prototipo, las clases de anticuerpos IgA e IgG dirigidas
contra estos componentes bacterianos serán sintetizadas en el
animal o humano inoculado y servirán para proteger al animal o al
humano contra siguientes agresiones con cepas virulentas de V.
cholerae.
La determinación del dosaje y administración
apropiados de estas vacunas se lleva a cabo esencialmente tal como
se describe en Herrington y otros, (1988, J. Exper. Med.
168:1487-1492). En general, los citados dosajes se
encuentran entre 10^{5} a 10^{9} bacterias viables por dosis,
aunque no quedan limitados a éstos.
Las bacterias a utilizar como vacuna pueden
crecer en un medio de laboratorio de V. cholerae estándar.
Las células pueden cultivarse y después liofilizarse en una
formulación que mantenga la viabilidad (por ejemplo, leche
descremada estéril o una solución salina que contenga 5 mM de
CaCl_{2} y un 10% en peso por volumen de glicerol).
La administración de la vacuna implica la
combinación del contenido de dos sobres o viales, uno que contiene
la cepa o combinación de cepas de la vacuna liofilizada, y otro
que contiene agua y bicarbonato sódico o un tampón alterno
suficiente para neutralizar el ácido del estómago (aproximadamente
2 gramos). La vacuna puede ser tragada por el vacunado.
Alternativamente, la vacuna liofilizada puede incorporarse en
pastillas que pueden cubrirse con un "revestimiento entérico"
resistente al ácido. Dicha forma de vacuna puede administrarse al
vacunado en una o más dosis (hasta tres) separadas de pocos días a
varias semanas. Si se utiliza como vacuna "de refuerzo", la
vacuna también puede administrarse a individuos vacunados
previamente en una o más dosis (hasta tres) en un intervalo de
pocos días a varias semanas. Cuando se están administrando dos o
más cepas, éstas pueden proporcionarse juntas, o en dosis
individuales en un intervalo de 28 días.
Los preparados de vacunas del cólera
perfeccionadas de administración oral de virus muertos pueden
realizarse a partir de las cepas descritas anteriormente. La vacuna
del cólera experimental que se encuentra disponible en la
actualidad comprende aproximadamente 10^{11} de formalina y
células de V. cholerae de virus muertos por calor mezcladas
con la subunidad B de la toxina del cólera purificado (Black y
otros, Infect. Immun. 55:1116, 1987). Las cuatro cepas que se
utilizan en la preparación del componente bacteriano de esta vacuna
producen una toxina del cólera activa que tiene que inactivarse
completamente antes de la administración al vacunado. Las nuevas
cepas descritas anteriormente proporcionan una vacuna muy mejorada
en comparación con la vacuna de Black y otros (Supra) por
cada una de las razones que se dan a continuación.
(1) Debido a que las cepas derivadas, e
incluyendo Perú-2, Bang-2 y Bah-2,
producen solamente la subunidad B no tóxica de la toxina del cólera
y no la subunidad A tóxica, los cultivos de estas cepas solamente
requieren una suave inactivación antes de la administración a un
vacunado, evitando así los tratamientos de desnaturalización más
severos tales como formalina o calor. Las ventajas del tratamiento
más suave son que los antígenos retendrán un mayor grado de su
configuración nativa y por consiguiente serán más inmunógenos. Los
procedimientos suaves de inactivación que evitan la inactivación
química de las proteínas bacterianas incluyen el calentamiento por
microondas de los organismos, el tratamiento con otra fuente de
radiación o un disolvente o detergente orgánico suave, o pueden
lisarse las células mediante procedimientos mecánicos tales como
sonicación o utilización de una French Press.
(2) en las cepas Perú-3, Bang-3 y
Bah-3, el gen ctxB se ha dispuesto bajo el
control del activador htp. En consecuencia, estas cepas
sintetizan grandes cantidades de la subunidad B de la toxina del
cólera (mayor de 10 \mug/ml de cultivo) en un medio de
laboratorio estándar tal como LB. Esto facilita la purificación de
grandes cantidades de la subunidad B del cólera y, de este modo,
estas cepas proporcionan una importante ventaja sobre otras cepas
que solamente producen la subunidad B en pequeñas cantidades bajo
rigurosas condiciones de crecimiento.
(3) En la preparación de vacunas existentes de
cólera de virus muertos se utiliza una cepa bacteriana
independiente para producir la subunidad de la toxina B a partir de
la cepa utilizada como antígeno de células enteras. Durante la
preparación de la subunidad B es necesario por consiguiente
purificar la subunidad B fuera de la subunidad A tóxica utilizando
procedimientos bioquímicos. Dicha purificación tiene el riesgo de
que pequeñas cantidades de la subunidad A pueden contaminar la
preparación de la subunidad B. Utilizando las cepas descritas
anteriormente es posible generar una preparación de antígenos de
células enteras a partir del mismo cultivo utilizado para obtener
la preparación de la subunidad B. En el primer caso, la
purificación de la subunidad B ahora es innecesaria debido a que la
cepa no produce la subunidad A reduciéndose, por lo tanto, la
cantidad de tiempo y gastos considerables implicados en la
producción de la vacuna. En segundo lugar, no existe riesgo de
tener cualquier subunidad A contaminante en los preparados debido
a que las bacterias simplemente no codifican el gen para esta
subunidad y por consiguiente no lo pueden producir. Por esta razón,
puede utilizarse el preparado de células enteras como vacuna con un
riesgo mínimo para el vacunado.
(4) Algunas de nuestras cepas bacterianas son
derivados del V. Cholerae del tipo El Tor y más
particularmente, en el caso del Perú-2, Perú-3 y Perú-4, son
derivados de un aislado (C6709-Sm) que, de hecho, es
el agente causante de la actual epidemia en Latinoamérica. Si
existen antígenos que son únicos respecto a esta particular cepa
parental, los derivados de la vacuna descritos anteriormente pueden
proporcionar generalmente una mejor protección contra la enfermedad
El Tor en Latinoamérica y posiblemente otras zonas del mundo.
Puede prepararse una vacuna del Cólera de virus
muertos y administración oral mejorada tal como sigue. Un mínimo de
dos cepas, preferiblemente, seleccionadas entre el serotipo Ogawa
(por ejemplo, Bah-3) y el serotipo Inaba (por
ejemplo, Perú-3, Perú-14, o Bang-3), y el serotipo
Bengal (por ejemplo, Bengal-2 o
Bengal-3) pueden crecer en cultivos independientes.
Un experto en la materia sabrá cómo regular las condiciones, el
medio, etc. para maximizar el crecimiento celular a 37°C. Por
ejemplo, los cultivos crecen bajo un elevado nivel de aireación en
un medio tal como CYE (Mekalanos y otros, 1977, Infect. Immun.
16:789) o puede utilizarse un medio mínimo que contenga glucosa, es
decir, AGM4 (van de Walle y otros, 1990, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 33:389). Cuando el crecimiento de las bacterias ha
alcanzado la saturación, las células enteras puede recuperarse del
medio por centrifugación, mientras que las proteínas (incluyendo la
subunidad B) contenidas en la fracción sobrenadante pueden
obtenerse mediante ultracentrifugación o por precipitación. Las
células pueden inactivarse utilizando los procedimientos de Black y
otros (Infect. Immun. 55:1116, 1987) o a través de procedimientos
más suaves (por ejemplo, calentamiento por microondas, irradiación
utilizando rayos alfa, beta o gamma), tratamiento con disolventes
orgánicos tales como etanol o acetona, o pueden lisarse mediante el
tratamiento con detergente o bien a través de procedimientos
mecánicos, tales como sonicación o utilizando una French
Press. Las células inactivadas pueden combinarse entonces con
proteínas bacterianas que contienen sobrenadante concentrado y
filtrado (incluyendo la subunidad B) y la mezcla puede dejarse
suspender en una solución farmacéuticamente aceptable apropiada
para una administración oral (por ejemplo, una solución salina
estéril o bicarbonato sódico al 2%).
La vacuna puede administrarse al vacunado como
una solución salina oral que la traga el vacunado varios minutos
después de que éste haya ingerido 2 gramos de bicarbonato sódico.
Alternativamente, el preparado puede ser liofilizado y comprimido
en pastillas que vayan cubiertas con un "recubrimiento
entérico" resistente al ácido antes de la administración al
vacunado. Las pastillas también pueden microencapsularse con
polímeros con el fin de facilitar la absorción del preparado por el
tejido mucosal intestinal.
Una dosis única de la vacuna debería contener
aproximadamente 10^{11} células y aproximadamente
100-5000 \mug de subunidad B del cólera. Es de
esperar que el vacunado requiera aproximadamente dos o más dosis
separadas de vacuna administradas aproximadamente en un intervalo
de dos o más semanas.
Bajo los términos del Tratado de Budapest sobre
el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos
para el objetivo de Procedimiento de Patente, se ha realizado el
depósito de cepas de V. cholerae C6709-Sm,
P27459-Sm, E7946-Sm,
Bengal-2, Bengal-3, MO10, y Perú 14
con el American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville,
Maryland, USA, donde a los depósitos se les otorgaron los números
ATCC Accesion Numbers ATCC 55331 (06709-Sm);
ATCC 55333 (P27459-Sm); ATCC 55332
(E7946-Sm); ATCC 55436 (0139,
Bengal-2); ATCC 55437 (0139,
Bengal-3); y ATCC 55438 (0139, MO10). El Perú-14 se
depositó con la ATCC el 30 de Junio de 1993.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Mekalanos, John J.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES DE DELECIÓN COMO VACUNAS PARA EL CÓLERA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 225 Franklin Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02110-2804
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO ELECTRÓNICO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco de 3112, 1,44 Mb
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2 Modelo 50Z o 55SX
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (Versión 5.0)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect (Versión 5.1)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Freeman, John W.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29.066
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 00742/007001
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 542-5070
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FAX: (617) 542-8906
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 200154
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTAGTGCGC ATTATGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTAAACCTAGA GACAAAATGT TCCTAGTGCG CATTATGTAT GTTATGTTAA AT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTAAACCTAGA GACAAAATGT TCCTAGTGCG CATTATGTGG CGCGGCAT
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAAACCCTAGA TTCCGCCGCC TTAGTGCGCA TTATGTATGT TATGTTAAAT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGGCTAAAGT TAAAAGACAA ATATTTTCAG GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA
SECUENCIA NÚMERO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGGTAGAAGT GAAACGGGGT TTACCG
\hfill26
Claims (29)
1. Cepa mutante genéticamente estable no
toxicógena de V. cholerae, siendo dicha cepa un mutante de
deleción modificado genéticamente que carece de ADN que codifica
una subunidad ctxA funcional de manera que dicha cepa no
induce los síntomas del cólera de nausea y diarrea, careciendo
dicho mutante además de cualquier secuencia attRS1, en el
que una secuencia attRS1 funcional es una secuencia de 17
pares de bases contenida en el elemento genético ctx que se
requiere para la recombinación y amplificación del elemento
genético ctx, o suficiente de esa secuencia para permitir
tal recombinación y amplificación, en el que la ausencia de
secuencias attRS1 funcionales provoca una recombinación en un punto
específico mediada por attRS1 de por lo menos 1000 pliegues
menor respecto a una cepa parental que presenta dos secuencias
attRS1 funcionales.
2. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 1, caracterizada en que dicha cepa deriva de
una cepa parental que pertenece al serogrupo El Tor.
3. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 2, caracterizada en que dicha cepa deriva de
una cepa parental que pertenece al serotipo Inaba u Ogawa.
4. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 1, caracterizada en que dicha cepa deriva del
serogrupo non-01.
5. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 4, caracterizada en que dicha cepa es del
serogrupo Bengal.
6. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 4 ó 5, caracterizada en que dicha cepa es
Bengal-2 (ATCC 55436) o Bengal-3
(ATCC 55437).
7. Cepa de V. cholerae según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizada en que dicha
cepa carece de secuencias centrales ctx y está totalmente suprimida
por todas las secuencias attRS1.
8. Cepa de V. cholerae según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada en que dicha cepa
carece, además, de un gen recA de manera que 0,1 ml metil metano
sulfonato por ml de Luria Broth es letal para dicha cepa.
9. Cepa de V. cholerae según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizada en que dicha
cepa codifica adicionalmente una subunidad B de toxina del
cólera.
10. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, caracterizada en que
dicha cepa codifica adicionalmente un antígeno que no está
expresado normalmente en el V. cholerae.
11. Cepa de V. cholerae según la
reivindicación 10, caracterizada en que dicho antígeno es
una toxina de tipo Shiga, o un antígeno CFA E. coli.
12. Cepa de V. cholerae según las
reivindicaciones 10 ó 11, caracterizada en que dicha
secuencia de ADN que codifica el citado antígeno se inserta en el
gen lacZ del V. cholerae.
13. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizada en que dicha
cepa es Bengal-2 (ATCC 55436) o
Bengal-3 (ATCC 55437).
14. Procedimiento para la elaboración de una
cepa mutante genéticamente estable de V. cholerae según la
reivindicación 1, que comprende la introducción en V.
cholerae de tipo salvaje un plásmido que comprende un fragmento
de ADN de V. cholerae capaz de recombinarse con ADN de V.
cholerae de tipo salvaje, cuyo fragmento ha mutado las
secuencias ctxA y attRS1 de manera que, tras la
recombinación con ADN de V. cholerae de tipo salvaje, dicho
fragmento no induce los síntomas del cólera de nausea y diarrea y
no proporciona una secuencia attRS1 funcional tal como se define en
la reivindicación 1.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado en que dicha cepa de V. cholerae es
Bengal-2 (ATCC 55436) o Bgengal-3
(ATCC 55437).
16. Procedimiento según las reivindicaciones 14
ó 15, caracterizado en que dicha cepa mutante carece de
secuencias centrales ctx y todas las secuencias
attRS1.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 15, caracterizado en que dicha cepa
mutante carece adicionalmente de un gen recA de manera que
0,1 ml de metil metano sulfonato por ml de Luria Broth es letal
para dicha cepa.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, caracterizado en que dicha cepa
mutante codifica adicionalmente un antígeno que no está expresado
normalmente en el V. cholerae.
\newpage
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, caracterizado en que el
procedimiento comprende, además, la introducción en el gen
lacZ de la citada cepa mutante un fragmento de ADN que
codifica un antígeno.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado en que dicha cepa es Bengal-2
(ATCC 55436) o Bengal-3 (ATCC 55437).
21. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, siendo dicha cepa un mutante
deficiente en la penetración del agar blando.
22. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 ó 21, caracterizada en que
dicha cepa es 2att.
23. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, 21 ó 22, caracterizada en
que por lo menos un 25% de las células de la citada cepa son
capaces de formar estructuras filamentosas de 15nM o mayores bajo
condiciones de crecimiento de fase estacionaria.
24. Cepa según la reivindicación 10,
caracterizado en que el citado antígeno es un antígeno
lipopolisacárido Shigella; un antígeno VIH; una toxina de
ántrax; una endotoxina A pseudomonas; un fragmento antigénico de
cápside de VIH; una toxina pertussis; una toxina tetánica; un
antígeno del virus del Herpes, virus de la rubéola, virus de la
gripe, virus de las paperas, virus del sarampión, o virus de la
poliomielitis; o un polipéptido inmunógeno de un parásito eucariota
que provoca la malaria, neumonía pneumocystis, o
toxoplasmosis.
25. Vacuna que comprende por lo menos dos cepas
diferentes de V. cholerae según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 ó 21 a 24, estando derivada una de dichas
cepas de Perú y estando derivada la otra de Bengal.
26. Vacuna según la reivindicación 25,
caracterizada en que cada una de dichas cepas es
ctx^{-}, att^{-}, y recA^{-}.
27. Vacuna que comprende una cepa de V.
cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ó 21 a
25.
28. Cepa de V. cholerae según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 ó 21 a 25 para su uso como
medicamento.
29. Utilización de una cepa de V. cholerae
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ó 21 a 25 en la
preparación de una vacuna para el tratamiento del cólera.
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