TWI257951B - Streptomyces strain with insecticidal activity and method of using as an insecticide - Google Patents

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1257951 玖、發明說明： 發明範, 本赉明係有關於生物殺蟲劑之範疇。更特定言之，本發 明係有關於一種具有殺蟲活性之新穎鏈黴菌菌株及其使用 方法。 1明背景 天然產物即由微生物、植物、及其它生物所產生之物 質。天然微生物產物提供了豐富的化學多樣來源。利用這 些天然產物供醫藥學用途的歷史悠久。儘管於人類治療方 面相S強调天然產物，但僅有少數天然生產殺蟲劑供作農 業用途。最成功之微生物天然生產殺蟲劑為蘇雲金芽孢桿 菌（5此"/似毒素、艾佛牧可汀（avermectin)及 司賓諾新（spinosyns)。蘇雲金芽孢桿菌（Bt)細菌於孢子形 成時所產生之細胞質蛋白質結晶（3 _内毒素）為最重要的昆 蟲致病因子（見於艾拉（Ellar)，DJ· (1997) ”The skuchK and function of Bacillus thuringiensis -endotoxins and prospects for biopesticide improvement/» In: Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The British Crop Protection Council Symposium Proceedings No.68, Coventry，UK)。f内毒素已同時運用於喷劑製備物及”系 統性”生物殺蟲劑，後者係經由將内毒素基因引入基因轉 殖植物中而達成。1997年至2000年間，出噴劑製備物之市 場成長量估計約為10%，2000年之市場規模可達}億至2億 3 千萬美金（見利山斯基（Lisansky)，s (1997) ”Micr〇bial 70068-940928.doc 1257951 biopesticides’’ In: Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The British Crop Protection Council Symposium Proceedings Νο·68，Coventry，UK·)。主要之Bt基因轉殖作 物為玉米及棉花。美國基因轉殖Bt玉米之市場已由1996年 之僅1.4%的栽種英畝面積成長至1998年之19.1%。Bt棉花 成長並未如此劇烈，其由1996年之14.6%的栽種英畝面積 增加至1998年之16.8%。整體市場現況係指向對抗鱗翅目 害蟲的方面。於1999年，美國用於對抗毛蟲之殺蟲劑市場 超過4億美金。 艾佛牧可；丁係由艾佛米提力鏈黴菌 ⑷於發酵時產生。艾巴枚可汀（Abamectin)係一種 天然產生之大環内酯，其可顯示對抗、梨黃木虱（pea psylla)及菜蛾（diamond back moth)之活性。依瑪枚可行 (Emamectin)係一種艾巴牧可汀之半合成類似物，其顯示 對抗鱗翅目幼蟲之活性。於無脊椎動物，艾佛枚可汀可引 起突觸前氯離子通道（非GABA_活化者）開口，導致氯離子 流出，使神經末稍去極化，並因此釋出神經傳導素。見於 透納（Turner)，M.j·及沙佛（Schaeffe〇, JM(i989 年广 of action of Ivermectin/* In: Ivermectin and Abamectin3 W.C· Campbell (Ed·) Springe卜VeHag，紐約。Μ%年將 艾佛牧可;丁運用於昆蟲防治之全球市場價值據 至1億2千萬美金。 雨 司賓諾新係一種新等級的由發酵所取得之四環-大環内 醋，其係由放射菌類司賓諾撒糖多孢菌 70068-940928.doc 1257951 所產生。司賓諾新A及D為司 賓諾撒殺蟲劑追蹤者（Tracer )之主成份，其顯示對抗鱗 翅目害蟲及蚊類之活性。見史巴克思（Sparks)，T.C·等人（1999) ’’Fermentation-derived insecticide control agents: the spinosyns” In: Biopesticides Use and Delivery, Hall，F.R. et al·，eds. Humana Press，Totowa，New Jersey, ρρ·155-170 o 其作用模式獨特，主攻擊部位為菸鹼乙醯膽素接受器且次 要攻擊部位可能為GABA接受器。見撒加竇（Salgado)， V.L.(1997) ’’The modes of action of spinosad and other insect control products” Down to Earth 52:35-43 o 鏈黴菌係一種認可之天然殺昆蟲產物來源。除艾佛牧可 汀及司賓諾新外，尚有膽固醇氧化（珀協（Purcell)，J.P.等 人，（1993 年）Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1406-1413)、阿露撒密定（allosamidin)(撒苦達（Sakuda)，S.( 1986) Tetrahedron Lett. 27:2475-2478)、華力諾黴素 (valinomycin)(黑協（Heisey)，R.(1988) J. Agric. Food Chem. 36:1283-1286)、°比p各力仁（pyrrolizine)衍生物（吉石拔 (Jizba), J.等人，（1992 年）Folia-Microbiologica 37:461-462)、雷司皮蘭汀（respirantin)(烏魯虛巴塔（Urushibata)，I. 等人（1993 年）J. Antibiotics 46:701-703)、普拉新諾司 (prasinons)(巴克士（Box)， S.J_ 等人（1973 年）Appl. Microbiol. 26:699-704)、皮耳西定（piercidin)(塔 π客哈許 (Takahashi)，Ν·等人（1968) Agr. Biol· Chem. 32:1115-1122)、葛力蘇林（griseulin)(内爾（Nair)，M.G·等人，（1993 70068-940928.doc 1257951 年）J· Antibiotics 46··1762_1763)、瑪爾提諾黴素 (martinomycin)(卡爾特（Carter)，G.T·等人，（1994 年）J. Antibiotics 47:1549] 553)、費利方琴（faeriefungin)(内爾， M.G·等人（1989年）J. Nat. Prod. 52:797-809)、印大諾黴素 (indanomycin)(冉（Zhang), D.等人，（1997年）J. Antibiotics 50:617-620)、環佛司汀（CyCi〇ph〇stin)(庫洛卡娃 (Kurokawa)，T·等人，（1993 年）J· Antibiotics 46:1315-1318)、曼怒黴素（manumycin)(齊克（Zeeck)，A·等人（1987 年）J. Antibiotics 40:1530-1540)、依曲賽歐黴素 (ichthyomycin)(齊茲卡（Zizka)，Z.等人（1991) Cytobios 65:31-38)、維吉尼亞黴素（virginiamycin)(普力克力羅娃 (Prikrylova)，V.等人（1992) Folia Microbiol. 37:386-388)、 蘇塔疊司全（suidatestrin) (克奴協（Knuessel)，I·等人（1998) Comp· Biochem. Phys. Β· 120Β:639-646)、瓜拉黴素（gualamycin)(祖曲亞 (Tsuchiya), K.J.(1995) J. Antibiotics 48:626-629)、及其它 來自鍵M函菌株之殺昆蟲天然產物。 鮮黃鏈黴菌可產生有效的抗-蠶黴菌大環内酯、郭邦諾 來德（galbonolide) A及郭邦諾來德B。（保羅（Paul) Α·Κ·及 邦納吉（Banerjee)，A.K.(1983) Folia Microbiol. 28:386-396;西格門德（Sigmund)，J.M.及贺須（Hirsch)，C.F.(1998) J· Antibiotics 5 1:829-836、奥肯巴哈（Achenbach)，H·，德國 專利案號86-3632168 ;及查納（Zaehner)，H·，德國專利案號 3632168)。拿卡亞馬（Nakayama)等人（1987年）（Agric. Biol. 70068-940928.doc 1257951

Chem_ 5 1:853-860)報告發現銹黴素（rustmicin)，一種有效 的小麥桿銹病（禾柄銹菌（Puccinia gramnis))抑制劑。稍 後，郭邦諾來德A顯示出與銹黴素相同的分子。奥肯巴哈 等人（1988 年）(Annals N. Y· Acad· Sci· 544:128-140)報告出 邠邦諾來德A較郭邦諾來德b更加有效於對抗某些内孢酵 母少⑽謂⑷及大多數的半知菌綱 (Deuteromyceies)，如白假綠、酵母（Candida albicans)反灰 葡萄孢沿ckerea)。沒有證據顯示這些大環内酯會 V致離子游離（i〇n〇ph〇ric)活性、細胞膜不穩定、干擾dna 或RNA生物合成、或抑制幾丁質之生物合成。近來曼達拉 (Mandala)等人（1998) j· Bi〇l· Chem· 24:14942-14949)及哈 里斯（Harris)等人（1998 年）J. Antibiotics 5 1:83 7-844、及哈 里斯，G.等人（英國專利案號23243〇〇)證明銹黴素可抑制肌 醇鱗酸神經醯胺合成，即神經鞘脂質生物合成之第一種 黴菌_特異酵素。我們在此提供一種鮮黃鏈黴菌新穎菌株 之有效殺昆蟲特性，其擁有對抗一些與農業相關之鱗翅目 昆蟲之活性。 發明說明 本發明提供一種新穎化合物，鮮黃鏈黴菌，NRRL登錄 號碼30232，及其保留相同活性之突變種，其可作用為對 抗鱗翅目昆蟲之殺蟲劑。本發明包含將該菌株之代謝物及 上清液作為殺蟲劑之用途。本發明亦包含使用該菌株治療 植物或果貫以控制鱗翅目昆蟲侵擾之方法，其可單獨或與 其它化學或生物殺蟲劑共同使用。本發明更進一步提供發 70068-940928.doc -10- 1257951 酵該菌株以增加其用作殺蟲劑之生物活性的方法。 本發明實粁方法 微生物窬在_ 於辰業研九服務專利培養採集所（Agricuiturai Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern gional Research Center，1815 University Street，Peoria，

Illmcns，61604, USA)根據布達佩斯協定（Budapest Treaty) 寄存鮮黃鏈黴菌菌株。其登錄號碼（Accessi〇n number)為 NRRL 3 0232。該鮮黃鏈黴菌3〇232業已於民國 90年4月20日寄存於新竹食品工業發展研究所，其寄存編 號為 CCRC 910169。 邊菌株已經女善保存，於專利申請期間皆可隨時提供。 該沉積可提供國外專利法及各國列檔專利申請主題複本或 其子代所需。然而，應明白提供本發明沉積物並不代表授 權實行本發明因而減損由政府所授予的專利權。 定義 以下定義在此所用之部分名詞。 除非文中特別指明，否則單數型式及"該，，涵蓋複數 型式。如"一細胞"一詞包含多數細胞及其混合物。 包括"一詞係指組合物及方法包含所敘述之要素，但並 不排除它者。運用"實質上由...組成”來定義組合物及方法 時’應指未包含組合物必要物質以外之任何其它要素。因 此，實質上由在此所定義之要素所組成之組合物並未排除 來自分離及純化方法及農業可接受載劑中之微量污染物:、 70068-940928.doc !257951 由···組成，，應指未包含來自其它成份及施用本發明組合物 之基本方法步驟以外之微量元素。經由這些轉變名詞所定 義之具體實施例皆包含於本發明範圍中。 在此所用之，，生物控制”定義為使用第二種生物來控制病 原體或昆蟲。已知生物控制機轉包含以腸内菌與真菌競爭 根部表面空間而控制根部腐爛，或施用蘇雲金芽孢桿菌來 控制昆蟲類害蟲。細菌毒素，如抗生素，已用於控制病原 體及昆蟲。毒素可分離並直接施用於植物或採用細菌物種 使其可於原處產生毒素。 ”真菌”-詞包含多種有核、可產生孢子、無葉綠素的生 物。真菌之實例包含酵母、黴菌、霉、銹病、及簟。 ’’細菌”一詞包含任何未擁有明顯細胞核之原核生物。 殺真菌或抗-真菌”指一種物質可增加真菌死亡率或抑 制其生長速率之能力。 抗生素包含可殺死它種存活生物（包含（但不限於）其它 微生物）或抑制其生長之任何物質。抗生素可由微生物或 藉合成或半合成步驟產生。 、犬1種詞係指來自親代菌株之變異種以及獲得突變 種或、=異種之方法’其殺蟲活性大於親代菌株所表現者。 親代菌株在此定義為突變前之原始鏈徽菌菌株。為獲得 口亥大文種可以化學物處理親代菌株，如甲基-N，_硝基_ 亞肖基胍、乙基甲石黃酸（ethylmethane⑽lf〇ne)，或利 用r射線、X-射線、或紫外線等幅射處理或精於此技藝者 所熟知的其它方法。 70068-940928.doc 1257951 ’’變異種’’係擁有NRRL登錄號碼30232所確認所有特性之 菌株且可確認出其擁有之基因組係於與NRRL登錄號碼B_ 3 0 2 3 2之基因組相同局度嚴格的條件下雜交而成。”雜 交’’係指由一或多個聚核甘酸反應而形成複合物之反 應，其係經由核甘酸殘基間之氫鍵聯結而獲得穩定。氫鍵 結合可經由華森-克里客（Watson-Crick)驗基配對、胡格斯 坦（Hoogstein)結合、或任何其它順序-特異方法。複合物 可包括二股所形成之雙重構造、三或更多股形成之多股複 合物、單一自我雜交股、或其任何混合物。雜交反應可於 不同”嚴格”狀況下進行。一般來說，低度嚴格雜交反應係 在約40°C、於10 X SSC或具同等離子強度/温度之溶液中 進行。中度嚴格雜交一般在約5〇°C、於6 X SSC中進行， 而高度嚴格雜交反應通常在約6〇。〇、於1 X SSC中進行。 NRRL登錄號碼30232之變異種亦可定義為高於85%之基 因組序列與NRRL登錄號碼B-30232之基因組相同之菌株， 較佳為高於90%或更佳為高於95%。當一多核甘酸或多核 甘酸區（或一多肽或多肽區）具有與其它序列某種比例（如 80%、85%、90%、或95%)上之，，序列相同，，則表示將兩組 序列排成直線作比較時有如此百分比的驗基（或胺基酸）相 同。這種排列及相似百分比或序列一致性可使用本技藝中 為人所知的軟體程式來測定，如描述於CURRENt PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY之中者（F.M·奥甦 貝爾（Ausubel)等人編輯，1987年）Supplement 3〇, secti〇n 7·7_18，Table 7.7.1。較佳地，使用預設參數來進行排列。 70068-940928.doc -13 - 1257951 較佳的排列程式為BLAST，使用預設參數。特定言之，較 佳程式為BLASTN及BLASTP，使用下列預設參數：遺傳 密碼=標準；過濾（filter)=無；股（strand)=雙；切斷 (cutoff) = 60 ;預計（expect)=10 ;基質=BLOSUM62 ;描述 =50序列；排列=高分（HIGH SCORE);資料=非過剩（non-redundant)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB + GenBank CDS轉 譯+Swiss蛋白質+SPupdate+PIR。這些程式的細節可見於 下列網址： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST 〇 ”培養”一詞係指於各種培養基中增殖生物。 ”全液培養物”係指同時含有細胞及培養基之液體培養 物。 ’’上清液π係指以離心、過濾、沉澱、或其它本技藝中已 知方法將生長於液中的細胞移除後所剩餘之液體液。 ’’有效量’’係足以產生有益或所需結果之份量。有效量可 一次或分成多次給予。以治療及保護而言，”有效量’’係指 足以減少、阻礙、或排除昆蟲之攝食、生長、及未成年蟲 或成蟲發展階段繁殖等能力的份量。 在此所用之π昆蟲’’ 一詞包含所有昆蟲綱的生物。 在此所用之’’鱗翅目昆蟲’’係指一昆蟲目，其特徵為幼蟲 階段為毛蟲或蠕蟲型態，而成蟲階段之型態為蛾或蝴蝶。 π未成年π昆蟲係指成年期前任何型式之生物，包含如卵 、幼蟲、及踊。 π殺昆蟲π係指物質增加死亡率或抑制昆蟲生長速率的能 70068-940928.doc -14· 1257951 力。 :殺害蟲”係指物質增加死亡率或抑制昆蟲、線蟲及生長 速率的能力。 ”正控制劑”指一種已知具有殺害蟲活性之化合物。”正 控制劑”包含（但不限於）化學殺害蟲劑商品。 ”負一控制劑詞指已知不具有殺害蟲活性之化合物。負 控制貫例為水、空白培養基、或低濃度溶劑，如丙_、乙 醇或乙酸乙酯。 工白坧養基係由不含發酵微生物之滅菌發酵液所組成。 ，:溶劑”-詞包含任何可保存其它物質成為溶液之液體。 可抽離洛劑”係指任何可溶於溶劑且可再由溶劑中分離 之化合物。溶劑實例包含（但不限於）有機溶劑，如乙酸乙 醋⑻〇岭丙輞、乙醇（Et0H)、乙腈、甲醇（Me〇H)、丁 酉手（BuOH)或二甲亞（DMS〇)。 代身物-詞係指任何來自微生物發酵、具有生物活性 之化合物、物質或副產品。 左口物仏才曰活性作用劑及其它化合物、載劑或組合物 月’物(如可查覺劑或標籤或液體載劑)或活性物(如佐 劑）等之結合物。 1 、、本發明提供一菌株之生物學上純淨培養物，該菌株如前 述擁有與鮮更鏈黴菌，NRRL登錄號碼30232、及其變異種 二：艾種相同之所有特性，並具有殺昆蟲活性。於一具體 貝_中’本發明係指定為NRRL登錄號碼30232之菌株。 I月提ί、種由在此所述菌株之生物學上純淨培養物 70068-940928.doc 15 1257951 中分離出代謝物之步驟以及由此所分離出之代謝物。該代 謝物特徵為可以溶劑抽出且分子量低於10,000道耳呑 (Daltons)。 進一步所提供的係自在此所確認之生物學上純淨培養物 純化出生物學活性上清液之方法以及因此而分離出的上清 液。該分離之上清液具有類似於鮮黃鏈黴菌，NRRL登錄 號碼30232、或其突變種及變異種所擁有之殺昆蟲活性。 本發明亦提供包括至少一種生物學上純淨培養物、上清 液或上述之分離代謝物及一種載劑之組合物。另一方面， 該組合物更進一步包含至少一種化學或生物殺蟲劑。該組 合物可調配成為任一種或多種可濕性粉末、顆粒、水性懸 浮液、及可乳化濃縮物與微包囊配方物。 為使本發明組合物達到良好分散及附著狀況，可方便的 將完整液培養物、上清液、及/或代謝物/抗生素調配以可 幫助分散及附著的成分。因此，適當調配物已為熟諳此技 藝者所熟知（可濕性粉末、顆粒、及其類似物、或可微包 封於適當媒介物及類似物中、液體，如水性可流動物及水 性懸浮液、及可乳化濃縮物）。其它適當調配物已為熟諳 此技藝者所熟知。 任何上述所提及之菌株、代謝物、部分、上清液及含這 些活性成份之組合物可用於提供治療或保護植物、根或果 貫免於昆蟲感染之方法。昆蟲包含（但不限於）自包括鱗翅 目、鞘翅目及雙翅目之昆蟲。以某方面而言，昆蟲係指鱗 翅目昆蟲’如甜菜仪蛾⑽）、安提卡西亞 70068-940928.doc -16- 1257951 健馬踏里司g㈣則ία/ζ、）、小菜蛾類（户/以化"α 印Ρ·)、煙草蛾ΖΜ)、黑理歐西司維力先 (Heliothis virescens)、反银故夜备蛾〈Trichoplusia ni)。 本發明亦提供一種生產作為殺蟲劑之上清液的方法，其 係經由培養本發明菌株並分離上清液而完成。藉該方法所 產生之上清液在此亦包含於專利申請範圍中。 邊代謝物係利用反相、固相抽取來分離，其中使用甲醇 及水之梯度。由分子量可確認該代謝物（小於1〇,〇〇〇道耳 吞）。 所有於此所引用之專利及文獻皆以引用的方式併入本文 中下列貫例係用以說明本發明。這些實例不可解釋為對 本發明申請範圍之限制。 實例 下列實例係用以說明（但不限制）本發明。 實例1 鮮黃鏈黴菌，菌株NRRL登錄號碼3〇232之特性 根據16S rRNA排序法確認}^111^登錄號碼3〇232。用來 產生 16S rRNA基因資料順序（Acculab Customer Handbook V· 1·0)之計劃敘述如下。 由細菌菌洛分離之基因組^^八進行16S rRNA基因之pcR 放大。用來仃放大作用的引導子相當於大腸桿菌(五⑶") 之005及531位置。利用微空1〇〇 (阿米空）分子量切除膜 ⑽―⑽(Amicon) cut 〇ff膜)將放大作用產物由多餘 引導子AdNTPS中純化’並將部》產物於«上進行定性 70068-940928.doc 1257951 及定量分析。 16S rRNA放大作用產物之環狀排序係使用安普力鐵克 (AmpliTaq) FS DNA聚合酶及滴羅達命（dRhodamine)染色 終止子進行。過量染色-標示終止子係使用西發疊士 (Sephadex) G-5 0旋轉柱由排序反應中移除。以離心法收集 產物，於真空下乾燥並於-20 °C冷凍備用。將樣本再懸浮 於甲醯胺/藍葡聚糖/EDTA溶液中並於裝填前去活性。於 ABI菱柱（Prism) 377 DNA排序器上將樣本進行電泳分析。 利用PE/實用生物系統（Applied Biosystem’s) DNA編輯及整 合軟體來分析資料。序列取得後，利用微序（MicroSeqTM) 序列分析軟體比對PE/實用生物系統微序資料庫。同時將 序列比對基因庫（GenBank)及核醣體資料庫計劃（Ribosomal Database Proiect (RDP))。 該16S rRNA排序結果與NRRL Ν〇·30232鮮黃鏈黴菌之相 似百分比為99% (基因庫）及相似性等級為〇·98 (RDp)。這 些分數代表兩者為同種。 實例2 鮮黃鏈黴菌，NRRL登錄號碼30232對抗植物病原體之活 性培養新穎鮮黃鏈黴菌菌株以供進行下列方法測試對抗植 物病原體之活性。將分離之微生物於三種不同的放射菌類 坧養基中發酵。培養基3 8係由2克/升蕃茄糊、2克/升燕麥 粕、及ι·ο克/升海鹽所組成。培養基31係由45克/升燕麥 粕、2克/升酵母抽提物、6克/升KHbPO4、及4.8克/升 2ΗΡ〇4 (ΡΗ 7)所組成。培養基6係由2〇克/升可溶性澱 70068-940928.doc 1257951 5克/升N-Z胺 粉、ι〇克/升葡萄糖、5克/升酵母抽提物 A、及1克/升CaC03所組成。 自蕃祐·燕麥粉瓊脂（2克/升蕃莊糊，2克/升燕麥粉及2〇 克/升€脂）取出微生物並導入含有12毫升無菌發酵 之50毫升圓錐試管中，以發泡塞蓋住。將已接種試^保二 在27 ±3 °c中，置於軌道搖晃器上6天。使用貝克: (—η) JB_6冷卻離心機中的擺動吊桶轉輪（JSU)將: 有小規模發酵產物的試管以4,2〇〇轉/分（3,5〇〇重力）旋轉^ 分鐘。無菌收集上清液並轉移入無菌96深孔平盤或裝置於 可供自動操作網架上之5毫升試管中。將各上清液無菌 式三份轉移入無菌96_孔微力價盤中。加入化學控制組作 為正面查核’其僅使用空白培養基及水作控制物。隨後逐 層覆蓋熔化瓊脂。 25微升等份試樣之上清液以75微升之炫化2·5%複脂覆 蓋，再覆蓋100微升等份試樣之〇·75%馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA，馬鈴薯葡萄糖液23克/升、瓊脂7.5克/升）。最後， 將25微升之病原體孢子懸浮液覆蓋在pda上並將試盤保溫 於24±2°C中4天。以分級指數測定病原體之生長速率，其 中5代表生長相當於水控制組，而1代表完全無生長。指數 值（2)至（4)代表孢子形成之中間階段，而代表失敗或非 必要之測試。 下列為測試之病原體/化學物配對：布拉西西可拉鏈格 孢〇4/化心似也/C(^)(ABRA本諾邁（万⑽⑽少，)）、西那 力屬黴菌（5〇卜少斤以c/⑽r⑽)(BOTC/本諾邁）、福路科提可 70068-940928.doc •19- 1257951

拉鏈核盤菌（M〇77///_0/rwci/e<9/a)(MONF/本諾邁）、辣椒疫 徽capdciKPCAP/牧塔雷西（Metalaxyl))、丁 香假單孢菌（Paw而所㈣似*^h77gae)(PSTO/見大黴素 (Gentamycin))、及可 口依兹刺盤孢 acc<9zWa)(C0LC/氣撒婁尼耳（Chlorothalonil))。表 1 顯示 二種不同重複試驗之結果。該試驗包括三種個別發酵日期 並登計於下。在所有的獨立重複試驗中化學控制組生長速 率指數為（1);而空白培養基生長指數為（5)。 NRRL登錄號碼30232之殺真菌活性 表1 重複試驗 培養基 濃度 ABRA BOTC MONF PCAP PSTO COLC 重複試驗1 6 lx上清液 4 5 5 3 5 4 重複試驗1 31 lx上清液 5 4 3 3 5 4 重複試驗1 38 lx上清液 5 5 4 3 5 4 重複試驗2 31 lx上清液 5 4 4 4 4 4 重複試驗2 38 lx上清液 5 5 5 5 5 4 重複試驗2 38 lx上清液 5 5 4 3 5 3 重複試驗3 6 lx上清液 5 4 5 0 5 重複試驗3 31 lx上清液 5 5 2 0 5 3 雖然在某些測試孔中（特別是PCAP重複試驗1)的受試病 原體有些許輕微抑制現象，但在重複試驗2中其結果無法 作出決定性的確認。整體而言，在瓊脂擴散式分析中，數 據顯示新穎菌株NRRL登錄號碼30232六日齡培養物之全液 上清液無法廣泛對抗植物病原體孢子。 實例3 70068-940928.doc -20- 1257951 鮮黃鏈黴菌’ NRRL登錄號碼30232對抗昆蟲之活性 為評估殺昆蟲活性，在六組重複試驗中將個別微生物抽 提物覆蓋於置於96孔試驗盤中、以麥芽/酪蛋白為主之人 工食餌上（29克/升瓊脂、13·8克/升協路菲（Celufil)、π」 克/升蔗糖、32.2克/升酪蛋白、27.5克/升小麥胚芽、92克/ 升威森鹽混合物（Wesson salt mix)、9.0克/升維生素預混 物、33 4克/升鏈黴素、33毫克/升氯四環黴素氫氯酸鹽、 1·2毫升/升丙酸、〇·12毫升/升磷酸、1〇毫升/升1〇〇標準酒 度乙醇（P_f ethanol)、！克/升甲基巴拉本（⑽㈣ paraben)、0.3克/升苯甲酸鈉、lo克/升山梨酸）。將時期同 步化的甜菜夜蛾蟲卵消毒並懸浮於稀釋瓊脂溶液中。使用 倒置的微孔（Millipore®) 96孔過濾試盤作為模板來接種含 25微升、5至10個7日齡印的矩形華特曼（whatman)@#2濾 紙。使濾紙乾燥後，反轉並對準食餌/抽取物試盤的孔開 口。以換氣試盤蓋將濾紙覆蓋並以膠帶固定。將試盤保溫 於伯西華（percival)生長室中、溫度28±2t：、曝光週期 16:8、相對濕度3G_4()% m的蛋及新生幼蟲會掉到以抽 取物處理過之食僻上。於4天後將試盤自伯西華室取出， 去除玻璃紙膝帶，並將試盤在桌面上摔叩以便將蟲自遽紙 上移除。用一片穿孔之透明密拉薄膜（Mylar)取代蓋子域 紙並以烙鐵密封固定。再將測試物放回伯西華室中一天。 使用類似植物病理學篩檢的指數來評估幼蟲的外表生長速 率，其中1代表1〇〇%死亡率而4代表生長情況相當於未處 理的拴制組。2代表死亡率介於1〇〇%至5〇%間或嚴重成長 70068-940928.doc 1257951 阻礙。3代表死亡率介於50%至25%間或發育遲缓。每次平 行實驗日皆進行一次化學控制試盤對照試驗。由8組自 1000至7 PPM之賈福林（Javelin®)(蘇雲金芽孢桿菌克司塔 基（kurstaki)株）連續稀釋物獲得劑量反應數據。使用拜分 新（bifenthrin)作為化學控制對西斑紋胡瓜甲蟲（western spotted cucumber beetles)(CRW: (Diabrotica undeeimpunctata)) 進行類似試驗。以桃蚜蟲（Green peach aphids)(GPA: Myzas persicae)或豆長管蚜蟲（pea aphids)(pA: Acyrthosiphon pisum)進行96孔試盤分析測試。讓置於96孔 试盤底的濾、紙圓盤吸收上清液。將虫牙蟲置於孔中並以附有 巴拉費（parafilm)膜的微孔®96孔過濾試盤覆蓋底試盤。過 濾試盤孔裝有40微升之上清液及4〇微升之人工液體食餌 (300克/升蔗糖、1〇克/升酪蛋白羥基化物hydr〇sylate、1克/ 升威森鹽混合物、1克/升維生素預混物、33毫克/升鏈黴 素、33毫克/升氯四環黴素氫氣化物、1克/升羥苯甲酸甲 酯、〇·3克/升苯甲酸鈉、ι·〇克/升山梨酸，ρΗ 6·8)。化學控 制試盤以連續稀釋之依密鬥可婁普力德（imid〇ci〇prid)處 理，其中底試盤之經處理濾紙有接觸活性，而覆膜之經處 理孔則有食入性活性。24至48小時後判讀蚜蟲之死亡率。 列表顯示在水/食餌控制膜進食及行走/停留於含以水處理 濾紙孔中的存活蚜蟲數。計算其上下限及標準誤差以便指 數範圍計算。利用含濾紙之96孔試盤評估棉紅蜘蛛（丁__ spotted spider mites)(SM: Tetranynchus 〇rticae)。將上清液 (40微升）移到濾紙上，再加上2〇微升等份試樣的人工液體 70068-940928.doc -22- 1257951 食餌，並將試盤於加壓空氣下部分乾燥。於24-48小時後 評估死亡率。使用連續稀釋之艾佛牧可汀作為化學控制。 於96孔試盤以J2s之液體懸浮液評估圓蟲（Round worms)(CE: Caenorhabditis elegans)、植物病害線蟲 (entomopathogenic nematodes)(//5: Heterorhabditis bacteriophora) 及根瘤線蟲（root knot nematodes)(MJ: Meloidogyne javonica)。使用艾佛牧可汀（Avermectin®)作為化學控制。

表2數據顯示NRRL登錄號碼30232對抗甜菜夜蛾幼蟲之 特性。ATCC登錄號碼49460係司賓諾撒糖多孢菌之美國型 培養收集（American Type Culture Collection)野外型分離 株-其係一種可產生司賓諾新的生物。見於史巴克司 (Sparks)等人（1999 年）’’Fermentation-derived insecticide

control agents: the spinosyns” (Biopesticides, Use and Delivery，豪爾（Hall) F.R.等人編，Humana Press，Totowa, New Jersey，pp· 15 5-170)。如顯示於下表2，ATCC登錄號 碼49460及NRRL登錄號碼30232二者皆具有對抗培養基31 中之甜菜夜蛾幼蟲的活性。 表2 · NRRL 3 0232及ATCC 49460之殺昆蟲活性 重複試驗 試樣 培養基 濃度 CE CRW BAW GPA SM 重複試驗1 30232 31 lx上清液 4 4 1 4 4 重複試驗1 30232 38 lx上清液 4 3 2 4 4 重複試驗1 49460 31 lx上清液 0 0 1 0 0 重複試驗2 30232 31 lx上清液 0 0 1 0 0 重複試驗2 30232 38 lx上清液 0 0 1 0 0 70068-940928.doc -23 - 1257951 重複試驗2 49460 31 lx上清液 0 0 2 0 0 一 重複試驗3 30232 31 lx上清液 0 0 4 0 0 重複試驗3 30232 38 lx上清液 0 0 1 0 0 重複試驗3 49460 31 lx上清液 0 0 2 0 0 重複試驗4 30232 31 lx上清液 0 0 1 0 0 重複試驗4 30232 38 lx上清液 0 0 1 0 0 實例4 由NRRL登錄號碼30232製備之殺昆蟲代謝物的化學特性 為測定活性成分之穩定性，以2N鹽酸（HC1)將1毫升等 份試樣之全液調整至pH i。！小時後再以2N氫氧化鈉 _ (NaOH)將pH調整至7。同樣地，將！毫升等份試樣之全液 以2N NaOH调整至pH 1〇。1小時後再以2N HCi將pH調整至 7。於酸處理時會喪失活性，但於鹼性狀況下則可保留。 為測定活性成分之抽取度，將2〇毫升等份試樣之全液以 乙酸乙酯抽離三次，每次為2〇毫升（總抽取物6〇毫升），隨 後再以水飽和正丁醇（Bu0H)抽離三次，每次為2〇毫升（總 抽取物60耄升）。將所有部分（包含殘留液態相）乾燥且再次 懸浮。乾燥之Et〇Ac抽出物懸浮於丙酮··水中，Bu〇h部分 _ 懸浮於Et〇H:水中，而殘留液態相再懸浮於於水中以重組 成lx液相當物。混合部份由等量之各相所組成。當於㈣ 度下分析時，可發現Et0A，分含大多數之活性代謝物， 少量留在BuOH部分。於稀釋更低濃度時〇/4χ)，活性僅見 於EtOAc部分。 將含有存於200微升丙酮中之Et〇Ac部分之⑺毫升全液 同等物以 25% Me0H:水、5〇% Me〇H ·•水、75% *⑽ 70068-940928.doc -24- 1257951 水、及100% MeOH之梯度以反相（RP)固相抽取法（貝 德設備（Bakerbond spe)，十八烧基）進一步純化。以 MeOH洗滌活性代謝物。 下表3數據顯示4種抽取-分離、2種反相色層分析 種p Η試驗之結果。 表3· NRRL登錄號碼30232、抽取物、分離物、RP、色 析、及改變pH之生物活性 克旁 100% 、及2 層分 重複試驗 試樣 濃度 BAW 重複試驗1 全液 lx 1.0 重複試驗1 EtOAc lx 1.0 重複試驗1 BuOH lx 1.0 重複試驗1 液相 lx 4.0 重複試驗1 混合物 lx 1.0 重複試驗1 全液 .25x 2.0 重複試驗1 EtOAc .25x 1.0 重複試驗1 BuOH .25x 4.0 重複試驗1 液相 .25x 4.0 重複試驗1 混合物 .25x 1.0 重複試驗2 全液 .25x 2.0 重複試驗2 EtOAc .25x 3.0 重複試驗2 BuOH .25x 4.0 重複試驗2 液相 .25x 4.0 重複試驗2 混合物 .25x 2.0 重複試驗3 上清液 .25x 1.0 重複試驗3 pHl .25x 4.0 重複試驗3 pH 10 .25x 2.0 重複試驗3 RP 25% MeOH lx 4.0 重複試驗3 RP 50% MeOH lx 4.0 70068-940928.doc -25- 1257951 重複試驗3 RP 75% MeOH lx 4.0 重複試驗3 RP 100% MeOH lx 1.0 重複試驗3 RP混合物 lx 1.0 重複試驗4 WB l/2x 1.0 重複試驗4 pH 1 l/2x 4.0 重複試驗4 pH 10 l/2x 1.0 重複試驗4 全液 l/2x 2.0 重複試驗4 pH 1 l/2x 4.0 重複試驗4 pH 10 l/2x 2.0 重複試驗4 EtOAc l/2x 2.0 重複試驗4 RP 25% MeOH lx 4.0 重複試驗4 RP 50% MeOH lx 4.0 重複試驗4 RP 75% MeOH lx 4.0 重複試驗4 RP 100% MeOH lx 2.0 重複試驗4 RP混合物 lx 2.0

不同於一般的鮮黃鏈黴菌相關殺真菌劑，NRRL登錄號 碼30232之殺昆蟲活性於鹼性狀況下呈現穩定（pH 9-10)並 於酸性下不穩定（pH 1-2)。 實例5 NRRL登錄號碼30232對抗昆蟲害蟲之植物活性 _ 完整植物試驗確認了 NRRL登錄號碼30232對抗甜菜夜蛾 之活性。首先，將嫩亨德森灌木青豆（Henderson bush lima beans)之真葉浸泡於全液3-5秒並風乾。將葉子置於含潮溼 濾紙及1 0隻第一蛻變期之新生甜菜夜蛾幼蟲之50毫米培養 孤（petri dish)内。48小時後計算死亡率。結果顯示於下表 4 〇 表4. 70068-940928.doc -26- 1257951 NRRL登錄號碼30232於葉浸泡抗甜菜夜蛾試驗之殺幼虫 活性 ％ 試樣 濃度 舌數/死亡數 %死亡率 平均死亡率 NRRL 30232 IX WB ^2^2/8,4/6 70, 80, 60 70% 賈福林 200 PPM 1/9, 2/8,1/9 90, 80, ％ 87%^ ' UTC (H20) 0 9/〇5 7/0 ---—— 10,050 3% 於類似試驗中’ NRRl登錄號碼30232於對抗煙芽夜蛾 (Heliothis Virescens)、馇萆 ^(HeUc〇verpa xea)、反黎 i 夜蛾時顯示相同或較佳之殺幼蟲活 性。 以9,000x重力旋轉NRRL登錄號碼30232全液，並使用喷 槍將上清液喷灑至1週齡之亨德森（Hendevs〇n)灌木青豆植 物上。將新葉乾燥並採集最少量之真葉。將每片葉子（每 一種處理法有三項重複試驗）置於含潮濕濾紙及約1〇隻新 生幼蟲之50毫升培替氏培養皿内。置於保溫箱内4〇小時後 判讀試盤（28±2(：，16:8曝光週期）。喷灑佈滿真葉的大型 二週齡豆類植物以評估可能的植物毒性。結果顯示於下表 表5· 上清液及EtOAc抽取物於豆類葉片上對抗甜菜夜蛾之效力

試樣 存活數/死亡數 平均死亡率 NRRL 30232 lx上清液 1/9,1/8,2/7 89% NRRL 30232 lx乙酸乙西旨 5/1，5/4, 4/6 40% UTC H2〇 6/1，8/2, 8/2 l"S *此為與表3所記錄分析所使用的相同扭〇八〇抽取物。 70068-940928.doc -27- 1257951 在追些樣本中皆無見到植物毒性。該葉片試驗證實了初 步篩4貝料並顯不出全液及上清液為穩定並有效。在此分 析中，§喷灑於葉片上時，乙酸乙酯組會喪失部分活性。 進步於溫室中進行的全植物試驗確認對於青菜 (Chinese cabbage)、芸薹（Brassica rapa)等植物的抗甜菜夜 蛾保遵性。將實驗用軌道喷灑器（Devries Manufacturing，

Holland，Mich.)調整成為經由tee-JET 8015扇形喷嘴可遞 送每公畝90加侖的噴灑量。以1.1磅/公畝（毒性標準）之去 離子水（負控制組）、NRRL登錄號碼30232全液、或賈福林 WG處理成熟甘藍菜植物。施用前，將NRRL登錄號碼 30232全液以超特拉（Ultra Turrax)(帖克馬（Tekmar)，辛辛 那k ’俄亥俄州）機械均質化2〇秒。每種處理法重覆三 次。檢查喷灑殘留物的均勻性；植物乾燥後置於塑膠玻璃 與網狀罩殼内再移入溫室中。每株植物接種約5〇隻新生幼 蟲及約5 0個卵。植物依需要量給水但不可自葉子上洗去喷 灑殘留物或昆蟲。 第7日之定性觀察顯示在控制處理組中出現明顯的昆蟲 進食損害，而毒性標準處理組（賈福林）傷害較小，而 NRRL登錄號碼30232處理組損害很小或無損害。結果顯示 NRRL·登錄號碼30232處理組產生優良的植物市場性能。 實例6 發酵規模放大及抗鱗翅目幼蟲（Carterpillar)活性之穩定 性。 發酵規模放大的問題在評估有效的生物性殺害蟲劑時是 70068-940928.doc -28- 1257951

一項很重要的部分（霍夫司坦（Hofstein)及富萊得蘭德 (Freidlender)(1994) ’’Development of production，formulation， and delivery systems for biofungicides’’ In: Brighton Crop Protection Conference. Pests and Disease， BCPC publications，Major Print Ltd·，Nottingham UK, pp. 1273- 1280)。發酵規模放大的第一步為將發酵份量由5〇毫升試 管（T1)之12毫升增加至250毫升-搖動燒瓶（S1)之50毫升。 當以2x、lx、及0·5χ測試時，發現經由司必德-維克（speed_ vac)之該步驟的上清液濃度對NRRL登錄號碼30232產生正 向劑量反應之生物活性並無負面影響。來自S 1發酵之 NRRL·登錄號碼30232的穩定性試驗顯示當冷藏於4。〇或冷 珠於-80°C時，其對抗甜菜夜蛾幼蟲之活性穩定性可持續2 至3週。結果顯示於下表6及7。 表6. 於250毫升搖動燒瓶（S1)及50毫升試管（T1)生長一週齡（W1) 液之生物活性 培養基 濃度 容器/年齡 BAW 31 0.5x上清液 S1W1 2.0 31 lx上清液 S1W1 2.0 31 2x上清液 S1W1 1.0 31 lx上清液 T1W1 2.0 31 lx上清液 S1W1 1.0 38 0.5x上清液 S1W1 4.0 38 lx上清液 S1W1 2.0 38 2x上清液 S1W1 2.0 38 lx上清液 T1W1 2.0 70068-940928.doc •29- 1257951 38 lx上清液 S1W1 2.0 表7· 於250毫升搖動燒瓶（S1)生長之二週齡（W2) 30232液的生 物活性 培養基 濃度 容器/年齡 CE CRW BAW GPA SM 31 0.5x上清液 S1W2 1.0 31 lx上清液 S1W2 1.0 31 2x上清液 S1W2 1.0 31 2x上清液 S1W2 4.0 4.0 1.0 3.0 0 38 0.5x上清液 S1W2 4.0 38 lx上清液 S1W2 1.0 38 2x上清液 S1W2 1.0 38 2x上清液 S1W2 4.0 4.0 1.0 4.0 0 下表8顯示當來自250毫升燒瓶的生物活性特性如同原始 50毫升試管發酵物限於甜菜夜蛾時的結果。 表8· 三週齡（W3)、冷藏及冷凍、於250毫升搖動燒瓶（S1)生長 之NRRL·登錄號碼30232液的生物活性 培養基 濃度 容器/年齡/溫度 BAW 31 lx S1W3-80〇C 2.0 31 lx S1W3-4°C 2.0 38 lx S1W3-80〇C 3.0 38 lx S1W3-4°C 3.0 規模放大之第二步驟為重覆於250毫升燒瓶（S2)之50毫 升份量。於50毫升試管中的同步發酵可證實該菌株之活 性。結果顯示於下表9。 表9_ 70068-940928.doc -30- 1257951 於250毫升搖動燒瓶（S2)及50毫升試管（T2)中生長的一週 齡（W1)液之反應 培養基 濃度 容器 BAW 31 lx上清液 S2W1 1.0 31 lx上清液 T2W1 2.0 31 lx上清液 S2W1 1.0 38 lx上清液 S2W1 3.0 38 lx上清液 T2W1 1.0 38 lx上清液 S2W1 4.0 隨份量增加，與培養基31相比之下，培養基38之生物活 性下降。席格目德（Sigmund) J.M.及贺許（Hirsch)， C.F.(1998) J. Antibiotics 5 1:829-836，證實添加蕃茄醬對 於產生殺真菌活性相當重要。與於銹黴素（由鮮黃鏈黴菌 產生）所見者相比、本發明之規模放大法顯示出隨著份量 增加，燕麥粉複合物培養基（31)比以蕃茄醬為主之培養基 38更可增加NRRL登錄號碼30232之殺昆蟲活性。兩種份量 之額外增加肯定了培養基3 1的效能。S3係於擋板1公升燒 瓶中使用200毫升之培養基31，而S4則於無擋板2.8公升分 貝克（Fernbach)燒瓶中使用500毫升容量之培養基3 1。結果 顯示於下表10。 表10. 於1，000-毫升搖動燒瓶（S3)及2,800毫升分貝克燒瓶（S4) 生長之二週齡（W2)液的生物活性 重複試驗 培養基 濃度 容器/年齡 BAW 重複試驗1 31 0.5倍上清液 S3W2 3.0 重複試驗1 31 1倍上清液 S3W2 2.0 70068-940928.doc -31 - 1257951 重複試驗1 31 2倍上清液 S3W2 2.0 重複試驗1 31 0.5倍上清液 S4W2 2.0 重複試驗1 31 1倍上清液 S4W2 1.0 重複試驗2 31 0.5倍上清液 S4W2 4.0 重複試驗2 31 1倍上清液 S4W2 2.0 重複試驗2 31 2倍上清液 S4W2 2.0 經由3步驟將發酵規模增加到在2800毫升分貝克燒瓶放 置500毫升之培養基3 1並不會負面影響NRRL登錄號碼 30232之殺昆蟲活性。 雖然上述發明已經由作為清楚理解目的之說明及實例來 描述部分細節，但對精於此技藝者顯然仍有某些變化及改 變可進行。因此，該描述及實例不應解釋為限制由隨附申 請專利範圍所描述之本發明領域。 70068-940928.doc 32-

Claims (1)

1257951 ^ ：., ' I \·^ r ：.·'"Γ' ：：-ί 拾、申請專利範園： 1. 一種組合物，其包括選自由具有與寄存於食品工業發展 研究所（FIRDI)寄存編號為CCRC 9101 69之鮮黃鏈徽菌 所有鑑別特徵之鮮黃鏈徽菌菌株、 該寄存於FIRDI(編號為CCRC 910169)菌株之變異體（其 中該變異體具有與FIRDI編號CCRC 910169菌株之所有 鑑別特徵，且具有與FIRDI編號CCRC 910169至少95%之 序列同一性）、及與該寄存於FIRDI(編號為CCRC 91016 9)之突變種（其中該突變種具有與fjrdj編號ccrc 910169菌株之所有鑑別特徵）所組成之群組之分離細菌 株，且其中FIRDI編號CCRC 910169菌株之鑑別特徵之 一係具有殺昆蟲活性。 根據申請專利範圍第1項之組合物，其申分離細菌菌株 為具有與寄存於食品工業發展研究所（FIRDI)寄存編號為 CCRC 910169之鮮黃鏈黴菌（加叩以客心叫所有鑑 別特徵之鮮黃鏈徽菌菌株，其中FIRDI編號CCRC 910169菌株之鑑別特徵之一係具有殺昆蟲活性。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之組合物，其更進一步包括 至少一種化學或生物殺蟲劑。 4. 根據申μ專利範圍第丨或2項之組合物，其中該組合物係 由可濕性粉末、細顆粒、水性懸浮液、及乳化濃縮物或 微包封配方物所調配。 5. 種控制昆蟲侵襲植物、根或果實之方法，其包括施用 有效$之根據申請專利範圍第1至4項中任一項之組合物 70068-940928.doc 1257951 於植物、根或果實上。 6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該昆蟲係選自鱗 翅目昆蟲目昆蟲及雙翅目昆蟲所組成之群組。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該昆蟲係鱗翅目 昆蟲。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該鱗翅目昆蟲侵襲 係起因於至少一種選自甜菜夜蛾（补“叩化μ以化⑽）、 安提卡西亞健馬踏里司U仙·wr心尽㈣則仏…）、小菜 蛾類印；7·)、煙草蛾（价Ζμ)、黑理歐 西司、准力先vz.r㈣㈣）、及銀紋夜盜蛾 ⑴.）所組成之群組的昆蟲。 9· -種培養物’其包括根據中請專利範圍第}或2項之組合 物0 10. -種控制昆蟲侵襲植物、根或果實之方法，其包括施用 有效量之根據中請專利範圍第9項之培養物於植物、根 或果實上。 H·根據申請專利範圍第10項之方法’其中該昆蟲係選自鱗 翅m鞘ϋ目昆蟲及雙翅目昆蟲所組成之群組。 12 ·如申請專利範圍第丨丨盲 国罘1項之方法，其中該昆蟲為鱗翅目昆 蟲0 13. 昆蟲侵襲係 健馬踏里 、及銀紋夜 如申請專利範圍第12項之方法，纟中鱗翅目 起因於至少一種選自甜菜夜蛾、安提卡西亞 司、小菜蛾類、煙草蛾、黑理歐西司維力先 盜蛾所組成之群組的昆蟲。 70068-940928.doc