DE60120143T2

DE60120143T2 - Streptomyces galbus stamm mit insektentötender wirkung und methode zu seiner verwendung als insekten-bekämpfungsmittel

Info

Publication number: DE60120143T2
Application number: DE2001620143
Authority: DE
Inventors: Jo Lori Vacaville LEHMAN; Ensio Jimmy Davis ORJALA; Carol Denise Davis MANKER; Rito Desmond Woodland JIMENEZ; Ann Nancy Davis BAUM; Gail Pamela Davis MARONE
Original assignee: AgraQuest Inc
Current assignee: AgraQuest Inc
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: AU2001257595B9; NZ522369A; BR122012030881B1; IL152266A0; BR0110083A; ATE328066T1; MXPA02010145A; PL362613A1; AU2001257595B2; CA2405950C; WO2001079450A3; JP2004507221A; AU5759501A; CA2405950A1; TWI257951B; EP1272611A2; ES2263616T3; DE60120143D1; BR0110083B1; WO2001079450A2

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung fällt in das Fachgebiet der Biopestizide. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung einen neuen Streptomyces-Stamm mit insektizider Aktivität und Verfahren zu dessen Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Naturstoffe sind Substanzen, die von Mikroben, Pflanzen und anderen Organismen produziert werden. Mikrobielle Naturstoffe bieten eine reichhaltige Quelle chemischer Vielfalt. Es gibt eine lange Historie des Verwendens dieser Naturstoffe für pharmazeutische Zwecke. Trotz der Bedeutung von Naturstoffen als Therapeutika für den Menschen gibt es nur ein paar natürlich vorkommende Insektizide für die landwirtschaftliche Verwendung. Die erfolgreichsten mikrobiellen Naturstoff-Insektizide sind die Bacillus thuringiensis-Toxine Avermectin und die Spinosyne. Bacillus thuringiensis (Bt)-Bakterien stellen während der Sporulation cytoplasmatische Proteinkristalle (δ-Endotoxine) her, welche den bedeutendsten Faktor bei der Inkektenpathogenese darstellen (siehe Ellar, D. J. (1997) „The structure and function of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins and prospects for biopesticide improvement" in: Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The Brithish Crop Protection Council Symposium Proceedings Nr. 68, Coventry, GB). δ-Endotoxine wurden sowohl in Sprühpräparaten als auch als „systemische" Biopestizide durch Einbringung der Endotoxingene in transgene Pflanzen verwendet. Das Marktwachstum für Bt-Sprühpräparate wird für 1997 bis 2000 auf etwa 10% geschätzt, was 2000 einem Marktvolumen von 100–130 Millionen $ entsprechen wird (siehe Lisansky, S. (1997) „Microbial biopesticides" in: Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The British Crop Protection Council Symposium Proceedings Nr. 68, Coventry, GB). Die bedeutendsten transgenen Bt-Pfanzen sind Mais und Baumwolle. Der Markt für transgenen Bt-Mais in den USA ist von nur 1,4% der bepflanzten Anbaufläche im Jahr 1996 auf 19,1% im Jahr 1998 gewachsen. Das Wachstum bei Bt-Baumwolle war nicht so drastisch, es hat sich von 14,6% der bepflanzten Anbaufläche im Jahr 1996 auf 16,8% im Jahr 1998 erhöht. Der gesamte Markt ist momentan auf Lepidoptera-Schädlinge gerichtet. 1999 überstieg der Markt für gegen Raupen verwendete Pestizide in den USA 400 Millionen US-Dollar.
Die Avermectine werden von Streptomyces avermitills während der Fermentation hergestellt. Abamectin, eines der natürlich vorkommenden makrozyklischen Laktone, zeigt Aktivität gegen Milben, Birnenblattfloh und Diamantmotten. Emamectin, ein halbsynthetisches Analogon von Abamectin, zeigt Aktivität gegen Lepidopteralarven. In Invertebraten induzieren die Avermectine das Öffnen eines präsynaptischen Chlorid-Ionenkanals (nicht GABA-aktiviert), was zu einem Ausfluß von Chloridionen, Depolarisation der Nervenendigungen und somit zu Neurotransmitterausschüttung führt. Siehe Turner, M. J. und Schaeffer, J. M. (1989) „Mode of action of Ivermectin" in: Ivermectin and Abamectin, W. C. Campbell (Hrsg.) Springer Verlag, New York. Die Verwendung von Avermectinen bei der Insektenkontrolle hatte 1998 einen geschätzten Weltmarktwert von 80–120 Millionen US-$.
Die Spinosyne sind eine neue Klasse von fermentationsbedingten tetrazyklischen Makroliden, die von dem Actinomyceten Saccharopolyspora spinosa hergestellt werden. Die Spinosyne A und D, die wesentlichen Komponenten des Spinosad-Insektizids Tracer^®, zeigen Aktivität gegen Lepidoptera-Schädlinge und Stechmücken. Siehe Sparks, T. C. et al. (1999) „Fermentation-derived insecticide control agents: the spinosyns" in: Biopesticides Use and Delivery, Hall, F. R. et al. (Hrsg.), Humana Press, Totowa, New Jersey, S. 155–170. Seine Wirkungsweise ist mit einer primären Angriffsstelle auf dem Nikotin-Acetylcholin-Rezeptor und einer zweiten vermutlich auf oder bei GABA-Rezeptoren einzigartig. Siehe Salgado, V. L. (1997) „The modes of action of spinosad and other insect control products", Down to Earth 52: 35–43.
Streptomyces ist eine anerkannte Quelle für insektizide Naturstoffe. Zusätzlich zu den Avermectinen und Spinosynen wurden Cholesterinoxidase (Purcell, J. P. et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1406–1413), Allosamidin (Sakuda, S. (1986) Tetrahedron Lett. 27: 2475–2478), Valinomycin (Heisey, R. (1988) J. Agric. Food Chem. 36: 1283–1286), Pyrrolizinderivate (Jizba, J. et al. (1992) Folia- Microbiologica 37: 461–462), Respirantin (Urushibata, I. et al. (1993) J. Antibiotics 46: 701–703), Prasinone (Box, S. J. et al. (1973) Appl. Microbiol. 26: 699–704), Piercidin (Takahashi N. et al. (1968) Agr. Biol. Chem. 32: 1115–1122), Griseulin (Nair, M. G. et al. (1993) J. Antibiotics 46: 1762–1763), Martinomycin (Carter, G. T. et al. (1994) J. Antibiotics 47: 1549–1553), Faeriefungin (Nair, M. G. et al. (1989) J. Nat. Prod. 52: 797–809), Indanomycin (Zhang D. et al. (1997) J. Antibiotics 50: 617–620), Cyclophostin (Kurokawa, T. et al. (1993) J. Antibiotics 46: 1315–1318), Manumycin (Zeeck, A. et al. (1987) J. Antibiotics 40: 1530–1540), Ichthyomycin (Zizka, Z. et al. (1991) Cytobios 65: 31–38), Virginiamycin (Prikrylova, V. et al. (1992) Folia Microbiol. 37: 386–388), Suidatestrin (Knuessel, I. et al. (1998) Comp. Biochem. Phys. B. 120B: 639–646), Gualamycin (Tsuchiya, K. J. (1995) J. Antibiotics 48: 626–629) und andere insektizide Naturstoffe aus Streptomyces Stämmen beschrieben.
Streptomyces galbus ist bekannt für die Herstellung der wirksamen anti-Botrytis-Makrolide Galbonolid A und Galbonolid B (Paul A. K. und Banerjee, A. K. (1983) Folia Microbiol. 28: 386–396, Sigmund, J. M. und Hirsch, C. F. (1998) J. Antibiotics 51: 829–836), Achenbach, H.: DE-Patent Nr. 86-3632168 und Zaehner, H.: DE-Patent Nr. 3632168). Nakayama et al., (1987) Agric. Biol. Chem. 51: 853–860, haben über die Entdeckung von Rustmicin, einem wirkungsvollen Inhibitor von Weizenhalmrost, Puccinia gramnis, berichtet. Später wurde gezeigt, dass Galbonolid A das gleiche Molekül ist wie Rustmicin. Achenbach et al., (1988) Annals N.Y. Acad. Sci. 544: 128–140, haben berichtet, dass Galbonolid A gegen eine Reihe von Endomycetes-Hefen und eine große Anzahl von Deuteromyceten wie Candida albicans und Botrytis cinerea viel aktiver ist als Galbonolid B. Diesen Makroliden konnte kein Hinweis auf ionophore Aktivität, Membrandestabilisierung, Interferenz mit DNA- oder RNA-Biosynthese oder Inhibition der Chitin-Biosynthese zugeschrieben werden. Kürzlich haben Mandala et al., (1998) J. Biol. Chem. 24: 14942–14949), und Harris et al., (1998) J. Antibiotics 51: 837–844, und Harris, G. et al., Patent-Nr. GB 2324300 , gezeigt, dass Rustmicin die Inositphosphoceramid-Synthetase, das erste pilzspezifische Enzym bei der Sphingolipid-Biosynthese, inhibiert. Wir zeigen nun die wirksamen insektiziden Eigenschaften eines neuen S. galbus-Stammes mit Aktivität gegen eine Reihe von landwirtschaftlich relevanten Lepidoptera.
Mishra et al. (Journal of Industrial Microbiology (1997) 2: 267–276) diskutieren insektizide und nematizide Eigenschaften von mikrobiellen Metaboliten. In dieser Studie wurden Metaboliten von 942 mikrobiellen Isolaten untersucht. Die Isolate schlossen 302 Streptomyceten, 502 neue Actinomyceten, einschließlich Vertretern aus 18 Gattungen, 28 nichtidentifizierte aerobe Actinomyceten, 70 Pilze und 40 Bakterien, die keine Actinomyceten waren, ein.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Verbindung, Steptomyces galbus, NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, und deren Mutanten, welche die gleiche Aktivität besitzen, zur Verwendung als Insektizid gegen Lepidoptera bereit. Die Erfindung umfasst die Verwendung von Überständen und Metaboliten des Stammes für die Verwendung als Insektizid. Die Erfindung schließt auch Verfahren zum Behandeln von Pflanzen oder Früchten ein, um Lepidopterabefälle unter Verwendung des beanspruchten Stammes entweder allein oder in Kombination mit anderen chemischen oder biologischen Pestiziden zu kontrollieren. Es werden weiterhin Verfahren zur Fermentation des beanspruchten Stamms zur Steigerung seiner Bioaktivität als Insektizid bereitgestellt.
METHODEN ZUM DURCHFÜHREN DER ERFINDUNG
Hinterlegung von Mikroorganismen
Ein Streptomyces galbus-Stamm wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA, hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL 30232.
Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass während der Anhängigkeit dieser Anmeldung Zugriff auf die Kultur möglich ist. Die Hinterlegung ist verfügbar wie dies aufgrund ausländischer Patentgesetze in Ländern, in denen Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder Nachfolgeanmeldungen eingereicht werden, erforderlich ist. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Erlaubnis zur Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Beeinträchtigung von Patentrechten, die durch Regierungshandlung eingeräumt werden, darstellt.
Definitionen
Wie hier verwendet, können bestimmte Begriffe die folgenden definierten Bedeutungen haben.
Die Singularform „ein/eine/eines" und „der/die/das" schließen, wenn nicht vom Kontext anders vorgeschrieben, betreffende Plurale ein. Zum Beispiel schließt der Begriff „eine Zelle" eine Vielzahl von Zellen, einschließlich deren Mischungen, ein.
Der Begriff „umfassend" soll bedeuten, dass die Zusammensetzungen und Verfahren die aufgezählten Elemente einschließen, andere aber nicht ausschließen. „Im Wesentlichen bestehend aus", soll, wenn verwendet, um Zusammensetzungen und Verfahren zu definieren, bedeuten, dass andere Elemente von irgendeiner wesentlichen Bedeutung für die Zusammensetzung ausgeschlossen sind. Daher würde eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus den hier definierten Elementen besteht, nicht Spuren von Kontaminationen aus dem Isolierungs- und Reinigungsverfahren und landwirtschaftlich verträglicher Träger ausschließen. „Bestehend aus" soll bedeuten, dass mehr als Spurenelemente anderer Inhaltsstoffe und wichtiger Verfahrensschritte für die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ausgeschlossen sind. Ausführungsformen, die definiert sind durch jeden dieser Übergangsbegriffe, liegen im Geltungsbereich dieser Erfindung.
Wie hier verwendet, ist eine „biologische Kontrolle" definiert als die Kontrolle eines Pathogens oder Insekts durch die Verwendung eines zweiten Organismus. Bekannte Mechanismen der biologischen Kontrolle schließen Enterobakterien, die Wurzelfäulnis kontrollieren, indem sie mit Pilzen um Platz auf der Oberfläche von Wurzeln kämpfen, oder die Verabreichung von Bacillus thuringiensis ein, um Insektenschädlinge zu kontrollieren. Bakterielle Toxine wie Antibiotika wurden verwendet, um Pathogene und Insekten zu kontrollieren. Die Toxine können isoliert und der Pflanze direkt verabreicht werden oder die Bakterienarten können verabreicht werden, so dass sie das Toxin in situ herstellen.
Der Begriff „Pilz" oder „Pilze" schließt eine breite Vielfalt von kernhaltigen sporentragenden Organismen ein, die frei von Chlorophyll sind. Beispiele für Pilze schließen Hefen, Schimmelpilze, Mehltaupilze, Rostpilze und Speisepilze ein.
Der Begriff „Bakterium" schließt jeden prokaryontischen Organismus, der keinen deutlichen Kern aufweist, ein.
„Fungizid" oder „Anti-fungös" beschreibt die Fähigkeit einer Substanz, die Mortalität von Pilzen zu erhöhen oder deren Wachstumsrate zu hemmen.
„Antibiotika" schließt jede Substanz ein, die in der Lage ist, einen anderen lebenden Organismus zu töten oder dessen Wachstum zu hemmen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf andere Mikroorganismen. Antibiotika können von einem Mikroorganismus oder durch ein synthetisches oder halbsynthetisches Verfahren hergestellt sein.
Der Begriff „Mutante" bezieht sich auf eine Variante des parentalen Stammes sowie auf Verfahren zum Erhalten einer Mutante oder Variante, in welcher die pestizide Aktivität höher ist als die vom parentalen Stamm exprimierte. Der „Mutterstamm" ist hier definiert als der Streptomyces-Ursprungsstamm vor der Mutagenese. Um solche Mutanten zu erhalten, kann der parentale Stamm mit einer Chemikalie wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Ethylmethansulfon oder durch Bestrahlung unter Verwendung von Gamma-, Röntgen- oder UV-Strahlung oder anhand anderer Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind behandelt werden.
Eine „Variante" ist ein Stamm, der all die identifizierenden Eigenschaften von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 aufweist, und er kann dadurch identifiziert werden, dass er ein Genom hat, das unter hochstringenten Bedingungen an das Genom von NRRL-Hinterlegungsnummer B-30232 hybridisiert.
„Hybridisierung" bezieht sich auf eine Reaktion, bei der eines oder mehrere Polynucleotide reagieren, um einen Komplex zu bilden, der über Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Basen der Nucleotidreste stabilisiert wird. Die Wasserstoffbrückenbindung kann durch Watson-Crick-Basenpaarung, Hoogsteen-Bindung oder auf jede andere sequenzspezifische Weise erfolgen. Der Komplex kann zwei Stränge, die eine Duplex-Struktur bilden, drei oder mehr Stränge, die einen Multistrang-Komplex bilden, einen einzelnen selbst-hybridizierenden Strang oder jede Kombination derselben umfassen. Hybridisierungsreaktionen können unter Bedingungen verschiedener Stringenz durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird eine Hybridisierungsreaktion mit niedriger „Stringenz" bei etwa 40°C in 10 × SSC oder einer Lösung mit äquivalenter Ionenstärke/Temperatur durchgeführt. Eine Hybridisierung mit mäßiger Stringenz wird typischerweise bei etwa 50°C in 6 × SSC durchgeführt und eine Hybridisierung mit hoher Stringenz gewöhnlich bei etwa 60°C in 1 × SSC.
Eine Variante der NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 kann auch definiert sein als ein Stamm, der eine genomische Sequenz mit mehr als 85%, stärker bevorzugt mehr als 90% oder stärker bevorzugt mehr als 95% Sequenzidentität zum Genom der NRRL-Hinterlegungsnummer B-30232 aufweist. Ein Polynucleotid oder ein Polynucleotidbereich (oder ein Polypeptid oder ein Polypeptidbereich) hat einen bestimmten Prozentsatz (zum Beispiel 80%, 85%, 90% oder 95%) an „Sequenzidentität" mit einer anderen Sequenz meint, dass, wenn die Sequenzen aneinander ausgerichtet werden, dieser Prozentsatz an Basen (oder Aminosäuren) beim Vergleich der beiden Sequenzen gleich ist. Diese Ausrichtung und die prozentuale Homologie oder Sequenzidentität kann bestimmt werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Software-Programmen, zum Beispiel denen, beschrieben in Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) „Current Protocols in Molecular Biology" (1987) Erg. 30, Kapitel 7.7.18, Tabelle 7.7.1. Vorzugsweise werden Standardparameter für die Ausrichtung verwendet. Ein bevorzugtes Alignmentprogramm ist BLAST unter Verwendung von Standardparametern. Im Besonderen sind bevorzugte Programme BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Standardparameter: Genetischer Code = Standard, Filter = keiner, Strang = beide, Ausschluß = 60, Erwartung = 10, Matrix = BLOSUM62, Beschreibungen = 50 Sequenzen, sortiert durch = HIGH SCORE, Datenbanken = nicht-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS-Translationen + SwissProtein + SPupdate + PIR. Details dieser Programme können unter der folgenden Internetadresse gefunden werden:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Der Begriff „Züchten" bezieht sich auf die Vermehrung von Organismen auf oder in verschiedenartigen Medien.
„Gesamtbrühen-Kultur" bezieht sich auf eine Flüssigkultur, die sowohl Zellen als auch Medien enthält.
„Überstand" bezieht sich auf die flüssige Brühe, die übrig bleibt, wenn Zellen, die in Fermentationsbrühe gewachsen sind, durch Zentrifugation, Filtration, Sedimentation oder andere, auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren entfernt werden.
Eine „wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, günstige oder gewünschte Ergebnisse zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehrerer Gaben verabreicht werden. In Bezug auf Behandlung und Schutz ist eine „wirksame Menge" die Menge, die ausreicht, die Fähigkeit eines Insekts, zu fressen, wachsen oder sich im prä-adulten oder adulten Entwicklungsstadium zu reproduzieren, zu reduzieren, verlangsamen oder eliminieren.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Insekt" alle Organismen der Klasse Insecta ein.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Lepidoptera" auf die Insektenordung, welche charakterisiert ist durch ein Larvenstadium in Form einer Raupe oder eines Wurms und ein Adultstadium in Form einer Motte oder eines Schmetterlings.
Ein „prä-adultes" Insekt bezieht sich auf jede Form eines Organismus vor dem Adultstadium, einschließlich zum Beispiel Eier, Larven und Nymphen.
„Insektizid" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz, die Mortalität von Insekten zu erhöhen oder deren Wachstumsrate zu hemmen.
„Pestizid" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz, die Mortalität von Insekten, Nematoden und Milben zu erhöhen oder deren Wachstumsrate zu hemmen.
„Positivkontrolle" meint eine Verbindung mit bekannter pestizider Aktivität. „Positivkontrollen" schließen kommerziell erhältliche chemische Pestizide ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff „Negativkontrolle" meint eine Verbindung, die bekanntermaßen keine pestizide Aktivität besitzt. Beispiele für Negativkontrollen sind Wasser, Nullmedien oder niedrige Konzentrationen von Lösungsmitteln wie Aceton, Ethanol oder Ethylacetat.
Nullmedien sind zusammengesetzt aus sterilisierter Fermentationsbrühe in Abwesenheit eines fermentierten Mikroorganismus.
Der Begriff „Lösungsmittel" schließt jede Flüssigkeit, die eine andere Substanz in Lösung hält, ein.
„Mit Lösungsmittel extrahierbar" bezieht sich auf jede Verbindung, die sich in einem Lösungsmittel löst und die dann aus dem Lösungsmittel extrahiert werden kann. Beispiele für Lösungsmittel schließen organische Lösungsmittel wie Ethylacetat (EtOAc), Aceton, Ethanol (EtOH), Acetonitrile, Methanol (MeOH), Butanol (BuOH) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Begriff „Metabolit" bezieht sich auf jede Verbindung, Substanz oder jedes Beiprodukt der Fermentation eines Mikroorganismus, die/das biologische Aktivität aufweist.
Eine „Zusammensetzung" soll eine Kombination aus einem aktivem Mittel und einer anderen Verbindung, einem Träger oder einer Zusammensetzung, inert (zum Beispiel ein nachweisbares Mittel oder eine Markierung oder ein flüssiger Träger) oder aktiv wie ein Adjuvans, beschreiben.
Diese Erfindung stellt eine biologisch reine Kultur eines Stammes bereit, der die identifizierenden Eigenschaften von Streptomyces galbus, NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, aufweist, sowie dessen Varianten und Mutanten, wie vorstehend beschrieben, welche insektizide Aktivität aufweisen. In einer Ausführungsform ist die Erfindung der Stamm, der als NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 bezeichnet wird.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Isolieren eines Metaboliten aus der biologisch reinen Kultur von hier beschriebenen Stämmen sowie die hierdurch isolierten Metaboliten bereit. Der Metabolit ist charakterisiert als mit Lösungsmittel extrahierbar und mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton.
Außerdem wird ein Verfahren zum Reinigen biologisch aktiver Überstände aus den hier identifizierten biologisch reinen Kulturen bereitgestellt und die hierdurch isolierten Überstände. Die isolierten Überstände weisen eine insektizide Aktivität ähnlich der von Streptomyces galbus, NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, oder dessen Mutanten oder Varianten auf.
Auch durch diese Erfindung bereitgestellt sind Zusammensetzungen, umfassend mindestens eine der biologisch aktiven Kulturen, Überstände oder den vorstehend beschriebenen isolierten Metaboliten und einen Träger. In einem anderen Aspekt enthält die Zusammensetzung außerdem mindestens ein chemisches oder biologisches Pestizid. Die Zusammensetzungen werden so formuliert, dass sie aus einer oder mehreren der folgenden Zusammensetzungen bestehen: einem benetzbaren Pulver, einem Granulat, einer wässrigen Suspension, einem emulgierbaren Konzentrat und einer mikroverkapselten Formulierung bestehen.
Um eine gute Verteilung und Adhäsion der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, die Vollbrühen-Kultur, den Überstand, die Fraktion und/oder den Metaboliten/das Antibiotikum mit Komponenten, welche Verteilung und Adhäsion unterstützen, zu formulieren. Entsprechend werden dem Fachmann geeignete Formulierungen bekannt sein (benetzbare Pulver, Granulate und dergleichen oder Mikroverkapselung in einem geeigneten Medium und dergleichen, Flüssigkeiten wie wässrige fließfähige Formulierungen und wässrige Suspensionen und emulgierbare Konzentrate). Andere geeignete Formulierungen werden dem Fachmann bekannt sein.
Jeder der vorstehend erwähnten Stämme, Fraktionen, Überstände und Zusammensetzungen, welcher diese aktiven Inhaltsstoffe enthält, kann verwendet werden, um ein Verfahren zum Behandeln oder Schützen von Pflanzen, Wurzeln oder Früchten gegen Insekteninfektionen bereitzustellen. Insekten schließen ein Insekt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lepidoptera, Coleoptera und Diptera ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. In einem Aspekt gehört das Insekt zu den Lepidoptera, z.B. Spodoptera exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp., Helicoverpa zea, Heliothis virescens und Trichoplusia ni.
Auch durch diese Erfindung bereitgestellt ist ein Verfahren zum Herstellen eines als Insektizid aktiven Überstandes durch Züchten der erfindungsgemäßen Stämme und Isolieren des Überstandes. Der durch dieses Verfahren hergestellte Überstand wird hier ebenfalls beansprucht.
Der Metabolit wird isoliert durch Umkehrphasen- oder Festphasenextraktion unter Verwendung eines Stufengradienten von Methanol und Wasser. Der Metabolit kann anhand seines Molekulargewichtes (weniger als 10.000 Dalton) identifiziert werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen. Diese Beispiele sollen nicht als beschränkend gedeutet werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiel sollen die Erfindung illustrieren, aber nicht beschränken.
Beispiel 1
Charakterisierung von Streptomyces galbus, Stamm NRRL-Hinterlegungsnummer 30232.
NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 wurde basierend auf der Sequenzierung von 16S-rRNA identifiziert. Das Protokoll, das verwendet wurde, um die 16S-rRNA-Gendatensequenz zu generieren (Acculab Kundenhandbuch 1.0), wird im folgenden beschrieben.
Das 16S-rRNA-Gen wird von genomischer DNA, die aus Bakterienkolonien isoliert wurde, PCR-amplifiziert. Die für die Amplifikation verwendeten Primer entsprechen den Positionen 005 und 531 von E. coli. Die Amplifikationsprodukte werden unter Verwendung von Microcon 100 (Amicon)-Molekulargewichts-Ausschlußmembranen von überschüssigen Primern und dNTPs gereinigt und durch einen Agarosegellauf eines Produktanteils hinsichtlich Qualität und Quantität überprüft.
Die zyklische Sequenzierung der 16S-rRNA-Amplifikationsprodukte wird unter Verwendung von AmpliTaq FS-DNA-Polymerase und dRhodamin-Farbterminatoren durchgeführt. Überschüssige farbmarkierte Terminatoren wurden unter Verwendung einer Sephadex G-50-Zentrifugationssäule aus den Sequenzierreaktionen entfernt. Die Produkte werden mittels Zentrifugation gesammelt, unter Vakuum getrocknet und bei –20°C bis zum Auftragen eingefroren. Die Proben werden in einer Lösung aus Formamid/Dextranblau/EDTA resuspendiert und vor dem Auftragen denaturiert. Die Proben werden auf einem ABI Prism 377 DNA-Sequenziergerät einer Elektrophorese unterzogen. Die Daten werden unter Verwendung von PE/Applied Biosystems DNA-Editing- und Assembly-Software analysiert. Sobald sie erhalten sind, werden die Sequenzen mit der PE/Applied Biosystems MicroSeq^TM-Datenbank unter Verwendung der MicroSeq^TM-Sequenzanalysesoftware verglichen. Die Sequenzen werden auch mit GenBank und Ribosomal Database Projekt (RDP) verglichen.
Das Ergebnis der 16S-rRNA-Sequenzierung identifizierte NRRL Nr. 30232 als Streptomyces galbus mit einem %ID-Wert von 99% (GenBank) und einem Ähnlichkeitsrang von 0,98 (RDP). Diese Werte zeigen eine Übereinstimmung auf der Arteneben an.
Beispiel 2
Aktivität von Streptomyces galbus, NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gegen Pflanzenpathogene.
Der neue Streptomyces galbus-Stamm wurde auf folgende Weise gezüchtet, um ihn gegen Pflanzenpathogene zu testen. Die isolierte Mikrobe wurde anfangs in drei unterschiedlichen Actinomyceten-Kulturmedien fermentiert. Medium 38 war zusammengesetzt aus 2 g/l Tomatenpaste, 2 g/l Hafermehl und 1 g/l Meersalzen. Medium 31 war zusammengesetzt aus 45 g/l Hafermehl, 2 g/l Hefeextrakt, 6 g/l KH₂PO₄ und 4,8 g/l Na₂HPO₄, pH 7. Medium 6 war zusammengesetzt aus 20 g/l löslicher Stärke, 10 g/l Dextrose, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l N-Z-Amin A und 1 g/l CaCO₃.
Die Mikrobe wurde von Tomaten-Hafermehl Agar (2 g/l Tomatenpaste, 2 g/l Hafermehl und 20 g/l Agar) gepickt und in 50-ml-Röhrchen überführt, die 12 ml steriles Fermentationsmedium enthielten, und mit einem Schaumgummistöpsel verschlossen waren. Die beimpften Röhrchen wurden für sechs Tage bei 27 ± 3°C in einem Orbitalschüttler inkubiert. Die Röhrchen mit dem Fermentationsprodukt im geringen Maßstab wurden unter Verwendung eines Ausschwingrotors (JS4.2) in einer Beckman JB-6-Kühlzentrifuge bei 4.200 UpM (3.500 g-Kräfte) für 15 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurde steril gesammelt und in sterile Platten mit 96 tiefen Vertiefungen oder 5-ml-Röhrchen in automatisierbaren Ständern überführt. Jeder Überstand wurde in Dreifachausführung steril in sterile Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt. Chemische Kontrollen als Positivkontrollen zusammen mit Nullmedien und Wasserkontrollen wurden zugegeben. Dann wurden schrittweise Schichten von geschmolzenem Agar überschichtet.
Aliquots der Überstände á 25 Mikroliter (μl) wurden mit 75 ml geschmolzenem 2,5%igem Agar, gefolgt von 100-μl-Aliquots von 0,75%igem Kartoffel-Dextrose-Agar (Kartoffel-Dextrose-Fermentationsbrühe 23 g/l, Agar 7,5 g/l) überschichtet. Abschließend wurden 25 μl einer pathogenen Sporensuspension über den KDA überschichtet und die Platten wurden für vier Tage bei 24 ± 2°C inkubiert. Das Pathogenwachstum wurde unter Verwendung eines skalierten Index bewertet, in welchem fünf Wachstum gleich der Wasserkontrolle entsprach und eine Bewertung von eins die vollständige Abwesenheit von Wachstum anzeigte. Die Indexwerte zwei (2) bis vier (4) stellen Zwischenstufen von Sporulation und Wachstum dar, während null (0) einen fehlgeschlagenen oder unnötigen Test anzeigt.
Die folgenden Pathogen/Chemikalien-Paare wurden getestet: Alternaria brassisicola (ABRA Benomyl), Botrytris cinerea (BOTC/Benomyl), Monilinua fructicola (MONF/Benomyl), Phytophthora capsici (PCAP/Metalaxyl), Pseudomonas syringae (PSTO/Gentamycin) und Colletotrichum coccoides (COLC/Chlorothalonil). Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von drei unterschiedlichen, wiederholten Versuchen. Die Versuche umfassten drei getrennte Fermentationsdaten und sind nachstehend dokumentiert. Die chemischen Kontrollen erreichten Indexbewertungen von eins (1) in allen der unabhängigen wiederholten Versuche und Nullmedien zeigten Bewertungen von fünf (5).
Tabelle 1 Fungizide Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232
Obwohl es eine leichte Inhibition der getesteten Pathogene in einigen der Vertiefungen gab, besonders PCAP Rep 1, wurden die Ergebnisse in Rep 2 nicht entgültig bestätigt. Insgesamt zeigen die Daten, dass der Vollbrühen-Überstand einer sechs Tage alten Kultur des neuen Stammes NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 in einem Agardiffussionstest nicht allgemein gegen Pflanzenpathogen-Sporen aktiv war.
Beispiel 3
Aktivität von Streptomyces galbus, NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, gegen Insekten
Um die insektizide Aktivität zu untersuchen, wurde jeder mikrobielle Extrakt in Platten mit 96 Vertiefungen auf eine Weizenkeim/Casein-basierte künstliche Nahrungsquelle (29 g/l Agar, 13,8 g/l Celufil, 38,5 g/l Saccharose, 32,2 g/l Casein, 27,5 g/l Weizenkeime, 9,2 g/l Wesson-Salzmischung, 9,0 g/l Vitamin-Vormischung, 33 mg/l Streptomycin, 33 mg/l Chlorotetracyclin-Hydrochlorid 1,2 ml/l Proprionsäure, 0,12 ml/l Phosphorsäure, 10 ml/l reinstes Ethanol, 1 g/l Methylparaben, 0,3 g/l Natriumbenzoat, 1,0 g/l Sorbinsäure) in sechs Wiederholungsversuchen überschichtet. Vorrübergehend synchronisierte Eier der Rübenheerwurm („beet army worm") wurden keimfrei gemacht und in einer verdünnten Agarlösung suspendiert. Umgedrehte Millipore^® Filtrationsplatten mit 96 Vertiefungen wurden als Schablone benutzt, um Rechtecke von Whatman^® #2-Filterpapier mit fünf bis zehn sieben Tage alten Eiern in 25 μl zu beimpfen. Das Filterpapier wurde getrocknet, umgedreht und an die Lochöffnungen der Nahrungsquelle/Extrakt-Platte angepasst. Die Filterpapiere wurden mit einem belüfteten Plattendeckel bedeckt und mit Klebeband fixiert. Die Platten wurden in einer Percival-Wachstumskammer bei 28 ± 2°C unter einer 16:8-Photoperiode bei 30–40% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Neugeborenen schlüpften und sanken auf die mit Extrakt behandelte Nahrungsquelle. Nach vier Tagen wurden die Platten aus der Percival-Wachstumskammer entfernt, das Zellophanklebeband wurde entfernt und die Platten auf eine Tischplatte geklopft, um Würmer vom Filterpapier zu entfernen. Die Deckel/Filter wurden durch ein Stück transparentes, perforiertes Mylar ersetzt und mit einem heißen Bügeleisen verschlossen. Die Versuchsplatten wurden für einen weiteren Tag zurück in die Percival-Wachstumskammer gestellt. Larvenwachstum wurde unter Verwendung eines ähnlichen Index wie bei der Durchmusterung der Pflanzenpathogene visuell bewertet, wobei eine Bewertung mit eins 100% Mortalität anzeigte und eine Bewertung mit vier ein Wachstum ähnlich wie bei unbehandelten Kontrollen anzeigte. Eine Bewertung mit zwei zeigt weniger als 100%, aber mehr als 50% Mortalität oder ernsthaft gehemmtes Wachstum an. Eine Bewertung mit drei zeigt weniger als 50%, aber mehr als 25% Mortalität oder Wachstumshemmung an. An jedem Versuchstag mit Wiederholungen wurde eine chemische Kontrollplatte mitgeführt. Acht serielle Verdünnungen von Javelin^® (Bacillus thuringiensis Stamm Kurstaki) von 1000 bis 7 ppm erzielten Dosisantwort-Ergebnisse. Westlich Gepunktete Gurkenkäfer (CRW: Diabrotica undecimpunctata) wurden in einem ähnlichen Test unter Verwendung von Bifenthrin als chemische Kontrolle untersucht. Grüne Pfirsichblattläuse (GPA: Myzus persicae) oder Grüne Erbsenblattläuse (PA: Acyrthosiphon pisum) wurden in Versuchen mit Platten mit 96 Vertiefungen untersucht. Überstände wurden auf Filterpapierscheiben am Boden der Platten mit 96 Vertiefungen absorbiert. Blattläuse wurden in die Vertiefungen gegeben und mit Parafilm-Membran versehene Millipore^® Filterplatten mit 96 Vertiefungen wurden verwendet, um die Grundplatte abzudecken. Die Vertiefungen der Filterplatte wurden mit 40 μl Überstand und 40 μl künstlicher Flüssigkost (300 g/l Saccharose, 10 g/l Caseinhydrolysat, 1 g/l Wesson-Salzmischung, 1 g/l Vitamin-Vormischung, 33 mg/l Streptomycin, 33 mg/l Chlorotetracyclinhydrochlorid, 1 g/l Methylparaben, 0,3 g/l Natriumbenzoat, 1,0 g/l Sorbinsäure, pH 6,8) beladen. Chemische Kontrollplatten wurden mit seriellen Verdünnungen von Imidocloprid behandelt, in welchen Grundplatten-behandeltes Filterpapier Kontaktaktivität nachwies, und Membran-behandelte Vertiefungen wiesen aufgenommene Aktivität nach. Die Blattlaus-Mortalität wurde nach 24–48 Stunden abgelesen. Die Anzahl lebender Blattläuse, die auf Wasser/Nahrungsquelle Kontrollmembranen fraßen und in den Vertiefungen mit Wasser-behandeltem Filterpapier liefen/ruhten, wurde tabellarisch aufgelistet. Ober- und Untergrenzen und deren Standardabweichung wurden berechnet, was Indexbereichsberechnungen zuließ. Zweigepunktete Blattspinnmilben (SM: Tetranynchus orticae) wurden unter Verwendung von Platten mit 96 Vertiefungen mit Filterpapieren untersucht. Überstände (40 μl), gefolgt von 20-μl-Aliquots künstlicher Flüssigkost, wurden auf Filterpapiere pipettiert und die Platten wurden partiell unter Druckluft getrocknet. Nach 24–48 Stunden wurde die Mortalität bestimmt. Serielle Verdünnungen von Avermectin wurden als chemische Kontrollen verwendet. Fadenwürmer (CE: Caenorhabditis elegans), entomopathogene Nematoden (HB: Heterorhabditis bacteriophora) und Wurzelknotennematoden (MJ: Meloidogyne javonica) wurden als Flüssigsuspensionen von J2s in Platten mit 96 Vertiefungen untersucht. Avermectin^® wurde als chemische Kontrolle verwendet.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen die Spezifität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gegen den Rübenheerwurm („beet army worm", "BAW"). ATCC-Hinterlegungsnummer 49460 ist das Wildtyp-Isolat der American Type Culture Collection von Saccharopolyspora spinosa, ein Organismus, der Spinosyne herstellt. Siehe Sparks et al. (1997) „Fermentation-derived insecticide control agents: the spinosyns", Biopesticides, Use and Delivery, Hall, F. R. et al. (Hrsg.), Humana Press, Totowa, New Jersey, S. 155–170. Wie nachstehend in Tabelle 2 gezeigt, waren sowohl ATCC-Hinterlegungsnummer 49460 als auch NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 in Medium 31 aktiv gegen den Rübenheerwurm.
Tabelle 2 Insektizide Aktivität von NRRL 30232 und ATCC 49460
Beispiel 4
Chemische Eigenschaften der von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 hergestellten insektiziden Metabolite
Um die Stabilität des aktiven Bestandteils zu bestimmen wurden 1-ml-Aliquots der Vollbrühen mit 2 N Salzsäure (HCl) auf einen pH-Wert von 1 eingestellt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert mit 2 N Natriumhydroxid (NaOH) auf 7 erneut angepasst. Ähnlich wurden 1-ml-Aliquots der Vollbrühe mit 2 N NaOH auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert mit 2 N HCl auf 7 erneut angepasst. Die Aktivität ging während der Säurebehandlung verloren, blieb aber unter basischen Bedingungen erhalten.
Um die Extraktionsfähigkeit des aktiven Bestandteils zu bestimmen, wurden 20-ml-Aliquots der Vollbrühe dreimal mit je 20 ml Ethylacetat aufgeteilt (Gesamtextrakt 60 ml) und nachfolgend dreimal (Gesamtextrakt 60 ml) mit je 20 ml wassergesättigtem n-Butanol (BuOH). Alle Fraktionen, einschließlich der verbleibenden wässrigen Phase, wurden getrocknet und dann resuspendiert. Getrocknete EtOAc-Extrakte wurden in Aceton:Wasser suspendiert, die BuOH-Fraktionen wurden in EtOH:Wasser suspendiert und die verbleibende wässrige Phase wurde in Wasser resuspendiert, um wieder das Äquivalent einer 1× Brühe zu erhalten. Kombinierte Fraktionen bestanden aus gleichen Volumina jeder Phase. Es zeigte sich, dass die EtOAc-Fraktion den Großteil des aktiven Metaboliten enthielt, wobei eine kleine Menge in die BuOH-Fraktion überging, wenn bei 1× Konzentration untersucht wurde. Bei verdünnteren Konzentrationen (1/4×) wurde die Aktivität nur in der EtOAc-Fraktion beobachtet.
Ein 10-ml-Vollbrühen-Äquivalent der EtOAc-Fraktion in 200 μl Aceton wurde durch Umkehrphasen (RP)-Festphasen-Extraktion (Bakerbond spe, Octadecyl) unter Verwendung eines Stufengradienten von 25% MeOH:Wasser, 50% MeOH:Wasser, 75% MeOH:Wasser und 100% MeOH weiter gereinigt. Der aktive Metabolit wurde mit 100% MeOH eluiert.
Die Daten in der nachstehenden Tabelle 3 zeigen die Ergebnisse aus vier Extraktionsaufteilungen, zwei Umkehrphasenchromatographien und zwei pH-Tests.
Tabelle 3 Bioaktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, Extrakte, Aufteilungen, RP-Chromatographie und veränderter pH-Wert
Anders als die normalerweise mit Streptomyces galbanus assoziierten Fungizide war die insektizide Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 unter alkalischen Bedingungen (pH 9–10) stabil und in Säure (pH 1–2) instabil.
Beispiel 5
Pflanzenaktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gegen Insektenschädlinge
Versuche mit ganzen Pflanzen bestätigten die Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gegen den Rübenheerwurm. Zuerst wurden echte Blätter von jungen Henderson-Buschlimabohnen für 3–5 Sekunden in Gesamtbrühe getaucht und dann an der Luft getrocknet. Die Blätter wurden in 50-mm-Petrischalen mit feuchtem Filterpapier und 10 frischgeschlüpften Rübenheerwurm-Larven im ersten Stadium gegeben. Nach 48 Stunden wurde die Mortalität bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Larventötende Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gegen Rübenheerwürmer in Blatt-Tauchtests
In ähnlichen Tests zeigte NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 gleiche oder bessere larventötende Aktivität gegen Heliothis virescens, Helicoverpa zea und Anticarsia gemmatalis.
Vollbrühen mit NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 wurden bei 9.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde unter Verwendung einer Luftspritze auf eine Woche alte Henderson-Buschlimabohnenpflanzen gesprüht. Neue Blätter durften trocknen und die kleinsten, echten Blätter wurden geerntet. Jedes Blatt (drei Wiederholungen pro Behandlung) wurde in eine 50-mm-Petrischale mit einem benetzten Filterpapier und etwa 10 frischgeschlüpften Larven gegeben. Die Platten wurden nach 40 Stunden in einem Inkubator (28 ± 2°C, 16:8-Photoperiode) abgelesen. Große, zwei Wochen alte Bohnenpflanzen mit vollausgebreiteten, echten Blättern wurden besprüht, um auf mögliche Phutotoxizität zu untersuchen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Wirksamkeit von Überstand und EtOAc-Extrakten gegen Rübenheerwürmer auf Bohnenblättern

* Gleicher EtOAc-Extrakt, wie in dem in Tabelle 3 dokumentierten Versuch.

Bei keiner der Proben wurde Phytotoxizität beobachtet. Die Blattversuche unterstützen die primären Durchmusterungsdaten, die zeigten, dass Gesamtbrühe und Überstand stabil und wirksam sind. In diesem Versuch verlor die Ethylacetat-Fraktion etwas Aktivität, wenn sie auf Blätter gesprüht wurde.
Zusätzliche Untersuchungen mit ganzen Pflanzen im Gewächshausmaßstab bestätigten den Pflanzenschutz von chinesischem Senfkohl, Brassica rapa, gegen Rübenheerwürmer. Ein Labor-Tracksprüher (Devries Manufacturing, Holland, Mich.) wurde so kalibriert, dass er 90 Gallonen/Morgen Sprühvolumen über eine TEE-JET 8015 Mantelstromdüse aufbrachte. Reife Kohlpflanzen wurden mit deionisiertem Wasser (Negativkontrolle), Gesamtbrühe mit NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 oder 1,1 Pfund/Morgen Javelin^® WG (toxischer Standard) behandelt. Vor der Verabreichung wurde die Gesamtbrühe mit NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 für 20 Sekunden mit einem Ultra Turrax (Tekmar, Cincinnati, Ohio) mechanisch homogenisiert. Jede Behandlung wurde dreimal wiederholt. Die Sprührückstände wurden auf Gleichförmigkeit getestet und getrocknet, bevor die Pflanzen innerhalb einer Umzäunung aus Plexiglas und Gitter in einer Gewächshausumgebung platziert wurden. Jede Pflanze wurde dann mit etwa 50 frisch geschlüpften Larven und etwa 50 Eiern beimpft. Die Pflanzen wurden nach Bedarf und ohne Sprayrückstände oder Insekten von den Blättern zu waschen bewässert.
Qualitative Beobachtungen an Tag 7 zeigten einen signifikanten Insektenfraßschaden bei der Kontrollbehandlung, weniger Schaden bei der toxischen Standardbehandlung (Javelin^®) und wenig oder keinen Schaden bei der Behandlung mit NRRL-Hinterlegungsnummer 30232. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 zu Pflanzen mit hervorragender Marktqualität führte.
Beispiel 6
Fermentation in großem Maßstab und Stabilität der Aktivität gegen Raupenschädlinge.
Das Thema der Fermentation in großem Maßstab ist ein bedeutender Faktor auf dem kritischen Weg der Beurteilung eines wirksamen Biopestizids (Hofstein und Freidlender (1994) „Development of production, formulation and delivery systems for biofungicides", Brighton Crop Protection Conference: Pests and Disease, BCPC-Veröffentlichungen, Major Print Ltd., Nottigham GB, S. 1273–1280). Erhöhen des Fermentationsvolumens von 12 ml in einem 50-ml-Röhrchen (T1) auf 50 ml in einem 250-ml-Schüttelkolben (S1) ist der erste Schritt im Maßstabsvergrößerungsverfahren. Die Einengung der Überstände aus diesem Schritt über Speed-Vac hatten keinen negativen Einfluss auf die biologische Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, welcher getestet in den Konzentrationen 2×, 1× und 0,5× eine positive Dosisantwort erreichte. Die Untersuchung der Stabilität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 aus der Fermentierung S1 zeigte, dass die Aktivität gegen Rübenheerwürmer bei gekühlter Aufbewahrung bei 4°C oder eingefroren bei –80°C für zwei bis drei Wochen stabil war. Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.
Tabelle 6 Bioaktivität einer eine Woche alten (W1) Fermentationsbrühe gezüchtet in einem 250-ml-Schüttelkolben (S1) und 50-ml-Röhrchen (T1)
Tabelle 7 Bioaktivität einer zwei Wochen alten (W2) 30232 Fermentationsbrühe, gezüchtet in einem 250-ml-Schüttelkolben (S1)
Die nachstehende Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse, wenn die Spezifität der biologischen Aktivität aus dem 250-ml-Kolben auf den Rübenheerwurm beschränkt war, wie in der anfänglichen 50-ml-Röhrchenfermentation.
Tabelle 8 Bioaktivität einer drei Wochen alten (W3), gekühlten und gefrorenen Fermentationsbrühe von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232, gezüchtet in einem 250-ml-Schüttelkolben (S1)
Der zweite Schritt im Maßstabsvergrößerungsverfahren ist eine Wiederholung des 50-ml-Volumens in einem 250-ml-Kolben (S2). Gleichzeitige Fermentation in einem 50-ml-Röhrchen bestätigte die Aktivität des Stammes. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9 Antwort einer eine Woche alten (W1) Fermentationsbrühe, gezüchtet in einem 250-ml-Schüttelkolben (S2) und 50-ml-Röhrchen (T2)
Mit Zunahme des Volumens nahm die Bioaktivität von Medium 38 verglichen mit Medium 31 ab. Sigmund, M. J. und Hirsch, C. F. (1998), J. Antibiotics 51: 829–836, zeigten, dass die Zugabe von Tomatenpaste eine kritische Komponente bei der Herstellung fungizider Aktivität ist. Im Gegensatz zu dem, was mit Rustmicin (hergestellt von S. galbus) gesehen wird, zeigte unsere Maßstabsvergrößerung, dass das komplexe Hafermehlmedium (31) mit zunehmendem Volumen die insektizide Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232 verglichen mit auf Tomatenpaste basiertem Medium 38 erhöhte. Zwei zusätzliche Volumenvergrößerungen bestätigten die Wirksamkeit von Medium 31. Für die S3 wurden 200 ml Medium 31 in einem 1 l Kolben mit Prallflächen verwendet und für die S4 500-ml-Volumina in 2,8-l-Fernbach-Kolben ohne Prallflächen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10 Bioaktivitäten von zwei Wochen alten (W2) Fermentationsbrühen, gezüchtet in 1000-ml-Schüttelkolben (S3) und 2800-ml-Fernbach-Kolben (S4)
Erhöhen der Fermentationsgröße über drei Stufen auf 500 ml Medium 31 in einem 2800-ml-Fernbach-Kolben hatte keinen negativen Einfluss auf die insektizide Aktivität von NRRL-Hinterlegungsnummer 30232.
Obwohl die vorstehende Erfindung in einigen Details durch Illustration und Beispiele zum Zwecke des klaren Verständnisses beschrieben wurde, wird es Fachleuten offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen gemacht werden können. Daher sollen die Beschreibungen und Beispiele den Geltungsbereich der Erfindung nicht beschränken, der durch die beigefügten Patentansprüche dargestellt wird.

Claims

Zusammensetzung, umfassend einen isolierten Bakterienstamm, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Streptomyces galbus-Stamm hinterlegt bei NRRL mit der Hinterlegungsnummer 30232 und Mutanten des Stamms hinterlegt bei NRRL mit der Hinterlegungsnummer 30232, wobei die Mutanten insektizide Aktivität besitzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, ferner umfassend mindestens ein chemisches oder biologisches Pestizid.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung formuliert ist als ein benetzbares Pulver, ein Granulat, eine wässrige Suspension, ein emulgierbares Konzentrat oder als mikroverkapselte Formulierung.
Kultur, umfassend den Bakterienstamm nach Anspruch 1.
Verfahren zum Verhindern oder Behandeln des Insektenbefalls einer Pflanze, Wurzel oder Frucht, umfassend das Aufbringen einer wirksamen Menge der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Kultur nach Anspruch 4 auf die Pflanze, Wurzel oder Frucht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Insekt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lepidoptera, Coleoptera und Diptera.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Lepidopterabefall verursacht wird durch mindestens ein Insekt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Spodoptera exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp., Helicoverpa zea, Heliothis virescens und Trichoplusia ni.
Verfahren zur Verbesserung der Bioaktivität der biologisch reinen Kultur nach Anspruch 1, umfassend das Fermentieren der Kultur für eine bis drei Wochen vor dem Aufbringen auf die Pflanze, Wurzel oder Frucht.
Verfahren zur Herstellung eines Überstandes mit insektizider Aktivität, umfassend das Züchten des Stamms nach Anspruch 1 und das Isolieren des Überstandes, der durch den Stamm hergestellt wird, wobei der Überstand hergestellt wird.
Verfahren zur Isolierung eines Metaboliten mit insektizider Aktivität, umfassend das Trennen des Metaboliten vom Überstand nach Anspruch 9 durch eine Umkehrphasen- und eine Festphasenextraktion unter Verwendung eines Stufengradienten von Methanol und Wasser, wodurch der Metabolit isoliert wird.