ES2263616T3 - Cepa de streptomyces galbus con actividad insecticida y procedimiento para su utilizacion como insecticida. - Google Patents
Cepa de streptomyces galbus con actividad insecticida y procedimiento para su utilizacion como insecticida.Info
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Abstract
Composición que comprende una cepa bacteriana aislada, seleccionada de entre el grupo constituido por la cepa de Streptomyces galbus depositada en el laboratorio NRRL con número de depósito 30232; y mutantes de la cepa depositada en el laboratorio NRRL con número de depósito 30232, en la que los mutantes presentan actividad insecticida.
Description
Cepa de Streptomyces galbus con actividad
y procedimiento para su utilización como insecticida.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de los biopesticidas. Más particularmente, la presente
invención se refiere a una nueva cepa de Streptomyces con
actividad insecticida y a procedimientos para la utilización de la
misma.
Los productos naturales son sustancias
producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos
naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad
química. Existe una larga historia de utilización de estos productos
naturales con fines farmacéuticos. A pesar de la abundancia de
productos naturales para tratamientos terapéuticos en humanos,
existen únicamente unos pocos productos naturales para aplicaciones
agrícolas. Los insecticidas a base de productos naturales
microbianos más exitosos son las toxinas de Bacillus
thuringiensis, las avermectinas y las espinosinas. Las bacterias
Bacillus thuringiensis (Bt) producen cristales de
proteínas citoplasmáticas (\delta-endotoxinas)
durante la esporulación, y éstas constituyen el factor más
importante en la patogénesis de insectos (ver Ellar, D.J. (1997),
"The structure and function of Bacillus thuringiensis
\delta-endotoxins and prospects for piopesticide
improvement", en: Microbial Insecticides: Novelty or
Necessity?, The British Crop Protection Council Symposium
Proceedings Nº 68, Coventry, Reino Unido). Las
\delta-endotoxinas se han utilizado tanto en
preparaciones de pulverización como en biopesticidas
"sistémicos", a través de la introducción de los genes de las
endotoxinas en plantas transgénicas. Se estima que el crecimiento
del mercado de preparaciones de pulverización de Bt será de
aproximadamente el 10% entre 1997 y 2000, lo que significará un
mercado de entre 100 y 130 millones de dólares en el año 2000 (ver
Lisansky, S. (1997), "Microbial biopesticides", en:
Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The British
Crop Protection Council Symposium Proceedings Nº 68, Coventry, Reino
Unido). Los cultivos transgénicos Bt más importantes son el
maíz y el algodón. El mercado de maíz transgénico Bt en
U.S.A. ha crecido desde sólo un 1,4% de la superficie cultivada en
1996, hasta el 19,1% en 1998. El crecimiento en el caso del algodón
Bt no ha sido tan drástico, aumentando desde el 14,6% de la
superficie cultivada en 1996, hasta el 16,8% en 1998. Actualmente,
todo el mercado está centrado en combatir las plagas de
lepidópteros. En 1999, el mercado de los pesticidas contra orugas
superó los 400 millones de dólares en U.S.A.
Las avermectinas son producidas por el
Streptomyces avermitilis durante la fermentación. La
abamectina, una de las lactonas macrocíclicas de procedencia
natural, muestra actividad contra los ácaros, el psílido del peral y
la polilla dorso de diamante. La emamectina, un análogo
semisintético de la abamectina, muestra actividad contra larvas de
lepidópteros. En los invertebrados, las avermectinas inducen la
abertura de un canal presináptico de ion cloruro (no activado por
receptores GABA) que provoca la descarga de iones cloruro, la
despolarización del terminal nervioso y, en consecuencia, la
liberación de neurotransmisores. Ver Turner, M. J. y Schaeffer, J.
M. (1989), "Mode of action of Ivermectin", en:
Ivermectin and Abamectin, W. C. Campbell (Ed.)
Springer-Verlag, New York. Se estimó que el
valor del mercado mundial para la utilización de avermectinas para
control de insectos era de entre 80 y 120 millones de dólares en
1998.
Las espinosinas son una nueva clase de
macrólidos tetracíclicos derivados de fermentación, y son producidas
por la actinomiceta Saccharopolyspora spinosa. Las
espinosinas A y D, los componentes principales del insecticida a
base de spinosad Tracer®, muestran actividad contra plagas de
lepidópteros y mosquitos. Ver Sparks, T. C. et al. (1999),
"Fermentation-derived insecticide control agents:
the spinosyns", en: Biopesticides Use and Delivery, Hall, F. R.
et al., eds. Humana Press, Totowa, N.J.,
pp.155-170. Su modo de acción es único, con un
primer lugar de ataque en el receptor nicotínico de acetilcolina y
un segundo lugar de ataque, posiblemente sobre o en los receptores
GABA. Ver Salgado, V. L. (1997), "The modes of action of spinosad
and other insect control products", Down to Earth,
52:35-43.
Los Streptomyces son una fuente
reconocida de productos insecticidas naturales. Además de las
avermectinas y espinosinas, se han identificado a partir de cepas de
Streptomyces colesterol oxidasa (Purcell, J. P. et al.
(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.
196:1406-1413), alosamidina (Sakuda, S. (1986)
Tetrahedron Lett. 27:2475-2478), valinomicina
(Heisey, R. (1988) J. Agric. Food Chem.
36:1283-1286), derivados de pirrolizina (Jizba, J.
et al. (1992) Folia-Microbiologica
37:461-462), respirantin (Urushibata, I. et
al. (1993) J. Antibiotics 46:701-703),
prasinonas (Box, S. J. et al. (1973) Appl. Microbiol.
26:699-704), piercidina (Takahashi, N. et al.
(1968) Agr. Biol. Chem. 32:1115-1122)
griseulina (Nair, M. G. et al. (1993) J. Antibiotics
46:1762-1763), martinomicina (Carter, G. T. et
al. (1994) J. Antibiotics 47:1549-1553),
faeriefungina (Nair, M. G. et al. (1989) J. Nat. Prod.
52:797-809), indanomicina (Zhang, D. et al.
(1997) J. Antibiotics 50:617-620),
ciclofostina (Kurokawa, T. et al. (1993) J.
Antibiotics 46:1315-1318), manumicina (Zeeck, A.
et al. (1987) J. Antibiotics
40:1530-1540), ictiomicina (Zizka, Z. et al.
(1991) Cytobios 65:31-38), virginiamicina
(Prikrylova, V. et al. (1992) Folia Microbiol.
37:386-388), suidatestrina (Knuessel, I., et
al. (1998) Comp. Biochem. Phys. B.
120B:639-646), gualamicina (Tsuchiya, K. J. (1995)
J. Antibiotics 48:626-629), y otros productos
naturales insecticidas.
El Streptomyces galbus es conocido por su
producción de los potentes macrólidos antibotritis galbonolida A y
galbonolida B. (Paul A. K. y Banerjee, A. K. (1983) Folia
Microbiol. 28:386-396; Sigmund, J. M. y Hirsch,
C. F. (1998) J. Antibiotics 51:829-836;
Achenbach, H., patente DE nº 86-3632168; y Zaehner,
H., patente DE nº 3632168). Nakayama et al. (1987) Agric.
Biol. Chem. 51:853-860 publicaron el
descubrimiento de la rustmicina, un potente inhibidor de la roya del
tallo de trigo, Puccinia gramnis. Posteriormente, se
descubrió que la galbonolida A era la misma molécula que la
rustmicina. Achenbach et al. (1988) Annals N.Y. Acad.
Sci. 544:128-140, demostraron que la galbonolida
A es mucho más activa que la galbonolida B contra diversas levaduras
endomicetales y un gran número de Deuteromycetes, tal como
Candida albicans y Botrytis cinerea. No se pudieron
atribuir a estos macrólidos indicios de actividad ionofórica,
desestabilización de membrana, interferencia con la síntesis de ADN
o ARN, o inhibición de la biosíntesis de quitina. Recientemente,
Mandala et al. ((1998) J. Biol. Chem.
24:14942-14949) y Harris et al. ((1998) J.
Antibiotics 51:837-844; y Harris, G., et
al. patente nº GB 2324300) han demostrado que la rustmicina
inhibe la inositol fosfoceramida sintasa, la primera enzima fúngica
específica en la biosíntesis de esfingolípidos. En la presente
descripción, documentamos las potentes propiedades insecticidas de
una nueva cepa de S. Galbus, con actividad contra diversos
lepidópteros de importancia agrícola.
Mishra et al (Journal of Industrial
Microbiology, 2 (1987) 267-276) describen las
propiedades insecticidas y nematicidas de los metabolitos
microbianos. Este estudio examinó metabolitos obtenidos a partir de
942 aislados microbianos. Los aislados incluían 302 estreptomicetas,
502 actinomicetas nuevas, incluyendo representantes de 18 géneros,
28 actinomicetas aeróbicas no identificadas, 70 hongos y 40
bacterias que no eran actinomicetas.
La presente invención da a conocer un nuevo
compuesto, Streptomyces galbus, número de depósito en el NRRL
30232, y mutantes del mismo que mantienen la misma actividad, para
su utilización como insecticida contra lepidópteros. La invención
incluye la utilización de sobrenadantes y metabolitos obtenidos a
partir de la cepa para su utilización como insecticidas. La
invención incluye también procedimientos para tratar plantas o
frutos a efectos de controlar invasiones de lepidópteros mediante la
utilización de la cepa reivindicada, ya sea individualmente o en
combinación con otros pesticidas químicos o biológicos. Además, se
dan a conocer procedimientos para fermentar la cepa reivindicada a
efectos de incrementar su bioactividad como insecticida.
Se ha depositado una cepa de Streptomyces
galbus, según el Tratado de Budapest, en el Agricultural
Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional
Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604,
U.S.A. El número de depósito es NRRL 30232.
La cepa se ha depositado bajo unas condiciones
que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible mientras la
presente solicitud permanezca en estado pendiente. El depósito es
accesible tal como requieren las leyes de patente extranjera en
países en los que las contrapartes de la solicitud en cuestión, o su
progenie, están archivadas. Sin embargo, debe entenderse que la
disponibilidad de un depósito con constituye una licencia para poner
en práctica la invención en cuestión, derogando los derechos de
patente garantizados por la acción gubernamental.
Tal como se utiliza en el presente documento,
algunos términos pueden tener el significado definido a
continuación.
Las formas singulares "un", "una",
"el" y "la" incluyen referencias en plural, a no ser que
el contexto exija claramente lo contrario. Por ejemplo, el término
"una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo
mezclas de las mismas.
La expresión "que comprende" o "que
comprenden" pretende significar que las composiciones y
procedimientos incluyen los elementos citados, pero no excluyen
otros. La expresión "que consiste esencialmente en" o "que
consisten esencialmente en", cuando se utiliza para definir
composiciones y procedimientos, significa excluyendo otros elementos
sin ninguna importancia esencial para la combinación. De este modo,
una composición que consiste esencialmente en los elementos tal como
se definen en el presente documento, no excluye trazas de
contaminantes procedentes de los procedimientos de aislamiento y
purificación, ni portadores aceptables desde el punto de vista
agrícola. "Que consiste en" o "que consisten en" significa
excluyendo más que elementos traza de otros ingredientes y etapas
sustanciales del procedimiento para aplicar las composiciones según
la presente invención. Las formas de realización definidas por todos
estos términos de transición están dentro del alcance de la presente
invención.
Tal como se utiliza en el presente documento,
"control biológico" se define como el control de un patógeno o
insecto mediante la utilización de un segundo organismo. Mecanismos
conocidos de control biológico incluyen bacterias entéricas que
controlan la putrefacción de la raíz compitiendo por el espacio de
la superficie de las raíces con los hongos hasta expulsarlos, o la
aplicación del para controlar Bacillus thuringiensis plagas
de insectos. Se han utilizado toxinas bacterianas, tal como
antibióticos, para controlar patógenos e insectos. La toxina puede
aislarse y aplicarse directamente a la planta, o puede administrarse
la especie bacteriana de tal modo que produzca la toxina in
situ.
El término "hongo" u "hongos" incluye
una amplia variedad de organismos nucleados portadores de esporas y
que carecen de clorofila. Ejemplos de hongos incluyen levaduras,
mohos, añublos, royas y setas.
El término "bacteria" incluye cualquier
organismo procariota que no tenga un núcleo delimitado.
"Fungicida" o "antifúngico" se refiere
a la capacidad de una sustancia de incrementar la tasa de mortalidad
o inhibir la tasa de crecimiento de los hongos.
"Antibiótico" incluye cualquier sustancia
capaz de matar o inhibir el crecimiento de otro organismo vivo,
incluyendo otros microorganismos, aunque sin limitarse a los mismos.
Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o
mediante un procedimiento de síntesis o de semisíntesis.
El término "mutante" se refiere a una
variante de la cepa original, así como a procedimientos para obtener
un mutante o variante en la que la actividad pesticida sea mayor que
la expresada por la cepa original. En el presente documento, la
"cepa original" se define como la cepa de Streptomyces
inicial, antes de la mutagénesis. Para obtener estos mutantes, la
cepa original puede tratarse con una sustancia química, tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
o etilmetanosulfonato, o mediante irradiación con rayos gamma, rayos
X o radiación UV, o mediante otros medios bien conocidos por los
expertos en la materia.
Una "variante" es una cepa que posee todas
las características identificativas de la cepa con número de
depósito NRRL 30232 y puede ser identificada como poseedora de un
genoma que se hibrida bajo condiciones de elevada astringencia hasta
el genoma de la cepa con número de depósito NRRL
B-30232. "Hibridación" se refiere a una
reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar
un complejo que se estabiliza mediante puentes de hidrógeno entre
bases de los residuos de nucleótidos. El establecimiento de puentes
de hidrógeno puede tener lugar por el apareamiento de bases de
Watson y Crick, por el apareamiento de Hoogstein o de cualquier otro
modo específico de la secuencia. El complejo puede comprender dos
cadenas que forman una estructura doble, tres o más cadenas que
forman un complejo multicadena, una sola cadena autohibridante o una
combinación de las mismas. Las reacciones de hibridación pueden
llevarse a cabo bajo condiciones de diferente "astringencia".
En general, una reacción de hibridación con astringencia baja se
lleva a cabo a aproximadamente 40ºC en 10 X SSC o una solución de
fuerza iónica/temperatura equivalente. Típicamente, una hibridación
con astringencia moderada se lleva a cabo a aproximadamente 50ºC en
6 X SSC, y una reacción de hibridación con astringencia alta se
lleva a cabo, generalmente, a aproximadamente 60ºC en 1 X SSC.
También puede definirse una variante de la cepa
con número de depósito NRRL 30232 como una cepa que posee una
secuencia genómica con una identidad de secuencia mayor del 85%, más
preferentemente mayor del 90%, o más preferentemente mayor del 95%,
con respecto al genoma de la cepa con número de depósito NRRL
B-30232. Que un polinucleótido o región de
polinucleótidos (o un polipéptido o región de polipéptidos) tenga
cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%, 90% ó 95% de "identidad
de secuencia" con respecto a otra secuencia significa que, al
alinearse, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son los mismos
comparando las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de
homología o de identidad de secuencia puede determinarse utilizando
programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los
descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel
et al., eds., 1987), suplemento 30, sección 7.7.18, tabla
7.7.1. Preferentemente, para la alineación se utilizan parámetros
por defecto. Un programa de alineación preferente es el BLAST, que
utiliza parámetros por defecto. Particularmente, son programas
preferentes el BLASTN y el BLASTP, que utilizan los parámetros por
defecto siguientes: código genético = estándar; filtro = ninguno;
cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62;
descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; bases
de datos = no redundantes, GenBank + EMBL \pm DDBJ + PDB + GenBank
CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Pueden encontrarse
detalles acerca de estos programas en la dirección de Internet
siguiente:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
El término "cultivar" se refiere a la
propagación de organismos sobre medios o en medios de diversos
tipos.
La expresión "cultivo de caldo completo" se
refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como medio
de cultivo.
El término "sobrenadante" se refiere a el
caldo líquido que queda una vez extraídas las células que han
crecido en el caldo por centrifugación, filtración, sedimentación u
otros medios bien conocidos en la técnica.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad
suficiente para provocar resultados beneficiosos o los resultados
esperados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más
administraciones. En términos de tratamiento y protección, una
"cantidad efectiva" es la cantidad suficiente para reducir,
retrasar o eliminar la capacidad de un insecto para alimentarse,
crecer y reproducirse en la etapa adulta o preadulta de su
desarrollo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "insecto" incluye todos los organismos de la clase
insectos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "lepidópteros" se refiere al orden de insectos
caracterizado por una etapa larval, en la que adopta la forma de
oruga o gusano, y una etapa adulta, en la que adopta la forma de
polilla o mariposa.
Un insecto "preadulto" se refiere a
cualquier forma de un organismo anterior a la etapa adulta,
incluyendo, por ejemplo, huevos, larvas y ninfas.
"Insecticida" se refiere a la capacidad de
una sustancia para aumentar la tasa de mortalidad o inhibir la tasa
de crecimiento de los insectos.
"Pesticida" se refiere a la capacidad de
una sustancia para aumentar la tasa de mortalidad o inhibir la tasa
de crecimiento de los insectos, nematodos y ácaros.
"Control positivo" se refiere a un
compuesto del que se conoce su actividad pesticida. "Controles
positivos" incluyen los pesticidas químicos comercialmente
disponibles, aunque no se limitan a los mismos.
El término "control negativo" se refiere a
un compuesto del que se conoce que no presenta actividad pesticida.
Ejemplos de controles negativos son el agua, blancos de medio de
cultivo o concentraciones bajas de disolvente, tal como acetona,
etanol o acetato de etilo.
Los blancos de medio de cultivo están compuestos
por caldo de fermentación esterilizado en ausencia de
microorganismos de fermentación.
El término "disolvente" incluye cualquier
líquido que mantenga otra sustancia en solución.
"Extraíble por disolvente" se refiere a
cualquier compuesto que se disuelve en un disolvente y que, a
continuación, puede aislarse del disolvente. Ejemplos de disolventes
incluyen disolventes orgánicos, tales como acetato de etilo (EtOAc),
acetona, etanol (EtOH), acetonitrilos, metanol (MeOH), butanol
(BuOH) o dimetilsulfóxido (DMSO), aunque sin limitarse a los
mismos.
El término "metabolito" se refiere a
cualquier compuesto, sustancia o producto secundario de la
fermentación de un microorganismo que presenta actividad
biológica.
Una "composición" se refiere a una
combinación de agente activo y otro compuesto, portador o
composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o marcador o
un portador líquido) o activo, tal como un adyuvante.
Esta invención da a conocer un cultivo
biológicamente puro de una cepa que presenta todas las
características indentificativas de Streptomyces galbus, con
número de depósito NRRL 30232, y sus variantes y mutantes, tal como
se ha descrito anteriormente, que presentan actividad insecticida.
En una forma de realización, la invención es la cepa designada con
el número de depósito NRRL 30232.
La presente invención da a conocer un
procedimiento para aislar un metabolito a partir de los cultivos
biológicamente puros de cepas descritos en el presente documento,
así como los metabolitos aislados mediante dicho procedimiento. El
metabolito se caracteriza por ser extraíble por disolvente y poseer
un peso molecular inferior a 10.000 Daltons.
Además, la presente invención da a conocer un
procedimiento para purificar sobrenadantes biológicamente activos a
partir de los cultivos biológicamente puros identificados en el
presente documento, y los sobrenadantes aislados de los mismos. Los
sobrenadantes aislados presentan una actividad insecticida similar a
la de Streptomyces galbus con número de depósito NRRL 30232,
o a mutantes y variantes de la misma.
La presente invención da a conocer además
composiciones que comprenden por lo menos uno de los cultivos
biológicamente puros, sobrenadantes o los metabolitos aislados
descritos anteriormente, y un portador. En otro aspecto, la
composición contiene además por lo menos un pesticida químico o
biológico. Las composiciones están formuladas como uno o más polvos
humectables, gránulos, suspensiones acuosas, concentrados
emulsificables o formulaciones microencapsuladas.
A efectos de alcanzar una buena dispersión y
adhesión de las composiciones según la presente invención, puede
resultar ventajoso formular el cultivo de caldo completo, el
sobrenadante, las fracciones y/o el metabolito/antibiótico con
componentes que ayuden a la dispersión y adhesión. En consecuencia,
las formulaciones adecuadas serán conocidas por los expertos en la
materia (polvos humectables, gránulos y similares, o pueden estar
microencapsuladas en un medio adecuado y similares, líquidos, tal
como fluidos acuosos y suspensiones acuosas, y concentrados
emulsificables). Otras formulaciones adecuadas serán conocidas por
los expertos en la materia.
Todas las cepas, fracciones, sobrenadantes y
composiciones indicados anteriormente, que contienen estos
ingredientes activos, pueden utilizarse para proporcionar un
procedimiento para tratar o proteger plantas, raíces o frutos de
infecciones por insectos. Los insectos incluyen un insecto
seleccionado de entre el grupo constituido por lepidópteros,
coleópteros y dípteros, aunque sin limitarse a los mismos. En un
aspecto, el insecto es un lepidóptero, por ejemplo Spodoptera
exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp., Helicoverpa zea,
Heliothis virescens, y Trichoplusia ni.
La presente invención da a conocer además un
procedimiento para producir un sobrenadante activo como insecticida
mediante el cultivo de las cepas según la presente invención y el
aislamiento del sobrenadante. El sobrenadante producido mediante
este procedimiento se reivindica asimismo en el presente
documento.
\newpage
El metabolito se aísla por extracción en fase
sólida y en fase inversa, utilizando un gradiente escalonado de
metanol y agua. El metabolito puede identificarse a través de su
peso molecular (inferior a 10.000 Daltons).
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título
ilustrativo. Estos ejemplos no deben entenderse como
limitativos.
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar la
invención, sin limitar la misma.
La cepa con número de depósito NRRL 30232 se
identificó en base a la secuenciación del ARNr 16S. El protocolo
utilizado para generar la secuencia de datos génicos del ARNr 16S
(Acculab Customer Handbook v.1.0) se describe de la manera
siguiente.
El gen ARNr 16S se amplifica por PCR a partir de
ADN genómico aislado a partir de colonias bacterianas. Los primers
utilizados para la amplificación corresponden a las posiciones 005 y
531 de E. coli. Los productos de amplificación se purifican a
partir de cebadores en exceso y dNTP utilizando membranas Microcon
100 (Amicon) de corte de peso molecular, y se comprueban su calidad
y cantidad haciendo pasar una parte de los productos sobre un gel de
agarosa.
La secuenciación cíclica de los productos de
amplificación de ARNr 16S se lleva a cabo utilizando la enzima
AmpliTaq FS ADN polimerasa y finalizadores de tinción de dRodamina.
Los finalizadores en exceso marcados con trazador se eliminaron de
las reacciones de secuenciación utilizando una columna de
centrifugado Sephadex G-50. Los productos se recogen
por centrifugación, se secan bajo vacío y se congelan a -20ºC hasta
que están listos para la carga. Se vuelven a suspender muestras en
una solución de formamida/azul dextrano/EDTA y se desnaturalizan
antes de la carga. Las muestras se someten a electroforesis en un
secuenciador de ADN ABI Prism 377. Los datos se analizan utilizando
el software de edición y ensamblaje de ADN de PE/Applied Biosystems.
Una vez obtenidas, las secuencias se cotejan con la base de datos
MicroSeq^{TM}, de PE/Applied Biosystems, utilizando el software de
análisis de secuencias de MicroSeq^{TM}. Las secuencias también se
cotejan con el GenBank y el Ribosomal Database Project (RDP).
El resultado de la secuenciación de ARNr 16S fue
la identificación de la cepa con número de depósito NRRL 30232 como
Streptomyces galbus, con un porcentaje %ID del 99% (GenBank)
y un grado de semejanza de 0,98 (RDP). Estas puntuaciones indican
una coincidencia al nivel de especie.
Se cultivó la nueva cepa de Streptomyces
galbus para analizar su actividad contra patógenos de plantas
del modo siguiente. Inicialmente, el microbio aislado se fermentó en
tres medios de cultivo distintos de actinomicetas. El medio 38
estaba compuesto por 2 g/l de pasta de tomate, 2 g/l de harina de
avena y 1,0 g/l de sales marinas. El medio 31 estaba compuesto por
45 g/l de harina de avena, 2 g/l de extracto de levadura, 6 g/l de
KH_{2}PO_{4} y 4,8 g/l de Na_{2}HPO_{4}, a pH 7. El medio 6
estaba compuesto por 20 g/l de almidón soluble, 10 g/l de dextrosa,
5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de N-Z amineA y
1 g/l de CaCO_{3}.
El microbio se extrajo de
tomate-harina de avena-agar (2 g/l
de pasta de tomate, 2 g/l de harina de avena y 20 g/l de agar) y se
introdujo en tubos cónicos de 50 ml que contenían 12 ml de medio de
fermentación estéril tapado con un tapón de espuma. Los tubos
inoculados se incubaron a 27 \pm 3ºC en un agitador orbital
durante seis días. Los tubos de producto de fermentación a pequeña
escala se centrifugaron a 4.200 rpm (3.500 fuerzas G) durante 15
minutos utilizando un rotor de cesto giratorio (JS4.2) en una
centrifugadora refrigerada Beckman JB-6. Los
sobrenadantes se recogieron asépticamente y se transfirieron a
placas de 96 pocillos fondos estériles o tubos de cinco ml
dispuestos en soportes adaptados a funcionamiento automático. Se
transfirió cada sobrenadante, asépticamente y por triplicado, en
placas de microtitulación de 96 pocillos estériles. Se añadieron
controles químicos como comprobaciones positivas junto con blancos
de medio de cultivo y controles de agua. A continuación, se
cubrieron gradualmente las preparaciones con capas de agar
fundido.
Las alícuotas de 25 microlitros (\mul) de
sobrenadante se cubrieron con 75 \mul de agar fundido al 2,5%,
seguido de alícuotas de 100 \mul de 0,75% de agar patata dextrosa
(caldo de patata dextrosa 23 g/l, agar 7,5 g/l). Finalmente, se
dispusieron 25 \mul de una suspensión de espora patógena encima de
la APD y se incubaron las placas a 24 \pm 2ºC durante cuatro días.
Se cuantificó el crecimiento del patógeno utilizando un índice
escalado en el que cinco indica un crecimiento igual al control de
agua y un índice de uno indica ausencia absoluta de crecimiento. Los
índices dos (2) a cuatro (4) representan niveles intermedios de
esporulación y crecimiento, mientras que cero (0) indica un ensayo
erróneo o innecesario.
Se llevó a cabo el ensayo con los siguientes
pares patógeno/sustancia química: Alternaria brassisicola
(ABRA Benomil), Botrytris cinerea (BOTC/Benomil),
Monilinua fructicola (MONF/Benomil), Phytophthora
capsici (PCAP/
Metalaxil), Pseudomonas syringae (PSTO/Gentamicina) y Colletotrichum coccoides (COLC/Clorotalonil). La tabla 1 muestra los resultados de tres ensayos replicados distintos. Los ensayos comprendían tres fechas de fermentación separadas y se documentan a continuación. Los controles químicos dieron índices de uno (1) en todos los ensayos replicados independientes; y los blancos de medio de cultivo dieron índices de cinco (5).
Metalaxil), Pseudomonas syringae (PSTO/Gentamicina) y Colletotrichum coccoides (COLC/Clorotalonil). La tabla 1 muestra los resultados de tres ensayos replicados distintos. Los ensayos comprendían tres fechas de fermentación separadas y se documentan a continuación. Los controles químicos dieron índices de uno (1) en todos los ensayos replicados independientes; y los blancos de medio de cultivo dieron índices de cinco (5).
| Replicado | Medio | Conc. | ABRA | BOTC | MONF | PCAP | PSTO | COLC |
| Rep 1 | 6 | 1 x Super | 4 | 5 | 5 | 3 | 5 | 4 |
| Rep 1 | 31 | 1 x Super | 5 | 4 | 3 | 3 | 5 | 4 |
| Rep 1 | 38 | 1 x Super | 5 | 5 | 4 | 3 | 5 | 4 |
| Rep 2 | 31 | 1 x Super | 5 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Rep 2 | 38 | 1 x Super | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 4 |
| Rep 2 | 38 | 1 x Super | 5 | 5 | 4 | 3 | 5 | 3 |
| Rep 3 | 6 | 1 x Super | 5 | 4 | 5 | 0 | 5 | 5 |
| Rep 3 | 31 | 1 x Super | 5 | 5 | 2 | 0 | 5 | 3 |
Aunque en algunos pocillos se observó una ligera
inhibición de los patógenos ensayados, particularmente PCAP Rep 1,
los resultados no se confirmaron de forma concluyente en Rep 2. En
su conjunto, los datos muestran que el sobrenadante del caldo
completo de un cultivo de seis días de la nueva cepa con número de
depósito NRRL 30232 no es generalmente activo contra esporas de
patógenos de plantas en un ensayo de tipo difusión de agar.
Para determinar la actividad insecticida, se
dispusieron seis replicados de cada extracto microbiano sobre una
dieta artificial basada en germen de trigo/caseína en placas de 96
pocillos (29 g/l de agar, 13,8 g/l de celufil, 38,5 g/l de sucrosa,
32,2 g/l de caseína, 27,5 g/l de germen de trigo, 9,2 g/l de mezcla
de sal Wesson, 9,0 g/l de premezcla de vitaminas, 33 mg/l de
estreptomicina, 33 mg/l de hidrocloruro de clorotetraciclina, 1,2
ml/l de ácido propiónico, 0,12 ml/l de ácido fosfórico, 10 ml/l de
etanol de 100 grados proof, 1 g/l de metilparabeno, 0,3 g/l de
benzoato sódico, 1,0 g/l de ácido sórbico). Se esterilizaron huevos
de gusano soldado de la remolacha temporalmente sincronizados y se
suspendieron en una solución diluida de agar. Se utilizaron placas
invertidas de filtración Millipore® de 96 pocillos como plantilla
para inocular rectángulos de papel de filtro Whatman® #2 con entre
cinco y diez huevos de siete días en 25 \mul. El papel de filtro
se dejó secar, se invirtió y se ajustó a los orificios de pocillo de
la placa de dieta/extracto. Los papeles de filtro se cubrieron con
una tapa de placa ventilada y se fijaron con cinta en su sitio. Se
incubaron las placas en una cámara de crecimiento Percival a 28
\pm 2ºC, bajo un fotoperiodo de 16:8 y con una humedad relativa
comprendida entre 30 y 40%. Los huevos se rompieron y los neonatos
cayeron en la dieta tratada con extracto. Tras cuatro días, se
sacaron las placas de la cámara Percival, se retiró la cinta de
celofán y se golpearon las placas sobre una mesa para separar los
gusanos del papel de filtro. Las tapas/filtros se reemplazaron por
una pieza perforada de Mylar transparente y se sellaron en su sitio
con hierro caliente. El ensayo se retornó a la cámara Percival
durante otro día adicional. El crecimiento larval se cuantificó
visualmente, utilizando un índice similar al de la pantalla de
patología de la planta, en el que un índice de uno indica un 100% de
mortalidad y un índice de cuatro indica un crecimiento igual a los
controles no tratados. Un índice de dos indica una mortalidad
inferior a 100% pero superior a 50%, o un crecimiento severamente
impedido. Un índice de tres indica una mortalidad inferior a 50%
pero superior a 25%, o un crecimiento impedido. Para cada dato
experimental replicado, se procesó una placa de control químico.
Ocho diluciones en serie de Iavelin® (cepa de Bacillus
thuringiensis kurstaki) de entre 1.000 y 7 ppm proporcionaron
datos de respuesta a la dosis. Se analizaron escarabajos manchados
del pepino (CRW: Diabrotica undecimpunctuata) en un ensayo
similar, utilizando bifentrina como control químico. Se sometieron a
ensayo pulgones verdes del melocotonero (GPA: Myzus persicae)
o pulgones de la alfalfa (PA: Acyrthosiphon pisum) en placas
de 96 pocillos. Los sobrenadantes se absorbieron sobre discos de
papel de filtro, en el fondo de las placas de 96 pocillos. Los
pulgones se colocaron en los pocillos y se utilizaron placas de
filtración Millipore® de 96 pocillos provistas de membranas de
parafilm para cubrir la placa base. Los pocillos de la placa de
filtración se cargaron con 40 \mul de sobrenadante y 40 \mul de
dieta líquida artificial (300 g/l de sucrosa, 10 g/l de hidrosilado
de caseína, 1 g/l de mezcla de sal Wesson, 1 g/l de premezcla de
vitaminas, 33 mg/l de estreptomicina, 33 mg/l de hidrocloruro de
clorotetraciclina, 1 g/l de metilparabeno, 0,3 g/l de benzoato
sódico, 1,0 g/l de ácido sórbico, pH 6,8). Se trataron placas de
control químico con diluciones en serie de imidacloprida, en las que
el papel de filtro tratado en la placa base detectaba actividad por
contacto y los pocillos tratados con membranas detectaban actividad
por ingestión. La mortalidad de los pulgones se registró pasadas
entre 24 y 48 horas. Se registraron el número de pulgones vivos
alimentándose en las membranas de control de agua/dieta y los que se
desplazaban/se mantenían en los pocillos con papel de filtro
tratado con agua. Se calcularon los límites superior e inferior, y
su desviación estándar, permitiéndose cálculos de índices. Se
evaluaron arañuelos rojos de dos manchas (SM: Tetranynchus
orticae) utilizando placas de 96 pocillos con papeles de filtro.
Se transfirieron los sobrenadantes (40 \mul) con pipeta sobre
papeles de filtro, seguidos de alícuotas de 20 \mul de dieta
líquida artificial, y las placas se secaron parcialmente bajo
circulación forzada de aire. Se evaluó la mortalidad tras 24 a 48
horas. Se utilizaron diluciones en serie de avermectina como
controles químicos. Se evaluaron gusanos redondos (CE:
Caenorhabditis elegans), nematodos entomopatógenos (HB:
Heterorhabditis bacteriophora) y nematodos noduladores de las
raíces (MJ: Meloidogyne javonica) como suspensiones líquidas
de J2s en placas de 96 pocillos. Se utilizó Avermectin® como control
químico.
Los datos de la tabla 2 muestran la
especificidad de la cepa con número de depósito NRRL 30232 contra el
gusano soldado de la remolacha. La cepa con número de depósito ATCC
49460 es el aislado tipo salvaje de la American Type Culture
Collection del Saccharopolyspora spinosa, un organismo que
produce espinosinas. Ver Sparks et al. (1999),
"Fermentation-derived insecticide control agents:
the spinosyns", en: Biopesticides, Use and Delivery, Hall
F. R. et al., eds. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, pp.
155-170. Tal como se muestra en la tabla 2
siguiente, tanto la cepa con depósito ATCC 49460 como la cepa con
depósito NRRL 30232 se mostraron activas contra el gusano soldado de
la remolacha en el medio 31.
\vskip1.000000\baselineskip
| Replicado | Muestra | Medio | Conc. | CE | CRW | BAW | GPA | SM |
| Rep 1 | 30232 | 31 | 1 x Super | 4 | 4 | 1 | 4 | 4 |
| Rep 1 | 30232 | 38 | 1 x Super | 4 | 3 | 2 | 4 | 4 |
| Rep 1 | 49460 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| Rep 2 | 30232 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| Rep 2 | 30232 | 38 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| Rep 2 | 49460 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| Rep 3 | 30232 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 |
| Rep 3 | 30232 | 38 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| Rep 3 | 49460 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| Rep 4 | 30232 | 31 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| Rep 4 | 30232 | 38 | 1 x Super | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
Para determinar la estabilidad del principio
activo, se ajustaron alícuotas de 1 ml del caldo completo a pH 1 con
ácido clorhídrico 2N (HCl). Tras una hora, se reajustó el pH a 7 con
hidróxido sódico 2N (NaOH). Similarmente, se ajustaron alícuotas de
1 ml del caldo completo a pH 10 con NaOH 2N. Tras 1 hora, se
reajustó el pH a 7 con HCl 2N. La actividad se perdió durante el
tratamiento con ácido, pero se mantuvo en condiciones básicas.
Para determinar la extractabilidad del principio
activo, se partieron alícuotas de 20 ml del caldo
completo con acetato de etilo, 3 veces con 20 ml cada vez (extracto
total de 60 ml), y a continuación con n-butanol
saturado en agua (BuOH), 3 veces con 20 ml cada vez (extracto total
de 60 ml). Todas las fracciones, incluyendo la fase acuosa restante,
se secaron y luego se resuspendieron. Los extractos secos del EtOAc
se suspendieron en acetona:agua, las fracciones de BuOH se
suspendieron en EtOH:agua, y la fase acuosa restante se resuspendió
en agua para retornarla al equivalente de 1x caldo. Las fracciones
combinadas consistían en volúmenes iguales de cada fase. Se
descubrió que la fracción de EtOAc contenía la mayoría del
metabolito activo, restando una pequeña porción en la fracción de
BuOH, al llevarse a cabo el ensayo a 1x. Para concentraciones más
diluidas (1/4x), la actividad sólo se observó en la fracción de
EtOAc.
Se purificaron además por extracción en fase
inversa (RP) y en fase sólida (modelo Bakerbond SPE, octadecilo)
utilizando un gradiente escalonado de 25% de MeOH:agua, 50% MeOH:
agua, 75% de MeOH:agua y 100% de MeOH 10 ml de equivalente de caldo
completo de la fracción de EtOAc en 200 \mul de acetona. El
metabolito activo se eluyó con el 100% de MeOH.
Los datos de la tabla 3 siguiente muestran los
resultados obtenidos de cuatro
extracciones-particiones, dos cromatografías en fase
inversa y dos ensayos de pH.
\vskip1.000000\baselineskip
| Replicado | Muestra | Conc. | BAW |
| Rep 1 | Caldo completo | 1x | 1,0 |
| Rep 1 | EtOAc | 1x | 1,0 |
| Rep 1 | BuOH | 1x | 1,0 |
| Rep 1 | Acuoso | 1x | 4,0 |
| Rep 1 | Combinado | 1x | 1,0 |
| Rep 1 | Caldo completo | 0,25x | 2,0 |
| Rep 1 | EtOAc | 0,25x | 1,0 |
| Rep 1 | BuOH | 0,25x | 4,0 |
| Rep 1 | Acuoso | 0,25x | 4,0 |
| Rep 1 | Combinado | 0,25x | 1,0 |
| Rep 2 | Caldo completo | 0,25x | 2,0 |
| Rep 2 | EtOAc | 0,25x | 3,0 |
| Rep 2 | BuOH | 0,25x | 4,0 |
| Rep 2 | Acuoso | 0,25x | 4,0 |
| Rep 2 | Combinado | 0,25x | 2,0 |
| Rep 3 | Sobrenadante | 0,25x | 1,0 |
| Rep 3 | pH 1 | 0,25x | 4,0 |
| Rep 3 | pH 10 | 0,25x | 2,0 |
| Rep 3 | FI 25% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 3 | FI 50% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 3 | FI 75% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 3 | FI 100% MeOH | 1x | 1,0 |
| Replicado | Muestra | Conc. | BAW |
| Rep 3 | FI Combinada | 1x | 1,0 |
| Rep 4 | Caldo completo | 1/2x | 1,0 |
| Rep 4 | pH 1 | 1/2x | 4,0 |
| Rep 4 | pH 10 | 1/2x | 1,0 |
| Rep 4 | Caldo completo | 1/2x | 2,0 |
| Rep 4 | pH 1 | 1/2x | 4,0 |
| Rep 4 | pH 10 | 1/2x | 2,0 |
| Rep 4 | EtOAc | 1/2x | 2,0 |
| Rep 4 | FI 25% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 4 | FI 50% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 4 | FI 75% MeOH | 1x | 4,0 |
| Rep 4 | FI 100% MeOH | 1x | 2,0 |
| Rep 4 | FI Combinada | 1x | 2,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
A diferencia de los fungicidas típicamente
asociados con Streptomyces galbus, la actividad insecticida
de la cepa con número de depósito NRRL 30232 se mantenía estable
bajo condiciones alcalinas (pH 9-10) e inestables en
condiciones ácidas (pH 1-2).
Los ensayos completos en planta confirmaron la
actividad de la cepa con número de depósito NRRL 30232 contra el
gusano soldado de la remolacha. En primer lugar, se enjuagaron hojas
verdaderas de judía de Lima de Henderson Bush jóvenes durante 3 a 5
segundos en caldo completo, y se dejaron secar al aire. Se colocaron
las hojas en placas de Petri de 50 mm con papel de filtro húmedo y
10 larvas de gusano soldado de la remolacha neonato en estado
larvario. La mortalidad se tasó al cabo de 48 horas. Los resultados
se muestran en la tabla 4 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Conc. | Nº. vivos/Nº muertos | % Mortalidad | Mortalidad promedio |
| NRRL 30232 | 1XCC | 3/7, 2/8, 4/6 | 70, 80, 60 | 70% |
| Javelln® | 200 PPM | 1/9, 2/8, 1/9 | 90, 80, 90 | 87% |
| UTC (H_{2}O) | 0 | 9/1, 9/0, 7/0 | 10, 0, 0 | 3% |
\vskip1.000000\baselineskip
En ensayos similares, la cepa con número de
depósito NRRL 30232 mostraron una actividad larvicida igual o mejor
contra Heliothis virescens, Helicoverpa zea y Anticarsia
gemmatalis.
\newpage
Los caldos completos de la cepa con número de
depósito NRRL 30232 se centrifugaron a 9.000 x g, y el sobrenadante
se pulverizó sobre plantas de judía de Lima de Henderson Bush de una
semana de edad, utilizando un aerógrafo. Las nuevas hojas se dejaron
secar y se cosecharon las hojas verdaderas más pequeñas. Cada hoja
(tres replicados por tratamiento) se colocó en una placa de Petri de
50 ml con un papel de filtro húmedo y aproximadamente 10 larvas
neonatas. Las placas se evaluaron tras permanecer 40 horas en un
incubador (28 \pm 2ºC, fotoperiodo 16:8). Se pulverizaron plantas
de judía grandes, de dos semanas de edad y con hojas verdaderas
plenamente desarrolladas, para examinar la fitotoxicidad potencial.
Los resultados se muestran en la tabla 5 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Nº. vivos/Nº muertos | Mortalidad promedio |
| 30232 1 x Sobrenadante | 1/9, 1/8, 2/7 | 89% |
| 30232 1 x Acetato de etilo | 5/1, 5/4, 4/6 | 40% |
| UTC H_{2}O | 6/1, 8/2, 8/2 | 18% |
\vskip1.000000\baselineskip
Éste es el mismo extracto de EtOAc utilizado en
el ensayo documentado en la tabla 3.
No se observó fitotoxicidad en ninguna de las
muestras. Los ensayos de hojas apoyan los primeros datos que
mostraban que el caldo completo y el sobrenadante eran estables y
potentes. En este ensayo, la fracción de acetato de etilo perdió
cierta actividad al ser pulverizada sobre las hojas.
Ensayos adicionales en plantas completas
llevados a cabo a escala de invernadero confirmaron la protección de
la col china, Brassica rapa, contra el gusano soldado de la
remolacha. Se calibró un pulverizador de laboratorio (Devries
Manufacturing, Holland, Mich.) para que proporcionara un volumen de
pulverización de 90 galones/acre a través de una boquilla de abanico
TEE-JET 8015. Se trataron plantas maduras de col con
agua desionizada (control negativo), con caldo completo de cepa con
número de depósito NRRL 30232, o con Javelin® WG a 1,1 libras/acre
(estándar tóxico). Antes de la aplicación, el caldo completo de cepa
con número de depósito NRRL 30232 se homogeneizó mecánicamente
durante 20 segundos con un Ultra Turrax (Tekmar, Cincinnati, Ohio).
Cada tratamiento se replicó tres veces. Se analizó la uniformidad de
los residuos de pulverización y se dejaron secar antes de colocar
las plantas dentro de un recinto de plexiglás y de malla dentro de
un entorno de invernadero. A continuación, se inoculó cada planta
con aproximadamente 50 larvas neonatas y aproximadamente 50 huevos.
Las plantas se regaron según lo necesario y sin lavar los residuos
de pulverización ni los insectos del follaje.
Las observaciones cualitativas realizadas en el
día 7 indicaban daños significantes por insectos en el tratamiento
de control, daños menores en el tratamiento de estándar tóxico
(Javelin®), y poco o ningún daño en el tratamiento con cepa NRRL
30232. Los resultados indicaron que el tratamiento con cepa con
número de depósito NRRL 30232 proporciona plantas con una mayor
calidad de mercado.
La evaluación del aumento a escala de la
fermentación es un componente muy importante de la evaluación de un
biopesticida potencial (Hofstein y Freidlender (1994),
"Development of production, formulation, and delivery systems for
biofungicides", en: Brighton Crop Protection Conference: Pests
and Disease, BCPC publications, Major Print Ltd., Nottingham,
Reino Unido, pp. 1273-1280). Aumentando el volumen
de la fermentación desde 12 ml en un tubo de 50 ml (T1) hasta 50 ml
en un frasco de agitación de 250 ml (S1) es la primera etapa del
procedimiento de aumento a escala. La concentración de los
sobrenadantes de esta etapa a través de centrifugadoras de alta
velocidad ("speed-vac") no tuvo ningún impacto
negativo sobre la actividad biológica de la cepa con número de
depósito NRRL 30232, proporcionando una respuesta positiva a la
dosis al ensayarse a 2x, 1x y 0,5x. Los ensayos de estabilidad de la
cepa con número de depósito NRRL 30232 a partir de la fermentación
en S1 mostró que la actividad contra el gusano soldado de la
remolacha era estable durante dos o tres semanas cuando se mantenía
refrigerada a 4ºC o congelada a -80ºC. Los resultados se muestran en
las tablas 6 y 7 siguientes.
| Medio | Concentración | Frasco/edad | BAW |
| 31 | 0,5 x Super | S1W1 | 2,0 |
| 31 | 1 x Super | S1W1 | 2,0 |
| 31 | 2 x Super | S1W1 | 1,0 |
| 31 | 1 x Super | T1W1 | 2,0 |
| 31 | 1 x Super | S1W1 | 1,0 |
| 38 | 0,5 x Super | S1W1 | 4,0 |
| 38 | 1 x Super | S1W1 | 2,0 |
| 38 | 2 x Super | S1W1 | 2,0 |
| 38 | 1 x Super | T1W1 | 2,0 |
| 38 | 1 x Super | S1W1 | 2,0 |
| Medio | Concentración | Frasco/edad | CE | CRW | BAW | GPA | SM |
| 31 | 0,5 x Super | S1W2 | 1,0 | ||||
| 31 | 1 x Super | S1W2 | 1,0 | ||||
| 31 | 2 x Super | S1W2 | 1,0 | ||||
| 31 | 2 x Super | S1W2 | 4,0 | 4,0 | 1,0 | 3,0 | 0 |
| 38 | 0,5 x Super | S1W2 | 4,0 | ||||
| 38 | 1 x Super | S1W2 | 1,0 | ||||
| 38 | 2 x Super | S1W2 | 1,0 | ||||
| 38 | 2 x Super | S1W2 | 4,0 | 4,0 | 1,0 | 4,0 | 0 |
La tabla 8 siguiente muestra los resultados
cuando la especificidad de la actividad biológica a partir del
frasco de 250 ml se limitó al gusano soldado de la remolacha, tal
como en la fermentación en tubo de 50 ml inicial.
| Medio | Concentración | Frasco/edad/temp | BAW |
| 31 | 1x | S1W3 - 80ºC | 2,0 |
| 31 | 1x | S1W3 - 4ºC | 2,0 |
| 38 | 1x | S1 W3 - 80ºC | 3,0 |
| 38 | 1x | S1W3 - 4ºC | 3,0 |
La segunda etapa del procedimiento de aumento a
escala consiste en una repetición del volumen de 50 ml en un frasco
de 250 ml (S2). La fermentación concurrente en un tubo de 50 ml
verificó la actividad de la cepa. Los resultados se muestran en la
tabla 9 siguiente.
| Medio | Concentración | Frasco | BAW |
| 31 | 1 x Sobrenadante | S2W1 | 1,0 |
| 31 | 1 x Sobrenadante | T2W1 | 2,0 |
| 31 | 1 x Sobrenadante | S2W1 | 1,0 |
| 38 | 1 x Sobrenadante | S2W1 | 3,0 |
| 38 | 1 x Sobrenadante | T2W1 | 1,0 |
| 38 | 1 x Sobrenadante | S2W1 | 4,0 |
Al incrementarse el volumen, la bioactividad del
medio 38 disminuyó en comparación con el medio 31. Sigmund J. M. y
Hirsch, C. F. (1998), J. Antibiotics
51:829-836, demostraron que la adición de pasta de
tomate era un componente crítico en la producción de actividad
fungicida. En contraste con lo que se observa con la rustmicina
(producida por S. galbus), el aumento de los presentes
inventores a escala mostró que, al aumentar el volumen, el medio
complejo de harina de avena (31) hacía aumentar la actividad
insecticida de la cepa con número de depósito NRRL 30232 por encima
de la del medio 38 a base de pasta de tomate. Dos aumentos
adicionales del volumen confirmaron la eficacia del medio 31. La S3
utilizaba 200 ml de medio 31 en un frasco de 1 l con difusor, y la
S4 utilizaba volúmenes de 500 ml en frascos de Fernbach de 2,8 l sin
difusor. Los resultados se muestran en la tabla 10 siguiente.
| Replicado | Medio | Concentración | Frasco/edad | BAW |
| Rep 1 | 31 | 0,5 x Sobrenadante | S3W2 | 3,0 |
| Rep 1 | 31 | 1 x Sobrenadante | S3W2 | 2,0 |
| Rep 1 | 31 | 2 x Sobrenadante | S3W2 | 2,0 |
| Rep 1 | 31 | 0,5 x Sobrenadante | S4W2 | 2,0 |
| Rep 1 | 31 | 1 x Sobrenadante | S4W2 | 1,0 |
| Rep 2 | 31 | 0,5 x Sobrenadante | S4W2 | 4,0 |
| Rep 2 | 31 | 1 x Sobrenadante | S4W2 | 2,0 |
| Rep 2 | 31 | 2 x Sobrenadante | S4W2 | 2,0 |
El aumento de tamaño de la fermentación, a
través de tres etapas, hasta 500 ml de medio 31 en un frasco de
Fernbach de 2.800 ml no tuvo ningún impacto negativo sobre la
actividad insecticida de la cepa con número de depósito NRRL
30232.
Aunque la presente invención se ha descrito en
detalle a título de ejemplo ilustrativo a efectos de proporcionar
una comprensión más clara de la misma, resultará evidente para los
expertos en la materia que pueden introducirse algunos cambios y
modificaciones. En consecuencia, la descripción y los ejemplos no
deben entenderse como limitativos del alcance de la invención, tal y
como está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (10)
1. Composición que comprende una cepa bacteriana
aislada, seleccionada de entre el grupo constituido por la cepa de
Streptomyces galbus depositada en el laboratorio NRRL con
número de depósito 30232; y mutantes de la cepa depositada en el
laboratorio NRRL con número de depósito 30232, en la que los
mutantes presentan actividad insecticida.
2. Composición según la reivindicación 1, que
comprende además por lo menos un pesticida químico o biológico.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en
la que la composición está formulada como polvos humectables, un
gránulo, una suspensión acuosa, un concentrado emulsificable o una
formulación microencapsulada.
4. Cultivo que comprende la cepa bacteriana
según la reivindicación 1.
5. Procedimiento para prevenir o tratar una
planta, raíz o fruto de una invasión de insecto, que comprende la
aplicación de una cantidad efectiva de la composición según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o del cultivo según la
reivindicación 4, a la planta, raíz o fruto.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el insecto se selecciona de entre el grupo constituido por
lepidópteros, coleópteros y dípteros.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la invasión de lepidópteros está provocada por al menos un
insecto seleccionado de entre el grupo constituido por Spodoptera
exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp., Helicoverpa zea,
Heliothis virescens y Trichoplusia ni.
8. Procedimiento para mejorar la bioactividad
del cultivo biológicamente puro según la reivindicación 1, que
comprende la fermentación del cultivo durante una a tres semanas
antes de su aplicación a una planta, raíz o fruto.
9. Procedimiento para producir un sobrenadante
activo como insecticida, que comprende el cultivo de la cepa según
la reivindicación 1 y el aislamiento del sobrenadante producido por
la cepa, produciéndose de esta manera el sobrenadante.
10. Procedimiento para aislar un metabolito
activo como insecticida, que comprende la separación del metabolito
a partir del sobrenadante según la reivindicación 9 por extracción
en fase sólida y en fase inversa, utilizando un gradiente escalonado
de metanol y agua, aislando de esta manera el metabolito.
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