RU2736827C2 - Композиции, содержащие рекомбинантные клетки bacillus и другой агент биологической борьбы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиции для усиления роста растения и способствования жизнеспособности растения, содержащей рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок, а также по меньшей мере один агент биологической борьбы, выбранный из группы, состоящей из Bacillus subtilis QST713 и Bacillus firmus I-1582 в синергетически эффективном количестве. Также раскрыто семя, покрытое вышеуказанной композицией. Изобретение также относится к способу обработки растения, части растений или локуса, окружающего растение, для усиления роста растения, а также для способствования жизнеспособности растения, предусматривающему использование вышеуказанной композиции. Изобретение позволяет эффективно усиливать рост растения и способствовать жизнеспособности растения. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке заявляется приоритет предварительной заявки на патент США №62/051,911, поданной 17 сентября 2014 г., содержание которой полностью включено в данную заявку путем ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ ЭЛЕКТРОННО

Официальная копия перечня последовательностей подана электронно через EFS-Web в виде ASCII-форматированного перечня последовательности с файлом под названием "BCS149057WO_ST25.txt", который был создан 14 сентября 2015 г., и имеет размер 152 килобайт, и подан одновременно с заявкой. Перечень последовательностей, содержащийся в ASCII-форматированном документе, является частью описания и, таким образом, включена полностью путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (I) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (а) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид; и (б) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и (II) по меньшей мере один дополнительный агент биологической борьбы, выбранный из предпочтительных микроорганизмов, раскрытых в настоящей заявке, и/или мутанта специфического штамма микроорганизма, раскрытого в настоящей заявке, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет способность улучшать рост растения и/или жизнеспособность и/или активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективных количествах. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению этой композиции, а также к способу усиления роста растения, способствованию жизнеспособности растения, и/или уменьшению суммарного поражения растений и частей растений.

Уровень техники

В защите сельскохозяйственных культур, существует постоянная потребность в применяемых препаратах, которые улучшают жизнеспособность и/или рост растений. Более здоровые растения в целом обеспечивают

урожайность и/или лучшее качество растения или его продуктов.

Для способствования жизнеспособности растения, во всем мире используются удобрения, как на основании неорганических, так и органических веществ. Удобрение может представлять собой единственное вещество или композицию, и использоваться для обеспечения растений питательными веществами. Большим открытием в применении удобрений была разработка азотного удобрения Justus von Liebig примерно в 1840 г. Тем не менее, удобрения могут приводить к подкислению почвы и дестабилизации баланса питательных веществ в почве, включая истощение запасов минералов и обогащение солями и тяжелыми металлами. Дополнительно, чрезмерное удобрение может приводить к изменению фауны почвы, а также к загрязнению поверхностной воды и грунтовой воды. Кроме того, вредные для здоровья вещества, такие как нитрат, могут в большом количестве обогащать растения и плоды.

Дополнительно, инсектициды и фунгицид применяются во всем мире для борьбы с вредителями. Синтетические инсектициды или фунгициды часто являются неспецифическими и, следовательно, могут действовать на организмы, отличающиеся от целевых организмов, включая других встречающихся в природе полезных организмов. Вследствие их химической природы, они также могут быть токсичными и бионеразлагаемыми. Пользователи во всем мире все больше и больше осознают потенциальные проблемы воздействия на окружающую среду и здоровье, связанные с остатками химических веществ, в особенности в пищевых продуктах. Это приводит к возрастающему давлению пользователей на уменьшение применения или по меньшей мере количества химических (то есть, синтетических) пестицидов. Таким образом, существует потребность управления пищевыми цепочками, при этом все еще предоставляя возможность эффективной борьбы с вредителями.

Другой проблемой, возникающей вследствие применения синтетических инсектицидов или фунгицидов, является тот факт, что повторное и монопольное применение инсектицида или фунгицидов часто приводит к селекции резистентных животных-вредителей или микроорганизмов. В обычных условиях, такие штаммы также перекрестно резистентны к другим активным компонентам, имеющим такой же способ действия. Таким образом, эффективная борьба с патогенами с помощью указанных активных соединений больше не является возможной. Тем не менее, сложно и дорого разрабатывать активные компоненты, имеющие новые механизмы действия.

Применение агентов биологической борьбы (ВСА) является альтернативой удобрениям и синтетических пестицидов. В некоторых случаях, эффективность ВСА не находится на таком же уровне, что и для удобрений или для общепринятых инсектицидов и фунгицидов, в особенности в случае тяжелого инфекционного давления. Следовательно, при определенных условиях, агенты биологической борьбы, их мутанты и метаболиты, продуцируемые ими, в особенности, в низких нормах внесения, являются не полностью удовлетворительными. Таким образом, существует постоянная потребность в разработке новых альтернативных агентов, улучшающих жизнеспособность растения и/или агентов для защиты растений, которые в некоторых случаях, по меньшей мере помогают выполнить вышеуказанные требования.

Краткое изложение сущности изобретения

С учетом вышеизложенного, в особенности, задачей настоящего изобретения является обеспечение композиций, которые обладают увеличенной способностью улучшать рост растения и/или увеличивать жизнеспособность растения или которые проявляют увеличенную активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам.

Таким образом, было обнаружено, что эти задачи решаются с помощью композиций в соответствии с изобретением, как определено далее. Путем применения а) рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений; фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания; и белок или пептид, который защищает растение от патогена, или вредителя; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) по меньшей мере один предпочтительный штамм, описанный в настоящей заявке, отличающийся от указанных рекомбинантных клеток Bacillus в соответствии с изобретением, способностью усиливать предпочтительно сверхаддитивным образом (I) рост растения, урожайность растений и/или жизнеспособность растения и/или (II) активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам.

Ссылки в настоящей заявке на нацеливающие последовательности, белки экзоспория, фрагменты белков экзоспория, слитые белки, и рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экпрессируют такие слитые белки, не должны рассматриваться как обособленные варианты осуществления изобретения. Вместо этого, для всего настоящего изобретения, ссылки на нацеливающие последовательности, белки экзоспория, фрагменты белков экзоспория, слитые белки, и рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экпрессируют такие слитые белки, должны рассматриваться, как описанные и заявленные только в комбинации (и предпочтительно в синергетической комбинации) с одним или несколькими предпочтительными агентами биологической борьбы, описанными в настоящей заявке. Кроме того, ссылки на "предпочтительные микроорганизмы, описанные в настоящей заявке" или "на предпочтительные агенты биологической борьбы, описанные или раскрытые в настоящей заявке" охватывают агенты биологической борьбы и микроорганизмы, включая их штаммы, мутанты и метаболиты, как описано в абзацах [000183]-[000226] ниже.

Настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую а) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, и фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания или белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) по меньшей мере один дополнительный и другой предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и/или мутант специфического штамма микроорганизма, раскрытый в настоящей заявке, имеющий все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере один метаболит, продуцируемый соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективных количествах.

В некоторых вариантах осуществления, нацеливающая последовательность включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 1; нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1; нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 из SEQ ID NO: 1; нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 из SEQ ID NO: 1; нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 из SEQ ID NO: 1; нацеливающая последовательность, содержащая SEQ ID NO: 1; или белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 2.

В других вариантах осуществления, рекомбинантные клетки Bacillus представляют собой клетки представителя семейства Bacillus cereus, такого как Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis и их комбинации. В дальнейшем варианте осуществления, рекомбинантные клетки Bacillus представляют собой клетки Bacillus thuringiensis ВТ013А.

В определенных аспектах, слитый белок включает фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, выбранный из группы, включающей ацетоин-редуктазу, индол-3-ацетамид-гидролазу, триптофан-монооксигеназу, ацетолактат-синтетазу, α-ацетолактат-декарбоксилазу, пируват-декарбоксилазу, диацетил-редуктазу, бутандиол-дегидрогеназу, аминотрансферазу, триптофан-декарбоксилазу, аминоксидазу, индол-3-пируват-декарбоксилазу, индол-3-ацетальдегид дегидрогеназу, оксидазу боковой цепи триптофана, нитрил-гидролазу, нитрилазу, пептидазу, протеазу, аденозинфосфат-изопентенил-трансферазу, фосфатазу, аденозин-киназу, аденин-фосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5'-рибонуклеотид-фосфогидролазу, аденозин-нуклеозидазу, зеатин цис-транс-изомеразу, зеатин О-гликозилтрансферазу, β-глюкозидазу, цис-гидроксилазу, CK цис-гидроксилазу, CK N-гликозилтрансферазу, 2,5-рибонуклеотид фосфогидролазу, аденозин-нуклеозидазу, пуриннуклеозид фосфорилазу, зеатин редуктазу, гидроксиламин редуктазу, 2-оксоглутарат диоксигеназу, гиббереллиновую 2В/3В гидролазу, гиббереллин 3-оксидазу, гиббереллин 20-оксидазу, хитозаназу, хитиназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, и фермент, вовлеченный в продукцию nod-фактора.

В других аспектах, слитый белок включает фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания, выбранный из группы, включающей целлюлазу, липазу, лигнин-оксидазу, протеазу, гликозид гидролазу, фосфатазу, нитрогеназу, нуклеазу, амидазу, нитрат-редуктазу, нитрит-редуктазу, амилазу, аммоний-оксидазу, лигниназу, глюкозидазу, фосфолипазу, фитазу, пектиназу, глюканазу, сульфатазу, уреазу, ксиланазу, и сидерофор.

В некоторых вариантах осуществления, слитый белок экспрессируется под контролем промотора спорообразования, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория, или фрагмента белка экзоспория слитого белка. Слитый белок может экспрессироваться под контролем высокоэкспрессируемого промотора спорообразования. В определенных аспектах, высокоэкспрессируемый промотор спорообразования включает промоторную последовательность сигма-K полимеразы, специфической для спорообразования. В других аспектах, промотор спорообразования включает нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность, по меньшей мере 85% идентичность, по меньшей мере 90% идентичность, по меньшей мере 95% идентичность, по меньшей мере 96% идентичность, по меньшей мере 97% идентичность, по меньшей мере 98% идентичность, или по меньшей мере 99% идентичность с нуклеотидной последовательностью с любой из SEQ ID NOS: 85-103. В некоторых вариантах осуществления, промотор спорообразования включает нуклеотидную последовательность, имеющую 100% идентичность с нуклеотидной последовательностью с любой из SEQ ID NOS: 85-103.

В других вариантах осуществления, по меньшей мере один агент биологической борьбы представляет собой штамм Bacillus subtilis или Bacillus amyloliquefaciens, который продуцирует фенгицин или соединение типа плипастатина, соединение типа итурина, и/ соединение типа сурфактина. Для справки, см. следующую обзорную статью: Ongena, М., и др., “Bacillus Lipopeptides: Versatile Weapons for Plant Disease Biocontrol," Trends in Microbiology, Tom 16, №3, март 2008 г., cc. 115-125. Штаммы Bacillus, способные продуцировать липопептиды, включают Bacillus subtilis QST713, штамм Bacillus amyloliquefaciens D747 (доступный в виде BACSTAR^® от Etec Crop Solutions, NZ и также доступный в виде DOUBLE NICKEL™ от Certis, US); Bacillus subtilis MBI600 (доступный в виде SUBTILEX^® от Becker Underwood, US EPA Рег. №71840-8); Bacillus subtilis Y1336 (доступный в виде BIOBAC^® WP от Bion-Tech, Тайвань, зарегистрированный в виде биологического фунгицида в Тайвани под Регистрационными номерами 4764, 5454, 5096 и 5277); Bacillus amyloliquefaciens, в особенности штамм FZB42 (доступный в виде RHIZOVITAL^® от ABiTEP, DE); и Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens FZB24 доступен от Novozymes Biologicals Inc. (Salem, Virginia) или Syngenta Crop Protection, LLC (Greensboro, North Carolina) в виде фунгицида TAEGRO^® или TAEGRO^® ECO (EPA Регистрация №70127-5).

В еще других вариантах осуществления, по меньшей мере один агент биологической борьбы выбирают из группы, включающей штамм Bacillus pumilus QST2808, штамм Bacillus subtilis QST713, штамм Bacillus subtilis QST30002, штамм Bacillus subtilis QST30004, Streptomyces microflavus штамм NRRL B-50550, Streptomyces microflavus штамм M, штамм Bacillus firmus I-1582, их мутанты, имеющие все идентификационные характеристики соответствующих штаммов, и по меньшей мере один метаболит, продуцируемый соответствующими штаммами, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам.

В некоторых вариантах осуществления, композиция согласно настоящему изобретению включает а) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, и фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания; или белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) штамм Bacillus firmus 1-1582 в синергетически эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления, композиция согласно настоящему изобретению включает а) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, и фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания или по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) штамм Bacillus subtilis QST713 в синергетически эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления, композиция согласно настоящему изобретению включает а) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, и фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания или по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) штамм Bacillus pumilus QST2808 в синергетически эффективном количестве.

В еще других вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно включает в) по меньшей мере один фунгицид и/или г) по меньшей мере один инсектицид. По меньшей мере один фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид могут быть синтетическими. В одном аспекте такого варианта осуществления, агент биологической борьбы и дополнительный инсектицид такой композиции включают штамм Bacillus firmus I-1582 и клотианидин, соответственно.

В предпочтительном аспекте вышеописанных вариантов осуществления изобретения (I) агент биологической борьбы представляет собой Bacillus subtilis QST713 или мутанты, которые имеют все идентификационные характеристики Bacillus subtilis QST713 и/или последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% с Bacillus subtilis QST713; (II) нацеливающая последовательность включает аминокислотную

последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (III) стимулирующий рост растений белок или пептид включает эндоглюканазу, фосфолипазу или хитозиназу, предпочтительно с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 95% с SEQ ID NO: 107, 108 и 109, соответственно; и (IV) рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus включают клетки Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides. В еще другом предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus представляют собой клетки Bacillus thuringiensis ВТ013А.

В предпочтительном аспекте вышеописанных вариантов осуществления изобретения (I) агент биологической борьбы представляет собой Bacillus firmus I-1582 или мутанты, которые имеют все идентификационные характеристики Bacillus firmus I-1582 и/или последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% с Bacillus firmus 1-1582; (II) нацеливающая последовательность включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (III) стимулирующий рост растений белок или пептид включает эндоглюканазу, фосфолипазу или хитозиназу, предпочтительно с последовательностью, идентичную по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% с SEQ ID NO: 107, 108 и 109, соответственно; и (IV) рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus включают клетки Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides. В еще другом предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus представляют собой клетки Bacillus thuringiensis ВТ013А. В еще другом аспекте этого варианта осуществления композиция дополнительно включает клотианидин.

В предпочтительном аспекте вышеописанных вариантов осуществления изобретения (I) агент биологической борьбы представляет собой Bacillus pumilus QST2808 или мутанты, которые имеют все идентификационные характеристики Bacillus pumilus QST2808 и/или последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% с Bacillus pumilus QST2808; (II) нацеливающая последовательность включает аминокислотную

последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (III) стимулирующий рост растений белок или пептид включает эндоглюканазу, фосфолипазу или хитозиназу, предпочтительно с последовательностью, идентичную по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% с SEQ ID NO: 107, 108 и 109, соответственно; и (IV) рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus включают клетки Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides. В еще другом предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантные клетки представителя семейства Bacillus cereus представляют собой клетки Bacillus thuringiensis ВТ013А.

В некоторых аспектах, композиция дополнительно включает по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из группы, включающей модифицирующие агенты, растворители, самопроизвольные промоторы, носители, эмульсификаторы, диспергирующие вещества, вещества, защищающие от замерзания, загустители и адъюванты.

В других аспектах, изобретение относится к семени, обработанному любой из композиций, описанных в настоящей заявке.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению описанных композиций в качестве фунгицида и/или инсектицида. В определенных аспектах, описанные композиции используются для уменьшения суммарного поражения растений и частей растений, а также потерей собранных фруктов или овощей, вызванных насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами. В других аспектах, описанные композиции используются для усиления роста растения и/или способствования жизнеспособности растения.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к способу обработки растения, части растения, такой как семена, корень, ризома, клубнелуковица, луковица или клубень, и/или локуса, на котором или возле которого растение или части растения растут, такого как почва, для усиления роста растения и/или способствования жизнеспособности растения, включающий стадию одновременного или последовательного использования на растении, части растения и/или локусах растения: а) рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений; фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания; и белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) по меньшей мере одного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и/или мутанта специфического штамма микроорганизма, раскрытого в настоящей заявке, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективном количестве.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ уменьшения суммарного поражения растений и частей растений, а также потерей собранных фруктов или овощей, вызванных насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами, включающий стадию одновременного или последовательного использования на растении, части растения, такой как семена, корень, ризома, клубнелуковица, луковица или клубень, и/или локуса, на котором или возле которого растение или части растения растут, такого как почва: а) рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений; фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания; и белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий клеток Bacillus; и б) по меньшей мере одного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и/или мутанта специфического штамма микроорганизма, раскрытого в настоящей заявке, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективном количестве.

В вышеприведенных абзацах, термин "включают" или любое его производное (например, включающий, включает) может быть заменен на "состоят из" или его применимое соответствующее производное.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности амино-концевой части штамма Bacillus anthracis BclA и с соответствующим участком из различных белков экзоспория из представителей семейства Bacillus cereus.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В целом "пестицидный" обозначает способность вещества повышать смертность или ингибировать скорость роста вредителей растений. Термин используется в настоящей заявке, для описания свойства вещества проявлять активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам. В контексте настоящего изобретения термин "вредители" включает насекомых, клещей, нематод и/или фитопатогенов.

Как используется в настоящей заявке, "биологическая борьба" определяется как борьба с патогеном и/или насекомым и/или клещом и/или нематодой путем использования второго организма. Известные механизмы биологической борьбы включают бактерии, которые борются с корневой гнилью путем увеличения конкуренции с грибками за площадь или питательные вещества на поверхности корня. Бактериальные токсины, такие как антибиотики, используются для борьбы с патогенами. Токсин может быть выделен и использоваться непосредственно на растении или могут вводиться виды бактерий таким образом, что они продуцируют токсин in situ. Другие возможности осуществления биологической борьбы включают применение определенных грибов, продуцирующих компоненты, активные по отношению к целевому фитопатогену, насекомому, клещу или нематоде, или нападению целевого вредителя /патогена. "Биологическая борьба", как используется в связи с настоящим изобретением, также может охватывать микроорганизмы, имеющие благоприятное воздействие на жизнеспособность растения, рост, мощность, ответную реакцию на стресс или урожайность. Пути применения включают нанесение распылением, внесение в почву и протравливание семян.

Термин "метаболит" относится к любому соединению, веществу или побочному продукту ферментации указанного микроорганизма, который имеет пестицидную, фунгицидную или нематицидную активность или способность увеличивать жизнеспособность растения или повышать урожайность растений. Термин "мутант" относится к варианту родительского штамма, а также к способам получения мутанта или варианта, в котором пестицидная активность больше, чем экпрессируемая родительским штаммом. "Родительский штамм" определяется в настоящей заявке как исходный штамм перед мутагенезом или депонированный штамм. Для получения таких мутантов, родительский штамм может быть обработан химическим веществом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, этилметансульфон, или путем облучения, используя гамма-, рентгеновское, или УФ-облучение, или с помощью других методов, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области техники.

"Вариант" представляет собой штамм, имеющий все идентификационные характеристики номеров доступа NRRL или АТСС, как указано в этом тексте и может быть идентифицирован как имеющий геном, который гибридизируется в условиях высокой жесткости с геномом номеров доступа NRRL или АТСС.

"Гибридизация" относится к реакции, в которой один или несколько полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который стабилизируется с помощью водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Образование водородных связей может происходить путем спаривания оснований по Уотсону-Крику, связывания Hoogstein, или любым другим способом, специфическим для последовательности. Комплекс может включать две цепи, образующие дуплексную структуру, три или более цепей, образующие многоцепочечный комплекс, единичную само-гибридизирующуюся цепь, или любую их комбинацию. Реакции гибридизации можно осуществлять в условиях различной "жесткости". В целом, реакции гибридизации при низкой жесткости осуществляют приблизительно при 40°С в 10 X SSC или растворе эквивалентной ионной силы/температуре. Гибридизацию умеренной жесткости обычно осуществляют приблизительно при 50°С в 6 X SSC, и реакцию гибридизации сильной жесткости, как правило, осуществляют приблизительно при 60°С в 1 X SSC.

Вариант указанного номер доступа NRRL или АТСС также может быть определен как штамм, имеющий геномную последовательность, которая имеет более чем на 85%, более предпочтительно, более чем на 90% или более предпочтительно, более чем на 95% идентичность последовательности с геномом указанного номер доступа NRRL или АТСС. Полинуклеотид или полинуклеотидный участок (или полипептид или полипептидный участок), имеющий определенный процент (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) "идентичности последовательности" к другой последовательности обозначает, что, при выравнивании, процент оснований (или аминокислот) является одинаковым при сравнении двух последовательностей. Это выравнивание и процент гомологии или идентичность последовательности может быть определено, используя программное обеспечение, известное в данной области техники, например, которое описано в Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., ред., 1987) дополнение 30, раздел 7.7.18, Таблица 7.7.1.

NRRL представляет собой сокращение для Коллекции запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service Culture Collection), которая имеет адрес National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.

АТСС представляет собой сокращение для Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), которая имеет адрес АТСС Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 10110, U.S.A.

CNCM представляет собой сокращение для Национальной коллекции культур микроорганизмов Collection (Nationale de Cultures de Microorganismes), Institute Pasteur, France, которая имеет адрес Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France.

Все штаммы, описанные в настоящей заявке и имеющие номер доступа, в котором префикс представляет собой NRRL, АТСС или CNCM, были задепонированы в вышеописанном соответствующем депозитарном учреждении в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

«Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений", включает любой фермент, который катализирует любую стадию в биологическом синтетическом пути для соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует превращение неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения на активную или более активную форму соединения. Такие соединения включают, например, но не ограничиваясь только ими, низкомолекулярные растительные гормоны, такие как ауксины и цитокинины, биологически активные пептиды, и небольшие молекулы, стимулирующие рост растений, синтезируемые бактериями или грибами в ризосфере (например, 2,3-бутандиол).

«Белок или пептид, который усиливает иммунную систему растения", как используется в настоящей заявке, включает любой белок или пептид, который имеет благоприятный эффект на иммунную систему растения.

Термин "стимулирующий рост растений белок или пептид", как используется в настоящей заявке, включает любой белок или пептид, который увеличивает рост растения в растении, подвергнутому воздействию белка или пептида.

Термины "способствующий росту растения" и "стимулирующий рост растения" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо, и относится к способности усиливать или повышать по меньшей мере одну из характеристик растения: высоту, вес, размер листьев, размер корней, или размер стебля, увеличивать выход белка из растения или увеличивать урожай зерна белка из растения.

«Белок или пептид, который защищает растение от патогена", как используется в настоящей заявке, включает любой белок или пептид, который делает растение, подвергнутое воздействию белка или пептида, менее чувствительным к инфицированию патогеном.

«Белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растений", как используется в настоящей заявке, включает любой белок или пептид, который делает растение, подвергнутое воздействию белка или пептида, более устойчивым к стрессу.

Термин "белок или пептид, связывающийся с растением," относится к любому пептиду или белку, способному специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, корни или воздушные части растения, такие как листвяной покров, стебли, цветы или плоды) или растительным материалом.

Термин "нацеливающая последовательность", как используется в настоящей заявке, относится к полипептидной последовательности, которая приводит к локализации более длинного полипептида или белка на экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus.

Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, экспрессирующие слитые белки

Слитые белки содержат нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, который (ая) нацеливает слитый белок на экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus и: (а) стимулирующий рост растений белок или пептид; (б) белок или пептид, который защищает растение от патогена; (в) белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растения; (г) белок или пептид, связывающийся с растением; или (д) белок или пептид, который усиливает иммунную систему растения. При экспрессии в бактериях представителях семейства Bacillus cereus, эти слитые белки нацеливаются на слой экзоспория споры и физически располагаются таким образом, что белок или пептид выводится на наружную сторону споры.

Эта система отображения экзоспория Bacillus (BEMD) может использоваться для доставки пептидов, ферментов, и других белков растениям (например, на листья, плоды, цветы, стебли, или корни растений) или на среду роста растения, такую как почва. Пептиды, ферменты, и белки, доставляемые в почву или другую среду для роста растения таким образом, продолжают существовать и проявляют активность в почве в течение длительного периода времени. Введение рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, экспрессирующих слитые белки, описанных в настоящей заявке, в почву или ризосферу растения, приводит к благоприятному усилению роста растения во многих различных почвенных условиях. Применение BEMD для создания этих ферментов предоставляет им возможность продолжать проявлять их благоприятные результаты на растение и ризосферу в течение первых месяцев жизни растений.

Нацеливающая последовательность, белки экзоспория, и фрагменты белков экзоспория

Для удобства использования, номера SEQ ID NOS для последовательностей пептидов и белков, на которые ссылаются на настоящей заявке, перечислены в таблице 1 ниже.

АА = аминокислоты

*В. anthracis Sterne штамм BclA имеет 100% идентичность последовательности с В. thuringiensis BclA. Таким образом, SEQ ID NOS: 1, 2, и 59 также представляет собой аминокислоты 1-41 из В. thuringiensis BclA, полноразмерный В. thuringiensis BclA, и аминокислоты 1-196 из В. thuringiensis BclA, соответственно. Аналогичным образом, SEQ ID NO: 60 также представляет собой метиониновый остаток плюс аминокислоты 20-35 из В. thuringiensis BelA. ** гипотетический белок TIGR03720 В. mycoides имеет 100% идентичность последовательности с В. mycoides гипотетический белок WP003189234. Таким образом, SEQ ID NOs: 57 и 58 также представляет собой аминокислоты 1-136 гипотетического белка В. mycoides WP003189234 и полноразмерного гипотетического белка В. mycoides WP003189234, соответственно.

Bacillus представляет собой род палочкообразных бактерий. Семейство бактерий Bacillus cereus включает виды Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus toyoiensis и Bacillus weihenstephensis. В стрессовых условиях окружающей среды, бактерии семейства Bacillus cereus подвергаются спорообразованию и образуют овальные эндоспоры, которые могут оставаться спящими в течение длительного периода времени. Наружный слой эндоспор известен как экзоспорий и включает базальный слой, окруженный наружным ворсом волосообразным выступающих частей. Филаменты на волосообразном ворсе главным образом образованы коллагеноподобным гликопротеином BclA, в то время как базальный слой состоит из нескольких различных белков. Другой коллагено-подобный белок, BclB, также присутствует в экзоспории и экспонирован на эндоспорах представителей семейства Bacillus cereus.

Было показано, что BclA, основной компонент поверхностного ворса, присоединен на экзоспории с его амино-концом (N-конец), расположенным на базальном слое, и его карбокси-концом (С- конец), простирающимся наружу из споры.

Ранее было открыто, что определенные последовательности из N-концевых участков из BclA и BclB могут использоваться для нацеливания пептида или белка на экзоспорий эндоспор Bacillus cereus (см. Опубликованные заявки на патенты США №№2010/0233124 и 2011/0281316, и Thompson, et al., "Targeting of the BclA and BclB Proteins to the Bacillus anthracis Spore Surface," Molecular Microbiology, 70(2):421-34 (2008), полное содержание каждой из них таких образом включено в настоящую заявку путем ссылки). Также было обнаружено, что BetA/BAS3290 белок из Bacillus anthracis локализован на экзоспории.

Было обнаружено, что аминокислот 20-35 из BclA из штамма Bacillus anthracis Sterne, достаточно для нацеливания на экзоспорий. Выравнивание последовательности аминокислот 1-41 из BclA (SEQ ID NO: 1) с соответствующими N-концевыми участками нескольких других белков экзоспория семейства Bacillus cereus и белков семейства Bacillus cereus, имеющих родственные последовательности, представлены на Фигуре 1. Как можно увидеть на фигуре 1, существует высокогомологичный участок среди всех белков в участке, соответствующем аминокислотам 20-41 из BclA. Тем не менее, в этих последовательностях, аминокислоты, соответствующие аминокислотам 36-41 из BclA содержат вторичную структуру и не являются необходимыми для локализации слитого белка на экзоспории. Консервативный участок нацеливающей последовательности из BclA (аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1) выделены жирным шрифтом на фигуре 1 и соответствует минимальной нацеливающей последовательности, необходимой для локализации на экзоспории. Более высоко консервативный участок, содержащий аминокислоты 25-35 из BclA в пределах нацеливающей последовательности, подчеркнуты в последовательностях на фигуре 1, и представляет собой последовательность распознавания для ExsFA/BxpB/ExsFB и гомологи, которые нацеливают и собирают описанные белки на поверхности экзоспория Аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NOS: 3, 5, и 7 на фигуре 1, представляет собой аминокислоты 1-33 штамма Bacillus anthracis BetA/BAS3290, метионин с последующими аминокислотами 2-43 штамма Bacillus anthracis BAS4623, и аминокислотами 1-34 штамма Bacillus anthracis BclB, соответственно. (Для BAS4623, было обнаружено, что замена валина, присутствующего в 1 положении в нативном белке, на метионин приводит к лучшей экспрессии.) Как можно увидеть на фигуре 1, каждая из этих последовательностей содержит консервативный участок, соответствующий аминокислотам 20-35 из BclA (SEQ ID NO: 1; выделено жирным шрифтом), и более высоко консервативный участок, соответствующий аминокислотам 20-35 из BclA (почеркнуто).

Дополнительные белки из представителей семейства Bacillus cereus также содержат консервативный нацеливающий участок. В особенности, на фигуре 1, SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислоты 1-30 штамма Bacillus anthracis BAS1882, SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислоты 1-39 продукта гена Bacillus weihenstephensis KBAB4 2280, SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислоты 1-39 продукта гена Bacillus weihenstephensis KBAB4 3572, SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислоты 1-49 лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислоты 1-33 лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD166, SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислоты 1-39 гипотетического белка IKG 04663 Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислоты 1-39 β-пропеллерного белка Bacillus weihenstephensis КВАВ4 YVTN, SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bcerkbab4_2363 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bcerkbab4_2131 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислоты 1-36 тройного спирального повтора, содержащего коллаген, Bacillus weihenstephensis КВАВ4, SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислоты 1-39 гипотетического белка bmyco0001_21660 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bmyc0001_22540 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислоты 1-21 гипотетического белка bmyc0001_21510 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 35 представляет собой аминокислоты 1-22 коллагенового белка тройного спирального повтора Bacillus thuringiensis 35646, SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислоты 1-35 гипотетического белка WP 69652 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислоты 1-41 лидера экзоспория WP016117717 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислоты 1-49 пептида экзоспория WP002105192 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 49 представляет собой аминокислоты 1-38 гипотетического белка WP87353 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 51 представляет собой аминокислоты 1-39 пептида экзоспория 02112369 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 53 представляет собой аминокислоты 1-39 белка экзоспория WP016099770 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 55 представляет собой аминокислоты 1-36 гипотетического белка YP006612525 Bacillus thuringiensis, и SEQ ID NO: 57 представляет собой аминокислоты 1-136 гипотетического белка TIGR03720 Bacillus mycoides. Как показано на фигуре 1, каждый из N-концевых участков этих белков содержит участок, который консервативный с аминокислотами 20-35 из BclA (SEQ ID NO: 1), и более высоко консервативный участок, соответствующий аминокислотам 25-35 из BclA.

Любую часть из BclA, которая включает аминокислоты 20-35, можно использовать как нацеливающую последовательность. Дополнительно, полноразмерные белки экзоспория или фрагменты белков экзоспория можно использовать для нацеливания слитых белков на экзоспорий. Таким образом, полноразмерный BclA или фрагмент из BclA, который включает аминокислоты 20-35, можно использовать для нацеливания на экзоспорий. Например, полноразмерный BclA (SEQ ID NO: 2) или фрагмент среднего размера из BclA, в котором отсутствует карбокси-конец, такой как SEQ ID NO: 59 (аминокислоты 1-196 из BclA) можно использовать для нацеливания слитых белков на экзоспорий. Фрагменты средних размеров, такие как фрагмент из SEQ ID NO: 59, имеют меньше вторичной структуры, чем полноразмерный BclA, и было обнаружено, что они являются пригодными для применения в качестве нацеливающей последовательности. Нацеливающая последовательность также может включать более короткие участки из BclA, которые включают аминокислоты 20-35, такие как SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 1-41 из BclA), аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 1, аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 60 (метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 20-35 из BclA). Даже более короткие фрагменты из BclA, которые включают только некоторые из аминокислот 20-35, также проявляют способность нацеливания слитых белков на экзоспорий. Например, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 22-31 из SEQ ID NO: 1, аминокислоты 22-33 из SEQ ID NO: 1, или аминокислоты 20-31 из SEQ ID NO: 1.

Альтернативно, любая часть из BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, продукта гена KBAB4 2280, продукта гена KBAB4 3572, лидерного пептида экзоспория В. cereus VD200, лидерного пептида экзоспория В. cereus VD166, гипотетического белка IKG_04663 В. cereus VD200, YVTN β-пропеллерного белка В. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bcerkbab4_2363 В. weihenstephensis КВАВ4, гипотетического белка bcerkbab4_2131 В. weihenstephensis KBAB4, тройного спирального повтора, содержащего коллаген, В. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bmyco0001_21660 В. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_22540 В. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_21510 В. mycoides 2048, коллагенового белка тройного спирального повтора В. thuringiensis 35646, гипотетического белка WP 69652 В. cereus, лидера экзоспория WP016117717 В. cereus, пептида экзоспория WP002105192 В. cereus, гипотетического белка WP87353 В. cereus, пептида экзоспория 02112369 В. cereus, белка экзоспория WP016099770 В. cereus, гипотетического белка YP006612525 В. thuringiensis, или гипотетического белка TIGR03720 В. mycoides, который включает аминокислоты, соответствующие аминокислотам 20-35 из BclA, может служить в качестве нацеливающей последовательности. Как можно увидеть на фигуре 1, аминокислоты 12-27 из BetA/BAS3290, аминокислоты 23-38 из BAS4623, аминокислоты 13-28 из BclB, аминокислоты 9-24 из BAS1882, аминокислоты 18-33 продукта гена КВАВ4 2280, аминокислоты 18-33 продукта гена КВАВ4 3572, аминокислоты 28-43 лидерного пептида экзоспория В. cereus VD200, аминокислоты 12-27 лидерного пептида экзоспория В. cereus VD166, аминокислоты 18-33 гипотетического белка IKG 04663 В. cereus VD200, аминокислоты 18-33 YVTN β-пропеллерного белка В. weihenstephensis КВАВ4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2363 В. weihenstephensis КВАВ4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 В. weihenstephensis КВАВ4, аминокислоты 15-30 тройного спирального повтора, содержащего коллаген, В. weihenstephensis КВАВ4, аминокислоты 18-33 гипотетического белка bmyco0001_21660 В. mycoides 2048, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 В. mycoides 2048, аминокислоты 1-15 гипотетического белка bmyc0001_21510 В. mycoides 2048, аминокислоты 1-16 коллагенового белка тройного спирального повтора В. thuringiensis 35646, аминокислоты 14-29 гипотетического белка WP 69652 В. cereus, аминокислоты 20-35 лидера экзоспория WP016117717 В. cereus, аминокислоты 28-43 пептида экзоспория WP002105192 В. cereus, аминокислоты 17-32 гипотетического белка WP87353 В. cereus, аминокислоты 18-33 пептида экзоспория 02112369 В. cereus, аминокислоты 18-33 белка экзоспория WP016099770 В. cereus, аминокислоты 15-30 гипотетического белка YP006612525 В. thuringiensis, и аминокислоты 115-130 гипотетического белка TIGR03720 В. mycoides соответствуют аминокислотам 20-35 из BclA. Таким образом, любая часть этих белков, которая включает вышеперечисленные соответствующие аминокислоты, может служить в качестве нацеливающей последовательности.

Кроме того, любая аминокислотная последовательность, содержащая аминокислоты 20-35 из BclA, или любые из вышеперечисленных соответствующих аминокислот, может служить в качестве нацеливающей последовательности.

Таким образом, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 1, аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 60, аминокислоты 22-31 из SEQ ID NO: 1, аминокислоты 22-33 из SEQ ID NO: 1, или аминокислоты 20-31 из SEQ ID NO: 1. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислот 1-35 из SEQ ID NO: 1, аминокислот 20-35 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 60. Альтернативно, нацеливающая последовательность может состоять из аминокислот 22-31 из SEQ ID NO: 1, аминокислот 22-33 из SEQ ID NO: 1, или аминокислот 20-31 из SEQ ID NO: 1. Альтернативно, белок экзоспория может включать полноразмерный BclA (SEQ ID NO: 2), или фрагмент белка экзоспория может включать фрагмент среднего размера из BclA, в котором отсутствует карбокси-конец, такой как SEQ ID NO: 59 (аминокислоты 1-196 из BclA). Альтернативно, фрагмент белка экзоспория может состоять из SEQ ID NO: 59.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-27 из SEQ ID NO: 3, аминокислоты 12-27 из SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 3, или белок экзоспория может включать полноразмерный BetA/BAS3290 (SEQ ID NO: 4). Также было обнаружено, что метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 12-27 из BetA/BAS3290 можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 61. Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 14-23 из SEQ ID NO: 3, аминокислоты 14-25 из SEQ ID NO: 3, или аминокислоты 12-23 из SEQ ID NO: 3.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-38 из SEQ ID NO: 5, аминокислоты 23-38 из SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 5, или белок экзоспория может включать полноразмерный BAS4623 (SEQ ID NO: 6).

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-28 из SEQ ID NO: 7, аминокислоты 13-28 из SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 7, или белок экзоспория может включать полноразмерный BclB (SEQ ID NO: 8).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-24 из SEQ ID NO: 9, аминокислоты 9-24 из SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 9, или белок экзоспория может включать полноразмерный BAS1882 (SEQ ID NO: 10). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 из BAS1882, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 69.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO:11, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 11, или белок экзоспория может включать полноразмерный продукт гена В. weihenstephensis КВАВ4 2280 (SEQ ID NO: 12). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 продукта гена В. weihenstephensis КВАВ4 2280, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 62.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 13, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO:13, или белок экзоспория может включать полноразмерный продукт гена В. weihenstephensis КВАВ4 3572 (SEQ ID NO:14). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 продукта гена В. weihenstephensis КВАВ4 3572, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 63.

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-43 из SEQ ID NO: 15, аминокислоты 28-43 из SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 15, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидерный пептид экзоспория В. cereus VD200 (SEQ ID NO: 16).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-27 из SEQ ID NO: 17, аминокислоты 12-27 из SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 17, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидерный пептид экзоспория В. cereus VD166 (SEQ ID NO: 18). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 12-27 лидерного пептида экзоспория В. cereus VD166, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 64.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 19, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 19, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок IKG_04663 В. cereus VD200 (SEQ ID NO: 20).

Альтернативно, нацеливающая последовательность включает аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 21, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 21, или белок экзоспория может включать полноразмерный YVTN β-пропеллерного белка В. weihenstephensis КВАВ4 (SEQ ID NO: 22). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 YVTN β-пропеллерного белка В. weihenstephensis КВАВ4, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 65.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-24 из SEQ ID NO: 23, аминокислоты 9-24 из SEQ ID NO: 23, или SEQ ID NO: 23, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2363 В. weihenstephensis КВАВ4 (SEQ ID NO: 24). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2363 В. weihenstephensis КВАВ4, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 66.

Нацеливающая последовательность включает аминокислоты 1-24 из SEQ ID NO: 25, аминокислоты 9-24 из SEQ ID NO: 25, или SEQ ID NO: 25, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2131 В. weihenstephensis КВАВ4 (SEQ ID NO: 26). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 В. weihenstephensis КВАВ4, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 67.

Альтернативно, нацеливающая последовательность включает аминокислоты 1-30 из SEQ ID NO: 27, аминокислоты 15-30 из SEQ ID NO: 27, или SEQ ID NO: 27, или белок экзоспория может включать полноразмерный тройного спирального повтора, содержащего коллаген, В. weihenstephensis КВАВ4 (SEQ ID NO: 28).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 29, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 29, или SEQ ID NO: 29, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bmyco0001_21660 В. mycoides 2048 (SEQ ID NO:30).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-24 из SEQ ID NO: 31, аминокислоты 9-24 из SEQ ID NO: 31, или SEQ ID NO:31, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_22540 В. mycoides 2048 (SEQ ID NO:32). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 В. mycoides 2048, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 68.

Альтернативно, нацеливающая последовательность включает аминокислоты 1-15 из SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, или белок экзоспория включает полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_21510 В. mycoides 2048 (SEQ ID NO: 34).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-16 из SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, или белок экзоспория может включать полноразмерный коллагеновый белок тройного спирального повтора В. thuringiensis 35646 (SEQ ID NO:36).

Нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-29 из SEQ ID NO: 43, аминокислоты 14-29 из SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 43, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок WP_69652 В. cereus (SEQ ID NO: 44).

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 45, аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 45, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидера экзоспория WP016117717 В. cereus (SEQ ID NO: 46). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 20-35 лидера экзоспория WP016117717 В. cereus, также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может включать SEQ ID NO: 70.

Нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-43 из SEQ ID NO: 47, аминокислоты 28-43 из SEQ ID NO: 47, или SEQ ID NO: 47, или белок экзоспория может включать полноразмерный пептида экзоспория WP002105192 В. cereus (SEQ ID NO: 48).

Нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-32 из SEQ ID NO: 49, аминокислоты 17-32 из SEQ ID NO: 49, или SEQ ID NO: 49, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок WP87353 В. cereus (SEQ ID NO: 50).

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 51, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 51, или SEQ ID NO: 51, или белок экзоспория может включать полноразмерный пептида экзоспория 02112369 В. cereus (SEQ ID NO: 52).

Нацеливающая последовательность может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID NO: 53, аминокислоты 18-33 из SEQ ID NO: 53, или SEQ ID NO: 53, или белок экзоспория может включать полноразмерный белок экзоспория WP016099770 В. cereus (SEQ ID NO: 54).

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать кислоты 1-30 из SEQ ID NO: 55, аминокислоты 15-30 из SEQ ID NO: 55, или SEQ ID NO: 55, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок YP006612525 В. thuringiensis (SEQ ID NO: 56).

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислоты 1-130 из SEQ ID NO: 57, аминокислоты 115-130 из SEQ ID NO: 57, или SEQ ID NO: 57, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок TIGR03720 В. mycoides (SEQ ID NO: 58).

Дополнительно, легко можно увидеть из выравнивания последовательностей на фигуре 1, что, в то время как аминокислоты 20-35 из BclA являются консервативными, и аминокислоты 25-35 являются более консервативными, то в этом участке может происходить вариантность в определенной степени без влияния на способность нацеливающей последовательности нацеливать белок на экзоспорий. На фигуре 1 представлен процент идентичности каждой из соответствующих аминокислот каждой последовательности к аминокислотам 20-35 из BclA ("20-35% Идентичность") и к аминокислотам 25-35 из BclA ("25-35% Идентичность"). Таким образом, например, по сравнению с аминокислотами 20-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290 идентичны приблизительно на 81,3%, соответствующие аминокислоты из BAS4623 идентичны приблизительно на 50,0%, соответствующие аминокислоты из BclB идентичны приблизительно на 43,8%, соответствующие аминокислоты из BAS1882 идентичны приблизительно на 62,5%, соответствующие аминокислоты продукта гена КВАВ4 2280 идентичны приблизительно на 81,3%, и соответствующие аминокислоты продукта гена КВАВ4 3572 идентичны приблизительно на 81,3%. Идентичности последовательностей выше этого участка для оставшихся последовательностей представлены на фигуре 1.

По отношению к аминокислотам 25-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290 идентичны приблизительно на 90,9%, соответствующие аминокислоты из BAS4623 идентичны приблизительно на 72,7%, соответствующие аминокислоты из BclB идентичны приблизительно на 54,5%, соответствующие аминокислоты из BAS1882 идентичны приблизительно на 72,7%, соответствующие аминокислоты продукта гена КВАВ4 2280 идентичны приблизительно на 90,9%, и соответствующие аминокислоты продукта гена КВАВ4 3572 идентичны приблизительно на 81,8%. Идентичности последовательностей выше этого участка для оставшихся последовательностей представлены на фигуре 1.

Таким образом, нацеливающая последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 43% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 50% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 50% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 50% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 50% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 56% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 56% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.

Альтернативно, нацеливающая последовательность может включать амино последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 62% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Нацеливающая последовательность также может включать аминокислотную последовательность, состоящую из 16 аминокислот и имеющую по меньшей мере приблизительно 62% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID NO:1 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.

Нацеливающая последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 68% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере 68% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.

Нацеливающая последовательность также может включать амино последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 75% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 75% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID NO:1 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.

Нацеливающая последовательность также может включать амино последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 75% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 75% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID NO:1 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.

Нацеливающая последовательность также может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 81% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 81% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.

Нацеливающая последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 81% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%. Альтернативно, нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере приблизительно 81% идентичность с аминокислотами 20-35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.

Для квалифицированного специалиста в данной области техники будет понятным, что варианты вышеописанных последовательностей также можно использовать в качестве нацеливающей последовательности, при условии, что нацеливающая последовательность включает аминокислоты 20-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, продукта гена КВАВ4 2280, или продукта гена КВАВ 3572, или присутствует последовательность, содержащая любые из вышеуказанных последовательностей, идентичные аминокислотам 20-35 и 25-35 из BclA.

Кроме того, было обнаружено, что определенные белки экзоспория семейства Bacillus cereus, в которых отсутствуют участки, имеющие гомологию к аминокислотам 25-35 из BclA, также можно использовать для нацеливания пептида или белка на экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. В особенности, слитые белки могут включать белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 71 (В. mycoides InhA), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 72 (В. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 73 {В. anthracis Sterne BASH44 (BxpB/ExsFA)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 74 (B. anthracis Sterne В AS 1145 (CotY)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 75 (B. anthracis Sterne BAS1140), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 76 (B. anthracis H9401 ExsFB), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 77 (B. thuringiensis HD74 InhA1), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 78 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 79 (B. cereus ExsH), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 80 (B. anthracis Ames YjcA), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 81 (B. anthracis YjcB), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 82 (В. anthracis Sterne BclC), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 83 (Bacillus thuringiensis серовар konkukian штамм 97-27 кислая фосфатаза), или белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 84 (В. thuringiensis HD74 InhA2). Включение белка экзоспория, содержащего SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, или 84 в слитые белки, описанные в настоящей заявке, будет приводить к нацеливанию на экзоспорий представителя семейства В. cereus.

Более того, белки экзоспория, имеющие высокую степень идентичности последовательностей с любыми полноразмерными белками экзоспория или фрагментами белков экзоспория, описанными выше, также можно использовать для нацеливания пептида или белка на экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Таким образом, слитый белок может включать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с любой из SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, и 84. Альтернативно, слитый белок может включать белок экзоспория, имеющий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичность с любой из SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, и 84.

Альтернативно, слитый белок может включать фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 59. Альтернативно, слитый белок может включать фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичность с SEQ ID NO: 59.

В любой из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящей заявке, нацеливающая последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория может включать аминокислотную последовательность GXT на его карбокси конце, где X представляет собой любую аминокислоту.

В любой из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, и фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящей заявке, нацеливающая последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, может включать аланиновый остаток в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 из SEQ ID NO: 1.

Слитые белки

Слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, и по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид. Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать пептидный гормон, негормональный пептид, фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений или фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания. Нацеливающая последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящей заявке.

Слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, и по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена. Нацеливающая последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящей заявке.

Слитый белок может быть получен, используя стандартные методы клонирования и молекулярной биологии, известные в области техники. Например, ген, кодирующий белок или пептид (например, ген, кодирующий стимулирующий рост растений белок или пептид) может быть амплифицирован путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигирован с ДНК, кодирующей любую из вышеописанных нацеливающих последовательностей с образованием ДНК молекулы, которая кодирует слитый белок. ДНК молекула, кодирующая слитый белок может быть клонирована в любом подходящем векторе, например, плазмидном векторе. Вектор подходяще включает сайт множественного клонирования, в который легко может быть вставлена ДНК молекула, кодирующая слитый белок. Вектор также подходяще содержит селектируемый маркер, такой как ген резистентности к антибиотику, таким образом, что бактерия, трансформированная, трансфектированная или матированная с помощью вектора, легко может быть идентифицирована и выделена. Если вектор представляет собой плазмиду, то плазмида подходяще также включает точку начала репликации. ДНК, кодирующая слитый белок, подходяще находится под контролем промотора спорообразования, который будет вызывать экспрессию слитого белка на экзоспории представителя семейства В. cereus эндоспора (например, нативный bclA промотор из представителя семейства В. cereus). Альтернативно, ДНК, кодирующая слитый белок, может быть интегрирована в хромосомную ДНК хозяина представителя семейства В. cereus.

Слитый белок также может включать дополнительные полипептидные последовательности, которые не являются частью нацеливающей последовательности, белка экзоспория, фрагмента белка экзоспория, или стимулирующего рост растений белка или пептида, белка или пептида, который защищает растение от патогена, белка или пептида, который усиливает стрессоустойчивость растений, или белка или пептида, связывающегося с растением. Например, слитый белок может включать метки или маркеры для облегчения очистки или визуализации слитого белка (например, полигистидиновую метку или флуоресцентный белок, такой как GFP или YFP) или визуализации рекомбинантных продуцирующих экзоспорий споровых клеток Bacillus, экспрессирующих слитый белок.

Экспрессия слитых белков на экзоспории, используя нацеливающие последовательности, белки экзоспория, и фрагменты белков экзоспория, описанные в настоящей заявке, усиливается благодаря отсутствию вторичной структуры на амино-концах этих последовательностей, что предоставляет возможность нативной укладки слитых белков и сохранения активности. Надлежащая укладка дополнительно может усиливаться путем включения короткого аминокислотного линкера между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, фрагментом белка экзоспория, и белком партнером слияния.

Таким образом, любые из слитых белков, описанных в настоящей заявке, могут включать аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, или фрагментом белка экзоспория и стимулирующим рост растений белком или пептидом, белком или пептидом, который защищает растение от патогена, белком или пептидом, который усиливает стрессоустойчивость растений, или белком или пептидом, связывающимся с растением.

Линкер может включать полиаланиновый линкер или полиглициновый линкер. Также можно использовать линкер, содержащий смесь как остатков аланина, так и глицина. Например, если нацеливающая последовательность включает SEQ ID NO: 1, то слитый белок может иметь одну из следующих структур:

Без линкера: SEQ ID NO: 1 - Белок партнер слияния

Аланиновый линкер: SEQ ID NO: 1-An-Белок партнер слияния

Глициновый линкер: SEQ ID NO: 1-Gn-Белок партнер слияния

Смешанный аланиновый и глициновый линкер: SEQ ID NO: 1 - (A/G)n - Белок партнер слияния

где An, Gn, и (A/G)n представляют собой любое количество аланинов, любое количество глицинов, или любое количество аланинов и глицинов, соответственно. Например, n может представлять собой от 1 до 25, и предпочтительно равен от 6 до 10. Если линкер включает смесь остатков аланина и глицина, то можно использовать любую комбинацию остатков глицина и аланина. В вышеописанных структурах, "Белок партнер слияния" представляет собой стимулирующий рост растений белок или пептид, белок или пептид, который защищает растение от патогена, белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растений, или белок или пептид, связывающийся с растением.

Альтернативно или дополнительно, линкер может включать сайт распознавания протеазой. Включение сайта распознавания протеазой предоставляет возможность нацеленного удаления, при воздействии протеазы, которая распознает сайт распознавания протеазой, стимулирующего рост растений белка или пептида, белка или пептида, который защищает растение от патогена, белка или пептида, который усиливает стрессоустойчивость растений, или белка или пептида, связывающегося с растением.

Белки и Пептиды, которые стимулируют рост растений

Как было указано выше, слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид. Например, стимулирующий рост растений белок или пептид может включать пептидный гормон, негормональный пептид, фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, или фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания.

Например, если стимулирующий рост растений белок или пептид включает пептидный гормон, то пептидный гормон может включать фитосульфокин (например, фитосульфокин-α), клавату 3 (CLV3), системин, ZmlGF, или SCR/SP11.

Если стимулирующий рост растений белок или пептид включает негормональный пептид, то негормональный пептид может включать RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40 пептид, мелитин, мастопаран, Mas7, RHPP, POLARIS, или ингибитор трипсина Кунитца (KTI).

Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений. Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, может представлять собой любой фермент, который катализирует любую стадию в биологическом синтетическом пути для соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует превращение неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения на активную или более активную форму соединения.

Соединение, стимулирующее рост растений, может включать соединение, продуцируемое бактериями или грибами в ризосфере, например, 2,3-бутандиол.

Альтернативно, соединение, стимулирующее рост растений, может включать гормон роста растения, например, цитокинин или производное цитокинина, этилен, ауксин или производное ауксина, гиббереллиновую кислоту или производное гиббереллиновой кислоты, абсцизовую кислоту или производное абсцизовой кислоты, или жасмоновую кислоту или производное жасмоновой кислоты.

Если соединение, стимулирующее рост растений, включает цитокинин или производное цитокинина, то цитокинин или производное цитокинина может включать кинетин, цис-зеатип, транс-зеатин, 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил) аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил) аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, транс-рибозилзеатин, 2-метилтио-транс-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-моносфосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2'-дезоксизеатин рибозид, 4-гидрокси-3-метил- транс-2-бутениламинопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, орто-метилтополин, мета-метилтополин, или их комбинацию.

Если соединение, стимулирующее рост растений, включает ауксин или производное ауксина, то ауксин или производное ауксина может включать активный ауксин, неактивный ауксин, конъюгированный ауксин, встречающийся в природе ауксин, или синтетический ауксин, или их комбинацию. Например, ауксин или производное ауксина может включать индол-3-уксусную кислоту, индол-3-пировиноградную кислоту, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусную кислоту, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту, конъюгированный с глюкозой ауксин, или их комбинацию.

Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, может включать такие ферменты: ацетоин-редуктаза, индол-3-ацетамид-гидролаза, триптофан-монооксигеназа, ацетолактат-синтетаза, α-ацетолактат-декарбоксилаза, пируват-декарбоксилаза, диацетил-редуктаза, бутандиол-дегидрогеназа, аминотрансфераза (например, триптофан аминотрансфераза), триптофан-декарбоксилаза, аминоксидаза, индол-3- пируват декарбоксилаза, индол-3-ацетальдегид дегидрогеназа, оксидаза боковой цепи триптофана, нитрил-гидролаза, нитрилаза, пептидаза, протеаза, аденозинфосфат-изопентенил-трансфераза, фосфатаза, аденозин-киназа, аденин-фосфорибозилтрансфераза, CYP735A, 5'-рибонуклеотид-фосфогидролаза, аденозин-нуклеозидаза, зеатин цис-транс-изомераза, зеатин О-гликозилтрансфераза, β-глюкозидаза, цис-гидроксилаза, СК цис-гидроксилаза, СК N-гликозилтрансфераза, 2,5-рибонуклеотид фосфогидролаза, аденозин-нуклеозидаза, пуриннуклеозид фосфорилаза, зеатин редуктаза, гидроксиламин редуктаза, 2-оксоглутарат диоксигеназа, гиббереллиновая 2В/3В гидролаза, гиббереллин 3-оксидаза, гиббереллин 20-оксидаза, хитозиназа, хитиназа, β-1,3-глюканаза, β-1,4-глюканаза, β-1,6-глюканаза, дезаминаза аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, или фермент, вовлеченный в продукцию nod-фактора (например, nodA, nodB, или nodI).

Если фермент включает протеазу или пептидазу, то протеаза или пептидаза может представлять собой протеазу или пептидазу, которая отщепляет белки, пептиды, пробелки, или препробелки, образуя биологически активный пептид. Биологически активный пептид может представлять собой любой пептид, который проявляет биологическую активность.

Примеры биологически активных пептидов включают RKN 16D10 и RHPP.

Протеаза или пептидаза, которая отщепляет белки, пептиды, пробелки, или препробелки, образуя биологически активный пептид, может включать субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, серин-протеазу, глутаминовую протеазу, аспартат-протеазу, цистеин-протеазу, треонин-протеазу, или металлопротеазу.

Протеаза или пептидаза может расщеплять белки в богатой белками муке (например, соевая мука или дрожжевой экстракт).

Стимулирующий рост растений белок также может включать фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания. Такие ферменты включают целлюлазы, липазы, лигнин-оксидазы, протеазы, гликозид-гидролазы, фосфатазы, нитрогеназы, нуклеазы, амидазы, нитрат-редуктазы, нитрит-редуктазы, амилазы, оксидазы аммония, лигниназы, глюкозидазы, фосфолипазы, фитазы, пектиназы, глюканазы, сульфатазы, уреазы, ксиланазы, и сидерофоры. Включение в среду для роста растения или нанесение на растение, семена, или площадь, окружающую растение или семя растения, слитых белков, содержащих ферменты, которые разлагают или модифицируют бактериальный, грибковый или растительный источник питания, может способствовать переработке питательных веществ вблизи растений и приводить к увеличению поглощения растением питательных веществ или благоприятными бактериями или грибами вблизи растения.

Подходящие целлюлазы включают эндоцеллюлазы (например, эндоглюконазу, такую как эндоглюканазу Bacillus subtilis, эндоглюканазу Bacillus thuringiensis, эндоглюканазу Bacillus cereus, или эндоглюканазу Bacillus clausii), экзоцеллюлазы (например, экзоцеллюлазу Trichoderma reesei), и β-глюкозидазы (например, β-глюкозидазу Bacillus subtilis, β-глюкозидазу Bacillus thuringiensis, β-глюкозидазу Bacillus cereus, или В-глюкозидазу Bacillus clausii).

Липаза может включать липазу Bacillus subtilis, липазу Bacillus thuringiensis, липазу Bacillus cereus, или липазу Bacillus clausii.

В одном варианте осуществления, липаза включает липазу Bacillus subtilis. Липаза Bacillus subtilis может быть ПЦР амплифицирована, используя следующие праймеры: ggatccatggctgaacacaatcc (прямой, SEQ ID NO: 37) и ggatccttaattcgtattctggcc (обратный, SEQ ID NO: 38).

В другом варианте осуществления, целлюлаза представляет собой эндоглюканазу Bacillus subtilis. Эндоглюканаза Bacillus subtilis может быть ПЦР амплифицирована, используя следующие праймеры: ggatccatgaaacggtcaatc (прямой, SEQ ID NO: 39) и ggatccttactaatttggttctgt (обратный, SEQ ID NO: 40).

В еще другом варианте осуществления, слитый белок включает протеазу PtrB Е. coli. Протеаза PtrB Е. coli может быть ПЦР амплифицирована, используя следующие праймеры: ggatccatgctaccaaaagcc (прямой, SEQ ID NO: 41) и ggatccttagtccgcaggcgtagc (обратный, SEQ ID NO: 42).

В определенных вариантах осуществления, слитый белок содержит эндоглюканазу, которая имеет происхождение из нуклеотидной последовательности в SEQ ID NO: 104.

Аминокислотная последовательность для типичной эндоглюканазы, которая может быть слита с нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, или фрагментом белка экзоспория и, необязательно, линкерной последовательностью, такой как поли-А линкер, представляет собой слитый белок, обеспеченный как SEQ ID NO: 107.

В других вариантах осуществления, слитый белок содержит фосфолипазу, которая имеет происхождение из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 105.

Аминокислотная последовательность для типичной фосфолипазы, которая может быть слита с нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, или фрагментом белка экзоспория и, необязательно, линкерной последовательностью, такой как поли-А линкер, представляет собой слитый белок, обеспеченный как SEQ ID NO: 108.

В еще других вариантах осуществления, слитый белок содержит хитозаназу, которая имеет происхождение из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 106. Аминокислотная последовательность для типичной хитозаназы, которая может быть слита с нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, или фрагментом белка экзоспория и, необязательно, линкерной последовательностью, такой как поли-А линкер, в слитом белке обеспечена как SEQ ID NO: 109.

Для создания слитых конструкций, гены могут быть слиты с нативным bclA промотором ДНК Bacillus thuringiensis. кодирующим первые 35 аминокислот из BclA (аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 1), используя технику сращивания путем перекрывающихся расширений (SOE). Правильные ампликоны клонировали в Е. colilBacillus в «челночном» векторе рНР13, и правильные клоны подвергали скринингу путем секвенирования ДНК. Правильные клоны электропорировали в Bacillus thuringiensis (Cry-, плазмида-) и подвергали скринингу для определения резистентности к хлорамфениколу. Правильные трансформанты выращивали в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом в течение ночи при 30°С, высевали в планшеты с питательным агаром, и инкубировали при 30°С в течение 3 дней. Споры, экспрессирующие слитые конструкции (BEMD споры), могут собраны с планшет путем промывания в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) и очищены путем центрифугирования и дополнительного промывания в PBS.

В таких слитых белках, эндоглюканаза, фосфолипаза или хитозиназа может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109, соответственно.

В таких слитых белках, эндоглюканаза, фосфолипаза или хитозиназа может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109, соответственно.

В таких слитых белках, эндоглюканаза, фосфолипаза или хитозиназа может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109, соответственно.

В таких слитых белках, эндоглюканаза, фосфолипаза или хитозиназа может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109, соответственно.

В таких слитых белках, эндоглюканаза, фосфолипаза или хитозиназа может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичность с SEQ ID NO: 107, 108 или 109, соответственно.

Подходящие лигнин-оксидазы включают лигнин пероксидазы, лакказы, глиоксаль оксидазы, лигниназы, и марганецпероксидазы.

Протеаза может включать субти лизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, пептидазу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, серин-протеазу, глутаминовую протеазу, аспартат-протеазу, цистеин-протеазу, треонин-протеазу, или металлопротеазу.

Фосфатаза может включать фосфоросодержащую моноэфиргидролазу, фосфоромоноэстеразу (например, PhoA4), фосфоросодержащую диэфиргидролазу, фосфодиэстеразу, трифосфорную моноэфиргидролазу, фосфорилангидрид-гидролазу, пирофосфатазу, фитазу (например, фитазу Bacillus subtilis ЕЕ148 или фитазу Bacillus thuringiensis ВТ013А), триметафосфатазу, или трифосфатазу.

Нитрогеназа может включать нитрогеназу семейства Nif (например, PaeniBacillus massiliensis NifBDEHKNXV).

Белки и Пептиды, которые защищают растения от патогенов

Слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, и по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена.

Белок или пептид может включать белок или пептид, который стимулирует иммунную реакцию растения. Например, белок или пептид, который стимулирует иммунную реакцию растения, может включать белок или пептид, который усиливает иммунную систему растения. Белок или пептид, который усиливает иммунную систему растения, может представлять собой любой белок или пептид, который имеет благоприятный эффект на иммунную систему растения. Подходящие белки и пептиды, усиливающие иммунную систему растения, включают гарпины, α-эластины, β-эластины, системины, фенилаланинаммоний-лиазу, элиситины, дефензины, криптогеины, флагеллиновые белки, и флагеллиновые пептиды (например, flg22).

Альтернативно, белок или пептид, который защищает растение от патогена, может представлять собой белок или пептид, который имеет антибактериальную активность, противогрибковую активность, или как бактериальную, так и противогрибковую активность. Примеры таких белков и пептидов включают бактериоцины, лизоцимы, лизоцимные пептиды (например, LysM), сидерофоры, нерибосомальные активные пептиды, кональбумины, альбумины, лактоферрины, лактоферриновые пептиды (например, LfcinB), стрептавидин и TasA.

Белок или пептид, который защищает растение от патогена, также может представлять собой белок или пептид, который имеет инсектицидную активность, гельминтицидную активность, подавляют насекомых или уничтожают гусениц, или их комбинацию. Например, белок или пептид, который защищает растение от патогена, может включать инсектицидный бактериальный токсин (например, VIP инсектицидный белок), эндотоксин, Cry токсин (например, Cry токсин от Bacillus thuringiensis), белок или пептид, ингибитор протеазы (например, ингибитор трипсина или ингибитор остроголовой протеазы), цистеин-протеазу, или хитиназу. Если Cry токсин представляет собой Cry токсин от Bacillus thuringiensis, То Cry токсин может представляет собой Cry5B белок или Cry21A белок. Cry5B и Cry21A имеют обе активности: инсектицидную и нематоцидную.

Белок, который защищает растение от патогена, может включать фермент. Подходящие ферменты включают протеазы и лактоназы. Протеазы и лактоназы могут быть специфическими для бактериальной сигнальной молекулы (например, бактериальной лактоновой гомосериновой сигнальной молекулы).

Если фермент представляет собой лактоназу, то лактоназа может включать 1,4-лактоназу, 2- пирон-4,6-дикарбоксилат лактоназу, 3-оксоадипат енол-лактоназу, актиномицин лактоназу, дезоксилимонат А-кольцо-лактоназу, глюконолактоназу L-рамноно-1,4-лактоназу, лимонин-D-кольцо-лактоназу, стероид-лактоназу, триацетат-лактоназу, или ксилоно-1,4-лактоназу.

Фермент также может представлять собой фермент, который является специфическим для клеточного компонента бактерии или гриба. Например, фермент может включать β-1,3-глюканазу, β-1,4- глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназа-подобный фермент, лутиказу, пептидазу, протеиназу, протеазу (например, щелочную протеазу, кислую протеазу, или нейтральную протеазу), мутанолизин, стафолизин, или лизоцим.

Белки и Пептиды, которые усиливают стрессоустойчивость растений

Слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растений.

Например, белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растений, включает фермент, который разлагает связанное со стрессом соединение. Связанные со стрессом соединения включает, но не ограничиваясь только ими, аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АСС), активные формы кислорода, оксид азота, оксилипины, и фенольные смолы. Специфические активные формы кислорода включают гидроксил, пероксид водорода, кислород и супероксид. Фермент, который разлагает связанное со стрессом соединение, может включать супероксиддисмутазу, оксидазу, каталазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, пероксидазу, антиоксидантный фермент, или антиоксидантный пептид.

Белок или пептид, который усиливает стрессоустойчивость растений, также может включать белок или пептид, который защищает растение от стресса под влиянием факторов окружающей среды. Стресс под влиянием факторов окружающей среды может включать, например, засуху, затопление, жару, заморозки, соль, тяжелые металлы, низкий рН, высокий рН, или их комбинацию. Например, белок или пептид, который защищает растение от стресса под влиянием факторов окружающей среды, может включать белок, индуцирующий формирование микрокристаллов льда, пролиназу, фенилаланинаммоний-лиазу, изохорисмат-синтазу, изохорисматпируват-лиазу или холиндегидрогеназу.

Белки и Пептиды, связывающиеся с растением

Слитые белки могут включать нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере белок или пептид, связывающийся с растением. Белок или пептид, связывающийся с растением, может представлять собой любой белок или пептид, который способен специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, корень растения или воздушная часть растения, такая как лист, стебель, цветок или плод) или растительным материалом. Таким образом, например, белок или пептид, связывающийся с растением, может представлять собой белок или пептид, связывающийся с корнем, или белок или пептид, связывающийся с листьями.

Подходящие белки и пептиды, связывающиеся с растением, включают адгезины (например, рикадгезин), флагеллины, омптины, лектины, экспансины, биопленочные структурные белки (например, TasA или YuaB) пилус белки, курлус белки, интимины, инвазины, агглютинины, и афимбриальные белки.

Рекомбинантные Bacillus, которые экспрессируют слитые белки

Слитые белки, описанные в настоящей заявке, могут экспрессироваться с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus. Слитый белок может представлять собой любой из слитых белков, описанных выше.

Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут совместно экспрессировать два или больше любых слитых белков, описанных выше. Например, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут совместно экспрессировать по меньшей мере один слитый белок, который включает белок или пептид, связывающийся с растением, совместно с по меньшей мере одним слитым белком, содержащим стимулирующий рост растений белок или пептид, по меньшей мере одним слитым белком, содержащим белок или пептид, который защищает растение от патогена, или по меньшей мере одним белком или пептидом, который усиливает стрессоустойчивость растений.

Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут включать Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis или их комбинацию. Например, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут включать Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudomycoides, или Bacillus mycoides. В особенности, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут включать Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.

Для создания рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, экспрессирующих слитый белок, любой представитель семейства Bacillus cereus может быть конъюгирован, трансдуцирован или трансформирован с вектором, кодирующим слитый белок, используя стандартные методы, известные в данной области техники (например, путем электропорации). После этого бактерии могут быть подвергнуты скринингу для идентификации трансформантов с помощью любого метода, известного в данной области техники. Например, если вектор включает ген резистентности к антибиотику, то бактерия может быть подвергнута скринингу для определения резистентности к антибиотику. Альтернативно, ДНК, кодирующая слитый белок, может быть интегрирована в хромосомную ДНК представителя семейства хозяина В. cereus. Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus впоследствии могут быть подвергнуты условиям, которые будут индуцировать спорообразования. Подходящие условия для индуцирования спорообразования известны в данной области техники. Например, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут высеваться на агаровые планшеты, и инкубироваться при температуре приблизительно 30°С в течение нескольких дней (например, 3 дня).

Инактивированные штаммы, нетоксические штаммы, или генетически обработанные штаммы любых вышеперечисленных видов также подходяще можно использовать. Например, можно использовать Bacillus thuringiensis, в котором отсутствует Cry токсин. Альтернативно или дополнительно, как только были созданы рекомбинантные споры семейства В. cereus, экспрессирующие слитый белок, они могут быть инактивированы для предотвращения дальнейшего прорастания сразу после использования. Можно использовать любой метод для инактивации бактериальных спор, который известен в данной области техники. Подходящие методы включают, но не ограничиваясь только ими, термическую обработку, гамма-облучение, рентгеновское облучение, УФ-А облучение, УФ-Б облучение, химическую обработку (например, обработку с помощью глутаральдегида, формальдегида, перекиси водорода, уксусной кислоты, отбеливателя, или любую их комбинацию), или их комбинацию. Альтернативно, можно использовать споры, имеющие происхождение из нетоксиногенных штаммов, или генетически или физически инактивированных штаммов.

Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, имеющие стимулирующие эффекты на рост растений и/или другие благоприятные свойства

Многие штаммы представителей семейства Bacillus cereus имеют свойственные благоприятные свойства. Например, некоторые штаммы имеют стимулирующие эффекты на рост растений. Любые из слитых белков, описанных в настоящей заявке, могут экспрессироваться в таких штаммах.

Например, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут включать штамм бактерий, стимулирующий рост растений.

Штамм бактерий, стимулирующий рост растений может включать штамм бактерий, который продуцирует инсектицидный токсин (например, Cry токсин), продуцирует фунгицидное соединение (например, β-1,3-глюканазу, хитозиназу, лутиказу, или их комбинацию), продуцирует нематоцидное соединение (например, Cry токсин), продуцирует бактериоцидное соединение, которое является резистентным к одним или нескольким антибиотикам, включает одну или несколько свободно реплицирующихся плазмид, связанных с корнями растений, колонизирующих корни растений, образующих биопленки, солюбилизирующих питательные вещества, секретирующих органические кислоты, или любую их комбинацию.

Например, если рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus включают штамм бактерий, стимулирующий рост растений, то штамм бактерий, способствующий росту растений, может включать Bacillus mycoides ВТ155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), или представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928). Bacillus thuringiensis BT013A также известен как Bacillus thuringiensis 4Q7. Каждый из этих штаммов был задепонирован в министерстве сельского хозяйства США (USDA) Agricultural Research Service (ARS), расположенному по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A., 10 марта 2014 г., и идентифицируется по номеру депонирования NRRL, указанному в круглых скобках.

Эти штаммы, стимулирующие рост растений были выделены из ризосфер различных сильных растений и были идентифицированы в соответствии с их последовательностями 16S рРНК, и с помощью биохимических анализов. Штаммы были идентифицированы по меньшей мере до их родового названия с помощью общепринятых биохимических и морфологических индикаторов. Биохимические анализы для подтверждения грамположительных штаммов, таких как Bacillus, включают рост на PEA среде и питательном агаре, микроскопическое исследование, рост на 5% и 7,5% NaCl среде, рост при рН 5 и рН 9, рост при 42°С и 50°С, способность продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; продуцировать флуоресцентный пигмент; гидролизировать желатин; восстанавливать нитрат; продуцировать каталазу, гидролизировать крахмал; оксидазную реакцию, продукцию уреазы и подвижность.

Например, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, содержащие штамм бактерий, стимулирующий рост растений, могут включать Bacillus mycoides ВТ155, Bacillus mycoides EE141, или Bacillus thuringiensis ВТ013А. Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут экспрессировать любые слитые белки, описанные в настоящей заявке, например, слитый белок, содержащий нацеливающую последовательность из SEQ ID NO: 60 и негормональный пептид (например, ингибитор трипсина Кунитца (KTI)), фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений (например, хитозиназу), белок или пептид, связывающийся с растением, (например, TasA); белок или пептид, который защищает растение от патогена, (например, TasA), или фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания (например, фосфатазу, такую как PhoA или фитазу, или эндоглюканазу).

Промоторы

В любых рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клетках Bacillus, описанных в настоящей заявке, слитый белок может экспрессироваться под контролем промотора, который нативный для нацеливающей последовательности, белка экзоспория, или фрагмента белка экзоспория слитого белка. Например, если слитый белок включает нацеливающую последовательность, имеющую происхождение из В. anthracis Sterne BclA (например, аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1, аминокислоты 1-35 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 60) или если слитый белок включает полноразмерный BclA (SEQ ID NO: 2) или фрагмент полноразмерного BclA (например, SEQ ID NO: 59), то слитый белок может экспрессироваться под контролем промотора, который в обычных условиях ассоциирован с BclA геном в геноме В. anthracis Sterne (например, промотор из SEQ ID NO: 85).

Альтернативно, слитый белок может экспрессироваться под контролем высокоэкспрессируемого промотора спорообразования. В некоторых случаях, промотор, который является нативным для нацеливающей последовательности, белка экзоспория, или фрагмента белка экзоспория, будет представлять собой высокоэкспрессируемый промотор спорообразования. В других случаях, промотор, который является нативным для нацеливающей последовательности, белка экзоспория, или фрагмента белка экзоспория, не будет представлять собой высокоэкспрессируемый промотор спорообразования. В последних случаях, может являться благоприятным заменять нативный промотор на высокоэкспрессируемый промотор спорообразования. Экспрессия слитого белка под контролем высокоэкспрессируемого промотора спорообразования обеспечивает увеличенную экспрессию слитого белка на экзоспории представителя семейства Bacillus cereus.

Высокоэкспрессируемый промотор спорообразования может включать одну или несколько промоторных последовательностей сигма-K полимеразы, специфической для спорообразования.

Подходящие высокоэкспрессируемые промоторы спорообразования для применения в экспрессирующих слитых белках в представителях семейства Bacillus cereus включают те, которые представлены в Таблице 2 ниже:

В промоторных последовательностях, перечисленных в Таблице 2 выше, местонахождения промоторных последовательностей сигма- K полимеразы, специфической для спорообразования, указаны жирных шрифтом и подчеркнуты. Cry1A промотор (В. thuringiensis HD-73; SEQ ID NO: 90) имеет всего четыре сигма-K последовательности, две из которых перекрываются друг с другом, как указано двойным подчеркиванием в Таблице 2.

Предпочтительные высокоэкспрессируемые промоторы спорообразования для применения в экспрессирующих слитых белках в представителях семейства Bacillus cereus включают Bet А промотор (В. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 86), BclA промотор (В. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 85), промоторы оперонов 1 и 2 BclA кластерной гликозил трансферазы (В. anthracis Sterne; SEQ ID NOS: 101 и 102), и Промотор YVTN β-пропеллерного белка (В. weihenstephensis КВАВ 4; SEQ ID NO: 89).

В любых рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клетках Bacillus, описанных в настоящей заявке, слитый белок может экспрессироваться под контролем промотора спорообразования, содержащего нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичность с нуклеотидной последовательностью с любой из SEQ ID NOS: 85-103.

Если промотор спорообразования содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичность с нуклеотидной последовательностью с любой из SEQ ID NOS: 85-103, то промоторная последовательность или последовательности сигма-K полимеразы, специфической для спорообразования, предпочтительно имеют 100% идентичность с соответствующими нуклеотидами из SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, или 103. Например, как указано в Таблице 2 выше, BclA промотор из В. anthracis Sterne (SEQ ID NO: 85) имеет промоторные последовательности сигма-К полимеразы, специфической для спорообразования, на нуклеотидах 24-32, 35-43, и 129-137. Таким образом, если промотор спорообразования включает последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 85, то является предпочтительным, что нуклеотиды промотора спорообразования, соответствующие нуклеотидам 24-32, 35-43, и 129-137 из SEQ ID NO: 85, имеют 100% идентичность с нуклеотидами 24-32, 35-43, и 129-137 из SEQ ID NO: 85.

В любых из методов, описанных в настоящей заявке для стимуляции роста растения, рост растений в среде для роста растения, содержащей рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и по меньшей мере один дополнительный агент биологической борьбы, выбранных из предпочтительных микроорганизмов, описанных в настоящей заявке, проявляет усиленный рост по сравнению с ростом растений в идентичной среде для роста растения, которая содержит рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus.

В любых композициях и методах, описанных в настоящей заявке для стимуляции роста растения, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus могут включать любые рекомбинантные штаммы бактерий, стимулирующих рост растений, описанных выше.

В любых композициях и методах для стимуляции роста растения, описанных в настоящей заявке, слитый белок может экспрессироваться под контролем любого из промоторов, описанных выше.

Синтетические факторы образования клубеньков и стимуляторы роста растений

В некоторых вариантах осуществления, композиции, содержащие рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок и по меньшей мере один из агентов биологической борьбы, описанных в настоящей заявке, дополнительно включают синтетический фактор образования клубеньков и/или стимулятор роста растения. Неограничивающий пример такого синтетического соединения представляет собой соединение общей формулы (I)

в которой:

n представляет собой 2 или 3;

А представляет собой -С(О)-;

В представляет собой фенилен;

С представляет собой -О-;

D представляет собой линейную углеводородную цепь, содержащую 11 углеродов, которая является насыщенной или ненасыщенной между углеродами 4 и 5;

Е и G независимо выбирают из группы, включающей заместитель NHR20;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, и R9 представляют собой Н;

R8 выбирают из группы, включающей Н, фукозил, метилфукозил, SO₃H, SO₃Li, SO₃Na, SO₃K, и SO₃N(C_1-8-алкил)₄;

R20 представляет собой С(O)С_1-6-алкил; и

его любой сельскохозяйственно приемлемый геометрический и/или оптический изомер, энантиомер и/или диастереоизомер, таутомер, соль, N-оксид, сульфоксид или сульфон.

Соль может быть выбрана из группы, включающей соли лития, натрия, калия и тетраалкиламмония.

В определенных вариантах осуществления, Е и G представляют собой NHC(O)CH₃.

В других вариантах осуществления, R8 выбирают из группы, включающей Н, SO₃H, SO₃Li, SO₃Na, SO₃K, SO₃N(C_1-8алкил)₄ и заместитель формулы:

где:

R26 выбирают из группы, включающей Н и СН₃; и

R27 и R28 независимо выбирают из группы, включающей Н, С(O)СН₃, SO₃H, SO₃Li, SO₃Na, SO₃K и SO₃N(C_1-8алкил)₄.

В некоторых аспектах, R26, R27, и R28 все представляют собой водород. Дополнительные неограничивающие примеры синтетического фактора образования клубеньков и/или стимулятора роста растения, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают соединения структурных формул:

в которых, если он присутствует, М выбирают из группы, включающей Н⁺, Li⁺, Na⁺, К⁺ и (С_1-8алкил)₄N⁺.

В определенных аспектах, синтетический фактор образования клубеньков и/или стимулятор роста растения представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей:

и

Дополнительные агенты биологической борьбы

Агенты биологической борьбы могут включать, в особенности, бактерии, грибы или дрожжи, простейшие, вирусы, энтомопатогенные нематоды, инокулянты и растения и/или их мутанты, имеющие все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам. Настоящее изобретение относится к комбинациям вышеописанных рекомбинантных клеток Bacillus с предпочтительными агентами биологической борьбы, описанными в настоящей заявке, и/или к мутантам специфических штаммов микроорганизмов, описанных в настоящей заявке, где мутанты имеют все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам или способствуют росту растения и/или усиливают жизнеспособность растения.

Бактериальные клетки, споры и метаболиты в культуральном бульоне, образующемся вследствие ферментации ("цельный бульон" или "ферментационный бульон") предпочтительных микроорганизмов, описанных в настоящей заявке, могут использоваться непосредственно или концентрироваться с помощью общеизвестных промышленных методов, таких как центрифугирование, фильтрация и упаривание, или перерабатываться в безводный порошок и гранулы, например, путем распылительной сушки, барабанной сушки и лиофилизации.

Термины "цельный бульон" и "ферментационный бульон", как используется в настоящей заявке, относится к культуральному бульону, образующемуся при ферментации перед любой последующей обработкой. Цельный бульон охватывает микроорганизм и его составляющие компоненты, неиспользуемые неочищенные субстраты, и метаболиты, продуцируемые микроорганизмом при ферментации. Термин "концентрат бульона", как используется в настоящей заявке, относится к цельному бульону (ферментационный бульон), который был концентрирован с помощью общепринятых промышленных методов, как описано выше, но остается в жидкой форме. Термин "твердые компоненты ферментации", как используется в настоящей заявке, относится к высушенному ферментационному бульону. Термин "продукт ферментации", как используется в настоящей заявке, относится к цельному бульону, концентрату бульона и/или твердым компонентам ферментации. Композиции согласно настоящему изобретению включают продукты ферментации. В некоторых вариантах осуществления, концентрированный ферментационный бульон промывают, например, с помощью процесса диафильтрации, для удаления оставшегося ферментационного бульона и метаболитов.

В другом варианте осуществления, ферментационный бульон или концентрат бульона может быть высушен с или без добавления носителей, инертных компонентов, или аддитивов, используя общепринятые процессы или методы сушки, такие как распылительная сушка, лиофилизация, тарельчатая сушка, сушка в псевдоожиженном слое, сушка в барабанной сушилке или упаривание.

В соответствии с изобретением, агенты биологической борьбы, которые обобщены под термином "бактерии", включают спорообразующие, колонизирующие корень бактерии, или бактерии и их метаболиты, пригодные в качестве биологических инсектицидов, -нематицидов, майтицидов, или - фунгицида или почвоулучшителей, улучшающих жизнеспособность и рост растений. Следующие бактерии используются или применяются в соответствии с изобретением.

Штаммы В. cereus, включая штамм CNCM 1-1562 (ср. Патент US №6,406,690), Bacillus firmus, Bacillus pumilus, в особенности штамм GB34 (продукты, известные как YIELD SHIELD^®), и штамм QST2808 (продукты, известные как SONATA^® QST2808) Bacillus subtilis, в особенности штамм GB03 (продукты, известные как KODIAK^®), штамм QST713 (продукты, известные как SERENADE^® QST713), штамм AQ30002 (также называемый QST30002; номер доступа NRRL. В-50421, известный из WO 2012/087980, который включен в настоящую заявку путем ссылки), штамм AQ30004 (также называемый QST30004; номер доступа NRRL. В-50455, известный из WO 2012/087980, который включен в настоящую заявку путем ссылки), штамм AQ743 (Номер доступа NRRLB-21665), штамм AQ153 (Номер доступа АТСС 55614, как описано в WO 98/21964), (1.79) Streptomyces galbus штамм AQ 6047 (Номер доступа NRRL 30232), (1.91) Rhodococcus globerulus AQ719 (Номер доступа NRRLB-21663), (1.92) Bacillus sp.AQ175 (Номер доступа АТСС 55608), (1.93) Bacillus sp.AQ 177 (Номер доступа АТСС 55609), (1.94) Bacillus sp.AQ178 (Номер доступа АТСС 53522), (1.95) Streptomyces sp.штамм, описанный в WO 02/26041 А2 (Номер доступа NRRLB-30145), (1.96) Streptomyces microflavus штамм NRRL В-50550, (1.97) Streptomyces microflavus штамм М (Номер доступа 091013-02), гугеротин-содержащие продукты ферментации Streptomyces, как описано в WO2014/059275, и Streptomyces galbus QST6047, описанный в патенте US №6,682,925.

В предпочтительном варианте осуществления используются следующие бактерии в комбинации с продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus, описанными выше:

Bacillus firmus, в особенности штамм I-1582 (продукты, известные как Bionem, Votivo, Flocter),

Bacillus pumilus, в особенности штамм GB34 (продукты, известные как YIELD SHIELD^®), и штамм QST2808 (продукты, известные как SONATA^® QST2808),

Bacillus subtilis, в особенности штамм GB03 (продукты, известные как KODIAK^®), штамм QST713 (продукты, известные как SERENADE^® QST713); номер доступа NRRL. В-50455, известный из WO 2012/087980, который включен в настоящую заявку путем ссылки), или штамм В. subtilis var. amyloliquefaciens FZB24 (продукты, известные как TAEGRO^®), штамм AQ743 (Номер доступа NRRLB-21665), штамм AQ153 (Номер доступа АТСС 55614, как описано в WO 98/21964),

В одном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению включает комбинацию по меньшей мере одного из предпочтительных агентов биологической борьбы, описанных в настоящей заявке, и по меньшей мере одного дополнительного агента биологической борьбы, выбранного из группы, включающей Bacillus chitinosporus AQ746 (Номер доступа NRRLB-21618), Bacillus mycoides AQ726 (Номер доступа NRRLB-21664), Bacillus pumilus QST2808 (Номер доступа NRRLB-30087), Bacillus pumilus AQ717 (Номер доступа NRRLB-21662), Bacillus sp. AQ175 (Номер доступа АТСС 55608), Bacillus sp. AQ177 (Номер доступа АТСС 55609), Bacillus sp. AQ178 (Номер доступа АТСС 53522), Bacillus subtilis AQ743 (Номер доступа NRRLB-21665), Bacillus subtilis AQ713 (Номер доступа NRRLB-21661), Bacillus subtilis AQ153 (Номер доступа АТСС 55614), Muscodor albus 620 (Номер доступа NRRL30547), Muscodor roseus А3-5 (Номер доступа NRRL30548), Rhodococcus globerulus AQ719 (Номер доступа NRRLB-21663), Streptomyces galbus (Номер доступа NRRL30232), Streptomyces sp. (Номер доступа NRRLB-30145), Bacillus subtilis AQ30002 (Номер доступа NRRLB-50421), и Bacillus subtilis AQ30004 (Номер доступа NRRLB-50455) и/или мутанта этих штаммов, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам.

Следующие указанные дальнейшие агенты биологической борьбы известны в данной области техники:

Bacillus chitinosporus AQ746 (Номер доступа NRRLB-21618) известен из WO 98/21966 А2. Он является специфически активным по отношению к нематодам и насекомым и продуцирует не-экзотоксические не-белковоподобные, активные метаболиты в его супернатанте. Эти метаболиты являются активными по отношению к нематодам и тараканам, но неактивным по отношению к мухам, злаковому корневому червю или совке малой.

Bacillus mycoides AQ726 (Номер доступа NRRLB-21664) и его водорастворимые метаболиты убивают или останавливают рост насекомых, таких как личинки злакового корневого червя и тля (WO 99/09820 А1).

Как описано в WO 00/58442 A1 Bacillus pumilus QST2808 (Номер доступа NRRLB-30087) способен ингибировать широкий спектр грибковых болезней растений in vivo. Коммерчески доступные препаратов этого штамма продаются под торговыми названиями SONATA^® и BALLAD^® плюс от Bayer CropScience LP (North Carolina, USA).

Bacillus pumilus AQ717 (NRRL доступ B-21662) известен из WO 99/10477 A1. Он продуцирует метаболит, который проявляет пестицидную активность к злаковым корневым червям, нематодам и совке малой.

Бактериальные штаммы Bacillus sp. AQ175 (Номер доступа АТСС 55608), Bacillus sp. AQ177 (Номер доступа АТСС 55609) и Bacillus sp.AQ178 (Номер доступа АТСС 53522) описанные в WO 98/21967 А1, являются эффективными для борьбы и защиты растений от надземных грибковых и бактериальных инфекций.

Продуцируюший метаболит штамм Bacillus subtilis AQ743 (Номер доступа NRRLB-21665) убивает или останавливает рост личинок злакового корневого червя, личинок совки малой, взрослых особей мух и нематод (ср. WO 99/09819).

Bacillus subtilis AQ713 (Номер доступа В-21661), также называемый Bacillus subtilis QST713, проявляют широкую фунгицидную и бактерицидную активность и также проявляет активность по отношению к злаковому корневому червю (WO 98/50422 А1). Коммерчески доступный препарат этого штамма доступный под торговыми названиями SERENADE^® MAX, SERENADE SOIL^®, SERENADE^® ASO, SERENADE^® СРВ и RHAPSODY^® от Bayer CropScience LP (North Carolina, USA). Продукт SERENADE^® (U.S. EPA Регистрация №69592-12) содержит запатентованный штамм Bacillus subtilis (штамм QST713) и многие различные липопептиды, которые действуют синергитически, разрушая болезнетворные патогены и обеспечивая улучшенную антимикробную активность. Продукт SERENADE^® используют для защиты растений, таких как овощи, фрукты, орехоплодные и лозовые культуры по отношению к таким заболеваниям, как красная бактериальная гниль корней, серая гниль, кислая гниль, ржавчина, склеротиния, настоящая мучнистая роса, бактериальная пятнистость и белая гниль. Продукты SERENADE^® доступны либо в виде жидких или безводных препаратов, которые могут применяться в качестве листовой и/или почвенной обработки. Копии U.S. ЕРА Master Labels для продуктов SERENADE^®, включая SERENADE^® ASO, SERENADE^® МАХ, и SERENADE SOIL, находятся в открытом доступе от National Pesticide Information Retrieval System's (NPIRSv) USEPA/OPP Pesticide Product Label System (PPLS).

SERENADE^® ASO (водная суспензия-органическкая) содержит 1,34% безводного QST713 в качестве активного компонента и 98,66% других компонентов. SERENADE^® ASO также приготовлен в виде препарата, который содержит минимум 1×10⁹ КОЕ/г QST713, в то время как определенное максимальное количество QST713 должно составлять 3,3×10¹⁰ КОЕ/г. Для дополнительной информации, см. U.S. ЕРА Master Labels для SERENADE^® ASO от 4 января 2010 г., которая полностью включена в настоящую заявку путем ссылки.

SERENADE^® МАХ содержит 14,6% безводного QST713 в качестве активного компонента и 85,4% других компонентов. SERENADE^® МАХ приготовлен в виде препарата, который содержит минимум 7,3×10⁹ КОЕ/г QST713, в то время как определенное максимальное количество QST713 должно составлять 7,9×10¹⁰ КОЕ/г. Для дополнительной информации, см. U.S. ЕРА Master Label для SERENADE^® МАХ, которая полностью включена в настоящую заявку путем ссылки.

Bacillus subtilis AQ153 (Номер доступа АТСС 55614), как описано в WO 98/21964 А1 является эффективным для ингибирования роста патогенных для растений бактерий и грибов.

В WO 02/02082898 А1 описаны эндопатогенные грибы, включая Muscodor albus 620, также известен как Muscodor albus QST20799 (Номер доступа NRRL30547) и Muscodor roseus А3-5 (Номер доступа NRRL30548), которые продуцируют смесь лабильных антибиотиков с активностью по отношению к грибам, бактериям, насекомым и нематодам.

Rhodococcus globerulus AQ719 (Номер доступа NRRLB-21663) продуцирует метаболиты, которые проявляют пестицидную активность по отношению к злаковым корневым червям (патент US №6,027,723 А).

В WO 01/79480 А2 описан штамм Streptomyces galbus (Номер доступа NRRL30232), который проявляет инсектицидную активность по отношению к Lepidoptera.

Штамм Streptomyces sp., описанный в WO 02/26041 А2 (Номер доступа NRRLB-30145), проявляет противогрибковую активность на специфические патогены растений, такие как Alternaria, Phytophthora, Botrytis, Rhizoctonia и Sclerotinia.

Штаммы Bacillus subtilis AQ30002 (также известен как QST30002) (Номер доступа NRRLB-50421, задепонированный 5 октября 2010 г.) и Bacillus subtilis AQ30004 (также известен как QST30004) (Номер доступа NRRLB-50455, задепонированный 5 октября 2010 г.) известны из WO 2012/087980 А1, которая включена в настоящую заявку путем ссылки. Как описано в этом источнике, эти ВСА проявляют широкую фунгицидную и бактерицидную активностью. В19 и В20 имеют мутацию в гене swrA, которая приводит к ослабленной способности к роению и усиленному способствованию жизнеспособности растения по сравнению со штаммом, содержащим ген swrA дикого типа. Мутация, вызываемая этими ВСА, образует более крепкую биопленку, чем штамм дикого типа, таким образом усиливая его фунгицидную и бактерицидную активностью.

В некоторых вариантах осуществления, агент биологической борьбы представляет собой штамм Bacillus subtilis, такой как Bacillus subtilis QST713, который продуцирует соединение типа фенгицина, соединение типа итурина и/или соединение типа сурфактина. В некоторых аспектах, липопептид представляет собой соединение типа фенгицина, такое как плипастатин А1, плипастатин В1, плипастатин В2, фенгицин А, фенгицин В, аграстатин 1, или аграстатин 2. В других аспектах, липопептид представляет собой соединение типа итурина, такое как итурин А, микосубтилин или бацилломицин.

Другие продуцирующие липопептиды штаммы, которые пригодны для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению, включают штамм Bacillus amyloliquefaciens D747 (доступный в виде BACSTAR^® от Etec Crop Solutions, NZ и также доступный в виде DOUBLE NICKEL™ от Certis, US); Bacillus subtilis MBI600 (доступный в виде SUBTILEX^® от Becker Underwood, U.S. EPA Рег. №71840-8); Bacillus subtilis Y1336 (доступный в виде BIOBAC^® WP от Bion-Tech, Тайвань, зарегистрированный в виде биологического фунгицида в Тайвани под Регистрационными номерами 4764, 5454, 5096 и 5277); Bacillus amyloliquefaciens, в особенности штамм FZB42 (доступный в виде RHIZOVITAL^® от ABiTEP, DE); и Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens FZB24 доступен от Novozymes Biologicals Inc. (Salem, Virginia) или Syngenta Crop Protection, LLC (Greensboro, North Carolina) в виде фунгицида TAEGRO^® или TAEGRO^® ECO (EPA Регистрация №70127-5).

В некоторых вариантах осуществления, агент биологической борьбы в синергетических комбинациях согласно настоящему изобретению представляет собой:

Bacillus firmus, включая штамм I-1582 (продукты, известные как Bionem, Votivo, Flocter), описанный в патенте US №6,406,690 (который включен в настоящую заявку посредством ссылки) и задепонирован с CNCM 29 мая 1995 г., с номером доступа CNCM I-1582,

Bacillus pumilus, включая штамм GB34 (продукты, известные как YIELD SHIELD^®) и штамм QST2808 (продукты, известные как SONATA^® QST2808),

Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens, включая те, которые продуцируют липопептиды и, в особенности, комбинацию плипастатинов или фенгицинов, сурфактинов и/или итуринов. Также, как для Bacillus subtilis, в особенности штамма GB03 (продукты, известные как KODIAK^®, ср. U.S. ЕРА, Pesticide Fact Sheet -- Bacillus subtilis GB03 1992), штамм QST713 (продукты, известные как SERENADE^® QST713), штамм AQ30002 (также называемый QST30002; номер доступа NRRL. В-50421, известный из WO 2012/087980, который включен в настоящую заявку путем ссылки), и штамм AQ30004 (также называемый QST30004; номер доступа NRRL. В-50455, известный из WO 2012/087980, который включен в настоящую заявку путем ссылки).

В соответствии с изобретением, агенты биологической борьбы, которые могут быть включены в композицию согласно изобретению и которые обобщены под термином "грибы" или "дрожжи" представляют собой следующие организмы и и/или их мутанты, имеющие все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или метаболиты, продуцируемого соответствующим штаммом, которые проявляют активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам (нумерация используется в полном описании):

Muscodor albus, в особенности штамм QST20799 (продукты, известные как ARABESQUE™ или ANDANTE™), Coniothyrium minitans, в особенности штамм CON/M/91-8 (продукты, известные как CONTANS^®), Lagenidium giganteum (продукты, известные как LAGINEX^® от AgraQuest, Inc.), Paecilomyces lilacinus, в особенности споры штамма 251 P. lilacinus (продукты, известные как BIOACT^®, ср. Защита сельскохозяйственных культур 2008, 27, 352-361).

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, агент биологической борьбы включает не только чистые культуры соответствующих микроорганизмов, но также их суспензии в цельной бульонной культуре или супернатант, содержащий метаболит, или очищенный метаболит, полученный из цельной бульонной культуры штамма. "Цельная бульонная культура" относится к жидкой культуре, содержащей как клетки, так и среду. "Супернатант" относится к жидкому бульону, остающемуся после того, как клетки, растущие в бульоне, были удалены путем центрифугирования, фильтрации, седиментации или другими способами, известными в данной области техники.

Вышеуказанные метаболиты, продуцируемые непатогенными микроорганизмами, включают антибиотики, ферменты, сидерофоры и средства, способствующие росту, например, цвиттермицин-А, канозамин, полиоксин, ферменты, такие как α-амилаза, хитиназы и пектиназы, фитогормоны и их предшественники, такие как ауксины, гибберелиноподобные вещества, цитокинин-подобные соединения, липопептиды, такие как итурины, плипастатины или сурфактины, например, аграстатин А, бацилломицин D, бацилизин, дуффицидин, макролактин, фенгицин, бацилизин и бациллаен.

В соответствии с изобретением, агенты биологической борьбы, описанные в настоящей заявке, могут применяться или использоваться на любой физиологической стадии, такой как активная или покоящаяся.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением

В соответствии с настоящим изобретением композиция включает а) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид, выбранный из группы, включающей фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений; фермент, который разлагает или модифицирует бактериальный, грибковый или растительный источник питания; и белок или пептид, который защищает растение от патогена; и (II) нацеливающую последовательность, которая локализует слитый белок на экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus; и б) по меньшей мере один дополнительный и другой предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и/или мутант специфического штамма микроорганизма, раскрытый в настоящей заявке, имеющий все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере один метаболит, продуцируемый соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективном количестве.

«Синергетически эффективное количество» в соответствии с настоящим изобретением представляет собой количество комбинации рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые экспрессируют слитый белок и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, которое является более эффективным по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам, чем рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, или такой дополнительный агент биологической борьбы отдельно. «Синергетически эффективное количество» в соответствии с настоящим изобретением также представляет собой количество комбинации рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, которое является более эффективным для усиления роста растения и/или способствования жизнеспособности растения, чем рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, или такой дополнительный агент биологической борьбы отдельно.

Настоящее изобретение включает всякую и каждую комбинацию каждого из дополнительных предпочтительных агентов биологической борьбы, описанных в настоящей заявке, с рекомбинантными продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus.

В предпочтительном варианте осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере один дополнительный фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид, при условии, что рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, инсектицид и фунгицид не являются идентичными.

Термин "активное соединение" или "активный компонент" используется в настоящем описании для обозначения рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, по меньшей мере одного дополнительного агента биологической борьбы и/или его мутанта, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам, по меньшей мере одного инсектицида и по меньшей мере одного фунгицида.

Дополнительные аддитивы

Один аспект настоящего изобретения обеспечивает композицию, как описано выше, дополнительно содержащую по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из группы, включающей модифицирующие агенты, растворители, самопроизвольные промоторы, носители, эмульсификаторы, диспергирующие вещества, вещества, защищающие от замерзания, загустители и адъюванты. Эти композиции обозначаются как препараты.

Таким образом, в одном аспекте согласно настоящему изобретению обеспечиваются такие препараты, и применяемые формы, приготовленные из них, в качестве средств защиты сельскохозяйственных культур и/или пестицидных агентов, таких как пропитывающие, капающие и распыляющие жидкости, содержащие композиции согласно изобретению. Применяемые формы могут дополнительно включать средства защиты сельскохозяйственных культур и/или пестицидные агенты, и/или адъюванты, усиливающие активность, такие как пенетранты, примерами которых являются растительные масла, такие как, например, рапсовое масло, подсолнечное масло, минеральные масла, такие как, например, жидкие парафины, алкиловые сложные эфиры растительных жирных кислот, таких как рапсовое масло или сложные метиловые эфиры соевого масла, или алканол алкоксилаты, и/или заполнители, такие как, например, алкилсилоксаны и/или соли, примерами которых являются органические или неорганические соли аммония или фосфония, примерами которых являются сульфат аммония или диаммоний гидрофосфат, и/или промоторы удерживания, такие как диоктил сульфосукцинат или гидроксипропилгуарные полимеры и/или увлажняющие средства, такие как глицерин, и/или удобрения, такие как, например, аммониевые, калиевые или фосфорные удобрения.

Примеры типичных препаратов включают водорастворимые жидкости (SL), эмульгируемые концентраты (ЕС), эмульсии в воде (EW), суспензионные концентраты (SC, SE, FS, OD), диспергируемые в воде гранулы (WG), гранулы (GR) и капсульные концентраты (CS); эти и другие возможные типы препаратов описаны, например, в Crop Life International and in Pesticide Specifications, Manual on Development and Use of FAO and WHO Specifications for Pesticides, FAO Plant Production and Protection Papers - 173, подготовленном FAO/WHO Joint Meeting on Pesticide Specifications, 2004, ISBN: 9251048576. Препараты могут включать активные агрохимические соединения, отличающиеся от одного или нескольких активных соединений согласно изобретению.

Данные препараты или применяемые формы предпочтительно включают вспомогательные вещества, такие как модифицирующие агенты, растворители, самопроизвольные промоторы, носители, эмульсификаторы, диспергирующие вещества, вещества, защищающие от замерзания, биоциды, загустители и/или другие вспомогательные вещества, такие как, например, адъюванты. Адъювант в этом контексте представляет собой компонент, который усиливает биологический эффект препарата, при этом сам компонент не имеет биологического действия. Примерами адъювантов являются агенты, которые способствуют удерживанию, распространению, присоединению к поверхности листа или проникновению.

Эти препараты готовят известным способом, например, путем смешивания активных соединений со вспомогательными веществами, такими как, например, модифицирующие агенты, растворители и/или твердые носители и/или дополнительные вспомогательные вещества, такие как, например, сурфактанты. Препараты приготавливают либо в подходящих растениях или еще до или после применения.

Подходящими для использования в качестве вспомогательных веществ являются вещества, которые являются подходящими для придания препарату активного соединения или применяемых форм, приготовленных из этих препаратов (таких как, например, пригодные агенты для защиты сельскохозяйственных культур, такие как распыляемые жидкости или протравливание семян) предпочтительных свойств, таких как определенные физические, технические и/или биологические свойства.

Подходящие модифицирующие агенты представляют собой, например, воду, полярные и неполярные химические жидкости, например, из классов ароматических и неароматических углеводородов (такие как парафины, алкилбензолы, алкилнафталины, хлорбензолы), спиртов и полиолов (которые, если это является подходящим, также могут быть замещены, этерифицированы и/или эстерифицированы), кетонов (такие как ацетон, циклогексанон), сложных эфиров (включая жиры и масла) и (поли)эфиров, незамещенных и замещенных аминов, амидов, лактамов (такие как N-алкилпирролидоны) и лактонов, сульфонов и сульфоксидов (такие как диметилсульфоксид).

Если используемым модифицирующим агентом является вода, то также предоставляется возможность применять, например, органические растворители в качестве вспомогательных растворителей. Главным образом, подходящие жидкие растворители представляют собой: ароматические вещества, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины, хлорированные ароматические вещества и хлорированные алифатические углеводороды, такие как хлорбензолы, хлорэтилены или метиленхлорид, алифатические углеводороды, такие как циклогексан или парафины, например, петролейные фракции, минеральные и растительные масла, спирты, такие как бутанол или гликоль и также их простые эфиры и сложные эфиры, кетоны, такие как ацетон, метил этил кетон, метил изобутил кетон или циклогексанон, сильно полярные растворители, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид, а также вода.

В принципе, представляется возможным использовать все подходящие растворители. Подходящие растворители представляют собой, например, ароматические углеводороды, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины, например, хлорированные ароматические или алифатические углеводороды, такие как хлорбензол, хлорэтилен или метиленхлорид, например, алифатические углеводороды, такие как циклогексан, например, парафины, петролейные фракции, минеральные и растительные масла, спирты, такие как метанол, этанол, изопропанол, бутанол или гликоль, например, и также их простые эфиры и сложные эфиры, кетоны, такие как ацетон, метил этил кетон, метил изобутил кетон или циклогексанон, например, сильно полярные растворители, такие как диметилсульфоксид, и вода.

В принципе, можно использовать все подходящие носители. Подходящие носители представляют собой, в особенности: например, аммониевые соли и измельченные природные минералы, такие как каолины, глины, тальк, мел, кварц, аттапульгит, монтмориллонит или диатомовую землю, и измельченные синтетические минералы, такие как тонкодисперсный диоксид кремния, глинозем и природные или синтетические силикаты, смолы, воски и/или твердые удобрения. Аналогичным образом можно использовать смеси таких носителей. Носители, подходящие для гранул, включают следующие вещества: например, раздробленные и фракционированные природные минералы, такие как кальцит, мрамор, пемза, сепиолит, доломит, и также синтетические гранулы неорганической и органической муки, и также гранулы органического материала, такие как древесные опилки, бумага, кокосовая скорлупа, початки кукурузы и стебли табака.

Также можно использовать ожиженные газообразные модифицирующие агенты или растворители. Особенно предпочтительными являются те модифицирующие агенты или носители, которые при стандартной температуре и при стандартном давлении являются газообразными, их примеры включают аэрозольные пропелленты, такие как галогенированные углеводороды, и также бутан, пропан, азот и углекислый газ.

Примеры эмульсификаторов и/или пенообразователей, диспергирующих веществ или смачивающих агентов, имеющих ионные или неионные свойства, или смесей этих поверхностно-активных веществ, включают соли полиакриловой кислоты, соли лигносульфоновой кислоты, соли фенолсульфоновой кислоты или нафталинсульфоновой кислоты, поликонденсаты этиленоксида с жирными спиртами или с жирными кислотами или с жирными аминами, с замещенными фенолами (предпочтительно алкилфенолы или арилфенолы), соли сульфоянтарных сложных эфиров, производные таурина (предпочтительно алкилтаураты), фосфорные сложные эфиры полиэтоксилированных спиртов или фенолов, сложные эфиры жирных кислот и многоатомных спиртов, и производные соединений, содержащие сульфаты, сульфонаты и фосфаты, их примеры включают алкиларил полигликолевые простые эфиры, алкилсульфонаты, алкил сульфаты, арилсульфонаты, белковые гидролизаты, лигнин-сульфитные отработанные щелоки и метилцеллюлозу. Присутствие поверхностно-активного вещества является благоприятным, если одно из активных соединений и/или один из инертных носителей нерастворимы в воде и если применение происходит в воде.

Дополнительные вспомогательные вещества, которые могут присутствовать в препаратах и в применяемых формах, производных от них, включают окрашиватели, такие как неорганические пигменты, их примеры включают оксид железа, оксид титана, берлинскую лазурь, и органические красители, такие как ализариновые красители, азо красители и метал фталоцианиновые красители, и питательные вещества и микроэлементы, такие как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка.

Стабилизаторы, такие как низкотемпературные стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты, светостабилизаторы или другие агенты, которые улучшают химическую и/или физическую стабильность, также могут присутствовать. Дополнительно могут присутствовать пенообразователи или противовспенивающие агенты.

Кроме того, препараты и применяемые формы, приготовленные из них, также могут включать, в качестве дополнительных вспомогательных веществ, клейкие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, природные и синтетические полимеры в форме порошка, гранулы или латекса, такие как гуммиарабик, поливиниловый спирт, поливинилацетат, и также природные фосфолипиды, такие как цефалины и лецитины, и синтетические фосфолипиды. Другие возможные вспомогательные вещества включают минеральные и растительные масла.

Также в препаратах и применяемых формах, приготовленные из них, могут присутствовать дополнительные вспомогательные вещества. Примеры таких аддитивов включают ароматизирующие вещества, защитные коллоиды, связующие, адгезивы, загустители, тиксотропные вещества, пенетранты, промоторы удерживания, стабилизаторы, секвестранты, комплексообразующие вещества, увлажняющие средства и распределители. В целом, активные соединения можно комбинировать с любыми твердыми или жидкими вспомогательными веществами, обычно используемыми для приготовления препаративных форм.

Подходящие промоторы удерживания включают все те вещества, которые уменьшают динамическое поверхностное натяжение, такие как диоктилсульфосукцинат, или повышают вязкоупругость, такие как, например, гидроксипропилгуарные полимеры.

Подходящие пенетранты в контексте настоящего изобретения включают все те вещества, которые типично используют для усиления пенетрации активных агрохимических соединений в растения. Пенетранты в этом контексте определяются таким образом, что, из (обычно водного) применяемого раствора и/или распыляемого покрытия, они способны проникать в кутикулу растения и таким образом повышать подвижность активных соединений в кутикуле. Это свойство можно определить, используя метод, описанный в литературе (Baur, et al., 1997, Pesticide Science 51, 131-152). Примеры включают спиртовые алкоксилаты, такие как этоксилат жирных кислот кокосового масла (10) или изотридецил этоксилат (12), сложные эфиры жирных кислот, таких как рапсовая или сложные метиловые эфиры соевого масла, алкоксилаты жирных аминов, такие как таллоуамин этоксилат (15), или соли аммония и/или фосфония, такие как, например, сульфат аммония или диаммоний гидрофосфат.

Препараты предпочтительно включают в диапазоне от 0,0001% до 98% по весу активного соединения или, особенно предпочтительно, в диапазоне от 0,01% до 95% по весу активного соединения, более предпочтительно в диапазоне от 0,5% до 90% по весу активного соединения, на основании веса препарата. Содержание активного соединения определяется как сумма рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и/или мутанта предпочтительного штамма микроорганизма, описанного в настоящей заявке, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам, и фунгицида и/или инсектицида, если они присутствуют.

Содержание активного соединения применяемых форм (продукты для защиты сельскохозяйственных культур), приготовленных из препаратов, может изменяться в широких диапазонах. Концентрация активного соединения применяемых форм может находиться типично в диапазоне от 0,0001% до 95% по весу активного соединения, предпочтительно в диапазоне от 0,0001% до 1% по весу, на основании веса применяемой формы. Применение осуществляют общепринятым способом, адаптированным к применяемым формам.

Кроме того, в одном аспекте согласно настоящему изобретению обеспечивается составной комплект, содержащий рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и/или мутант специфического штамма микроорганизма, раскрытого в настоящей заявке, имеющий все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере один метаболит, продуцируемый соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективном количестве в пространственно разделенном приспособлении.

В дальнейшем варианте осуществления согласно настоящему изобретению вышеуказанный составной комплект дополнительно включает по меньшей мере один фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид, при условии, что рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, инсектицид и фунгицид не являются идентичными. Фунгицид и/или инсектицид может присутствовать либо в компоненте составного комплекта агента биологической борьбы на основании рекомбинантного продуцирующего экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus или в компоненте составного комплекта, содержащем предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, которые пространственно разделенные или в обоих этих компонентах. В одном варианте осуществления, фунгицид и инсектицид присутствуют в компоненте агента биологической борьбы на основании рекомбинантного продуцирующего экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus.

Более того, составной комплект в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из группы, включающей модифицирующие агенты, растворители, самопроизвольные промоторы, носители, эмульсификаторы, диспергирующие вещества, вещества, защищающие от замерзания, загустители и адъюванты, как указано ниже. Это по меньшей мере один вспомогательное вещество может присутствовать либо в компоненте составного комплекта агента биологической борьбы на основании рекомбинантного продуцирующего экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus или в компоненте составного комплекта, содержащем предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, которые пространственно разделенные или в обоих этих компонентах.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения композиция, как описано выше, используется для уменьшения суммарного поражения растений и частей растений, а также потерей собранных фруктов или овощей, вызванных насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами.

Кроме того, в дальнейшем аспекте настоящего изобретения композиция, как описано выше, повышает суммарную жизнеспособность растения.

Термин "жизнеспособность растения" в целом включает различные виды улучшения у растений, которые не связаны с борьбой с вредителями. Например, благоприятные свойства, которые могут быть упомянуты, представляют собой улучшенные характеристики сельскохозяйственных культур, включая: прорастание, урожайность культур, содержание белка, масличность, содержание крахмала, более развитую корневую систему, улучшенный рост корней, улучшенное поддержание размера корней, улучшенную эффективность корней, улучшенная толерантность к стрессу (например, к засухе, жаре, соли, УФ, воде, холоду), уменьшение этилена (уменьшение продукции и/или ингибирование рецепции), увеличение побегообразования, увеличение высоты растения, большая листовая пластинка, меньше погибших базальных листьев, более сильные побеги, более зеленый цвет листьев, содержание пигмента, фотосинтетическая активность, меньшая потребность в поглощаемых веществах (такие как удобрения или вода), меньшая потребность в семенах, более продуктивные побеги, более ранее цветение, более ранее созревание зерна, меньше падение растений (полегание), увеличенный рост побегов, усиленная мощность растений, увеличенная густота стояния растений и ранняя и лучшая всхожесть.

По отношению к применению в соответствии с настоящим изобретением, улучшенная жизнеспособность растения предпочтительно относится к улучшенным характеристикам растений, включая: урожайность культуры, более развитую корневую систему (улучшенный рост корней), улучшенное поддержание размера корней, улучшенную эффективность корней, увеличение побегообразования, увеличение высоты растения, большая листовая пластинка, меньше погибших базальных листьев, более сильные побеги, более зеленый цвет листьев, фотосинтетическая активность, более продуктивные побеги, усиленная мощность растений, и увеличенная густота стояния растений.

В контексте настоящего изобретения, улучшенная жизнеспособность растения предпочтительно в особенности относится к улучшенным свойствам растения, выбранным из: урожайность культуры, более развитая корневая система, улучшенный рост корней, улучшенное поддержание размера корней, улучшенную эффективность корней, увеличение побегообразования, и увеличение высоты растения.

Влияние композиции в соответствии с настоящим изобретением на жизнеспособность растения, как определено в настоящей заявке, можно определить путем сравнения растений, которые росли в аналогичных условиях окружающей среды, в соответствии с этим часть указанных растений обрабатывали композицией в соответствии с настоящим изобретением, а другую часть указанных растений не обрабатывали композицией в соответствии с настоящим изобретением. Вместо этого, указанную другую часть не обрабатывали совсем или обрабатывали с помощью плацебо (то есть, применение без композиции в соответствии с изобретением, такое как применение без всех активных компонентов (то есть, без рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, как описано в настоящей заявке, и без другого предпочтительного агента биологической борьбы, как описано в настоящей заявке), или применение без рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, как описано в настоящей заявке, или применение без другого предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может применяться любым желательным способом, таким как в форме дражирования семян, пропитывания почвы, и/или непосредственно в борозду и/или в виде распыления на листья и применяя перед всходами, после входов или оба варианта. Другими словами, композицию можно использовать на семенах, растении или на собранных фруктах и овощах или на почве, где растение выращивают, или где ему желательно расти (локус роста растения).

Уменьшение суммарного поражения растений и частей растений часто приводит к более здоровым растениям и/или к повышению мощности и урожайности растений.

Предпочтительно, композицию в соответствии с настоящим изобретением используют для обработки обычных или трансгенных растений или их семян.

Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции роста растения, использующим любые из композиций, описанных выше, содержащие рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок и по меньшей мере один из дополнительных предпочтительных агентов биологической борьбы, описанных в настоящей заявке. Способ стимуляции роста растения включает нанесение на растение, часть растения, на локус, окружающий растение, или в котором растение будут выращивать (например, почву или другую среду для роста) композиции, содержащей рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий: (I) по меньшей мере один стимулирующий рост растений белок или пептид; и (II) нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, и по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и/или мутант специфического штамма микроорганизма, раскрытого в настоящей заявке, имеющий все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере один метаболит, продуцируемый соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам в синергетически эффективном количестве.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения, обеспечивается способ уменьшения суммарного поражения растений и частей растений, а также потерей собранных фруктов или овощей, вызванных насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами, включающий стадию одновременного или последовательного использования рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, в синергетически эффективном количестве.

В одном варианте осуществления заявленного способа композиция дополнительно включает по меньшей мере один фунгицид. В одном аспекте, по меньшей мере один фунгицид представляет собой синтетический фунгицид. В дальнейшем аспекте этого варианта осуществления, по меньшей мере один фунгицид выбирают из следующей группы: битертанол, биксафен, бромуконазол, карбендазим, карпропамид, дихлофлуанид, фенамидон, фенгексамид, фентин ацетат, фентин гидроксид, фторпиколид, флуопирам, флуоксастробин, флухинконазол, фосетил, ипродион, ипроваликарб, изотианил, метоминостробин, офурац, пенцикурон, пенфлуфен, прохлораз, пропамокарб, пропинеб, протиоконазол, пириметанил, спироксамин, тебуконазол, толилфлуанид, триадимефон, триадименол, триазоксид, и трифлоксистробин.

В другом варианте осуществления, композиция включает по меньшей мере один инсектицид дополнительно к фунгициду или вместо фунгицида, при условии, что инсектицид, фунгицид, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, не являются идентичными.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере один инсектицид представляет собой синтетический инсектицид. В дальнейшем варианте осуществления, по меньшей мере один инсектицид выбирают из следующей группы: ацетамиприд, алдикарб, амитраз, бета-цифлутрин, карбарил, клотианидин, цифлутрин, циперметрин, дельтаметрин, эндосульфан, этион, этипрол, этопрофос, фенамифос, фенобукарб, фентион, фипронил, флубендиамид, флуопирам, флупирадифурон, форметанат, гептанофос, имидаклоприд, метамидофос, метиокарб, метомил, никлозамид, оксидеметон-метил, фосалон, силафлуофен, спиродиклофен, спиромезифен, спиротетрамат, тиаклоприд, тиодикарб, тралометрин, триазофос, трифлумурон, и вамидотион.

Способ согласно настоящему изобретению включает следующие методы применения, то есть два компонента рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, могут быть приготовлены в форме одной, стабильной композиции с сельскохозяйственно приемлемым сроком хранения (так называемый "соло-препарат"), или их комбинируют перед или во время использования (так называемые "комбинированные препараты").

Если специально не было указано иначе, выражение "комбинация" обозначает различные комбинации рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительно предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида, в соло-препарате, в одной "готовой к смешиванию" форме, в комбинированной смеси для распыления, состоящей из соло-препаратов, такой как "баковая смесь", и в особенности при комбинированном применении отдельных активных компонентов, если применяются последовательным образом, то есть, один после другого в пределах целесообразно короткого периода, такого как несколько часов или дней, например, от 2 часов до 7 дней. Порядок применения композиции в соответствии с настоящим изобретением не является важным для осуществления настоящего изобретения. Таким образом, термин "комбинация" также охватывает присутствие рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительно предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или инсектицида на или в растении, подвергаемое обработке или его окружающую среду, место произрастания или место хранения, например, после одновременного или последовательного применения рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида на растение его окружающую среду, место произрастания или место хранения.

Если рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере один фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид применяют или используют последовательным образом, то является предпочтительным обрабатывать растения или части растений (которые включают семена и растения, проросшие из семян), собранные фрукты и овощи в соответствии со следующим способом: Во-первых применяют по меньшей мере один фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид на растение или части растения, и во-вторых применяют дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus на то же самое растение или части растения. При использовании таким образом, количество оставшихся инсектицидов/фунгицидов в растении при сборе урожая является минимально возможным. Временные периоды между первым и вторым применением в пределах цикла роста (культуры) может изменяться и зависит от достигаемого эффекта. Например, первое применение осуществляют для предупреждения заражения растения или частей растения насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами (это особенно предпочтительно в случае, если осуществляют обработку семян) или для борьбы с заражением насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами (это особенно предпочтительно в случае обработки растений и частей растений) и второе применение осуществляют для предотвращения или борьбы с заражением насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами и/или для стимуляции роста растения. Борьба в этом контексте обозначает, что композиция, содержащая рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, не способна полностью уничтожить вредителей или фитопатогенных грибов, но способна поддерживать заражение на приемлемом уровне.

Настоящее изобретение также обеспечивает способы усиления уничтожающей, ингибирующей, предупреждающей и/или отпугивающей активности композиций согласно настоящему изобретению путем многократных применений. В некоторых других вариантах осуществления, композиции согласно настоящему изобретению применяют на растении и/или части растения два раза, во время любых желательных стадий развития или при заранее определенном давлении вредителей, в интервале приблизительно 1 час, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно два дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 1 неделя, приблизительно 10 дней, приблизительно две недели, приблизительно три недели, приблизительно 1 месяц или больше. Еще в некоторых вариантах осуществления, композиции согласно настоящему изобретению применяют на растении и/или части растения больше, чем два раза, например, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, или больше, во время любых желательных стадий развития или при заранее определенном давлении вредителей, в интервале приблизительно 1 час, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно два дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 1 неделя, приблизительно 10 дней, приблизительно две недели, приблизительно три недели, приблизительно 1 месяц или больше. Интервалы между каждым применением могут изменяться, если это является желательным. Квалифицированный специалист в данной области техники сможет определить количество применений и длину интервалов в зависимости от видов растений, видов вредителей растений и других факторов.

При осуществлении вышеуказанных стадий, можно достичь чрезвычайно низкого уровня остатков по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере один инсектицида на обработанных растениях, частях растений, и собранных фруктах и овощах.

Если специально не было указано иначе, обработку растений или частей растений (которые включают семена и растения, проросшие из семян), собранных фруктов и овощей композицией в соответствии с изобретением осуществляют непосредственно или путем воздействия на их окружающую среду, место произрастания или место хранения, используя общепринятые методы обработки, например, погружение, распыление, атомизацию, орошение, упаривание, опыление, создание тумана, разбрасывание, образование пены, окрашивание, намазывание, полив (пропитывание), капельное орошение. Кроме того, представляется возможным применять рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере один фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид в виде соло-препарата или комбинированных препаратов с помощью метода сверхнизкого объема, или инъецировать композицию в соответствии с настоящим изобретением в виде композиции или в виде подошвенных препаратов в почву (в борозду).

Термин "растение, подвергаемое обработке" охватывает каждую часть растения, включая его корневую систему и материал - например, почву или питательную среду - которое имеет радиус по меньшей мере 10 см, 20 см, 30 см вокруг стебля или ствола растения, подвергаемого обработке, или которое составляет по меньшей мере 10 см, 20 см, 30 см вокруг корневой системы указанного растения, подвергаемого обработке, соответственно.

Количество рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, которые используют или применяют в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным предпочтительным агентом биологической борьбы, описанным в настоящей заявке, необязательно в присутствии по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида, зависит от конечного препарата, а также от размера или типа растения, частей растения, семян, собранных фруктов и овощей, подвергаемых обработке. Обычно, рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus, которые применяют или используют в соответствии с изобретением, присутствуют в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 80% (мас./мас.), предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 60% (мас./мас.), более предпочтительно от приблизительно 10% до приблизительно 50% (мас./мас.) его соло-препарата или комбинированного препарата с по меньшей мере одним дополнительным предпочтительным агентом биологической борьбы, описанным в настоящей заявке, и необязательно фунгицид и/или по меньшей мере один инсектицид.

Также количество по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, который используют или применяют в комбинации, с рекомбинантными продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus, необязательно в присутствии по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида, зависит от конечного препарата, а также от размера или типа растения, частей растения, семян, собранных фруктов и овощей, подвергаемых обработке. Обычно, дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, которые применяют или используют в соответствии с изобретением, присутствует в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 80% (мас./мас.), предпочтительно 1% до приблизительно 60% (мас./мас.), более предпочтительно приблизительно 10% до приблизительно 50% (мас./мас.) его соло-препарата или комбинированного препарата, с рекомбинантными продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus, и необязательно по меньшей мере одним фунгицидом и/или по меньшей мере один инсектицидом.

Применение рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus может осуществляться в виде распыления на листья, в виде почвенной обработки, и/или в виде протравливания семян/дражирования. Если используют в виде листовой обработки, в одном варианте осуществления, от приблизительно 1/16 до приблизительно 5 галлонов цельного бульона применяют на акр. При использовании в виде почвенной обработки, в одном варианте осуществления, от приблизительно 1 до приблизительно 5 галлонов цельного бульона применяют на акр. При использовании для протравливания семян от приблизительно 1/32 до приблизительно 1/4 галлонов цельного бульона применяют на акр. Для протравливания семян, конечный используемый препарат содержит по меньшей мере 1×10⁴, по меньшей мере 1×10⁵, по меньшей мере 1×10⁶, 1×10⁷, по меньшей мере 1×10⁸, по меньшей мере 1×10⁹, по меньшей мере 1×10¹⁰ колониеобразующих единиц на грамм.

Рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и по меньшей мере один дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, и, если присутствует, предпочтительно также фунгицид и/или инсектицид, используют или применяют в синергетическом весовом соотношении. Квалифицированный специалист способен установить синергетические весовые соотношения для настоящего изобретения с помощью обычных методов. Квалифицированный специалист понимает, что все эти соотношения относятся к соотношению в пределах комбинированного препарата, а также к рассчитанному соотношению рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, описанных в настоящей заявке, и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, если оба компонента применяются в виде моно-препаратов на растении, подвергаемом обработке. Квалифицированный специалист может рассчитать это соотношение путем простых математических вычислений, поскольку объем и количество рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, соответственно, в моно-препарате известно квалифицированному специалисту в данной области техники.

Соотношение может быть рассчитано на основании количества по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, в момент времени применения указанного компонента из комбинации в соответствии с изобретением на растении или части растения и количество рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus незадолго до (например, 48 ч, 24 ч, 12 ч, 6 ч, 2 ч, 1 ч) или в момент времени применения указанного компонента из комбинации в соответствии с изобретением на растении или части растения.

Применение рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, на растение или часть растения может осуществляться одновременно или в различное время до тех пор, пока оба компонента присутствуют на или в растении после применения (й). В случаях, если рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus и дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, применяют в различное время и дополнительный предпочтительный агент биологической борьбы, описанный в настоящей заявке, применяют перед рекомбинантными продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus, то квалифицированный специалист может определить концентрацию дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, на/в растении с помощью химического анализа, известного в данной области техники, в момент времени или незадолго до момента времени применения рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus. И наоборот, если рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus применяют на растении первыми, то концентрацию рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus можно определить, используя тесты, которые также известны в данной области техники, в момент времени или незадолго до момента времени применения дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке.

В особенности, в одном варианте осуществления синергетическое весовое соотношение рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus (то есть, неприготовленный споровый препарат) и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, находится в диапазоне от 1:1000 до 1000:1; в диапазоне от 1:500 до 500:1; в диапазоне от 1:300 до 500:1. Дополнительные соотношения находятся в интервале от 20:1 до 1:20, таком как 10:1, 5:1 или 2:1. В вариантах осуществления, в которых агент биологической борьбы создан на основании Bacillus, соотношения веса к весу будет применяться к неприготовленному препарату спор Bacillus. В одном аспекте этого варианта осуществления, препараты спор как рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, так и агента биологической борьбы на основании Bacillus, представляют собой высушенный препарат спор, содержащий по меньшей мере приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г, по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, по меньшей мере приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, по меньшей мере приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, и по меньшей мере приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г. В другом варианте осуществления соотношение колониеобразующий единицы к колониеобразующей единице рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и предпочтительного агента биологической борьбы на основании Bacillus, описанного в настоящей заявке, находится в диапазоне от 1:100,000 до 100,000 до 1, в диапазоне от 1:10,000 до 10,000:1, в диапазоне от 1:1000 до 1000:1, в диапазоне от 1:500 до 500:1, в диапазоне от 1:100 до 100:1, в диапазоне от 1:10 до 10:1, в диапазоне от 1:5 до 5:1, и в диапазоне от 1:1.

В одном варианте осуществления согласно настоящему изобретению, концентрация агента биологической борьбы на основании рекомбинантного продуцирующего экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus после диспергирования составляет по меньшей мере 50 г/га, например 50 - 7500 г/га, 50 - 2500 г/га, 50 - 1500 г/га; по меньшей мере 250 г/га (гектар), по меньшей мере 500 г/га или по меньшей мере 800 г/га.

Норма внесения композиции, применяемой или используемой в соответствии с настоящим изобретением, может изменяться. Квалифицированный специалист может установить подходящую норму внесения с помощью общепринятых экспериментов.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения обеспечивается обработка семян с применением композиции, как описано выше.

Борьба с насекомыми, клещами, нематодами и/или фитопатогенами путем обработки семян растений была известна в течение длительного времени и она является предметом постоянных улучшений. Тем не менее, обработка семян вызывает целый ряд проблем, которые не всегда могут быть решены удовлетворительно. Таким образом, является желательным разрабатывать способы защиты семян и проросшего растения, в котором устранена потребность, или по меньшей мере существенно уменьшена, дополнительной доставки композиций для защиты сельскохозяйственных культур в течение периода хранения, после высевания или после прорастания растений. Кроме того, является желательным оптимизировать количество применяемого активного компонента таким образом, чтобы обеспечить наилучшую возможную защиту для семян и проросшего растения от нападения насекомых, клещей, нематод и/или фитопатогенов, но не вызывая при этом повреждения самого растения применяемым активным компонентом. В особенности, способы обработки семян должны также принимать во внимание присущие инсектицидные и/или нематицидные свойства резистентных к вредителям или толерантных к вредителям трансгенных растений, для достижения оптимальной защиты семян и проросшего растения при минимальном использовании композиций для защиты сельскохозяйственных культур.

Следовательно, настоящее изобретение также относится, в особенности, к способу защиты семян и проросших растений от нападения вредителей, путем обработки семян с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus, как определено выше, и по меньшей мере одного дополнительного агента биологической борьбы, выбранного из предпочтительных микроорганизмов, раскрытых в настоящей заявке, и/или мутанта специфического штамма микроорганизма, описанного в настоящей заявке, имеющего все идентификационные характеристики соответствующего штамма, и/или по меньшей мере одного метаболита, продуцируемого соответствующим штаммом, который проявляет активность по отношению к насекомым, клещам, нематодам и/или фитопатогенам и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или необязательно по меньшей мере одного инсектицида согласно изобретению. Способ согласно изобретению для защиты семян и проросших растений от нападения вредителей охватывает способ, в котором семена обрабатывают одновременно за одну операцию, с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида. Он также охватывает способ, в котором семена обрабатывают в различное время, с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида.

Аналогичным образом, изобретение относится к применению композиции согласно изобретению для обработки семян для защиты семян и полученного растения от насекомых, клещей, нематод и/или фитопатогенов.

Изобретение также относится к семенам, которые в одно и тоже время были обработаны рекомбинантными продуцирующими экзоспорий клетками Bacillus и по меньшей мере одним дополнительным предпочтительным агентом биологической борьбы, описанным в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одним фунгицидом и/или по меньшей мере одним инсектицидом. Изобретение также относится к семенам, которые были обработаны в различное время, с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одним дополнительным предпочтительным агентом биологической борьбы, описанным в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одним фунгицидом и/или по меньшей мере одним инсектицидом. В случае семян, которые были обработаны в различное время, с помощью рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, и необязательно по меньшей мере одного фунгицида и/или по меньшей мере одного инсектицида, индивидуальные активные компоненты в композиции согласно изобретению могут присутствовать в различных шарах на семенах.

Кроме того, изобретение относится к семенам, которые, после обработки с помощью композиция согласно изобретению, подвергаются процессу нанесения пленочного покрытия для предотвращения механического повреждения семян частичками пыли.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что, благодаря предпочтительным системным свойствам композиций согласно изобретению, обработка семян этими композициями обеспечивает защиту от насекомых, клещей, нематод и/или фитопатогенов не только для самих семян, но также и для растений, выросших с этих семян после прорастания. Следовательно, может отсутствовать необходимость обрабатывать культуры непосредственно во время высевания или сразу после него.

Дальнейшим преимуществом является тот факт, что, при обработке семян композицией согласно изобретению, можно способствовать прорастанию и схожести обработанных семян.

Аналогичным образом, является благоприятным, что композицию согласно изобретению также можно использовать, в особенности, на трансгенных семенах.

Также следует отметить, что композицию согласно изобретению можно использовать в комбинации со средствами технологии передачи сигналов, в результате чего улучшается, например, колонизация симбионтами, такими как клубеньковые бактерии, микориза и/или эндофитные бактерии, например, усиливается, и/или оптимизируется фиксация азота.

Композиции согласно изобретению пригодны для защиты семян любых видов растений, пригодны в сельском хозяйстве, в теплице, в лесном хозяйстве или в садоводства. Более предпочтительно, данные семена представляют собой семена зерновых (например, пшеница, ячмень, рожь, овес и просо), кукуруза, хлопчатник, соя, рис, картофель, подсолнечник, кофе, табак, канола, масличный рапс, свекла (например, сахарная свекла и кормовая свекла), арахис, овощные культуры (например, томаты, огурец, бобовые, капуста, лук и салат-латук), плодовые растения, газонные травы и декоративные растения. Особенно предпочтительным является обработка семян зерновых (таких как пшеница, ячмень, рожь и овес) кукуруза, соя, хлопчатник, канола, масличный рапс и рис.

Как уже было указано выше, обработка трансгенных семян с помощью композиции согласно изобретению является чрезвычайно важной. Эти семена представляют собой семена растений, которые обычно содержат по меньшей мере один гетерологичный ген, который контролирует экспрессию полипептида, имеющего, в особенности, инсектицидные и/или нематицидные свойства. Эти гетерологичные гены в трансгенных семенах могут иметь происхождение из микроорганизмов, таких как Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Clavibacter, Glomus или Gliocladium. Настоящее изобретение особенно пригодно для обработки трансгенных семян, которые содержат по меньшей мере один гетерологичный ген из Bacillus sp. Особенно предпочтительно, данный гетерологичный ген имеет происхождение из Bacillus thuringiensis.

Для целей настоящего изобретения, композиция согласно изобретению применяется отдельно или в подходящем препарате на семенах. Семена обычно обрабатывают в условиях, в которых оно стабильно таким образом, чтобы не происходило повреждений в процессе обработки. В общем, семена могут быть обработаны в любой период времени между сбором урожая и высеванием. Типично, используют семена, которые были отделены от растения и с которых были удалены стержни початков кукурузы, стручки, стебли, шелуха, волосы или пульпа. Таким образом, например, можно использовать семена, которые были собраны, очищены и высушены до содержания влаги менее, чем 15% по весу. Альтернативно, также можно использовать семена, которые после высушивания были обработаны водой, например, и потом снова высушены.

При обработке семян необходимо, в целом, обеспечивать, чтобы количество композиции согласно изобретению, и/или других аддитивов, которое применяется на семенах, выбирали таким образом, чтобы не оказывать отрицательного воздействия на прорастание семян, и/или чтобы растения, которые выросли из этих семян, не были поврежденными. Это особенно важно в тех случаях, когда активные компоненты могут проявлять фитотоксические эффекты при определенных нормах внесения.

Композиции согласно изобретению можно применять непосредственно, другими словами, они не содержат дополнительных компонентов и не были разведены. Обычно, предпочтительно применять композиции в форме подходящего препарата на семенах. Подходящие препараты и способы протравливания семян известны квалифицированному специалисту и описаны, например, в следующих документах: патенты US №№4,272,417 А; 4,245,432 А; 4,808,430 А; 5,876,739 А; опубликованная заявка на патент US №2003/0176428 Al;WO 2002/080675 Al; WO 2002/028186 A2.

Комбинации, которые можно использовать в соответствии с изобретением, можно превращать в общепринятые препараты для протравливания семян, такие как растворы, эмульсии, суспензии, порошки, пены, взвеси или другие композиции для нанесения покрытий на семена, и также ULV препараты.

Эти препараты приготавливают с помощью известного способа, путем смешивания композиции с общепринятыми адъювантами, такими как, например, общепринятые модифицирующие агенты и также растворители или разбавители, красители, смачиватели, диспергирующие вещества, эмульсификаторы, противовспениватели, консерванты, вторичные загустители, клейкие заполнители, гибереллины, а также вода.

Красители, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все красители, которые обычно используются для таких целей. В этом контексте, представляется возможным использовать не только пигменты, которые плохо растворяются в воде, но также растворимые в воде красители. Примеры включают красители, известные под обозначениями Rhodamin В, С.I. Pigment Red 112 и С.I. Solvent Red 1.

Смачиватели, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все вещества, которые способствуют смачиванию и которые обычно используются в препарате активных агрохимических компонентов. Предпочтительно можно использовать алкилнафталинсульфонаты, такие как диизопропил- или диизобутил-нафталинсульфонаты.

Диспергирующие вещества и/или эмульсификаторы, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все неоионные, анионные и катионные диспергирующие вещества, которые обычно используются в препарате активных агрохимических компонентов. Предпочтительно можно использовать неоионные или анионные диспергирующие вещества или смеси неоионных или анионных диспергирующих веществ. Подходящие неоионные диспергирующие вещества представляют собой, в особенности, блок-полимеры этиленоксид-пропиленоксид, алкилфенол полигликолевые простые эфиры и также тристририлфенольные полигликолевые простые эфиры, и их фосфатированные или сульфатированные производные. Подходящие анионные диспергирующие вещества представляют собой, в особенности, лигносульфонаты, соли полиакриловой кислоты, и конденсаты арилсульфонат-формальдегиды.

Противовспениватели, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все ингибиторы пенообразования, которые обычно используются в препарате активных агрохимических компонентов. Предпочтительно можно использовать силиконовые противовспениватели и стеарат магния.

Консерванты, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все вещества, которые можно использовать для таких целей в агрохимических композициях. Примеры включают дихлорфен и полуформаль бензилового спирта.

Вторичные загустители, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все вещества, которые можно использовать для таких целей в агрохимических композициях. Эти компоненты предпочтительно включают производные целлюлозы, производные ариловой кислоты, ксантан, модифицированную глину и высокодиспергированный диоксид кремния.

Клейкие заполнители, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают все общепринятые связующие, которые можно использовать в продуктах для протравливания семян. Предпочтительно можно упомянуть поливинилпирролидон, поливинилацетат, поливиниловый спирт и тилозу.

Гибереллины, которые могут присутствовать в препаратах для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают предпочтительно гибереллины А1, A3 (=гиббереллиновая кислота), А4 и А7, где особенно предпочтительно используется гиббереллиновая кислота. Гибереллины известны (ср. R. Wegler, "Chemie der Pflanzenschutz- und

", том 2, Springer Verlag, 1970, cc. 401-412).

Препараты для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, могут использоваться либо непосредственно или предварительно разведенные водой, для обработки семян любых различных типов. Таким образом, концентраты или препараты, получаемые из них путем разведения водой, могут применяться для протравливания семян зерновых, таких как пшеница, ячмень, рожь, овес и тритикале, и также семян кукурузы, риса, масличного рапса, гороха, бобов, хлопчатника, подсолнечника и свеклы, или также семян любых различных сортов овощных культур. Препараты для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, или их разведенные препараты, также можно использовать для протравливания семян трансгенных растений. В этом случае, могут происходить дополнительные синергетические эффекты при взаимодействии с веществами, образованными при экспрессии.

Для обработки семян препаратами для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, или препаративными формами, полученными из них путем разведения водой, подходящее оборудование для смешивания включает все такое оборудование, которое типично можно применять для протравливания семян. Более предпочтительно, процедура, когда осуществляют протравливание семян, состоит в помещении семян в смеситель, добавление предпочтительного желательного количества препаратов для протравливания семян, либо как таковых или после предварительного разведения водой, и осуществления смешивания до однородного распределения препарата на семенах. После этого можно осуществлять этап высушивания.

Норма внесения препараты для протравливания семян, которые можно использовать в соответствии с изобретением, могут изменяться в относительно широком диапазоне. При этом руководствуются предпочтительным количеством рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного дополнительного предпочтительного агента биологической борьбы, описанного в настоящей заявке, в препаратах, и семенами. Нормы внесения для композиции в целом находятся в диапазоне от 0,001 и 50 г на килограмм семян, предпочтительно в диапазоне от 0,01 и 15 г на килограмм семян.

Кроме того, композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет сильную микробицидную активность и ее можно использовать для борьбы с нежелательными микроорганизмами, такими как грибы и бактерии, для защиты сельскохозяйственных культур и для защиты материалов.

Изобретение также относится к способу борьбы с нежелательными микроорганизмами, который характеризуется тем, что композицию в соответствии с изобретением применяют на фитопатогенных грибах, фитопатогенных бактериях и/или местах их обитания.

Фунгициды можно использовать для защиты сельскохозяйственных культур для борьбы с фитопатогенными грибами. Они характеризуются чрезвычайно хорошей эффективностью по отношению к широкому спектру фитопатогенных грибов, включая почвенные патогены, которые, в особенности, являются представителями классов Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (Син. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes (Син. Fungi imperfecti). Некоторые фунгициды являются системно активными и их можно использовать для защиты растений в качестве листового фунгицида, протравливателя семян или почвенного фунгицида. Кроме того, они являются пригодными для борьбы с грибами, которые, в частности, инфицируют древесину или корни растений.

Бактерициды можно использовать для защиты сельскохозяйственных культур для борьбы с Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae и Streptomycetaceae.

Неограничивающие примеры патогенов грибковых заболеваний, с которым можно бороться в соответствии с изобретением, включают:

заболевания, вызываемые патогенами настоящей мучнистой росы, например, виды Blumeria, например, Blumeria graminis; виды Podosphaera, например, Podosphaera leucotricha; виды Sphaerotheca, например, Sphaerotheca fuliginea; виды Uncinula, например, Uncinula necator;

заболевания, вызываемые патогенами ржавчинных заболеваний, например, виды Gymnosporangium, например, Gymnosporangium sabinae; виды Hemileia, например, Hemileia vastatrix; виды Phakopsora, например, Phakopsora pachyrhizi и Phakopsora meibomiae; виды Puccinia, например, Puccinia recondite, P. triticina, P. graminis или P. striiformis или P. hordei; виды Uromyces, например, Uromyces appendiculatus;

заболевания, вызываемые патогенами из группы Oomycetes, например, виды Albugo, например, Algubo Candida; виды Bremia, например, Bremia lactucae; виды Peronospora, например, Peronospora pisi, P. parasitica или P. brassicae; виды Phytophthora, например, Phytophthora infestans; виды Plasmopara, например, Plasmopara viticola; виды Pseudoperonospora, например, Pseudoperonospora humuli или Pseudoperonospora cubensis; виды Pythium, например, Pythium ultimum;

заболевания пятнистости листьев и заболевания увядания листьев, вызываемые, например, такими возбудителями: виды Alternaria, например, Alternaria solani; виды Cercospora, например, Cercospora beticola; виды Cladiosporium, например, Cladiosporium cucumerinum; Cochliobolus виды, например, Cochliobolus sativus (конидиальная форма: Drechslera, Син: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; виды Colletotrichum, например, Colletotrichum lindemuthanium; виды Cycloconium, например, Cycloconium oleaginum; виды Diaporthe, например, Diaporthe citri; виды Elsinoe, например, Elsinoe fawcettii; виды Gloeosporium, например, Gloeosporium laeticolor; виды Glomerella, например, Glomerella cingulata; виды Guignardia, например, Guignardia bidwelli; виды Leptosphaeria, например, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria nodorum; виды Magnaporthe, например, Magnaporthe grisea; виды Microdochium, например, Microdochium nivale; виды Mycosphaerella, например, Mycosphaerella graminicola, M. arachidicola и M. fijiensis; виды Phaeosphaeria, например, Phaeosphaeria nodorum; виды Pyrenophora, например, Pyrenophora teres, Pyrenophora tritici repentis; виды Ramularia, например, Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; виды Rhynchosporium, например, Rhynchosporium secalis; виды Septoria, например, Septoria apii, Septoria lycopersii; виды Typhula, например, Typhula incarnata; виды Venturia, например, Venturia inaequalis;

заболевания корней и стеблей, вызываемые, например, такими возбудителями: виды Corticium, например, Corticium graMuuarum; виды Fusarium, например, Fusarium oxysporum; виды Gaeumannomyces, например, Gaeumannomyces graminis; виды Rhizoctonia, такие как, например, Rhizoctonia solani; Sarocladium заболевания, вызываемые например, Sarocladium oryzae; Sclerotium заболевания, вызываемые например, Sclerotium oryzae; виды Tapesia, например, Tapesia acuformis; виды Thielaviopsis, например, Thielaviopsis basicola;

заболевания початков и метелок (включая початки кукурузы), вызываемые, например, такими возбудителями: виды Alternaria, например, Alternaria spp.; виды Aspergillus, например, Aspergillus flavus; виды Cladosporium, например, Cladosporium cladosporioides; виды Claviceps, например, Claviceps purpurea; виды Fusarium, например, Fusarium culmorum; виды Gibberella, например, Gibberella zeae; виды Monographella, например, Monographella nivalis; виды Septoria, например, Septoria nodorum; заболевания, вызываемые головневыми грибами, например, виды Sphacelotheca, например, Sphacelotheca reiliana; виды Tilletia, например, Tilletia caries, Т. controversa; виды Urocystis, например, Urocystis occulta; виды Ustilago, например, Ustilago nuda, U. nuda tritici;

плодовая гниль, вызываемая, например, такими возбудителями: виды Aspergillus, например, Aspergillus flavus; виды Botrytis, например, Botrytis cinerea; виды Penicillium, например, Penicillium expansum и P. purpurogenum; виды Sclerotinia, например, Sclerotinia sclerotiorum; виды Verticilium, например, Verticilium alboatrum;

заболевания семян и передающиеся через почву порча, плесень, полегание, гниль и увядание, вызываемые, например, такими возбудителями: виды Alternaria, вызываемые, например, Alternaria brassicicola; виды Aphanomyces, вызываемые, например, Aphanomyces euteiches; виды Ascochyta, вызываемые, например, Ascochyta lentis; виды Aspergillus, вызываемые, например, Aspergillus flavus; виды Cladosporium, вызываемые, например, Cladosporium herbarum; виды Cochliobolus, вызываемые, например, Cochliobolus sativus; (конидиальная форма: Drechslera, Bipolaris Син: Helminthosporium); виды Colletotrichum, вызываемые, например, Colletotrichum coccodes; виды Fusarium, вызываемые, например, Fusarium culmorum; виды Gibberella, вызываемые, например, Gibberella zeae; виды Macrophomina, вызываемые, например, Macrophomina phaseolina; виды Monographella, вызываемые, например, Monographella nivalis; виды Penicillium, вызываемые, например, Penicillium expansum; виды Phoma, вызываемые, например, Phoma lingam; виды Phomopsis, вызываемые, например, Phomopsis sojae; виды Phytophthora, вызываемые, например, Phytophthora cactorum; виды Pyrenophora, вызываемые, например, Pyrenophora graMuna; виды Pyricularia, вызываемые, например, Pyricularia oryzae; виды Pythium, вызываемые, например, Pythium ultimum; виды Rhizoctonia, вызываемые, например, Rhizoctonia solani; виды Rhizopus, вызываемые, например, Rhizopus oryzae; виды Sclerotium, вызываемые, например, Sclerotium rolfsii; виды Septoria, вызываемые, например, Septoria nodorum; виды Typhula, вызываемые, например, Typhula incarnata; виды Verticillium, вызываемые, например, Verticillium dahliae;

рак, галлы и ведьмины метлы, вызываемые, например, видами Nectria, например, Nectria galligena;

увядающие заболевания, вызываемые, например, такими возбудителями: виды Monilinia, например, Monilinia laxa;

заболевания пузырчатости листьев и кучерявости листьев, вызываемые, например, такими возбудителями: виды Exobasidium, например, Exobasidium vexans;

виды Taphrina, например, Taphrina deformans;

увядающие заболевания древесных растений, вызываемые, например, эску винограда, вызываемые, например, Phaemoniella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum и Fomitiporia mediterranea; этипоз, вызываемый, например, Eutypa lata; заболевания Ganoderma, вызываемые например, Ganoderma boninense; заболевания Rigidoporus, вызываемые например, Rigidoporus lignosus;

заболевания цветов и семян, вызываемые, например, видами Botrytis, например, Botrytis cinerea;

заболевания клубней растений, вызываемые, например, видами Rhizoctonia, например, Rhizoctonia solani; виды Helminthosporium, например, Helminthosporium solani;

кила, вызываемая, например, видами Plasmodiophora, например, Plamodiophora brassicae;

заболевания, вызываемые бактериальными патогенами, например, такими возбудителями: виды Xanthomonas, например, Xanthomonas campestris pv. oryzae; виды Pseudomonas, например, Pseudomonas syringae pv. lachrymans; виды Erwinia, например, Erwinia amylovora.

Следующие заболевания сои можно предпочтительно контролировать:

Грибковые заболевания на листьях, стеблях, стручках и семенах, вызываемые, например, возбудителями: Alternaria пятнистость листьев (Alternaria spec, atrans tenuissima), антракноз (Colletotrichum gloeosporoides dematium var. truncatum), бурая пятнистость (Septoria glycines), церкоспорозная пятнистость и гниль листьев (Cercospora kikuchii), повреждение листьев choanephora (Choanephora infundibulifera trispora (Син.)), повреждение листьев dactuliophora (Dactuliophora glycines), ложная мучнистая роса (Peronospora manshurica), пятнистость, вызванная drechslera (Drechslera glycini), селенофомозная пятнистость листьев {Cercospora sojina), пятнистость листьев, вызванная leptosphaerulina (Leptosphaerulina trifolii), филлостиктозная пятнистость листьев (Phyllosticta sojaecola), гниль бобов и стеблей (Phomopsis sojae), настоящая мучнистая роса (Microsphaera diffusa), пятнистость листьев, вызванная pyrenochaeta (Pyrenochaeta glycines), ризоктониозная воздушная, листовая и паутинистая гниль (Rhizoctonia solani), ржавчина (Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), парша (Sphaceloma glycines), стемфилийная пятнистость листьев (Stemphylium botryosum), мишеневидная пятнистость листьев (Corynespora cassiicola).

Грибковые заболевания на корнях и основании стебля, вызываемые, например, возбудителями: черная корневая гниль (Calonectria crotalariae), угольная гниль (Macrophomina phaseolina), фузариозная гниль или увядание, корневая гниль, и гниль стручков и ветвей (Fusarium oxysporum, Fusarium orthoceras, Fusarium semitectum, Fusarium equiseti), корневая гниль, вызванная mycoleptodiscus (Mycoleptodiscus terrestris), neocosmospora (Neocosmospora vasinfecta), гниль бобов и стеблей (Diaporthe phaseolorum), рак стебля (Diaporthe phaseolorum var. caulivora), фитофторозная гниль (Phytophthora megasperma), бурая гниль стеблей (Phialophora gregata), грибная гниль (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultimum), ризоктониальная корневая гниль, разрушение стебля и черная ножка (Rhizoctonia solani), склеротиническое выпревание стебля (Sclerotinia sclerotiorum), склеротиническая южная гниль (Sclerotinia rolfsii), корневая гниль, вызванная thielaviopsis (Thielaviopsis basicola).

Композиции в соответствии с изобретением можно использовать для лечебной или защитной/профилактической борьбы с фитопатогенными грибами. Следовательно, изобретение также относится к лечебным и защитным способам борьбы с фитопатогенными грибами путем применения композиции в соответствии с изобретением, которую наносят на семена, растения или части растений, плоды или почву, в которой растет растение.

Тот факт, что композиция хорошо переносится растениями при концентрациях, необходимых для борьбы с болезнями растений, предоставляет возможность обрабатывать надземные части растений, ствол и семена для размножения, и почву.

В соответствии с изобретением можно обрабатывать все растения и части растений. Под растениями подразумевают все растения и популяции растений, такие как желательные и нежелательные дикие растения, культивары и сорта растений (которые защищены или незащищены правами собственника сорта растения или селекционера). Культивары и сорта растений могут представлять собой растений, полученные путем общепринятых методов размножения и селекции, которые могут дополнены или усилены с помощью одного или нескольких биотехнологических методов, например, путем использования двойных гаплоидов, слияния протопластов, случайного и направленного мутагенеза, молекулярных или генетических маркеров или с помощью биотехнологических и генно-инженерных методов. Под частями растений подразумевают все вышеуказанные надземные и подземные части и органы растений, такие как черенок, листок, цветок и корень, таким образом, например, перечисляются листья, иголки, стебли, ветки, цветы, плодовые тела, плоды и семена, а также корни, луковицы и ризомы. Также к частям растений относятся урожай, вегетативный и генеративный материал размножения, например, черенки, луковицы, ризомы, усы и семена.

Композиция в соответствии с изобретением, когда она хорошо переносится растением, имеет благоприятную гомеотермическую токсичность и хорошо переносится окружающей средой, пригодна для защиты растений и органов растений, для усиления собранного урожая, для улучшения качества собранного материала. Предпочтительно она может использоваться в качестве композиции для защиты сельскохозяйственных культур. Она является активной по отношению к чувствительным и резистентным видам в обычных условиях и по отношению ко всем или некоторым стадиям развития.

Растения, которые можно обрабатывать в соответствии с изобретением, включают следующие основные культурные растения: кукуруза, соя, люцерна, хлопчатник, подсолнечник, семена масличных культур Brassica, такие как Brassica napus (например, канола, семена рапса), Brassica гара, В. juncea (например, (полевая) горчица) и Brassica carinata, Arecaceae sp.(например, масличная пальма, кокосовая пальма), рис, пшеница, сахарная свекла, сахарный тростник, овес, рожь, ячмень, просо и сорго, тритикале, лен, орехи, виноград и виноград и различные фрукты и овощи с различных ботанических таксонов, например, Rosaceae sp.(например, мясистые семечковые плоды, такие как яблоки и груши, но также косточковые плоды, такие как абрикосы, вишни, миндаль, сливы и персики, и ягодные плоды, такие как земляника, малина, красная и черная смородина и крыжовник), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp. (например, оливковое дерево), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (например, авокадо, корица, камфара), Musaceae sp. (например, банановые деревья и плантации), Rubiaceae sp.(например, кофе), Theaceae sp.(например, чай), Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (например, лимоны, апельсины, мандарины и грейпфруты); Solanaceae sp.(например, помидоры, картофель, перец, стручковый перец, баклажан, табак), Liliaceae sp., Compositae sp.(например, салат-латук, артишок и цикорий - включая корневой цикорий, салатный или обыкновенный цикорий), Umbelliferae sp.(например, морковь, петрушка, селера и сальдерей), Cucurbitaceae sp. (например, огурцы - включая корнишоны, тыквы, арбузы, тыквенное дерево и дыни), Alliaceae sp. (например, лук-порей и лук), Cruciferae sp. (например, капуста белокочанная, капуста краснокочанная, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, пекинская капуста, кольраби, хрен, кресс-салат и капуста китайская), Leguminosae sp. (например, арахис, горох, чечевица и бобовые - например, фасоль обыкновенная и кормовые бобы), Chenopodiaceae sp. (например, листовая свекла, кормовая свекла, шпинат, столовая свекла), Linaceae sp. (например, конопля), Cannabeacea sp. (например, cannabis), Malvaceae sp. (например, окра, какао), Papaveraceae (например, мак), Asparagaceae (например, спаржа); полезные растения и декоративные растения в садах и лесах, включая дерн, газоны, траву, и Stevia rebaudiana; и в каждом случае генетически модифицированные типы этих растений.

В зависимости от видов растений или культиваров растений, их местонахождения и условий роста (почва, климат, период вегетации, питание), использования или применения композиции в соответствии с настоящим изобретением, обработка в соответствии с изобретением также может приводит к сверх-аддитивным ("синергетическим") действиям. Таким образом, например, путем применения или использования композиции согласно изобретению для обработки в соответствии с изобретением, вероятно уменьшается норма внесения и/или расширяется спектр активности и/или повышается активность лучшего роста растения, увеличивается толерантность к высоким или низким температурам, увеличивается толерантность к засухе или содержанию воды или соли в почве, повышается производительность цветения, более ранний сбор урожая, ускоренное созревание, более высокий собранный урожай, более крупные плоды, большая высота растений, более зеленый цвет листьев, более ранее цветение, лучшее качество и/или более высокая питательная ценность собранных продуктов, более высокая концентрация сахара в плодах, лучшая стабильность при хранении и/или перерабатываемость собранных продуктов, что превышает эффекты, которые фактически предполагают получить

При определенной норме внесения композиция согласно изобретению для обработки в соответствии с изобретением может также иметь укрепляющий эффект на растениях. Мобилизуется защитная система растения по отношению к нападению нежелательных фитопатогенных грибов и/или микроорганизмов и/или вирусов. Вещества, укрепляющие растения (индуцирующие резистентность), обозначают, в контексте настоящего изобретения, те вещества или комбинации веществ, которые способны стимулировать защитную систему растений таким образом, что, при последующей инокуляции нежелательными фитопатогенными грибами и/или микроорганизмами и/или вирусами, обработанные растения проявляют существенную степень резистентности к этим фитопатогенным грибам и/или микроорганизмам и/или вирусам. Таким образом, путем использования или применения композиции в соответствии с настоящим изобретением, для обработки в соответствии с изобретением, растения могут быть защищенными от нападения вышеуказанных патогенов в течение определенного периода времени после обработки. Период времени, в течение которого осуществляется защита, в целом составляет от 1 до 10 дней, предпочтительно от 1 до 7 дней, после обработки растений активными соединениями.

Растения и культивары растений, которые также предпочтительно обрабатывают в соответствии с изобретением, резистентны к одному или нескольки биотическим стрессам, то есть, указанные растения проявляют лучшую защиту от животных и микробных вредителей, такую как от нематод, насекомых, клещей, фитопатогенных грибов, бактерий, вирусов и/или вироидов.

Растения и культивары растений, которые также можно обрабатывать в соответствии с изобретением, представляют собой те растения, которые резистентны к одним или нескольким абиотическим стрессам, то есть, которые уже проявляют повышенную жизнеспособность растения по отношению к толерантности к стрессу. Абиотические стрессовые условия могут включать, например, засуху, воздействие холодной температуры, тепловое воздействие, осмотический стресс, затопление, повышенная засоленность почвы, повышенное минеральное воздействие, озоновое воздействие, воздействие лучей света, ограниченная доступность азотистых питательных веществ, ограниченная доступность азотистых фосфорных веществ, избегание тени. Предпочтительно, обработка этих растений и культиваров с помощью композиции согласно настоящему изобретению дополнительно повышает суммарную жизнеспособность растения (ср. выше).

Растения и культивары растений, которые также могут быть обработаны в соответствии с изобретением, представляют собой те растения, которые характеризуются увеличенными характеристиками урожайности, то есть, которые уже проявляют повышенную жизнеспособность растения по отношению к этому характерному признаку. Повышенная урожайность указанных растений может быть результатом, например, улучшенной физиологии растения, роста и развития, такой как эффективность использования воды, эффективность задержки воды, улучшенное использование азота, улучшенное ассимиляция углерода, улучшенный фотосинтез, увеличенная эффективность прорастания и усиленное созревание.

Кроме того, на урожайность можно оказывать влияние путем улучшенной архитектуры растения (в стрессовых и нестрессовых условиях), включая, но не ограничиваясь только ими, ранее цветение, контроль цветения для продукции гибридных семян, мощность проростков, размер растения, количество и расстояние междоузлий, рост корней, размер семян, размер плодов, размер стручков, количество стручков или колосков, количество семян на стручок или колосок, масса семян, увеличенное заполнение семян, уменьшенное разбрасывание семян, уменьшенное растрескивание стручков и резистентность к полеганию. Дальнейшие характерные признаки урожая включают состав семян, такой как содержание углеводов, содержание белка, масличность и композиция, питательная ценность, уменьшение антипитательных соединений, улучшение способности к переработке и лучшая стабильность при хранении. Предпочтительно, обработка этих растений и культиваров с помощью композиции согласно настоящему изобретению дополнительно повышает суммарную жизнеспособность растения (ср. выше).

Растения, которые можно обработать в соответствии с изобретением, представляют собой гибридные растения, которые уже экспрессируют характеристики гетерозиса или гибридной мощности, что приводит в целом к более высокой урожайности, мощности, здоровью и резистентности к биотическим и абиотическими стрессовым факторам. Такие растения типично получают путем скрещивания инбредной обладающей мужской стерильностью родительской линии (женский родитель) с другой инбредной обладающей мужской фертильностью родительской линией (мужской родитель). Гибридные семена типично собирают с обладающей мужской стерильностью растений и продают растениеводам. Обладающие мужской стерильностью растения могут несколько раз (например, у кукурузы) быть получены путем удаления соцветия-метелки, то есть, механического удаления мужских репродуктивных органов (или мужских цветков), но, более типично, мужская стерильность является результатом генетических детерминант в растительном геноме. В этом случае, и, в особенности, если семена представляют собой желательный продукт, который следует собрать с гибридных растений, то типично полезно обеспечивать, что мужская фертильность в гибридных растениях полностью восстанавливается. Это можно осуществить путем обеспечения того, что мужские родители имеют подходящие гены восстановления фертильности, которые способны восстанавливать мужскую фертильность в гибридных растениях, которые содержат генетические детерминанты, ответственные за мужскую стерильность. Генетические детерминанты для мужской стерильности могут быть расположены в цитоплазме. Примеры цитоплазматической мужской стерильности (CMS) описаны, например, для видов Brassica. Тем не менее, генетические детерминанты для мужской стерильности также могут быть расположены в ядерном геноме. Обладающие мужской стерильностью растения также могут быть получены с помощью методов биотехнологии растений, таких как генетическая инженерия. Особенно предпочтительные способы получения растений с мужской стерильностью описаны в WO 89/10396, в которой, например, рибонуклеаза, такая как барназа, селективно экспрессируется в клетках тапетума в тычинках. Затем фертильность может быть восстановлена путем экспрессии в клетках тапетума ингибитора рибонуклеазы, такого как барстар.

Растения или культивары растений (полученные с помощью методов биотехнологии растений, таких как генетическая инженерия), которые могут быть обработаны в соответствии с изобретением, представляют собой толерантные к гербицидам растения, то есть, растения, которым была придана толерантность к одним или нескольким гербицидам. Такие растения могут быть получены либо путем генетической трансформации, или путем отбора растений, содержащих мутацию, придающую такую толерантность к гербициду.

Последующие неограничивающие примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1: Формула для определения эффективности комбинация множественных активных компонентов

Синергетический эффект активных компонентов присутствует, если активность комбинаций активных компонентов превышает общие активности активных компонентов при применении индивидуально. Предполагаемая активность для данной комбинации двух активных компонентов может быть рассчитана следующим образом (ср. Colby, S.R., "Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations," Weeds 1967, 75, 20-22):

Если

X представляет собой эффективность, если активный компонент А

применяют в норме внесения m част./млн (или г/га),

Y представляет собой эффективность, если активный компонент В

применяют в норме внесения n част./млн (или г/га),

Е представляет собой эффективность, если активные компоненты А и В применяют в нормах внесения m и n част./млн (или г/га), соответственно, и

то

Если фактическая активность превышает расчетное значение, то активность комбинации является сверхаддитивной, то есть существует синергетический эффект. В этом случае, эффективность, которая фактически наблюдается, должна быть больше, чем значение для рассчитанной эффективности (Е), рассчитанной согласно представленной выше формуле.

Например, формулу и анализ можно применять для оценки стимуляции роста растения. В таком анализе оценку осуществляют через несколько дней после применения на растениях. 100% обозначает вес растения, который соответствует такому необработанного контрольного растения. Эффективность обозначает в этом случае дополнительный % веса растения по сравнению с таким необработанного контроля. Например, обработка, которая приводила к весу растений, составляющему 120% по сравнению с необработанным контрольным растением, будет иметь эффективность 20%. Если эффект способствования росту растения для комбинации (то есть, наблюдаемая эффективность для % веса проростков растений, обработанных с помощью комбинации) превышает расчетное значение, то активность комбинации является сверхаддитивной, то есть существует синергетический эффект.

Формулу и анализ также можно использовать для оценки синергизма в анализах борьбы с болезнями. Обозначена степень эффективности, выраженная в %. 0% обозначает эффективность, которая соответствует таковой контроля, в то время как эффективность 100% обозначает, что не наблюдается заболевания.

Если фактическая инсектицидная или фунгицидная активность превышает расчетное значение, то активность комбинации является сверхаддитивной, то есть существует синергетический эффект. В этом случае, эффективность, которая фактически наблюдается, должна быть больше значения для рассчитанной эффективности (Е), рассчитанной согласно представленной выше формуле.

Дальнейшим вариантом демонстрации синергетического эффекта является способ Tammes (ср. "Isoboles, A Graphic Representation of Synergism in Pesticides," в Neth. J. Plant Path., 1964, 70, 73-80).

Пример 2: Способствование росту растения с помощью Bacillus subtilis QST713 и рекомбинантных клеток Bacillus thuringiensis, экспрессирующих фосфолипазу С

Эксперименты осуществляли для анализа эффективности комбинации продукта на основании Bacillus subtilis QST713 и продукт ферментации рекомбинантных клеток Bacillus thuringiensis, экспрессирующих фосфолипазу С ("ВЕРС"). Семена кукурузы выращивали в стерильной смеси синтетической среды и засыпали песком в небольших трехдюймовых квадратных горшках на освещенных полках для роста растений в комнате при 25-28°С и 50% влажности приблизительно в течение 14 дней. В каждый горшок высаживали по два семена. При выращивании, ростовую среду в каждом горшке пропитывали обработками, описанными ниже. Через 14 дней, растения измеряли для определения суммарной биомассы растения. В некоторых экспериментах, анализировали корни, используя сканер WinRhizo Root. Во всех таблицах для этих примеров, UTC относится к необработанному контролю. «Рассчитанный» относится к предполагаемому эффекту, рассчитанному с использованием вышеописанного уравнения Колби и «эффективность» относится к фактическому наблюдаемому эффекту.

Продукт SERENADE^® ASO разводили в воде (1% и 5% объем к объему) и разведенный раствор использовали для пропитки ростовой среды. Норма внесения SERENADE^® ASO относится к количеству Bacillus subtilis QST713 (то есть, препарату спор), содержащемуся в продукте SERENADE^® ASO, которое составляет 1,34%. Приготовленный продукт имел минимальную концентрацию спор 1×10⁹ КОЕ/г.

Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus (Bacillus thuringiensis ВТ013А), экспрессирующий фосфолипазу С на его экзоспории (ВЕРС) создавали следующим образом. Для создания плазмид для экспрессии слитых белков в представителях семейства Bacillus cereus, создавали ПЦР фрагменты, которые кодируют BclA промотор (SEQ ID NO: 85), метиониновый стартовый ко дон, и аминокислоты 20-35 из BclA (SEQ ID NO: 1) с последующей линкерной последовательностью с шестью аланинами, сопряженной в рамке с Bacillus thuringiensis ВТ013Фосфолипаза С (SEQ ID NO: 108). Эти ПЦР фрагменты расщепляли с помощью XhoI и лигировали в SalI сайт pSUPER плазмиды для создания плазмид pSUPER-BclA 20-35-Фосфолипаза. PSUPER плазмиду создавали путем слияния pUC57 плазмиды (содержащей кассету резистентности к ампициллину) с рВС16-1 плазмидой из Bacillus (содержащей кассету резистентности к тетрациклину). Эта плазмида с 5,5 т.п.н. может реплицироваться в обоих Е. coli и Bacillus spp. Плазмиды pSUPER-BclA 20-35-Фосфолипаза трансформировали в и размножали в dam-метилаза отрицательных штаммах Е. coli и в завершение трансформировали в Bacillus thuringiensis ВТ013А.

Для получения цельных бульонных культур ВЕРС, 15 мл конусоообразных, содержащих бульон с сердечно-мозговым экстрактом (BHI), инокулировали с ВЕРС и выращивали в течение 7-8 часов приблизительно при 30°С в шейкере, установленном на 300 об/мин. На следующий день, 250 мкл аликвот из каждой колбы инокулировали в 250 мл колбы, содержащие 50 мл среды на основании дрожжевого экстракта и выращивали приблизительно при 30°С. После инкубировали приблизительно в течение 2 дней, когда спорообразование завершилось по меньшей мере на 95%, культуральный бульон собирали и рассчитывали колониеобразующие единицы. Ферментационный бульон разводили до 5% в 50 мл воды и для каждого горшка применяли следующие колониеобразующие единицы.

Эксперимент повторяли, как описано выше, но с 1% разведения продукта SERENADE^® ASO. Результаты представлены в таблице 4, ниже.

Результаты измерений объема корней, используя корневой сканер WinRhizo, представлены в таблице 5.

Результаты указывают на супераддитивный эффект на урожайность растений при комбинировании SERENADE^® ASO и ВЕРС.

Пример 3: Способствование росту растения с помощью Bacillus subtilis QST713 и рекомбинантных клеток Bacillus thuringiensis, экспрессирующих эндоглюканазу

Осуществляли эксперименты, аналогичные описанным в примере 2, используя рекомбинантные клетки Bacillus thuringiensis, экспрессирующие эндоглюканазу (SEQ ID NO: 107), обозначаемые в этих примерах как BEE. Создавали цельные бульонные культуры BEE, как описано выше, за исключением того, что использовали эндоглюканазу (SEQ ID NO: 107), вместо фосфолипазы. Влияния комбинации BEE с SERENADE^® ASO на урожайность растений представлены в таблицах ниже.

Вышеприведенные результаты указывают на супераддитивный эффект на урожайность растений при применении Bacillus subtilis QST713 и BEE в комбинации.

Пример 4: Способствование росту растения с помощью штамма Bacillus firmus I-1582 и рекомбинантных клеток Bacillus thuringiensis

Семена кукурузы выращивали в суглинистом песке в теплице при 20°С и 70% влажности приблизительно в течение 11 дней. Приблизительно через 11 дней от времени обработки всходы срезали выше почвы и определяли свежий вес.

Рекомбинантные клетки Bacillus thuringiensis, экспрессирующие эндоглюканазу, кодируемую SEQ ID NO: 107 или фосфолипазу С, кодируемую SEQ ID NO: 108 и приготовленные, как описано выше, применяли в количестве приблизительно 50 мкг/зерно. Штамм Bacillus firmus I-1582 также применяли в количестве приблизительно 50 мкг/зерно.

Полагают, что растения кукурузы, обработанные с помощью рекомбинантного Bacillus thuringiensis в комбинации со штаммом Bacillus firmus I-1582, будут иметь % веса проростков, который превышает расчетное значение на основании % веса проростков из растений кукурузы, обработанных двумя активными компонентами отдельно, то есть будет наблюдаться синергетический эффект.

--->

Перечень последовательностей

<110> БАЙЕР КРОПСАЙЕНС ЛП

<120> Композиции, содержащие рекомбинантные клетки BACILLUS

и другой АГЕНТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БОРЬБЫ

<130> BCS149057 WO

<150> US 62/051,911

<151> 2014-09-17

<160> 109

<170> PatentIn версия 3,5

<210> 1

<211> 41

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 1

Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro

20 25 30

Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35 40

<210> 2

<211> 332

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 2

Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro

20 25 30

Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Phe Thr Thr

35 40 45

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

50 55 60

Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro

65 70 75 80

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

85 90 95

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Phe Thr Pro Thr Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly

130 135 140

Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro

145 150 155 160

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

165 170 175

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro

180 185 190

Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ala Gly Leu Tyr Ala Phe Asn Ser Gly Gly

195 200 205

Ile Ser Leu Asp Leu Gly Ile Asn Asp Pro Val Pro Phe Asn Thr Val

210 215 220

Gly Ser Gln Phe Phe Thr Gly Thr Ala Ile Ser Gln Leu Asp Ala Asp

225 230 235 240

Thr Phe Val Ile Ser Glu Thr Gly Phe Tyr Lys Ile Thr Val Ile Ala

245 250 255

Asn Thr Ala Thr Ala Ser Val Leu Gly Gly Leu Thr Ile Gln Val Asn

260 265 270

Gly Val Pro Val Pro Gly Thr Gly Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ala

275 280 285

Pro Phe Thr Ile Val Ile Gln Ala Ile Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro

290 295 300

Ser Leu Val Glu Val Ile Val Thr Gly Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu

305 310 315 320

Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ile Ile Glu Lys Val Ala

325 330

<210> 3

<211> 33

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 3

Met Ser Glu Lys Tyr Ile Ile Leu His Gly Thr Ala Leu Glu Pro Asn

1 5 10 15

Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Asn

20 25 30

Gly

<210> 4

<211> 209

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 4

Met Ser Glu Lys Tyr Ile Ile Leu His Gly Thr Ala Leu Glu Pro Asn

1 5 10 15

Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Asn

20 25 30

Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Phe Thr Gly

35 40 45

Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly

50 55 60

Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Ile Leu Pro Val Phe

65 70 75 80

Gly Thr Ile Thr Thr Asp Val Gly Ile Gly Phe Ser Val Ile Val Asn

85 90 95

Thr Asn Ile Asn Phe Thr Leu Pro Gly Pro Val Ser Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Asn Pro Val Asp Asn Ser Ile Ile Ile Asn Thr Thr Gly Val Tyr Ser

115 120 125

Val Ser Phe Ser Ile Val Phe Val Ile Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Leu Asn Leu Thr Ile Asn Asp Ser Ile Gln Phe Ala Ile Glu Ser Arg

145 150 155 160

Ile Gly Gly Gly Pro Gly Val Arg Ala Thr Ser Ala Arg Thr Asp Leu

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Gln Gly Asp Val Leu Arg Val Arg Ile Arg Glu Ala

180 185 190

Thr Gly Asp Ile Ile Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Val Val Ser Lys Val

195 200 205

Asp

<210> 5

<211> 44

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 5

Met Val Lys Val Val Glu Gly Asn Gly Gly Lys Ser Lys Ile Lys Ser

1 5 10 15

Pro Leu Asn Ser Asn Phe Lys Ile Leu Ser Asp Leu Val Gly Pro Thr

20 25 30

Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Met Thr Gly Ile Thr

35 40

<210> 6

<211> 647

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 6

Val Val Lys Val Val Glu Gly Asn Gly Gly Lys Ser Lys Ile Lys Ser

1 5 10 15

Pro Leu Asn Ser Asn Phe Lys Ile Leu Ser Asp Leu Val Gly Pro Thr

20 25 30

Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Met Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly

35 40 45

Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ser

50 55 60

Ala Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Gly Thr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly

85 90 95

Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser

100 105 110

Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr

115 120 125

Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly

130 135 140

Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Asn

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ile Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser Met Gly Pro Thr

165 170 175

Gly Glu Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Gly Thr Gly Ser Thr Gly

180 185 190

Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser

195 200 205

Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr

210 215 220

Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly

225 230 235 240

Val Thr Gly Asn Met Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn

245 250 255

Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Met

260 265 270

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly

275 280 285

Glu Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn

290 295 300

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr

305 310 315 320

Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

325 330 335

Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser

340 345 350

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr

355 360 365

Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

370 375 380

Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu

385 390 395 400

Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Val Thr

405 410 415

Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

420 425 430

Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr

450 455 460

Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly

465 470 475 480

Ala Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Asn

485 490 495

Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser

500 505 510

Thr Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Val Ile

515 520 525

Ser Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn

530 535 540

Ile Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val

545 550 555 560

Ala Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Leu Thr Ala

565 570 575

Gly Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala

580 585 590

Gly Thr Ile Asn Ser Pro Thr Val Ala Thr Gly Ser Phe Ser Ala Thr

595 600 605

Ile Ile Ala Ser Leu Pro Ala Gly Ala Ala Val Ser Leu Gln Leu Phe

610 615 620

Gly Val Val Ala Leu Ala Thr Leu Ser Thr Ala Thr Pro Gly Ala Thr

625 630 635 640

Leu Thr Ile Ile Arg Leu Ser

645

<210> 7

<211> 34

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 7

Met Lys Gln Asn Asp Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Ile Gly Pro

1 5 10 15

Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Val Leu Pro Pro Ile His Ile Pro

20 25 30

Thr Gly

<210> 8

<211> 366

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 8

Met Lys Gln Asn Asp Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Ile Gly Pro

1 5 10 15

Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Val Leu Pro Pro Ile His Ile Pro

20 25 30

Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr

35 40 45

Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly

50 55 60

Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile

65 70 75 80

Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr

85 90 95

Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly

100 105 110

Pro Ala Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala

115 120 125

Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr

130 135 140

Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly

145 150 155 160

Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala

165 170 175

Thr Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr

180 185 190

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro

195 200 205

Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala Leu Leu Val Asn Ala Val Leu Ala

210 215 220

Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe Gly Phe Ser Gln Pro Gly Ile Ala

225 230 235 240

Pro Gly Val Gly Gly Thr Leu Thr Ile Leu Pro Gly Val Val Gly Asp

245 250 255

Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Asp Gly Ile Ile Thr Ser Leu Ala Gly

260 265 270

Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ala Pro Leu Thr Pro Val Gln Ile

275 280 285

Gln Met Gln Ile Phe Ile Ala Pro Ala Ala Ser Asn Thr Phe Thr Pro

290 295 300

Val Ala Pro Pro Leu Leu Leu Thr Pro Ala Leu Pro Ala Ile Ala Ile

305 310 315 320

Gly Thr Thr Ala Thr Gly Ile Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Val Ala

325 330 335

Gly Asp Lys Ile Leu Val Tyr Val Ser Leu Thr Gly Ala Ser Pro Ile

340 345 350

Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala Gly Leu Asn Ile Val

355 360 365

<210> 9

<211> 30

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 9

Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Arg Thr Gly

20 25 30

<210> 10

<211> 77

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 10

Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Arg Thr Gly Pro Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ile Gly Asn Thr Glu Pro Tyr Trp

35 40 45

His Thr Gly Pro Pro Gly Ile Val Leu Leu Thr Tyr Asp Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ile Ile Ser Phe Ala Phe Arg Ile Leu Pro Ile Ser

65 70 75

<210> 11

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 11

Met Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35

<210> 12

<211> 299

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 12

Met Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr

65 70 75 80

Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly

85 90 95

Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp Cys Cys Val Leu

130 135 140

Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly Glu Thr Val Ile Leu

145 150 155 160

Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro Leu Phe Phe Leu Phe

165 170 175

Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr Gly Val Gly Phe Leu

195 200 205

Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro Thr Asp Val Gly Cys

210 215 220

Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln Leu Leu Asp Ala Phe

225 230 235 240

Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn Gly Ser Ile Ala Ala

245 250 255

Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile Val Leu Gly Thr Leu

260 265 270

Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala Ile Ser Thr Cys Lys

275 280 285

Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met

290 295

<210> 13

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 13

Met Phe Asp Lys Asn Glu Met Lys Lys Thr Asn Glu Val Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35

<210> 14

<211> 289

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 14

Met Phe Asp Lys Asn Glu Met Lys Lys Thr Asn Glu Val Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr

65 70 75 80

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly

85 90 95

Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Gln Thr Gly Ser Thr Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Ala Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp Cys Cys Val Phe Pro Met

115 120 125

Gln Glu Val Leu Arg Gln Leu Val Gly Gln Thr Val Ile Leu Ala Thr

130 135 140

Ile Ala Asp Ala Pro Asn Val Ala Pro Arg Phe Phe Leu Phe Asn Ile

145 150 155 160

Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val Thr Asp Pro Val Ser Asn

165 170 175

Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Ile Gly Val Gly Phe Ser

180 185 190

Leu Thr Val Pro Pro Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gly Cys

195 200 205

Glu Cys Asp Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Glu Leu Leu Asp Thr Leu

210 215 220

Ile Gly Ser Thr Val Asn Leu Leu Val Ser Asn Gly Ser Ile Ala Thr

225 230 235 240

Gly Phe Asn Val Glu Gln Thr Ala Leu Gly Ile Val Ile Gly Thr Leu

245 250 255

Pro Ile Pro Ile Asn Pro Pro Pro Pro Thr Leu Phe Arg Phe Ala Ile

260 265 270

Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asp Ile Thr Pro Thr Pro Thr Ala

275 280 285

Thr

<210> 15

<211> 49

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 15

Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp

1 5 10 15

Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp

20 25 30

Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr

35 40 45

Gly

<210> 16

<211> 189

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 16

Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp

1 5 10 15

Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp

20 25 30

Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr

35 40 45

Gly Ile Thr Gly Pro Thr Phe Asn Ile Asn Phe Arg Ala Glu Lys Asn

50 55 60

Val Ala Gln Ser Phe Thr Pro Pro Ala Asp Ile Gln Val Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val Thr Asn Thr

85 90 95

Phe Thr Ala Pro Ile Asn Gly Ile Tyr Leu Phe Ser Ala Ser Ile Gly

100 105 110

Phe Asn Pro Thr Leu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Arg Ile Thr Ile Arg

115 120 125

Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Ser Gln Thr Gly Thr Ile Thr Thr Gly

130 135 140

Gly Thr Pro Gln Leu Glu Ile Thr Thr Ile Ile Asp Leu Leu Ala Ser

145 150 155 160

Gln Thr Ile Asp Ile Gln Phe Ser Ala Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr

165 170 175

Val Gly Ser Ser Asn Phe Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro

180 185

<210> 17

<211> 33

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 17

Met Asn Glu Glu Tyr Ser Ile Leu His Gly Pro Ala Leu Glu Pro Asn

1 5 10 15

Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Thr

20 25 30

Gly

<210> 18

<211> 84

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 18

Met Asn Glu Glu Tyr Ser Ile Leu His Gly Pro Ala Leu Glu Pro Asn

1 5 10 15

Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Thr

20 25 30

Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Phe Thr Gly

35 40 45

Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly

50 55 60

Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly Ile Thr

65 70 75 80

Gly Pro Thr Gly

<210> 19

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 19

Met Lys Asn Arg Asp Asn Asn Arg Lys Gln Asn Ser Leu Ser Ser Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly

35

<210> 20

<211> 1056

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 20

Met Lys Asn Arg Asp Asn Asn Arg Lys Gln Asn Ser Leu Ser Ser Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Leu Gln Gly Pro Met Gly Glu

50 55 60

Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ser Val

65 70 75 80

Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Val

100 105 110

Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Pro Glu Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala

145 150 155 160

Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Pro

165 170 175

Gly Pro Ser Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr

195 200 205

Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

210 215 220

Gly Pro Gly Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

225 230 235 240

Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly

245 250 255

Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile

260 265 270

Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Ser Gln

275 280 285

Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly

290 295 300

Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp

305 310 315 320

Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Ile Gly Pro Gln Gly Val Thr

325 330 335

Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly

340 345 350

Pro Ser Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro

355 360 365

Met Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln

370 375 380

Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly

385 390 395 400

Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val Gly Ala

405 410 415

Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln

420 425 430

Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Ala Thr Gly Ile Gln Gly

435 440 445

Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val

450 455 460

Gln Gly Ala Gln Gly Ala Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln

465 470 475 480

Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly

485 490 495

Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala

500 505 510

Thr Gly Asp Met Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly

515 520 525

Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly

530 535 540

Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Val

545 550 555 560

Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala

565 570 575

Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr

580 585 590

Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Leu Gln Gly

595 600 605

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro

610 615 620

Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Thr Gly Ala Thr

625 630 635 640

Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Asp Ile Gly

645 650 655

Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Ile

660 665 670

Gln Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln

675 680 685

Gly Pro Gln Gly Asp Ile Gly Leu Thr Gly Ser Gln Gly Pro Thr Gly

690 695 700

Ile Gln Gly Ile Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro

705 710 715 720

Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val

725 730 735

Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly

740 745 750

Val Gln Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile

755 760 765

Gln Gly Val Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ala Thr

770 775 780

Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly

785 790 795 800

Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Ile Gly Pro Thr Gly Pro

805 810 815

Met Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr

820 825 830

Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly

835 840 845

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu

850 855 860

Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly

865 870 875 880

Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly

885 890 895

Pro Ala Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly

900 905 910

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ser

915 920 925

Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr

930 935 940

Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Glu Ile Gly

945 950 955 960

Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val

965 970 975

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln

980 985 990

Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly

995 1000 1005

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly

1010 1015 1020

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly

1025 1030 1035

Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly

1040 1045 1050

Pro Thr Gly

1055

<210> 21

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 21

Met Ser Asp Lys His Gln Met Lys Lys Ile Ser Glu Val Leu Gln Ala

1 5 10 15

His Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr

20 25 30

Pro Phe Thr Phe Pro Thr Gly

35

<210> 22

<211> 365

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 22

Met Ser Asp Lys His Gln Met Lys Lys Ile Ser Glu Val Leu Gln Ala

1 5 10 15

His Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr

20 25 30

Pro Phe Thr Phe Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly

35 40 45

Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Pro Val Gly Thr Asn Leu Asp Thr Ile Tyr Val Thr Asn

65 70 75 80

Asp Ile Ser Asn Asn Val Ser Ala Ile Asp Gly Asn Thr Asn Thr Val

85 90 95

Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Asn Pro Val Gly Val Gly Val Asn

100 105 110

Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Val Asn Asn Gly Ser Asp Asn Ile

115 120 125

Ser Val Ile Asn Gly Ser Thr Asn Thr Val Val Ala Thr Ile Pro Val

130 135 140

Gly Thr Gln Pro Phe Gly Val Gly Val Asn Pro Ser Thr Asn Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Val Ala Asn Arg Thr Ser Asn Asn Val Ser Val Ile Lys Gly Gly

165 170 175

Thr Asn Thr Val Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Asn Pro Val Gly

180 185 190

Val Gly Val Asn Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Thr Asn Glu Ile

195 200 205

Pro Asn Ser Val Ser Val Ile Lys Gly Gly Thr Asn Thr Val Val Ala

210 215 220

Thr Ile Pro Val Gly Leu Phe Pro Phe Gly Val Gly Val Asn Ser Leu

225 230 235 240

Thr Asn Leu Ile Tyr Val Val Asn Asn Ser Pro His Asn Val Ser Val

245 250 255

Ile Asp Gly Asn Thr Asn Thr Val Leu Thr Thr Ile Ser Val Gly Thr

260 265 270

Ser Pro Val Gly Val Gly Val Asn Leu Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val

275 280 285

Ala Asn Glu Val Pro Asn Asn Ile Ser Val Ile Asn Gly Asn Thr Asn

290 295 300

Thr Val Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Thr Pro Phe Glu Val Gly

305 310 315 320

Val Asn Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Ser Asn Leu Asn Ser Asn

325 330 335

Asn Val Ser Val Ile Asn Gly Ser Ala Asn Thr Val Ile Ala Thr Val

340 345 350

Pro Val Gly Ser Val Pro Arg Gly Ile Gly Val Lys Pro

355 360 365

<210> 23

<211> 30

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 23

Met Asp Glu Phe Leu Ser Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly

20 25 30

<210> 24

<211> 160

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 24

Met Asp Glu Phe Leu Ser Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Phe Asn Leu Pro Ala Gly Pro Ala Ser Ile Thr Leu Thr

50 55 60

Ser Asn Glu Thr Thr Ala Cys Val Ser Thr Gln Gly Asn Asn Thr Leu

65 70 75 80

Phe Phe Ser Gly Gln Val Leu Val Asn Gly Ser Pro Thr Pro Gly Val

85 90 95

Val Val Ser Phe Ser Phe Ser Asn Pro Ser Leu Ala Phe Met Val Pro

100 105 110

Leu Ala Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Asn Phe Thr Ala Val Phe Leu

115 120 125

Ala Ala Asn Gly Pro Gly Thr Val Thr Val Thr Ala Ser Leu Leu Asp

130 135 140

Ser Pro Gly Thr Met Ala Ser Val Thr Ile Thr Ile Val Asn Cys Pro

145 150 155 160

<210> 25

<211> 30

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 25

Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly

20 25 30

<210> 26

<211> 69

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 26

Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Asn Thr Gly Leu Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Asp Thr Gly

65

<210> 27

<211> 36

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 27

Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile

1 5 10 15

Ser Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe

20 25 30

Thr Gly Ile Gly

35

<210> 28

<211> 934

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 28

Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile

1 5 10 15

Ser Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe

20 25 30

Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu Met Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala Gly Gln Met

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly Leu Arg Gly

85 90 95

Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu

100 105 110

Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ile Gln

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly

130 135 140

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Val Pro Gly Ala Thr Gly Ser

145 150 155 160

Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Pro Ser

165 170 175

Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gln Gly Ile Ser Gly Pro

180 185 190

Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro

195 200 205

Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro

210 215 220

Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr

225 230 235 240

Gly Ser Ala Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly

245 250 255

Glu Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Pro

260 265 270

Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Pro

275 280 285

Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly

290 295 300

Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile

305 310 315 320

Gln Gly Ala Ile Gly Pro Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln

325 330 335

Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly

340 345 350

Ser Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Met Gly Asp Ile Gly Pro

355 360 365

Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln

370 375 380

Gly Val Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly

385 390 395 400

Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Val Thr Gly Pro Glu Gly Pro

405 410 415

Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr

420 425 430

Gly Ala Gln Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Asn Ile Gly

435 440 445

Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Thr Gln Gly Asp

450 455 460

Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln

465 470 475 480

Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly

485 490 495

Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Thr

500 505 510

Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly

515 520 525

Pro Ser Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly

530 535 540

Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Pro Ser Gly Gly

545 550 555 560

Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Val Gly Asp

565 570 575

Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr

580 585 590

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly

595 600 605

Val Gln Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro

610 615 620

Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln

625 630 635 640

Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly

645 650 655

Ile Gln Gly Gly Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala

660 665 670

Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln

675 680 685

Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly

690 695 700

Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu Gln Gly Pro

705 710 715 720

Gln Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln

725 730 735

Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly

740 745 750

Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile

755 760 765

Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

770 775 780

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Thr

785 790 795 800

Thr Ala Thr Tyr Ser Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ala Ile Ser

805 810 815

Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn Ile

820 825 830

Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val Thr

835 840 845

Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Ile Thr Ala Ala

850 855 860

Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Asn Ser Pro Ala Val Ala Thr Gly Ser Phe Asn Ala Thr Ile

885 890 895

Ile Ser Asn Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Leu Gln Leu Phe Gly

900 905 910

Leu Leu Ala Val Ala Thr Leu Ser Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Leu

915 920 925

Thr Ile Ile Arg Leu Ser

930

<210> 29

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 29

Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35

<210> 30

<211> 287

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 30

Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr

65 70 75 80

Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly

85 90 95

Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp

115 120 125

Cys Cys Val Leu Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly Glu

130 135 140

Thr Val Ile Leu Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro Leu

145 150 155 160

Phe Phe Leu Phe Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val

165 170 175

Thr Asp Gly Thr Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr Gly

180 185 190

Val Gly Phe Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro Thr

195 200 205

Asp Val Gly Cys Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln Leu

210 215 220

Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn Gly

225 230 235 240

Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile Val

245 250 255

Leu Gly Thr Leu Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala Ile

260 265 270

Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met

275 280 285

<210> 31

<211> 30

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 31

Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly

20 25 30

<210> 32

<211> 190

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 32

Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

65 70 75 80

Gly Phe Asn Leu Pro Ala Gly Pro Ala Ser Ile Thr Leu Thr Ser Asn

85 90 95

Glu Thr Thr Ala Cys Val Ser Thr Gln Gly Asn Asn Thr Leu Phe Phe

100 105 110

Ser Gly Gln Val Leu Val Asn Gly Ser Pro Thr Pro Gly Val Val Val

115 120 125

Ser Phe Ser Phe Ser Asn Pro Ser Leu Ala Phe Met Val Pro Leu Ala

130 135 140

Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Asn Phe Thr Ala Val Phe Leu Ala Ala

145 150 155 160

Asn Gly Pro Gly Thr Val Thr Val Thr Ala Ser Leu Leu Asp Ser Pro

165 170 175

Gly Thr Met Ala Ser Val Thr Ile Thr Ile Val Asn Cys Pro

180 185 190

<210> 33

<211> 21

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 33

Met Asp Ser Lys Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ile

1 5 10 15

Asn Phe Pro Thr Gly

20

<210> 34

<211> 335

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 34

Met Asp Ser Lys Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ile

1 5 10 15

Asn Phe Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr

20 25 30

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

35 40 45

Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu

50 55 60

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala

100 105 110

Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala

145 150 155 160

Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

165 170 175

Gly Ala Ile Gly Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly

180 185 190

Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ile

195 200 205

Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr

210 215 220

Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Pro Gly Thr Ile Pro Thr Thr Asn Leu

245 250 255

Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asn Ala

260 265 270

Asp Gly Ile Ala Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Ile Leu Ser Pro Ser Glu

275 280 285

Val Ser Tyr Ile Asn Leu Phe Ile Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro

290 295 300

Phe Tyr Glu Val Thr Ala Gly Gln Leu Thr Leu Leu Asp Asp Glu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Gln Gly Ser Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn

325 330 335

<210> 35

<211> 22

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 35

Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro

1 5 10 15

Ile Tyr Ile Pro Thr Gly

20

<210> 36

<211> 234

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 36

Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro

1 5 10 15

Ile Tyr Ile Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala

20 25 30

Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr

35 40 45

Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly

50 55 60

Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr

85 90 95

Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Leu Thr Gly

100 105 110

Val Thr Gly Leu Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Pro

115 120 125

Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr

130 135 140

Gly Gly Ile Gly Pro Ile Thr Thr Thr Asn Leu Leu Tyr Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Ala Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asp Thr Asp Gly Ile Pro Gln

165 170 175

Tyr Gly Thr Thr Asn Ile Leu Ser Pro Ser Glu Val Ser Tyr Ile Asn

180 185 190

Leu Phe Val Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro Leu Tyr Glu Val Ser

195 200 205

Thr Gly Lys Leu Thr Leu Leu Asp Thr Gln Pro Pro Ser Gln Gly Ser

210 215 220

Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn

225 230

<210> 37

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 37

ggatccatgg ctgaacacaa tcc 23

<210> 38

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 38

ggatccttaa ttcgtattct ggcc 24

<210> 39

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 39

ggatccatga aacggtcaat c 21

<210> 40

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 40

ggatccttac taatttggtt ctgt 24

<210> 41

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 41

ggatccatgc taccaaaagc c 21

<210> 42

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 42

ggatccttag tccgcaggcg tagc 24

<210> 43

<211> 35

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 43

Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn

1 5 10 15

Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu

20 25 30

Pro Thr Gly

35

<210> 44

<211> 222

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 44

Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn

1 5 10 15

Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu

20 25 30

Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro

35 40 45

Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr

50 55 60

Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

65 70 75 80

Thr Phe Ser Ser Ala Asn Ala Ser Ile Val Thr Pro Ala Pro Gln Thr

85 90 95

Val Asn Asn Leu Ala Pro Ile Gln Phe Thr Ala Pro Val Leu Ile Ser

100 105 110

Lys Asn Val Thr Phe Asn Gly Ile Asp Thr Phe Thr Ile Gln Ile Pro

115 120 125

Gly Asn Tyr Phe Phe Ile Gly Ala Val Met Thr Ser Asn Asn Gln Ala

130 135 140

Gly Pro Val Ala Val Gly Val Gly Phe Asn Gly Ile Pro Val Pro Ser

145 150 155 160

Leu Asp Gly Ala Asn Tyr Gly Thr Pro Thr Gly Gln Glu Val Val Cys

165 170 175

Phe Gly Phe Ser Gly Gln Ile Pro Ala Gly Thr Thr Ile Asn Leu Tyr

180 185 190

Asn Ile Ser Asp Lys Thr Ile Ser Ile Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly

195 200 205

Ser Ser Ile Val Ala Ala Arg Leu Ser Phe Phe Arg Ile Ser

210 215 220

<210> 45

<211> 41

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 45

Met Phe Ser Glu Lys Lys Arg Lys Asp Leu Ile Pro Asp Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro

20 25 30

Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35 40

<210> 46

<211> 293

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 46

Met Phe Ser Glu Lys Lys Arg Lys Asp Leu Ile Pro Asp Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro

20 25 30

Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Pro

35 40 45

Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Ala Thr Ile Cys Ile Arg

50 55 60

Thr Asp Pro Asp Asn Gly Cys Ser Val Ala Glu Gly Ser Gly Thr Val

65 70 75 80

Ala Ser Gly Phe Ala Ser His Ala Glu Ala Cys Asn Thr Gln Ala Ile

85 90 95

Gly Asp Cys Ser His Ala Glu Gly Gln Phe Ala Thr Ala Ser Gly Thr

100 105 110

Ala Ser His Ala Glu Gly Phe Gln Thr Thr Ala Ser Gly Phe Ala Ser

115 120 125

His Thr Glu Gly Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Asn Phe Ser His Thr

130 135 140

Glu Gly Ile Asn Thr Ile Val Asp Val Leu His Pro Gly Ser His Ile

145 150 155 160

Met Gly Lys Asn Gly Thr Thr Arg Ser Ser Phe Ser Trp His Leu Ala

165 170 175

Asn Gly Leu Ala Val Gly Pro Ser Leu Asn Ser Ala Val Ile Glu Gly

180 185 190

Val Thr Gly Asn Leu Tyr Leu Asp Gly Val Val Ile Ser Pro Asn Ala

195 200 205

Ala Asp Tyr Ala Glu Met Phe Glu Thr Ile Asp Gly Asn Leu Ile Asp

210 215 220

Val Gly Tyr Phe Val Thr Leu Tyr Gly Glu Lys Ile Arg Lys Ala Asn

225 230 235 240

Ala Asn Asp Asp Tyr Ile Leu Gly Val Val Ser Ala Thr Pro Ala Met

245 250 255

Ile Ala Asp Ala Ser Asp Leu Arg Trp His Asn Leu Phe Val Arg Asp

260 265 270

Glu Trp Gly Arg Thr Gln Tyr His Glu Val Val Val Pro Glu Lys Lys

275 280 285

Met Ala Met Glu Glu

290

<210> 47

<211> 49

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 47

Met Thr Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Ile Ser Arg Arg Asp

1 5 10 15

Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Leu Ile Ser Pro Asp

20 25 30

Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr

35 40 45

Gly

<210> 48

<211> 83

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 48

Met Thr Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Ile Ser Arg Arg Asp

1 5 10 15

Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Leu Ile Ser Pro Asp

20 25 30

Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr

35 40 45

Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly

50 55 60

Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Ile

65 70 75 80

Thr Gly Pro

<210> 49

<211> 38

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 49

Met Ser Arg Lys Asp Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile

1 5 10 15

Ser Ile Ser Pro Asp Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser

20 25 30

Phe Thr Leu Pro Thr Gly

35

<210> 50

<211> 163

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 50

Met Ser Arg Lys Asp Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile

1 5 10 15

Ser Ile Ser Pro Asp Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser

20 25 30

Phe Thr Leu Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Pro

35 40 45

Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Asn Ile Asn Phe Arg

50 55 60

Ala Glu Lys Asn Gly Ala Gln Ser Phe Thr Pro Pro Ala Asp Ile Gln

65 70 75 80

Val Ser Tyr Gly Asn Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gly Gly Tyr Ser Ser

85 90 95

Val Thr Asn Thr Phe Thr Ala Pro Ile Asn Gly Ile Tyr Leu Phe Ser

100 105 110

Ala Asn Ile Gly Phe Asn Pro Thr Leu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Arg

115 120 125

Ile Thr Ile Arg Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Ser Gln Thr Ile Asp

130 135 140

Ile Gln Phe Ser Ala Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser

145 150 155 160

Asn Phe Phe

<210> 51

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 51

Met Lys Glu Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln His Ser Leu Asn Ser Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly

35

<210> 52

<211> 323

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 52

Met Lys Glu Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln His Ser Leu Asn Ser Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu

50 55 60

Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala

65 70 75 80

Gly Gln Met Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Glu Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gln Gly Val

100 105 110

Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala

145 150 155 160

Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Val Ile Gly Pro Gln

165 170 175

Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Val

180 185 190

Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Pro Ser

195 200 205

Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly

210 215 220

Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Asn Thr

225 230 235 240

Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly

245 250 255

Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gln Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Ile

260 265 270

Gln Gly Ile Gln Gly Pro Leu Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln

275 280 285

Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Glu Gln Gly

290 295 300

Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp

305 310 315 320

Gln Gly Thr

<210> 53

<211> 39

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 53

Met Arg Glu Arg Asp Asn Lys Arg Gln Gln His Ser Leu Asn Pro Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Ser Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly

35

<210> 54

<211> 436

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 54

Met Arg Glu Arg Asp Asn Lys Arg Gln Gln His Ser Leu Asn Pro Asn

1 5 10 15

Phe Arg Ile Ser Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro

20 25 30

Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly

35 40 45

Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu

50 55 60

Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val

65 70 75 80

Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly

85 90 95

Leu Arg Gly Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Val

100 105 110

Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln

115 120 125

Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala

145 150 155 160

Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln

165 170 175

Gly Pro Ser Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Ile

180 185 190

Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser

195 200 205

Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly

210 215 220

Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr

225 230 235 240

Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly

245 250 255

Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile Gln Gly Ile

260 265 270

Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln

275 280 285

Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly Ile Gln Gly

290 295 300

Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro

305 310 315 320

Gln Gly Ile Gln Gly Val Ile Gly Ala Gln Gly Val Thr Gly Ala Thr

325 330 335

Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Ser Gly

340 345 350

Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Met Gly Asp

355 360 365

Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln

370 375 380

Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly

385 390 395 400

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ala Thr Gly Pro

405 410 415

Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Thr

420 425 430

Gly Ala Thr Gly

435

<210> 55

<211> 36

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 55

Met Lys Asn Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln Gln Ser Asn Phe Arg Ile

1 5 10 15

Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe

20 25 30

Thr Gly Ile Gly

35

<210> 56

<211> 470

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 56

Met Lys Asn Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln Gln Ser Asn Phe Arg Ile

1 5 10 15

Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe

20 25 30

Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly

35 40 45

Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu Met Gly Pro

50 55 60

Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val Gly Pro Ile

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Ala Gln Gly Leu Arg Gly

85 90 95

Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu

100 105 110

Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ile Gln

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly

130 135 140

Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala Thr Gly Pro

145 150 155 160

Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Gln Gly Pro Ser

165 170 175

Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Leu Thr Gly Pro

180 185 190

Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro

195 200 205

Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro

210 215 220

Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr

225 230 235 240

Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly

245 250 255

Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala

260 265 270

Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr

275 280 285

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly

290 295 300

Pro Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala

305 310 315 320

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser Thr

325 330 335

Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ile Ile Ser

340 345 350

Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn Ile

355 360 365

Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val Ala

370 375 380

Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Leu Thr Ala Gly

385 390 395 400

Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala Gly

405 410 415

Thr Ile Asn Ser Pro Ala Val Ala Ala Gly Ser Phe Ser Ala Thr Ile

420 425 430

Ile Ala Asn Leu Pro Ala Gly Ala Ala Val Ser Leu Gln Leu Phe Gly

435 440 445

Val Ile Ala Leu Ala Thr Leu Ser Thr Ala Thr Pro Gly Ala Thr Leu

450 455 460

Thr Ile Ile Arg Leu Ser

465 470

<210> 57

<211> 136

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 57

Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys

1 5 10 15

Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser

20 25 30

Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe

35 40 45

Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala

50 55 60

His Asn Ser Ile Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Thr Ile Asn Glu Val Tyr

65 70 75 80

Val Phe Val Thr Val Leu Leu Gln Tyr Ser Thr Leu Ile Gly Gly Ser

85 90 95

Tyr Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln

100 105 110

Ala Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile

115 120 125

Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly

130 135

<210> 58

<211> 384

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 58

Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys

1 5 10 15

Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser

20 25 30

Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe

35 40 45

Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala

50 55 60

His Asn Ser Ile Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Thr Ile Asn Glu Val Tyr

65 70 75 80

Val Phe Val Thr Val Leu Leu Gln Tyr Ser Thr Leu Ile Gly Gly Ser

85 90 95

Tyr Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln

100 105 110

Ala Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile

115 120 125

Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Pro Thr

130 135 140

Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly

145 150 155 160

Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val

165 170 175

Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr

180 185 190

Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly

195 200 205

Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys

210 215 220

Asp Cys Cys Val Leu Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly

225 230 235 240

Glu Thr Val Ile Leu Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro

245 250 255

Leu Phe Phe Leu Phe Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr

260 265 270

Val Thr Asp Gly Thr Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr

275 280 285

Gly Val Gly Phe Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro

290 295 300

Thr Asp Val Gly Cys Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln

305 310 315 320

Leu Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn

325 330 335

Gly Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile

340 345 350

Val Leu Gly Thr Leu Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala

355 360 365

Ile Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met

370 375 380

<210> 59

<211> 196

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 59

Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro

20 25 30

Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Phe Thr Thr

35 40 45

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

50 55 60

Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro

65 70 75 80

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

85 90 95

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Phe Thr Pro Thr Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly

130 135 140

Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro

145 150 155 160

Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly

165 170 175

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro

180 185 190

Ser Gly Leu Gly

195

<210> 60

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 60

Met Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 61

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 61

Met Ala Leu Glu Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 62

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 62

Met Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 63

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 63

Met Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 64

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 64

Met Ala Leu Glu Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 65

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 65

Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 66

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 66

Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro

1 5 10 15

Pro

<210> 67

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 67

Met Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln

1 5 10 15

Pro

<210> 68

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 68

Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln

1 5 10 15

Pro

<210> 69

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 69

Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln

1 5 10 15

Pro

<210> 70

<211> 17

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 70

Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro

1 5 10 15

Ser

<210> 71

<211> 799

<212> Белок

<213> Bacillus mycoides

<400> 71

Met Lys Arg Lys Thr Pro Phe Lys Val Phe Ser Ser Leu Ala Ile Thr

1 5 10 15

Thr Met Leu Gly Cys Thr Phe Ala Leu Gly Thr Ser Val Ala Tyr Ala

20 25 30

Glu Thr Thr Ser Gln Ser Lys Gly Ser Ile Ser Thr Thr Pro Ile Asp

35 40 45

Asn Asn Leu Ile Gln Glu Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Lys Glu Arg

50 55 60

Gly Thr Ile Asp Gln Ser Ala Ser Lys Glu Glu Thr Gln Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Ile Glu Lys Lys Lys Gly Asp Gln Pro Asn Lys Glu Ile

85 90 95

Leu Pro Asp Asp Pro Ala Lys Glu Ala Ser Asp Phe Val Lys Lys Val

100 105 110

Lys Glu Lys Lys Met Glu Glu Lys Glu Lys Val Lys Lys Ser Val Glu

115 120 125

Asn Ala Ser Ser Glu Gln Thr Pro Ser Gln Asn Lys Lys Gln Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Val Pro Thr Ser Pro Ala Lys Gln Ala Pro Tyr Asn Gly Ala

145 150 155 160

Val Arg Thr Asp Lys Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Tyr

165 170 175

Lys His Asn Asn Ile Glu Gln Ser Pro Gly Tyr Met Tyr Ala Asn Asp

180 185 190

Phe Ser Arg Glu His Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe

195 200 205

Thr Leu Phe Asp Gly Ser Lys Val Lys Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu

210 215 220

Glu Gln Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Tyr Val Thr Glu Trp

225 230 235 240

Leu Thr Val Pro Gly Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Gly Lys Thr

245 250 255

Gly His Asp Asn Lys Gly Pro Lys Gly Ala Arg Asp Leu Val Lys Glu

260 265 270

Ala Leu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Gly Leu Asp Leu Ser Gln Phe Asp

275 280 285

Gln Phe Asp Arg Tyr Asp Thr Asn Gly Asp Gly Asn Gln Asn Glu Pro

290 295 300

Asp Gly Val Ile Asp His Leu Met Val Ile His Ala Gly Val Gly Gln

305 310 315 320

Glu Ala Gly Gly Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg

325 330 335

Ser Lys Leu Ala Gln Asp Pro Val Ala Ile Glu Gly Thr Lys Ser Lys

340 345 350

Val Ser Tyr Trp Asp Gly Lys Val Ala Ala His Asp Tyr Thr Ile Glu

355 360 365

Pro Glu Asp Gly Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Phe Gly His Asp

370 375 380

Leu Gly Leu Pro Asp Glu Tyr Asp Thr Asn Tyr Thr Gly Ala Gly Ser

385 390 395 400

Pro Val Glu Ala Trp Ser Leu Met Ser Gly Gly Ser Trp Thr Gly Arg

405 410 415

Ile Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Asp Phe

420 425 430

Leu Gln Lys Asn Met Asp Gly Asn Trp Ala Lys Ile Val Glu Val Asp

435 440 445

Tyr Asp Lys Ile Lys Arg Gly Val Gly Phe Pro Thr Tyr Ile Asp Gln

450 455 460

Ser Val Thr Lys Ser Asn Arg Pro Gly Leu Val Arg Val Asn Leu Pro

465 470 475 480

Glu Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Thr Gly Phe Gly Lys His Ala Tyr

485 490 495

Tyr Ser Thr Arg Gly Asp Asp Met His Thr Thr Leu Glu Thr Pro Leu

500 505 510

Phe Asp Leu Thr Lys Ala Ala Asn Ala Lys Phe Asp Tyr Lys Ala Asn

515 520 525

Tyr Glu Leu Glu Ala Glu Cys Asp Phe Ile Glu Val His Ala Val Thr

530 535 540

Glu Asp Gly Thr Lys Thr Leu Ile Asp Lys Leu Gly Asp Lys Val Val

545 550 555 560

Lys Gly Asp Gln Asp Thr Thr Glu Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr

565 570 575

Asp Leu Ser Gln Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Asp Tyr

580 585 590

Ile Thr Asp Pro Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Met Asp Asn Val

595 600 605

Asn Val Thr Val Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly

610 615 620

Gln Ala Lys Met Lys Leu Asn Gly Phe Val Val Ser Asp Gly Thr Glu

625 630 635 640

Lys Lys Pro His Tyr Tyr Tyr Leu Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ser

645 650 655

Asp Glu Gly Leu Lys Val Gly Arg Gly Pro Val Tyr Asn Thr Gly Leu

660 665 670

Val Val Trp Tyr Ala Asp Asp Ser Phe Lys Asp Asn Trp Val Gly Arg

675 680 685

His Pro Gly Glu Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala

690 695 700

Val Val Gly Asn Leu Asn Gly Lys Pro Val Tyr Gly Asn Thr Gly Leu

705 710 715 720

Gln Ile Ala Asp Ala Ala Phe Ser Leu Asp Gln Thr Pro Ala Trp Asn

725 730 735

Val Asn Ser Phe Thr Arg Gly Gln Phe Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Gly

740 745 750

Val Ala Thr Phe Asp Asp Ser Lys Val Tyr Ser Asn Thr Gln Ile Pro

755 760 765

Asp Ala Gly Arg Lys Val Pro Gln Leu Gly Leu Lys Phe Gln Val Val

770 775 780

Gly Gln Ala Asp Asp Lys Ser Ala Gly Ala Ile Trp Ile Arg Arg

785 790 795

<210> 72

<211> 152

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 72

Met Ser Cys Asn Glu Asn Lys His His Gly Ser Ser His Cys Val Val

1 5 10 15

Asp Val Val Lys Phe Ile Asn Glu Leu Gln Asp Cys Ser Thr Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Ser Gly Cys Glu Ile Pro Phe Leu Gly Ala His Asn Thr Ala

35 40 45

Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr Lys Ala Gly Ala

50 55 60

Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr Ser Cys Arg Ser

65 70 75 80

Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Val Asp Asp Asp Ser Cys Ala Val Leu

85 90 95

Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Ser Ser Pro Val Pro Pro Thr

100 105 110

Asp Asp Pro Ile Cys Thr Phe Leu Ala Val Pro Asn Ala Arg Leu Val

115 120 125

Ser Thr Ser Thr Cys Ile Thr Val Asp Leu Ser Cys Phe Cys Ala Ile

130 135 140

Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile

145 150

<210> 73

<211> 167

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 73

Met Phe Ser Ser Asp Cys Glu Phe Thr Lys Ile Asp Cys Glu Ala Lys

1 5 10 15

Pro Ala Ser Thr Leu Pro Ala Phe Gly Phe Ala Phe Asn Ala Ser Ala

20 25 30

Pro Gln Phe Ala Ser Leu Phe Thr Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser

35 40 45

Pro Asn Pro Asn Ile Thr Val Pro Val Ile Asn Asp Thr Val Ser Val

50 55 60

Gly Asp Gly Ile Arg Ile Leu Arg Ala Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Pro Val Ala Pro Glu Ala Gly

85 90 95

Arg Phe Phe Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ala Asn Ile Ile Pro Gly Ser

100 105 110

Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Val Ile Gly Thr Gly Glu Val Asp Val

115 120 125

Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu Asn Pro Gly Asp Leu Ile Arg

130 135 140

Ile Val Pro Val Glu Leu Ile Gly Thr Val Asp Ile Arg Ala Ala Ala

145 150 155 160

Leu Thr Val Ala Gln Ile Ser

165

<210> 74

<211> 156

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 74

Met Ser Cys Asn Cys Asn Glu Asp His His His His Asp Cys Asp Phe

1 5 10 15

Asn Cys Val Ser Asn Val Val Arg Phe Ile His Glu Leu Gln Glu Cys

20 25 30

Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ser Gly Cys Glu Val Pro Phe Leu Gly Ala

35 40 45

His Asn Ser Ala Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr

50 55 60

Lys Ala Gly Ala Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr

65 70 75 80

Ser Cys Arg Ser Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Ile Asp Asp Asp Asp

85 90 95

Cys Ala Val Leu Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Pro

100 105 110

Val Pro Pro Thr Asp Asp Pro Ile Cys Thr Phe Leu Ala Val Pro Asn

115 120 125

Ala Arg Leu Ile Ser Thr Asn Thr Cys Leu Thr Val Asp Leu Ser Cys

130 135 140

Phe Cys Ala Ile Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile

145 150 155

<210> 75

<211> 182

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 75

Met Glu Val Gly Gly Thr Ser Val Lys Asn Lys Asn Lys Ser Ser Thr

1 5 10 15

Val Gly Lys Pro Leu Leu Tyr Ile Ala Gln Val Ser Leu Glu Leu Ala

20 25 30

Ala Pro Lys Thr Lys Arg Ile Ile Leu Thr Asn Phe Glu Asn Glu Asp

35 40 45

Arg Lys Glu Glu Ser Asn Arg Asn Glu Asn Val Val Ser Ser Ala Val

50 55 60

Glu Glu Val Ile Glu Gln Glu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Glu Gln Glu

65 70 75 80

Gln Glu Glu Gln Val Glu Glu Lys Thr Glu Glu Glu Glu Gln Val Gln

85 90 95

Glu Gln Gln Glu Pro Val Arg Thr Val Pro Tyr Asn Lys Ser Phe Lys

100 105 110

Asp Met Asn Asn Glu Glu Lys Ile His Phe Leu Leu Asn Arg Pro His

115 120 125

Tyr Ile Pro Lys Val Arg Cys Arg Ile Lys Thr Ala Thr Ile Ser Tyr

130 135 140

Val Gly Ser Ile Ile Ser Tyr Arg Asn Gly Ile Val Ala Ile Met Pro

145 150 155 160

Pro Asn Ser Met Arg Asp Ile Arg Leu Ser Ile Glu Glu Ile Lys Ser

165 170 175

Ile Asp Met Ala Gly Phe

180

<210> 76

<211> 174

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 76

Met Lys Glu Arg Ser Glu Asn Met Arg Ser Ser Ser Arg Lys Leu Thr

1 5 10 15

Asn Phe Asn Cys Arg Ala Gln Ala Pro Ser Thr Leu Pro Ala Leu Gly

20 25 30

Phe Ala Phe Asn Ala Thr Ser Pro Gln Phe Ala Thr Leu Phe Thr Pro

35 40 45

Leu Leu Leu Pro Ser Thr Gly Pro Asn Pro Asn Ile Thr Val Pro Val

50 55 60

Ile Asn Asp Thr Ile Ser Thr Gly Thr Gly Ile Arg Ile Gln Val Ala

65 70 75 80

Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Leu Asp Asn Val

85 90 95

Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala Arg Phe Phe Leu Thr Leu Asn Ser Ser

100 105 110

Thr Asn Ile Ile Ala Gly Ser Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Ile Ile

115 120 125

Gly Thr Gly Glu Val Asp Val Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu

130 135 140

Asn Pro Gly Asp Leu Ile Gln Ile Val Pro Val Glu Val Ile Gly Thr

145 150 155 160

Val Asp Ile Arg Ser Ala Ala Leu Thr Val Ala Gln Ile Arg

165 170

<210> 77

<211> 796

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 77

Met Ser Lys Lys Pro Phe Lys Val Leu Ser Ser Ile Ala Leu Thr Ala

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Gln Ser Ala Tyr Ala Glu

20 25 30

Thr Pro Val Asn Lys Thr Ala Thr Ser Pro Val Asp Asp His Leu Ile

35 40 45

Pro Glu Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Lys Lys Arg Gly Val Ile Asp

50 55 60

Ser Lys Ala Ser Glu Thr Glu Thr Lys Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val

65 70 75 80

Glu Asn Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ala Ala Asn Gly Asp

85 90 95

Gln Leu Thr Lys Asp Ala Ser Asp Phe Leu Lys Lys Val Lys Asp Ala

100 105 110

Lys Ala Asp Thr Lys Glu Lys Leu Asn Gln Pro Ala Thr Gly Thr Pro

115 120 125

Ala Ala Thr Gly Pro Val Lys Gly Gly Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr

130 135 140

Ser Pro Ala Lys Gln Lys Asp Tyr Asn Gly Glu Val Arg Lys Asp Lys

145 150 155 160

Val Leu Val Leu Leu Val Glu Tyr Ala Asp Phe Lys His Asn Asn Ile

165 170 175

Asp Lys Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Asn Asp Phe Asn Lys Glu His

180 185 190

Tyr Glu Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe Thr Leu Asp Asp Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly

210 215 220

Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Lys Trp Leu Thr Val Pro Gly

225 230 235 240

Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Pro Gly Gly Gly His Asp Asn

245 250 255

Lys Gly Pro Lys Gly Pro Arg Asp Leu Val Lys Asp Ala Leu Lys Ala

260 265 270

Ala Val Asp Ser Gly Ile Asp Leu Ser Glu Phe Asp Gln Phe Asp Gln

275 280 285

Tyr Asp Val Asn Gly Asp Gly Asn Lys Asn Gln Pro Asp Gly Leu Ile

290 295 300

Asp His Leu Met Ile Ile His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Val Gly

325 330 335

Pro Lys Pro Phe Pro Ile Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Pro Tyr Trp

340 345 350

Gly Gly Lys Met Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly

355 360 365

Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro

370 375 380

Asp Glu Tyr Asp Thr Gln Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Ile Glu Ala

385 390 395 400

Trp Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr

405 410 415

Thr Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Thr

420 425 430

Ile Gly Gly Asn Trp Ala Asn Ile Val Glu Val Asp Tyr Glu Lys Leu

435 440 445

Asn Lys Gly Ile Gly Leu Ala Thr Tyr Leu Asp Gln Ser Val Thr Lys

450 455 460

Ser Ala Arg Pro Gly Met Ile Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Val

465 470 475 480

Lys Thr Ile Glu Pro Ala Phe Gly Lys Gln Tyr Tyr Tyr Ser Thr Lys

485 490 495

Gly Asp Asp Leu His Thr Lys Met Glu Thr Pro Leu Phe Asp Leu Thr

500 505 510

Asn Ala Thr Ser Ala Lys Phe Asp Phe Lys Ser Leu Tyr Glu Ile Glu

515 520 525

Ala Gly Tyr Asp Phe Leu Glu Val His Ala Val Thr Glu Asp Gly Lys

530 535 540

Gln Thr Leu Ile Glu Arg Leu Gly Glu Lys Ala Asn Ser Gly Asn Ala

545 550 555 560

Asp Ser Thr Asn Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ser Gln

565 570 575

Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Thr Phe Asp Tyr Ile Thr Asp Gly

580 585 590

Gly Leu Ala Leu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Asn Ala Ser Leu Thr Val

595 600 605

Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Thr Pro Gln Leu

610 615 620

Lys Leu Asp Gly Phe Val Val Ser Asn Gly Thr Glu Lys Lys Lys His

625 630 635 640

Asn Tyr Tyr Val Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ala Asp Asn Ala Leu

645 650 655

Lys Phe Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr

660 665 670

Ala Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Asn Trp Val Gly Val His Pro Gly His

675 680 685

Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala Ile Val Gly Thr

690 695 700

Leu Asn Gly Lys Pro Thr Val Lys Ser Ser Thr Arg Phe Gln Ile Ala

705 710 715 720

Asp Ala Ala Phe Ser Phe Asp Lys Thr Pro Ala Trp Lys Val Val Ser

725 730 735

Pro Thr Arg Gly Thr Phe Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Gly Val Pro Lys

740 745 750

Phe Asp Asp Ser Lys Thr Tyr Ile Asn Gln Gln Ile Pro Asp Ala Gly

755 760 765

Arg Ile Leu Pro Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Val Val Gly Gln Ala

770 775 780

Asp Asp Asn Ser Ala Gly Ala Val Arg Leu Tyr Arg

785 790 795

<210> 78

<211> 430

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 78

Met Lys His Asn Asp Cys Phe Asp His Asn Asn Cys Asn Pro Ile Val

1 5 10 15

Phe Ser Ala Asp Cys Cys Lys Asn Pro Gln Ser Val Pro Ile Thr Arg

20 25 30

Glu Gln Leu Ser Gln Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Val Ser Ala

35 40 45

Ile Ser Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asn Ala Asn Arg Leu Val Leu

50 55 60

Leu Asp Leu Phe Asn Gln Phe Leu Ile Phe Leu Asn Ser Leu Leu Pro

65 70 75 80

Ser Pro Glu Val Asn Phe Leu Lys Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ile Val

85 90 95

Leu Leu Gln Ser Pro Ala Pro Asn Leu Gly Gln Leu Ser Thr Leu Leu

100 105 110

Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Gln Phe Phe Phe Ala Leu Asp Leu

115 120 125

Ile Pro Ile Ser Cys Asn Ser Asn Val Asp Ser Ala Thr Leu Gln Leu

130 135 140

Leu Phe Asn Leu Leu Ile Gln Leu Ile Asn Ala Thr Pro Gly Ala Thr

145 150 155 160

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly

165 170 175

Thr Gly Ala Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

180 185 190

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala

195 200 205

Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr

210 215 220

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala

245 250 255

Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile

260 265 270

Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ser Ala Leu Val Asn Ala Leu Val

275 280 285

Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe Gly Phe Ser Gln Pro Gly Val

290 295 300

Ala Leu Thr Gly Gly Thr Ser Ile Thr Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp

305 310 315 320

Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Ala Gly Thr Ile Thr Ser Leu Ala Gly

325 330 335

Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val Gln Val

340 345 350

Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val

355 360 365

Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile

370 375 380

Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Ala Glu Ala Ile Pro Val Ala Ala

385 390 395 400

Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile

405 410 415

Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala Gly Ile Asn Ile Val

420 425 430

<210> 79

<211> 437

<212> Белок

<213> Bacillus cereus

<400> 79

Met Lys His Asn Asp Cys Phe Gly His Asn Asn Cys Asn Asn Pro Ile

1 5 10 15

Val Phe Thr Pro Asp Cys Cys Asn Asn Pro Gln Thr Val Pro Ile Thr

20 25 30

Ser Glu Gln Leu Gly Arg Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Ile Ala

35 40 45

Ala Ile Ala Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asp Ala Asn Arg Leu Ala

50 55 60

Leu Leu Asn Leu Phe Thr Gln Leu Leu Asn Leu Leu Asn Glu Leu Ala

65 70 75 80

Pro Ser Pro Glu Gly Asn Phe Leu Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile Ile

85 90 95

Asn Leu Leu Gln Ser Pro Asn Pro Asn Leu Gly Gln Leu Leu Ser Leu

100 105 110

Leu Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Pro Phe Phe Phe Ser Leu Ile

115 120 125

Leu Asp Pro Ala Ser Leu Gln Leu Leu Leu Asn Leu Leu Ala Gln Leu

130 135 140

Ile Gly Val Thr Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr

145 150 155 160

Gly Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gly

165 170 175

Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr

180 185 190

Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly

195 200 205

Val Ala Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu

210 215 220

Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu Ala

225 230 235 240

Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly

245 250 255

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala

260 265 270

Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Ala Leu Val Asn Ala Leu Ile Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe

290 295 300

Gly Phe Ser Gln Pro Gly Ile Gly Leu Ala Gly Gly Thr Ser Ile Thr

305 310 315 320

Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Asp Gly

325 330 335

Val Ile Thr Ser Leu Ala Gly Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ser

340 345 350

Pro Leu Ser Pro Val Gln Val Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala

355 360 365

Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro

370 375 380

Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Pro

385 390 395 400

Glu Ala Ile Pro Val Val Ala Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser

405 410 415

Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala

420 425 430

Gly Ile Asn Ile Val

435

<210> 80

<211> 119

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 80

Met Leu Phe Thr Ser Trp Leu Leu Phe Phe Ile Phe Ala Leu Ala Ala

1 5 10 15

Phe Arg Leu Thr Arg Leu Ile Val Tyr Asp Lys Ile Thr Gly Phe Leu

20 25 30

Arg Arg Pro Phe Ile Asp Glu Leu Glu Ile Thr Glu Pro Asp Gly Ser

35 40 45

Val Ser Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Lys Gly Leu Arg Lys Trp Ile

50 55 60

Gly Glu Leu Leu Ser Cys Tyr Trp Cys Thr Gly Val Trp Val Ser Ala

65 70 75 80

Phe Leu Leu Val Leu Tyr Asn Trp Ile Pro Ile Val Ala Glu Pro Leu

85 90 95

Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ile Glu Thr Ile

100 105 110

Thr Gly Tyr Phe Met Gly Glu

115

<210> 81

<211> 61

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 81

Met Phe Ala Val Ser Asn Asn Pro Arg Gln Asn Ser Tyr Asp Leu Gln

1 5 10 15

Gln Trp Tyr His Met Gln Gln Gln His Gln Ala Gln Gln Gln Ala Tyr

20 25 30

Gln Glu Gln Leu Gln Gln Gln Gly Phe Val Lys Lys Lys Gly Cys Asn

35 40 45

Cys Gly Lys Lys Lys Ser Thr Ile Lys His Tyr Glu Glu

50 55 60

<210> 82

<211> 481

<212> Белок

<213> Bacillus anthracis

<400> 82

Met Ser Arg Tyr Asp Asp Ser Gln Asn Lys Phe Ser Lys Pro Cys Phe

1 5 10 15

Pro Ser Ser Ala Gly Arg Ile Pro Asn Thr Pro Ser Ile Pro Val Thr

20 25 30

Lys Ala Gln Leu Arg Thr Phe Arg Ala Ile Ile Ile Asp Leu Thr Lys

35 40 45

Ile Ile Pro Lys Leu Phe Ala Asn Pro Ser Pro Gln Asn Ile Glu Asp

50 55 60

Leu Ile Asp Thr Leu Asn Leu Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ser Leu Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Ile Ile Lys Asn Leu

85 90 95

Ile Thr Ile Leu Lys Asn Pro Thr Phe Val Ala Ser Ala Val Phe Ile

100 105 110

Glu Leu Gln Asn Leu Ile Asn Tyr Leu Leu Ser Ile Thr Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Ile Asp Pro Cys Thr Leu Gln Glu Leu Leu Lys Leu Ile Ala Ala

130 135 140

Leu Gln Thr Ala Leu Val Asn Ser Ala Ser Phe Ile Gln Gly Pro Thr

145 150 155 160

Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly

165 170 175

Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala

180 185 190

Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr

195 200 205

Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly

210 215 220

Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro

225 230 235 240

Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln

245 250 255

Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro

260 265 270

Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro

275 280 285

Gln Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly

305 310 315 320

Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala

325 330 335

Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ser Phe

340 345 350

Pro Val Ala Thr Ile Val Val Thr Asn Asn Ile Gln Gln Thr Val Leu

355 360 365

Gln Phe Asn Asn Phe Ile Phe Asn Thr Ala Ile Asn Val Asn Asn Ile

370 375 380

Ile Phe Asn Gly Thr Asp Thr Val Thr Val Ile Asn Ala Gly Ile Tyr

385 390 395 400

Val Ile Ser Val Ser Ile Ser Thr Thr Ala Pro Gly Cys Ala Pro Leu

405 410 415

Gly Val Gly Ile Ser Ile Asn Gly Ala Val Ala Thr Asp Asn Phe Ser

420 425 430

Ser Asn Leu Ile Gly Asp Ser Leu Ser Phe Thr Thr Ile Glu Thr Leu

435 440 445

Thr Ala Gly Ala Asn Ile Ser Val Gln Ser Thr Leu Asn Glu Ile Thr

450 455 460

Ile Pro Ala Thr Gly Asn Thr Asn Ile Arg Leu Thr Val Phe Arg Ile

465 470 475 480

Ala

<210> 83

<211> 275

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 83

Met Lys Met Lys Arg Gly Ile Thr Thr Leu Leu Ser Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Ile Thr Glu Lys Thr Val Ala

20 25 30

Lys Glu Glu Lys Val Lys Leu Thr Asp Gln Gln Leu Met Ala Asp Leu

35 40 45

Trp Tyr Gln Thr Ala Gly Glu Met Lys Ala Leu Tyr Tyr Gln Gly Tyr

50 55 60

Asn Ile Gly Gln Leu Lys Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Gly Thr Glu

65 70 75 80

Lys Lys Pro Ala Ile Val Leu Asp Leu Asp Glu Thr Val Leu Asp Asn

85 90 95

Ser Pro His Gln Ala Met Ser Val Lys Thr Gly Lys Gly Tyr Pro Tyr

100 105 110

Lys Trp Asp Asp Trp Ile Asn Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Pro Gly

115 120 125

Ala Ile Asp Phe Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Lys Gly Val Asp Ile Tyr

130 135 140

Tyr Ile Ser Asn Arg Lys Thr Asn Gln Leu Asp Ala Thr Ile Lys Asn

145 150 155 160

Leu Glu Arg Val Gly Ala Pro Gln Ala Thr Lys Glu His Ile Leu Leu

165 170 175

Gln Asp Pro Lys Glu Lys Gly Lys Glu Lys Arg Arg Glu Leu Val Ser

180 185 190

Gln Thr His Asp Ile Val Leu Phe Phe Gly Asp Asn Leu Ser Asp Phe

195 200 205

Thr Gly Phe Asp Gly Lys Ser Val Lys Asp Arg Asn Gln Ala Val Ala

210 215 220

Asp Ser Lys Ala Gln Phe Gly Glu Lys Phe Ile Ile Phe Pro Asn Pro

225 230 235 240

Met Tyr Gly Asp Trp Glu Gly Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Phe Lys Lys

245 250 255

Ser Asp Ala Glu Lys Asp Lys Ile Arg Arg Asp Asn Leu Lys Ser Phe

260 265 270

Asp Thr Lys

275

<210> 84

<211> 795

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 84

Met Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Pro Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala

1 5 10 15

Ala Val Leu Ser Ser Thr Phe Ala Phe Gly Gly His Ala Ala Tyr Ala

20 25 30

Glu Thr Pro Thr Ser Ser Leu Pro Ile Asp Glu His Leu Ile Pro Glu

35 40 45

Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Lys Gln Arg Gly Val Ile Asp Gln Ser

50 55 60

Ala Ser Gln Ala Glu Thr Ser Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val Glu Lys

65 70 75 80

Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ile Leu Thr Gly Asp Ser Leu

85 90 95

Thr Gln Glu Ala Ser Asp Phe Met Lys Lys Val Lys Asp Ala Lys Met

100 105 110

Arg Glu Asn Glu Gln Ala Gln Gln Pro Glu Val Gly Pro Val Ala Gly

115 120 125

Gln Gly Ala Ala Leu Asn Pro Gly Lys Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr

130 135 140

Thr Ser Ala Lys Gln Glu Glu Tyr Asn Gly Ala Val Arg Lys Asp Lys

145 150 155 160

Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Phe Lys His Asn Asn Ile

165 170 175

Asp Gln Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Lys Asp Phe Asn Arg Glu His

180 185 190

Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asp Glu Pro Phe Thr Leu Phe Asp Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Asn Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly

210 215 220

Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Glu Trp Leu Thr Val Pro Gly

225 230 235 240

Lys Ala Ser Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Gly Thr Gly His Asp Asn Lys

245 250 255

Gly Pro Leu Gly Pro Lys Asp Leu Val Lys Glu Ala Leu Lys Ala Ala

260 265 270

Val Ala Lys Gly Ile Asn Leu Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Asp Gln Tyr

275 280 285

Asp Gln Asn Gly Asn Gly Asn Lys Asn Glu Pro Asp Gly Ile Ile Asp

290 295 300

His Leu Met Val Val His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly Gly

305 310 315 320

Lys Leu Lys Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Ser Lys Leu Gly Ser

325 330 335

Lys Pro Tyr Ala Ile Asp Gly Thr Lys Ser Ser Val Ser Asn Trp Gly

340 345 350

Gly Lys Met Ala Ala Tyr Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly Ala

355 360 365

Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro Asp

370 375 380

Glu Tyr Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Val Glu Ser Trp

385 390 395 400

Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr Glu

405 410 415

Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Asn Met

420 425 430

Lys Gly Asn Trp Ala Asn Ile Leu Glu Val Asp Tyr Asp Lys Leu Ser

435 440 445

Lys Gly Ile Gly Val Ala Thr Tyr Val Asp Gln Ser Thr Thr Lys Ser

450 455 460

Lys Arg Pro Gly Ile Val Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Ile Lys

465 470 475 480

Asn Ile Glu Ser Ala Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Ser Thr Lys Gly

485 490 495

Asn Asp Ile His Thr Thr Leu Glu Thr Pro Val Phe Asp Leu Thr Asn

500 505 510

Ala Lys Asp Ala Lys Phe Asp Tyr Lys Ala Phe Tyr Glu Leu Glu Ala

515 520 525

Lys Tyr Asp Phe Leu Asp Val Tyr Ala Ile Ala Glu Asp Gly Thr Lys

530 535 540

Thr Arg Ile Asp Arg Met Gly Glu Lys Asp Ile Lys Gly Gly Ala Asp

545 550 555 560

Thr Thr Asp Gly Lys Trp Val Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Phe

565 570 575

Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Glu Tyr Leu Thr Asp Ile Ala

580 585 590

Val Ala Tyr Lys Gly Phe Ala Leu Asp Asn Ala Ala Leu Thr Val Asp

595 600 605

Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Gln Pro Ala Met Thr

610 615 620

Leu Lys Gly Phe Thr Val Ser Asn Gly Phe Glu Gln Lys Lys His Asn

625 630 635 640

Tyr Tyr Val Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ser Asp Thr Ala Leu Gln

645 650 655

Tyr Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr Ala

660 665 670

Asp Gln Ser Phe Thr Asp Asn Trp Val Gly Val His Pro Gly Glu Gly

675 680 685

Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala Ile Val Gly Thr Leu

690 695 700

Asn Gly Gln Pro Thr Val Lys Ser Ser Thr Arg Tyr Gln Ile Ala Asp

705 710 715 720

Ala Ala Phe Ser Phe Asp Gln Thr Pro Ala Trp Lys Val Asn Ser Pro

725 730 735

Thr Arg Gly Ile Phe Asp Tyr Lys Gly Leu Pro Gly Val Ala Lys Phe

740 745 750

Asp Asp Ser Lys Gln Tyr Ile Asn Ser Val Ile Pro Asp Ala Gly Arg

755 760 765

Lys Leu Pro Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Val Val Gly Gln Ala Glu

770 775 780

Asp Lys Ser Ala Gly Ala Val Trp Leu His Arg

785 790 795

<210> 85

<211> 169

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 85

taatcaccct cttccaaatc aatcatatgt tatacatata ctaaactttc cattttttta 60

aattgttcaa gtagtttaag atttcttttc aataattcaa atgtccgtgt cattttcttt 120

cggttttgca tctactatat aatgaacgct ttatggaggt gaatttatg 169

<210> 86

<211> 303

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 86

atttatttca ttcaattttt cctatttagt acctaccgca ctcacaaaaa gcacctctca 60

ttaatttata ttatagtcat tgaaatctaa tttaatgaaa tcatcatact atatgtttta 120

taagaagtaa aggtaccata cttaattaat acatatctat acacttcaat atcacagcat 180

gcagttgaat tatatccaac tttcatttca aattaaataa gtgcctccgc tattgtgaat 240

gtcatttact ctccctacta catttaataa ttatgacaag caatcatagg aggttactac 300

atg 303

<210> 87

<211> 173

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 87

aattacataa caagaactac attagggagc aagcagtcta gcgaaagcta actgcttttt 60

tattaaataa ctattttatt aaatttcata tatacaatcg cttgtccatt tcatttggct 120

ctacccacgc atttactatt agtaatatga atttttcaga ggtggatttt att 173

<210> 88

<211> 124

<212> ДНК

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 88

ctatgattta agatacacaa tagcaaaaga gaaacatatt atataacgat aaatgaaact 60

tatgtatatg tatggtaact gtatatatta ctacaataca gtatactcat aggaggtagg 120

tatg 124

<210> 89

<211> 376

<212> ДНК

<213> Bacillus weihenstephensis

<400> 89

ggtaggtaga tttgaaatat gatgaagaaa aggaataact aaaaggagtc gatatccgac 60

tccttttagt tataaataat gtggaattag agtataattt tatataggta tattgtatta 120

gatgaacgct ttatccttta attgtgatta atgatggatt gtaagagaag gggcttacag 180

tccttttttt atggtgttct ataagccttt ttaaaagggg taccacccca cacccaaaaa 240

cagggggggt tataactaca tattggatgt tttgtaacgt acaagaatcg gtattaatta 300

ccctgtaaat aagttatgtg tatataaggt aactttatat attctcctac aataaaataa 360

aggaggtaat aaagtg 376

<210> 90

<211> 225

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 90

aacccttaat gcattggtta aacattgtaa agtctaaagc atggataatg ggcgagaagt 60

aagtagattg ttaacaccct gggtcaaaaa ttgatattta gtaaaattag ttgcactttg 120

tgcatttttt cataagatga gtcatatgtt ttaaattgta gtaatgaaaa acagtattat 180

atcataatga attggtatct taataaaaga gatggaggta actta 225

<210> 91

<211> 125

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 91

taattccacc ttcccttatc ctctttcgcc tatttaaaaa aaggtcttga gattgtgacc 60

aaatctcctc aactccaata tcttattaat gtaaatacaa acaagaagat aaggagtgac 120

attaa 125

<210> 92

<211> 144

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 92

aggatgtctt tttttatatt gtattatgta catccctact atataaattc cctgctttta 60

tcgtaagaat taacgtaata tcaaccatat cccgttcata ttgtagtagt gtatgtcaga 120

actcacgaga aggagtgaac ataa 144

<210> 93

<211> 126

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 93

ttaatgtcac tccttatctt cttgtttgta tttacattaa taagatattg gagttgagga 60

gatttggtca caatctcaag accttttttt taaataggcg aaagaggata agggaaggtg 120

gaatta 126

<210> 94

<211> 103

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 94

atatattttc ataatacgag aaaaagcgga gtttaaaaga atgagggaac ggaaataaag 60

agttgttcat atagtaaata gacagaattg acagtagagg aga 103

<210> 95

<211> 169

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 95

aaactaaata atgagctaag catggattgg gtggcagaat tatctgccac ccaatccatg 60

cttaacgagt attattatgt aaatttctta aaattgggaa cttgtctaga acatagaacc 120

tgtccttttc attaactgaa agtagaaaca gataaaggag tgaaaaaca 169

<210> 96

<211> 111

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 96

attcactaca acggggatga gtttgatgcg gatacatatg agaagtaccg gaaagtgttt 60

gtagaacatt acaaagatat attatctcca tcataaagga gagatgcaaa g 111

<210> 97

<211> 273

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 97

cgcgcaccac ttcgtcgtac aacaacgcaa gaagaagttg gggatacagc agtattctta 60

ttcagtgatt tagcacgcgg cgtaacagga gaaaacattc acgttgattc agggtatcat 120

atcttaggat aaatataata ttaattttaa aggacaatct ctacatgttg agattgtcct 180

ttttatttgt tcttagaaag aacgattttt aacgaaagtt cttaccacgt tatgaatata 240

agtataatag tacacgattt attcagctac gta 273

<210> 98

<211> 303

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 98

tgaagtatct agagctaatt tacgcaaagg aatctcagga caacactttc gcaacaccta 60

tattttaaat ttaataaaaa aagagactcc ggagtcagaa attataaagc tagctgggtt 120

caaatcaaaa atttcactaa aacgatatta tcaatacgca gaaaatggaa aaaacgcctt 180

atcataaggc gttttttcca ttttttcttc aaacaaacga ttttactatg accatttaac 240

taatttttgc atctactatg atgagtttca ttcacattct cattagaaag gagagattta 300

atg 303

<210> 99

<211> 240

<212> ДНК

<213> Bacillus anthracis

<400> 99

tatatcatat gtaaaattag ttcttattcc cacatatcat atagaatcgc catattatac 60

atgcagaaaa ctaagtatgg tattattctt aaattgttta gcaccttcta atattacaga 120

tagaatccgt cattttcaac agtgaacatg gatttcttct gaacacaact ctttttcttt 180

ccttatttcc aaaaagaaaa gcagcccatt ttaaaatacg gctgcttgta atgtacatta 240

<210> 100

<211> 267

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 100

tatcacataa ctctttattt ttaatatttc gacataaagt gaaactttaa tcagtggggg 60

ctttgttcat ccccccactg attattaatt gaaccaaggg ataaaaagat agagggtctg 120

accagaaaac tggagggcat gattctataa caaaaagctt aatgtttata gaattatgtc 180

tttttatata gggagggtag taaacagaga tttggacaaa aatgcaccga tttatctgaa 240

ttttaagttt tataaagggg agaaatg 267

<210> 101

<211> 124

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 101

attttttact tagcagtaaa actgatatca gttttactgc tttttcattt ttaaattcaa 60

tcattaaatc ttccttttct acatagtcat aatgttgtat gacattccgt aggaggcact 120

tata 124

<210> 102

<211> 170

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 102

acataaattc acctccataa agcgttcatt atatagtaga tgcaaaaccg aaagaaaatg 60

acacggacat ttgaattatt gaaaagaaat cttaaactac ttgaacaatt taaaaaaatg 120

gaaagtttag tatatgtata acatatgatt gatttggaag agggtgatta 170

<210> 103

<211> 212

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 103

ttctattttc caacataaca tgctacgatt aaatggtttt ttgcaaatgc cttcttggga 60

agaaggatta gagcgttttt ttatagaaac caaaagtcat taacaatttt aagttaatga 120

cttttttgtt tgcctttaag aggttttatg ttactataat tatagtatca ggtactaata 180

acaagtataa gtatttctgg gaggatatat ca 212

<210> 104

<211> 1500

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 104

atgaaacggt caatctcgat ttttattacg tgtttattga ttacgttatt gacaatgggc 60

ggcatgatag cttcgccggc atcagcagca gggacaaaaa cgccagtagc caagaatggc 120

cagcttagca taaaaggtac acagctcgtt aaccgagacg gtaaagcggt acagctgaag 180

gggatcagtt cacacggatt gcaatggtat ggagaatatg tcaataaaga cagcttaaaa 240

tggctgagag atgattgggg tatcaccgtt ttccgtgcag cgatgtatac ggcagatggc 300

ggttatattg acaacccgtc cgtgaaaaat aaagtaaaag aagcggttga agcggcaaaa 360

gagcttggga tatatgtcat cattgactgg catatcttaa atgacggtaa tccaaaccaa 420

aataaagaga aggcaaaaga attcttcaag gaaatgtcaa gcctttacgg aaacacgcca 480

aacgtcattt atgaaattgc aaacgaacca aacggtgatg tgaactggaa gcgtgatatt 540

aaaccatatg cggaagaagt gatttcagtt atccgcaaaa atgatccaga caacatcatc 600

attgtcggaa ccggtacatg gagccaggat gtgaatgatg ctgccgatga ccagctaaaa 660

gatgcaaacg ttatgtacgc acttcatttt tatgccggca cacacggcca atttttacgg 720

gataaagcaa actatgcact cagcaaagga gcacctattt ttgtgacaga gtggggaaca 780

agcgacgcgt ctggcaatgg cggtgtattc cttgatcaat cgagggaatg gctgaaatat 840

ctcgacagca agaccattag ctgggtgaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 900

tcagctttaa agccgggggc atctaaaaca ggcggctggc ggttgtcaga tttatctgct 960

tcaggaacat tcgttagaga aaacattctc ggcaccaaag attcgacgaa ggacattcct 1020

gaaacgccat caaaagataa acccacacag gaaaatggta tttctgtaca gtacagagca 1080

ggggatggga gtatgaacag caaccaaatc cgtccgcagc ttcaaataaa aaataacggc 1140

aataccacgg ttgatttaaa agatgtcact gcccgttact ggtataaagc gaaaaacaaa 1200

ggccaaaact ttgactgtga ctacgcgcag attggatgcg gcaatgtgac acacaagttt 1260

gtgacgttgc ataaaccaaa gcaaggtgca gatacctatc tggaacttgg atttaaaaac 1320

ggaacgttgg caccgggagc aagcacaggg aatattcagc tccgtcttca caatgatgac 1380

tggagcaatt atgcacaaag cggcgattat tcctttttca aatcaaatac gtttaaaaca 1440

acgaaaaaaa tcacattata tgatcaagga aaactgattt ggggaacaga accaaattag 1500

<210> 105

<211> 852

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 105

atgaaaaaga aagtacttgc tttagcggca gctattacat tggttgctcc attacaaagt 60

gttgcatttg ctcatgaaaa tgatggggga cagagatttg gagttattcc gcgctggtct 120

gctgaagata aacataaaga aggcgtgaat tctcatttat ggattgtaaa tcgtgcaatt 180

gatattatgt ctcgtaatac aacacttgta aaacaagatc gagttgcact attaaatgaa 240

tggcgtactg agttagagaa cggtatttat gctgctgact atgaaaatcc ttattatgat 300

aatagcacat ttgcttcaca tttctatgac cctgacaatg ggaaaactta tattccgtat 360

gcaaagcagg caaaggaaac tggagctaaa tattttaaat tagctggtga gtcttacaaa 420

aataaagata tgcaacaagc attcttctat ttaggattat ctcttcatta tctaggggat 480

gtaaaccaac cgatgcatgc agcaaacttt acaaaccttt cgtatccaca agggttccat 540

tctaaatatg aaaactttgt agatacgata aaagataact ataaagtaac ggatggaaat 600

ggatattgga actggaaagg tacgaatcca gaagattgga ttcatggagc ggcagtagtt 660

gcgaaacaag attacgctgg cattgtaaat gataatacga aagattggtt cgtgagagct 720

gctgtatcac aagaatatgc agataaatgg cgcgctgaag ttacaccaat gacaggtaag 780

cgtttaatgg atgcacaacg tgttactgct ggatatattc agctttggtt tgatacgtac 840

ggagatcgtt aa 852

<210> 106

<211> 729

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 106

gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60

ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120

tgcggacggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180

acaaaggcag ttccgaataa caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240

aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300

gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360

cctgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420

tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480

aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540

ttgaataaat tcttggacgt acgctatgac gatctgatga atccggccaa tcatgacacc 600

cgtgacgaat ggagagaatc agttgcccgt gtggacgtgc ttcgctctat cgccaaggag 660

aacaactata atctaaacgg accgattcat gttcgttcaa acgagtacgg taattttgta 720

atcaaataa 729

<210> 107

<211> 499

<212> Белок

<213> Bacillus subtilis

<400> 107

Met Lys Arg Ser Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu

1 5 10 15

Leu Thr Met Gly Gly Met Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln

35 40 45

Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser

50 55 60

His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys

65 70 75 80

Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr

85 90 95

Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val

100 105 110

Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile

115 120 125

Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys

130 135 140

Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro

145 150 155 160

Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp

165 170 175

Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg

180 185 190

Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser

195 200 205

Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val

210 215 220

Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg

225 230 235 240

Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr

245 250 255

Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp

260 265 270

Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp

275 280 285

Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys

290 295 300

Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr

325 330 335

Lys Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn

340 345 350

Gly Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn

355 360 365

Gln Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val

370 375 380

Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys

385 390 395 400

Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Val

405 410 415

Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr

420 425 430

Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser

435 440 445

Thr Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr

450 455 460

Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr

465 470 475 480

Thr Lys Lys Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr

485 490 495

Glu Pro Asn

<210> 108

<211> 283

<212> Белок

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 108

Met Lys Lys Lys Val Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Thr Leu Val Ala

1 5 10 15

Pro Leu Gln Ser Val Ala Phe Ala His Glu Asn Asp Gly Gly Gln Arg

20 25 30

Phe Gly Val Ile Pro Arg Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly

35 40 45

Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser

50 55 60

Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Leu Leu Asn Glu

65 70 75 80

Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn

85 90 95

Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp

100 105 110

Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Tyr Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly

115 120 125

Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met

130 135 140

Gln Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp

145 150 155 160

Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro

165 170 175

Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp

180 185 190

Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr

195 200 205

Asn Pro Glu Asp Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp

210 215 220

Tyr Ala Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Arg Ala

225 230 235 240

Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro

245 250 255

Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr

260 265 270

Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg

275 280

<210> 109

<211> 244

<212> Белок

<213> Bacillus subtilis

<400> 109

Leu Glu Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu

1 5 10 15

Thr Ser Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val

20 25 30

Glu Arg Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe

35 40 45

Thr Thr Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys

50 55 60

Ala Val Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg

65 70 75 80

Leu Ala Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala

85 90 95

Ser Ala Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln

100 105 110

Asp Lys Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser

115 120 125

Asp Asn Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp

130 135 140

Thr Val Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ile Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly

165 170 175

Ile Asp Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp

180 185 190

Asp Leu Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu

195 200 205

Ser Val Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn

210 215 220

Tyr Asn Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn

225 230 235 240

Phe Val Ile Lys

<---

Claims (29)

1. Композиция для усиления роста растения и способствования жизнеспособности растения, содержащая:

a) рекомбинантные продуцирующие экзоспорий клетки Bacillus представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий:

(I) по меньшей мере один белок или пептид, выбранный из группы, состоящей из эндоглюканазы, имеющей последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную с SEQ ID NO: 107, и фосфолипазы, имеющей последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную с SEQ ID NO: 108; и

(II) нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, причем нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория включает:

- аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность с аминокислотами 20–35 из SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25–35 составляет по меньшей мере 54%;

- аминокислоты 1–35 из SEQ ID NO: 1;

- аминокислоты 20–35 из SEQ ID NO: 1;

- аминокислоты 22–31 из SEQ ID NO: 1;

- аминокислоты 22–33 из SEQ ID NO: 1;

- аминокислоты 20–31 из SEQ ID NO: 1;

- аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1; или

- аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 2; и

б) по меньшей мере один агент биологической борьбы, выбранный из группы, состоящей из Bacillus subtilis QST713 и Bacillus firmus I-1582 в синергетически эффективном количестве, причем синергизм возникает между a) и б) и причем синергетическое весовое соотношение рекомбинантных продуцирующих экзоспорий клеток Bacillus и по меньшей мере одного агента биологической борьбы находится в диапазоне от 1:1000 до 1000:1.

2. Композиция по п. 1, где представитель семейства Bacillus cereus выбирают из группы, состоящей из Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis и их комбинаций.

3. Композиция по п. 1, где слитый белок содержит эндоглюканазу, имеющую последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную с SEQ ID NO: 107.

4. Композиция по п. 1, где рекомбинантные клетки Bacillus имеют происхождение из Bacillus thuringiensis BT013A.

5. Композиция по п. 1, где слитый белок содержит фосфолипазу, имеющую последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную с SEQ 15 ID NO: 108.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, где слитый белок экспрессируется под контролем промотора спорообразования, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, где слитый белок экспрессируется под контролем высокоэкспрессируемого промотора спорообразования.

8. Композиция по п. 7, где высокоэкспрессируемый промотор спорообразования включает промоторную последовательность сигма-K полимеразы, специфической для спорообразования.

9. Композиция по любому из пп. 6-8, где промотор спорообразования включает нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NOs: 85-03.

10. Семя для прорастания растений, покрытое композицией по любому из пп. 1-9.

11. Применение композиции по любому из пп.1-9 для усиления роста растения.

12. Применение по п. 11, в котором композиция нанесена на обычные или трансгенные растения или их семена.

13. Способ обработки растения, части растений или локуса, окружающего растение, для усиления роста растения, включающий стадию одновременного или последовательного использования композиции по п. 1 на растении, части растений или локусе роста растения.

14. Композиция по п. 1, где слитый белок включает SEQ ID NO: 107; нацеливающая последовательность включает аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1; и клетки Bacillus имеют происхождение из Bacillus thuringiensis BT013A.

15. Композиция по п. 1, где слитый белок включает SEQ ID NO: 108; нацеливающая последовательность включает аминокислоты 20-35 из SEQ ID NO: 1; и клетки Bacillus имеют происхождение из Bacillus thuringiensis BT013A.

16. Способ обработки растения, части растений, или локуса, окружающего растение, для способствования жизнеспособности растения, включающий стадию одновременного или последовательного использования композиции по п. 1 на растении, части растений или локусе роста растения.

17. Применение композиции по любому из пп. 1-9 для способствования жизнеспособности растения.

Images