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TW201819417A - 結合至凝血因子ix及凝血因子x之雙特異性抗體 - Google Patents

結合至凝血因子ix及凝血因子x之雙特異性抗體 Download PDF

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TW201819417A
TW201819417A TW106140758A TW106140758A TW201819417A TW 201819417 A TW201819417 A TW 201819417A TW 106140758 A TW106140758 A TW 106140758A TW 106140758 A TW106140758 A TW 106140758A TW 201819417 A TW201819417 A TW 201819417A
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TW
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antibody
antigen
seq
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cdr2
Prior art date
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TW106140758A
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English (en)
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妮娜 萊克莎
布萊德利 R. 皮爾斯
羅伯特 T. 彼得斯
約翰 庫爾曼
瑪莉亞 艾爾曼
艾利森 古德曼
Original Assignee
美商拜歐維拉提夫治療股份有限公司
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Abstract

本發明提供選擇性結合至凝血因子之特定形式的抗體，詳言之，特異性結合至活化因子IX (FIXa)之抗體，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分在FIXa及因子IX酶原(FIXz)存在下優先結合至FIXa；及特異性結合至因子X酶原(FXz)之抗體，其中該抗FXz抗體或其抗原結合部分在FXz及活化因子X (FXa)存在下優先結合至FXz。亦提供包含例如抗FIXa抗體或其抗原結合部分及/或抗FXz抗體或其抗原結合部分之雙特異性分子(例如抗體)。本發明亦提供編碼所揭示之抗體及雙特異性分子之組成物、載體、細胞、醫藥組成物及診斷組成物、套組、製造方法、使用方法以及免疫偶聯物。

Description

結合至凝血因子IX及凝血因子X之雙特異性抗體
本申請案特別關於優先結合至活化凝血因子IX或凝血因子X酶原之抗體，以及包含模擬活化因子VIII輔因子之兩種特異性的雙特異性分子。
血友病A係由因子VIII (FVIII)基因突變引起的嚴重X染色體連鎖隱性病症。FVIII參與固有凝血路徑，且FVIII缺乏導致血液凝固不良，或完全不凝固。FVIII缺乏症，又稱為血友病A，係最常見的出血性病症之一，且約10,000位男性中有一位患病(Stonebraker等人(2012) Haemophilia 18(3):e91-4)。血友病A根據因子FVIII血漿含量而具有三個嚴重度等級：1%或更低(「重度」)、2至5%(「中度」)及6至30%(「輕度」)(White等人(2001) Thromb. Haemost. 85:560)。在該病症之重度形式中，第一次出血典型地在5至6個月齡時發生，而在中度形式中，第一次出血延遲直到約1至2歲。出血可自發地發生，或在微小外傷之後發生。在所有血友病A患者中有約一半係歸類為患有該疾病之重度形式。該等患者在兒童期早期開始經歷嚴重出血，且在此後生命中經歷自發或過量出血的頻繁發作。出血通常在關節和肌肉中發生，若無適當治療，則反復出血可導致不可逆出血性關節病變(Manco-Johnson等人(2007) N. Engl. J. Med. 357(6):535-44)。
血友病A治療之主要目標係維持FVIII血漿含量＞ 1%，以降低出血風險。為達成此目的，常常靜脈內投予重組或血漿源性FVIII作為預防療法。然而，此種血友病A當前標準治療很難，具有若干缺點，且對患者及其家庭帶來相當大的生理及精神負擔。
FVIII治療之最常見阻礙係產生針對FVIII之同種抗體，充當FVIII抑制劑。有多達30%的重度患者產生此類同種抗體，且一旦產生，使用FVIII治療正在發生之出血的有效性即受到限制(Kempton及White (2009) Blood 113(1):11-7)。在此類情況下，使用替代性旁路作用藥劑來控制出血。然而，此等藥劑典型地具有較短半衰期且並不總是有效。此外，由於血漿半衰期較短(在成人體內平均約12小時，且在兒童體內甚至更短)，故需要頻繁投予FVIII。此類方案可能很難實現，特別是在幼兒中。由於可用治療伴隨併發症及副作用，故並無最適宜且有效治療血友病的單藥治療。因此，仍亟需可解決用FVIII治療血友病A之缺點的新穎且有效之治療。
本發明提供一種特異性結合至活化因子IX (FIXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FIXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分在FIXa及因子IX酶原(FIXz)存在下優先結合至FIXa。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。本發明亦提供一種經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。在一些態樣中，如藉由生物膜層干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)檢定所測定，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約8 nM或更低、約6 nM或更低、約4 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低之KD 結合至FIXa。在一些態樣中，FIXa係游離FIXa、呈因子X活化酶(tenase)複合物形式之FIXa或共價連接至EGR-CMK之FIXa (FIXa-SM)。在一些態樣中，FIXz包含不可活化因子IX (FIXn)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A、圖3B及圖3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A、圖3B及圖3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，此類參考抗體係選自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433及其任何組合。在一些態樣中，相較於游離FIXa或FIXz，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分優先結合至FIXa-SM，及/或結合至FIXa-SM之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至游離FIXa或FIXz之結合親和力。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，此類參考抗體係選自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-460及其任何組合。在一些態樣中，相較於FIXa-SM或FIXz，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分優先結合至游離FIXa，及/或其結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa-SM或FIXz之結合親和力。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，相較於FIXz，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分優先結合至游離FIXa或FIXa-SM，及/或其結合至游離FIXa或FIXa-SM之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，此類參考抗體係選自BIIB-9-882、BIIB-9-433及其任何組合。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARDX1 X2 X3 X4 X5 X6 YYX7 MDV (SEQ ID NO: 753)，其中X1 係V或G，X2 係G或V，X3 係G或R，X4 係Y或V，X5 係A或S，X6 係G或D，X7 係G或不存在。在一些態樣中，該CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 905，BIIB-9-484、1335、1336)、ARDISTDGESSLYYYMDV (SEQ ID NO: 901，BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV (SEQ ID NO: 1186，BIIB-9-882)或ARDGPRVSDYY MDV (SEQ ID NO: 912，BIIB-9-619)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
本發明亦提供一種特異性結合至FIXa的經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖3A、圖3B及圖3C之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 815、860及905之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、995及1040之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-484)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 854及SEQ ID NO: 899之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 944、SEQ ID NO: 989及SEQ ID NO: 1034之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-440)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1102、SEQ ID NO: 1144及SEQ ID NO: 1186之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1228、SEQ ID NO: 1270及SEQ ID NO: 1312之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-882)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 811、SEQ ID NO: 856及SEQ ID NO: 901之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 946、SEQ ID NO: 991及SEQ ID NO: 1036之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-460)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1108、SEQ ID NO: 1150及SEQ ID NO: 1192之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1234、SEQ ID NO: 1276及SEQ ID NO: 1318之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-433)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 822、SEQ ID NO: 867及SEQ ID NO: 912之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、SEQ ID NO: 1002及SEQ ID NO: 1047之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-619)。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 843、SEQ ID NO: 888及SEQ ID NO: 933之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；或(ii)該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 844、SEQ ID NO: 889及SEQ ID NO: 934之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3 (BIIB-9-1335及BIIB-9-1336)。該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.7、VH1-46.9、VH1-69.9、VH3-07.0、VH3-21.0、VH3-21.2、VH3-23.0、VH3-23.1、VH4-31.0、VH4-34.0、VH4-39.0、VH4-39.2、VH4-39.3、VH4-39.5、VH4-39.6、VH4-39.8、VH4-59.6、VH4-0B.4或VH4-0B.6。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05.0、VK1-05.6、VK1-05.9、VK1-05.21、VK1-12.0、VK1-12.3、VK1-33.0、VK1-33.1、VK1-33.2、VK1-33.8、VK1-33.10、VK1-39.0、VK1-39.6、VK2-28.0、VK2-28.1、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.10、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.6、VK3-15.8、VK3-15.11、VK3-15.20、VK3-15.26、VK3-20.0、VK3-20.4、VK3-20.5、VK3-20.8或VK4-01.0。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中(a1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 31及221 (BIIB-9-484)；(a2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 19及209 (BIIB-9-440)；(a3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 115及301 (BIIB-9-882)；(a4) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 23及213 (BIIB-9-460)；(a5) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 127及313 (BIIB-9-433)；(a6) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 45及235 (BIIB-9-619)；(a7) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 185及371 (BIIB-9-578)；(a8) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 87及221 (BIIB-9-1335)；或(a9) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 89及221 (BIIB-9-1336)。
本發明亦提供一種特異性結合至FIXz的經分離之抗體，或其抗原結合部分(「抗FIXz抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FIXz抗體或其抗原結合部分在游離FIXa或FIXa-SM存在下優先結合至FIXz，及/或該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力高於該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至游離FIXa或FIXa-SM之結合親和力。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，此類參考抗體係BIIB-9-578。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3D中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。在一些態樣中，該CDR3包含ARDKYQDYSFDI (SEQ ID NO: 1355，BIIB-9-578)。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3D中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3D中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3D中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3D中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3D中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。在一些態樣中，該抗FIX抗體係選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體組成之群。在一些態樣中，該抗FIX抗體係IgG4抗體。在一些態樣中，該抗FIX抗體包含無效應物IgG4 Fc。在一些態樣中，該抗FIX抗體或其抗原結合部分包含重鏈恆定區。在一些態樣中，該抗FIX抗體係人類抗體、經工程改造之抗體或人類化抗體。在一些態樣中，該抗FIX抗原結合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。
本發明亦提供一種雙特異性分子，其包含與具有第二結合特異性之分子連接之本文所揭示之抗FIX抗體或其抗原結合部分。亦提供一種核酸，其編碼本文所揭示之抗FIX抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區，或包含本文所揭示之抗FIX抗體或其抗原結合部分之雙特異性分子。亦提供一種表現載體，其包含本文所揭示之編碼核酸分子。亦提供一種用本文所揭示之表現載體轉型之細胞。本發明亦提供一種免疫偶聯物，其包含與藥劑連接之本文所揭示之任何抗體或其抗原結合部分或本文所揭示之雙特異性分子。本發明亦提供一種組成物，其包含(i)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分、本文所揭示之雙特異性分子，或本文所揭示之免疫偶聯物，及(ii)載劑。亦提供一種套組，其包含(i)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分、本文所揭示之雙特異性分子，或本文所揭示之免疫偶聯物，及(ii)使用說明書。
本發明亦提供一種製備抗FIX抗體或其抗原結合部分之方法，其包括在細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離出該抗體或其抗原結合部分。亦提供一種量測有需要之受試者體內活化FIX之含量的方法，其包括使本文所揭示之抗FIXa抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與該樣品中之FIXa的結合。在一些態樣中，該樣品係血液或血清。
本發明提供一種特異性結合至因子X酶原(FXz)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXz抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXz抗體或其抗原結合部分在FXz及活化因子X (FXa)存在下優先結合至FXz。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。亦提供一種經分離之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。在一些態樣中，如藉由BLI所測定，該抗FXz抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約9 nM或更低、約8 nM或更低、約7 nM或更低、約6 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約3 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低之KD 結合至FXz。在一些態樣中，該FXa係游離FXa或共價連接至EGR-CMK之FXa (FIXa-SM)。在一些態樣中，FXz包含不可活化因子X (FXn)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由以下組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932及其任何組合。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 FDX8 (SEQ ID NO: 766)，其中X1 係G或L，X2 係R或G，X3 係F或Y，X4 係P或G，X5 係R或A，X6 係G或S，X7 係R或A，且X8 係Y或I。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARGRFRPRGRFDY (SEQ ID NO: 1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI (SEQ ID NO: 1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP (SEQ ID NO: 1573，BIIB-12-915)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
本發明亦提供一種特異性結合至FXz的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖12A及圖12B之VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1393、1483或1573之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、1753或1843之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-915)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1395、1485或1575之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、1755或1845之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-917)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1409、1499或1589之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、1769或1859之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-932)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553及555。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741及743。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些態樣中，該抗FX抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中(b1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 423及611 (BIIB-12-915)；(b2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 427及615 (BIIB-12-917)或(b3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 455及643 (BIIB-12-932)。
本發明亦提供一種特異性結合至活化因子X (FXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXa抗體或其抗原結合部分在FXz及FXa存在下優先結合至FXa，及/或結合至FXa之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與選自由BIIB-12-925組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12C中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含AKGPRYYWYSWYFDL (SEQ ID NO: 1919，BIIB-12-925)。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12C中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12C中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12C中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12C中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12C中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
本發明亦提供一種特異性結合至FXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖12C之VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1911、1915或1919之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、1927或1931之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-925)。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH及VL分別包含SEQ ID NO: 559及747 (BIIB-12-925)。在一些態樣中，該抗FX抗體或其抗原結合部分係選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體組成之群。在一些態樣中，該抗FX抗體或其抗原結合部分係IgG4抗體。在一些態樣中，該抗FX抗體或其抗原結合部分包含無效應物IgG4 Fc。在一些態樣中，該抗FX抗體或其抗原結合部分包含重鏈恆定區。在一些態樣中，該抗FX抗體係人類抗體、經工程改造之抗體或人類化抗體。在一些態樣中，其抗原結合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。本發明亦提供一種雙特異性分子，其包含與具有第二結合特異性之分子連接之本文所揭示之抗FX抗體。亦提供一種核酸，其編碼本文所揭示之抗FX抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區，或包含本文所揭示之抗FX抗體或其抗原結合部分之雙特異性分子。亦提供一種包含該核酸分子之表現載體。亦提供一種用該表現載體轉型之細胞。亦提供一種免疫偶聯物，其包含與藥劑連接之該抗體或其抗原結合部分，或該雙特異性分子。亦提供一種組成物，其包含(i)該抗體或其抗原結合部分，或該雙特異性分子，或該免疫偶聯物，及(ii)載劑。亦提供一種套組，其包含(i)該抗體或其抗原結合部分，或該雙特異性分子，或該免疫偶聯物，及(ii)使用說明書。亦提供一種製備抗FX抗體或其抗原結合部分之方法，其包括在細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離出該抗體或其抗原結合部分。
本發明亦提供一種量測有需要之受試者體內之酶原FX (FXz)的方法，其包括使本文所揭示之抗FX抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該抗FX抗體或其抗原結合部分與該樣品中FXz之結合。在一些態樣中，該樣品係來自該受試者之血液或血清。本發明亦提供一種雙特異性分子，其包含(i)本文所揭示之抗FIX抗體或其抗原結合部分，及(ii)本文所揭示之抗FX抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A、圖3B、圖3C及圖3D中之抗FIX抗體組成之群的抗FIX抗體之VH及VL，以及選自由圖12A、圖12B及圖12C中之抗FX抗體組成之群的抗FX抗體之VH及VL。在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A、圖3B、圖3C及圖3D中之抗FIX抗體組成之群的抗FIX抗體之VH及VL，以及選自由圖12A、圖12B及圖12C中之抗FX抗體組成之群的抗FX抗體之VH及VL。在本文所揭示之雙特異性抗體的一些態樣中，(i)抗FIX抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3係選自由圖16A、圖16B、圖16C及圖16D中之抗FIX (BIIB-9)抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3組成之群；及(ii)抗FX抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3係選自由圖16A、圖16B、圖16C及圖16D中之抗FX (BIIB-12)抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3組成之群。在本文所揭示之雙特異性抗體的一些態樣中，(a)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括：(a1)分別包含SEQ ID NO: 815、860或905之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、995或1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-484)；(a2)分別包含SEQ ID NO: 822、867及912之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、1002及1047之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-619)；(a3)分別包含SEQ ID NO: 1347、1351及1355之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1359、1363及1367之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-578)；(a4)分別包含SEQ ID NO: 843、888及933之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 978、1023及1068之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-1335)；或(a5)分別包含SEQ ID NO: 844、889及934之VH CDR1、CDR2及CDR3序列；及/或分別包含SEQ ID NO: 979、1024及1069之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-1336)；且(b)抗FX抗體或其抗原結合部分包括：(b1)分別包含SEQ ID NO: 1393、1483及1573之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、1753及1843之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-915)；(b2)分別包含SEQ ID NO: 1395、1485及1575之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、1755及1845之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-917)；(b3)分別包含SEQ ID NO: 1911、1915及1919之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、1927及1931之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-925)；(b4)分別包含SEQ ID NO: 1409、1499及1589之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、1769及1859之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-932)；或(b5)分別包含SEQ ID NO: 1433、1523及1613之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1703、1793及1883之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-1306)。在本文所揭示之雙特異性抗體的一些態樣中，(a)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括：(a1)分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)；(a2)分別包含SEQ ID NO: 45及235之VH及VL (BIIB-9-619)；(a3)分別包含SEQ ID NO: 185及371之VH及VL (BIIB-9-578)；(a4)分別包含SEQ ID NO: 87及221之VH及VL (BIIB-9-1335)；或(a5)分別包含SEQ ID NO: 89及221之VH及VL (BIIB-9-1336)；且(b)抗FX抗體或其抗原結合部分包括：(b1)分別包含SEQ ID NO: 423及611之VH及VL (BIIB-12-915)；(b2)分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL (BIIB-12-917)；(b3)分別包含SEQ ID NO: 559及747之VH及VL (BIIB-12-925)；(b4)分別包含SEQ ID NO: 455及643之VH及VL (BIIB-12-932)；或(b5)分別包含SEQ ID NO: 503及691之VH及VL (BIIB-12-1306)。在本文所揭示之雙特異性抗體的一些態樣中，(i)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611之VH及VL (BIIB-12-915)；或(ii)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL (BIIB-12-917)；或(iii)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747之VH及VL (BIIB-12-925)；或(iv)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 455及643之VH及VL (BIIB-12-932)；或(v)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371之VH及VL (BIIB-9-578)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611之VH及VL (BIIB-12-915)；或(vi)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371之VH及VL (BIIB-9-578)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL (BIIB-12-917)；或(vii)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235之VH及VL (BIIB-9-619)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL (BIIB-12-917)；或(viii)抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235之VH及VL (BIIB-9-619)；且抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747之VH及VL (BIIB-12-925)。在一些態樣中，該雙特異性分子在至少一種活化因子VIII (FVIIIa)活性檢定中在功能上模擬FVIIIa輔因子。在一些態樣中，該FVIIIa活性檢定係選自發色FXa產生檢定、一期凝血檢定或其組合。在一些態樣中，該FVIIIa活性達到在相同檢定中FVIII另外達成之活性的至少10%、20%、30%、35%、40%、45% 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。在一些態樣中，該雙特異性分子能夠在活體外或活體內由凝血酶原產生凝血酶、由纖維蛋白原產生纖維蛋白，及/或產生纖維蛋白凝塊。在一些態樣中，如藉由BLI所測定，該雙特異性分子同時結合至FIXa及FX兩者。在一些態樣中，該雙特異性分子屬於IgG同型。在一些態樣中，該IgG同型屬於IgG1亞類。在一些態樣中，該IgG同型屬於IgG4亞類。在一些態樣中，該雙特異性分子具有雙特異性IgG形式且選自由表2中之抗體組成之群。在一些態樣中，該雙特異性分子具有雙特異性異二聚體形式。在一些態樣中，該雙特異性分子包含兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈。在一些態樣中，該雙特異性分子包含兩條相同輕鏈及兩條不同重鏈。在一些態樣中，該雙特異性分子能夠控制或降低患有血友病之受試者出血發作之發生率。在一些態樣中，該雙特異性分子能夠維持患有血友病之受試者之動態平衡。在一些態樣中，該雙特異性分子能夠向患有血友病之受試者提供常規預防。在一些態樣中，該受試者已產生或預期會產生針對因子VIII之中和抗體。
本發明亦提供一種免疫偶聯物，其包含與藥劑，例如治療劑連接之本文所揭示之雙特異性分子。亦提供一種組成物，其包含(i)本文所揭示之雙特異性分子或包含該雙特異性分子之免疫偶聯物，及(ii)載劑。亦提供一種套組，其包含(i)本文所揭示之雙特異性分子或包含該雙特異性分子之免疫偶聯物，及(ii)使用說明書。亦提供一種編碼本文所揭示之雙特異性分子的核酸序列。亦提供包含該核酸之載體及包含該載體之宿主細胞。在一些態樣中，該宿主細胞係原核細胞、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、CHO細胞、HEK細胞或COS細胞。亦提供一種產生本文所揭示之雙特異性分子之方法，其包括在允許表現該雙特異性分子之條件下培養本文所揭示之宿主細胞。在一些態樣中，本文所揭示的產生雙特異性分子之方法進一步包括使用增進異二聚化之條件。
本發明亦提供一種促進有需要之受試者體內FX活化的方法，其包括向該受試者投予治療有效量的本文所揭示之雙特異性分子，或本文所揭示的包含或編碼本文所揭示之雙特異性分子的免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞。
本發明亦提供一種降低有需要之受試者出血發作之頻率或程度的方法，其包括向該受試者投予有效量的本文所揭示之雙特異性分子，或本文所揭示的包含或編碼本文所揭示之雙特異性分子的免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞。在一些態樣中，該受試者已經產生或有傾向產生針對因子VIII(「FVIII」)之抑制劑。在一些態樣中，該針對FVIII之抑制劑係針對FVIII之中和抗體。在一些態樣中，該出血發作係由關節積血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外傷、外傷性頭痛、胃腸出血、顱內大量出血、腹內大量出血、胸內大量出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何組合引起。
本發明亦提供一種治療有需要之受試者之凝血病症的方法，其包括向該受試者投予有效量的本文所揭示之雙特異性分子，或本文所揭示的包含或編碼本文所揭示之雙特異性分子的免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞。在一些態樣中，該凝血病症係血友病A或血友病B。在一些態樣中，該受試者係人類受試者。在一些態樣中，該受試者正在經歷或曾經歷FVIII替代療法。在一些態樣中，雙特異性分子係與血友病療法組合投予。在一些態樣中，該血友病療法係FVIII替代療法。在一些態樣中，雙特異性分子、免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞係在投予血友病療法之前、期間或之後投予。在一些態樣中，雙特異性分子、免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞係靜脈內或皮下投予。在一些態樣中，投予雙特異性分子、免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞使突破性出血發作、自發性出血發作或急性出血之頻率降低。在一些態樣中，投予雙特異性分子、免疫偶聯物、組成物、核酸、載體或宿主細胞使年平均出血率降低5%、10%、20%、30%或50%。
本發明亦提供一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與BIIB-9-1336結合至相同抗原決定基。亦提供一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至與BIIB-9-1336抗原決定基重疊的抗原決定基。
本發明亦提供一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至包含至少一個位於FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號位置(i) 91與101、(ii) 125與128、(iii) 165與179或(iv) 232與241之間之胺基酸的抗原決定基區。亦提供一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241中之至少一個的抗原決定基。在一些態樣中，該抗原決定基包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N93、R165、N178及R233。在其他態樣中，該抗原決定基包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241。在一些態樣中，該抗原決定基不包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205中的至少一個。在一些態樣中，該抗原決定基不包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中至少一個胺基酸殘基。在一些態樣中，該FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中的胺基酸殘基係K100。在一些態樣中，該抗原決定基與FVIIIa結合至FIXa之結合位點重疊。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與FVIIIa交叉競爭結合至FIXa。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分阻斷FVIIIa與FIXa之結合。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VH CDR1包含選自由表7中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1；及/或(ii)該VH CDR2包含選自由表7中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2；及/或(iii)該VH CDR3包含選自由表7中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3；及/或(iv)該VL CDR1包含選自由表7中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1；及/或(v)該VL CDR2包含選自由表7中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2；及/或(vi)該VL CDR3包含選自由表7中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDX1 GGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 2196)，其中X1 係L或V。在一些態樣中，(i)該VH CDR1包含胺基酸序列FTFX1 SX2 X3 MX4 (SEQ ID NO: 2194)，其中X1 係S、G或E，X2 係Y或F，X3 係S、E、G或D，且X4 係N、V、A或T；及/或(ii)該VH CDR2包含胺基酸序列X5 ISX6 X7 X8 X9 X10 IYYADSVKG (SEQ ID NO: 2195)，其中X5 係S、A、Y或G，X6 係S或A，X7 係S、A或G，X8 係S、G或D，X9 係S、T或G，且X10 係Y或T。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR3包含胺基酸序列QQYANFPYT (SEQ ID NO: 2168)。在一些態樣中，(i)該VL CDR1包含胺基酸序列QASQDIANYLN (SEQ ID NO: 2116)；及/或(ii)該VL CDR2包含胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 2142)。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：(i) VH CDR1、CDR2及CDR3，其中VH CDR1係選自SEQ ID NO: 2038至2047，VH CDR2係選自SEQ ID NO: 2064至2073且VH CDR3係選自SEQ ID NO: 2090至2099；及/或(ii) VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1係選自SEQ ID NO: 2116至2125，VL CDR2係選自SEQ ID NO: 2142至2151且VL CDR3係選自SEQ ID NO: 2168至2177。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列X1 RDVX2 GYAGX3 YGMDV (SEQ ID NO: 2198)，其中X1 係A或V，X2 係G或S，且X3 係Y或F。在一些態樣中，(i)該VH CDR1包含胺基酸序列FTFGSYDMN (SEQ ID NO: 2048)；及/或(ii)該VH CDR2包含胺基酸序列SISX1 X2 X3 SYIX4 YAX5 SVKG (SEQ ID NO: 2197)，其中X1 係S或D，X2 係G或S，X3 係E或A，X4 係Y或A，且X5 係E或D。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR3包含胺基酸序列X1 QYAX2 FPYT (SEQ ID NO: 2201)，其中X1 係Q或S，且X2 係N或R。在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VL CDR1包含胺基酸序列X1 AX2 X3 X4 IX5 X6 YLN (SEQ ID NO: 2199)，其中X1 係Q、G或E，X2 係S或N，X3 係Q或E，X4 係D或Y，X5 係A或S，X6 係N或D；及/或(ii)該VL CDR2包含胺基酸序列DAX7 NLX8 X9 (SEQ ID NO: 2200)，其中X7 係S或A，X8 係E、H或Q，且X9 係T或Y。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：(i) VH CDR1、CDR2及CDR3，其中VH CDR1係選自SEQ ID NO: 2048至2052，VH CDR2係選自SEQ ID NO: 2074至2078且VH CDR3係選自SEQ ID NO: 2100至2104；及/或(ii) VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1係選自SEQ ID NO: 2126至2130，VL CDR2係選自SEQ ID NO: 2152至2156且VL CDR3係選自SEQ ID NO: 2178至2182。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDGPX1 X2 X3 DYYMDV (SEQ ID NO: 2204)，其中X1 係R或Q，X2 係V、D、L或E，且X3 係S或V。在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VH CDR1包含胺基酸序列YTFX1 X2 YX3 MH (SEQ ID NO: 2202)，其中X1 係T或H，X2 係S、G或H，且X3 係Y或P；及/或(ii)該VH CDR2包含胺基酸序列X4 INPSX5 GX6 TX7 YAQKFQG (SEQ ID NO: 2203)，其中X4 係I或S，X5 係G或R，X6 係S或R，且X7 係S或E。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR3包含胺基酸序列QQRDNWPFT (SEQ ID NO: 2116)。在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VL CDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 2116)；及/或(ii)該VL CDR2包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 2116)。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：(i) VH CDR1、CDR2及CDR3，其中VH CDR1係選自SEQ ID NO: 2053至2057，VH CDR2係選自SEQ ID NO: 2079至2083且VH CDR3係選自SEQ ID NO: 2105至2109；及/或(ii) VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1係選自SEQ ID NO: 2131至2135，VL CDR2係選自SEQ ID NO: 2157至2161且VL CDR3係選自SEQ ID NO: 2183至2187。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDKYQDYSX1 DI (SEQ ID NO: 2207)，其中X1 係F或V。在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VH CDR1包含胺基酸序列GSIX1 SX2 X3 YX4 WX5 (SEQ ID NO: 2205)，其中X1 係S或A，X2 係S、T、G或V，X3 係S或A，X4 係Y或A，且X5 係G、V、N或S；及/或(ii)該VH CDR2包含胺基酸序列X6 IX7 X8 X9 GX10 TX11 YNPSLKS (SEQ ID NO: 2206)，其中X6 係S或Y，X7 係S、Y、R、T或Q，X8 係Y、G、P或A，X9 係S或Q，X10 係S或K，且X11 係Y或Q。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR3包含胺基酸序列QQANFLPFT (SEQ ID NO: 2188)。在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中(i)該VL CDR1包含胺基酸序列RASQGIDSWLA (SEQ ID NO: 2136)；及/或(ii)該VL CDR2包含胺基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 2162)。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：(i) VH CDR1、CDR2及CDR3，其中VH CDR1係選自SEQ ID NO: 2058至2063，VH CDR2係選自SEQ ID NO: 2084至2089且VH CDR3係選自SEQ ID NO: 2110至2115；及/或(ii) VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1係選自SEQ ID NO: 2136至2141，VL CDR2係選自SEQ ID NO: 2162至2167且VL CDR3係選自SEQ ID NO: 2188至2193。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中(i)該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031及2035；及/或(ii)該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033及2037。
在一些態樣中，本文所揭示的特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中(a1)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1935及1937 (BIIB-9-3595)；(a2)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1939及1941 (BIIB-9-3601)；(a3)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1943及1945 (BIIB-9-3604)；(a4)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1947及1949 (BIIB-9-3617)；(a5)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1951及1953 (BIIB-9-3618)；(a6)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1955及1957 (BIIB-9-3621)；(a7)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1959及1961 (BIIB-9-3647)；(a8)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1963及1965 (BIIB-9-3649)；(a9)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1967及1969 (BIIB-9-3650)；(a10)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1971及1973 (BIIB-9-3654)；(a11)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1975及1977 (BIIB-9-3753)；(a12)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1979及1981 (BIIB-9-3754)；(a13)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1983及1985 (BIIB-9-3756)；(a14)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1987及1989 (BIIB-9-3764)；(a15)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1991及1993 (BIIB-9-3766)；(a16)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1995及1997 (BIIB-9-3707)；(a17)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1999及2001 (BIIB-9-3709)；(a18)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2003及2005 (BIIB-9-3720)；(a19)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2007及2009 (BIIB-9-3727)；(a20)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2011及2013 (BIIB-9-3745)；(a21)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2015及2017 (BIIB-9-3780)；(a22)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2019及2021 (BIIB-9-3675)；(a23)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2023及2025 (BIIB-9-3681)；(a24)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2027及2029 (BIIB-9-3684)；(a25)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2031及2033 (BIIB-9-3698)；或(a26)該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2035及2037 (BIIB-9-3704)。 實施例
實施例1. 一種特異性結合至活化因子IX (FIXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FIXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分在FIXa及因子IX酶原(FIXz)存在下優先結合至FIXa。
實施例2. 如實施例1之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。
實施例3. 一種經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。
實施例4. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，如藉由生物膜層干涉(BLI)檢定所測定，其以約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低之KD 結合至FIXa。
實施例5. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該FIXa係游離FIXa、呈因子X活化酶複合物形式之FIXa或共價連接至EGR-CMK之FIXa (FIXa-SM)。
實施例6. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該FIXz包含不可活化因子IX (FIXn)。
實施例7. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3A、圖3B及圖3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例8. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3A、圖3B及圖3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例9. 如實施例7或8之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體係選自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433及其任何組合。
實施例10. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於游離FIXa或FIXz，其優先結合至FIXa-SM，及/或其結合至FIXa-SM之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至游離FIXa或FIXz之結合親和力。
實施例11. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例12. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例13. 如實施例11或12之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體係選自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-460及其任何組合。
實施例14. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於FIXa-SM或FIXz，其優先結合至游離FIXa，及/或其結合至游離FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa-SM或FIXz之結合親和力。
實施例15. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例16. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例17. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於FIXz，其優先結合至游離FIXa或FIXa-SM，及/或其結合至游離FIXa或FIXa-SM之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。
實施例18. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例19. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例20. 如實施例18或19之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體係選自BIIB-9-882、BIIB-9-433及其任何組合。
實施例21. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。
實施例22. 如實施例1至21中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARDX1 X2 X3 X4 X5 X6 YYX7 MDV (SEQ ID NO: 753)，其中X1 係V或G，X2 係G或V，X3 係G或R，X4 係Y或V，X5 係A或S，X6 係G或D，X7 係G或不存在。
實施例23. 如實施例22之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 905，BIIB-9-484、1335、1336)、ARDISTDGESSLYYYMDV (SEQ ID NO: 901，BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV (SEQ ID NO: 1186，BIIB-9-882)或ARDGPRVSDYY MDV (SEQ ID NO: 912，BIIB-9-619)。
實施例24. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。
實施例25. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。
實施例26. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。
實施例27. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。
實施例28. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3A、圖3B及圖3C中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
實施例29. 一種特異性結合至FIXa的經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖3A、圖3B及圖3C之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。
實施例30. 如實施例29之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 815、860及905之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、995及1040之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-484)。
實施例31. 如實施例29之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中 (a1) 該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 854及SEQ ID NO: 899之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 944、SEQ ID NO: 989及SEQ ID NO: 1034之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-440)； (a2) 該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1102、SEQ ID NO: 1144及SEQ ID NO: 1186之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1228、SEQ ID NO: 1270及SEQ ID NO: 1312之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-882)； (a3) 該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 811、SEQ ID NO: 856及SEQ ID NO: 901之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 946、SEQ ID NO: 991及SEQ ID NO: 1036之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-460)；或 (a4) 該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1108、SEQ ID NO: 1150及SEQ ID NO: 1192之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1234、SEQ ID NO: 1276及SEQ ID NO: 1318之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-433)。
實施例32. 如實施例29之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 822、SEQ ID NO: 867及SEQ ID NO: 912之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、SEQ ID NO: 1002及SEQ ID NO: 1047之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-619)。
實施例33. 如實施例29之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中(i)該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 843、SEQ ID NO: 888及SEQ ID NO: 933之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；或(ii)該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 844、SEQ ID NO: 889及SEQ ID NO: 934之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3 (BIIB-9-1335及BIIB-9-1336)。
實施例34. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181。
實施例35. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367。
實施例36. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.7、VH1-46.9、VH1-69.9、VH3-07.0、VH3-21.0、VH3-21.2、VH3-23.0、VH3-23.1、VH4-31.0、VH4-34.0、VH4-39.0、VH4-39.2、VH4-39.3、VH4-39.5、VH4-39.6、VH4-39.8、VH4-59.6、VH4-0B.4或VH4-0B.6。
實施例37. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05.0、VK1-05.6、VK1-05.9、VK1-05.21、VK1-12.0、VK1-12.3、VK1-33.0、VK1-33.1、VK1-33.2、VK1-33.8、VK1-33.10、VK1-39.0、VK1-39.6、VK2-28.0、VK2-28.1、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.10、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.6、VK3-15.8、VK3-15.11、VK3-15.20、VK3-15.26、VK3-20.0、VK3-20.4、VK3-20.5、VK3-20.8或VK4-01.0。
實施例38. 如前述實施例中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中 (a1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 31及221 (BIIB-9-484)； (a2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 19及209 (BIIB-9-440)； (a3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 115及301 (BIIB-9-882)； (a4) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 23及213 (BIIB-9-460)； (a5) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 127及313 (BIIB-9-433)； (a6) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 45及235 (BIIB-9-619)； (a7) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 185及371 (BIIB-9-578)； (a8) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 87及221 (BIIB-9-1335)；或 (a9) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 89及221 (BIIB-9-1336)。
實施例39. 一種特異性結合至FIXz的經分離之抗體，或其抗原結合部分(「抗FIXz抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FIXz抗體或其抗原結合部分在游離FIXa或FIXa-SM存在下優先結合至FIXz，及/或該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力高於該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至游離FIXa或FIXa-SM之結合親和力。
實施例40. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例41. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例42. 如實施例40或41之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體係BIIB-9-578。
實施例43. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3D中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。
實施例44. 如實施例43之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其中該CDR3包含ARDKYQDYSFDI (SEQ ID NO: 1355，BIIB-9-578)。
實施例45. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3D中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。
實施例46. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3D中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。
實施例47. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖3D中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。
實施例48. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖3D中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。
實施例49. 如前述實施例中任一個之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖3D中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
實施例50. 如前述實施例及實施例169至204中任一個之抗FIX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體。
實施例51. 如實施例50之抗FIX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係IgG4抗體。
實施例52. 如實施例50之抗FIX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含無效應物IgG4 Fc。
實施例53. 如前述實施例及實施例169至204中任一個之抗FIX抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈恆定區。
實施例54. 如前述實施例及實施例169至204中任一個之抗FIX抗體，其中該抗體係人類抗體、經工程改造之抗體或人類化抗體。
實施例55. 如前述實施例及實施例169至204中任一個之抗FIX抗原結合部分，其中該其抗原結合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。
實施例56. 一種雙特異性分子，其包含與具有第二結合特異性之分子連接之如前述實施例及實施例169至204中任一個之抗FIX抗體或其抗原結合部分。
實施例57. 一種核酸，其編碼如實施例1至55及169至204中任一個之抗FIX抗體或其抗原結合部分的重鏈及/或輕鏈可變區，或如實施例56之雙特異性分子。
實施例58. 一種表現載體，其包含如實施例57之核酸分子。
實施例59. 一種用如實施例58之表現載體轉型的細胞。
實施例60. 一種免疫偶聯物，其包含與藥劑連接之如實施例1至55及169至204中任一個之抗體或其抗原結合部分或如實施例56之雙特異性分子。
實施例61. 一種組成物，其包含如實施例1至55及169至204中任一個之抗體或其抗原結合部分、如實施例56之雙特異性分子或如實施例60之免疫偶聯物，及載劑。
實施例62. 一種套組，其包含如實施例1至55及169至204中任一個之抗體或其抗原結合部分、如實施例56之雙特異性分子或如實施例60之免疫偶聯物，及使用說明書。
實施例63. 一種製備抗FIX抗體或其抗原結合部分之方法，包括在如實施例59之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離出該抗體或其抗原結合部分。
實施例64. 一種量測有需要之受試者體內活化FIX之含量的方法，包括使如實施例1至55及169至204中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該樣品中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與FIXa之結合。
實施例65. 如實施例64之方法，其中該樣品係血液或血清。
實施例66. 一種特異性結合至因子X酶原(FXz)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXz抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXz抗體或其抗原結合部分在FXz及活化因子X (FXa)存在下優先結合至FXz。
實施例67. 如實施例66之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。
實施例68. 一種經分離之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。
實施例69. 如實施例66至68中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，如藉由BLI所量測，其以約100 nM或更低、約90nM或更低、約80 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低之KD結合至FXz。
實施例70. 如實施例66至69中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其中該FXa係游離FXa或共價連接至EGR-CMK之FXa (FIXa-SM)。
實施例71. 如實施例66至70中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其中該FXz包含不可活化因子IX (FXn)。
實施例72. 如實施例66至71中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例73. 如實施例66至72中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例74. 如實施例73之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由以下組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932及其任何組合。
實施例75. 如實施例66至74中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。
實施例76. 如實施例66至75中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 FDX8 (SEQ ID NO: 766)，其中X1 係G或L，X2 係R或G，X3 係F或Y，X4 係P或G，X5 係R或A，X6 係G或S，X7 係R或A，且X8 係Y或I。
實施例77. 如實施例66至76中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含ARGRFRPRGRFDY (SEQ ID NO: 1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI (SEQ ID NO: 1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP (SEQ ID NO: 1573，BIIB-12-915)。
實施例78. 如實施例66至77中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。
實施例79. 如實施例66至78中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12A及圖12B中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。
實施例80. 如實施例66至79中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。
實施例81. 如實施例66至80中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。
實施例82. 如實施例66至81中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12A及圖12B中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
實施例83. 一種特異性結合至FXz的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖12A及圖12B之VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。
實施例84. 如實施例83之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1393、1483或1573之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、1753或1843之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-915)。
實施例85. 如實施例83之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1395、1485或1575之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、1755或1845之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-917)。
實施例86. 如實施例83之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1409、1499或1589之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、1769或1859之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-932)。
實施例87. 如實施例66至86中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553及555。
實施例88. 如實施例66至87中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741及743。
實施例89. 如實施例66至88中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1。
實施例90. 如實施例66至89中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。
實施例91. 如實施例66至90中任一個之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中 (b1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 423及611 (BIIB-12-915)； (b2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 427及615 (BIIB-12-917)；或 (b3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 455及643 (BIIB-12-932)。
實施例92. 一種特異性結合至活化因子X (FXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXa抗體或其抗原結合部分在FXz及FXa存在下優先結合至FXa，及/或結合至FXa之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力。
實施例93. 如實施例92之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。
實施例94. 如實施例92或93之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例95. 如實施例94之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由BIIB-12-925組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
實施例96. 如實施例92至95中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12C中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3。
實施例97. 如實施例92至96中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含AKGPRYYWYSWYFDL (SEQ ID NO: 1919，BIIB-12-925)。
實施例98. 如實施例92至97中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12C中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1。
實施例99. 如實施例92至98中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12C中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2。
實施例100. 如實施例92至99中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR1包含選自由圖12C中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1。
實施例101. 如實施例92至100中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR2包含選自由圖12C中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2。
實施例102. 如實施例92至101中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該CDR3包含選自由圖12C中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
實施例103. 一種特異性結合至FXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3分別包含圖12C之VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3。
實施例104. 如實施例103之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括分別包含SEQ ID NO: 1911、1915或1919之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、1927或1931之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-925)。
實施例105. 如實施例92至104中任一個之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH及VL分別包含EQ ID NO:559及747 (BIIB-12-925)。
實施例106. 如實施例66至105中任一個之抗FX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體。
實施例107. 如實施例106之抗FX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係IgG4抗體。
實施例108. 如實施例106之抗FX抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含無效應物IgG4 Fc。
實施例109. 如實施例66至108中任一個之抗FX抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈恆定區。
實施例110. 如實施例66至109中任一個之抗FX抗體，其中該抗體係人類抗體、經工程改造之抗體或人類化抗體。
實施例111. 如實施例66至110中任一個之其抗FX抗原結合部分，其中該其抗原結合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。
實施例112. 一種雙特異性分子，其包含與具有第二結合特異性之分子連接之如實施例66至111中任一個之抗FX抗體。
實施例113. 一種核酸，其編碼如實施例66至111中任一個之抗體或其抗原結合部分的重鏈及/或輕鏈可變區，或如實施例112之雙特異性分子。
實施例114. 一種表現載體，其包含如實施例113之核酸分子。
實施例115. 一種用如實施例114之表現載體轉型的細胞。
實施例116. 一種免疫偶聯物，其包含與藥劑連接之如實施例66至111中任一個之抗體或其抗原結合部分，或如實施例112之雙特異性分子。
實施例117. 一種組成物，其包含如實施例66至111中任一個之抗體或其抗原結合部分，或如實施例112之雙特異性分子，或如實施例116之免疫偶聯物，及載劑。
實施例118. 一種套組，其包含如實施例66至111中任一個之抗體或其抗原結合部分，或如實施例112之雙特異性分子，或如實施例116之免疫偶聯物，及使用說明書。
實施例119. 一種製備抗FX抗體或其抗原結合部分之方法，包括在如實施例115之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離出該抗體或其抗原結合部分。
實施例120. 一種量測有需要之受試者體內之酶原FX (FXz)的方法，包括使如實施例66至111中任一個之抗FX抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該抗FX抗體或其抗原結合部分與該樣品中FXz之結合。
實施例121. 如實施例120之方法，其中該樣品係來自該受試者之血液或血清。
實施例122. 一種雙特異性分子，其包含如實施例1至55及169至204中任一個之抗FIX抗體或其抗原結合部分及(ii)如實施例66至111中任一個之抗FX抗體或其抗原結合部分。
實施例123. 如實施例122之雙特異性分子，其與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A、圖3B、圖3C及圖3D中之抗FIX抗體組成之群的抗FIX抗體之VH及VL，以及選自由圖12A、圖12B及圖12C中之抗FX抗體組成之群的抗FX抗體之VH及VL。
實施例124. 如實施例122或123之雙特異性分子，其與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A、圖3B、圖3C及圖3D中之抗FIX抗體組成之群的抗FIX抗體之VH及VL，以及選自由圖12A、圖12B及圖12C中之抗FX抗體組成之群的抗FX抗體之VH及VL。
實施例125. 如實施例122至124中任一個之雙特異性分子，其中 (i) 該抗FIX抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3係選自由圖16A、圖16B、圖16C及圖16D中之抗FIX (BIIB-9)抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3組成之群；及 (ii) 該抗FX抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3以及該VL CDR1、CDR2及CDR3係選自由圖16A、圖16B、圖16C及圖16D中之抗FX (BIIB-12)抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3組成之群。
實施例126. 如實施例122至124中任一個之雙特異性分子，其中 (a) 抗FIX抗體或其抗原結合部分包括： (a1) 分別包含SEQ ID NO: 815、860或905之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、995或1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-484)； (a2) 分別包含SEQ ID NO: 822、867及912之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、1002及1047之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-619)； (a3) 分別包含SEQ ID NO: 1347、1351及1355之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1359、1363及1367之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-578)； (a4) 分別包含SEQ ID NO: 843、888及933之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 978、1023及1068之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-1335)；或 (a5) 分別包含SEQ ID NO: 844、889及934之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 979、1024及1069之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-9-1336)；及 (b) 抗FX抗體或其抗原結合部分包含： (b1) 分別包含SEQ ID NO: 1393、1483及1573之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、1753及1843之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-915)； (b2) 分別包含SEQ ID NO: 1395、1485及1575之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、1755及1845之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-917)； (b3) 分別包含SEQ ID NO: 1911、1915及1919之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、1927及1931之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-925)； (b4) 分別包含SEQ ID NO: 1409、1499及1589之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、1769及1859之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-932)；或 (b5) 分別包含SEQ ID NO: 1433、1523及1613之VH CDR1、CDR2及CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1703、1793及1883之VL CDR1、CDR2及CDR3序列(BIIB-12-1306)。
實施例127. 如實施例122至124中任一個之雙特異性分子，其中 (a) 抗FIX抗體或其抗原結合部分包括： (a1) 分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL (BIIB-9-484)； (a2) 分別包含SEQ ID NO: 45及235之VH及VL (BIIB-9-619)； (a3) 分別包含SEQ ID NO: 185及371之VH及VL (BIIB-9-578)； (a4) 分別包含SEQ ID NO: 87及221之VH及VL (BIIB-9-1335)；或 (a5) 分別包含SEQ ID NO: 89及221之VH及VL (BIIB-9-1336)；及 (b) 抗FX抗體或其抗原結合部分包含： (b1) 分別包含SEQ ID NO: 423及611之VH及VL (BIIB-12-915)； (b2) 分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL (BIIB-12-917)； (b3) 分別包含SEQ ID NO: 559及747之VH及VL (BIIB-12-925)； (b4) 分別包含SEQ ID NO: 455及643之VH及VL (BIIB-12-932)；或 (b5) 分別包含SEQ ID NO: 503及691之VH及VL (BIIB-12-1306)。
實施例128. 如實施例122至127中任一個之雙特異性分子， (i) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611的VH及VL (BIIB-12-915)； (ii) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)； (iii) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747的VH及VL (BIIB-12-925)； (iv) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 455及643的VH及VL (BIIB-12-932)； (v) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371的VH及VL (BIIB-9-578)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611的VH及VL (BIIB-12-915)； (vi) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371的VH及VL (BIIB-9-578)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)； (vii) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235的VH及VL (BIIB-9-619)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)；或 (viii) 其中該抗FIX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235的VH及VL (BIIB-9-619)；且該抗FX抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747的VH及VL (BIIB-12-925)。
實施例129. 如實施例122至128中任一個之雙特異性分子，其在至少一種活化因子VIII (FVIIIa)活性檢定中在功能上模擬FVIIIa輔因子。
實施例130. 如實施例129之雙特異性分子，其中該FVIIIa活性檢定係選自發色FXa產生檢定、一期凝血檢定或其組合。
實施例131. 如實施例129或130之雙特異性分子，其中該FVIIIa活性達到在相同檢定中FVIII另外達成之活性的至少10%、20%、30%、35%、40%、45% 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。
實施例132. 如實施例122至131中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子能夠在活體外或活體內由凝血酶原產生凝血酶、由纖維蛋白原產生纖維蛋白，及/或產生纖維蛋白凝塊。
實施例133. 如實施例122至132中任一個之雙特異性分子，其中如藉由BLI所測定，該雙特異性分子同時結合至FIXa及FX兩者。
實施例134. 如實施例122至133中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子係屬於該IgG同型。
實施例135. 如實施例134之雙特異性分子，其中該IgG同型係屬於該IgG1亞類。
實施例136. 如實施例134之雙特異性分子，其中該IgG同型係屬於該IgG4亞類。
實施例137. 如實施例122至136中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子具有雙特異性IgG形式且選自由表2中的抗體組成之群。
實施例138. 如實施例137之雙特異性分子，其中該雙特異性分子具有雙特異性異二聚體形式。
實施例139. 如實施例122至138中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子包含兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈。
實施例140. 如實施例122至138中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子包含兩條相同輕鏈及兩條不同重鏈。
實施例141. 如實施例122至140中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子能夠控制或降低患有血友病之受試者出血發作之發生率。
實施例142. 如實施例122至140中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子能夠維持患有血友病之受試者之動態平衡。
實施例143. 如實施例122至140中任一個之雙特異性分子，其中該雙特異性分子能夠對患有血友病之受試者提供常規預防。
實施例144. 如實施例122至143中任一個之雙特異性分子，其中該受試者已經產生或預期會產生針對因子VIII之中和抗體。
實施例145. 一種免疫偶聯物，其包含與藥劑連接之如實施例122至144中任一個之雙特異性分子。
實施例146. 一種組成物，其包含如實施例122至144中任一個之雙特異性分子或如實施例145之免疫偶聯物，及載劑。
實施例147. 一種套組，其包含如實施例122至144中任一個之雙特異性分子或如實施例145之免疫偶聯物，及使用說明書。
實施例148. 一種核酸序列，編碼如實施例122至144中任一個之雙特異性分子。
實施例149. 一種載體，其包含如實施例148之核酸。
實施例150. 一種宿主細胞，其包含如實施例149之載體。
實施例151. 如實施例150之宿主細胞，其中該宿主細胞係原核細胞、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、CHO細胞、HEK細胞或COS細胞。
實施例152. 一種產生雙特異性分子之方法，包括在允許表現該雙特異性分子之條件下培養如實施例150之宿主細胞。
實施例153. 一種產生如實施例122至144中任一個之雙特異性分子之方法，進一步包括增進異二聚化之條件。
實施例154. 一種促進有需要之受試者體內FX活化之方法，包括向該受試者投予治療有效量的如實施例122至144中任一個之雙特異性分子、如實施例145之免疫偶聯物、如實施例146之組成物、如實施例148之核酸、如實施例149之載體或如實施例150之宿主細胞。
實施例155. 一種降低有需要之受試者之出血發作之頻率或程度的方法，包括向該受試者投予有效量的如實施例122至144中任一個之雙特異性分子、如實施例145之免疫偶聯物、如實施例146之組成物、如實施例148之核酸、如實施例149之載體或如實施例150之宿主細胞。
實施例156. 如實施例155之方法，其中該受試者已經產生或有傾向產生針對因子VIII(「FVIII」)之抑制劑。
實施例157. 如實施例156之方法，其中該針對FVIII之抑制劑係針對FVIII之中和抗體。
實施例158. 如實施例155至157中任一個之方法，其中該出血發作係由關節積血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外傷、外傷性頭痛、胃腸出血、顱內大量出血、腹內大量出血、胸內大量出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何組合引起。
實施例159. 一種治療有需要之受試者之凝血病症的方法，包括向該受試者投予有效量的如實施例122至144中任一個之雙特異性分子、如實施例145之免疫偶聯物、如實施例146之組成物、如實施例148之核酸、如實施例149之載體或如實施例150之宿主細胞。
實施例160. 如實施例159之方法，其中該凝血病症係血友病A或血友病B。
實施例161. 如實施例154至160中任一個之方法，其中該受試者係人類受試者。
實施例162. 如實施例154至160中任一個之方法，其中該受試者正經歷或曾經歷FVIII替代療法。
實施例163. 如實施例154至162中任一個之方法，其中該雙特異性分子係與血友病療法組合投予。
實施例164. 如實施例163之方法，其中該血友病療法係FVIII替代療法。
實施例165. 如實施例163或164之方法，其中該雙特異性分子係在投予該血友病療法之前、期間或之後投予。
實施例166. 如實施例154至165中任一個之方法，其中該雙特異性分子係經靜脈內或皮下投予。
實施例167. 如實施例154至166中任一個之方法，其中投予該雙特異性分子使突破性出血發作、自發性出血發作或急性出血的頻率降低。
實施例168. 如實施例167之方法，其中投予該雙特異性分子使年平均出血率降低5%、10%、20%、30%或50%。
實施例169. 一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與BIIB-9-1336結合至相同抗原決定基。
實施例170. 一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至與BIIB-9-1336抗原決定基重疊的抗原決定基。
實施例171. 一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至包含至少一個位於FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號位置(i) 91與101、(ii) 125與128、(iii) 165與179或(iv) 232與241之間之胺基酸的抗原決定基區。
實施例172. 一種抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241中之至少一個的抗原決定基。
實施例173. 如實施例171或172之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N93、R165、N178及R233。
實施例174. 如實施例171至173之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241。
實施例175. 如實施例171至174之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基不包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205中的至少一個。
實施例176. 如實施例171至175之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基不包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205。
實施例177. 如實施例171至176之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中至少一個胺基酸殘基。
實施例178. 如實施例177之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中之胺基酸殘基係K100。
實施例179. 如實施例169至178中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基與FVIIIa結合至FIXa之結合位點重疊。
實施例180. 如實施例169至179中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與FVIIIa交叉競爭結合至FIXa。
實施例181. 如實施例169至180中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分阻斷FVIIIa與FIXa之結合。
實施例182. 如實施例1至12中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含選自由表7中之VH CDR1組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1；及/或 (ii) 該VH CDR2包含選自由表7中之VH CDR2組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2；及/或 (iii) 該VH CDR3包含選自由表7中之VH CDR3組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3；及/或 (iv) 該VL CDR1包含選自由表7中之VL CDR1組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1；及/或 (v) 該VL CDR2包含選自由表7中之VL CDR2組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2；及/或 (vi) 該VL CDR3包含選自由表7中之VL CDR3組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
實施例183. 如實施例182之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDX1 GGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 2196)，其中X1 係L或V。
實施例184. 如實施例183之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFX1 SX2 X3 MX4 (SEQ ID NO: 2194)，其中X1 係S，G或E，X2 係Y或F，X3 係S、E、G或D，且X4 係N、V、A或T；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X5 ISX6 X7 X8 X9 X10 IYYADSVKG (SEQ ID NO: 2195)，其中X5 係S、A、Y或G，X6 係S或A，X7 係S、A或G，X8 係S、G或D，X9 係S、T或G，且X10 係Y或T。
實施例185. 如實施例182至184中任一個之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR3包含胺基酸序列QQYANFPYT (SEQ ID NO: 2168)。
實施例186. 如實施例185之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) VL CDR1包含胺基酸序列QASQDIANYLN (SEQ ID NO: 2116)；及/或 (ii) VL CDR2包含胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 2142)。
實施例187. 如實施例182之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含：VH CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2038至2047之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2064至2073之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2090至2099之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2116至2125之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2142至2151之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2168至2177之VL CDR3。
實施例188. 如實施例182之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列X1 RDVX2 GYAGX3 YGMDV (SEQ ID NO: 2198)，其中X1 係A或V，X2 係G或S，且X3 係Y或F。
實施例189. 如實施例188之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFGSYDMN (SEQ ID NO: 2048)；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列SISX1 X2 X3 SYIX4 YAX5 SVKG (SEQ ID NO: 2197)，其中X1 係S或D，X2 係G或S，X3 係E或A，X4 係Y或A，且X5 係E或D。
實施例190. 如實施例182、188或189中任一個之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR3包含胺基酸序列X1 QYAX2 FPYT (SEQ ID NO: 2201)，其中X1 係Q或S，且X2 係N或R。
實施例191. 如實施例190之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VL CDR1包含胺基酸序列X1 AX2 X3 X4 IX5 X6 YLN (SEQ ID NO: 2199)，其中X1 係Q、G或E，X2 係S或N，X3 係Q或E，X4 係D或Y，X5 係A或S，X6 係N或D；及/或 (ii) 該VL CDR2包含胺基酸序列DAX7 NLX8 X9 (SEQ ID NO: 2200)，其中X7 係S或A，X8 係E、H或Q，且X9 係T或Y。
實施例192. 如實施例182之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含：VH CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2048至2052之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2074至2078之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2100至2104之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2126至2130之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2152至2156之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2178至2182之VL CDR3。
實施例193. 如實施例182之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDGPX1 X2 X3 DYYMDV (SEQ ID NO: 2204)，其中X1 係R或Q，X2 係V、D、L或E，且X3 係S或V。
實施例194. 如實施例193之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列YTFX1 X2 YX3 MH (SEQ ID NO: 2202)，其中X1 係T或H，X2 係S，G或H，且X3 係Y或P；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X4 INPSX5 GX6 TX7 YAQKFQG (SEQ ID NO: 2203)，其中X4 係I或S，X5 係G或R，X6 係S或R，且X7 係S或E。
實施例195. 如實施例182、193或194中任一個之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR3包含胺基酸序列QQRDNWPFT (SEQ ID NO: 2116)。
實施例196. 如實施例195之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VL CDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 2116)；及/或 (ii) 該VL CDR2包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 2116)。
實施例197. 如實施例182之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：VH CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2053至2057之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2079至2083之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2105至2109之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2131至2135之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2157至2161之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2183至2187之VL CDR3。
實施例198. 如實施例182之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至FIXa，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VH CDR3包含胺基酸序列ARDKYQDYSX1 DI (SEQ ID NO: 2207)，其中X1 係F或V。
實施例199. 如實施例198之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列GSIX1 SX2 X3 YX4 WX5 (SEQ ID NO: 2205)，其中X1 係S或A，X2 係S, T, G或V，X3 係S或A，X4 係Y或A，且X5 係G、V、N或S；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X6 IX7 X8 X9 GX10 TX11 YNPSLKS (SEQ ID NO: 2206)，其中X6 係S或Y，X7 係S、Y、R、T或Q，X8 係Y、G、P或A，X9 係S或Q，X10 係S或K，且X11 係Y或Q。
實施例200. 如實施例182、198或199之經分離之抗FIXa抗體，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR3包含胺基酸序列QQANFLPFT (SEQ ID NO: 2188)。
實施例201. 如實施例200之經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VL CDR1包含胺基酸序列RASQGIDSWLA (SEQ ID NO: 2136)；及/或 (ii) 該VL CDR2包含胺基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 2162)。
實施例202. 如實施例182之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：VH CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2058至2063之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2084至2089之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2110至2115之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 2136至2141之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2162至2167之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2188至2193之VL CDR3。
實施例203. 如實施例182至202中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031及2035；及/或 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033及2037。
實施例204. 如實施例182至203中任一個之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中 (a1) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1935及1937 (BIIB-9-3595)； (a2) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1939及1941 (BIIB-9-3601)； (a3) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1943及1945 (BIIB-9-3604)； (a4) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1947及1949 (BIIB-9-3617)； (a5) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1951及1953 (BIIB-9-3618)； (a6) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1955及1957 (BIIB-9-3621)； (a7) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1959及1961 (BIIB-9-3647)； (a8) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1963及1965 (BIIB-9-3649)； (a9) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1967及1969 (BIIB-9-3650)； (a10) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1971及1973 (BIIB-9-3654)； (a11) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1975及1977 (BIIB-9-3753)； (a12) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1979及1981 (BIIB-9-3754)； (a13) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1983及1985 (BIIB-9-3756)； (a14) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1987及1989 (BIIB-9-3764)； (a15) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1991及1993 (BIIB-9-3766)； (a16) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1995及1997 (BIIB-9-3707)； (a17) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1999及2001 (BIIB-9-3709)； (a18) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2003及2005 (BIIB-9-3720)； (a19) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2007及2009 (BIIB-9-3727)； (a20) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2011及2013 (BIIB-9-3745)； (a21) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2015及2017 (BIIB-9-3780)； (a22) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2019及2021 (BIIB-9-3675)； (a23) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2023及2025 (BIIB-9-3681)； (a24) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2027及2029 (BIIB-9-3684)； (a25) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2031及2033 (BIIB-9-3698)；或 (a26) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2035及2037 (BIIB-9-3704)。
有關先前提交之申請案的引用
本申請案要求2016年11月23日提交之美國臨時申請案第62/425,921號、2017年1月31日提交之美國臨時申請案第62/452,809號、2017年7月7日提交之美國臨時申請案第62/529,805號及2017年11月16日提交之美國臨時申請案第62/587,284號的權益，該等專利以全文引用之方式併入本文中。 有關經由EFS-WEB以電子方式提交之序列表的引用
與本申請案一起申請的以電子方式提交之序列表之內容(名稱：4159.485PC04_Sequence_listing_ST25.txt；大小：1,053,370字元；且創建日期：2017年11月21日)以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供優先結合至特定形式凝血因子之抗體。詳言之，本發明提供特異性結合至FIX之抗體及其抗原結合部分(例如在FIXa及因子IX酶原(FIXz)存在下優先結合至活化因子IX(FIXa)之抗體及其抗原結合部分)。本發明亦提供在FXz及FXa存在下特異性且優先結合至FX(FX酶原(FXz))之抗體及其抗原結合部分。
亦提供包含本文所揭示之抗FIX抗體或其抗原結合部分中之任一種及本文所揭示之抗FX抗體或其抗原結合部分中之任一種的雙特異性分子(例如抗體)。該等雙特異性抗體可同時結合至FIX及FX且模擬凝血因子VIIIa之功能。
本發明亦提供例如包含本文所揭示之結合分子，例如抗體之組成物(例如醫藥組成物或診斷組成物)、編碼本文所揭示之結合分子的核酸及載體、包含編碼本文所揭示之結合分子之核酸的細胞、製備方法、治療及診斷方法、免疫偶聯物以及套組。
本文所提供之標題並非對本發明各種態樣之限制，該等態樣可藉由參照整個說明書確定。相應地，以下將定義之術語藉由參照說明書全文更完整地定義。在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明不限於特定組成或方法步驟，因此可變化。 I. 定義
為了使本發明更容易理解，先定義某些術語。如本申請案中所使用，除非本文另外明確提供，否則以下各術語應當具有以下陳述之含義。其他定義將於本申請案通篇陳述。
本發明包括群組中僅一個成員存在於、用於或以其他方式涉及給定產物或方法的實施例。本發明包括超過一個或所有群組成員存在於、用於或以其他方式涉及給定產物或方法的實施例。
在本說明書及所附申請專利範圍中，除非上下文另外清楚地規定，否則單數形式「一個(種)(a/an)」及「該」包括複數個參照物。術語「一個(種)」以及術語「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。在某些態樣中，術語「一個(種)」意謂「單個(種)」。在其他態樣中，術語「一個(種)」包括「兩個(種)或多於兩個(種)」或「多個(種)」。
此外，在本文中使用時將「及/或」視為對兩個指定特徵或組分中之每一者以及具有或不具有另一者的具體揭示。因此，如本文中在諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」意圖包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與本發明所屬領域之一般技術人員通常所理解相同的含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press，為技藝人士提供本發明中所使用的許多術語之一般解釋。
當在本文中以語言「包含」描述各態樣時，亦提供以術語「由...組成」及/或「基本上由...組成」描述之其他相似態樣。
單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites, (SI))可接受之形式表示。數字範圍包括界定該範圍之數字在內。在陳述值之範圍時，應瞭解，亦特定地揭示在該範圍之所述上限與下限之間的每一中間整數值及其每一分數，以及該等值之間的每一子範圍。任一範圍之上限及下限可以獨立地包括或不包括在該範圍中，且包括任一限值、不包括限值及包括兩個限值之每一範圍亦涵蓋在本發明內。在明確陳述一值時，應瞭解，與所述值數量或量大致相同的值亦在本發明之範圍內。在揭示組合時，該組合中各要素之每一子組合亦特定地揭示且在本發明之範圍內。相反地，在個別地揭示不同要素或要素群組時，亦揭示其組合。在揭示本發明之任一成分具有複數個替代物時，亦特此揭示每一替代物單獨地排除或與其他替代物以任何組合形式排出的本發明之實例；發明之超過一個成分可具有此類排除，且特此揭示具有此類排除之要素的所有組合。
核苷酸係以其通常公認之單字母代碼提及。除非另外指示，否則核酸係自左至右以5'至3'取向書寫。核苷酸在本文中以IUPAC-IUB生物化學命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的其通常已知之單字母符號提及。因此，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤，T表示胸腺嘧啶，U表示尿嘧啶。
胺基酸在本文中以其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦的單字母符號提及。除非另外指明，否則胺基酸序列係自左至右以胺基至羧基取向書寫。
約 ： 如本說明書通篇及申請專利範圍結合數字值使用的術語「約」表示熟習此項技術者熟悉且接受的準確度區間。一般而言，此準確度區間係± 10%。
在給定範圍之情況下，終點包括在內。此外，除非另外指示或自上下文及普通熟習此項技術者之理解另外顯而易見，以範圍表示之值在本發明之不同實施例中可呈現所述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則精確至該範圍下限單位之十分之一。
以組合投予 ： 如本文所使用，術語「以組合投予」、「組合投予」或「組合療法」意謂，兩種或多於兩種藥劑，例如本文所揭示之結合分子，及第二藥劑，係同時或在一定時間間隔內投予受試者，由此每一藥劑對患者之作用可存在重疊。在一個實施例中，該等藥劑係彼此間隔約60分鐘、30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘或1分鐘投予。在一些實施例中，該等藥劑之投予間隔足夠接近以便獲得組合(例如協同)作用。
親和力 ： 術語「親和力」係指結合分子(例如抗體)結合至抗原以將抗原及結合分子之平衡轉移朝向由其結合形成之複合物之存在的程度。因此，當抗原與結合分子以相對相等濃度組合時，具有高親和力之結合分子將結合至可用抗原以將平衡朝向所得複合物之高濃度轉移。本發明之結合分子(例如抗體)或其抗原結合片段、變異體或衍生物亦可以其與抗原之結合親和力描述或說明。結合分子(例如抗體)對抗原之親和力可使用任何適合方法以實驗測定。(參見例如，Berzofsky等人, 「Antibody-Antigen Interactions,」 In Fundamental Immunology, Paul, W. E.編, Raven Press: New York, N.Y. (1984)；Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；及本文中描述之方法)。
特定結合分子-抗原相互作用之親和力量測值若在不同條件(例如鹽濃度、pH)下量測，則可變化。因此，親和力及其他抗原結合參數(例如KD 、Ka 、Kd )之量測值較佳用結合分子及抗原之標準化溶液，及標準化緩衝液進行。
結合分子(例如抗體)之「高親和力」係指至少約1×107 公升/莫耳，或至少約1×108 公升/莫耳，或至少約1×109 公升/莫耳，或至少約1×1010 公升/莫耳，或至少約1×1011 公升/莫耳，或至少約1×1012 公升/莫耳，或至少約1×1013 公升/莫耳，或至少約1×1014 公升/莫耳或更高的平衡締合常數(Kaff )。「高親和力」結合可能因抗體同型而改變。
KD ，平衡解離常數，係亦用於描述抗體親和力之術語且為Kaff 之倒數。KD 係由kd 與ka 之比率(亦即，kd /ka )獲得且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD 值可使用此項技術中充分確立之方法測定。用於測定抗體之KD 的可用方法包括生物膜層干涉(BLI)檢定、表面電漿共振、生物感測器系統，諸如BIACORE®系統或流動式細胞測量術及Scatchard分析。若使用KD ，則術語抗體之「高親和力」係指小於約1×10− 7 M，或小於約1×10− 8 M，或小於約1×10− 9 M，或小於約1×10− 10 M，或小於約1×10− 11 M，或小於約1×10− 12 M，或小於約1×1013 M、小於約1×10− 14 M或更低的平衡解離常數(KD )。
胺基酸取代 ： 術語「胺基酸取代」係指親本或參考序列(例如野生型序列)中存在之胺基酸殘基經另一胺基酸殘基置換。胺基酸可例如經由化學肽合成或經由此項技術中已知之重組方法取代入親本或參考序列(例如野生型多肽序列)中。因此，提及「在X位處取代」係指X位存在之胺基酸經替代性胺基酸殘基取代。在一些態樣中，取代模式可根據模式AnY描述，其中A係對應於n位天然或初始存在之胺基酸的單字母代碼，且Y係取代胺基酸殘基。在其他態樣中，取代模式可根據模式An(YZ)描述，其中A係對應於取代n位天然或最初存在之胺基酸的胺基酸殘基之單字母代碼，且Y及Z係可置換A的替代性取代胺基酸殘基。
在本發明之上下文中，取代(甚至當將其稱為胺基酸取代時)係在核酸層面上進行，亦即，用替代性胺基酸殘基取代胺基酸殘基係藉由用編碼第二胺基酸之密碼子取代編碼第一胺基酸之密碼子進行。
親和力成熟 ： 術語「親和力成熟」係指結合分子(例如抗體)已經歷親和力成熟，此係使結合分子(例如抗體)對靶抗原之親和力增加的過程。因此，親和力成熟抗體係在一或多個CDR中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，該一或多種變化使該抗體對抗原之親和力改善。例示性親和力成熟抗體將對靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。
根據本文所揭示之本發明的各種實施例，為了產生親和力成熟抗體，可採用此項技術中可用的製備及/或使用親和力成熟文庫的任一種或多種方法。例示性親和力成熟方法包括隨機突變誘發、致突變細菌菌株傳代、定點突變誘發、突變熱點靶向、簡約突變誘發(parsimonious mutagenesis)、抗體改組、輕鏈改組、重鏈改組、CDR1及/或CDR1突變誘發，以及產生及使用可用於實施根據本文所揭示之本發明之各種實施例的方法和用途的親和力成熟文庫的方法，包括例如，以下揭示之方法：Prassler等人(2009); Immunotherapy, 第1卷 (4), 第571 -583頁；Sheedy等人(2007), Biotechnol. Adv., 第25(4)卷, 第333-352頁；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679，皆以全文引用之方式併入本文中。Marks等人(1992) BioTechnology 10:779-783描述藉由VH及VL結構域改組進行之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發描述於Barbas等人(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Schier等人(1995) Gene 169:147-155；Yelton等人(1995) J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7):3310-9；及Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896中。在選擇性突變誘發位置、接觸或高突變位置處突變而具有活性增強之胺基酸殘基描述於美國專利第6,914,128號中。
動物 ： 如本文所使用，術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，動物摂係指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物係哺乳動物(例如囓齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於，哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚及蠕蟲。在一些實施例中，動物係轉殖基因動物、基因經工程改造之動物或純系。
抗體 ：術語「抗體」與「免疫球蛋白」(縮寫「Ig」)在本文中可互換使用且係指特異性結合至特定抗原或與特定抗原免疫反應的包含至少一個免疫球蛋白結構域之分子。該術語包括完整抗體及其任何抗原結合部分或單一鏈及其組合(例如雙特異性抗體)。
典型看題包含藉由二硫鍵互連的至少兩條重鏈(「HC」)及兩條輕鏈(「L」)。
每一「重鏈」包含「重鏈可變區」(本文縮寫為「VH」)及「重鏈恆定區」(本文縮寫為「CH」)。未修飾抗體中之重鏈恆定區包含三個恆定結構域，即CH1、CH2及CH3。
每一「輕鏈」包含「輕鏈可變區」(本文縮寫為「VL」)及「輕鏈恆定區」。未修飾抗體中之輕鏈恆定區包含一個恆定結構域，即「CL」。VH及VL區可進一步細分成稱為互補決定區(「CDR」)之高變區，其中散佈有更為保守之區域，稱為「構架區」(「FW)。
每一VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下次序排列之三個CDR及四個FW構成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。本發明提供VH及VL序列以及對應於CDR1、CDR2及CDR3之子序列。因此，熟習此項技術者應瞭解，同樣揭示FW1、FW2、FW3及FW4之序列。對於特定VH，FW1係在VH之N末端與VH-CDR1之N末端之間的子序列，FW2係在VH-CDR1之C末端與VH-CDR2之N末端之間的子序列，FW3係在VH-CDR2之C末端與VH-CDR3之N末端之間的子序列，且FW4係在VH-CDR3之C末端與VH之C末端之間的子序列。類似地，對於特定VL，FW1係在VL之N末端與VL-CDR1之N末端之間的子序列，FW2係在VL-CDR1之C末端與VL-CDR2之N末端之間的子序列，FW3係在VL-CDR2之C末端與VL-CDR3之N末端之間的子序列，且FW4係在VL-CDR3之C末端與VL之C末端之間的子序列。
重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q)在內之宿主組織或因子的結合。例示性本發明抗體包括典型抗體、scFv及其組合，其中例如，scFv係共價連接(例如經由肽鍵或經由化學連接子)至典型抗體之重鏈及/或輕鏈的N末端，或插入典型抗體之重鏈及/或輕鏈中。
如本文所使用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈可變片段(scFv)、二硫鍵穩定之scFv、由至少兩個完整抗體及/或其抗原結合部分產生之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原決定部分的融合蛋白，及包含抗原識別位點之任何其他經修飾的免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所需生物活性即可。
抗體可具有五個主要免疫球蛋白類別(同型)：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，基於其重鏈恆定結構域之身分，分別稱為α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白之不同類別具有不同且熟知之次單元結構及三維構型。抗體可為裸抗體或偶聯至其他分子，諸如治療劑或診斷劑以形成免疫偶聯物。
有至少兩種測定CDR之技術：(1)基於跨物種序列可變性之方法(亦即，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.))；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-lazikani等人(1997) J.Molec. Biol. 273:927-948))。此外，有時在此項技術中使用該兩種方法之組合測定CDR。當提到可變結構域中的殘基時，一般使用Kabat編號系統(大致輕鏈殘基1-107及重鏈殘基1-113)(例如Kabat等人, Sequences of Immunological Interest. 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。
片語「如Kabat中之胺基酸編號系統」、「Kabat位置」及其語法變化形式係指Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中用於編輯抗體之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。使用該編號系統，實際的線性胺基酸序列可以含有對應於可變結構域FW或CDR之縮短或插入的較少或另外的胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可以在H2之殘基52之後包括單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈之FW殘基82之後包括插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。參見表1。 表1
可以通過將抗體序列同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定給定抗體中殘基的Kabat編號。而Chothia係指結構環的位置(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。當使用Kabat編號規則編號時，Chothia CDR-H1環之末端依據環的長度在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案在H35A及H35B處有插入；若不存在35A及35B，則該環在32處結束；若僅存在35A，則該環在33處結束；若同時存在35A及35B，則該環在34處結束)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折中，且被Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。
IMGT (ImMunoGeneTics)亦提供包括CDR在內之免疫球蛋白可變區的編號系統。參見例如，Lefranc, M.P.等人, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)，以引用之方式併入本文中。IMGT編號系統係基於超過5,000個序列之比對、結構資料及高變環之表徵，且能夠容易地比較所有物種之可變區及CDR區。根據IMGT編號方案，VH-CDR1係在26至35位處，VH-CDR2係在51至57位處，VH-CDR3係在93至102位處，VL-CDR1係在27至32位處，VL-CDR2係在50至52位處，且VL-CDR3係在89至97位處。
對於本發明中論述的所有重鏈恆定區胺基酸位置，編號係根據最先在Edelman等人, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85中所描述的EU索引，該EU索引描述了骨髓瘤蛋白質EU之胺基酸序列，此係首個測序的人類IgG1。Edelman等人之EU索引亦陳述於Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda中。因此，片語「如Kabat中所陳述之EU索引」或「Kabat之EU索引」及「根據如Kabat中所陳述之EU索引的位置……」及其語法變化形式係指基於如Kabat 1991中所陳述的Edelman等人之人類IgG1 EU抗體的殘基編號系統。
用於可變結構域(重鏈及輕鏈可變結構域)及輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統係Kabat 1991中所陳述之編號系統。
如本文所使用，Fc區包括含抗體恆定區但不包含第一恆定區免疫球蛋白結構域的多肽。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG的後兩個恆定區免疫球蛋白結構域，以及IgE和IgM的後三個恆定區免疫球蛋白結構域，及該等結構域N末端之可撓性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc可以包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3以及在Cγ1與Cγ2之間的鉸鏈。
儘管Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為包含殘基C226或P230至其羧基末端，其中編號係根據如在Kabat中所陳述之EU索引。Fc可以指分離的該區域，或處於抗體、抗體片段或Fc融合蛋白環境中之該區域。
在抗體恆定區內之多個不同位置觀察到多形現象(例如，如藉由Kabat中所陳述之EU索引編號，Fc位置，包括但不限於位置270、272、312、315、356及358)，且因此在所提供之序列與先前技術中之序列之間可能存在微小差異。人類免疫球蛋白之多形性形式已得到充分表徵。目前，已知18 Gm之同種異型：G1m (1、2、3、17)，或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)，或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)，或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)。參見Lefranc等人, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, 第43-78頁(1990)；Lefranc等人(1979) Hum. Genet.: 50, 199-211。詳言之，預期本發明之抗體可併入任何免疫球蛋白基因之任何同種異型、異種型或單倍型，且不限於本文所提供之序列的同種異型、異種型或單倍型。
抗體結合位點 ： 術語「抗體結合位點」係指抗原(例如FIXa或FXz)中包含與互補抗體特異性結合之連續或不連續位點(亦即，抗原決定基)的區域。因此，抗體結合位點可含有抗原中在抗原決定基外且可決定諸如結合親和力及/或穩定性之特性，或影響諸如抗原酶活性或二聚化之特性的另外區域。因此，即使兩種抗體結合至抗原內之同一抗原決定基，但若該等抗體分子與抗原決定基外之胺基酸建立不同分子間接觸，則認為該等抗體結合至不同抗體結合位點。
抗原結合部分 ：如本文所使用，術語「抗原結合部分」可與「抗原結合片段」互換使用且指完整抗體中能夠特異性結合至與完整抗體相同之抗原決定基的部分。特定言之，其係指完整抗體中包含完整抗體之一或多個CDR的一或多個部分。此項技術中已知抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段執行。抗體片段之實例包括但不限於，Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗原結合分子 ：術語「抗原結合分子」與「結合分子」在本發明中可互換使用且涵蓋如本文所定義之抗體，以及包含本文所揭示之抗體之至少一個CDR且能夠結合至相同抗原決定基的其他分子實體。舉例而言，術語包括基於纖連蛋白III型結構域(單抗體)之支架、移植有一或多個CDR之其他支架系統(例如肌腱蛋白)、適體等的抗體模擬物。在一些態樣中，抗原結合分子可為雙特異性分子，亦即「雙特異性結合分子」或「雙特異性分子」。
大約 ： 如本文所使用，術語「大約」當用於一或多個所關注值時，係指類似於所述參考值的值。在某些實施例中，除非另外說明或自上下文另外顯而易見，否則術語「大約」係指在所述參考值之任一方向(大於或小於)的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更低範圍內的值範圍(該數字將超過可能值之100%的情形除外)。
與 …… 相關 ： 如本文關於疾病所使用之術語「與……相關」意謂，所論及之症狀、量測值、特徵或狀態與該疾病之診斷、發展、存在或進展關聯。相關可能但未必與疾病呈因果關係。
當關於兩個或多於兩個部分使用時，術語「與……締合」、「偶聯」、「連接」、「附接」及「繫栓」在用於兩個或多於兩個部分時意謂，該等部分彼此直接或經由一或多個充當連接劑之另外的部分以物理方式締合或連接，由此形成足夠穩定之結構，使得該等部分在該結構之使用條件，例如生理條件下保持物理締合。「締合」未必嚴格經由直接共價化學鍵接進行。其亦可表示足夠穩定以使「締合」之實體保持物理締合的基於離子鍵或氫鍵或雜交之連接。
結合親和力 ：「結合親和力」一般係指一個分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD )表示。可以通過此項技術中已知的常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體一般結合抗原較慢且往往易於解離，而高親和力抗體一般結合抗原較寬且往往保持結合較長時間。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，其中任一種均可用於本發明之目的。
術語「較高結合親和力」或「較高親和力」當用於本發明之任何抗體時係指結合親和力相較於參考抗體增加(如例如藉由KD 量測)。在一些實施例中，參考抗體係未親和力成熟之相應抗體。在一些實施例中，參考抗體係具有相同特異性之另一抗體(例如對於本文所揭示之抗FIXa，參考抗體可為此項技術中已知之另一抗FIX或抗FIXa抗體)。在一些實施例中，增加之結合親和力可例如比參考抗體對相同凝血因子(例如FIX或FX)、該因子之某一形式(例如FIXa或FXz)或抗原結合位點(例如抗原決定基)之結合親和力高至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些實施例中，增加之結合親和力可例如為參考抗體對相同凝血因子(例如FIX或FX)、該因子之某一形式(例如FIXa或FXz)或抗原結合位點(例如抗原決定基)之結合親和力的至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。
結合 ： 術語「結合」係指兩個分子，例如抗體與抗原之間之物理相互作用。 (i)結合特異性 ：術語「特異性」係指相對於不同抗原位點，結合分子(例如抗體)優先結合至一個抗原位點(例如抗原決定基)之能力且未必暗示高親和力。術語「結合特異性」與「特異性」可互換使用並且可指(i)結合分子之特定部分及(ii)結合分子特異性結合(參見以下「特異性結合」之定義)至特定抗原決定基之能力。舉例而言，在一些實施例中，本文所揭示之雙特異性抗體包含兩種結合特異性，即，對例如FIXa之第一結合特異性及對例如FXz之第二結合特異性(在此情形中，「結合特異性」諸如雙特異性抗體結合至特定抗原決定子之特定區域將相當於「結合結構域」)。 (ii)特異性結合 ： 當抗原與結合分子(例如抗體)之間存在特異性相互作用免疫反應時，該結合分子「特異性結合」。術語「特異性結合」意謂產生抗體經由其可變區結合至抗原。術語「非特異性結合」意謂，產生之抗體未特異性結合至抗原但出於某種原因經由非特異性方式結合抗原。作為一個實例，抗體將經由抗體分子之Fc部分非特異性結合至Fc受體。作為另一實例，某些抗體可無意地與抗原交叉反應，而該等抗體並非針對該等抗原所產生。 (iii)優先結合 ： 若相較於結合分子(例如抗體)結合至其他物質，該結合分子與抗原之結合具有較高親和力、親合力、更容易及/或持續時間更長，則其「優先結合至」抗原。舉例而言，優先結合至FIXa抗原決定基之抗體係以結合此抗原決定基比結合至其他FIXa抗原決定基或非FIXa抗原決定基的親和力高、親合力高、更容易及/或持續時間更長的抗體。舉例而言，若在活化FIX及FIX酶原存在下，超過50%、60%、70%、80%、90%或95%之抗FIX抗體結合至FIXa，則相對於FIXz，該抗FIXa抗體優先結合至FIXa。藉由閱讀此定義，還應理解，例如，優先結合至第一靶之抗體(或部分或抗原決定基)可以或可以不優先結合至第二靶。因此，「優先結合」未必需要(但其可以包括)獨佔性結合。因此，在一些態樣中，「優先結合」可為「獨佔性結合」。為了舉例說明該等概念，若50%之抗FIX特異性結合至FIX酶原且50%特異性結合至FIXa，則此結合將為「非選擇性」或「非優先的」。若不到50%之抗FIX結合至FIX酶原且超過50%結合至FXa，則該抗FIX將「優先結合」至FIXa。若抗FIX不結合至FIX酶原且僅結合至FIXa，則該抗FIX將「獨佔性結合」至FIXa。
生物樣品 ：如本文所使用，術語「生物樣品」係指自受試者、細胞株、組織培養物或可能包括含本文所揭示之結合分子特異性識別之抗原的分子之其他來源獲得的任何樣品。在一些態樣中，生物樣品係血液樣品或來源於血液樣品之樣品(例如血漿)。此項技術中已知用於自哺乳動物獲得組織活檢體及體液的方法。
雙特異性抗體 ： 「雙特異性抗體」係「雙特異性分子」或「雙特異性結合分子」之特定形式。術語「雙特異性抗體」意謂能夠經由兩個不同抗原結合位點結合到至少兩個抗原決定子(例如抗原決定基)的抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體能夠同時結合兩個抗原決定子(例如抗原決定基)。在一些實施例中，雙特異性抗體結合其結合臂(一對重鏈/輕鏈)之一上的一個抗原(例如抗原決定基)且結合其第二結合臂(一對不同的重鏈/輕鏈)上之不同抗原(或抗原決定基)。在一些實施例中，雙特異性抗體可具有兩個截然不同之抗原結合臂(在特異性及CDR序列方面)，且對於其結合之每一抗原而言為單價的。雙特異性抗體包括例如由四源融合瘤技術(Milstein及Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40)、藉由兩種不同單株抗體之化學偶聯(Staerz等人(1985) Nature 314(6012): 628-31)或藉由孔中節或在Fc區中引入突變之類似方法(Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14): 6444-6448)所產生之抗體。
近期，已例如藉由融合例如IgG抗體形式與單鏈結構域開發出多種重組雙特異性抗體形式(參見Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16)。可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1相互置換的雙特異性抗體描述於WO2009080251及WO2009080252中。
稱為‘孔中節’的防止錯誤配對副產物問題之方法旨在藉由將突變引入CH3結構域中改變接觸界面來迫使兩條不同抗體之重鏈配對。一條鏈上之大體積胺基酸經具有較短側鏈之胺基酸置換而產生‘孔’。相反，將具有較大側鏈之胺基酸引入其他CH3結構域中以產生‘節’。藉由共表現該兩條重鏈(及兩條一致輕鏈，該等輕鏈須適於兩條重鏈)，觀察到異二聚體形成(‘孔中節’)相對於同二聚體形成(‘孔-孔’或‘節-節’)之高產率(Ridgway JB, Presta LG, Carter P；及WO1996027011)。可藉由使用噬菌體展示方法重組兩個CH3結構域之相互作用界面且引入二硫橋以使異二聚體穩定來進一步增加異二聚體之百分含量(Merchant A.M等人, Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Aτwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35)。用於孔中節技術之新方法描述於例如EP 1870459A1中。Xie, Z.等人, J Immunol Methods 286 (2005) 95-101提及使用scFv與針對FC部分之孔中節技術之組合的雙特異性抗體形式。
已利用抗體之模組結構產生超過60種不同的雙特異性抗體形式。參見Spiess等人(2015) Molecular Immunology 67:95-106，以全文引用之方式併入本文中。因此，在一些態樣中，雙特異性抗體形式係選自crossMab、雙重作用Fab (DAF) (二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-IgG、LC共用孔中節、孔中節組裝體、電荷對(Charge pair)、Fab臂交換、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y (利用白胺酸拉鏈誘導兩個HC異二聚化的雙特異性抗體)、Fcab、Kλ-body、正交Fab、DVD-IgG (雙可變結構域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG (四合一)、奈米抗體、奈米抗體-HSA、BiTE (雙特異性T細胞接合子)、雙功能抗體、雙重親和力再靶向 (dual-affinity-retargeting，DART)、串聯抗體(TandAb)、scDiabody、scDiabody-CH3、三功能抗體、微抗體、微型抗體、TriBi微型抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HC Ab、scDiabody-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc、內抗體、對接鎖定、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HSA、串聯scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body及scFv1-PEG-scFV2。
在一些態樣中，雙特異性抗體係不對稱(例如異二聚體)抗體，其包含鏈A及鏈B，其中 (i) 鏈A包含T336W突變，且鏈B包含T366W、L368A及Y407V突變(孔中節形式)； (ii) 鏈A包含F405L突變，且鏈B包含K409R突變(duobody形式)； (iii) 鏈A包含T350V、L351Y、F405A及Y407V突變，且鏈B包含T350V、T366L、K392L及T394W突變(azymetric形式)； (iv) 鏈A包含K409D及K392D突變，且鏈B包含D399K及E356K突變(電荷對形式)； (v) 鏈A包含D221E、P228E及L368E突變，且鏈B包含D221R、P228R及K409R突變(電荷對形式)； (vi) 鏈A包含S364H及F405A突變，且鏈B包含Y349T及T394F突變(HA-TF形式)；或 (vii) 鏈A包含IgG/A嵌合體，且鏈B亦包含IgG/A嵌合體(SEEDbody形式)。
在一些態樣中，雙特異性抗體係藉由將輕鏈或重鏈之胺基或羧基末端與另外抗原結合單元附接而工程改造成具有雙特異性的單特異性抗體。該等另外抗原結合單元之替代選擇包括單結構域抗體(未配對VL或VH)、配對之抗體可變結構域(例如Fv或scFv)或經工程改造之蛋白質支架。在一些態樣中，本發明之雙特意箱體包含雙特異性抗體片段。此項技術中已知缺乏雙特異性抗體恆定結構域中之一些或全部的多種雙特異性片段形式。在一些態樣中，本發明之雙特異性分子係雙特異性融合蛋白，例如ImmTAC (連接至親和力成熟之受體的scFv)。在其他態樣中，該雙特異性分子係雙特異性抗體偶聯物。
雙特異性分子 ：參見以上「抗原結合分子 」/「結合分子 」之定義。
嵌合抗體 ：術語「嵌合抗體」及其語法變化形式係指免疫球蛋白分子之胺基酸序列來源於兩個或多於兩個物種之抗體。典型地，輕鏈及重鏈之可變區對應於來源於一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性及/或親和力，及/或能力之抗體可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體中之序列同源以避免在該物種中引起免疫反應。
互補決定區 ：術語「互補決定區」或「CDR」係指重(H)鏈或輕(L)鏈之可變區含有能夠特異性結合至抗原靶之胺基酸序列。該等CDR區引起抗體對特定抗原決定結構之基礎特異性。此等區域亦稱為「高變區」。參見以上「抗體」之定義。
保守胺基酸取代 ： 「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中有定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸或麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸或半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸或色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸或組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則認為該胺基酸取代係保守取代。在另一態樣中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似之胺基酸串保守地置換。
非保守胺基酸取代包括以下取代，其中(i)具有帶正電側鏈之殘基(例如Arg、His或Lys)取代帶負電殘基(例如Glu或Asp)或經帶負電殘基取代；(ii)親水性殘基(例如Ser或Thr)取代疏水性殘基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或經疏水性殘基取代；(iii)半胱胺酸或脯胺酸取代任何其他殘基，或經任何其他殘基取代；或(iv)具有大體積疏水性或芳族側鏈之殘基(例如Val、His、Ile或Trp)取代具有較小側鏈(例如Ala或Ser)或無側鏈(例如Gly)之殘基，或經該殘基取代。
普通技藝人士亦可容易地鑑別其他胺基酸取代。舉例而言，對於胺基酸丙胺酸，可由D-丙胺酸、甘胺酸、β-丙胺酸、L-半胱胺酸及D-半胱胺酸中之任一種進行取代。對於離胺酸，置換可為D-離胺酸、精胺酸、D-精胺酸、高精胺酸、甲硫胺酸、D-甲硫胺酸、鳥胺酸或D-鳥胺酸中之任一種。一般而言，預期可誘導經分離之多肽之特性改變的功能重要區中之取代係以下取代，其中(i)極性殘基，例如絲胺酸或蘇胺酸，取代疏水性殘基，例如白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸或丙胺酸(或經疏水性殘基取代)；(ii)半胱胺酸殘基取代任何其他殘基(或經任何其他殘基取代)；(iii)具有帶正電側鏈之殘基，例如離胺酸、精胺酸或組胺酸，取代具有帶負電側鏈之殘基，例如麩胺酸或天冬胺酸(或經具有帶負電側鏈之殘基取代)；或(iv)具有大體積側鏈之殘基，例如苯丙胺酸，取代不具有此類側鏈之殘基，例如甘胺酸(或經不具有此類側鏈之殘基取代)。前述非保守性取代之一可改變蛋白質之功能特性的可能性亦與針對蛋白質功能重要區之取代位置相關：一些非保守取代因此可能對生物特性具有極少或不具有影響。
保守 ：如本文所使用，術語「保守」係指聚核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別係在所比較之兩個或多於兩個序列之相同位置未發生改變的該等核苷酸或胺基酸殘基。相對保守的核苷酸或胺基酸係在相關序列間之保守性比在該等序列別處出現之核苷酸或胺基酸高的該等核苷酸或胺基酸。
在一些實施例中，若兩個或多於兩個序列彼此100%一致，則認為該等序列「完全保守」或「一致」。在一些實施例中，若兩個或多於兩個序列彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則認為該等序列「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或多於兩個序列彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%、約98%或約99%一致，則認為該等序列「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或多於兩個序列彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則認為該等序列「保守」。在一些實施例中，若兩個或多於兩個序列彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則認為該等序列「保守」。序列保守性可適用於聚核苷酸或多肽之整個長度或可適用於其一部分、一個區域或一個特徵。
交叉競爭 ：如本文關於結合分子(例如抗體)所使用之術語「競爭」或「交叉競爭」意謂，第一結合分子，例如第一抗體或其抗原結合部分，以與第二結合分子，例如第二抗體或其抗原結合部分足夠類似之方式結合至抗原決定基，由此在第二結合分子存在下，該第一結合分子與其同源抗原決定基之結合結果相較於在無第二結合分子存在下該第一結合分子之結合明顯減少。第二結合分子與其抗原決定基之結合在第一結合分子存在下亦明顯減少的替代情況可以但未必為此情形。亦即，第一結合分子可以抑制第二結合分子與其抗原決定基之結合，而不存在第二分子抑制第一結合分子與其相應抗原決定基之結合。然而，在每一結合分子明顯抑制另一結合分子與其同源抗原決定基結合的情況下，無論達到相同程度、較高程度抑或較低程度，均認為該等結合分子彼此「交叉競爭」結合其相應抗原決定基。本發明涵蓋競爭結合分子及交叉競爭結合分子。
若結合分子，例如抗體交叉競爭以致僅一種抗體在給定時間點可結合至抗原決定基，亦即，一個結合分子阻止另一結合分子之結合或調節作用，則認為該等結合分子「結合至相同抗原決定基」或「包含相同結合位點」或具有「基本上相同之結合」特徵。
競爭在本文中意謂如藉由競爭ELISA分析或藉由ForteBio分析(例如，如實例部分中所描述)所測定的高出至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%之相對抑制作用。設定較高的相對抑制臨限值作為在特定情形中適合競爭水準之標準可為合乎需要的。因此，可設定競爭性結合之標準，其中偵測到至少約40%，或至少約45%，或至少約50%，或至少約55%，或至少約60%，或至少約65%，或至少約70%，或至少約75%，或至少約80%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%或甚至約100%之相對抑制作用，則認為抗體具有足夠競爭性。
有效量 ： 如本文所使用，術語試劑，例如治療劑，諸如抗體之「有效量」係指以實現有益或所需結果，例如臨床結果的量，且因此「有效量」取決於其應用之環境。舉例而言，在投予治療劑治療出血之情況下，試劑之有效量係例如相較於在不投予該試劑情況下獲得的反應，足以減輕或減少出血發生之量。術語「有效量」可與「有效劑量」、「治療有效量」或「治療有效劑量」互換使用。
效應功能 ： 抗體之「效應功能」係結合補體蛋白之能力，該能力可以在稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)之過程中幫助溶解靶抗原，例如細胞病原體。Fc區之另一效應活性係結合至免疫細胞，或具有觸發其他免疫作用之能力的所謂效應細胞之表面上的Fc受體(例如FcγR)。可以例如藉由使用不含Fc區之抗體片段(諸如Fab、F(ab')2或單鏈Fv (scFv))；藉由移除連接至Fc區中特定殘基之糖(去糖基化抗體)；或藉由採用來自IgG4抗體之Fc區(「無效應物IgG4 Fc」)代替IgG1之Fc區，來避免抗體之效應功能。眾所周知，IgG4抗體係以補體活化程度以及抗體依賴性細胞之細胞毒性比IgG1低為特徵。
經工程改造之抗體 ： 如本文所使用，當本發明之實施例經設計成具有與起始點、野生型或天然分子不同之特徵或特性(無論是結構抑或化學方面)時，其為「經工程改造的」。就這一點而言，「經工程改造之抗體」係例如已進行取代/突變以改良親和力、血漿半衰期等的抗體，該抗體之形式已經修飾(例如藉由產生scFv或雙特異性抗體)，或該抗體已經歷親和力成熟。
抗原決定基 ： 如本文所使用，術語「抗原決定基」係指能夠結合至結合分子，例如抗體的抗原蛋白決定子(例如FIXa或FXz之胺基酸子序列)。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成且通常具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。抗體或結合分子中識別抗原決定基之部分稱為抗原決定簇。蛋白質抗原之抗原決定基係基於其結構及與抗原決定簇之相互作用而分成兩類，即構象抗原決定基及線性抗原決定基。構象抗原決定基係由抗原胺基酸序列之不連續區段構成。該等抗原決定基係基於抗原之3-D表面特徵及形狀或三級結構而與抗原決定簇相互作用。相比之下，線性抗原決定基係基於其一級結構而與抗原決定簇相互作用。線性抗原決定基係由抗原之連續胺基酸序列形成。
表現載體 ：「表現載體」係當引入適當宿主細胞中時可轉錄且轉譯成多肽的聚核苷酸。「表現系統」通常係指包含可用於得到所需表現產物之表現載體的適合宿主細胞。根據本發明之抗體(例如雙特異性抗體)較佳藉由重組方式產生。此類方法係現有技術狀態中廣泛所知的且包含在原核及真核細胞中進行蛋白質表現，隨後分離抗體多肽及通常純化至醫藥學上可接受之純度。
生殖系序列 ： 如本文所使用，術語「生殖系序列」係指未重排之免疫球蛋白DNA序列的序列。任何適合的未重排免疫球蛋白來源均可使用。術語「生殖系」係指在抗體暴露於抗原之前的V、D及J微型基因(分鐘igene)之序列。重排之「V區」描述由V、D及J(對於重鏈)或V與J微型基因(對於輕鏈)之間之重排事件產生的遺傳元件。「抗體V區」係指由V、D及J元件編碼之多肽區。抗體V區係由重排之V、D及J微型基因編碼。術語「V(D)J重組」係指使V、D或J微型基因與另一V、D或J微型基因重組的任何方法。V區可為全長抗體之一部分、Fab、scFv或抗體之任何其他衍生物(參見以下抗體之定義)。「生殖系V區」係指在顯著突變誘發事件之前重排V、D及J微型基因之序列。生殖系V區可以在V-D、D-J或V-J微型基因之接合處具有隨機插入或缺失。非生殖系V區(或「成熟」V區)將與微型基因之生殖系序列相差通常超過5個殘基(不包括接合處缺失或插入)。
同源性 ：如本文所使用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。一般而言，術語「同源性」暗示兩個分子之間之進化關係。因此，同源的兩個分子將具有共同的進化祖先。在本發明之上下文中，術語同源性涵蓋一致性及相似性。
在一些實施例中，若聚合分子中至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之單體一致(完全相同之單體)或類似(保守取代)，則認為該等分子彼此「同源」。術語「同源」必要地指至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間之比較。
人類抗體 ：術語「人類抗體」意謂人類產生之抗體，或使用此項技術中已知之任何技術(例如在培養細胞中重組表現，或在轉殖基因動物中表現)製備的具有對應於人類產生之抗體之胺基酸序列的抗體。因此，術語人類抗體亦涵蓋具有對應於最初由人類產生之抗體之胺基酸序列(或其經工程改造之變異體或衍生物)但在非人類系統中表現(例如由化學合成產生；在微生物、哺乳動物或昆蟲細胞中重組表現；或在動物受試者中表現)的抗體。因此，由人類受試者或由人類細胞(例如表現重組抗體或其片段的融合瘤或細胞株)獲得且隨後在動物，例如小鼠中表現的抗體被視為人類抗體。人類抗體之該定義包括完整或全長抗體、其片段，及/或包含至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體，例如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
人類化抗體 ：術語「人類化抗體」係指經工程改造成含有最小非人類(例如鼠類)序列的來源於非人類(例如鼠類)免疫球蛋白之抗體。典型地，人類化抗體係來自CDR之殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR的殘基置換的人類免疫球蛋白(Jones等人, 1986, Nature, 321:522-525；Riechmann等人, 1988, Nature, 332:323-327；Verhoeyen等人, 1988, Science, 239:1534-1536)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FW殘基經來自具有所需特異性及/或親和力及/或能力之非人類物種之抗體中的相應殘基置換。
人類化抗體可進一步藉由取代FW區中及/或經置換非人類殘基內之其他殘基進行修飾以精製並優化抗體特異性、親和力及/或能力。一般而言，人類化抗體將包含至少一個，且典型地兩個或三個可變結構域之基本上全部，該等結構域含有所有或基本上所有的與非人類免疫球蛋白對應之CDR區，而所有或基本上所有的FW區係人類免疫球蛋白共同序列的FW區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白恆定區或結構域之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法的實例描述於美國專利第5,225,539號或第5,639,641號中。
一致性 ：如本文所使用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如多肽分子或聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間的總體單體保守性。在無任何其他限定詞情況下，術語「一致」，例如蛋白質A與蛋白質B一致，表明序列100%一致(100%序列一致性)。兩個序列描述為例如「70%一致」相當於描述其具有例如「70%序列一致性」。
兩個聚核苷酸序列之一致性百分比的計算例如可以藉由對準該兩個序列以實現最佳比較目的進行(例如為了最佳對準，可以在第一及第二核酸序列之一或兩個中引入空位，且出於比較目的，可以忽略不一致的序列)。在某些實施例中，出於比較目的對準的序列之長度係參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著，比較在相應核苷酸位置處之核苷酸。當佔據第一序列中某一位置的核苷酸與第二序列中的相應位置相同時，則該等分子在該位置處一致。兩個序列間的一致性百分比隨該等序列所共有的一致位置之數量而變化，需考慮出於最佳對準兩個序列而需要引入的空位之數量及各空位之長度。序列比較及兩個序列間一致性百分比之測定可使用數學算法實現。當比較DNA及RNA時，胸腺嘧啶(T)與尿嘧啶(U)可以視為相同的。
適合軟體程式可自各種來源獲得，且用於比對蛋白質及核苷酸序列。一種適於測定序列一致性百分比之程式為bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為生物資訊程式之EMBOSS套件之部分，且亦可獲自歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)之www.ebi.ac.uk/Tools/psa。
序列比對可使用此項技術中已知之方法，諸如MAFFT、Clustal (ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等進行。
與聚核苷酸或多肽參考序列比對的單個聚核苷酸或多肽靶序列內之不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，序列一致性百分比值係捨入至最接近的十分位。舉例而言，80.11、80.12、80.13及80.14向下捨入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上捨入至80.2。亦應注意，長度值將始終為整數。
在某些態樣中，第一胺基酸序列(或核酸序列)與第二胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(%ID)係以%ID = 100 × (Y/Z)計算，其中Y係在第一與第二序列比對(如藉由目測檢查或特定序列比對程式比對)中評為一致匹配的胺基酸殘基(或核鹼基)之數量且Z係第二序列中之殘基總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列與第二序列之一致性百分比將高於第二序列與第一序列之一致性百分比。
熟習此項技術者將理解，產生用於計算序列一致性百分比的序列比對不限於僅僅由原始序列資料驅動之二元序列-序列比較。亦應理解，序列比對可藉由整合序列資料與異質來源之資料產生，該等異質來源之資料諸如結構資料(例如結晶蛋白結構)、功能資料(例如突變位置)或譜系學資料。整合異質資料以產生多重序列比對的適合程式為T-Coffee，其獲自www.tcoffee.org且可替代地獲自例如EBI。亦應瞭解，用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動或手動策劃。
免疫偶聯物 ： 如本文所使用，術語「免疫偶聯物」係指包含結合分子(例如抗FIXa、抗FXz或雙特異性抗FIXa/抗FXz)及以化學方式偶聯至該結合分子之一或多個部分，例如治療部分或診斷部分的複合物。一般而言，免疫偶聯物係由以下通式定義：A-(L-M)n，其中A係結合分子(例如抗體)，L係可選連接子，且M係異源部分，其可例如為治療劑、可偵測標記等，且n為整數。免疫偶聯物亦可藉由顛倒次序之該通式定義。在一些態樣中，免疫偶聯物係「抗體-藥物偶聯物」(「ADC」)。在本發明之上下文中，術語「免疫偶聯物」不限於化學或酶偶聯物分子。如本發明中所使用，術語「免疫偶聯物」亦包括基因融合物。
經分離之 ：如本文所使用，術語「經分離之」係指已與其所締合之至少一些組分(無論在自然界抑或在實驗環境中)分離的物質或實體(例如多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或呈自然界中未發現之形式的組成物)。經分離之物質(例如核苷酸序列或蛋白質序列)可關於與其締合之物質而具有不同純度。
經分離之物質及/或實體可與至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少95%或更高百分比的最初其所締合之其他組分分離。
在一些實施例中，經分離之試劑係約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%純。
如本文所使用，若一種物質基本上不含其他組分，則其為「純」的。術語「大體上分離」意謂化合物大體上自形成或偵測其之環境分離。部分分離可包括例如富含本發明化合物之組成物。大體上分離可包括以重量計含有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之本發明化合物或其鹽的組成物。
「經分離之」本文所揭示之聚核苷酸(例如抗體)、載體、多肽、細胞或任何組成物係呈自然界中未發現之形式的聚核苷酸(例如抗體)、載體、多肽、細胞或組成物。經分離之聚核苷酸、載體、多肽或組成物包括純化至使其不再呈其在自然界中所發現之形式的程度之聚核苷酸、載體、多肽或組成物。在一些態樣中，經分離之聚核苷酸、載體、多肽或組成物係大體上純的。
模擬 FVIIIa 活性 ： 本文所揭示之結合分子「模擬FVIIIa活性」之能力，亦即，模擬活化因子VIII之活性的能力，可根據此項技術中已知之不同方法量測。一種此類方法係如本說明書實例部分中所描述之發色檢定。在一個態樣中，若觀察到的FXa受質裂解速率比在不添加結合分子(例如雙特異性抗體)情況下之平均基礎速率高至少三個標準偏差，則認為本文所揭示之結合分子(例如雙特異性抗體)「模擬FVIIIa活性」。另一例示性方法係活化部分凝血活酶時間(aPTT)檢定。術語‘活化部分凝血活酶時間(APTT)’得自該測試之最初形式(1953年創造)，其中僅控制該測試之磷脂濃度(與磷脂和表面活化物濃度相對)且名稱‘部分凝血活酶’係在磷脂製備時應用，其加速凝血但不校正血友病血漿延長之凝血時間。術語‘部分’基本上意謂磷脂存在但非組織因子。aPTT又稱為：高嶺土-腦磷脂凝固時間(KCCT)或高嶺土部分凝血活酶時間(Partial Thromboplastin Time with Kaolin，PTTK)。其他有用方法包括一期(OS)凝血檢定，該檢定改編自上述傳統aPTT檢定。一期凝血檢定使用缺乏FVIII之血漿及稀釋之測試樣品，且可定量FVIII活性。參見實例4。相比之下，aPTT檢定使用樣品血漿及aPTT試劑及鈣且報告凝血時間。
單株抗體 ：「單株抗體」係指單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合所涉及的同質抗體群。這與典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體的多株抗體相對。術語「單株抗體」涵蓋完整及全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈可變片段(scFv)、包含抗體部分之融合蛋白，以及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以多種方式，包括但不限於，藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物(例如在轉殖基因小鼠中表現人類抗體)製備之該等抗體。
突變 ：在本發明之內容中，認為術語「突變」與以上所定義之「胺基酸取代」(有時簡稱為「取代」)係可互換的。在一些態樣中，術語突變係指編碼抗體生殖系基因之核酸中藉由化學、酶或任何其他方式進行的任何核苷酸之缺失、插入或取代，由此使所得多肽之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基改變。在一些態樣中，本文所揭示之核酸序列中之突變引起胺基酸取代。在其他態樣中，本文所揭示之核酸序列中之密碼子突變不引起胺基酸取代，其中所得密碼子係同義密碼子。因此，在一些態樣中，本文所揭示之核酸序列可藉由引入一或多個同義密碼子改變進行密碼子優化。此類密碼子優化可例如(i)提高重組蛋白質表現中之蛋白質產率；或(ii)改善編碼本文所揭示之結合分子的mRNA或DNA的穩定性、半衰期或其他所需特性，其中將該mRNA或DNA投予有需要之受試者。
患者 ： 如本文所使用，「患者」係指可能尋求或有治療需求、需要治療、正接受治療、將接受治療之受試者，或正由經過訓練之專業人員針對特定疾病或病況進行護理之受試者。
醫藥組成物 ：術語「醫藥組成物」係指呈允許活性成分(例如本文所揭示之結合分子，諸如抗體)之生物活性有效之形式且不含對將投予組成物之受試者產生不可接受之毒性之其他組分的製劑。此類組成物可為無菌的。
醫藥學上可接受 ：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範圍內、適於與人類及動物組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理的效益/風險比相符的化合物、材料、組成物及/或劑型。一般而言，聯邦或州政府之管理機構批准(或美國藥典或其他普遍公認之藥典中所列)用於動物且更特定言之，用於人類表明該等化合物、材料、組成物及/或劑型係醫藥學上可接受的。普遍認為安全用於治療目的的化合物、材料、組成物及/或劑型係「治療可接受的」。普遍認為安全用於診斷目的的化合物、材料、組成物及/或劑型係「診斷可接受的」。
醫藥學上可接受之賦形劑 ： 如本文所使用，片語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除本文所述之化合物外的任何成分(例如能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)且其具有對患者大體上無毒且不會使患者發炎之特性。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包覆劑、壓縮助劑、崩解劑、染料(著色劑)、緩和劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包覆劑、調味劑、香料、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷墨水、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑以及水合用水。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸二鈣、硬脂酸鈣、交聯羧甲基纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮(crospovidone)、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠凝澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、視黃醇棕櫚酸酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
普遍認為安全用於治療目的的賦形劑係「治療可接受之賦形劑」。普遍認為安全用於診斷目的的賦形劑係「診斷可接受之賦形劑」。
醫藥學上可接受之鹽 ：本發明亦包括本文所述化合物之醫藥學上可接受之鹽。如本文所使用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中藉由將現有酸或鹼部分轉化其鹽形式(例如藉由使游離鹼性基團與適合有機酸反應)來改變母體化合物。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於，鹼性殘基，諸如胺之無機或有機酸鹽；酸性殘基，諸如羧酸之鹼金屬或有機鹽；及類似鹽。代表性酸加成鹽包括但不限於，乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、褐藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴化物、鹽酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及類似鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括但不限於，鈉、鋰、鉀、鈣、鎂鹽及類似鹽；以及無毒銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於，銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及類似胺。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機或有機酸形成的母體化合物之習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可由含有鹼性或酸性部分之母體化合物藉由習知化學方法合成。一般而言，此類鹽可藉由使該等化合物之游離酸或鹼性時與化學計算量之量的適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中，或在該兩者之混合物中反應來製備；一般使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適合鹽之清單見於Re min gton's Pharmaceutical Sciences , 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁,Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use , P.H. Stahl及C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008；以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)，其各自以全文引用之方式併入本文中。
醫藥學上可接受之溶劑合物 ：如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂在晶格中併入適合溶劑分子的本發明之化合物。適合溶劑係在所投予之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，可藉由自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液結晶、再結晶或沈澱來製備溶劑合物。適合溶劑之實例係乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N -甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N ,N' -二甲基甲醯胺(DMF)、N ,N' -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及類似溶劑。當水作為溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
藥物動力學 ： 如本文所使用，「藥物動力學」係指分子或化合物之一或多種特性，因為其涉及決定投予活生物體之物質的命運。藥物動力學分為若干區域，包括吸收、分配、代謝及排泄之程度及速率。此通常稱為ADME，其中：(A)吸收(Absorption)係物質進入血液循環之過程；(D)分配(Distribution)係物質在整個體液及組織中分散或散佈；(M)代謝(Metabolism)(或生物轉化)係母體化合物成為產物代謝物之不可逆轉化；及(E)排泄(Excretion)(或去除)係指物質自身體去除。在極少情況下，一些藥物不可逆積累於身體組織中。
聚核苷酸： 如本文所使用，術語「聚核苷酸」係指由任何長度之核苷酸，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物構成之聚合物。此術語係指分子之一級結構。因此，該術語包括三股、雙股及單股脫氧核糖核酸(「DNA」)以及三股、雙股及單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括例如藉由烷基化及/或戴帽修飾，及聚核苷酸之未修飾形式。更特定言之，術語「聚核苷酸」包括聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA及mRNA(無論是剪接抑或未剪接的)、呈嘌呤或嘧啶鹼基之N-或C－糖苷的任何其他類型之聚核苷酸，以及含有非核苷酸主鏈之其他聚合物，例如聚醯胺(例如肽核酸「PNA」)及聚嗎啉基聚合物，及其他合成序列特異性核酸聚合物，只要該等聚合物含有的核鹼基呈如在DNA及RNA中所見的允許鹼基配對及鹼基堆疊之構型即可。在特定態樣中，聚核苷酸包含mRNA。在其他態樣中，mRNA係合成mRNA。在一些態樣中，合成mRNA包含至少一個非天然核鹼基。在一些態樣中，某一類別之所有核鹼基均經非天然核鹼基置換(例如本文所揭示之聚核苷酸中的所有尿苷可經非天然核鹼基，例如5-甲氧基尿苷置換)。在一些態樣中，聚核苷酸(例如合成RNA或合成DNA)僅包含天然核鹼基，亦即，在合成DNA情況下的A、C、T及U；或在合成RNA情況下之A、C、T及U。
熟習此項技術者應理解，本文所揭示之密碼子譜中的T鹼基係存在於DNA中，而T鹼基在相應RNA中將經U鹼基置換。舉例而言，本文所揭示的呈DNA形式之密碼子-核苷酸序列，例如載體或活體外轉譯(IVT)模板，將具有其T鹼基轉錄成其相應轉錄mRNA中之U鹼基。就這一點而言，認為密碼子優化之DNA序列(包含T)及其相應RNA序列(包含U)係本發明之密碼子優化的核苷酸序列。熟習此項技術者亦應瞭解，可藉由用非天然鹼基置換一或多個鹼基產生等效密碼子譜。因此，例如TTC密碼子(DNA譜)將對應於UUC密碼子(RNA譜)，UUC密碼子又將對應於ΨΨC密碼子(RNA譜，其中U經假尿苷置換)。
標準A-T及G-C鹼基對在允許胸苷之N3-H及C4-氧基分別與腺苷之N1及C6-NH2 之間以及胞苷之C2-氧基、N3及C4-NH2 分別與鳥苷之C2-NH2 、N′-H及C6-氧基之間形成氫鍵的條件下形成。因此，例如，鳥苷(2-胺基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可經修飾以形成異鳥苷(2-氧基-6-胺基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。此類修飾使核苷鹼基不再與胞嘧啶有效形成標準鹼基配對。不過，修飾胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-胺基-嘧啶)形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-胺基-4-氧基-嘧啶)使得經修飾核苷酸不能與鳥苷有效鹼基配對，而是與異鳥苷形成鹼基配對(頒予Collins等人之美國專利第5,681,702號)。異胞嘧啶可得自Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)；異胞苷可藉由Switzer等人(1993) Biochemistry 32:10489-10496及其中引用之參考文獻所描述之方法製備；2'-脫氧-5-甲基-異胞苷可藉由Tor等人(1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467及其中引用之參考文獻所描述之方法製備；且異鳥嘌呤核苷酸可使用Switzer等人, 1993, 同上文及Mantsch等人 (1993) Biochem. 14:5593-5601所描述之方法，或藉由頒予Collins等人之美國專利第5,780,610號中所描述之方法製備。其他非天然鹼基對可藉由Piccirilli等人(1990) Nature 343:33-37中關於合成2,6-二胺基嘧啶及其補體(1-甲基吡唑并[4,3]嘧啶-5,7-(4H,6H)-二酮)所描述之方法合成。已知其他形成獨特鹼基對的此類經修飾核苷酸單元，諸如Leach等人(1992) J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683及Switzer等人, 同上文中所描述之核苷酸單元。
多肽： 術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸聚合物。該聚合物可包含經修飾胺基酸。該等術語亦涵蓋天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如經二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，如與標記組分偶聯。在該定義中亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如，非天然胺基酸，諸如高半胱胺酸、鳥胺酸、對乙醯基苯丙胺酸、D-胺基酸及肌胺酸)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。
如本文所使用，該術語係指任何大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、前述之同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單一多肽或者可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最常見之二硫鍵聯見於多鏈多肽中。術語多肽亦可適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係相應天然存在之胺基酸的人工化學類似物。在一些實施例中，「肽」的長度可小於或等於50個胺基酸，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
防止 ：如本文所使用，術語「防止」係指部分或完全延遲疾病、病症及/或病狀之發作；部分或完全延遲特定疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或臨床表現之發作；部分或完全延遲特定疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或表現之發作；部分或完全延遲特定疾病、病症及/或病狀之進展；及/或降低發展與該疾病、病症及/或病狀有關之病變的風險。
預防 ：如本文所使用，「預防的」係指用於防止疾病或病狀之發作，或者防止或延遲與出血發作(例如血友病)有關之症狀的治療或操作過程。
預防治療 ： 如本文所使用，「預防治療」係指維持健康狀況且防止或延遲出血發作之發生，或者防止或延遲與疾病或病狀有關之症狀所採取的措施。
重組 ：「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。出於本發明之目的，在經工程改造之宿主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質視為分離的，已藉由任何適合技術分離、部分分離或者部分地或大體上純化之天然或重組多肽亦視為分離的。本文所揭示之多肽可使用此項技術中已知之方法重組產生。或者，本文所揭示之蛋白質及肽可為化學合成的。
相似性 ：如本文所使用，術語「相似性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。聚合分子之間相似性百分比之計算可以與一致性百分比計算相同之方式進行，不過如此項技術中所理解，相似性百分比之計算考慮保守取代。
受試者 ： 「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂希望診斷、預後或治療之任何受試者，特別是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括但不限於，人類、家畜、農畜、動物園動物、運動動物、寵物，諸如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛；靈長類動物，諸如猿、猴、猩猩及黑猩猩；犬科動物，諸如狗及狼；貓科動物，諸如貓、獅子及虎；馬科動物，諸如馬、驢及斑馬；熊、食用動物諸如奶牛、豬及綿羊；有蹄類動物，諸如鹿及長頸鹿；囓齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠及豚鼠；等等。在某些實施例中，哺乳動物係人類受試者。在其他實施例中，受試者係人類患者。在一特定實施例中，受試者係可用於本文所描述之方法中的人類患者或其細胞，無論是在活體內、活體外抑或離體的。
大體上 ： 如本文所使用，術語「大體上」係指展現所關注特徵或特性之總體或近似總體之範圍或程度的定性條件。熟習生物技術之普通技術者應瞭解，生物及化學現象若發生的話，則很少達到完成及/或進行完全或者達成或避免絕對結果。因此，術語「大體上」在本文中用於捕捉許多生物及化學現象中固有的完全性之潛在缺乏。
大體上相等 ：如本文關於劑量間之時間差異所使用，該術語意謂+/- 2%。
大體上同時 ： 如本文所使用且當涉及複數個劑量時，該術語意謂在2秒內。
罹患 ： 「罹患」疾病、病症及/或病狀之個體已診斷患有該疾病、病症及/或病狀或展現該疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或病狀之個體尚未診斷患有該疾病、病症及/或病狀及/或可能未展現該疾病、病症及/或病狀之症狀，但有發展疾病或其症狀之傾向。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀(例如癌症)之個體可藉由以下一或多項表徵：(1)與發展該疾病、病症及/或病狀有關之基因突變；(2)與發展該疾病、病症及/或病狀有關之基因多形性；(3)與該疾病、病症及/或病狀有關之蛋白質及/或核酸之表現及/或活性增加或降低；(4)與發展該疾病、病症及/或病狀有關之習慣及/或生活方式；(5)該疾病、病症及/或病狀之家族史；及(6)暴露於及/或感染與發展該疾病、病症及/或病狀有關之微生物。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將發展該疾病、病症及/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將不會發展該疾病、病症及/或病狀。
治療劑 ： 術語「治療劑」或「藥劑」係指當投予受試者時具有治療、診斷及/或預防作用及/或引起所需生物及/或藥理學作用的分子實體。舉例而言，在一些實施例中，本文所揭示之雙特異性抗體可為治療劑。在一些實施例中，藥劑係作為組合療法之一部分與至少一種本文所揭示之抗體共投予的另一分子(例如凝血因子、輔因子等)。
治療有效量 ： 如本文所使用，術語「治療有效量」意謂當投予罹患或易患感染、疾病、病症及/或病狀之受試者時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病狀，改善其症狀、診斷、防止及/或延遲其發作而遞送的藥劑量(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)。
治療有效結果 ：如本文所使用，術語「治療有效結果」意謂在罹患或易患感染、疾病、病症及/或病狀之受試者中足以治療該感染、疾病、病症及/或病狀，改善其症狀、診斷、防止及/或延遲其發作的結果。
治療、治療方法、療法 ：如本文所使用，術語「治療」或「治療方法」或「療法」或其語法變化形式係指部分或完全地減輕、改良、改善、緩解出血疾病、病症或病狀，例如血友病之一或多種症狀或特徵，延遲其發作，抑制其進展，降低其嚴重程度及/或減少其發生。舉例而言，「治療」出血病症可指防止出血，降低出血發作頻率及/或嚴重程度等。治療方法可投予未展現疾病、病症及/或病狀之病徵的受試者及/或僅展現疾病、病症及/或病狀之早期病徵的受試者以達到降低發展與該疾病、病症及/或病狀有關之病變之風險的目的。
載體 ： 「載體」係將插入之核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞之間的核酸分子，特別是自複製核酸分子。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中(例如染色體整合)之載體、主要用於DNA或RNA複製之複製載體，及用於轉錄及/或轉譯DNA或RNA之表現載體。在一些態樣中，編碼本文所揭示之結合分子的核酸(DNA或RNA，諸如mRNA)的投予及/或表現可在活體外(例如在重組蛋白質產生期間)發生，而在其他情況下，其可在活體內發生(例如將mRNA投予受試者)或離體發生(例如將DNA或RNA引入自體或異體細胞中以投予有需要之受試者)。亦包括提供超過一種上述功能之載體。 II. 抗FIX及抗FX結合分子
本發明提供結合至因子IX及因子X之抗體，以及其抗原結合部分。該等抗體能夠優先結合至該等凝血因子之特定功能形式。舉例而言，在一些實施例中，所揭示的針對FIX之抗體優先結合至活化FIX (FIXa)，例如游離FIXa或在活性位點中共價連接至受質模擬物的FIXa (FXa+EGR-CMK)。在其他實施例中，相對於游離FIXa或FIX酶原，所揭示之抗體優先結合至FIXa-SM。在其他實施例中，相對於FIXa-SM或FIX酶原，所揭示之抗體優先結合至游離FIXa。相比之下，在一些實施例中，相對於活化FX (FXa)，所揭示的針對FX之抗體優先結合至FX酶原(FXz)。此優先結合對於產生包含抗FIXa部分及抗FXz部分之雙特異性分子至關重要，該等雙特異性分子可特異性且同時結合至FIXa及FXz。因子VIII係FIXa之輔因子，其在Ca2+ 及磷脂存在下與FX形成複合物，由此將FX轉化成活化FXa。因此，在FIXa與FXz之間抗體介導之複合物的形成模擬FVIIIa之作用。
在又其他實施例中，相對於游離FIXa或FIXa-SM，一些所揭示之抗體優先結合至FIX酶原(「抗FIXz抗體」)。因此，可使用抗FIXz抗體產生包含抗FIXz抗體及抗FX抗體(例如抗FXz抗體或抗FXa抗體)之雙特異性分子。
在某些實施例中，相對於FXz，一些所揭示之抗FX抗體優先結合至FXa(「抗FXa抗體」)。可使用抗FXa抗體產生包含抗FXa抗體及抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)之雙特異性分子。
因此，在FIX與FX之間抗體介導之複合物的形成可用於回避FVIII替代療法，特別是用於已產生針對FVIII之抗體或有產生針對FVIII之抗體之風險的受試者。
本發明亦提供結合至FX (FXz及/或FXa)及FIX (FIXz及/或FIXa)之雙特異性結合分子。在一個實施例中，該雙特異性結合分子可為抗FIXa抗體或抗FIXz抗體中之任一種與抗FXa抗體或抗FXz抗體中之任一種的組合。在一些實施例中，該雙特異性結合分子特異性結合至FXz、FIXz及FIXa，但不明顯結合至FXa。在某些實施例中，該雙特異性結合分子以不同結合親和力(例如KD )結合至FIXz、FIXa及FXz。在其他實施例中，該雙特異性結合分子以小於1 µM之KD 結合至FIXz、FIXa及FXz中之每一個(例如分別為8 nM、2 nM或20 nM)。(a) 抗 FIXa 結合分子
本發明提供相對於FIX酶原，優先結合活化FIX (FIXa)之抗FIX結合分子，例如抗FIX抗體或包含其抗原結合部分之分子。
因子IX (FIX)係由肝臟肝細胞以前原酶原形式合成，其合成需要廣泛轉譯後修飾。前原酶原在其胺基末端含有前體肽(疏水性信號肽)，其將正在生長之多肽轉運至內質網之內腔中。一旦進入ER內部，此信號肽即經信號肽酶裂解。原肽充當維生素K依賴性羧酶(γ-麩胺醯基羧酶)之識別元件，該羧酶將12個麩胺酸殘基修飾成γ-羧基麩胺醯基(Gla)殘基。該等殘基係經由Ca2+依賴性結合與陰離子性磷脂表面締合所需的。
以下提供前原FIX酶原之胺基酸序列(信號序列加下劃線(1-28)；原肽序列(29-46)加粗)：MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAEC TVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT (SEQ ID NO: 764)。
在信號肽及原肽裂解之後，FIX呈酶原形式。因此，FIX酶原以415個胺基酸之單鏈多肽形式循環。參見Vysotchin等人,J. Biol. Chem. 268:8436 (1993)。在一個實施例中，FIX酶原係SEQ ID NO: 764之胺基酸47至461。在另一實施例中，FIX酶原係SEQ ID NO: 764之胺基酸47至461，其中胺基酸殘基180係丙胺酸而非精胺酸(亦即，不可活化FIX)。
FIX之酶原係由FXIa或由組織因子/FVIIa複合物活化。最先在Arg191(成熟FIX序列中之Arg145)處裂解，產生無活性FIX-α。其次在Arg226(成熟FIX序列中之Arg180)處裂解，移除FIX活化肽之35個胺基酸且產生催化活性分子FIXa-β。該未與FVIIIa締合之催化活性FIXa在本文中又稱為游離FIXa。由此產生之異二聚體係由Cys178-Cys335處之二硫橋保持。絲胺酸蛋白酶含有His267、Asp315及Ser411之催化三聯體。在Arg226處裂解後，Val227可與Asp410形成鹽橋，此為活性絲胺酸蛋白酶特有的。在一個實施例中，游離FIXa由SEQ ID NO: 764之胺基酸47至191及SEQ ID NO: 764之胺基酸227至461組成，其中SEQ ID NO: 764之胺基酸178與胺基酸335形成二硫鍵。
然而，已知游離FIXa之活性類似於FIX酶原之活性。與輔因子FVIIIa形成複合物表示活化之第二關鍵階段，之後，固有的X酶複合物達到約200,000倍之活性增強，該活性對生理學受質FX具有嚴格特異性且侷限於活化血小板之表面(van Dieijen等人, J Biol Chem. 1981年4月10日;256(7):3433-42)。低分子量促效劑，包括Ca2+有助於此巨分子活化(Mathur等人, Biol. Chem., 272 (1997), 第23418–23426頁)。若干條證據表明，Ca2+結合伴隨構象重排(Bajaj等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 第152–156頁, Enfield及Thompson, Blood, 64 (1984), 第821–831頁)。可藉由將受質模擬物(例如Glu-Gly-Arg-氯甲基酮(EGR-CMK))共價附接至FIXa之活性位點(FXa+EGR-CMK，又稱為FIXa-SM)來模擬該呈因子X活化酶複合物形式之超活性FIXa。因此，FIXa-SM可用作區別相較於游離FIXa，優先結合至超活性FIXa (呈因子X活化酶複合物形式)之抗體或其抗原結合部分的重要工具。
三肽氯甲基酮在本領域中一般公認為受質模擬物，且該三肽序列表示經特定酶裂解之天然受質序列，且CMK部分由於與活性位點絲胺酸反應而將此三肽不可逆鎖定於活性位點中。結果是，若將酶結合至受質模擬物，則此應呈現受質結合形式，亦即，真實的活性構象。參見Brandsteter等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(21):9796-80；及Hopfner等人, (1999) Structure 7(8):989-96。
術語「FIX酶原」在本文中可與「FIXz」、「FIX前驅體」、「未活化FIX」、「非活化FIX」或「非活化FIX前驅體」互換使用。在一個實施例中，FIX酶原(FIXz)包括非活化FIX前驅體，其中活化肽(例如表示為SEQ ID NO: 764(成熟序列編號)之胺基酸146至180的35個胺基酸之活化肽)未自該前驅體裂解。FIX酶原可包括任何天然存在或經工程改造之變異體。FIX酶原之非限制性實例顯示於SEQ ID NO: 764中。在另一實施例中，FIX酶原係不可活化FIX (FIXn)，其在因子XIa，即活化血漿凝血活酶先質存在下經工程改造成無活性。不可活化FIX之實例可為在180位(成熟序列編號)帶有精胺酸變為丙胺酸之突變，由此防止其活化並使因子IX維持酶原形式(FIXz)的FIX。FIX酶原可視情況含有信號肽及/或原肽。
術語「活化FIX」在本文中可與「FIXa」互換使用。在一個實施例中，活化FIX係野生型、天然存在之FIXa(在本文中又稱為「野生型FIXa」)。在另一實施例中，FIXa包含非天然存在之FIXa，例如FIXa構象變異體。舉例而言，FIXa可為FIXa-SM，其係設計成具有與結合至受質FX之野生型、天然存在之FIXa相同的構象。在一特定實施例中，FIXa-SM係具有受質模擬物共價結合至活性位點的活化FIX，其意圖模擬活化FIX之活性最強之構象。
FIX酶原及FIXa可包括FIX變異體。在一個實施例中，FIX變異體已經選殖，如美國專利第4,770,999號及第7,700,734號中所描述，且編碼人類因子IX之cDNA已經分離，表徵且經選殖至表現載體中(參見例如，Choo等人, Nature 299:178-180 (1982)；Fair等人, Blood 64:194-204 (1984)；及Kurachi等人, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982))。一個特定FIX變異體係由Simioni等人, 2009表徵之R338L FIX (Padua)變異體，其包含功能獲得性突變，該突變與Padua變異體活性相對於天然FIX有近8倍增加相關。FIX變異體亦可包括具有一或多個保守胺基酸取代之任何FIX多肽，該一或多個取代不會影響FIX多肽之FIX活性。
因此，本發明提供一種特異性結合至活化因子IX (FIXa)(例如游離FIXa或FIXa-SM)的抗體(例如經分離之抗體)或其抗原結合部分，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分在FIXa及FIX酶原(FIXz)存在下優先結合至FIXa(「抗FIXa抗體或其抗原結合部分」)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。在一個實施例中，結合親和力係以KD 表示。
本發明亦提供一種經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。在一些態樣中，如藉由生物膜層干涉(BLI)檢定所測定，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低(例如1nM至100 nM或0.1 nM至100 nM)、約95 nM或更低、約90 nM或更低、約85 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約65 nM或更低、約60 nM或更低、約55 nM或更低、約50 nM或更低、約45 nM或更低、約40 nM或更低、約35 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約15 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低，或約1 nM或更低之KD 結合至FIXa。在其他實施例中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分以約10 nM或更低、約9 nM或更低、約8 nM或更低、約7 nM或更低、約6 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約3 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低，或約0.05 nM或更低之KD 結合至FIXa。在又其他實施例中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分以1 nM至100 nM、1 nM至90 nM、1 nM至80 nM、1 nM至70 nM、1 nM至60 nM、1 nM至50 nM、1 nM至40 nM、1 nM至30 nM、1 nM至20 nM、1 nM至10 nM、0.1 nM至100 nM、0.1 nM至90 nM、0.1 nM至80 nM、0.1 nM至70 nM、0.1 nM至60 nM、0.1 nM至50 nM、0.1 nM至40 nM、0.1 nM至30 nM、0.1 nM至20 nM、0.1 nM至10 nM，或0.1 nM至1 nM之KD 結合至FIXa。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A、3B及/或3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A、3B及/或3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，參考抗體係選自BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460、BIIB-9-433及其任何組合。
在其他態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分可進一步分為三類： 第I類： 相對於游離FIXa或FIXz，優先結合至FIXa-SM之抗FIXa抗體或其抗原結合部分(圖3A抗體)； 第II類： 相對於FIXa-SM或FIXz，優先結合至游離FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分(圖3B抗體)；及 第III類： 近似相等地結合至游離FIXa及FIXa-SM但與FIXz不明顯締合的抗FIXa抗體或其抗原結合部分(圖3C抗體)。
在一些實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在其他實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3A中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在其他實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在其他實施例中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含 (i) 與選自由圖3A中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在其他態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含 (i) 與選自由圖3B中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含 (i) 與選自由圖3C中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，胺基酸取代係保守胺基酸取代。在其他態樣中，胺基酸取代係回復突變。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含胺基酸序列ARDX1 X2 X3 X4 X5 X6 YYX7 MDV (SEQ ID NO: 753)，其中X1 係V或G，X2 係G或V，X3 係G或R，X4 係Y或V，X5 係A或S，X6 係G或D，X7 係G或不存在。
熟習此項技術者應瞭解誒，當在共同序列中之一個位置描述為「無」或「不存在」時，該不存在不表示多肽鏈斷裂。該等術語僅反映如在多序列比對中所觀察到的胺基酸鏈中插入及缺失之發生情況。因此，當比對兩個序列以產生共同序列，且其中之一含有胺基酸插入時，該不含插入之序列將在該位置處具有一個「不存在」(「無」)之胺基酸。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含選自以下之胺基酸序列：ARDVGGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 905；BIIB-9-484、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336之VH CDR3)、ARDISTDGESSLYYYMDV (SEQ ID NO: 901；BIIB-9-460)、ARGPTDSSGYLDMDV (SEQ ID NO: 1186；BIIB-9-882)、ARSPRHKVRGPNWFDP (SEQ ID NO: 899；BIIB-9-440)或ARDGPRVSDYYMDV (SEQ ID NO: 912；BIIB-9-619)。在一些態樣中，本文所揭示之VH CDR3序列可包含1、2或3個胺基酸取代。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3A中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3B中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3C中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3A中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3B中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3C中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3A中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3B中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3C中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3A中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3B中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3C中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖3A中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3A中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖3B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖3C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
本發明亦提供一種特異性結合至FIXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下圖3A中之抗體組成之群之抗FIXa抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-9-605、BIIB-9-475、BIIB-9-477、BIIB-9-479、BIIB-9-480、BIIB-9-558、BIIB-9-414、BIIB-9-415、BIIB-9-425、BIIB-9-440、BIIB-9-452、BIIB-9-460、BIIB-9-461、BIIB-9-465、BIIB-9-564、BIIB-9-484、BIIB-9-469、BIIB-9-566、BIIB-9-567、BIIB-9-569、BIIB-9-588、BIIB-9-611、BIIB-9-619、BIIB-9-626、BIIB-9-883、BIIB-9-419、BIIB-9-451、BIIB-9-473、BIIB-9-565、BIIB-9-573,BIIB-9-579、BIIB-9-581、BIIB-9-582、BIIB-9-585、BIIB-9-587、BIIB-9-590、BIIB-9-592、BIIB-9-606、BIIB-9-608 BIIB-9-616、BIIB-9-621、BIIB-9-622、BIIB-9-627、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336。
在一些實施例中，本發明包括特異性結合至FIXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下圖3B中之抗體組成之群之抗FIXa抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-9-408、BIIB-9-416、BIIB-9-629或BIIB-9-885。
在其他實施例中，本發明提供一種特異性結合至FIXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下圖3C中之抗體組成之群之抗FIXa抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-9-607、BIIB-9-471、BIIB-9-472、BIIB-9-439、BIIB-9-446、BIIB-9-568、BIIB-9-615、BIIB-9-628、BIIB-9-882、BIIB-9-884、BIIB-9-886、BIIB-9-887、BIIB-9-888、BIIB-9-889、BIIB-9-433、BIIB-9-445、BIIB-9-470、BIIB-9-625、BIIB-9-1264、BIIB-9-1265、BIIB-9-1266、BIIB-9-1267、BIIB-9-1268、BIIB-9-1269、BIIB-9-1270、BIIB-9-1271、BIIB-9-1272、BIIB-9-1273、BIIB-9-1274、BIIB-9-1275、BIIB-9-1276、BIIB-9-1277、BIIB-9-1278、BIIB-9-1279、BIIB-9-1280、BIIB-9-1281、BIIB-9-1282、BIIB-9-1283、BIIB-9-1284、BIIB-9-1285、BIIB-9-1286及BIIB-9-1287。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 800-844、SEQ ID NO: 845-889及SEQ ID NO: 890-934之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(第I類抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 935-979、SEQ ID NO: 980-1024及SEQ ID NO: 1025-1069之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(第I類抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1070-1073、SEQ ID NO: 1074-1077及SEQ ID NO: 1078-1081之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(第II類抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1082-1085、SEQ ID NO: 1086-1089及SEQ ID NO: 1090-1093之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(第II類抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1094-1135、SEQ ID NO: 1136-1177及SEQ ID NO: 1178-1219之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(第III類抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1220-1261、SEQ ID NO: 1262-1303及SEQ ID NO: 1304-1345之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(第III類抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 815、SEQ ID NO: 860及SEQ ID NO: 905之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-484抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-484抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 843、SEQ ID NO: 888及SEQ ID NO: 933之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-1335抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-1335抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 844、SEQ ID NO: 889及SEQ ID NO: 934之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-1336抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-1336抗體之VL CDR)。
在其他態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分與抗體BIIB-9-484、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336交叉競爭，及/或與抗體BIIB-9-484、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336結合至相同抗原決定基。在某些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR3包含ARDVGGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 905，BIIB-9-484 VH CDR3)；VH CDR2包含SISSX1 X2 SYIYYAX3 SVKG (SEQ ID NO: 754)，其中X1 係S、G或任何保守取代，X2 係S、E或任何保守取代，且X3 係D、E或任何保守取代；VH CDR1包含FTFX4 SYX5 MX6 (SEQ ID NO: 755)，其中X4 係S、G或任何保守取代，X5 係D、S或任何保守取代，且X6 係H、N或任何保守取代。抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含針對VH CDR1之SEQ ID NO: 815、針對VH CDR2之SEQ ID NO: 860及針對VH CDR3之SEQ ID NO: 905。(BIIB-9-484 VH CDR)
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括 (a1) 分別包含SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 854及SEQ ID NO: 899之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-440抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 944、SEQ ID NO: 989及SEQ ID NO: 1034之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-440抗體之VL CDR)； (a2) 分別包含SEQ ID NO: 1102、SEQ ID NO: 1144及SEQ ID NO: 1186之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-882抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1228、SEQ ID NO: 1270及SEQ ID NO: 1312之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-882抗體之VL CDR)； (a3) 分別包含SEQ ID NO: 811、SEQ ID NO: 856及SEQ ID NO: 901之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-460抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 946、SEQ ID NO: 991及SEQ ID NO: 1036之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-460抗體之VL CDR)；或 (a4) 分別包含SEQ ID NO: 1108、SEQ ID NO: 1150及SEQ ID NO: 1192之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-433抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1234、SEQ ID NO: 1276及SEQ ID NO: 1318之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-433抗體之VL CDR)；
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 822、SEQ ID NO: 867及SEQ ID NO: 912之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-619抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、SEQ ID NO: 1002及SEQ ID NO: 1047之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-619抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括 (i) 分別包含SEQ ID NO: 843、SEQ ID NO: 888及SEQ ID NO: 933之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-1335抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-1335抗體之VL CDR)；或 (ii) 分別包含SEQ ID NO: 844、SEQ ID NO: 889及SEQ ID NO: 934之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-1336抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 995及SEQ ID NO: 1040之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-1336抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH，其中該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181 (對於第I類抗體，SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87及89；對於第II類抗體，SEQ ID NO: 91、93、95及97；及對於第III類抗體，SEQ ID NO: 99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367 (對於第I類抗體，SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273及275；對於第II類抗體，SEQ ID NO: 277、279、281及283；及對於第III類抗體，SEQ ID NO: 285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181 (對於第I類抗體，SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87及89；對於第II類抗體，SEQ ID NO: 91、93、95及97；及對於第III類抗體，SEQ ID NO: 99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181)；且 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367 (對於第I類抗體，SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273及275；對於第II類抗體，SEQ ID NO: 277、279、281及283；及對於第III類抗體，SEQ ID NO: 285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365及367)。
在某些態樣中，抗FIXa抗體包含來自特定生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗FIXa抗體之VH序列可來源於V、D或J生殖系序列中之任一種，及/或抗FIXa抗體之VL序列可來源於κ或λ生殖系序列中之任一種。
如本文所展示，已製備出對FIXa具有特異性之人類抗體，其包含作為人類生殖系基因之產物或來源於人類生殖系基因的重鏈可變區。因此，本文提供經分離之FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含作為選自由以下組成之群之人類VH生殖系基因之產物或來源於該人類VH生殖系基因的重鏈可變區：VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B、VH5-51及其任何組合。在特定實施例中，VH生殖系基因係選自由以下組成之群：VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4、VH5-51.1及其任何組合。
在其他態樣中，本文提供經分離之FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含作為選自由以下組成之群之人類VL生殖系基因之產物或來源於該人類VL生殖系基因的重鏈可變區：VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-01及其任何組合。在特定實施例中，該VL生殖系基因係選自由以下組成之群：VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20及其任何組合。
本文所描述之抗體包括含作為以上所列人類生殖系VH基因之一之產物或來源於該基因之重鏈可變區，且亦包含作為以上所列人類生殖系VK基因之一之產物或來源於該基因之輕鏈可變區，如圖中所示。
如本文所使用，若人類抗體之可變區係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則該抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列的重鏈及輕鏈可變區。該等系統包括以所關注抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以所關注抗原篩選在噬菌體上展示之人類免疫球蛋白基因庫。因此，作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較，及選擇序列最接近(亦即，最大一致性百分比)該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與該生殖系序列相比可含有胺基酸差異，此係歸因於例如天然存在之體細胞突變或有意引入之定點突變。然而，當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)進行比較時，所選人類抗體典型地與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列具有至少90%之胺基酸序列一致性，且含有將人類抗體鑑別為屬於人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%，或甚至是至少96%、97%、98%或99%一致。典型地，來源於特定人類生殖系序列之人類抗體將展示與人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列不超過10個胺基酸之差異。在某些情況下，人類抗體可展示與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (a1) VH包含與SEQ ID NO: 31至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 221至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-484之VH及VL)； (a2) VH包含與SEQ ID NO: 19至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 209至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-440之VH及VL)； (a3) VH包含與SEQ ID NO: 115至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 301至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-882之VH及VL)； (a4) VH包含與SEQ ID NO: 23至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 213至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-460之VH及VL)； (a5) VH包含與SEQ ID NO: 127至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 313至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-433之VH及VL)； (a6) VH包含與SEQ ID NO: 45至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 235至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-619之VH及VL)； (a7) VH包含與SEQ ID NO: 87至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 221至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-1335之VH及VL)；或 (a8) VH包含與SEQ ID NO: 89至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 221至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-1336之VH及VL)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分與BIIB-9-1336結合至相同抗原決定基。在其他態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至與BIIB-9-1336之抗原決定基重疊之抗原決定基。在一些實施例中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含至少一個位於FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號位置91與101、125與128、165與179或232與241之間之胺基酸的抗原決定基區(分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置76至88、112至115、153至167及222至231)。
如本文所使用，片語「胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基」及其語法變化形式係指藉由與絲胺酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶原之同源性描述FIX中之某些胺基酸。在本發明中，在絲胺酸蛋白酶結構域內之胰凝乳蛋白酶原編號係根據Hopfner等人(EMBO J. 1997; 16:6626-35)使用。對於本發明，僅在本文中明確指示時才使用胰凝乳蛋白酶原編號。所揭示之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基與SEQ ID NO: 758中胺基酸位置之間的對應性提供於下表中：
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基中之至少一個的抗原決定基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)。在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個選自由FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基組成之群之胺基酸殘基的抗原決定基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基的抗原決定基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至由以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基組成的抗原決定基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基N93、R165、N178及R233(分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置N78、R153、N166及R223)的抗原決定基。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至不包含以下至少一個FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基的抗原決定基：N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置N87、K121、Y126、R158、T160、F162、T163、H174、E192及G195)。在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至不包含以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基的抗原決定基：N100、K132、Y137、R170、T172、F174、T175、H185、E202及G205 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置N87、K121、Y126、R158、T160、F162、T163、H174、E192及G195)。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至包含FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中之至少一個胺基酸殘基的抗原決定基。在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分所結合的FIXa輕鏈(SEQ ID NO: 756)中之抗原決定基係K100。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合的抗原決定基包含以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)；及FIXa輕鏈序列 (SEQ ID NO: 756)之胺基酸殘基K100。在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合的抗原決定基由以下FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基：H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241 (分別對應於SEQ ID NO: 758中之位置H76、H77、N78、H88、D112、K113、E114、Y115、R153、Y165、N166、N167、S222、R223、Y224、V225、N226、W227、E230及K231)；及FIXa輕鏈序列(SEQ ID NO: 756)之胺基酸殘基K100組成。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合的抗原決定基與FVIIIa與FIXa之結合位點重疊。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與FVIIIa交叉競爭結合至FIXa。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分阻斷FVIIIa與FIXa之結合。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VH CDR1序列包含選自由表7中所揭示之VH CDR1序列組成之群的VH CDR1序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VH CDR1序列。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VH CDR2序列包含選自由表7中所揭示之VH CDR2序列組成之群的VH CDR2序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VH CDR2序列。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VH CDR3序列包含選自由表7中所揭示之VH CDR3序列組成之群的VH CDR3序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VH CDR3序列。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VL CDR1序列包含選自由表7中所揭示之VL CDR1序列組成之群的VL CDR1序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VL CDR1序列。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VL CDR2序列包含選自由表7中所揭示之VL CDR2序列組成之群的VL CDR2序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VL CDR2序列。
在一些態樣中，特異性結合至FIXa之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VL CDR3序列包含選自由表7中所揭示之VL CDR3序列組成之群的VL CDR3序列，或具有一個或兩個突變的表7中所揭示之VL CDR3序列。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3序列，以及VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該VH CDR1、CDR2及CDR3序列以及該VL CDR1、CDR2及CDR3序列分別包含表7中所揭示之VH CDR1、CDR2及CDR3序列以及VL CDR1、CDR2及CDR3序列。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFX1 SX2 X3 MX4 (SEQ ID NO: 2194)，其中X1 係S、G或E，X2 係Y或F，X3 係S、E、G或D，且X4 係N、V、A或T；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X5 ISX6 X7 X8 X9 X10 IYYADSVKG (SEQ ID NO: 2195)，其中X5 係S、A、Y或G，X6 係S或A，X7 係S、A或G，X8 係S、G或D，X9 係S、T或G，且X10 係Y或T；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDX11 GGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 2196)，其中X11 係L或V。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VL CDR1包含胺基酸序列QASQDIANYLN (SEQ ID NO: 2116)；及/或 (ii) 該VL CDR2包含胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 2142)；及/或 (iii) 該VL CDR3包含胺基酸序列QQYANFPYT (SEQ ID NO: 2168)。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFX1 SX2 X3 MX4 (SEQ ID NO: 2194)，其中X1 係S、G或E，X2 係Y或F，X3 係S、E、G或D，且X4 係N、V、A或T；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X5 ISX6 X7 X8 X9 X10 IYYADSVKG (SEQ ID NO: 2195)，其中X5 係S、A、Y或G，X6 係S或A，X7 係S、A或G，X8 係S、G或D，X9 係S、T或G，且X10 係Y或T；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDX11 GGYAGYYGMDV (SEQ ID NO: 2196)，其中X11 係L或V；且 進一步包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1包含胺基酸序列QASQDIANYLN (SEQ ID NO: 2116)；及/或VL CDR2包含胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 2142)；及/或VL CDR3包含胺基酸序列QQYANFPYT (SEQ ID NO: 2168)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括：VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2038至2047之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2064至2073之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2090至2099之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2116至2125之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2142至2151之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2168至2177之VL CDR3。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFGSYDMN (SEQ ID NO: 2048)；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列SISX1 X2 X3 SYIX4 YAX5 SVKG (SEQ ID NO: 2197)，其中X1 係S或D，X2 係G或S，X3 係E或A，X4 係Y或A，且X5 係E或D；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列X6 RDVX7 GYAGX8 YGMDV (SEQ ID NO: 2198)，其中X6 係A或V，X7 係G或S，且X8 係Y或F。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VL CDR1包含胺基酸序列X1 AX2 X3 X4 IX5 X6 YLN (SEQ ID NO: 2199)，其中X1 係Q、G或E，X2 係S或N，X3 係Q或E，X4 係D或Y，X5 係A或S，X6 係N或D；及/或 (ii) 該VL CDR2包含胺基酸序列DAX7 NLX8 X9 (SEQ ID NO: 2200)，其中X7 係S或A，X8 係E、H或Q，且X9 係T或Y；及/或 (iii) 該VL CDR3包含胺基酸序列X10 QYAX11 FPYT (SEQ ID NO: 2201)，其中X10 係Q或S，且X11 係N或R。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列FTFGSYDMN (SEQ ID NO: 2048)；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列SISX1 X2 X3 SYIX4 YAX5 SVKG (SEQ ID NO: 2197)，其中X1 係S或D，X2 係G或S，X3 係E或A，X4 係Y或A，且X5 係E或D；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列X6 RDVX7 GYAGX8 YGMDV (SEQ ID NO: 2198)，其中X6 係A或V，X7 係G或S，且X8 係Y或F；且 進一步包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中 (iv) 該VL CDR1包含胺基酸序列X1 AX2 X3 X4 IX5 X6 YLN (SEQ ID NO: 2199)，其中X1 係Q、G或E，X2 係S或N，X3 係Q或E，X4 係D或Y，X5 係A或S，X6 係N或D；及/或 (v) 該VL CDR2包含胺基酸序列DAX7 NLX8 X9 (SEQ ID NO: 2200)，其中X7 係S或A，X8 係E、H或Q，且X9 係T或Y；及/或 (vi) 該VL CDR3包含胺基酸序列X10 QYAX11 FPYT (SEQ ID NO: 2201)，其中X10 係Q或S，且X11 係N或R。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括：VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2048至2052之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2074至2078之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2100至2104之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2126至2130之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2152至2156之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2178至2182之VL CDR3。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列YTFX1 X2 YX3 MH (SEQ ID NO: 2202)，其中X1 係T或H，X2 係S、G或H，且X3 係Y或P；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X4 INPSX5 GX6 TX7 YAQKFQG (SEQ ID NO: 2203)，其中X4 係I或S，X5 係G或R，X6 係S或R，且X7 係S或E；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDGPX8 X9 X10 DYYMDV (SEQ ID NO: 2204)，其中X8 係R或Q，X9 係V、D、L或E，且X10 係S或V。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 2116)；及/或該VL CDR2包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 2116)；及/或(iii)該VL CDR3包含胺基酸序列QQRDNWPFT (SEQ ID NO: 2116)。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列YTFX1 X2 YX3 MH (SEQ ID NO: 2202)，其中X1 係T或H，X2 係S、G或H，且X3 係Y或P；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X4 INPSX5 GX6 TX7 YAQKFQG (SEQ ID NO: 2203)，其中X4 係I或S，X5 係G或R，X6 係S或R，且X7 係S或E；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDGPX8 X9 X10 DYYMDV (SEQ ID NO: 2204)，其中X8 係R或Q，X9 係V、D、L或E，且X10 係S或V；且 進一步包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 2116)；及/或該VL CDR2包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 2116)；及/或(iii)該VL CDR3包含胺基酸序列QQRDNWPFT (SEQ ID NO: 2116)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括：VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2053至2057之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2079至2083之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2105至2109之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2131至2135之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2157至2161之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2183至2187之VL CDR3。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列GSIX1 SX2 X3 YX4 WX5 (SEQ ID NO: 2205)，其中X1 係S或A，X2 係S、T、G或V，X3 係S或A，X4 係Y或A，且X5 係G、V、N或S；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X6 IX7 X8 X9 GX10 TX11 YNPSLKS (SEQ ID NO: 2206)，其中X6 係S或Y，X7 係S、Y、R、T或Q，X8 係Y、G、P或A，X9 係S或Q，X10 係S或K，且X11 係Y或Q；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDKYQDYSX12 DI，其中X12 係F或V (SEQ ID NO: 2207)。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR1包含胺基酸序列RASQGIDSWLA (SEQ ID NO: 2136)；及/或該VL CDR2包含胺基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 2162)；及/或該VL CDR3包含胺基酸序列QQANFLPFT (SEQ ID NO: 2188)。
在一些態樣中，經分離之抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、CDR2及CDR3，其中 (i) 該VH CDR1包含胺基酸序列GSIX1 SX2 X3 YX4 WX5 (SEQ ID NO: 2205)，其中X1 係S或A，X2 係S、T、G或V，X3 係S或A，X4 係Y或A，且X5 係G、V、N或S；及/或 (ii) 該VH CDR2包含胺基酸序列X6 IX7 X8 X9 GX10 TX11 YNPSLKS (SEQ ID NO: 2206)，其中X6 係S或Y，X7 係S、Y、R、T或Q，X8 係Y、G、P或A，X9 係S或Q，X10 係S或K，且X11 係Y或Q；及/或 (iii) 該VH CDR3包含胺基酸序列ARDKYQDYSX12 DI (SEQ ID NO: 2207)，其中X12 係F或V；且 進一步包含VL CDR1、CDR2及CDR3，其中該VL CDR1包含胺基酸序列RASQGIDSWLA (SEQ ID NO: 2136)；及/或該VL CDR2包含胺基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 2162)；及/或該VL CDR3包含胺基酸序列QQANFLPFT (SEQ ID NO: 2188)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含：VH CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2058至2063之VH CDR1、選自SEQ ID NO: 2084至2089之VH CDR2及選自SEQ ID NO: 2110至2115之VH CDR3；及/或VL CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含選自SEQ ID NO: 2136至2141之VL CDR1、選自SEQ ID NO: 2162至2167之VL CDR2及選自SEQ ID NO: 2188至2193之VL CDR3。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031及2035。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033及2037。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1935、1939、1943、1947、1951、1955、1959、1963、1967、1971、1975、1979、1983、1987、1991、1995、1999、2003、2007、2011、2015、2019、2023、2027、2031及2035；及/或 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1937、1941、1945、1949、1953、1957、1961、1965、1969、1973、1977、1981、1985、1989、1993、1997、2001、2005、2009、2013、2017、2021、2025、2029、2033及2037。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 89至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且該VL包含與SEQ ID NO: 221至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-1336之VH及VL)。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (a1) VH包含與SEQ ID NO: 1935至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1937至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a2) VH包含與SEQ ID NO: 1939至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1941至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a3) VH包含與SEQ ID NO: 1943至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1945至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a4) VH包含與SEQ ID NO: 1947至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1949至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a5) VH包含與SEQ ID NO: 1951至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1953至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a6) VH包含與SEQ ID NO: 1955至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1957至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a7) VH包含與SEQ ID NO: 1959至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1961至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a8) VH包含與SEQ ID NO: 1963至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1965至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a9) VH包含與SEQ ID NO: 1967至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1969至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a10) VH包含與SEQ ID NO: 1971至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1973至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a11) VH包含與SEQ ID NO: 1975至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1977至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a12) VH包含與SEQ ID NO: 1979至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1981至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a13) VH包含與SEQ ID NO: 1983至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1985至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a14) VH包含與SEQ ID NO: 1987至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1989至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a15) VH包含與SEQ ID NO: 1991至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1993至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a16) VH包含與SEQ ID NO: 1995至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 1997至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a17) VH包含與SEQ ID NO: 1999至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2001至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a18) VH包含與SEQ ID NO: 2003至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2005至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a19) VH包含與SEQ ID NO: 2007至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2009至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a20) VH包含與SEQ ID NO: 2011至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2013至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a21) VH包含與SEQ ID NO: 2015至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2017至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a22) VH包含與SEQ ID NO: 2019至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2021至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a23) VH包含與SEQ ID NO: 2023至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2025至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a24) VH包含與SEQ ID NO: 2027至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2029至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列； (a25) VH包含與SEQ ID NO: 2031至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2033至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；或 (a26) VH包含與SEQ ID NO: 2035至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 2037至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (a1) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1935及1937 (BIIB-9-3595)； (a2) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1939及1941 (BIIB-9-3601)； (a3) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1943及1945 (BIIB-9-3604)； (a4) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1947及1949 (BIIB-9-3617)； (a5) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1951及1953 (BIIB-9-3618)； (a6) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1955及1957 (BIIB-9-3621)； (a7) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1959及1961 (BIIB-9-3647)； (a8) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1963及1965 (BIIB-9-3649)； (a9) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1967及1969 (BIIB-9-3650)； (a10) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1971及1973 (BIIB-9-3654)； (a11) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1975及1977 (BIIB-9-3753)； (a12) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1979及1981 (BIIB-9-3754)； (a13) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1983及1985 (BIIB-9-3756)； (a14) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1987及1989 (BIIB-9-3764)； (a15) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1991及1993 (BIIB-9-3766)； (a16) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1995及1997 (BIIB-9-3707)； (a17) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 1999及2001 (BIIB-9-3709)； (a18) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2003及2005 (BIIB-9-3720)； (a19) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2007及2009 (BIIB-9-3727)； (a20) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2011及2013 (BIIB-9-3745)； (a21) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2015及2017 (BIIB-9-3780)； (a22) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2019及2021 (BIIB-9-3675)； (a23) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2023及2025 (BIIB-9-3681)； (a24) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2027及2029 (BIIB-9-3684)； (a25) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2031及2033 (BIIB-9-3698)；或 (a26) 該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 2035及2037 (BIIB-9-3704)。
在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體(例如BIIB-9-484)與FIXa之結合係鈣依賴性的。在其他態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體與FIXa之結合不依賴於鈣。在又其他態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體(例如BIIB-9-1336)與FIXa之結合係部分鈣依賴性的。
在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336，可增加FIXa之醯胺溶解活性。在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體(例如BIIB-9-1336，或包含BIIB-9-1336之雙特異性抗體)可增加FIXa之受質裂解(例如ADG299)速率。在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336與FIXa結合可使FIXa之醯胺溶解活性增加至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336與FIXa結合可使FIXa之醯胺溶解活性增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少120%、至少140%、至少160%、至少180%、至少200%、至少220%、至少240%、至少260%、至少280%、至少300%、至少320%、至少340%、至少360%、至少380%、至少400%、至少420%、至少440%、至少460%、至少480%或至少500%。
本發明提供一種增加FIXa之醯胺溶解活性之方法，該方法包括向有需要之受試者投予此處所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336或包含BIIB-9-1336之雙特異性抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體可增加抗凝血酶III (ATIII)之FIXa抑制速率。在一些態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體(例如BIIB-9-1336，或包含BIIB-9-1336之雙特異性抗體)可增加ATIII之FIXa抑制速率。在一些態樣中，使ATIII之FIXa抑制速率增加至少2倍、至少3倍或至少4倍。在其他態樣中，本文所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336與FIXa結合可使ATIII之FIXa抑制速率增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少120%、至少140%、至少160%、至少180%、至少200%、至少220%、至少240%、至少260%、至少280%、至少300%、至少320%、至少340%、至少360%、至少380%或至少400%。
本發明提供一種增加ATIII之FIXa抑制速率之方法，該方法包括向有需要之受試者投予此處所揭示之抗FIXa抗體，例如BIIB-9-1336或包含BIIB-9-1336之雙特異性抗體。(b) 抗 FIXz 結合分子
因此，本發明提供一種特異性結合至FIX酶原(FIXz)之抗體(例如經分離之抗體)或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分在FIXa及FIXz存在下優先結合至FIXz(「抗FIXz抗體或其抗原結合部分」)。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力高於該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至FIXa(例如游離FIXa或FIXa-SM)之結合親和力。
本發明亦提供一種經分離之抗FIXz抗體或其抗原結合部分，其結合至FIXz之結合親和力高於該抗FIXz抗體或其抗原結合部分結合至FIXa之結合親和力。在一些態樣中，如藉由生物膜層干涉(BLI)檢定所測定，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低、約95 nM或更低、約90 nM或更低、約85 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約65 nM或更低、約60 nM或更低、約55 nM或更低、約50 nM或更低、約45 nM或更低、約40 nM或更低、約35 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約15 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低，或約1 nM或更低之KD 結合至FIXz。在其他實施例中，抗FIXz抗體或其抗原結合部分以約10 nM或更低、約9 nM或更低、約8 nM或更低、約7 nM或更低、約6 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約3 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低，或約0.05 nM或更低之KD 結合至FIXz。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖3D中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該參考抗體係BIIB-9-578。
在其他態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分亦可稱為第IV類：相對於游離FIXa或FIXa-SM，優先結合至FIXz之抗FIXz抗體或其抗原結合部分(圖3D抗體)。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含 (i) 與選自由圖3D中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，胺基酸取代係保守胺基酸取代。在其他態樣中，胺基酸取代係回復突變。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含選自ARDKYQDYSFDI (SEQ ID NO: 1355；BIIB-9-578)之胺基酸序列。在一些態樣中，本文所揭示之VH CDR3序列可包含1、2或3個胺基酸取代。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含SEQ ID NO: 1355 (BIIB-9-578)且該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3D中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3包含SEQ ID NO: 1355 (BIIB-9-578)且該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3D中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分進一步包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖3D中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分進一步包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖3D中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分進一步包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖3D中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖3D中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
本發明亦提供一種優先結合至FIXz的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下圖3D中之抗體組成之群之抗FIXz抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-9-397、BIIB-9-578、BIIB-9-631或BIIB-9-612。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1346-1349、SEQ ID NO: 1350-1353及SEQ ID NO: 1354-1357之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(第IV類抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1358-1361、SEQ ID NO: 1362-1365及SEQ ID NO: 1366-1369之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(第IV類抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1347、SEQ ID NO: 1351及SEQ ID NO: 1355之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-9-578抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1359、SEQ ID NO: 1363及SEQ ID NO: 1367之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-9-578抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH，其中該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 183、185、187及189。
在一些態樣中，該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 369、371、373及375。
在一些態樣中，抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 183、185、187及189；且 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 369、371、373及375。
在某些態樣中，抗FIXz抗體包含來自特定生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗FIXz抗體之VH序列可來源於V、D或J生殖系序列中之任一種，及/或抗FIXz抗體之VL序列可來源於κ或λ生殖系序列中之任一種。
如本文所展示，已製備出對FIXz具有特異性之人類抗體，其包含作為人類生殖系基因之產物或來源於人類生殖系基因的重鏈可變區。因此，本文提供經分離之FIXz抗體或其抗原結合部分，其包含作為選自由以下組成之群之人類VH生殖系基因之產物或來源於該人類VH生殖系基因的重鏈可變區：VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B、VH5-51及其任何組合。在特定實施例中，VH生殖系基因係選自由以下組成之群：VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4、VH5-51.1及其任何組合。
在其他實施例中，本文提供經分離之FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含作為選自由以下組成之群之人類VL生殖系基因之產物或來源於該人類VL生殖系基因的重鏈可變區：VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20、VK4-01及其任何組合。在特定實施例中，該VL生殖系基因係選自由以下組成之群：VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20及其任何組合。
在一些態樣中，抗FIXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 185至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且該VL包含與SEQ ID NO: 371至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(分別為BIIB-9-578抗體之VH及VL)。(c) 抗 FXz 結合分子
本發明亦提供特異性結合FX之抗FX結合分子，例如抗FX抗體或包含其FX結合片段之分子。在本發明之一些態樣中，所揭示之抗FX結合分子，例如抗FX抗體或包含其FX結合片段之分子優先結合至FX酶原(FXz)(在本發明通篇稱為「抗FXz抗體」)。
因子X係分子量為58.5 kDa之維生素K依賴性糖蛋白，其係由肝細胞以酶原形式分泌至血漿中。最初，因子X係以由總計488個胺基酸組成的帶有信號肽之前原肽形式產生。以下提供FX酶原(FXz)之胺基酸序列(信號序列(1-23)加下劃線且原肽(24-40)加粗)：MGRPLHLVLLSASLAGLLLLGES LFIRREQANNILARVTRANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEAREVFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQNQGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTRKLCSLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGYTLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSVAQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENPFDLLDFNQTQPERGDNNLTRIVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGGTILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNTEQEEGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDIAVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAESTLMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLEVPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQEDACQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWGEGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTRGLPKAKSHAPEVITSSPLK (SEQ ID NO: 765)。
信號肽在輸出至內質網中期間由信號肽酶裂解去除。在成熟N末端鏈之N末端處的前11個麩胺酸殘基處發生γ羧基化之後，原肽序列經裂解去除。下一加工步驟係在Arg182與Ser183之間裂解。此加工步驟亦同時引起三肽Arg180-Lys181-Arg182之缺失。由此得到的分泌因子X酶原由在Cys172與Cys342之間經由二硫橋共價連接的含139個胺基酸之N末端輕鏈(M, 16,200)(亦即，SEQ ID NO: 765之胺基酸41至179)與含306個胺基酸之C末端重鏈(M, 42,000)(亦即，SEQ ID NO: 765之胺基酸183至488)組成。其他轉譯後加工步驟包括Asp103之b-羥基化以及N型及O型糖基化。
FX酶原可在其重鏈中由因子IXa在Arg234與Ile235(對應於SEQ ID NO: 765)之間裂解並在釋放活化肽後，因此變得活化。
術語「FX酶原」在本文中可與「FXz」、「FX前驅體」、「未活化FX」、「非活化之FX」或「非活化之FX前驅體」互換使用。在一個實施例中，FX酶原(FIXz)包括非活化FX前驅體，其中活化肽(例如表示為SEQ ID NO: 765(成熟序列編號)之胺基酸183至234的52個胺基酸之活化肽)未自該前驅體裂解。FIX酶原可包括任何天然存在或經工程改造之變異體。FX酶原之非限制性實例顯示於SEQ ID NO: 765中。在另一實施例中，FX酶原係不可活化FX (FXn)，其在因子FIXa存在下經工程改造成無活性。不可活化FX之實例可為在194位(成熟序列編號)帶有精胺酸變為丙胺酸之突變，由此防止其活化並使因子X維持酶原形式(FXz)的FX。FX酶原可視情況含有信號肽及/或原肽。
術語「活化FX」在本文中可與「FXa」互換使用。在一個實施例中，活化FX係野生型、天然存在之FXa(在本文中又稱為「野生型FXa」)。在另一實施例中，FXa包含非天然存在之FXa，例如FXa構象變異體。舉例而言，FXa可為FXa-SM，其係設計成具有與受質結合之FXa類似的構象。在一特定實施例中，FXa-SM係帶有共價結合至活性位點之受質模擬物的活化FX。
本發明提供一種特異性結合至FXz之抗體(例如經分離之抗體)或其抗原結合部分，其中該抗FX抗體或其抗原結合部分在FXz及FXa存在下優先結合至FXz。在一個實施例中，該FXa係共價連接至受質模擬物(亦即，Glu-Gly-Arg-氯甲基酮(EGR-CMK))之FXa。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。本發明亦提供一種經分離之抗FX抗體或其抗原結合部分，其結合至FXz之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力。
在一些態樣中，如藉由BLI檢定所測定，該抗FXz抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低、約95 nM或更低、約90 nM或更低、約85 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約65 nM或更低、約60 nM或更低、約55 nM或更低、約50 nM或更低、約45 nM或更低、約40 nM或更低、約35 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約15 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低，或約1 nM或更低之KD 結合至FXz。
在其他實施例中，抗FXz抗體或其抗原結合部分以約10 nM或更低、約9 nM或更低、約8 nM或更低、約7 nM或更低、約6 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約3 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低，或約0.05 nM或更低之KD 結合至FXz。在又其他實施例中，抗FXz抗體或其抗原結合部分以1 nM至100 nM、1 nM至90 nM、1 nM至80 nM、1 nM至70 nM、1 nM至60 nM、1 nM至50 nM、1 nM至40 nM、1 nM至30 nM、1 nM至20 nM、1 nM至10 nM、0.1 nM至100 nM、0.1 nM至90 nM、0.1 nM至80 nM、0.1 nM至70 nM、0.1 nM至60 nM、0.1 nM至50 nM、0.1 nM至40 nM、0.1 nM至30 nM、0.1 nM至20 nM、0.1 nM至10 nM，或0.1 nM至1 nM之KD 結合至FXz。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由圖12A及圖12B中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分與選自由以下組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基：BIIB-12-915、BIIB-12-917、BIIB-12-932及其任何組合。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分結合至與本文所揭示之任何抗FXz抗體或其抗原結合部分之抗原結合位點基本上相同的抗原結合位點(例如抗原決定基)。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分結合至與本文所揭示之抗FXz抗體或其抗原結合部分之抗原結合位點(例如抗原決定基)重疊的抗原結合位點(例如抗原決定基)。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列；或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，胺基酸取代係保守胺基酸取代或回復突變。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含胺基酸序列ARX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 FDX8 (SEQ ID NO: 766)，其中X1 係G或L，X2 係R或G，X3 係F或Y，X4 係P或G，X5 係R或A，X6 係G或S，X7 係R或A，且X8 係Y或I。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列由或基本上由胺基酸序列ARX1 X2 X3 RX4 X5 X6 X7 FDX8 (SEQ ID NO: 766)組成，其中X1 係G或L，X2 係R或G，X3 係F或Y，X4 係P或G，X5 係R或A，X6 係G或S，X7 係R或A，且X8 係Y或I。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含選自以下之胺基酸序列：ARGRFRPRGRFDY (SEQ ID NO: 1575，BIIB-12-917)、ARLGYRGASAFDI (SEQ ID NO: 1589，BIIB-12-932)或ARVGGGYANP (SEQ ID NO: 1573，BIIB-12-915)。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列由或基本上由以下組成： (i) 與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12A或圖12B中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
本發明亦提供一種特異性結合至FXz的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下組成之群之抗FXz抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-12-891、BIIB-12-892、BIIB-12-893、BIIB-12-895、BIIB-12-896、BIIB-12-897、BIIB-12-898、BIIB-12-899、BIIB-12-900、BIIB-12-901、BIIB-12-902、BIIB-12-903、BIIB-12-904、BIIB-12-905、BIIB-12-906、BIIB-12-907、BIIB-12-908、BIIB-12-909、BIIB-12-910、BIIB-12-911、BIIB-12-912、BIIB-12-913、BIIB-12-914、BIIB-12-915、BIIB-12-916、BIIB-12-917、BIIB-12-918、BIIB-12-919、BIIB-12-920、BIIB-12-921、BIIB-12-922、BIIB-12-923、BIIB-12-924、BIIB-12-926、BIIB-12-927、BIIB-12-928、BIIB-12-929、BIIB-12-930、BIIB-12-931、BIIB-12-932、BIIB-12-933、BIIB-12-934、BIIB-12-935、BIIB-12-936、BIIB-12-937、BIIB-12-1288、BIIB-12-1289、BIIB-12-1290、BIIB-12-1291、BIIB-12-1292、BIIB-12-1293、BIIB-12-1294、BIIB-12-1295、BIIB-12-1296、BIIB-12-1297、BIIB-12-1298、BIIB-12-1299、BIIB-12-1300、BIIB-12-1301、BIIB-12-1302、BIIB-12-1303、BIIB-12-1304、BIIB-12-1305、BIIB-12-1306、BIIB-12-1307、BIIB-12-1308、BIIB-12-1309、BIIB-12-1310、BIIB-12-1311、BIIB-12-1312、BIIB-12-1313、BIIB-12-1314、BIIB-12-1315、BIIB-12-1316、BIIB-12-1317、BIIB-12-1318、BIIB-12-1319、BIIB-12-1322、BIIB-12-1323、BIIB-12-1324、BIIB-12-1325、BIIB-12-1326、BIIB-12-1327、BIIB-12-1328、BIIB-12-1329、BIIB-12-1330、BIIB-12-1331、BIIB-12-1332,BIIB-12-1333或BIIB-12-1334。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1393、SEQ ID NO: 1483及SEQ ID NO: 1573之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-12-915抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、SEQ ID NO: 1753及SEQ ID NO: 1843之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-915抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1395、SEQ ID NO: 1485及SEQ ID NO: 1575之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-12-917抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、SEQ ID NO: 1755及SEQ ID NO: 1845之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-917抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1409、SEQ ID NO: 1499及SEQ ID NO: 1589之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列(BIIB-12-932抗體之VH CDR)，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、SEQ ID NO: 1769及SEQ ID NO: 1859之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列(BIIB-12-932抗體之VL CDR)。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553及555。
在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741及743。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553及555；且 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：565、567、569、571、573、575、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741及743。
在某些態樣中，抗FIXa抗體包含來自特定生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗FIXa抗體之VH序列可來源於V、D或J生殖系序列中之任一種，及/或抗FIXa抗體之VL序列可來源於κ或λ生殖系序列中之任一種。
如本文所展示，已製備出對FIXa具有特異性之人類抗體，其包含作為人類生殖系基因之產物或來源於人類生殖系基因的重鏈可變區。因此，提供一種抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B或VH5-51。在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20或VK4-01。在一些態樣中，該抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1，且該VL係來源於生殖系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些態樣中，該VH及/或該VL係來源於其經過親和力優化之對應生殖系。
本文所描述之抗體包括含作為以上所列人類生殖系VH基因之一之產物或來源於該基因之重鏈可變區，且亦包含作為以上所列人類生殖系VK基因之一之產物或來源於該基因之輕鏈可變區，如圖中所示。
如本文所使用，若人類抗體之可變區係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則該抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列的重鏈及輕鏈可變區。該等系統包括以所關注抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以所關注抗原篩選在噬菌體上展示之人類免疫球蛋白基因庫。因此，作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較，及選擇序列最接近(亦即，最大一致性百分比)該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與該生殖系序列相比可含有胺基酸差異，此係歸因於例如天然存在之體細胞突變或有意引入之定點突變。然而，當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)進行比較時，所選人類抗體典型地與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列具有至少90%之胺基酸序列一致性，且含有將人類抗體鑑別為屬於人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%，或甚至是至少96%、97%、98%或99%一致。典型地，來源於特定人類生殖系序列之人類抗體將展示與人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列不超過10個胺基酸之差異。在某些情況下，人類抗體可展示與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含至少一個VH，其中該VH包含選自SEQ ID NO: 423、427或455之序列，由該序列組成或基本上由該序列組成。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含至少一個VL，其中該VL包含選自SEQ ID NO: 611、615或643之序列，由該序列組成或基本上由該序列組成。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含至少一個VH及至少一個VL，其中 (i) 至少一個VH包含選自SEQ ID NO: 423、427或455之序列，由該序列組成或基本上由該序列組成；且 (ii) 至少一個VL包含選自SEQ ID NO: 611、615或643之序列，由該序列組成或基本上由該序列組成。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (b1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 423及611，由該序列組成或基本上由該序列組成； (b2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 427及615，由該序列組成或基本上由該序列組成；或 (b3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 455及643，由該序列組成或基本上由該序列組成。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 423至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且VL包含與SEQ ID NO: 611至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 427至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且VL包含與SEQ ID NO: 615至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗FXz抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 455至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且VL包含與SEQ ID NO: 643至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。
在某些態樣中，本發明之抗FXz抗體或其抗原結合部分不明顯結合至FXa。在其他態樣中，本發明之雙特異性分子包含特異性結合至FXz且不明顯結合至FXa之抗FXz抗體或其抗原結合部分，以及特異性結合至FIXz及FIXa兩者的抗FIX抗體。(d) 抗 FXa 結合分子
本發明提供一種特異性結合至活化因子X (FXa)之抗體(例如經分離之抗體)或其抗原結合部分，其中該抗FX抗體或其抗原結合部分在FXz及FXa存在下優先結合至FXa。在一個實施例中，該FXa係共價連接至受質模擬物(亦即，EGR-CMK)之FXa。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分結合至FXa之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力。本發明亦提供一種經分離之抗FX抗體或其抗原結合部分，其結合至FXa之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力。
在一些態樣中，如藉由BLI檢定所測定，該抗FXa抗體或其抗原結合部分以約100 nM或更低、約95 nM或更低、約90 nM或更低、約85 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約65 nM或更低、約60 nM或更低、約55 nM或更低、約50 nM或更低、約45 nM或更低、約40 nM或更低、約35 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約15 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低，或約1 nM或更低之KD 結合至FXa。
在其他實施例中，抗FXa抗體或其抗原結合部分以約10 nM或更低、約9 nM或更低、約8 nM或更低、約7 nM或更低、約6 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約3 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低，或約0.05 nM或更低之KD 結合至FXa。在又其他實施例中，抗FXa抗體或其抗原結合部分以1 nM至100 nM、1 nM至90 nM、1 nM至80 nM、1 nM至70 nM、1 nM至60 nM、1 nM至50 nM、1 nM至40 nM、1 nM至30 nM、1 nM至20 nM、1 nM至10 nM、0.1 nM至100 nM、0.1 nM至90 nM、0.1 nM至80 nM、0.1 nM至70 nM、0.1 nM至60 nM、0.1 nM至50 nM、0.1 nM至40 nM、0.1 nM至30 nM、0.1 nM至20 nM、0.1 nM至10 nM，或0.1 nM至1 nM之KD 結合至FXa。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與選自由圖12C中之抗體組成之群之參考抗體結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分與參考抗體，即BIIB-12-925結合至相同抗原決定基。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分結合至與本文所揭示之任何抗FXa抗體或其抗原結合部分之抗原結合位點基本上相同的抗原結合位點(例如抗原決定基)。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分結合至與本文所揭示之抗FXa抗體或其抗原結合部分之抗原結合位點(例如抗原決定基)重疊的抗原結合位點(例如抗原決定基)。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含 (i) 與選自由圖12C中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中之VH CDR3序列組成之群之VH CDR3序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，胺基酸取代係保守胺基酸取代或回復突變。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含如(SEQ ID NO: 1919；BIIB-12-925)所陳述之胺基酸序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (i) 與選自由圖12C中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (i) 與選自由圖12C中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中所揭示之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (i) 與選自由圖12C中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (i) 與選自由圖12C中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (i) 與選自由圖12C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列由或基本上由以下組成： (i) 與選自由圖12C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (ii) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由圖12C中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
本發明亦提供一種特異性結合至FXa的經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3包含選自由以下組成之群之抗FXa抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：BIIB-12-894、BIIB-12-925、BIIB-12-1320或BIIB-12-1321。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 1911、SEQ ID NO: 1915及SEQ ID NO: 1919之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、SEQ ID NO: 1927及SEQ ID NO: 1931之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 557、559、561及563。
在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO: 745、747、749及751。
在一些態樣中，抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中 (i) 該VH包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 557、559、561及563；且 (ii) 該VL包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 745、747、749及751。
在某些態樣中，抗FIXa抗體包含來自特定生殖系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定生殖系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗FXa抗體之VH序列可來源於V、D或J生殖系序列中之任一種，及/或抗FXa抗體之VL序列可來源於κ或λ生殖系序列中之任一種。
如本文所展示，已製備出對FXa具有特異性之人類抗體，其包含作為人類生殖系基因之產物或來源於人類生殖系基因的重鏈可變區。因此，提供一種抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18、VH1-46、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-31、VH4-39、VH4-0B或VH5-51。在一些態樣中，抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VL係來源於生殖系序列VK1-05、VK1-12、VK1-39、VK2-28、VK3-11、VK3-15、VK3-20或VK4-01。在一些態樣中，該抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH係來源於生殖系序列VH1-18.0、VH1-18.1、VH1-18.8、VH1-46.0、VH1-46.4、VH1-46.5、VH1-46.6、VH1-46.7、VH1-46.8、VH1-46.9、VH3-21.0、VH3-23.0、VH3-23.2、VH3-23.6、VH3-30.0、VH4-31.5、VH4-39.0、VH4-39.5、VH4-0B.4或VH5-51.1，且該VL係來源於生殖系序列VK1-05.6、VK1-05.12、VK1-12.0、VK1-12.4、VK1-12.7、VK1-12.10、VK1-12.15、VK1-39.0、VK1-39.3、VK1-39.15、VK2-28.0、VK2-28.1、VK2-28.5、VK3-11.0、VK3-11.2、VK3-11.6、VK3-11.14、VK3-15.0、VK3-15.8、VK3-15.10、VK3-20.0、VK3-20.1、VK3-20.4、VK3-20.5、VK4-01.0、VK4-01.4、VK4-01.20。在一些態樣中，該VH及/或該VL係來源於其經過親和力優化之對應生殖系。
在一些態樣中，抗FXa抗體或其抗原結合部分包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO: 559至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且VL包含與SEQ ID NO: 747至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。(e) 共同態樣
本發明之某些態樣係關於本文所揭示之抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)及抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)，其包含本文所揭示之VH及VL CDR序列，又含有來自本文所揭示之抗體的不同構架序列。可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNA資料庫或已出版文獻獲得此等構架序列。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可見於網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat, E. A.等人, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M.等人, (1992) 「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」Mol. Biol. 227:776-798；及Cox, J. P. L.等人, (1994) 「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」 Eur. J Immunol. 24:827-836中；該等文獻各自之內容以引用之方式清楚地併入本文中。
用於本文所描述之抗體中的例示性構架序列係結構與本文所描述之抗體所使用之構架序列類似的構架序列 VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植至與得到構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所見的序列具有一致序列之構架區上，或者CDR序列可移植至與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些情形中，使構架區內之殘基突變以保持或增強抗體之抗原結合能力係有益的(參見例如，頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
本文所描述的經經工程改造之抗體包括已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾例如以改良抗體特性之抗體。典型地作該等構架修飾以降低該抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法係使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更具體言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有與由得到該抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將抗體構架序列與得到該抗體之生殖系序列相比較來鑑別。為了使構架區序列恢復成其生殖系構型，可藉由例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發使體細胞突變「回復突變」成生殖系序列。亦意圖涵蓋該等「回復突變」之抗體。另一種類型之構架修飾包含使該構架區內，或甚至使一或多個CDR區內之一或多個殘基突變以去除T細胞抗原決定基，由此降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
另一類可變區修飾係使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變以由此改良所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且對抗體結合或其他所關注之功能特性之影響可以如本文中所描述及實例中所提供之活體外或活體內檢定來評估。在一些實施例中，引入保守修飾(如上文所論述)。該等突變可為胺基酸取代、增加或缺失。此外，典型地CDR區內不超過1個、2個、3個、4個或5個殘基經改變。
在一些態樣中，抗體CDR中之甲硫胺酸殘基可經氧化，引起潛在化學降解且由此降低抗體之效力。因此，亦提供重鏈及/或輕鏈CDR中之一或多個甲硫胺酸殘基經未經歷氧化降解之胺基酸殘基置換的抗FIX/FX抗體。在一個實施例中，本文所揭示之抗體之CDR中的甲硫胺酸殘基經未經歷氧化降解之胺基酸殘基置換。類似地，可自任何抗體，特別是CDR中移除脫醯胺位點。
在某些態樣中，本文所揭示的抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)及抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)中之任一種可為IgG。在一些態樣中，該IgG係IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體。在一些態樣中，本文所揭示的抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)及抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)中之任一種係IgG4抗體。在一些態樣中，本文所揭示的抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)及抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)包含無效應物IgG4 Fc。
在一些態樣中，抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)之重鏈恆定區或其片段係IgG恆定區。在一些態樣中，IgG恆定區或其片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。在一些態樣中，抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)包括含輕鏈恆定區(LC)之VL，其中該LC恆定區係κ恆定區。在一些態樣中，抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)包括含輕鏈恆定區(LC)之VL，其中該LC恆定區係λ恆定區。
在一些態樣中，抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)包含重鏈恆定區(CH)。在一些態樣中，抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)包含CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域。
在一些態樣中，其FIX或FX抗原結合部分包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv (scFv)。在其他態樣中，其FIX或FX抗原結合部分包含Fd、scFv、二硫鍵穩定之scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgG CH2、微型抗體、F(ab')3 、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
在一些態樣中，本文所揭示之抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為單特異性的。在其他態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為雙特異性、三特異性、四特異性的，等等。在其他態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為多特異性的。在一些態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為單價、二價、三價、四價的，等等。在又其他態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為多價的。在特定態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為二價的，例如包含若干特異性抗原結合位點之抗體。在特定態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為雙特異性的，亦即，該分子可特異性結合至兩種不同抗原(例如在相同或不同分子上之兩個不同抗原決定基)。在一些特定態樣中，該抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)為二價且雙特異性的，例如包含能夠結合至兩種不同抗原(例如在相同或不同分子上之兩個不同抗原決定基)之四個雙結合位點的抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)或抗FX抗體(例如抗FXa抗體或抗FXz抗體)係人類抗體、經工程改造之抗體、嵌合抗體、人類化抗體或優化抗體。在一些態樣中，該優化抗體係親和力優化之抗體。在一些態樣中，該抗體之所需物理化學或功能特性，例如延長之血漿半衰期、較少聚集、熱穩定性等已得到優化。 III. 雙特異性抗FIXa/抗FXz結合分子
本發明亦提供包含抗FIX特異性(例如本文所揭示之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，或本文所揭示之抗FIXz抗體或其抗原結合部分)與具有第二結合特異性之分子相連接的雙特異性分子。亦提供包含抗FX特異性(例如本文所揭示之抗FXz抗體或其抗原結合部分，或本文所揭示之抗FXa抗體或其抗原結合部分)與具有第二結合特異性之分子相連接的雙特異性分子。亦提供一種雙特異性分子，其包含(i)抗FIX特異性(例如本文所揭示之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，或本文所揭示之抗FIXz抗體或其抗原結合部分)與(ii)抗FXz特異性(例如本文所揭示之抗FXz抗體或其抗原結合部分，或本文所揭示之抗FXa抗體或其抗原結合部分)相連接。本文所揭示之雙特異性分子不侷限於具有免疫球蛋白架構或由抗體例如藉由重排結構域得到之結構的雙特異性分子。本文所揭示之雙特異性分子亦包含上面移植有本文所揭示之CDR或其組合的分子支架(例如纖連蛋白III或肌腱蛋白-C支架)。
在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FX抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。在其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3B中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3C中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。
在某些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3D中之抗FIXz抗體組成之群的抗FIXz抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。
本發明之其他態樣亦提供與參考雙特異性抗體交叉競爭之雙特異性分子，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。在一些實施例中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3B中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。在其他實施例中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3C中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。在又其他實施例中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體交叉競爭，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3D中之抗FIXz抗體組成之群的抗FIXz抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。
在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。在其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3B中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。在又其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3C中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。
在一些其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3D中之抗FIXz抗體組成之群的抗FIXz抗體之VH及VL，以及選自由圖12A及圖12B中之抗FXz抗體組成之群的抗FXz抗體之VH及VL。在又其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3D中之抗FIXz抗體組成之群的抗FIXz抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。
在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3A中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。在一些態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3B中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。在其他態樣中，該雙特異性分子與參考雙特異性抗體結合至相同抗原決定基，其中該參考雙特異性抗體包含選自由圖3C中之抗FIXa抗體組成之群的抗FIXa抗體之VH及VL，以及選自由圖12C中之抗FXa抗體組成之群的抗FXa抗體之VH及VL。
在一些態樣中，該雙特異性分子包含 (i) 抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3係選自由圖3A、3B、3C及3D中之抗FIXa (BIIB-9)抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3(例如圖15A、15B、15C及15D之CDR)組成之群；且 (ii) 抗FX抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3係選自由圖12A及12B中之抗FX (BIIB-12)抗體的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3(例如圖15A、15B、15C及15D之CDR)組成之群。
在一些態樣中，該雙特異性分子包含 (a) 抗FIX抗體或其抗原結合部分，其包含： (a1) 分別包含SEQ ID NO: 815、860或905之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 950、995或1040之VL CDR1、CDR2及CDR3序列；(BIIB-9-484) (a2) 分別包含SEQ ID NO: 822、867或912之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 957、1002或1047之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-9-619) (a3) 分別包含SEQ ID NO: 1347、1351或1355之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1359、1363或1367之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-9-578) (a4) 分別包含SEQ ID NO: 843、888或933之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 978、1023或1068之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-9-1335)或 (a5) 分別包含SEQ ID NO: 844、889或934之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 979、1024或1069之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-9-1336)及 (b) 抗FX抗體或其抗原結合部分，其包含： (b1) 分別包含SEQ ID NO: 1393、1483或1573之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1663、1753或1843之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-12-915) (b2) 分別包含SEQ ID NO: 1395、1485或1575之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1665、1755或1845之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-12-917) (b3) 分別包含SEQ ID NO: 1911、1915或1919之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1923、1927或1931之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-12-925) (b4) 分別包含SEQ ID NO: 1409、1499或1589之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1679、1769或1859之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列；(BIIB-12-932)或 (b5) 分別包含SEQ ID NO: 1433、1523或1613之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3序列，及/或分別包含SEQ ID NO: 1703、1793或1883之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列。(BIIB-12-1306)
在一些態樣中，該雙特異性分子包含 (a) 抗FIX抗體或其抗原結合部分，其包含： (a1) 分別包含SEQ ID NO: 31及221之VH及VL；(BIIB-9-484) (a2) 分別包含SEQ ID NO: 45及235之VH及VL；(BIIB-9-619) (a3) 分別包含SEQ ID NO: 185及371之VH及VL；(BIIB-9-578) (a4) 分別包含SEQ ID NO: 87及221之VH及VL；(BIIB-9-1335)或 (a5) 分別包含SEQ ID NO: 89及221之VH及VL；(BIIB-9-1336) (b) 抗FX抗體或其抗原結合部分，其包含： (b1) 分別包含SEQ ID NO: 423及611之VH及VL；(BIIB-12-915) (b2) 分別包含SEQ ID NO: 427及615之VH及VL；(BIIB-12-917) (b3) 分別包含SEQ ID NO: 559及747之VH及VL；(BIIB-12-925) (b4) 分別包含SEQ ID NO: 455及643之VH及VL；(BIIB-12-932)或 (b5) 分別包含SEQ ID NO: 503及691之VH及VL。(BIIB-12-1306)
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIX抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FIXa或抗FIXz抗體或其抗原結合部分)及抗FX抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FXz或抗FXa抗體或其抗原結合部分)，其中 (i) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611的VH及VL (BIIB-12-915)； (ii) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)； (iii) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747的VH及VL (BIIB-12-925)； (iv) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 31及221的VH及VL (BIIB-9-484)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 455及643的VH及VL (BIIB-12-932)；或 (v) 該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371的VH及VL (BIIB-9-578)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 423及611的VH及VL (BIIB-12-915)； (vi) 該抗FIXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 185及371的VH及VL (BIIB-9-578)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)； (vii) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235的VH及VL (BIIB-9-619)；且該抗FXz抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 427及615的VH及VL (BIIB-12-917)；或 (viii) 該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 45及235的VH及VL (BIIB-9-619)；且該抗FXa抗體或其抗原結合部分包括分別包含SEQ ID NO: 559及747的VH及VL (BIIB-12-925)。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH包含與表6中所揭示之VH序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列且VL包含與表6中所揭示之VL序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR1序列包含 (iii) 與選自由表7中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列，或 (iv) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中所揭示之VH CDR1序列組成之群之序列一致的VH CDR1序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR2序列包含 (iii) 與選自由表7中之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列，或 (iv) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中之VH CDR2序列組成之群之序列一致的VH CDR2序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中該VH CDR3序列包含 (iii) 與選自由表7中所揭示之VH CDR3序列組成之群之序列一致的VH CDR3序列，或 (iv) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中所揭示之VH CDR3序列組成之群之序列一致的VH CDR3序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR1序列包含 (v) 與選自由表7中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列，或 (vi) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中所揭示之VL CDR1序列組成之群之序列一致的VL CDR1序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR2序列包含 (v) 與選自由表7中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列，或 (vi) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中之VL CDR2序列組成之群之序列一致的VL CDR2序列。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VL CDR3序列包含 (v) 與選自由表7中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列，或 (vi) 除1、2或3個胺基酸取代外與選自由表7中所揭示之VL CDR3序列組成之群之序列一致的VL CDR3序列。
在一些態樣中，該抗FIXa抗體或其抗原結合部分包含選自表7中所示之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
本發明之一些態樣係關於特異性結合至FIX及FX且接著在至少一種活化因子VIII (FVIIIa)活性檢定中在功能上模擬FVIIIa輔因子之雙特異性分子。在一些態樣中，該FVIIIa活性檢定係選自發色FXa產生檢定、一期凝血檢定或其組合。本發明之另一態樣包括一種雙特異性分子，其相對於游離FIXa或FIX酶原，優先結合至FIXa (例如呈因子X活化酶複合物形式之FIXa，例如FIXa-SM)且相對於FXa (例如FXa-SM)，優先結合至FX酶原且模擬活化因子VIII輔因子活性。
在一些實施例中，該FVIIIa活性達到在相同檢定中FVIII另外所達到之活性的至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約105%、至少約110%、至少約115%、至少約120%、至少約125%、至少約130%、至少約135%、至少約140%、至少約145%、至少約150%、至少約155%、至少約160%、至少約165%、至少約170%、至少約175%、至少約180%、至少約185%、至少約190%、至少約195%或至少約200%。
在其他實施例中，該雙特異性分子能夠在活體外或活體內由凝血酶原產生凝血酶、由纖維蛋白原產生纖維蛋白，及/或產生纖維蛋白凝塊。在一些實施例中，如藉由BLI所測定，該雙特異性分子同時結合至FIXa及FX兩者。
在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIX抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FIXa或抗FIXz抗體或其抗原結合部分)及抗FX抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FXz或抗FXa抗體或其抗原結合部分)，其中如在FXa產生檢定中所量測，該雙特異性分子在無磷脂存在下顯示活性之明顯損失。在一些態樣中，雙特異性分子包含抗FIXa抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FIXa或抗FIXz抗體或其抗原結合部分)及抗FX抗體或其抗原結合部分(亦即，抗FXz或抗FXa抗體或其抗原結合部分)。在一些態樣中，在FXa產生檢定中若不存在磷脂則使活性相對於在磷脂存在下所量測之活性損失至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。在一些態樣中，相較於以全文引用之方式併入本文中的美國專利第8,062,635號中所揭示之參考雙特異性抗體(例如艾美珠單抗，ACE910)的不依賴於磷脂之活性，該雙特異性分子顯示極小的不依賴於磷脂之活性。在一些態樣中，在FXa產生檢定中，在無磷脂存在下，本文所揭示之雙特異性分子顯示的活性係所觀察到的美國專利第8,062,635號中所揭示之參考雙特異性抗體(例如艾美珠單抗，ACE910)之活性的不到約20%、不到約15%、不到約10%或不到約5%。
在一些態樣中，在以因子XIa觸發之凝血酶產生檢定中，本文所揭示之雙特異性分子在所測試之合成磷脂囊泡由磷脂醯絲胺酸(PS)/磷脂醯乙醇胺(PE)/磷脂醯膽鹼(PC)(20%/40%/40%)構成時顯示的活性高於在所測試之合成磷脂囊泡由PS/PC (20%/80%)構成時的活性。在一些態樣中，在以因子XIa觸發之凝血酶產生檢定中，本文所揭示之雙特異性分子在含PE之磷脂囊泡(例如PS/PE/PC 20%/40%/40%)存在下的活性比在相同實驗條件下在不含PE之囊泡(例如PS/PC 20%/80%)存在下所觀察到的活性高至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少約220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%。
在一些態樣中，支持本發明雙特異性分子之峰值活性的磷脂濃度高於支持rFVIII之峰值活性的磷脂濃度。
在一些態樣中，該雙特異性分子屬於IgG同型。在一些態樣中，該IgG同型屬於IgG1亞類。在一些態樣中，該IgG同型屬於IgG4亞類。
在一些態樣中，該雙特異性分子具有雙特異性IgG形式且選自由表2中之雙特異性抗體組成之群。在一些態樣中，該雙特異性分子具有雙特異性異二聚體形式。
在一些態樣中，該雙特異性分子包含兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈。在一些態樣中，該雙特異性分子包含兩條相同輕鏈及兩條不同重鏈。
在一些態樣中，該雙特異性分子能夠控制或降低患有血友病之受試者出血發作之發生率。在一些態樣中，該雙特異性分子能夠維持患有血友病之受試者之動態平衡。
在一些態樣中，該雙特異性分子能夠向患有血友病之受試者提供常規預防。在一些態樣中，該受試者已產生或預期會產生針對因子VIII之中和抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之雙特異性分子(例如抗體)係對至少兩個不同位點具有結合特異性且可呈任何形式的(單株)雙特異性抗體。近期已開發出多種重組抗體形式，例如二價、三價或四價雙特異性抗體。實例包括IgG抗體形式與單鏈結構域之融合物(有關不同形式，參見例如Coloma, M.J.等人, Nature Biotech 15 (1997), 159-163；WO 2001/077342；Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007), 1233-1234；Holliger. P.等人, Nature Biotech. 23 (2005), 1 126-1 136；Fischer, N.及Leger, O., Pathobiology 74 (2007), 3-14；Shen, J.等人, J. Immunol. Methods 318 (2007), 65-74；Wu, C等人, Nature Biotech. 25 (2007), 1290-1297)。
本文之雙特異性抗體或片段亦包括根據以下中所揭示之方法製造的二價、三價或四價雙特異性抗體：WO2009/080251；WO2009/080252；WO 2009/080253；WO2009/080254；WO2010/112193；WO2010/115589；WO2010/136172；WO2010/145792；WO2010/145793；及WO2011/117330，皆以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，本文所揭示之雙特異性分子，例如抗體包含Fd、scFv、二硫鍵穩定之scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgG-CH2、微型抗體、F(ab')3 、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
本文所揭示之雙特異性抗體可為雙特異性的，甚至是在存在超過兩個結合結構域(亦即，該抗體係三價或多價的)之情況下亦然。雙特異性抗體包括例如多價單鏈抗體、雙鏈抗體及三鏈抗體，以及具有經一或多個肽連接子連接至其他抗原結合結構域(例如單鏈Fv、VH結構域及/或VL結構域、Fab或(Fab)2)的全長抗體之恆定結構域結構之抗體。該等抗體可為來自單一物種之全長抗體，或為嵌合抗體或人類化抗體。對於具有超過兩個抗原結合結構域之抗體而言，一些結合結構域可為相同的，只要蛋白質具有針對兩種不同抗原之結合結構域即可。
如本申請案內所使用，術語「價態」表示抗體分子中指定數量結合結構域之存在。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示在抗體分子中分別存在兩個結合結構域、四個結合結構域及六個結合結構域。本文所揭示之雙特異性抗體係至少「二價」的且可為「三價」或「多價」(例如「四價」或「六價」)的。在一些態樣中，根據本發明之雙特異性抗體係二價、三價或四價的。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於，具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello, Nature 305: 537 (1983))，WO 93/08829及Traunecker等人, EMBO J. 10: 3655 (1991))；及「孔中節」工程改造(參見例如，美國專利第5,731,168號；美國公開案第2011/0287009號)。多特異性抗體也可以通過以下方式製備：工程改造靜電牽引作用以製備抗體Fc-異二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如，美國專利第4,676,980號，及Brennan等人, Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈或捲曲螺旋製造雙特異性抗體(參見例如，Kostelny等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)及WO201 1/034605)；使用弗林蛋白酶(furin)裂解單一VH/VL單元中CL結構域與VH結構域之間的繫栓(參見例如，WO2013/119966及WO2013/055958)；使用「雙鏈抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參見例如，Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；使用免疫球蛋白結構域交換製備雙特異性抗體(參見例如WO2009/080251)；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如，Gruber等人, J. Immunol.,152:5368 (1994))；以及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人,J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述。
在本發明之上下文中，雙特異性結合分子可涉及包含兩個抗體源性結合結構域之抗體分子，其中一個結合結構域可為scFv。該等結合結構域之一由能夠特異性結合至第一靶分子(例如FIXa)/與第一靶分子(例如FIXa)相互作用之抗體、抗體片段或其衍生物之可變區(或其部分)組成。第二結合結構域由能夠特異性結合至第二靶分子(例如FXz)/與第二靶分子(例如FXz)相互作用之抗體、抗體片段或其衍生物之可變區(或其部分)組成。
雙特異性抗體分子中之兩個結構域/區域較佳彼此共價連接。此連接可直接實現，例如結構域1[對第一(人類)靶分子，例如FIXa具有特異性]-結構域2[對第二(人類)靶分子，例如FXz具有特異性]或反之亦然。在其他態樣中，此連接可經由另外的多肽連接子序列實現，[結構域l]-[連接子序列]-[結構域2]。
在使用連接子之情況下，此連接子在本發明之情形中具有足以確保第一及第二結構域各自可彼此獨立地保持其不同結合特異性之長度及序列。在本發明之情形中，該另外的多肽連接子序列亦可為抗體本身之片段，其可例如為Fc部分或者抗體之一或多個恆定結構域。
在本發明之情形中，結合結構域1亦可為抗體臂1之一部分且結合結構域2亦可為抗體臂2之一部分，或反之亦然，其中該兩個抗體臂經由界面連接。抗體臂1由能夠特異性結合至(人類)靶分子1/與(人類)靶分子1相互作用之抗體、抗體片段或其衍生物之可變區(或其部分)組成。抗體臂2由能夠特異性結合至(人類)靶分子2/與(人類)靶分子2相互作用之抗體、抗體片段或其衍生物之可變區(或其部分)組成。
「界面」包含第一抗體臂中與第二抗體臂之界面中的一或多個「接觸」胺基酸殘基(或其他非胺基酸基團)相互作用的接觸胺基酸殘基(或其他非胺基酸基團，諸如碳水化合物基團)。較佳界面係免疫球蛋白之結構域，諸如抗體重鏈之恆定結構域(或其區域)，其中經由界面之結合/相互作用實現兩個抗體臂之異二聚化。參見例如，Ridgway等人(1996) Protein Eng. 9:617-621；國際公開案第WO 96/027011號；Merchant等人(1998) Nature Biotech. 16:677-681；Atwell等人(1997) J. Mol. Biol. 270:26-35；歐洲專利申請案EP1870459Al；及國際公開案第WO2007/147901號、第WO2009/089004號及第WO 2010/129304號，皆以全文引用之方式併入本文中。
根據本發明使用之雙特異性抗體分子可使用此項技術中已知之習知技術，例如藉由使用單獨或組合的胺基酸缺失、插入、取代、添加及/或重組及/或此項技術中已知之任何其他修飾進一步修飾。用於在免疫球蛋白鏈之胺基酸序列之潛在DNA序列中引入此類修飾的方法係熟習此項技術者熟知的，參見例如Sambrook (1989), 見以上引述。所述Ig源性結構域之片段或衍生物確定(多)肽，該等(多)肽係以上抗體分子之一部分及/或藉由化學/生物化學或分子生物學方法進行修飾。相應方法係此項技術中已知的且尤其描述於實驗室手冊中(參見Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版(1989)及第3版(2001)；Gerhardt等人, Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press ( 1994)；Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997)；Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))。
本文所揭示之雙特異性分子可包含例如以下組分中之一或多種： (i) 「單鏈Fv」或「scFv」：具有抗體VH及VL結構域之抗體片段，其中該等結構域係以單一多肽鏈形式存在。一般而言，scFv多肽另外包含在VH與VL結構域之間的多肽連接子，該連接子使sFv能夠形成抗原結合所希望的結構。所描述的有關產生單鏈抗體之技術描述於例如Pluckhun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , Rosenburg and Moore編, Springer-Verlag, N.Y. 113 (1994), 269-315中。 (ii) 「Fab片段」：由一條輕鏈以及一條重鏈的CH1及可變區構成。Fab分子之重鏈無法與另一重鏈分子形成二硫鍵。 (iii) 「Fab'片段」：含有一條輕鏈以及一條重鏈的一部分，該重鏈之一部分含有VH結構域和CH1結構域以及在CH1與CH2結構域之間的區域，由此可以在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵，從而形成F(ab')2 分子。 (iv) 「F(ab')2 片段」：含有兩條輕鏈以及兩條重鏈，該兩條重鏈含有在CH1與CH2結構域之間之恆定區的一部分，由此在該兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')2 片段是由經兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。「Fv區」包含來自重鏈及輕鏈的可變區，但缺乏恆定區。
應注意的是，本文所揭示之雙特異性分子除本文所定義之第一(Ig源性)結構域及(Ig源性)第二結構域外，亦可包含另外的結構域，例如用於分離及/或製備重組產生之構築體。 IV. 抗體恆定區
本文所述的呈單特異性、雙特異性或多特異性分子之抗FIX可變區(例如抗FIXa可變區或抗FIXz可變區)及/或抗FX可變區(例如抗FXa可變區或抗FXz可變區)可連接(例如共價連接或融合)至Fc，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可屬於任何同種異型或異種型，例如對於IgGl：Glm、Glml(a)、Glm2(x)、Glm3(f)、Glml7(z)；對於IgG2：G2m、G2m23(n)；對於IgG3：G3m、G3m21(gl)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(bl)、G3ml3(b3)、G3ml4(b4)、G3ml0(b5)、G3ml5(s)、G3ml6(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；及對於K：Km、Kml、Km2、Km3 (參見例如，Jefferies等人(2009) mAbs 1:1)。
在某些實施例中，本文所描述之抗FIX或抗FX可變區連接至結合於一或多種活化Fc受體(Fcγl、Fcγlla或Fcγllla)之Fc且因此刺激ADCC。在某些實施例中，本文所描述之抗FIX或抗FX可變區連接至無效應物或主要無效應物Fc，例如IgG2或IgG4。
本文所描述之抗FIX或抗FX可變區可連接至非天然存在之Fc區，例如無效應物Fc或與一或多種活化Fc受體(Fcγl、Fcγlla或Fcγllla)之結合增強的Fc。
一般而言，本文所描述之可變區可連接至包含一或多個修飾之Fc，典型地以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞之細胞毒性。此外，本文所描述之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化、改變抗體之一或多種功能特性。以下進一步詳細描述此等實施例中之每一個。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。
Fc區涵蓋來源於免疫球蛋白，較佳人類免疫球蛋白之恆定區，包括恆定區之片段、類似物、變異體、突變體或衍生物。適合免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4及其他類別，諸如IgA、IgD、IgE及IgM。免疫球蛋白之恆定區定義為與免疫球蛋白C末端區域同源的天然存在或合成產生之多肽，且可包括單獨或組合之CH1結構域、鉸鏈、CH2結構域、CH3結構域或CH4結構域。
免疫球蛋白恆定區負責許多重要的抗體功能，包括Fc受體(FcR)結合及補體固定。重鏈恆定區有五個主要類別，歸類為IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，各自具有由同型指定之特徵性效應功能。距離而言，IgG分成稱為IgGl、IgG2、IgG3及IgG4之四個亞類。Ig分子與多種類別之細胞受體相互作用。舉例而言，IgG分子與對IgG類別抗體具有特異性之三類Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII及FcγRIII相互作用。據報告，IgG與FcγR受體結合之重要序列位於CH2及CH3結構域中。抗體之血清半衰期受該抗體結合至Fc受體(FcR)之能力影響。
在某些實施例中，Fc區係變異Fc區，例如相對於親本Fc序列(例如隨後經修飾以產生變異體的未修飾之Fc多肽)經修飾(例如藉由胺基酸取代、缺失及/或插入)以提供所需結構特徵及/或生物活性的Fc序列。
舉例而言，可在Fc區中進行修飾以便產生Fc變異體，該Fc變異體(a)具有增加或降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；(b)增加或降低之補體介導之細胞毒性(CDC)；(c)具有增加或降低的對Clq之親和力；及/或(d)相對於親本Fc，具有增加或降低的對Fc受體之親和力。此類Fc區變異體一般將在Fc區中包含至少一個胺基酸修飾。組合胺基酸修飾被認為特別合乎需要。舉例而言，變異Fc區可在其中，例如本文所標識之特定Fc區位置包括兩個、三個、四個、五個等取代。
變異Fc區亦可包含序列改變，其中二硫鍵形成所涉及之胺基酸經移除或經其他胺基酸置換。此類移除可避免與用於產生本文所描述之抗體的宿主細胞中存在之其他含半胱胺酸蛋白質反應。甚至在移除半胱胺酸殘基時，單鏈Fc結構域仍能形成二聚體Fc結構域，該結構域係非共價保持在一起。在其他實施例中，Fc區可經修飾以使其與所選宿主細胞更相容。舉例而言，可移除典型原生Fc區N末端附近的PA序列，該序列可由大腸桿菌中之消化酶，諸如脯胺酸亞胺基肽酶識別。在其他實施例中，可移除Fc結構域內之一或多個糖基化位點。典型地經糖基化(例如天冬醯胺)之殘基可賦予細胞毒性反應。此類殘基可缺失或經未糖基化殘基(例如丙胺酸)取代。在其他實施例中，可自Fc區移除與補體相互作用所涉及之位點，諸如Clq結合位點。舉例而言，可缺失或取代人類IgGl之EKK序列。在某些實施例中，可移除影響與Fc受體之結合的位點，較佳除補救受體結合位點外的位點。在其他實施例中，Fc區可經修飾以移除ADCC位點。ADCC位點係此項技術中已知的；有關IgGl中之ADCC位點，參見例如Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)。變異Fc結構域之具體實例揭示於例如WO 97/34631及WO 96/32478中。
在一個實施例中，Fc之鉸鏈區經修飾以使該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。Fc鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或者增加或降低抗體之穩定性。在一個實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以降低抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區以使得該抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於原生Fc-鉸鏈結構域SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在又其他實施例中，Fc區藉由以不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基而改變以改變抗體之效應功能。舉例而言，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一個或多個胺基酸可以用不同胺基酸殘基置換以使抗體對效應配體之親和力改變但保持親本抗體之抗原結合能力。相關親和力改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之CI組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實例中，可以用不同胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸以使抗體具有改變之Clq結合及/或減弱或消除之補體依賴細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實例中，改變胺基酸位置231及239內的一或多個胺基酸殘基經，由此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又另一實例中，可藉由修飾以下位置處之一個或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)及/或增加對Fcγ受體之親和力：234、235、236、238、239、240、241 、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。例示性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。例示性變異體包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F7324T。用於增強FcγR及補體相互作用之其他修飾包括但不限於，取代298 A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。該等及其他修飾評述於Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中。
增加與Fcγ受體之結合的Fc修飾包括在Fc區中以下胺基酸位置中之任一個或多個處之胺基酸修飾：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區中殘基之編號係如Kabat (WO00/42072)中之EU索引的編號。
可對Fc進行的其他Fc修飾係用於減少或消除與FcγR及/或補體蛋白之結合，由此減少或消除Fc介導之效應功能，諸如ADCC、ADCP及CDC的修飾。例示性修飾包括但不限於，在位置234、235、236、237、267、269、325及328處之取代、插入及缺失，其中編號係根據EU索引。例示性取代包括但不限於234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中編號係根據EU索引。Fc變異體可包含236R/328R。用於減少FcyR及補體相互作用之其他修飾包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V，以及藉由突變或酶方式或藉由在不能使蛋白質糖基化之生物體，諸如細菌中產生來移除297位之糖基化。該等及其他修飾評述於Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中。
視情況，Fc區可在熟習此項技術者已知之另外及/或替代性位置處包含非天然存在之胺基酸殘基(參見例如，美國專利第5,624,821號、第6,277,375號、第6,737,056號、第6,194,551號、第7,317,091號、第8,101,720號；PCX專利公開案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/0201 14)。
亦可使用增強對抑制性受體FcγRllb之親和力的Fc變異體。此類變異體可提供具有與FcγRllb+ 細胞，包括例如B細胞及單核細胞相關之免疫調節活性的Fc融合蛋白。在一個實施例中，相對於一或多種活化受體，Fc變異體提供對FcγRllb選擇性增強之親和力。根據EU索引，用於改變與FcγRllb之結合的修飾在選自由以下組成之群的位置處包括一或多個修飾：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用於增強FcγRllb親和力之例示性取代包括但不限於234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。例示性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcyRllb之結合的其他Fc變異體包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。
Fc區對其配體之親和力及結合特性可藉由此項技術中已知的多種活體外檢定方法(基於生物化學或免疫學之方法)測定，包括但不限於，平衡法(例如酶聯免疫吸附劑檢定(ELISA)或放射免疫檢定(RIA))或動力學(例如BIACORE分析)及其他方法，諸如間接結合檢定、競爭性抑制檢定、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析法(例如凝膠過濾)。此等及其他方法可利用在所檢查之一或多種組分上的標記及/或採用多種偵測方法，包括但不限於發色、螢光、發光或同位素標記。有關結合親和力及動力學之詳細描述可見於Paul, W. E.編, Fundamental immunology, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)，其集中在抗體-免疫原相互作用。
在某些實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。多種方法可行。舉例而言，此可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力實現。舉例而言，如美國專利第6,277,375號中所描述，以下殘基中之一或多個可經突變：252、254、256、433、435、436。具體例示性取代包括以下一或多個：T252L、T254S及/或T256F。或者，為了增加生物半衰期，抗體之CH1或CL區內可經改變以含有自IgG之Fc區CH2結構域之兩個環獲得的補救受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第號5,869,046及第6,121,022號中所述。增加與FcRn之結合及/或改良藥物動力學特性的其他例示性變異體包括在位置259、308、428及434處之取代，包括例如2591、308F、428L、428M、434S、4341 1. 434F、434Y及434X1。增加Fc與FcRn之結合的其他變異體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L (Hinton等人, 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216；Hinton等人, 2006 Journal of Immunology 176:346- -356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A (Shields等人, Journal of Biological Chemistry, 2001 , 276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S (Dall Acqua等人, Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180；Dall'Acqua等人, 2006, Journal of Biological Chemistry 281 :23514-23524)。用於調節FcRn結合之其他修飾描述於Yeung等人, 2010, J Immunol, 182:7663-7671中。在某些實施例中，可使用具有特定生物特徵之混合IgG同型。舉例而言，IgG1/IgG3混合變異體可藉由用IgG3中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG1位置來構建。因此，可構建出包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F的混合變異體IgG抗體。在本文所描述之其他實施例中，IgG1/IgG2混合變異體可藉由用IgG1中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG2位置來構建。因此，可以構建出包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多個的混合變異體IgG抗體：233E、234L、235L、-236G (涉及在236位處插入甘胺酸)及321 h。
此外，已定位人類IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點並描述具有改良結合之變異體(參見Shields, R.L.等人，(2001) J. Biol. Chen. 276:6591-6604)。經顯示，在位置256、290、298、333、334及339處之特定突變改良與FcγRIII之結合。另外，經顯示以下組合突變體改良FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、
S298A/K224A及S298A/E333A/K334A，經顯示其展現增強之FcγRIIIa結合及ADCC活性(Shields等人, 2001)。已鑑別出與FcγRIIIa之結合有較強增強的其他IgGl，包括具有S239D/I332E及
S239D/I332E/A330L突變之變異體，其顯示對FcγRIIIa之親和力的最大增加、FcγRIIb結合減小及在食蟹獼猴中較強的細胞毒性活性(Lazar等人, 2006)。在抗體，諸如阿倫單抗(alemtuzumab)(CD52特異性)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HER2/neu特異性)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20特異性)及西妥昔單抗(cetuximab)(EGFR特異性)中引入該三個突變轉變成活體外大幅增強之ADCC活性，且S239D/I332E變異體在猴中顯示增強的耗竭B細胞之能力(Lazar等人, 2006)。此外，已鑑別出含有L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L突變之IgGl突變體，該等突變體在B細胞惡性疾病及乳癌模型中於表現人類FcγRIIIa之轉殖基因小鼠中展現增強的與FcγRIIIa之結合及同時增強之ADCC活性(Stavenhagen等人, 2007；Nordstrom等人, 2011)。可以使用的其他Fc突變體包括S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L及M428L/N434S。
在某些實施例中，所選Fc具有減少的與FcγR之結合。具有減少之FcγR結合的例示性Fc，例如IgGl Fc包含以下三個胺基酸取代：L234A、L235E及G237A。
在某些實施例中，所選Fc具有減少的補體固定。具有減少之補體固定的例示性Fc，例如IgGl Fc包含以下兩個胺基酸取代：A330S及P331S。
在某些實施例中，所選Fc基本上不具有效應功能，亦即，其具有減少之與FcγR之結合及減少之補體固定。例示性無效應物Fc，例如IgGl Fc，包含以下五個突變：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
當使用IgG4恆定結構域時，通常較佳包括取代S228P，該取代模擬IgGl中之鉸鏈序列並由此使IgG4分子穩定。
應注意，在某些態樣中，本文所揭示之結合分子可工程改造用於將CH3結構域與對應經修飾抗體或其片段的鉸鏈區直接融合。在其他構築體中，可將肽間隔子插入鉸鏈區與經修飾CH2及/或CH3結構域之間。舉例而言，可表現相容構築體，其中CH2結構域已缺失且剩餘CH3結構域(經修飾或未經修飾)經5-20個胺基酸之間隔子接合至鉸鏈區。添加此類間隔子可例如確保恆定結構域之調控元件保持游離且可接近狀態或使鉸鏈區保持可撓性。然而，應注意，在一些情況下，胺基酸間隔子可證實具有免疫原性且引起針對構築體之不想要的免疫反應。因此，在某些態樣中，添加至構築體中的任何間隔子將為相對非免疫原性的，或甚至完全遺漏的，由此維持經修飾抗體所需之生物化學特性。
除缺失整個恆定區結構域外，應理解本文所揭示之結合分子可由數個或甚至單個胺基酸之部分缺失或取代來提供。舉例而言，在CH2結構域所選區域中之單一胺基酸突變可足以大體上減少Fc結合且由此增加腫瘤定位。此外，如以上間接提到的，所揭示之結合分子的恆定區可經由一或多個胺基酸之突變或取代進行修飾以增強所得構築體之特徵。就這一點而言，可破壞由保守結合位點所提供之活性(例如Fc結合)，同時大體上維持經修飾抗體或其抗原結合片段之構型及免疫原性特徵。某些態樣可包含在恆定區中添加一或多個胺基酸以增強所需特徵，諸如降低效應功能，或提供更多治療劑或診斷劑連接。在此等態樣中，可插入或複製來源於所選恆定區結構域之特定序列。
在又一實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化抗體(亦即，抗體缺乏糖基化)。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原之親和力。可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖化位點實現該等碳水化合物修飾。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其消除一或多個可變區構架糖基化位點以由此消除彼位點處之糖基化。該去糖化可增加抗體對抗原之親和力。此方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
可藉由使一或多個胺基酸殘基(例如糖基化胺基酸殘基或相鄰胺基酸殘基)突變成另一殘基，例如N297A、S298G、T299A或其任何組合，來防止恆定區N297的糖基化。
另外或替代地，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量減少之低岩藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。經證實，該等變化的糖基化模式可增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機構改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機構改變之細胞在此項技術中有描述且可用作宿主細胞，在其中表現本文所描述之重組抗體，由此產生糖基化改變之抗體。舉例而言，Hanai等人之EP 1,176,195描述具有功能破壞之FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶以使得在該細胞株中表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述變異CHO細胞株，即Led 3細胞，該等細胞中岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物的能力減弱，亦使得在該宿主細胞中表現之抗體低岩藻糖基化(亦參見Shields, R.L.等人(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白改變之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))以使得在經工程改造之細胞株中表現之抗體展現二分GlcNac結構之增加，由此使該等抗體之ADCC活性增加的細胞株(亦參見Umana等人(1999) Nat. Biotech. 17: 176-180)。
本文描述之抗體的另一修飾係聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體的生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，典型地使該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在使一或多個PEG基團附接至該抗體或抗體片段之條件下反應。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文中所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋用於使其他蛋白質衍生化之任何形式之PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或單芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化之抗體。用於使蛋白質聚乙二醇化之方法係此項技術中已知的且可應用於本文所描述之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。 V. 免疫偶聯物及融合蛋白
本發明亦提供包含本文所揭示之結合分子(例如抗體)中之任一種(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)的免疫偶聯物。在一個態樣中，免疫偶聯物包含本文所揭示之抗體或其抗原結合部分連接至試劑。在一特定態樣中，免疫偶聯物包含本文所揭示之雙特異性分子連接至試劑(例如治療劑或診斷劑)。
因此，本發明提供基於本文所揭示之抗FIX、基於本文所揭示之抗FX或基於本文所揭示之雙特異性抗體，例如包含抗FIX特異性及抗FX特異性之雙特異性抗體的免疫偶聯物。
在一些態樣中，免疫偶聯物包含本文所揭示之結合分子中的任一種(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)與至少一種治療劑或診斷劑的偶聯物。在一些態樣中，免疫偶聯物進一步包含至少一個可選間隔子，該間隔子可夾在本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之多肽鏈中的側鏈或胺基酸與治療部分或診斷部分之間。在一些態樣中，該至少一個間隔子係肽間隔子。在其他態樣中，該至少一個間隔子係非肽間隔子。在一些態樣中，間隔子不穩定，諸如酸不穩定性間隔子(例如肼)。在其他態樣中，間隔子係酶可裂解肽，例如可裂解二肽。在一些態樣中，間隔子係不可裂解(的水解穩定的)，例如硫醚間隔子或受阻二硫化物間隔子。
在一些態樣中，免疫偶聯物包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個治療或診斷部分。在一些態樣中，所有治療或診斷部分均相同。在一些態樣中，至少一個治療部分或診斷部分不同於其餘治療或診斷部分。在一些態樣中，所有治療或診斷部分均不同。在一些態樣中，所有間隔子(例如肽及/或非肽間隔子)均相同。在一些態樣中，至少一個間隔子不同於其餘間隔子。在又其他態樣中，所有間隔子均不同。
在一些態樣中，每一治療或診斷部分以化學方式偶聯至本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之Fc區中特定位置的胺基酸側鏈。
在一些態樣中，Fc區中的特定位置係選自由以下組成之群：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、在239位與240位之間的插入，及其組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所陳述之EU索引。
在一些態樣中，偶聯治療或診斷部分的胺基酸側鏈係硫氫基側鏈，例如半胱胺酸胺基酸之硫氫基。在一些態樣中，至少一個治療或診斷部分以化學方式偶聯至位於本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之Fc區外之位置處的胺基酸之側鏈。
在一些態樣中，所有治療或診斷部分均以化學方式偶聯至位於本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之Fc區外之位置處的胺基酸之側鏈。在一些態樣中，使用此項技術中所知之重組技術將至少一個治療或診斷部分以遺傳方式併入本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)的多肽鏈中。
在一些實施例中，本文所揭示之免疫偶聯物可包含使本文所揭示之抗體或結合分子靶向損傷部位的部分。在一個特定實施例中，使該等抗體或結合分子靶向損傷部位的部分包含血小板靶向部分，例如血小板靶向部分。
本文所揭示之免疫偶聯物包含至少一個經衍生化或連接(例如以化學方式或重組方式)至另一分子(例如肽、小藥物分子、可偵測分子等)的本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)。一般而言，本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)經衍生化以使其與特定抗原結合位點(例如FIXa上之抗原決定基及/或FXz上之抗原決定基)的結合不受例如化學或酶衍生化、基因融合或標記之不良影響。
因此，預期本發明之結合分子包括本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)的完整及經修飾形式。舉例而言，本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或其抗原結合部分可功能性連接(藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如醫藥劑、偵測劑及/或可介導本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)之締合的蛋白質或肽。
可藉由將兩個或兩個以上分子實體，例如本文所揭示之結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)與治療部分交聯來產生一種類型的衍生化分子。適合交聯劑包括異雙官能性，亦即具有由適當間隔基(例如間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)分隔之兩個不同反應性基團；或同雙官能性(例如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)的交聯劑。此類交聯劑可得自例如Pierce Chemical Company, Rockford, II。另外的雙官能偶合劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
另一類衍生化分子可藉由併入可偵測標記產生。有用偵測劑包括螢光化合物(例如螢光素、螢光素異硫氰酸酯、羅丹明、5-二甲基胺-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白、鑭化物磷光體及類似物)、可用於偵測之酶(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及類似物)、由第二報告子識別之抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤等)。在一些態樣中，可偵測標記可用至少一個間隔子臂附接。間隔子臂可具有各種長度以減小潛在空間位阻。
本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)亦可用放射性標記進行標記，例如用於診斷目的。本文所揭示之結合分子亦可用化學基團，例如聚合物諸如聚乙二醇(PEG)、甲基、乙基或碳水化合物基團衍生化。該等基團可用於改良結合分子(例如本文所揭示之抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之生物特徵，諸如增加血清半衰期或增加組織結合。 VI. 核酸、表現載體及細胞
本發明亦提供編碼本文所揭示之結合分子，例如本文所揭示之抗體或結合分子中之任一種的核酸。在一些態樣中，該核酸編碼本文所揭示之抗體的重鏈及/或輕鏈可變區，或其抗原結合部分，或本文所揭示之雙特異性或多特異性分子(例如抗體)。本發明之聚核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA；且可為雙股或單股的，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。在某些態樣中，DNA係cDNA，用於產生非天然存在之重組抗體。在一些態樣中，RNA係mRNA，其可在投予有需要之受試者之後表現此處所揭示之結合分子。在一些態樣中，可在活體內表現mRNA。亦可在活體外或離體表現mRNA。在一些態樣中，編碼本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)的mRNA可經化學修飾，例如以包括經修飾之核苷間鍵聯(例如硫代磷酸酯)或經修飾鹼基(例如假尿苷、硫代尿苷等)。
在某些態樣中，分離出聚核苷酸。在某些態樣中，聚核苷酸係大體上純的。在某些態樣中，聚核苷酸包含與有助於例如宿主細胞表現及分泌多肽的聚核苷酸(天然或異源)(例如充當分泌序列以控制細胞中多肽轉運的前導序列)在同一閱讀框中融合的成熟多肽之編碼序列。具有前導序列之多肽係前體蛋白且可具有由宿主細胞裂解以形成多肽之成熟形式的前導序列。聚核苷酸亦可編碼結合分子原蛋白，該原蛋白係成熟蛋白加另外的胺基酸殘基，例如5'胺基酸殘基。在某些態樣中，使聚核苷酸改變以針對某些宿主細胞優化密碼子使用。
在某些態樣中，聚核苷酸包含與允許例如純化所編碼多肽之異源標記物序列在同一閱讀框中融合的成熟結合分子，例如本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或其抗原結合片段的編碼序列。
舉例而言，在細菌宿主情況下，標記物序列可為例如由pQE-9載體提供的六組胺酸(His6)標籤，以允許純化出與該標記物融合之成熟多肽。在其他態樣中，當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記物序列可為例如來源於流感血球凝集素蛋白之血球凝集素(HA)標籤。
本發明進一步係關於所描述的編碼例如本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之片段、類似物及衍生物的聚核苷酸之變異體。該等聚核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中含有變化。在一些態樣中，聚核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加或缺失但不改變所編碼多肽之特性或活性的變化。在一些態樣中，由於基因密碼之簡併性，核苷酸變異體係由沉默取代產生。聚核苷酸變異體之產生可出於多種原因，例如針對特定宿主優化密碼子表現(將人類mRNA中之密碼子變成細菌宿主，諸如大腸桿菌中較佳之密碼子)。
在一些態樣中，編碼本文所揭示之結合分子或其抗原結合片段的DNA序列可藉由化學合成，例如使用寡核苷酸合成儀構築。此類寡核苷酸可基於所需多肽之胺基酸序列且選擇有利於在宿主細胞中產生所關注重組多肽之密碼子設計。可應用標準方法合成編碼經分離之所關注多肽的經分離之聚核苷酸序列。舉例而言，可使用完整胺基酸序列構築回譯基因。另外，亦可合成含有編碼特定分離多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽各部分之若干小寡核苷酸，且接著連接。個別寡核苷酸典型地含有5'或3'突出用於互補組裝。
亦提供一種表現載體或表現載體組合，其包含一或多個本文所揭示之核酸分子。一旦組裝(藉由合成、定點突變誘發或另一方法)，即將編碼特定所關注分離多肽之聚核苷酸序列插入表現載體中並可操作地連接至適於在所需宿主中表現蛋白質的表現控制序列。正確組裝可例如藉由核苷酸測序、限制性定位及在適合宿主中表現生物活性多肽來證實。如此項技術中所熟知的，為了在宿主中實現轉染基因之高水準表現，該基因必須可操作地連接至在所選表現宿主中起作用的轉錄及轉譯表現控制序列。
在某些態樣中，使用重組表現載體擴增並表現編碼本文所揭示之結合分子的DNA。重組表現載體係可複製DNA構築體，其具有編碼例如本文所揭示之結合分子或其抗原結合片段之多肽鏈的合成或cDNA源性DNA片段可操作地連接至來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適合轉錄或轉譯調控元件。
轉錄單元一般包含以下之組裝物：(1)在基因表現中具有調控作用的一或多個基因元件，例如轉錄啟動子或強化子；(2)轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質的結構或編碼序列；及(3)適當轉錄及轉譯起始及終止序列，如下文所詳述。該等調控元件可包括用以控制轉錄之操作子序列。
可另外併入通常由複製起點賦予的在宿主中複製之能力及有利於識別轉型株之選擇基因。DNA區當彼此功能相關時係可操作地連接。舉例而言，若信號序列(分泌性前導序列)之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白，則其可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子控制編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點定位成允許轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。擬用於酵母表現系統中之結構元件包括使宿主細胞能夠細胞外分泌轉譯之蛋白質的前導序列。或者，在無前導序列或轉運序列下表現重組蛋白時，其可包括N末端甲硫胺酸殘基。該殘基可視情況隨後自表現之重組蛋白裂解，以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇將取決於宿主的選擇。可採用多種表現宿主/載體組合。可用於真核宿主之表現載體包括例如，包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物；較廣宿主範圍之質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。
本發明亦提供包含一或多個本文所揭示之核酸，或一或多個本文所揭示之表現載體之細胞。在一些態樣中，用一或多種本文所揭示之表現載體轉型細胞。在一些態樣中，細胞係用於重組表現之宿主細胞。舉例而言，在一些態樣中，宿主細胞係原核細胞、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、CHO細胞、HEK細胞或COS細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高級真核細胞包括確定的哺乳動物來源之細胞株。亦可採用無細胞轉譯系統。適用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之選殖及表現載體描述於Pouwels等人(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)中，其相關揭示內容特此以引用的方式併入。有關蛋白質製造，包括抗體製造之方法的額外資訊可見於例如美國公開案第2008/0187954號；美國專利第6,413,746號及第6,660,501號；以及國際專利公開案第WO 04009823號中，其各自特此以全文引用之方式併入。
由於重組蛋白質一般係正確摺疊，經適當修飾且有完整功能，故可在哺乳動物細胞中表現此類蛋白質。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括HEK-293和HEK-293T、Gluzman (Cell 23:175, 1981)所描述的猴腎細胞COS-7株，及其他細胞株，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、NSO、HeLa及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含不轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及強化子，以及其他5'或3'側接不轉錄序列，及5'或3'不轉譯序列，諸如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點，以及轉錄終止序列。Luckow及Summers, BioTechnology 6:47 (1988)評述用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統。
由轉型宿主產生的本文所揭示之結合分子或其抗原結合片段可根據任何適合的方法純化。此類標準方法包括例如，層析法(例如離子交換層析、親和層析及定尺寸管柱層析法)、離心、差示溶解度法或任何其他標準蛋白質純化技術。親和標籤，諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感病毒衣殼序列、麩胱甘肽-S-轉移酶等，可以附接至該蛋白質以便藉由穿過適當親和管柱容易地純化。經分離之蛋白質亦可使用例如蛋白水解、核磁共振或x射線結晶學以物理方式表徵。
舉例而言，首先，可使用可商購之蛋白質濃縮過濾器，例如AMICON® 或Millipore PELLICON® 超濾裝置濃縮來自系統之上清液，該等系統將重組蛋白分泌至培養基中。在濃縮步驟之後，可將濃縮物施加至適合純化基質上。或者，可採用陰離子交換樹脂，例如具有側接二乙胺基乙基(DEAE)之基質或受質。該等基質可為丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或常用於蛋白質純化中之其他類型。或者，可採用陽離子交換步驟。
適合陽離子交換劑包括含磺基丙基或羧甲基之各種不溶基質。最後，可採用一或多個逆相高效液相層析(RP-HPLC)步驟進一步純化本文所揭示之結合分子或其抗原結合部分，該等步驟採用疏水性RP-HPLC介質，例如具有側接甲基或其他脂族基團之矽膠。在各種實施例中，前述純化步驟中有一些或全部亦可用於提供同源重組蛋白。
可以例如通過最初自細胞塊提取，隨後一或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟，分離出在細菌培養物中產生的本文所揭示之重組結合分子或其抗原結合部分。高效液相層析法(HPLC)可以用於最後的純化步驟。用於表現重組蛋白的微生物細胞可以藉由任何便利方法破壞，包括冷凍-解凍循環、音波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑。
此項技術中已知用於純化抗體及其他蛋白質的方法包括例如美國專利公開案第US20080312425號、第US20080177048號及第US20090187005號中所述之方法，各案特此以全文引用之方式併入。 VII. 製備及表徵方法
本發明亦提供製備本文所揭示之結合分子，例如抗體的方法。在一些態樣中，製備本文所揭示之(i)抗FIX抗體或其抗原結合部分；(ii)抗FX抗體或其抗原結合部分；或(iii)雙特異性分子之方法包括在細胞(例如宿主細胞)中表現抗體、其抗原結合部分，或雙特異性分子，並自細胞分離該抗體、其抗原結合部分，或雙特異性分子。
本發明提供一種製備雙特異性分子之方法，其包括在允許表現該雙特異性分子之條件下培養本文所揭示之宿主細胞。亦提供一種製備本文所揭示之雙特異性分子之方法，該方法進一步包括增進異二聚化之條件。
可根據此項技術中已知之方法製備本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)。舉例而言，可使用雜交瘤方法，諸如Kohler及Milstein (1975) Nature 256:495所描述之方法，產生本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)。
使用雜交瘤方法，如上文所述對小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫以引起淋巴細胞產生將特異性結合至免疫抗原之抗體。亦可在活體外使淋巴細胞免疫。在免疫後，分離淋巴細胞，並使用例如聚乙二醇使其與適合骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞，接著可自未融合之淋巴細胞及骨髓瘤細胞中選出雜交瘤細胞。接著，可使用標準方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)藉由活體外培養，或在活體內以動物體內之腹水腫瘤形式繁殖雜交瘤，如藉由免疫沈澱法、免疫墨點法，或藉由活體外結合檢定(例如放射免疫檢定(RIA)；酶聯免疫吸附劑檢定(ELISA))所測定，該等雜交瘤產生特異性針對所選抗原之單株抗體。接著，可如以上關於多株抗體所描述，自培養基或腹水純化出單株抗體。
亦可如美國專利第4,816,567號所描述，使用重組DNA方法製備本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)。編碼單株抗體之聚核苷酸係諸如使用特異性擴增編碼該抗體重鏈及輕鏈之寡核苷酸引子，藉由PCR自成熟B細胞或雜交瘤分離，且其序列係使用習知程序測定。接著，將所分離的編碼重鏈及輕鏈之聚核苷酸選殖至適合表現載體中，當將其轉染至宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不會另外產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞中時，該等宿主細胞產生單株抗體。
又，可如所描述(McCafferty等人, Nature 348:552-554 (1990)；Clarkson等人, Nature 352:624-628 (1991)；及Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))，自表現所需物種之CDR的噬菌體展示文庫分離重組單株抗體或包含所需物種之抗原結合片段的分子。
編碼本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)的聚核苷酸可藉由多種不同方式，使用重組DNA技術進一步修飾以產生替代性結合分子。在一些態樣中，例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈恆定結構域可取代(1)例如人類抗體之該等區域以產生嵌合抗體，或(2)非免疫球蛋白多肽以產生融合抗體。在一些態樣中，將恆定區截短或移除以產生所需的單株抗體之抗體片段。可使用可變區之定點或高密度突變誘發以優化單株抗體之特異性、親和力等。
在某些態樣中，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)係人類抗體或其抗原結合片段。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術直接製備。可產生在活體外免疫或自經免疫個體分離永生化人類B淋巴細胞，該等淋巴細胞產生針對靶抗原之抗體(參見例如，Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁(1985)；Boemer等人, J. Immunol. 147:86-95 (1991)；及美國專利第5,750,373號)。接著，可製備一或多個編碼永生化B淋巴細胞中之抗體之cDNA並將其插入表現載體及/或異源宿主細胞中以表現該抗體之非天然存在之重組形式。
另外，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)可選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現呈與異源噬菌體蛋白之融合蛋白形式的人類抗體或其片段，如例如Vaughan等人, Nat. Biotech. 14:309-314 (1996)；Sheets等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)；Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)；以及Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581 (1991))中所描述。用於產生及使用抗體噬菌體文庫之技術亦描述於美國專利第5,969,108號、第6,172,197號、第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,300,064號、第6,653,068號、第6,706,484號及第7,264,963號中，其各自以全文引用之方式併入。
親和力成熟策略及鏈改組策略(Marks等人, BioTechnology 10:779-783 (1992)，以全文引用之方式併入)係此項技術中已知的且可用於產生高親和力人類抗體或其抗原結合片段。
在一些態樣中，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)可為人類化抗體。用於工程改造、人類化或表面重塑非人類或人類抗體之方法亦可使用且係此項技術中熟知的。人類化、表面重塑或類似經工程改造之抗體可具有一或多個來自非人類來源，例如但不限於，小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物或其他哺乳動物之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基經通常稱為「輸入」殘基，該等殘基典型地自已知人類序列之「輸入」可變結構域、恆定結構域或其他結構域獲得。如此項技術所知，此類輸入序列可用於降低免疫原性或減小、增強或改良結合、親和力、締合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。一般而言，CDR殘基直接且最充分地參與影響與特定抗原結合位點(例如抗原決定基)之結合。因此，非人類或人類CDR序列之一部分或全部得以保持，同時可變區及恆定區之非人類序列可經人類或其他胺基酸置換。在某些態樣中，將人類CDR插入非人類抗體支架中以使抗體在動物模型系統中具有降低之免疫原性，例如「鼠類化」抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)可經人類化、表面重塑或工程改造而保持對抗原結合位點(例如抗原決定基)之高親和力及其他有利的生物特性。為達到此目標，可視情況藉由使用親本序列、工程改造序列及人類化序列之三維模型分析親本序列與各種概念性人類化及工程改造產物的方法來製備人類化(例如人類)、工程改造或表面重塑之結合分子。三維免疫球蛋白模型係常用的且為熟習此項技術者所熟悉的。
可用電腦程式說明並展示選定的候選免疫球蛋白序列之可能三維構象結構。檢查該等展示允許分析該等殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可以自共同序列及輸入序列中選出構架殘基並組合，以獲得所需抗體特徵，諸如增加對靶抗原之親和力。
本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之人類化、表面重塑或工程改造可使用任何已知方法，諸如但不限於以下所描述之方法進行：Jones等人, Nature 321:522 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239:1534 (1988)), Simset al. , J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)；Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)；Presta等人, J. Immunol. 151:2623 (1993)；美國專利第5,639,641號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567號、第7,557,189號、第7,538,195號及第7,342,110號；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430及EP229246，其各自以引用之方式完整併入本文中，包括其中引用之參考文獻。
在某些態樣中，提供自本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)獲得的抗體片段。已知用於產生抗體片段的各種技術。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體得到該等片段(參見例如，Morimoto等人, J. Biochem. Biophy. Methods 24:107-117 (1993)；及Brennan等人, Science, 229:81 (1985))。
在某些態樣中，重組產生抗體片段。Fab、Fv及scFv抗體片段均可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現且由其分泌，由此能夠產生大量該等片段。亦可自以上論述之抗體噬菌體文庫分離該等抗體片段。如美國專利第5,641,870號中所述，抗體片段亦可為線性抗體。用於產生抗體片段之其他技術將係熟練技術人員顯而易知的。
可採用產生對與本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)相同之抗原決定基具有特異性之單鏈抗體的技術。此外，亦可採用構築Fab表現文庫之方法(參見例如，Huse等人, Science 246:1275-1281 (1989))以允許快速且有效地鑑別對FIX及/或FX，或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所需特異性之單株Fab片段。可藉由此項技術中之技術製備抗體片段，包括但不限於：(a)藉由胃蛋白酶消化抗體分子產生之F(ab')2 片段；(b)藉由還原F(ab')2 片段之二硫橋產生的Fab片段；(c)藉由用木瓜蛋白酶及還原劑處理抗體分子產生的Fab片段；及(d) Fv片段。
可藉由此項技術中已知之任何方法檢定本文所揭示之結合分子及其抗原結合部分、其變異體或衍生物的免疫特異性結合。可使用之免疫檢定包括但不限於使用諸如西方墨點法之技術進行的競爭性及非競爭性檢定系統、放射免疫檢定、酶聯免疫吸附劑檢定(ELISA)、夾心摂免疫檢定、免疫沈澱檢定、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散檢定、凝集檢定、補體固定檢定、免疫放射檢定、螢光免疫檢定、蛋白質A免疫檢定等。此類檢定係常規的且係此項技術中熟知的(參見例如，Ausubel等人編(1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) 第1卷，以全文引用之方式併入本文中)。
給定的一組本文所揭示之結合分子、其抗原結合部分、其變異體或衍生物之結合活性可根據熟知方法測定。熟習此項技術者藉由採用常規實驗將能夠確定用於每次測定之可操作且最佳的檢定條件。
適於測定本文所揭示之結合分子或其抗原結合部分之結合特徵的方法及試劑係此項技術中已知的及/或可商購的。設計用於此類動力學分析之設備及軟體係可商購的(例如BIACORE®，BIAevaluation軟體，GE Healthcare；KinExa軟體, Sapidyne Instruments)。
除非另外指示，否則本發明之實施將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術，其屬於此項技術之技能。該等技術於文獻中有完整解釋。參見例如，Sambrook等人編(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編(1985) DNA Cloning, 第I及II卷；Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人, 美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編, Methods In Enzymology, 第154及155卷；Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir及Blackwell編(1986) Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；及Ausubel等人 (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。
抗體經工程改造之一般原理陳述於Borrebaeck編(1995) Antibody Engineering (第2版; Oxford Univ. Press)中。蛋白質經工程改造之一般原理陳述於Rickwood等人編(1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)中。抗體及抗體-半抗原結合之一般原理陳述於：Nisonoff (1984) Molecular Immunology (第2版; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)；及Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)。另外，此項技術中已知且未具體描述的免疫學標準方法一般遵循Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Stites等人編(1994) Basic and Clinical Immunology (第8版; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)以及Mishell及Shiigi (編) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)中所述。
陳述免疫學一般原理之標準參考著作包括Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)；Kennett等人編(1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY)；Campbell (1984) 「Monoclonal Antibody Technology」, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burden等人編(Elsevier, Amsterdam)；Goldsby等人編(2000) Kuby Immunology (第4版；H. Freemand & Co.)；Roitt等人(2001) Immunology (第6版；London: Mosby)；Abbas等人(2005) Cellular and Molecular Immunology (第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann及Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag)；Sambrook及Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003)；Harlow及Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach及Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)。 VIII. 醫藥組成物
本發明亦提供醫藥組成物，其包含例如(i)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分、本文所揭示之雙特異性分子(例如雙特異性抗體)，或本文所揭示之免疫偶聯物，及(ii)載劑。
具體言之，本發明提供醫藥組成物(例如治療或診斷性組成物)，其包含 (1) 至少一種選自由以下組成之群的治療或診斷活性組分： (i) 本文所揭示之結合分子，例如抗FIX抗體或其抗原結合部分、抗FX抗體或其抗原結合部分，包含抗FIX特異性及/或抗FX特異性之雙特異性分子； (ii) 其衍生物，例如免疫偶聯物、融合蛋白或帶有賦予本文所揭示之結合分子所需特性(例如較長血漿半衰期)的異源部分之衍生物； (iii) 編碼(i)之結合分子及/或(ii)之衍生物的聚核苷酸； (iv) 包含(iii)之聚核苷酸之載體； (v) 包含(iii)之聚核苷酸或(iv)之載體的細胞；或 (vi) 其組合；及 (2) 一或多種載劑、賦形劑及/或稀釋劑。
本文所揭示之醫藥組成物適合於獸醫應用或人類醫藥應用。本文所揭示之醫藥組成物典型地包含一或多種本文所述之治療或診斷活性組分及一或多種載劑、賦形劑及/或稀釋劑。醫藥組成物之形式(例如乾粉、液體調配物等)及所用賦形劑、稀釋劑及/或載劑將取決於該等組成物之預定用途、治療或診斷用途及投藥模式。
包含本文所述之治療或診斷活性組分的醫藥組成物係用於但不限於，診斷、偵測或監測病症；預防、治療、管理或緩解病症或者其一或多種症狀；及/或研究。
對於治療用途，醫藥組成物可作為包括醫藥學上可接受之載劑之無菌醫藥組成物的一部分提供。此醫藥組成物可呈任何適合形式(取決於將其投予患者所需之方法)。投藥方法係一般熟習此項技術者已知的。該醫藥組成物可藉由多種途徑，諸如經口、經皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鞘內、表面或局部投予患者。在任何給定情況下，最適合的投藥途徑將取決於特定治療或診斷活性組分、受試者，以及疾病之性質及嚴重程度，及受試者之身體狀況。典型地，醫藥組成物將皮下投予。
醫藥組成物可便利地以每劑含有預定量本文所述之治療或診斷活性組分的單位劑型提供。單位劑量中所包括的治療或診斷活性組分的量將取決於所治療或診斷之疾病，以及此項技術中熟知之其他因素。該等單位劑量可呈含有適於單次投予之量之治療或診斷活性組分的凍乾之乾粉形式，或呈液體形式。乾粉單位劑型可包裝於帶有注射器、適量稀釋劑及/或可用於投予之其他組分的套組中。呈液體形式之單位劑量宜以預填充適於單次投予之量之治療或診斷活性組分的注射器形式提供。
醫藥組成物亦可以含有適於多次投予之量之治療或診斷活性組分的散裝形式提供。
醫藥組成物亦可與投藥說明書一起包含在容器、包裝或施配器中。
可藉由將具有所需純度的本文所述之治療或診斷活性組分與此項技術中常用的可選醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(全部在本文中稱為「載劑」)，亦即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等張劑、非離子清潔劑、抗氧化劑及其他各種添加劑混合來製備醫藥組成物以凍乾調配物或水溶液形式儲存。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版(Osol編, 1980)及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(Allen, Loyd V. Jr.編輯, 2012)。該等添加劑應當在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。
用於皮內或皮下應用之溶液或懸浮液典型地包括以下組分中之一或多種：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調節張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉調劑pH。此類製劑可以封裝於由玻璃或塑料製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適於注射之醫藥組成物包括無菌水性溶液或分散液，及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投予，適合載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水。在所有情形中，該組成物均必須為無菌的且流動性應當達到易於注射的程度。其必須在製造及儲存條件下穩定，並且能防止諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可以為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及類似物)及其適合混合物的溶劑或分散介質。可以例如藉由利用包衣劑，諸如卵磷脂，在分散液的情況下藉由保持所需粒度及藉由利用界面活性劑來維持流動性。
可添加防腐劑以阻止微生物生長，且添加量可在約0.2%-1% (w/v)範圍內。適用於本發明之防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯紮鹵銨(benzalconium halide)(例如苯紮氯銨、苯紮溴銨及苯紮碘銨)、氯化六羥季銨，及對羥基苯甲酸烷酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯，兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。可添加等張劑，有時稱為「穩定劑」，以確保本發明之液體組成物等張力，且包括多羥基糖醇，例如三羥基或更高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
穩定劑係指功能範圍自增積劑至溶解治療劑或有助於防止變性或黏附至容器壁之添加劑的一大類賦形劑。典型穩定劑可為多羥基糖醇(如以上列舉)；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯基丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及類似物，包括環醇，諸如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如具有10個或更少殘基之肽)；蛋白質，諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖及海藻糖；及三醣，棉子糖；及多醣，諸如葡聚糖。
緩衝劑有助於將pH保持在使蛋白質穩定的範圍內。其可以多種濃度存在，但典型地以在約2 mM至約50 mM範圍內之濃度存在。
適用於本發明之緩衝劑包括有機及無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝劑(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸緩衝劑(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝劑(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)及乙酸鹽緩衝劑(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，亦可使用磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑，及三甲胺鹽，諸如Tris。
其他各種賦形劑包括增積劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)及共溶劑。 IX. 治療及診斷方法
本發明亦提供治療及診斷方法，其包括使用本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。(a) 治療用途
在一個態樣中，可使用本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)預防、治療或逆轉凝血或出血病症。在另一態樣中，該方法包括向有需要之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。受試者可為哺乳動物，諸如但不限於人類、小鼠、大鼠、豚鼠，家畜，諸如但不限於，牛、馬、綿羊、豬、山羊、貓、狗、倉鼠、驢。在一個態樣中，受試者係人類。
在各種態樣中，凝血或出血病症係由缺乏凝血因子引起。熟習此項技術者應理解凝血或出血病症之類型與缺乏凝血因子有關。在一些態樣中，凝血或出血病症可為血友病或範維勒布蘭德氏病(von Willebrand disease)。在另一態樣中，凝血或出血病症係血友病A或獲得性血友病。在一特定態樣中，凝血或出血病症係血友病A。在另一態樣中，凝血或出血病症係獲得性血友病，其中受試者不再產生FVIII。
在各種態樣中，可向患有輕度血友病A、中度血友病A或重度血友病A之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在另一態樣中，可向血漿因子含量為6%至30%、2%至5%，或1%或更低之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在一些態樣中，可向患有血友病A或懷疑患有血友病A(當在受試者身上出現外部傷口時)之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在另一態樣中，可向患有血友病A或在受試者身上存在外部傷口的懷疑患有血友病A之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在另一態樣中，可向具有外部傷口之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)，直至傷口癒合。在一些態樣中，傷口可包括但不限於擦傷、撕裂傷、刺傷或撕脫傷。
在一些態樣中，可在手術、嚴重損傷或牙科操作之前、期間或之後，向患有血友病A或懷疑患有血友病A之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在一些態樣中，可向患有血友病A或懷疑患有血友病A並經歷自發出血之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在另一態樣中，可向患有血友病A或懷疑患有血友病A並在一週內經歷一次、兩次或更多次出血之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在各種態樣中，可向患有或懷疑患有血友病A的各種年齡群之受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在一些態樣中，可向患有或懷疑患有血友病A的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 ,15、16或17歲兒童投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。在另一態樣中，可向患有或懷疑患有血友病A的嬰兒投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在又另一態樣中，可向患有或懷疑患有血友病A之0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月大的嬰兒受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在一些態樣中，在第一次出血發作之前的早期階段向受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)。
在其他態樣中，在第一次出血發作之前投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之其他組成物(例如核酸、載體、細胞)防止將來再出血及關節損傷之發生。
在一些實施例中，向受試者投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)或本發明之另一組成物(例如核酸、載體、細胞)可具有後續效應，但不限於，止血、減輕疼痛及改善活動性。
亦提供促進有需要之受試者之FX活化的方法，該方法包括向受試者投予治療有效量的本文所揭示之抗體、雙特異性分子、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)或其組合。
亦提供一種降低有需要之受試者之出血發作之頻率或程度的方法，該方法包括向受試者投予有效量的本文所揭示之抗體、雙特異性分子、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)或其組合。
在一些態樣中，該受試者已經產生，有傾向產生且有風險產生針對因子VIII(「FVIII」)之抑制劑。在一些態樣中，該針對FVIII之抑制劑係針對FVIII之中和抗體。在一些態樣中，受試者正經歷用FVIII之治療，或為用FVIII治療，例如FVIII替代療法之候選者。
在一些態樣中，該出血發作係由關節積血、肌肉出血、口腔出血、大量出血、肌肉中大量出血、口腔大量出血、外傷、外傷性頭痛、胃腸出血、顱內大量出血、腹內大量出血、胸內大量出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何組合引起。
本發明亦提供一種治療有需要之受試者之凝血病症的方法，該方法包括向受試者投予有效量的本文所揭示之雙特異性分子、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)或其組合。
在一些態樣中，該凝血病症係血友病A或血友病B。在一些態樣中，該受試者係人類受試者。
在一些態樣中，該受試者正在經歷或曾經歷FVIII替代療法。在一些態樣中，雙特異性分子係與血友病療法組合投予。在一些態樣中，該血友病療法係FVIII替代療法。在一些態樣中，雙特異性分子係在投予血友病療法之前、期間或之後投予。在一些態樣中，該雙特異性分子係靜脈內或皮下投予。
在一些態樣中，投予雙特異性分子使突破性出血發作、自發性出血發作或急性出血之頻率降低。在一些態樣中，投予該雙特異性分子使年平均出血率降低5%、10%、20%、30%或50%。
可藉由適於待治療病狀之任何途徑投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)。典型地，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)係非經腸投予，亦即，輸注、皮下、肌肉內、靜脈內或皮內投予。在一些態樣中，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)係皮下投予。
在某些態樣中，本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)係間歇性或不連續投予。在各種態樣中，經由注射，諸如皮下注射投予的本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)之劑量在每公斤體重約0.0001 mg至約100 mg範圍內。
在一些態樣中，投予本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)直至存在疾病進展或不可接受之毒性。(b) 診斷用途
本發明亦提供可用於診斷以凝血因子，諸如FIX及FX之表現異常或缺乏為特徵之疾病的診斷方法。在一些態樣中，診斷涉及量測來自個體之組織或體液中FIX(例如FIXa)及/或FX(例如FXz)之表現量，並將所量測之表現量與正常組織或體液中FIX(例如FIXa)及/或FX(例如FXz)之標準表現量相比較，其中該表現量相較於標準量增加或降低指示病症。
可使用本發明之結合分子及其抗原結合片段、變異體及衍生物，使用熟習此項技術者已知之經典免疫組織學方法檢定FIX(例如FIXa)及/或FX(例如FXz)(參見例如，Jalkanen等人,J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985)；Jalkanen等人,J. Cell Biol . 105:3087-3096 (1987))。
可用於偵測FIX(例如FIXa)及/或FX(例如FXz)蛋白質表現的其他基於抗體之方法包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸附劑檢定(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法。適合檢定在本文別處有更詳細地描述。
片語檢定FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽之表現量係指直接(例如藉由測定或估計絕對蛋白質含量)或相對地(例如藉由與第二生物樣品中疾病相關多肽含量)定性或定量地量測或估計第一生物樣品中的FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽量。
可量測或估計第一生物樣品中之FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽表現量並與標準FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽量相比較，該標準係自未患該病症之個體獲得的第二生物樣品取得或藉由對未患該病症之個體群之含量求平均值測定。如此項技術中所瞭解，一旦已知「標準」FIX(例如FIXa)或FX(例如FXz)多肽含量，即可反復使用其作為比較標準。
本發明提供一種量測有需要之受試者體內活化FIX之含量的方法，其包括使本文所揭示之抗FIXa抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該抗FIXa抗體或其抗原結合部分與該樣品中之FIXa的結合。
在一個實施例中，可使用第I類抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於游離FIXa或FIX酶原量測呈因子X活化酶複合物形式之活化FIX之含量。在另一實施例中，可使用第IV類抗FIXz抗體或其抗原結合部分，相較於游離FIXa或呈因子X活化酶複合物形式之FIXa量測FIX酶原之含量。在其他實施例中，可使用第II類抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於呈因子X活化酶複合物形式之FIXa或FIX酶原量測游離FIXa之含量。在一些實施例中，可使用第III類抗FIXa抗體或其抗原結合部分，相較於FIX酶原量測活化FIX(亦即，游離FIXa及之呈因子X活化酶複合物形式之FIXa)之含量。
亦提供一種量測有需要之受試者體內之酶原FX (FXz)的方法，其包括使第V類抗FXz抗體或其抗原結合部分與自該受試者獲得的樣品在適合條件下接觸，及量測該抗FX抗體或其抗原結合部分與該樣品中FXz之結合。在其他實施例中，可使用第VI類抗FXa抗體或其抗原結合部分，相較於FX酶原量測活化FX之含量。在一些態樣中，該樣品係血液或血清。 X. 組合治療
本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體或雙特異性抗FIX/抗FX抗體)可作為唯一活性劑投予或亦可與一或多種可用於治療各種疾病之其他藥劑或治療劑組合，例如以組合療法投予。舉例而言，該其他藥劑可為技術認可為可用於治療由本文提供之雙特異性抗體所治療之疾病或病狀的治療劑。該組合亦可包括超過一種其他藥劑，例如兩種或三種其他藥劑。
在某些實施例中，該其他藥劑或治療劑係常用於治療凝血或出血病症之藥劑。熟習此項技術者將瞭解常規治療劑。在一些實施例中，該其他治療劑係血友病治療劑。例示性血友病治療劑包括但不限於因子濃縮物替代療法。在特定實施例中，輔因子替代療法係FVIII替代療法。熟習此項技術者應瞭解，替代療法可為血漿來源及/或重組FVIII替代品。在一些實施例中，FVIII替代療法係重組FVIII。在另一實施例中，FVIII替代療法係血漿源性FVIII。在各種實施例中，該其他藥劑或治療劑可包括例如乙酸去胺加壓素(desmopressin acetate)、防凝塊藥物(例如抗纖維蛋白溶解劑)或纖維蛋白密封劑。
在某些實施例中，該其他藥劑或治療劑可在投予本文所述之抗體之前、期間或之後投予受試者。在各種實施例中，該其他藥劑或治療劑及本文所提供之抗體可按相同給藥時程投予。在一些實施例中，該其他藥劑或治療劑係與本文所述之抗體同時投予。
在各種實施例中，該其他藥劑或治療劑係預防性或按需投予。在另一實施例中，該其他藥劑或治療劑係作為主要治療投予。在其他實施例中，該其他藥劑或治療劑係作為次要治療投予。
在一些實施例中，當本文所揭示之結合分子(例如抗FIX抗體、抗FX抗體、雙特異性抗FIX/抗FX抗體，或免疫偶聯物)與標準護理一起或作為標準護理之輔助投予時，利用本文所揭示之結合分子之治療可在開始標準療法之前，例如在開始標準療法之前一天、數天、一週、數週、一個月或甚至數月起始。 XI. 套組
本發明亦提供可用於執行本文所述之方法的套組，該等套組包含本文所揭示之結合分子或其抗原結合部分。在某些態樣中，套組包含(i)本文所揭示之抗體、雙特異性分子、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)，或其組合；及(ii)使用說明書。在一些態樣中，套組在一或多個容器中包含本文所揭示之抗體、雙特異性分子、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)，或其組合。
在一些態樣中，套組含有執行偵測檢定所需及/或足夠的所有組分，包括所有對照物、有關執行檢定之指導，及用於分析及呈現結果之任何必要軟體。
熟習此項技術者將易於認識到，本文所揭示之抗體、雙特異性分子(例如雙特異性抗體)、免疫偶聯物、醫藥組成物、核酸(例如DNA或mRNA)、載體或細胞(例如宿主細胞)，或其組合可容易地併入此項技術中熟知的確定套組形式之一中。 實例 實例1 產生相較於FIX優先結合至FIXa之抗體
抗體選擇及抗體產生之設計 ： 自人類抗體Adimab酵母文庫(ADIMAB, 7 Lucent Drive, Lebanon, NH 03766)選擇針對人類活化FIX之一系列人類抗體。抗體選擇係使用三種不同的因子IX變異體進行： (i)「不可活化FIX」(亦縮寫為FIXn)，其係在180位(成熟序列編號)帶有精胺酸變為丙胺酸之突變，由此防止其活化並使因子IX維持酶原形式(FIXz)的因子IX。 (ii)「游離FIXa」，呈活化FIX形式且咸信在未結合FVIIIa形成因子X活化酶複合物時呈活化FIX之構象；及 (iii)「FIXa-SM」，呈在活性位點共價結合至受質模擬物(例如L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，亦即EGR-CMK)之活化FIX形式，意圖模擬活化FIX活性最強之構象。
FIX酶原(例如不可活化FIX)、游離活化FIX及FIXa-SM (例如因子IXa + EGR-CMK)之示意圖顯示於圖1A中。
在每一情形中，FIX序列之後係在分子C末端之GS連接子及生物素化標籤。當在生物素存在下與生物素連接酶BirA共表現時，所得FIX分子將帶有單一生物素標記以允許用Adimab展示文庫選擇。
在生物素存在下，與BirA一起重組表現不可活化FIX，並根據此項技術中已知之方法純化。由表現非活化前驅體(FIX酶原)產生游離FIXa，亦在生物素存在下與BirA共表現，並以與不可活化FIX相同之方式純化。接著，藉由在鈣存在下，以1:500莫耳比添加重組凝血因子XIa使非活化FIX前驅體活化，且隨後根據此項技術中已知之方法，藉由尺寸排阻層析法純化。
向游離FIXa中添加三肽氯甲基酮(亦即，EGR-CMK)引起該肽，或受質模擬物，及FIXa活性位點之共價連接。儘管與肽之不可逆連接中和FIXa活性，但認為該複合物模擬受質結合或活性最強的FIXa構象。為產生在活性位點共價結合至受質模擬物的活化因子IX(亦即，FIXa-SM)，將游離FIXa與5倍莫耳過量之肽一起在鈣及30%乙二醇存在下培育六小時。藉由尺寸排阻層析法或透析移除過量的肽並藉由質譜法確定活性位點飽和。
用於上述實例中的FIX蛋白質係根據此項技術中已知之方法重組產生的。凝血因子之序列係：不可活化FIX (SEQ ID NO: 773)、游離FIXa (SEQ ID NO: 764之47至191及SEQ ID NO: 764之胺基酸227至461)且FIXa-SM為(在活性位點共價結合至EGR-CMK的SEQ ID NO: 764之47至191及SEQ ID NO: 764之胺基酸227至461)，如表4中所示。
根據此項技術中已知之方法，將所有FIX蛋白質緩衝液更換為以5 mM CaCl2 作為添加劑的Tris緩衝之生理食鹽水。
如所述，產生一組針對FIXa之抗體，相對於FIX，其能夠以與FVIIIa類似之方式優先與FIXa締合。為了產生該等類別之抗體，根據美國公開案第2010/0056386號及第2009/0181855號中所揭示之方法篩選Adimab表現文庫，各案以全文引用之方式併入本文中。參見例如，Van Deventer及Wittrup (2014) Methods Mol. Biol. 1319:3-36；Chao等人(2006), Nature Protocols 1(2):755-768；Feldhaus等人(2003) Nature Biotechnology 21(2):163-170；Boder及Wittrup (1997) Nature Biotechnology 15(6):553-557，均以全文引用之方式併入本文中。
在針對靶抗原游離FIXa及/或FIXa-SM之陽性選擇壓力及針對不可活化FIX之陰性選擇壓力的數輪迭代選擇之後，使用此項技術中已知之技術對集落測序以鑑別獨特純系。在抗體選擇之後，表現該等選擇性抗體中之658種抗體並根據標準方法，在蛋白質A樹脂上自酵母純化。隨後，藉由生物膜層干涉法(BLI)再次關於其相對於不可活化FIX優先結合至游離FIXa及/或模擬物結合之FIXa來篩選該658種抗體。
除非另外說明，否則本文所揭示之BLI實驗中的所有抗原皆購自Haematologic Technologies, Inc. (HTI, 57 River Road, Essex Junction, VT, USA)：FIXz (目錄號HCIX-0040)、游離FIXa (目錄號HCIXA-0050)及FIXa-SM (目錄號HCIXA-EGR)。在所有BLI實驗中使用OctetRed94、Ocetet QK 384或Octet HTX系統。所有方法，關於抗體及抗原濃度以及各個步驟之溫育時間，均基於製造商之推薦。基線步驟係60秒。抗體係以範圍自100至200 nM或10至15 μg/mL之濃度裝載至抗人類IgG定量探針上，保持180秒。抗原濃度在10至250nM範圍內且抗原與載有抗體之探針的締合在90至180秒範圍內。解離步驟係在單獨緩衝液中進行90至180秒。所有BLI實驗均用包括100-200nM NaCl、25-50mM Tris pH 7.4-8.0或25-50mM Hepes pH 7.4-8.0且在存在或不存在0.1% BSA、存在或不存在2.5-5mM CaCl2之緩衝液進行。有關具體實驗之其他詳情見於以下實例中。各種抗體與特定抗原之相對結合一般以「反應」或自締合期開始至結束時奈米位移之變化報告。抗原結合反應取決於在裝載期間裝載至探針上的抗體量。因此，若裝載至探針上的抗體量相同且抗原濃度及締合期時長相同，則該等反應係相當的。在其他情況下，可以使用ForteBio資料分析軟體計算KD 。在所有情況下，確定不存在該等抗原與抗人類IgG AHQ探針之非特異性結合。
用於鑑別優先結合游離FIXa及FIXa-SM之抗體的實驗類選概述顯示於圖2中。類選方案之詳情提供於以下「結合至靶抗原之抗體的表徵」及「針對生物物理特性篩選抗體」部分中。
該另外的抗體類選產生可優先結合至游離FIXa及FIXa-SM的一組93種抗體。可變區之胺基酸及核酸序列提供於下。該93種抗體之VH及VL的生殖系序列及CDR序列顯示於圖3A、3B、3C及圖3D中(BIIB-9-1335及BIIB-9-1336除外，其係藉由以下實例5中所示之方法獲得)。
結合至靶抗原 FIXa 之抗體的表徵 ： 為了鑑別在初步選擇中發現的經證實相較於不可活化FIX優先結合至游離FIXa之抗體，使用BLI，使用抗人類IgG 定量(AHQ) dip and read生物感測器(Pall ForteBio: 目錄號18-5005)，以單價檢定形式用150 nM抗體篩選自酵母Adimab文庫純化之658種抗體。BLI係根據標準程序，在OctetRed94或Octet HTX系統上執行。簡言之，在補充有5 mM CaCl2 及0.1%牛血清白蛋白(TBSFCa)之Tris緩衝生理食鹽水中平衡生物感測器。接著將板轉移至儀器上。在儀器上執行浸泡步驟，並在TBSFCa中溫育生物感測器60秒。接著，將生物感測器轉移至含有代表性IgG (150 nM於TBSFCa中)之孔中，保持180秒。之後，在TBSFCa中溫育生物感測器60秒以確定基線。接著，將生物感測器轉移至含有所需抗原(100 nM於TBSFCa中)之孔中並溫育90秒。最後，將感測器轉移至單獨TBSFCa中，溫育90秒。
在針對游離FIXa特異性之初始酵母文庫選擇中鑑別的658種抗體幾乎全部對游離FIXa展示高於不可活化FIX的近似結合親和力。在BLI檢定中，有四種抗體(亦即，BIIB-9-397、BIIB-9-578、BIIB-9-612及BIIB-9-631)對不可活化FIX之親和力高於游離FIXa。
繪製在選擇中鑑別的93種抗體各自在抗原締合期之後針對100 nM游離FIXa或不可活化FIX之最大反應值(nm)(圖4A及圖4B)。
如藉由BLI所量測，對游離FIXa之結合親和力高於不可活化FIX之抗體可能例如由於與人類FIXa上FIXa特有之抗原決定基，或FIXa上明顯不同於FIX酶原上之相應抗原決定基之抗原決定基的選擇性結合而優先結合游離FIXa。換言之，抗體與FIXa之優先結合可例如由與FIX酶原中不存在之抗原決定基之結合，或由對相同抗原決定基或其變異體(例如重疊抗原決定基或構象不同之抗原決定基)之較高結合親和力驅動。
圖5顯示如藉由ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供的1:1擬合算法測定的所列抗體各自與游離FIXa之表觀單價親和力值(KD )的表。
一組選定的分析抗體之BLI結合曲線提供於圖6A-6E中。藉由BLI測定的一組選定的測試抗體對游離FIXa或不可活化FIX之近似單價親和力列於圖6F中。
預計優先識別活性較強構象之FIXa(亦即，FXa-SM)的雙特異性抗體的活性將高於優先結合至游離FIXa之抗體。
如圖7中所示，根據製造商之程序，在OctetRed94或 Octet HTX系統上，在利用150 nM抗體之BLI單價結合檢定中，進一步評估對游離FIXa展示之結合親和力高於對不可活化FIX之結合親和力的一小組93種抗體與100 nM游離FIXa及與100 nM FIXa-SM之結合。簡言之，在TBSFCa中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read生物感測器(Pall Fortebio: 目錄號18-5005)。接著將板轉移至儀器上。在儀器上執行浸泡步驟，並在TBSFCa中溫育生物感測器60秒。接著，將生物感測器轉移至含有代表性IgG (150 nM於TBSFCa中)之孔中，保持180秒。之後，在TBSFCa中溫育生物感測器60秒以確定基線。接著，將生物感測器轉移至含有所需抗原(100 nM於TBSFCa中)之孔中並溫育90秒。最後，將感測器轉移至單獨TBSFCa中，溫育90秒。
觀察到多種抗體與FIXa-SM之結合高於與游離FIXa之結合。有關與各靶抗原締合之BLI結合曲線的代表性實例提供於圖8A-8E中。圖8F中之表列出根據ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供之擬合算法得到的測試抗體與各靶抗原之表觀親和力。
由BLI實驗鑑別出四類抗體，用於說明在選擇中發現之抗體之特異性：第 I 類 ：相較於游離FIXa或不可活化FIX，抗體優先結合至FIXa-SM。此類別之實例有BIIB-9-460及BIIB-9-484，如圖9A中所示；第 II 類 ：相較於FIXa-SM或不可活化FIX，抗體優先結合至游離FIXa，以BIIB-9-885及BIIB-9-416為代表(圖9B)；第 III 類 ：抗體近似相等地結合至FIXa-SM或游離FIXa，但不與不可活化FIX明顯締合。BIIB-9-1287用作此類別之實例(圖9C)；及第 IV 類 ：相較於游離FIXa或FIXa-SM，抗體優先結合至不可活化FIX(圖9D)。BIIB-9-397用作此類別之實例。
列出本文所揭示之所有抗FIX抗體(例如抗FIXa抗體或抗FIXz抗體)之類別指定的表提供於圖10中。
針對生物物理特性篩選抗體 ：藉由親和捕獲自相互作用奈米粒子光譜法(affinity capture self-interaction nanoparticle spectroscopy，AC-SINS)檢查93種抗FIX抗體，該方法係微量濃縮奈米粒子表面上之靶抗體以評估自締合之檢定。根據文獻中所描述之方法進行AC-SINS篩選以鑑別相較於其等效物具有較差生物物理特性，例如自聚集之抗體。參見例如，Liu等人(2014) MAbs. 6(2):483-92；及Wu等人(2015) Protein Engineering, Design and Selection 28: 403-414，二者皆以全文引用之方式併入本文中。將100 µl體積初始濃度為40 µg/ml的各抗體捕獲於金奈米粒子之表面上並在室溫下溫育兩小時。在溫育後，測定在一系列波長範圍內之吸光度。在抗體自締合之情況下，粒子間距離減小，使得較高波長具有最大吸光度。相較於內標之生物物理特性，超過540 nm的最大波長指示抗體有自相互作用之傾向。列出由AC-SINS測定的93種抗FIX抗體之最大波長計算值的表顯示於圖11中。 實例2 產生相較於FXa優先結合至FX之抗體
抗體選擇及抗體產生之設計 ： 為了獲得相較於活化因子X (FXa)，選擇性結合FX酶原(例如不可活化因子X (FX))之抗體，使用三種不同因子X變異體自酵母Adimab人類抗體文庫選擇抗體：(i) 「不可活化因子X」(「FXn」)，係在194位(成熟序列編號)帶有精胺酸變為丙胺酸之突變，由此防止其活化並使FX維持酶原形式的FX。此為用於BLI實驗之FXz (酶原FX)。如下文所描述，產生FXn且在室內生物素化；(ii) 「游離FX」(「FXa」)，係不含任何受質模擬物的一種形式之活化FX且咸信呈野生型活化FX構象(HTI，目錄號HCXA-0060)；及(iii) 「FXa-SM」，呈在活性位點共價結合至受質模擬物(例如EGR-CMK)的一種形式之活化因子X(HTI，目錄號HCXA-EGR)。在一些情況下，受質模擬物經生物素化(BEGR-CMK)且共價結合至活性位點(HTI，目錄號HCXA-BEGR)。
FX酶原、游離FXa及FXa-SM (因子Xa + EGR-CMK)之示意圖顯示於圖1B中。
不可活化FX序列之後係在分子C末端之GS連接子及生物素化標籤。當在生物素存在下與生物素連接酶BirA共表現時，所得FX分子將帶有單一生物素標記以允許用Adimab展示文庫選擇。
不可活化FX與BirA一起在生物素存在下重組表現且根據此項技術中已知之方法純化。
與FIXa中之情形相同，具有序列EGR之三肽氯甲基酮(亦即，EGR-CKM)可共價修飾FXa之活性位點，模擬受質結合之FXa構象。
為進行陰性選擇，游離FXa (HTI，目錄號HCXA-0060)及人類FXa-SM (HTI，目錄號HCXA-EGR及HCXA-BEGR)係購自Haematologic Technologies Incorporated (HTI)。
根據此項技術中已知之方法，將所有FX蛋白質，無論是室內製造的抑或購買的，緩衝液更換為以5 mM CaCl2 作為添加劑的Tris緩衝之生理食鹽水。在本發明中，描述一組針對不可活化FX產生的抗體，該等抗體展示的與不可活化FX之結合高於與FXa(例如游離FXa或FXa模擬物)之結合(以與FVIIIa類似之方式)。
與在以上所揭示之抗FIX抗體情況下相同，根據美國公開案第20100056386號及第20090181855號中所揭示之方法，篩選Adimab表現文庫。在針對靶抗原FX，亦即不可活化FX之陽性選擇壓力以及針對游離FXa或FXa-SM之陰性選擇壓力的數輪迭代選擇之後，使用此項技術中已知之技術對集落測序以鑑別獨特純系。在抗體選擇之後，表現超過800種抗體並根據標準方法，在蛋白質A樹脂上自酵母純化。用於鑑別選擇性結合至不可活化FX之抗體的實驗類選概述於圖2中。
有關類選方案第二步驟之詳情提供於題為「結合至靶抗原因子 X(FX) 之抗體的表徵 」及「針對生物物理特性篩選抗體」部分中，參見下文。第二步驟之抗體類選產生一組94種針對FXn之抗體，相較於活性FXa(例如野生型FXa或FXa-SM)，該等抗體優先結合至FXn。可變區之胺基酸及核酸序列提供於上。有關該94種抗體各自之生殖系及CDR序列的表描繪於圖12A、12B及12C中。
結合至靶抗原因子 X (FX) 之抗體的表徵 ： 為了進一步確定所發現之抗體中與FX酶原之結合高於與FXa-SM之結合的抗體，使用生物膜層干涉法(BLI)，以單價檢定形式，用200 nM抗體篩選自酵母純化的超過800種抗體。不可活化FX及FXa-SM係自HIT獲得。游離FXa及FXa-SM在結合實驗中之表現相同，且可互換使用，因此未顯示游離FXa之結果。由於所呈現的游離FXa之資料與FXa-SM對應，故使用FXa-SM之觀察結果同樣適用於游離FXa。
BLI係根據標準程序，在OctetRed94或Octet HTX系統上執行。簡言之，在TBSFCa中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read生物感測器(Pall Fortebio: 目錄號18-5005)。接著將板轉移至儀器上。在儀器上執行浸泡步驟，並在TBSFCa中溫育生物感測器60秒。接著，將生物感測器轉移至含有代表性IgG (200 nM於TBSFCa中)之孔中，保持180秒。之後，在TBSFCa中溫育生物感測器60秒以確定基線。接著，將生物感測器轉移至含有所需抗原(200 nM於TBSFCa中)之孔中並締合90秒。最後，將感測器轉移至單獨TBSFCa中，溫育90秒。繪製在締合期後在選擇中鑑別的94種抗體各自對於200 nM FXn或FXa-SM之最大反應值(nm)。在針對FXn特異性之選擇中鑑別的抗體幾乎全部展示之對FX之結合親和力高於對共價修飾之FXa之結合親和力(圖13)。
僅BIIB-12-894、BIIB-12-925、BIIB-12-1320及BIIB-12-1321對FXa-SM展示較強結合。預期相較於活化FX(例如游離FXa或FXa-SM)優先結合至FXn之抗體相較於FXa，優先結合至FX酶原。因此，抗FIXn抗體亦可稱為抗FXz抗體。圖14包括的表列出了根據ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供之擬合算法得到的測試抗體與FXn之表觀親和力。
針對生物物理特性篩選抗體 ： 如關於以上揭示之抗FIXa抗體所描述，藉由親和捕獲自相互作用奈米粒子光譜法(AC-SINS)檢查94種抗FXz抗體。根據文獻中所描述之方法進行AC-SINS篩選以鑑別相較於其等效物具有較差生物物理特性(例如自締合傾向)之抗體。參見例如Liu等人(2014) MAbs 6(2):483-92。將100 µl體積初始濃度為40 µg/ml的抗體捕獲於金奈米粒子之表面上並在室溫下溫育兩小時。在溫育後，測定在一系列波長範圍內之吸光度。在抗體自締合之情況下，粒子間距離減小，使得較高波長具有最大吸光度。相較於內標之生物物理特性，超過540 nm的最大波長指示抗體有自相互作用之傾向。圖15包括的表列出了藉由AC-SINS測定的94種抗FXz抗體之最大波長計算值。 實例3 雙特異性抗體之構築及在發色檢定中FVIIIa樣活性之評價
由實例1和2中所述之個別抗體產生由兩個不同Fab臂組成之雙特異性抗體，該等Fab臂之一相較於FIX酶原優先結合至活化FIX(「FXa」)(第I、II及III類抗體)且另一臂相較於FXa優先結合至FX酶原(第V類抗體)。產生另外的雙特異性抗體，該等抗體由相較於FIXa優先結合至FIX酶原之第一Fab臂(第IV類抗體)及相較於FXa優先結合至FXz(第V類抗體)或相較於FXz優先結合至FXa之第二Fab臂(第VI類抗體)組成。亦產生其他雙特異性抗體，該等抗體由相較於FIXz優先結合至FIXa之第一Fab臂(第I、II及III類抗體)及相較於FXz優先結合至FXa之第二Fab臂(第VI類抗體)組成。
所揭示之雙特異性抗體可使用此項技術中已知之方法產生，無需過多實驗。參見例如，Kontermann及Brinkmann (2015) Drug Discovery Today 20:838-847及其中引用之參考文獻；Spies等人(2015) Molecular Immunology 67:95-106及其中引用之參考文獻；Byrne等人(2013) Trends in Biotechnology 31:621-632及其中引用之參考文獻；Strop等人(2012) J. Mol. Biol. 420:204-219及其中引用之參考文獻；其全部以全文引用之方式併入本文中。亦參見，以全文引用之方式併入本文中。
雙特異性抗體由兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈，或兩條不同重鏈及一條共同輕鏈以IgG1樣形式組成。在另一小組中，該等雙特異性抗體屬於IgG4亞類。先在發色檢定中且其次在基於血漿之凝血檢定中針對替代FVIIIa活性之能力(亦即，模擬FVIIIa之能力)篩選該等雙特異性抗體。
檢定緩衝液、磷脂、CaCl2 及FXa發色受質S-2765係作為Chomogenix Coatest SP因子VIII套組(目錄號K824086)之一部分購自Diapharma。使用1X檢定緩衝液製劑稀釋所有蛋白質。在室溫下，將各雙特異性抗體(25 µL)與20 µL稀釋至750 nM之FX (HTI，目錄號HCX-0050)、20 µL稀釋至75 nM之FIXa (HTI，目錄號HCIXA-0050)及10 µL磷脂混合。5分鐘後，添加25 µL CaCl2 。
又10分鐘後，添加50 µL受質S-2765且每15秒在Biotek Synergy2板讀取器中讀取在405 nM下之吸光度，持續一小時。藉由在每條吸光度曲線線性部分之時間內OD 405 nM之變化測定初始速率。如藉由OD 405 nM (mOD/分鐘)隨時間之變化所量測，在無FVIIIa存在下，hFIXa係低活性酶，僅產生少量FXa，產生基線FXa受質裂解水準。在FXa產生檢定中，在添加雙特異性抗體之後，FXa受質裂解速率增加指示其能夠促進FIXa對FX之活化作用(由此替代FVIIIa樣功能)。使用此方法，鑑別出202種抗體，該等抗體模擬FVIIIa活性，亦即，具有的FXa受質裂解速率比未添加雙特異性抗體情況下之平均基線速率高至少三個標準差(5.88 mOD/分鐘)。
圖16A-16D中顯示在無雙特異性抗體存在下OD隨時間之變化(基線)，亦即在3種不同雙特異性抗體存在下OD隨時間之變化：BIIB-9-484/BIIB-12-915、BIIB-9-619/BIIB-12-925及BIIB-9-578/BIIB-12-917，該等抗體能夠替代FVIIIa樣功能。
能夠替代FVIIIa樣功能之全部202種IgG1雙特異性抗體之速率顯示於圖16A-16D中。呈IgG4-鉸鏈形式的一小組該等抗體之速率顯示於圖17中。 表2. 例示性雙特異性抗體 實例4 在基於血漿之凝血檢定中評估雙特異性抗體
在一期血漿凝固檢定中，進一步測試在發色檢定中能夠替代及/或模擬FVIIIa活性之雙特異性抗體替代FVIIIa樣活性的能力。僅選擇在上述發色檢定中展示最強活性之雙特異性抗體用於本研究。
將不同濃度之雙特異性抗體(5 µL)與50 µL不含FVIII之血漿(Siemens)混合60秒。為活化反應，將50 µL Actin FSL鞣花酸添加至反應混合物中，保持240秒，隨後添加50 µL CaCl2 。使用Sysmex CA-1500系統(Siemens)，藉由光學偵測來量測凝固時間，保持300秒。在雙特異性抗體存在下凝固時間縮短，尤其是凝固時間縮短至基線以下達到約126秒及存在指示凝固時間縮短之劑量反應，認為指示該抗體能夠替代FVIIIa功能並促進凝塊形成。
圖19顯示三種此類雙特異性抗體之實例：BIIB-9-484/BIIB-12-917、BIIB-9-484/BIIB-12-915及BIIB-9-484/BIIB-12-1306。為了顯示FVIIIa樣活性係由抗體之雙特異性形式引起，利用單獨抗FIXa及抗FX同二聚體，或同二聚體混合群進行相同實驗，與雙特異性抗體進行比較。BIIB-9-484及BIIB-12-917對之結果顯示於圖20中。
為了確保在FXa產生及基於血漿之凝血檢定中所觀察的雙特異性活性涉及各靶抗原之同時締合，在ForteBio HTX系統上，使用抗生蛋白鏈菌素dip and read生物感測器(Pall ForteBio；目錄號18-5021)進行基於BLI之實驗。在補充有0.1%牛血清白蛋白及5 mM CaCl2 之Tris緩衝生理食鹽水(在圖21中稱為緩衝液)中溫育之後，接著將生物感測器與在室內製備之生物素化FIXa-SM一起溫育。隨後，將生物感測器轉移至含有100 nM BIIB-9-484/BIIB-12-917之孔中。最後，將該等生物感測器與200 nM未生物素化之FX(非活化因子X)一起溫育。如本文之揭示內容中所展示，圖21中作為實例呈現的雙特異性BIIB-9-484/BIIB-12-917能夠與各靶抗原締合。此結果支持且符合所觀察到的其功能活性。 實例5 工程改造及優化雙特異性活性
為了確定是否能經由工程改造抗體:抗原相互作用改善雙特異性活性，對BIIB-9-484 VH之CDR1及CDR2區進行修飾以將胺基酸多樣性引入生殖系序列中。接著將106 種BIIB-9-484序列衍生物構成之文庫引入Adimab平台中。
為了鑑別相對於不可活化FIX，對FIXa(亦即，游離FXa)及FIXa-SM之親和力提高之衍生物，根據以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第20100056386號及第20090181855號中所揭示之方法，對表現文庫進行藉由對較高親和力純系施加選擇壓力而進行的數輪迭代選擇。亦參見Van Deventer及Wittrup (2014) Methods Mol. Biol. 1319:3-36；Chao等人(2006), Nature Protocols 1(2):755-768；Feldhaus等人(2003) Nature Biotechnology 21(2):163-170；Boder及Wittrup (1997) Nature Biotechnology 15(6):553-557，全部以全文引用之方式併入本文中。
隨後，根據此項技術中已知之方法，淬滅集落以鑑別獨特衍生物。此程序鑑別出至少76種獨特VH序列。表現76種抗體且根據此項技術中之標準程序，藉由蛋白質A純化自酵母純化。
接著，使用BLI，以單價檢定形式利用200 nM抗體針對與靶抗原游離FIXa (HTI)或FIXa-SM (HTI)之結合的改善再篩選由親本BIIB-9-484得到的76種獨特的衍生物抗體。BLI係根據製造商之程序，在Octet HTX系統上進行。簡言之，在TBSFCa中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read生物感測器(Pall Fortebio: 目錄號18-5005)。接著將板轉移至儀器上。在儀器上執行浸泡步驟，並在TBSFCa中溫育生物感測器60秒。接著，將生物感測器轉移至含有代表性IgG (100 nM於TBSFCa中)之孔中，保持180秒。之後，在TBSFCa中溫育生物感測器60秒以確定基線。接著，將生物感測器轉移至含有所需抗原(10 nM於TBSFCa中)之孔中並締合90-180秒。最後，將感測器轉移至單獨TBSFCa中，溫育180秒。
至少兩種BIIB-9-484衍生物，分別命名為BIIB-9-1335及BIIB-9-1336，在10 nM抗體濃度下展示與靶抗原之結合相對於親本抗體明顯改善。與BIIB-9-484重鏈CDR1及CDR2區之偏差標註於圖22A中。揭示該兩種衍生物之BLI結合曲線，展現所觀察到的與靶抗原(亦即，游離FIXa)之較強結合(圖22B-22D)。BIIB-9-484、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336之經修飾VH區的胺基酸及核酸序列提供於下。
藉由在一期凝血檢定中比較各雙特異性抗體(含有親本抗FIXa臂或具有恆定抗FX臂的親和力成熟之抗FIXa臂)替代FVIIIa活性之能力來測試增加雙特異性抗體抗FIXa臂之親和力的影響。如實例4中所解釋，進行實驗。一個此類實例顯示於圖23中，其中雙特異性抗體(BIIB-12-917)之抗FX臂與BIIB-9-484抗FIXa臂，或與抗FIXa臂之親和力成熟產物(BIIB-9-1335及BIIB-9-1336)配對(圖23)。含有親和力成熟之抗FIXa臂相對於含有親本抗FIXa臂之雙特異性抗體凝固時間的進一步降低指示，增加抗FIXa臂之親和力引起所得雙特異性抗體之活性增加。 實例6 有關針對FVIII之FVIIIa模擬性雙特異性抗體用於血友病A治療的基準分析
使用多種活性檢定，將參考雙特異性抗體(bsAb)及本發明之雙特異性抗體BS-027125與重組FVIII (rFVIII)進行比較。bsAb BS-027125包含BIIB-9-1336及BIIB-12-917。參考雙特異性抗體具有與ACE910/艾美珠單抗(「艾美珠單抗生物類似藥」)一致之序列；ACE910係結合至活化因子IX及因子X且模擬因子VIII (FVIII)之輔因子功能的重組人類化雙特異性抗體。ACE910揭示於美國專利第8,062,635號中，以引用之方式併入本文中。艾美珠單抗生物類似藥及BS-027125分別描繪於圖24A及圖24B中。艾美珠單抗生物類似藥結合至因子IX酶原、因子IXa、因子X酶原及因子Xa中之每一個，且Kd 為約1 μM (圖24A)。BS-027125亦結合至因子IX酶原(KD = 8nM)、因子IXa (KD = 2 nM)及因子X酶原(KD = 20 nM)，但不結合至因子Xa (圖24B)。因此，相較於艾美珠單抗生物類似藥，BS-027125對活化因子IX及/或因子X酶原具有較高親和力及較高特異性。
如上文所揭示，使用Adimab活體外酵母呈遞平台，利用基於FACS之選擇隨後親和力成熟來設計BS-027125。藉由將使用Adimab鑑別的＞200種獨特FIXa特異性抗體及＞250種獨特FX特異性抗體設計成bsAb形式來產生初始bsAb庫。BS-027125之親本抗體BS-027025在此初始bsAb庫中具有最高的FVIIIa樣活性，在一期凝血檢定中維持顯著活性。如圖25中所描繪，BS-027025在該檢定中明顯縮短凝固時間，基本上接近重組因子VIII之活性。如表3中所示，BS-027025結合至因子XI酶原(KD = 370 nM)、因子IXa (KD = 67 nM)、因子IXa-LTR (KD = 10.5 nM)及因子X酶原(KD = 20 nM)，但不結合至因子IXa。 表3.
使BS-027025之抗FIXa臂親和力成熟產生bsAb BS-027125。增加抗FIXa臂之親和力(BS-025變為BS-125)使所得雙特異性抗體之FXa產生速率增加，特別是當與BS-027或BS-007組分配對形成雙特異性抗體時。(資料未顯示)進一步測試指示，如藉由一期凝血檢定所測定，BS-027125實現約90%的FVIIIa樣活性(圖26)。
藉由發色因子Xa(FXa)產生檢定(圖27)、由因子XIa觸發之凝血酶產生檢定(圖28A及28B)及由Actin FSL觸發之活化部分凝血活酶時間(aPTT)(圖26)量測BS-027125、其對應二價同二聚體及rFVIII之活性。
儘管參考bsAb在所有檢定中具有較高活性，但其達到峰值活性之濃度在各檢定間完全不同。BS-027125在所有檢定中亦展示活性，且在aPTT中具有高活性。對於該兩種bsAb，在凝血酶產生檢定中之滯後時間及峰高度與rFVIII活性程度不同相關。參考bsAb二價同二聚體在若干檢定中皆展現顯著活性，不過僅BS-027125 FIXa二價同二聚體在FXa產生檢定中保持適度活性。正如預期，在FXa產生檢定中，rFVIII在無磷脂存在下失去所有活性。BS-027125亦顯示極低的不依賴於磷脂之活性。相比之下，參考bsAb在無磷脂存在下具有極顯著之活性。 實例7 磷脂組成對雙特異性FVIIIa模擬抗體活性之影響
作為因子X活化酶複合物之一部分，活化因子VIII (FVIIIa)結合至細胞表面上暴露之磷脂醯絲胺酸(PS)並與活化因子IXa及因子X組裝在一起。經顯示，FVIIIa優先結合至含有磷脂醯絲胺酸(PS)及磷脂醯乙醇胺(PE)之磷脂。已顯示，磷脂醯膽鹼(PC)磷脂囊泡中磷脂醯乙醇胺(PE)之存在可減少獲得最佳凝血因子活性所需之PS的量，而僅由PS及PC構成之囊泡需要較高的PS含量來達成最佳活性。近期，已開發出FVIIIa模擬性雙特異性抗體(艾美珠單抗)在存在及不存在抑制劑情況下作為血友病A患者之潛在治療方法。相對於艾美珠單抗，FVIII模擬性雙特異性抗體BS-027125具有改良的靶特異性。鑒於磷脂組成影響因子X活化酶活性且抗體不直接結合磷脂，故有關FVIIIa模擬抗體是否會顯示類似磷脂偏好尚不瞭解。
比較改變磷脂組成及濃度對實例6中所示參考bsAb、本發明之雙特異性抗體BS-027125及重組FVIII (rFVIII)之活性的影響。
藉由用因子XIa觸發之凝血酶產生檢定評估參考bsAb、BS-027125及rFVIII之促凝血活性。如Mui B等人,Methods Enzymol, 2003中所述，藉由擠出來製備單層磷脂囊泡。所測試的合成磷脂囊泡由PS(磷脂醯絲胺酸)/PE(磷脂醯乙醇胺)/PC(磷脂醯膽鹼) (20%/40%/40%)或PS/PC (20%/80%)構成。
正如預期，rFVIII活性在含PE之磷脂上要高約2.5倍且當限制劑量或極大過量時，活性在兩種磷脂上喪失。值得注意的是，儘管參考bsAb活性在兩種磷脂上類似，但BS-027125之活性在含PE之磷脂上要高約3倍。支持峰值活性之磷脂濃度對於參考bsAb及BS-027125要比rFVIII高。該等結果表明，參考bsAb及BS-027125經由不同機制起作用。
對於rFVIII及BS-027125，在含PE之磷脂上活性增加之趨勢保持在FXa產生檢定與凝血酶產生檢定之間。參見圖29。不過Emi-bsim之活性在FXa產生中增加，但在凝血酶產生中不增加。參見圖30。rFVIII與FVIIIa模擬性雙特異性抗體在不同磷脂表面上不同的相對活性使得該等分子之間之直接比較變得複雜，並突顯出在有關FVIIIa模擬性雙特異性抗體相對於rFVIII之活性基準分析時檢定設計之影響。該等資料進一步表明Emi-bsim與BS-027125之間作用機制之差異。 實例8 抗FIXa抗體之抗原決定基分箱
為了確定各種抗FIXa抗體對是否結合至獨特位點，使用生物膜層干涉法，遵循製造商之說明書，在Octet HTX系統上進行分箱實驗。簡言之，在TBSFCa中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read生物感測器(Pall Fortebio: 目錄號18-5005)達60秒。隨後，經180秒將第一抗體(200nM於TBSFCa中)裝載至生物感測器尖端上，隨後在單獨緩衝液中執行基線步驟達60秒。
用非特異性IgG阻斷保留在探針上的任何游離結合位點，保持180秒，隨後在單獨緩衝液中進行另一基線步驟達60秒。接下來，使FIXa+SM (100nM於TBSFCa中)結合至載有抗FIXa抗體之探針，保持90秒。最後，使第一抗體與FIXa+SM之複合物暴露於第二抗FIXa抗體(200nM於TBSFCa中)。
信號之進一步增加指示，抗體1及抗體2可同時結合至抗原，且其係非競爭性的，意味著其不在同一組中(圖31A)。然而，若未觀察到信號進一步增加，則此指示抗體1及抗體2不能同時結合至抗原且因此認為其競爭，意味著其在同一組中(圖31B)。
若僅在一個方向上(亦即，抗體1-抗原-抗體2對比抗體2-抗原-抗體1)觀察到抗體1與2之同時結合，則認為此係單向衝突。
選擇一小組48種抗體進行此分析且結果概述於圖31C中。少數抗體由於資料收集誤差或由於給定抗體不結合至FIXa+SM(例如，因為其對FIXa具有特異性)而結束分析。
對分箱網路進行節點分析以提供各FIXa抗體在其分箱譜方面之接近程度的視覺呈現(圖31D)。大多數抗體相互極接近地群集，而存在少數不同組。BIIB-9-484看來在獨特組中。 實例9 BIIB-9-484及BIIB-9-1336之鈣依賴性結合
歸於BIIB-9-484之獨特分箱特徵，研究此抗體以及親和力成熟產物BIIB-9-1336之其他特性。由於包括FIXa在內之許多凝血因子之活性及結合特性均依賴於鈣，故首先使用生物層干涉法(BLI)，測試該兩種抗體之結合是否受鈣存在或不存在影響。
使用Octet QK384系統，在HBS中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read生物感測器(Pall Fortebio: 目錄號18-5005)，保持60秒，隨後為經180秒將10μg/mL抗體裝載至探針上的步驟。在HBS中之60秒基線步驟之後，使載有抗體之探針暴露於含200nM FIXa之HBS或含5 mM CaCl2之HBS，保持180秒，隨後在單獨HBS或含5 mM CaCl2之HBS中進行解離步驟，保持180秒。
圖32A及32B中所示之結合資料指示，BIIB-9-484及BIIB-9-1336與FIXa之結合均為鈣依賴性的。BIIB-9-484完全依賴於鈣的存在，而在無鈣存在下，BIIB-9-1336與FIXa之結合明顯較低，但仍可量測。 實例10 BIIB-9-1336對FIXa之蛋白水解活性的影響
為了確定BIIB-9-1336是否影響FIXa之酶功能，將不同量之抗體與含250nM FIXa之TBSCa一起溫育5分鐘。隨後，添加肽受質ADG299達到0.8 mM之最終濃度且藉由OD隨時間之變化量測FIXa之受質裂解速率(圖33A)。
對於比較，亦測試另一抗FIXa抗體BIIB-9-579以及作為陰性對照物之抗FX抗體BIIB-12-917影響FIXa之醯胺水解活性的能力。BIIB-9-1336能夠使FIXa之受質裂解速率增加3倍，而BIIB-9-579及BIIB-12-917沒有影響。
此活性與BIIB-9-1336呈單臂之同二聚體性質無關且僅含一個BIIB-9-1336臂之雙特異性抗體顯示相同的3倍速率增加。由於BIIB-9-1336係BIIB-9-484之產物且歸於同一獨特組中，故繼續測試該組中其他抗體增加FIXa之醯胺水解活性的能力。使用與上述相同之實驗設置，不過使用500nM FIXa，測試來自BIIB-9-484/1336組之15種抗體以及由屬於不同組的BIIB-9-619及BIIB-9-578得到的另外11種產物抗體。
在該等抗體存在下FIXa之醯胺水解活性增加倍數顯示於圖33B中，且指示增加FIXa之醯胺水解活性的能力係來自BIIB-9-484/BIIB-9-1336組之抗體特有的，在測試條件下達到最高5倍增加。接下來，測定在存在及不存在BIIB-9-1336下FIXa針對ADG299之動力學參數KM及Vmax。此處將500nM FIXa與1000nM BIIB-9-1336一起在含33%乙二醇之TBSCa中溫育。受質ADG299之濃度在10mM至0.078mM間變化。添加BIIB-9-1336使KM自4.4mM降低至3.4mM且使Vmax自500 mOD/分鐘增加至588 mOD/分鐘 (圖33C及33D)。
BIIB-9-1336/BIIB-12-917及單臂BIIB-9-1336使醯胺水解活性增加與同二聚體二價BIIB-9-1336類似之程度的能力指示，此活性係由一個BIIB-9-1336臂與FIXa之間之單價相互作用引起。 實例11 BIIB-9-1336對ATIII抑制FIXa之影響
抗凝血酶III係一種絲胺酸蛋白酶抑制劑且導致在ATIII與FIXa活性位點絲胺酸之間形成不可逆鍵。因此，抑制機制依賴於FIXa活性位點之反應性。由於BIIB-9-1336能夠增加FIXa之醯胺水解活性，故顯然其應當亦增加ATIII對FIXa之抑制速率。為了測試此觀點，在存在或不存在1500nM BIIB-9-1336或在BIIB-9-484親和力成熟期間鑑別之另一抗FIXa抗體BIIB-9-1335下，在TBSCa中溫育500nM FIXa與5000nM ATIII。在1、30、60及120分鐘時取出樣品並與非還原性SDS上樣緩衝液混合並在4-20% BioRad無染色劑凝膠上跑膠(圖34A)。
在接近75kDa分子量標記處出現的譜帶指示形成ATIII-FIXa複合物。對相對譜帶強度定量並隨時間變化繪圖(圖34B)且顯示BIIB-9-1335及BIIB-9-1336能夠使ATIII對FIXa之抑制速率增加約3倍。 實例12 FIXa上BIIB-9-1336抗原決定基之表徵
為了進一步瞭解BIIB-9-484及BIIB-9-1336與FIXa之相互作用，試圖確定該等抗體之確切抗原決定基。為此，首先使用標準方法選殖、表現及純化該等抗體各自之單獨Fab部分。隨後，在含鈣緩衝液中，將各Fab與FIXa以1.5:1莫耳比混合並使用尺寸排阻層析法自過量Fab中純化出所得複合物。
使用蒸氣擴散方法，在可商購之結晶篩選器上篩選所得1:1複合物。儘管兩種複合物均產生晶體，但只有BIIB-9-1336複合物晶體產生高品質繞射資料。使用標準方法，藉由分子置換解析所得到的在BIIB-9-1336 Fab與FIXa之間之結構，且顯示於圖35中。
FIXa上構成BIIB-9-1336抗原決定基之殘基在圖36中以黑色顯示，且為了比較，亦顯示出FIXa上構成FVIIIa結合位點之殘基。該等相同殘基在圖37之表中列出。
該等資料揭露，BIIB-9-1336及FVIIIa在FIXa上共有重疊抗原決定基。共有殘基在圖36中以白色繪出且在圖37中加下劃線且以粗體顯示。 實例13 FX上BIIB-12-917抗原決定基之表徵
由於BIIB-12-917在與BIIB-9-484或BIIB-9-1336配對時形成具有較高FVIIIa樣活性的高產雙特異性抗體，故嘗試表徵在FX上其抗原決定基。使用BLI，測試BIIB-12-917與一組不同的重組FX變異體，包括野生型酶原FX (FXz)、野生型活化FX (FXa)、保持活化肽之活化FX (FXa+AP)、不含活化肽之酶原FX (FXa-AP)及含有來自FX之活化肽的酶原FIX (FIX+FX AP)的結合。該等變異體之示意性表示提供於圖38B中。
使用Octet QK384，在HBSCa中平衡抗人類IgG Quantitation (AHQ) dip and read，保持60秒，隨後為經180秒將15μg/mL抗體裝載至探針上的步驟。在HBSCa中之60秒基線步驟之後，使載有抗體之探針暴露於含250nM各FX變異體之HBSCa，保持300秒，隨後在HBSCa中進行解離步驟，保持180秒。圖38A中之結合資料顯示，BIIB-12-917結合至含有FX活化肽之所有構築體，但不結合至不含活化肽之構築體。因此，BIIB-12-917之抗原決定基在FX活化肽內。 實例14 新抗FIXa抗體
使用實例1及5中所述之方法，藉由將胺基酸多樣性引入CDR H1及CDR H2；或CDR H3；或CDR L1、CDR L2及CDR L3；或其組合中，產生衍生自BIIB-9-484、BIIB-9-1336、BIIB-9-578或BIIB-9-619之一系列抗體。自該等文庫鑑別出具有增加之FIXa特異性及/或親和力之抗體。該等抗體之VH及VL結構域序列以及其CDR提供於下表6及7中。 實例15 在人類化小鼠血友病A模型中雙特異性抗體之藥物動力學及藥效學
在人類化小鼠血友病A模型中進行雙特異性抗體之臨床前藥物動力學評估。使用胚胎幹細胞基因靶向，經由同源重組將人類FIX及人類FX基因分別敲入各個對應的小鼠基因座中。隨後，利用CRISPR/Cas9技術編輯人類FIX基因敲入小鼠之FVIII基因以產生FVIII基因敲除種。在人類FIX基因敲入種與人類FX基因敲入種之間雜交育種將產生關於人類FIX及人類FX為純合型之小鼠(FIX-X-KI)。此小鼠模型可用於建立血栓形成模型，諸如下腔靜脈停滯模型或氯化鐵損傷頸動脈模型。在缺乏小鼠FVIII基因之人類FIX基因敲入種與人類FX基因敲入種之間雜交育種將產生關於人類FIX、人類FX為純合型且缺乏FVIII之小鼠(FIX-X-KI/FVIII-def)。此小鼠模型可用於建立止血模型，諸如斷尾模型及尾靜脈斷流模型。
在該等實驗中，向FIX-X-KI/FVIII-def小鼠給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或活化凝血酶原複合物濃縮物(aPCC)。根據分子且根據時間點向各組小鼠給藥。在給藥後的每個時間點，對小鼠實施安樂死並收集血液。一部分血液用於旋轉血栓彈性檢測(rotational thromboelastometry，ROTEM)或其他基於活性之檢定，且其餘血液處理成血漿以藉由ELISA測定雙特異性抗體之循環含量。 實例16 在人類化小鼠血友病A模型中雙特異性抗體之功效
利用斷尾出血模型測定雙特異性抗體之急性功效，在該模型中，切除尾尖且如先前所描述(Dumont等人, 2012, Blood, 119(13):3024-3030)，量測給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或aPCC的FIX-X-KI/FVIII-def小鼠之總失血量。如先前所描述(Pan等人, 2009, Blood, 114(13):2802-2811)，利用尾靜脈斷流模型測定雙特異性抗體之長期功效。簡言之，向FIX-FX-KI/FVIII-def小鼠給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或aPCC，並在給藥後24小時，將其麻醉並進行尾靜脈斷流。記錄下出血時間並將小鼠放回籠中，保持達24小時，此時評估其再出血情況、總體反應性、活動性及存活率百分比。 實例17 在人類化小鼠模型中進行雙特異性抗體之安全性評估
使用血栓形成模型評價雙特異性抗體之潛在促血栓形成特性。建立下腔靜脈停滯模型(Aleman等人, 2014, J Clin Invest, 124(8):3590-3600)或氯化鐵損傷頸動脈模型(Machlus等人, 2011, Blood, 117(18):4953-4963)。簡言之，對於下腔靜脈模型，將FIX-FX-KI小鼠麻醉，給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或aPCC，並進行無菌剖腹術以完全結紮下腔靜脈。24小時後，對小鼠實施安樂死並量測血栓重量。對於氯化鐵損傷頸動脈模型，將FIX-FX-KI小鼠麻醉並給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或aPCC。用10%氯化鐵溶液損傷頸動脈。藉由Doppler超音波監測血流變化並記錄下頸動脈堵塞之時間。 實例18 在食蟹獼猴中雙特異性抗體之藥物動力學及藥效學
如所描述(Dumont等人, 2015, Thromb Res, 136(6):1266-1272)，亦在食蟹獼猴中進行雙特異性抗體之藥物動力學及藥效學評估。簡言之，將開發獲得性血友病A模型，諸如Muto等人, 2014, Blood, 124(20):3165-3171中所描述。向患血友病的猴給與一系列量的雙特異性抗體、對照抗體、rFVIII及/或分流療法，諸如rFVIIa或aPCC。在給藥後一系列時間點，收集血液樣品。一部分血液將用於ROTEM分析或其他基於活性之檢定，且其餘血液將處理成血漿以藉由ELISA測定雙特異性抗體之循環含量。 ***
應理解，實施方式部分而非發明內容及摘要部分意圖用於解釋申請專利範圍。發明內容及摘要部分可陳述一或多個但非全部本發明人所預期的本發明之例示性實施例，且因此不打算以任何方式限制本發明及所附申請專利範圍。
以上已藉助於說明指定功能及其關係之實施方案的功能結構單元描述本發明。為便於說明，該等功能結構單元之邊界在本文中係任意指定的。可指定替代邊界，只要能適當執行指定功能及其關係即可。
特定實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般特性，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無過多實驗且不背離本發明之一般概念的情況下，可輕易地針對各種應用對此等特定實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文所呈現之教示及指導，此類改變及修改意圖在所揭示實施例之含義及等效內容範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，由此本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。
本發明之寬度及範圍不應受上述任何例示性實施例限制，而應當僅根據以下申請專利範圍及其等效內容界定。
在本申請案通篇引用的所有引用之參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請案及網頁)的內容以及其中引用之參考文獻均以全文引用之方式清楚地併入本文中用於任何目的。表 4. 序列 表 5. CDR之SEQ ID NO名稱 表 6 ：實例14產物抗體之序列 (aa) = 胺基酸序列；(nt) = 核苷酸序列表 7 ：實例14產物抗體之CDR
圖1A係在存在及不存在模擬結合於活性位點之受質(FIXa+EGR-CMK) (分別為游離FIXa及FIXa-SM)下FIX酶原及活化FIX之結構域組織的示意性表示。圖1B係在存在及不存在模擬結合於活性位點之受質(FIXa+EGR-CMK)下FX酶原及活化FX之結構域組織的示意性表示。在此表示中，HC係FIX、FIXa、FX或FXa之重鏈。LC係FIX、FIXa、FX或FXa之輕鏈。
圖2顯示在本文所述之某些實施例中抗體產生、抗體表徵及功能表徵的示意性表示。
圖3A-3D描繪藉由圖2中所述之抗體產生方法發現的本文所揭示之95種抗FIX抗體。提供了該等抗體VH及VL的生殖系序列、CDR長度、CDR胺基酸序列及SEQ ID NO。VH及VL之全長序列提供於表4中。各CDR序列之SEQ ID編號呈現於表4中。圖3A-3C提供相較於FIX酶原(例如不可活化FIX)，優先結合至活化凝血因子IX (FIXa)(例如游離FIXa及/或經EGR-CMK或LTR-CMK共價修飾之FIXa (FIXa-SM))的抗體。詳言之，圖3A列出了相較於游離FIXa或FIXa酶原(例如不可活化FIX)，優先結合至FIXa-SM之抗體(第I類)。圖3B列出了相較於FIXa-SM或FIX酶原(例如不可活化FIX)，優先結合至游離FIXa之抗體(第II類)。圖3C列出了結合至FIXa-SM或游離FIXa，但不明顯結合至FIXa酶原(例如不可活化FIX)之抗體(第III類)。圖3D列出了優先結合至FIX酶原(例如不可活化FIX)(相較於游離FIXa或FIXa-SM)之抗體(第IV類)。
圖4A及4B顯示了藉由生物膜層干涉法(BLI)量測的感測器相連IgG與指定抗原FIX酶原(例如不可活化FIX)(Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA)或FIXa(Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA)之結合。各抗體之最大BLI反應(nm)繪於y軸上。
圖5係呈現如藉由ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供的1:1擬合算法測定的各所列抗體與游離FIXa之表觀單價親和力值(KD )的表。
圖6A-6E描繪了藉由BLI測定的感測器相連IgG與指定抗原(游離FIXa或FIX酶原(例如不可活化FIX))之結合的量測值。圖6A顯示抗體BIIB-9-484 (VH：SEQ ID NO: 31；VL：SEQ ID NO: 221)之結合的量測值。圖6B顯示抗體BIIB-9-440 (VH：SEQ ID NO: 19；VL：SEQ ID NO: 209)之結合的量測值。圖6C顯示抗體BIIB-9-882 (VH：SEQ ID NO: 115；VL：SEQ ID NO: 301)之結合的量測值。圖6D顯示抗體BIIB-9-460 (VH：SEQ ID NO: 23；VL：SEQ ID NO: 213)之結合的量測值。圖6E顯示抗體BIIB-9-433 (VH：SEQ ID NO: 127；VL：SEQ ID NO: 313)之結合的量測值。各曲線顯示締合及解離之BLI反應(nm)隨時間的變化。圖6F描繪如藉由ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供的1:1擬合算法測定的圖6A-6E中所描述的各所列抗體(亦即，BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460及BIIB-9-433)分別與FIX酶原(例如不可活化FIX)及游離FIXa之表觀單價親和力(KD )的表。
圖7顯示藉由BLI測定的感測器相連IgG與指定抗原游離FIXa (Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA)或FIXa-SM (例如FIXa + EGR-CMK (Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA))之結合的量測值。各抗體之最大BLI反應(nm)繪於y軸上。
圖8A-8E展現藉由BLI測定的感測器相連IgG與指定抗原(FIXa-SM，例如FIXa + EGF-CMK；及游離FIXa)之結合的量測值。圖8A顯示抗體BIIB-9-484 (VH：SEQ ID NO: 31；VL：SEQ ID NO: 221)之結合的量測值。圖8B顯示抗體BIIB-9-440 (VH：SEQ ID NO: 19；VL：SEQ ID NO: 209)之結合的量測值。圖8C顯示抗體BIIB-9-882 (VH：SEQ ID NO: 115；VL：SEQ ID NO: 301)之結合的量測值。圖8D顯示抗體BIIB-9-460 (VH：SEQ ID NO: 23；VL：SEQ ID NO: 213)之結合的量測值。圖8E顯示抗體BIIB-9-433 (VH：SEQ ID NO: 127；VL：SEQ ID NO: 313)之結合的量測值。提供的曲線顯示締合及解離之BLI反應(nm)隨時間的變化。圖8F描繪如藉由ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供的1:1擬合算法測定的各所列抗體(亦即，BIIB-9-484、BIIB-9-440、BIIB-9-882、BIIB-9-460及BIIB-9-433)與(i)游離FIXa或(ii) FIXa-SM(例如FIXa+EGR-CMK)之表觀單價親和力(KD )的表。
圖9A-9D展示藉由BLI測定的所列感測器相連IgG與指定抗原FIXn (不可活化FIX)、游離FIXa或FXa-SM (例如FIXa + EGR-CMK) (皆獲自Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, USA)之結合的量測值隨時間之變化。最大BLI反應(nm)提供於各感測圖上。圖9A顯示第I類中之代表性抗體(圖3A)，例如抗體BIIB-9-484及抗體BIIB-9-460 (VH：SEQ ID NO: 23；VL：SEQ ID NO: 213)之結合的量測值。圖9B顯示第II類中之代表性抗體(圖3B)，例如抗體BIIB-9-416(VH：SEQ ID NO: 93；VL：SEQ ID NO: 279)及抗體BIIB-9-885 (VH：SEQ ID NO: 97；VL：SEQ ID NO: 283)之結合的量測值。圖9C顯示第III類中之代表性抗體(圖3C)，例如抗體BIIB-9-1287 (VH：SEQ ID NO: 181；VL：SEQ ID NO: 367)之結合的量測值。圖9D顯示第IV 類中之代表性抗體(圖3D)，例如抗體BIIB-9-397 (VH：SEQ ID NO: 183；VL：SEQ ID NO: 369)之結合的量測值。
圖10顯示列出本文所揭示之95種抗體以及基於如藉由BLI結合檢定所測定之抗原結合特徵指定的其類別。若使用實例中所定義之檢定參數，抗體與另一抗體展現0.1或更高的與一種抗原之BLI反應差異，則對該等抗體指定類別。第I類抗體對應於圖3A中之抗體。第II類抗體對應於圖3B中之抗體。第III類抗體對應於圖3C中之抗體。第IV類抗體對應於圖3D中之抗體。
圖11顯示如藉由AC-SINS針對自相互作用傾向進行篩選所測定的各指定抗體之最大波長(nm)的表。臨限值540 nm係基於內部對照設定，其中超過臨限值之抗體以黑色陰影顯示(指示有可能自相互作用)。
圖12A-12C係列出由抗體產生程序所發現的本文所揭示之94種抗體的表。提供了該94種抗體各自之VH及VL的生殖系序列、CDR長度、CDR胺基酸序列及SEQ ID NO。各抗體之完整VH及VL序列呈現於表4中。圖12A及圖12B呈現相較於活化凝血因子FX (FXa)(例如經EGR-CMK或LTR-CMK共價修飾之FXa(FXa-SM))，優先結合至FX酶原(例如不可活化FX)之抗體(第V類)。圖12C呈現相較於FX酶原(例如不可活化FX)，優先結合至活化凝血因子FX (FXa)(例如經EGR-CMK或LTR-CMK共價修飾之FXa(FXa-SM))之抗體(第VI類)。
圖13A及13B描繪藉由BLI量測的感測器相連IgG與指定抗原，即FX酶原或FXa-SM(例如FXa+EGR-CMK)的結合。各抗體之最大BLI反應(nm)繪於y軸上。
圖14係呈現如藉由ForteBio Data Analysis 9.0軟體中所提供的1:1擬合算法測定的所列各抗體與FX酶原之表觀單價親和力(KD )的表。
圖15顯示如藉由AC-SINS針對自相互作用傾向篩選所測定的各指定抗體之最大波長(nm)的表。540 nm之臨限值係基於內對照設定。超過臨限值之抗體以黑色陰影顯示，指示有可能自相互作用。
圖16A-16D顯示在發色因子Xa產生檢定中鑑別為能夠替代FVIIIa樣功能的202種雙特異性抗體。該202種雙特異性抗體分為四組，且具有四個相應子圖。圖16A顯示第一組雙特異性抗體(202種中之1-51)的FXa發色受質裂解速率。圖16B顯示第二組雙特異性抗體(202種中之52-102)的FXa發色受質裂解速率。圖16C顯示第三組雙特異性抗體(202種中之103-152)的FXa發色受質裂解速率。圖16D顯示第四組雙特異性抗體(202種中之153-202)的FXa發色受質裂解速率。在每一情形中，無雙特異性抗體存在之平均基線速率以虛線指示。
圖17描繪呈IgG4形式之一小組雙特異性分子的FXa發色受質裂解速率。無雙特異性抗體存在之平均基線速率以虛線指示。
圖18說明在代表性雙特異性抗體存在下FXa發色受質裂解之動力學。相較於基線對照(其中未添加抗體至反應混合物中)，BIIB-9-484/BIIIB-12-915、BIIB-9-619/BIIB-12-925及BIIB-9-578/BIIB-12-917能夠增加FXa發色受質裂解之速率，如由OD隨時間增加所指示。
圖19說明在一期凝血檢定中BIIB-9-484/BIIB-12-917、BIIB-9-484/BIIB-12-915及BIIB-9-484/BIIB-12-1306替代缺乏FVIII之血漿中FVIIIa之功能的能力(如由凝血時間縮短所指示)。顯示在無雙特異性抗體情況下的缺乏FVIII之血漿供比較。
圖20顯示在一期凝血檢定中，雙特異性抗體BIIB-9-484/BIIB-12-917替代缺乏FVIII之血漿中FVIIIa之功能的能力取決於雙特異性形式。同二聚體BIIB-9-484、同二聚體BIIB-12-917及該兩種同二聚體的混合物不能替代FVIIIa樣功能。顯示在無抗體情況下的缺乏FVIII之血漿供比較。
圖21展現BLI結合檢定使用dip and read抗生蛋白鏈菌素生物感測器評估各靶抗原與指定雙特異性抗體之共結合。感測圖繪製出BLI反應(nm)隨時間之變化，且每一階段實驗以黑色豎線隔開。在特定階段中反應之增加指示蛋白質裝載。
圖22A列出BIIB-9-484以及兩個親和力成熟產物BIIB-9-1335與BIIB-9-1336的CDR序列。提供了藉由BIIB-9-484、BIIB-9-1335、BIIB-9-1336之VH區段的MAFFT (v7.205)進行的CLUSTAL形式多序列比對。胺基酸保守程度在該比對上方(「*」=一致；「:」=較強保守性；「.」=較差保守性)以及該比對下方一欄指示。VH及VL CDR加下劃線。在VH-CDR1前的序列係構架區(FR) 1；在VH-CDR1之後且在VH-CDR2之前的序列係FR2；在VH-CDR2之後且在VH-CDR3之前的序列係FR3；且在VH-CDR3之後的序列係FR4。在VL-CDR1前的序列係構架區(FR) 1；在VL-CDR1之後且在VL-CDR2之前的序列係FR2；在VL-CDR2之後且在VL-CDR3之前的序列係FR3；且在VL-CDR3之後的序列係FR4。圖22B-22D分別顯示游離FIXa與BIIB-9-484、BIIB-9-1335及BIIB-9-1336之BLI結合譜。
圖23顯示在具有FVIIIa樣活性之雙特異性抗體情況下，增加抗FIXa臂之親和力在一期凝血檢定中產生較高活性。此實例在以上曲線中示出，其中具有高親和力抗FIXa臂的雙特異性抗體(BIIB-9-1335/BIIB-12-917及BIIB-9-1336/BIIB-12-917)顯示的凝血時間相較於具有較低親和力抗FIXa臂之雙特異性抗體(BIIB-9-484/BIIB-12-917)進一步縮短。
圖24A顯示艾美珠單抗(emicizumab)(ACE910)序列一致性雙特異性抗體(「艾美珠單抗生物類似藥」)與FIX酶原、活化FIX、FX酶原及活化FX的結合親和力(亦即，分別為1 µM、1 µM、1 µM及1 µM)。圖24B顯示雙特異性分子(BS-027125)與FIX酶原、活化FIX、FX酶原及活化FX的結合親和力(亦即，分別為8 nM、2 nM、20 nM及未偵測到)。
圖25顯示FVIII(倒三角形)、BS-025 FIXa同二聚體(大菱形)、BS-027 FX同二聚體(小菱形)、BS-027025同二聚體混合物(三角形)及BS-027025雙特異性抗體(正方形)在各種濃度(IU/mL或µM)下的凝血時間(秒)。
圖26顯示BS-027125(正方形)、BS-027125 FIXa同二聚體(三角形)及BS-027125 FX同二聚體(圓形)之FVIII活性(FVIII當量%)。FVIII活性係由一期凝血檢定量測。
圖27顯示藉由發色因子Xa (FXa)產生檢定量測的rFVIII(大圓形)、BS-027125(正方形)、BS-027125 FIXa同二聚體(三角形)、BS-027125 FX同二聚體(倒三角形)及BS-027125(無PL)(小圓形)的nM FXa產生情況。
圖28A顯示BS-027125的凝血酶產生檢定的結果。左圖顯示滯後時間(分鐘)，且右圖顯示峰。
圖28B顯示由rFVIII(左圖)和BS-027125(右圖)產生的凝血酶之量。
圖29顯示在rFVIII、艾美珠單抗生物類似藥或BS-027125及PC/PS (80%/20%)或PC/PE/PS (40%/40%/20%)磷脂囊泡存在下產生的nM FXa(上圖)及由PC/PE/PS磷脂囊泡相對於由PC/PS磷脂囊泡貢獻之活性的倍數變化。
圖30顯示在rFVIII、艾美珠單抗生物類似藥及BS-027125存在下PC/PE/PS磷脂上進行的凝血酶產生檢定的結果。上圖顯示滯後時間(分鐘)；中間圖顯示峰值凝血酶(nM)；及下圖顯示內源性凝血酶潛能(ETP) (nM*分鐘)。
圖31A、31B、31C及31D顯示如藉由生物膜層干涉法測定的47種不同抗FIXa抗體相互的抗原決定基分箱。圖31A及圖31B分別顯示非競爭性及競爭性結合劑的Octet譜。圖31C概述測試的47x47相互作用以及該等抗體對是否引起競爭性或非競爭性結合。深灰色方形指示交叉阻斷之抗體對，表明其屬於同一組。中等灰色的方形指示未交叉阻斷之抗體對，表明其屬於不同組。白色方形指示單向矛盾且淺灰色方形指示無法分析到資料之抗體。圖31D顯示在圖31C中測定之分箱網路的節點分析。兩種抗體在該圖上越靠近，則其分箱譜越類似。
圖32A顯示使用生物膜層干涉法，在存在及不存在鈣下BIIB-9-484與FIXa之結合譜。虛線指示締合期結束且解離期開始。
圖32B顯示使用生物膜層干涉法，在存在及不存在鈣下BIIB-9-1336與FIXa之結合譜。虛線指示締合期結束且解離期開始。
圖33A顯示由單獨FIXa (250 nM)或其在遞增濃度的兩種不同抗FIXa抗體(BIIB-9-1336及BIIB-9-579)或抗FX抗體對照(BIIB-12-917)存在下引起的受質裂解速率。測試的BIIB-9-1336係呈同二聚、二價抗體(「BIIB-9-1336」)形式、作為單臂抗體(「單臂BIIB-9-1336」)及與BIIB-12-917呈雙特異性構造(「BIIB-9-1336/BIIB-12-917」)。受質裂解速率以mOD/分鐘表示且抗體之遞增量係以FIXa-Ab複合物之濃度(nM)表示。
圖33B顯示在一組BIIB-9-484、BIIB-9-1336、BIIB-9-619及BIIB-9-578抗體存在下所觀察到的500nM FIXa之FIXa醯胺水解活性的增加倍數。
圖33C顯示在存在或不存在飽和量的BIIB-9-1336下，在不同受質濃度範圍內FIXa引起的受質裂解速率。
圖33D顯示在存在及不存在BIIB-9-1336下FIXa的KM 及Vmax 。
圖34A及圖34B顯示在存在或不存在抗FIXa抗體下FIXa的ATIII抑制速率。圖34A顯示在75kDa處對應於ATIII-FIXa複合物之譜帶的出現。複合物形成速率指示FIXa的ATIII抑制作用且在BIIB-9-1335及BIIB-9-1336存在下增加。圖34B顯示在不同時間點定量及繪製的ATIII-FIXa複合物形成之譜帶強度。
圖35係呈複合物形式之BIIB-9-1336之Fab區的晶體結構之草圖，其中EGF2及FIXa之絲胺酸蛋白酶結構域以兩種取向顯示。
圖36顯示在表面呈現的FIXa之絲胺酸蛋白酶結構域，其中BIIB-9-1336 (1336抗原決定基)及FVIIIa (FVIIIa抗原決定基)之抗原決定基繪製於表面上。FIXa上之BIIB-9-1336抗原決定基及在FIXa上之FVIIIa抗原決定基呈黑色。該兩個抗原決定基之間的殘基以白色略述。
圖37列出FIXa重鏈中構成BIIB-9-1336及FVIIIa抗原決定基且對應於圖36中突出顯示之殘基的特定胺基酸殘基。該兩個抗原決定基之間之殘基加下劃線且以粗體顯示。括號中所顯示的殘基在圖36中未示出，因為其與公開之報道不符。胺基酸殘基之編號係基於胰凝乳蛋白酶原編號。BIIB-9-1336亦接觸FIXa輕鏈中之一個殘基且以星號指示。FVIIIa之輕鏈接觸未列出。
圖38A顯示藉由生物膜層干涉法測定的BIIB-12-917與一組FX變異體之結合，該等FX變異體包括野生型因子X酶原、野生型活化FX、保留活化肽之活化FX、缺乏活化肽之酶原FX，及FIX活化肽經FX活化肽置換的嵌合FIX構築體。虛線指示締合期結束且解離期開始。
圖38B顯示以上提及之FX變異體各自之草圖。+及-符號指示是否結合BIIB-12-917。此等資料顯示BIIB-12-917之抗原決定基係在FX之活化肽區域中。

Claims (15)

  1. 一種特異性結合至活化因子IX (FIXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FIXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分在FIXa及因子IX酶原(FIXz)存在下優先結合至FIXa或其中該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXa之結合親和力高於該抗FIXa抗體或其抗原結合部分結合至FIXz之結合親和力。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭或與該參考抗體結合至相同抗原決定基。
  3. 如申請專利範圍第3項之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其中該抗原決定基包含FIXa重鏈序列中之胰凝乳蛋白酶原編號胺基酸殘基H91、H92、N93、H101、D125、K126、E127、Y128、R165、Y177、N178、N179、S232、R233、Y234、V235、N236、W237、E240及K241，或其組合。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中(i)該VH CDR1包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VH CDR1，SEQ ID NO: 2058至2063組成之群的VH CDR1或具有一個或兩個突變之VH CDR1；及/或(ii)該VH CDR2包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VH CDR2，SEQ ID NO: 2084至2089組成之群的VH CDR2或具有一個或兩個突變之VH CDR2；及/或(iii)該VH CDR3包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VH CDR3，SEQ ID NO: 2084至2089組成之群的VH CDR3或具有一個或兩個突變之VH CDR3；及/或其中(iv)該VL CDR1包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VL CDR1，SEQ ID NO: 2136至2141組成之群的VL CDR1或具有一個或兩個突變之VL CDR1；及/或(v)該VL CDR2包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VL CDR2，SEQ ID NO: 2162至2167組成之群的VL CDR2或具有一個或兩個突變之VL CDR2；及/或(vi)該VL CDR3包含選自由圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 中之VL CDR3，SEQ ID NO: 2188至2193組成之群的VL CDR3或具有一個或兩個突變之VL CDR3。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項之抗FIXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中(a1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 31及221 (BIIB-9-484)；(a2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 19及209 (BIIB-9-440)；(a3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 115及301 (BIIB-9-882)；(a4) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 23及213 (BIIB-9-460)；(a5) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 127及313 (BIIB-9-433)；(a6) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 45及235 (BIIB-9-619)；(a7) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 185及371 (BIIB-9-578)；(a8) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 87及221 (BIIB-9-1335)；或(a9) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 89及221 (BIIB-9-1336)。
  6. 一種特異性結合至因子X酶原(FXz)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXz抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXz抗體或其抗原結合部分在FXz及活化因子X (FXa)存在下優先結合至FXz。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖 12A 及圖 12B 中之抗體組成之群之參考抗體交叉競爭或與該參考抗體結合至相同抗原決定基。
  8. 如申請專利範圍第6項或第7項之抗FXz抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中(b1) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 423及611 (BIIB-12-915)；(b2) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 427及615 (BIIB-12-917)；或(b3) VH及VL分別包含SEQ ID NO: 455及643 (BIIB-12-932)。
  9. 一種特異性結合至活化因子X (FXa)的經分離之抗體或其抗原結合部分(「抗FXa抗體或其抗原結合部分」)，其中該抗FXa抗體或其抗原結合部分在FXz及FXa存在下優先結合至FXa，及/或結合至FXa之結合親和力高於該抗體或其抗原結合部分結合至FXz之結合親和力。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其與選自由圖 12C 中之抗體組成之群的參考抗體交叉競爭，或與選自由圖 12C 中之抗體組成之群的參考抗體結合至相同抗原決定基。
  11. 如申請專利範圍第9項或第10項之抗FXa抗體或其抗原結合部分，其包含VH及VL，其中該VH及VL分別包含SEQ ID NO: 559及747 (BIIB-12-925)。
  12. 一種雙特異性分子，其包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗FIX抗體或其抗原結合部分及/或(ii)如申請專利範圍第6項至第11項中任一項之抗FX抗體或其抗原結合部分。
  13. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之抗體。
  14. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之抗體及如申請專利範圍第13項之核酸，以及醫藥學上可接受之載劑。
  15. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之抗體、如申請專利範圍第13項之核酸或如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其係用於治療。
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Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106140758A TW201819417A (zh) 2016-11-23 2017-11-23 結合至凝血因子ix及凝血因子x之雙特異性抗體

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US (1) US20230192896A1 (zh)
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WO (1) WO2018098363A2 (zh)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) * 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
FR3038517B1 (fr) 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
MY204354A (en) 2017-02-01 2024-08-24 Novo Nordisk As Procoagulant antibodies
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
TWI870011B (zh) 2017-08-25 2025-01-11 美商戊瑞治療有限公司 Ｂ７－ｈ４抗體及其使用方法
EA202090641A1 (ru) * 2017-09-29 2020-08-07 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Мультиспецифическая антиген-связывающая молекула, обладающая замещающей функциональной активностью кофактора коагулирующего фактора крови viii, и фармацевтическая композиция, содержащая указанную молекулу в качестве активного ингредиента
CN111386285B (zh) 2017-11-15 2024-08-27 诺和诺德股份有限公司 增强fx活化的因子x结合物
MA51903A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Five Prime Therapeutics Inc Formulations d'anticorps b7-h4
KR20200144094A (ko) 2018-03-02 2020-12-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 및 이의 사용 방법
FR3082427B1 (fr) * 2018-06-14 2020-09-25 Lab Francais Du Fractionnement Combinaison de facteur vii et d'un anticorps bispecifique anti-facteurs ix et x
US12466884B2 (en) * 2018-07-09 2025-11-11 Surrozen Operating, Inc. Tissue-specific WNT signal enhancing molecules and uses
US11220554B2 (en) 2018-09-07 2022-01-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies
MY202203A (en) * 2018-08-01 2024-04-17 Novo Nordisk As Improved procoagulant antibodies
EP3847192A4 (en) * 2018-09-05 2022-09-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ENDOTROPHIN AND THEIR USE
WO2020115283A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
TW202039583A (zh) * 2018-12-07 2020-11-01 瑞士商巴克斯歐塔有限公司 結合因子IXa及因子X的蛋白分子
WO2020114615A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
WO2020114614A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x
CA3121420A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Surface Oncology, Inc. Anti-il-27 antibodies and uses thereof
LT3723858T (lt) * 2018-12-21 2022-02-10 Kymab Limited Fixaxfx bispecifiniai antikūnai, turintys bendrą lenvąją grandinę
CN118546960A (zh) 2019-03-05 2024-08-27 恩卡尔塔公司 Cd19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
JP7705406B2 (ja) * 2020-01-30 2025-07-09 ノヴォ ノルディスク アー／エス 二重特異性第ｖｉｉｉ因子模倣抗体
US11365239B2 (en) * 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
JP2023106635A (ja) 2020-04-17 2023-08-02 中外製薬株式会社 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法
WO2021231237A2 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 Augmenta Bioworks, Inc. Antibodies for sars-cov-2 and uses thereof
IL298510A (en) 2020-06-12 2023-01-01 Nkarta Inc Genetically modified natural killer cells for cd70-directed cancer immunotherapy
TW202233656A (zh) 2020-11-16 2022-09-01 美商蘇羅森營運公司 肝特異性wnt訊號增強分子及其用途
WO2022217054A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind ror1
WO2023111018A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against coagulation factor x and uses thereof
US20250313635A1 (en) * 2022-05-12 2025-10-09 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-integrin antibodies and uses thereof
AR129879A1 (es) 2022-07-08 2024-10-09 Novo Nordisk As Compuestos de isvd altamente potentes capaces de sustituir al fviii(a)
WO2024050356A2 (en) * 2022-08-29 2024-03-07 Invivyd, Inc. Sars-cov2 antibodies and uses thereof
US12157776B2 (en) 2022-11-15 2024-12-03 Calico Life Sciences Llc Anti-PAPP-A antibodies and methods of use thereof
WO2024108158A1 (en) * 2022-11-18 2024-05-23 Byomass Inc. Anti-activin a/b antibodies and uses thereof
WO2024216106A1 (en) * 2023-04-14 2024-10-17 Triveni Bio, Inc. Dual inhibitor trypsin antibodies and uses thereof
CN116589588B (zh) * 2023-04-14 2023-12-22 北京基科晟斯医药科技有限公司 结合凝血因子x的抗体
WO2024233955A1 (en) * 2023-05-11 2024-11-14 Avantgen, Inc. Agents that bind to cd16a and uses thereof
AU2024272787A1 (en) * 2023-05-17 2025-11-20 Adimab, Llc Anti-cd28 antibodies and methods related thereto
WO2025076507A1 (en) * 2023-10-06 2025-04-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Engineered proteins and methods of use thereof
GB202316779D0 (en) * 2023-11-01 2023-12-13 Ucl Business Ltd Antigen binding protein

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE3587814T2 (de) 1985-03-30 1994-11-10 Marc Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
JP2584443B2 (ja) 1985-04-22 1997-02-26 ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド 活性化▲ｉ▼▲ｘ▼因子の高収率産生
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FI915411A0 (fi) 1989-05-16 1991-11-15 Scripps Research Inst Samexpression av heteromeriska receptorer.
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
JP4436457B2 (ja) 1995-08-18 2010-03-24 モルフォシス アイピー ゲーエムベーハー 蛋白質／（ポリ）ペプチドライブラリー
US6828422B1 (en) 1995-08-18 2004-12-07 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
MA24512A1 (fr) * 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP2278003B2 (en) 1999-04-09 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
ES2353268T3 (es) 1999-07-02 2011-02-28 Morphosys Ag Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est.
AT411997B (de) * 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
LT2857516T (lt) 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
DK1443961T3 (da) 2001-10-25 2009-08-24 Genentech Inc Glycoprotein-sammensætninger
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003075840A2 (en) * 2002-03-04 2003-09-18 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
ES2381617T5 (es) 2002-08-14 2016-02-24 Macrogenics, Inc. Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso
EP2042517B1 (en) 2002-09-27 2012-11-14 Xencor, Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
EP1562972B1 (en) 2002-10-15 2010-09-08 Facet Biotech Corporation ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
CA2504818C (en) 2002-11-07 2013-04-23 Immunogen, Inc. Anti-cd33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
WO2005035753A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
JP5490734B2 (ja) 2003-10-10 2014-05-14 中外製薬株式会社 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
KR101149242B1 (ko) 2004-01-12 2012-05-25 어플라이드 몰리큘라 에볼류션, 인코포레이티드 Ｆｃ 영역 변이체
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
CA2561264A1 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
EA012464B1 (ru) 2004-08-04 2009-10-30 Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк. Антитело против cd20 и его применение
EP1685161A1 (en) 2004-08-30 2006-08-02 Lonza Biologics plc Affinity- plus ion exchange-chromatography for purifying antibodies
CA2603408C (en) 2005-03-31 2018-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
CA2924155C (en) * 2007-01-03 2020-02-11 Philip M. Sass High affinity antibodies that neutralize staphylococcus enterotoxin b
US7700734B2 (en) 2007-01-09 2010-04-20 Shu-Wha Lin Recombinant human factor IX and use thereof
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA3187687A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
WO2009092014A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Gagnon Peter S Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
MX2011010168A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos, trivalentes.
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
MX2011011925A (es) 2009-05-27 2011-12-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos.
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
MX2012003396A (es) 2009-09-16 2012-04-10 Genentech Inc Complejos de proteina conteniendo helice super-enrollada y/o enlazador tether y usos de los mismos.
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
ES2617777T5 (es) 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
CA3117920A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Adimab, Llc Libraries comprising segmental pools, and methods for their preparation and use
ES2660151T3 (es) * 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Molécula de unión a antígeno multiespecífica que tiene función alternativa a la función del factor VIII de coagulación sanguínea
KR102492792B1 (ko) 2011-10-11 2023-01-30 제넨테크, 인크. 이중특이적 항체의 개선된 어셈블리
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
MX2017010734A (es) * 2015-04-17 2017-12-04 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion con factores de coagulacion y anticuepos multiespecificos.

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