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DE3587814T2 - Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren. - Google Patents

Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.

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Publication number
DE3587814T2
DE3587814T2 DE3587814T DE3587814T DE3587814T2 DE 3587814 T2 DE3587814 T2 DE 3587814T2 DE 3587814 T DE3587814 T DE 3587814T DE 3587814 T DE3587814 T DE 3587814T DE 3587814 T2 DE3587814 T2 DE 3587814T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
host cells
dna
genes
stochastic
property
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE3587814T
Other languages
English (en)
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DE3587814D1 (de
Inventor
Marc Ballivet
Stuart Alan Kauffman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kauffmann Stuart Alan Santa Fe Nmex Us
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=4209046&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE3587814(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of DE3587814D1 publication Critical patent/DE3587814D1/de
Publication of DE3587814T2 publication Critical patent/DE3587814T2/de
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Description

  • Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von DNS, RNS, Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen unter Verwendung transformierter Wirtszellen, die Gene enthalten, die zur Expression dieser RNS, Peptide, Polypeptide oder Proteine fähig sind, d. h. unter Verwendung der Methode der rekombinierten DNS.
  • Ziel der Erfindung ist insbesondere die Herstellung stochastischer Gene oder Fragmente von stochastischen Genen in einer Weise, die es gleichzeitig, nach Transkription und Translation dieser Gene, ermöglicht, eine große Zahl (in der Größenordnung von mindestens 10'000) vollständig neuer Proteine in Gegenwart von Wirtszellen (bakterieller oder eukaryontischer) herzustellen, die diese Gene, die zur Expression dieser Proteine fähig sind, enthalten, um danach eine Selektion oder ein Screening unter diesen Klonen vorzunehmen, um zu bestimmen, welche von ihnen Proteine mit gewünschten Eigenschaften produzieren, z. B. strukturelle, enzymatische, katalytische, antigene, pharmakologische oder Ligandeneigenschaften und, mehr im allgemeinen, chemische, biochemische, biologische usw. Eigenschaften.
  • Ziel der Erfindung ist auch die Herstellung von DNS- oder RNS- Sequenzen mit brauchbaren Eigenschaften, insbesondere chemischen, biochemischen oder biologischen Eigenschaften.
  • Es ist deshalb klar, daß die Erfindung auf zahlreichen und vielseitigen Gebieten der Wissenschaft, Industrie und Medizin angewendet werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder Polypeptiden ist dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig im gleichen Medium Gene herstellt, die zumindest teilweise aus synthetischen, stochastischen Polynukleotiden zusammengesetzt sind, daß man die so erhaltenen Gene in Wirtszellen einbringt, daß man die unabhängigen Klone der transformierten Wirtszellen, die diese Gene enthalten, gleichzeitig in einer solchen Weise kultiviert, um die stochastischen Gene zu klonieren und die Bildung von Proteinen zu erhalten, die durch jedes dieser stochastischen Gene exprimiert sind, daß man die Selektion und/oder das Screening der Klone transformierter Wirtszellen in einer Weise durchführt, um diejenigen Klone zu identifizieren, die Peptide oder Polypeptide mit mindestens einer gewünschten Aktivität bilden, daß man danach die so identifizierten Klone isoliert und daß man diese kultiviert, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid mit dieser Eigenschaft zu produzieren.
  • In einer ersten Ausführungsform dieses Verfahrens werden stochastische Gene hergestellt durch stochastische Copolymerisation der vier Arten von Deoxyphosphonukleotiden A, C, G und T, von denen zwei Enden eines anfänglich linearisierten Expressionsvektors, gefolgt von der Bildung kohäsiver Enden in einer solchen Weise, um einen stochastischen ersten Strang von DNS zu bilden, der von einem Molekül des Expressionsvektors gebildet wird, das zwei stochastische Sequenzen, deren 3'-Enden komplementär sind, besitzt, gefolgt von der Synthese des zweiten Stranges der stochastischen DNS.
  • In einer zweiten Ausführungsform dieses Verfahrens werden stochastische Gene hergestellt durch Copolymerisation von Oligonukleotiden ohne kohäsive Enden, in einer Weise, um Fragmente stochastischer DNS zu bilden, gefolgt von einer Ligierung dieser Fragmente an einen vorher linearisierten Expressionsvektor.
  • Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein, insbesondere ein bakterielles Plasmid. Hervorragende Ergebnisse wurden unter Verwendung des Plasmid pUC8 als Expressionsvektor erhalten.
  • Der Expressionsvektor kann auch eine virale DNS oder ein Hybrid eines Plasmids und einer viralen DNS sein.
  • Die Wirtszellen können prokaryontische Zellen, wie z. B. HB 101 und C 600, oder eukaryontische Zellen sein.
  • Wenn das Verfahren gemäß der zweiten, oben erwähnten Ausführungsform verwendet wird, ist es möglich, Oligonukleotide zu verwenden, die eine Gruppe palindromischer Oktamerer bilden.
  • Insbesonders gute Ergebnisse werden erhalten unter Verwendung der folgenden Gruppen palindromischer Oktamerer:
  • 5' GGAATTCC 3'
  • 5' GGTCGACC 3'
  • 5' CAAGCTTG 3'
  • 5' CCATATGG 3'
  • 5' CATCGATG 3'
  • Es ist auch möglich, Oligonukleotide zu verwenden, die eine Gruppe palindromischer Heptamerer bilden.
  • Sehr gute Ergebnisse werden erhalten unter Verwendung der folgenden Gruppe palindromischer Heptamerer:
  • 5' XTCGCGA 3'
  • 5' XCTGCAG 3'
  • 5' RGGTACC 3'
  • worin X = A, G, C oder T und R = A oder T ist.
  • Nach einer besonders vorteilhaften Verwendungsweise dieser Verfahren isoliert und reinigt man die transformierende DNS der Plasmide aus einer Kultur unabhängiger Klone der transformierten Wirtszellen, die nach den obigen Verfahren erhalten wurden, dann wird die gereinigte DNS durch mindestens ein Restriktionsenzym geschnitten, das spezifischen enzymatischen Schnittstellen entspricht, die in den palindromischen Oktameren oder Heptameren vorhanden sind, aber in dem verwendeten Expressionsvektor fehlen; auf dieses Schneiden folgt Inaktivierung des Restriktionsenzyms, dann behandelt man das Ensemble der so erhaltenen, linearisierten, stochastischen DNS-Fragmente gleichzeitig mit T4-DNS-Ligase in einer solchen Weise, um ein neues Ensemble von DNS zu bilden, das neue stochastische Sequenzen enthält, wobei dieses neue Ensemble deshalb eine Zahl stochastischer Gene enthalten kann, die größer ist als die Zahl der Gene in dem anfänglichen Ensemble. Dieses neue Ensemble transformierender DNS verwendet man dann zur Transformierung der Wirtszellen und Klonierung dieser Gene und schließlich wendet man das Screening und/oder die Selektion an und isoliert die neuen Klone der transformierten Wirtszellen, und schließlich werden diese kultiviert, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid, z. B. ein neues Protein, zu produzieren.
  • Die Eigenschaft, die als Kriterium zur Selektion der Klone von Wirtszellen dient, kann die Fähigkeit der in einem bestimmten Klon produzierten Peptide oder Polypeptide sein, eine bestimmte chemische Reaktion zu katalysieren, insbesondere die Fähigkeit, die katalytische Aktivität eines Polypeptids selektiv zu modifizieren.
  • Diese Eigenschaft kann gleichermaßen die Fähigkeit der Peptide oder Polypeptide sein, an einen bestimmten Liganden zu binden.
  • Gemäß einer Abänderung des Verfahrens identifiziert und isoliert man die Klone transformierter Wirtszellen, die Peptide oder Polypeptide mit den gewünschten Eigenschaften produzieren, durch Affinitätschromatographie gegen Antikörper, die einem Protein, das durch den natürlichen Teil des DNS-Hybrids exprimiert ist, entsprechen.
  • Im Fall, bei dem der natürliche Teil der Hybrid-DNS ein Gen enthält, das β-Galactosidase exprimiert, kann man z. B. die Klone der transformierten Wirtszellen vorteilhafterweise durch Affinitätschromatographie gegen Anti-β-Galactosidase-Antikörper identifizieren und isolieren.
  • Nach Expression und Reinigung der Hybridpeptide oder Polypeptide kann man ihre neuen Teile trennen und isolieren.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen die Wirtszellen aus Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, dessen Genom weder das natürliche Gen, das β-Galactosidase exprimiert, noch das EBG-Gen enthält, d. h. Z&supmin;, EBG&supmin; E. coli. Die transformierten Zellen werden in Gegenwart vom Medium X-gal und dem Indikator IPTG kultiviert, und Zellen, die für β-Galactosidase-Funktionen positiv sind, werden bestimmt; danach wird für eine Großkultur die transformierende DNS in ein geeignetes Klon von Wirtszellen transplantiert, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid auf industrielle Weise zu produzieren.
  • Die als Kriterium zur Selektion der transformierten Wirtszellen dienende Eigenschaft kann auch die Fähigkeit der durch Kultivierung dieser Klone produzierten Polypeptide oder Proteine sein, an eine bestimmte Verbindung zu binden.
  • Diese Verbindung kann vorteilhafterweise insbesondere ausgewählt sein unter Peptiden, Polypeptiden und Proteinen.
  • Auf der anderen Seite kann diese Verbindung auch ausgewählt sein aus DNS und RNS-Sequenzen.
  • Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von DNS, gekennzeichnet durch gleichzeitige Herstellung von Genen im gleichen Medium, die mindestens teilweise aus stochastischen, synthetischen Polynukleotiden aufgebaut sind, daß die so erhaltenen Gene in Wirtszellen eingebracht werden, um ein Ensemble transformierter Wirtszellen herzustellen, daß das Screening und/oder die Selektion dieses Ensembles durchgeführt wird, um die Wirtszellen zu identifizieren, die in ihrem Genom stochastische Sequenzen von DNS enthalten, die mindestens eine gewünschte Eigenschaft besitzen, und schließlich, daß die DNS von den Klonen der so identifizierten Wirtszellen isoliert wird.
  • Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von RNS, gekennzeichnet durch gleichzeitige Herstellung von Genen im gleichen Medium, die mindestens teilweise aus stochastischen, synthetischen Polynukleotiden aufgebaut sind, daß die so erhaltenen Gene in Wirtszellen eingebracht werden, um ein Ensemble transformierter Wirtszellen herzustellen, daß die so hergestellten, unabhängigen Klone von Wirtszellen gleichzeitig kultiviert werden und daß das Screening und/oder die Selektion dieses Ensembles in einer Weise durchgeführt wird, um die Wirtszellen zu identifizieren, die stochastische Sequenzen von RNS mit mindestens einer gewünschten Eigenschaft besitzen und daß die RNS aus den so identifizierten Wirtszellen isoliert wird.
  • Die genannte Eigenschaft kann die Fähigkeit sein, eine bestimmte Verbindung zu binden, die z. B. ein Peptid oder Polypeptid oder Protein sein könnte, oder auch die Fähigkeit, eine bestimmte chemische Reaktion zu katalysieren, oder die Fähigkeit, die Funktion einer Transfer-RNS zu haben.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren sowie einige seiner Anwendungen wird nun unter Bezugnahme auf nicht einschränkende Ausführungsformen näher beschrieben.
  • Zunächst werden besonders brauchbare Verfahren beschrieben, um die Synthese von stochastischen Genen durchzuführen, und die Einführung dieser Gene in Bakterien, um Klone transformierter Bakterien zu bilden.
    • I) Direkte Synthese auf einem Expressionsvektor a) Linearisierung des Vektors
  • 30 ug, das sind ca. 10¹³ Moleküle des pUC8 Expressionsvektors, werden durch Inkubation während 2 Stunden bei 37ºC mit 100 Einheiten PstI-Restriktionsenzym in einem Volumen von 300 ul des geeigneten Standardpuffers linearisiert. Der linearisierte Vektor wird mit Phenol- Chloroform behandelt, dann in Ethanol ausgefällt, in einem Volumen von 30 ul aufgenommen und auf ein 0,8% Agarose- Gel in Standard TEB-Puffer aufgebracht. Nach Wanderung in einem Feld von 3V/cm während 3 Stunden wird der linearisierte Vektor elektroeluiert, in Ethanol ausgefällt und in 30 ul Wasser aufgenommen.
    • b) Stochastische Synthese unter Verwendung des Enzyms Terminal Transferase (TdT)
  • Man läßt 30 ug des linearisierten Vektors 2 Stunden lang bei 37ºC mit 30 Einheiten TdT in 300 ul des geeigneten Puffers in Gegenwart von 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,3 mM dTTP und 1 mMdATP reagieren. Die niedrigere Konzentration von dTTP wird gewählt, um die Häufigkeit von "Stop"-Codons in der entsprechenden Messenger RNS zu verringern. Ein ähnliches Resultat, obgleich etwas ungünstiger, kann erhalten werden durch Verwendung einer niedrigeren Konzentration von dATP als die der anderen Desoxynukleotid- Triphosphate. Der Verlauf der Polymerisation an dem 3'-Ende der PstI-Stellen wird durch Analyse auf Gel aliquoter Anteile verfolgt, die während des Verlaufes der Reaktion entnommen werden.
  • Wenn die Reaktion einen mittleren Wert von 300 Nukleotiden pro 3'-Ende erreicht oder durchläuft, wird sie abgebrochen, und die freien Nukleotide werden von dem Polymeren durch differenzielle Ausfällung oder durch Leiten über eine Säule, die ein Molekularsieb wie z. B. Biogel P60 enthält, getrennt. Nach Konzentrierung durch Ausfällung in Ethanol werden die Polymeren einer weiteren Polymerisation mit TdT unterworfen, zuerst in Gegenwart von dATP, dann in Gegenwart von dTTP. Diese letzten zwei Reaktionen werden durch eine Filtration an einem Gel getrennt und werden in kurzen Intervallen (30 Sekunden bis 3 Minuten) durchgeführt, um den 3'-Enden der Polymeren aufeinanderfolgend 10 bis 30 A, gefolgt von 10 bis 30 T, zuzuführen.
    • c) Synthese des zweiten Stranges von stochastischen DNS
  • Jedes Molekül des Vektors besitzt am Ende des vorhergehenden Durchlaufes zwei stochastische Sequenzen, dessen 3'-Enden komplementär sind. Die Mischung der Polymeren wird deshalb unter Bedingungen inkubiert, die die Hybridisierung der komplementären Enden begünstigen (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA bei 65ºC während 10 Minuten, gefolgt von einer Erniedrigung der Temperatur auf 22ºC mit einer Geschwindigkeit von 3 bis 4ºC pro Stunde). Die hybridisierten Polymeren werden dann mit 60 Einheiten des großen Fragmentes (Klenow) von Polymerase I in Gegenwart der vier Nukleotid-Triphosphate (200 mM) bei 4ºC während 2 Stunden umgesetzt. Diese Stufe bewirkt die Synthese des zweiten Stranges aus den 3'-Enden der Hybrid-Polymeren. Die Moleküle, die aus dieser direkten Synthese, ausgehend vom linearisierten Vektor, resultieren, werden danach verwendet, um kompetente Zellen zu transformieren.
    • d) Transformierung kompetenter Klone
  • 100 bis 200 ml von kompetenten Zellen HB101 oder C600 werden bei der Konzentration von 10¹&sup0; Zellen/ml mit der stochastischen DNS-Präparation in Gegenwart von 6 mM CaCl&sub2;, 6 mM Tris-HCl, pH 8, 6 mM MgCl&sub2; 30 Minuten bei 0ºC inkubiert. Die Mischung wird einem Temperaturschock von 3 Minuten bei 37ºC unterworfen, gefolgt von der Zugabe von 400 bis 800 ml NZY Kulturmedium ohne Antibiotika. Die transformierte Kultur wird bei 37ºC während 16 Minuten inkubiert, dann auf 10 l durch Zugabe von NZY-Medium, das 40 ug/ml Ampicillin enthält, verdünnt. Nach 3 bis 5 Stunden Inkubation bei 37ºC wird die verstärkte Kultur zentrifugiert und die Pellets der transformierten Zellen lyophilisiert und bei -70ºC aufbewahrt. Eine solche Kultur enthält 3·10&sup7; bis 10&sup8; unabhängige Transformanten, wobei jeder ein einziges stochastisches Gen enthält, eingefügt in den Expressionsvektor.
    • II) Synthese stochastischer Gene, ausgehend von Oligonukleotiden ohne kohäsive Enden
  • Dieses Verfahren basiert auf der Tatsache, daß die Polymerisation von vernünftig gewählten palindromischen Oligonukleotiden den Aufbau von stochastischen Zellen ermöglicht, die kein "Stop"-Codon in einem der 6 möglichen Leserahmen besitzen, während sie gleichzeitig eine ausgeglichene Repräsentation von Triplets, die alle Aminosäuren spezifieren, sicherstellen. Um eine Wiederholung von Sequenzmotiven in den entstehenden Proteinen zu vermeiden, können die Oligonukleotide weiters eine Zahl von Basen enthalten, die kein vielfach es von 3 ist. Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung einer der möglichen Kombinationen, die diese Kriterien erfüllen:
    • a) Wahl einer Gruppe von Oktameren
  • Die Gruppe der folgenden Oligonukleotide:
  • 5' GGAATTCC 3'
  • 5' GGTCGACC 3'
  • 5' CAAGCTTG 3'
  • 5' CCATATGG 3'
  • 5' CATCGATG 3'
  • setzt sich aus 5 Palindromen (also selbstkomplementären Sequenzen) zusammen, bei denen es leicht ist, sicherzustellen, daß ihre stochastische Polymerisation nicht irgendwelche "Stop"-Codons hervorruft, und spezifiziert alle Aminosäuren.
  • Man kann selbstverständlich andere Gruppen palindromischer Oktamerer verwenden, die nicht irgendwelche "Stop"-Codons hervorrufen, und alle Aminosäuren spezifizieren, die in Polypeptiden gefunden werden. Es ist selbstverständlich auch möglich, nicht palindromische Gruppen von Oktameren zu verwenden unter der Bedingung, daß ihre Komplemente, die doppelsträngige DNS bilden, auch verwendet werden.
    • b) Aufbau eines stochastischen Gens aus einer Gruppe von Oktameren
  • Eine Mischung, die 5 ug jedes der oben angegebenen Oligonukleotide enthält (vorher an der 5'-Stelle durch ein Standardverfahren phosphoriliert), wird in einem Volumen von 100 ul, das 1 mM ATP, 10% Polyethylenglykol und 100 Einheiten T4 DNS-Ligase in dem geeigneten Puffer enthält, bei 13ºC während 6 Stunden umgesetzt. Diese Stufe bewirkt die stochastische Polymerisation der Oligomere im doppelsträngigen Zustand ohne kohäsive Enden. Die entstehenden Polymeren werden durch Laufenlassen über ein Molekularsieb (Biogel P60) isoliert, wobei diejenigen mit 20 bis 100 Oligomeren erhalten werden. Nach Konzentrierung wird diese Fraktion wieder einer Katalyse oder Polymerisation durch T4 DNS-Ligase unter den oben beschriebenen Bedingungen unterworfen. Danach werden, wie oben beschrieben, diejenigen Polymeren isoliert, die aus mindestens 100 Oligomeren aufgebaut sind.
    • Herstellung des Wirtsplasmids
  • Der pUC8-Expressionsvektor wird durch SmaI-Enzym in dem geeigneten Puffer, wie oben beschrieben, linearisiert. Der durch SmaI linearisierte Vektor besitzt keine kohäsiven Enden. Der so linearisierte Vektor wird mit alkalischer Kälberdarmphosphatase (CIP) bei einem Gehalt von einer Einheit pro ug des Vektors in dem geeigneten Puffer bei 37ºC 30 Minuten lang behandelt. Das CIP-Enzym wird danach mittels zweier aufeinanderfolgender Extraktionen mit Phenol-Chloroform inaktiviert. Der linearisierte und dephosphorilierte Vektor wird in Ethanol ausgefällt, dann mit 1 mg/ml in Wasser wieder gelöst.
    • d) Ligierung von stochastischen Genen an den Vektor
  • Äquimolare Mengen des Vektors und Polymers werden gemischt und in Gegenwart von 1000 Einheiten T4 DNS- Ligase, 1 mM ATP, 10% Polyethylenglykol in dem geeigneten Puffer 12 Stunden lang bei 13ºC inkubiert. Diese Stufe ligiert die stochastischen Polymeren in den Expressionsvektor und bildet doppelsträngige, kreisförmige Moleküle, die deshalb zur Transformation geeignet sind.
    • Transformation kompetenter Klone
  • Die Transformation kompetenter Klone wird in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt.
    • III) Aufbau stochastischer Gene, ausgehend von einer Gruppe von Heptameren
  • Dieses Verfahren unterscheidet sich von dem gerade beschriebenen dadurch, daß man palindrome Heptamere verwendet, die variable kohäsive Enden besitzen, anstelle der stochastischen Sequenzen, die eine geringere Anzahl identisch er Motive enthalten.
    • a) Wahl einer Gruppe von Heptameren
  • Es ist, als ein Beispiel, möglich, die folgenden drei palindromischen Heptamere zu verwenden:
  • 5' XTCGCGA 3'
  • 5' XCTGCAG 3'
  • 5' RGGTACC 3'
  • worin X = A, G, C, oder T und R = A oder T, und worin die Polymerisation nicht irgendwelche "Stop"-Codons bilden kann und Triplets bildet, die alle Aminosäuren spezifizieren.
  • Es ist selbstverständlich möglich, andere Gruppen von Heptameren zu verwenden, die diese gleichen Bedingungen erfüllen.
    • b) Polymerisation einer Gruppe von Heptameren
  • Diese Polymerisation wird in genau der gleichen Weise durchgeführt, wie sie oben für Oktamere beschrieben ist.
    • c) Eliminierung kohäsiver Enden
  • Die so erhaltenen Polymeren haben an ihren zwei 5'-Enden eine ungepaarte Base. Es ist deshalb notwendig, die komplementäre Base an den entsprechenden 3'-Enden anzufügen. Dies wird wie folgt ausgeführt: 10 ug der doppelsträngigen Polymeren werden mit 10 Einheiten des Klenow-Enzyms in Gegenwart der 4-Deoxynukleotidphosphate (200 mM) in einem Volumen von 100 ul bei 4ºC während 60 Minuten umgesetzt. Das Enzym wird durch Phenol- Chloroform-Extraktion inaktiviert und die Polymeren werden von den verbliebenen freien Nukleotiden durch differentielle Ausfällung gereinigt. Die Polymeren werden dann an das Wirtsplasmid (vorher linearisiert und dephosphoriliert) gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ligiert.
  • Es ist festzustellen, daß die zwei letztbeschriebenen Verfahren palindromischer Oktamere oder Heptamere verbinden, die spezifische Stellen von gewissen Restriktionsenzymen bilden. Diese Stellen fehlen zum größten Teil im pUC8-Expressionsvektor. Es ist deshalb möglich, die Komplexität einer anfänglichen Präparation von stochastischen Genen beträchtlich zu vermehren, wenn man nach dem folgenden Weg vorgeht: Die Plasmid-DNS, die sich von der Kultur von 10&sup7; unabhängigen Transformanten, die nach einer der beiden letzten, oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, ableitet, wird isoliert. Nachdem diese DNS gereinigt ist, wird sie teilweise vom ClaI-Restriktionsenzym (Verfahren II) oder vom PstI-Restriktionsenzym (Verfahren III) verdaut. Nach Inaktivierung des Enzyms wird die teilweise verdaute DNS mit T4-DNS-Ligase behandelt, die die Wirkung hat, eine sehr große Zahl neuer Sequenzen hervorzurufen, während die fundamentalen Eigenschaften der anfänglichen Sequenzen bewahrt bleiben. Dieses neue Ensemble stochastischer Sequenzen kann dann verwendet werden, um kompetente Zellen zu transformieren.
  • Zusätzlich können die nach dem Verfahren II und III klonierten stochastischen Gene in intakter Form aus dem pUC8-Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsstellen herausgeschnitten werden, die zu dem klonierenden Vektor gehören und in den stochastischen DNS-Sequenzen nicht vorhanden sind.
  • Die Rekombinierung innerhalb der durch die zwei gerade beschriebenen Verfahren gebildeten stochastischen Gene, die aus der internen Homologie aufgrund der wiederkehrenden molekularen Motive resultieren, ist eine wichtige zusätzliche Methode, um in vivo Mutagenese der kodierenden Sequenzen zu erreichen. Dies ergibt eine Vermehrung der Zahl neuer Gene, die geprüft werden können.
  • Schließlich ist es für alle Verfahren zur Schaffung neuer synthetischer Gene möglich, eine Zahl allgemein üblicher Verfahrensweisen zu verwenden, um Gene in vivo oder in vitro zu modifizieren, wie z. B. eine Änderung des Leserahmens, Inversion von Sequenzen im Hinblick auf ihren Promotor, Punktmutationen oder Verwendung von Wirtszellen, die eine oder mehrere Suppressor-tRNSs exprimieren.
  • Unter Berücksichtigung der obigen Beschreibung ist es klar, daß es möglich ist, in vitro eine extrem große Zahl (z. B. mehr als eine Billion) verschiedener Gene durch enzymatische Polymerisation von Nukleotiden oder von Oligonukleotiden zu konstruieren. Diese Polymerisation wird in einer stochastischen Weise durchgeführt, wie sie bestimmt wird durch die jeweiligen Konzentrationen der Nukleotide oder Oligonukleotide, die in der Reaktionsmischung vorhanden sind.
  • Wie vorstehend gezeigt, können zwei Verfahren verwendet werden, um solche Gene (oder kodierende Sequenzen) zu klonieren: die Polymerisation kann direkt an einem klonierenden Expressionsvektor durchgeführt werden, der vorher linearisiert wurde; oder es ist möglich, auf die Polymerisation dann die Ligierung der Polymeren auf dem klonierenden Expressionsvektor folgen zu lassen.
  • In den zwei Fällen ist die nächste Stufe die Transformation oder Transfektion kompetenter Bakterienzellen (oder Zellen in Kultur). Diese Stufe konstituiert die Klonierung der stochastischen Gene in lebenden Zellen, wo sie unbegrenzt vermehrt und exprimiert werden.
  • Es ist klar, daß es zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Verfahren möglich ist, alle anderen Verfahren zu verwenden, die geeignet sind zur Synthese stochastischer Sequenzen. Insbesondere ist es möglich, die Polymerisation von einzelsträngigen Oligomeren der DNS oder RNS, erhalten durch chemische Synthese, durch biochemische Mittel durchzuführen, dann diese Segmente von DNS oder RNS nach bewährten Verfahren zu behandeln, um doppelsträngige DNS (cDNS) auszubilden, um solche Gene zu klonieren.
    • Screening oder Selektion von Klonen transformierter Wirtszellen
  • Die weitere Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Prüfung der transformierten oder transfektierten Zellen durch Selektion oder Screening, um eine oder mehrere Zellen zu isolieren, deren transformierende oder transfektierende DNS zur Synthese eines Transkriptionsproduktes (RNS) oder Translationsproduktes (Protein) führt, das die gewünschte Eigenschaft besitzt. Diese Eigenschaften können z. B. enzymatischer, funktioneller oder struktureller Natur sein.
  • Einer der wichtigsten Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß es das gleichzeitige Screening oder die Selektion eines verwertbaren Produktes (RNS oder Protein) und des Gens, welches dieses Produkt produziert, ermöglicht. Zusätzlich kann, wie beschrieben, die synthetisierte und klonierte DNS selektiert oder gescreent werden, um DNS- Sequenzen zu isolieren, die selbst Produkte bilden, die verwertbare biochemische Eigenschaften besitzen.
  • Wir werden nun, als nicht einschränkende Beispiele, bevorzugte Verfahrensweisen zum Screening oder zur Selektion von Klonen transformierter Zellen beschreiben, die solcher Art sind, daß die neuen Proteine vom Standpunkt industrieller oder medizinischer Anwendungen von Interesse sind.
  • Es wird darauf hingewiesen, daß während der obigen Beschreibung der Verfahren eine Zahl von Mitteln beschrieben wurde, um Selektion oder Screening zu erreichen. Alle diese Verfahren können die Reinigung eines bestimmten Proteins von einem transformierten Klon erfordern. Diese Proteinreinigungen können durch bewährte Verfahren durchgeführt werden und verwenden insbesondere die Techniken der Gelchromatographie, Ionenaustausch und Affinitätschromatographie. Zusätzlich können die durch stochastische Gene erzeugten Proteine in Form von Hybridproteinen kloniert gewesen sein, z. B. mit einer Sequenz des β-Galactosidaseenzyms, welche Affinitätschromatographie gegen Anti-Galactosidase-Antikörper und die nachfolgende Abspaltung des Hybridteils erlaubt (d. h. die Trennung des neuen Teils vom bakteriellen Teil). Nachfolgend beschreiben wir die Prinzipien und Verfahren zur Selektion von Peptiden oder Polypeptiden und der entsprechenden Gene gemäß einem zweiten Verfahren des Screenings und der Selektion, das auf der Bestimmung der Fähigkeit dieser Peptide oder Polypeptide beruht, eine spezifische Reaktion zu katalysieren.
  • Als ein konkretes und nicht einschränkendes Beispiel wird das Screening oder die Selektion in dem besonderen Fall eines Proteins beschrieben, das fähig ist, die Spaltung von Lactose zu katalysieren, eine Funktion, die normalerweise von dem Enzym β-Galactosidase (β-gal) erfüllt wird.
  • Wie vorstehend beschrieben, besteht die erste Stufe des Verfahrens in der Schaffung eines sehr großen Ensembles von Expressionsvektoren, von denen jeder ein bestimmtes neues Protein exprimiert. Im konkreten Fall kann man z. B. den pUC8- Expressionsvektor wählen, mit Klonieren stochastischer Sequenzen von DNS in der PstI-Restriktionsstelle. Die so erhaltenen Plasmide werden dann in ein Klon von E. coli eingebracht, von dessen Genom das natürliche Gen für β- Galactosidase, Z und ein zweites Gen EBG, das zum ersten in keiner Beziehung steht, aber dazu fähig ist, in Richtung β-gal- Funktion zu mutieren, beide durch bekannte genetische Methoden entfernt wurden. Solche Wirtszellen (Z&supmin;, EBG&supmin;) sind für sich nicht fähig, die Lactose-Hydrolyse zu katalysieren und dadurch Lactose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu verwenden. Dies erlaubt die Verwendung solcher Wirtsklone für das Screening oder die Selektion für β-gal-Funktion.
  • Ein zweckmäßig es biologisches Prüfverfahren zur Untersuchung transformierter E. coli Klone mit neuen Genen, die eine β-gal- Funktion exprimieren, besteht in der Kultur von so transformierten Bakterien in Petrischalen, die X-gal Medium enthalten. In diesem Fall werden alle Bakterienkolonien, die eine β-gal-Funktion exprimieren, als blaue Kolonien sichtbar gemacht. Unter Verwendung eines solchen biologischen Prüfverfahrens ist es möglich, sogar schwache katalytische Aktivität festzustellen. Die spezifische Aktivität der charakteristischsten Enzyme liegt im Bereich von 10 bis 10.000 Produktmolekülen pro Sekunde.
  • Unter der Annahme, daß ein durch ein stochastisches Gen synthetisiertes Protein eine schwache spezifische Aktivität besitzt in der Größenordnung von einem Molekül pro 100 Sekunden, bleibt es möglich, eine solche katalytische Aktivität zu bestimmen. In einer Petrischale, die X-gal Medium enthält und in Gegenwart des nicht metabolisierbaren Inducer IP T G (Isopropyl-D-thiogalactosid) erfordert die Sichtbarmachung einer blauen Region die Spaltung von ca. 10¹&sup0; bis 10¹¹ Molekülen an X-gal pro mm². Eine Bakterienkolonie, die ein schwaches Enzym exprimiert und eine Oberfläche von 1 mm² einnimmt, hat ca. 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen. Wenn jede Zelle nur eine Kopie des schwachen Enzyms besitzt, würde jede Zelle zur Katalyse der Spaltung zwischen 10.000 und 100 von X-gal benötigen, um bestimmt zu werden, was zwischen 2,7 und 270 Stunden erfordern würde. Da es unter selektiven Bedingungen möglich ist, die Zahl der Kopien jedes Plasmids pro Zelle auf 5 bis 20 Kopien pro Zelle zu verstärken oder sogar auf 100 bis 1000, und weil bis zu 10% des Proteins der Zelle durch das neue Gen spezifiziert werden kann, ist die zur Bestimmung einer blauen Kolonie im Fall von 100 Enzymmolekülen schwacher Aktivität pro Zelle benötigte Zeit in der Größenordnung von 0,27 bis 2,7 Stunden.
  • Folglich ist das Screening einer sehr großen Zahl unabhängiger Bakterienkolonien, von denen jede ein verschiedenes neues Gen exprimiert und die Verwendung der Fähigkeit, eine β-gal- Funktion zu exprimieren, als Selektionskriterium voll realisierbar. Folglich ist es möglich, das Screening von ca. 2.000 Kolonien in einer Petrischale von 10 cm Durchmesser durchzuführen. So können ca. 20 Millionen Kolonien auf einem Blatt von X-gal-Agar von 1 m² gescreent werden.
  • Es ist festzustellen, daß Bakterienkolonien, die auf X-gal- Petrischalen blau erscheinen, falsche Positive sein könnten, aufgrund einer Mutation in dem Bakteriengenom, die die Fähigkeit, Lactose zu metabolisieren, darauf überträgt, oder aus anderen Gründen als denen, die aus einer katalytischen Wirkung des neuen, durch die Zellen der Kolonie exprimierten Proteins resultieren. Solche falschen Positive können direkt eliminiert werden durch Reinigung der DNS des Expressionsvektors von der positiven Kolonie und Retransformierung von Z&supmin;, EBG&supmin;, E. coli- Wirtszellen. Wenn die β-gal-Aktivität auf dem durch das neue Gen in dem Expressionsvektor kodierte Protein beruht, werden alle die durch diesen Vektor transformierten Zellen β-gal- Funktion zeigen. Im Gegensatz dazu ist es eine seltene Erscheinung und unabhängig von der Transformation, wenn die anfängliche blaue Kolonie auf einer Mutation im Genom der Wirtszelle beruht, und deshalb wird die Zahl der Zellen des neuen transformierten E. coli Klons, der als Wirt zur Exprimierung der β-gal-Funktion fähig ist, klein oder null sein.
  • Die Leistung der gleichzeitigen Massenreinigung aller Expressionsvektoren für alle positiven Klone (blau), gefolgt von Retransformierung naiver Bakterien, sollte hervorgehoben werden. Unter der Annahme, daß es das Ziel ist, ein Screening durchzuführen, um Proteine zu selektieren, die eine katalytische Funktion besitzen, und daß die Wahrscheinlichkeit, daß ein neues Peptid oder Polypeptid diese Funktion mindestens geringfügig ausführt, 10&supmin;&sup6; ist, während die Wahrscheinlichkeit, daß ein Klon des bakteriellen E. coli-Wirts einer Mutation unterliegt, die ihn dazu befähigt, die gleiche Funktion auszuüben, 10&supmin;&sup5; ist, dann kann errechnet werden, daß unter 20 Millionen transformierten Bakterien, die gescreent werden, 20 positive Klone den neuen Genen in den Expressionsvektoren, welche jede trägt, zuzuschreiben sind, während 200 positive Klone das Ergebnis von Hintergrundsmutationen sein werden. Die Massenreinigung der Expressionsvektoren von den insgesamt 220 positiven bakteriellen Klonen, gefolgt von der Retransformation naiver Bakterien mit der Mischung dieser Expressionsvektoren, wird eine große Zahl positiver Klone produzieren, die aus allen diesen Bakterien bestehen, die mit den 20 Expressionsvektoren transformiert sind, die für die neuen Proteine kodieren, die die gewünschte Funktion besitzen, und eine sehr kleine Zahl von bakteriellen Klonen, die aus Hintergrundsmutationen resultieren und die 200 Expressionsvektoren enthalten, die nicht von Interesse sind. Eine kleine Zahl von Reinigungszyklen von Expressionsvektoren von positiven bakteriellen Kolonien, gefolgt von einer solchen Retransformation, erlaubt die wirklich positive Bestimmung sehr seltener Expressionsvektoren für eine gewünschte katalytische Aktivität, trotz einer hohen Hintergrundsrate von Mutationen in den Wirtszellen für die gleiche Funktion.
  • Nachfolgend auf die Screening-Verfahren dieser Art ist es möglich, das neue Protein durch bewährte Techniken zu reinigen. Die Herstellung dieses Proteins in großer Menge wird durch die Tatsache möglich gemacht, daß die Identifizierung des brauchbaren Proteins zusammen mit der gleichzeitigen Identifizierung des Gens stattfindet, das für das gleiche Protein kodiert. Es kann deshalb entweder der gleiche Expressionsvektor verwendet werden, oder das neue Gen kann für seine Synthese und Isolierung in großer Menge in einen geeigneteren Expressionsvektor transplantiert werden.
  • Es ist möglich, dieses Screeningverfahren für irgendeine enzymatische Funktion anzuwenden, für die eine geeignete biologische Prüfung existiert. Für solche Screenings ist es nicht notwendig, daß die enzymatische Funktion, die gesucht wird, für die Wirtszelle vorteilhaft ist. Es ist möglich, die Screenings nicht nur für eine enzymatische Funktion auszuführen, sondern für irgendeine andere gewünschte Eigenschaft, für die es möglich ist, ein geeignetes biologisches Prüfverfahren zu schaffen. Es ist deshalb selbst in dem einfachen Fall einer βgal-Funktion, die an einer X-gal-Petriplatte sichtbar gemacht wird, möglich, ein Screening in der Größenanordnung von 100 Millionen oder sogar einer Billion neuer Gene für eine katalytische Aktivität oder irgendeine andere gewünschte Eigenschaft durchzuführen.
    • Selektion transformierter Wirtszellen
  • Auf der anderen Seite ist es möglich, die Selektionstechniken für irgendeine Eigenschaft, katalytischer oder anderer Natur, zu verwenden, worin die Gegenwart oder Abwesenheit der Eigenschaft für das Überleben der Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, die für die neuen Gene kodieren, wesentlich ist, oder auch verwendet werden kann, um diese Viren zu selektieren, die das neue Gen kodieren und exprimieren. Als konkretes, aber nicht einschränkendes Beispiel soll die Selektion der β-Galactosidase-Funktion beschrieben werden. Ein geeignetes Klon von Z&supmin;EBG&supmin; E. coli kann nicht wachsen bei Verwendung von Lactose als einziger Kohlenstoffquelle. Es ist deshalb nach Durchführung der ersten oben beschriebenen Stufe möglich, eine sehr große Zahl von Wirtszellen, die durch die Expressionsvektoren transformiert sind, die für die neuen Gene kodieren, unter selektiven Bedingungen zu kultivieren, entweder durch progressive Verringerung anderer Kohlenstoffquellen oder alleiniger Verwendung von Lactose von Anfang an. Während der Durchführung einer solchen Selektion erlaubt die in vivo Mutagenese durch Rekombination oder durch explizite Gewinnung der Expressionsvektoren und Mutagenese ihrer neuen Gene in vitro durch verschiedene Mutagene oder durch irgendeine andere übliche Technik, anpassungsfähige Verbesserungen in der Fähigkeit, die gewünschte katalytische Funktion zu erfüllen. Wenn zur gleichen Zeit Selektionstechniken und bequeme biologische Prüfverfahren existieren, wie im vorliegenden Fall, ist es möglich, die Selektionstechniken anfangs zu verwenden, um die Repräsentation der Wirtsbakterien, die die β-gal- Funktion exprimieren, anzureichern und dann ein Screening auf einer Petrischale an X-gal-Medium durchzuführen, um wirkungsvoll zu bestimmen, welches die positiven Zellen sind. In Abwesenheit zweckmäßiger biologischer Prüfverfahren ist die Anwendung einer progressiv genaueren Selektion der einfachste Weg, um ein oder eine kleine Zahl bestimmter Wirtszellen zu reinigen, deren Expressionsvektoren für die Proteine kodieren, die die gewählte Reaktion katalysieren.
  • Es ist möglich, diese Techniken zu verwenden, um neue Proteine zu finden, die eine große Vielzahl struktureller oder funktioneller Charakteristika neben der Fähigkeit, eine spezifische Reaktion zu katalysieren, besitzen.
  • Im Falle von E. coli exprimiert z. B. ein Klonmutant in dem Repressor des Lactose-Operons (i-) grundlegend die β-gal- Funktion aufgrund der Tatsache, daß der Lactose-Operator nicht reprimiert ist. Alle Zellen dieses Typs produzieren an Petrischalen, die X-gal-Medium enthalten, blaue Klone. Es ist möglich, solche Wirtszellen mit Expressionsvektoren zu transformieren, die neue Proteine synthetisieren, und ein ein Screening an X-gal-Petrischalen durchzuführen, um diese Klone zu bestimmen, die nicht blau sind. Unter diesen repräsentieren einige den Fall, bei dem das neue Protein an den Lactose- Operator bindet und die Synthese von β-gal reprimiert. Es ist möglich, solche Plasmide in Masse zu isolieren, zu retransformieren, solche Klone, die kein β-gal produzieren, zu isolieren, und danach eine detaillierte Prüfung durchzuführen.
  • Wie vorstehend erwähnt, kann das Verfahren verwendet werden, um nicht nur verwertbare Proteine zu schaffen und dann zu isolieren, sondern auch RNS und DNS als Produkte, die selbst verwertbare Eigenschaften besitzen. Dies ergibt sich selbstverständlich aus der Tatsache, daß auf der einen Seite das Verfahren darin besteht, stochastische Sequenzen von DNS zu schaffen, die direkt mit anderen zellulären oder biochemischen Bestandteilen in Wechselwirkung treten können, und auf der anderen Seite diese in Expressionsvektoren klonierten Sequenzen in RNS transkribiert werden, die selbst für viele biochemische Wechselwirkungen fähig sind.
    • Schaffung und Selektion einer als solche verwendbaren RNS
  • Es wird eine sehr große Zahl stochastischer DNS-Sequenzen angenommen, die wie beschrieben hergestellt und in einem Expressionsvektor kloniert wurden. Es folgt, daß die aus diesen Sequenzen in den transformierten Wirtszellen transkribierte RNS als solche brauchbare Produkte sein können. Als nicht einschränkendes Beispiel ist es möglich, ein stochastisches Gen, das für eine Suppressor-Transfer-RNS (tRNS) kodiert, nach dem folgenden Verfahren zu selektieren:
  • Eine große Zahl (≥10&sup8;) stochastischer Sequenzen wird in kompetente bakterielle Wirte transformiert, die eine "Nonsense"-Mutation in dem arg E. Gen tragen. Diese transformierten Bakterien werden im geringstmöglichen Medium ohne Arginin und mit dem selektiven Antiobiotikum für das Plasmid (Ampicillin, wenn der Vektor pUC8 ist) auf eine Platte aufgeschichtet. Nur diejenigen transformierten Bakterien, die zur Synthese von Arginin befähigt wurden, sind fähig zu wachsen. Dieser Phenotyp kann entweder von einer Rückmutation des Wirtsgenoms resultieren oder von der Einführung eines Suppressors in die Zelle. Es ist leicht, jede transformierte Kolonie zu testen, um festzustellen, ob der arg&spplus;-Phenotyp von der Gegenwart des stochastischen Gens in seinem Vektor abhängig ist oder nicht; es reicht aus, das Plasmid dieser Kolonie herzustellen und festzustellen, daß es den Phenotyp Arg&spplus; an jede Zelle überträgt, die es transformiert.

Claims (37)

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen mit mindestens einer bestimmten Eigenschaft, wobei man gleichzeitig eine Vielzahl von Genen in einem gemeinsamen Milieu hinzufügt, um eine Genenbibliothek zu produzieren, man die Gene multipliziert, man ein Screening und/oder eine Selektion durchführt, um mindestens ein Gen zu identifizieren, das fähig ist, als Peptid, Polypeptid oder Protein mit der erwähnten Eigenschaft exprimiert zu werden, und man mindestens ein Peptid, Polypeptid oder Protein herstellt, indem man die so erhaltene genetische Information benutzt dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zumindest teilweise aus stochastischen, synthetischen Polynukleotiden zusammengesetzt sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Screening und/oder die Selektion auf der erwähnten Genenbibliothek durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ferner die erwähnten Gene in Wirtszellen einbringt, um eine Bibliothek von transformierten Wirtszellen zu produzieren, welche diese Gene enthalten, und daß man das Screening und/oder die Selektion auf der so erhaltenen Bibliothek von transformierten Wirtszellen durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei man die unabhängigen Klone der transformierten Wirtszellen gleichzeitig kultiviert, um die stochastischen Gene zu klonieren und die Bildung von Proteinen, die durch jedes dieser stochastischen Gene exprimiert werden, zu bewirken, man das Screening und/oder die Selektion an solchen Klonen transformierter Wirtszellen durchführt, um die Klone zu identifizieren, die Peptide, Polypeptide oder Proteine mit der erwähnten bestimmten Eigenschaft bilden, und man die so identifizierten Klone isoliert, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid oder mindestens ein Protein mit dieser Eigenschaft zu produzieren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene durch stochastische Copolymerisation der vier Arten von Deoxyphosphonukleotiden A, C, G und T gebildet werden, ausgehend von den zwei Enden eines vorher linearisierten Expressionsvektors, dann durch Bildung kohäsiver Enden, um einen ersten Strang von stochastischer DNS zu bilden, der aus einem Molekül des Expressionsvektors aufgebaut ist, der zwei stochastische Sequenzen besitzt dessen 3'-Enden komplementär sind, gefolgt von der Synthese des zweiten Stranges der stochastischen DNS.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene durch stochastische Copolymerisation von doppelsträngigen Oligonukleotiden, die keine kohäsiven Enden besitzen, in einer solchen Weise hergestellt werden, um Fragmente von stochastischer DNS zu bilden, gefolgt von der Ligierung dieser Fragmente in einem vorher linearisierten Expressionsvektor.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor das Plasmid pUC8 ist.
9. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor ein Fragment einer viralen DNS ist.
10. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor ein Hybrid eines Plasmids und einer viralen DNS ist.
11. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor ein Phage ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische Zellen sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen eukaryontische Zellen sind.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ausgewählt sind aus HB101 und C600.
15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide eine Gruppe palindromischer Octamerer bilden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe palindromischer Octamerer die folgende Gruppe ist:
5' GGAATTCC 3'
5' GGTCGACC 3'
5' CAAGCTTG 3'
5' CCATATGG 3'
5' CATCGATG 3'.
17. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide eine Gruppe palindromischer Heptamerer bilden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe palindromischer Heptamere die folgende Gruppe ist:
5' XTCGCGA 3'
5' XCTGCAG 3'
5' RGGTACC 3'
worin X = A, G, C oder T, und R = A oder T.
19. Verfahren nach Anspruch 7 und einem der Ansprüche 15 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man zuerst die von einer Kultur unabhängiger Klone transformierter Wirtszellen abgeleitete transformierende DNS reinigt, die erhalten wird durch die in Anspruch 15 oder in Anspruch 17 angegebene Verfahrensweise, dann die gereinigte DNS mittels mindestens einem Restriktionsenzym, das einer spezifischen Restriktionsstelle entspricht, welche in diesen palindromischen Octameren oder Heptameren vorhanden ist, aber in dem verwendeten Expressionsvektor nicht vorhanden ist, schneidet und dann das Restriktionsenzym inaktiviert wird, daß man danach das so erhaltene Ensemble linearisierter stochastischer DNS- Fragmente mit T4 DNS-Ligase in einer solchen Weise behandelt, um ein neues Ensemble von DNS, das neue stochastische Sequenzen enthält, zu schaffen, und daß man dieses neue Ensemble transformierender DNS verwendet, um Wirtszellen zu transformieren und solche Gene zu klonen, und daß man schließlich das Screening und/oder eine Selektion durchführt und die neuen Klone transformierter Zellen isoliert, und daß man diese vermehrt, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid herzustellen.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, eine bestimmte chemische Reaktion zu katalysieren.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, selektiv die katalytische Aktivität eines Polypeptids zu modifizieren.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, an einen bestimmten Liganden zu bilden.
23. Verfahren nach Anspruch 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß Klone transformierter Wirtszellen, die Peptide oder Polypeptide mit der gewünschten Eigenschaft produzieren, durch Affinitätschromatographie an Antikörpern, die einem Protein entsprechen, das durch das natürliche Fragment des DNS-Hybrids exprimiert ist, identifiziert und isoliert werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das natürliche Fragment des DNS-Hybrids ein Gen enthält, das β-Galactosidase exprimiert, und daß man die Klone der transformierten Wirtszellen durch Affinitätschromatographie mit Anti-β-Galactosidase-Antikörpern identifiziert und isoliert.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß nach Expression und Reinigung der Hybridpeptide oder -polypeptide die neuen Fragmente abgetrennt und isoliert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, 13 und 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen aus Bakterien des Escherichia coli-Typs bestehen, dessen Genom weder das natürliche β-Galactosidase-Gen, noch das EBG-Gen enthält, d. h. Z&supmin;, EBG&supmin;, E. coli, und daß diese transformierten Wirtszellen in einem X-gal-Medium, das auch den Inducer IPTG enthält, kultiviert werden, daß Klone, die für β-Galactosidase-Funktion positiv sind, in dem Kulturmedium bestimmt werden, daß danach diese DNS auf einen Klon von Wirtszellen transplantiert wird, der geeignet ist zur industriellen Herstellung von mindestens einem Peptid, Polypeptid oder Protein.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, an eine bestimmte Verbindung zu binden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist aus Peptiden, Polypeptiden und Proteinen.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist unter den Sequenzen von DNS und RNS.
30. Verfahren zur Herstellung von DNS, dadurch gekennzeichnet, daß man einem gleichen Milieu gleichzeitig Gene produziert, die mindestens teilweise aus stochastischen, synthetischen Polynukleotiden zusammengesetzt sind, daß man die so produzierten Gene in die Wirtszellen in einer Weise einführt, um ein Ensemble von transformierten Wirtszellen zu bilden, daß man gleichzeitig die unabhängigen Klone der so hergestellten transformierten Wirtszellen kultiviert, daß man ein Screening und/oder eine Selektion an diesem Ensemble durchführt, um diese Wirtszellen zu identifizieren, die in ihren Genomen stochastische Sequenzen von DNS enthalten, die mindestens eine gewünschte Eigenschaft besitzen, und daß man die DNS aus Kulturen der so identifizierten Wirtszellen isoliert.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, an eine bestimmte Verbindung zu binden.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist unter Peptiden, Polypeptiden und Proteinen.
33. Verfahren zur Herstellung von RNS, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem gleichen Milieu gleichzeitig Gene produziert, die mindestens teilweise aus synthetischen, stochastischen Polynukleotiden zusammengesetzt sind, daß man die so erhaltenen Gene in Wirtszellen in einer Weise einbringt, um ein Ensemble transformierter Wirtszellen zu produzieren, daß man gleichzeitig die unabhängigen Klone der so hergestellten transformierten Wirtszellen kultiviert, daß man ein Screening und/oder eine Selektion an diesem Ensemble in einer Weise durchführt, um diese Wirtszellen zu identifizieren, die stochastische RNS-Sequenzen enthalten, die mindestens eine gewünschte Eigenschaft besitzen, und daß man die RNS aus Kulturen der so identifizierten Wirtszellen isoliert.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, an eine bestimmte Verbindung zu binden.
35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft die Fähigkeit ist, eine bestimmte chemische Reaktion zu katalysieren.
36. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft daraus besteht, die Funktion einer Transfer-RNS zu haben.
37. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen mit mindestens einer bestimmten Eigenschaft, wobei man eine Genenbibliothek produziert, man die Gene so amplifiziert und übersetzt, um Peptide oder Polypeptide oder Proteine herzustellen, welche durch mindestens eines der Genen dieser Bibliothek exprimiert werden, und man ein Screening und/oder eine Selektion durchführt, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid oder mindestens ein Protein mit dieser Eigenschaft zu identifizieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zumindest teilweise aus stochastischen, synthetischen Polynukleotiden zusammengesetzt sind.
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