SI8611796A

SI8611796A - Postopek za aktiviranje gentehnolosko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki imajo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih

Info

Publication number: SI8611796A
Application number: SI8611796A
Authority: SI
Inventors: Stephen Fischer; Ralf Mattes
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1985-10-23
Filing date: 1986-10-21
Publication date: 1996-10-31
Also published as: EP0219874B1; ES2020498A4; JPH0824594B2; JPH04218387A; HU204855B; SU1607689A3; HRP921075B1; DK200001897A; FI94050B; GR3018410T3; EP0393725A1; PT83609B; ZA868012B; IE62634B1; IE862683L; GR920300062T1; HK153496A; ATE98648T1; FI872753L; DE3650449D1

Abstract

Za aktiviranje gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariotskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih s celičnim razklopom, solubiliziranjem ob denaturiranih in reduciranih pogojih ter aktiviranjem ob oksidirnih pogojih v prisotnosti GSH/GSSG, delamo bodisi v stopnji aktiviranja pri pH vrednosti 9 do 12, koncentraciji GSH 0,1 do 20 mmol/l, koncentraciji GSSG 0,01 do 3 mmol/l ter ne-denaturirani koncentraciji denaturirnega sredstva, ali pa tako, da odločimo redukcijsko/denaturirno sredstvo, z dodatkom GSSG ob denaturiranih pogojih prevedemo tiolne skupine proteinov v mešane disulfide proteina in glutationa. Pri stopnji aktiviranja pri vrednosti pH 7 do 10,5 nastavimo koncentracijo GSH 0,5 do 5 mmol/l ter ne-denaturirno koncentracijo denaturirnega sredstva. Postopek je dragocen zlasti za t-PA in interferon Beta.

Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

Postopek za aktiviranje gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki imajo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih

Predloženi izum se nanaša na postopek za aktiviranje gentehnološko pripravljenih, eukariontskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih.

Pri ekspresiji heterolognih proteinov v prokariontih tvorijo ti proteini v celicah gostiteljicah pogosto neaktivne težko topne agregate (t.i. refractile bodies), ki so vrhu tega še oneciščeni s proteini celic gostiteljic. Domnevajo, da je tvorba takih refractile bodies posledica pri ekspresiji nastale visoke koncentracije proteinov v celici. Znano je, da pri tvorbi velikih količin encimov v celici poteka agregacija encimov v netopne, visokomolekulske, večinoma neaktivne delce. Preden pa lahko uporabimo take proteine, npr. za terapevtske namene, pa jih je treba očistiti in prevesti v aktivno obliko.

Po znanih postopkih lahko poteka aktiviranje tovrstnih proteinov, ki nastopajo kot agregati, v več stopnjah (prim. npr. B. R. Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, Vol. 52 (1979) 187 do 198; R. Rudolph, Biochemistry J8 (1979) 5572 do 5575):

V prvi stopnji dosežejo solubiliziranje z dodatkom močnih denaturirnih sredstev, npr. gvanidin-hidroklorida ali sečnine v visoki koncentraciji, ali z dodatkom močno kislih sredstev, npr. zmesi glicina/fosforove kisline. Kot nadaljnje pomožne snovi so se obnesli reducirni SH-reagenti (npr. ditioeritritol, DTE) in EDTA, npr. pri renaturiranju LDH. V kolikor je protein onečiščen s proteini celice gostiteljice, sledi kot naslednja stopnja čiščenje po metodah, ki so same po sebi znane in običajne, npr. z gelno ali ionsko izmenjalno kromatografijo. Zatem močno razredčimo, da se zmanjša koncentracija denaturirnega sredstva. Pri uporabi gvanidin-hidroklorida pri tem razredčimo na vrednosti pod 0,5 mol/1. Pri encimih s prostimi SH-skupinami se izkaže kot prikladen dodatek sredstev, ki ščitijo SH-skupine (prim. npr. B. R. Jaenicke, Journal Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143 do 2160).

V EP-A-O1145O6 opisujejo postopke za izolacijo, čiščenj in aktiviranje nekaterih heterolognih produktov ekspresije iz bakterijskih kultur; za aktiviranje prevedejo raztopine refractile bodies v močnem denaturirnem sredstvu a) direktno v raztopino v šibkejšem denaturirnem sredstvu, kar nato pod- 3 vržejo oksidirnim pogojem, za ponovno tvorbo disulfidnih mostov; b) protein sulfonirajo, da nato prevedejo v raztopino v šibkem denaturirnem sredstvu ter S-sulfonatne skupine z obdelavo s sulfihidrilnim reagentom v njegovi reducirani in oksidirani obliki, npr. z GSH/GSSG, prevedejo v -S-S-skupine; ali c) raztopino v šibkem denaturirnem sredstvu direktno obdelajo s sulfhidrilnim reagentom, npr. z GSH/GSSG. Značilen primer, pri katerem nastopajo zgoraj prikazani problemi, je t-PA.

Glavna komponenta proteinske matrice strjene krvi je polimer fibrin. To proteinsko matrico raztaplja plazmin, ki se tvori iz plazminogena preko aktiviranja s t.i. aktivatorji plazminogena, npr. s t-PA (tkivni aktivator plazminogena, tissue-type plasminogen activator). Encimatska aktivnost naravnega ali iz eukariontov gentehnološko pridobljenega t-PA (katalitsko aktiviranje plazminogena do plazmina) je v odsotnosti fibrina ali fibrinskih cepilnih produktov (FSP) zelo majhna, da pa se v prisotnosti teh stimulatorjev znatno ojačiti (za več kot faktor 10). Ta t.i. stimulirnost učinkovi tosti je odločilna prednost t-PA v primeri z drugimi znanimi aktivatorji plazminogenov kot urokinazo ali streptokinazo (prim. npr. M. Hoylaerts et al, J. Biol. Chem. 257 (1982)

2912 do 2019; Nieuwenhiuzen et al, Biochimica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 do 533). Faktor stimulirnosti z BrCNcepilnimi produkti je zato v literaturi različno naveden in oštevilčen z do 35.

- 4 t-PA-nast, neglikoziliran produkt se tvori tudi v genetsko manipuliranih prokariontih (po vrinjenju c-DNA); takemu produktu pa ne pripada stimulirnost učinkovitosti t-PA iz eukarionta. Možno je, da izvira to iz tega, da so redoks pogoji v prokariontni celici tako različni od eukariontne celice, iz katere izvira gen, da se na začetku izoblikuje neaktiven produkt, kar lahko vodimo npr. na to, da so številni SS-mostovi, ki jih vsebuje naravna aktivna molekula, povezani na napačen način, ali pa sploh niso izoblikovani. Za terapevtsko uporabo t-PA pa ni potrebna samo encimatska aktivnost kot taka, temveč vrhu tega tudi njegova stimulirnost. Tudi dejstvo, da prokariontna celica verjetno ne ustvarja pravih pogojev za izoblikovanje aktivnosti eukariontskih proteinov na pravilen način, je za druge snovi nakazano v The EMBO Journal 4, Nr. 3 (1985) 775 do 780.

Po EP-A-0093639 za aktiviranje t-PA suspendirajo iz E. coli dobljene celične peletke v 6 mol/1 gvanidin-hidroklorida, obdelajo z ultra zvokom, inkubirajo in zatem dializirajo 4 ure proti raztopini iz Tris-HCl (pH = 8,0), natrijevega klorida, EDTA in Tween 80. Po dializi centrifugirajo, pri čemer v vrhnjem sloju (supernatantu) najdejo učinkovitost aktiviranja plazminogena. Na ta način naturiran t-PA je sicer proteolitično aktiven, vendar pa ne kaže merljive stimulirnosti z BrCN-cepilnimi produkti (BrCN-FSP) fibrina v smislu postopka, opisanega v J. H. Verheijen, Thromb. Haemostas.,

48, (3), 260 - 269 (1982).

- 5 Za aktiviranje denaturiranih proteinov ni iz stanja tehnike znan noben splošno uporaben postopek; to velja še prav posebej za t-PA, ker ima nativni protein zelo kompleksno strukturo; vsebuje prosto tiolno skupino in 17 SS-mostov, ki se dajo teoretično povezati na 2,2 x 10 različnih načinov, pri čemer samo ena struktura ustreza nativnemu stanju. Iz stanja tehnike znani postopki za aktiviranje t-PA sicer vodijo do proteolitično aktivnega t-PA, ki pa ne kaže merljive stimulirnosti; postopek aktiviranja, ki vodi do stimulirnega t-PA, pa še ni znan.

Naloga predloženega izuma za to je, da nam da na voljo postopek za popolno aktiviranje gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih; to nalogo rešimo s predmetom predloženega izuma.

Predmet izuma je postopek za aktiviranje gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih, ob razklopu celice, solubiliziranju pri denaturirnih in reducirnih pogojih ter aktiviranju (renaturiranju) pri oksidirnih pogojih v prisotnosti GSH/GSSG, ki je označen s tem, da v stopnji aktiviranja delamo pri pH vrednosti 9 do 12, GSH-koncentraciji 0,1 do 20 mmol/1, GSSG-koncentraciji 0,01 do 3 mmol/1, ter z ne-denaturirno koncentracijo denaturirnega sredstva.

Prednostne izvedbe predloženega postopka so predmet ood zahtevkov.

- 6 Kot denaturirno sredstvo lahko praviloma uporabimo za aktiviranje pri oksidirnih pogojih običajno uporabljeno denaturirno sredstvo ali arginin; prednostno uporabljamo izmed znanih denaturirnih sredstev gvanidin-hidroklorid ali sečnino ali njune derivate. Vrhu tega se je kot primeren izkazal tudi arginin. Nadalje se da uporabljati zmesi teh denaturirnih sredstev. Prednostno izvedemo to stopnjo aktiviranja tudi v prisotnosti tujega proteina; kot tak je primeren praviloma vsak tuj protein, v kolikor ni proteolitično učinkovit; prednostno uporabijamo goveji serumski albumin (BSA), npr. v količini 1 do 3 mg/ml. Dodatek BSA izzove lahno povišanje dobitka in stabiliziranje proteina (verjetno z zaščito pred površinskim denaturiranjera in/ali proteolitično razgradnjo).

Ostali pogoji postopka lahko ustrezajo pogojem, ki so znani in običajni za reaktivirne stopnje iz stanja tehnike. Trajanje aktiviranja (inkubacija) znaša prednostno 20 do 48 ur pri sobni temperaturi. Razplovni čas aktiviranja znaša v prisotnosti 0,5 mmol/1 reduciranega (GSH) in oksidiranega (GSSG) glutationa okoli 10 do 15 ur pri 20 °C. Pri daljši inkubaciji (48 ur) pri reoksidacijskih pogojih stimulirnost z CNBr-FSP praviloma pojema. Stopnjo aktiviranja izvedemo pred nostno v prisotnosti EDTA, pri čemer najbolj smotrna koncentra cija znaša okoli 1 mmol/1 EDTA.

Stopnje postopka, ki jih izvajamo pred ali po stopnji aktiviranja (reoksidacija/aktiviranje), kot celični razklop, solubiliziranje (solubiliziranje/redukcija) in v danem primeru ena ali več čistilnih operacij, ki jih izvedemo pred in/ali po stopnji aktiviranja, se dajo izvesti po tehniki, ki je znana oz. običajna za tovrstne postopke, npr. iz EP-A01 14506, EP-A-0093619; za dosego razultata, optimalnega z ozirom na dobitek in aktiviranje, pa je lahko smotrno, da izvedemo posamično ali vse stopnje postopka ob upoštevanju ene ali več v predloženem opisu pojasnjenih izvedb postopka. Tako je zlasti možno, da izvedemo stopnjo aktiviranja v smislu izuma v zmesi, dobljeni po razklopu, brez predhodnega denaturiranja in/ali redukcije, vsekakor pa z nizkim dobitkom. Ekspresijo izvedemo v prokariontih, prednostno v P.putida in zlasti E.coli. Postopek v smislu izuma pa je prav tako prikladen, kadar eksprimiramo v drugih prokariontih (npr. v Bacilli).

Celični razklop lahko pri tem izvedemo po običajnih metodah, npr. s pomočjo ultra zvoka, visokotlačno disperzijo ali lizocimsko; izvedemo ga prednostno v pufrski raztopini, primerni za nastavitev nevtralne do šibko kisle pH-vrednosti, kot suspenzijskega medija, npr. v 0,1 mol/1 Tris-HCl. Po celičnem razklopu odločimo netopno (refractile bodies) na poljuben način, prednostno z odcentrifugiranjem pri višjih g-številih in daljšem času centrifugiranja, ali s filtracijo. Po izpranju s sredstvi, ki ne motijo t-PA, tuje celične protei ne pa po možnosti raztapljajo, npr. v vodi, fosfatni pufrski raztopini, v danem primeru ob dodatku milih detergentov kot tritona, podvržemo oborino (pelet) solubiliziranju (solubiliziranje/redukcija). Solubiliziranje poteka prednostno v alkalnem pH-območju, zlasti pri pH 8,6 + 0,4 ter v prisotnosti

- 8 redukcijskega sredstva iz merkaptanske skupine in denaturirnega sredstva.

Kot denaturirna sredstva lahko uporabimo za solubiliziranje iz stanja tehnike, npr. iz EP-A-0114506, znana in običajna denaturirna sredstva, zlasti gvanidin-hidroklorid ali sečnino. Koncentracija gvanidin-hidroklorida znaša smotrno okoli 6 molov/1, sečnine pa okoli 8 raolov/1. Prav tako lahko uporabimo spojine s splošno formulo I.

Kot reducente iz skupine merkaptanov lahko uporabimo npr. reduciran glutation (GSH) ali 2-raerkaptoetanol, npr. v koncentraciji okoli 50 do 400 mmolov/1 ditiotreitola in/ali zlasti DTE (ditioeritritol) oz. DTT (ditiotreitol) , npr. v koncentraciji okoli 80 do 400 mmolov/1. Solubiliziranje poteka smotrno pri sobni temperaturi v času (inkubacija) 1 do več ur, prednostno 2 uri. Za preprečenje oksidacije reducenta z zračnim kisikom je lahko smotrno uporabiti EDTA. Poleg solubuliziranja/redukcije ima stopnja solubiliziranja tudi čistilni efekt, ker večji del materiala, ki ne reagira navskrižno imunološko s t-PA (tujih proteinov), ne preide v raztopino.

Po solubiliziranju in pred stopnjo aktiviranja lahko vrinemo same po sebi znane in običajne stopnje čiščenja; kot čistilne metode pridejo v poštev npr. sterična razklopna kromatografija (SEC) (v prisotnosti gvanidin-hidroklorida ali sečnine) ali ionski izmenjevalniki (v prisotnosti sečnine ali njenih derivatov); nespecifično reoksidacijo lahko preprečimo z dodatkom reducenta (npr. 2-merkaptoetanola) ali s pH-vrednostmi

- 9 £. 4,5 (prim. npr. R. Rudolph, Biochem. Soc.

Transactions 13 (1985) 3θθ do 311). Če v predhodni stopnji solubiliziranja uporabimo DTE, je treba le-tega v čistilni stopnji odstraniti, čiščenje lahko poteka npr. s SEC preko Sephade* G 100 v prisotnosti gvanidin-hidroklorida in reducenta, npr. GSH pri pH 1 do 4 (pri tej stopnji lahko odločimo veliko količino tujega proteina); ali z odločanjem denaturirnega - redukcijskega sredstva z razsoljenjem preko Sephadex G 25 v 0,01 mol/1 HCl oz. 0,1 mol/1 ocetne kisline. Odločanje denaturirnega-redukcijskega sredstva je alternativno možno z dializo proti istim raztopinam.

Stopnji reaktiviranja je lahko priključena nadaljnja čistilna stopnja; tako čiščenje poteka praviloma s pomočjo dialize, ali pa tudi s sledečim izoliranjem aktiviranega t-PA, npr. z afinitetsko kromatografijo, npr. nad Lys-Sepharose

Nadaljnja izvedbena oblika izuma sloni na tvorbi mešanih disulfidov gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, in glutationa (v nadaljevanju okrajšano t-PASSG). To lahko olajša tako odločenje tujih proteinov v denaturiranem stanju, kot tudi nadaljnje čiščenje nativnega proteina. Čiščenje po modifikaciji tiolnih skupin ima to prednost, da je protein zaščiten pred oksidacijo iz zraka in s tem stabilen v večjem pH-območju, sprememba neto naboja pa olajša čiščenje. Z ionsko izmenjevalno obdelavo se da zlasti prikladno izvesti odločenje nemodificiranega proteina.

Za tvorbo mešanih disulfidov inkubiramo dializirani, reducirani protein, iz katerega smo očistili denaturirna in redukcijska sredstva, z razredčeno, npr. 0,2 M raztopino GSSG, ki vsebuje denaturirno sredstvo. Aktiviranje poteka po odločenju denaturirnega in oksidacijskega sredstva pri pH vrednosti 7 do 10,5, GSH-koncentraciji 0,5 do 5 mmol/1, in z ne-denaturirno koncentracijo denaturirnega sredstva.

Pri vseh drugih reakcijskih stopnjah ustreza aktiviranje proteina preko tvorbe mešanih disulfidov z GSSG izvedbenim oblikam za aktiviranje prejšnjega dela izuma. Pri tej izvedbeni obliki leži pH-optimura pri 8,5, dobitek je približno dvakrat tolikšen in aktivirani protein je dalj časa stabilen v renaturirnem pufru.

V smislu izuma se nam posreči t-PA tako aktivirati iz prokariontov, da ni doseženo samo aktiviranje normalne biološke aktivnosti, temveč preko tega dosežemo še stimulirnost v zgoraj definiranem smislu, ki daleč prekaša stimulirnost nativnega t-PA in je večja od faktorja 10, lahko celo prekorači faktor 50.

Nadaljnji eukariontski protein, katerega v smislu izuma lahko aktiviramo po ekspresiji v prokariontu, je ,^-interferon.

Naslednji primeri bliže pojasnjujejo izum, ne da bi ga omejevali. Če ni navedeno drugače, se odstotni podatki nanašajo na masne odstotke, temperaturni podatki pa na Celzijeve stopinje.

PRIMER 1

a) Priprava refractile bodies

100 g vlažne celične mase E. coli, navzete v 1,5 1,

0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) in 20 mrool/1 EDTA smo homogenizirali (Ultra-Turrax, 10 sek.) ter dodali 0,25 mg/ml lizocima Po 30 minutah inkubacije pri sobni temperaturi smo ponovno homogenizirali in ohladili na 3 °C. Celični razklop smo dosegli z visokotlačno disperzijo (550 kg/cm²). Zatem smo splaknil še s 300 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) in 20 mmol/1 EDTA. Po centrifugiranju (Sorvall GSA, 2 uri pri 13000 obr./min.,

21000 g, 4 °C) smo pelet prevzeli v 1,2 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/1 EDTA in 2,5 % Triton-x-100 ter homogenizirali. Po ponovnem centrifugiranju (Sorvall GSA, 30 min. pri 13000 U/min., 27000 g, 4 °C) smo pelet prevzeli v 1,3 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/1 EDTA in 0,5 % Triton-x ter homogenizirali. Še trikrat smo izvedli izmenjalna centrifugiranja (Sorvall GSA, 30 minut pri 13000 obr./min., 27000 g 4 °C) in homogeniziranja peletov v 1 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) in 20 mmol/1 EDTA.

Vsebnost t-PA v refractile bodies pripravkih smo kvantificirali s SDS-PAGE, identificiranjem t-PA-trakov z Western-blotting in densitometrično analizo. Refractile bodies pokažejo pri SDS-PAGE in Western-blotting močan t-PA-trak z molekulsko maso okoli 60 kDa. Delež t-PA v celokupni vsebnosti proteinov refractile bodies znaša okoli 21 %.

1.2

b) Solubiliziranje/redukcija refractile bodies”

Refractile bodies s koncentracijo proteinov 1 do 5 mg/ml smo inkubirali v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 molov/1 gvanidin-hidroklorida, 0,15 do 0,4 mol/1 DTE in 1 mmol/1 EDTA 2 do 3 ure pri sobni temperaturi. Zatem smo odcentrifugirali netopni material (fragmente celičnih sten itd.) (npr.

Sorvall SS 34, 30 minut pri 15000 do 20000 obr./min., 35000 do 50000 g, 4 °C). pH vrednost vrhnjega sloja (supernatanta) smo s koncentrirano solno kislino nastavili na pH 3· Denaturirno in redukcijsko sredstvo smo nato odločili z dializo proti 0,01 mol/1 HCl pri 4 °C.

c) Reoksidacija/aktiviranje

Reoksidacija/aktiviranje je poteklo z 1:50 do 1:200 razredčino v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, mg/ml BSA, 0,5 mol/1 L-arginina, 2 mmola/1 GSH, 0,2 mmola/1 GSSG. Po 1? do 24 urah aktiviranja pri okoli 20 °C smo določili aktivnost in v primerjavi z aktivnostjo nativnega glikoziliranega t-PA iz eukarionta določili dobitek.

Dobitek z ozirom na celokupno vsebnost proteinov v refractile bodies”: 2,5 +/- 0,5 % stimulirnost: 10 +/- 5

Dobitek z ozirom na delež t-PA v refractile bodies:

Ca. 12 %.

d) Reoksidacija/aktiviranje brez odločenja denaturirno/redukcijskega sredstva

Refractile bodies smo inkubirali pri koncentraciji proteinov 1,25 mg/ml v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 molov/1 gvanidin-hidroklorida, 0,2 mola/1 DTE in 1 mmol/1 EDTA 2 uri pri sobni temperaturi. Zatem smo takoj uvedli reoksidacijo z 1:100 razredčino v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 rnmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mole/1 L-arginina, ter količinami GSSG, navedenimi v tabeli. Dodatno se je v aktivirnem nastavku nahajala preostala koncentracija 0,06 molov/1 gvanidin-hidroklorida in 2 mmola/1 DTE.

Odvisnost dobitka aktiviranja od GSSG-koncentracije pri aktiviranju brez odločenja denaturirno/redukcijskega sredstva.

GSSG (mmol /1)

Dobitek Stimulirnost (%)(Faktor)

0,2	0
1	0,13
5	1,49
6	1,28
7	1,04
9	0,98
10	1,77
15	0
20	0

4,0

1.4

5.4 5,8 5,2

10,0 ’= dobitek aktivnega t-PA z ozirom na celokupno vsebnost proteinov v refractile bodies.

PRIMER 2

Pripravek RB (refractile bodies) (450 0D_ccn/ml) ob u smo inkubirali v 1 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 8,6), mole/1 gvanidin-hidroklorida in 0,15 do 0,2 mola/1 DTE 2 do 3 ure pri sobni temperaturi. Netopni material (fragemente celičnih sten itd.) smo zatem odločili s centrifugacijo (20 minut pri 17000 obr./min.). Denaturirno in redukcijsko sredstvo smo odstranili z gelno filtracijo preko Sephadex C 25 (superfin) v 0,01 mol/1 HCI. Pri tem smo vzorec razredčili za faktor okoli 5 do 10. Reducirani material v 0,01 mol/1 HCI smo shranili pri -20 °C.

PRIMER 3

V naslednjih tabelah je zbran vpliv različnih parametrov v smislu izuma na aktiviranje in stimuliranje t-PA. Za te reoksidacijske poskuse pa po primeru 1 solubilizirani, reducirani protein nismo dalje predhodno očistili.

Reducirani protein (v 0,01 molu HCI) smo z razredčenjem na 1:10 do 1:500 aktivirali v reoksidacijskem pufru. Aktiviranje smo določili po 22 do 48 urah inkubacije pri sobni temperaturi. Aktivnost reoksidiranega proteina se nanaša na standardno reoksidacijo (=100 %) v:

0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-arginina + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH (reduciran glutation) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutationdisulfid).

l' - . t

Stimulirnost izračunamo iz E+cugppsp^.cNBrFSP (prim. W. Nieuwenhuizen et al, Biochimica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 do 533). Aktivnost (v odstotkih) in stimulirnost (faktor) smo določili po J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269, (1982).

Dobili smo naslednje rezultate:

1. Odvisnost izkoristka aktiviranja po dodatku L-arginina, gvanidin-hidroklorida

Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

a) L-arginin

L-arginin)	Aktivnost	Stimulirnost
(mol/1)	(%)	(Faktor)

0	4	2,5
0,25	98	7,5
0,5	100	21,9
0,75	27	16,3
1,0	23	3,5

Pri tem poskusu je treba upoštevati, da se t-PA inhibira z L-argininom. Zato je treba padec aktivir nega dobitka korigirati pri višjih koncentracijah L-arginina z ozirom na inhibicijo.

b) Gvanidin-hidroklorid (Gdn.HCl)

(Gdn'HCl, (mol/1)	Aktivnost (%)
0	11
0,25	22
0,5	53
0,75	58
1,0	12
Odvisnost izkoristka aktiviranja	od dodatka
sečnine in derivatov sečnine.
Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5) , 1 mmol/1
EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH,	0,2 mmol/1 GSSG
a) Sečnina
Sečnina	Aktivnost
(mol/1)	(%)
0	1
0,5	20
1	59
1,5	126
2	162
2,5	141
3	72
4	12
5	0

b) Metilsecnina

Metilsečnina Aktivnost (mol/1) (%)

0,5	22
1	174
1,5	313
2	375
2,5	332
3	215
4	12
5	0
_c) Etilsečnina
Etilsečnina	Aktivnost
(moi/1)	(%)
0,5	46
1	212
1,5	323
2	300
2,5	107
3	19
4	0
5	0

d) Dimetilsečnina Dimetilsečnina (mol/1)	Aktivnost (%)	Stimulirnost (Faktor)
0,5	167	8,8
1	256	8,9
1,5	283	9,4
2	177	7,7
2,5	78	8,9
3	23	9,9
4	4	8,6
5	2	3,5

Odvisnost izkoristka aktiviranja od dodatka amidov maščobne kisline:

Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Formamid

Formamid Aktivnost

(mol/1)	(%)
0	42
0,5	59
1	175
1,5	245
2	325
2,5	423
3	444
4	416
5	341

b) Metilformamid
Metilformamid (mol/1)	Aktivnost (%)
0,5	100
1	135
1,5	304
2	389
2,5	466
3	452
4	425
5	121

c) Acetamid
Acetamid (mol/1)	Aktivnost (%)
0,5	72
1	134
1,5	207
2	261
2,5	204
3	237
4	198
5	141

d) Propionamid

Propionamid (mol/1)	Aktivnost (%)
0,5	95
1	99
1,5	197
2	150
2,5	101
3	39
4	2
5	0

e) Butiramid
Butiramid (mol/1)	Aktivnost (%)
0,5	55
1	52
1,5	17
2	0

Odvisnost izkoristka aktiviranja od pH-vrednosti

Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris/HCl + 1 mmol/1 EDTA +0,5 mol/1 L-arginina + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

_PH	Aktivnost (%)	Stimulirnost (Faktor)
7	1
8	22	3,0
9	89	13,6
10	105	20,3
11	95	21,3

5, Odvisnost izkoristka aktiviranja od GSH/GSSG-koncentracije

Reoksidacija v o,l mol/1 Tris/HCl, pH 10,5, + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-^arS^inina+ 1 mg/ml BSA

a) + 1 mmol/1 GSH

(GSSG) (mmol/1)	Aktivnost (%)	Stimulirnost (Faktor)
0,1	239	14,9
0,2	273	15,3
0,5	193	13,3
1	198	12,5
5	17	2,1
10	0	-
20	0	—

b) + 0,2 mmol/l GSSG

(GSH) (mmol/l)	Aktivnost (%)	Stimulirnost (Faktor)
0,05	15	2,2
0,1	40	3,8
0,2	112	6,8
0,5	142	7,4
1	273	6,8
5	260	7,9
10	143	6,3
20	55	5,1

Odvisnost izkoristka aktiviranja od koncentracije proteina pri reoksidaciji (razredčenje 1:20 - 1:500)

Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5) + 1 mmol/l EDTA + 0,5 mol/1 L-arginina + 1 mg/ml BSA +0,5 mmol/l GSH + 0,5 mmol/l GSSG

Razredčenje	Aktivnost (%)	Stimulirnost (Faktor)
1:10	29	15,3
1:20	45	25,4
1:50	69	37,9
1:100	100	37,9
1:200	79	52,7
1:500	29	28,7

Odvisnost izkoristka aktiviranja od dodatka BSA

Reoksidacija v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol L+ 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

BSA	Aktivnost
(mg/ml)	(%)
0	47
0,5	83
1	100
3	102
5	52

Sliki 1 in 2 kažeta aktivnost z in brez CNBr-FSP pri standardnem testu po 17 urah reoksidacije pri sobni temperaturi v 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/L-arginina + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG. Na sl. 1 in 2 kažejo krivulje (A) aktivnost v prisotnosti CNBr-FSP, krivulje (B) pa aktivnost brez CNBr-FSP.

PRIMER 4

Aktiviranje t-PA preko mešanih disulfidov t-PA in GSSG

Uporabljene refractile bodies smo dobili po enem izmed prejšnjih primerov. Redukcijo

- 23 refractile bodies smo izvedli po 2 urah inkubacije pri sobni temperaturi v 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,6, 1 mmol/1 EDTA, 6 mol/1 Gdn/HCl, 0,2 mol/1 DTE pri koncentraciji proteinov okoli 1 mg/ml.

Reducirani protein, dializiran proti 0,01 mol/1 HCl, smo razredčili v razmerju 1:1 z 0,1 mol/1 Tris, pH 9,3, mol/1 sečnine in 0,2 mol/1 GSSG ter inkubirali 5 ur pri sobni temperaturi.

Po nakisanju s koncentrirano HCl na pH 3 je sledila dializa proti 0,1 mol/1 HCl pri 4 °C. Po dializi je znašala celokupna koncentracija proteinov 0,33 mg/ml. S tako pripravljenim t-PASSG smo določili optimalne reaktivirne pogoje.

a) pH-optimum aktiviranja t-PASSG

V tem primeru kot tudi v naslednjih optimirnih poskusih pri (1) nismo uporabili GSSG in (2) smo določili aktiviranje po 17 urah inkubacije pri sobni temperaturi. Aktiviranje je poteklo z 1:100 razredčino v 0,1 mol/1 Tris, mmol/1 EDTA, 0,5 mol/1 L-arginina, 1 mg/ml BSA in 2 mmola/1 GSH pri variaciji vrednosti pH.

pH	Dobitek (%)	Stimulirnost
6	0,04	3,3
6,5	0,37	9,5
7	1,35	11,4
7,5	5,66	7,1
8	7,32	8,2
8,5	8,65	7,0
9	8,59	8,7
9,5	8,32	11,7
10	6,15	12,5
10,5	3,07	11,2

Dobitek smo določili v odtotkih aktivnega t-PA z ozirom na uporabljeno količino proteina.

b) Reproducirnost rezultatov aktiviranja od t-PASSG Pri identičnih aktivirnih pogojih opazimo pri različnih merjenih vrstah različne dobitke, ki so med drugim pogojeni z nihanjem standardnega t-PA. Za pojasnilo te širine napak smo vse aktivirne podatke po 1:100 oz. 1:200 razredčini zbrali v 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, mraol/1 EDTA, 0,5 mol/1 L-arginina, 1 mg/ml BSA in mmol/1 GSH.

Poskus	Dobitek	(%)	Stimulirnost
1	8,65		7,0
2	4,47		9,3
3	4,49		9,7
4	8,50		6,5
5	3,45		17,2
6	4,32		8,3
7	3,29		14,0
8	3,54		13,4
9	5,07		16,4
Srednja vrednost	5,1 +/-	1,9	11,3 +/- 3,8

c) Stabilnost aktiviranega proteina

Aktiviranje je poteklo v navedenih primerih z 1:200 razredčino v 0,1 mol/1 Tris/HCl, 1 mmol/1 EDTA,

0,5 mol/1 L-arginina, 1 mg/ml BSA in 2 mmol/1 GSH.

PRIMER 5

Aktiviranje gentehnološko pripravljenega interferona-^.

Refractile bodies smo proizvedli po zgornjih metodah. Redukcijo/solubiliziranje refractile bodies smo izvedli kot sledi: pelet smo inkubirali za 3 ure pri 25 °C v 10 ml 9,1 mol Tris/HCl, pH 8,6, 6 mol/1 Gdn/HCl, mmol/1 EDTA in 0,2 mol/1 DTE ter po 3θ minutah centrifugiranja pri 4 °C in 48000 g uravnali pH vrhnjega sloja (supernatanta) na okoli 3 s koncentrirano HCI. Zatem smo izvedli gelno filtracijo preko Sephadex G 25 F v 0,01 mol/1

HCI.

Eluat smo kontrolirali s pomočjo transmisije (280 nm) na prevodnost, koncentracijo proteinov in reaktivirnost.

Standardno aktiviranje (100 %) smo izvedli v 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG in 0,25 mol/1 L-arginina.

a) Ca sovna odvisnost od aktiviranja

Eluat smo razredčili 1:50 v 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5,.1.mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG in 0,25 mol/1 L-arginina.

Aktivirni čas (h)

Aktivnost

0°C

b) Odvisnost aktivirnega dobitka od dodatka L-arginina Eluat smo razredčili 1:50 z 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 ramol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG ter 20 ur aktivirali pri 0 °C.

Odvisnost aktiviranja od L-arginina

L-arginin (M) Aktivnost (%)

8

0,25 8

0,5 15

0,75 15

c) Odvisnost dobitka aktiviranja od dodatka sečnine

Aktivirna raztopina je ustrezala oni pri točki b), vendar pa smo aktivirali 17 ur pri 0°C.

Odvisnost aktiviranja od sečnine

Sečnina (M) Aktivnost (%)

0	13
0,5	100
1	200
1 »5	100

d) Odvisnost dobitka aktiviranja od dodatka formamida Aktiviranje kot pri b); vzorce smo kontrolirali po 17 urah aktiviranja pri 0 °C.

Odvisnost aktiviranja od formamida

Formamid (M)

Aktivnost

e) Odvisnost dobitka aktiviranja od redoks pufra

Eluat smo razredčili 1:50 v 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 mM EDTA in 0,25 M L-arginina ter vzorce kontrolirali po 17 urah aktiviranja pri 0 °C.

Odvisnost aktiviranja od GSH/GSSG

GSH (mM) GSSG (mM) Aktivnost (%)

0,5 6

0,5 13

0,5 25

0,1 13

0,5 13

1,0 13

5 6

- 28 f) Odvisnost dobitka aktiviranja od koncentracije proteinov Eluat smo razredčili 1:10 do 1:100 v 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG in 0,25 M L-arginina ter kontorlirali po 17 urah aktiviranja pri 0 °C. cp-odvisnost aktiviranja cp (mg/ml) Aktivnost (%)

0,018 13

0,036 13

0,072 13

0,108 8

0,180 10

g) Odvisnost dobitka aktiviranja od dodatka BSA

Eluat smo razredčili 1:50 v 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG in 0,25 M L-arginina ter kontrolirali po 17 urah aktiviranja pri 0 °C.

BSA-odvisnost aktiviranja

BSA (mg/ml) Aktivnost (%)

13

25

13

- 29 h) Odvisnost dobitka aktiviranja od pH

Eluat smo razredčili 1:50 v 0,1 M Tris/HCl, mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG in 0,25 M L-arginina ter kontrolirali po 17 urah aktiviranja pri 0 °C.

pH-odvisnost aktiviranja pH Aktivnost (%)

6,5	0
7,5	6
8,5	13
9,5	50
10,5	100

Claims

1. Postopek za aktiviranje gentehnološko pripravljenih heterolognih, eukariontskih proteinov, ki vsebujejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih s celičnim razklopom, solubiliziranjem ob denaturirnih in reducirnih pogojih ter aktiviranjem ob oksidirnih pogojih v prisotnosti GSH/GSSG, označen s tera, da pri stopnji aktiviranja delomo s pH vrednostjo 9 do 12, koncentracijo GSH 0,1 do 20 mmol/1, koncentracijo GSSG 0,01 do 3 mmol/1 ter ne-denaturirno koncentracijo denaturirnega sredstva.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da v stopnji aktiviranja znaša pH vrednost 9,5 do 11.

3. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 in 2, označen s tem, da v stopnji aktiviranja znaša koncentracija GSH 0,2 do 10 mmol/1 in/ali koncentracija GSSG 0,05 do 1 mmol/1.

4. Postopek po enem izmed zgornjih zahtevkov, označen s tem, da po solubiliziranju in pred aktiviranjem izvedemo stopnjo čiščenja.

5. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 3, označen s tem, da izvedemo aktiviranje brez predhodnega odločenja denaturirno/redukcijskega sredstva, pri čemer reakcijsko raztopino po denaturiranju/redukciji razredčimo z aktivirnim pufrom ter pri naslednjem aktiviranju koncentracija GSSG prekorači preostalo rezidualno koncentracijo DTE.

6. Varianta postopka za aktiviranje gentehnološko pripravljenih, heterolognih, eukariontskih proteinov, ki kažejo disulfidne mostove, po ekspresiji v prokariontih s celičnim razklopom, solubiliziranjem pri denaturirnih in reducirnih pogojih, ter aktiviranjem pri oksidirnih pogojih v prisotnosti GSH, označen s tem, da redukcijsko/ denaturirno sredstvo odločimo, z dodatkom GSSG pri denaturirnih pogojih prevedemo tiolne skupine proteinov v mešane disulfide proteina in glutationa, pri stopnji aktiviranja delamo pri pH vrednosti 7 do 10,5 in koncentraciji GSH 0,5 do 5 mmol/1 ter pri ne-denaturirni koncentraciji denaturirnega sredstva.

7. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 6, označen s tem, da izvedemo ekspresijo v E. coli ali p. putida.

8. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 7, označen s tem, da v stopnji aktiviranja uporabimo kot denaturirno sredstvo arginin, gvanidin hidroklorid in/ali vsaj eno spojino s splošno formulo R^CO-NRR^ (I), v kateri R in R₁ pomenita vodik ali alkil z 1 do 4 atomi ogljika, R₂ pa vodik ali NHR₁ ali alkil z 1 do 3 atomi ogljika.

9. Postopek po zahtevku 8, označen s tem, da znaša koncentracija arginina in/ali gvanidinhidroklorida 0,1 do 1,0 mol/1, zlasti 0,25 do 0,8 mol/1.

32

10. Postopek po zahtevku 8, označen s tem, da znaša koncentracija spojine s splošno formulo I 0,5 do 4 mol/1, zlasti 1 do 3,5 mol/1.

11. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da delamo pri stopnji aktiviranja v prisotnosti neproteolitično učinkovitega proteina, zlasti v prisotnosti albumina iz govejega seruma.

12. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da izvedemo celični razklop s pomočjo ultra zvoka, visokotlačne disperzije ali lizocima.

13· Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da izvedemo razklop v razredčeni vodni pufrski raztopini, zlasti v 0,1 mol/1 Tris, pri nevtralni do šibko kisli pH vrednosti.

14. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da po celičnem razklopu odločimo netopne sestavine.

15. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da pri stopnji solubiliziranja delamo pri alkalni pH vrednosti v prisotnosti redukcijskega sredstva iz merkapto skupine ter v prisotnosti denaturirnega sredstva.

16. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da delamo v prisotnosti gvanidinhidroklorida in/ali spojine s splošno formulo I kot denaturirnega sredstva.

- 33

17. Postopek po zahtevku 16, označen s tem, da znaša koncentracija gvanidinhidroklorida 6 mol/1, koncentracija spojine s splošno formulo I pa 8 mol/1.

18. Postopek po enem izmed zahtevkov 15 do 17, označen s tem, da delamo v prisotnosti DTE, /J-merkaptoetanola ali GSH.

19. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da izvedemo čiščenje in odločenje redukcijskih, oksidacijskih ali denaturirnih sredstev s pomočjo sterične izločevalne kromatografije ali dialize.

20. Postopek po enem izmed prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da po stopnji aktiviranja izvedemo čistilno stopnjo s pomočjo dialize.

21. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 20, označen s tem, da kot gentehnološko pripravljen eukariontski protein uporabimo t-PA.

22. Postopek po enem izmed zahtevkov 1 do 20, označen s tem, da kot gentehnološko pripravljen eukariontski protein uporabimo inteferon-/^ .

23. Postopek po zahtevku 6, označen s tem, da odločimo mešani disulfid proteina in glutationa z ionsko izmenjalno obdelavo od nemodificiranega proteina.