FI94050C - Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen - Google Patents
Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen Download PDFInfo
- Publication number
- FI94050C FI94050C FI872753A FI872753A FI94050C FI 94050 C FI94050 C FI 94050C FI 872753 A FI872753 A FI 872753A FI 872753 A FI872753 A FI 872753A FI 94050 C FI94050 C FI 94050C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- mol
- mmol
- process according
- protein
- denaturing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 64
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 14
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title claims 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims abstract description 69
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 18
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims abstract description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 63
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 33
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 29
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 24
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 22
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 12
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 12
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 11
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 2
- 101100294106 Caenorhabditis elegans nhr-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 claims 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 29
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 abstract description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 10
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 abstract description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 abstract 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 31
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 31
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 16
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 16
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- ZQRPGFWGRMBUQW-QLAMLYEZSA-N (2s)-2-amino-5-[[(2r)-3-[[(2r)-2-[[(4s)-4-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-3-(carboxymethylamino)-3-oxopropyl]disulfanyl]-1-(carboxymethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;(2s)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan- Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O ZQRPGFWGRMBUQW-QLAMLYEZSA-N 0.000 description 2
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical group SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N N,N'-dimethylurea Chemical compound CNC(=O)NC MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical compound CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N N-methylthiourea Natural products CNC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N methylurea Chemical compound [14CH3]NC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- IMVJCTWESJIARS-QWWZWVQMSA-N (2r,3r)-2,3-bis(sulfanyl)butane-1,4-diol Chemical compound OC[C@@H](S)[C@H](S)CO IMVJCTWESJIARS-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- RYECOJGRJDOGPP-UHFFFAOYSA-N Ethylurea Chemical compound CCNC(N)=O RYECOJGRJDOGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 GSH Chemical compound 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003948 formamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940045883 glutathione disulfide Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
94050 I'.enetel mä geeniteknisesti valmistettujen, hetero! og i Sten , riisuit i di s iltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen
Keksintö kohdistuu menetelmään geeniteknisesti valmistettujen, di sulfi di s i1 toja si sälta vi en euka riootti s ten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen.
Ilmennettäessä heterologisia proteiineja prokariooteissa nämä proteiinit muodostavat isäntäsoluissa usein inaktiivisia, vaikeasti liukoisia kasaumia (nk. valoa taittavia kappaleita, "retractile bodies"), ja ne käsittävät lisäksi epäpuhtauksina isäntäsolun proteiineja. Oletetaan, että tällaisten "valoa taittavien kappaleiden" muodostuminen johtuu ilmennettäessä syntyvästä suuresta proteiinipitoisuudesta solussa. On tunnettua, että suurien entsyymimäärien muodostuessa solussa nämä entsyymit kasautuvat liukenemattomiksi, suurimolekyylisiksi, useimmiten inaktiivisiksi hiukkasiksi. Ennen kuin tällaisia proteiineja voidaan käyttää esimerkiksi terapeuttisiin tarkoituksiin, ne on näin ollen puhdistettava ja saatettava aktiiviseen muotoonsa.
Tällaisten kasautumina esiintyvien proteiinien uudestaanakti -vointi voidaan toteuttaa tunnettujen menetelmien mukaisesti useassa vaiheessa (katso esimerkiksi julkaisut R. Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, Voi. 52 (1S79 ) 187-198; R. Rudolph et ai., Biochemistry 1_8 (1979) 5572-5575 ):
Ensimmäisessä vaiheessa proteiini tehdään liukoiseksi lisäämällä siihen vahvaa denaturoi nti ainetta, esimerkiksi guani-diini-hydroklori di a tai ureaa suurina pitoisuuksina, tai lisäämällä vahvasti happamia aineita, esimerkiksi glysiinin ja fosforihapon seoksia. Käyttökelpoisiksi apuaineiksi ovat osoittautuneet pelkistävät SH-reagenssit (esim. ditioerytri- 2 94050 toll, DTE) ja EDTA, esimerkiksi renaturoitaessa LDH-proteii-nia. Mikäli proteiini sisältää epäpuhtautena isänta solun proteiineja, niin tällöin seuraavana vaiheena on puhdistaminen sinänsä tunnetuilla tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi geeli- tai ioninvaihtokromatografisesti. Tämän jälkeen pro-teini laimennetaan voimakkaasti, jotta denaturoi nti aineen pitoisuus saataisiin pienemmäksi. Käytettäessä guanidiini-hydrokloridi a proteiini laimennetaan arvoon, joka on alle 0,5 moolia/1. Vapaita SH-ryhmiä käsittävien entsyymien tapauksessa SH-ryhmiä suojaavien aineiden lisääminen on osoittautunut edulliseksi (katso esimerkiksi julkaisu R. Jaenicke, Journal Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143-2160.
Patenttijulkaisussa EP-A 0114506 kuvataan menetelmä eräiden heterologiSten ilmennettyjen tuotteiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi bakteeriviljelmistä sekä näiden tuotteiden uu-destaanakti voi nti: tuotteen uudestaanakti voimiseksi "valoa taittavien kappaleiden" liuokset vahvasti denaturoivassa ai-. neessa a) muunnetaan suoraan heikommin denaturoivassa ainees sa olevaksi liuokseksi, joka saatetaan sitten hapettaviin olosuhteisiin disulfidi si 1 tojen palauttamiseksi; b) proteiini sulfonoidaan, ja liuotetaan sitten heikosti denaturoivaan aineeseen, minkä jälkeen S-sulfonaattiryhmät muunnetaan sulf-hydryylireagenssi11 a käsittelemällä pelkistyneeseen ja hapettuneeseen muotoonsa, esimerkiksi GSH/GSSG-reagenssi11 a -S-S-ryhmiksi; tai c) heikosti denaturoivassa aineessa oleva liuos käsitellään suoraan sulfhydryylireagenssi11 a, esimerkiksi GSH/GSSG-reagenssi11 a. Tyypillinen esimerkki, jossa törmätään edellä kuvattuihin vaikeuksiin, on t-PA.
* ♦ Pääasiallinen komponentti hyytyneen veren proteiinimatriisis-sa on polymeerinen fi bri i n i. Tämä protei i n i ma tri i s i liukenee plasmiinin vaikutuksesta, jota plasmiinia muodostuu plasmino-geenista nk. plasminogeeniaktivaattoreiden, esimerkiksi t-PA:n (tissue type plasminogen activator; kudosplasminogeenin akti-. vaattori), aktivoinnin seurauksena. Luonnollisen t-PA:n tai eukariooteista geeniteknisesti saadun t-PA:n entsymaattinen aktiivisuus (plasminogeenin katalyyttinen aktivointi plasmii- 94050 niksi) on hyvin alhainen fibriinin tai fibriinin pi 1 kkoututui stuottei den (FPT) puuttuessa, riutta tämä aktiivisuus saadaan olennaisesti suuremmaksi (yli 10-kertaisek si) näiden stimuloi j ien läsnäollessa. Tämä aktiivisuuden nk. stimuloitavuus on t-PA:n ratkaiseva etu verrattuna muihin tunnettuihin plasmi-nogeeniaktivaattoreihin, kuten urokinaasi tai streptokinaasi (katso esimerkiksi julkaisut M. Hoylaerts et ai., J. Bio!.
C h e m. 257 (1982) 2912-2919; Nieuwenhiuzen et ai., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531-533. Näin ollen kirjallisuudessa esitetään erilaisia kertoimia aktiivisuuden stimuloi ta vuudel 1 e BrCN-pi1 kkoutumis tuotteita käyttäen, tämän kertoimen saavuttaessa jopa arvon 35.
t-PA:n kaltaista, glykosyloi tumatonta tuotetta saadaan myös muodostumaan geneettisesti manipuloiduissa prokariooteissa (cDNA:n istuttamisen jälkeen); tämän tuotteen aktiivisuus ei ole kuitenkaan stimuloitavissa eukariootista saadun t-PA:n tavoin. Tämä johtuu mahdollisesti siitä, että hapetus-pelkis-tys-olosuhteet prokarioottisoiussa eroavat eukarioottisoiussa, josta geeni on peräisin, vallitsevista olosuhteista siten, että prokariootissa muodostuu alusta pitäen inaktiivinen tuote. Tämä voi puolestaan johtua esimerkiksi siitä, että luonnollisen, aktiivisen molekyylin sisältämät lukuisat SS-s illat ovat kytkeytyneet väärällä tavalla, tai niitä ei ole muodostunut lainkaan. t-PA:n terapeuttisen käytön edellytyksenä ei ole ainoastaan entsymaattinen aktiivisuus sinänsä, vaan lisäksi myös sen stimuloitavuus. Julkaisussa The EMBO Journal £, Nr. 3 (1985) 775-780 korostetaan muiden aineiden tapauksessa sitä tosiseikkaa, ettei prokarioottisoi ui hi n todennäköisesti saada aikaan sellaisia asianmukaisia olosuhteita, .. joissa eukarioottiSten proteiinien aktiivisuus muodostuisi oikealla tavalla.
Patenttijulkaisun EP-A 0093639 mukaisesti t-PA:n uudestaanak-tivointi toteutetaan siten, että E. coli -soluista saadut so-lukasaumat suspendoidaan pitoisuudeltaan 6 moolia/1 olevaan • · 4 94050 guanidiinihydrokloridiin, ne käsitellään ultraäänellä, niitä inkuboidaan, minkä jälkeen niitä dialysoidaan neljä tuntia tuotteita Tris-HCl (pH 8,0), EDTA ja Tween 80 sekä natrium-kloridia sisältävää liuosta vastaan. Dialyysin jälkeen preparaatti sentrifugoidaan, minkä jälkeen plasminogeenin akti-vaattori on löydettävissä supernatantista. Tällä tavalla re-naturoitu t-PA on tosin proteolyyttisesti aktiivista, mutta sen stimuloitavuus fibriinistä saaduilla BrCN-pilkkoutumis-tuotteilla (BrCN-FPT) on kuitenkin mittauskynnystä pienempi käytettäessä menetelmää, joka esitetään julkaisussa J. H. Verheijen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 260-269 (1982).
Tällä hetkellä alalla ei tunneta ainoatakaan yleisesti käyttökelpoista menetelmää denaturoituneiden proteiinien uudes-taanaktivoimiseksi; tämä pätee erityisesti t-PA:lle, koska luonnollinen proteiini on rakenteeltaan hyvin monimutkainen. Se sisältää vapaan tioliryhmän ja 17 SS-siltaa, jotka teoreettisesti tarkastellen voivat olla kytkeytyneet 2,2 x 1020 erilaisella tavalla, vain yhden ainoan rakenteen vastatessa proteiinin luonnollista tilaa. Alalla tällä hetkellä tunnetuilla menetelmillä t-PA:n uudelleenaktivoimiseksi päästään tosin proteolyyttisesti aktiiviseen t-PA-proteiiniin, jolla ei ole kuitenkaan mitattavaa stimuloitavuutta. Alalla ei tunneta sellaista aktivointimenetelmää, jolla päästäisiin stimuloitavissa olevaan t-PA-proteiiniin.
Näin ollen esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologis-ten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien täydelliseksi aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen. Tähän tavoitteeseen päästään esillä olevan keksinnön kohteena olevalla menetelmällä.
Keksintö kohdistuu patenttivaatimuksen l mukaiseen menetelmään geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disul-fidisiltoja sisältävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen siten, että prokarioottisolut rikotaan, eukarioottinen proteiini saate- 5 94050 taan liukoiseksi denaturoivissa ja pelkistävissä olosuhteissa, erotetaan pelkistys-/denaturointiaine, uudelleenaktivoi-daan hapettavissa olosuhteissa muuntamalla liukoisiksi tehtyjen proteiinien tioliryhmät proteiinin ja glutationin välisiksi sekadisulfideiksi lisäämällä GSSG:tä denaturoivissa olosuhteissa, ja muodostamalla aktiiveja proteiineja seka-disulfideista GSH-pitoisuudessa 0,5-5 mmol/1, pH-arvossa 7- 10,5, denaturointiaineen ollessa läsnä ei-denaturoivana pitoisuutena.
Muut patenttivaatimukset kohdistuvat tämän menetelmän muihin edullisiin suoritusmuotoihin.
Denaturoivana aineena voidaan käyttää tavallisesti sellaista denaturoivaa ainetta, jota käytetään yleensä proteiineja hapettavissa olosuhteissa aktivoitaessa, tai arginiinia; tunnetuista denaturoivista aineista käytetään mielellään gua-nidiinihydrokloridia tai ureaa tai niiden johdannaisia. Tämän lisäksi sopivaksi ollaan todettu arginiini. Edelleen näiden denaturoivien aineiden seoksia voidaan käyttää. Tämä aktivointivaihe toteutetaan mielellään lisäksi jonkin vieraan proteiinin läsnäollessa; sopiva vieras proteiini voi olla yleensä mikä tahansa sellainen proteiini, joka ei ole proteolyyttisesti aktiivista. Menetelmässä käytetään mielellään naudan seerumin albumiinia (BSA), sen määrän ollessa esimerkiksi 1-3 mg/ml. BSA:n lisääminen johtaa saannon lievään kasvuun, ja se stabiloi proteiinia (mikä johtuu todennäköisesti siitä, että vieras proteiini suojaa pinnan dena-turoitumiselta ja/tai proteolyyttiseltä hajoamiselta).
Muut menetelmässä vallitsevat olosuhteet voivat vastata tek- "! niikan tason mukaisissa uudestaanaktivointivaiheissa vallit sevia tunnettuja ja tavanomaisia olosuhteita. Aktivointiaika (inkubointiaika) on mielellään 20-48 tuntia huoneen lämpötilassa. Aktivoitumisen puoliaika, kun läsnä on 0,5 mmoolia/1 pelkistettyä (GSH) ja hapetettua (GSSG) glutationia, on noin 10-15 tuntia 20°C:n lämpötilassa. Mikäli inkubointia jatke- % 6 94050 taan pitemmän aikaa (48 tuntia) uudestaan hapettavissa olosuhteissa, niin sti inul oi ta vuus BrCIJ-pi 1 kkoutumi stuottei 11 a heikkenee tavallisesti. Akti voi nti vai he toteutetaan mielellään EDTA:n läsnäollessa, jolloin tarkoituksenmukaisin pitoisuus on noin 1 mmooli/1 yhdistettä EDTA.
Menetelmässä akti voi nti vaihetta (uudelleenhapetus/aktivointi) edeltävät ja seuraavat vaiheet, kuten solujen rikkominen, liukoiseksi tekeminen (liukoiseksi tekeminen/pelkistys ) sekä akti voi nti vaihetta mahdollisesti edeltävät ja/tai sitä seuraavat puhdistustoimenpiteet voidaan toteuttaa tekniikan tason, esimerkiksi patenttijulkaisujen EP-A 0114506 tai EP-A 0093619 perusteella tällaisille toimenpiteille tunnettujen ja tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Kuitenkin saantoa ja aktivoitumista ajatellen optimaalisen tuloksen saavuttamiseksi saattaa olla tarkoituksenmukaista, että menetelmän eräät tai kaikki vaiheet toteutetaan yhden tai useamman ohessa esitetyn suoritusmuodon mukaisesti. Mahdollista on myös erityisesti se, että keksinnön mukainen akti voi ntivaihe toteutetaan solujen rikkomisen jälkeen saadulla seoksella ilman edeltävää denaturoi nti a ja/tai pelkistämistä, saannon jäädessä tällöin kuitenkin alhaiseksi. Ilmentäminen toteutetaan prokariooteissa, mielellään P. putida -bakteerissa ja erityisesti E-coli -bakteerissa. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan kuitenkin käyttää yhtä hyvin silloinkin, kun ilmentämi- • · nen toteutetaan muissa prokariooteissa (esimerkiksi basil-lei ssa).
Solujen rikkominen voidaan toteuttaa tähän tarkoitukseen tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi ultraäänellä, korkeapaineisella dispersiolla tai lysotsyymi11ä. Solut rikotaan tavallisesti neutraalin tai heikosti happaman pH-arvon aikaansaamiseksi sopivassa, suspension väliaineena toimivassa puskuriliuoksessa, kuten esimerkiksi Tris-HC1 -1iuoksessa, jonka pitoisuus on 0,1 moolia/1. Solujen rikkomisen jälkeen liukenematon aines ("valoa taittavat kappaleet") erotetaan • * 7 94050 halutulla tavalla, mielellään sentrifugoimaila suuria g-arvoja ja pitkiä sentrifugointi aikoja käyttäen, tai suodattamalla. Kasauma pestään aineilla, jotka eivät häiritse t-PA-proteiinia, mutta jotka kuitenkin mahdollisesti liuottavat vieraita soiuproteiineja, esimerkiksi vedellä tai fosfaatti-puskuriliuoksella, johon on lisätty mahdollisesti laimeita pinta-aktiivisiä aineita, kuten Tritonia, minkä jälkeen kasauma (pelletti) tehdään liukoiseksi (liukoistaminen/pelkis-täminen). Liukoiseksi tekeminen tapahtuu mielellään aikai τεεί 1 a pH-alueella, erityisesti pH-arvossa 8,6 + 0,4, mer-kaptaaniryhmästä peräisin olevan pelkistimen ja denaturoivan aineen läsnäollessa.
Denaturoivana aineena voidaan käyttää tekniikan tason, esimerkiksi patenttijulkaisun EP-A 0114506 perusteella tunnettuja, 1iukoistamiseen tavanomaisia denaturoivia aineita, erityisesti guanidiini-hydrokloridi a tai ureaa. Guanidiinihyd-rokloridin pitoisuus on tarkoituksenmukaisesti noin 6 moo-lia/1, ja urean noin 8 moolia/1. Menetelmässä voidaan samoin käyttää yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä.
Merkaptaaniryhmästä peräisin olevana pelkistimenä voidaan käyttää esimerkiksi pelkistettyä glutationia {G S H) tai 2-mer-kaptoetanolia, esimerkiksi pitoisuutena, joka on noin 50-400 mmoolia/1, ja/tai erityisesti di tioerytritoiia (DTE) tai di-tiotreitolia (DTT) esimerkiksi pitoisuutena, joka on noin 80-400 mmoolia/1. Liukoiseksi tekeminen toteutetaan tarkoituksenmukaisesti huoneenlämpötilassa, sen (inkuboinnin ) kestäessä yhdestä useampaan tuntiin, mielellään kaksi tuntia. Jotta voitaisiin estää pelkistimen hapettuminen ilmassa läsnäolevan hapen vaikutuksesta, yhdisteen EDTA lisääminen saattaa olla tarkoituksenmukaista. Liukoistamisvaiheella on liukoiseksi tekemisen ja pelkistämisen lisäksi puhdistavaa vaikutusta, koska suurin osa siitä materiaalista, joka ei risti-reagoi immunologisesti t-PA:n kanssa (vieraista proteiineista), ei muutu liukoiseksi.
* « δ 94050
Liukoiseksi tekemisen jälkeen ja ennen akti voi nti vaihetta voidaan toteuttaa sinänsä tunnettuja ja tavanomaisia puhdis-tusvaiheita; puhdistavina menetelminä voidaan käyttää esimerkiksi steeriseen poissulkemiseen (ekskluusio) perustuvaa kro-matografiaa (SEC) (guanidiini-hydrokloridin tai urean läsnäollessa) tai ioninvaihtoa (urean tai sen johdannaisten läsnäollessa). Epäspesifinen hapettuminen uudestaan voidaan estää lisäämällä pelkistintä (esimerkiksi 2-merkaptoetanolia) tai pitämällä pH arvossa 4,5 (katso esimerkiksi julkaisu R. Rudolph, Biochem. Soc. Transactions 1_3 (1985) 308-311). Mikäli edeltävässä 1iukoistamisvaiheessa käytetään yhdistettä DTE, se on erotettava jossakin puhdistusvaiheessa .
Puhdistaminen voidaan toteuttaa esimerkiksi SEC-kromatogra fi-sesti käyttäen Sephadex G-100 -geeliä, guanidiini-hydroklori-din ja pelkistimen, esimerkiksi yhdisteen GSH, läsnäollessa, pK-arvossa 1-4 (tässä vaiheessa voidaan erottaa suuri osa vieraasta proteiinista); tai se voidaan toteuttaa erottamalla denaturoi nti ai ne ja pelkistin siten, että suolat poistetaan Sephadex G-25 -geelillä pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa MC1-1iuoksessa tai pitoisuudeltaan 0,1 moolia/1 olevassa etikkahapossa. Denaturoiva aine ja pelkistin voidaan erottaa vaihtoehtoisesti di aiysoimal1 a näitä samoja liuoksia vastaan.
Uudestaanaktivoi van vaiheen jälkeen voidaan toteuttaa toinen puhdistusvaihe; tämän vaiheen puhdistaminen toteutetaan tavallisesti dialysoimalla tai eristämällä aktivoitu t-PA tämän jälkeen, esimerkiksi affiniteettikromatografisesti, käyttäen esimerkiksi Lys-Sepharose -geeliä.
Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto perustuu sekadisulfidi en muodostamiseen geeniteknisesti valmistetuista, heterologisis-ta, di sulfi di siltoja sisäitä vista eukarioottisista proteiineista ja glutationista (joista käytetään seuraavassa lyhennettä t-PASSG). Tämä saattaa helpottaa sekä vieraiden pro-•j teiinien erottamista denaturoituneessa tilassa seka luonnol- 9 94050 1i s e proteiinin puhdistumista edelleen. Tioliryhmien muokkaamisen jälkeen toteutetun puhdistuksen etuna on se, että proteiini saadaan suojatuksi ilman aiheuttamalta hapettumi-selta, jolloin se on stabiilimpi laajemmalla pH-alueella, sekä se, että nettovarauksen muuttuminen helpottaa puhdistamista. Erityisesti muokkaamattomista proteiineista erottaminen saadaan edullisesti toteutetuksi ioninvaihtajalla käsittelemällä.
Sekadisulfidi en muodostamiseksi dialysoitua, pelkistettyä, denaturoivasta aineesta ja pel kistimesta puhdistettua proteiinia inkuboitiin laimeassa GSSG-1iuoksessa, joka sisältää denaturoivaa ainetta, ja jonka pitoisuus on esimerkiksi 0,2 moolia/l. Aktivointi toteutettiin denaturoivan aineen ja hapettavan aineen erottamisen jälkeen pH-arvossa 7-10,5, käyttäen yhdisteen GSH pitoisuutena arvoa 0,5-5 mmoolia/1, ja käyttäen denaturoivaa ainetta ei-denaturoivana pitoisuutena.
Kaikissa muissa reaktiovaiheissa proteiinin aktivoiminen seka-disulfideja yhdisteen GSSG kanssa muodostamalla vastaa keksinnön aikaisemmassa osassa esitetyn aktivoinnin suoritusmuotoja. Tässä suoritusmuodossa pH-optimi on arvossa 8,5, saanto on noin kaksinkertainen, ja aktivoitu proteiini pysyy renatu-rointi puskurissa pitemmän aikaa stabiilina.
Keksinnön muka i ses ti prokari ooteista peräisin oleva t-PA saadaan aktivoiduksi siten, että normaalin biologisen aktiivisuuden lisäksi päästään myös edellä määritellyllä tavalla stimuloitavuuteen, joka on huomattavasti suurempi kuin luonnollisen t-PA:n stimuloitavuus, siihen verrattuna suurempi kuin 10-, jopa 50-kertainen.
Eräs toinen eukarioottinen proteiini, joka voidaan aktivoida keksinnön mukaisesti prokariooteissa ilmentämisen jälkeen, on beeta-interferoni.
• · 10 94050
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä edelleen, sitä kuitenkaan millään tavalla rajoittamatta. Mikäli toisin ei mainita, prosenttiset osuudet ovat painoprosentteina, ja lämpötilat on esitetty Celsius-asteina.
Vertailuesimerkki 1 a) "Valoa taittavien kappaleiden" valmistaminen 100 g E. coli -bakteerin kosteata solumassaa sekoitettuna
1,5 litraan liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH
6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA, homogenoitiin (Ultra-Turrax, 10) ja homogenaattiin lisättiin 0,25 mg/ml lysotsyymiä. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se homogenoitiin uudestaan ja jäähdytettiin 3°C:n lämpötilaan. Solut rikottiin korkeapaineisella dispersiolla (550 kg/cm2) . Tämän jälkeen seos huuhdottiin vielä 300 millilit-ralla liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA. Seos sentrifugoitiin (2 tuntia nopeudella 27 000 x g 4°C:n lämpötilassa), minkä jälkeen kasauma sekoitettiin 1,3 litraan liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5), 20 mmoolia/1 EDTA ja 2,5 % Triton X-100, ja se homogenoitiin. Seos sentrifugoitiin toistamiseen (30 minuuttia nopeudella 27 000 x g 4°C:n lämpötilassa), minkä jälkeen kasauma sekoitettiin 1,3 litraan liuosta, joka si-• sältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5), 20 mmoolia/1 EDTA ja 0,5 % Triton X-100, ja se homogenoitiin. Kasauman sentrifu-gointi (30 minuuttia nopeudella 27 000 x g 4°C:n lämpötilassa) ja homogenointi 1 litrassa liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA, toistettiin vuorotellen vielä kolmasti.
t-PA-pitoisuus "valoa taittavien kappaleiden" preparaatissa määritettiin kvantitatiivisesti SDS-PAGE-menetelmällä, jossa t-PA-vyöhykkeet tunnistettiin "Westernin täplinä" ja ne analysoitiin densitometrisesti. "Valoa taittavat kappaleet" tuottavat SDS-PAGE-menetelmässä ja "Westernin täpliin" perus- 11 94050 tuvassa menetelmässä voimakkaan t-PA-vyöhykkeen, jossa mole-kyylipaino on noin 60 kDa. t-PA:n osuus "valoa taittavien kappaleiden" kokonaisproteiInipitoisuudesta on noin 21 %.
b) Valoa taittavien kappaleiden" tekeminen liukoiseksi ja pelkistäminen "Valoa taittavia kappaleita" inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2-3 tunnin ajan liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HC1 (pH 8,6), 6 moolia/1 guanidiini-hydrokloridi a, 0,15-0,4 moolia/1 DTE ja 1 mmooli/1 EDTA, ja jossa proteiinipitoisuus on 1-5 mg/ml. Tämän jälkeen liukenematon materiaali (solusei-nän;::n kappaleet, jne.) erotettiin sentri f ugoimal 1 a (esimerkiksi 30 minuuttia nopeudella 35000-50000 x g 4°C:n lämpötilassa). Supernatantin pH asetettiin väkevällä suolahapolla HC1 arvoon 3. Denaturoiva aine ja pelkistin poistettiinn tämän jälkeen dialyysillä 4°C:n lämpötilassa pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevaa HCl-liuosta vastaan.
c) Uudestaanhapetus ja aktivointi
Uudestaanhapetus ja aktivointi toteutettiin laimentamalla seos suhteessa 1:50 - 1:200 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 .· moolia/1 L-argini inia, 2 mmoolia/1 6SH, 0,2 mmoolia/1 GSS6.
o
Aktivoitumisen annettiin edetä 17-24 tuntia noin 20 C:n lämpötilassa, minkä jälkeen saanto määritettiin vertaamalla aktiivisuutta eukariooteista saadun luonnollisen glykosyloi-tuneen t-PA:n aktiivisuuteen.
Saanto laskettuna "valoa taittavien kappaleiden" kokonaispro-teiinipitoisuudesta: 2,5 +/- 0,5 % stimuloi tavuus: 10 +/- 5 %.
• · 12 94050
Saanto laskettuna t-PA-osuudesta "valoa taittavissa kappaleissa": noin 12 %.
d) Uudestaanhapetus ja aktivointi denaturoivaa ainetta ja pelkistintä erottamatta "Valoa taittavia kappaleita" inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 moolia/1 guanidiini-hydroklori dia, 0,2 moolia/1 DTE ja 1 mmoolia/1 EDTA, ja jossa proteiinipitoisuus on 1,25 mg/ml. Uudestaanhapetus käynnistettiin sitten välittömästi laimentamalla suhteessa 1:100 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml ESA, 0,3 moolia/1 L-arginiinia sekä taulukossa esitetyt määrät yhdistettä GSSG. Tämän lisäksi akti vointi seoksessa oli läsnä guanidiini-hydroklori dia jäänncspitoisuutena 0,06 moolia/1 sekä 2 mmoolia/1 yhdistettä DTE.
. Seuraavassa taulukossa esitetään akti voi nti saannon riippuvuus GSSG-pitoisuudesta, kun aktivointi toteutetaan denaturoivaa ainetta ja pelkistintä erottamatta.
GSSG Saanto' Stimuloitavuus (mmoolia/1) (¾) (kerroin) • —
0,2 C
1 0,13 4,0 5 1,49 7,4 6 1,28 5,4 7 1,04 5,8 9 0.98 5,2 10 1,77 10,0 15 0 20 0 • · '= Aktiivisen t-PA:n saanto laskettuna "valoa taittavien kap paleiden" kokonaisproteiinipitoisuudesta.
13 94050
Esimerkki 1 "Valoa taittavien kappaleiden" (VTK) preparaattia (noin 5 mg) inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2-3 tuntia 1 ml:ssa liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 moolia/1 gua-nidiini-hydrokloridia ja 0,15-0,2 moolia/1 DTE. Tämän jälkeen liukenematon materiaali (soluseinämien kappaleet, jne.) erotettiin sentrifugoimalla (20 minuuttia nopeudella 17 000 x g). Denaturoiva aine ja pelkistin poistettiin geelisuodatuk-sella käyttäen Sephadex G-25 -geeliä ("superfine") pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa. Näyte laimeni tällöin 5-10-kertaisesti. Pelkistettyä materiaalia säilytettiin -20°C:n lämpötilassa pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa.
Vertailuesimerkki 2
Seuraavissa taulukoissa esitetään useiden keksinnön mukaisten parametrien vaikutus t-PA:n aktivoitumiseen ja stimuloitavani -teen. Esimerkin 2 mukaisesti liukoiseksi tehtyä ja pelkistettyä proteiinia ei puhdistettu edelleen näitä uudelleenhape-tuskokeita varten.
Pelkistetty proteiini (pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa) aktivoitiin laimentamalla se suhteessa 1:10 -1:500 "uudestaan hapettavalla puskurilla". Aktivoituminen määritettiin 22-48 tuntia huoneen lämpötilassa kestäneen in-kuboinnin jälkeen. Uudestaan hapetetun proteiinin aktiivisuus lasketaan "uudestaanhapettumisstandardista" (100 %) liuoksessa, joka sisältää:
0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5) +1 mmoolia/1 EDTA + 0,5 moolia/1 L-arginiinia + 1 mg/ml BSA
+ 0,5 mmoolia/1 GSH (pelkistetty glutationi) * +0,5 mmoolia/1 GSSG (glutationidisulfidi).
14 94050
Stimuloitavuus lasketaan kaavalla AE+CNBrFSPAE-CNBrFSP (katso: W. Nieuwenhuizen et al.f Biochimica et Biophysica Acta 755 (1983) 531-533). Aktiivisuus (prosentteina) ja stimuloitavuus (kerroin) määritettiin julkaisussa J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269, (1982) esitetyllä taval la.
Tällöin saatiin seuraavat tulokset: 1. Aktivoitumissaannon riippuvuus L-arginiinin tai guani-diinihydrokloridin lisäyksestä:
Uudestaan hapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moo-lia/1 Tris/HCl (pH 10,5)
+ 1 mmoolia/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH
+ 0,5 mmoolia/1 GSSG
a) L-arginiini L-arginiini Aktiivisuus Stimuloitavuus (mooli/1) (%) (kerroin) 0 4 2,5 0,25 98 7,5 0,5 100 21,9 0,75 27 16,3 1,0 23 3,5 "· Tässä esimerkissä on otettava huomioon se, että L-arginiini inhiboi t-PA:ta. Näin ollen suurempien L-arginiinipitoisuuk-sien tapauksessa aktivoitumissaannon pienentyminen on korjattava inhibitiota vastaavalla tavalla.
15 94050 b ) G u a n i d i i n i - hy d r o k 1 o r i d i (G d n / K C1 ) (Gdn/HCl) Aktiivisuus (mooli a/1 ) (¾) 0 11 0,25 22 0,5 53 0,75 58 1,0_12_ 2. Akti voitumissaannon riippuvuus urean ja urean johdannaisten lisäyksestä:
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,2 mmoolia/1 GSSG.
• a) Urea
Urea Aktiivisuus (mooli a/1) (%) 0 1 0,5 20 1 59 1.5 126 2 162 2.5 141 3 72 4 12 5 0 16 94050 b) Metyyli urea
Metyyli urea Aktiivisuus (mooli a/1 ) [%) 0,5 22 1 174 1.5 313 2 375 2.5 332 3 215 4 12 5 0 c ) E tyyli urea
Etyyli urea Aktiivisuus (mooli a/1 ) (%) 0,5 46 1 212 1.5 323 2 300 2.5 107 3 19 4 0 5 0
Dimetyyliurea Aktiivisuus Stimuloitavuus (moolia/1) (¾) (kerroin) 17 94050 d) Di metyyli urea 0,5 167 8,8 1 256 8,9 1.5 283 9,4 2 177 7,7 2.5 78 8,9 3 23 9,9 4 4 8,6 5 2 3,5
Akti voi tumi ssaannon riippuvuus rasvahappoani! di en lisäyksestä:
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 nioolia/1 Tris (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,2 mmoolia/1 GSSG.
a) Formamidi
Formamidi Aktiivisuus .· (mool ia/1 ) (%) 0 42 0,5 59 1 175 1.5 245 2 325 2.5 423 3 444 4 416 5 341 • ·
IS
94050 b) Metyy1ifornamidi
Me tyy 1 i f o rmami d i Aktiivisuus (mooli a/1) (%) 0,5 100 1 135 1.5 304 2 389 2.5 466 3 452 4 425 5 121 c) Asetamidi
Asetamidi Aktiivisuus (mooli a/1) (%) 0,5 72 1 134 1.5 207 2 261 .: 2,5 204 3 237 4 198 5 141 19 94050 d) Propionamidi P r o p i o n a mi d i Aktiivisuus (moolia/1) (%) 0,5 95 1 99 1.5 197 2 150 2.5 101 3 39 4 2 5 0 e ) B u ty r a m i d i
Butyramidi Aktiivisuus (mooli a/1) (¾) 0,5 55 1 52 1.5 17 2 0 4. Akti voitumissaannon riippuvuus pH-arvosta
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl + 1 mmoolia/1 EDTA + 0,5 moolia/1 L-arginiini + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG
Aktiivisuus Stimuloi tavuus pH (¾) (kerroin) 20 94050 7 1- 8 22 3,0 9 89 12,6 10 105 20,3 11 95 21,3 5. Akti voi turn'ssaannon riippuvuus GSH/GSSG-pitoisuudesta
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 mooli a/1 Tris/HCl , pH 10,5,
+ 1 mmooli/1 EDTA + 0,5 mo o 1i a/1 L- a r g i n i i n i + 1 mg/ml BSA
a) + 1 mmooli /1 GSH
(GSSG) Aktiivisuus Stimuloi tavuus (mmoolia/1) (¾) (kerroin) 0,1 239 14,9 | 0,2 273 15,3 0,5 193 13,3 1 198 12,5 5 17 2,1 10 0 20 0 -
b) + 0,2 mmoolia/1 GSSG
(CSH) Aktiivisuus Stimuloitavuus (mmoolia/1) (") (kerroin) 21 94050 0,05 15 2,2 0,1 40 3,8 0,2 112 6,8 0,5 142 7,4 1 273 6,8 5 260 7,9 10 143 6,3 20 55 5,1 6. Akti voi turnissaannon riippuvuus proteiinin pitoisuudesta uudestaanhapetettaessa (laimennos suhteessa 1:20 - 1:500)
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tri s/HCl (pH 10,5)
+ 1 mmooli/1 EDTA + 0,5 moolia/1 L-arginiinia + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH
+ 0,5 mmooli a/1 GSSG
«
Laimennnos Aktiivisuus Stimuloitavuus [%) (kerroin) 1:10 29 15,3 1:20 45 25,4 1:50 69 37,9 1:100 100 37,9 1:200 79 52,7 1:500 29 28,7 94050 22 7. Aktivoitumissaannon riippuvuus BSA:n lisäyksestä
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5)
+ 1 irimooli/1 EDTA + 0,5 moolia L-arginiinia +0,5 mmoolia/1 GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG
BSA Aktiivisuus (mg/ml) (%) 0 47 0,5 83 1 100 3 102 5 52
Kuviot 1 ja 2 esittävät aktiivisuutta fibriinin CNBr-pilkkou-tumistuotteiden läsnäollessa ja niiden puuttuessa 17 tuntia huoneen lämpötilassa kestäneen uudelleenhapettamisen jälkeen, joka uudelleenhapettaminen toteutettiin seuraavassa liuoksessa: 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH =10,5) +1 mmooli/1 EDTA + 0,5 moolia/L-arginiini + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG. Kuvioissa 1 ja 2 käyrät (A) esittävät aktiivisuutta CNBr-pilkkoutumistuotteiden läsnäollessa, ja käyrät (B) aktiivisuutta CNBr-pilkkoutumistuotteiden puuttuessa.
Esimerkki 2 t-PA:n aktivointi t-PA:n ja glutationin välisten sekadisulfi-dien avulla Käytetyt "valoa taittavat kappaleet" saatiin jonkin edellä esitetyn esimerkin mukaisesti. "Valoa taittavat kappaleet" pelkistettiin inkuboimalla niitä 2 tuntia huoneen lämpötilas- 23 94050 sa liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH C,6, 1 mmooli/1 EDTA, 6 moolia/1 Gdn.HCl, 0,2 moolia/1 DTE, ja jossa proteiinin pitoisuus on noin 1 mg/ml.
Pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevaa HCl-liuosta vastaan dia-lysoitu, pelkistetty proteiini 1 aimennettiin suhteessa 1:1 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris, ph' 9,3, 9 moolia/1 ureaa ja 0,2 moolia/1 yhdistettä GSSG, ja sitä inkuboi-tiin 5 tuntia huoneen lämpötilassa.
Seos tehtiin happamaksi laskemalla sen pH arvoon 3 väkevällä suolahapolla HC1 , mitä seura:i dialyysi pitoisuudeltaan 0,01 o moolia/1 olevaa HCl-liuosta vastaan 4 C:n lämpötilassa. Dialyysin jälkeen proteiinien kokonaispitoisuus oli 0,33 mg/ml. Uudel1eenaktivoinnin optimaaliset olosuhteet määritettiin tällä tavalla esikäsitellyllä yhdisteellä t-PASSG.
a) pH-optimi yhdistettä t-PASSG aktivoitaessa Tässä, kuten seuraavissakaan optimointiin liittyvissä esimerkeissä (1) ei käytetty yhdistettä GSSG; ja (2) näissä esimerkeissä aktivoituminen määritettiin huoneen lämpötilassa 17 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen. Aktivointi toteutettiin laimentamalla näyte suhteessa 1:100 liuoksella, joka sisältää .♦ 0,1 moolia/1 Tris, 1 mmoolia/1 EDTA, 0,5 moolia/1 L-arginiini, 1 mg/ml BSA ja 2 mmoolia/1 GSH:ta, sekä vaihtelemalla pH-arvoa.
pH Saanto (¾) Stimuloitavuus 6 0,04 3,3 6.5 0,37 9,5 7 1,35 11,4 7.5 5,66 7,1 8 7,32 8,2 8.5 8,65 7,0 • · 24 94050 pH Saanto (¾) Stimuloitavuus (jatkoa) 9 8,59 8,7 9.5 8,32 11,7 10 6,15 12,5 10.5 3,07 11,2
Saanto määritettiin aktiivisen t-PA:n prosenttisena osuutena käytetystä proteiinimäärästä.
b) t-PA$SG:n aktivoinnista saatujen tulosten toistettavuus Täsmälleen samoja aktivoimisoiosuhteita käytettäessä eri mit-taussarjoissa saatiin erilaisia saantoja, mikä johtuu mm. standardina käytetyn t-PA:n vaihteluista. Tämän virhealueen havainnollistamiseksi kaikki akti voi nti tiedot esitetään näytteillä, jotka oli laimennettu suhteessa 1:100 tai 1:200 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmooli/1 EDTA, 0,5 moolia/1 L-arginiini, 1 mg/ml BSA ja 2 mmooli a/1 GSH:ta.
Koe Saanto (¾) Stimuloitavuus : 1 8,65 7,0 2 4,47 9,3 3 4,49 9,7 4 8,50 6,5 5 3,45 17,2 6 4,32 8,3 7 3,29 14,0 8 3,54 13,4 9 5,07 16,4
Keskiarvo 5,1 +/- 1,9 11,3 +/- 3,8 • · 25 94050 c) Aktivoidun proteiinin stabiilisuus
Aktivointi toteutettiin mainitussa esimerkissä laimentamalla suhteessa 1:200 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/-HC1, 1 mmoolia/1 EDTA, 0,5 moolia/1 L-arginiini, 1 mg/ml BSA ja 2 mmoolia/1 GSH:ta.
Aika pH 9,5 (h) Saanto Stimuloitavuus (%) 1 0 6 0,89 15,5 23 2,43 23,1 47 2,83 23,6 71 2,62 21,5 215 2,21 22,6 239 2,28 14,3
Vertailuesimerkki 3
Geeniteknisesti valmistetun beeta-interferonin aktivointi "Valoa taittavat kappaleet" valmistettiin edellä kuvatulla menetelmällä. "Valoa taittavien kappaleiden" pelkistäminen ja liukoiseksi tekeminen toteutettiin seuraavasti: kasaumaa in-kuboitiin 3 tuntia 25°C:n lämpötilassa 10 millilitrassa liuosta, joka sisältää 9,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,6, 6 moolia/1 Gdn.HCl, 1 mmooli/1 EDTA ja 0,2 moolia/1 DTE:tä, seosta sent-rifugoitiin 30 minuuttia nopeudella 48 000 x g 4°C:n lämpöti-- lassa, minkä jälkeen supernatantin pH asetettiin arvoon 3 väkevällä suolahapolla HC1. Sitten seos geelisuodatettiin käyttäen Sephadex G25 F -geeliä pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa.
Eluentin johtokyky, proteiinipitoisuus ja uudelleenaktivoita-vuus määritettiin.
26 94050
Uudestaan hapetetun proteiinin aktiivisuus perustuu "standardi ak ti vo i tumi seen " (= 100 %) liuoksessa, joka sisältää 0,1 ntoolia/1 Tris/HCI, pH 10,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia.
a) Akti voi tiimi ssaannon riippuvuus L-argi rii i ni n lisäyksestä
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCI, pH 8,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG, ja sitä aktivoitiin 20 tuntia o 0 C:n lämpötilassa.
Aktivoitumisen riippuvuus L-argi n i i ni s ta L-arginiini (moolia/1) Aktiivisuus (%) 0 8 0,25 8 0,5 15 0,75 15 b) Akti voitumissaannon riippuvuus urean lisäyksestä
Aktivoimisliuos vastaa kohdan a) mukaista liuosta; aktivoimisen annettiin kuitenkin edetä 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.
Aktivoitumisen riippuvuus ureasta
Urea (moolia/1) Aktiivisuus (¾) 0 13 0,5 100 1 200 1,5 100 » • __________________________________________ 27 94050 c) Akti voi turn ssaannon riippuvuus formamidin lisäyksestä
Aktivoiminen toteutettiin kohdassa a) kuvatulla tavalla; näytteet tutkittiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli eden- o nyt 17 tunnin ajan 0 C:n lämpötilassa.
Aktivoitumisen riippuvuus formamidista
Formamidi Aktiivisuus (mooli a/1) 0 13 1 13 2 13 3 0 4 0 d) Akti voitumissaannon riippuvuus hapetus-pelkistys-puskuris-ta
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl, pH 8,5, 1 mmoolia/1 EDTA ja 0,25 • moolia/l L-arginiinia, ja näytteet analysoitiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.
Aktivoitumisen riippuvuus yhdisteistä GSH ja GSSG
GSH GSSG Aktiivisuus (mmoolia/1) (mmoolia/1 [%) 1 0,5 6 5 0,5 13 10 0,5 25 20 0,5 25 94050 28 GSH GSSG Aktiivisuus (mmoolia/1) (mmoolia/1 (%) (jatkoa) 5 0,1 13 5 0,5 13 5 1,0 13 5 5 6 e) Aktivoitumissaannon riippuvuus BSA:n lisäyksestä
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia, ja se analysoitiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.
Aktivoitumisen riippuvuus yhdisteestä BSA
BSA (mg/ml) Aktiivisuus (%) 0 13 1 13 2 25 5 13 f) Aktivoitumissaannon riippuvuus pH-arvosta
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, 1 mmoolia/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia, ja se analysoitiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.
i 29 94050
Aktivoitumisen riippuvuus pH-arvosta pH Akti i vi su us (¾) 6.5 0 7.5 6 8.5 13 9.5 50 10,5 100
Claims (17)
1. Menetelmä geeniteknisesti prokariooteissa ilmentämällä valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien, eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi, tunnettu siitä, että a) prokarioottisolut rikotaan, b) eukarioottiset proteiinit tehdään liukoisiksi denaturoivissa ja pelkistävissä olosuhteissa, c) erotetaan pelkistys-/denaturointiaine, d) uudelleenaktivoidaan hapettavissa olosuhteissa e) muuntamalla liukoisiksi tehtyjen proteiinien tioliryh-mät proteiinin ja glutationin välisiksi sekadisulfi-deiksi lisäämällä GSSG:tä denaturoivissa olosuhteissa, ja f) muodostamalla aktiiveja proteiineja sekadisulfideista GSH-pitoisuudessa 0,5-5 mmol/1, pH-arvossa 7-10,5, de-naturointiaineen ollessa läsnä ei-denaturoivana pitoisuutena .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmentäminen toteutetaan E. coli- tai P. putida -bakteerissa.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenaktivointivaiheessa denaturoivana V aineena käytetään arginiinia, guanidiini-hydrokloridia ja/- tai vähintään yhtä yleisen kaavan R^CO-NRRj (I) mukaista yhdistettä, jossa kaavassa R ja Rt tarkoittavat vetyatomia tai 1-4 hiiliatomia käsittävää alkyyliä, ja R2 tarkoittaa vetyatomia tai ryhmää NHRi tai 1-3 hiiliatomia käsittävää alkyyliä. 94050 31
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että arginiinin ja/tai guanidiini-hydrokloridin pitoisuus on 0,1-1,0 moolia/1, erityisesti 0,25-0,8 moolia/1.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yleisen kaavan (I) mukaisen yhdisteen pitoisuus on 0,5-4 moolia/1, erityisesti 1-3,5 moolia/1.
6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenaktivointivaihe toteutetaan proteiinin, jolla ei ole proteolyyttistä aktiivisuutta, läsnäollessa, erityisesti naudan seerumin albumiinin läsnäollessa.
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut rikotaan ultraäänen, korkeapaineisen dispersion tai lysotsyymin avulla.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikkominen toteutetaan laimeassa, veteen valmistetussa puskuriliuoksessa, erityisesti pitoisuudeltaan 0,1 moolia/1 olevassa Tris-puskurissa, neutraalissa tai heikosti happamassa pH-arvossa.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solujen rikkomisen jälkeen liukenematon materiaali poistetaan.
10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukoiseksi tekemiseen tähtäävä vaihe toteutetaan aikaiisessa pH-arvossa merkaptoryhmästä peräisin olevan pelkistimen ja denaturoivan aineen läsnäollessa.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä toteutetaan guanidiini-hydrokloridin ja/tai yleisen kaavan I mukaisen yhdisteen läsnäollessa denaturoivana aineena. , 94050 32
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiini-hydrokloridin pitoisuus on 6 moolia/1 ja yleisen kaavan I mukaisen yhdisteen pitoisuus on 8 moolia/1 .
13. Jonkin patenttivaatimuksista 10-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan yhdisteen DTE, β-merkap-toetanolin, kysteiinin tai yhdisteen GSH läsnäollessa.
14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistaminen sekä pelkistimen, hapettimen tai denaturoivan aineen poistaminen toteutetaan eteerisen erotuskromatografian tai dialyysin avulla.
15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenaktivointivaiheen jälkeen toteutetaan puhdistusvaihe dialyysin avulla.
16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeniteknisesti valmistettuna eukari-oottisena proteiinina käytetään t-PA-proteiinia.
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin ja glutationin välinen sekadisulfidi erotetaan modifioimattomasta proteiinista ioninvaihtajalla : käsittelemällä.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI933868A FI95578C (fi) | 1985-10-23 | 1993-09-03 | Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853537708 DE3537708A1 (de) | 1985-10-23 | 1985-10-23 | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| DE3537708 | 1985-10-23 | ||
| EP8600610 | 1986-10-23 | ||
| PCT/EP1986/000610 WO1987002673A2 (en) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | Process for activating heterologous, eucaryotic proteins genetically engineered and presenting disulphide bridges after their expression in procaryotic cells |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI872753L FI872753L (fi) | 1987-06-22 |
| FI872753A0 FI872753A0 (fi) | 1987-06-22 |
| FI94050B FI94050B (fi) | 1995-03-31 |
| FI94050C true FI94050C (fi) | 1995-07-10 |
Family
ID=6284269
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI872753A FI94050C (fi) | 1985-10-23 | 1987-06-22 | Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen |
| FI933868A FI95578C (fi) | 1985-10-23 | 1993-09-03 | Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI933868A FI95578C (fi) | 1985-10-23 | 1993-09-03 | Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0219874B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0728745B2 (fi) |
| KR (1) | KR900009139B1 (fi) |
| AT (2) | ATE131489T1 (fi) |
| AU (2) | AU590029B2 (fi) |
| CA (1) | CA1329157C (fi) |
| CZ (1) | CZ280727B6 (fi) |
| DD (1) | DD260517A5 (fi) |
| DE (3) | DE3537708A1 (fi) |
| DK (2) | DK175091B1 (fi) |
| ES (2) | ES2020498T3 (fi) |
| FI (2) | FI94050C (fi) |
| GR (2) | GR920300062T1 (fi) |
| HK (2) | HK153496A (fi) |
| HR (1) | HRP921075B1 (fi) |
| HU (2) | HUT43643A (fi) |
| IE (1) | IE62634B1 (fi) |
| IL (1) | IL80325A (fi) |
| PT (1) | PT83609B (fi) |
| SI (1) | SI8611796B (fi) |
| SK (1) | SK752686A3 (fi) |
| SU (1) | SU1607689A3 (fi) |
| UA (1) | UA6023A1 (fi) |
| WO (1) | WO1987002673A2 (fi) |
| YU (1) | YU47185B (fi) |
| ZA (1) | ZA868012B (fi) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| JP2581668B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1997-02-12 | 三井東圧化学株式会社 | ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞 |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| WO1988008428A1 (en) * | 1987-04-28 | 1988-11-03 | Amgen Inc. | Method for purifying granulocyte/macrophage colony stimulating factor |
| DE3722082A1 (de) * | 1987-07-03 | 1989-01-12 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von serinproteasen oder serinproteaseinhibitoren |
| CA1340586C (en) * | 1988-09-23 | 1999-06-08 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-beta |
| DE3832898A1 (de) * | 1988-09-28 | 1990-04-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator |
| DE3835350A1 (de) * | 1988-10-17 | 1990-04-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern |
| DE3903581A1 (de) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
| DE3942143A1 (de) * | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | T-pa pro stabilisierung |
| JPH06500084A (ja) * | 1990-08-20 | 1994-01-06 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用 |
| EP0547102B1 (en) * | 1990-09-05 | 1998-07-08 | Southern Cross Biotech Pty.Ltd. | Solubilization of proteins in active forms |
| DE4037196A1 (de) * | 1990-11-22 | 1992-05-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein |
| DE4113750A1 (de) | 1991-04-26 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
| DE4139000A1 (de) | 1991-11-27 | 1993-06-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf |
| US5212091A (en) * | 1992-03-02 | 1993-05-18 | Monsanto Company | Method of producing tissue factor pathway inhibitor |
| WO1993019084A1 (en) * | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Synergen, Inc. | Refolding and purification of insulin-like growth factor i |
| SG46612A1 (en) | 1992-12-02 | 1998-02-20 | Hoechst Ag | Process for obtaining proinsulin in processing correctly linked cystine bridges |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| FR2729972B1 (fr) * | 1995-01-31 | 1997-04-18 | Sanofi Sa | Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine |
| US5714371A (en) * | 1995-05-12 | 1998-02-03 | Schering Corporation | Method for refolding insoluble aggregates of hepatitis C virus protease |
| US5728804A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-17 | Research Corporation Technologies, Inc. | Use of cyclodextrins for protein renaturation |
| US6342585B1 (en) * | 1996-06-11 | 2002-01-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Method of activating denatured protein |
| US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
| US6653098B1 (en) * | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
| DE19850429A1 (de) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Andre Schrattenholz | Fragmente |
| EP1048732A1 (de) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
| EP1077263A1 (de) * | 1999-07-29 | 2001-02-21 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen |
| NZ522847A (en) | 2000-05-16 | 2004-11-26 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
| DE10105912A1 (de) * | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Proteinase K |
| DE10105911A1 (de) | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe |
| DE102005033250A1 (de) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
| DE202006020194U1 (de) | 2006-03-01 | 2007-12-06 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF-Flüssigformulierung |
| WO2008008975A2 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Genentech, Inc. | Refolding of recombinant proteins |
| US8617531B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-12-31 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine |
| CN102892780B (zh) | 2010-03-17 | 2015-07-29 | 通益制药有限公司 | 获得生物活性的重组人g-csf的方法 |
| WO2012054679A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Medimmune, Llc | Methods for processing inclusion bodies |
| HUP1200171A1 (hu) | 2012-03-19 | 2013-09-30 | Richter Gedeon Nyrt | Módszerek polipeptidek elõállítására |
| HUP1200172A2 (en) | 2012-03-19 | 2013-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for refolding g-csf from inclusion bodies |
| CN103852527B (zh) * | 2012-12-05 | 2015-05-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种高通量蛋白质样品预处理装置 |
| US10457716B2 (en) | 2014-08-06 | 2019-10-29 | University Of Notre Dame Du Lac | Protein folding and methods of using same |
| JP6629488B2 (ja) | 2016-12-30 | 2020-01-15 | バイオジェンド セラピューティクス カンパニー リミテッド | 組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法 |
| AU2021399935A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-06-29 | Richter Gedeon Nyrt. | Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4468633A (en) | 1982-04-28 | 1984-08-28 | The Bendix Corporation | Adjustable microwave power combiner for a plurality of coaxially mounted impatt diodes |
| IL68561A (en) | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| US4432895A (en) * | 1982-11-24 | 1984-02-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Monomeric interferons |
| GR79124B (fi) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| EP0122080B1 (en) * | 1983-03-25 | 1989-09-13 | Celltech Limited | A process for the production of a protein |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| FR2596360B1 (fr) * | 1986-04-01 | 1989-02-17 | Sotralentz Sa | Conteneur sur palette avec dispositif de protection en treillis plie et renforce |
| JPH0651119A (ja) * | 1992-07-28 | 1994-02-25 | Sekisui Chem Co Ltd | 位相差板の製造方法 |
-
1985
- 1985-10-23 DE DE19853537708 patent/DE3537708A1/de active Granted
-
1986
- 1986-10-10 IE IE268386A patent/IE62634B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-15 IL IL80325A patent/IL80325A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-10-17 SK SK7526-86A patent/SK752686A3/sk unknown
- 1986-10-17 CZ CS867526A patent/CZ280727B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-10-21 YU YU179686A patent/YU47185B/sh unknown
- 1986-10-21 SI SI8611796A patent/SI8611796B/sl unknown
- 1986-10-22 DD DD29546886A patent/DD260517A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-22 ZA ZA868012A patent/ZA868012B/xx unknown
- 1986-10-22 CA CA000521121A patent/CA1329157C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP86114731A patent/EP0219874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AU AU65993/86A patent/AU590029B2/en not_active Ceased
- 1986-10-23 ES ES90109721T patent/ES2020498T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 JP JP61505882A patent/JPH0728745B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 KR KR1019870700536A patent/KR900009139B1/ko not_active Expired
- 1986-10-23 HU HU865290A patent/HUT43643A/hu unknown
- 1986-10-23 WO PCT/EP1986/000610 patent/WO1987002673A2/de not_active Ceased
- 1986-10-23 DE DE3650449T patent/DE3650449D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP86906320A patent/EP0253823A1/de active Pending
- 1986-10-23 EP EP90109721A patent/EP0393725B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 UA UA4202987A patent/UA6023A1/uk unknown
- 1986-10-23 AT AT90109721T patent/ATE131489T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 PT PT83609A patent/PT83609B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 DE DE86114731T patent/DE3689404D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 ES ES86114731T patent/ES2061434T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 HU HU865290A patent/HU204855B/hu unknown
- 1986-10-23 AT AT86114731T patent/ATE98648T1/de not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-06-22 FI FI872753A patent/FI94050C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 SU SU874202987Q patent/SU1607689A3/ru active
- 1987-06-23 DK DK198703203A patent/DK175091B1/da not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-09-13 AU AU41321/89A patent/AU607083B2/en not_active Expired
-
1991
- 1991-04-12 JP JP3079762A patent/JPH0824594B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-08-31 GR GR92300062T patent/GR920300062T1/el unknown
- 1992-10-16 HR HRP-1796/86A patent/HRP921075B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-09-03 FI FI933868A patent/FI95578C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-14 GR GR950403376T patent/GR3018410T3/el unknown
-
1996
- 1996-08-08 HK HK153496A patent/HK153496A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-08 HK HK153596A patent/HK153596A/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-12-18 DK DK200001897A patent/DK175109B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI94050C (fi) | Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen | |
| Marston et al. | [20] Solubilization of protein aggregates | |
| EP0364926B1 (de) | Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in Prokaryonten exprimierten Antikörpern | |
| US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
| EP0595476A2 (en) | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase | |
| EP0067293B1 (en) | Method for isolating alpha-1-antitrypsin | |
| Hochstraßer et al. | Detection and isolation of a second acid stable proteinase inhibitor from human bronchial mucus | |
| Hosoi et al. | A new esteroproteinase (proteinase F) from the submandibular glands of female mice | |
| WO2003044055A1 (en) | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines | |
| CZ46094A3 (en) | Activation method of heterologous proteins obtained by genetic technology containing disulfide bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms | |
| KR100337010B1 (ko) | 항산화 활성이 증진된 사람혈장알부민 및 그의 제조방법 | |
| Kishimura et al. | Characteristics of trypsin from the starfish Asterias amurensis | |
| JPH0824576B2 (ja) | 新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法 | |
| JPS61268181A (ja) | Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法 | |
| JPS6226298A (ja) | ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |
|
| MA | Patent expired |