RU2620942C2

RU2620942C2 - Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst

Info

Publication number: RU2620942C2
Application number: RU2015148917A
Authority: RU
Inventors: Денис Дмитриевич Дербиков; Татьяна Александровна Губанова; Андрей Дмитриевич Новиков; Тигран Владимирович Юзбашев; Александр Степанович Яненко
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2017-05-30
Also published as: RU2015148917A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: plasmid-free recombinant Escherichia coli strain with constitutive aspartic activity and obtained by replacing the promoter of the aspA gene in Escherichia coli strain MG1655 with the bacteriophage T5 pG25 promoter is represented. A method for L-aspartic acid synthesis from ammonium fumarate is provided, using the said recombinant strain as a biocatalyst in the form of either free or immobilized cells.

EFFECT: more efficient preparation of L-aspartic acid; and allows to reduce the time of its production 3-4 times due to higher aspartic activity of the biocatalyst.

2 cl, 1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма Escherichia coli, обладающего аспартазной активностью, а также способа синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.The invention relates to biotechnology and relates to a strain of Escherichia coli with aspartase activity, as well as a method for the synthesis of L-aspartic acid from ammonium fumarate using cells of this strain as a biocatalyst.

L-аспарагиновая кислота представляет собой дикарбоновую аминокислоту, которая синтезируется в любой клетке живых организмов и используется для построения белков. Как химический реагент L-аспарагиновая кислота используется, прежде всего, для синтеза искусственного подсластителя - аспартама, а также для изготовления лекарственных препаратов и кормовых добавок.L-aspartic acid is a dicarboxylic amino acid that is synthesized in any cell of living organisms and is used to build proteins. As a chemical reagent, L-aspartic acid is used primarily for the synthesis of an artificial sweetener - aspartame, as well as for the manufacture of drugs and feed additives.

В настоящее время основным способом получения L-аспарагиновой кислоты является биокаталитический способ, заключающийся в аминировании фумаровой кислоты с помощью фермента аспартазы (аспартат-аммоний-лиазы).Currently, the main method for producing L-aspartic acid is the biocatalytic method, which consists in the amination of fumaric acid with the help of the aspartase enzyme (aspartate ammonium lyase).

Известен химический синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака. Результатом такого синтеза является смесь D и L - изомеров аспарагиновой кислоты, разделение которых является дорогостоящим процессом.Known chemical synthesis of aspartic acid from maleic acid and ammonia. The result of this synthesis is a mixture of D and L - isomers of aspartic acid, the separation of which is an expensive process.

Для синтеза L-аспарагиновой кислоты в качестве биокатализаторов используют бактериальные клетки микроорганизмов, обладающие аспартазной активностью, преимущественно бактерий E.coli, в свободном или иммобилизованном виде (1). Для получения таких клеток применяют различные подходы, в том числе мутагенез (2) и клонирование гена аспартазы (aspA) в составе плазмидных векторов (3).For the synthesis of L-aspartic acid, bacterial cells of microorganisms with aspartase activity, mainly E. coli bacteria, in free or immobilized form are used as biocatalysts (1). Various approaches are used to obtain such cells, including mutagenesis (2) and aspartase gene (aspA) cloning as part of plasmid vectors (3).

Главным недостатком обладающих аспартазной активностью клеток, полученных с использованием селекционных подходов (мутагенез и отбор), является низкий уровень активности. В свою очередь клонирование в составе плазмидных векторов требует использования антибиотиков для стабильного поддержания плазмиды и сопровождается появлением в штаммах генов устойчивости к антибиотикам, что приводит к ограничениям при использовании штаммов.The main drawback of aspartase-active cells obtained using selection approaches (mutagenesis and selection) is the low level of activity. In turn, cloning as a part of plasmid vectors requires the use of antibiotics for stable maintenance of the plasmid and is accompanied by the appearance of antibiotic resistance in the gene strains, which leads to limitations when using strains.

Известен способ биокаталитического синтеза L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют штамм E.coli PUaspE2 (3), содержащий ген аспартазы в составе плазмидного вектора. Недостатком способа являются сложность культивирования штамма, связанная с необходимостью вносить в питательную среду антибиотик ампициллин для стабильного поддержания плазмиды и дорогостоящий индуктор синтеза аспартазы изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ).A known method of biocatalytic synthesis of L-aspartic acid, in which the E. coli strain PUaspE2 (3) containing the aspartase gene in the plasmid vector is used as the biocatalyst. The disadvantage of this method is the difficulty of culturing the strain associated with the need to introduce the antibiotic ampicillin into the nutrient medium for stable plasmid maintenance and the expensive isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducer of aspartase synthesis.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют клетки штамма E.coli В-11864 (RU 2546239), содержащего рекомбинантную плазмиду с геном aspA, находящимся под контролем конститутивного промотора. Такой штамм обладает конститутивной аспартазной активностью, однако требует использования антибиотиков для стабильного поддержания плазмиды в штамме.Closest to the claimed method is a method for producing L-aspartic acid, in which cells of the E. coli strain B-11864 (RU 2546239) containing a recombinant plasmid with the aspA gene controlled by the constitutive promoter are used as a biocatalyst. Such a strain has constitutive aspartase activity, however, it requires the use of antibiotics for the stable maintenance of the plasmid in the strain.

Задачей заявляемого изобретения является создание штамма E.coli с конститутивной аспартазной активностью, для которого не требуется использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы, а также разработка биокаталитического способа синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.The objective of the invention is the creation of a strain of E. coli with constitutive aspartase activity, which does not require the use of an antibiotic to stably maintain the level of aspartase production, as well as the development of a biocatalytic method for the synthesis of L-aspartic acid using cells of this strain as a biocatalyst.

Задача решена путем:The problem is solved by:

- конструирования бесплазмидного штамма бактерий Е.coli В-12466, обладающего конститутивной аспартазной активностью, путем замены в хромосоме штамма Е.coli собственного промотора гена аспартазы (aspA), на промотор pG25 бактериофага Т5, специфичного в отношении штаммов Е.coli;- constructing a plasmid-free E. coli B-12466 bacterial strain with constitutive aspartase activity by replacing the own aspartase gene (aspA) promoter on the E. coli strain chromosome with the pG25 promoter of the T5 bacteriophage specific for E. coli strains;

- разработки способа синтеза L-аспарагиновой кислоты, с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Е.coli В-12466.- development of a method for the synthesis of L-aspartic acid, using the inventive bacterial strain E. coli B-12466 as a biocatalyst.

Бесплазмидный штамм, содержащий в хромосоме ген aspA под контролем промотора pG25 бактериофага Т5, получен путем замещения фрагмента, содержащего собственный промотор гена аспартазы в штамме Е.coli MG1655, на фрагмент, содержащий промотор pG25 с помощью метода фаг лямбда-зависимой рекомбинации (4). Линейный фрагмент, содержащий промотор pG25, получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы ДНК бактериофага Т5 (получена из ВКПМ) и праймеров, содержащих области гомологии с хромосомной ДНК в области замещения. Фрагмент, введенный в клетки штамма Е.coli MG1655 путем электропорации, интегрируется в хромосому по участкам гомологии за счет фаговых систем рекомбинации, что приводит к замещению собственного промотора гена аспартазы на промотор pG25 бактериофага Т5. Штамм Е.coli В-12466, в хромосоме которого содержится ген aspA под контролем промотора pG25 из бактериофага Т5, приобретает высокий уровень конститутивной аспартазной активности и способность синтезировать L-аспарагиновую кислоту из фумарата аммония. При смешивании водного раствора фумарата аммония и используемых в качестве биокатализатора клеток Е.coli В-12466 (свободных или иммобилизованных) происходит синтез L-аспарагиновой кислоты.A non-plasmid strain containing the aspA gene in the chromosome under the control of the pG25 promoter of the T5 bacteriophage was obtained by replacing a fragment containing its own aspartase gene promoter in E. coli strain MG1655 by a fragment containing the pG25 promoter using the phage lambda-dependent recombination method (4). A linear fragment containing the pG25 promoter was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the bacteriophage T5 (obtained from VKPM) and primers containing homology regions with chromosomal DNA in the substitution region as a DNA template. The fragment introduced into the cells of the E. coli strain MG1655 by electroporation is integrated into the chromosome at the homology sites due to phage recombination systems, which leads to the replacement of the own aspartase gene promoter with the pG25 promoter of bacteriophage T5. Strain E. coli B-12466, whose chromosome contains the aspA gene under the control of the pG25 promoter from the T5 bacteriophage, acquires a high level of constitutive aspartase activity and the ability to synthesize L-aspartic acid from ammonium fumarate. When mixing an aqueous solution of ammonium fumarate and E. coli B-12466 cells (free or immobilized) used as a biocatalyst, L-aspartic acid is synthesized.

Характеристика заявляемого штаммаCharacterization of the claimed strain

Штамм Е.coli В-12466 является производным штамма Е.coli MG1655 (получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ) и обладает следующими морфологическими и физиологическими свойствами. Реакция Фогес-Проскауэра - отрицательная, реакция с метиловым красным - положительная. Культура отрицательна по признакам образования H₂S и гидролиза мочевины. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными подвижными клетками, со слегка закругленными концами, размером 0,4-0,8×1-3 мкм. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах, например МПА и LB (5). Оптимальная температура роста 37°C, оптимальный рН 7,2. Колонии на плотных питательных средах (МПА, LB) беловатые блестящие, размером 2-3мм, края ровные, спор не образует.The strain E. coli B-12466 is a derivative of the strain E. coli MG1655 (obtained from the All-Russian collection of industrial microorganisms, VKPM) and has the following morphological and physiological properties. The Voges-Proskauer reaction is negative, the reaction with methyl red is positive. The culture is negative for signs of H ₂ S formation and urea hydrolysis. The strain is oxidase-negative, catalase-positive. The culture is represented by gram-negative, optionally anaerobic rod-shaped motile cells, with slightly rounded ends, size 0.4-0.8 × 1-3 microns. Cells grow well on simple rich nutrient media, for example, MPA and LB (5). The optimum growth temperature is 37 ° C; the optimum pH is 7.2. Colonies on dense nutrient media (MPA, LB) are whitish, shiny, 2-3 mm in size, the edges are even, do not form a spore.

Получение биомассы заявляемого штаммаObtaining biomass of the claimed strain

Для получения биомассы клеток заявляемого штамма с аспартазной активностью штамм выращивают при 28-30°C в течение 12-15 часов на обычных для E.coli средах: полноценных (LB) либо синтетических, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или ацетат в концентрациях 0.1-1%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или дрожжевой экстракт в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (3-4 тыс. об/мин), ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде (клеточная суспензия) при 4°C.To obtain the biomass of cells of the claimed strain with aspartase activity, the strain is grown at 28-30 ° C for 12-15 hours on normal E. coli media: high-grade (LB) or synthetic ones containing glucose or acetate at a concentration of 0.1- as a carbon source 1%, and as a source of nitrogen, ammonium, nitrate salts or yeast extract in concentrations of 0.4-2%. The obtained cells are separated from the culture fluid by centrifugation (3-4 thousand rpm), resuspended in 10 mM phosphate buffer pH 7.0-8.0 to a concentration of 20-40 g dry weight / L and stored as such (cell suspension) at 4 ° C.

Аспартазную активность клеток штамма определяют по скорости синтеза L-аспарагиновой кислоты следующим образом: к 1 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляют 0,5 мл полученной клеточной суспензии, клетки которой предварительно активируют и смесь инкубируют 10 минут при 37°C. Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводят инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумарата аммония при 37°C в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для фумарата и аспартата.Aspartase activity of strain cells is determined by the rate of synthesis of L-aspartic acid as follows: 0.5 ml of the obtained cell suspension is added to 1 ml of a 1 M solution of ammonium fumarate, the cells of which are pre-activated and the mixture is incubated for 10 minutes at 37 ° C. Activation of microbial cells before obtaining L-aspartic acid is carried out by incubating a suspension of cells in a 1M solution of ammonium fumarate at 37 ° C for 16-18 hours. The purpose of activation is to increase the permeability of the cell membrane for fumarate and aspartate.

Количество L-аспарагиновой кислоты в образцах определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 510 нм. Активность клеток выражают в мкМ L-аспарагиновой кислоты, образующейся за 1 мин при 37°C.The amount of L-aspartic acid in the samples is determined spectrophotometrically at a wavelength of 510 nm. Cell activity is expressed in μM L-aspartic acid formed in 1 min at 37 ° C.

Способ синтеза L-аспарагиновой кислоты в общем видеThe method of synthesis of L-aspartic acid in General

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты осуществляют путем смешивания растворов фумарата аммония в концентрациях 1М-1,5М (рН 8,0-8,5), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии биокатализатора в концентрациях 0,4 - 4 мг/мл в термостатируемом реакторе с системой перемешивания и последующей инкубации при температуре 30-37°C в течение 1-6 часов. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют клетки штамма Е.coli В-12466 или в нативном или в иммобилизованном виде. Содержание L-аспарагиновой кислоты определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).The inventive method for the synthesis of L-aspartic acid is carried out by mixing solutions of ammonium fumarate in concentrations of 1M-1.5M (pH 8.0-8.5) containing 0.001M MgCl ₂ and a suspension of biocatalyst in concentrations of 0.4 to 4 mg / ml a thermostatic reactor with a stirring system and subsequent incubation at a temperature of 30-37 ° C for 1-6 hours. As a biocatalyst in the claimed method, cells of the E. coli strain B-12466 are used either in native or immobilized form. The content of L-aspartic acid is determined using high performance liquid chromatography (HPLC).

Пример 1. Оценка аспартазной активности заявляемого штаммаExample 1. Evaluation of the aspartase activity of the inventive strain

Наработку биомассы Е.coli В-12466 осуществляют в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды LB в которые вносят по 1 мл культуры, предварительно выращенной в течение ночи при 37°C в пробирках объемом 40 мл, содержащих 5 мл среды LB, в условиях перемешивания (300 об/мин). Колбы культивируют 2 часа при 37°C, затем снижают температуру до 30°C и продолжают культивирование в течение 8 часов с постоянным перемешиванием (300 об/мин). Затем биомассу штамма Е.coli В-12466 отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и хранят при +4°C. Аспартазная активность клеток E.coli В-12466 составляет 140 мкм аспарагиновой кислоты/мин/ мг клеток по сухой массе.The accumulation of E. coli B-12466 biomass is carried out in 750 ml flasks containing 100 ml of LB medium, into which 1 ml of culture previously grown overnight at 37 ° C in 40 ml tubes containing 5 ml of LB medium is added to stirring conditions (300 rpm). The flasks were cultured for 2 hours at 37 ° C, then the temperature was reduced to 30 ° C and cultivation was continued for 8 hours with constant stirring (300 rpm). Then the biomass of E. coli strain B-12466 is separated by centrifugation (5 thousand rpm) and stored at + 4 ° C. Aspartase activity of E. coli B-12466 cells is 140 μm aspartic acid / min / mg cells by dry weight.

Отличительная особенность заявляемого штамма, содержащего ген aspA под контролем промотора pG25 из фага Т5, состоит в его способности синтезировать фермент аспартазу конститутивно, при этом не требуя использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы. Кроме того, использование сильного конститутивного промотора из фага позволяет увеличить продукцию аспартазы в несколько раз по сравнению с ближайшим аналогом.A distinctive feature of the claimed strain containing the aspA gene under the control of the pG25 promoter from T5 phage is its ability to synthesize the aspartase enzyme constitutively, without requiring the use of an antibiotic to stably maintain the level of aspartase production. In addition, the use of a strong constitutive phage promoter can increase the production of aspartase several times in comparison with the closest analogue.

Как видно из результатов, приведенных в таблице, при одинаковых условиях культивирования (среда LB) заявляемый штамм, обладающий активностью 143 мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток, что в 5,7 раза выше уровня активности штамма E.coli В-11864 - ближайшего аналога (RU2546239).As can be seen from the results shown in the table, under the same cultivation conditions (LB medium), the inventive strain having an activity of 143 μM aspartic acid / min mg of cells, which is 5.7 times higher than the activity level of the E. coli B-11864 strain, the closest analogue (RU2546239).

Пример 2. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием свободных клеток заявляемого штаммаExample 2. Synthesis of L-aspartic acid using free cells of the inventive strain

Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 100 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (рН 8), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии активированного биокатализатора в концентрации 0,4 мг/мл, полученного, как указано в примере 1. Процесс проводят при 37°C в течение 1 часа. Концентрацию L-аспарагиновой и яблочной кислот в реакционной смеси определяют с помощью ВЭЖХ. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 199,1 г/л, конверсия - 99%, содержание яблочной кислоты 0,06%.The synthesis of L-aspartic acid is carried out in a glass reactor with a volume of 100 ml by mixing the substrate - 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8) containing 0.001 M MgCl ₂ and a suspension of activated biocatalyst in a concentration of 0.4 mg / ml, obtained as described in Example 1. The process is carried out at 37 ° C for 1 hour. The concentration of L-aspartic and malic acids in the reaction mixture was determined by HPLC. The concentration of L-aspartic acid in the obtained sample is 199.1 g / l, the conversion is 99%, and the content of malic acid is 0.06%.

Пример 3. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток заявляемого штаммаExample 3. Synthesis of L-aspartic acid using immobilized cells of the inventive strain

Биомассу клеток штамма E.coli В-12466 в количестве 7 г, полученную как в примере 1, суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, рН 7,5. Смесь охлаждают до 5°C и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5% водного раствора N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и 0,2 г 5% водного раствора персульфата аммония. Полученный гель измельчают, промывают деионизованной водой, затем 1,5М раствором фумарата аммония (рН 8). Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 200 мл путем смешивания субстрата (смесь фумарата аммония и хлорида магния с конечными концентрациями компонентов смеси - 1,5М раствора фумарата аммония (рН 8) и 0,001М MgCl₂) и 12,5 г гранул иммобилизованного биокатализатора. Процесс проводят при 37°C в течение 1 часа. Конверсия субстрата в продукт составляет не менее 98%.The biomass of cells of strain E. coli B-12466 in an amount of 7 g, obtained as in example 1, is suspended in 27.3 g of a solution of sodium asparaginate with a concentration of 20%, pH 7.5. The mixture is cooled to 5 ° C and 6.15 g of acrylamide, 0.36 g of N, N'-methylene-bis-acrylamide, 1.0 g of a 5% aqueous solution of N, N, N ', N' are successively added to the cooled mixture. -tetramethylethylenediamine and 0.2 g of a 5% aqueous solution of ammonium persulfate. The resulting gel is ground, washed with deionized water, then with a 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8). The synthesis of L-aspartic acid is carried out in a glass reactor with a volume of 200 ml by mixing the substrate (a mixture of ammonium fumarate and magnesium chloride with final concentrations of the mixture components - 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8) and 0.001 M MgCl ₂ ) and 12.5 g of granules immobilized biocatalyst. The process is carried out at 37 ° C for 1 hour. The conversion of the substrate to the product is at least 98%.

Выделение L-аспарагиновой кислоты проводят стандартным химическим методом с использованием серной кислоты (2). Из 100 мл элюата получают 18,4 г кристаллической L-аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н HCl [α]²⁰ _D=24,9.The isolation of L-aspartic acid is carried out by a standard chemical method using sulfuric acid (2). From 100 ml of the eluate, 18.4 g of crystalline L-aspartic acid are obtained. The specific rotation angle of 5 n HCl [α] ²⁰ _D = 24.9.

Таким образом, заявляемый штамм E.coli В-12466, по сравнению с ближайшим аналогом (RU 2546239), обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет более высокой аспартазной активности биокатализатора и конститутивного синтеза аспартазы, что делает ненужным использование индуктора. Кроме того, заявляемый штамм не является плазмидосодержащим, не требует использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы и обладает высокой генетической стабильностью. Заявляемый штамм E.coli В-12466, по сравнению с ближайшим аналогом (RU 2546239), позволяет снизить расход биокатализатора для получения L-аспарагиновой кислоты в 3-4 раза.Thus, the claimed strain of E. coli B-12466, in comparison with the closest analogue (RU 2546239), provides more efficient production of L-aspartic acid due to the higher aspartase activity of the biocatalyst and constitutive synthesis of aspartase, which makes the use of an inductor unnecessary. In addition, the inventive strain is not plasmid-containing, does not require the use of an antibiotic to stably maintain the level of aspartase production, and has high genetic stability. The inventive strain of E. coli B-12466, compared with the closest analogue (RU 2546239), allows to reduce the consumption of biocatalyst to obtain L-aspartic acid by 3-4 times.

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием заявляемого штамма в качестве биокатализатора как в виде свободных клеток, так и в иммобилизованном виде обеспечивает сокращение времени синтеза L-аспарагиновой кислоты в 3-4 раза за счет более высокой аспартазной активности биокатализатора.The inventive method for the synthesis of L-aspartic acid using the inventive strain as a biocatalyst both in the form of free cells and in an immobilized form reduces the synthesis time of L-aspartic acid by 3-4 times due to the higher aspartase activity of the biocatalyst.

Список источников информацииList of sources of information

1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.

2. M.K. Синолицкий и др. Способ получения L-аспарагиновой кислоты. Патент №RU 2174558 С1.2. M.K. Sinolitsky et al. A method for producing L-aspartic acid. Patent No.RU 2174558 C1.

3. М. Mukouyama, S. Komatsuzaki. Method for producing L-aspartic acid, Patent №US 6,214,589 B1, 2001.3. M. Mukouyama, S. Komatsuzaki. Method for producing L-aspartic acid, Patent No. US 6,214,589 B1, 2001.

4. Kirill A. Datsenko, Barry L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 97 (12), 6640, 20004. Kirill A. Datsenko, Barry L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 97 (12), 6640, 2000

5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.

Claims

1. A non-plasmid recombinant strain of Escherichia coli with constitutive aspartase activity and obtained by replacing the aspA gene promoter in the Escherichia coli strain MG1655 with the pG25 promoter of bacteriophage T5.

2. A method for synthesizing L-aspartic acid from ammonium fumarate using the recombinant strain of claim 1 as a biocatalyst in the form of either free or immobilized cells.