RU2546239C1 - RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST - Google Patents
RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST Download PDFInfo
- Publication number
- RU2546239C1 RU2546239C1 RU2013155234/10A RU2013155234A RU2546239C1 RU 2546239 C1 RU2546239 C1 RU 2546239C1 RU 2013155234/10 A RU2013155234/10 A RU 2013155234/10A RU 2013155234 A RU2013155234 A RU 2013155234A RU 2546239 C1 RU2546239 C1 RU 2546239C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- aspartic acid
- biocatalyst
- synthesis
- coli
- Prior art date
Links
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 33
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 29
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 title claims abstract description 29
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 101150007902 ASPA gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 6
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100378784 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aldA gene Proteins 0.000 description 3
- 101100057016 Talaromyces wortmannii astA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001744 Sodium fumarate Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940005573 sodium fumarate Drugs 0.000 description 2
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 102100032948 Aspartoacylase Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000797251 Homo sapiens Aspartoacylase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000947 motile cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- HKCPSLRXMHNTBX-DKWTVANSSA-M sodium;(2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HKCPSLRXMHNTBX-DKWTVANSSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E.coli с аспартазной активностью, а также способа синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.The claimed group of inventions relates to biotechnology and relates to a recombinant E. coli strain with aspartase activity, as well as a method for the synthesis of L-aspartic acid from ammonium fumarate using cells of this strain as a biocatalyst.
L-аспарагиновая кислота является широко востребованным органическим соединением, используемым, прежде всего, для синтеза искусственного подсластителя - аспартама, а также для изготовления лекарственных препаратов и кормовых добавок.L-aspartic acid is a widely used organic compound, used primarily for the synthesis of an artificial sweetener - aspartame, as well as for the manufacture of medicines and feed additives.
Основным способом получения L-аспарагиновой кислоты в настоящее время является биокаталитический синтез из фумаровой кислоты и аммония с помощью фермента аспартазы (аспартат-аммиак-лиазы).The main method for producing L-aspartic acid is currently biocatalytic synthesis from fumaric acid and ammonium using the aspartase enzyme (aspartate ammonia lyase).
Альтернативой этой технологии является химический синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака. Важнейшим недостатком химического способа является отсутствие стереоселективности и, как следствие, получение в результате синтеза смеси D и L-изомеров аспарагиновой кислоты, разделение которых является дорогостоящим процессом.An alternative to this technology is the chemical synthesis of aspartic acid from maleic acid and ammonia. The most important disadvantage of the chemical method is the lack of stereoselectivity and, as a result, the synthesis of a mixture of D and L-isomers of aspartic acid, the separation of which is an expensive process.
В качестве биокатализаторов L-аспарагиновой кислоты используются бактериальные штаммы разных видов, преимущественно бактерий E.coli, с аспартазной активностью в виде свободных или иммобилизованных клеток (1). Для повышения аспартазной активности штаммов используют широкий арсенал генетических методов, в том числе мутагенез (2) и клонирование гена аспартазы в составе плазмидных векторов (3). Однако во всех случаях для появления аспаратазной активности клетки выращивают в питательных средах с добавлением дорогостоящих индукторов синтеза аспаратазы.Bacterial strains of various species, mainly E.coli bacteria, with aspartase activity in the form of free or immobilized cells are used as biocatalysts of L-aspartic acid (1). To increase the aspartase activity of the strains, a wide arsenal of genetic methods is used, including mutagenesis (2) and aspartase gene cloning as part of plasmid vectors (3). However, in all cases, for the appearance of aspartase activity, cells are grown in nutrient media with the addition of expensive induction synthesis agents.
Известен способ биокаталитического синтеза L-аспарагиновой кислоты с помощью биокатализатора - клеток мутантного штамма E.coli ВКПМ 7188, обладающих аспартазной активностью (2). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности штамма. Кроме того, L-аспарагиновая кислота, получаемая с помощью этого способа, содержит до 5% яблочной кислоты - побочного продукта, снижающего качество аспарагиновой кислоты. Образование яблочной кислоты связано с присутствием в штамме фумаразной активности.A known method of biocatalytic synthesis of L-aspartic acid using a biocatalyst - cells of a mutant strain of E. coli VKPM 7188 with aspartase activity (2). The method is not effective enough due to the low aspartase activity of the strain. In addition, L-aspartic acid obtained using this method contains up to 5% malic acid, a by-product that reduces the quality of aspartic acid. The formation of malic acid is associated with the presence of fumarase activity in the strain.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют штамм E.coli PUaspE2 (3), содержащий ген аспаратазы в составе плазмидного вектора. Недостатком способа является сложность культивирования штамма, связанная с необходимостью вносить на определенной стадии роста дорогостоящий индуктор синтеза аспартазы изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ).Closest to the claimed method is a method for producing L-aspartic acid, in which the E. coli strain PUaspE2 (3) containing the asparatase gene in the plasmid vector is used as a biocatalyst. The disadvantage of this method is the complexity of the cultivation of the strain associated with the need to make at a certain stage of growth an expensive inducer of aspartase synthesis isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
Задача заявляемой группы изобретений - создание рекомбинантного штамма E.coli, синтезирующего аспартазу конститутивно, т.е. в отсутствие в среде индуктора, и разработка биокаталитического способа синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.The task of the claimed group of inventions is the creation of a recombinant E. coli strain synthesizing aspartase constitutively, i.e. in the absence of an inducer in the medium, and the development of a biocatalytic method for the synthesis of L-aspartic acid using cells of this strain as a biocatalyst.
Задача решена путем:The problem is solved by:
- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864, обладающего конститутивной аспартазной активностью, полученного путем введения в штамм E.coli ВКПМ 7188 плазмиды, содержащей ген aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032;- designing a recombinant strain of bacteria E. coli VKPM B-11864 with constitutive aspartase activity obtained by introducing into the E. coli strain VKPM 7188 a plasmid containing the aspA gene under the control of the pEftu promoter from Corynebacterium glutamicum ATCC13032;
- разработки способа синтеза L-аспарагиновой кислоты, с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864.- the development of a method for the synthesis of L-aspartic acid, using the inventive strain of bacteria E. coli VKPM B-11864 as a biocatalyst.
Заявляемый штамм Е.coli ВКПМ В-11864, содержащий плазмиду pAsp 161-3, с геном aspA, под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, обладает конститутивной аспартазной активностью и способностью синтезировать L-аспарагиновую кислоту. При смешивании водных растворов фумаровой кислоты и биокатализатора на основе клеток Е.coli ВКПМ В-11864 происходит синтез L-аспарагиновой кислоты.The inventive E. coli strain VKPM B-11864, containing the plasmid pAsp 161-3, with the aspA gene, under the control of the pEftu promoter from C. glutamicum ATCC13032, has constitutive aspartase activity and the ability to synthesize L-aspartic acid. When mixing aqueous solutions of fumaric acid and a biocatalyst based on E. coli cells VKPM B-11864, L-aspartic acid is synthesized.
Характеристика заявляемого штаммаCharacterization of the claimed strain
Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 является производным штамма Е.coli ВКПМ В-7188 (2) и обладает следующими морфологическими и культуральными свойствами. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными подвижными клетками, со слегка закругленными концами, размером 0,4-0,8×1-3 мкм. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, реакция с метиловым красным положительная. Культура отрицательна по признакам образования H2S и гидролиза мочевины. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах, например МПА и LB (4). Оптимальная температура роста 37°C, оптимальный pН 7,2. Колонии на плотных питательных средах (МПА, LB) (4) беловатые блестящие, размером 2-3 мм, края ровные, спор не образует. Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 дополнительно содержит маркер устойчивости к ампицилину.The strain of E. coli VKPM B-11864 is a derivative of the strain E. coli VKPM B-7188 (2) and has the following morphological and cultural properties. The culture is represented by gram-negative, optionally anaerobic rod-shaped motile cells, with slightly rounded ends, size 0.4-0.8 × 1-3 microns. The Voges-Proskauer reaction is negative, the reaction with methyl red is positive. The culture is negative for signs of H 2 S formation and urea hydrolysis. The strain is oxidase-negative, catalase-positive. Cells grow well on simple rich nutrient media, for example, MPA and LB (4). The optimum growth temperature is 37 ° C; the optimum pH is 7.2. Colonies on solid nutrient media (MPA, LB) (4) are whitish, shiny, 2-3 mm in size, the edges are even, do not form a spore. Strain E. coli VKPM B-11864 additionally contains a marker of resistance to ampicillin.
Получение биомассы заявляемого штаммаObtaining biomass of the claimed strain
Для получения биомассы клеток заявляемого штамма с аспартазной активностью штамм выращивают при 28-30°C в течение 12-15 часов на обычных для E.coli средах: полноценных (LB) либо синтетических, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или ацетат в концентрациях 0.1-1%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или дрожжевой экстракт в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C. To obtain the biomass of cells of the claimed strain with aspartase activity, the strain is grown at 28-30 ° C for 12-15 hours on normal E. coli media: high-grade (LB) or synthetic ones containing glucose or acetate at a concentration of 0.1- as a
Аспартазную активность штамма определяют по скорости синтеза L-аспарагиновой кислоты следующим образом: к 1 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляют 0,5 мл этой клеточной суспензии, предварительно активированных микробных клеток и инкубируют смесь 10 минут при 37°C. Количество L-аспарагиновой кислоты в образцах определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 510 нм. Активность клеток выражают в мкМ L-аспарагиновой кислоты, образующейся за 1 мин при 37°C.Aspartase activity of the strain is determined by the rate of synthesis of L-aspartic acid as follows: 0.5 ml of this cell suspension, previously activated microbial cells, are added to 1 ml of a 1 M solution of ammonium fumarate and the mixture is incubated for 10 minutes at 37 ° C. The amount of L-aspartic acid in the samples is determined spectrophotometrically at a wavelength of 510 nm. Cell activity is expressed in μM L-aspartic acid formed in 1 min at 37 ° C.
Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводят инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумарата аммония при 37°C в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для фумарата и аспартата.Activation of microbial cells before obtaining L-aspartic acid is carried out by incubating a suspension of cells in a 1M solution of ammonium fumarate at 37 ° C for 16-18 hours. The purpose of activation is to increase the permeability of the cell membrane for fumarate and aspartate.
Отличительная особенность заявляемого штамма, содержащего ген aspA в составе плазмиды под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, состоит в его способности синтезировать фермент аспартазу конститутивно, в отсутствие в среде индуктора (табл.1).A distinctive feature of the claimed strain containing the aspA gene in the plasmid under the control of the pEftu promoter from C. glutamicum ATCC13032 is its ability to synthesize the aspartase enzyme constitutively, in the absence of an inducer in the medium (Table 1).
При тех же условиях культивирования (среда LB) штамм E.coli PUaspE2 (ближайший аналог) обладает аспартазной активностью (17,5 мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток), сравнимой с активностью заявляемого штамма. Однако такой уровень активности штамма E.coli PUaspE2 наблюдают только при добавлении индуктора (ИПТГ) в среду культивирования (3).Under the same cultivation conditions (LB medium), the E. coli PUaspE2 strain (the closest analogue) has aspartase activity (17.5 μM aspartic acid / min mg cells), comparable with the activity of the claimed strain. However, this level of activity of the E. coli PUaspE2 strain is observed only when an inducer (IPTG) is added to the culture medium (3).
Способ в общем видеThe method in General
Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты осуществляют путем смешивания следующих водных растворов: фумарата аммония в концентрациях 1 М - 1,5 М (рН 8,0-8,5), содержащего 0,001М MgCl2 и суспензии биокатализатора в концентрациях 0,4-4 мг/мл в термостатируемом реакторе с системой перемешивания и последующей инкубации при температуре 30-37°C в течение 1-6 часов. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют биомассу клеток штамма Е.coli ВКПМ В-11864 в нативном или иммобилизованном виде. Содержание целевого продукта - L-аспарагиновой кислоты - определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).The inventive method for the synthesis of L-aspartic acid is carried out by mixing the following aqueous solutions: ammonium fumarate in concentrations of 1 M - 1.5 M (pH 8.0-8.5) containing 0.001 M MgCl 2 and a suspension of biocatalyst in concentrations of 0.4- 4 mg / ml in a thermostatic reactor with a stirring system and subsequent incubation at a temperature of 30-37 ° C for 1-6 hours. As a biocatalyst in the present method using the biomass of cells of the strain E. coli VKPM B-11864 in native or immobilized form. The content of the target product, L-aspartic acid, is determined by high performance liquid chromatography (HPLC).
Изобретение включает следующую иллюстрацию.The invention includes the following illustration.
Фиг 1. Структура плазмиды pAspl61-3.Fig 1. The structure of the plasmid pAspl61-3.
Amp - ген устойчивости к ампицилину; Asp - ген aspA; Prom - промоторная область р Eftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032; Rep - репликон.Amp - ampicillin resistance gene; Asp is the aspA gene; Prom is the promoter region p Eftu from Corynebacterium glutamicum ATCC13032; Rep is a replicon.
Пример 1. Конструирование плазмиды, содержащей ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium slutamicum АТСС13032Example 1. Construction of a plasmid containing the aspA aspartase gene under the control of the pEftu promoter from Corynebacterium slutamicum ATCC13032
Гибридную плазмиду, содержащую ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, получают путем встраивания фрагментов, содержащих ген aspA (1423 п.о. фрагмент) и промотор pEftu (239 п.о. фрагмент) в правильной ориентации по сайту Sma I в плазмиду pTZ19R, согласно общепринятым методикам (5). 1423 п.о. - фрагмент, содержащий ген aspA, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Escherichia coli ВКПМ В-7188 и праймеров AN226 (tttccatggcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgg), AN287 (gtggtggtgatggtgatggcctgctttgtaagccgggtgcatc), структура которых рассчитана на основе сиквенса U14003 (GeneBank). 239 п.о. - фрагмент, содержащий промотор pEftu, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и праймеров AN 253 (ggg teg acg ata tct ggc cgt tac cct gcg aat g) и AN269 (ctt cga tac gaa tgt tgt ttg аса ttg tat gtc etc ctg gac ttc), структура которых была рассчитана на основе сиквенса NC_006958(GeneBank).A hybrid plasmid containing the aspA aspartase gene under the control of the pEftu promoter is obtained by inserting fragments containing the aspA gene (1423 bp fragment) and the pEftu promoter (239 bp fragment) in the correct orientation at the Sma I site in plasmid pTZ19R, according to generally accepted methods (5). 1423 bp - a fragment containing the aspA gene was obtained by PCR using the Escherichia coli strain VKPM B-7188 and primers AN226 (tttccatggcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgg), AN287 (gtggtggtgatggtgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgct) 239 bp - a fragment containing the pEftu promoter was obtained by PCR using the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain and primers AN 253 (ggg teg acg ata tct ggc cgt tac cct gcg aat g) and AN269 (ctt cga ta gtg) as a template ttg asa ttg tat gtc etc ctg gac ttc), the structure of which was calculated based on the sequence NC_006958 (GeneBank).
Гибридную плазмиду правильной конструкции отбирают в клетках E.coli XL 1-Blue среди клонов, обладающих аспартазной активностью. Структуру плазмиды подтверждают секвенированием. Один из вариантов гибридной плазмиды, содержащий ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, обозначен как pAsp 161-3.The hybrid plasmid of the correct design is selected in E. coli XL 1-Blue cells among clones with aspartase activity. The structure of the plasmid is confirmed by sequencing. One embodiment of a hybrid plasmid containing the aspA aspartase gene under the control of the pEftu promoter is designated as pAsp 161-3.
Пример 2. Конструирование заявляемого штаммаExample 2. Construction of the inventive strain
Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-11864 получен путем введения ДНК плазмиды pAsp 161-3, изолированной из клеток E.coli XL1-Blue (pAspl61-3), в клетки Е. coli ВКПМ В-7188 с помощью электропорации. Среди трансформантов, выросших на среде LB с ампициллином, обнаружен клон, проявляющий максимальную аспартазную активность при культивировании в пробирках на среде следующего состава (г/л воды деионизированной): Na2HPO4∗12H2O - 15,0; KН2РО4 - 2,0; CH3COONa - 7; Дрожжевой экстракт - 20; MgSO4∗7H2O - 0,25; фумарат натрия - 3, pH - 6,5-7,0 (далее среда МФС). Этот клон депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В-11864.The inventive strain of Escherichia coli VKPM B-11864 was obtained by introducing DNA of the plasmid pAsp 161-3 isolated from E. coli XL1-Blue cells (pAspl61-3) into E. coli VKPM B-7188 cells by electroporation. Among the transformants grown on LB medium with ampicillin, a clone was found to exhibit maximum aspartase activity when cultured in test tubes in a medium of the following composition (g / l deionized water): Na 2 HPO 4 * 12H 2 O - 15.0; KH 2 PO 4 - 2.0; CH 3 COONa - 7; Yeast extract - 20; MgSO 4 * 7H 2 O - 0.25; sodium fumarate - 3, pH - 6.5-7.0 (hereinafter MFS). This clone was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) as Escherichia coli VKPM B-11864.
Пример 3. Наработка биомассы заявляемого штаммаExample 3. The accumulation of biomass of the inventive strain
Наработку биомассы Е.coli ВКПМ В-11864 осуществляют в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды МФС, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в которые вносят по 1 мл культуры, предварительно выращенной в пробирках на среде LB, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°C. Колбы культивируют 2 часа при 37°C, затем снижают температуру до 30°C и продолжают культивирование в течение 8 часов с постоянным перемешиванием. Затем биомассу штамма Е.coli ВКПМ В-11864 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C. Аспартазная активность клеток E.coli ВКПМ 11864 составляет 31 мкм аспарагиновой кислоты/мин/ мг клеток по сухой массе.The production of E. coli biomass VKPM B-11864 is carried out in 750 ml flasks containing 100 ml of MFS medium containing 100 mg / ml ampicillin, into which 1 ml of culture previously grown in test tubes on LB medium containing 100 mg / ml is added ampicillin overnight at 37 ° C. The flasks were cultured for 2 hours at 37 ° C, then the temperature was reduced to 30 ° C and cultivation was continued for 8 hours with constant stirring. Then the biomass of E. coli strain VKPM B-11864 is separated by centrifugation at 5 thousand rpm and stored at + 4 ° C. Aspartase activity of E. coli VKPM 11864 cells is 31 μm aspartic acid / min / mg cells by dry weight.
Пример 4. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием свободных клеток заявляемого штаммаExample 4. The synthesis of L-aspartic acid using free cells of the inventive strain
Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 100 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8), содержащего 0,001М MgCl2 и суспензии активированного биокатализатора в концентрации 0.4 мг/мл, полученного как указано в примере 3. Процесс проводят при 37°C в течение 4 час. Концентрацию L-аспарагиновой и яблочной кислот в реакционной смеси определяют с помощью ВЭЖХ. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 198 г/л, конверсия - 99%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.The synthesis of L-aspartic acid is carried out in a glass reactor with a volume of 100 ml by mixing the substrate - 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8) containing 0.001 M MgCl 2 and a suspension of activated biocatalyst in a concentration of 0.4 mg / ml obtained as described in example 3. The process is carried out at 37 ° C for 4 hours. The concentration of L-aspartic and malic acids in the reaction mixture was determined by HPLC. The concentration of L-aspartic acid in the obtained sample is 198 g / l, the conversion is 99%. The content of malic acid was 0.1%.
Пример 5. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток заявляемого штаммаExample 5. Synthesis of L-aspartic acid using immobilized cells of the inventive strain
Биомассу клеток штамма E.coli ВКПМ В-11864 в количестве 7 г, полученную как в примере 3, суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7,5. Смесь охлаждают до 5°C и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г N,N′-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5% водного раствора N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамина и 0,2 г 5% водного раствора персульфата аммония. Полученный гель измельчают, промывают деионизованной водой, затем 1,5М раствором фумарата аммония (pH 8). Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 200 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8) с 0,001М MgCl2 и 12,5 г гранул иммобилизованного биокатализатора. Процесс проводят при 37°C в течение 3 час. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 197 г/л, конверсия - 98,5%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.The biomass of cells of the E. coli strain VKPM B-11864 in an amount of 7 g, obtained as in example 3, is suspended in 27.3 g of a solution of sodium asparaginate with a concentration of 20%, pH 7.5. The mixture is cooled to 5 ° C and 6.15 g of acrylamide, 0.36 g of N, N′-methylene-bis-acrylamide, 1.0 g of 5% aqueous solution of N, N, N ′, N ′ are successively added to the cooled mixture. -tetramethylethylenediamine and 0.2 g of a 5% aqueous solution of ammonium persulfate. The resulting gel is ground, washed with deionized water, then with a 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8). The synthesis of L-aspartic acid is carried out in a glass reactor with a volume of 200 ml by mixing the substrate - 1.5 M solution of ammonium fumarate (pH 8) with 0.001 M MgCl 2 and 12.5 g of granules of immobilized biocatalyst. The process is carried out at 37 ° C for 3 hours. The concentration of L-aspartic acid in the obtained sample is 197 g / l, the conversion is 98.5%. The content of malic acid was 0.1%.
Таким образом, заявляемый штамм E.coli ВКПМ В-11864, по сравнению с ближайшим аналогом, обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет более высокой аспартазной активности этого биокатализатора и конститутивного синтеза аспартазы, что делает ненужным использование индуктора. Кроме того, заявляемый штамм обеспечивает снижение содержания в растворах L-аспарагиновой кислоты побочного продукта - яблочной кислоты.Thus, the claimed E. coli strain VKPM B-11864, in comparison with the closest analogue, provides more efficient production of L-aspartic acid due to the higher aspartase activity of this biocatalyst and constitutive synthesis of aspartase, which makes it unnecessary to use an inductor. In addition, the inventive strain reduces the content in solutions of L-aspartic acid of a by-product of malic acid.
Список источников информацииList of sources of information
1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.
2. RU 2174558.2. RU 2174558.
3. US 6,214,589.3. US 6,214,589.
4. Ф. Герхардт и др. Методы общей бактериологии в 3 т., Мир, 1984.4. F. Gerhardt and others. Methods of general bacteriology in 3 volumes, Mir, 1984.
5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, Т. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155234/10A RU2546239C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155234/10A RU2546239C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2546239C1 true RU2546239C1 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53295775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013155234/10A RU2546239C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2546239C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316273A (en) * | 2015-11-24 | 2016-02-10 | 南京工业大学 | L-aspartase recombinant escherichia coli without malic acid byproduct and construction method and application thereof |
| RU2620942C2 (en) * | 2015-11-16 | 2017-05-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst |
| WO2018160103A1 (en) * | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method for producing l-asparaginic acid |
| EA038585B1 (en) * | 2019-01-31 | 2021-09-17 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method to produce complex microelement fodder additives based on organic iron, manganese, zinc, copper and cobalt compounds |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6214589B1 (en) * | 1998-02-13 | 2001-04-10 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for producing L-aspartic acid |
| RU2174558C1 (en) * | 2000-12-07 | 2001-10-10 | Закрытое акционерное общество "Биоамид" | Method of l-aspartic acid producing |
| RU2497943C2 (en) * | 2010-07-15 | 2013-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | METHOD OF PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS USING BACTERIA OF FAMILY Enterobacteriaceae |
-
2013
- 2013-12-12 RU RU2013155234/10A patent/RU2546239C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6214589B1 (en) * | 1998-02-13 | 2001-04-10 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for producing L-aspartic acid |
| RU2174558C1 (en) * | 2000-12-07 | 2001-10-10 | Закрытое акционерное общество "Биоамид" | Method of l-aspartic acid producing |
| RU2497943C2 (en) * | 2010-07-15 | 2013-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | METHOD OF PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS USING BACTERIA OF FAMILY Enterobacteriaceae |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620942C2 (en) * | 2015-11-16 | 2017-05-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst |
| CN105316273A (en) * | 2015-11-24 | 2016-02-10 | 南京工业大学 | L-aspartase recombinant escherichia coli without malic acid byproduct and construction method and application thereof |
| CN105316273B (en) * | 2015-11-24 | 2019-08-30 | 南京工业大学 | A strain of L-aspartase recombinant Escherichia coli without malic acid by-product and its construction method and application |
| WO2018160103A1 (en) * | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method for producing l-asparaginic acid |
| EA035353B1 (en) * | 2017-02-28 | 2020-06-01 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method for producing l-asparaginic acid and recombinant escherichia coli aspartase producer strain |
| EA038585B1 (en) * | 2019-01-31 | 2021-09-17 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method to produce complex microelement fodder additives based on organic iron, manganese, zinc, copper and cobalt compounds |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1611241B1 (en) | Method for producing l-amino acid using bacteria having enhanced expression of the gene pcka | |
| US8518685B2 (en) | Engineered nitrile hydratase-producing bacterium with amidase gene knocked-out, the construction and the use thereof | |
| JP7475434B2 (en) | Use of transporter genes in Escherichia coli to improve L-tryptophan production efficiency | |
| CN105420154B (en) | Double-gene knockout recombinant rhodococcus, construction method and application thereof | |
| CN106434510B (en) | One plant of fermentation produces the genetic engineering bacterium of L-Aspartic acid | |
| RU2546239C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST | |
| CN114672525B (en) | Biosynthesis method and application of N-acetyl-5-methoxy tryptamine | |
| CN101186911B (en) | Construction method of nitrile hydratase gene engineering bacteria, gene engineering strain and application | |
| WO2022174597A1 (en) | Genetically engineered bacterium for producing l-sarcosine, construction method therefor and use thereof | |
| CN114854658A (en) | A method for enhancing the utilization of acetic acid and improving the fermentation production of L-arginine by Escherichia coli | |
| CN111057672B (en) | Recombinant strain and application thereof | |
| CN117866866A (en) | Recombinant escherichia coli for producing exendin by utilizing fumaric acid as well as construction method and application thereof | |
| CN113604413B (en) | A kind of recombinant bacterial strain and preparation method and application | |
| RU2620942C2 (en) | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst | |
| CN106010999A (en) | Gene engineering strain, culturing method and application of gene engineering strain | |
| CN101137743B (en) | Escherichia strain capable of converting XMP into GMP and keeping genes related to GMP degradation in an inactivated state and method of use thereof | |
| Cui et al. | Optimal culture condition for the production of phenyalanine ammonia lyase from E. coli | |
| RU2539033C1 (en) | RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST | |
| CN119161416B (en) | Genetically engineered bacterium for efficiently synthesizing tetrahydropyrimidine and construction method thereof | |
| CN115851691B (en) | Aspartate ammonia lyase mutant and its application | |
| RU2844007C2 (en) | Improved biocatalyst recombinant escherichia coli bacteria strain which synthesises nitrilase enzyme from achromobacter denitrificans | |
| EP4509612A1 (en) | Method for preparing s-lactoylglutathione | |
| CN110331121B (en) | A high-yielding lipopeptide recombinant bacteria and its application | |
| CN111334445B (en) | Long-chain dibasic acid producing strain and preparation method and application thereof | |
| CN116536292A (en) | Phosphogluconate dehydratase mutant and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |