RU2174558C1 - Method of l-aspartic acid producing - Google Patents
Method of l-aspartic acid producing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2174558C1 RU2174558C1 RU2000130575A RU2000130575A RU2174558C1 RU 2174558 C1 RU2174558 C1 RU 2174558C1 RU 2000130575 A RU2000130575 A RU 2000130575A RU 2000130575 A RU2000130575 A RU 2000130575A RU 2174558 C1 RU2174558 C1 RU 2174558C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- strain
- coli
- aspartic acid
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 23
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 33
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 5
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001744 Sodium fumarate Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940005573 sodium fumarate Drugs 0.000 description 2
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- PMVSDNDAUGGCCE-TYYBGVCCSA-L Ferrous fumarate Chemical compound [Fe+2].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O PMVSDNDAUGGCCE-TYYBGVCCSA-L 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- ZSQBOIUCEISYSW-GKHCUFPYSA-N Methyl alpha-D-glucofuranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@H]1O ZSQBOIUCEISYSW-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- -1 aspartate ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- HKCPSLRXMHNTBX-DKWTVANSSA-M sodium;(2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HKCPSLRXMHNTBX-DKWTVANSSA-M 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-аспарагиновой кислоты, применяемой в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. The invention relates to biotechnology and relates to a method for producing L-aspartic acid used in medicine, food and microbiological industries.
Известны способы получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью микроорганизмов рода Serratia (заявка EP 0111293, 1984), рода Escherichia (заявка EP 0110422, 1984), рода Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium и др. (заявка EP 0752476, 1997). Однако все эти способы являются многостадийными, достаточно трудоемкими, требуют специальных питательных сред для используемых штаммов. Known methods for producing L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate using microorganisms of the genus Serratia (application EP 0111293, 1984), the genus Escherichia (application EP 0110422, 1984), the genus Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium and others (application EP 0752476, 1997) . However, all these methods are multi-stage, rather laborious, require special nutrient media for the strains used.
Известен способ получения L-аспарагиновой кислоты с использованием штамма Escherichia coli 85 (авт. св-во СССР N 644833). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности используемого штамма. A known method of obtaining L-aspartic acid using a strain of Escherichia coli 85 (ed. St. USSR N 644833). The method is not effective enough due to the low aspartase activity of the used strain.
Наиболее близким к заявленному способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, предусматривающий обработку раствора фумарата аммония биокатализатором, на основе клеток Escherichia coli с последующим выделением L-аспарагиновой кислоты (авт. св-во СССР N 659611, C 12 P 13/20, 1979). В качестве биокатализатора в данном способе используют клетки одного из штаммов Escherichia coli 83 или АН 52, или 85, иммобилизованные включением в полиакриламидный гель. Процесс биотрансформации ведут, как правило, пропуская раствор фумарата аммония через колонку, заполненную частицами полиакриламидного геля с включенными в него клетками E. coli. Closest to the claimed method is a method for producing L-aspartic acid, comprising treating a solution of ammonium fumarate with a biocatalyst based on Escherichia coli cells, followed by isolation of L-aspartic acid (ed. USSR USSR N 659611, C 12 P 13/20, 1979 ) As a biocatalyst in this method, cells of one of the strains of Escherichia coli 83 or AN 52, or 85, immobilized by incorporation into a polyacrylamide gel are used. The biotransformation process is usually carried out by passing a solution of ammonium fumarate through a column filled with particles of a polyacrylamide gel with E. coli cells included in it.
Недостатками способа являются невысокая эффективность процесса культивирования клеток Е. coli, получения биокатализатора и как следствие низкая эффективность всего процесса получения L- аспарагиновой кислоты. The disadvantages of the method are the low efficiency of the process of culturing E. coli cells, obtaining a biocatalyst and, as a consequence, the low efficiency of the entire process for producing L-aspartic acid.
Это связано с тем, что используемые в способе штаммы Е.coli требуют для своего выращивания многокомпонентных сред, стоимость которых достаточно высока. Кроме того, к недостаткам штаммов Escherichia coli можно отнести следующее: аспартазная активность штамма достигает максимальных значений на ранних логарифмических стадиях роста (6-10 ч), когда урожай клеток низкий. На стационарной фазе роста, когда достигается максимальный урожай клеток, аспартазная активность быстро снижается. В присутствии в питательной среде глюкозы, как источника углерода, аспартазная активность бактерий снижается и как результат этого снижается эффективность процесса получения аспарагиновой кислоты. This is due to the fact that the E. coli strains used in the method require multicomponent media for their growth, the cost of which is quite high. In addition, the following can be attributed to the disadvantages of Escherichia coli strains: aspartase activity of the strain reaches its maximum values at the early logarithmic growth stages (6-10 h), when the cell yield is low. In the stationary phase of growth, when the maximum cell yield is reached, aspartase activity rapidly decreases. In the presence of glucose in the nutrient medium as a carbon source, the aspartase activity of bacteria decreases and, as a result, the efficiency of the process of producing aspartic acid decreases.
По этой причине при культивировании клеток E.coli приходится использовать большие объемы или осуществлять многократное воспроизведение клеток штамма-биотрансформатора. For this reason, when culturing E.coli cells, large volumes have to be used or multiple reproduction of cells of the biotransformer strain has to be performed.
Все вышеперечисленные факторы удорожают процесс и делают его неэффективным с точки зрения промышленного воспроизводства. All of the above factors increase the cost of the process and make it ineffective from the point of view of industrial reproduction.
Настоящее изобретение направлено на повышение эффективности процесса получения L-аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоемкости и удешевления процесса, связанного с применением более эффективного биокатализатора на основе нового штамма E.coli и особенностей культивирования штамма. The present invention is aimed at improving the efficiency of the process of obtaining L-aspartic acid by reducing the complexity and cost of the process associated with the use of a more effective biocatalyst based on a new E. coli strain and the cultivation features of the strain.
Технический результат заявленного способа заключается, в частности, в обеспечении более высокой аспартазной активности биокатализатора на основе клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188). The technical result of the claimed method consists, in particular, in providing a higher aspartase activity of a biocatalyst based on cells of E. coli strain 858 (VKPM B-7188).
Таким образом, предлагаемый способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе микробных клеток Escherichia coli с последующим выделением целевого продукта предусматривает использование в процессе биотрансформации биокатализатора на основе штамма Е.coli ВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту. Thus, the proposed method for producing L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate using a biocatalyst based on Escherichia coli microbial cells with subsequent isolation of the target product involves the use of a biocatalyst based on E. coli strain VKPM B-7188 grown on a nutrient medium in the biotransformation process containing acetic acid.
В качестве биокатализатора в предлагаемом способе может быть использована биомасса клеток штамма Е.coli ВКПМ В-7188 как в нативном, так и в иммобилизованном виде. При этом может быть использована биомасса клеток штамма ВКПМ В-7188, выращенного на среде с содержанием уксусной кислоты 0,0001 до 5%. As a biocatalyst in the proposed method, the biomass of cells of the E. coli strain VKPM B-7188 can be used both in native and in immobilized form. In this case, the biomass of cells of the VKPM B-7188 strain grown on a medium with an acetic acid content of 0.0001 to 5% can be used.
Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.
Характеристика используемого штамма E.coli 858 (ВКПМ В-7188). Characterization of the used strain E.coli 858 (VKPM B-7188).
Среди клонов Е.coli 85, образующих колонии на среде М9 с альфа-метил-D-глюкопиранозидом, 50 мМ (аналогом глюкозы) были выделены мутанты с высокой аспартазной активностью. Выделенные штаммы выращивали при 37oC в колбах с перемешиванием. Среда для культивирования - М9 с добавлением: аммония хлорида 3 г/л, глюкозы 10 г/л, кукурузного экстракта 5 г/л. В табл. 1 представлены сравнительные данные по активности для родительского и выделенных мутантных штаммов.Among the E. coli 85 clones forming colonies on M9 medium with alpha-methyl-D-glucopyranoside, 50 mM (glucose analogue), mutants with high aspartase activity were isolated. The isolated strains were grown at 37 ° C. in flasks with stirring. Cultivation medium - M9 with the addition of: ammonium chloride 3 g / l, glucose 10 g / l, corn extract 5 g / l. In the table. 1 shows comparative activity data for the parent and isolated mutant strains.
Используемый в способе штамм Е.coli 858 (ВКПМ В-7188) показал повышение аспартазной активности при включении в питательную среду уксусной кислоты (или ее солей). Причем это повышение активности наблюдалось как для культур в логарифмической, так и в стационарной фазе. The E. coli 858 strain (VKPM B-7188) used in the method showed an increase in aspartase activity when acetic acid (or its salts) was included in the nutrient medium. Moreover, this increase in activity was observed both for cultures in the logarithmic and in the stationary phase.
Способ получения стационарных культур с высокой аспартазной активностью и урожаем клеток осуществляли культивированием клеток Escherichia coli на среде следующего состава, г/л:
Na2HPO4•12H2O - 1.5
KH2PO4 - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl2 - 0.01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
В этих условиях штамм Е.coli 858 обладает высокой аспартазной активностью, которая достигает максимума на стационарной фазе роста (21 ч). Результаты культивирования используемого и исходного штаммов в колбах представлены в табл. 2.A method of obtaining stationary cultures with high aspartase activity and cell yield was carried out by culturing Escherichia coli cells on a medium of the following composition, g / l:
Na 2 HPO 4 • 12H 2 O - 1.5
KH 2 PO 4 - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl 2 - 0.01
Sodium Fumarate - 3
Ammonium Acetate - 5
Corn Extract - 5
Under these conditions, the strain E. coli 858 has a high aspartase activity, which reaches a maximum in the stationary phase of growth (21 h). The results of the cultivation of the used and initial strains in flasks are presented in table. 2.
Таким образом, использование уксусной кислоты вместо глюкозы в качестве источника углерода для выращивания штамма Е. coli 858 позволяет решить две важные проблемы - повысить аспартазную активность клеток и обеспечить достижение максимального уровня активности на стационарной фазе, когда клеточный урожай достигает максимальных значений. Вводимое в питательную среду количество уксусной кислоты (от 0,0001 до 5%) является оптимальным. Повышение концентрации свыше 5% не приводит к повышению урожайности клеток. Thus, the use of acetic acid instead of glucose as a carbon source for growing E. coli 858 strain allows solving two important problems - increasing the aspartase activity of cells and ensuring the achievement of the maximum level of activity in the stationary phase when the cell yield reaches maximum values. The amount of acetic acid introduced into the culture medium (from 0.0001 to 5%) is optimal. Increasing the concentration of more than 5% does not increase cell productivity.
Ниже приводятся примеры по получению клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188), являющегося биокатализатором процесса получения L-аспарагиновой кислоты, и примеры получения L-аспарагиновой кислоты с его использованием. The following are examples of the production of cells of E. coli strain 858 (VKPM B-7188), which is a biocatalyst for the process of producing L-aspartic acid, and examples of the preparation of L-aspartic acid using it.
Аспартазную активность определяли следующим образом: к 4 мл 1М раствора фумарата аммония прибавляли 1 мл суспензии предварительно активированных микробных клеток и инкубировали смесь при перемешивании один час при 37oC. Количество образовавшейся аспарагиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ. За единицу активности принято образование одного микромоля аспарагиновой кислоты за один час. Оптическую плотность клеточной суспензии определяли при длине волны 540 нм и оптическом пути 5 мм.Aspartase activity was determined as follows: 1 ml of a suspension of previously activated microbial cells was added to 4 ml of a 1M solution of ammonium fumarate and the mixture was incubated with stirring for one hour at 37 ° C. The amount of aspartic acid formed was determined by HPLC. The unit of activity is the formation of one micromole of aspartic acid in one hour. The optical density of the cell suspension was determined at a wavelength of 540 nm and an optical path of 5 mm.
Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводили инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумара аммония при 37oC в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионов фумарата и аспартата.Activation of microbial cells before obtaining L-aspartic acid was carried out by incubating a suspension of cells in a 1M solution of ammonium fumar at 37 ° C for 16-18 hours. The activation goal was to increase the permeability of the cell membrane for fumarate and aspartate ions.
Пример 1. Культивирование микроорганизмов. Example 1. The cultivation of microorganisms.
Односуточную культуру Escherichia coli 858 (ВКПМ-В-7188) смывают с поверхности МПА 1-2мл физиологического раствора и стерильно переносят в колбу Эрленмеера на 250 мл с жидкой питательной средой в объеме 50 мл следующего состава, г/л:
Na2HPO4•12H2О - 1.5
KH2PO4 - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl2 - 0-01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
pH 7.0. Культивирование ведут при 28-30oC на круговом встряхивателе в течение 16-20 ч. Посевной материал переносят в трехлитровый ферментер, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Условия культивирования: температура 29oC, аэрация 2 л/мин, перемешивание 500 об/мин, pH 7.9. Система автоматического поддержания pH осуществляет дозировку питательного раствора уксусной кислоты (70 г). Время культивирования 22-26 ч. Оптическая плотность К.Ж. на сливе 20 ед. (540 нм). Удельная аспартазная активность 148.0 Ед.акт. /ОП. Общая аспартазная активность 2960 Ед.акт./мл. Клетки отделяли центрифугированием и промывали физиологическим раствором. Количество собранных влажных клеток в виде пасты составило 104 г.A one-day culture of Escherichia coli 858 (VKPM-B-7188) is washed off the surface of MPA 1-2 ml of physiological solution and sterilely transferred to a 250 ml Erlenmeer flask with a liquid nutrient medium in a volume of 50 ml of the following composition, g / l:
Na 2 HPO 4 • 12H 2 O - 1.5
KH 2 PO 4 - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl 2 - 0-01
Sodium Fumarate - 3
Ammonium Acetate - 5
Corn Extract - 5
pH 7.0. Cultivation is carried out at 28-30 o C on a circular shaker for 16-20 hours. The seed is transferred to a three-liter fermenter containing 2 l of nutrient medium of the same composition. Cultivation conditions: temperature 29 o C, aeration 2 l / min, stirring 500 rpm, pH 7.9. The automatic pH maintenance system doses the acetic acid nutrient solution (70 g). The cultivation time is 22-26 hours. Optical density K.Zh. on the sink 20 units. (540 nm). Specific aspartase activity 148.0 / OP. Total aspartase activity 2960 Ed.act. / Ml. Cells were separated by centrifugation and washed with saline. The number of collected wet cells in the form of a paste was 104 g.
Пример 2. Получение аспарагиновой кислоты свободными клетками. Example 2. Obtaining aspartic acid free cells.
0.8 г пасты клеток, полученной в примере 1, разводят в 19 мл 1М раствора фумарата аммония. Полученная суспензия имеет оптическую плотность 15 ед. (540 нм). Данную суспензию помещают в термостат на 37oC на 17 ч.0.8 g of the cell paste obtained in example 1 was diluted in 19 ml of a 1M solution of ammonium fumarate. The resulting suspension has an optical density of 15 units. (540 nm). This suspension is placed in a thermostat at 37 o C for 17 hours
В реактор с рубашкой и мешалкой объемом 250 мл помещают 180 мл раствора фумарата аммония. В рубашку реактора непрерывно подают воду с температурой 37oC. При перемешивании добавляют суспензию активированных клеток. Реакцию трансформации ведут в течение 6 ч. Затем полученный раствор центрифугируют, отделяя микробные клетки, и к надосадочной жидкости при перемешивании добавляют 30%-ный раствор серной кислоты до достижения pH в растворе 2.9 ед. При этом выпадает обильный осадок аспарагиновой кислоты. Полученную суспензию охлаждают до 10oC, выдерживают 1 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 200 мл захоложенной воды и сушат при температуре 50oC до постоянного веса. Количество полученного продукта 21.4 г.180 ml of a solution of ammonium fumarate are placed in a reactor with a jacket and a stirrer of 250 ml. Water at a temperature of 37 ° C is continuously fed into the jacket of the reactor. A suspension of activated cells is added with stirring. The transformation reaction is carried out for 6 hours. Then, the resulting solution is centrifuged to separate microbial cells, and a 30% sulfuric acid solution is added to the supernatant with stirring until the pH in the solution reaches 2.9 units. In this case, an abundant precipitate of aspartic acid precipitates. The resulting suspension was cooled to 10 o C, incubated for 1 h. The precipitate was filtered off, washed with 200 ml of chilled water and dried at a temperature of 50 o C to constant weight. The amount of product obtained is 21.4 g.
Пример 3. Получение L-аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Е.coli 858. Example 3. Obtaining L-aspartic acid using immobilized in polyacrylamide gel cells of E. coli 858.
Биомассу клеток штамма Е.coli 858 из примера 1 в количестве 15 г суспензируют в 27.3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7.5 Смесь охлаждают до 5oC и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6.15 г акриламида, 0,36 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5%-ного водного раствора N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина и 0,2 свежеприготовленного 5%-ного водного раствора персульфата аммония.The biomass of cells of the strain E. coli 858 of Example 1 in an amount of 15 g is suspended in 27.3 g of a solution of sodium asparaginate with a concentration of 20%, pH 7.5. The mixture is cooled to 5 ° C and 6.15 g of acrylamide, 0.36 g N, are added successively to the cooled mixture. N'-methylene-bis-acrylamide, 1.0 g of a 5% aqueous solution of N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine and 0.2 freshly prepared 5% aqueous solution of ammonium persulfate.
Полученный гель измельчают, промывают сначала водой, потом 1,5 М раствором фумарата аммония. Гранулами геля заполняют термостатируемую при 30oC колонку и пропускают через нее 1,5 М раствор фумарата аммония, содержащий 0,0001 MgSO4, pH 8,5. Выделение L-аспарагиновой кислоты проводят как в примере 2. Из 1000 мл элюата получают 184 г кристаллической L-аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н. HCl[α]
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000130575A RU2174558C1 (en) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Method of l-aspartic acid producing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000130575A RU2174558C1 (en) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Method of l-aspartic acid producing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2174558C1 true RU2174558C1 (en) | 2001-10-10 |
Family
ID=20243048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000130575A RU2174558C1 (en) | 2000-12-07 | 2000-12-07 | Method of l-aspartic acid producing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2174558C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546239C1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST |
| RU2620942C2 (en) * | 2015-11-16 | 2017-05-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst |
| WO2018160103A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method for producing l-asparaginic acid |
| WO2020159399A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method of producing a complex micronutrient feed additive based on organic compounds of iron, manganese, zinc, copper and cobalt |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU644833A1 (en) * | 1976-11-26 | 1979-01-30 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В. Ломоносова | 85 escherichia coli strain as producer of l-aspartic acid |
| SU659611A1 (en) * | 1977-02-09 | 1979-04-30 | Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова | Method of obtaining l-aspartic acid |
| EP0752476A1 (en) * | 1994-12-09 | 1997-01-08 | Mitsubishi Chemical Corporation | Process for the production of l-aspartic acid |
| WO1997027312A1 (en) * | 1996-01-22 | 1997-07-31 | Amylum N.V. | Process for the preparation of aspartic acid |
| WO2000026938A1 (en) * | 1998-10-30 | 2000-05-11 | Applied Materials, Inc. | Apparatus for ion implantation |
-
2000
- 2000-12-07 RU RU2000130575A patent/RU2174558C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU644833A1 (en) * | 1976-11-26 | 1979-01-30 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В. Ломоносова | 85 escherichia coli strain as producer of l-aspartic acid |
| SU659611A1 (en) * | 1977-02-09 | 1979-04-30 | Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова | Method of obtaining l-aspartic acid |
| EP0752476A1 (en) * | 1994-12-09 | 1997-01-08 | Mitsubishi Chemical Corporation | Process for the production of l-aspartic acid |
| WO1997027312A1 (en) * | 1996-01-22 | 1997-07-31 | Amylum N.V. | Process for the preparation of aspartic acid |
| WO2000026938A1 (en) * | 1998-10-30 | 2000-05-11 | Applied Materials, Inc. | Apparatus for ion implantation |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546239C1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST |
| RU2620942C2 (en) * | 2015-11-16 | 2017-05-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst |
| WO2018160103A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method for producing l-asparaginic acid |
| WO2020159399A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Акционерное Общество "Биоамид" | Method of producing a complex micronutrient feed additive based on organic compounds of iron, manganese, zinc, copper and cobalt |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1259939A (en) | Production of isomaltulose | |
| CN107916283B (en) | A kind of production technology of niacinamide | |
| JPH0120871B2 (en) | ||
| CN109153966B (en) | Biotechnological method for producing acrylamide and related new strains | |
| WO2016123745A1 (en) | Immobilized cell and preparation method thereof | |
| JP3301140B2 (en) | Method for producing L-glutamic acid by fermentation method | |
| JPS62289A (en) | Enzymatic production of l-alpha-amino acid from alpha-ketoic acid | |
| CN116496950B (en) | A lysine-producing strain and its use, and a method for producing lysine | |
| RU2174558C1 (en) | Method of l-aspartic acid producing | |
| RU2546239C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST | |
| EP0107400A1 (en) | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid | |
| EP0110422A2 (en) | Process for producing L-aspartic acid | |
| CN117586999A (en) | New semi-continuous fermentation high-yield enzyme process | |
| RU2815972C1 (en) | Culture medium for culturing ureolytic bacteria | |
| RU2839899C1 (en) | Method of producing bacterial alginate | |
| Chibata | Production of useful chemicals using cells immobilized with polyacrylamide and carrageenan | |
| CN109312298B (en) | Thiamine miehei bacillus strain and application thereof | |
| JPH0634744B2 (en) | Method for producing γ-L-glutamyl-L-α-amino-n-butyrylglycine | |
| JPS6125359B2 (en) | ||
| EA047627B1 (en) | RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN WITH REDUCED FUMARASE ACTIVITY AND A METHOD FOR PRODUCING L-ASPARTIC ACID | |
| EA044598B1 (en) | BACTERIAL STRAIN Rhodococcus aetherivorans VKPM Ac-2208 - PRODUCER OF NITRILE HYDRATASE, METHOD FOR PRODUCING BIOCATALYST BASED ON CELLS OF Rhodococcus aetherivorans STRAIN VKPM Ac-2208 AND METHOD FOR PRODUCING ACRYLAMIDE | |
| KR0145011B1 (en) | L-Tryptophan-producing strains susceptible to L-arginine | |
| RU2620942C2 (en) | Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst | |
| RU2420581C1 (en) | Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity | |
| HK40019555A (en) | Method for producing and purification of gramicidin s |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | License on use of patent |
Effective date: 20080603 |
|
| QB4A | License on use of patent |
Effective date: 20080711 |
|
| QB4A | License on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20130710 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |