RU2699993C2 - Модифицированные нуклеотидные линкеры - Google Patents
Модифицированные нуклеотидные линкеры Download PDFInfo
- Publication number
- RU2699993C2 RU2699993C2 RU2017103539A RU2017103539A RU2699993C2 RU 2699993 C2 RU2699993 C2 RU 2699993C2 RU 2017103539 A RU2017103539 A RU 2017103539A RU 2017103539 A RU2017103539 A RU 2017103539A RU 2699993 C2 RU2699993 C2 RU 2699993C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- linker
- nucleotide
- group
- alkyl
- optionally substituted
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 94
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 40
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 40
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims abstract description 6
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 30
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 208000016057 CHAND syndrome Diseases 0.000 abstract 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 85
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 56
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 32
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 31
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical group 0.000 description 28
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 24
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 20
- -1 modified nucleotide phosphoramidites Chemical class 0.000 description 20
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 18
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 16
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 15
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 14
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 14
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 14
- 125000004474 heteroalkylene group Chemical group 0.000 description 13
- 125000001313 C5-C10 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 12
- 125000004737 (C1-C6) haloalkoxy group Chemical group 0.000 description 11
- 125000000171 (C1-C6) haloalkyl group Chemical group 0.000 description 11
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000004452 carbocyclyl group Chemical group 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 8
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000003601 C2-C6 alkynyl group Chemical group 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 7
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 6
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 6
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 6
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 5
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 125000006272 (C3-C7) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 125000003161 (C1-C6) alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUMPSJKFHVLVAY-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-[2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]ethyldisulfanyl]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCSSC(C)(C)C(O)=O FUMPSJKFHVLVAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006727 (C1-C6) alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006700 (C1-C6) alkylthio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006728 (C1-C6) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006716 (C1-C6) heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- DXBHBZVCASKNBY-UHFFFAOYSA-N 1,2-Benz(a)anthracene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=CC=C4C=C3C=CC2=C1 DXBHBZVCASKNBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical group CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 1-Heptene Chemical group CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004812 1-ethylethylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REWCOXFGNNRNJM-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-propan-1,1-diyl Chemical group [CH2]C([CH2+])=[CH-] REWCOXFGNNRNJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006201 3-phenylpropyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- JKTYGPATCNUWKN-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JKTYGPATCNUWKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000937413 Axia Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZKGNPQKYVKXMGJ-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O.CN(C)C(C)=O ZKGNPQKYVKXMGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 125000005631 S-sulfonamido group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002178 anthracenyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005110 aryl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003828 azulenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004196 benzothienyl group Chemical group S1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004541 benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- JMRYOSQOYJBDOI-UHFFFAOYSA-N dilithium;di(propan-2-yl)azanide Chemical compound [Li+].CC(C)[N-]C(C)C.CC(C)N([Li])C(C)C JMRYOSQOYJBDOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N dimethylmethylene Chemical group C[C]C IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N etoac etoac Chemical compound CCOC(C)=O.CCOC(C)=O OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011915 haggis Nutrition 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004475 heteroaralkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000904 isoindolyl group Chemical group C=1(NC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 1
- 125000003253 isopropoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(O*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- BCVXHSPFUWZLGQ-UHFFFAOYSA-N mecn acetonitrile Chemical compound CC#N.CC#N BCVXHSPFUWZLGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001326 naphthylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 125000004592 phthalazinyl group Chemical group C1(=NN=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- SNOOUWRIMMFWNE-UHFFFAOYSA-M sodium;6-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)amino]hexanoate Chemical compound [Na+].COC1=CC(C(=O)NCCCCCC([O-])=O)=CC(OC)=C1OC SNOOUWRIMMFWNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RLNWRDKVJSXXPP-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-[(2-bromoanilino)methyl]piperidine-1-carboxylate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCCCC1CNC1=CC=CC=C1Br RLNWRDKVJSXXPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical group C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 150000003712 vitamin E derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер А, который может быть использован в технологиях анализа нуклеиновых кислот, соответствующему формуле:,где линкер А имеет структуру формулы (I) или (II):(I),(II),каждый из Rи Rпредставляет собой метил, m представляет собой 0, n представляет собой 1; Rпредставляет собой-NH-C(=O)O-трет-бутил, Rпредставляет собой водород, Х представляет собой СНи p равен 2; или Rпредставляет собой-NH-C(=O)СН, Rпредставляет собой водород, Х представляет собой СНи p равен 2. Предложен новый модифицированный нуклеотид и набор на его основе для повышения эффективности нуклеотидной инкорпорации в секвенирования путем синтеза. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Некоторые варианты осуществления настоящей заявки относятся к новым нуклеозидным или нуклеотидным линкерам для увеличения инкорпорации нуклеотидов в последовательности ДНК и других диагностических применений, например, секвенирования путем синтеза.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Прогресс в исследовании молекул был достигнут, в частности, путем улучшения технологий, используемых для характеристики молекул или их биологических реакций. В частности, в исследовании нуклеиновых кислот ДНК и РНК были использованы развивающиеся технологии, используемые для анализа последовательностей и изучения событий гибридизации.
[0003] Примером технологий, которые позволили улучшить изучение нуклеиновых кислот, является разработка искусственно полученных чипов иммобилизованных нуклеиновых кислот. Эти чипы, как правило, имеют матрицу полинуклеотидов высокой плотности, иммобилизованную на подложке из твердого материала. См., например, Fodor с соавт., Trends Biotech. 12: 19-26, 1994, где описаны способы сборки различных нуклеиновых кислот с использованием химически сенсибилизированной стеклянной поверхности, защищенной маской, но подверженной воздействию в определенных областях, чтобы можно было прикрепить соответствующим образом модифицированные нуклеотидные фосфорамидиты. Искусственно полученные чипы также могут быть изготовлены с помощью метода "нанесения пятнами" известных полинуклеотидов на твердую подложку в заранее определенных положениях (например, Stimpson с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6379-6383, 1995).
[0004] Один из способов определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с чипом, называется "секвенированием путем синтеза" или "SBS". Этот метод для определения нуклеотидной последовательности ДНК в идеале требует контролируемой (т.е., последовательной) инкорпорации правильного комплементарного нуклеотида напротив секвенируемой нуклеиновой кислоты. Это позволяет точно определять последовательность путем добавления нуклеотидов в несколько циклов, как если бы каждый нуклеотидный остаток секвенировали по одному, тем самым предотвращая инкорпорацию неконтролируемого ряда нуклеотидов. Каждый инкорпорированный нуклеотид считывается с использованием соответствующей метки, присоединенной к нему, перед удалением фрагмента метки и последовательного следующего этапа секвенирования.
[0005] Соответственно, в контексте реакций секвенирования нуклеиновых кислот было бы желательно иметь возможность увеличить скорость нуклеотидноой инкорпорации во время секвенирования путем синтеза таким образом, чтобы эффективность метода секвенирования могла быть улучшена.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, относятся к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер, где указанный линкер содержит структуру формулы (I) или (II), или комбинацию обоих:
каждый из R1 и R2 независимо выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
R3 выбран из водорода, необязательно замещенного С1-6 алкила, -NR5-C(=O)R6 или -NR7-C(=O)-OR8;
R4 выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
каждый из R5 и R7 независимо выбран из водорода, необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-12 аралкила;
каждый из R6 и R8 независимо выбран из необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила, необязательно замещенного C7-12 аралкила, необязательно замещенного C3-7 циклоалкила или необязательно замещенного 5-10-членного гетероарила;
каждое из метиленовых повторяющихся звеньев в 
, 
или 
является необязательно замещенным;
Х выбран из метилена (СН2), кислорода (О) или серы (S);
m представляет собой целое число от 0 до 20;
n представляет собой целое число от 1 до 20; и
p представляет собой целое число от 1 до 20.
[0007] В некоторых вариантах осуществления меченный флюорофором нуклеозид или нуклеотид, содержащий структуру формулы (I), не имеет структуру:
[0008] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, относятся к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер, в котором указанный линкер содержит структуру формулы (III)
где L1 отсутствует или содержит линкер любой структуры, описанной в формуле (I) или (II), или защитный фрагмент, или их комбинации; L2 выбран из необязательно замещенного C1-20 алкилена, необязательно замещенного C1-20 гетероалкилена, необязательно замещенного C1-20 алкилена, прерванного замещенной ароматической группой, или необязательно замещенного C1-20 гетероалкилена, прерванного замещенной ароматической группой; L3 выбран из необязательно замещенного C1-20 алкилена или необязательно замещенного C1-20 гетероалкилена; RA выбран из водорода, циано, гидрокси, галогена, С1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкила, C1-6 галогеналкокси или азидо, и где, по меньшей мере, одно из повторяющихся звеньев 
содержит азидогруппу; Z выбран из кислорода (O) или NRB; каждый из RB и RC независимо выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила; и k представляет собой целое число от 1 до 50.
[0009] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, относятся к наборам, содержащим меченый нуклеозид или нуклеотид, содержащий линкер между флуорофором и нуклеозидом или нуклеотидом, где линкер содержит структуру любой из формул (I), (II) или (III), или их комбинации.
[0010] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, относятся к реагентам для модификации нуклеозида или нуклеотида, содержащего флуорофор и линкер, где линкер содержит структуру любой из формул (I), (II) или (III), или их комбинации.
[0011] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в данном описании, относятся к способам обнаружения нуклеозида, который был инкорпорирован в полинуклеотид, включающий: (а) инкорпорацию меченого нуклеозида или нуклеотида, содержащего линкер, в полинуклеотид; и (b) обнаружение флуоресцентного сигнала от указанного меченого нуклеозида или нуклеотида, который был инкорпорирован на стадии (а), где линкер содержит структуру любой из формул (I), (II) или (III), или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает: предоставление матричной нити нуклеиновой кислоты и частично гибридизированной нити нуклеиновой кислоты, где стадия (а) инкорпорирует в гибридизированную нить, по меньшей мере, один нуклеозид или нуклеотид, который комплементарен нуклеозиду или нуклеотиду в соответствующем положении матричной нити, и где стадия (b) идентифицирует основание инкорпорированного нуклеозида или нуклеотида, таким образом, указывая на идентичность комплементарного нуклеозида или нуклеотида матричной нити.
[0012] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, относятся к способам секвенирования молекулы матричной нуклеиновой кислоты, включающим: инкорпорацию одного или нескольких меченых нуклеотидов в цепь нуклеиновой кислоты, комплементарной матричной нуклеиновой кислоте; определение идентичности основания, присутствующего в одном или нескольких инкорпорированных меченых нуклеотидах для того, чтобы определить последовательность молекулы матричной нуклеиновой кислоты; где идентичность основания, присутствующего в одном или нескольких меченых нуклеотидах, определяют путем детектирования флуоресцентного сигнала, создаваемого указанными мечеными нуклеотидами; и где, по меньшей мере, один инкорпорированный меченый нуклеотид, содержащий линкер, является таким, как описано выше, где линкер содержит структуру любой из формул (I), (II) или (III), или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения идентичность основания, присутствующего в одном или нескольких нуклеотидах, определяют после каждой стадии инкорпорации нуклеотида.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013] Фиг. 1А иллюстрирует частичную структурную формулу связывающей группы стандартного меченого нуклеотида.
[0014] Фиг. 1В иллюстрирует меченый нуклеотид, показанный на фиг. 1А, с двумя возможными линкерами 125 и 130, которые вставлены в стандартную связывающую группу, показанную на фиг. 1A.
[0015] Фиг. 2 демонстрирует график скорости инкорпорации нуклеотида с использованием меченого нуклеотида, показанного на фиг. 1А, и модифицированных меченых нуклеотидов, показанных на фиг. 1B.
[0016] Фиг. 3А-3Е иллюстрируют структурные формулы дополнительных линкеров, которые вставлены в стандартную связывающую группу, показанную на фиг. 1А.
[0017] Фиг. 4 демонстрирует таблицу данных для хода секвенирования с применением двух красителей, используемого для оценки влияния вставки 125, показанной на фиг. 1В, и вставки 315, показанной на фиг. 3В, на качество секвенирования.
[0018] Фиг. 5A и 5B демонстрируют график частоты появления ошибок для считывания 1 и график частоты появления ошибок для считывания 2 хода секвенирования, показанного на фиг. 4, с использованием вставки линкеров 125 и 315.
[0019] Фиг. 6 демонстрирует таблицу данных для хода секвенирования, используемого для оценки влияния вставки 125, показанной на фиг. 1В, и вставки 310, показанной на фиг. 3А, на качестве секвенирования.
[0020] Фиг. 7А и 7В демонстрируют график частоты появления ошибок для считывания 1 и график частоты появления ошибок для считывания 2 хода секвенирования, показанного на фиг. 6, с использованием вставки линкера 125.
[0021] Фиг. 8А демонстрирует пример стандартной структуры линкера LN3.
[0022] Фиг. 8B, 8С и 8D демонстрируют три примера модифицированных структур линкера LN3, показанного на фиг. 8А.
[0023] Фиг. 8Е иллюстрирует вставку защитного фрагмента в линкер, показанный на фиг. 8D.
[0023А] Фиг. 9А представляет собой хроматограмму, демонстрирующую появление примеси в ffA с SS-линкером. Фиг. 9B представляет собой таблицу сравнения стабильности ffA с SS-диккерок и с AЕDI-линкером. Фиг. 9C представляет собой хроматограмму, демонстрирующую сравнение SS-линкера и AEDI-линкера ffA в IMX 60° в течение 22 часов, снова демонстрирующую примесь с SS-линкером.
[0023В] Фиг. 10А, 10В и 10С демонстрируют неожиданное увеличение скорости нуклеотидной инкорпорации в растворе с изменениями линкера. Фиг. 10А представляет собой график, демонстрирующий степень инкорпорации при 1 мкМ с Фиг. 10В, демонстрирующей табулированные результаты. Фиг. 10С схематически демонстрирует линкеры AEDI и SS с MR550S0.
[0023С] Фиг. 11A демонстрирует диаграммы разброса.санных для комбинаций V10 с различными A-550S0 (той же концентрации). Фиг. 11В демонстрирует линкеры Kcat ETA в растворе.
[0023D] Фиг. 12A и 12В демонстрируют метрики секвенирования на M111, Human550, 2×151 циклов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0024] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в данном документе, относятся к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорсфору через линкер, где линкер содержит структуру формулы (I) или (II), приведенных ниже, или комбинацию обоих, в которых определения переменных определены выше.
[0025] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (I) R1 представляет собой водород. В некоторых других вариантах осуществления R1 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых таких вариантах осуществления R1 представляет собой метил.
[0026] В любых вариантах осуществления R1, как он описан в данном документе для формулы (I), R2 представляет собой водород. В некоторых других вариантах осуществления R2 представляет собой необязательно замещенный С1-6 алкил. В некоторых таких вариантах осуществления R2 представляет собой метил. В одном варианте осуществления как R1, так и R2 представляют собой метил. В другом варианте осуществления как R1, так и R2 представляют собой водород.
[0027] в некоторых вариантах осуществления структуры формулы (I) m равно 0. В некоторых других вариантах осуществления m равно 1.
[0028] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (I) n равно 1.
[0029] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (I) структура формулы (I) может также быть представлена формулой (Ia) или (Ib):
[0030] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, формула (Ia) упоминается как "AEDI", и формула (Ib) упоминается как "SS".
[0031] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (II) R3 представляет собой водород. В некоторых других вариантах осуществления R3 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых таких вариантах осуществления R3 представляет собой метил. В некоторых вариантах осуществления R3 представляет собой -NR5-C(=O)R6. В некоторых таких вариантах осуществления R5 представляет собой водород. В некоторых таких вариантах осуществления R6 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил, например, метил. В некоторых вариантах осуществления R3 представляет собой -NR7-C(=O)OR8. В некоторых таких вариантах осуществления R7 представляет собой водород. В некоторых таких вариантах осуществления R8 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил, например, трет-бутил.
[0032] В любых вариантах осуществления R3, как он описан в данном документе для формулы (II), R4 представляет собой водород. В некоторых других вариантах осуществления R4 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкил. В некоторых таких вариантах осуществления R4 представляет собой метил. В одном варианте осуществления как R3, так и R4 представляют собой метил. В другом варианте осуществления как R3, так и R4 представляют собой водород. В одном варианте осуществления R3 представляет собой -NH(C=O)CH3, и R4 представляет собой водород. В другом варианте осуществления R3 представляет собой -NH(C=O)O-tBu (Вос), и R4 представляет собой водород.
[0033] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (II) Х представляет собой метилен, который может быть необязательно замещен. В другом варианте осуществления Х представляет собой кислород (О). В еще одном варианте осуществления Х представляет собой серу (S).
[0034] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (II) p равно 1. В некоторых других вариантах осуществления p равно 2.
[0035] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (II) структура формулы (II) также может быть представлена формулой (IIа), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или (IIf):
[0036] В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, формула (IIa) упоминается как "АСА", формула (IIb) упоминается как "AcLys", формула (IIc) упоминается как "BocLys", формула (IId) упоминается как "dMeO", формула (IIe) упоминается как "dMeS", и формула (IIf) упоминается как "DMP".
[0037] В любых вариантах осуществления нуклеозида или нуклеотида, меченного флуорофором через линкер, содержащий структуру формулы (I) или (II), как описано в настоящем документе, нуклеозид или нуклеотид может быть прикреплен к левой стороне линкера, либо непосредственно, либо через дополнительный связывающий фрагмент.
[0038] Некоторые варианты осуществления, раскрытые в данном документе, относятся к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер, причем указанный линкер содержит структуру формулы (III), и в котором определения переменных определены выше.
[0039] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) L1 отсутствует. В некоторых других вариантах осуществления L1 представляет собой линкер, описанный выше, содержащий структуру формулы (I) или (II), в частности формулы (Ia), (Ib), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или (IIf). В некоторых других вариантах осуществления L1 может представлять собой защитный фрагмент, содержащий молекулу, которая защищает от повреждения ДНК. В некоторых таких вариантах осуществления защитный фрагмент включает Тролокс, галловую кислоту, п-нитро-бензил (pNB) или аскорбат, или их комбинации.
[0040] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) L2 представляет собой необязательно замещенный С1-20 алкилен. В некоторых других вариантах осуществления L2 представляет собой необязательно замещенный C4-10 алкилен. В некоторых таких вариантах осуществления L2 представляет собой гептилен. В некоторых других вариантах осуществления L2 представляет собой необязательно замещенный C1-20 гетероалкилен. В некоторых таких вариантах осуществления необязательно замещенный C1-20 гетероалкилен содержит один или несколько атомов азота. В некоторых таких вариантах осуществления, по меньшей мере, один из атомов углерода C1-20 гетероалкилена замещен оксо (=O). В некоторых других вариантах осуществления L2 представляет собой необязательно замещенный C3-6 гетероалкилен. В некоторых вариантах осуществления L2 прерывается замещенной ароматической группой, такой как замещенная C6-10 арильная группа или 5-10-членная замещенная гетероарильная группа, содержащая от одного до трех гетероатомов. В некоторых таких вариантах осуществления L2 прерывается замещенным фенилом. В некоторых таких вариантах осуществления фенильная группа замещена одним или несколькими (до четырех) заместителями, выбранными из нитро, циано, галогена, гидрокси, C1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкила, C1-6 галогеналкокси или сульфонилгидроксида. В некоторых других таких вариантах осуществления фенильная группа замещена одним-четырьмя заместителями, выбранными из нитро, циано, галогена или сульфонилгидроксида (т.е. -S(=O)2OH).
[0041] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) RA в 
выбран из водорода или азидо. В некоторых таких вариантах осуществления k равно 2, при этом один RA представляет собой азидо, а другой - водород.
[0042] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) L3 представляет собой необязательно замещенный С1-20 алкилен. В некоторых других вариантах осуществления L3 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкилен. В некоторых таких вариантах осуществления L3 представляет собой этилен. В некоторых других вариантах осуществления L3 представляет собой необязательно замещенный C1-20 гетероалкилен. В некоторых таких вариантах осуществления необязательно замещенный C1-20 гетероалкилен содержит один или несколько атомов кислорода. В некоторых таких вариантах осуществления L1 представляет собой необязательно замещенный C1-6 алкиленоксид, например, C1-3 алкиленоксид.
[0043] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) RB представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления RC представляет собой водород. В некоторых других вариантах осуществления как RB, так и RC представляют собой водород.
[0044] В некоторых вариантах осуществления структуры формулы (III) структура формулы (III) может также быть представлена формулой (IIIa), (IIIb) или (IIIc):
где RD выбран из нитро, циано, галогена, гидрокси, C1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкила, C1-6 галогеналкокси или сульфонилгидроксида. В некоторых других вариантах осуществления RD выбран из нитро, циано, галогена или сульфонилгидроксида.
[0045] В любых вариантах осуществления нуклеозида или нуклеотида, меченного флуорофором через линкер, содержащий структуру формулы (III), как описано в настоящем документе, флуорофор может быть прикреплен к левой стороне линкера, либо непосредственно, либо через дополнительный связывающий фрагмент.
[0046] В любых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе в отношении линкера, содержащего структуру формулы (I), (II) или (III), когда термин "необязательно замещенный" используется для определения переменной, такая переменная может быть незамещенной.
Определения
[0047] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается рядовым специалистом в данной области техники. Использование термина "включая", а также других форм, таких как "включать", "включает" и "включено", не является ограничивающим. Использование термина "имеющий", а также других форм, таких как "иметь", "имеет" и "имел", не является ограничивающим. В контексте настоящего описания, независимо от того, в переходной фразе или в теле формулы изобретения, термины "содержит" и "содержащий" должны интерпретироваться как имеющие неограничивающее значение. То есть, вышеуказанные термины должны интерпретироваться в качестве синонима фразы "имеющие, по меньшей мере" или "включающие, по меньшей мере". Например, при использовании в контексте процесса, термин "включающий" означает, что процесс включает, по меньшей мере, перечисленные стадии, но может включать дополнительные стадии. При использовании в контексте соединения, композиции или устройства, термин "содержащий" означает, что соединение, композиция или устройство содержит, по меньшей мере, указанные признаки или компоненты, но может также содержать дополнительные признаки или компоненты.
[0048] Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описанный объект.
[0049] В данном описании общепринятые органические аббревиатуры определены следующим образом:
| Ac | ацетил |
| Ас2О | уксусный ангидрид |
| водн. | водный |
| Bn | бензил |
| Bz | бензоил |
| ВОС или Вос | трет-бутоксикарбонил |
| Bu | н-бутил |
| кат. | каталитический |
| °C | Температура в градусах по Цельсию |
| CHAPS | 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат |
| дАТФ | дезоксиаденозин трифосфат |
| дЦТФ | дезоксицитидин трифосфат |
| дГТФ | дезоксигуанозин трифосфат |
| дТТФ | дезокситимидин трифосфат |
| ддНТФ | дидеоксинуклеотид(ы) |
| ДХМ | метиленхлорид |
| ДМА | диметилацетамид |
| ДМАП | 4-диметиламинопиридин |
| ДМФА | N,N'-диметилформамид |
| ДМСО | Диметилсульфоксид |
| ДСК | N,N'-дисукцинимидилкарбонат |
| ЭДТА | этилендиаминтетрауксусная кислота |
| Et | этил |
| EtOAc | этилацетат |
| ffN | Полностью функционализированный нуклеотид |
| ffA | Полностью функционализированный аденозиновый нуклеотид |
| г | грамм(ы) |
| ГПХ | гель-проникающая хроматография |
| ч или час | час(ы) |
| основание Хюнига | N,N-диизопропилэтиламин |
| iPr | изопропиловый |
| KPi | 10 мМ калий-фосфатный буфер при рН 7,0 |
| ИПС | изопропиловый спирт |
| ЖХМС | жидкостная хроматомасс-спектрометрия |
| ЛДА | Литийдиизопропиламид |
| м или мин | минута(минуты) |
| MeCN | ацетонитрил |
| мл | миллилитр(ы) |
| ПЭГ | полиэтиленгликоль |
| PG | защитная группа |
| Ph | фенил |
| pNB | п-нитро-бензил |
| ppt | осадок |
| К.т. | комнатная температура |
| SBS | Секвенирование путем синтеза |
| -S(O)2OH | сульфонилгидроксид |
| ТЭА | триэтиламин |
| ТЭАБ | тетраэтиламмония бромид |
| ТФУК | трифторуксусная кислота |
| трет, t | третичный |
| ТГФ | тетрагидрофуран |
| ТСХ | тонкослойная хроматография |
| TSTU | O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний тетрафторборат |
| мкл | микролитр(ы) |
[0050] В контексте настоящего описания термин "чип" относится к совокупности различных тест-молекул, которые подсоединены к одному или нескольким субстратам, таким, что различные тест-молекулы можно отличить друг от друга в соответствии с относительным расположением. Чип может содержать различные тест-молекулы, то есть каждая расположена в другом адресуемом местоположении на субстрате. В качестве альтернативы или дополнительно чип может содержать отдельные субстраты, каждый из которых несет другую тест-молекулу, где различные тест-молекулы могут быть идентифицированы в соответствии с местоположениями субстратов на поверхности, к которой субстраты прикреплены, или в соответствии с местоположениями субстратов в жидкости. Примерные чипы, в которых отдельные субстраты расположены на поверхности, включают, но не ограничиваются ими, те, в том числе "гранулы в ячейках", что описаны, например, в патенте США №6,355,431 B1, US 2002/0102578 и публикации РСТ № WO 00/63437. Примерные форматы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, чтобы отличить гранулы в жидком чипе, например, с помощью микрожидкостного устройства, такого как клеточный сортер с возбуждением флуоресценции (FACS), описаны, например, в патенте США № 6,524,793. Дополнительные примеры чипов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, те, которые описаны в патентах США №№ 5,429,807; 5,436,327; 5,561,071; 5,583,211; 5,658,734; 5,837,858; 5,874,219; 5,919,523; 6,136,269; 6,287,768; 6,287,776; 6,288,220; 6,297,006; 6,291,193; 6,346,413; 6,416,949; 6,482,591; 6,5147,51 и 6610482; и WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287; и EP 799 897.
[0051] В контексте настоящего описания термин "ковалентно присоединенный" или "ковалентно связанный" относится к образованию химической связи, характеризующейся обобщением пары электронов между атомами. Например, ковалентно присоединенное полимерное покрытие относится к полимерному покрытию, которое образует химические связи с функционализированной поверхностью субстрата, по сравнению с прикреплением к поверхности с помощью других способов, например, адгезии или электростатического взаимодействия. Следует принять во внимание, что полимеры, которые присоединены ковалентно к поверхности, также могут быть присоединены с помощью способов в дополнение к ковалентному присоединению.
[0052] В контексте настоящего описания "с Са по Cb" или "Ca-b", где "а" и "b" представляют собой целые числа, относятся к числу атомов углерода в указанной группе. То есть, группа может содержать от "а" до "b", включительно, атомов углерода. Так, например, группа "с C1 по C4 алкил" или "C1-4 алкил" относится ко всем алкильным группам, имеющим от 1 до 4 атомов углерода, то есть, СН3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (СН3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(СН3)- и (СН3)3C-.
[0053] Термин "галоген" или "гало" в контексте настоящего описания означает любой из радиостабильных атомов в колонке 7 Периодической Таблицы Элементов, например, фтор, хлор, бром или йод, с фтором и хлором, являющимися предпочтительными.
[0054] В контексте настоящего описания "алкил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи, которая является полностью насыщенной (т.е. не содержит двойных или тройных связей). Алкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода (всякий раз, когда она появляется в данном документе, числовой диапазон, такой как "от 1 до 20" относится к каждому целому числу в заданном диапазоне; например, "от 1 до 20 атомов углерода" означает, что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода и т.д., вплоть до и включая 20 атомов углерода, хотя настоящее определение охватывает также случай употребления термина "алкил", где не обозначен числовой диапазон). Алкильная группа может быть также алкилом среднего размера, имеющим от 1 до 9 атомов углерода. Алкильная группа также может быть низшим алкилом, имеющим от 1 до 4 атомов углерода. Алкильная группа может быть обозначена как "С1-4 алкил" или подобными обозначениями. Только в качестве примера, "C1-4 алкил" указывает на то, что в алкильной цепи присутствует от одного до четырех атомов углерода, т.е. алкильная цепь выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Типичные алкильные группы включают, но никаким образом не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, гексил и тому подобное. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной.
[0055] В контексте настоящего описания термин "алкокси" относится к формуле -OR, где R представляет собой алкил, как определено выше, такой как "C1-9 алкокси", включающий, но не ограничивающийся ими, метокси, этокси, н-пропокси, 1-метилэтокси (изопропокси), н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси и тому подобное.
[0056] В контексте настоящего описания "гетероалкил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей один или несколько гетероатомов, то есть элементов, отличных от углерода, включая, но не ограничиваясь ими, азот, кислород и серу, в основной цепи. Гетероалкильная группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение охватывает также случаи употребления термина "гетероалкил", где не обозначен числовой диапазон. Гетероалкильная группа может также быть гетероалкилом среднего размера, имеющим от 1 до 9 атомов углерода. Гетероалкильная группа также может быть низшим гетероалкилом, имеющим от 1 до 4 атомов углерода. Гетероалкильная группа может быть обозначена как "С1-4 гетероалкил" или подобными обозначениями. Гетероалкильная группа может содержать один или несколько гетероатомов. Только в качестве примера, "C1-4 гетероалкил" указывает на то, что в гетероалкильной цепи присутствует от одного до четырех атомов углерода и дополнительно один или несколько гетероатомов в основной цепи.
[0057] В контексте настоящего описания "алкилен" означает разветвленную или неразветвленную цепь полностью насыщенной ди-радикальной химической группы, содержащей только углерод и водород, которая присоединена к остальной части молекулы через две точки присоединения (т.е., алкандиил). Алкиленовая группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение охватывает также случаи употребления термина алкилен, где не обозначен числовой диапазон. Алкиленовая группа может быть также алкиленом среднего размера, имеющим от 1 до 9 атомов углерода. Алкиленовая группа может быть также низшим алкиленом, имеющим от 1 до 4 атомов углерода. Алкиленовая группа может быть обозначена как "С1-4 алкилен" или подобными обозначениями. Только в качестве примера "C1-4 алкилен" указывает на то, что в алкиленовой цепи присутствует от одного до четырех атомов углерода, то есть алкиленовая цепь выбрана из группы, состоящей из метилена, этилена, этан-1,1-диила, пропилена, пропан-1,1-диила, пропан-2,2-диила, 1-метил-этилена, бутилена, бутан-1,1-диила, бутан-2,2-диила, 2-метил-пропан-1,1-диила, 1-метил-пропилена, 2-метил-пропилена, 1,1-диметил-этилена, 1,2-диметил-этилена и 1-этил-этилена. В контексте настоящего описания, когда алкилен прерывается ароматической группой, он относится к вставке ароматической группы внутри одной углерод-углеродной связи алкиленовой цепи через две точки прикрепления или к присоединению ароматической группы к одному концу алкиленовой цепи через одну точку прикрепления. Например, когда н-бутилен прерывается фенильной группой, примерные структуры включают 
, 
или 
.
[0058] В контексте настоящего описания термин "гетероалкилен" относится к алкиленовой цепи, в которой один или несколько скелетных атомов алкилена выбраны из атома, отличного от углерода, например, кислорода, азота, серы, фосфора или их комбинаций. Гетероалкиленовая цепь может иметь длину от 2 до 20000. Типичные гетероалкилены включают, но не ограничиваются ими, -OCH2, -OCH(CH3)-, -O-С(СН3)2-, -OCH2CH2-, -CH(CH3)O-, -CH2OCH2-, -CH2OCH2CH2-, -SCH2-, -SCH(CH3)-, -SC(СН3)2-, -SCH2CH2-, -CH2SCH2CH2-, -NHCH2-, -NHCH(СН3)-, -NHC(СН3)2-, -NHCH2CH2-, -CH2NHCH2-, -CH2NHCH2CH2- и тому подобное. В контексте настоящего описания, когда гетероалкилен прерывается ароматической группой, он относится к вставке ароматической группы внутри одной углерод-углеродной связи или связи углерод-гетероатом гетероалкиленовой цепи через две точки прикрепления или к присоединению ароматической группы к одному концу гетероалкиленовой цепи через одну точку прикрепления. Например, когда н-пропиленоксид прерывается фенильной группой, примерные структуры включают 
, 
или 
.
[0059] В контексте настоящего описания "алкенил" относится к алкильной группе, которая содержит в неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи одну или несколько двойных связей. Алкенильная группа может быть незамещенной или замещенной.
[0060] В контексте настоящего описания "алкинил" относится к алкильной группе, которая содержит в неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи одну или несколько тройных связей. Алкинильная группа может быть незамещенной или замещенной.
[0061] В контексте настоящего описания "циклоалкил" относится к полностью насыщенной (без двойных или тройных связей) моно- или мульти-циклической углеводородной кольцевой системе. Когда он состоит из двух или более колец, кольца могут быть соединены вместе в конденсированном виде. Циклоалкильные группы могут содержать от 3 до 10 атомов в кольце(кольцах). В некоторых вариантах осуществления циклоалкильные группы могут содержать от 3 до 8 атомов в кольце(кольцах). Циклоалкильная группа может быть незамещенной или замещенной. Типичные циклоалкильные группы включают, но никаким образом не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.
[0062] Термин "ароматический" относится к кольцу или кольцевой системе, имеющим сопряженную пи-электронную систему, и включает как карбоциклические ароматические (например, фенил), так и гетероциклические ароматические группы (например, пиридин). Термин включает моноциклические или конденсированные полициклические (т.е. кольца, которые имеют общие смежные пары атомов) группы при условии, что вся кольцевая система является ароматической.
[0063] В контексте настоящего описания "арил" относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. два или несколько конденсированных колец, которые имеют два общих смежных атома углерода), содержащим только углерод в каркасе кольца. Когда арил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в системе является ароматическим. Арильная группа может иметь от 6 до 18 атомов углерода, хотя настоящее определение охватывает также случай употребления термина "алкил", где не обозначен числовой диапазон. В некоторых вариантах осуществления арильная группа имеет от 6 до 10 атомов углерода. Арильная группа может быть обозначена как "C6-10 арил", "C6 или C10 арил" или подобными обозначениями. Примеры арильных групп включают, но не ограничиваются ими, фенил, нафтил, азуленил и антраценил.
[0064] Термин "аралкил" или "арилалкил" означает арильную группу, присоединенную, в качестве заместителя, через алкиленовую группу, например, "C7-14 аралкил" и тому подобное, в том числе, но не ограничиваясь ими, бензил, 2-фенилэтил, 3-фенилпропил и нафтилалкил. В некоторых случаях, алкиленовая группа представляет собой низшую алкиленовую группу (т.е., C1-4 алкиленовую группу).
[0065] В контексте настоящего описания "гетероарил" относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. два или несколько конденсированных колец, которые имеют два общих смежных атома углерода), которые содержат один или несколько гетероатомов, то есть элементов, отличных от углерода, в том числе, но не ограничиваясь ими, азот, кислород и серу, в каркасе кольца. Когда гетероарил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в системе является ароматическим. Гетероарил может иметь 5-18 кольцевых членов (то есть, число атомов, образующих каркас кольца, в том числе атомов углерода и гетероатомов), хотя настоящее определение охватывает также случай употребления термина "алкил", где не обозначен числовой диапазон. В некоторых вариантах осуществления, гетероарильная группа имеет от 5 до 10 членов в кольце или от 5 до 7 кольцевых членов. Гетероарильная группа может быть обозначена как "5-7-членный гетероарил", "5-10-членный гетероарил" или подобными обозначениями. Примеры гетероарильных колец включают, но не ограничиваются ими, фурил, тиенил, фталазинил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, триазолил, тиадиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, индолил, изоиндолил и бензотиенил.
[0066] "Гетероаралкил" или "гетероарилалкил" означает гетероарильную группу, присоединенную, в качестве заместителя, через алкиленовую группу. Примеры включают, но не ограничиваются ими, 2-тиенилметил, 3-тиенилметил, фурилметил, тиенилэтил, пирролилалкил, пиридилалкил, изоксазолилалкил и имидазолилалкил. В некоторых случаях алкиленовая группа представляет собой низшую алкиленовую группу (т.е., C1-4 алкиленовую группу).
[0067] В контексте настоящего описания "циклоалкил" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо или кольцевую систему. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
[0068] Группа "О-карбокси" относится к группе "-OC(=O)R", в которой R выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, С3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании.
[0069] Группа "С-карбокси" относится к группе "C(=O)OR", в которой R выбран из водорода, С1-6 алкила, С2-6 алкенила, С2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, C6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании. Не ограничивающий пример включает карбоксил (т.е. -C(=O)ОН).
[0070] Группа "циано" относится к группе "CN".
[0071] Группа "азидо" относится к группе "-N3".
[0072] Группа "O-карбамоил" относится к группе "-OC(=O)NRARB", в которой RA и RB каждый независимо выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании.
[0073] Группа "N-карбамоил" относится к группе "-N(RA)OC(=O)RB", в которой RA и RB каждый независимо выбран из водорода, С1-6 алкила, С2-6 алкенила, C2-6 алкинила, С3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании.
[0074] Группа "С-амидо" относится к группе "C(=O)NRARB", в которой RA и RB каждый независимо выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, C3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании.
[0075] Группа "N-амидо" относится к группе "-N(RA)C(=O)RB", в которой RA и RB каждый независимо выбран из водорода, С1-6 алкила, С2-6 алкенила, C2-6 алкинила, С3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании.
[0076] Группа "амино" относится к группе "-NRARB", в которой RA и RB каждый независимо выбран из водорода, C1-6 алкила, C2-6 алкенила, C2-6 алкинила, С3-7 карбоциклила, С6-10 арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном описании. Не ограничивающий пример включает свободный амино (т.е. -NH2).
[0077] В контексте настоящего описания термин "Тролокс" относится к 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоте.
[0078] В контексте настоящего описания термин "аскорбат" относится к соли аскорбиновой кислоты.
[0079] В контексте настоящего описания термин "галловая кислота" относится к 3,4,5-тригидроксибензойной кислоте.
[0080] В контексте настоящего описания, замещенную группу получают из незамещенной исходной группы, в которой происходит обмен одного или нескольких атомов водорода на другой атом или группу. Если не указано иное, когда группа считается "замещенной", это означает, что группа замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из C1-C6 алкила, C1-C6 алкенила, С1-С6 алкинила, С1-С6 гетероалкила, С3-С7 карбоциклила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и С1-С6 галогеналкокси), С3-С7 карбоциклилил-С1-С6-алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 5-10-членного гетероциклила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и С1-C6 галогеналкокси), 5-10-членного гетероциклил-С1-С6-алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, С1-С6-галогеналкилом и С1-С6 галогеналкокси), арила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), арил(С1-С6)алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 5-10-членного гетероарила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), 5-10-членного гетероарил(С1-С6)алкила (необязательно замещенного галогеном, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 галогеналкилом и C1-C6 галогеналкокси), галогена, циано, гидрокси, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкокси(С1-С6)алкила (т.е., простого эфира), арилокси, сульфгидрила (меркапто), галоген(С1-С6)алкила (например, -CF3), галоген(С1-С6)алкокси (например, -OCF3), C1-C6 алкилтио, арилтио, амино, амино(С1-С6)алкила, нитро, О-карбамила, N-карбамила, О-тиокарбамила, N-тиокарбамила, С-амидо, N-амидо, S-сульфонамидо, N-сульфонамидо, С-карбокси, О-карбокси, ацила, цианато, изоцианато, тиоцианато, изотиоцианато, сульфинила, сульфонила и оксо (=O). Везде, где группа описана как "необязательно замещенная", эта группа может быть замещена вышеуказанными заместителями.
[0081] Следует понимать, что некоторые соглашения о присвоении имен радикалам могут включать либо моно-радикал, либо ди-радикал, в зависимости от контекста. Например, когда заместителю требуется две точки присоединения к остальной части молекулы, следует понимать, что заместитель представляет собой ди-радикал. Например, заместитель, определенный как алкил, которому требуется две точки присоединения, включает ди-радикалы, такие как -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- и тому подобное. Аналогичным образом, группа, определенная как амино, которому требуется две точки присоединения, включает ди-радикалы, такие как -NH-, -N(СН3)- и тому подобное. Другие соглашения о присвоении имен радикалам четко указывают, что радикал представляет собой ди-радикал, такой как "алкилен" или "алкенилен".
[0082] Везде, где заместитель, изображен как ди-радикал (то есть, имеет две точки присоединения к остальной части молекулы), следует понимать, что заместитель может быть присоединен в любой направленной конфигурации, если не указано иное. Так, например, заместитель, изображенный как -AE- или 
включает заместитель, сориентированный таким образом, что А присоединен к крайней левой точке присоединения молекулы, а также случай, в котором А присоединен к крайней правой точке присоединения молекулы.
[0083] Когда соединения, раскрытые в данном описании, имеют, по меньшей мере, один стереоцентр, они могут существовать в виде отдельных энантиомеров и диастереомеров или в виде смеси таких изомеров, включая рацематы. Разделение индивидуальных изомеров или селективный синтез индивидуальных изомеров осуществляется путем применения различных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Если не указано иное, все такие изомеры и их смеси включены в объем соединений, раскрытых в настоящем документе.
[0084] В контексте настоящего описания "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и один или несколько фосфатных групп. Они являются мономерными звеньями последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, а в ДНК - дезоксирибозу, т.е. сахар, у которого отсутствует гидроксильная группа, которая присутствует в рибозе. Азотсодержащее гетероциклическое основание может представлять собой пуриновое или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G), а также их модифицированные производные или их аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U), а также их модифицированные производные или их аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина.
[0085] В контексте настоящего описания "нуклеозид" структурно подобен нуклеотиду, но отсутствуют фосфатные остатки. Примером нуклеозидного аналога будет тот, в котором метка связана с основанием, и никакая фосфатная группа не присоединена к молекуле сахара. Термин "нуклеозид" используется в данном описании в его обычном смысле, как он понимается специалистами в данной области техники. Примеры включают, но не ограничиваются ими, рибонуклеозид, содержащий фрагмент рибозы, и дезоксирибонуклеозид, содержащий фрагмент деоксирибозы. Модифицированный фрагмент пентозы представляет собой фрагмент пентозы, в котором атом кислорода был заменен на углерод, и/или углерод был заменен на атом серы или кислорода. "Нуклеозид" представляет собой мономер, который может иметь замещенное основание и/или остаток сахара. Кроме того, нуклеозид может быть инкорпорирован в более крупные ДНК- и/или РНК-полимеры и олигомеры.
[0086] В контексте настоящего описания термин "полинуклеотид" относится к нуклеиновым кислотам в целом, включая ДНК (например, геномную ДНК кДНК), РНК (например, мРНК), синтетические олигонуклеотиды и синтетические аналоги нуклеиновых кислот. Полинуклеотиды могут включать природные или неприродные основания, или их комбинации, и природные или неприродные связи остова, например, фосфоротиоаты, ПНК или 2'-O-метил-РНК, или их комбинации.
[0087] В контексте настоящего описания термин "фазирование" относится к явлениям в SBS, что обусловлено неполным удалением 3'-терминаторов и флуорофоров, а также невозможностью завершить инкорпорацию части нитей ДНК внутри кластеров посредством полимераз при заданном цикле секвенирования. Предварительное фазирование обусловлено инкорпорацией нуклеотидов без эффективных 3'-терминаторов, и событие инкорпорации идет на 1 цикл впереди. Фазирование и предварительное фазирование являются причиной того, что выведенные интенсивности для конкретного цикла состоят из сигнала текущего цикла, а также фона от предшествующих и последующих циклов. По мере увеличения числа циклов возрастает доля последовательностей в кластере, подвергшихся воздействию фазирования, что затрудняет идентификацию подходящего основания. Предварительное фазирование может быть вызвано присутствием следовых количеств незащищенных или деблокированных 3'-ОН-нуклеотидов в процессе секвенирования путем синтеза (SBS). Незащищенные 3'-ОН-нуклеотиды могут быть образованы в ходе производственных процессов или, возможно, в процессе хранения и обработки реагентов. Соответственно, модификации нуклеотидных аналогов или связывающих групп, которые приводят к более быстрому времени цикла SBS, более низким значениям фазирования и предварительного фазирования и большей длине считывания последовательности, обеспечивают большие преимущества в применениях SBS.
[0088] В контексте настоящего описания термин "защитный фрагмент" включает, но не ограничивается ими, молекулы, которые могут защитить от повреждений ДНК (например, фото-повреждения или других химических повреждений). Некоторые конкретные примеры включают антиоксиданты, такие как витамин C, производные витамина E, фенольная кислота, полифенолы и их производные и аналоги. Следует понимать, что в некоторых контекстах, где термин "защитный фрагмент" определен, он относится к фрагменту, полученному в результате реакции между одной или несколькими функциональными группами защитного фрагмента с соответствующей функциональной группой линкера, как описано в настоящем документе. Например, когда защитная часть представляет собой "галловую кислоту", он может относиться к амидам и сложным эфирам галловой кислоты, а не к самой галловой кислоте со свободной карбоксильной группой.
Детектируемые метки
[0089] Некоторые варианты осуществления, описанные в данном документе, относятся к использованию обычных детектируемых меток. Детектирование может быть осуществлено любым подходящим способом, в том числе флуоресцентной спектроскопией или другими оптическими средствами. Предпочтительная метка представляет собой флуорофор, которая после поглощения энергии, испускает излучение на определенной длине волны. Многие подходящие флуоресцентные метки известны. Например, Welch с соавт. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999) раскрывает данзил-функционализированные флуоресцентные фрагменты, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Zhu с соавт. (Cytometry 28:206-211, 1997) описывает использование флуоресцентных меток Cy3 и Cy5, которые также могут быть использованы в настоящем изобретении. Метки, пригодные для использования, также раскрыты в Prober с соавт. (Science 238:336-341, 1987); Connell с соавт. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge с соавт. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) и Smith с соавт. (Nature 321:674, 1986). Другие коммерчески доступные флуоресцентные метки включают, но не ограничиваются ими, флуоресцеин, родамин (в том числе, TMR техасский красный и Rox), адекса, бодипи, акридин, кумарин, пирен, бензантрацен и цианины.
[0090] Различные метки могут быть также использованы в настоящей заявке, например, бифлуорофорные FRET-кассеты Tet. Let. 46:8867-8871, 2000). Мультифлуорофорные дендримерные системы (J. Am. Chem. Soc. 123:8101-8108, 2001) также могут быть использованы. Несмотря на то, флуоресцентные метки являются предпочтительными, другие формы детектируемых меток будут очевидны для обычных специалистов в данной области техники в качестве пригодных. Например, микрочастицы, в том числе квантовые точки (Empodocles с соавт., Nature 399:126-130, 1999), наночастицы золота (Reichert с соавт.., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) и микрогранулы (Lacoste с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000), могут быть использованы.
[0091] Мультикомпонентные метки также могут быть использованы в настоящей заявке. Мультикомпонентной меткой является та, которая зависит от взаимодействия с дополнительным соединением для обнаружения. Наиболее распространенной мультикомпонентной меткой, используемой в биологии, является система биотин-стрептавидин. Биотин используют в качестве метки, прикрепленной к нуклеотиду. Стрептавидин затем добавляют отдельно, чтобы произошла активизация детектирования. Доступны другие многокомпонентные системы. Например, динитрофенол имеет коммерчески доступное флуоресцентное антитело, которое может быть использовано для детектирования.
[0092] Если не указано иное, то ссылка на нуклеотиды также предназначена для применения к нуклеозидам. Настоящая заявка также будет дополнительно описана со ссылкой на ДНК, хотя описание будет также применимо к РНК, ПНК и другим нуклеиновым кислотам, если не указано иное.
Способы секвенирования
[0093] В нуклеозиды или нуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть использованы в сочетании с различными методами секвенирования. В некоторых вариантах осуществления способ для определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени может быть автоматизированным процессом.
[0094] Нуклеотидные аналоги, представленные в данном описании, могут быть использованы в методике секвенирования, такой как методика секвенирования путем синтеза (SBS). Если кратко, то SBS может быть инициировано путем контактирования целевой нуклеиновой кислоты с одним или несколькими мечеными нуклеотидами, ДНК-полимеразой и т.д. Те признаки, когда праймер удлиняется с использованием нуклеиновой кислоты-мишени в качестве матрицы, будут включать меченый нуклеотид, который может быть обнаружен. Необязательно меченые нуклеотиды могут дополнительно включать обратимое свойство терминации, терминирующее дальнейшее удлинение праймера, как только нуклеотид был добавлен в качестве праймера. Например, аналог нуклеотида, имеющий фрагмент обратимого терминатора, может быть добавлен в качестве праймера таким образом, что последующее удлинение не может произойти до тех пор, пока не будет доставлен деблокирующий агент, чтобы удалить фрагмент. Таким образом, для вариантов осуществления, которые используют обратимую терминацию, деблокирующий агент может быть доставлен в проточную кювету (до или после того, как происходит детектирование). Промывания могут осуществляться между различными стадиями доставки. Затем цикл может быть повторен n раз, чтобы удлинить праймер посредством n нуклеотидов, тем самым определяя последовательность длины n. Примерные методики SBS, жидкостные системы и платформы детектирования, которые могут быть легко адаптированы для использования с чипом, полученным способами в соответствии с настоящим раскрытием, описаны, например, в Bentley с соавт., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; в патентах США №№ 7,057,026; 7,329,492; 7,211,414; 7,315,019 или 7,405,281, а также в заявке на патент США № публикации 2008/0108082 А1, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[0095] Другие методики секвенирования, использующие циклические реакции, могут быть использованы, например, пиросеквенирование. Пиросеквенирование обнаруживает высвобождение неорганического пирофосфата (PPi), так как отдельные нуклеотиды инкорпорированы в образующуюся цепь нуклеиновой кислоты (Ronaghi, с соавт., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi с соавт. Science 281(5375), 363 (1998); патенты США №№ 6,210,891; 6,258,568 и 6,274,320, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки). В пиросеквенировании высвобождающийся PPi может быть обнаружен путем преобразования в аденозинтрифосфат (АТФ) с помощью АТФ-сульфурилазы, и полученный в результате АТФ может быть обнаружен с помощью люцифераза-продуцируемых фотонов. Таким образом, реакцию секвенирования можно контролировать с помощью системы детектирования люминесценции. Источники возбуждения излучения, используемые для систем детектирования на основе флуоресценции, не являются необходимыми для методик пиросеквенирования. Пригодные жидкостные системы, детекторы и методики, которые могут быть использованы для применения пиросеквенирования к чипам в соответствии с настоящим раскрытием, описаны, например, в заявке на патент ВОИС с серийным № PCT/US11/57111, заявке на патент США № публикации 2005/0191698 А1, патенте США № 7,595,883 и патенте США № 7,244,559, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[0096] Реакции секвенирования путем лигирования также могут быть использованы в том числе, например, те, которые описаны в Shendure с соавт. Science 309:1728-1732 (2005); в патенте США № 5,599,675; и в патенте США № 5,750,341, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Некоторые варианты осуществления могут включать методики секвенирования путем гибридизации, как описано, например, в Bains с соавт., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac с соавт., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor с соавт., Science 251(4995), 767-773 (1995); и WO 1989/10977, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Как в методиках секвенирования путем лигирования, так и в методиках секвенирования путем гибридизации, нуклеиновые кислоты, которые присутствуют в гель-содержащих лунках (или других вогнутых объектах), подвергают многократным циклам доставки олигонуклеотида и детектирования. Жидкостные системы для способов SBS, изложенные в настоящем документе, или в ссылках, приведенных в настоящем документе, могут быть легко адаптированы для доставки реагентов для методик секвенирования путем лигирования или секвенирования путем гибридизации. Как правило, олигонуклеотиды являются флуоресцентно мечеными и могут быть обнаружены с помощью флуоресцентных детекторов, аналогичных тем, которые описаны в отношении методик SBS в настоящем документе или в ссылках, приведенных в настоящем документе.
[0097] Некоторые варианты осуществления могут использовать способы, включающие мониторинг в режиме реального времени активности ДНК-полимеразы. Например, инкорпорации нуклеотидов могут быть обнаружены с помощью взаимодействий резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между флуорофор-несущей полимеразой и γ-фосфат-меченых нуклеотидов, или с помощью волноводов zeromode. Методики и реагенты для секвенирования на основе FRET описаны, например, в Levene с соавт. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist с соавт. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach с соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), раскрытие которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
[0098] Некоторые варианты осуществления SBS включают обнаружение протона, высвобождаемого при инкорпорации нуклеотида в инсерционный продукт. Например, секвенирование, основанное на обнаружении высвобождаемых протонов, может использовать электрический детектор и связанные с ним методики, которые являются коммерчески доступными от Ion Torrent (Гилфорд, штат Коннектикут, дочерняя компания Technologies Life), или способы и системы секвенирования, описанные в заявке на патент США № публикаций 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; или 2010/0282617 А1, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
Примерные модифицированные линкеры
[0099] Дополнительные варианты осуществления раскрыты более подробно в следующих примерах, которые ни в коей мере не предназначены для ограничения объема притязаний.
[0100] Фиг. 1А иллюстрирует частичную структурную формулу меченого нуклеотида 100. Меченый нуклеотид 100 включает полностью функционализированный аденозиновый нуклеотид (ffA) 110, стандартный линкерный фрагмент 115 и флуоресцентный краситель 120. Стандартный линкерный фрагмент 115 может представлять собой линкерный фрагмент, обычно используемый в синтезе меченых нуклеотидов для секвенирования путем синтеза (SBS). В одном примере флуоресцентный краситель 120 представляет собой NR550S0. В этом примере меченый нуклеотид 100 может быть описан как "ffA-NR550S0". В другом примере флуоресцентный краситель 120 представляет собой SO7181, и меченый нуклеотид 100 может быть описан как "FFA-SO7181".
[0101] Фиг. 1В иллюстрирует меченый нуклеотид 100, показанный на фиг. 1А, с двумя возможными структурными модификациями в стандартном линкерном фрагменте 115. В одном примере стандартный линкерный фрагмент 115 включает вставку AEDI 125 между карбонильной (то есть, -C(=O)-) и амино- (т.е. -NH-) частью амидного фрагмента. В этом примере модифицированный меченый нуклеотид может быть описан как "ffA-AEDI-NR550S0". В другом примере стандартный линкерный фрагмент 115 включает вставку SS 130, и модифицированный меченый нуклеотид может быть обозначен как "ffA-SS-NR550S0".
[0102] Фиг. 2 демонстрирует график скорости инкорпорации нуклеотида с использованием меченого нуклеотида, показанного на фиг. 1А, и модифицированных меченых нуклеотидов, показанных на фиг. 1B. Анализ проводили при 55°С, в 40мМ этаноламине (рН 9,8), 9 мМ MgCl, 40 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,2% CHAPS, с 20нМ праймером: матричная ДНК и 30мкг/мл полимеразы 812 (MiSeq Kit V2), 1 мМ нуклеотид. Фермент связывается с ДНК и затем быстро смешивается с нуклеотидом в модуле гашения потока в течение короткого промежутка времени (до 10 секунд) перед гашением с помощью 500 мМ ЭДТА. Берут несколько временных точек для каждого нуклеотида. Полученные образцы затем анализируют на денатурирующем геле, и процент ДНК, преобразованного в ДНК+1, определяют и наносят на график в зависимости от времени, чтобы определить константу скорости первого порядка для каждого нуклеотида. Данные приведены ниже в таблице 1. Данные показывают, что скорость инкорпорации для меченого нуклеотида, содержащего вставку SS 130 (ffA-SS-NR550S0), была приблизительно в 2 раза быстрее по сравнению со скоростью инкорпорации для меченого нуклеотида, содержащего стандартный линкер 115 (ffA-NR550S0). Скорость инкорпорации для меченого нуклеотида, содержащего вставку AEDI 125 (ffA-AEDI-NR550S0), была приблизительно в 4 раза быстрее по сравнению со скоростью инкорпорации ffA-NR550S0. Данные также показывают, что скорость инкорпорации для меченого нуклеотида, содержащего стандартный линкер 115 и флуоресцентный краситель SO7181 (ffA-SO7181), была приблизительно в 4 раза быстрее по сравнению со скоростью инкорпорации ffA-NR550S0.
| Таблица 1. | |
| ffA | K (мкM/мин) |
| ffA-NR550S0 | 22 (1×) |
| ffA-SS-NR550S0 | 54 (2×) |
| ffA-AEDI-NR550S0 | 97 (4×) |
| ffA-SO7181 | 99 (4×) |
[0103] Фиг. 3А-3F иллюстрируют структурные формулы дополнительных вставок 310, 315, 320, 325, 330 и 335 для стандартного линкерного фрагмента 115, показанного на фиг. 1A. Во вставке ACA 310 диметиловые замещения удаляют, и связь сера-сера (SS) заменяют углерод-углеродной связью по сравнению со вставкой 125. Связь сера-сера не является необходимой для SBS (например, SBS с применением 2 красителей или 4 красителей).
[0104] Во вставке AcLys 315, ацетил-защищенный лизин используют для замены вставки 125.
[0105] Во вставке BocLys 320, трет-бутоксикарбонил-защищенный лизин используют для замены вставки 125.
[0106] Во вставке dMeO 325, связь сера-сера (S-S) заменяют связью кислород-углерод (O-CH2) по сравнению со вставкой 125.
[0107] Во вставке dMeS 330, связь сера-сера (S-S) заменяют связью сера-углерод (S-CH2) по сравнению со вставкой 125.
[0108] Во вставке DMP 335, связь сера-сера (S-S) заменяют связью сера-углерод (CH2) по сравнению со вставкой 125.
[0109] В различных примерах, описанных в настоящем документе, вставки, включая тип с диметил-замещением (например, вставка AEDI 125, вставка dMeO 325 и вставка dMeS 330), как было установлено, увеличивали скорость нуклеотидной инкорпорации в процессе SBS.
[0110] В различных примерах, описанных в настоящем документе, длина углеродных цепей во вставках также может быть изменена.
[0111] Фиг. 4 демонстрирует таблицу данных для хода секвенирования с применением двух красителей, используемого для оценки влияния вставки AEDI 125, показанной на фиг. 1B, и вставки AcLys 315, показанной на фиг. 3B, на качество секвенирования. Секвенирование проводили на гибридной платформе Miseq с помощью матрицы Human 550bp и 2 раза по 150 циклов. Новый набор красителей, V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0, V10/циан-пэг4 A-AcLys550S0 и V10/циан A-AcLys 550S0, сравнивали со стандартным коммерческим набором красителей V4 и улучшенным набором красителей платформы Nova V5.75. Для каждого из образцов V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0, V10/циан-пэг4 A-AcLys550S0 и V10/циан A-AcLys 550S0 значение фазирования (Ph R1) было ниже, чем значения фазирования образцов без вставок AEDI или AcLys. Таким образом, меченые нуклеотиды, содержащие дополнительные вставки 125 и 315, продемонстрировали улучшение качества секвенирования.
[0112] Фиг. 5А и 5В демонстрируют график частоты появления ошибок для считывания 1 и график частоты появления ошибок для считывания 2 хода секвенирования, показанного на фиг. 4, соответственно. Для считывания 1 частота появления ошибок V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0 и V10/циан-пэг4 А-AcLys550S0 была ниже, чем того же набора красителей V10/циан-пэг4 без вставки. Для считывания 2 она становится еще более очевидной, когда используется вставка AcLys 315, где конечная частота появления ошибок была снижена на 30% по сравнению с набором красителей без вставки. Таким образом, вставки 125 и 315, как было доказано, значительно улучшают качество секвенирования.
[0113] Фиг. 6 демонстрирует таблицу данных для хода секвенирования, используемого для оценки влияния вставки AEDI 125 и вставки ACA 310 на качество секвенирования. Секвенирование проводили на гибридной платформе Miseq с матрицей Human 550bp и 2 раза по 150 циклов. Новый набор красителей, V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0, V10/циан-пэг4 A-ACALys550S0, сравнивали со стандартным коммерческим набором красителей V4 и улучшенным набором красителей платформы Nova V5.75. Опять же, каждый из образцов V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0 и V10/циан-пэг4 А-ACA550S0 имеет более низкое значение фазирования (Ph R1) по сравнению с образцами без вставок AEDI или ACA, и, таким образом, продемонстрировал улучшение качества секвенирования.
[0114] Фиг. 7A и 7B демонстрируют график частоты появления ошибок для считывания 1 и график частоты появления ошибок для считывания 2 хода секвенирования, показанного на фиг. 6, соответственно. Частота появления ошибок для считывания 1 для набора, содержащего новую вставку AEDI (V10/циан-пэг4 A-AEDI550S0), была ниже, чем того же набора красителей без вставки, V10/циан-пэг4. Вставка ACA (V10/циан-пэг4 ACA550S0) дала график частоты появления ошибок в обоих считываниях аналогичный стандартному V10/циан-пэг4. AEDI снова показала улучшение качества секвенирования. Эти данные также показали, что сама структура вставки оказывает влияние на улучшение качества секвенирования.
[0115] Фиг. 8А демонстрирует структурную формулу стандартного линкера LN3 800. Линкер LN3 800 включает первый замещенный амидо-функциональный фрагмент 810, второй азидо-замещенный ПЭГ-функциональный фрагмент 815 и третий сложноэфирный функциональный фрагмент 820, который может быть необходим в структуре линкера для связывания молекулы красителя 825 с нуклеотидом 830. Первый функциональный фрагмент 810 может, например, использоваться для присоединения молекулы красителя 825 к линкеру LN3 800. Второй функциональный фрагмент 815 может, например, быть расщепляемой функциональной группой, которая может использоваться для отщепления молекулы красителя 825 от линкера LN3 800. Третий функциональный фрагмент 820 может, например, использоваться для присоединения нуклеотида 830 к линкеру LN3 800. Фиг. 8B иллюстрирует определенную модификацию стандартного линкера LN3, где фенокси-фрагмент 850 замещен одним-четырьмя заместителями, выбранными из -NO2, -CN, галогена или -SO3H. Кроме того, сложноэфирный фрагмент 820 заменен амидным фрагментом 855.
[0115A] Фиг. 9А представляет собой график, показывающий появление примеси в ffA с SS-линкером. С ffA-SS-NR550S0 после очистки ВЭЖХ: примеси появились в течение ночи в слабощелочных условиях (pH8-9). К.т. в течение ночи в 0,1М ТЭАБ/CH3CN. Фиг. 9В сравнивает стабильность ffA с SS-линкером и AEDI-линкером, с AEDI-линкером демонстрирует значительно улучшенную стабильность
по сравнению с SS-линкерами. ffA-LN3-NR550S0 использовали в качестве внутреннего стандарта. Побочный дисульфидный продукт: (NR550S0 -S-)2. Фиг. 9С демонстрирует сравнение ffA с SS-линкером и AEDI-линкером в IMX 60° в течение 22 часов, снова показывая примесь с SS-линкером. Внутренним контролем является ffA-LN3-NR550S0. Ди-Р: дифосфат.
[0115B] Фиг. 10А, 10В и 10C демонстрируют неожиданное увеличение скорости нуклеотидной инкорпорации в растворе с изменениями линкера. Фиг. 10А демонстрирует скорость инкорпорации при 1 мкМ. Результаты показывают, что краситель и линкер оказывали значительное влияние на кинетику инкорпорации с таблицей 10B, ясно показывающей преимущество AEDI-линкера в кинетике инкорпорации. Фиг. 10C схематически демонстрирует линкеры AEDI и SS с NR550S0.
[0115C] Фиг. 11А демонстрирует диаграммы разброса данных для комбинаций V10 с различными А-550S0 (той же концентрации). Диаграммы разброса данных для цикла 2 тайла 1. Фиг. 11B демонстрирует линкеры Kcat FFA в растворе. Можно видеть, что на поверхности с точки зрения скорости инкорпорации AEDI-линкер быстрее, чем в отсутствие линкера: 'А'-облако (на диаграмме разброса данных) слегка движется в сторону центра. AcLys-линкер медленнее, чем AEDI и в отсутствие линкера: 'А'-облако движется в направлении оси х. BocLys-линкер похож на отсутствие линкера и не далеко от AEDI-линкера. В растворе можно видеть, что ACA-линкер был самым медленным, в то время как AEDI и ACLys имеют сходный Kcat, за ними следует BocLys.
[0115D] Фиг. 12А и 12B демонстрируют метрики секвенирования на M111, Human550, 2×151 циклов. Использование ffN в сочетании с различными А-550S0 (той же концентрации). Можно видеть, что как линкер AEDI, так и линкер BocLys дали сходные хорошие результаты секвенирования. Хотя Kcat раствора AEDI и AcLys похожи, результат секвенирования AEDI немного лучше.
[0116] Линкер LN3 800 включает дополнительный фенокси-фрагмент 835, который может быть удален из линкера LN3 800, как показано на фиг. 8C. Линкер LN3 800 также включает дополнительный амидо-фрагмент 840 и необязательный сложноэфирный фрагмент 845, оба из которых могут быть удалены из линкера LN3 800, как показано на фиг. 8D. Целью для удаления определенных функциональных групп, подобно амидному фрагменту 810, фенокси-фрагменту 835, является проверка того, имеют ли они негативные взаимодействия с ферментом во время нуклеотидной инкорпорации, что может снизить эффективность инкорпорации.
[0117] Фиг. 8E иллюстрирует вставку или добавление защитного фрагмента 860 в линкер. Защитный фрагмент 860 вставляют между функциональным фрагментом 810 (или может быть присоединен к фенокси-фрагменту 835 или 850 на фиг. 8A-8C) и молекулой красителя 825. Защитный фрагмент 860 может, например, представлять собой молекулу, которая защищает от повреждения ДНК. Повреждение ДНК, включая фото-повреждения или другие химические повреждения, является одним из кумулятивных эффектов (то есть, цикл за циклом) SBS. Существенное снижение или устранение повреждений ДНК может обеспечить более эффективное SBS и более долгие считывания секвенирования. В некоторых вариантах осуществления защитный фрагмент 860 может быть выбран из гасителя триплетного состояния, такого как Тролокс, галловая кислота, 2-меркаптоэтанол (BME) и т.д. В некоторых других вариантах осуществления защитный фрагмент 860 может быть выбран из реагента для гашения или защитного реагента, такого как 4-нитробензиловый спирт или соль аскорбиновой кислоты, такая как аскорбат натрия. В некоторых других вариантах осуществления защитный агент может быть физически примешан в буфер, а не образует ковалентные связи с меченым нуклеозидом или нуклеотидом. Тем не менее, этот подход может потребовать более высокую концентрацию защитного агента и может быть менее эффективным. В качестве альтернативы, защитный фрагмент, ковалентно присоединенный к нуклеозидам или нуклеотидам, может обеспечить лучшую защиту от повреждения ДНК. В некоторых других вариантах осуществления, показанных на фиг. 8С, 8D и 8Е, сложноэфирный фрагмент 820 может также быть заменен на амидо-фрагмент 855 и фенокси-фрагмент 835 и быть дополнительно замещенным.
[0118] В любом из примеров, продемонстрированных на фиг. 8A-8E, вставка AEDI 125 и вставка SS 130, показанные на фиг. 1В, и вставка 300, показанная фиг. 3A-3F, могут, например, быть вставлены между первым функциональным фрагментом 810 и молекулой красителя 825 линкера 800.
ПРИМЕРЫ
[0119] Дополнительные варианты осуществления раскрыты более подробно в следующих примерах, которые ни в коей мере не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.
Общая методика реакции получения ffA-LN 3 -AEDI-NR550S0:
[0120] В 50 мл круглодонной колбе, растворяли Вос-AEDI-ОН (1 г, 3,4 ммоль) в ДХМ (15 мл) и добавляли ТФУК (1,3 мл, 17 мл) к раствору при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 2-х часов. ТСХ (ДХМ:МеОН=9:1) указывала на полный расход Вос-AEDI-ОН. Реакционную смесь упаривали досуха. Затем к остатку добавляли ТЭАБ (2М, ~15 мл), и рН контролировали до нейтрального уровня. Смесь затем растворяли в H2O/CH3CN (1:1, ~15 мл) и упаривали досуха. Процедуру повторяли 3 раза, чтобы удалить избыток соли ТЭАБ. Твердый остаток белого цвета обрабатывали с помощью CH3CN (20 мл) и перемешивали в течение 0,5 часа. Отфильтровывая раствор и промывая твердое вещество с помощью CH3CN, получали чистую соль AEDI-ОН-ТФУК (530 мг, 80%). 1H ЯМР (400 МГц, D2O, δ (м.д.)): 3,32 (т, J=6,5 Гц, 2H, NH2-CH2); 2,97 (т, J=6,5 Гц, 2H, S-CH2); 1,53 (с, 6H, 2× СН3). 13С ЯМР (400 МГц, D2O, δ (м.д.)): 178,21 (с, СО); 127,91, 117,71 (2с, ТФУК); 51,87 (с, С-(CH3)2); 37,76 (т, СН2-NH2); 34,23 (т, S-CH2); 23,84 (д, 2× СН3). 19F ЯМР (400 МГц, D2O, δ (м.д.)): -75,64.
[0121] В 50 мл круглодонной колбе краситель NR550S0 (114 мг, 176 мкмоль) растворяли в ДМФА (безводный, 20 мл) и упаривали досуха. Процедуру повторяли в 3 раза. Безводный ДМА (10 мл) и основание Хаггиса (92 мкл, 528 мкмоль, 3 эквивалента) затем прикапывали с помощью пипетки в круглодонную колбу. TSTU (69 мг, 228 мкмоль, 1,3 эквивалента) добавляли в виде одной порции. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре. Через 30 мин анализ ТСХ (CH3CN:H2O=85:15) показал, что реакция завершена. AEDI-OH (68 мг, 352 мкмоль, 2 эквивалента) в 0,1 М ТЭАБ добавляли к реакционной смеси и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. ТСХ (CH3CN:H2O=8:2) показала полный расход активированного сложного эфира, и красное пятно появилось ниже активированного сложного эфира. В то же время аналитическая ВЭЖХ также показала полный расход активированного сложного эфира и образование продукта. Реакцию гасили с помощью буфера ТЭАБ (0,1М, 10 мл), и летучий растворитель удаляли при пониженном давлении испарения (HV) и очищали на колонке Axia с получением NR550S0-AEDI-ОН. Выход: 60%.
[0122] В 25 мл круглодонной колбе NR550S0-AEDI-ОН (10 мкмоль) растворяли в ДМФА (безводный, 5 мл) и выпаривали досуха. Процедуру повторяли 3 раза. Затем безводный ДМА (5 мл) и ДМАП (1,8 мл, 15 мкмоль, 1,5 эквивалента) добавляли в круглодонную колбу. ДСК (5,2 мг, 20 мкмоль, 2 эквивалента) добавляли в виде одной порции. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре. Через 30 мин анализ ТСХ (CH3CN:H2O=8:2) показал, что реакция завершена. Основание Хаггиса (3,5 мкл, 20 мкмоль) прикапывали с помощью пипетки к реакционной смеси. Затем раствор pppA-LN3 (20 мкмоль в 0,5 мл H2O, 2 эквивалента) и Et3N (5 мкл) добавляли к реакционной смеси и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ (CH3CN:H2O=8:2) показала полный расход активированного сложного эфира, и красное пятно появилось на нулевой линии. В то же время аналитическая ВЭЖХ также показала полный расход активированного сложного эфира и образование конечного продукта. Реакцию гасили с помощью буфера ТЭАБ (0,1М, 10 мл) и наносили на колонку DEAE Sephadex (25 г колонка Biotage). Колонку элюировали с градиентом, как показано ниже в таблице 2.
A: 0,1 M буфер ТЭАБ (10% CH3CN)
B: 1 М буфер ТЭАБ (10% CH3CN).
Градиент:
| Таблица 2 | ||
| СТАДИЯ | Смесь Растворителей (B%) | Длина (мл) |
| 1 | 0 | 100 |
| 2 | 0-45 | 50 |
| 3 | 45 | 100 |
| 4 | 45-100 | 50 |
| 5 | 100 | 100 |
[0123] Целевой продукт элюировали из 45%-100% 1 М буфера ТЭАБ. Фракцию, содержащую продукт, объединяли, упаривали и очищали с помощью ВЭЖХ (колонка YLC, 8 мл/мин). Выход: 53%.
[0124] Таким образом, настоящее изобретение может относиться к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер, где указанный линкер содержит структуру формулы (I) или (II), или комбинацию обоих:
где
каждый из R1 и R2 независимо выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
R3 выбран из водорода, необязательно замещенного С1-6 алкила, -NR5-C(=O)R6 или -NR7-C(=O)-OR8;
R4 выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
каждый из R5 и R7 независимо выбран из водорода, необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-12 аралкила;
каждый из R6 и R8 независимо выбран из необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила, необязательно замещенного C7-12 аралкила, необязательно замещенного C3-7 циклоалкила или необязательно замещенного 5-10-членного гетероарила;
каждое из метиленовых повторяющихся звеньев в 
, 
или 
является необязательно замещенным;
Х выбран из метилена (СН2), кислорода (О) или серы (S);
m представляет собой целое число от 0 до 20;
n представляет собой целое число от 1 до 20; и
p представляет собой целое число от 1 до 20, при условии, что меченый флюорофором нуклеозид или нуклеотид не имеет структуру:
[0125] В некоторых случаях нуклеозида или нуклеотида, указанного выше, структура формулы (I) также представлена формулой (Ia) или (Ib):
Кроме того, структура формулы (II) также может быть представлена формулой (IIа), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или (IIf):
[0126] Более конкретно настоящее изобретение может относиться к нуклеозиду или нуклеотиду, ковалентно присоединенному к флуорофору через линкер, где указанный линкер содержит структуру формулы (I) или (II), или комбинацию обоих:
где
R1 выбран из необязательно замещенного C1-6 алкила;
R2 выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
R3 выбран из необязательно замещенного C1-6 алкила, -NR5-C(=O)R6 или -NR7-C(=O)-OR8;
R4 выбран из водорода или необязательно замещенного C1-6 алкила;
каждый из R5 и R7 независимо выбран из водорода, необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-12 аралкила;
каждый из R6 и R8 независимо выбран из необязательно замещенного C1-6 алкила, необязательно замещенного фенила, необязательно замещенного C7-12 аралкила, необязательно замещенного C3-7 циклоалкила или необязательно замещенного 5-10-членного гетероарила;
каждое из метиленовых повторяющихся звеньев в , или является необязательно замещенным;
Х выбран из метилена (СН2), кислорода (О) или серы (S);
m представляет собой целое число от 0 до 20;
n представляет собой целое число от 1 до 20; и
р представляет собой целое число от 1 до 20.
[0127] Предпочтительно, чтобы структура формулы (I) также была представлена формулой (Ia):
Кроме того, структура формулы (II) также представлена формулой (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или (IIf):
Claims (13)
1. Нуклеотид, ковалентно присоединенный к флуорофору через линкер А и соответствующий формуле:
где линкер А имеет структуру формулы (I) или (II):
где
каждый из R1 и R2 представляет собой метил, m представляет собой 0, n представляет собой 1;
R3 представляет собой -NH-C(=O)O-трет-бутил, R4 представляет собой водород, Х представляет собой СН2 и p равен 2; или
R3 представляет собой -NH-C(=O)СН3, R4 представляет собой водород, Х представляет собой СН2 и p равен 2.
2. Нуклеотид по п.1, где линкер А имеет структуру формулы (Ia):
3. Нуклеотид по п.1, где линкер А имеет структуру формулы (IIb) или (IIc):
4. Набор, содержащий нуклеотид по любому из пп.1-3.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1414098.2 | 2014-08-08 | ||
| GBGB1414098.2A GB201414098D0 (en) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | Modified nucleotide linkers |
| PCT/GB2015/052282 WO2016020691A1 (en) | 2014-08-08 | 2015-08-06 | Modified nucleotide linkers |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017103539A RU2017103539A (ru) | 2018-09-10 |
| RU2017103539A3 RU2017103539A3 (ru) | 2018-11-15 |
| RU2699993C2 true RU2699993C2 (ru) | 2019-09-12 |
Family
ID=51629525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103539A RU2699993C2 (ru) | 2014-08-08 | 2015-08-06 | Модифицированные нуклеотидные линкеры |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10190157B2 (ru) |
| EP (2) | EP3177634B1 (ru) |
| JP (3) | JP6563482B2 (ru) |
| KR (2) | KR102491869B1 (ru) |
| CN (2) | CN111704643A (ru) |
| AU (2) | AU2015298469B2 (ru) |
| BR (2) | BR122020018717B1 (ru) |
| CA (1) | CA2957382C (ru) |
| DK (2) | DK3564252T3 (ru) |
| ES (2) | ES2875557T3 (ru) |
| GB (1) | GB201414098D0 (ru) |
| IL (1) | IL250498B (ru) |
| MX (2) | MX385213B (ru) |
| MY (1) | MY195167A (ru) |
| NZ (2) | NZ728810A (ru) |
| RU (1) | RU2699993C2 (ru) |
| SG (3) | SG11201700880RA (ru) |
| WO (1) | WO2016020691A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201700838B (ru) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201414098D0 (en) * | 2014-08-08 | 2014-09-24 | Illumina Cambridge Ltd | Modified nucleotide linkers |
| CN106117288B (zh) * | 2015-05-08 | 2019-10-15 | 生捷科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止子 |
| EP3356381A4 (en) | 2015-09-28 | 2019-06-12 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | DESIGN AND SYNTHESIS OF NUCLEOTIDES BASED ON NOVEL DISULFIDE COMPOUNDS AS REVERSIBLE TERMINATORS FOR DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS |
| EP3463381A4 (en) | 2016-05-23 | 2020-01-01 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | NUCLEOTIDE DERIVATIVES AND THEIR METHODS OF USE |
| JP7051869B2 (ja) * | 2016-12-22 | 2022-04-11 | イラミーナ インコーポレーテッド | 配列決定プライマーおよび非配列決定エンティティを含むアレイ |
| EP3596099B1 (en) | 2017-03-06 | 2024-07-24 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid sequencing-by-synthesis (sbs) methods that combine sbs cycle steps |
| US12018325B2 (en) | 2017-03-28 | 2024-06-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | 3′-O-modified nucleotide analogues with different cleavable linkers for attaching fluorescent labels to the base for DNA sequencing by synthesis |
| WO2019071474A1 (zh) * | 2017-10-11 | 2019-04-18 | 深圳华大智造科技有限公司 | 修饰的核苷或核苷酸 |
| WO2019164977A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | Fluorinated nucleotides and uses thereof |
| US12188086B2 (en) | 2018-03-15 | 2025-01-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Nucleotide analogues and use thereof for nucleic acid sequencing and analysis preliminary class |
| EP3870593A4 (en) | 2018-10-25 | 2022-11-16 | Singular Genomics Systems, Inc. | NUCLEOTIDE ANALOGUES |
| JP7542444B2 (ja) | 2018-12-14 | 2024-08-30 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 配列決定の間のアンラベル化ヌクレオチドによるフェージング減少 |
| US11293061B2 (en) | 2018-12-26 | 2022-04-05 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group |
| US10822653B1 (en) | 2019-01-08 | 2020-11-03 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleotide cleavable linkers and uses thereof |
| KR102865446B1 (ko) * | 2019-03-01 | 2025-09-29 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 삼차 아민 치환된 쿠마린 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 |
| NL2023327B1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-17 | Illumina Inc | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| CA3103900A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina Cambridge Limited | Exocyclic amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| WO2020178231A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| US11421271B2 (en) | 2019-03-28 | 2022-08-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels |
| IL292961B2 (en) | 2019-11-27 | 2024-01-01 | Illumina Cambridge Ltd | Cyclooctatetraene Containing Dyes and Compositions |
| JP7287299B2 (ja) | 2020-01-31 | 2023-06-06 | トヨタ自動車株式会社 | 車両および車両制御インターフェース |
| CN120174072A (zh) | 2020-06-22 | 2025-06-20 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 具有3’缩醛封端基团的核苷与核苷酸 |
| US11981964B2 (en) | 2020-07-28 | 2024-05-14 | Illumina Cambridge Limited | Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels |
| US20220195517A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Long stokes shift chromenoquinoline dyes and uses in sequencing applications |
| US20220195196A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications |
| US20220195516A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing |
| US20220195518A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| CA3215598A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Michael Callingham | Fluorescent dyes containing bis-boron fused heterocycles and uses in sequencing |
| WO2022243480A1 (en) | 2021-05-20 | 2022-11-24 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for sequencing by synthesis |
| JP2024520279A (ja) * | 2021-05-26 | 2024-05-24 | イルミナ インコーポレイテッド | ３’－ブロック化ヌクレオチドの精製及び重合 |
| CA3223115A1 (en) | 2022-03-28 | 2023-10-05 | Xiaolin Wu | Labeled avidin and methods for sequencing |
| CA3223125A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Illumina, Inc. | Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing |
| EP4499659A1 (en) | 2022-03-31 | 2025-02-05 | Illumina, Inc. | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis |
| EP4499870A1 (en) | 2022-03-31 | 2025-02-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| AU2023281871A1 (en) | 2022-05-31 | 2024-11-14 | Illumina, Inc | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| CN119604513A (zh) | 2022-06-28 | 2025-03-11 | 因美纳公司 | 含有稠合四环双硼杂环的荧光染料及其在测序中的用途 |
| EP4594428A2 (en) | 2022-09-30 | 2025-08-06 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing |
| CN119095983A (zh) | 2022-12-22 | 2024-12-06 | 伊路米纳有限公司 | 用于边合成边测序的过渡金属催化剂组合物和方法 |
| WO2024137774A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Illumina, Inc. | Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis |
| EP4642931A1 (en) | 2022-12-27 | 2025-11-05 | Illumina, Inc. | Methods of sequencing using 3´ allyl blocked nucleotides |
| CN119452044A (zh) | 2023-03-29 | 2025-02-14 | 因美纳公司 | 萘酰亚胺染料以及其在核酸测序中的用途 |
| US20240327909A1 (en) | 2023-03-30 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2025049700A1 (en) | 2023-08-31 | 2025-03-06 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2025090596A1 (en) | 2023-10-26 | 2025-05-01 | Illumina, Inc. | 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing |
| WO2025106715A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Illumina, Inc. | Conjugated polymers or polymer dots as fluorescent labels |
| WO2025136890A1 (en) | 2023-12-18 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Hydrogel nanoparticles as labeling scaffold in sequencing |
| WO2025144716A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing |
| WO2025144711A1 (en) | 2023-12-29 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing |
| WO2025184226A1 (en) | 2024-02-28 | 2025-09-04 | Illumina, Inc. | Nucleotides with terminal phosphate capping |
| WO2025188906A1 (en) | 2024-03-08 | 2025-09-12 | Illumina, Inc. | Modified adenosine nucleotides |
| WO2025221895A1 (en) | 2024-04-19 | 2025-10-23 | Illumina, Inc. | Water soluble polymer scaffolds for dye labeling |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000036152A1 (en) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | Li-Cor, Inc. | A system and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis |
| WO2002086088A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Li-Cor, Inc. | Polymerases with charge-switch activity and methods of generating such polymerases |
| WO2002088381A2 (de) * | 2001-04-27 | 2002-11-07 | Genovoxx Gmbh | Verfahren zur bestimmung der genexpression |
| WO2003048387A2 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| WO2004090154A2 (en) * | 2003-04-01 | 2004-10-21 | Activx Biosciences, Inc. | Acyl- phosphate and phosphonate probes and methods of their synthesis and use in proteomic analysis |
| WO2005044836A2 (de) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Genovoxx Gmbh | Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung |
| US20070166705A1 (en) * | 2002-08-23 | 2007-07-19 | John Milton | Modified nucleotides |
| WO2009051807A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| RU2009121089A (ru) * | 2006-12-05 | 2011-01-20 | Лазержен, Инкорпорэйтед (Сша) (Us) | Фоторасщепляющиеся меченые нуклеотиды и нуклеозиды и меченые нуклеотиды и нуклеозиды, и способы их использования в секвенировании днк |
| US20120252691A1 (en) * | 2010-04-21 | 2012-10-04 | Pierce Biotechnology, Inc. | Modified nucleotides methods and kits |
| WO2012159072A2 (en) * | 2011-05-18 | 2012-11-22 | Cayman Chemical Company, Incorporated | Fluorescent molecular probes for use in assays that measure test compound competitive binding with sam-utilizing proteins |
| WO2013044018A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| CN103087131A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-08 | 上海交通大学 | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 |
Family Cites Families (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8810400D0 (en) | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| GB8822228D0 (en) | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| DE3924454A1 (de) | 1989-07-24 | 1991-02-07 | Cornelis P Prof Dr Hollenberg | Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips) |
| EP0450060A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-10-09 | Sri International | Dna sequencing |
| DK0604552T3 (da) | 1991-09-18 | 1997-08-04 | Affymax Tech Nv | Fremgangsmåde til syntese af forskellige samlinger af oligomerer |
| WO1993009668A1 (en) | 1991-11-22 | 1993-05-27 | Affymax Technology N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| WO1993017126A1 (en) | 1992-02-19 | 1993-09-02 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| US5583211A (en) | 1992-10-29 | 1996-12-10 | Beckman Instruments, Inc. | Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides |
| US5472672A (en) | 1993-10-22 | 1995-12-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and method for polymer synthesis using arrays |
| EP0730663B1 (en) | 1993-10-26 | 2003-09-24 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
| US6156501A (en) | 1993-10-26 | 2000-12-05 | Affymetrix, Inc. | Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use |
| US5429807A (en) | 1993-10-28 | 1995-07-04 | Beckman Instruments, Inc. | Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface |
| US5552278A (en) | 1994-04-04 | 1996-09-03 | Spectragen, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
| US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
| US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
| US5624711A (en) | 1995-04-27 | 1997-04-29 | Affymax Technologies, N.V. | Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis |
| US5545531A (en) | 1995-06-07 | 1996-08-13 | Affymax Technologies N.V. | Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays |
| CA2227895C (en) | 1995-10-11 | 2012-07-17 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods |
| US5658734A (en) | 1995-10-17 | 1997-08-19 | International Business Machines Corporation | Process for synthesizing chemical compounds |
| US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
| GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| US6087102A (en) | 1998-01-07 | 2000-07-11 | Clontech Laboratories, Inc. | Polymeric arrays and methods for their use in binding assays |
| US6287776B1 (en) | 1998-02-02 | 2001-09-11 | Signature Bioscience, Inc. | Method for detecting and classifying nucleic acid hybridization |
| JP3944996B2 (ja) | 1998-03-05 | 2007-07-18 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａプローブアレー |
| US6031078A (en) | 1998-06-16 | 2000-02-29 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | MTbx protein and nucleic acid molecules and uses therefor |
| US6277628B1 (en) | 1998-10-02 | 2001-08-21 | Incyte Genomics, Inc. | Linear microarrays |
| US6379698B1 (en) | 1999-04-06 | 2002-04-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Fusogenic lipids and vesicles |
| US20050181440A1 (en) | 1999-04-20 | 2005-08-18 | Illumina, Inc. | Nucleic acid sequencing using microsphere arrays |
| US6355431B1 (en) | 1999-04-20 | 2002-03-12 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays |
| ATE413467T1 (de) | 1999-04-20 | 2008-11-15 | Illumina Inc | Detektion von nukleinsäurereaktionen auf kügelchen-arrays |
| US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US6274320B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US6770441B2 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-03 | Illumina, Inc. | Array compositions and methods of making same |
| US6936702B2 (en) | 2000-06-07 | 2005-08-30 | Li-Cor, Inc. | Charge-switch nucleotides |
| WO2001094609A1 (en) | 2000-06-07 | 2001-12-13 | Li-Cor, Inc. | Charge-switch nucleotides |
| CN101525660A (zh) | 2000-07-07 | 2009-09-09 | 维西根生物技术公司 | 实时序列测定 |
| EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| DE10120797B4 (de) | 2001-04-27 | 2005-12-22 | Genovoxx Gmbh | Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten |
| DE60327649D1 (de) | 2002-08-23 | 2009-06-25 | Illumina Cambridge Ltd | Markierte nukleotide |
| US7414116B2 (en) * | 2002-08-23 | 2008-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| US7595883B1 (en) | 2002-09-16 | 2009-09-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biological analysis arrangement and approach therefor |
| US20070117104A1 (en) | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US7315019B2 (en) | 2004-09-17 | 2008-01-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Arrays of optical confinements and uses thereof |
| WO2006097320A2 (de) * | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Genovoxx Gmbh | Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung |
| US8212020B2 (en) | 2005-03-11 | 2012-07-03 | Steven Albert Benner | Reagents for reversibly terminating primer extension |
| GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
| US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
| EP3722409A1 (en) | 2006-03-31 | 2020-10-14 | Illumina, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
| WO2007135368A2 (en) | 2006-05-18 | 2007-11-29 | Solexa Limited | Dye compounds and the use of their labelled conjugates |
| AU2007296190A1 (en) | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Lysine-based polymeric linkers |
| MX2009002859A (es) | 2006-09-15 | 2009-03-30 | Enzon Pharmaceuticals Inc | Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos. |
| KR20090083334A (ko) * | 2006-09-15 | 2009-08-03 | 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 | 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커를 갖는 폴리알킬렌 옥시드 |
| US8110559B2 (en) | 2006-09-15 | 2012-02-07 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery |
| BRPI0716812A2 (pt) * | 2006-09-15 | 2013-11-05 | Enzon Pharmaceuticals Inc | Pro drogas polimericas direcionadas contendo ligantes multifuncionais |
| WO2008042067A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
| WO2008051530A2 (en) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
| EP4134667B1 (en) | 2006-12-14 | 2025-11-12 | Life Technologies Corporation | Apparatus for measuring analytes using fet arrays |
| US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
| US9163053B2 (en) * | 2007-05-18 | 2015-10-20 | Fluidigm Corporation | Nucleotide analogs |
| US7678894B2 (en) * | 2007-05-18 | 2010-03-16 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
| EP2725107B1 (en) * | 2007-10-19 | 2018-08-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | DNA sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified ddNTPs and nucleic acid comprising inosine with reversible terminators |
| US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
| JP6324315B2 (ja) * | 2011-11-17 | 2018-05-16 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | グルココルチコイド受容体の活性を示すグルカゴンスーパーファミリーのペプチド |
| EP2797634A4 (en) * | 2011-12-29 | 2015-08-05 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED MRNAS FOR THE CODING OF CELL-PENETRATING POLYPEPTIDES |
| CN105263918B (zh) | 2013-03-08 | 2018-05-18 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途 |
| EP2964612B1 (en) | 2013-03-08 | 2017-02-01 | Illumina Cambridge Limited | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| CN103484106B (zh) | 2013-09-05 | 2015-08-19 | 上海交通大学 | 四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途 |
| CN103866010B (zh) | 2014-02-28 | 2016-04-20 | 郭诚 | 一种基因测序的方法 |
| GB201408077D0 (en) | 2014-05-07 | 2014-06-18 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| GB201414098D0 (en) | 2014-08-08 | 2014-09-24 | Illumina Cambridge Ltd | Modified nucleotide linkers |
-
2014
- 2014-08-08 GB GBGB1414098.2A patent/GB201414098D0/en not_active Ceased
-
2015
- 2015-08-06 NZ NZ728810A patent/NZ728810A/en unknown
- 2015-08-06 EP EP15750100.8A patent/EP3177634B1/en active Active
- 2015-08-06 ES ES19178987T patent/ES2875557T3/es active Active
- 2015-08-06 SG SG11201700880RA patent/SG11201700880RA/en unknown
- 2015-08-06 CA CA2957382A patent/CA2957382C/en active Active
- 2015-08-06 ES ES15750100T patent/ES2773438T3/es active Active
- 2015-08-06 KR KR1020217024527A patent/KR102491869B1/ko active Active
- 2015-08-06 BR BR122020018717-4A patent/BR122020018717B1/pt active IP Right Grant
- 2015-08-06 DK DK19178987.4T patent/DK3564252T3/da active
- 2015-08-06 SG SG10202000850XA patent/SG10202000850XA/en unknown
- 2015-08-06 AU AU2015298469A patent/AU2015298469B2/en active Active
- 2015-08-06 MX MX2020009401A patent/MX385213B/es unknown
- 2015-08-06 KR KR1020177006407A patent/KR102287718B1/ko active Active
- 2015-08-06 JP JP2017506886A patent/JP6563482B2/ja active Active
- 2015-08-06 CN CN202010305079.4A patent/CN111704643A/zh active Pending
- 2015-08-06 SG SG10201900948PA patent/SG10201900948PA/en unknown
- 2015-08-06 WO PCT/GB2015/052282 patent/WO2016020691A1/en not_active Ceased
- 2015-08-06 EP EP19178987.4A patent/EP3564252B1/en active Active
- 2015-08-06 BR BR112017002251-6A patent/BR112017002251B1/pt active IP Right Grant
- 2015-08-06 MY MYPI2020004681A patent/MY195167A/en unknown
- 2015-08-06 CN CN201580048113.1A patent/CN106604926B/zh active Active
- 2015-08-06 MX MX2017001694A patent/MX377448B/es active IP Right Grant
- 2015-08-06 NZ NZ748150A patent/NZ748150A/en unknown
- 2015-08-06 RU RU2017103539A patent/RU2699993C2/ru active
- 2015-08-06 DK DK15750100.8T patent/DK3177634T3/da active
- 2015-08-07 US US14/821,251 patent/US10190157B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-02 ZA ZA2017/00838A patent/ZA201700838B/en unknown
- 2017-02-07 IL IL250498A patent/IL250498B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-12-11 AU AU2018278843A patent/AU2018278843B2/en active Active
-
2019
- 2019-01-25 US US16/258,401 patent/US11230734B2/en active Active
- 2019-07-24 JP JP2019136261A patent/JP2020015722A/ja active Pending
-
2021
- 2021-09-13 JP JP2021148730A patent/JP7726707B2/ja active Active
- 2021-12-27 US US17/562,510 patent/US11773438B2/en active Active
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000036152A1 (en) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | Li-Cor, Inc. | A system and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis |
| WO2002086088A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Li-Cor, Inc. | Polymerases with charge-switch activity and methods of generating such polymerases |
| WO2002088381A2 (de) * | 2001-04-27 | 2002-11-07 | Genovoxx Gmbh | Verfahren zur bestimmung der genexpression |
| WO2003048387A2 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| US20070166705A1 (en) * | 2002-08-23 | 2007-07-19 | John Milton | Modified nucleotides |
| WO2004090154A2 (en) * | 2003-04-01 | 2004-10-21 | Activx Biosciences, Inc. | Acyl- phosphate and phosphonate probes and methods of their synthesis and use in proteomic analysis |
| WO2005044836A2 (de) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Genovoxx Gmbh | Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung |
| RU2009121089A (ru) * | 2006-12-05 | 2011-01-20 | Лазержен, Инкорпорэйтед (Сша) (Us) | Фоторасщепляющиеся меченые нуклеотиды и нуклеозиды и меченые нуклеотиды и нуклеозиды, и способы их использования в секвенировании днк |
| WO2009051807A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| US20120252691A1 (en) * | 2010-04-21 | 2012-10-04 | Pierce Biotechnology, Inc. | Modified nucleotides methods and kits |
| WO2012159072A2 (en) * | 2011-05-18 | 2012-11-22 | Cayman Chemical Company, Incorporated | Fluorescent molecular probes for use in assays that measure test compound competitive binding with sam-utilizing proteins |
| WO2013044018A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| CN103087131A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-08 | 上海交通大学 | 可逆终端及其合成和在dna合成测序中的用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| P. SURESH JAYASEKARA et al. Journal of medicinal chemistry, 2014, vol. N9, стр. 3874-3883. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2699993C2 (ru) | Модифицированные нуклеотидные линкеры | |
| EP1926829B2 (en) | Labelled modified guanine-containing nucleosides and nucleotides comprising a fluorophore attached to the base through a linking group comprising a polyethylene glycol spacing group and methods for their use | |
| US11001888B2 (en) | Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications | |
| US20220195196A1 (en) | Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications | |
| RU2818762C2 (ru) | Нуклеозиды и нуклеотиды с 3’-гидрокси блокирующими группами и их применение в способах секвенирования полинуклеотидов | |
| HK40009716B (en) | Modified nucleotide linkers | |
| HK40009716A (en) | Modified nucleotide linkers | |
| HK1233269A1 (en) | Modified nucleotide linkers | |
| HK1233269B (en) | Modified nucleotide linkers |