RU2537845C2 - Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы - Google Patents
Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2537845C2 RU2537845C2 RU2012116430/04A RU2012116430A RU2537845C2 RU 2537845 C2 RU2537845 C2 RU 2537845C2 RU 2012116430/04 A RU2012116430/04 A RU 2012116430/04A RU 2012116430 A RU2012116430 A RU 2012116430A RU 2537845 C2 RU2537845 C2 RU 2537845C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- penicillin acylase
- synthesis
- lactam antibiotics
- penicillin
- application
- Prior art date
Links
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 14
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 claims description 9
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 claims description 9
- LJXOMNKURQBXLP-SECBINFHSA-N 2-[[(2r)-2-azaniumyl-2-phenylacetyl]amino]acetate Chemical group OC(=O)CNC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 LJXOMNKURQBXLP-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KIYRSYYOVDHSPG-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-amino-2-phenylacetamide Chemical compound NC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 KIYRSYYOVDHSPG-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- NVIAYEIXYQCDAN-MHTLYPKNSA-N (6r,7s)-7-azaniumyl-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound S1CC(C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@H]([NH3+])[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-MHTLYPKNSA-N 0.000 description 1
- QHVQEQRGDKOHHC-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-[(2-phenylacetyl)amino]benzoic acid Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(NC(=O)CC=2C=CC=CC=2)=C1 QHVQEQRGDKOHHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004841 cefadroxil Drugs 0.000 description 1
- NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N cefadroxil monohydrate Chemical compound O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к повышению эффективности биокаталитических превращений посредством применения мутантных форм ферментов с улучшенными каталитическими свойствами. В настоящем изобретении повышение эффективности ферментативного синтеза пептидной связи достигается при использовании варианта пенициллинацилазы из E.coli, содержащего замену аминокислотного остатка бета-цепи фермента в положении 484. Использование данного мутанта пенициллинацилазы позволяет увеличить выход и скорость накопления целевого продукта в реакциях синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи с ядром. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
Description
Пенициллинацилаза (Penicillin G acylase) из E.coli относится к ферментам класса амидогидролаз. Способность пенициллинацилазы катализировать синтез пептидной связи в водной среде уже много лет используется в фармацевтической промышленности для получения полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1], тем не менее интерес к повышению эффективности этого процесса не уменьшается. Не прекращается поиск новых и улучшение существующих катализаторов на основе пенициллинацилазы, поскольку их использование может дать существенный экономический эффект. Одним из основных направлений улучшения эффективности процесса является получение мутантных форм пенициллинацилазы методами генной инженерии путем замены одной или нескольких аминокислот, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.
Полноразмерная аминокислотная последовательность пенициллинацилазы из E.coli включает в себя сигнальный пептид (аминокислоты 1-26), альфа-субъединицу (аминокислоты 27-235), спейсерный пептид (аминокислоты 236-289) и бета-субъединицу (аминокислоты 290-846):
В работах, связанных с получением вариантов пенициллинацилазы, субъединицы фермента, как правило, нумеруют отдельно, и в дальнейшем изложении будет использована именно эта нумерация (на полноразмерной аминокислотной последовательности она показана как α1-209 и β1-557).
Известно несколько научных работ по получению мутантных форм фермента из E.coli по положениям αR145 и αF146 с улучшенной способностью катализировать реакции образования пептидной связи в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина методом ацильного переноса [2, 3], что приводит к увеличению выхода в реакции синтеза ампициллина с 15% до 24% для низкоконцентрированных и с 51% до 77% для высококонцентрированных систем. Наибольший эффект характерен для мутантов αR145G/S/L. Для мутантов по позиции αF146 наблюдается существенное падение каталитической активности.
В работе [4] авторы получали рекомбинантные гибриды в семействе ПА. Среди случайных мутаций были обнаружены замены αD148G и βG385S, включив которые в состав ПА E.Coli, можно добиться улучшения выхода в реакции синтеза ампициллина на 20%
При использовании мутации βF24A можно добиться увеличения выходов в реакции синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. [5] Использование же амидов не приводит к улучшению выхода. Данный эффект связан с общим ослаблением каталитических способностей фермента.
Патентная литература по улучшению эффективности реакций синтеза пептидов посредством улучшения свойств пенициллинацилазы ограничивается несколькими патентами, относящимися, в основном, к использованию мутантных пенициллинацилаз для синтеза β-лактамных антибиотиков.
В патентах [WO9605318, 22-02-1996 и US6033823, 07-03-2000], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета-цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βI177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.
В патентах [WO9820120, 14-05-1998; US6403356, 11-06-2002] круг вариантов пенициллинацилазы из Е.coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αМ142, αF146, βF24, βV56, βI177. Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наибольший эффект дала мутация по сайту β24 заменой L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора.
В патенте [US2005124029, 09-06-2005] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, К или С. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности. Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения пептидов, в том числе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связью в боковой цепи, путем применения препарата пенициллинацилазы с улучшенными свойствами.
Техническим результатом изобретения является создание улучшенного способа получения пептидов, в том числе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи, характеризующегося более высоким выходом и скоростью образования целевого продукта.
Указанный технический результат достигается путем использования препарата пенициллинацилазы из E.coli с измененной структурой, а именно, содержащей замену остатка аспарагиновой кислоты бета цепи фермента по положению β484, на другой аминокислотный остаток, в частности на остаток аспарагина. Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются описанные выше патенты [WO9820120, 14-05-1998; US6403356, 11-06-2002, US2005124029, 09-06-2005].
В научной и патентной литературе не известны примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы в реакциях синтеза пептидов, не относящихся к β-лактамным антибиотикам, а полученное увеличение эффективности синтеза пептидов, в том числе относящихся к β-лактамным антибиотикам, с использованием мутанта пенициллинацилазы βD484N не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.
Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка в позиции 484 бета-цепи фермента любыми доступными методами генной инженерии, направленной к эволюции или селекции.
В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях синтеза пептидов, в том числе β-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи с ядром, могут быть использованы сложные эфиры и амиды аминокислот, их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце, предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.
Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратов, или применяется в виде культуры клеток, иммобилизованных клеток, комбинированных препаратов фермента с клетками, иммобилизованными клетками или ферментами. Заявленный способ реализуется приведением в контакт препарата пенициллинацилазы и реакционной смеси. В качестве реакционной среды может быть использована вода, однофазные и многофазные водно-органичесике смеси, растворы с содержанием органических и неорганических соединений, в частности солей, кислот, оснований. В качестве реакционной среды более предпочтительным является использование воды или водных растворов с содержанием не более 40% (по объему) органических растворителей. Некоторые примеры выполнения заявленного способа приведены ниже. Варианты пенициллинацилазы из E.coli получали путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены препараты мутантов пенициллинацилазы.
Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексина.
Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа.
| Таблица 1 Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексина |
||
| [7-ADCA]/[D-PGA], mM | Выход цефалексина, % | |
| Дикий тип | βD484N | |
| 200/200 | 40 | 60 |
| 200/400 | 39 | 73 |
Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина.
Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (Табл.2).
| Таблица 2 Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина |
|
| Вариант пенициллинацилазы | Выход D-фенилглицил-глицина, % |
| Дикий тип | 17 |
| βD484N | 80 |
Описание экспериментальной части
Определение ферментативной активности. Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5, 0,1 М KCl.
Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [7]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.
ВЭЖХ анализ. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250×4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH3CN/вода 30:70, 0,68 г/л КН2РO4, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, рН 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.
Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина. Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке рН-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, рН 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.
Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина. Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке рН-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, рН 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.
Список литературы
1. Bruggink, A., Roos, E.C., de Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of b-lactam antibiotics. Org. Proc. Res. Dev. (1998) 2, 128-33.
2. Alkema, W.B.L., Prins, A.K., de Vries, E. & Janssen, D.B. Role of a Arg 145 and b Arg 263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. (2002) 365, 303-309.
3. Jager, S.A.W., Shapovalova, I.V., Jekel, P.A., Alkema, W.B.L., Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues alphaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.
4. Jager, S.A.W., Jekel, P.A. and Janssen, D.B. Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of β-lactam antibiotics. Enzyme and Microb.l Technol (2007) 40, 1335-1344.
5. Alkema, W.B.L., Dijkhuis, A.-J., de Vries, E. & Janssen, D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.
6. Dominy, C.N., Andrews, D.W. in Methods in Molecular Biology. Vol.235 (E.coli Plasmid Vectors) (Eds.: N. Casali, A. Preston), Humana, Totowa, NJ, 209-223 (2003).
7. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк. С.Ф., Березин. И.В. Инактивация растворимой и иммобилизованной пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонилфторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорг. Химия (1977) 3, 546-554.
Полноразмерная аминокислотная последовательность пенициллинацилазы из E.coli с двумя типами нумерации: сквозная нумерация и нумерация субъединиц в отдельности, использованная для описания изобретения.
Claims (3)
1. Способ получения пептидов, в том числе β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи с ядром, ферментативным переносом ацильной части на нуклеофил, отличающийся тем, что в качестве катализатора используется вариант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из Е.coli, содержащий замену аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты по положению 484 бета-цепи (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.
2. Способ по п.1, где пептидом является цефалексин.
3. Способ по п.1, где пептидом является D-фенилглицил-глицин.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116430/04A RU2537845C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116430/04A RU2537845C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012116430A RU2012116430A (ru) | 2013-11-27 |
| RU2537845C2 true RU2537845C2 (ru) | 2015-01-10 |
Family
ID=49624814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012116430/04A RU2537845C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2537845C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729410C1 (ru) * | 2020-02-21 | 2020-08-06 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Промышленный способ микробиологического синтеза фермента пенициллин g ацилазы escherichia coli |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996005318A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Gist-Brocades B.V. | Mutated penicillin g acylase genes |
| RU96103686A (ru) * | 1995-02-28 | 1998-05-10 | Эй Си Эс Добфар С.п.А. | СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА β -ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРА ФЕРМЕНТА |
| WO1998020120A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Mutant penicillin g acylases |
| US20050124029A1 (en) * | 2001-12-27 | 2005-06-09 | Alkema Wynand B.L. | Process for the preparation of a betha- lactam antibiotic with mutated penicillin acylase |
| RU2009142994A (ru) * | 2009-11-23 | 2010-12-20 | Российская Федерация в лице Федерального агентства по науке и инновациям (RU) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы |
| US20110104748A1 (en) * | 2007-03-09 | 2011-05-05 | Van Der Does Thomas | Process for the preparation of beta-lactam compounds |
-
2012
- 2012-04-25 RU RU2012116430/04A patent/RU2537845C2/ru active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996005318A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Gist-Brocades B.V. | Mutated penicillin g acylase genes |
| RU96103686A (ru) * | 1995-02-28 | 1998-05-10 | Эй Си Эс Добфар С.п.А. | СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА β -ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРА ФЕРМЕНТА |
| WO1998020120A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Mutant penicillin g acylases |
| US20050124029A1 (en) * | 2001-12-27 | 2005-06-09 | Alkema Wynand B.L. | Process for the preparation of a betha- lactam antibiotic with mutated penicillin acylase |
| US20110104748A1 (en) * | 2007-03-09 | 2011-05-05 | Van Der Does Thomas | Process for the preparation of beta-lactam compounds |
| RU2009142994A (ru) * | 2009-11-23 | 2010-12-20 | Российская Федерация в лице Федерального агентства по науке и инновациям (RU) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A. * |
| A1. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729410C1 (ru) * | 2020-02-21 | 2020-08-06 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Промышленный способ микробиологического синтеза фермента пенициллин g ацилазы escherichia coli |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012116430A (ru) | 2013-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sio et al. | Improved β-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts | |
| EP2367940B1 (en) | Mutant penicillin G acylases | |
| Hernández-Jústiz et al. | Evaluation of different enzymes as catalysts for the production of β-lactam antibiotics following a kinetically controlled strategy | |
| ES2258260T3 (es) | Proceso para la preparacion de beta-lactamas. | |
| Bečka et al. | Penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824: an efficient biocatalyst for syntheses of beta-lactam antibiotics under conditions employed in large-scale processes | |
| CN105483105A (zh) | 一种青霉素g酰化酶突变体 | |
| EP2173892B1 (en) | Process for the preparation of penicillin or cephalosporin antibiotics | |
| Deng et al. | Efficient cascade synthesis of ampicillin from penicillin G potassium salt using wild and mutant penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis | |
| Houng et al. | Kinetic resolution of amino acid esters catalyzed by lipases | |
| Sklyarenko et al. | Enzymatic synthesis of β-lactam acids | |
| RU2537845C2 (ru) | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы | |
| CN103834631A (zh) | 一种青霉素g酰化酶突变体及其编码基因和应用 | |
| Basso et al. | Kinetically controlled synthesis of ampicillin and cephalexin in highly condensed systems in the absence of a liquid aqueous phase | |
| CN106399174B (zh) | 一株青霉素酰化酶及其编码基因、产生菌和应用 | |
| RU2381273C2 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора | |
| Zhu et al. | Dynamic kinetic resolution of Vince lactam catalyzed by γ-lactamases: a mini-review | |
| RU2564578C2 (ru) | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
| CZ148593A3 (en) | Process of separating a non-dissolved catalyst from one or a plurality of other non-dissolved components comprised in the same reaction mixture | |
| Kurochkina et al. | Alpha-amino acid ester hydrolases: properties and applications | |
| Shcherbakova et al. | The βD484N mutant of penicillin acylase from Escherichia coli is more resistant to inactivation by substrates and can effectively perform peptide synthesis in aqueous medium | |
| Spence et al. | Penicillin acylases | |
| JPH08256789A (ja) | β−ラクタム抗生物質の酵素阻害剤の存在下での酵素合成法 | |
| RU2576002C2 (ru) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы | |
| Zhang et al. | Kinetically controlled synthesis of cefaclor with immobilized penicillin acylase in the presence of organic cosolvents | |
| CN115851786B (zh) | 一种编码青霉素g酰化酶的基因及表达的突变后青霉素g酰化酶在制备头孢氨苄中应用 |