RU2576002C2 - Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы - Google Patents
Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2576002C2 RU2576002C2 RU2013146613/10A RU2013146613A RU2576002C2 RU 2576002 C2 RU2576002 C2 RU 2576002C2 RU 2013146613/10 A RU2013146613/10 A RU 2013146613/10A RU 2013146613 A RU2013146613 A RU 2013146613A RU 2576002 C2 RU2576002 C2 RU 2576002C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- penicillin acylase
- penicillinacylaze
- amino
- hydrolysis
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 title description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims abstract 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims description 63
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims description 12
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 14
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- -1 (R) -mandelyl Chemical class 0.000 description 11
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 4
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 4
- 125000000744 organoheteryl group Chemical group 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 241001482576 Saiga Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OZHIYEINSCNALY-BYPYZUCNSA-N (1s)-1-aminobutan-1-ol Chemical compound CCC[C@@H](N)O OZHIYEINSCNALY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- IWYDHOAUDWTVEP-ZETCQYMHSA-N (S)-mandelic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- JCBPETKZIGVZRE-UHFFFAOYSA-N 2-aminobutan-1-ol Chemical class CCC(N)CO JCBPETKZIGVZRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588773 Kluyvera cryocrescens Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical class OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 2
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical class O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- STVVMTBJNDTZBF-SECBINFHSA-N (2r)-2-amino-3-phenylpropan-1-ol Chemical compound OC[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 STVVMTBJNDTZBF-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- JYLHYOYRPZDJHM-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-(4-carboxybutanoylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CCCC(O)=O JYLHYOYRPZDJHM-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- MAGPZHKLEZXLNU-SSDOTTSWSA-N (R)-mandelamide Chemical compound NC(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 MAGPZHKLEZXLNU-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 1
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 1
- 241000185992 Rhizobium viscosum Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Chemical group CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы. Заявленный способ включает изменение структуры пенициллинацилазы из Escherichia coli путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи на лейцин или аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин. Способ приводит к улучшению каталитической активности пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного ацилирования первичных аминогрупп химических соединений и стереоселективного гидролиза N-ацильных производных первичных аминосоединений. 6 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу улучшения каталитических свойств ферментов.
Уровень техники
В настоящее время биокатализаторы широко используются в промышленности для проведения в мягких условиях химических превращений с высокой хемо-, регио- и стереоизбирательностью [Industrial enzymes. Eds. J. Polaina and A.P. MacCabe. Springer: Dordrecht, The Netherlands, 2007.]. Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [A. Bruggink et al. Org. Process Res. Dev. 1998, 2, P.128.]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [Svedas V.K. et al. Annal N.Y. Acad. Sci. 1996, 799, P.659.] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, 14-03-2002; WO 02/20821, 14-03-2002; D.T. Guranda et al. Tetrahedron: Asymm. 2004, 15, P.2901.]. Однако каталитические свойства природных ферментов ограничены.
Принимая во внимание высокий биокаталитический потенциал, пенициллинацилаза является объектом биоинженерии с целью создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Для улучшения каталитических свойств фермента используют методы, основанные на изменении его первичной структуры посредством введения мутаций или рекомбинации генов. В ряде работ было показано, что методами генной инженерии можно изменить субстратную специфичность и каталитические свойства пенициллинацилазы. В частности, в результате многоточечных мутаций была изменена архитектура участка связывания ацильной группы субстрата в активном центре фермента и таким образом впервые был получен рекомбинантный препарат пенициллинацилазы активный по отношению к цефалоспорину С [В. Oh et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 319, P.486]. Принципиальным достижением последних лет, открывающим новые возможности улучшения каталитических свойств фермента, является конструирование пермутированной одноцепочечной пенициллинацилазы, экспрессия которой не зависит от автокаталитического расщепления [G. Flores et al. J. Protein Science. 2006, 13, P.1677.].
В то время как большинство случайных мутаций практически не сказываются на каталитических свойствах пенициллинацилазы, отдельные мутации аминокислотных остатков могут существенно повлиять на субстратную специфичность и каталитические свойства фермента. Показательными являются примеры, когда методом направленной эволюции были получены мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.Citrophila по положению Pheβ71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [L.J. Forney et al. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(10), P.2550.; A. Roa et al. Biochem. J. 1994, 303, P.869.]. Результаты этих работ свидетельствуют о том, что «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с диким типом фермента.
В литературе большее число работ направлено на получение вариантов фермента с большей каталитической активностью в реакции гидролиза по отношению к ограниченному кругу природных и цветных высокоспецифических субстратов, которые традиционно используются для слежения за ферментативной активностью. Между тем пенициллинацилаза является высоко активным и стабильным ферментом в водной среде [V.K. Svedas et al. FEBS Lett. 1997, 417, P.414.; Д.Ф. Гуранда и др. Биохимия. 2004, 69(12), С.1700.], поэтому задача увеличения гидролитической активности фермента по отношению к природным и цветным высокоспецифическим субстратам, на наш взгляд, не является принципиальной. Более ценным считаем биоинженерию пенициллинацилазы с целью увеличения активности по отношению к неприродным и неспецифическим субстратам, увеличения стереоселективности, а также увеличения способности фермента катализировать ацилирование различных аминосоединений.
Несмотря на высокий синтетический потенциал пенициллинацилазы, известно всего несколько научных трудов по получению вариантов фермента с увеличенной способностью катализировать реакции ацилирования, где показано, что варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям Argα145 и Pheα146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом. [W.B.L. Alkema et al. Protein Engineering. 2000, 13(12), P.857.; W.B.L. Alkema et al. Biochem. J. 2002, 365, Р.303.].
В научной литературе нет сведений относительно влияния мутаций на стереоселективность пенициллинацилазы.
Патентная литература по вопросам биоинженерии пенициллинацилазы ограничивается несколькими патентами одной группы авторов. В заявке [WO 9605318, 22-02-1996] заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа- цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патент основан на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям Metα143, Pheα147, Leuβ56, Alaβ67, Ileβ177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина. В следующих патентных документах [WO 9820120, 14-05-1998; US 6403356, 11-06-2002] круг вариантов пенициллинацилазы существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам Metα142, Pheα146, Pheβ24, Valβ56, Ileβ177. Приоритетные права данных заявок ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамов ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетцефалоспорановой кислот.
Таким образом, за исключением случая улучшения каталитической активности по отношению к природным субстратам, ранее заявленные способы не затрагивают такие ключевые свойства пенициллинацилазы, как стереоселективность и способность ацилирования различных классов аминосоединений, а также способов применения таких препаратов с целью получения энантиомерно чистых соединений.
Раскрытие изобретения
Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с повышенной каталитической активностью и стереоселективностью в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в частности, с целью получения энантиомерно чистых соединений. Зачастую, настоящее изобретение не имеет отношение к способам получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способы получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетцефалоспорановой кислот.
Техническим результатом заявленного способа является создание препаратов пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью и стереоизбирательностью в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, а также их применения для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений.
Поставленная задача решается путем изменения структуры пенициллинацилазы заменой одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента, которые соответствуют сайгам α138-151 и β67-73 пенициллинацилазы из E.coli. Здесь имеется в виду нумерация аминокислотных остатков согласно общепринятым методам выравнивания аминокислотной последовательности пенициллинацилаз из разных источников, например [R.M.D. Verhaert et al. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63(9), P.3412.]
Наиболее близкими к заявленному решению является способ улучшения свойств пенициллинацилазы, описанный в рассмотренных выше патентных документах [WO 9605318, 22-02-1996; WO 9820120, 14-05-1998; US 6403356, 11-06-2002].
В научной и патентной литературе не известны примеры повышения каталитических свойств пенициллинацилазы по отношению к неприродным субстратам, в частности, каталитической эффективности и стереоизбирательности в реакциях ацилирования широкого круга аминосоединений и гидролиза их N-ацильных производных, включающие изменение структуры фермента путем замены одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента в положении 138-151 и 67-73, а новая функция и предлагаемое назначение не вытекают с очевидностью из его известной структуры, принятого назначения или, как следствие, ранее известных свойств.
Таким образом, настоящее изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к получению и применению вариантов пенициллинацилазы из разных источников, полученных из предшественника фермента посредством замены одного или нескольких остатков альфа и бета-цепи фермента, соответствующие сайгам α138-151 и β67-73 пенициллинацилазы из E.coli, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.
Предпочтительным является получение и применение вариантов пенициллинацилазы, содержащих замены по сайгам, соответствующих α145, α146 и β71 пенициллинацилазы из E.coli. Наиболее предпочтительным является получение и применение варианта пенициллинацилазы β71.
В качестве источника пенициллинацилазы могут быть использованы бактерии, в частности, из A.faecalis, B.megaterium, K.Citrophila, P.rettgeri, A.viscosus и др.
Субстратами в ферментативных реакциях гидролиза могут быть соответствующие эфиры и амиды карбоновых кислот, в частности фенилуксусной и феноксиуксусной кислоты и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце. Предпочтительным является использование амидов и эфиров фенилуксусной, п-гидрокси-фенилуксусной, феноксиуксусной, R- и S-миндальной кислоты, R- и S-фенилглицина.
В качестве ацильных доноров могут быть использованы карбоновые кислоты, в частности фенилуксусная и феноксиуксусная кислота и их замещенные производные в α-положении и в ароматическом кольце, а также их амиды и эфиры. Предпочтительным является использование амидов и эфиров фенилуксусной, п-гидрокси-фенилуксусной, феноксиуксусной, R- и S-миндальной кислоты, R- и S-фенилглицина.
Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов или иммобилизованных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.
Препараты биокатализаторов на основе пенициллинацилазы по изобретению могут применяться с целью:
- проведения биокаталитических превращений, в том числе протекающих хемо-, регио- и стереоизбирательно;
- проведения ацилирования первичных аминосоединений, в частности, для ацилирования аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов и эфиров, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов;
- проведения гидролиза амидной и эфирной связи, в частности, для гидролиза амидов и эфиров. О- или N-ацилированных производных спиртов, аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов и эфиров, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов;
- получения химических соединений, в том числе энантиомерно чистых соединений, в частности спиртов, аминов, аминоспиртов, аминокислот, их амидов, эфиров и ацильных производных, пептидов и пептидомиметиков, а также их элементоорганических аналогов.
Способ применения реализуется приведением в контакт препарата пенициллинацилазы и реакционной смеси. В качестве реакционной среды может быть использована вода, однофазные и многофазные водно-органические смеси, растворы с содержанием органических и неорганических соединений, в частности солей, кислот, оснований. В качестве реакционной среды более предпочтительным является использование воды или водных растворов с содержанием не более 40% (по объему) органических растворителей.
Способ применения препарата пенициллинацилазы по изобретению может быть как независимым, так и в комбинации с другими катализаторами и биокатализаторами.
Некоторые примеры реализации способа улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы и способа их применения по изобретению приведены ниже. Варианты пенициллинацилазы из E.coli получали путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в статьях [V. Picard et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, P.2587.; W.B.L. Alkema et al. Protein Eng. 2000, 13, P.857]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.
Осуществление изобретения
Пример 1. Увеличение каталитической активности пенициллинацилазы.
Каталитическую активность пенициллинацилазы измеряли с использованием удобного для регистрации цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамид)бензойной кислоты. Количественной мерой каталитической активности являются каталитическая константа (kkат) и константа специфичности (kkат/KM), значения которых в случае варианта βPhe71Leu в 2 и в 6 раз выше соответствующих значений для пенициллинацилазы дикого типа (табл.1).
| Таблица 1 | ||
| Каталитическая активность вариантов пенициллинацилазы (pH 7,5, 0,1 М KCl, 25°C) | ||
| Фермент | kkат, c-1 | (kkат/KM)·10-3, M-1·c-1 |
| Дикий тип | 26 | 867 |
| Pheβ71Leu | 53 | 5242 |
Пример 2. Увеличение стереоселективности пенициллинацилазы по отношению к N-ацильным производным аминосоединений.
Сравнение стереоизбирательности пенициллинацилаз по отношению к N-ацильным производным аминосоединений проводили на основании значений стереоселективности (Е) ферментативного гидролиза ряда N-ацильных производных аминосоединений. В случае варианта Pheβ71Leu значение стереоселективности гидролиза производных фенилуксусной и миндальной кислот примерно в 2-4 раза выше, чем в случае пенициллинацилазы дикого типа (табл.2 и 3). В случае варианта Argα145Leu наблюдается увеличение стереоселективности примерно в 1,5 раза относительно пенициллинацилазы дикого типа (табл.3). Следует отметить значительное влияние структуры ацильной части субстрата на стереоселективность ферментативной реакции.
| Таблица 2 | ||
| Стереоселективность пенициллинацилазы по отношению к N-фенилацетильным производным аминосоединений (pH 7,5, 25°C) | ||
| Субстрат | Препарат фермента | |
| дикий тип | Pheβ71Leu | |
| N-Phac-(±)-2-аминобутанол | 4 | 15 |
| N-Phac-(±)-2-амино-4-метилпентанол | 36 | 60 |
| N-Phac-(±)-фенилаланинол | 2 | 7 |
| Таблица 3 | ||||
| Стереоселективность пенициллинацилазы по отношению к N-(R)-манделил-производным аминосоединений (pH 7,5, 25°C) | ||||
| Субстрат | Препарат фермента | |||
| дикий тип | Pheβ71Leu | Pheβ71Arg | Argα145Leu | |
| N-(R)-Манделил-(±)-2-аминобутанол | 25 | 100 | 120 | 37 |
| N-(R)-Манделил-(±)-фенилаланинол | 4,2 | 39 | 120 | 7,4 |
Пример 3. Изменение стереоселективности и синтетической способности пенициллинацилазы в реакциях ацильного переноса.
Сравнение стереоизбирательности и синтетической способности вариантов пенициллинацилазы проводили на примере ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом (R)-миндальной кислоты. В рассмотренном ряду варианты пенициллинацилазы по положению Pheβ71 характеризуются предельными значениями скорости синтеза, соотношением начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза (С/Г)0 и стереоселективности (Е). С одной стороны, в случае вариантов Pheβ71Leu и Pheβ71Arg наблюдаемое увеличение по каждому из показателей составляет примерно 5-30 раз в сравнении с диким типом (табл.4). И напротив, в случае варианта Pheβ71Trp происходит обратный эффект.
| Таблица 4 | |||
| Кинетические параметры ферментативного стереоселективного ацилирования рацемата 2-аминобутанола амидом R-миндальной кислоты (pH 9,5, 25°C) | |||
| Фермент | VC/[E]0, у.е. | (С/Г)0, у.е. | Е |
| Дикий тип | 1 | 1 | 26 |
| Pheβ71Trp | 0,31 | 0,13 | 2,9 |
| Pheβ71Leu | 22 | 8,5 | 95 |
| Pheβ71Arg | 31 | 10 | 120 |
| Argα145Leu | 6,3 | 3,8 | 35 |
Пример 4. Получение энантиомеров соединений при использовании вариантов пенициллинацилазы методом ферментативного гидролиза.
Энантиомеры аминосоединений получали в результате ферментативного гидролиза рацемата N-ацильного производного до 50% конверсии как описано в экспериментальной части. Продукты наиболее высокой энантиомерной чистоты (S)-аминобутанола и (R)-фенилаланинола были получены в случае применения вариантов пенициллинацилазы по положению Pheβ71.
| Таблица 5 | ||||
| Энантиомерный избыток продукта ферментативного гидролиза рацемата (R)-манделил-производного аминосоединения | ||||
| Продукт гидролиза | Препарат фермента | |||
| Дикий тип | Pheβ71Leu | Pheβ71Arg | Argαl45Leu | |
| (S)-аминобутанол | 87% | 93% | 95% | 86% |
| (R)-фенилаланинол | 46% | 89% | 45% | 60% |
Пример 5. Получение энантиомерно чистых соединений при использовании вариантов пенициллинацилазы методом ацильного переноса.
Энантиомерно чистые амиды (диастереомеры) получали в результате ферментативного ацилирования рацемата аминосоединения при использовании амида (R)-миндальной кислоты в качестве ацильной донора, как описано в экспериментальной части. Наибольшие значения энантиомерного избытка продукта синтеза наблюдаются в случае применения вариантов пенициллинацилазы Pheβ71.
| Таблица 6 | ||||
| Энантиомерный избыток продукта стереоселективного ацилирования рацемата аминосоединения амидом (R)-миндальной кислоты | ||||
| Продукт синтеза | Препарат фермента | |||
| Дикий тип | Pheβ71Leu | Pheβ71Arg | Argα145Leu | |
| N-(R)-манделил-(S)-аминобутанол | 89% | 98% | 99% | 93% |
| N-(R)-манделил-(R)-фенилаланинол | 61% | 95% | 30% | 76% |
Описание экспериментальной части
Определение ферментативной активности
Активность мутантных форм пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамид)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5,0,1 М KCl.
Определение концентрации активных центров
Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [В.К. Швядас и др. Биоорг. химия. 1977, 3, С.546.]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.
Определение кинетических параметров
Кинетические параметры ферментативного превращения (KM и kкат) определяли общепринятым методом путем анализа зависимости начальных скоростей гидролиза от концентрации субстрата. Реакции проводили в рамках схемы Михаэлиса-Ментен (S0>>E0) в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,5, 0,1 М KCl) при 25°C.
ВЭЖХ анализ. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Luna C18 (Phenomenex, США), 250×4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH3CN/вода 40:60, 0,78 г/л KH3PO4, 0,5 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,8 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.
Определение энантиомерного избытка первичных аминосоединений определяли методом предколоночной модификации о-фталевым альдегидом и хиральным тиолом по методике [D.T. Guranda et al J. Chromatogr. A. 2005, 1095. P.89.].
Проведение стереоселективного гидролиза
Реакцию стереоселективного ферментативного гидролиза рацемата N-ацильного производного аминосоединения проводили в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 7,5 при постоянном перемешивании до достижения 50% степени конверсии. Начальные концентрации реагентов: 10 мМ субстрата, активных центров пенициллинацилазы 0,1 мкМ, объем реакционной смеси 5 мл. Время проведения эксперимента не превышала 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их мобильной фазой и анализировали методом ВЭЖХ. Затем реакционную смесь подкисляли до pH 1,5 6н. HCl и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Аминосоединение, высвободившееся в ходе ферментативного гидролиза, распределялось в водном слое. Для определения энантиомерного избытка аминосоединения аликвоту полученного водного раствора анализировали методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией. Стереоселективность ферментативного гидролиза определяли по значению энантиомерного избытка образующегося аминосоединения при 50% степени конверсии.
Проведение стереоселективного ацильного переноса
Реакцию стереоселективного ферментативного ацилирования рацемата первичного аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой, проводили в водной среде методом ацильного переноса от амида (R)-миндальной кислоты. Начальные концентрации реагентов: 100 мМ ацильного донора, 100 мМ рацемата аминосоединения, концентрация активных центров пенициллинацилазы 10 мкМ. Реакцию проводили в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Время проведения эксперимента составляло от 30 мин. Затем реакционную смесь подкисляли до pH 3,06 н. HCl и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Продукт синтеза распределялся в органическом слое. Органический слой выпаривали, а остаток растворяли в 5 мл водно-этанольного раствора. Для определения энантиомерного избытка продукта синтеза аликвоту полученного раствора анализировали методом ВЭЖХ. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их мобильной фазой и анализировали методом ВЭЖХ. Эффективность ацильного переноса определяли как соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза (С) и гидролиза (Г). Стереоселективность ацильного переноса определяли как соотношение начальных скоростей накопления продуктов ацилирования двух энантиомеров аминосоединения.
Claims (1)
- Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Escherichia coli в реакциях стереоселективного ацилирования первичной аминогруппы аминоспиртов и гидролиза N-ацильных производных первичных аминоспиртов, включающий изменение структуры пенициллинацилазы путем замены аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин или путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013146613/10A RU2576002C2 (ru) | 2013-10-18 | 2013-10-18 | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013146613/10A RU2576002C2 (ru) | 2013-10-18 | 2013-10-18 | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009142994/10A Substitution RU2575304C2 (ru) | 2009-11-23 | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013146613A RU2013146613A (ru) | 2015-04-27 |
| RU2576002C2 true RU2576002C2 (ru) | 2016-02-27 |
Family
ID=53282950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013146613/10A RU2576002C2 (ru) | 2013-10-18 | 2013-10-18 | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2576002C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020120A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Mutant penicillin g acylases |
-
2013
- 2013-10-18 RU RU2013146613/10A patent/RU2576002C2/ru not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020120A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Mutant penicillin g acylases |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALKEMA WB et.al. Role of alphaArg145 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem J. 2002 Jul 1;365(Pt 1):303-9. * |
| ШАПОВАЛОВА И.В. "Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli", автореферат диссертации, Москва 2007. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013146613A (ru) | 2015-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shaw et al. | Lonza: 20 years of biotransformations | |
| Rasor et al. | Enzyme-catalyzed processes in pharmaceutical industry | |
| Sio et al. | Improved β-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts | |
| Holt et al. | Enantioselective enzyme-catalysed synthesis of cyanohydrins | |
| Grulich et al. | Perspectives and industrial potential of PGA selectivity and promiscuity | |
| US20170067084A1 (en) | Production of chiral 1,2-amino alcohols and alpha-amino acids from alkenes by cascade biocatalysis | |
| CN105483105A (zh) | 一种青霉素g酰化酶突变体 | |
| Cobos-Puc et al. | Classical and new pharmaceutical uses of bacterial penicillin G acylase | |
| Gröger et al. | The first aminoacylase-catalyzed enantioselective synthesis of aromatic β-amino acids | |
| Houng et al. | Kinetic resolution of amino acid esters catalyzed by lipases | |
| Chen et al. | Application and microbial preparation of D-valine | |
| Youshko et al. | Application of aminoacylase I to the enantioselective resolution of α-amino acid esters and amides | |
| RU2576002C2 (ru) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы | |
| Chilov et al. | Resolution of (RS)-phenylglycinonitrile by penicillin acylase-catalyzed acylation in aqueous medium | |
| RU2575304C2 (ru) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы | |
| CA2428163C (en) | Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched .beta.-amino acids | |
| WO2004003001A1 (en) | Process for the enzymatic resolution of 1,3-dioxolane-4-carboxylates | |
| FI106266B (fi) | Stereospesifisten GABA-T-inhibiittoreiden raseemisen seoksen entsymaattinen erotus | |
| Miyazawa et al. | Resolution of racemic carboxylic acids via the lipase‐catalyzed irreversible transesterification of vinyl esters | |
| Liu et al. | Highly selective kinetic resolution of D/L-syn-p-sulfone phenylserine catalyzed by D-threonine aldolase in two-phase ionic solvent | |
| Gong et al. | Alcaligenes faecalis penicillin G acylase-catalyzed enantioselective acylation of dl-phenylalanine and derivatives in aqueous medium | |
| Vink et al. | Nitrile hydrolysis activity of Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 whole cells | |
| Liese | Replacing chemical steps by biotransformations: industrial application and processes using biocatalysis | |
| RU2564578C2 (ru) | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
| RU2537845C2 (ru) | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20150302 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20151023 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |