RU2564578C2 - МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ - Google Patents
МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2564578C2 RU2564578C2 RU2012116431/10A RU2012116431A RU2564578C2 RU 2564578 C2 RU2564578 C2 RU 2564578C2 RU 2012116431/10 A RU2012116431/10 A RU 2012116431/10A RU 2012116431 A RU2012116431 A RU 2012116431A RU 2564578 C2 RU2564578 C2 RU 2564578C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- penicillin
- penicillin acylase
- acylase
- coli
- synthesis
- Prior art date
Links
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 12
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 10
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 9
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 9
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 9
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- LJXOMNKURQBXLP-SECBINFHSA-N 2-[[(2r)-2-azaniumyl-2-phenylacetyl]amino]acetate Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 LJXOMNKURQBXLP-SECBINFHSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 4
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- KIYRSYYOVDHSPG-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-amino-2-phenylacetamide Chemical compound NC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 KIYRSYYOVDHSPG-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000588773 Kluyvera cryocrescens Species 0.000 description 2
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 229960004841 cefadroxil Drugs 0.000 description 2
- NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N cefadroxil monohydrate Chemical compound O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- JYLHYOYRPZDJHM-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-(4-carboxybutanoylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CCCC(O)=O JYLHYOYRPZDJHM-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QHVQEQRGDKOHHC-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-[(2-phenylacetyl)amino]benzoic acid Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(NC(=O)CC=2C=CC=CC=2)=C1 QHVQEQRGDKOHHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-Phenylalanine Natural products OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229960002588 cefradine Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N cephradine Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CCC=CC1 RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N mandelic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000744 organoheteryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина. Изобретение позволяет получить пенициллинацилазу с улучшенными каталитическими свойствами. 2 табл., 2 пр.
Description
Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [2] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, WO 02/20821, 3]. Высокий биокаталитический потенциал пенициллинацилазы делает ее перспективным объектом биоинженерии для создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Одним из основных путей улучшения свойств пенициллинацилазы является получение ее мутантных форм путем замены одной или нескольких аминокислотных остатков в структуре фермента данного типа, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.
В научных публикациях описаны мутации по целому ряду аминокислотных остатков прокариотических пенициллинацилаз. Основные данные изложены в обзоре [4], а также в более поздних и не вошедших в данный обзор работах [5-18]. Задачи, которые пытаются решить исследователи, вводя мутации в структуру пенициллинацилазы, - это увеличение эффективности ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков [9, 12, 13], улучшение специфичности и стереоспецифичности пенициллинацилазы [12, 13], увеличение стабильности пенициллинацилазы [8, 14, 16], изучение механизма процессинга пенициллинацилазы [17, 18].
Несмотря на то, что в литературе описано довольно много различных вариантов мутаций пенициллинацилазы, лишь немногие из них позволили улучшить субстратную специфичность и каталитические свойства фермента.
Показательными являются мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.citrophila по положению βF71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [19, 20]. Однако «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с ферментом дикого типа.
Варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям αR145 и αF146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом [6, 21, 22]. Наибольший эффект характерен для мутантов aR145G/S/L.
Представляет интерес мутация bF24A, посредством которой можно добиться увеличения выхода в реакциях синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила за счет увеличения соотношения скоростей синтеза и гидролиза [22]. Однако этот эффект достигается на фоне существенного снижения каталитической активности фермента (не более 1,6% каталитической активности пенициллинацилазы из E.coli дикого типа).
Патентная литература по получению мутантов пенициллинацилазы из прокариот с целью улучшения ее каталитических свойств также охватывает широкий круг мутаций. В основном, улучшение свойств направлено на увеличение эффективности синтеза β-лактамных антибиотиков.
В патентах [WO 9605318 и US 6033823], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βl177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.
В патентах [WО 9820120, US 6403356] круг вариантов пенициллинацилазы из Е. coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αM142, αF146, βF24, βV56, βl177.
Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наиболее значительный эффект дала мутация по сайту β24 при замене L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. Существенно, что данная улучшенная мутантная форма фермента позволяет использовать амиды в качестве ацильных доноров.
В патенте [US 2005124029] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, K, или C. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности.
В патенте [WO 2010072765] заявлены мутации в положениях α3, α77, α90, α144, α192, β24, β109, β148, β313, β460, β488 пенициллинацилазы из E.coli, предпочтительно мутации αM90K, αN144S, αV192E, βF24L, βK109R, βV148L, βS313N, βF460L, βF488L, а также находящие соответствие в прокариотических ПА. Авторы патента делают акцент на многоточечных заменах, содержащих мутацию βF24L либо βF460L в сочетании с любыми из вышеперечисленных мутаций. Заявленные авторами варианты пенициллинацилазы обладают улучшенными свойствами в синтезе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, в частности амоксициллина, ампициллина, цефалексина, цефадроксила и цефрадина, и позволяют повысить выход в синтезе амоксициллина до 90-95% относительно 6-аминопенициллановой кислоты.
В патенте [WO 2010054319] заявлены варианты пенициллинацилаз, содержащие изменения в аминокислотной последовательности в позициях 24, 28, 31, 56, 71, 74, 547, 697, 701. Полученные мутанты обладают повышенной стереоселективностью по отношению к α-положению ацильной группы метилового эфира α-гидрокси-фенилуксусной кислоты, улучшенным соотношением синтез/гидролиз в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина из сложных эфиров, а также повышенной термостабильностью и стабильностью в водно-органических средах по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа из K.Citrophila.
Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами, в частности с повышенной каталитической активностью, стереоселективностью, операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений.
Техническим результатом изобретения является создание пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью, стереоизбирательностью и операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений, в частности с целью получения так называемых ядер бета-лактамных антибиотиков 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, β-лактамных антибиотиков.
Указанный технический результат достигается путем внесения изменений в структуру пенициллинацилазы, а именно путем замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции β484 пенициллинацилазы из E.coli.
Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются патенты [WO 9820120, US 6403356, US 2005124029], описанными выше.
В научной и патентной литературе нет данных о получении пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами путем замены аминокислотного остатка 484. Полученное улучшение каталитических свойств, заявленное в настоящем патенте, не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.
Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к получению и применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции 484, на другой аминокислотный остаток, в частности на аспарагин, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.
Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции конденсации ацильного донора и нуклеофила при получении амидов, пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, или при получении энантиомерно чистых соединений.
Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции гидролиза эфиров, амидов или пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, при получении ценных продуктов, в частности энантиомерно чистых соединений, 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот.
В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы карбоновые кислоты, их сложные эфиры и амиды, в частности амиды и эфиры аминокислот и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.
В качестве нуклеофилов в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы амины, аминоспирты, аминокислоты, их эфиры, амиды и соответствующие элементоорганические аналоги, в частности 6-аминопенициллановая и 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислоты.
В качестве субстратов в ферментативных реакциях гидролиза, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы ацильные производные аминов, аминоспиртов, аминокислот, их эфиров и амидов, в частности природные антибиотики.
Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.
Примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы приведены ниже. Изменения в аминокислотную последовательность пенициллинацилазы из E.coli вводили путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.
Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексина
Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (см. табл. 1).
| Таблица 1 | ||
| Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексина | ||
| [7-ADCA]/[D-PGA], mM | Выход цефалексина, % | |
| Дикий тип | βD484N | |
| 200/200 | 40 | 60 |
| 200/400 | 39 | 73 |
Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина
Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (табл. 2).
| Таблица 2 | |
| Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина | |
| Вариант пенициллинацилазы | Выход D-фенилглицил-глицина, % |
| Дикий тип | 17 |
| βD484N | 80 |
Описание экспериментальной части
Определение ферментативной активности
Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5, 0,1 М KCl.
Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [23]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.
ВЭЖХ анализ
Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250 x 4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH3CN/вода 30:70, 0,68 г/л KH2PO4, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.
Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина
Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.
Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина
Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-дезацетокси-цефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.
Литература
1. Bruggink, A., Roos, E.G., De Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of (3-lactam antibiotics. Org. Process. Res. Dev. (1998) 2, 128-133.
2. Svedas, V.K., Savchenko, M.V., Beltser, A.I., Guranda, D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1996) 799, 659-669.
3. Guranda, D.T., Khimiuk, A.I., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A., Svedas, V.K. An "easy-on, easy-off" protecting group for the enzymatic resolution of (±)-1-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. (2004) 15(18), 2901-2906.
4. Rajendhran, J., Gunasekaran, P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J. Biosci. Bioeng. (2004) 97, 1-13.
5.Gabor, E.M. and Janssen, D.B. in Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17,571-579.
6. Jager, SAW., Shapovalova, I.V., Jekel, PA, Alkema, W.B.L, Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues a!phaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.
7. Wang, J., Zhang, Q., Huang, H., Yuan, Z., Ding, D., Yang, S., Jiang, W. Increasing synthetic performance of penicillin G acylase from Bacillus megaterium by site-directed mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74, 1023-1030.
8. Polizzi, K.M., phaparro-Riggers, J.F., yazquez-Figueroa, E., Bommarius, A.S. Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase. Biotechnol. J. (2006) 1(5), 531-6.
9. Chandel, A.K., Rao, L.V, Narasu, M.L., Singh, O.V., The realm of penicillin G acylase in beta-lactam antibiotics. Enzyme Microb. Technol. (2008) 42, 199-207.
10. Prieto, I., Martin, J., Arche, R., Fernandez, P., Perez-Aranda, A., Barbero, J.L. Penicillin acylase mutants with altered site-directed activity from Kluyvera citrophila. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33, 553-559.
11. Shi, Y.F., Soumillion, P., Ueda, M. Effects of catalytic site mutations on active expression of phage fused penicillin acylase. J. Biotechnol. (2010) 145, 139-142.
12. Carboni, С., Kierkels, H.G., Gardossi, L, Tamiola, K., Janssen, D.B., Quaedflieg, P.J. Preparation of D-amino acids by enzymatic kinetic resolution using a mutant of penicillin-G acylase from E.coli. Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17, 245-251.
13. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Snijder, H.J., Keizer, E., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17, 473-480.
14. Abian, 0., Grazu, V., Hermoso, J., Gonzalez, R., Garcia, J.L., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M. Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 1249-1251.
15. Kasche, V., Galunsky, В., Ignatova, Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase ofAlcaligenesfaecalis. Eur. J. Biochem. (2003) 270, 4721-4728.
16. Wang, Т., Zhu, H., Ma, X., Ма, Y., Wei, D. Structure-based stabilization of an enzyme: the case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein Pept. Lett. (2006) 13, 177-183.
17. Choi, K.S., Kim, J.A., and Kang, H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. (1992) 174, 6270-6276.
18. Lee, H., Park, O.K., and Kang, H.S. Identification of a new activ site for autocatalytic processing of penicillin acylase precursor in Escherichia coli ATCC 11105. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 272, 199-204.
19. Forney, L.J., Wong, D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55(10), 2550.
20. Roa, A., Garcia, J.L, Salto, F., Cortes, E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. (1994), 303, P. 869.
21. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Kroezinga, E.H., de Vries, E., Floris, R., van der Laan, J.M., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase of Escherichia coli by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Engineering (2000) 13(12), 857-863.
22. Alkema, W.B.L, Dijkhuis, A., de Vries, E., and Janssen, D.B. The role of hydrophobic activ-site residues in substrate specificity and acyi transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.
23. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк, С.Ф., Березин, И.В. Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорган. химия (1977) 3, 546-553.
Claims (1)
- Мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116431/10A RU2564578C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116431/10A RU2564578C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012116431A RU2012116431A (ru) | 2013-11-10 |
| RU2564578C2 true RU2564578C2 (ru) | 2015-10-10 |
Family
ID=49516461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012116431/10A RU2564578C2 (ru) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2564578C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087533A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-11-25 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU512234A1 (ru) * | 1974-09-30 | 1976-04-30 | Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков | Штамм нра -3/5 -продуцент пенициллинацилазы |
| US6403356B1 (en) * | 1996-11-05 | 2002-06-11 | Bristol-Myers Squibb Co. | Mutant penicillin G acylases |
| US20050124029A1 (en) * | 2001-12-27 | 2005-06-09 | Alkema Wynand B.L. | Process for the preparation of a betha- lactam antibiotic with mutated penicillin acylase |
| US20110256585A1 (en) * | 2008-12-23 | 2011-10-20 | Jan Metske Van Der Laan | Mutant penicillin g acylases |
-
2012
- 2012-04-25 RU RU2012116431/10A patent/RU2564578C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU512234A1 (ru) * | 1974-09-30 | 1976-04-30 | Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков | Штамм нра -3/5 -продуцент пенициллинацилазы |
| US6403356B1 (en) * | 1996-11-05 | 2002-06-11 | Bristol-Myers Squibb Co. | Mutant penicillin G acylases |
| US20050124029A1 (en) * | 2001-12-27 | 2005-06-09 | Alkema Wynand B.L. | Process for the preparation of a betha- lactam antibiotic with mutated penicillin acylase |
| US20110256585A1 (en) * | 2008-12-23 | 2011-10-20 | Jan Metske Van Der Laan | Mutant penicillin g acylases |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087533A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-11-25 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用 |
| CN105087533B (zh) * | 2015-09-30 | 2018-03-27 | 湖南福来格生物技术有限公司 | 一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012116431A (ru) | 2013-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marešová et al. | Current state and perspectives of penicillin G acylase-based biocatalyses | |
| EP2367940B1 (en) | Mutant penicillin G acylases | |
| Sio et al. | Improved β-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts | |
| Arroyo et al. | Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art | |
| Grulich et al. | Perspectives and industrial potential of PGA selectivity and promiscuity | |
| Sambyal et al. | Exploitation of E. coli for the production of penicillin G amidase: a tool for the synthesis of semisynthetic β-lactam antibiotics | |
| Bečka et al. | Penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824: an efficient biocatalyst for syntheses of beta-lactam antibiotics under conditions employed in large-scale processes | |
| HU226348B1 (en) | Mutant penicillin g acylases | |
| Cobos-Puc et al. | Classical and new pharmaceutical uses of bacterial penicillin G acylase | |
| Houng et al. | Kinetic resolution of amino acid esters catalyzed by lipases | |
| CN109971743B (zh) | 来源于无色杆菌属ccm 4824的青霉素g酰化酶突变体及其应用 | |
| RU2564578C2 (ru) | МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
| Hassan | Production, immobilization and industrial uses of penicillin G acylase | |
| RU2381273C2 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора | |
| CN1327002C (zh) | 酶制备富集对映体的β－氨基酸的方法 | |
| RU2537845C2 (ru) | Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы | |
| Mateo et al. | Recent Advances in the Industrial Enzymatic Synthesis of Semi-Synthetic βLactam Antibiotics | |
| HUT67012A (en) | Method for separation of two solid components | |
| RU2576002C2 (ru) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из escherichia coli и применение мутантной пенициллинацилазы | |
| Spence et al. | Penicillin acylases | |
| RU2575304C2 (ru) | Способ улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы | |
| Grulich et al. | Helena Marešová, Martina Plačková | |
| Zhang et al. | Kinetically controlled synthesis of cefaclor with immobilized penicillin acylase in the presence of organic cosolvents | |
| Lata | Production, purification, immobilization and application of penicillin acylase from Acremonium sclerotigenum | |
| US20060292665A1 (en) | Glutaryl amidases and their uses |