RU2301524C1

RU2301524C1 - Cryoconserving agent for leucocytes

Info

Publication number: RU2301524C1
Application number: RU2006101031/15A
Authority: RU
Inventors: Евгений Павлович Сведенцов (RU); Евгений Павлович Сведенцов; Тать на Витальевна Туманова (RU); Татьяна Витальевна Туманова; Раиса Григорьевна Оводова (RU); Раиса Григорьевна Оводова; Юрий Семенович Оводов (RU); Юрий Семенович Оводов; Виктори Владимировна Головченко (RU); Виктория Владимировна Головченко; Ольга Нурзадиновна Соломина (RU); Ольга Нурзадиновна Соломина; Оксана Олеговна Щеглова (RU); Оксана Олеговна Щеглова; Сергей В чеславович Утемов (RU); Сергей Вячеславович Утемов; ев Андрей Александрович Кост (RU); Андрей Александрович Костяев
Original assignee: Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской Академии Наук; ФГУ "Кировский НИИ гематологии и переливания крови" Росздрава"
Priority date: 2006-01-10
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2007-06-27

Abstract

FIELD: medicine, physiology.

SUBSTANCE: claimed conserving agent contains in optimal ratio lemnan, glycerol, oxymethylethylpyridine succinate, water for injections, and sodium hydroxide for pH adjusting to 7/907/4. Leucoconcentrate is exposed with cryoconserving agent for 18 min, and cooled in according to exponential program to -10°C. Agent of present invention makes it possible to preserve 99.75±0.71 % of physiologically full-value leucocytes (neurophylic cells) under fast reheating.

EFFECT: cryoconserving agent for leucocytes of improved quality.

3 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания криоконсерванта для лейкоцитов.The invention relates to medicine and physiology and for the creation of a cryopreservative for leukocytes.

В качестве прототипа нами выбран протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (Патент на изобретение №2261595), который включает модежель, глицерин и оксиметилэтилпиридина сукцинат.As a prototype, we selected a tread solution for preserving white blood cells at a temperature of -10 ° C (Patent for invention No. 2261595), which includes model, glycerin and oxymethylethylpyridine succinate.

Существенным недостатком прототипа является то, что данный раствор не может быть реализован, т.к. модежель, входящий в него, перестал выпускаться промышленностью, кроме того, модежель не обладает стимулирующим действием на фагоциты, в частности, на нейтрофилы.A significant disadvantage of the prototype is that this solution cannot be implemented, because the model included in it has ceased to be produced by industry, in addition, the model does not have a stimulating effect on phagocytes, in particular, on neutrophils.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание криоконсерванта для лейкоцитов, позволяющего сохранить лейкоциты в физиологически полноценном состоянии при температуре -10°С.The technical result of the present invention is the creation of a cryopreservative for leukocytes, which allows you to save white blood cells in a physiologically complete state at a temperature of -10 ° C.

Технический результат достигается тем, что в предложенный криоконсервант для лейкоцитов включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - лемнан, обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -10°С выраженный криобиологический (технический) эффект и оказывающий стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов: под действием лемнана увеличивается способность нейтрофилов поглощать частицы латекса на 20-50% (Ovodov Yu.S. et.al. // XIX Intern. Carbohydr. Symp. August 9-14, 1998, San Diego, 1998 - P.DPO 41; Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф....дис. канд. биол. наук; Сыктывкар, 1999-19 с.), поэтому включение лемнана в криоконсервант, не требующий отмывания после выхода нейтрофильных клеток из криогипобиоза, усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 100% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев: Наукова думка, 1978. - с.5-64) и производное янтарной кислоты оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные функции мембран клеток, тормозит перекисное окисление липидов. Сукцинат участвует в энергетическом обмене клетки (Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - с.317-319 и с.321-322).The technical result is achieved by the fact that the following ingredients are included in the proposed cryopreservative for leukocytes: plant polysaccharide - lemnan, which has an exocellular cryoprotective effect as a polysaccharide (pectin), which harmoniously complements the endocellular cold-reflecting effect of glycerin on cells and makes the combined cryoconserved preservative up to -10 ° С pronounced cryobiological (technical) effect and having a stimulating effect on phagocytic activity neutrophils: under the influence of lemnan, the ability of neutrophils to absorb latex particles increases by 20-50% (Ovodov Yu.S. et.al. // XIX Intern. Carbohydr. Symp. August 9-14, 1998, San Diego, 1998 - P.DPO 41; Popov S.V. Functional reactions of neutrophils and macrophages to plant polysaccharides: Abstract ... Ph.D. Candidate of Biological Sciences; Syktyvkar, 1999-19 pp.), Therefore, inclusion of Lemnan in a cryopreservative that does not require washing after neutrophil release cells from cryohypobiosis, enhances and activates their phagocytic ability and contributes to 100% of their morphological safety; glycerin of the highest grade - cryoprotectant of endocellular action (Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V. Cryoprotectants: Kiev: Naukova Dumka, 1978. - p. 5-64) and amber derivative oxymethylethylpyridine succinate (briefly OMEPS), which has an antioxidant and membrane-stabilizing effect, restores impaired functions of cell membranes, inhibits lipid peroxidation. Succinate is involved in the energy metabolism of the cell (Metzler D. Biochemistry. Chemical reactions in a living cell. T.2. - M .: Mir, 1980. - p.317-319 and p.321-322).

Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.The cryopreservative has a pH of 7.0-7.4, the most favorable for blood cells. Its ingredients are tropic to white blood cells and are produced in the Russian Federation.

Пример использования средстваAn example of using the tool

Консервант, содержащий лемнан в концентрации 0,3%, глицерин - 7%, оксиметилэтилпиридина сукцинат - 0,3%, воду для инъекций до 100 мл и 4 М. раствор гидроксид натрия (1-2 кап.) до рН раствора 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 18 мин при комнатной температуре, помещают на 24 часа в электрический морозильник (в 3-литровую ванну с этиловым 96° спиртом, охлажденным до -10°С). Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 2-3 секунд при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в сек). Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.A preservative containing lemnan at a concentration of 0.3%, glycerol - 7%, oxymethylethylpyridine succinate - 0.3%, water for injection up to 100 ml and 4 M. sodium hydroxide solution (1-2 cap.) To a solution pH of 7.0 -7.4, mixed in a 1: 1 ratio with the leukocyte concentrate in the Compoplast polymer container. The mixture, having stood for 18 min at room temperature, is placed for 24 hours in an electric freezer (in a 3-liter bath with ethyl alcohol 96 °, cooled to -10 ° C). Defrosting is carried out in a 20-liter water bath at a temperature of + 38 ° C for 2-3 seconds with intensive shaking of the container (3-4 times per second). The temperature of the thawed leukoconcentrate in the container should be within + 2 ÷ + 4 ° С. Then determine the morphological safety of thawed leukocyte cells, their viability by vital dye (with 1% eosin solution) and the phagocytic activity of neutrophils in a sample with latex (by Potapova S.G. et al., G. Problems of hematology and blood transfusion. - 1977. - N 9. - p. 58-59). The calculation is expressed as a percentage in comparison with similar indicators of cells before freezing.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».Experimental studies were performed on the basis of blood cryophysiology laboratories of the Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences and the preservation of blood and tissues of the Federal State Institution “Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of Roszdrav”.

Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов представлен в таблице 1.Three preservative options for leukoconcentrate, differing in the concentration of their constituent ingredients, were studied. The composition of the options is presented in table 1.

Таблица 1Table 1 Характеристика состава различных вариантов криоконсерванта для сохранения лейкоцитов при температуре -10°С в расчете на 100 г сухого вещества (в г)Characterization of the composition of various variants of the cryopreservative for preserving white blood cells at a temperature of -10 ° C per 100 g of dry matter (in g) Номер варианта криоконсервантаCryopreservative Option Number Состав хладоограждающего раствораThe composition of the cooling solution Лемнан, в%Lemnan, in% Глицерин, в%Glycerin,% ОМЭПС, в%OMEPS, in% Вода для инъекций, в мл.Water for injection, in ml. 1one 0,200.20 7,07.0 0,300.30 До 100Up to 100 22 0,300.30 7,07.0 0,300.30 До 100Up to 100 33 0,400.40 7,07.0 0,400.40 До 100Up to 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта N1, N2 и N3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.The final concentration of substances that are part of the cryopreservative options N1, N2 and N3, after mixing 1: 1 with leukoconcentrate, turned out to be 2 times lower than the initial one (table 2), the pH of the medium did not change, remaining within 7.0-7.4.

Таблица 2.Table 2. Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейкоцитным концентратомThe final concentration of the ingredients in various variants of the cryopreservative after mixing with leukocyte concentrate Номер варианта криоконсервантаCryopreservative Option Number Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесьюThe final concentration of ingredients in various variants of the cryopreservative after mixing with leukemia suspension Лемнан, в%Lemnan, in% Глицерин, в%Glycerin,% ОМЭПС, в%OMEPS, in% Вода для инъекций, в мл.Water for injection, in ml. 1one 0,100.10 0,350.35 0,150.15 До 200Up to 200 22 0,150.15 0,350.35 0,150.15 До 200Up to 200 33 0,200.20 0,350.35 0,200.20 До 200Up to 200

Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (табл.3).Leukocyte studies were performed on morphological safety and functional activity (table 3).

Таблица 3.Table 3. Результаты после замораживания до -10°С и оттаивания лейкоцитов с различными вариантами предложенного криоконсервантаThe results after freezing to -10 ° C and thawing leukocytes with various variants of the proposed cryopreservation Вариант консервирующего раствораPreservation Solution Option Показатели, в % к исходному уровню. n=7Indicators, in% of the initial level. n = 7 Жизнеспособность лейкоцитовWhite blood cell viability Морфологическая сохранность гранулоцитовThe morphological preservation of granulocytes Фагоцитарная активность нейтрофиловPhagocytic activity of neutrophils Верхний предел дозировок ингредиентов раствораThe upper limit of the dosage of the ingredients of the solution 83,50±12,15*83.50 ± 12.15 * 95,50±5,7595.50 ± 5.75 98,75±2,9998.75 ± 2.99 Оптимальное соотношение ингредиентов раствораThe optimal ratio of the ingredients of the solution 97,58±1,7397.58 ± 1.73 100,00±0,00100.00 ± 0.00 99,75±0,7199.75 ± 0.71 Нижний предел дозировок ингредиентов раствораThe lower limit of the dosage of the ingredients of the solution 81,62±15,96*81.62 ± 15.96 * 78,86±10,54*78.86 ± 10.54 * 86,14±5,61*86.14 ± 5.61 * * - различие достоверное (р<0,05)* - significant difference (p <0.05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - отогрева при использовании криконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.The main criterion for assessing the biological usefulness of leukocytes, primarily neutrophils, is the determination of their phagocytic activity. This test, which most reliably characterizes the physiological properties of cells, was the best after cooling - heating using a cryopreservative with the optimal ratio of ingredients.

Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов до -10°С.The ready-made optimal variant of the cryopreservative is transparent, with a yellowish tint, odorless, pH 7.0-7.4, mixes well with leukocyte concentrate in all ratios, does not cause cell conglomeration and provides functional and morphological preservation at a positive temperature until freezing. The cryopreservative exhibits a pronounced cold-protective property when the white blood cells are cooled to -10 ° C.

Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -10°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.Thus, the developed cryopreservative when freezing leukoconcentrate to -10 ° C ensured the preservation of a high percentage of physiologically active leukocyte cells. It can be used in medical and biological institutions.

Claims

Cryopreservative for leukocytes, characterized in that it contains lemnan, glycerin, oxymethylethylpyridine succinate and water for injection in the following ratio of ingredients,%:

Lemnan 0.2-0.4 Glycerol 7.0 Oxymethylethylpyridine Succinate 0.3-0.4 Water for injections Up to 100 ml Sodium hydroxide 1 M solution To pH 7.0-7.4