RU2439877C2

RU2439877C2 - Cryoprotective solution for moderately hypothermic leukocyte preservation (-40°c)

Info

Publication number: RU2439877C2
Application number: RU2009147672/21A
Authority: RU
Inventors: Евгений Павлович Сведенцов (RU); Евгений Павлович Сведенцов; Татьяна Витальевна Полежаева (RU); Татьяна Витальевна Полежаева; Денис Сергеевич Лаптев (RU); Денис Сергеевич Лаптев; Ольга Нурзадиновна Соломина (RU); Ольга Нурзадиновна Соломина; Оксана Олеговна Зайцева (RU); Оксана Олеговна Зайцева; Андрей Николаевич Худяков (RU); Андрей Николаевич Худяков; Сергей Вячеславович Утемов (RU); Сергей Вячеславович Утемов; Филипп Сергеевич Шерстнев (RU); Филипп Сергеевич Шерстнев
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; ФГУ "Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2012-01-20
Also published as: RU2009147672A

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention relates to physiology, cryobiology and medicine. A cryoprotective solution contains glycerin, oxymethylethylpyridine succinate, hydroxyethylstarch, tri-based sodium citrate in the following proportions, %: glycerin 6.0- 3.6; oxymethylethylpyridine succinate 0.2-0.01; tri-based sodium citrate 0,2; 6% hydroxyethylstarch up to 100 ml. The pH value of the solution is 7.0-7.4.

EFFECT: invention ensures a high yield of physiologically adequate cells preserved.

3 tbl

Description

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию криопротекторного раствора для консервирования лейкоцитов, в частности, человека.The invention relates to physiology, cryobiology and medicine, in particular to the creation of a cryoprotective solution for preserving white blood cells, in particular, humans.

В качестве прототипа нами выбран хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре // Сведенцов Е.П. и соавт., 2002 г. (Патент РФ №2184449), включающий гексаметиленбистетраоксиэтил мочевину (ГМБТОЭМ), фумарат натрия, лимонную кислоту и воду для инъекций.As a prototype, we chose a cold-enclosing solution for freezing white blood cells at a moderately low temperature // Swedentsov EP et al., 2002 (RF Patent No. 2184449), including hexamethylene bistetraoxyethyl urea (GMBTOEM), sodium fumarate, citric acid and water for injection.

Существенным недостатком прототипа является то, что ГМБТОЭМ имеет весьма высокую стоимость и не может широко применяться для консервирования лейкоцитов.A significant disadvantage of the prototype is that GMBTOEM has a very high cost and cannot be widely used for preserving white blood cells.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание криозащитного раствора для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре, обеспечивающего высокую морфологическую сохранность лейкоцитарных клеток.The technical result of the invention is the creation of a cryoprotective solution for freezing white blood cells at a moderately low temperature, providing high morphological preservation of white blood cells.

Технический результат достигается тем, что криозащитный раствор содержит эндоцеллюлярный криопротектор глицерин, сукцинат оксиметилэтилпиридина (ОМЭПС), обладающий антиоксидантным, мембраностабилизирующим и умеренным антигипоксическим действием, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) с экзоцеллюлярным хладоограждающим действием, а также в качестве антикоагулятна трехзамещенный цитрат натрия. Данный раствор создает оптимальную среду для клеток, pH которой составляет 7,0-7,4. Его ингредиенты тропны к лейкоцитам и все производятся в Российской Федерации.The technical result is achieved by the fact that the cryoprotective solution contains an endocellular cryoprotectant glycerin, oxymethylethylpyridine succinate (OMEPS), which has an antioxidant, membrane stabilizing and moderate antihypoxic effect, hydroxyethyl starch (HES) with an exothermic antifungal effect as well. This solution creates an optimal environment for cells, the pH of which is 7.0-7.4. Its ingredients are tropic to white blood cells and are all produced in the Russian Federation.

Пример использования средстваAn example of using the tool

Криопротекторый раствор, содержащий глицерин в концентрации 4,8%, сукцинат оксиметилэтилпиридина (ОМЭПС) 0,1%, трехзамещенный цитрат натрия 0,2%, следы гидроксида натрия, ГЭК 6% до 100 мл и имеющий pH 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт 300». Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре (+21°С), охлаждают по нелинейной программе в электроморозильнике в 4-литровой спиртовой ванне, заполненной 96° этиловым спиртом, охлажденным до -28°С, в течение 20 минут. Замороженный лейкоцитный концентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющего температуру -40°С. Отогревают образцы до +2÷+4°С в 20 литровой водяной ванне при +38°С при активном перемешивании содержимого колебательными движениями.A cryoprotective solution containing 4.8% glycerol, hydroxymethylethylpyridine succinate (OMEPS) 0.1%, trisubstituted sodium citrate 0.2%, traces of sodium hydroxide, HES 6% to 100 ml and having a pH of 7.0-7.4 , mixed in a ratio of 1: 1 with leukocyte concentrate in a polymer container "Compoplast 300". The mixture, having stood for 20 minutes at room temperature (+ 21 ° С), is cooled according to a nonlinear program in an electric freezer in a 4-liter alcohol bath filled with 96 ° ethanol, cooled to -28 ° С, for 20 minutes. The frozen leukocyte concentrate is transferred to the chamber of an electric freezer having a temperature of -40 ° C. Samples are heated to + 2 ÷ + 4 ° С in a 20 liter water bath at + 38 ° С with active mixing of the contents by vibrational movements.

Определяют морфологическую сохранность лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до охлаждения.Determine the morphological safety of leukocyte cells, their viability by vital dye (with 1% eosin solution) and the phagocytic activity of neutrophils in a sample with latex (according to Potapova SG et al., G. Problems of hematology and blood transfusion. - 1977. - N9 . - p. 58-59). Calculation is expressed as a percentage in comparison with similar cells before cooling.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА».Experimental studies were carried out on the basis of blood cryophysiology laboratories of the Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences and the preservation of blood and tissues of the Federal State Institution “Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion FMBA”.

Изучены три варианта консервирующего раствора для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов раствора представлен в таблице 1.Three versions of a preservative solution for leukoconcentrate, differing in the concentration of their constituent ingredients, were studied. The composition of the solution options is presented in table 1.

Таблица 1.Table 1. Характеристика состава различных вариантов раствора для консервирования лейкоцитов при -40°С в расчете на 100 г сухого вещества (г).Characterization of the composition of the various solutions for preserving white blood cells at -40 ° C per 100 g of dry matter (g). Номер варианта консервирующего раствораPreservation Solution Option Number Состав консервирующего раствораThe composition of the preservation solution Глицерин в %Glycerin in% ОМЭПС в %OMEPS in% Трехзамещенный цитрат натрия в %Trisubstituted sodium citrate in% ГЭК 6% в млHES 6% in ml 1one 6,006.00 0,200.20 0,20.2 До 100Up to 100 22 4,804.80 0,100.10 0,20.2 До 100Up to 100 33 3,603.60 0,010.01 0,20.2 До 100Up to 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов N1, N2 и N3 после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом, оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), pH среды оставалась в пределах 7,0-7,4.The final concentration of the substances that make up the solutions N1, N2 and N3 after mixing 1: 1 with leukoconcentrate turned out to be 2 times lower than the initial (table 2), the pH of the medium remained in the range of 7.0-7.4.

Таблица 2.Table 2. Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах консервирующего раствора после смешивания с лейкоцитным концентратом.The final concentration of ingredients in various versions of the preservative solution after mixing with leukocyte concentrate. Номер варианта консервирующего раствораPreservation Solution Option Number Состав консервирующего раствораThe composition of the preservation solution Глицерин в %Glycerin in% ОМЭПС в %OMEPS in% Трехзамещенный цитрат натрия в %Trisubstituted sodium citrate in% ГЭК 3% в млHES 3% in ml 1one 3,003.00 0,100.10 0,10.1 До 200Up to 200 22 2,402.40 0,050.05 0,10.1 До 200Up to 200 33 1,801.80 0,0050.005 0,10.1 До 200Up to 200

Исследования лейкоцитов выполняли на морфологическую сохранность, жизнеспособность и функциональную активность (табл.3).Leukocyte studies were performed on morphological safety, viability and functional activity (table 3).

Таблица 3.Table 3. Результаты после охлаждения до -40°С, хранения при данной температуре в течение 1 суток и отогрева лейкоцитов с различными вариантами предложенного криопротекторного раствораThe results after cooling to -40 ° C, storage at a given temperature for 1 day and warming of white blood cells with various variants of the proposed cryoprotective solution Вариант консервирующего раствораPreservation Solution Option Показатели, в % к исходному уровню (n=6).Indicators, in% of the initial level (n = 6). Морфологическая сохранность гранулоцитовThe morphological preservation of granulocytes Жизнеспособность лейкоцитовWhite blood cell viability Фагоцитарная активность нейтрофиловPhagocytic activity of neutrophils Нижний предел дозировок ингредиентов раствораThe lower limit of the dosage of the ingredients of the solution 85,0±11,585.0 ± 11.5 60,4±2,0*60.4 ± 2.0 * 33,5±9,0*33.5 ± 9.0 * Оптимальное соотношение ингредиентов раствораThe optimal ratio of the ingredients of the solution 96,2±8,596.2 ± 8.5 82,0±4,182.0 ± 4.1 72,0±7,672.0 ± 7.6 Верхний предел дозировок ингредиентов раствораThe upper limit of the dosage of the ingredients of the solution 88,2±7,188.2 ± 7.1 51,0±7,4*51.0 ± 7.4 * 47,8±6,6*47.8 ± 6.6 * * - различие достоверное (p<0,05)* - significant difference (p <0.05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - хранения - отогрева биообъекта при использовании раствора с оптимальным соотношением ингредиентов и достоверно отличался от данных, полученных при использовании консервирующего раствора с верхним и нижним пределами дозировок ингредиентов.The main criterion for assessing the biological usefulness of leukocytes, primarily neutrophils, is the determination of their phagocytic activity. This test, which most reliably characterizes the physiological properties of cells, was the best after cooling - storing - heating a biological object using a solution with the optimal ratio of ingredients and significantly differed from the data obtained using a preservative solution with upper and lower dosage limits of the ingredients.

Готовый оптимальный раствор прозрачен, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток, повреждения их мембран и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при -40°. Раствор обладает хладоограждающим действием при охлаждении лейкоцитов до -40°С, не нуждается в отмывании от размороженных лейкоцитных клеток, т.к. конечная концентация глицерина 3,3% и ниже нетоксична для клеток крови.The ready-made optimal solution is transparent, odorless, pH = 7.0-7.4, mixes well with leukocyte concentrate in all ratios, does not cause conglomeration of cells, damage to their membranes and ensures functional and morphological safety at -40 °. The solution has a cold-shielding effect upon cooling of leukocytes to -40 ° C, does not need to be washed from thawed leukocyte cells, because a final concentration of glycerol of 3.3% or lower is not toxic to blood cells.

Таким образом, предложенный консервирующий раствор позволяет сохранять высокий процент физиологически активных лейкоцитарных клеток при температуре -40°С в течение 1 суток. Данный раствор может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля для сохранности биообъектов в условиях электроморозильника (-40°С).Thus, the proposed preservation solution allows you to maintain a high percentage of physiologically active leukocyte cells at a temperature of -40 ° C for 1 day. This solution can be used in medical and biological institutions for the preservation of biological objects in an electric freezer (-40 ° C).

Claims

A cryoprotective solution for preserving leukocytes at a moderately low temperature (-40 ° C), characterized in that it contains glycerin, hydroxyethyl ethyl pyridine succinate, hydroxyethyl starch, trisubstituted sodium citrate in the following ratio of ingredients,%:
Glycerol 6.0-3.6 Oxymethylethylpyridine Succinate 0.2-0.01 Trisubstituted Sodium Citrate 0.2 Hydroxyethyl starch 6% up to 100 ml solution pH 7.0-7.4