[go: up one dir, main page]

RS65104B1 - Onkolitičke imunoterapije - Google Patents

Onkolitičke imunoterapije

Info

Publication number
RS65104B1
RS65104B1 RS20240082A RSP20240082A RS65104B1 RS 65104 B1 RS65104 B1 RS 65104B1 RS 20240082 A RS20240082 A RS 20240082A RS P20240082 A RSP20240082 A RS P20240082A RS 65104 B1 RS65104 B1 RS 65104B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
virus
deletion
tumor
trif
oncolytic
Prior art date
Application number
RS20240082A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen Howard Thorne
Original Assignee
Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education filed Critical Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education
Publication of RS65104B1 publication Critical patent/RS65104B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
1. UVOD
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na onkolitičke viruse vakcinije koji su modifikovani da bi promovisali antitumorski imunitet i/ili smanjili odgovor antitela domaćina na virus.
2. POZADINA PRONALASKA
[0002] Onkolitički virusi (OV) su virusi sa replikacijom koja je prirodna ili modifikovana da bi bili selektivni za tumorske ćelije<1-3>. Mnoštvo različitih kičmi virusa ispitivano je kao OV, uključujući sojeve virusa vakcinije (VV).<4-11>Najmanje tri odvojena onkolitička vektora vakcinije prošla su testiranje Faze I, uključujući soj vvDD.<6,7>VV OV, JX-594<4,12>(Jennerex), nedavno je pokazao veoma ohrabrujuće odgovore u ispitivanjima Faze II za hepatocelularni karcinom (HCC), uključujući sistemsku isporuku tumorima<13,14>. Dalje, prijavljeni su ohrabrujući rezultati Faze III za virus herpesa HSV OV (T-Vec, Amgen<15,16>) u terapiji melanoma (16% odgovora, u odnosu na 2% u kontrolnoj grupi). Kao takvi, pravi potencijal OV u lečenju kancera počeo je da se otkriva (izvan originalnog ONYX-015 (H-101) soja adenovirusa<17,18>koji ostaje jedina odobrena OV terapija na bilo kom tržištu<19>).
[0003] Uprkos ovom obećanju, potpuni odgovori sa OV ostaju retki. Značajno, OV sojevi prve i druge generacije pre svega su projektovani da uništavaju tumorske ćelije kroz selektivnu replikaciju dovodeći direktno do lize ćelija. Pored toga, i JX-594 i T-Vec eksprimiraju transgen citokina (GM-CSF) za koji se očekuje da pojača limfocite domaćina.<12,14,20,21>Predklinička ispitivanja pokazala su kritični značaj imunskog odgovora u terapijskoj aktivnosti onkolitičkog VV, pri čemu (i) miševi su uniformno otporni na ponovno izazivanje nakon potpunog odgovora posle VV terapije, što ukazuje na apsolutni zahtev za indukcijom antitumorskog adaptivnog imuniteta<22>; (ii) efekti vakcine VV demonstrirali su veću terapijsku korist u odnosu na ekvivalentne DC vakcine<23>; (iii) pri čemu je VV infekcija tumora proizvela karakterističan citokinski profil ('Imunološka konstanta odbacivanja'<24>); (iv) pri čemu je VV terapija smanjila broj imunosupresivnih ćelija u tumoru (MDSC, T-reg i M2 makrofagi)<25>; (v) pri čemu je imunski odgovor, koji je podignut VV terapijom, mogao dobro da iskoreni rezidualni tumor i metastaze nakon što je virus očišćen, pružajući dugotrajan imunološki nadzor da bi se sprečio recidiv<22,25,26>; i (vi) u nekim ispitivanjima čini se da robusna replikacija virusa zapravo nije potrebna za terapijski efekat<27,28>. Stoga, imunoterapijski efekti OV, posebno VV, su najmanje isto značajni kao direktni onkolitički efekti i verovatno bi ove vektore trebalo, pre svega, posmatrati kao imunoterapije.
[0004] Značajno je da trenutni klinički vektori nisu dizajnirani kao imunoterapeutici (mimo ekspresije pojedinačnih citokina) i ova oblast ostaje relativno nedovoljno istražena. Kao takvi, postoji ogroman neispunjen potencijal za poboljšanje onkolitičkih vektora optimizovanjem njihovih interakcija sa imunskim sistemom domaćina i za stvaranje vektora sposobnih za in situ vakcinaciju protiv relevantnih tumorskih antigena. Alternativno, većina tradicionalnih terapijskih pristupa vakcinama protiv kancera imala je ograničen uspeh u klinici naročito protiv većih tumora, uprkos dokazu o uspešnoj imunizaciji<29->
<31>. Stoga su takođe potrebni novi pristupi vakcinama, idealno posredovanje u indukciji odgovora protiv relevantnih antigena u svakom tumoru, prevazilaženje supresije čak i unutar većih tumora i poboljšanje usmeravanja T-ćelija ka ciljnim tumorima.
3. SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Prema prvom aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je onkolitički virus vakcinije u skladu sa patentnim zahtevom 1 ovde.
[0006] Ovaj pronalazak odnosi se na "imunoonkolitičke" viruse vakcinije koji su modifikovani da promovišu antitumorski imunitet i/ili smanjuju imunski odgovor i odgovor antitela domaćina na virus. Zasnovan je, najmanje delom, na otkriću poboljšane inhibicije razvoja tumora pomoću onkolitičkog virusa vakcinije koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije i/ili tretira enzimom sijalidaza (za koje se veruje da smanjuju TLR2 aktivaciju i da smanjuju odgovor antitela domaćina na virus); i/ili nosi modifikacije ili delecije nukleinske kiseline genoma virusa, koja kodira proizvod koji smanjuje T ćelijski imunitet (virusni protein koji vezuje interleukin-18); i/ili nosi nukleinsku kiselinu koja kodira proizvod koji (i) pojačava indukciju citotoksičnih T limfocita (TRIF) i/ili (ii) smanjuje tumorske supresorske ćelije mijeloidnog porekla (MDSC) smanjenjem prostaglandina E2. Prema tome, ovaj opis obezbeđuje imunoonkolitičke viruse vakcinije i postupke njihove primene u lečenju kancera.
4. KRATAK OPIS NACRTA
[0007]
FIG.1A-C. (A) WR.ΔC12L virus pokazuje selektivnost prema tumoru in vivo u odnosu na WR roditeljski virus. C57BL/6 miševi koji nose CMT-93 tumore tretirani su IV sa 5e8 PFU virusa, i miševi su žrtvovani u prethodno određenim vremenskim tačkama nakon terapije. Virusne PFU su kvantifikovane u različitim tkivima post mortem nakon homogenizacije. (B) Poboljšani antitumorski efekti WR.ΔC12L. Miševi koji nose potkožne CMT-93 tumore tretirani su IV jednom dozom (1e8 PFU) virusa i praćeno je preživljavanje (definisano je kao vreme za koje je zapremina tumora dostigla 1000mm<3>kao što je određeno merenjem kaliperom). (C) Proizvodnja IFN-γ (kao marker proizvodnje efektorskih T-ćelija) iz splenocita oporavljena je iz miševa prethodno tretiranih naznačenim virusom i nakon ex vivo izlaganja WR.
FIG.2A-E. Deglikozilacija omotača virusa vakcinije. (A) Imunoblot koji pokazuje deglikozilaciju proteina omotača virusa vakcinije. Prečišćeni WR i WR deglikozilovani virusi su poremećeni i blotirani pomoću anti-B5R antitela. Smanjenje mase proteina odgovara deglikozilaciji B5R proteina. (B) Deglikozilacija virusnog omotača nije imala efekta na infektivnost virusa Vakcinije. Različite mišje tumorske ćelijske linije su inficirane sa TK- ili njegovom deglikozilovanom verzijom pri MOI od 1, i virusna ekspresija luciferaze izmerena je 3 sata nakon infekcije bioluminiscentnim snimanjem. Srednje vrednosti SD 3 nezavisna eksperimenta su ucrtane. (C) Deglikozilacija smanjuje TLR2 aktivaciju in vitro. HEK293 ćelije koje eksprimiraju mišji TLR2 transfektovane su sa pNiFty (TLR-reporter plazmid signalnog puta).24 sata nakon transfekcije, ćelije su inficirane pri MOI od 1 sa WR ili WR deglikozilovanim i TLR2 aktivacija je kvantifikovana 24 sata nakon infekcije, bioluminiscentnim snimanjem. Prikazane su srednje vrednosti SD 3 nezavisna eksperimenta (izvedena četvorostruko). (D) STAT3 fosforilacija je iscrpljena u limfocitima slezine miševa kojima je ubrizgana deglikozilovana Vakcinija. Procenat pSTAT1-pSTAT3+ limfocita određen je protočnom citometrijom. PBS i PAM(3)CSK(4) korišćeni su kao kontrole. Vrednosti za pojedinačne miševe i srednje vrednosti ±SEM različitih tretiranja su ucrtane. (E) Deglikozilacija omotača Vakcinije povećala je ekspresiju virusnog gena iz tumora in vivo. BALB/c miševi koji nose potkožne ksenografte Renca ćelija (adenokarcinom bubrega miševa) randomizirani su i ubrizgana im je jedna intravenska doza od 1×10<8>PFU po mišu TK- ili deglikozilovanog TK-.
Kinetika ekspresije virusnog gena unutar tumora praćena je bioluminiscentnim snimanjem virusne ekspresije luciferaze. Srednje vrednosti za 12-13 životinja SD su ucrtane. *, značajno P<0.05 u poređenju sa PBS ili Kontrolom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- ili WR grupom. φ, značajno P<0.05 u poređenju sa PAM(3)CSK(4) grupom.
FIG.3A-D. Ablacija TLR2 aktivacije deglikozilacijom dovodi do povećanih terapijskih efekata. (A) Tretiranje soja vakcinije WR enzimom sijalidaza (DS) dovelo je do gubitka aktivacije TLR2 signalnog puta u in vitro modelu (NF-kB aktivacija u HEK293 ćelijama transfektovanim da eksprimiraju TLR2). (B) DS WR virus je pokazao značajno poboljšanu sistemsku isporuku mišjim tumorima (4T1 potkožni tumori u BALB/c miševima sa virusnom isporukom IV i virusnom ekspresijom transgena za luciferazu u tumoru određeni su 24h kasnije bioluminiscentnim snimanjem (N.B. ne-tumorska tkiva nisu pokazala nikakvu razliku u unosu virusa). (C) Antitumorski efekat u istom modelu pokazao je terapijsku prednost DS virusa. (D) Gubitak TLR2 aktivacije (u TLR2 nokaut transgenom mišu) nakon infekcije vakcinijom dovodi do značajno smanjene indukcije neutrališućeg antitela protiv virusa (neutrališuće antitelo izmereno kao sposobnost različitih razblaženja mišjeg seruma prikupljenog 14d nakon tretiranja sa WR da bi se sprečila virusna ekspresija transgena za luciferazu nakon mešanja sa WR.TK-Luc+ i infekcija BSC-1 ćelijskog sloja)
FIG.4A-C. (A) Šematski dijagram koji predstavlja konstrukt TK-TRIF virusa i šematski dijagram koji predstavlja konstrukt TK-DAI virusa. (B) Korišćeni su ELISA testovi da bi se odredile koncentracije TRIF u ćelijama sa inficiranim sa TK- i TK-TRIF. (C) Western blot koji prikazuje ekspresiju DAI iz TK-DAI reference.
FIG.5A-C. (A) TRIF ekspresija iz vakcinije pojačava proizvodnju IFN tipa I in vitro, čak i iznad one od B 18R-soja. (B) Proizvodnja CTL povećana TRIF ekspresijom in vivo. (C) Dalje poboljšan terapijski efekat in vivo nakon jedne IV isporuke 1e8 PFU virusa BALB/c miševima koji nose potkožne Renca tumore.
FIG.6A-D. Onkolitički virus vakcinije koji eksprimira mišji TRIF protein povećao je aktivaciju TLR-reagujućih puteva i oslobađanje proinflamatornih citokina i hemokina. (A-B) Aktivacija NF-κB (A) i IRF3 (B) puteva nakon infekcije sa TK-TRIF i TK-DAI. Korišćeni su ELISA testovi da bi se odredile koncentracije pIKKβ i IRF3 na ekstrakte citoplazme i jedra, tim redom, kod 4T1 ili MEF ćelija inficiranih sa TK-, TK-TRIF, ili TK-DAI pri MOI od 1. Analize su izvedene 24 sata nakon infekcije. Podaci su dobijeni četvorostruko iz 2 nezavisna eksperimenta, i prikazani su putem dijagrama kao vrednost promene vs TK- SD. Isprekidana linija označava nivo TK- aktivacije. (C) Oslobađanje citokina i hemokina in vitro nakon TK-TRIF i TK-DAI infekcije. IL-6, IP-10, TNF-α, i IFN-β koncentracija u supernatantu Renca, 4T1, MC38 i MEF ćelija ocenjena je Luminex testom 24 sata nakon infekcije sa TK-, TK-TRIF ili TK-DAI (MOI od 1). Podaci su prikazani kao vrednost promene vs TK- SD (2 nezavisna eksperimenta). Isprekidana linija označava TK- koncentracije. (D) In vivo intratumorska koncentracija citokina i hemokina. BALB/c miševi sa uspostavljenim Renca potkožnim ksenograftima randomizirani su i ubrizgana im je jedna intravenska doza od 1×10<8>PFU TK- ili TK-TRIF po mišu. Vrednost promene vs TK- iz 4-5 miševa SD prikazana je putem dijagrama. Isprekidana linija označava TK- koncentracije. *, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- grupom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-DAI grupom.
FIG.7A-E. Korišćeni su ELISA testovi da bi se odredila koncentracija NF-κB (A), HMGB1 (B) i Hsp-70 (C) u ćelijama inficiranim sa TK-, TK-TRIF ili TK-DAI pri MOI od 1. Analize su izvedene 24 sata nakon infekcije. Podaci su dobijeni i ucrtani kao vrednost promene vs TK- SD. Isprekidana linija označava nivo TK- aktivacije. Nivoi pomoćnih T-ćelija (D) i regulatornih T-ćelija (E) ispitivani su u odgovoru na infekciju sa TK- ili TK-TRIF virusom.
FIG.8A-D. Replikacija i antitumorska aktivnost TK-TRIF i TK-DAI. (A) Virusna proizvodnja TK-TRIF i TK-DAI u mišjim tumorskim ćelijama. Različite tumorske ćelijske linije inficirane su pri MOI od 1 i virusna proizvodnja izmerena je testom plaka u različitim trenucima vremena. Prinos virusa ocenjen je četvorostruko za svaku ćelijsku liniju, izvođenjem dva nezavisna eksperimenta.
Srednje vrednosti SD su ucrtane. (B) Uporedna citotoksičnost TK-TRIF i TK-DAI. Ćelije su inficirane naznačenim virusima u dozama u opsegu od 75 do 0.00025 PFU/ćelija. Prikazane su EC50vrednosti (MOI potrebna da izazove smanjenje od 50% u vijabilnosti ćelijske kulture) 4. dana nakon infekcije. Četiri različita ponavljanja kvantifikovana su za svaku ćelijsku liniju i srednja vrednost za svaki MOI je prikazana. (C-D) Ekspresija virusnog gena i antitumorska efikasnost in vivo. Renca ili MC38 ksenografti implantirani su u BALB/c ili C57BL/6 miševe, tim redom, i miševima su ubrizgani PBS ili 1×10<8>PFU TK-, TK-TRIF ili TK-DAI kroz repnu venu. Virusna ekspresija luciferaze u tumorima (C) i izmerene su zapremine tumora (D) u naznačenim vremenskim tačkama. n=12-15 miševi/grupa SE. *, značajno P<0.05 u poređenju sa PBS grupom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- grupom. φ, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-DAI grupom.
FIG.9A-F. (A) Ekspresija virusnog gena TK-TRIF i TK-DAI u mišjim tumorskim ćelijama. Različite tumorske ćelijske linije inficirane su sa MOI od 1 i virusna ekspresija luciferaze je kvantifikovana bioluminiscentnim snimanjem u različitim vremenskim tačkama. Ekspresija luciferaze ocenjena je četvorostruko za svaku ćelijsku liniju, izvođenjem dva nezavisna eksperimenta. Srednje vrednosti SD su ucrtane. (B) Procenat apoptotskih ćelija nakon infekcije sa TK-TRIF i TK-DAI. Panel mišjih tumorskih ćelijskih linija inficiran je naznačenim virusima korišćenjem MOI od 1.48 sati nakon infekcije, procenat nektrotičkih i apoptotskih ćelija određen je protočnom citometrijom bojenjem sa PI i Aneksinom V. Dva nezavisna eksperimenta izvedena su i srednje vrednosti SD su ucrtane. (C-D) TK-TRIF poboljšava antitumorsku efikasnost TK-GMCSF u poluortotopičnom modelu mlečnih žlezda.4T1 ćelije implantirane su u masni jastučić mlečnih žlezda BALB/c miševa i, kada je tumor ustanovljen, miševima su ubrizgani PBS ili 1×10<8>pfu TK-, TK-TRIF ili TK-GMCSF kroz repnu venu. Virusna ekspresija luciferaze unutar tumora (C) i zapremine tumora (D) izmerene su u naznačenim vremenskim tačkama. n=12-14 miševi/grupa SE. (E-F) TK-TRIF poboljšava preživljavanje miševa koji nose tumore. BALB/c ili C57BL/6 miševi koji nose Renca (E) ili MC38 (F) ksenografte, tim redom, tretirani su kao na Fig.3d i krajnja tačka ustanovljena je u zapreminama tumora ≥750 mm<3>. Kaplan-Mejerove krive preživljavanja su ucrtane. n=12-15 miševi/grupa. *, značajno P<0.05 u poređenju sa PBS ili kontrolom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- grupom. φ, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-GMCSF grupom. ω, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-DAI grupom.
FIG.10A-E. (A) Promena telesne mase nakon intravenskog davanja deglikozilovanog TK-TRIF. BALB/C miševima su ubrizgani intravenski sa 1×10<8>PFU po mišu TK-, TK-TRIF ili deglikozilovanog TK-TRIF. Davanje fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (PBS) korišćeno je u kontrolnoj grupi. TK-injektirani miševi pokazali su smanjenje telesne mase više od 10% 6 dana nakon infekcije virusom, dok su miševi kojima su ubrizgani TK-TRIF i deglikozilovan TK-TRIF pokazali sličan profil mase kao oni kojima je ubrizgan PBS. (B) Ekspresija virusnog gena in vivo nakon davanja deglikozilovanog TK-TRIF. Renca tumori implantirani su u BALB/c miševe, i miševima su ubrizgani PBS ili 1×10<8>pfu TK-, TK-TRIF ili deglikozilovanog TK-TRIF kroz repnu venu. Virusna ekspresija luciferaze unutar tumora izmerena je u naznačenim vremenskim tačkama. n=12-14 miševi/grupa SE. (C-D) Preživljavanje miševa koji nose tumor tretiranih deglikozilovanim TK-TRIF. (C-D) Renca (C) ili MC38 (D) ksenografti ustanovljeni su u BALB/C ili C57BL/6 miševima, tim redom, i tretirani jednom intravenskom dozom od 1×10<8>PFU naznačenih virusa ili PBS. Krajnja tačka ustanovljena je pri zapremini tumora ≥750 mm<3>i Kaplan-Mejerove krive preživljavanja su ucrtane. n=12-15 miševi/grupa. (E) Deglikozilovan TK-TRIF povećao je preživljavanje u poređenju sa TK-GMCSF tretiranjem. Miševi (BALB/c koji nose potkožne Renca tumore) tretirani su injekcijom PBS ili jednom dozom od 1×10<8>pfu TK-GMCSF ili deglikozilovanog TK-TRIF (n=10-12 po grupi) kroz repnu venu. Kaplan-Mejerove krive preživljavanja dobijene su nakon dostizanja krajnje tačke od ≥750 mm<3>za zapreminu tumora. *, značajno P<0.05 u poređenju sa PBS grupom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- grupom. φ, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-deglikozilovanom grupom. ω, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-TRIF grupom. Ψ, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-GMCSF grupom.
FIG.11A-F. Kombinacija deglikozilacije omotača i ekspresije mišjeg TRIF pojačala je antitumorske ćelijske odgovore i pokazala je potentnu antitumorsku efikasnost. (A-B) Čelijski imunski odgovori na virus Vakcinije i tumorske ćelije ocenjeni su IFN-γ ELISpot testom.7 dana nakon davanja virusa, slezine su sakupljene iz miševa kojima je intravenski ubrizgano 1×10<8>PFU naznačenih virusa ili PBS (BALB/c miševi koji nose Renca ksenografte) i ocenjena im je količina CTL koji prepoznaju virus Vakcinije (A) ili Renca ćelije (B). Prikazane su vrednosti za pojedinačne miševe i srednje vrednosti ±SEM. (C) Titri neutrališućih antitela u serumu. Test neutralizacije izveden je da bi se odredili cirkulišući nivoi antitela protiv Vakcinije za miševe kojima je ubrizgano 1×10<8>PFU TK-, TK-TRIF ili deglikozilovanog TK-TRIF. Nab titri određeni su najvećim razblaženjem seruma koje je dovelo do inhibicije infekcije od najmanje 50%. Vrednosti za pojedinačne miševe i srednje vrednosti ±SEM su ucrtane. (D-E) In vivo antitumorska aktivnost u različitim modelima. BALB/c koji nose Renca (D) ili C57BL/6 koji nose MC38 (E) ksenografte tumora tretirani su jednom intravenskom dozom naznačenih virusa (1×10<8>PFU/miš). Praćen je rast tumora merenjima kaliperom. Prikazane su srednje vrednosti 12-15 miševa po grupi SE. (F) Deglikozilovan TK-TRIF pokazao je veću antitumorsku aktivnost nego TK-GMCSF. BALB/c miševima koji nose Renca ksenografte je intravenski ubrizgana doza od 1×10<8>PFU/miš TK-GMCSF ili deglikozilovanog TK-TRIF. Relativna zapremina tumora nakon davanja virusa je ucrtana (n=12-15 miševi/grupa SE). *, značajno P<0.05 u poređenju sa PBS grupom. #, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- grupom. φ, značajno P<0.05 u poređenju sa TK- deglikozilovanom grupom. ω, značajno P<0.05 u poređenju sa TK-TRIF grupom.
FIG.12A-C. (A) Soj WR Vakcinije sa DS tretiranjem, C12L delecijom i mTRIF ekspresijom (nazvan UPCI-1812) pokazao je poboljšane antitumorske efekte kod BALB/c miševa koji nose 4T1 tumore u odnosu na trenutne kliničke sojeve WR.TK-GM-CSF+ (kao model soja JX-594). UPCI-1812 virus takođe je pokazao povećanu proizvodnju imunoterapeutskih citokina u tumorskom mikrookruženju uključujući (B) interferon gama i (C) interleukin-12.
FIG.13A-C. (A) Preživljavanje raznih tumorskih ćelijskih linija ispitivano je nakon virusne infekcije sa TK-. (B) Ekspresija virusnog gena u tumorima dobijenim iz BALB/c i C57BL/6 miševa kojima su implantirane određene tumorske ćelijske linije, i zapremina tumora dobijenih iz BALB/c i C57BL/6 kojima su implantirane određene tumorske ćelijske linije i koji su inficirani sa TK-. (C) Detekcija fosforilovanog Sp6 u mijeloidnim ćelijama u tumorima dobijenim iz BALB/c i C57BL/6 miševa kojima su implantirane određene tumorske ćelijske linije i koji su tretirani sa TK-.
FIG.14A-B. (A) Miševi koji ne nose tumor ili potkožne tumore izvedene iz LLC ili B16 ćelija (50-100mm<3>) tretirani su u okviru jedne intravenske injekcije od 1×10<7>PFU WR.TK-. Miševi (n=3 po grupi i vremenu) žrtvovani su u naznačenim vremenskim tačkama, a slezine i serum su oporavljeni. Splenociti su brzo fiksirani i permeabilizovani (prema našem ranije objavljenom protokolu) i zatim obojeni za phosflow da bi se otkrila aktivacija signalnih puteva. Ovo je izvedeno za regulatorne T-ćelije (CD3+CD4+CD8-FoxP3+CD25+), sa analizom pSTAT5, pS6 i Ki67; za CD4 T-ćelije (CD3+CD4+CD8-FOXP3-), sa analizom pS6, Ki67, CD44 i CD62L; i za CD8 T-ćelije (CD3+CD4-CD8+FoxP3-), sa analizom pS6, Ki67, CD44 i CD62L. (B) Nivoi neutrališućih antitela protiv virusa takođe su ispitani u serumu.
FIG.15A-B. (A) Koncentracija regulatornih T-ćelija i MDSC ćelija u različitim mišjim modelima tumora inficiranih sa TK-. (B) Koncentracija regulatornih T-ćelija, MDSC ćelija i CD8+ T-ćelija u 4T1 i MC38 mišjim modelima tumora inficiranih sa TK-.
FIG.16A-B. (A) Strategije gejtinga prikazane su za detekciju MDSC (levo) i T-ćelija i T-reg (desno) za splenocite ili ćelije oporavljene iz razgrađenih tumora. (B) Nivoi MDSC i T-reg u slezini prikazani su za miševe koji nose različite tumore.
FIG.17A-C. (A) TK- soj vakcinije pokazao je veoma slabu sposobnost da poveća srednju liniju preživljavanja (u odnosu na PBS kontrolu) u mišjim modelima tumora koji pokazuju visoke nivoe MDSC na osnovnoj liniji. Takođe, TK- virusna terapija može da smanji nivoe (B) T-reg u tretiranim tumorima, ali ne deluje na (C) MDSC nivoe.
FIG.18. Analiza imunskog odgovora kod miševa kojima su implantirane MC38 tumorske ćelije nakon tretiranja imunogenim sojevima vakcinije, GM-CSF, WR.TK-GM-CSF, WR.B 18R-IFNα+, WR.B 18R-IFNβ+ i WR.B 18R-IFNγ+ u poređenju sa imunskim odgovorom izazvanim TK-infekcijom.
FIG.19. Analiza imunskog odgovora kod miševa kojima su implantirane 4T1 tumorske ćelije nakon tretiranja imunogenim sojevima vakcinije, GM-CSF, WR.TK-GMCSF i WR.B18R-IFNβ+ u poređenju sa imunskim odgovorom izazvanim TK- infekcijom.
FIG.20. Ekspresija COX2 i HPGD nakon ekspresije WR-TK-HPGD ili tretiranja Cox 2 inhibitorom, Celekoksib. Beta-aktin detektovan je kao kontrola opterećenja. Ekspresija PGE2 određena je u Renca ćelijama nakon infekcije sa WR-TK-HPGD ili WR TK- ili tretiranja Celekoksibom.
FIG.21A-D. HPGD ekspresija od onkolitičke vakcinije smanjila je MDSC u tumoru i senzibilizuje rezistentne tumore na virusnu terapiju. (A) Efekat HPGD ekspresije na T-reg i MDSC nivoe u tumoru. Miševi koji nose Renca tumore tretirani su intratumorski, injekcijom sa malom dozom (1×10<7>PFU) naznačenog virusa i miševi su žrtvovani u naznačenim vremenskim tačkama, tumori su oporavljeni, razgrađeni i ispitani protočnom citometrijom kao pre. HPGD ekspresija smanjuje MDSC i T-reg nivoe (*p<0.05 u odnosu na kontrolu). (B) Poboljšana terapijska aktivnost WR.TK-.HPGD+. Miševi koji nose potkožne Renca ili MC38 tumore tretirani su jednom intratumorskom injekcijom PBS ili 1×10<7>PFU ili WR.TK- ili WR.TK-HPGD+ i praćen je naknadni rast tumora merenjem kaliperom (n=15 po grupi; WR.TK-HPGD+ značajno (p<0.05) su odložile rast tumora od 3. dana (RENCA) ili 7. dana (MC38) u poređenju sa WR.TK- i dovele do 3 potpuna odgovora za RENCA i 2 za MC38. Miševi iz bilo koje druge grupe nisu pokazali CR). (C) Poređenje rasta tumora i ekspresije virusnog gena za WR.TK-.HPGD+ tretiranje. Rast tumora za pojedinačne miševe sa Renca tumorima i tretiranih sa WR.TK-HPGD+ su ucrtane, u odnosu na PBS kontrolu (sivi stubić) i podeljeni su u dobre (puna linija) i najbolje (isprekidana linija) respondere. Signal bioluminiscencije (ekspresija virusnog gena) od tumora 1. i 5. dana normalizovan je na zapreminu tumora i prikazan je i za dobre i najbolje respondere. (D) HPGD ekspresija nije smanjila ekspresiju virusnog gena. Prikazana je ekspresija virusnog gena za luciferazu unutar tumora 24h nakon tretiranja sa WR.TK- ili WR.TK-HPGD+.
FIG.22. Zapremina tumora kao funkcija dana nakon tretiranja PBS kontrolom (CTL; krug), Western Reserve VV negativan na timidin kinazu (WR TK-; kvadrat) ili timidin kinaza (TK)-negativan Western Reserve VV koji nosi HPGD (WR TK- HPGD, trougao) (HPGD je mišji ekvivalent humanom 15-PGDH proteinu).
FIG.23A-D. Procenat MDSC u (A) slezini miševa inficiranih sa WR TK-; (B) slezini miševa inficiranih sa WR TK- HPGD; (C) tumoru miševa inficiranih sa WR TK-; i (D) tumoru miševa inficiranih sa WR TK- HPGD.
FIG.24A-D. HPGD ekspresija poboljšava imunski odgovor i menja promet imunskih ćelija tumoru. (A) Profili citokina i hemokina u tumoru nakon različitih tretiranja. Miševi koji nose RENCA tumore tretirani su kao što je naznačeno sa 1×10<7>PFU različitih virusnih sojeva IT i žrtvovani nakon 3 dana. Homogenati tumora ispitivani su Luminex testovima da bi se kvantifikovali različiti citokini i hemokini (*p<0.05). (B) Antitumorski CTL odgovor povećan je HPGD ekspresijom. Splenociti sakupljeni od miševa koji nose RENCA tumor 7 dana nakon naznačenih tretiranja kvantifikovani su za antitumorski CTL odgovor kao što je određeno pomoću ELISPOT (*p<0.06). (C) Sistemske promene u nivoima hemokina nakon različitih tretiranja. Serum prikupljen od miševa koji nose RENCA tumor 3 dana nakon naznačenih tretiranja kvantifikovan je za nivoe hemokina pomoču ELISA (p<0.05). (D) Aktivirane imunske ćelije poželjno ciljaju tumore inficirane virusom koji eksprimira HPGD. Miševima su implantirani bilateralni RENCA tumori i kada su dostigli 50-100mm<3>, injektirani su sa 1×10<7>PFU WR.TK- u jedan bok i WR.TK-HPGD+ u suprotni bok, nakon 24 h 1×10<7>aktivirane i Cy5.5 obeležene NK T (CIK) ćelije dostavljene su injekcijom u repnu venu.24h kasnije, miševi su snimljeni za bioluminiscenciju (Ekspresija virusnog gena) i fluorescenciju (promet NK T ćelija tumorima) (*p<0.05). Prikazan je reprezentativni primer snimanja fluorescencije.
FIG.25. COX2 ekspresija u tumorima inficiranim sa WR.TK-u poređenju sa netretiranim tumorima.
FIG.26A-B. (A) Preživljavanje različitih ćelijskih linija nakon infekcije sa TK-. (B) Virusna proizvodnja i genska ekspresija TK- u različitim tumorskim ćelijskim linijama.
FIG.27 prikazuje ekspresiju virusnog gena TK- inficiranih MC-38, LLC i AB12 mišjih modela tumora nakon 4 dana ili 5 dana od infekcije.
FIG.28. Rast tumora kao funkcija dana nakon tretiranja sa PBS ili infekcije deglikozilovanim WR.TK-TRIF+- (UPCI-1812), Western Reserve TK- nosećim HPGD (VV-HPGD) ili UPCI-1812 kombinovanim sa HPGD ekspresijom.
FIG.29. Poboljšana EEV proizvodnja (A34R mutacija K151E) dovodi do smanjenja neutrališućeg antitela protiv virusa (14 dana nakon IP isporuke WR ili EEV).
FIG.30. TRIF domeni. U humanoj TRIF aminokiselinskoj sekvenci postoje tri TRAF vezujuća domena i RHIM domen koji vezuje RIP1.
5. DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0008] Radi jasnoće opisa, a ne radi ograničenja, detaljan opis ovog pronalaska podeljen je u sledeće pododeljke:
(i) mutacije kičme virusa;
(ii) modifikacija glikozilacije virusa;
(iii) modifikacija koja promoviše T ćelijski odgovor;
(iv) modifikacija koja inhibira imunosupresiju;
(v) modifikacija koja pojačava širenje i aktivnost virus;
(vi) modifikovani virusi;
(vii) postupci za lečenje; i
(viii) kompleti.
[0009] Pojam "homologija" kao što se ovde koristi odnosi se na stepen homologije između sekvenci nukleinske kiseline ili aminokiselinskih sekvenci kao što je određeno upotrebom postupaka poznatih u ovoj oblasti, na primer, ali koji se ne ograničavaju na, softver kao što je BLAST ili FASTA.
5.1 MUTACIJE KIČME VIRUSA
[0010] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja ovog opisa, VV sadrži jednu ili više mutacija njegovog genoma koji favorizuje replikaciju virusa u ćeliji kancera i/ili povećanu indukciju imunskog odgovora Citotoksičnih T-Limfocita (CTL). Mutacija može biti umetanje, delecija ili supstitucija jedne ili više nukleinskih kiselina nativnog virusa.
[0011] U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, mutacija dovodi do smanjene funkcionalne ekspresije interleukin-18 vezujućeg proteina ("IL-18BP"). Kao neograničavajući primeri, (i) mutacija može dovesti do proteina koji se slabije vezuje za IL-18 u odnosu na nativni VV protein; (ii) mutacija može dovesti do ekspresije skraćenog proteina sa smanjenom ili odsutnom funkcionalnom aktivnošću; ili (iii) mutacija može obrisati IL-18BP gen. U određenom neograničavajućem primeru, mutacija može biti C12L delecija (npr., videti Symons et al., 2002, J. Gen. Virol.83:2833-2844). U određenim načinima ostvarivanja, C12L delecija može biti potpuna ili delimična delecija C12L. Na primer, a ne kao ograničenje, delimična delecija C12L može da uključuje mutaciju koja dovodi do delecije najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30% ili najmanje oko 40% ili više aminokiselinske sekvence C12L proteina.
[0012] U daljim neograničavajućim načinima ostvarivanja, kičma virusa može da sadrži, posebno ili pored jedne ili više mutacija (uključujući deleciju) u nukleinskoj kiselini koja kodira prethodno opisan IL-18BP, mutaciju u nukleinskoj kiselini koja kodira B8R (IFN gama vezujući protein; npr., videti Symons et al., 1995, Cell.81(4):551-60), B18R (protein koji vezuje IFN tipa I; npr., videti Colamonici et al., 1995, J. Biol. Chem.270(27):15974-8), A35R (inhibitor MHC II prezentacija; npr., videti Rehm et al., 2010, Virology.397(1):176-86 i Roper et al., 2006, J. Virol.80(1):306-13), B15R (IL-1β vezujući protein; npr., videti Alcami et al., 1992, Cell.71(1):153-67), proteine koji vezuju hemokin (B29R, G3R, H5R), STAT1 inhibitor (H1L); dsRNK ili PKR inhibitore kao što su E3L (npr., videti Chang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.89(11):4825-9) ili K3L (npr., videti Davies et al., 1993, J. Virol.67(3): 1688-92 i Langland et al., 2002, Virology.299(1):133-41); proteine slične Bcl-2 (kao što su N1, N2, B14, F1, C6, A46 i K7), ili njihovu kombinaciju.
5.2 MODIFIKACIJA GLIKOZILACIJE VIRUSA
[0013] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja ovog opisa, VV je tretiran nekim agensom koji modifikuje glikozilaciju. Na primer, ćeliji koja proizvodi VV može se dati inhibitor glikozilacije i/ili može se kultivisati u prisustvu inhibitora glikozilacije ili se VV može tretirati nekim agensom koji smanjuje ili uklanja ili modifikuje glikozilaciju. U određenim načinima ostvarivanja, VV može se podvrgnuti tretiranju kiselinom da bi se smanjila glikozilacija virusa. U određenim načinima ostvarivanja, VV ovog opisa može se proizvesti u ćelijskoj liniji koja nema funkciju glikozilacije, npr., zbog mutacija u jednom ili više enzima glikozilacije.
[0014] U određenim načinima ostvarivanja, VV tretiran nekim agensom koji smanjuje ili uklanja ili modifikuje glikozilaciju, npr., deglikozilovan virus, može imati manje od oko 90%, manje od oko 80%, manje od oko 70%, manje od oko 60%, manje od oko 50%, manje od oko 40%, manje od oko 30%, manje od oko 20% ili manje od oko 10% glikozilacije VV koji nije tretiran agensom koji modifikuje glikozilaciju.
[0015] U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, VV ovog opisa može se tretirati enzimom sijalidazom koji smanjuje ili uklanja ostatke sijalinske kiseline sa površine virusa (npr., omotač). U neograničavajućim načinima ostvarivanja, VV je tretiran enzimom sijalidazom pre davanja subjektu. U nekom posebnom neograničavajućem načinu ostvarivanja, enzim sijalidaza je enzim Sijalidaza A (Gliko Sijalidaza A, Šifra WS0042) na primer kao deo Glycopro Kompleta za enzimsku deglikozilaciju (Šifra proizvoda: GK80110, Prozim). U određenim načinima ostvarivanja, VV se može tretirati Sijalidazom A u kombinaciji sa N- i O-glikanazama. Ostali enzimi koji uklanjaju sijalinsku kiselinu ili koji cepaju glikozilne ostatke iz virusa mogu se takođe koristiti prema ovom opisu, uključujući, ali neograničavajući se na, neuraminidaze, PNGaze (npr., PNGaza A ili PNGaza F), β1-4 galaktozidazu, β-N-acetilglukozaminidazu, ili upotrebu hemijskih obrada kao što su b-eliminacija ili alkalije ili hidrazinoili.
[0016] Nevezujući se ni za kakvu posebnu teoriju, veruje se da smanjenje glikozilacije, na primer tretiranjem virusa vakcinije sijalidazom, smanjuje TLR2 aktivaciju i, time, odlaže sistemsku aktivaciju imunskog sistema tokom perioda isporuke virusa i/ili smanjuje proizvodnju neutrališućih antitela protiv virusa.
5.3 MODIFIKACIJE KOJE PROMOVIŠU T ĆELIJSKI ODGOVOR
[0017] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja ovog opisa, VV je modifikovan da uključuje jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju peptid ili protein koji promoviše T ćelijski odgovor. U određenim načinima ostvarivanja, peptid ili protein koji promoviše T-ćelijski odgovor može da promoviše ekspresiju jednog ili više proinflamatornih citokina. Na primer, a ne kao ograničenje, proinflamatorni citokini mogu da uključuju IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CCL5 i IP-10.
[0018] Neograničavajući primeri peptida ili proteina koji promoviše T ćelijski odgovor uključuju adapter sa Toll/IL-1R domenom koji indukuje IFN-β ("TRIF") ili njegov funkcionalni domen. U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina može da kodira humani TRIF koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u UniProtKB br. Q8ILTC6, ili aminokiselinsku sekvencu koja je s njom homologna najmanje oko 90 procenata, najmanje oko 95 procenata ili najmanje oko 98 procenata, ili mišji TRIF koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u UniProtKB br. Q80UF7, ili aminokiselinsku sekvencu koja je s njom homologna najmanje oko 90 procenata, najmanje oko 95 procenata ili najmanje oko 98 procenata.
[0019] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina može da kodira jedan ili više TRIF domena kao što je prikazano na FIG.30. U određenim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira neki peptid ili protein koji promoviše T ćelijski odgovor, npr., TRIF, može da se klonira u lokus gena timidin kinaze (TK) virusa kao što je prikazano na FIG.4A. Nukleinska kiselina koja kodira neki peptid ili protein koji promoviše T ćelijski odgovor može se radno vezati za neki promoter koji može dovesti do ekspresije nukleinske kiseline. Kao što se ovde koristi, "radno vezan" znači da je promoter na ispravnoj funkcionalnoj lokaciji i/ili orijentaciji u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline radi kontrole inicijacije transkripcije i/ili ekspresije te sekvence. U određenim načinima ostvarivanja, promoter je promoter vakcinije i/ili sintetički promoter vakcinije. U određenim načinima ostvarivanja, promoter je sintetički promoter vakcinije pSE/L. U određenim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira neki peptid ili protein koji promoviše T ćelijski odgovor radno je vezana za virusni p7.5 promoter.
[0020] U ostalim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina može da kodira faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija ("GM-CSF"), IL-12, IFN-γ ili IL-18. U određenim načinima ostvarivanja više od jedne takve nukleinske kiseline može da se inkorporira u VV.
5.4 MODIFIKACIJE KOJE INHIBIRAJU IMUNOSUPRESIJU
[0021] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja ovog opisa, VV je modifikovan da uključuje jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju neki peptid ili protein ili ribonukleinsku kiselinu ili mikro-RNK koja inhibira ili smanjuje imunosupresiju. Neograničavajući primeri mera imunosupresije uključuju: nivo supresorskih ćelija mijeloidnog porekla ("MDSC"); nivo M2 makrofaga; i nivo pomoćnih T ćelija versus supresorske regulatorne T ćelije. U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina kodira peptid ili protein ili ribonukleinsku kiselinu ili mikro-RNK koja smanjuje prostaglandin E2 aktivnost ("PGE2 antagonist"). U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina kodira neki peptid i/ili protein koji je PGE2 antagonist (kako se taj pojam ovde koristi) koji razgrađuje PGE2. U posebnom neograničavajućem primeru, protein koji razgrađuje PGE2 je 15-PGDH (humani) ili HPGD (mišji). Na primer, a ne kao ograničenje, 15-PGDH može da ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u UniProtKB br. P15428, ili aminokiselinsku sekvencu koja joj je homologna najmanje oko 90 procenata, najmanje oko 95 procenata ili najmanje oko 98 procenata, i nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH može da ima sekvencu nukleinske kiseline kao što je navedena u GenBank pristupni br. U63296.1, ili sekvencu nukleinske kiseline koja joj je homologna najmanje oko 90 procenata, najmanje oko 95 procenata ili najmanje oko 98 procenata. U daljim neograničavajućim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira izlučenu i rastvorenu verziju ekstracelularnog receptora za PGE2 može biti uključena u VV, na primer nukleinska kiselina koja kodira EP1, EP2, EP3 i/ili EP4, gde su EP3 i 4 višeg afiniteta. U određenim načinima ostvarivanja, jedan ili više peptida ili proteina koji inhibiraju ili smanjuju imunosupresiju mogu dovesti do smanjene ekspresije jednog ili više supresivnih hemokina kao što je, ali neograničavajući se na, CXCL12. U određenim načinima ostvarivanja, jedan ili više peptida ili proteina koji inhibiraju ili smanjuju imunosupresiju mogu dovesti do povećane ekspresije jednog ili više hemokina koji aktiviraju imunski sistem kao što su, ali neograničavajući se na, CXCL9, CXCL10 i CCL5.
[0022] U određenim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira PGE2 antagonist može da se klonira u lokus gena timidin kinaze (TK) virusa. Nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein PGE2 antagonista može biti radno vezana za bilo koji promoter koji može dovesti do ekspresije nukleinske kiseline. U određenim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein PGE2 antagonista je radno vezana za virusni p7.5 promoter. U određenim načinima ostvarivanja, promoter je promoter vakcinije i/ili sintetički promoter vakcinije. U određenim načinima ostvarivanja, promoter je sintetički promoter vakcinije pSE/L. U određenim načinima ostvarivanja, virus može da uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist i nukleinsku kiselinu koja kodira neki peptid ili protein koji promoviše T ćelijski odgovor pri čemu su obe radno vezane za promoter, npr., virusni p7.5 promoter, i klonirane u lokus gena timidin kinaze (TK) virusa.
[0023] U daljim neograničavajućim načinima ostvarivanja, imunoonkolitički virus ovog opisa može se dati zajedno sa nekim agensom koji inhibira ili smanjuje MDSC, uključujući, na primer, ali ne putem ograničenja, neko antitelo koje cilja površinski marker MDSC kao što je anti-CD33 antitelo ili njegov varijabilni region; anti-CD11b antitelo ili njegov varijabilni region; COX2 inhibitor, npr., celekoksib; sunitinib i/ili sva trans retinoinska kiselina (npr., videti Najjar i Finke, 2013, Frontiers in Oncology, 3(49) 1-9).
5.5 MODIFIKACIJE KOJE POBOLJŠAVAJU ŠIRENJE I AKTIVNOST VIRUSA
[0024] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja ovog opisa, VV se modifikuje da bi se poboljšalo širenje i/ili aktivnost virusa. U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, VV se modifikuje da bi se povećala količina ekstracelularnog oblika virusa sa omotačem koja se proizvodi, na primer, uvođenjem jedne ili više sledećih mutacija: A34R Lys151 u Glu; potpuna ili delimična delecija BSR; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R. U određenim načinima ostvarivanja, VV se modifikuje da bi uključio potpunu ili delimičnu deleciju B5R.
5.6 MODIFIKOVANI VIRUSI
[0025] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje imuno-onkolitički VV koji obuhvata jednu ili više, ili dve ili više, ili tri ili više, ili četiri ili više, sledećih modifikacija, kao što je opisano u prethodnim odeljcima:
(i) mutacija kičme virusa;
(ii) modifikacija glikozilacije virusa;
(iii) modifikacija koja promoviše T ćelijski odgovor;
(iv) modifikacija koja inhibira imunosupresiju; i/ili
(v) modifikacija koja pojačava širenje i aktivnost virusa.
[0026] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji obuhvata modifikaciju glikozilacije virusa i jednu ili više sledećih modifikacija, kao što je opisano u prethodnim odeljcima:
(i) mutacija kičme virusa;
(ii) modifikacija koja promoviše T ćelijski odgovor;
(iii) modifikacija koja inhibira imunosupresiju; i/ili
(iv) modifikacija koja pojačava širenje i aktivnost virusa.
[0027] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu i obuhvata ili nosi ili sadrži jednu ili više sledećih modifikacija, kao što je opisano u prethodnim odeljcima:
(i) mutacija kičme virusa;
(ii) modifikacija koja promoviše T ćelijski odgovor;
(iii) modifikacija koja inhibira imunosupresiju; i/ili
(iv) modifikacija koja pojačava širenje i aktivnost virusa.
[0028] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji ima smanjenu glikozilaciju (npr., sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i obuhvata ili nosi ili sadrži jednu ili više sledećih modifikacija, kao što je opisano u prethodnim odeljcima:
(i) mutacija kičme virusa;
(ii) modifikacija koja promoviše T ćelijski odgovor;
(iii) modifikacija koja inhibira imunosupresiju; i/ili
(iv) modifikacija koja pojačava širenje i aktivnost virusa.
[0029] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija u odnosu na nemodifikovan virus.
[0030] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira sijalidazom pre davanja domaćinu ili koji je na drugi način smanjio ostatke sijalinske kiseline u odnosu na nemodifikovan virus.
[0031] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF.
[0032] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD).
[0033] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R.
[0034] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija.
[0035] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili neki njegov funkcionalni domen.
[0036] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD).
[0037] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD),
U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R. U određenim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje deglikozilovan VV koji obuhvata potpunu ili delimičnu deleciju B5R.
[0038] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus, i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija. U određenim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje deglikozilovan VV koji obuhvata C12L deleciju.
[0039] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabrani iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija, i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R. U određenim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje deglikozilovan VV koji obuhvata C12L deleciju i B5R deleciju.
[0040] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen, i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija. U određenim načinima ostvarivanja, virus obuhvata C12L deleciju.
[0041] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD), i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija.
[0042] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje TK- VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen i nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD), i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija.
[0043] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R.
[0044] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD) i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R.
[0045] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen i nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD), i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R.
[0046] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV koji se tretira nekim agensom koji smanjuje količinu glikozilacije (npr., sijalinizacija) pre davanja domaćinu ili kojem je na neki drugi način smanjena glikozilacija (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus i dalje obuhvata ili nosi ili sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen i nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonist (npr., 15-PGDH ili HPGD), i dalje obuhvata jednu ili više modifikacija koje poboljšavaju širenje i aktivnost virusa, odabranih iz grupe koju čine A34R Lys151 u Glu mutacija; potpuna ili delimična delecija B5R; mutacija/delecija A36R i/ili mutacija/delecija A56R i obuhvata jednu ili više modifikacija kičme virusa, odabranih iz grupe koju čine mutacija koja smanjuje ekspresiju funkcionalnog IL-18BP (npr., C12L delecija), B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija, ili njihova kombinacija. U određenim načinima ostvarivanja, virus obuhvata C12L deleciju. U određenim načinima ostvarivanja, VV može da obuhvata C12L deleciju i B5R deleciju.
[0047] Prethodno opisane modifikacije mogu se proizvesti u VV (virus vakcinije) koji je poznat u ovoj oblasti. Neograničavajući primeri uključuju; Western Reserve soj, Copenhagen soj; Wyeth (NYCBOH) soj; Tian Tian soj; ili USSR soj (i videti reference 1 i 2, dole). Osnovni VV soj modifikovan kako je navedeno ovde može sam da obuhvata jednu ili više mutacija u odnosu na svoj roditeljski soj, na primer, ali bez ograničenja na, jednu ili više od sledećih: delecija u TK (tj., ovde označena kao "TK-"); delecija u VGF; SPI-1 delecija; i/ili SPI-2 delecija.
[0048] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(ii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; i/ili
(iii) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0049] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(ii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen;
(iii) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i/ili
(iv) C12L delecija.
[0050] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(ii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen;
(iii) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen;
(iv) C12L delecija; i/ili
(v) B5R delecija.
[0051] U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) TK delecija;
(ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(iii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; i/ili
(iv) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0052] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) TK delecija;
(ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(iii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen;
(iv) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i/ili
(v) C12L delecija.
[0053] U neograničavajućim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje VV sa sledećim modifikacijama:
(i) TK delecija;
(ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus;
(iii) nukleinska kiselina koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen;
(iv) nukleinska kiselina koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen;
(v) C12L delecija; i/ili
(vi) B5R delecija.
5.7 POSTUPCI ZA LEČENJE
[0054] Ovaj opis obezbeđuje postupak za smanjenje rasta ćelije kancera, koji obuhvata davanje, ćeliji kancera subjekta, efektivne količine imunoonkolitičkog VV kako je opisan ovde. Smanjenje rasta ćelije kancera može da se manifestuje, na primer, putem ćelijske smrti ili manje brzine replikacije ili smanjene brzine rasta tumora koji obuhvata tu ćeliju ili produženog preživljavanja subjekta koji sadrži ćeliju kancera.
[0055] "Subjekt" ili "pacijent," kako se ovde koriste naizmenično, odnosi se na humani ili neki nehumani subjekt. Neograničavajući primeri nehumanih subjekata uključuju nehumane primate, pse, mačke, miševe, pacove, zamorce, zečeve, svinje, živinu, konje, krave, koze, ovce, itd.
[0056] Ovaj opis obezbeđuje postupak za smanjenje rasta tumora, koji obuhvata davanje, tumoru, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV, kako je opisan ovde. Smanjenje rasta tumora može da se manifestuje, na primer, smanjenjem brzine rasta ili produženjem preživljavanja subjekta koji sadrži tumor.
[0057] Ovaj opis obezbeđuje postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom, koji obuhvata davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV kako je opisan ovde.
[0058] "Efektivna količina" u takvom postupku uključuje količinu koja smanjuje brzinu rasta ili širenje kancera ili koja produžava preživljavanje subjekta. U određenim načinima ostvarivanja, efektivna količina može da uključuje količinu koja je dovoljna da proizvede antikancerogeno dejstvo kod subjekta.
[0059] "Antikancerogeno dejstvo," kako se ovde koristi, odnosi se na jedno ili više od smanjenja ukupne mase ćelija kancera, smanjenja brzine rasta ćelija kancera, smanjenja proliferacije ćelija kancera, smanjenja mase tumora, smanjenja zapremine tumora, smanjenja proliferacije ćelija tumora, smanjenja brzine rasta tumora i/ili smanjenja metastaze tumora.
[0060] U određenim načinima ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje postupak za proizvodnju antikancerogenog dejstva kod subjekta sa nekim kancerom koji obuhvata davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV, kako je opisan ovde.
[0061] U posebnim neograničavajućim načinima ostvarivanja, količina datog VV (npr., doza) može biti između oko 10<3>i 10<11>jedinice za formiranje plaka (PFU), ili između oko 10<5>i 10<10>PFU, ili između oko 10<5>i 10<8>PFU, ili između oko 10<5>i 10<11>PFU ili između oko 10<8>i 10<11>PFU. Videti, takođe, Thorne and Kirn, 2009, Nat Rev Cancer 9: 64-71. Treba napomenuti da je ovde 10<X>alternativno izraženo kao 1eX. U određenim načinima ostvarivanja, onkolitički virus može se dati u jednoj dozi ili se može dati u više doza. U određenim načinima ostvarivanja gde se virus daje u više doza, doze se mogu dati uzastopno, npr., u dnevnim, nedeljnim ili mesečnim intervalima, ili kao odgovor na posebnu potrebu subjekta.
[0062] U određenim načinima ostvarivanja, imunoonkolitički virus može se dati u farmaceutskoj kompoziciji, pri čemu je virus prisutan u nekoj efektivnoj količini i kombinovan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. "Farmaceutski prihvatljiv," kako se ovde koristi, uključuje bilo kojeg nosača koji ne utiče na efektivnost biološke aktivnosti aktivnih sastojaka i/ili koji nije toksičan za pacijenta kojem se daje. Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača uključuju fiziološke rastvore sa fosfatnim puferom, vodu, emulzije kao što su ulje/voda, različite vrste agenasa za vlaženje i sterilne rastvore. Dodatni neograničavajući primeri farmaceutski kompatibilnih nosača mogu da uključuju gelove, bioadsorbabilne materijale matriksa, elemente za implantaciju koji sadrže onkolitički VV ili bilo koji drugi pogodni vehikulum, sredstva za isporuku ili doziranje ili materijal. Takvi nosači mogu se formulisati uobičajenim postupcima i mogu se dati subjektu u nekoj efektivnoj količini.
[0063] VV ovog opisa mogu se proizvesti postupcima koji su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. U određenim načinima ostvarivanja, VV može da se širi u odgovarajućim ćelijama domaćina, izoluje iz ćelija domaćina i čuva u uslovima koji promovišu stabilnost i integritet virusa, tako da se gubitak infektivnosti tokom vremena minimizira. Na primer, VV se može čuvati zamrzavanjem ili sušenjem, kao što je liofilizacijom. U određenim načinima ostvarivanja, pre davanja, čuvani VV može se rekonstituisati (ako je osušen radi skladištenja) i razblažiti u nekom farmaceutski prihvatljivom nosaču radi davanja.
[0064] Onkolitički virus može se dati subjektu pomoću standardnih postupaka za davanje. U određenim neograničavajućim načinima ostvarivanja, onkolitički virus može se dati sistemski. Alternativno ili dodatno, onkolitički virus se može dati injekcijom na mestu kancera, npr., lokacija tumora. Na primer, a ne kao ograničenje, način davanja može biti inhalacija, intranazalno, intravensko, intraarterijalno, intratekalno, intratumorsko, intraperitonealno, intramuskularno, potkožno, topikalno, intradermalno, lokalno regionalno, oralno davanje, ili njihove kombinacije. U određenim načinima ostvarivanja, onkolitički virus može se dati pacijentu iz izvora implantiranog u pacijentu. U određenim načinima ostvarivanja, davanje onkolitičkog virusa može se desiti kontinuiranom infuzijom tokom odabranog vremenskog perioda. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutske kompozicije mogu se dati direktno na lokaciju tumora, npr., putem direktne intratumorske injekcije.
[0065] Kanceri koji se mogu tretirati imunoonkolitičkom VV terapijom uključuju, ali nisu ograničeni na, adenokarcinom, osteosarkom, karcinom grlića materice, melanom, hepatocelularni karcinom, rak dojke, rak pluća, rak prostate, rak jajnika, leukemiju, limfom, karcinom bubrega, rak pankreasa, rak želuca, karcinom kolona, rak dvanaestopalačnog creva, multiformni glioblastom, astrocitom i sarkom.
[0066] U određenim načinima ostvarivanja, lečenje pomoću imunoonkolitičkog VV, kako je opisan ovde, može da se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više antikancerogenih agenasa. "Antikancerogeni agens," kako se ovde koristi, može biti bilo koji molekul, jedinjenje, hemikalija ili kompozicija koja ima antikancerogeno dejstvo. Antikancerogeni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, hemoterapijske agense, radioterapijske agense, citokine, inhibitore imunološke kontrolne tačke, antiangiogene agense, agense koji indukuju apoptozu, antikancerogena antitela i/ili agensi protiv ciklin-zavisne kinaze.
[0067] U određenim načinima ostvarivanja, lečenje korišćenjem imunoonkolitičkog VV može da se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili imunomodulatornih agenasa. Imunomodulatorni agens može da uključuje bilo koje jedinjenje, molekul ili supstancu koja može da suzbije imunitet protiv virusa povezan sa tumorom ili kancerom. U određenim načinima ostvarivanja, imunomodulatorni agens može da suzbije urođeni imunitet i/ili adaptivni imunitet prema onkolitičkom virusu. Neograničavajući primeri imunomodulatornih agenasa uključuju anti-CD33 antitelo ili njegov varijabilni region, anti-CD11b antitelo ili njegov varijabilni region, COX2 inhibitor, npr., celekoksib, citokine kao što su IL-12, GM-CSF, IL-2, IFNβ i IFNγ, i hemokine kao što su MIP-1, MCP-1 i IL-8. U određenim načinima ostvarivanja, imunomodulatorni agens uključuje inhibitore imunološke kontrolne tačke kao što su, ali neograničavajući se na, anti-CTLA4, anti-PD-1, anti-PDL1 i TLR agonisti (npr., Poli I:C).
[0068] "U kombinaciji sa," kako se ovde koristi, znači da se imunoonkolitički VV i jedan ili više agenasa daju subjektu kao deo režima ili plana lečenja. U određenim načinima ostvarivanja, upotreba u kombinaciji ne zahteva da se imunoonkolitički VV i jedan ili više agenasa fizički kombinuju pre davanja ili da se daju u istom vremenskom okviru. Na primer, a ne kao ograničenje, imunoonkolitički VV i jedan ili više agenasa mogu da se daju paralelno subjektu koji se tretira, ili mogu da se daju istovremeno ili uzastopno u bilo kom redosledu ili u različitim vremenskim tačkama.
[0069] Reference za postupke za lečenje terapijom u sledećim stavovima ovog pronalaska treba tumačiti kao reference za jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u tim postupcima.
[0070] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0071] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i (iv) C12L deleciju.
[0072] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; (iv) C12L deleciju; i (v) B5R deleciju.
[0073] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; i (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0074] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i (v) C12L deleciju.
[0075] Postupak za lečenje subjekta sa nekim kancerom uključuje davanje, subjektu, neke efektivne količine imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; (v) C12L deleciju; i (vi) B5R deleciju.
[0076] Postupci ovog opisa mogu dalje da uključuju davanje subjektu neke efektivne količine jednog ili više agenasa. Na primer, a ne kao ograničenje, agens može biti neki antikancerogeni agens i/ili neki imunomodulatorni agens, kako je opisan ovde.
5.8 KOMPLETI
[0077] Ovaj opis dalje obezbeđuje komplete koji obezbeđuju imunoonkolitički VV kako je opisan ovde. U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa može da uključuje imunoonkolitički VV ili farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata imunoonkolitički VV kako je opisan ovde. U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa može dalje da uključuje jednu ili više komponenata kao što su instrukcije za upotrebu, uređaji i dodatni reagensi, i komponente, kao što su epruvete, kontejneri i špricevi za izvođenje ovde opisanih postupaka. U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa može dalje da uključuje jedan ili više agenasa, npr., antikancerogene agense i/ili imunomodulatorne agense, koji se mogu dati u kombinaciji sa imunoonkolitičkim VV.
[0078] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa može da uključuje instrukcije za upotrebu, sredstvo za davanje imunoonkolitičkog VV subjektu, ili sredstvo za davanje dodatnog agensa ili jedinjenja subjektu. Na primer, a ne kao ograničenje, instrukcije mogu da uključuju opis imunoonkolitičkog VV i, opciono, ostalih komponenata uključenih u kompletu, i postupaka za davanje, uključujući postupke za određivanje odgovarajućeg stanja subjekta, odgovarajuće količine za doziranje i odgovarajućeg postupka primene za davanje imunoonkolitičkog VV. Instrukcije mogu, takođe, da uključuju uputstvo za praćenje subjekta tokom trajanja lečenja.
[0079] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa može da uključuje sredstvo za davanje imunoonkolitičkog VV subjektu. Bilo koje od mnoštva sredstava poznatih u ovoj oblasti za davanje lekova i farmaceutskih kompozicija može biti uključeno u ovde obezbeđene komplete. Na primer, a ne kao ograničenje, takva sredstva uključuju hipodermalnu iglu, intravensku iglu, kateter, injekcije bez igala, inhalator i dozator tečnosti kao što je kapaljka za oči. U određenim načinima ostvarivanja, imunoonkolitički VV koji se isporučuje sistemski, na primer, intravenskom injekcijom, može biti uključen u komplet sa hipodermalnom iglom i špricem.
[0080] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; i (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0081] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i (iv) C12L deleciju.
[0082] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (ii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; (iv) C12L deleciju; i (v) B5R deleciju.
[0083] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; i (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen.
[0084] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; i (v) C12L deleciju.
[0085] U određenim načinima ostvarivanja, komplet ovog opisa uključuje efektivnu količinu imunoonkolitičkog VV koji obuhvata: (i) TK deleciju; (ii) omotač sa smanjenom glikozilacijom (npr., smanjena sijalinizacija) u odnosu na nemodifikovan virus; (iii) nukleinsku kiselinu koja kodira TRIF ili njegov funkcionalni domen; (iv) nukleinsku kiselinu koja kodira 15-PGDH ili njen funkcionalni domen; (v) C12L deleciju; i (vi) B5R deleciju.
[0086] Sledeći Primeri dati su kako bi potpunije prikazali ovo otkrivanje, ali ih ne treba tumačiti kao da ograničavaju njegov obim.
6. PRIMER 1: EFEKAT MUTACIJE KIČME C12L
[0087] Western Reserve virus vakcinije (VV) negativan na timidin kinazu ("TK-") modifikovan je da bi se obrisao C12L. Western Reserve soj vakcinije dobijen je od BEI Resources (Manassas, VA), i svi korišćeni ili konstruisani rekombinantni virusi vakcinije zasnovani su na ovom soju.
[0088] Mutant virusa sa delecijom kojem nedostaje 40% C12L ORF konstruisan je korišćenjem prolazne dominantne selekcije (Falkner & Moss, 1990, J Virol.64(6): 3108-3111). Ćelije su inficirane vakcinijom divljeg tipa WR i istovremeno transfektovane plazmidom koji sadrži regione 3' i 5' iz C12L gena.
Omogućeno je da dođe do rekombinacije i selektibilni marker je korišćen da bi se odredili događaji rekombinacije. Virusi su određeni testom plaka na BSC-1 ćelijama, proizvedeni i prečišćeni kao što je prethodno opisano za in vivo upotrebu (Sampath, P et al. (2013) Mol. Ther., 21: 620-628).
[0089] C57BL/6 miševima koji nose CMT-93 tumor dato je 5 × 10<8>jedinica za formiranje plaka ("PFU") ili nemodifikovanog WR virusa ili virusa koji nosi C12L deleciju (WRΔC12L). Da bi se ispitala specifičnost virusa prema tumoru, količina virusa u mozgu, jetri, plućima i tumoru ocenjena je 1, 3 i 10 dana nakon infekcije. Rezultati, na FIG.1A, prikazuju da iako su približno ekvivalentne količine WR i WRΔC12L virusa pronađane u jetri, plućima i tumoru 1. dana nakon infekcije, do desetog dana otkriveno je veoma malo WRΔC12L virusa u netumorskom tkivu u odnosu na količinu otkrivenu u tumoru, pri čemu je razlika u ekspresiji u tumorskom/netumorskom tkivu bila mnogo manja za nemodifikovan WR virus.
[0090] Da bi se ocenio efekat C12L mutacije na preživljavanje, C57BL/6 miševi (nabavljeni od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) koji nose potkožne CMT-93 tumore tretirani su intravenski jednom dozom WR ili WRΔC12L virusa od 1 × 10<8>PFU, i zatim praćeni. Dok su svi miševi koji su primili WR virus umrli pre 60. dana nakon infekcije, nakon 70 dana 50 procenata WRΔC12L životinja bilo je i dalje živo (FIG.1B).
[0091] Životinje su najpre imunizovane sa WR ili WRΔC12L i T-ćelije iz ovih miševa (ili kontrolnih miševa) umešane su sa WR i dobijeni nivoi IFN-γ proizvodnje određeni su pomoću ELISA. Rezultati su prikazani na FIG.1C i pokazuju da je C12L delecija dovela do veće proizvodnje splenocita koji proizvode CTL ili IFN-γ.
7. PRIMER 2. EFEKAT TRETMANA DEGLIKOZILACIJOM
[0092] Da bi se ispitao efekat modifikacije glikozilacije površinskih proteina virusa, WR TK- VV, N-vezani i prosti O-vezani glikani, npr., sijalinska kiselina, uklonjeni su iz virusnog omotača upotrebom Sijalidaze A (Gliko Sijalidaza A, Šifra WS0042) ili koktela N- i O-glikanaza i Sijalidaze A (Glycopro Komplet za enzimsku deglikozilaciju, Šifra proizvoda: GK80110, Prozim). Ne-denaturišući protokol za deglikozilaciju virusa bio je da se uzme (i) 20 µl zaliha virusa; (ii) doda 17 µl dejonizovane vode; (iii) doda 10ul 5X reakcionog pufera; (iv) doda 1ul svakog od N-Glikanaze, Sijalidaze A i O-Glikanaze (ili bilo koji enzim sam korišćen sa 19ul dejonizovane vode); i (v) inkubira na 37°C tokom 16 sati pre upotrebe. Deglikozilacija virusa potvrđena je western blot analizom (FIG.2A).
[0093] Efekat deglikozilacije na infektivnost virusa ocenjena je u različitim mišjim tumorskim ćelijskim linijama inficiranim sa TK- ("WR" ili "WR.TK-) ili njenom deglikozilovanom verzijom ("TK- deglyc" i "DS WR.TK-") pri MOI od 1. HeLa (humani adenokarcinom grlića materice), Bsc-1 (normalne ćelije bubrega zelenih majmuna), 143B (humani osteosarkom), CV-1 (fibroblasti bubrega zelenih majmuna), Renca (adenokarcinom bubrega miševa) i 4T1 (rak dojke miševa) ćelijske linije obijene su od American Type Culture Collection (Manassas, VA). HEK293-mTLR2 ćelije su nabavljene od InvivoGen (San Diego, CA). MC38 (adenokarcinom kolona miševa) i MEF (embrionalni fibroblasti miševa) ćelijske linije su, tim redom, ljubazan dar od Dr. David Bartlett i Dr. Robert Sobol (Centar za rak Univerziteta u Pitsburgu). Sve ćelijske linije održavane su u preporučenim podlogama za kulturu koje sadrže 5-10% fetalnog goveđeg seruma i antibiotike na 37°C, 5% CO2. Infektivnost virusa određena je ispitivanjem ekspresije virusnog gena. Ekspresija virusnog gena izmerena je 3 sata nakon infekcije bioluminiscentnim snimanjem ekspresije luciferaze in vitro. Za kultivisane ćelije, 10 µl D-luciferina od 30 mg/ml (GoldBio, St Louis, MO) dodato je u 1 ml podloge za kulturu. Kao što je primećeno na FIG.2B, deglikozilacija virusnog omotača nije imala efekta na infektivnost virusa.
[0094] Efekat deglikozilacije na TLR2 aktivaciju ocenjen je u sistemu modela koji meri NF-κB aktivaciju u HEK293 ćelijama modifikovanim da eksprimiraju TLR2 (HEK293/mTLR2) i transfektovanim sa pNiFty, TLR-reporter plazmid signalnog puta. pNiFty (TLR-reporter plazmid signalnog puta-Luciferaza) dobijen je od InvivoGen i transfektovan u HEK293/mTLR2 ćelije upotrebom FuGENE HD reagensa za transfekciju (Promega, Madison, WI). HEK293/mTLR2 ćelije su inficirane pri MOI od 1 sa WR ili WR deglikozilovanom virusom i TLR2 aktivacija je kvantifikovana 24 sata nakon infekcije bioluminiscentnim snimanjem. Kao što je prikazano na FIG.2C, deglikozilacija virusa dovela je do manje aktivacije TLR2 in vitro u poređenju sa virusom koji nije deglikozilovan. Osim toga, i kao što se može videti na FIG.3A, deglikozilovan virus povezan je sa suštinski manjom TLR2 aktivacijom nego WR virus.
[0095] Deglikozilovan virus takođe je pokazao veću apsorpciju od strane tumora. Za ove eksperimente, gen za luciferazu pod kontrolom sintetičkog promotera vakcinije pE/L (Chakrabarti et al. (1997).
Biotechniques 23: 1094-1097) inkorporiran je u WR.TK- ili DS WR.TK- virus vakcinije ("WR.TK-Luc+" i "DS WR.TK-Luc+", tim redom), i uveden intravenski u BALB/c miševe (nabavljeni od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) koji nose 4T1 potkožni tumor. Ekspresija virusnog gena u tumoru potom je mogla da se izmeri bioluminiscentnim snimanjem ekspresije luciferaze in vivo. Za životinjske modele, doza od 4.5 mg D-luciferina injektirana je intraperitonealno po mišu pre snimanja. IVIS 2000 model (PerkinElmer, Waltham, MA) je korišćen za snimanje i snimci su ispitivani LivingImage softverom (PerkinElmer).
[0096] FIG.3B prikazuje da je 24 sata nakon infekcije, došlo do značajno veće ekspresije DS WR.TK-Luc+ virusa u tumoru u odnosu na njegov glikozilovani pandan. Ova razlika u apsorpciji nije primećena u netumorskim tkivima. FIG.3C prikazuje da je infekcija de-sijalinizovanim virusom dovela do manje zapremine tumora. Pored toga, BALB/c miševi koji nose potkožne ksenografte Renca ćelija (adenokarcinom bubrega miševa) su randomizirani i injektirani jednom intravenskom dozom od 1×10<8>PFU po mišu TK- ili deglikozilovanog TK- virusa. Kinetike ekspresije virusnog gena unutar tumora praćene su bioluminiscentnim snimanjem virusne ekspresije luciferaze. Kao što je prikazano na FIG.2E, deglikozilacija virusnog omotača povećala je gensku ekspresiju u tumorima in vivo.
[0097] Efekat deglikozilacije virusa na prisustvo pSTAT1-pSTAT3+ limfocita analiziran je kod C57BL/6 miševa injektiranih intravenski sa 1×10<7>PFU WR ili WR deglikozilovanog virusa. Slezine su sakupljene od C57BL/6 miševa 1 sat nakon injekcije naznačenih virusa i splenociti su izolovani, fiksirani na 1.6% PFA i permeabilizovani metanolom. Intracelularne analize imunobojena s dve boje izvedene su pomoću LSRFortessa protočnog citometra (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija). Splenociti su obojeni upotrebom PacificBlue antimišjih pSTAT1 i AlexaFluor647 antimišjih pSTAT3 antitela (BD Biosciences). Procenat pSTAT1-pSTAT3+ limfocita određen je protočnom citometrijom, i PBS i PAM(3)CSK(4) korišćeni su kao kontrole. FIG.2D prikazuje da je STAT3 fosforilacija iscrpljena u limfocitima slezine miševa kojima je ubrizgan deglikozilovan virus vakcinije.
[0098] Da bi se odredio imunski odgovor na virus in vivo, izvedeni su testovi sa neutrališućim antitelom. Ukratko, serum koji sadrži antitelo dobijen je od miševa tretiranih kako je naznačeno 14 dana nakon injekcije virusom i korišćeno je serijsko razblaživanje seruma (polazeći od 1/20) da bi se neutralizovalo 1000 PFU TK-virusa vakcinije.2×10<4>HeLa ćelija zasejano je po bunarčiću u 96-bunarčića i inficirane su mešavinom serum-virus.4 dana nakon infekcije, ploče su isprane sa PBS i apsorpcija je kvantifikovana nakon bojenja kultura upotrebom kompleta za neradioaktivno ispitivanje proliferacije ćelija (Promega, Madison, WI). IC50vrednosti (potrebno rastvaranje seruma da neutralizuje virus Vakcinije koji može da indukuje 50% ćelijske inhibicije) određene su iz krivih odgovora na dozu standardnom nelinearnom regresijom, upotrebom adaptirane Hill-ove jednačine. Kao što je prikazano na FIG.3D, količina neutrališućeg antitela protiv virusa veća je kod C57BL/6 miševa divljeg tipa nego kod miševa koji nose TLR2 nokaut mutaciju. Prema tome, manja TLR2 aktivacija povezana sa deglikozilovanim virusom može biti povezana sa manjom proizvodnjom antitela protiv virusa i poboljšanim antitumorskim odgovorom.
8. PRIMER 3. EFEKAT TRIF EKSPRESIJE
[0099] Nukleinska kiselina koja kodira mišji TRIF uvedena je u WR.TK-virus i ocenjen je njen efekat na T ćelije. TRIF je eksprimiran unutar lokusa timidin kinaze, eksprimiran od ranog/kasnog promotera virusa vakcinije p7.5 ("TK-TRIF" ili "WR.TK-.TRIF"; FIG.4A). Generisan je WR.TK- virus koji ima nukleinsku kiselinu koja kodira mišji DAI (DLM-1/ZBP1) eksprimiran od p7.5 i kloniran u lokus virusnog gena timidin kinaze ("TK-DAI"; FIG.4A).
[0100] ELISA je izvedena da bi se potvrdila ekspresija TRIF iz TK-TRIF virusa (FIG.4B). Za ELISA, korišćen je ELISA komplet za mišji TRIF da bi se odredila koncentracija TRIF u supernatantu ili ćelijski ekstrakt ćelija inficiranih pri MOI od 1 (PFU/ćelija) sa TK-TRIF. Kao što je prikazano na FIG.4B, TK-TRIF virus specifično je eksprimirao TRIF u odnosu na TK-. Western blot je korišćen da bi se potvrdila ekspresija DAI iz TK-DAI virusa (FIG.4C). Za western blot analizu, ćelijske kulture zasejane su na pločama sa 6-bunarčića i inficirane pri MOI od 5 (PFU/ćelija) i, 24 sata nakon infekcije, proteinski ekstrakti celih ćelija inkubirani su u puferu za ćelijsku lizu (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA) tokom 1 sata na 4°C. Prečišćeni uzorci (15 µg/traka) razdvojeni su upotrebom 10% SDS-PAGE gela i preneti u nitroceluloznu membranu. Mišji DAI protein detektovan je imunoblotingom membrana upotrebom poliklonalnog anti-DAI primarnog antitela (Rabbit, Abcam, Cambridge, MA) i poliklonalnog anti-zečjeg konjugovanog sa HRP (Goat, Thermo Scientific, Waltham, MA). Mišje monoklonalno anti-β aktin antitelo (SantaCruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) i peroksidaza-konjugovano anti-mišje antitelo (Goat, Thermo Scientific) korišćeni su za imunobloting β-aktina kao kontrola opterećenja. Kao što je prikazano na FIG.4C, TK-DAI virus specifično je eksprimirao DAI u odnosu na TK-.
[0101] Kao što je prikazano na FIG.5A, ekspresija TRIF dovela je do povećanja proizvodnje interferona tipa I limfocitima in vitro. Ekspresija TRIF je, takođe, povećala CTL proizvodnju in vivo, kao što je prikazano ELISpot testom (FIG.5B). Za ELISpot testove, splenociti su pripremljeni iz miševa. Splenociti su umešani sa tumorskim ćelijama ili su splenociti prethodno inficirani UV-deaktiviranim virusom vakcinije u odnosu 5: 1. Naivni splenociti iz svakom miša korišćeni su kao kontrola. Membranske filterske ploče sa 96-bunarčića (EMD Millipore, Billerica, MA) premazane sa 15 µg/ml monoklonalnog anti-mišjeg IFN-γ antitela AN18 (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH) korišćene su za testove. Ćelije su održavane tokom 48 sati na 37°C i tačkice su detektovane upotrebom 1 µg/ml biotinilovanog anti-mišjeg IFN-γ antitela R4-6A2-biotina (Mabtech). Ploče su razvijene upotrebom ABC kompleta i kompleta sa AEC supstratom za peroksidazu (Vektor Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Specifične tačkice su izbrojane i analizirane upotrebom ImunoSpot analizatora i softvera (CTL, Shaker Heights, OH).
[0102] Analiza oslobađanja citokina i hemokina in vitro i in vivo posle 24 sata nakon infekcije sa TK-, TK-TRIF ili TK-DAI (MOI od 1) izvedena je Luminex testom. Za supernatante ćelijskih kultura, korišćeni su Miliplex Mouse Cytokine Panel (5-plex) komplet od Milipore (Billerica, MA) i Mouse 2-plex testni komplet od Panomics (Redwood City, CA). Za lizate tumora, Cytokine Mouse 20-plex Panel komplet od Invitrogen (Carlsbad, CA) korišćen je za određivanje koncentracija u tumorima sakupljenim 4 dana nakon davanja virusa Vakcinije. Tumori su homogenizovani upotrebom Lysing Matrix D epruveta i FastPrep-24 instrumenta. Kao što je prikazano na FIG.6A i C, koncentracije pIKKβ, IL-6, IP-10, TNF-α i IFN-β povećane su značajno nakon infekcije sa TK-TRIF u poređenju sa TK- u različitim tumorskim ćelijskim linijama u poređenju sa TK-. Pored toga, BALB/c miševi sa ustanovljenim Renca potkožnim ksenograftima kojima je ubrizgana jedna intravenska doza od 1×10<8>PFU TK- ili TK-TRIF po mišu ispitivani su da bi se odredila in vivo intratumorska koncentracija citokina i hemokina.4 dana nakon injekcije, tumori su sakupljeni i koncentracija različitih citokina i hemokina određena je u lizatima tumora pomoću luminex ili ELISA testova. FIG.6D prikazuje da su intratumorske koncentracije INF-γ, IL-12, IP-10, TNF-α, IL-1β, GM-CSF i KC značajno povećale odgovor na TK-TRIF u poređenju sa TK-.
[0103] Aktivacija NF-κB i IRF3 puteva ispitivana je nakon infekcije sa TK-TRIF i TK-DAI. Korišćeni su ELISA testivi da bi se odredile koncentracije pIKKβ i IRF3 u ekstraktima citoplazme i jedra, tim redom, 4T1 ili MEF ćelija inficiranih sa TK-, TK-TRIF ili TK-DAI pri MOI od 1. Kao što je prikazano na FIG.6A i B, TK-TRIF povećao je aktivaciju NF-κB i IRF3 puteva signalizacije kao što je primećeno povećanjem koncentracije pIKKβ i IRF3 ekspresije posle 24 sata nakon infekcije. FIG.7A prikazuje da se fosforilacija NF-κB povećala nakon infekcije TK-TRIF i TK-DAI. HMGB1 i Hsp-70, koji funkcionišu kao regulatori NF-κB, takođe su pokazali izmenjenu ekspresiju nakon infekcije sa TK-TRIF (FIG.7B i 7C). Prisustvo CD4+ pomoćnih T ćelija i CD8+ citotoksičnih T-ćelija ispitivano je nakon infekcije sa TK-, TK-TRIF. Kao što je prikazano na FIG.7D i E, broj citotoksičnih T-ćelija i pomoćnih T-ćelija bio je veći kod miševa inficiranih sa TK-TRIF.
[0104] Analiza replikacije i antitumorske aktivnosti TK-TRIF izvedena je u različitim mišjim tumorskim ćelija. Različite tumorske ćelijske linije inficirane su sa MOI od 1 i virusna proizvodnja izmerena je ELISpot testom plaka, kako je opisan ovde, u različitim vremenskim tačkama. Kao što je prikazano na FIG.8A, virusna proizvodnja i TK-TIRF i TK-DAI bila je značajno manja u rezistentnim Renca ćelijama u odnosu na TK-, ali virusna proizvodnja TK-TIRF i TK-DAI u MC38 i 4T1 ćelijama bila je na sličnim nivoima kao i TK-(videti, takođe, FIG.9A).
[0105] Dalja analiza virusne ekspresije u tumorima i zapremina tumora izvedena je u BALB/c ili C57BL/6 miševima kojima su implantirani Renca ili MC38 ksenografti, tim redom, i BALB/c miševima kojima su implantirani 4T1 ksenografti. BALB/c ili C57BL/6 miševima ubrizgani su PBS ili 1×10<8>PFU TK-, TK-TRIF ili TK-DAI kroz repnu venu. Za 4T1 poluortotopični model, 2×10<5>4T1 ćelija implantirano je u masni jastučić mlečne žlezde BALB/C ženskih miševa. FIG.8C prikazuje da je ekspresija virusnog gena za TK-TRIF i TK-DAI bila na manjem nivou u tumorima Renca ili MC38 ksenografta implantiranih u BALB/c ili C57BL/6 miševe, tim redom, u odnosu na ekspresiju virusnog gena za TK-. FIG.9C prikazuje da su virusna proizvodnja i virusna ekspresija TK-DAI i TK-TRIF smanjene u tumorima u odnosu na virusnu ekspresiju TK- ili TK- virusa koji eksprimira GM-CSF ("TK-GMCSF"). BALB/c miševi sa potkožno implantiranim Renca tumorima tretirani su sa IV dozom od 1×10<8>PFU kada su tumori dostigli 50-100 mm<3>. Korišćeni virusi bili su WR.TK- i WR.TK-TRIF+ (ili PBS kontrola). Naknadni tumorski odgovor praćen je merenjem kaliperom, i smanjenje rasta tumora primećeno je kod miševa inficiranih sa TK-TRIF (FIG.5C i FIG.8D). Sličan odgovor primećen je kod miševa kojima su implantirani MC38 tumori (FIG.8D) i 4T1 tumori u odnosu na tumore inficirane sa TK-GMCSF (FIG.9D).
[0106] Citotoksičnost modifikovanog virusa u poređenju sa TK- određena je izvođenjem testa za citotoksičnost. Testovi za citotoksičnost izvedeni su zasejavanjem 2×10<4>ćelija po bunarčiću na pločama sa 96-bunarčića u DMEM sa 5% FBS. Ćelije su inficirane sa serijskim razblaženjima polazeći od MOI od 75 i, 4 dana nakon infekcije, ploče su isprane sa PBS i apsorbancija je kvantifikovana nakon bojenja kultura upotrebom kompleta za neradioaktivno ispitivanje proliferacije ćelija (Promega, Madison, WI).
IC50vrednosti (PFU po ćeliji potrebnih da se proizvede 50% inhibicija) procenjene su iz krivih odgovora na dozu standardnom nelinearnom regresijom, upotrebom adaptirane Hill-ove jednačine. FIG.8B prikazuje uporednu citotoksičnost TK-TRIF i TK-DAI u ćelijama inficiranim sa naznačenim virusima u dozama koje su u opsegu od 75 do 0.00025 PFU/ćelija. Modifikacija TK-virusa da bi eksprimirao TRIF ili DAI nije dovela do promene u citotoksičnosti u odnosu na TK-. Određivanje broja apoptotskih ćelija bojenjem Aneksinom V, kao što je prikazano na FIG.9B, ukazuje da je infekcija Renca i 4T1 ćelija dovela do porasta apoptotskih ćelija. Ocenjivanje apoptoze/nekroze ćelijskih linija, ćelije su inficirane sa MOI od 1 naznačenim virusima i obojene upotrebom kompleta za detekciju apoptoze sa Aneksinom V-FITC (Abcam, Cambridge, MA) 48 sati nakon infekcije. Analize su izvedene upotrebom Accuri C6 Protočnog Citometra (BD Biosciences).
[0107] Eksperimenti su izvedeni da bi se odredilo da li TK-TRIF utiče na preživljavanje miševa sa Renca ili MC38 ksenograftima u odnosu na miševe tretirane sa TK- ili PBS. Renca ili MC38 ksenografti ustanovljeni su u BALB/C ili C57BL/6 miševima, tim redom, i tretirani jednom intravenskom dozom od 1×10<8>PFU naznačenih virusa ili PBS. Kao što je prikazano na FIG.9E i F, TK-TRIF značajno su poboljšali preživljavanje u odnosu na tretiranje sa TK-.
9. PRIMER 4. EFEKAT KOMBINOVANE TRIF EKSPRESIJE I DEGLIKOZILACIJE.
[0108] TK- virus modifikovan da bi eksprimirao TRIF, kao što je prethodno opisano u 6.3, deglikozilovan je ("TK-TRIF deglyc") da bi se ispitao efekat koji bi takva kombinacija imala na antitumorske ćelijske odgovore i antitumorsku efikasnost virusa.
[0109] Da bi se odredila toksičnost virusa koji eksprimira TK-TRIF, ispitivana je telesna masa BALB/C miševa kojima je intravenski ubrizgan PBS kao kontrola ili 1 × 10<8>PFU po mišu TK-, TK-TRIF, ili deglikozilovanog TK-TRIF. FIG.10A prikazuje da TK-injektirani miševi imaju više od 10% smanjenja telesne mase 6 dana nakon infekcije virusom, dok TK-TRIF i TK-TRIF deglyc-injektirani miševi imaju sličan profil mase kao oni kojima je ubrizgan PBS, što ukazuje na to da su TK-TRIF i TK-TRIF deglyc manje toksični od TK-.
[0110] Ispitivana je ekspresija virusnog gena TK-TRIF-deglyc u in vivo, u poređenju sa TK- i TK-TRIF. Renca tumori implantirani su u BALB/c miševe, i miševima su ubrizgani PBS ili 1×10<8>pfu TK-, TK-TRIF ili TK-TRIF deglyc kroz repnu venu. Ekspresija virusnog gena određena je detektovanjem virusne ekspresije luciferaze unutar tumora izmerena je u naznačenim vremenskim tačkama. FIG.10B prikazuje da je, 24 sata nakon infekcije, bilo manje ekspresije TK-TRIF i TK-TRIF deglyc u tumorima u odnosu na TK-.
[0111] Eksperimenti su izvedeni da bi se odredilo da li TK-TRIF ili TK-TRIF deglyc utiču na preživljavanje miševa sa Renca ili MC38 ksenograftima u odnosu na miševe tretirane sa TK- ili PBS. Renca ili MC38 ksenografti ustanovljeni su u BALB/C ili C57BL/6 miševima, tim redom, i tretirani jednom intravenskom dozom od 1×10<8>PFU naznačenih virusa ili PBS. Kao što je prikazano na FIG.10C i D, TK-TRIF i TK-TRIF deglyc značajno su poboljšali preživljavanje miševa u odnosu na tretiranje sa TK-. Takođe, TK-TRIF deglyc poboljšao je preživljavanje miševa sa Renca tumorima u poređenju sa TK-GMCSF tretiranjem (FIG.10E).
[0112] Ćelijski imunski odgovori na virus Vakcinije i tumorske ćelije ocenjeni su u IFN-γ ELISpot testu, kako je opisano ovde u odeljku 6.3.7 dana nakon davanja virusa, slezine su sakupljene iz miševa kojima je intravenski ubrizgano 1×10<8>PFU naznačenih virusa ili PBS (BALB/c miševi koji nose Renca ksenografte) i ocenjena je količina CTL koji prepoznaju virus Vakcinije ili Renca ćelije. FIG.11A prikazuje da je deglikozilacija i ekspresija TRIF dovela do značajnog porasta proizvodnje CTL koji prepoznaju virus Vakcinije in vivo, u odnosu na same modifikacije, npr., TK-TRIF ili TK-deglyc. Određenije, deglikozilovan virus koji eksprimira TRIF doveo je do porasta CTL proizvodnje koja je veća od porasta CTL proizvodnje primećene kod pojedinačnih modifikacija. Pored toga, FIG.11B prikazuje da je deglikozilacija i ekspresija TRIF dovela do porasta količine proizvodnje CTL koji prepoznaju RENCA ćelije in vivo, u odnosu na same modifikacije, npr., TK-TRIF ili TK-deglyc.
[0113] Ispitivanje neutralizacije izvedeno je da bi se odredili cirkulišući nivoi antitela protiv Vakcinije za miševe kojima je ubrizgano 1×10<8>PFU TK-, TK-TRIF, ili deglikozilovanog TK-TRIF. Nab titri određeni su najvećim razblaženjem seruma koje je dovelo do najmanje 50% inhibicije infekcije. FIG.11C prikazuje da je količina neutrališućeg antitela veća kod C57BL/6 miševa divljeg tipa inficiranih sa TK- u odnosu na miševe inficirane sa TK-TRIF, TK-deglyc ili TK-TRIF-deglyc. Miševi inficirani sa TK-TRIF-deglyc pokazali su najveće smanjenje količine neutrališućeg antitela u serumu.
[0114] Efekat deglikozilovanog virusa koji eksprimira TRIF na rast tumora ispitivan je kod BALB/c miševa koji nose Renca ili C57BL/6 miševa koji nose MC38 ksenografte tumora. Za Renca ili MC38 ksenografte tumora, tumorske ćelijske linije implantirane su potkožno sa 5×10<5>ćelija po mišu u BALB/c ili C57BL/6 miševe, tim redom. Kada je tumor dostigao ~50-100 mm<3>, miševi su tretirani jednom intravenskom dozom naznačenih virusa (1×10<8>PFU/miš) u repnu venu. Rast tumora praćen je merenjem kaliperom i definisan je jednačinom V(mm<3>)= π/6 × W<2>× L, gde su W i L širina i dužina tumora, tim redom. Podaci su eksprimirani kao relativna veličina tumora u odnosu na početak terapije, koja je postavljena kao 100%. Neočekivano, TK-TRIF deglikozilovan virus doveo je do većeg smanjenja veličine tumora kod miševa koji nose RENCA i MC38 xenografte u odnosu na zbirni efekat kombinovanih pojedinačnih modifikacija ili TK-virus (FIG.11D i E). Dalje, deglikozilovan TK-TRIF pokazao je poboljšanu antitumorsku aktivnost u odnosu na TK-GMCSF, kao što je primećeno značajnim smanjenjem veličine tumora kod BALB/c miševa koji nose Renca ksenografte (FIG.11F) ili 4T1 potkožnih tumora kod BALB/c miševa (FIG.9D). Prema tome, deglikozilovan TK- virus vakcinije koji eksprimira TRIF pokazuje značajno poboljšan antitumorski odgovor i dovodi do smanjenja proizvodnje antitela protiv virusa.
10. PRIMER 5. EFEKAT KOMBINOVANE TRIF EKSPRESIJE, DE-SIJALINIZACIJE I C12L DELECIJE KOD UPCI-1812
[0115] Gorepomenute modifikacije, naime C12L delecija, de-sijalinizacija i uvođenje TRIF inkorporirane su zajedno da bi se stvorio novi VV soj UPCI-1812, a efekat ovog trostruko modifikovanog virusa ocenjen je prema njegovim terapijskim i imunološkim efektima. Kao što je prikazano na FIG.12A, UPCI-1812 infekcija dovela je do značajno boljeg preživljavanja u odnosu na WR.TK- koji kodira GM-CSF. U odnosu na de-sijalinizovan virus sa C12L delecijom ("vvDD"), UPCI-1812 je proizveo značajno više nivoe interferona gama (IFN-γ) (FIG.12B) i interleukina-12 (IL-12) (FIG.12C).
11. PRIMER 6. EFEKAT PGE2 CILJANJA
[0116] Onkolitičke virusne terapije konačno su počele da pokazuju kliničku efikasnost u randomiziranim ispitivanjima naglašavajući stvarni potencijal platforme. Međutim, među trenutnom generacijom kliničkih vektora, oni za koje je utvrđeno da su najuspešniji eksprimirali su citokin koji aktivira imunski sistem (GM-CSF), pojačavajući mnoštvo predkliničkih podataka koji ukazuju da je imunski odgovor ključni posrednik virusne efektivnosti. Međutim, uprkos ovom zapažanju, i dalje je nejasno kako ili zašto neki pacijenti reaguju dobro dok su drugi rezistentni na onkolitičku viroterapiju.
[0117] Inicijalni eksperimenti izvedeni su da bi se doveli u vezu in vitro osetljivost tumorske ćelijske linije na virusnu infekciju i replikaciju sa in vivo odgovorima iste ćelijske linije kada se koristi da bi se obrazovali singeni tumori kod imunokompetentnih miševa.14 različitih mišjih tumorskih ćelijskih linija različitih vrsta tumora i mišji sojevi ispitivani su in vitro inficiranjem ćelijskih linija sa TK- (FIG.26A). Virusna proizvodnja i ekspresija virusnog gena primećena je kod 14 različitih mišjih ćelijskih linija tumora. Virusna proizvodnja ispitivana je zasejavanjem 2×10<5>ćelija u ploče sa 24-bunarčića, nakon čega je usledila infekcija pri MOI od 1 (PFU/ćelija) naznačenim virusima Vakcinije. Četiri sata nakon infekcije, kulture su isprane dvaput sa PBS i inkubirane u svežoj podlozi bez virusa. U naznačenim vremenskim tačkama nakon infekcije, kulture su sakupljene i zamrznute-odmrznute tri puta da bi se dobio ćelijski ekstrakt (CE). Virusni titri određeni su testom plaka na BSC-1 ćelijama.
[0118] Sedam od 14 linija je dalje testirano in vivo upotrebom direktne intratumorske injekcije TK- (FIG.
13A i B i FIG.26A i B). Direktna intratumorska injekcija korišćena je da bi se smanjila varijabilnost koja se može javiti zbog razlika u virusnoj isporuci. Kao što je prikazano na FIG.13A i B nije primećena direktna veza između ili replikacije virusa ili virusom posredovanog ubijanja ćelija i in vivo antitumorskog efekta, što ukazuje da drugi faktori osim direktne onkolitičke aktivnosti posreduju u antitumorskim efektima.
[0119] Onkolitička vakcinija koja eksprimira luciferazu korišćena je tokom ovih eksperimenata da bi se omogućila analiza ekspresije virusnog gena tokom vremena kod pojedinačnih miševa (kao surogat za virusnu replikaciju i perzistenciju), i omogućila poređenja sa naknadnim odgovorom. Čini se da iz podataka proizilaze dva različita obrasca. Za rezistentnije modele tumora, definisane kao virusna terapija koja povećava ukupno preživljavanje za manje od 2 nedelje, kao što se može videti sa Renca, B16, PAN02 i 4T1, direktna veza mogla bi se povući unutar svakog pojedinačnog modela tumora, tako da nivo ekspresije virusnog gena u 24h odgovara naknadnom odgovoru (FIG.13B). Prema tome, čak iako in vitro replikacija nije u vezi sa in vivo aktivnošću kada se porede modeli tumora (verovatno zbog uticaja faktora kao što su ECM i netumorske ćelije u tumoru), i okviru bilo kog pojedinačnog modela tumora postoji veza između rane ekspresije virusnog gena i naknadnog odgovora. Bez vezivanja za određenu teoriju, čini se da su replikacija virusa i direktna onkolitička aktivnost ključni posrednik ograničenog odgovora kod rezistentnijih modela tumora. Međutim, primećen je drugačiji obrazac u tumorima koji dobro reaguje na virusnu terapiju, koji uključuje modele tumora AB12, LLC, MC38. U ovim modelima, oni koji najbolje reaguju u okviru svakog modela pokazali su brzo i snažno čišćenje virusa nakon inicijalne infekcije i rane replikacije (FIG.13B i FIG.27). Ovo snažno čišćenje ukazuje da indukcija snažnog imunskog odgovora poboljšava virusne direktne onkolitičke efekte u modelima tumora sa boljim odgovorom.
[0120] Da bi se detaljnije ispitalo ovo zapažanje, inicijalno su odabrana dva modela tumora u istoj genetskoj pozadini koja pokazuju uporedive odgovore nakon virusne terapije in vivo, ali gde jedan od njih (LLC) pokazuje indikacije snažne indukcije imunskog sistema (rano virusno čišćenje) i ograničeno virusom posredovano ubijanje ćelija in vitro (FIG.13B i FIG.26A i B). Drugi (B16) je osetljiviji na virusno ubijanje in vitro, i bilo koji odgovor in vivo čini se da je u vezi sa ranom ekspresijom virusnog gena (FIG.
13B i FIG.26A i B). Sveobuhvatno ispitivanje aktivacije sistemskih imunoloških markera nakon virusne infekcije upoređeno je između miševa bez tumora, miševa sa B 16 tumorima i miševa sa LLC tumorima. Ovi uključuju rane urođene markere aktivacije signalizacije kao što su pS6, pSTAT1, pSTAT3, pSTAT5 u različitim populacijama ćelija (FIG.13C i FIG.14A), markere T-ćelijske proliferacije kao što su pS6 i Ki67 (FIG.14A) i markere aktivacije kao što su CD44 i CD62L (FIG.14A), i odgovore neutrališućih antitela (FIG.
14D). Manje razlike uočene su u sistemskom imunskom odgovoru na virusnu terapiju između životinja sa tumorom i životinja bez tumora, uz jedan izuzetak koji je fosforilacija S6 u nekim mijeloidnim ćelijama rano nakon infekcije (FIG.13C). Primećeno je da su pS6 nivoi smanjeni kod životinja sa tumorom, a smanjenje aktivacije imunskog sistema bila je najizraženija kod miševa sa B16 tumorom (FIG.13C i FIG.
14A). Ovo je potvrđeno kod ostalih modela tumora, pri čemu je opet potvrđeno da su pS6 nivoi smanjeni u rezistentnijim modelima tumora (uključujući 4T1 i RENCA), što ukazuje na defekt u odgovoru dendritskih ćelija (DC) koji može da posreduje u otpornosti kod ovih miševa (FIG.13C).
[0121] Budući da su primećene male razlike u sistemskom imunskom odgovoru, ispitani su efekti lokalizovanije imunske supresije unutar tumora. Različite imunske ćelije povezane su sa supresivnim fenotipom, uključujući supresorske ćelije mijeloidnog porekla (MDSC) i regulatorne T-ćelije (T-reg) (i M2 macs). Ispitivani su nivoi ovih različitih vrsta ćelija i u slezini i u tumoru svih modela tumora u odnosu na netretirane životinje. Za procenu imunskih populacija u tumorima, tumori su sakupljeni iz miševa tretiranih kao što je naznačeno, i razgrađeni mehanički i razgrađeni mešavinom tri enzima (Kolagenaza tipa IV, DNaza tipa IV i Hijaluronidaza tipa V (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)). Analize imunobojenja ćelijske površine sa četiri boje izvedene su upotrebom Gallios Protočnog Citometra (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Ćelije razgrađenog tumora obojene su upotrebom PE-Cy7 anti-mišjeg CD3 (BD Biosciences, San Jose, CA), FITC anti-mišjeg CD4, PerCP-Cy5.5 anti-mišjeg CD8, i PE anti-mišjeg CD25 (eBioscience, San Diego, CA).
[0122] Nivoi MDSC pronađeni u tumoru za različite modele tumora bili su u bliskoj vezi sa rezistencijom ili osetljivošću modela na virusnu terapiju (FIG.15A i B i FIG.16). Na primer, Renca, koji pokazuje rezistenciju na virusnu terapiju, doveo je do tumora sa visokim MDSC nivoima. FIG.17A prikazuje broj MDSC u netretiranim tumorima kao funkciju povećanog preživljavanja nakon intravenskog tretmana sa 1e8 PFU WR.TK- za brojne različite sisteme modela tumora. Sojevi vakcinije pokazuju veoma lošu sposobnost da povećaju preživljavanje u mišjim modelima tumora koji pokazuju više nivoe MDSC na osnovnoj liniji. Ćelije svake od navedenih ćelijskih linija modela tumora (FIG.17A) implantirane su u singene imunokompetentne miševe. Miševi su zatim ili žrtvovani da bi se odredio prosečan nivo MDSC na osnovnoj liniji u dobijenim tumorima za svaki model ili su miševi tretirani sa WR.TK- (ili PBS kontrola)(1e8 PFU dato intratumorski) i povećanje očekivanog životnog veka (za 50% preživljavanja) određeno je nakon tretiranja (u danima). Grafički prikazi "relativni MDSC brojevi u tumorima na osnovnoj liniji" vs "porast preživljavanja na srednjoj liniji nakon WR.TK- tretiranja (u odnosu na netretiranu kontrolu)". Više MDSC na osnovnoj liniji bilo je u vezi sa smanjenom efektivnošću terapije.
[0123] Ispitivane su dalje promene koje su se javile u tumoru nakon virusne terapije i primećeno je da je za višestruke modele tumora, kao što su 4T1, RENCA i MC38, dodatak terapije vakcinijom doveo do gubitka T-reg, ali da su MDSC nivoi bili nepromenjeni i nastavili su da rastu tokom vremena, kao što su bili u kontrolnim grupama (FIG.15A i B i FIG.16A i B). Virusna terapija smanjila je nivoe T-reg u tretiranim tumorima ali nije uticala na MDSC nivoe. Kod Renca modela tumora (implantiran potkožno u BALB/c miševe), relativni brojevi T-reg ili MDSC u tumoru/ mg tumora određeni su u različitim vremenskim tačkama pre ili posle WR.TK- tretiranja (1e8 PFU dato intratumorski) (FIG.17B i C). Stoga se čini da je onkolitička nesposobnost vakcinije da cilja MDSC smanjila njenu terapijsku aktivnost u nekim tumorima gde su nivoi MDSC visoki. U tumorima sa niskim pozadinskim nivoima MDSC (MC38), takođe je otkriveno da virusna terapija povećava nivo CD8+ T-ćelija u tumoru, dok rezistentniji modeli tumora (4T1) nisu pokazali nikakvo povećanje (FIG.15B).
[0124] Izvedena je analiza imunogenog soja vakcinije GM-CSF, koji eksprimira citokin faktor stimulacije kolonija (CSF). Prethodno se pokazalo da GM-CSF dovodi do dramatičnijih kliničkih odgovora i da je povezan sa MDSC proliferacijom. FIG.18 i 19 prikazuju da iako je više imunogenih sojeva vakcinije (WR.TK-GMCSF i WR.B 18R-IFNP+) dalje poboljšalo neke aspekte imunskog odgovora u osetljivim modelima tumora, kao što je dalje smanjenje T-reg i povećanje CD8+ T-ćelijskih nivoa, nije uočena takva prednost kod inače rezistentnih modela tumora. Nevezujući se za neku određenu teoriju, čini se da se glavna razlika između osetljivih i rezistentnih tumora odnosi na nesposobnost virusa da indukuje snažan imunoterapijski efekat u tumorima sa visokim nivoima MDSC-posredovane imunske supresije u okviru tumorskog mikrookruženja.
[0125] Poslednji izveštaji identifikovali su COX2-posredovanu proizvodnju prostaglandina PGE2 kao ključnu determinantu MDSC infiltracije i održavanja MDSC fenotipa. Korišćena su dva pristupa za ciljanje ovog puta. Jedan pristup je bio primena COX2 inhibitora. Drugi pristup bila je ekspresija enzima koji razgrađuje prostaglandina HPGD direktno iz virusnih vektora. Nukleinska kiselina koja kodira hidroksiprostaglandin dehidrogenazu 15 (HPGD), mišji enzim koji razgrađuje PGE2, uvedena je u WR.TK-umetanjem u lokus timidin kinaze homolognom rekombinacijom, i pod kontrolom virusnog p7.5 promotera ("TK-HPGD" ili "WR.TK-.HPGD"). Kao što je prikazano na FIG.20, HPGD je specifično eksprimiran iz TK-HPGD i značajno su smanjeni PGE2 nivoi u Renca ćelijama inficiranim sa TK-HPGD. Kao što je prikazano na FIG.25, izgleda da infekcija sa WR.TK- može da izmeni COX2 ekspresiju u tumorima lokalno na mestu infekcije, a da se pri tom ne proizvedu značajni nivoi COX2 ekspresije sveukupno u tumoru, ili virus može selektivno da se replikuje u regionima sa niskim COX2 nivoima. Inicijalni in vitro i in vivo eksperimenti odredili su da, čak i pri toksičnim nivoima, COX2 inhibitori ne mogu da smanje PGE2 nivoe na bilo koji nivo blizu nivoa postignutog HPGD ekspresijom (FIG.20).
[0126] Eksprimiranje onkolitičke vakcinije zatim je ispitivano kod nekoliko mišjih modela tumora.
Primećeno je da je broj MDSC ćelija u tumoru brzo i značajno smanjen u slezini i tumorima nakon tretiranja samo sa WR-TK-HPGD (FIG.21 i FIG.23A-D). Takođe je otkriveno da uključivanje HPGD smanjuje MDSC u tumoru i slezini u odnosu na nemodifikovan WR.TK- virus. Ovo je bilo specifično za tumore, bez sistemske toksičnosti (FIG.21A). Zanimljivo, TK-HPGD je takođe indukovao brže i snažnije smanjenje T-reg brojeva u tumoru. Kao što je prikazano na FIG.21B i C, i FIG.22, infekcija sa WR-TK-HPGD bila je u vezi sa poboljšanim terapijskim efektom u nekoliko mišjih modela tumora in vivo i dovela je do manjih zapremina tumora. Značajno, model tumora koji je prethodno bio najrezistentniji na virusnu terapiju, RENCA, koji je pokazao "samo onkolitički" fenotip i visoke nivoe MDSC na osnovnoj liniji, iznenađujuće je pokazao najveće povećanje terapijske koristi nakon HPGD ekspresije (FIG.21B).
[0127] Obrasci ekspresije virusnog gena takođe su upoređeni sa WR.TK- i WR.TK-HPGD u RENCA tumoru. Primetilo se da, dok je za WR.TK- primećen "samo onkolitički" fenotip (viša genska ekspresija 1. dana u vezi je sa najvećom terapijskom koristi), WR.TK-HPGD+ pokazuju "onkolitički i imunoterapeutski" fenotip, pri čemu najbolji responderi pokazuju snažno i brzo čišćenje virusa do 5. dana (FIG.21D).
Nevezujući se za neku određenu teoriju, čini se da HPGD ekspresija može da povrati imunoterapijsku aktivnost vektora u ovim rezistentnijim modelima, i time može da učini osetljivim inače rezistentne tumore na onkolitičku virusnu terapiju. Ovo je bilo uprkos tome što nije bilo ukupnog gubitka onkolitičkog potencijala HPGD ekspresije.
[0128] Izvedena je analiza mehanizama koji posreduju u terapijskim prednostima uočenim sa WR.TK-HPGD+.3 dana nakon tretiranja, do kad su nivoi MDSC i T-reg već bili dramatično smanjeni unutar okruženja tumora, konstatovano je da su se javile samo umerene promene u nivoima citokina i hemokina u tumoru (FIG.24A). Međutim, nivo hemokina u serumu značajno se promenio (FIG.24B). Određenije, hemokini povezani sa privlačenjem aktiviranih T-ćelija, uključujući CCL5, ushodno su regulisani, dok je CXCL12 (sdf-1, povezan sa imunosupresivnim fenotipom i lošom prognozom) bio dramatično smanjen (FIG.24A i B). Ova promena u sistemskom efektu hemokina može biti odgovorna za posredovanje u promenama u repertoaru imunskih ćelija u tumoru. Ovo je dalje ispitano pomoću bilateralnog ispitivanja tumora, u kojem je jednom tumoru ubrizgan WR.TK- dok je tumoru na suprotnom boku ubrizgan WR.TK-HPGD. Primećeno je da su se aktivirane T-ćelije značajno više prenosile u tumor koji eksprimira HPGD (FIG.24D). Osim toga, U kasnijim vremenskim tačkama primećeno je da je WR.TK-HPGD ekspresija dovela do dramatičnog povećana nivoa CTL koji cilja tumor, u slezini. Ovi podaci ukazuju da ekspresija HPGD ne deluje samo da ograniči supresivno okruženje unutar tumora, već deluje i da poboljša privlačenje T-ćelija što dovodi do snažnijeg adaptivnog imunskog odgovora protiv tumora. Osim toga, ugradnja HPGD u UPCI-1812 dovela je do virusa koji inhibira rast tumora značajno više od UPCI-1812 ("kombinovan"; FIG.28). Kao što je prikazano na FIG.28, kombinovan virus doveo je do većeg smanjenja rasta tumora u odnosu na zbirni efekat UPCI-1812 virusa i VV-HPGD virusa. Virusom posredovano ciljanje PGE2 moglo je da prevaziđe lokalizovanu imunu supresiju koja dovodi do temeljnih promena u tumorskom mikrookruženju i dovelo je do osetljivosti prethodno rezistentnih tumora na virusnu terapiju.
13. PRIMER 7. MODIFIKACIJA KOJA POVEĆAVA AKTIVNOST I ŠIRENJE
[0129] FIG.29 prikazuje nivo neutrališućeg antitela protiv vakcinije prisutnog u serumu miševa vakcinisanih sa (1e4 PFU) ili WR ili WR sa EEV-poboljšanom tačkastom mutacijom u A34R virusnom genu (Lys151 u Glu). A34R mutantni soj proizvodi manje neutrališućeg antitela protiv vakcinije u odnosu na WR-.
14. REFERENCE
[0130]
1. Guo, Z.S., Thorne, S.H. & Bartlett, D.L. Oncolytic virotherapy: Molecular targets in tumorselective replication and carrier cell-mediated delivery of oncolytic viruses. Biochim Biophys Acta (2008).
2. Kirn, D.H. & Thorne, S.H. Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer. Nat Rev Cancer 9, 64-71 (2009).
3. Kirn, D., Martuza, R.L. & Zwiebel, J. Replication-selective virotherapy for cancer: Biological principles, risk management and future directions. Nat Med 7, 781-7 (2001).
4. Kim, J.H., Oh, J.Y., Park, B.H., Lee, D.E., Kim, J.S., Park, H.E., Roh, M.S., Je, J.E., Yoon, J.H., Thorne, S.H., Kirn, D. & Hwang, T.H. Systemic Armed Oncolytic and Immunologic Therapy for Cancer with JX-594, a Targeted Poxvirus Expressing GM-CSF. Mol Ther 14, 361-70 (2006).
5. Kirn, D.H., Wang, Y., Le Boeuf, F., Bell, J. & Thorne, S.H. Targeting of interferon-beta to produce a specific, multi-mechanistic oncolytic vaccinia virus. PLoS Med 4, e353 (2007).
6. Thorne, S.H., Hwang, T.H., O'Gorman, W.E., Bartlett, D.L., Sei, S., Kanji, F., Brown, C., Werier, J., Cho, J.H., Lee, D.E., Wang, Y., Bell, J. & Kirn, D.H. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963. J Clin Invest 117, 3350-3358 (2007).
7. McCart, J.A., Ward, J.M., Lee, J., Hu, Y., Alexander, H.R., Libutti, S.K., Moss, B. & Bartlett, D.L. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res 61, 8751-7 (2001).
8. Guo, Z.S., Naik, A., O'Malley, M.E., Popovic, P., Demarco, R., Hu, Y., Yin, X., Yang, S., Zeh, H.J., Moss, B., Lotze, M.T. & Bartlett, D.L. The enhanced tumor selectivity of an oncolytic vaccinia lacking the host range and antiapoptosis genes SPI-1 and SPI-2. Cancer Res 65, 9991-8 (2005).
9. Gnant, M.F., Noll, L.A., Irvine, K.R., Puhlmann, M., Terrill, R.E., Alexander, H.R., Jr. & Bartlett, D.L. Tumor-specific gene delivery using recombinant vaccinia virus in a rabbit model of liver metastases. J Natl Cancer Inst 91, 1744-50 (1999).
10. Zhang, Q., Yu, Y.A., Wang, E., Chen, N., Danner, R.L., Munson, P.J., Marincola, F.M. & Szalay, A.A. Eradication of solid human breast tumors in nude mice with an intravenously injected lightemitting oncolytic vaccinia virus. Cancer Res 67, 10038-46 (2007).
11. Yu, Y.A., Shabahang, S., Timiryasova, T.M., Zhang, Q., Beltz, R., Gentschev, I., Goebel, W. & Szalay, A.A. Visualization of tumors and metastases in live animals with bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins. Nat Biotechnol 22, 313-20 (2004).
12. Park, B.H., Hwang, T., Liu, T.C., Sze, D.Y., Kim, J.S., Kwon, H.C., Oh, S.Y., Han, S.Y., Yoon, J.H., Hong, S.H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y.J., Daneshmand, M., Rhee, B.G., Pinedo, H.M., Bell, J.C. & Kirn, D.H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol 9, 533-42 (2008).
13. Breitbach, C.J., Burke, J., Jonker, D., Stephenson, J., Haas, A.R., Chow, L.Q., Nieva, J., Hwang, T.H., Moon, A., Patt, R., Pelusio, A., Le Boeuf, F., Burns, J., Evgin, L., De Silva, N., Cvancic, S., Robertson, T., Je, J.E., Lee, Y.S., Parato, K., Diallo, J.S., Fenster, A., Daneshmand, M., Bell, J.C. & Kirn, D.H. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans. Nature 477, 99-102 (2011).
14. Schmidt, C. Amgen spikes interest in live virus vaccines for hard-to-treat cancers. Nature biotechnology 29, 295-6 (2011).
15. Coffin, R. Clinical Updates with oncolytic HSV. in 7th International Oncolytic Virus Meeting (Quebec City, 2013).
16. Senzer, N.N., Kaufman, H.L., Amatruda, T., Nemunaitis, M., Reid, T., Daniels, G., Gonzalez, R., Glaspy, J., Whitman, E., Harrington, K., Goldsweig, H., Marshall, T., Love, C., Coffin, R. & Nemunaitis, J.J. Phase II clinical trial of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factorencoding, second-generation oncolytic herpesvirus in patients with unresectable metastatic melanoma. J Clin Oncol 27, 5763-71 (2009).
17. Bischoff, J.R., Kirn, D.H., Williams, A., Heise, C., Horn, S., Muna, M., Ng, L., Nye, J.A., Sampson-Johannes, A., Fattaey, A. & McCormick, F. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science 274, 373-6 (1996).
18. Khuri, F., Nemunaitis, J., Ganly, I., Gore, M., MacDougal, M., Tannock, I., Kaye, S., Hong, W. & Kirn, D. A controlled trial of Onyx-015, an E1B gene-deleted adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with recurrent head and neck cancer. Nature Medicine 6, 879-885 (2000).
19. Garber, K. China approves world's first oncolytic virus therapy for cancer treatment. J Natl Cancer Inst 98, 298-300 (2006).
20. Liu, T.C., Hwang, T., Park, B.H., Bell, J. & Kirn, D.H. The targeted oncolytic poxvirus JX-594 demonstrates antitumoral, antivascular, and anti-HBV activities in patients with hepatocellular carcinoma. Mol Ther 16, 1637-42 (2008).
21. Kim, M.K., Breitbach, C.J., Moon, A., Heo, J., Lee, Y.K., Cho, M., Lee, J.W., Kim, S.G., Kang, D.H., Bell, J.C., Park, B.H., Kirn, D.H. & Hwang, T.H. Oncolytic and immunotherapeutic vaccinia induces antibody-mediated complement-dependent cancer cell lysis in humans. Science translational medicine 5, 185ra63 (2013).
22. Contag, C.H., Sikorski, R., Negrin, R.S., Schmidt, T., Fan, A.C., Bachireddy, P., Felsher, D.W. & Thorne, S.H. Definition of an enhanced immune cell therapy in mice that can target stem-like lymphoma cells. Cancer Research 70, 9837-45 (2010).
23. Yang, Y., Huang, C.T., Huang, X. & Pardoll, D.M. Persistent Toll-like receptor signals are required for reversal of regulatory T cell-mediated CD8 tolerance. Nature immunology 5, 508-15 (2004).
24. Worschech, A., Chen, N., Yu, Y.A., Zhang, Q., Pos, Z., Weibel, S., Raab, V., Sabatino, M., Monaco, A., Liu, H., Monsurro, V., Buller, R.M., Stroncek, D.F., Wang, E., Szalay, A. A. & Marincola, F.M. Systemic treatment of xenografts with vaccinia virus GLV-1h68 reveals the immunologic facet of oncolytic therapy. BMC genomics 10, 301 (2009).
25. Thorne, S.H., Liang, W., Sampath, P., Schmidt, T., Sikorski, R., Beilhack, A. & Contag, C.H. Targeting localized immune suppression within the tumor through repeat cycles of immune celloncolytic virus combination therapy. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 1698-705 (2010).
26. Thorne, S.H. Enhancing biological therapy through conditional regulation of protein stability. Expert reviews in molecular medicine 12, e2 (2010).
27. Wang, L.C., Lynn, R.C., Cheng, G., Alexander, E., Kapoor, V., Moon, E.K., Sun, J., Fridlender, Z.G., Isaacs, S.N., Thorne, S.H. & Albelda, S.M. Treating Tumors With a Vaccinia Virus Expressing IFNbeta Illustrates the Complex Relationships Between Oncolytic Ability and Immunogenicity. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy (2011).
28. Prestwich, R.J., Ilett, E.J., Errington, F., Diaz, R.M., Steele, L.P., Kottke, T., Thompson, J., Galivo, F., Harrington, K.J., Pandha, H.S., Selby, P.J., Vile, R.G. & Melcher, A.A. Immune-mediated antitumor activity of reovirus is required for therapy and is independent of direct viral oncolysis and replication. Clin Cancer Res 15, 4374-81 (2009).
29. Banchereau, J. & Palucka, A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 5, 296-306 (2005).
30. Nestle, F.O., Tonel, G. & Farkas, A. Cancer vaccines: the next generation of tools to monitor the anticancer immune response. PLoS Med 2, e339 (2005).
31. Rosenberg, S.A., Yang, J.C. & Restifo, N.P. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med 10, 909-15 (2004).
32. Banaszynski, L.A., Sellmyer, M.A., Contag, C.H., Wandless, T.J. & Thorne, S.H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nat Med (2008).
33. Rommelfanger, D.M., Wongthida, P., Diaz, R.M., Kaluza, K.M., Thompson, J.M., Kottke, T.J. & Vile, R.G. Systemic Combination Virotherapy for Melanoma with Tumor Antigen-Expressing Vesicular Stomatitis Virus and Adoptive T-Cell Transfer. Cancer Research (2012).
34. Thorne, S.H. Immunotherapeutic potential of oncolytic vaccinia virus. Immunologic research 50, 286-93 (2011).
35. Setoguchi, R., Hori, S., Takahashi, T. & Sakaguchi, S. Homeostatic maintenance of natural Foxp3(+) CD25(+) CD4(+) regulatory T cells by interleukin (IL)-2 and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization. The Journal of experimental medicine 201, 723-35 (2005).
36. Enzler, T., Gillessen, S., Manis, J.P., Ferguson, D., Fleming, J., Alt, F.W., Mihm, M. & Dranoff, G. Deficiencies of GM-CSF and interferon gamma link inflammation and cancer. The Journal of experimental medicine 197, 1213-9 (2003).
37. Jinushi, M., Nakazaki, Y., Dougan, M., Carrasco, D.R., Mihm, M. & Dranoff, G. MFG-E8-mediated uptake of apoptotic cells by APCs links the pro- and antiinflammatory activities of GM-CSF. The Journal of clinical investigation 117, 1902-13 (2007).
38. Lemoine, F.M., Cherai, M., Giverne, C., Dimitri, D., Rosenzwajg, M., Trebeden-Negre, H., Chaput, N., Barrou, B., Thioun, N., Gattegnio, B., Selles, F., Six, A., Azar, N., Lotz, J.P., Buzyn, A., Sibony, M., Delcourt, A., Boyer, O., Herson, S., Klatzmann, D. & Lacave, R. Massive expansion of regulatory T-cells following interleukin 2 treatment during a phase I-II dendritic cell-based immunotherapy of metastatic renal cancer. International journal of oncology 35, 569-81 (2009).
39. Wei, S., Kryczek, I., Edwards, R.P., Zou, L., Szeliga, W., Banerjee, M., Cost, M., Cheng, P., Chang, A., Redman, B., Herberman, R.B. & Zou, W. Interleukin-2 administration alters the CD4+FOXP3+ T-cell pool and tumor trafficking in patients with ovarian carcinoma. Cancer Research 67, 7487-94 (2007).
40. Filipazzi, P., Valenti, R., Huber, V., Pilla, L., Canese, P., Iero, M., Castelli, C., Mariani, L., Parmiani, G. & Rivoltini, L. Identification of a new subset of myeloid suppressor cells in peripheral blood of melanoma patients with modulation by a granulocyte-macrophage colonystimulation factor-based antitumor vaccine. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 25, 2546-53 (2007).
41. Smith, G.L., Symons, J.A., Khanna, A., Vanderplasschen, A. & Alcami, A. Vaccinia virus immune evasion. Immunol Rev 159, 137-54 (1997).
42. Smith, G.L., Symons, J.A. & Alcami, A. Immune modulation by proteins secreted from cells infected by vaccinia virus. Arch Virol Suppl 15, 111-29 (1999).
43. Symons, J.A., Alcami, A. & Smith, G.L. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. Cell 81, 551-60 (1995).
44. Iwasaki, A., Stiemholm, B.J., Chan, A.K., Berinstein, N.L. & Barber, B.H. Enhanced CTL responses mediated by plasmid DNA immunogens encoding costimulatory molecules and cytokines. Journal of Immunology 158, 4591-601 (1997).
45. Gulley, J.L., Arlen, P.M., Tsang, K.Y., Yokokawa, J., Palena, C., Poole, D.J., Remondo, C., Cereda, V., Jones, J.L., Pazdur, M.P., Higgins, J.P., Hodge, J.W., Steinberg, S.M., Kotz, H., Dahut, W.L. & Schlom, J. Pilot study of vaccination with recombinant CEA-MUC-1-TRICOM poxviralbased vaccines in patients with metastatic carcinoma. Clin Cancer Res 14, 3060-9 (2008).
46. Takeshita, F., Tanaka, T., Matsuda, T., Tozuka, M., Kobiyama, K., Saha, S., Matsui, K., Ishii, K.J., Coban, C., Akira, S., Ishii, N., Suzuki, K., Klinman, D.M., Okuda, K. & Sasaki, S. Toll-like receptor adaptor molecules enhance DNA-raised adaptive immune responses against influenza and tumors through activation of innate immunity. Journal of virology 80, 6218-24 (2006).
47. Sasaki, S., Amara, R.R., Yeow, W.S., Pitha, P.M. & Robinson, H.L. Regulation of DNA-raised immune responses by cotransfected interferon regulatory factors. Journal of virology 76, 6652-9 (2002).
48. O'Gorman, W.E., Sampath, P., Simonds, E.F., Sikorski, R., O'Malley, M., Krutzik, P.O., Chen, H., Panchanathan, V., Chaudhri, G., Karupiah, G., Lewis, D.B., Thorne, S.H. & Nolan, G.P.
Alternate mechanisms of initial pattern recognition drive differential immune responses to related poxviruses. Cell host & microbe 8, 174-85 (2010).
49. Zhu, J., Martinez, J., Huang, X. & Yang, Y. Innate immunity against vaccinia virus is mediated by TLR2 and requires TLR-independent production of IFN-beta. Blood 109, 619-25 (2007).
50. Samuelsson, C., Hausmann, J., Lauterbach, H., Schmidt, M., Akira, S., Wagner, H., Chaplin, P., Suter, M., O'Keeffe, M. & Hochrein, H. Survival of lethal poxvirus infection in mice depends on TLR9, and therapeutic vaccination provides protection. J Clin Invest 118, 1776-84 (2008).
51. Hennessy, E.J., Parker, A.E. & O'Neill, L.A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? Nature reviews. Drug discovery 9, 293-307 (2010).
52. O'Neill, L.A., Bryant, C.E. & Doyle, S.L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacological reviews 61, 177-97 (2009).
53. Fukata, M. & Abreu, M.T. Role of Toll-like receptors in gastrointestinal malignancies.
Oncogene 27, 234-43 (2008).
54. Chen, R., Alvero, A.B., Silasi, D.A., Steffensen, K.D. & Mor, G. Cancers take their Toll--the function and regulation of Toll-like receptors in cancer cells. Oncogene 27, 225-33 (2008).
55. Sautes-Fridman, C., Cherfils-Vicini, J., Damotte, D., Fisson, S., Fridman, W.H., Cremer, I. & Dieu-Nosjean, M.C. Tumor microenvironment is multifaceted. Cancer metastasis reviews 30, 13-25 (2011).
56. Rakoff-Nahoum, S. & Medzhitov, R. Toll-like receptors and cancer. Nature reviews. Cancer 9, 57-63 (2009).
57. Umemura, N., Zhu, J., Mburu, Y.K., Forero, A., Hsieh, P.N., Muthuswamy, R., Kalinski, P., Ferris, R.L. & Sarkar, S.N. Defective NF-kappaB signaling in metastatic head and neck cancer cells leads to enhanced apoptosis by double-stranded RNA. Cancer Research 72, 45-55 (2012).
58. Cheng, Y.S. & Xu, F. Anticancer function of polyinosinic-polycytidylic acid. Cancer biology & therapy 10, 1219-23 (2011).
59. Longhi, M.P., Trumpfheller, C., Idoyaga, J., Caskey, M., Matos, I., Kluger, C., Salazar, A.M., Colonna, M. & Steinman, R.M. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. The Journal of experimental medicine 206, 1589-602 (2009).
60. Trumpfheller, C., Caskey, M., Nchinda, G., Longhi, M.P., Mizenina, O., Huang, Y., Schlesinger, S.J., Colonna, M. & Steinman, R.M. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 2574-9 (2008).
61. Kalinski, P., Hilkens, C.M., Wierenga, E.A. & Kapsenberg, M.L. T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal. Immunol Today 20, 561-7 (1999).
62. Mailliard, R.B., Wankowicz-Kalinska, A., Cai, Q., Wesa, A., Hilkens, C.M., Kapsenberg, M.L., Kirkwood, J.M., Storkus, W.J. & Kalinski, P. alpha-type-1 polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res 64, 5934-7 (2004).
63. Wesa, A., Kalinski, P., Kirkwood, J.M., Tatsumi, T. & Storkus, W.J. Polarized type-1 dendritic cells (DC1) producing high levels of IL-12 family members rescue patient TH1-type antimelanoma CD4+ T cell responses in vitro. J Immunother 30, 75-82 (2007).
64. Kalinski, P. & Okada, H. Polarized dendritic cells as cancer vaccines: directing effector-type T cells to tumors. Seminars in immunology 22, 173-82 (2010).
65. Okada, H., Kalinski, P., Ueda, R., Hoji, A., Kohanbash, G., Donegan, T.E., Mintz, A.H., Engh, J.A., Bartlett, D.L., Brown, C.K., Zeh, H., Holtzman, M.P., Reinhart, T.A., Whiteside, T.L., Butterfield, L.H., Hamilton, R.L., Potter, D.M., Pollack, I.F., Salazar, A.M. & Lieberman, F.S.
Induction of CD8+ T-cell responses against novel glioma-associated antigen peptides and clinical activity by vaccinations with {alpha}-type 1 polarized dendritic cells and polyinosinicpolycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in patients with recurrent malignant glioma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 29, 330-6 (2011).
66. Hokey, D.A., Larregina, A.T., Erdos, G., Watkins, S.C. & Falo, L.D., Jr. Tumor cell loaded type-1 polarized dendritic cells induce Th1-mediated tumor immunity. Cancer Research 65, 10059-67 (2005).
67. Buller, R.M. & Palumbo, G.J. Poxvirus pathogenesis. Microbiol Rev 55, 80-122 (1991).
68. Moss, B. Poxviridae: The viruses and their replication. in Field's Virology (eds. D.M., K., Fields, B.N. & Howley, P.M.) Ch.84 (Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001).
69. Putz, M.M., Midgley, C.M., Law, M. & Smith, G.L. Quantification of antibody responses against multiple antigens of the two infectious forms of Vaccinia virus provides a benchmark for smallpox vaccination. Nat Med 12, 1310-5 (2006).
70. Symons, J.A., Adams, E., Tscharke, D.C., Reading, P.C., Waldmann, H. & Smith, G.L. The vaccinia virus C12L protein inhibits mouse IL-18 and promotes virus virulence in the murine intranasal model. J Gen Virol 83, 2833-44 (2002).
71. Reading, P.C. & Smith, G.L. Vaccinia virus interleukin-18-binding protein promotes virulence by reducing gamma interferon production and natural killer and T-cell activity. J Virol 77, 9960-8 (2003).
72. Zhu, J., Smith, K., Hsieh, P.N., Mburu, Y.K., Chattopadhyay, S., Sen, G.C. & Sarkar, S.N. Highthroughput screening for TLR3-IFN regulatory factor 3 signaling pathway modulators identifies several antipsychotic drugs as TLR inhibitors. Journal of Immunology 184, 5768-76 (2010).
73. Okamura, H., Tsutsi, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K. & et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Nature 378, 88-91 (1995).
74. Wong, J.L., Mailliard, R.B., Moschos, S.J., Edington, H., Lotze, M.T., Kirkwood, J.M. & Kalinski, P. Helper Activity of Natural Killer Cells During the Dendritic Cell-mediated Induction of Melanoma-specific Cytotoxic T Cells. Journal of immunotherapy 34, 270-8 (2011).
75. Falivene, J., Del Medico Zajac, M.P., Pascutti, M.F., Rodriguez, A.M., Maeto, C., Perdiguero, B., Gomez, C.E., Esteban, M., Calamante, G. & Gherardi, M.M. Improving the MVA vaccine potential by deleting the viral gene coding for the IL-18 binding protein. PLoS One 7, e32220 (2012).
76. Kirn, D.H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C.H. & Thome, S.H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res 68, 2071-5 (2008).
77. Puhlmann, M., Brown, C.K., Gnant, M., Huang, J., Libutti, S.K., Alexander, H.R. & Bartlett, D.L. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinasedeleted mutant. Cancer Gene Ther 7, 66-73 (2000).
78. Alvarez-Breckenridge, C.A., Yu, J., Price, R., Wojton, J., Pradarelli, J., Mao, H., Wei, M., Wang, Y., He, S., Hardcastle, J., Fernandez, S.A., Kaur, B., Lawler, S.E., Vivier, E., Mandelboim, O., Moretta, A., Caligiuri, M.A. & Chiocca, E.A. NK cells impede glioblastoma virotherapy through NKp30 and NKp46 natural cytotoxicity receptors. Nature Medicine 18, 1827-34 (2012).
79. Errington, F., Jones, J., Merrick, A., Bateman, A., Harrington, K., Gough, M., O'Donnell, D., Selby, P., Vile, R. & Melcher, A. Fusogenic membrane glycoproteinmediated tumour cell fusion activates human dendritic cells for enhanced IL-12 production and T-cell priming. Gene Ther 13, 138-49 (2006).
80. Prestwich, R.J., Errington, F., Ilett, E.J., Morgan, R.S., Scott, K.J., Kottke, T., Thompson, J., Morrison, E.E., Harrington, K.J., Pandha, H.S., Selby, P.J., Vile, R.G. & Melcher, A.A. Tumor infection by oncolytic reovirus primes adaptive antitumor immunity. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 14, 7358-66 (2008).
81. Feoktistova, M., Geserick, P., Kellert, B., Dimitrova, D.P., Langlais, C., Hupe, M., Cain, K., MacFarlane, M., Hacker, G. & Leverkus, M. cIAPs block Ripoptosome formation, a RIP1/caspase-8 containing intracellular cell death complex differentially regulated by cFLIP isoforms.
Molecular cell 43, 449-63 (2011).
82. Sato, S., Sugiyama, M., Yamamoto, M., Watanabe, Y., Kawai, T., Takeda, K. & Akira, S. Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta (TRIF) associates with TNF receptorassociated factor 6 and TANK-binding kinase 1, and activates two distinct transcription factors, NF-kappa B and IFN-regulatory factor-3, in the Toll-like receptor signaling. Journal of Immunology 171, 4304-10 (2003).
83. Jiang, Z., Mak, T.W., Sen, G. & Li, X. Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-kappaB and IRF3 diverges at Toll-IL-1 receptor domain-containing adapter inducing IFN-beta.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 3533-8 (2004).
84. Bahar, M.W., Kenyon, J.C., Putz, M.M., Abrescia, N.G., Pease, J.E., Wise, E.L., Stuart, D.I., Smith, G.L. & Grimes, J.M. Structure and function of A41, a vaccinia virus chemokine binding protein. PLoS Pathog 4, e5 (2008).
85. Smith, G.L. & Moss, B. Infectious poxvirus vectors have capacity for at least 25000 base pairs of foreign DNA. Gene 25, 21-8 (1983).
86. Jones, S.A., Scheller, J. & Rose-John, S. Therapeutic strategies for the clinical blockade of IL-6/gp130 signaling. The Journal of clinical investigation 121, 3375-83 (2011).
87. Chang, C.L., Ma, B., Pang, X., Wu, T.C. & Hung, C.F. Treatment with cyclooxygenase-2 inhibitors enables repeated administration of vaccinia virus for control of ovarian cancer.
Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1365-72 (2009).
88. Bernard, M.P., Bancos, S., Chapman, T.J., Ryan, E.P., Treanor, J.J., Rose, R.C., Topham, D.J. & Phipps, R.P. Chronic inhibition of cyclooxygenase-2 attenuates antibody responses against vaccinia infection. Vaccine 28, 1363-72 (2010).
89. Kalinski, P. Regulation of immune responses by prostaglandin E2. Journal of Immunology 188, 21-8 (2012).
90. Vella, L.A., Yu, M., Fuhrmann, S.R., El-Amine, M., Epperson, D.E. & Finn, O.J. Healthy individuals have T-cell and antibody responses to the tumor antigen cyclin B1 that when elicited in mice protect from cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 14010-5 (2009).
91. Weiss, V.L., Lee, T.H., Song, H., Kouo, T.S., Black, C.M., Sgouros, G., Jaffee, E.M. & Armstrong, T.D. Trafficking of high avidity HER-2/neu-specific T cells into HER-2/neu-expressing tumors after depletion of effector/memory-like regulatory T cells. PLoS One 7, e31962 (2012).
92. Ercolini, A.M., Ladle, B.H., Manning, E.A., Pfannenstiel, L.W., Armstrong, T.D., Machiels, J.P., Bieler, J.G., Emens, L.A., Reilly, R.T. & Jaffee, E.M. Recruitment of latent pools of high-avidity CD8(+) T cells to the antitumor immune response. The Journal of experimental medicine 201, 1591-602 (2005).
93. Pulido, J., Kottke, T., Thompson, J., Galivo, F., Wongthida, P., Diaz, R.M., Rommelfanger, D., Ilett, E., Pease, L., Pandha, H., Harrington, K., Selby, P., Melcher, A. & Vile, R. Using virally expressed melanoma cDNA libraries to identify tumorassociated antigens that cure melanoma. Nature biotechnology 30, 337-43 (2012).
94. Pol, J.G., Acuna, S., Stephenson, K., Tang, N., Kazdhan, N., Bramson, J.L., McCart, J.A., Stojdl, D., Bell, J., Wan, Y. & Lichty, B. Preclinical Evaluation of an Oncolytic Maraba Virus Vaccine in a Simian Model. in 7th International Oncolytic Viruses Meeting (Quebec City, 2013).
95. Belyakov, I.M. & Ahlers, J.D. What role does the route of immunization play in the generation of protective immunity against mucosal pathogens? Journal of Immunology 183, 6883-92 (2009).
96. Guy, C.T., Webster, M.A., Schaller, M., Parsons, T.J., Cardiff, R.D. & Muller, W.J. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 10578-82 (1992).
97. Tsukamoto, A.S., Grosschedl, R., Guzman, R.C., Parslow, T. & Varmus, H.E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell 55, 619-25 (1988).
98. Kelly, K.J., Brader, P., Woo, Y., Li, S., Chen, N., Yu, Y.A., Szalay, A.A. & Fong, Y. Real-time intraoperative detection of melanoma lymph node metastases using recombinant vaccinia virus GLV-1h68 in an immunocompetent animal model. International journal of cancer. Journal international du cancer 124, 911-8 (2009).
99. Eisenberg, D.P., Adusumilli, P.S., Hendershott, K.J., Chung, S., Yu, Z., Chan, M.K., Hezel, M., Wong, R.J. & Fong, Y. Real-time intraoperative detection of breast cancer axillary lymph node metastases using a green fluorescent protein-expressing herpes virus. Annals of surgery 243, 824-30; discussion 830-2 (2006).
100. Brader, P., Kelly, K., Gang, S., Shah, J.P., Wong, R.J., Hricak, H., Blasberg, R.G., Fong, Y. & Gil, Z. Imaging of lymph node micrometastases using an oncolytic herpes virus and [F]FEAU PET. PLoS One 4, e4789 (2009).
101. Kim, P.S., Armstrong, T.D., Song, H., Wolpoe, M.E., Weiss, V., Manning, E.A., Huang, L.Q., Murata, S., Sgouros, G., Emens, L.A., Reilly, R.T. & Jaffee, E.M. Antibody association with HER2/neu-targeted vaccine enhances CD8 T cell responses in mice through Fc-mediated activation of DCs. The Journal of clinical investigation 118, 1700-11 (2008).
102. Le, D.T., Ladle, B.H., Lee, T., Weiss, V., Yao, X., Leubner, A., Armstrong, T.D. & Jaffee, E.M. CD8(+) Foxp3(+) tumor infiltrating lymphocytes accumulate in the context of an effective antitumor response. International journal of cancer. Journal international du cancer 129, 636-47 (2011).
103. Chen, H., Sampath, P., Hou, W. & Thome, S.H. Regulating cytokine function enhances safety and activity of genetic cancer therapies. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 167-74 (2013).
104. Green, D.R., Ferguson, T., Zitvogel, L. & Kroemer, G. Immunogenic and tolerogenic cell death. Nature reviews. Immunology 9, 353-63 (2009).
105. Workenhe, S.T., Pol, J.G., Lichty, B.D., Cummings, D.T. & Mossman, K.L. Mitoxantrone synergizes with oncolytic herpes simplex virus to regress established breast tumors in part by increasing recruitment of CD8+ T cells. in 7th International Oncolytic Viruses Meeting (Quebec City, 2013).
106. Fujita, M., Kohanbash, G., Fellows-Mayle, W., Hamilton, R.L., Komohara, Y., Decker, S.A., Ohlfest, J.R. & Okada, H. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloidderived suppressor cells. Cancer Research 71, 2664-74 (2011).
107. Godin-Ethier, J., Hanafi, L.A., Piccirillo, C.A. & Lapointe, R. Indoleamine 2,3-dioxygenase expression in human cancers: clinical and immunologic perspectives. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 17, 6985-91 (2011).
108. Terajima, M. & Leporati, A.M. Role of Indoleamine 2,3-Dioxygenase in Antiviral Activity of Interferon-gamma Against Vaccinia Virus. Viral immunology 18, 722-9 (2005).
109. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F., Kirilovsky, A., Mlecnik, B., Lagorce-Pages, C., Tosolini, M., Camus, M., Berger, A., Wind, P., Zinzindohoue, F., Bruneval, P., Cugnenc, P.H., Trajanoski, Z., Fridman, W.H. & Pages, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-4 (2006).
110. Parato, K.A., Breitbach, C.J., Le Boeuf, F., Wang, J., Storbeck, C., Ilkow, C., Diallo, J.S., Falls, T., Burns, J., Garcia, V., Kanji, F., Evgin, L., Hu, K., Paradis, F., Knowles, S., Hwang, T.H., Vanderhyden, B.C., Auer, R., Kirn, D.H. & Bell, J.C. The oncolytic poxvirus JX-594 selectively replicates in and destroys cancer cells driven by genetic pathways commonly activated in cancers. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 749-58 (2012).
111. Visus, C., Wang, Y., Lozano-Leon, A., Ferris, R.L., Silver, S., Szczepanski, M.J., Brand, R.E., Ferrone, C.R., Whiteside, T.L., Ferrone, S., DeLeo, A.B. & Wang, X. Targeting ALDH(bright) human carcinoma-initiating cells with ALDH1A1-specific CD8(+) T cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 17, 6174-84 (2011).
112. Silva, I.A., Bai, S., McLean, K., Yang, K., Griffith, K., Thomas, D., Ginestier, C., Johnston, C., Kueck, A., Reynolds, R.K., Wicha, M.S. & Buckanovich, R.J. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research 71, 3991-4001 (2011).
113. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Iovino, F., Wicinski, J., Cervera, N., Finetti, P., Hur, M.H., Diebel, M.E., Monville, F., Dutcher, J., Brown, M., Viens, P., Xerri, L., Bertucci, F., Stassi, G., Dontu, G., Birnbaum, D. & Wicha, M.S. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research 69, 1302-13 (2009).
114. Ning, N., Pan, Q., Zheng, F., Teitz-Tennenbaum, S., Egenti, M., Yet, J., Li, M., Ginestier, C., Wicha, M.S., Moyer, J.S., Prince, M.E., Xu, Y., Zhang, X.L., Huang, S., Chang, A.E. & Li, Q. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Research 72, 1853-64 (2012).
115. Cho, R.W., Wang, X., Diehn, M., Shedden, K., Chen, G.Y., Sherlock, G., Gurney, A., Lewicki, J. & Clarke, M.F. Isolation and molecular characterization of cancer stem cells in MMTV-Wnt-1 murine breast tumors. Stem Cells 26, 364-71 (2008).
116. Ginestier, C., Liu, S., Diebel, M.E., Korkaya, H., Luo, M., Brown, M., Wicinski, J., Cabaud, O., Charafe-Jauffret, E., Birnbaum, D., Guan, J.L., Dontu, G. & Wicha, M.S. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. The Journal of clinical investigation 120, 485-97 (2010).

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Onkolitički virus vakcinije koji obuhvata: nukleinsku kiselinu koja kodira adapter protein sa Toll/IL-1R domenom koji indukuje interferon beta (TRIF) ili funkcionalni domen koji ima TRIF aktivnost.
2. Onkolitički virus vakcinije prema zahtevu 1, koji dalje obuhvata:
a. mutaciju kičme virusa koja obuhvata deleciju u nukleinskoj kiselini koja kodira jedan ili više iz grupe koju čine C12L, B8R, B18R, A35R, B15R, B29R, G3R, H5R, STAT1 inhibitor (H1L); dsRNK ili PKR inhibitori;
b. virusni omotač sa smanjenom glikozilacijom u odnosu na inače identičan nemodifikovan virus; c. nukleinsku kiselinu koja kodira faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija (GM-CSF); d. nukleinsku kiselinu koja kodira prostaglandin E2 (PGE2) antagonistu; ili
e. mutaciju odabranu iz grupe koju čine: aminokiselinska supstitucija Lys151 sa Glu u A34R, potpuna ili delimična delecija B5R, A36R mutacija ili delecija, A56R mutacija ili delecija, i njihove kombinacije.
3. Onkolitički virus vakcinije prema zahtevu 2, koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira PGE2 antagonistu, pri čemu PGE2 antagonista predstavlja 15-hidroksiprostaglandin dehidrogenazu (15-PGDH).
4. Onkolitički virus vakcinije prema zahtevu 2 ili 3, koji obuhvata C12L deleciju.
5. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 2-4, koji obuhvata virusni omotač sa smanjenom glikozilacijom u odnosu na inače identičan nemodifikovan virus.
6. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 2-5, koji obuhvata mutaciju kičme virusa odabranu iz grupe koju čine: B8R delecija, B18R delecija, A35R delecija i njihove kombinacije.
7. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 2-6, koji obuhvata mutaciju odabranu iz grupe koju čine: aminokiselinska supstitucija Lys151 sa Glu u A34R, potpuna ili delimična delecija B5R, A36R mutacija ili delecija, A56R mutacija ili delecija, i njihove kombinacije.
8. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 2-7, koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira GM-CSF.
9. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu je onkolitički virus vakcinije negativan na timidin kinazu.
10. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu onkolitički virus vakcinije obuhvata Western Reserve soj.
11. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1-10, za upotrebu kod najmanje jednog od:
a. lečenja subjekta sa nekim kancerom;
b proizvodnje antikancerogenog dejstva kod subjekta;
c. smanjenja rasta ćelije kancera; i
d. smanjenja rasta tumora.
12. Onkolitički virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1-10, u kombinaciji sa nekim agensom koji inhibira ili smanjuje nivoe supresorskih ćelija mijeloidnog porekla, ili njihove kombinacije, za upotrebu kod najmanje jednog od:
a. lečenja subjekta sa nekim kancerom;
b proizvodnje antikancerogenog dejstva kod subjekta;
c. smanjenja rasta ćelije kancera; i
d. smanjenja rasta tumora.
13. Onkolitički virus vakcinije prema zahtevu 12, pri čemu je agens koji inhibira ili smanjuje nivoe supresorskih ćelija mijeloidnog porekla nezavisno odabran iz grupe koju čine: anti-CD33 antitelo ili njegov varijabilni region, anti-CD11b antitelo ili njegov varijabilni region, ili COX2 inhibitor.
14. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata onkolitički virus prema bilo kom od zahteva 1-10, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14 za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta.
RS20240082A 2013-08-22 2014-08-22 Onkolitičke imunoterapije RS65104B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361868978P 2013-08-22 2013-08-22
EP20189155.3A EP3778897B1 (en) 2013-08-22 2014-08-22 Immuno-oncolytic therapies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65104B1 true RS65104B1 (sr) 2024-02-29

Family

ID=52484194

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240082A RS65104B1 (sr) 2013-08-22 2014-08-22 Onkolitičke imunoterapije

Country Status (27)

Country Link
US (2) US11478518B2 (sr)
EP (3) EP4324918A3 (sr)
JP (3) JP6912199B2 (sr)
KR (1) KR102389240B1 (sr)
CN (1) CN105658795B (sr)
AU (1) AU2014308648B2 (sr)
CA (3) CA3213715A1 (sr)
DK (2) DK3036329T3 (sr)
EA (1) EA037582B1 (sr)
ES (2) ES2847305T3 (sr)
FI (1) FI3778897T3 (sr)
HR (1) HRP20240078T1 (sr)
HU (1) HUE066593T2 (sr)
IL (1) IL243996A0 (sr)
LT (1) LT3778897T (sr)
MD (2) MD4748C1 (sr)
MX (1) MX2016002257A (sr)
NZ (1) NZ716825A (sr)
PE (1) PE20160673A1 (sr)
PH (1) PH12016500329A1 (sr)
PL (1) PL3778897T3 (sr)
PT (1) PT3778897T (sr)
RS (1) RS65104B1 (sr)
SG (1) SG11201600960PA (sr)
SI (1) SI3778897T1 (sr)
SM (1) SMT202400047T1 (sr)
WO (1) WO2015027163A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3213715A1 (en) * 2013-08-22 2015-02-26 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Immuno-oncolytic thereapies
JP2018510143A (ja) 2015-02-25 2018-04-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 不活化非複製改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の固形腫瘍のための単独療法又は免疫チェックポイント遮断剤併用における使用
CN107847534B (zh) 2015-04-17 2022-10-04 纪念斯隆凯特琳癌症中心 Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
EP3327137B1 (en) * 2015-07-22 2020-12-09 National University Corporation Tottori University Host regulation factor for enhancing proliferation and propagation of vaccinia virus
JP6895968B2 (ja) * 2015-09-08 2021-06-30 シルラジェン インコーポレイテッド サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼを発現する腫瘍溶解性改変ワクシニアウイルス、および、その使用方法
WO2017079746A2 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
EP3419648A4 (en) 2016-02-25 2019-09-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center REPLICATING COMPETENTES WEAKENED VACCINIA VIRUSES WITH DELETION OF THYMIDINE KINASE WITH AND WITHOUT EXPRESSION OF HUMAN FLT3L OR GM-CSF FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
BR112018016948A2 (pt) 2016-02-25 2019-01-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center mva recombinante ou mva¿e3l que expressa flt3l humano e uso do mesmo como agente imunoterapêutico contra tumores sólidos
WO2017165725A1 (en) * 2016-03-25 2017-09-28 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthetically enveloped virus
EP3254692A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
KR102546501B1 (ko) 2016-07-19 2023-06-21 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 Stat3를 타겟으로 하는 종양용해성 바이러스
EP3515419A4 (en) * 2016-09-21 2020-06-10 Stephen H. Thorne High mobility group box i mutant
GB201616365D0 (en) 2016-09-27 2016-11-09 Helsingin Yliopisto Non-genetic modification of enveloped viruses
JP2020510624A (ja) 2016-12-12 2020-04-09 マルチビア インコーポレイテッド がんおよび感染性疾患の治療および予防のための、ウイルス遺伝子治療および免疫チェックポイント阻害剤を含む方法および組成物
KR20190128050A (ko) * 2017-02-03 2019-11-14 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 종양용해성 바이러스 요법
WO2018165161A1 (en) * 2017-03-06 2018-09-13 Novartis Ag Methods and compositions for determining the potency of a therapeutic cellular composition
EP3612201B1 (en) * 2017-04-21 2023-10-25 Sillajen, Inc. Oncolytic vaccinia virus and checkpoint inhibitor combination therapy
US11242509B2 (en) 2017-05-12 2022-02-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
WO2019089755A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Western Oncolytics Ltd. Platform oncolytic vector for systemic delivery
CA3082961A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Gerd Sutter Immuno-modulated replication-efficient vaccinia virus strain
AU2019205036A1 (en) * 2018-01-05 2020-08-20 Ottawa Hospital Research Institute Modified orthopoxvirus vectors
WO2020036635A2 (en) 2018-03-19 2020-02-20 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
JP2021531042A (ja) * 2018-07-20 2021-11-18 アンサン バイオファーマ, インク.Ansun Biopharma, Inc. 癌細胞、免疫細胞及び腫瘍微小環境へのシアリダーゼの送達
US12252702B2 (en) 2018-09-15 2025-03-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant poxviruses for cancer immunotherapy
AU2019410148A1 (en) * 2018-12-21 2021-08-12 Ottawa Hospital Research Institute Modified orthopoxvirus vectors
AU2020207040A1 (en) * 2019-01-07 2021-07-15 Kalivir Immunotherapeutics, Inc. Methods of treating cancer
TW202038994A (zh) * 2019-01-14 2020-11-01 美商醫格耐免疫治療公司 重組痘瘡病毒及其使用方法
WO2020165730A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ignite Immunotherapy, Inc. Recombinant vaccinia virus and methods of use thereof
AU2019463579B2 (en) * 2019-08-26 2024-08-08 Bionoxx Inc. Pharmaceutical composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredient for treatment of cancer
EP4045657A4 (en) * 2019-10-16 2023-11-15 KaliVir Immunotherapeutics, Inc. MODIFIED EXTRACELLULAR ENCLOSED VIRUS
WO2021102307A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Vaccinia viruses and methods for using vaccinia viruses
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
BR112022011158A2 (pt) * 2019-12-12 2022-08-30 Ignite Immunotherapy Inc Vírus vaccinia oncolítico variante e métodos de uso do mesmo
MX2022008547A (es) * 2020-01-09 2022-08-10 Pfizer Virus de vacuna recombinante.
JP2023517183A (ja) * 2020-03-06 2023-04-24 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション がんを治療するためのｉｒｆモジュレーター発現腫瘍溶解性ウィルス
PE20231175A1 (es) 2020-11-19 2023-08-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Inmunoterapia oncolitica por remodelacion del microambiente tumoral
IL308018B2 (en) 2021-04-30 2025-04-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for altered MHC expression
AU2022303363A1 (en) * 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023106839A1 (ko) * 2021-12-07 2023-06-15 재단법인 아산사회복지재단 Il-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130012595A (ko) * 2002-08-12 2013-02-04 제네렉스, 인코포레이티드 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물
JPWO2007023725A1 (ja) * 2005-08-25 2009-02-26 公立大学法人横浜市立大学 遺伝子ワクチン
US8980246B2 (en) * 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
AU2012244210B2 (en) * 2005-09-07 2014-10-02 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
EP1933857A2 (en) * 2005-09-07 2008-06-25 Jennerex Biotherapeutics ULC Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
KR20080084528A (ko) 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
WO2009124044A2 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. Tumor growth inhibition via conditioning of tumor microenvironment
EP2477499B1 (en) 2009-09-14 2018-04-11 SillaJen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy
WO2011119925A2 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthetic herpes simplex viruses for treatment of cancers
ES2733211T3 (es) * 2011-04-15 2019-11-28 Genelux Corp Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas
US20150250837A1 (en) * 2012-09-20 2015-09-10 Morningside Technology Ventures Ltd. Oncolytic virus encoding pd-1 binding agents and uses of the same
CA3213715A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Immuno-oncolytic thereapies

Also Published As

Publication number Publication date
MD20160027A2 (ro) 2016-08-31
MD20180086A2 (ro) 2019-03-31
AU2014308648B2 (en) 2020-11-12
JP7021154B2 (ja) 2022-02-16
MD4748C1 (ro) 2021-09-30
SMT202400047T1 (it) 2024-03-13
EP3778897B1 (en) 2023-12-20
JP2016527920A (ja) 2016-09-15
CA2921041A1 (en) 2015-02-26
EP3036329B1 (en) 2020-10-07
EP4324918A2 (en) 2024-02-21
MD4624C1 (ro) 2019-10-31
PH12016500329A1 (en) 2016-05-02
HK1223402A1 (zh) 2017-07-28
MD4748B1 (ro) 2021-02-28
PL3778897T3 (pl) 2024-04-02
CN105658795B (zh) 2020-07-03
EA037582B1 (ru) 2021-04-16
CN105658795A (zh) 2016-06-08
CA2921041C (en) 2023-10-31
JP7333431B2 (ja) 2023-08-24
ES2847305T3 (es) 2021-08-02
JP2019205451A (ja) 2019-12-05
US20230008089A1 (en) 2023-01-12
NZ716825A (en) 2022-02-25
IL243996A0 (en) 2016-04-21
EP3036329A4 (en) 2017-08-02
KR102389240B1 (ko) 2022-04-20
US11478518B2 (en) 2022-10-25
WO2015027163A1 (en) 2015-02-26
DK3778897T3 (da) 2024-01-29
EP4324918A3 (en) 2024-04-24
PE20160673A1 (es) 2016-07-21
FI3778897T3 (fi) 2024-01-25
EP3778897A1 (en) 2021-02-17
HRP20240078T1 (hr) 2024-03-29
DK3036329T3 (da) 2021-01-11
SG11201600960PA (en) 2016-03-30
CA3213683A1 (en) 2015-02-26
US20160235793A1 (en) 2016-08-18
ES2971528T3 (es) 2024-06-05
SI3778897T1 (sl) 2024-03-29
MX2016002257A (es) 2016-11-08
JP2022062171A (ja) 2022-04-19
KR20160044529A (ko) 2016-04-25
JP6912199B2 (ja) 2021-08-04
CA3213715A1 (en) 2015-02-26
EA201690444A1 (ru) 2016-08-31
HUE066593T2 (hu) 2024-08-28
EP3036329A1 (en) 2016-06-29
AU2014308648A1 (en) 2016-03-03
LT3778897T (lt) 2024-02-12
WO2015027163A9 (en) 2016-04-14
PT3778897T (pt) 2024-02-01
MD4624B1 (ro) 2019-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230008089A1 (en) Immuno-Oncolytic Therapies
AU2014308648A2 (en) Immuno-oncolytic therapies
US20250332208A1 (en) Oncolytic virus therapy
JP7025339B2 (ja) 癌免疫療法のための、チミジンキナーゼの欠失を伴い、ヒトｆｌｔ３ｌまたはｇｍ－ｃｓｆの発現を伴うかまたは伴わない、複製可能な弱毒化ワクシニアウイルス
RS58146B1 (sr) Onkolitički herpes simpleks virus i njegova terapeutska upotreba
KR20200026894A (ko) 개인 맞춤형 백신
CN114786715A (zh) 痘苗病毒和使用痘苗病毒的方法
KR20220116191A (ko) 4-1bbl 아쥬반트화 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라 (mva)의 의약적 용도
HK40104741A (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40045119B (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40045119A (en) Immuno-oncolytic therapies
HK1223402B (zh) 免疫溶瘤療法
US20220211814A1 (en) Il-36 cytokine expressing oncolytic viruses for treating cancer
HK40088792A (zh) 用於癌症免疫疗法的重组痘病毒
JP2025538787A (ja) 抗腫瘍薬の調製におけるｄｒ－１８と腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用