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WO2023106839A1 - Il-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

Il-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023106839A1
WO2023106839A1 PCT/KR2022/019840 KR2022019840W WO2023106839A1 WO 2023106839 A1 WO2023106839 A1 WO 2023106839A1 KR 2022019840 W KR2022019840 W KR 2022019840W WO 2023106839 A1 WO2023106839 A1 WO 2023106839A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
vaccinia virus
recombinant vaccinia
virus
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/019840
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
손우찬
김태희
이지영
손호선
고수민
이장미
강지연
정다솜
임희선
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020220169132A external-priority patent/KR20230086610A/ko
Application filed by Asan Foundation, University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation filed Critical Asan Foundation
Publication of WO2023106839A1 publication Critical patent/WO2023106839A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a cancer therapeutic agent using a recombinant virus, and more particularly, to a recombinant vaccinia virus having an interleukin-12 (IL-12) gene and a B8R gene deletion, and a use thereof.
  • IL-12 interleukin-12
  • Oncolytic virus which is one of the treatments that has recently attracted attention in the pharmaceutical industry, does not proliferate in normal cells, but proliferates specifically in cancer cells and destroys cancer cells.
  • the four main mechanisms of oncolytic viruses are oncolysis by direct infection, release of tumor-associated antigen (TAA) that contributes to the activation of anti-tumor immune cells, promotion of host immunity by expression of foreign genes genetically inserted into recombinant viruses, and And as a mechanism to prevent cancer recurrence due to B-cell and T-cell immune memory, in addition to directly attacking cancer cells, it promotes the body's adaptive immune response (Immune stimulation) and specifically infects and destroys tumor vascular endothelial cells. It is known to inhibit angiogenesis.
  • TAA tumor-associated antigen
  • the inventors of the present invention found that when the B8R gene of vaccinia virus is substituted with the interleukin-12 gene, immunity due to increased IFN- ⁇ activity and IL-12 activity The present invention was completed by confirming that anti-tumor immunity is remarkably increased by synergistic effect in .
  • an object of the present invention is a recombinant vaccinia virus comprising an interleukin-12 (IL-12) gene, characterized in that the interleukin-12 gene is inserted into the B8R region of the vaccinia virus gene. to provide vaccinia virus.
  • IL-12 interleukin-12
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant vaccinia virus as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing anti-tumor immunity comprising the recombinant vaccinia virus as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for preventing or treating cancer comprising the recombinant virus as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the recombinant virus.
  • the present invention is a recombinant vaccinia virus comprising an interleukin-12 (IL-12) gene, characterized in that the interleukin-12 gene is inserted into the B8R region of the vaccinia virus gene To provide a recombinant vaccinia virus.
  • IL-12 interleukin-12
  • the interleukin-12 (IL-12) gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto.
  • the vaccinia virus gene B8R may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the recombinant vaccinia virus may have a vaccinia virus gene B8R region deleted, but is not limited thereto.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister , Copenhagen, Tian Tan, USSR, Tashkent, Evans, and International Health Division (IHD) vaccinia virus strain.
  • it may be an International Health Division (IHD) vaccinia virus species, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant vaccinia virus as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for enhancing anti-tumor immunity comprising the recombinant vaccinia virus as an active ingredient.
  • the present invention provides a kit for preventing or treating cancer comprising the recombinant vaccinia virus as an active ingredient.
  • the present invention may provide a food composition containing the recombinant vaccinia virus as an active ingredient, and the food composition may be a health functional food composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the recombinant vaccinia virus to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for the preparation of a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides a method for enhancing anti-tumor immunity comprising administering the recombinant vaccinia virus to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for enhancing antitumor immunity.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for preparing an anti-tumor immunity enhancer.
  • the cancer is squamous cell carcinoma, glioma, lung cancer, adenocarcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, eye cancer, rectal cancer, perianal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, parathyroid cancer, adenocarcinoma Renal cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, blood cancer, liver cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate It may be at least one selected from the group consisting of cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, oral cancer, tongue cancer, brain cancer, malignant melanoma, and stromal tumor, but is not limited thereto.
  • the composition may satisfy at least one characteristic selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the composition may enhance anti-tumor immunity, but is not limited thereto.
  • the present invention includes the steps of inserting the interleukin-12 (IL-12) gene into a delivery vector; and inserting the transfer vector into the vaccinia virus.
  • IL-12 interleukin-12
  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus expressing IL-12 and a use thereof, wherein the recombinant vaccinia virus in which the B8R gene is deleted from the vaccinia virus and the IL-12 gene is inserted at the site of the deleted B8R is IFN- ⁇
  • the recombinant vaccinia virus in which the B8R gene is deleted from the vaccinia virus and the IL-12 gene is inserted at the site of the deleted B8R is IFN- ⁇
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a cloning method of plasmid pB8R(-)mCherry-mIL12.
  • FIGS. 2a and 2b are schematic diagrams of recombinant plasmids pSP72-B8R and pB8R(-)mCherry-mIL12.
  • FIG. 3 is a view showing the results of confirming the plaque of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention isolated through a single plaque isolation process (A: Bright-field microscopy, ⁇ 100/B: Fluorescence microscopy (Red), ⁇ 100).
  • Figure 4 shows the expression of IL-12 protein by performing Western blot analysis on recombinant vaccinia virus-treated cells and media for characterization of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention. This is a diagram showing the result.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of comparing the cytotoxicity of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention in Vero cells, MC38 cells and LLC1 cells.
  • Figure 6 shows the results of comparing the cytotoxicity of IHD virus (parental virus) to which no genetic manipulation was applied and the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention on mouse pancreatic cancer cells (Pan02). It is a drawing
  • Figure 7 shows the results of comparison of cytotoxicity against mouse melanoma cells (B16F10) of IHD virus (parental virus) without genetic manipulation and the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention. is the drawing shown.
  • FIG. 8a to 8e confirm the anti-tumor effect of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention in a mouse pancreatic cancer model.
  • FIG. 8c is a result of measuring the tumor volume
  • FIG. 8d is a result of measuring the tumor weight
  • FIG. 8e is a view showing a tumor extracted from a mouse pancreatic cancer model.
  • FIG. 9 is a view showing the results of confirming T cell activity after treatment with the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention using spleen tissue extracted from a mouse pancreatic cancer model.
  • 10A to 10C show the results of analyzing the number of tumor-infiltrating lymphocytes by performing immunostaining on tumor tissue extracted from a mouse pancreatic cancer model after treatment with the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention.
  • 10A is a diagram showing the analysis result of a CD3 immunostaining slide
  • FIG. 10B is a diagram showing the analysis result of a CD8 immunostaining slide
  • FIG. 10C is a diagram showing the analysis result of a CD4 immunostaining slide.
  • FIG. 11a to 11e confirm the anti-tumor effect of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention in a mouse melanoma model.
  • FIG. 11c is a result of measuring the tumor volume
  • FIG. 11d is a result of measuring the tumor weight
  • FIG. 11e is a diagram showing a tumor extracted from a mouse melanoma model.
  • FIG. 12 is a view showing the results of confirming T cell activity after treatment with the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention using spleen tissue extracted from a mouse melanoma model.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of confirming the distribution of infiltrated cytotoxic T cells in tumors by performing CD8 immunofluorescence staining on tumor tissue extracted from a mouse melanoma model.
  • FIG. 14a to 14d confirm the anti-tumor effect of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention in a hamster melanoma model.
  • FIG. 14c is a result of measuring the tumor weight
  • FIG. 14d is a view showing a tumor extracted from a hamster melanoma model.
  • FIG. 15 is a view showing the results of confirming T cell activity after treatment with the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention using spleen tissue extracted from a hamster melanoma model.
  • 16a to 16c show the results of analyzing the number of tumor-infiltrating lymphocytes by performing immunostaining on tumor tissue extracted from a hamster melanoma model after treatment with the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention
  • 16a is a view showing the analysis result of the CD3 immunostaining slide
  • FIG. 16b is the analysis result of the CD8 immunostaining slide
  • FIG. 16c is the analysis result of the CD4 immunostaining slide.
  • 17 is a diagram schematically showing the anti-tumor mechanism of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention.
  • FIG. 18 is a schematic diagram of the recombinant vaccinia virus (B8R(-)mCherry-mIL12 virus) of the present invention.
  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus containing an interleukin-12 (IL-12) gene and a use thereof, wherein when the B8R gene of the vaccinia virus is replaced with the IL-12 gene, IFN- ⁇ activity And it was completed by confirming that an increase in IL-12 activity exhibits a synergistic effect on immunity and enhances anti-tumor immunity to exhibit a remarkable anti-cancer effect.
  • IL-12 interleukin-12
  • the present invention is a recombinant vaccinia virus containing an interleukin-12 (IL-12) gene,
  • the recombinant vaccinia virus is characterized in that the interleukin-12 gene is inserted into the B8R region of the vaccinia virus gene.
  • vaccina virus also called cowpox virus
  • cowpox virus is one of the most widely studied oncolytic viruses, which proliferates in the cytoplasm and has an envelope with 200 kb double-stranded DNA as its genome. It is a virus that belongs to poxvirus.
  • Vaccinia virus transcribes and translates 200 kb of double-stranded DNA to express a total of 250 genes, and has a 200 kb linear DNA genome that allows deletion of multiple genes and insertion of up to 40 kb of transgenes, enabling gene therapy and It is widely used as a transportation tool, and since it proliferates depending on the EGFR/RAS pathway, which is activated in epithelial cancer, it has an innate tumor specificity and has the advantage of low risk of carcinogenicity.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen ), Tian Tan, USSR, Tashkent, Evans, International Health Division (IHD) vaccinia virus strain, but is not limited thereto.
  • IHD strain vaccinia virus was used.
  • “recombinant vaccinia virus” means a vaccinia virus in which one or more foreign genes are inserted (introduced) into the genome.
  • the position in the genome where the foreign gene is inserted is not limited, but preferably, the recombinant vaccinia virus according to the present invention is characterized in that the IL-12 gene is inserted into the B8R region of the vaccinia virus gene, more preferably, The recombinant vaccinia virus is characterized in that the B8R gene of the vaccinia virus is substituted with the IL-12 gene.
  • the vaccinia virus to be genetically modified in the present invention may be wild-type, or may have some sequences deleted to enhance infection efficiency, replication function, anticancer effect, and the like.
  • B8R is a gene of vaccinia virus that encodes a secretory interferon gamma (IFN- ⁇ ) binding protein, and the interferon gamma binding protein inhibits the interferon gamma activity of the host by blocking the binding of interferon gamma. It is characterized by delaying antiviral immunity.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention is deficient in the vaccinia virus gene B8R region and thus does not produce interferon gamma binding protein, so that it can inhibit T lymphocytes and natural killer cells (NK cells) in the host. It is characterized by increasing interferon gamma activity involved in activating and improving humoral immunity.
  • the B8R gene may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto, and variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 of the present invention is a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting it, for example, a part of the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule is deleted, substituted (substitution) or inserted (insertion) Although modified by , it is a concept that includes variants that can functionally have the same action as a nucleic acid molecule.
  • the B8R gene has 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, respectively. sequence may be included. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology It includes a polynucleotide having.
  • the “% of sequence homology” for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to (not including).
  • the B8R gene may be characterized in that it encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • interferon gamma IFN-g or IFN- ⁇
  • IFN-g or IFN- ⁇ IFN-g or IFN- ⁇
  • deletion used in relation to a viral genetic sequence herein has the meaning of including a complete deletion of the corresponding sequence as well as a partial deletion of the sequence.
  • the expression of the functional protein of the gene does not occur or is inhibited by the deletion of the sequence.
  • IL-12 interleukin-12
  • IL-12 is one of the most effective and promising anticancer cytokines.
  • IL-12 is a heterodimeric protein comprising 40 kDa and 35 kDa subunits linked by disulfide bonds and is produced by activated macrophages, monocytes, dendritic cells and activated B lymphocytes.
  • IL-12 can enhance T-helper 1 cell immunity, increase cellular T-lymphocyte cytotoxicity, and inhibit angiogenesis.
  • IL-12 activates IFN- ⁇ production of T cells and NK cells.
  • Local expression of IL-12 sensitizes tumor cells to T-cell mediated cytotoxicity, resulting in inhibition of tumor growth and establishment of systemic immunity.
  • the IL-12 gene may be a mouse IL-12 gene (mIL-12).
  • the IL-12 gene may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto, and variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the present invention is a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting it, for example, a part of the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule is deleted, substituted (substitution) or inserted (insertion) Although modified by , it is a concept that includes variants that can functionally have the same action as a nucleic acid molecule.
  • the IL-12 gene has a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the branch may include a nucleotide sequence.
  • the "% sequence homology" for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a region of comparison, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the region of comparison is a reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (additional or not including deletions) compared to additions or deletions (i.e., gaps).
  • the IL-12 gene may be characterized in that it encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-12 gene can be introduced into the B8R gene region in the genome of vaccinia virus using a vector, and according to an embodiment of the present invention, the recombinant vaccinia virus according to the present invention uses a vector It is characterized in that the IL-12 gene is expressed without B8R gene expression by replacing the B8R gene with the IL-12 gene.
  • the genome modification method of the recombinant vaccinia virus according to the present invention is not limited and can be prepared using known genetic recombination techniques.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention may have a foreign gene (ie, IL-12 gene) inserted into the genome through homologous endjoining.
  • Homologous end joining is one of the methods for repairing double-strand breaks in DNA. It is characterized by synthesizing the cut DNA using a homologous sequence as a template during DNA repair, and non-homologous ends in which the cut DNA strands are connected as they are. It is distinct from non-homologous endjoining.
  • cells are infected with wild-type vaccinia virus, and then a vector containing a gene to be inserted into the virus genome is introduced into the cell to convert the vaccinia virus genome into the cell. Modification (i.e. insertion of a gene) can be induced to occur.
  • the introduction of the vector into the cells and the infection of the wild-type vaccinia virus are not limited in order and can be performed simultaneously or sequentially.
  • vectors into cells i.e., transfection or transfection of vectors
  • introduction of vectors into cells is accomplished by a variety of techniques commonly used to introduce exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells, such as electroporation, calcium phosphate Precipitation method, DEAE-dextran transfection or lipofection may be performed.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention may further include a marker gene for selecting transformants.
  • the marker gene may be included without limitation as long as it is simultaneously expressed with the IL-12 gene inserted into the genome of the vaccinia virus to impart a phenotype enabling identification of the virus or transformant.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention may include a fluorescent protein coding gene as a marker gene.
  • Fluorescent protein refers to a protein that emits light of a specific wavelength to the outside in the process of being activated by absorbing light of a specific wavelength and then returning to a normal state, thereby emitting light in a unique color.
  • the fluorescent protein examples include a green fluorescent protein (GFP) coding gene, a red fluorescent protein (RFP) protein coding gene, and an mCherry coding gene.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention may further include an mCherry coding gene (eg, SEQ ID NO: 13) as a marker gene.
  • the location of the marker gene in the genome is not limited, but may preferably be present in the B8R gene region, more preferably upstream or downstream of the IL-12 gene inserted into the genome of the recombinant vaccinia virus. ) can be located.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient.
  • active ingredient means a component that exhibits the desired activity alone or can exhibit the desired activity together with a carrier having no activity itself.
  • cancer is characterized by uncontrolled cell growth, which results in the formation of a cell mass called a tumor, infiltrating surrounding tissues and, in severe cases, metastasizing to other organs in the body.
  • cancer may be solid cancer or blood cancer, and non-limiting examples thereof include squamous cell carcinoma, glioma, lung cancer, lung adenocarcinoma, peritoneal cancer, skin cancer, eye cancer, rectal cancer, perianal cancer, esophageal cancer, and small intestine.
  • cancer endocrine cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, blood cancer, liver cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, It may be selected from the group consisting of uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, oral cancer, tongue cancer, brain cancer, malignant melanoma, and stromal tumor.
  • the blood cancer may be leukemia, lymphoma, multiple myeloma, and the like.
  • the content of the recombinant vaccinia virus in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition. It may be % by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.
  • compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods.
  • tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate It can be formulated and used in the form of an external agent such as a warning agent, lotion, pasta agent, spray, inhalant, patch, sterile injection solution, or aerosol, and the external agent is a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent , lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition according to the present invention When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated so that the recombinant vaccinia virus contained in the composition is bioavailable when administered into a subject. After administration, vaccinia virus present in tumor tissue, blood, and other tissues can be monitored through a detection method such as ELISA.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered once or twice or more repeatedly to a subject in need thereof, and may be repeatedly administered until the tumor is reduced or disappears.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention may be administered intratumorally through direct or intravenous administration, and an appropriate administration method may be selected depending on the state and type of tumor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the recombinant vaccinia virus to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for the preparation of a cancer therapeutic agent.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. of mammals.
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of a desired disease
  • treatment means that the desired disease and its resulting metabolic abnormality are improved or improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. All actions that are advantageously altered are meant, and “improvement” means any action that reduces a parameter related to a target disease, for example, the severity of a symptom, by administration of the composition according to the present invention.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention expresses the IL-12 protein (see Example 3).
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention showed superior tumor killing ability compared to the parent virus (see Example 5).
  • composition according to the present invention may satisfy one or more properties selected from the group consisting of:
  • composition according to the present invention can enhance anti-tumor immunity.
  • the present invention provides a composition for enhancing anti-tumor immunity comprising the recombinant vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for enhancing anti-tumor immunity comprising administering the recombinant vaccinia virus to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for enhancing antitumor immunity.
  • the present invention provides a use of the recombinant vaccinia virus for preparing an anti-tumor immunity enhancer.
  • anti-tumor includes death of cancer cells, reduction in viability of cancer cells, inhibition or delay of pathological symptoms of cancer due to inhibition of cancer cell proliferation, inhibition of cancer metastasis, and inhibition of cancer recurrence. it means to
  • composition for enhancing antitumor immunity of the present invention may be used in combination or mixing with any approved anticancer agent.
  • anticancer agent includes any anticancer agent that exhibits cytotoxicity to cancer cells, such as a metabolic antagonist, an alkylating agent, a topoisomerase antagonist, a microtubule antagonist, a plant-derived alkaloid, any cytokine drug, any antibody It includes pharmaceuticals, any immune checkpoint inhibitor medicines, any cell therapy (car-T cell therapy, car-NK cell therapy) medicines, and the like.
  • taxol nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, cisplatin, rituximab, erlotinib, sorafenib, IL-2 drugs, INF- ⁇ drugs, INF - ⁇ drugs, Trastuzumab, Blinatumomab, Ipilimumab, Pepbrolizumab, Nivolizumab, Atezolizumab, Durvalumab, Bevacizumab, Cetuximab, Tisagenrelucel ( Tisagenlecleucel (Kymria), Axicabtagene Ciloleucel (Yescata), etc. may be exemplified, and in addition to these exemplified anticancer agents, other anticancer agents known in the art are used in combination with the composition of the present invention without limitation or may be used in combination.
  • the present invention may provide a food composition for prevention or improvement containing the recombinant vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient, and the food composition may be a health functional food composition.
  • the recombinant vaccinia virus according to the present invention When the recombinant vaccinia virus according to the present invention is used as a food additive, the recombinant vaccinia virus may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the recombinant vaccinia virus of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount greater than the above range.
  • Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice creams, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in a conventional sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, A carbonation agent used in carbonated beverages and the like may be contained.
  • the composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • health functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and refers to foods with high medical and medical effects that are processed to efficiently display bioregulatory functions in addition to nutritional supply.
  • the food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills in order to obtain useful effects for preventing or improving cancer.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • unlike general drugs there is an advantage in that there is no side effect that may occur when taking a drug for a long time by using food as a raw material, and it can be excellent in portability.
  • the present invention provides a kit for preventing or treating cancer comprising the recombinant vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient.
  • the kit may further include an immuno-anticancer agent.
  • the kit means a combination of substances or devices that can be used to prevent or treat cancer, and may be in a form capable of preparing, storing, or administering the recombinant vaccinia virus according to the present invention, and the specific form is not limited. . Therefore, the kit according to the present invention may include, without limitation, those known in the art as components of kits for the treatment of specific diseases as well as recombinant vaccinia virus and immuno-anticancer agents.
  • the present invention includes the steps of inserting the interleukin-12 (IL-12) gene into a delivery vector; and inserting the transfer vector into the vaccinia virus.
  • IL-12 interleukin-12
  • pB8R(-)mCherry-mIL12 was used as the delivery vector, but is not limited thereto.
  • vector can be used as a carrier nucleic acid molecule into which an exogenous nucleotide sequence can be inserted for introduction into a cell where the vector can be replicated.
  • a nucleotide sequence may be "exogenous,” meaning that it is external to the cell into which the vector is being introduced, or that the sequence is homologous to a sequence within the cell, but the nucleic acid is located at a location within the host cell where the sequence is not normally found.
  • Vectors may include plasmids, cosmids, viruses (bacteriophages, animal viruses and plant viruses) and yeast artificial chromosomes (eg YAC).
  • Inserting the gene of interest into the vector may be performed by a method selected from all genetic recombination methods known in the art, and inserting the vector into the vaccinia virus may be performed by any transfection method known in the art. It may be performed by a method selected from among.
  • the term "combination thereof" included in the expression of the Markush form means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the expression of the Markush form, It means including one or more selected from the group consisting of components.
  • the plasmid vector for the production of recombinant vaccinia virus is derived from vaccinia virus for insertion by recombination reaction at the B8R locus in the pSP72 plasmid having an origin of replication for growth in E. coli and an antibiotic ampicillin resistance gene.
  • a homologous sequence was inserted, and additionally, a foreign gene, mCherry fluorescent protein, and a mouse single-chain IL-12 gene were inserted in combination with an appropriate promoter.
  • pB8R(-)mCherry-mIL12 was prepared by constructing a plasmid in which the B8R gene was deleted and inserting the mCherry-mIL12 transgene. The overall steps of the plasmid cloning method are shown in Figure 1.
  • pSP72 a commercial plasmid
  • primers pSP72-R (SEQ ID NO: 1) and pSP72-F (SEQ ID NO: 2) (Phusion flash high-fidelity 70 PCR Master mix, F548S) described in Table 1 below. was amplified through PCR reaction using (Step1).
  • the B8R locus was also amplified through a PCR reaction using IHD virus genomic DNA as a template using the primers SP72-B8R_Left-F (SEQ ID NO: 3) and SP72-B8R_Right-R (SEQ ID NO: 4) described in Table 1 below (Step2 ).
  • the sP72 PCR product and the B8R locus PCR product were assembled to construct the SP72-B8R plasmid using an overlap cloner kit (EBK1011, Elpis Bio.) (Step3).
  • the SP72-B8R plasmid sequence was DNA sequenced by Cosmogenetech (Korea) using primers Seq-B8Rp-F (SEQ ID NO: 7), Seq-B8R-R (SEQ ID NO: 8), and commercial primers T7 and SP6 described in Table 1 below. It was verified through a genome sequencing service.
  • sequences without the B8R gene were amplified by PCR (Step4).
  • the sequence lacking the B8R locus was amplified with the primers ApaI-B8Rminus_Left-R (SEQ ID NO: 5) and XhoI-B8R_Right-F (SEQ ID NO: 6) described in Table 1 below.
  • the synthesized gene product was digested with the enzymes ApaI and XhoI (Step5).
  • the amplified B8Rminus sequence was assembled with the gene product synthesized by overlap cloner (Step6).
  • the validated plasmid was transformed into appropriate E. coli cells, plated on LB Agar plates containing ampicillin, and cultured overnight at 37°C to form colonies. Colony PCR was performed on pB8R(-)mCherry-mIL12 E.coli colonies using the primers Seq-B8Rp-F (SEQ ID NO: 7) and Seq-B8R-R (SEQ ID NO: 8) described in Table 1, respectively. Colonies with the expected band size were inoculated into 10 mL Ampicillin broth containing LB Broth medium and cultured overnight in a shaking incubator at 37 ° C. Plasmid DNA Purification Kit Mini (CMP0112, Cosmogenetech, Korea) was used to obtain purified plasmids.
  • the final product, pB8R(-)mCherry-mIL12 was prepared by Cosmogenetech using primers Seq-B8Rp-F (SEQ ID NO: 7) and Seq-B8R-R (SEQ ID NO: 8), and commercial primers T7 and SP6 described in Table 1 above. Korea) was verified through a DNA sequencing service.
  • Vaccinia virus IHD strain (VR-156) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). The recombinant vaccinia virus was transformed by transfecting the plasmid transfer vector into Vero cells infected with the IHD virus (parental virus) (jetPRIME, #101000015, Polyplus, USA). Agarose overlay method was continuously performed to isolate single recombinant plaques until all plaques expressed red fluorescence.
  • recombinant vaccinia virus was amplified in Vero cells and purified by 30% sucrose gradient ultra-centrifugation (13,700 rpm, 4°C 1hr 20min, Acel 9, Decel 9).
  • Viral titers were determined by the TCID 50 assay, one of the infectivity assays. 4.2 ⁇ 10 3 Vero cells were prepared in growth medium in each well of a 96-well plate and cultured overnight at 37° C., 5% CO 2 , under humid conditions. A serial dilution of 1:10 of the original virus sample, for example, from 10 -3 to 10 -7 of the original virus sample was prepared, and all virus samples were vigorously vortexed until immediately before transferring 50 ⁇ l of virus to each well. The cell plates were moved back to a 37°C, CO 2 incubator to monitor cytopathic effect (CPE) for 3 to 4 days. An endpoint was determined when CPE was the same per dilution for three separate readings, and titers were calculated based on the Spearman-Karber method (Ramakrishnan, 2016).
  • Vero cells seeded in 6-well plates with 1 mL of appropriate media were infected with viruses (parent virus, and pB8R(-)mCherry-mIL12 virus) for 36 hours.
  • the medium was carefully transferred to a 1.5 mL e-tube and centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new 1.5 mL e-tube, and 10 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) was added and stored at 20 ° C.
  • the remaining cell pellet was scraped into 1 mL PBS and centrifuged at 4,000 rpm for 3 minutes. The supernatant was carefully removed and the pellet was incubated in 200 uL PRO-PREP solution for a minimum of 30 min and stored at 20 °C.
  • Cells seeded in 96-well plates were infected with viruses at different concentrations (0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, and 500 MOI) for 72 hours.
  • 10 uL of CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) solution was added to each well of the plate. Plates were incubated at 37 for 2 hours.
  • Cell viability was analyzed with a TECAN 2000 spectrophotometer (Spark, Mannedorf, Switzerland) at a wavelength of 450 nm.
  • mice Female C57BL/6 mice (7 weeks old) were purchased from Orient Bio (Korea) and female Syrian golden hamsters were purchased from Jabaio (Korea). All animals were treated according to the guidelines of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Asan Medical Center. After purchase, a one-week acclimatization period was taken before starting drug treatment or tumorigenesis. Animals were housed under standardized conditions with controlled temperature and humidity and a 12/12-hour light/dark cycle, with free access to food and water.
  • IACUC Institutional Animal Care and Use Committee
  • mice were subcutaneously injected into the right flank with 5 ⁇ 10 5 Pan02 and B16F10 cells.
  • the mice were randomly divided into three groups, and mice in each group were treated with PBS (negative control), 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of IHD virus, and 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of B8R.
  • (-)mCherry-mIL12 virus was injected intratumorally once. Tumor size was measured every 2-3 days with a Vernier caliper, and tumor volume was calculated as [(width) 2 ⁇ length] ⁇ 0.5. Mice were euthanized when tumors reached 16 mm in any dimension or the experiment was terminated.
  • hamsters were subcutaneously injected into the right flank with 1 ⁇ 10 7 RPMI 1846 cells.
  • the hamsters were randomly divided into three groups, and the hamsters in each group were treated with PBS (negative control), 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of IHD virus, and 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of B8R.
  • (-)mCherry-mIL12 virus was injected intratumorally once.
  • Hamsters were euthanized by ending the experiment before the tumor volume reached 10000 mm 3 .
  • ELISpot plates were prepared, washed 4 times with sterile PBS (200 ul/well), and conditioned for at least 30 minutes with the same medium containing 10% serum as used for the cells.
  • a single isolated splenocyte was seeded into each well (mouse, 5.0 ⁇ 10 5 splenocytes; hamster, 2.5 ⁇ 10 5 splenocytes) and a stimulus (tumor cell) was added at a ratio of 5:1. Plates were incubated in a humidified incubator at 37° C. with 5% CO 2 for about 18 hours.
  • the detection antibody (mouse, R4-6A2-biotin; hamster, MTH29-biotin) was diluted to 1 ug/ml in PBS containing 0.5% FBS (PBS-0.5% FBS), and 100 ⁇ l was added to each well to plate the plate. Incubated for 2 hours at room temperature. Plates were washed 3 times with PBS. Streptavidin-ALP was diluted (1:1000) in PBS-0.5% FBS, and 100 ul was added to each well.
  • Plates were incubated for 1 hour at room temperature. Plates were washed 3 times with PBS. A ready-to-use substrate solution (BCIP/NBT-plus) was filtered through a 0.45 um filter and added to each well in an amount of 100 ul. Plates were washed extensively with tap water and then dried. Plates were inspected and spots counted using an ELISpot reader.
  • BCIP/NBT-plus ready-to-use substrate solution
  • Tumor and spleen tissues of each group were collected and fixed in 10% neutral formalin. Tissues were minced, dehydrated using a Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific), embedded in paraffin, and longitudinally embedded in paraffin blocks using an EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Staining was performed by sectioning paraffin blocks at 3 ⁇ m.
  • Immunohistochemistry of sections was performed using an automated slide preparation system (Benchmark XT; Ventana Medical Systems Inc., Arlington, AZ). Deparaffinization, epitope retrieval, and immunostaining were performed according to the manufacturer's instructions. Epitope retrieval was performed using a cell conditioning solution. For immunostaining, BMK UltraView Universal DAB Detection Kit (catalog no. 670-501) was used. Tumor and spleen sections were prepared for 36 min at 37°C for CD3 (1:400, ab16669, Abcam, Cambridge, UK), CD4 (1:1000, ab183685, Abcam, Cambridge, UK), CD8 (1:2000, ab217344, Abcam , Cambridge) antibody was reacted.
  • CD3 1:400, ab16669, Abcam, Cambridge, UK
  • CD4 (1:1000, ab183685, Abcam, Cambridge, UK
  • CD8 (1:2000, ab217344, Abcam , Cambridge
  • UltraMap Anti-rabbit HRP was used as secondary antibody for 16 min at 37°C. Positive signals were amplified using UltraView DAB and UltraView Copper, and sections were counterstained with hematoxylin and bluing reagent. Histological examination of the tumor and spleen was performed by an experienced pathologist, and scanned images at 400 times magnification of the stained slides were obtained using a Motic Easy Scan slide scanner.
  • Tumor and spleen tissues of each group were collected and fixed in 10% neutral formalin. Tissues were minced, dehydrated using a Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific), embedded in paraffin, and longitudinally embedded in paraffin blocks using an EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Paraffin blocks were sectioned at 3 ⁇ m and used for staining.
  • a plasmid (pSP72-B8R) containing the SP72-B8R locus was first prepared, and then the final product, pB8R(-)mCherry-mIL12, was successfully prepared.
  • a schematic diagram of the prepared plasmid is shown in Figures 2a and 2b. The base sequence was verified by confirming the expected band size of the PCR product after gel electrophoresis and genome sequencing service using several primers.
  • the B8R(-)mCherry-mIL12 virus was prepared through homologous recombination during transfection, which means that the viral B8R gene region was converted into the same sequence in the constructed plasmid vector. After recombination, as shown in Figure 3, the enhanced red fluorescent protein (mCherry; GenBank: BAP87017.1) gene was inserted into the viral gene to allow cells infected with the recombinant virus to express red fluorescence.
  • CCK cell counting kit
  • a cell counting kit (CCK) assay was performed on a mouse pancreatic cancer cell line (Pan02) and a mouse melanoma cell line (B16F10).
  • CCK cell counting kit
  • the B8R(-)mCherry-mIL12 virus showed better tumor killing ability than the IHD virus.
  • Example 6 In mouse pancreatic cancer model in vivo Confirmation of anti-tumor effect
  • the mouse pancreatic cancer cell line Pan02 was maintained in 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) RPMI-1640 medium while being statically cultured. After harvesting and counting the cells, a mixture of 5 ⁇ 10 5 Pan02 cells and 50 ⁇ L of Matrigel was subcutaneously injected into the right flank of a 6-week-old C57BL/6 mouse after hair removal. When the tumor was formed, the size of the major axis and the minor axis were measured and observed with a caliper, and the volume of the tumor was calculated using the formula a 2 b/2 (a: length of the minor axis, b: length of the major axis).
  • mice When the average tumor size reached 100 mm 3 , the mice were randomly divided into 3 groups, and the mice in each group were inoculated with PBS (negative control), 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of the parent virus, and 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of the parental virus.
  • B8R(-)mCherry-mIL12 virus was administered intratumorally as a single dose of 50 ⁇ L. The size of the tumor and the weight of the animal were measured every 2-3 days, and the animal was sacrificed on the 9th day based on the day of virus administration (day 0), and the tumor and spleen were removed.
  • the animal's body weight was measured.
  • FIG. 8B as a result of calculating the relative weight of the spleen to the body weight, it was confirmed that the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-treated group increased about 2-fold compared to the negative control group (PBS-administered group) and the parent virus-administered group. , which means that immune boosting was induced by B8R(-)mCherry-mIL12 virus treatment.
  • tumor tissue from all animals was distinctly isolated from the right flank.
  • FIG. 8D when the weight of the isolated tumor was measured, a significant weight reduction was confirmed in the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-administered group, and as shown in FIG. 8E, the size of the tumor was significantly reduced visually.
  • Spleen tissues were obtained after sacrifice of C57BL/6 mice transplanted with mouse pancreatic cancer cell line Pan02 tumors.
  • the spleen tissue from which the surrounding fat was removed was ground and separated into single cells, washed and counted to obtain spleen cells for each animal.
  • 5 510 splenocytes for each animal were dispensed, and 1 ⁇ 10 5 Pan02 was added as a stimulus.
  • the test was performed using a minimum of 3 wells for each animal. Splenocytes and stimulants were incubated at 37° C. for 18 hours, washed, and treated with secondary antibodies to develop spots formed by IFN- ⁇ secreted from splenocytes. The number of spots on the stained plate was counted using AID EliSpot Reader.
  • a tumor tissue obtained by sacrificing a C57BL/6 mouse transplanted with a mouse pancreatic cancer cell line Pan02 tumor was fixed in 10% neutral buffered formalin and then processed into a paraffin-embedded block. Paraffin blocks were cut to a thickness of 3 ⁇ m and attached to New Silane III-coated slides. Immunohistochemical staining using T cell marker (CD3, CD4, CD8) antibodies was performed on the slides thus obtained. The slides were subjected to deparaffinization and antigen retrieval, and reacted with primary antibodies diluted in appropriate concentrations, respectively, and reacted with secondary antibodies suitable for the primary antibody host animal, and then developed with DAB. T cells infiltrated into the tumor were stained with brown staining on the cell membrane.
  • a 400-fold magnified scanned image of the stained slide was obtained using a Motic Easy Scan slide scanner.
  • the tumor area and the number of infiltrated T cells in the tumor were analyzed using the QuPath-0.3.2 program, and the number of infiltrated T cells per unit (tumor) area was calculated.
  • Example 7 In a mouse melanoma model in vivo Confirmation of anti-tumor effect
  • Mouse malignant melanoma cell line B16F10 was maintained in 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) RPMI-1640 medium while being statically cultured. After harvesting and counting the cells, a mixture of 5 ⁇ 10 5 B16F10 cells and 50 ⁇ L of Matrigel was subcutaneously injected into the right flank of 6-week-old C57BL/6 mice. When the tumor was formed, the size of the major axis and the minor axis were measured and observed with a caliper, and the volume of the tumor was calculated using the formula a 2 b/2 (a: length of the minor axis, b: length of the major axis).
  • mice When the average tumor size reached 100 mm 3 , the mice were randomly divided into 3 groups, and the mice in each group were inoculated with PBS (negative control), 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of the parent virus, and 1 ⁇ 10 8 TCID 50 of the parental virus.
  • B8R(-)mCherry-mIL12 virus was administered intratumorally as a single dose of 50 ⁇ L. The size of the tumor and the body weight of the animal were measured every 2-3 days, and the tumor was removed by sacrificing the animal on the 9th day based on the day of virus administration (day 0).
  • the animal's body weight was measured.
  • FIG. 11B as a result of calculating the relative weight of the spleen to the body weight, it was confirmed that the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-treated group increased compared to the negative control group (PBS-administered group) and the parent virus-administered group, This means that immune boosting was induced by B8R(-)mCherry-mIL12 virus treatment.
  • tumor tissue from all animals was distinctly isolated from the right flank.
  • FIG. 11D when the weight of the isolated tumor was measured, a significant weight reduction was confirmed in the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-administered group, and as shown in FIG. 11E, the size of the tumor was significantly reduced visually.
  • Spleen tissues were obtained after sacrifice of C57BL/6 mice transplanted with mouse malignant melanoma cell line B16F10 tumors.
  • the spleen tissue from which the surrounding fat was removed was ground and separated into single cells, washed and counted to obtain spleen cells for each animal.
  • 5 ⁇ 10 5 splenocytes for each animal were dispensed in a mouse IFN- ⁇ ELISpot 96-well plate, and 1 ⁇ 10 5 B16F10 was added as a stimulus.
  • the test was performed using a minimum of 3 wells for each animal. Splenocytes and stimulants were incubated at 37° C. for 18 hours, washed, and treated with secondary antibodies to develop spots formed by IFN- ⁇ secreted from splenocytes. The number of spots on the stained plate was counted using AID EliSpot Reader.
  • Tumor and spleen tissues of each group were collected and fixed in 10% neutral formalin. Tissues were minced, dehydrated using a Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific), embedded in paraffin, and longitudinally embedded in paraffin blocks using an EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Paraffin blocks were sectioned at 3 ⁇ m and used for staining.
  • Example 8 In a hamster melanoma model in vivo Confirmation of anti-tumor effect
  • RPMI 1846 The hamster malignant melanoma cell line RPMI 1846 was maintained in 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) McCoy's 5A medium in static culture. After harvesting and counting the cells, a mixture of 1 ⁇ 10 7 RPMI 1846 cells and 100 ⁇ L of Matrigel was subcutaneously injected into the right flank of a 6-week-old Syrian hamster. When the tumor was formed, the size of the major axis and the minor axis were measured and observed with a caliper, and the volume of the tumor was calculated using the formula a 2 b/2 (a: length of the minor axis, b: length of the major axis).
  • the hamsters were randomly divided into 3 groups, and the hamsters in each group were treated with PBS (negative control), 1 ⁇ 10 8 TCID 50 parental virus, and 1 ⁇ 10 8 TCID 50 B8R (-)mCherry-mIL12 virus was administered intratumorally once at a volume of 100 ⁇ L.
  • the size of the tumor and the weight of the animal were measured every 2-3 days, and the tumor was removed by sacrificing the animal on the 10th day based on the day of virus administration (day 0).
  • the animal's body weight was measured.
  • the tumor volume was measured from day 0 to day 10
  • the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-treated group showed significant tumor suppression.
  • tumor tissue from all animals was distinctly isolated from the right flank.
  • FIG. 14c when the weight of the isolated tumor was measured, a significant weight reduction was confirmed in the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-administered group, and as shown in FIG. 14d, the size of the tumor was significantly reduced visually.
  • Spleen tissues were obtained after sacrifice of Syrian hamsters transplanted with hamster malignant melanoma cell line RPMI-1846 tumors.
  • the spleen tissue from which the surrounding fat was removed was ground and separated into single cells, washed and counted to obtain spleen cells for each animal.
  • IFN- ⁇ ELISpot 96-well plate 2.5 ⁇ 10 5 splenocytes for each animal were dispensed, and 5 ⁇ 10 4 RPMI-1846 was added as a stimulus. The test was performed using a minimum of 3 wells for each animal. Splenocytes and stimulants were incubated at 37° C. for 18 hours, washed, and treated with secondary antibodies to develop spots formed by IFN- ⁇ secreted from splenocytes. The number of spots on the stained plate was counted using AID EliSpot Reader.
  • Hamster malignant melanoma cell line RPMI 1846 Tumor tissues obtained by sacrificing Syrian golden hamsters transplanted with tumors were fixed in 10% neutral buffered formalin, processed, and made into paraffin-embedded blocks. Paraffin blocks were cut to a thickness of 3 ⁇ m and attached to New Silane III-coated slides. Immunohistochemical staining using T cell marker (CD3, CD4, CD8) antibodies was performed on the slides thus obtained. The slides were subjected to deparaffinization and antigen retrieval, and reacted with primary antibodies diluted in appropriate concentrations, respectively, and reacted with secondary antibodies suitable for the primary antibody host animal, and then developed with DAB. T cells infiltrated into the tumor were stained with brown staining on the cell membrane.
  • T cell marker CD3, CD4, CD8
  • a 400-fold magnified scanned image of the stained slide was obtained using a Motic Easy Scan slide scanner.
  • the tumor area and the number of infiltrated T cells in the tumor were analyzed using the QuPath-0.3.2 program, and the number of infiltrated T cells per unit (tumor) area was calculated.
  • the part where necrosis occurred due to hypoxic conditions and the antitumor effect of the virus was excluded from the analysis.
  • FIGS. 16A to 16C it was confirmed that significantly more cytotoxic T cells infiltrated the tumors extracted from the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-administered group compared to the negative control group and the parent virus-administered group.
  • CD4-positive helper T cells were most infiltrated in the parent virus-administered group, but the degree of difference was not large compared to the B8R(-)mCherry-mIL12 virus-administered group.
  • the immune enhancement in the virus-treated group was due to highly activated T cells, in particular, T cells expressing CD4 and CD8, and this immune enhancement was due to IFN- ⁇ activity and IL-12 activity. It was judged to be a synergistic effect. However, in the results of the hamster allotransplantation model, it was judged that the IL-12 gene sequence inserted into the virus was mouse-derived, and therefore showed a relatively less immune enhancing effect compared to mice.
  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus expressing an interleukin-12 gene and a use thereof, wherein the recombinant vaccinia virus in which the B8R gene is deleted and the interleukin-12 gene is inserted at the site of the deleted B8R has IFN- ⁇ activity and IL Increased activity of -12 can exhibit a synergistic effect in immunity and enhance anti-tumor immunity, so it can be usefully applied to the prevention, improvement, or treatment of cancer, which has industrial applicability. there is.

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Abstract

본 발명은 IL-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로, B8R 유전자를 삭제하고, 삭제된 B8R 자리에 IL-12 유전자를 삽입시킨 재조합 백시니아 바이러스는 IFN-γ 활성 및 IL-12 활성이 증가함으로써 면역에서 상승적인(synergistic) 효과를 나타내어 항-종양 면역성 (Anti-tumor immunity)을 증진시킬 수 있으므로 암의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

IL-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도
본 발명은 재조합 바이러스를 이용한 암 치료제에 관한 것으로, 구체적으로 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하며 B8R 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 2021년 12월 7일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0174188호 및 2022년 12월 6일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2022-0169132호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
최근 제약산업에서 주목받고 있는 치료법 중 하나인 종양용해성 바이러스 (Oncolytic virus)는 정상세포에서는 증식하지 않으며, 암세포 특이적으로 증식하여 암세포를 파괴하는 특징을 가지고 있다. 종양용해성 바이러스의 4가지 주요기전은 직접감염으로 인한 종양용해, 항-종양 면역 세포 활성화에 기여하는 종양 관련 항원 (TAA) 방출, 재조합 바이러스에 유전적으로 삽입된 외래 유전자의 발현에 의한 숙주 면역 촉진, 그리고 B세포 및 T세포 면역 기억으로 인한 암 재발 방지 기전으로, 직접적으로 암세포를 공격하는 것 외에도 인체의 적응면역반응을 촉진시키는 기능 (Immune stimulation)과 더불어 종양 혈관내피세포를 특이적으로 감염시켜 파괴하여 신생혈관 생성을 억제하는 기능이 알려져 있다.
1904년 Dock G가 42세 여성 골수성 백혈병 환자가 인플루엔자로 추정되는 감기 바이러스 감염 후 보인 종양 관해를 보고한 것을 시작으로, 수두바이러스(chickenpox), 인플루엔자 바이러스 등의 바이러스에서 항암 연구가 진행, 보고되고 있으며, 현재 많은 종양용해성 바이러스의 연구와 임상시험이 진행되고 있다.
본 발명자들은 안전하며 항암 효능이 우수한 종양용해성 바이러스를 발굴하기 위하여 예의 연구한 결과, 백시니아 바이러스의 B8R 유전자를 인터루킨-12 유전자로 치환할 경우, IFN-γ 활성 및 IL-12 활성 증가에 따른 면역에서의 상승적인(synergistic) 효과로 항-종양 면역이 현저하게 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스로서, 상기 인터루킨-12 유전자는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항종양 면역성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스로서, 상기 인터루킨-12 유전자는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 백시니아 바이러스 유전자 B8R은 서열번호 11의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역이 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), 및 IHD (International Health Division) 백시니아 바이러스 종(strain)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 IHD (International Health Division) 백시니아 바이러스 종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항종양 면역성 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 암 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항종양 면역성 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 악성 흑색종, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 만족하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
(a) 종양 내 CD3+ T 세포 수준을 증가시킴;
(b) 종양 내 CD4+ T 세포 수준을 증가시킴; 및
(c) 종양 내 CD8+ T 세포 수준을 증가시킴.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 항-종양 면역 (Anti-tumor immunity)성을 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및 상기 전달벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 IL-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로, 백시니아 바이러스에서 B8R 유전자를 삭제하고, 삭제된 B8R 자리에 IL-12 유전자를 삽입시킨 재조합 백시니아 바이러스는 IFN-γ 활성 및 IL-12 활성이 증가함으로써 면역에서 상승적인(synergistic) 효과를 나타내어 항-종양 면역성 (Anti-tumor immunity)을 증진시킬 수 있으므로 암의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 플라스미드 pB8R(-)mCherry-mIL12의 클로닝 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 재조합 플라스미드 pSP72-B8R 및 pB8R(-)mCherry-mIL12의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 3은 단일 플라그 분리 (single plaque isolation) 과정을 거쳐 분리된 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 플라그를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (A: Bright-field microscopy, ×100/B: Fluorescence microscopy (Red), ×100).
도 4는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 특성 분석을 위해 재조합 백시니아 바이러스 처리된 세포 및 배지에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 IL-12 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 세포독성을 Vero 세포, MC38 및 LLC1 세포에서 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 유전적 조작을 가하지 않은 IHD 바이러스(모 바이러스)와 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 마우스 췌장암 세포(Pan02)에 대한 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 유전적 조작을 가하지 않은 IHD 바이러스(모 바이러스)와 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 마우스 흑색종 세포(B16F10)에 대한 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도 8e는 마우스 췌장암 모델에서 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 항-종양 효과를 확인한 것으로, 도 8a는 체중 변화를 측정한 결과, 도 8b는 체중에 대한 비장의 상대적인 무게를 확인한 결과, 도 8c는 종양 부피를 측정한 결과, 도 8d는 종양 무게를 측정한 결과, 도 8e는 마우스 췌장암 모델에서 적출한 종양을 나타낸 도면이다.
도 9는 마우스 췌장암 모델에서 적출한 비장 조직을 이용하여 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스) 처리 후의 T 세포 활성도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a 내지 도 10c는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스) 처리 후 마우스 췌장암 모델에서 적출한 종양 조직에 면역 염색을 수행하여 종양침윤림프구 수를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 도 10a는 CD3 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를, 도 10b는 CD8 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를, 도 10c는 CD4 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a 내지 도 11e는 마우스 흑색종 모델에서 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 항-종양 효과를 확인한 것으로, 도 11a는 체중 변화를 측정한 결과, 도 11b는 체중에 대한 비장의 상대적인 무게를 확인한 결과, 도 11c는 종양 부피를 측정한 결과, 도 11d는 종양 무게를 측정한 결과, 도 11e는 마우스 흑색종 모델에서 적출한 종양을 나타낸 도면이다.
도 12는 마우스 흑색종 모델에서 적출한 비장 조직을 이용하여 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스) 처리 후의 T 세포 활성도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 마우스 흑색종 모델에서 적출한 종양 조직에 CD8 면역 형광 염색을 수행하여 종양 내 침윤된 세포독성 T 세포의 분포를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14a 내지 도 14d는 햄스터 흑색종 모델에서 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 항-종양 효과를 확인한 것으로, 도 14a는 체중 변화를 측정한 결과, 도 14b는 종양 부피를 측정한 결과, 도 14c는 종양 무게를 측정한 결과, 도 14d는 햄스터 흑색종 모델에서 적출한 종양을 나타낸 도면이다.
도 15는 햄스터 흑색종 모델에서 적출한 비장 조직을 이용하여 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스) 처리 후의 T 세포 활성도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16a 내지 도 16c는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스) 처리 후 햄스터 흑색종 모델에서 적출한 종양 조직에 면역 염색을 수행하여 종양침윤림프구 수를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 도 16a는 CD3 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를, 도 16b는 CD8 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를, 도 16c는 CD4 면역 염색 슬라이드를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 항-종양 기전을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)의 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로, 백시니아 바이러스의 B8R 유전자를 IL-12 유전자로 치환하는 경우, IFN-γ 활성 및 IL-12 활성이 증가함으로써 면역에서 상승적인(synergistic) 효과를 나타내어 항-종양 면역성을 증진시켜 현저한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하여 완성된 것이다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스로서,
상기 인터루킨-12 유전자는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
본 발명에서 “백시니아 바이러스 (vaccina virus)”는 우두(cowpox) 바이러스로도 불리며, 가장 널리 연구된 종양용해성 바이러스 (oncolytic) 중 하나로 세포질에서 증식하고 200 kb의 이중가닥 DNA를 게놈으로 가지고 있는 외피 보유 바이러스로 두창바이러스(poxvirus)에 속한다. 백시니아 바이러스는 200 kb의 이중가닥 DNA를 전사하고 번역해 총 250개의 유전자를 발현하며, 200 kb의 선형 DNA 게놈을 가지고 있어 다수의 유전자 제거 및 최대 40 kb까지 전이 유전자 삽입이 가능하므로 유전자 치료 및 운반의 도구로 널리 이용되고 있으며, 상피암에서 활성화 되어있는 EGFR/RAS 경로에 의존하여 증식하기 때문에 선천적인 종양 특이성을 가지므로 발암성 유발의 위험이 적다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD (International Health Division) 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 IHD 종 백시니아 바이러스를 사용하였다.
본 발명에 있어서, “재조합 (recombinant) 백시니아 바이러스”란 게놈 내에 외래 유전자가 하나 이상 삽입 (도입)된 백시니아 바이러스를 의미한다. 외래 유전자가 삽입되는 게놈 내 위치에는 제한이 없으나, 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 IL-12 유전자가 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스의 B8R 유전자가 IL-12 유전자로 치환된 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에서 유전자 변형되는 상기 백시니아 바이러스는 야생형일 수 있고, 감염 효율, 복제 기능, 항암 효과 등을 증진시키기 위해 일부 서열이 결실된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “B8R”은 분비형 인터페론 감마(IFN-γ) 결합 단백질을 암호화하는 백시니아 바이러스의 유전자로, 인터페론 감마 결합 단백질은 인터페론 감마의 결합을 차단하여 숙주의 인터페론 감마 활성을 억제하고 항바이러스 면역을 지연시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역이 결실되어 있어 인터페론 감마 결합 단백질을 생성하지 못하므로 숙주에서 T림프구와 자연 살상 세포(NK 세포)를 활성화하고 체액성 면역을 향상시키는데 관여하는 인터페론 감마 활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 B8R 유전자는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, B8R 유전자는 서열번호 11로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 B8R 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “인터페론 감마 (interferon gamma, IFN-g 또는 IFN-γ)”는 항암 면역 반응의 중심에서 조절자 역할을 하는 단백질로서, 암세포에 대한 세포면역을 활성화하여 암세포 증식 억제, 암세포 사멸 촉진 등을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 바이러스 유전 서열과 관련하여 사용되는 용어 “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 상기 서열 결실에 의해 유전자의 기능적 단백질의 발현이 일어나지 않거나 저해된다.
본 발명에 있어서, “인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12)”은 가장 효과적이고 유망한 항암 사이토카인 중의 하나이다. IL-12는 이황화결합으로 연결된 40 kDa 및 35 kDa 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머(heterodimeric) 단백질이며, 활성화된 대식세포, 단핵구, 수지상세포 및 활성 B 림프구에 의해 생성된다. IL-12는 T-helper 1 세포 면역을 증진시킬 수 있고, 세포성 T-림프구의 세포독성을 증가시키며, 혈관신생을 억제시킬 수 있다. 일반적으로 IL-12는 T 세포 및 NK 세포의 IFN-γ생산을 활성화시킨다. IL-12의 국소적 발현은 종양세포가 T-세포 매개 세포독성에 민감하게 반응하도록 하며, 결과적으로 종양 성장 억제 및 체액성 면역(systemic immunity)의 구축을 가져오는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 IL-12 유전자는 마우스의 IL-12 유전자(mIL-12)일 수 있다.
상기 IL-12 유전자는 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, IL-12 유전자는 서열번호 9로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클 레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 IL-12 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 IL-12 유전자는 백시니아 바이러스의 게놈 내 B8R 유전자 영역에 벡터를 이용하여 도입될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 벡터를 이용하여 B8R 유전자를 IL-12 유전자로 치환하여 B8R 유전자는 발현하지 않고, IL-12 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 게놈 변형 방법에는 제한이 없으며, 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 상동말단연결 (homologous endjoining)을 통해 외래 유전자 (즉, IL-12 유전자)가 게놈 내에 삽입될 수 있다. 상동말단연결은 DNA의 이중가닥 절단을 수선하는 방법 중 하나로, DNA 수선시 상동성을 가진 서열을 주형으로 이용해 절단된 DNA를 합성하는 것을 특징으로 하며, 절단된 DNA 가닥이 그대로 연결되는 비-상동말단연결 (non-homologous endjoining)과는 구별된다.
본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 제조하고자 하는 경우, 야생형 백시니아 바이러스로 세포를 감염시킨 후, 바이러스의 게놈 내에 삽입하고자 하는 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입시켜 세포 내에서 백시니아 바이러스 게놈의 변형 (즉, 유전자의 삽입)이 일어나도록 유도할 수 있다. 벡터의 세포 내 도입 및 야생형 백시니아 바이러스의 감염은 순서에 제한이 없고, 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 벡터의 세포 내로의 도입, 즉, 벡터의 형질감염 또는 트랜스펙션은 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하기 위해 통상 사용되는 다양한 기술, 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션 (lipofection) 등을 통해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 형질전환체를 선별하기 위한 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 백시니아 바이러스의 게놈 내에 함께 삽입된 IL-12 유전자와 동시에 발현되어 바이러스 내지 형질전환체의 식별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 마커 유전자로서 형광 단백질 (fluorescent protein) 코딩 유전자를 포함할 수 있다. 형광 단백질이란 특정 파장의 빛을 흡수하여 활성화된 뒤 다시 정상상태로 되돌아가는 과정에서 특정 파장의 빛을 외부로 발산함으로써 특유의 색깔로 발광하는 단백질을 지칭한다. 형광단백질의 예시로는 GFP (green fluorescent protein) 코딩 유전자, RFP (red fluorescent protein) 단백질 코딩 유전자, 및 mCherry 코딩 유전자 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 마커 유전자로서 mCherry 코딩 유전자 (예를 들어, 서열번호 13)를 더 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자의 게놈 내 위치에는 제한이 없으나, 바람직하게는 B8R 유전자 영역에 존재할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 재조합 백시니아 바이러스의 게놈 내에 삽입된 IL-12 유전자의 업스트림 (upstream) 또는 다운스트림(downstream)에 위치할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로서 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 악성 흑색종, 및 기질 종양으로 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등일 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 재조합 백시니아 바이러스의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 대상체 내로 투여되었을 때 상기 조성물 내에 포함된 재조합 백시니아 바이러스가 생체에서 이용 가능하도록 제형화될 수 있다. 투여 후에는 ELISA 등의 검출 방법을 통해 종양 조직, 혈액, 및 기타 조직 내에 존재하는 백시니아 바이러스를 모니터링할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 단회 투여 또는 2회 이상 반복 투여될 수 있으며, 종양이 감소하거나 소멸할 때까지 반복 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내(intratumorally) 직접투여 또는 정맥투여를 통해 투여될 수 있으며, 종양의 상태 및 종류 등에 따라 적절한 투여방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 암 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명은 일 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스가 IL-12 단백질을 발현하는 것을 확인하였다 (실시예 3 참조).
본 발명은 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스가 모 바이러스와 비교하여 우수한 종양 살상능을 나타내는 것을 확인하였다 (실시예 5 참조).
본 발명은 또 다른 실시예에서, 마우스 췌장암 모델, 마우스 흑색종 모델, 및 햄스터 흑색종 모델을 이용하여 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 항-종양 효과를 확인한 결과, 모 바이러스와 비교하여 종양 억제능이 우수하며, CD3, CD4 및 CD8을 발현하는 T-세포를 증가시킴으로써 T-세포를 높게 활성화시키는 것을 확인하였다 (실시예 6 내지 8 참조).
따라서, 본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 만족할 수 있다:
(a) 종양 내 CD3+ T 세포 수준을 증가시킴;
(b) 종양 내 CD4+ T 세포 수준을 증가시킴; 및
(c) 종양 내 CD8+ T 세포 수준을 증가시킴.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 항-종양 면역성 (Anti-tumor immunity)을 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항종양 면역성 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항종양 면역성 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, “항종양(Anti-tumor)”은 암세포의 사멸, 암세포의 생존능 저하, 암세포의 증식 억제에 따른 암이 가지는 병리적 증상의 억제나 지연, 암 전이 억제, 암 재발 억제를 포함하는 의미이다.
본 발명의 항종양 면역성 증진용 조성물은 허가된(approved) 임의의 항암제와 병용 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 항암제와 병용 또는 혼합되어 사용될 경우 그러한 항암제로는 대사 길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 식물유래 알칼로이드 등 암세포에 세포독성을 나타내는 임의의 항암제, 임의의 사이토카인 의약품, 임의의 항체 의약품, 임의의 면역관문 억제제 의약품, 임의의 세포 치료제(car-T cell therarpy, car-NK cell therapy) 의약품 등을 포함한다. 구체적으로 탁솔, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 시스플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 소라페닙, IL-2 의약품, INF-α 의약품, INF-γ의약품, 트라스투주맙, 블리나투모맙, 이필리무맙, 펩브롤리주맙, 니볼리주맙, 아테졸리주맙(Atezolizumab), 두발루맙(Durvalumab), 베바시주맙, 세툭시맙, 티사젠렉루셀(Tisagenlecleucel, 킴리아), 액시캡타젠 실로루셀(Tisagenlecleucel Axicabtagene Ciloleucel, 예스카타) 등이 예시될 수 있으며, 이들 예시된 항암제 이외에도 당업계에 공지된 여타의 항암제도 제한없이 본 발명의 조성물과 혼합되어 사용되거나 병용 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 재조합 백시니아 바이러스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 암의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 면역항암제를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 암을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있는 물질 내지 기기 등의 조합을 의미하며, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 제조, 보관, 또는 투여할 수 있는 형태이면 되고, 구체적인 형태에는 제한이 없다. 따라서, 본 발명에 따른 키트는 재조합 백시니아 바이러스 및 면역항암제 뿐만 아니라 특정 질환의 치료를 위한 키트의 구성요소로서 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및 상기 전달벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 전달벡터는 pB8R(-)mCherry-mIL12을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "벡터(vector)"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자로 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 핵산이 위치하는 것을 의미할 수 있다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 효모 인공 염색체(예: YAC)가 포함될 수 있다.
목적하는 유전자를 상기 벡터에 삽입하는 것은, 당업계에 알려진 모든 유전자 재조합 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 상기 벡터를 상기 백시니아 바이러스에 삽입하는 것은 당업계에 알려진 모든 형질감염 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 세포 배양
*Vero (African green monkey kidney epithelial cell line) 및 RPMI 1846 (Syrian golden hamster melanotic melanoma cell line)은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Pan02 (murine pancreatic cancer cell line), B16F10 (murine melanoma cell line), MC38 (murine colon adenocarcinoma cell line), 및 LLC1 (murine lung cancer cell line)은 APEX(Asan Preclinical Evaluation center for cancer therapeutiX)에서 입수하였다. 모든 세포주에 ATCC 권장량의 FBS(fetal bovine serum)을 각각 보충하고 1% AA(antibiotic-antibiotics)를 함유한 적절한 배지로 유지하였다. 세포는 37℃, 5% CO2, 습윤하 조건에서 배양하였다.
2. 플라스미드(plasmid)
유전자 재조합 백시니아 바이러스 제작을 위한 플라스미드 전달체(vector)는 대장균에서 증식하기 위한 복제기점과 항생제 ampicillin 저항성 유전자를 가진 pSP72 플라스미드에 B8R 유전자위(locus)에 재조합 반응이 일어나 삽입되기 위한 백시니아 바이러스 유래의 상동서열을 삽입하고, 추가로 외래 유전자인 mCherry 형광단백질과 마우스 단일사슬 형태의 IL-12 유전자를 적절한 프로모터(promoter)와 결합하여 삽입하였다. 구체적으로는 B8R 유전자가 결실된 플라스미드를 만들고, mCherry-mIL12 전이유전자(transgene)를 삽입하여 pB8R(-)mCherry-mIL12를 만들었다. 플라스미드 클로닝 방법의 전체 단계는 도 1에 나타내었다.
구체적으로, 상업 플라스미드인 pSP72는 Promega Corporation에서 구입하였으며, 하기 표 1에 기재된 프라이머 pSP72-R (서열번호 1) 및 pSP72-F (서열번호 2) (Phusion flash high-fidelity 70 PCR Master mix, F548S)를 이용하여 PCR 반응을 통해 증폭하였다 (Step1). B8R locus 또한 하기 표 1에 기재된 프라이머 SP72-B8R_Left-F (서열번호 3) 및 SP72-B8R_Right-R (서열번호 4)을 사용하여 IHD 바이러스 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR 반응을 통해 증폭하였다 (Step2). sP72 PCR 산물과 B8R locus PCR 산물을 overlap cloner kit (EBK1011, Elpis Bio.)를 사용하여 SP72-B8R 플라스미드를 만들기 위해 조립하였다 (Step3). SP72-B8R 플라스미드 서열은 하기 표 1에 기재된 프라이머 Seq-B8Rp-F (서열번호 7), Seq-B8R-R (서열번호 8), 및 상업용 프라이머 T7, SP6을 사용하여 Cosmogenetech(Korea)의 DNA 시퀀싱 서비스(genome sequencing service)를 통해 검증하였다.
pSP72-B8R 서열을 모두 검증한 후, B8R 유전자가 없는 서열을 PCR로 증폭하였다 (Step4). B8R locus가 없는 서열은 하기 표 1에 기재된 프라이머 ApaI-B8Rminus_Left-R (서열번호 5) 및 XhoI-B8R_Right-F (서열번호 6)로 증폭하였다. 합성된 유전자 생성물을 효소 ApaI 및 XhoI로 분해하였다 (Step5). 증폭한 B8Rminus 서열은 overlap cloner에 의해 합성된 유전자 생성물과 각각 조립하였다 (Step6).
Figure PCTKR2022019840-appb-img-000001
3. 플라스미드 E.coli 형질전환 및 정제
검증한 플라스미드를 적절한 E.coli 세포로 형질전환시키고, ampicillin을 함유하는 LB Agar 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하여 콜로니를 형성케 하였다. pB8R(-)mCherry-mIL12 E.coli 콜로니는 상기 표 1에 기재되어 있는 프라이머 Seq-B8Rp-F (서열번호 7) 및 Seq-B8R-R (서열번호 8)으로 각각 Colony PCR을 수행하였다. 예상되는 밴드 크기를 가진 콜로니를 LB Broth 배지를 포함하는 10 mL Ampicillin 액상배지에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 밤새 배양하여, Plasmid DNA Purification Kit Mini (CMP0112, Cosmogenetech, Korea)를 사용하여 정제된 플라스미드를 얻었다. 최종 생산물인 pB8R(-)mCherry-mIL12는 상기 표 1에 기재된 프라이머 Seq-B8Rp-F (서열번호 7), Seq-B8R-R (서열번호 8), 및 상업용 프라이머 T7, SP6을 사용하여 Cosmogenetech(Korea)의 DNA 시퀀싱 서비스를 통해 검증하였다.
4. 바이러스
백시니아 바이러스 IHD 균주(VR-156)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 IHD 바이러스(모 바이러스)를 감염시킨 Vero 세포에 플라스미드 전달벡터를 형질전환(jetPRIME, #101000015, Polyplus, USA)시켜 변형하였다. 모든 플라그(Plaque)가 적색 형광을 발현할 때까지 단일 재조합 플라그를 분리하기 위해 Agarose 오버레이 방법을 연속적으로 수행하였다.
단일 플라그를 분리한 후, 재조합 백시니아 바이러스를 Vero 세포에서 증폭하고 30% sucrose gradient ultra-centrifugation (13,700 rpm, 4℃1hr 20min, Acel 9, Decel 9)를 통해 정제하였다.
5. TCID 50 분석에 의한 바이러스 역가 측정
바이러스 역가는 감염성 분석 중 하나인 TCID50 분석에 의해 결정하였다. 4.2×103개의 Vero 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 있는 성장 배지에서 준비하여 37℃, 5% CO2, 습윤하 조건에서 밤새 배양하였다. 바이러스 샘플 원본의 1:10으로 예를 들어, 바이러스 원본의 10-3에서 10-7까지 일련의 희석을 준비하였으며, 모든 바이러스 샘플은 각 웰에 50 μl의 바이러스를 옮기기 직전까지 강하게 vortexing 하였다. 세포 플레이트는 3 내지 4일 동안 CPE (Cytopathic effect)를 모니터링하기 위해 37℃, CO2 인큐베이터로 다시 이동시켰다. CPE가 3개의 개별 판독값에 대해 희석당 동일하게 나타날 때 endpoint를 결정하였으며, Spearman-Karber 방법 (Ramakrishnan, 2016)에 기초하여 역가를 계산하였다.
6. 웨스턴 블롯 분석
1 mL의 적절한 배지로된 6-웰 플레이트에 seeding한 Vero 세포를 바이러스(모(parent) 바이러스, 및 pB8R(-)mCherry-mIL12 바이러스)로 36시간 동안 감염시켰다. 배지를 조심스럽게 1.5 mL e-tube로 옮겨 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 상층액을 새로운 1.5 mL e-tube로 옮기고, 10 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 20℃에서 보관하였다. 잔여 세포 펠렛(pellet)은 1 mL PBS로 스크랩하여, 4,000rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 200 uL PRO-PREP 용액에서 최소 30분 동안 인큐베이션하여 20°C에서 보관하였다.
동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE(4-15%)에 로딩하고 크기 별로 분리하여 polyvinylidene difluoride membrane (Thermo Scientific™)으로 옮겼다. 막(membrane)을 mouse IL-12A(1:2000, ab133751, Abcam, Cambridge, UK), β-액틴(1:5000, sc-47778, Santa Cruz, CA, 132 USA)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양하였다. 2차 항체 (Goat anti-mouse IgG, 및 Goat anti-rabbit IgG (no. A90-116P, A120-101P, Bethyl, Montgomery, TX, USA))와 함께 실온에서 인큐베이션하기 1시간 전 막을 0.1% Tween 20이 포함된 PBS에서 3회 세척하였다. 면역반응성 밴드는 ECL western blot detection reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 사용하여 화학 발광으로 시각화하였다.
7. In vitro 세포독성 분석
96-웰 플레이트에 seeding한 세포를 72시간 동안 서로 다른 농도(0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 및 500 MOI)의 바이러스로 감염시켰다. 10 uL의 CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37에서 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 파장 450 nm에서 TECAN 2000 spectrophotometer (Spark, Mannedorf, Swiss)로 분석하였다.
* 8. 동물 실험
암컷 C57BL/6 마우스 (7주령)은 오리엔트 바이오 (한국)에서, 암컷 Syrian golden 햄스터는 자바이오 (한국)에서 구입하였다. 모든 동물은 아산병원 동물관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 지침에 따라 처리하였다. 구입 후, 약물 처리 또는 종양 형성을 시작하기 전 일주일 동안 새로운 환경에 적응하는 순화기간을 가졌다. 동물은 온도와 습도가 조절되며, 12/12시간의 명암 주기가 있는 표준화된 조건에서 사육하였으며, 식이와 물은 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.
9. In vivo 항-종양 효능
마우스 췌장암, 흑색종 동종이소 종양 모델을 확립하기 위해, 마우스에 5×105개의 Pan02 및 B16F10 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 부피가 100 mm3에 도달하면 마우스를 무작위로 세 그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹의 마우스에 PBS (음성 대조군), 1×108 TCID50의 IHD 바이러스, 및 1×108 TCID50의 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 단회 종양 내 주사하였다. 종양 크기는 Vernier caliper로 2-3일마다 측정하였고 종양 부피는 [(폭)2×길이]×0.5로 계산하였다. 종양이 임의의 치수에서 16 mm에 도달하거나 실험이 종료된 때 마우스를 안락사시켰다.
또한, 햄스터 흑색종 동종이소 종양 모델을 확립하기 위해, 햄스터에 1×107개의 RPMI 1846 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 부피가 500 mm3에 도달하면 햄스터를 무작위로 세 그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹의 햄스터에 PBS (음성 대조군), 1×108 TCID50의 IHD 바이러스, 및 1×108 TCID50의 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 단회 종양 내 주사하였다. 종양의 부피가 10000 mm3에 도달하기 전에 실험을 종료하여 햄스터를 안락사시켰다.
10. ELISpot 분석
ELISpot 플레이트를 준비하여 멸균 PBS (200 ul/웰)로 4회 세척하고, 세포에 사용된 것과 동일한 혈청 10%를 함유하는 배지로 최소 30분 동안 컨디셔닝(conditioning)하였다. 단일 분리된 비장세포를 각 웰에 분주하고 (마우스, 5.0×105 비장세포; 햄스터, 2.5×105 비장세포) 자극원(종양 세포)을 5:1의 비율로 추가하였다. 플레이트를 약 18시간 동안 37℃에서 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 배양하였다.
세포를 제거하고 플레이트를 각 웰당 200 ㎕ PBS로 5회 세척하였다. 검출 항체 (마우스, R4-6A2-biotin; 햄스터, MTH29-biotin)를 0.5% FBS를 함유하는 PBS (PBS-0.5% FBS)에 1 ug/ml로 희석하고 각 웰에 100 μl씩 첨가하여 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. Streptavidin-ALP를 PBS-0.5% FBS에 희석(1:1000)하고, 각 웰에 100 ul씩 첨가하였다.
플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 바로 사용할 수 있는 기질 용액 (BCIP/NBT-plus)을 0.45 um 필터를 통해 여과하여 각 웰에 100 ul씩 첨가하였다. 수돗물로 플레이트를 광범위하게 세척한 후 건조하였다. 플레이트를 검사하고 ELISpot 판독기를 사용하여 스팟을 계산하였다.
11. 면역조직화학 염색
각 그룹의 종양 및 비장 조직을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 조직을 다듬고, Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 탈수하고, 파라핀으로 침투시키고, EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 파라핀 블록에 세로로 포매하였다. 파라핀 블록을 3 μm로 박절하여 염색을 수행하였다.
절편(section)의 면역조직화학은 automated slide preparation system (Benchmark XT; Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ)을 사용하여 수행하였다. 탈파라핀화, 에피토프 검색(Epitope retrieval), 및 면역염색은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 세포 컨디셔닝 용액을 사용하여 에피토프 검색을 수행하였다. 면역염색을 위해 BMK UltraView Universal DAB Detection Kit (catalog no. 670-501)를 사용하였다. 종양 및 비장 절편은 37℃에서 36분 동안 CD3 (1:400, ab16669, Abcam, Cambridge, UK), CD4 (1:1000, ab183685, Abcam, Cambridge, UK), CD8 (1:2000, ab217344, Abcam, Cambridge) 항체를 반응시켰다. UltraMap Anti-rabbit HRP를 37℃에서 16분 동안 2차 항체로 사용하였다. UltraView DAB 및 UltraView Copper를 사용하여 양성 신호를 증폭하고 절편을 hematoxylin 및 bluing 시약으로 대조염색하였다. 숙련된 병리학자가 종양과 비장의 조직학적 검사를 수행하였으며, Motic Easy Scan 슬라이드 스캐너를 이용하여 염색된 슬라이드의 400배 확대된 스캔 이미지를 얻었다.
12. 면역형광 염색
각 그룹의 종양 및 비장 조직을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 조직을 다듬고, Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 탈수하고, 파라핀으로 침투시키고, EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 파라핀 블록에 세로로 포매하였다. 파라핀 블록을 3 μm로 박절하여 염색에 사용하였다.
조직 절편을 탈파라핀화한 후 Tris/EDTA (pH9) 용액을 이용하여 항원 복구를 수행하였다. 슬라이드를 수분 상자(moisture chamber)에 배치한 후 5% normal goat serum이 포함된 0.4% Triton-X PBS (PBST)로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 슬라이드에 마우스 항 CD8 항체 (ab217344, Abcam, Cambridge)를 1% normal goat serum 포함 PBST에 1:100으로 희석하여 처리하였다. 각 단계마다 PBST로 3회씩 세척하였다. 2차 항체로 goat anti-rabbit IgG (H&L)-Alexa Fluor 488을 PBST에 1:1000으로 희석하여 처리하였고 1시간동안 실온에 방치하였다. DAPI를 이용한 핵 대조염색을 5분간 처리한 후 수성 봉입제로 슬라이드를 봉입하였다. 염색한 슬라이드는 형광현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰, 촬영하였다.
13. 통계 분석
모든 통계 분석은 Prism8 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
[실시예]
실시예 1. 플라스미드 공학 (Plasmid engineering)
플라스미드 생산의 모든 과정은 순차적으로 진행하였다. SP72-B8R locus를 포함하는 플라스미드(pSP72-B8R)를 먼저 제조한 후, 최종 생산물인 pB8R(-)mCherry-mIL12를 성공적으로 제조하였다. 제조한 플라스미드의 모식도는 도 2a 및 도 2b에 나타냈다. 염기서열은 여러 개의 프라이머를 이용한 게놈 시퀀싱 서비스와 겔 전기영동 후 PCR 산물의 예상 밴드 크기를 확인함으로써 검증하였다.
실시예 2. 바이러스 생성
B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스는 형질감염 (transfection) 동안 상동 재조합을 통해 제작하였으며, 이는 제작한 플라스미드 벡터 내에서 바이러스 B8R 유전자 영역이 동일한 서열로 전환되었음을 의미한다. 재조합 후, 도 3에 나타낸 바와 같이, 강화된 적색 형광 단백질 (mCherry; GenBank: BAP87017.1) 유전자를 바이러스 유전자에 삽입하여 적색 형광을 발현하는 재조합 바이러스에 감염된 세포를 허용하였다.
실시예 3. 단백질 수준에서 재조합 바이러스 특성화(characterization)
바이러스 유전자에 삽입된 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12)가 단백질 형태로 번역되는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 샘플 준비를 위해, Vero 세포를 모 바이러스(IHD 바이러스), 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스로 감염시켰다. 세포 펠렛과 배지는 별도로 준비하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 모 바이러스 처리 샘플의 세포 및 배지에서는 관찰되지 않았던 IL-12 단백질이 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리 샘플의 세포 및 배지 모두에서 발현되는 것을 확인하였다. 함께 로딩(loading)된 단백질 래더(protein ladder)를 기준으로 두 개의 두드러진 밴드의 크기는 29 kDa 및 70 kDa이였다. 로딩된 샘플의 양이 일정하고 예상한 대로 배지 샘플에서 전혀 검출되지 않았음을 확인하기 위해 β-액틴으로 웨스턴 블롯 분석 염색을 수행하였다.
실시예 4. 바이러스 감염성 분석
B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스의 감염성을 평가하기 위해, 세 가지 다른 세포주에서 CCK (cell counting kit) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스의 Vero 세포에 대한 IC50=0.4915, MC38 세포에 대한 IC50=0.3903, LLC1 세포에 대한 IC50=32.21였고, MC38, Vero, LLC1 순서로 세포에 매우 민감한 결과를 나타냈다.
실시예 5. 바이러스 감염성 분석
B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스의 감염성을 IHD 원(original) 바이러스와 비교하기 위해, 마우스 췌장암 세포주(Pan02)와 마우스 흑색종 세포주(B16F10)에서 CCK (cell counting kit) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6과 도 7에 나타난 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스의 Pan02 세포에 대한 IC50=83.25, B16F10 세포에 대한 IC50=146.6였고, IHD 바이러스는 Pan02 세포에 대한 IC50=210.5, B16F10 세포에 대한 IC50=406.3을 나타냈다. 두 가지 세포주 모두에서 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스가 IHD 바이러스보다 우수한 종양 살상능을 보였다.
실시예 6. 마우스 췌장암 모델에서 in vivo 항-종양 효과 확인
6-1. 항-종양 효과 확인
마우스 췌장암 세포주 Pan02를 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) RPMI-1640 배지에 정치배양하며 유지하였다. 세포를 수확하여 계수한 후 5×105개의 Pan02 세포와 Matrigel 50 μL을 혼합하여 제모한 6주령 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. 종양이 형성되면 장축과 단축의 크기를 caliper로 측정하며 관찰하였고, 종양의 부피는 a2b/2 (a: 단축의 길이, b: 장축의 길이) 식을 이용하여 계산하였다. 평균 종양의 크기가 100 mm3에 도달하면 마우스를 무작위로 3그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹의 마우스에 PBS (음성 대조군), 1×108 TCID50의 모 바이러스, 및 1×108 TCID50의 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 50 μL씩 단회 종양 내 투여하였다. 종양의 크기 및 동물의 체중을 2-3일 간격으로 측정하였고, 바이러스를 투여한 날(0일)을 기준으로 9일째 동물을 희생하여 종양과 비장을 적출하였다.
모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 마우스 췌장암 모델에 투여한 후 동물의 체중을 측정한 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 유의한 체중 변화를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 체중에 대한 비장의 상대적인 무게를 계산한 결과, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리군이 음성 대조군 (PBS 투여군) 및 모 바이러스 투여군에 비해 약 2배 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리로 면역 증강(immune boosting)이 유발된 것을 의미한다.
모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 후 0일부터 9일까지 종양 부피를 측정한 결과 도 8c에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군과 비교하여 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리군에서 현저한 종양 억제를 확인할 수 있었다.
부검 시 모든 동물의 종양 조직은 오른쪽 옆구리에서 뚜렷하게 분리되었다. 도 8d에 나타낸 바와 같이, 분리한 종양의 무게를 측정하였을 때 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군에서 뚜렷한 무게 감소를 확인할 수 있었고, 도 8e에 나타낸 바와 같이, 육안으로도 종양의 크기가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
* 6-2. T세포 활성도 확인
마우스 췌장암 세포주 Pan02 종양이 이식된 C57BL/6 마우스를 희생한 후 비장 조직을 얻었다. 주변의 지방을 제거한 비장 조직을 갈아 단일 세포로 분리한 후 세척 및 계수하여 각 동물별 비장세포를 확보하였다. 마우스 IFN-γ ELISpot 96-웰 플레이트에 각 동물별 비장세포 5105개씩 분주하고 1×105개의 Pan02를 자극원 (stimuli)으로 추가하였다. 시험은 각 동물별로 최소 3개의 웰을 이용하여 수행하였다. 비장세포와 자극원을 37℃에서 18시간동안 배양한 후 세척 및 2차 항체를 처리하여 비장세포에서 분비된 IFN-γ에 의해 형성되는 spot을 발색시켰다. AID EliSpot Reader를 이용하여 염색된 플레이트에서 Spot의 개수를 계수하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 군에서 활성화된 T 세포에서 분비하는 IFN-γ 양과 비례하는 반점 수가 음성 대조군(PBS 투여군) 및 모 바이러스 투여군에 비해 증가한 것을 확인할 수 있었다.
6-3. 종양 침윤 림프구 확인
마우스 췌장암 세포주 Pan02 종양이 이식된 C57BL/6 마우스를 희생하여 얻은 종양 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 조직처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매된 블록으로 제작하였다. 파라핀 블록을 3 μm 두께로 박절하여 New Silane III 코팅 슬라이드에 부착하였다. 이렇게 얻은 슬라이드에 T세포 마커 (CD3, CD4, CD8) 항체를 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 슬라이드를 탈파라핀, 항원 복구를 거쳐 각각 적절한 농도로 희석된 1차 항체로 반응시켰고, 1차 항체 숙주 동물에 맞는 2차 항체까지 반응시킨 후 DAB로 발색시켰다. 종양 내 침윤된 T세포는 세포막에 갈색의 염색상으로 염색되었다. Motic Easy Scan 슬라이드 스캐너를 이용하여 염색된 슬라이드의 400배 확대된 스캔 이미지를 얻었다. QuPath-0.3.2 프로그램을 이용하여 종양의 면적과 종양 내 침윤된 T세포의 개수를 분석하였고, 단위 (종양) 면적 당 침윤된 T세포의 수를 계산하였다.
그 결과, 도 10a 내지 도 10c에 나타내 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군에서 적출한 종양에 세포독성 및 도움 T 세포가 음성 대조군 및 모 바이러스 투여군에 비교하여 유의하게 많이 침윤된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 바이러스-처리군에서 발생한 면역 증강은 높게 활성화된 T 세포, 특히, CD4 및 CD8을 발현하는 T 세포에 의한 것으로 예상되었으며, 이러한 면역 증강은 IFN-γ 활성과 IL-12 활성 증가에 의한 상승적인 효과(synergistic effect)로 판단되었다.
실시예 7. 마우스 흑색종 모델에서 in vivo 항-종양 효과 확인
7-1. 항-종양 효과 확인
마우스 악성 흑색종 세포주 B16F10을 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) RPMI-1640 배지에 정치배양하며 유지하였다. 세포를 수확하여 계수한 후 5×105개의 B16F10 세포와 Matrigel 50 μL을 혼합하여 제모한 6주령 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. 종양이 형성되면 장축과 단축의 크기를 caliper로 측정하며 관찰하였고, 종양의 부피는 a2b/2 (a: 단축의 길이, b: 장축의 길이) 식을 이용하여 계산하였다. 평균 종양의 크기가 100 mm3에 도달하면 마우스를 무작위로 3그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹의 마우스에 PBS (음성 대조군), 1×108 TCID50의 모 바이러스, 및 1×108 TCID50의 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 50 μL씩 단회 종양 내 투여하였다. 종양의 크기 및 동물의 체중은 2-3일 간격으로 측정하였고, 바이러스를 투여한 날(0일)을 기준으로 9일째 동물을 희생하여 종양을 적출하였다.
모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 마우스 흑색종 모델에 투여한 후 동물의 체중을 측정한 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 유의한 체중 변화를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 체중에 대한 비장의 상대적인 무게를 계산한 결과, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리군이 음성 대조군 (PBS 투여군) 및 모 바이러스 투여군에 비해 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리로 면역 증강(immune boosting)이 유발된 것을 의미한다.
모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 후 0일부터 9일까지 종양 부피를 측정한 결과 도 11c에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군과 비교하여 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리군에서 현저한 종양 억제를 확인할 수 있었다.
부검 시 모든 동물의 종양 조직은 오른쪽 옆구리에서 뚜렷하게 분리되었다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, 분리한 종양의 무게를 측정하였을 때 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군에서 뚜렷한 무게 감소를 확인할 수 있었고, 도 11e에 나타낸 바와 같이, 육안으로도 종양의 크기가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
7-2. T세포 활성도 확인
마우스 악성 흑색종 세포주 B16F10 종양이 이식된 C57BL/6 마우스를 희생한 후 비장 조직을 얻었다. 주변의 지방을 제거한 비장 조직을 갈아 단일 세포로 분리한 후 세척 및 계수하여 각 동물별 비장세포를 확보하였다. 마우스 IFN-γ ELISpot 96-웰 플레이트에 각 동물별 비장세포 5×105개씩 분주하고 1×105개의 B16F10를 자극원(stimuli)으로 추가하였다. 시험은 각 동물별로 최소 3개의 웰을 이용하여 수행하였다. 비장세포와 자극원을 37℃에서 18시간동안 배양한 후 세척 및 2차 항체를 처리하여 비장세포에서 분비된 IFN-γ에 의해 형성되는 spot을 발색시켰다. AID EliSpot Reader를 이용하여 염색된 플레이트에서 Spot의 개수를 계수하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 군에서 활성화된 T 세포에서 분비하는 IFN-γ 양과 비례하는 반점 수가 음성 대조군(PBS 투여군) 및 모 바이러스 투여군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
7-3. 종양 내 침윤된 세포독성 T세포 확인
각 그룹의 종양 및 비장 조직을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 조직을 다듬고, Shandon Excelsior ES tissue processor (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 탈수하고, 파라핀으로 침투시키고, EG1150H paraffin-embedding station (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 파라핀 블록에 세로로 포매하였다. 파라핀 블록을 3 μm로 박절하여 염색에 사용하였다.
조직 절편을 탈파라핀화한 후 Tris/EDTA (pH9) 용액을 이용하여 항원 복구를 수행하였다. 슬라이드를 수분 상자(moisture chamber)에 배치한 후 5% normal goat serum이 포함된 0.4% Triton-X PBS (PBST)로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 슬라이드에 마우스 항 CD8 항체 (ab217344, Abcam, Cambridge)를 1% normal goat serum 포함 PBST에 1:100으로 희석하여 처리하였다. 각 단계마다 PBST로 3회씩 세척하였다. 2차 항체로 goat anti-rabbit IgG (H&L)-Alexa Fluor 488을 PBST에 1:1000으로 희석하여 처리하였고 1시간동안 실온에 방치하였다. DAPI를 이용한 핵 대조염색을 5분간 처리한 후 수성 봉입제로 슬라이드를 봉입하였다. 염색한 슬라이드는 형광현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰 및 촬영하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 군에서 적출한 종양에 침윤된 세포독성 T 세포가 막 패턴(membranous pattern)의 녹색 형광을 띄며 염색된 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조군 및 모 바이러스 투여군에는 양성으로 염색된 세포독성 T 세포가 매우 드물게 관찰되었다.
실시예 8. 햄스터 흑색종 모델에서 in vivo 항-종양 효과 확인
8-1. 항-종양 효과 확인
*햄스터 악성 흑색종 세포주 RPMI 1846을 10% FBS, 1% AA (Antibiotic-Antimycotic) McCoy's 5A 배지에 정치배양하며 유지하였다. 세포를 수확하여 계수한 후 1×107개의 RPMI 1846 세포와 Matrigel 100 μL을 혼합하여 제모한 6주령 시리안 햄스터의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. 종양이 형성되면 장축과 단축의 크기를 caliper로 측정하며 관찰하였고, 종양의 부피는 a2b/2 (a: 단축의 길이, b: 장축의 길이) 식을 이용하여 계산하였다. 평균 종양 크기가 500 mm3이 되었을 때 햄스터를 무작위로 3그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹의 햄스터에 PBS (음성 대조군), 1×108 TCID50의 모 바이러스, 및 1×108 TCID50의 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 100 μL씩 단회 종양 내 투여하였다. 종양의 크기 및 동물의 체중은 2-3일 간격으로 측정하였고, 바이러스를 투여한 날(0일)을 기준으로 10일째 동물을 희생하여 종양을 적출하였다.
모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 햄스터 흑색종 모델에 투여한 후 동물의 체중을 측정한 결과, 도 14a에 나타낸 바와 같이, 유의한 체중 변화를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 14b에 나타낸 바와 같이, 모 바이러스 및 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 후 0일부터 10일까지 종양 부피를 측정한 결과 음성 대조군과 비교하여 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 처리군에서 현저한 종양 억제를 확인할 수 있었다.
부검 시 모든 동물의 종양 조직은 오른쪽 옆구리에서 뚜렷하게 분리되었다. 도 14c에 나타낸 바와 같이, 분리한 종양의 무게를 측정하였을 때 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군에서 뚜렷한 무게 감소를 확인할 수 있었고, 도 14d에 나타낸 바와 같이, 육안으로도 종양의 크기가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
8-2. T세포 활성도 확인
햄스터 악성 흑색종 세포주 RPMI-1846 종양이 이식된 시리안 햄스터를 희생한 후 비장 조직을 얻었다. 주변의 지방을 제거한 비장 조직을 갈아 단일 세포로 분리한 후 세척 및 계수하여 각 동물별 비장세포를 확보하였다. 햄스터 마우스 IFN-γ ELISpot 96-웰 플레이트에 각 동물별 비장세포 2.5×105개씩 분주하고 5×104개의 RPMI-1846를 자극원(stimuli)으로 추가하였다. 시험은 각 동물별로 최소 3개의 웰을 이용하여 수행하였다. 비장세포와 자극원을 37℃에서 18시간동안 배양한 후 세척 및 2차 항체를 처리하여 비장세포에서 분비된 IFN-γ에 의해 형성되는 spot을 발색시켰다. AID EliSpot Reader를 이용하여 염색된 플레이트에서 Spot의 개수를 계수하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스를 투여한 군에서 활성화된 T 세포에서 분비하는 IFN-γ 양과 비례하는 반점 수가 음성 대조군(PBS 투여군) 및 모 바이러스 투여군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
8 -3. 종양 침윤 림프구 확인
햄스터 악성 흑색종 세포주 RPMI 1846 종양이 이식된 Syrian golden 햄스터를 희생하여 얻은 종양 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 조직처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매된 블록으로 제작하였다. 파라핀 블록을 3 μm 두께로 박절하여 New Silane III 코팅 슬라이드에 부착하였다. 이렇게 얻은 슬라이드에 T세포 마커 (CD3, CD4, CD8) 항체를 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 슬라이드를 탈파라핀, 항원 복구를 거쳐 각각 적절한 농도로 희석된 1차 항체로 반응시켰고, 1차 항체 숙주 동물에 맞는 2차 항체까지 반응시킨 후 DAB로 발색시켰다. 종양 내 침윤된 T세포는 세포막에 갈색의 염색상으로 염색되었다. Motic Easy Scan 슬라이드 스캐너를 이용하여 염색된 슬라이드의 400배 확대된 스캔 이미지를 얻었다. QuPath-0.3.2 프로그램을 이용하여 종양의 면적과 종양 내 침윤된 T세포의 개수를 분석하였고, 단위 (종양) 면적 당 침윤된 T세포의 수를 계산하였다. 저산소증 상태 및 바이러스의 항종양 효과로 괴사가 일어난 부분은 분석에서 제외하였다.
그 결과, 도 16a 내지 도 16c에 나타내 바와 같이, B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군에서 적출한 종양에 세포독성 T 세포가 음성 대조군 및 모 바이러스 투여군에 비교하여 상당히 더 침윤된 것을 확인할 수 있었다. CD4 양성 도움 T 세포의 경우 모 바이러스 투여군에서 가장 많이 침윤된 것으로 나타났으나 그 차이의 정도가 B8R(-)mCherry-mIL12 바이러스 투여군과 크지 않았다.
상기 결과로부터, 바이러스-처리군에서 발생한 면역 증강은 높게 활성화된 T 세포, 특히, CD4 및 CD8을 발현하는 T 세포에 의한 것으로 예상되었으며, 이러한 면역 증강은 IFN-γ 활성 및 IL-12 활성에 의한 상승적인 효과(synergistic effect)로 판단되었다. 다만, 햄스터 동종이식 모델에서의 결과는 바이러스에 삽입한 IL-12 유전자 서열이 마우스 유래였기 때문에 마우스와 비교하여 상대적으로 덜한 면역 증강 효과를 보인 것으로 판단되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 인터루킨-12 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로, B8R 유전자를 삭제하고, 삭제된 B8R 자리에 인터루킨-12 유전자를 삽입시킨 재조합 백시니아 바이러스는 IFN-γ 활성 및 IL-12 활성이 증가함으로써 면역에서 상승적인(synergistic) 효과를 나타내어 항-종양 면역성 (Anti-tumor immunity)을 증진시킬 수 있으므로 암의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (19)

  1. 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스로서,
    상기 인터루킨-12 유전자는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스 유전자 B8R은 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 유전자 B8R 영역이 결실된 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), 및 IHD (International Health Division) 백시니아 바이러스 종(strain)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 백시니아 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암은 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 악성 흑색종, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    (a) 종양 내 CD3+ T 세포 수준을 증가시킴;
    (b) 종양 내 CD4+ T 세포 수준을 증가시킴; 및
    (c) 종양 내 CD8+ T 세포 수준을 증가시킴.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 항-종양 면역성 (Anti-tumor immunity)을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항종양 면역성 증진용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 만족하는 것을 특징으로 하는, 항종양 면역성 증진용 조성물:
    (a) 종양 내 CD3+ T 세포 수준을 증가시킴;
    (b) 종양 내 CD4+ T 세포 수준을 증가시킴; 및
    (c) 종양 내 CD8+ T 세포 수준을 증가시킴.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트.
  13. 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및
    상기 전달벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하는, 제1항의 재조합 백시니아 바이러스의 제조방법.
  14. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법.
  15. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스의 암 예방 또는 치료 용도.
  16. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스의 암 치료제 제조를 위한 용도.
  17. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항종양 면역성 증진 방법.
  18. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진 용도.
  19. 제1항의 재조합 백시니아 바이러스의 항종양 면역성 증진제 제조를 위한 용도.
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