[go: up one dir, main page]

RS64662B1 - Humanizovana i afinitetno sazrela antitela na fcrh5 i postupci upotrebe - Google Patents

Humanizovana i afinitetno sazrela antitela na fcrh5 i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS64662B1
RS64662B1 RS20230879A RSP20230879A RS64662B1 RS 64662 B1 RS64662 B1 RS 64662B1 RS 20230879 A RS20230879 A RS 20230879A RS P20230879 A RSP20230879 A RS P20230879A RS 64662 B1 RS64662 B1 RS 64662B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fcrh5
antibody
amino acid
binding
seq
Prior art date
Application number
RS20230879A
Other languages
English (en)
Inventor
Isidro Hotzel
Teemu T Junttila
Ji Li
Justin Scheer
Danielle Dicara
Diego Ellerman
Christoph Spiess
Paul Carter
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS64662B1 publication Critical patent/RS64662B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

OPIS
Trenutna aplikacija sadrži popis sekvenci koji je poslat elektronski u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 14. juna 2016. godine, naziva se 50474-134WO2_Lista sekvenci_6_14_16_ST25 i veličine je 133.004 bajtova.
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja se vezuju za FcRH5 i CD3 i postupke za njihovo korišćenje.
OSNOVA PRONALASKA
Poremećaje ćelijske proliferacije, kao što je karcinom, karakteriše nekontrolisani rast ćelijskih subpopulacija. Oni su vodeći uzrok smrti u razvijenom svetu i drugi vodeći uzrok smrti u zemljama u razvoju, sa preko 14 miliona novih slučajeva karcinoma i preko osam miliona smrtnih slučajeva uzrokovanih karcinomom koji se javljaju svake godine. Nacionalni institut za rak (National Cancer Institute) procenjuje da će više od pola miliona Amerikanaca umreti od raka u 2016. godini, što predstavlja skoro svaku četvrtu smrt u zemlji. Uporedo sa rastom starije populacije rasla je i incidencija karcinoma, pošto je verovatnoća razvoja karcinoma više od dva puta veća nakon sedamdesete godine života. Stoga, lečenje obolelih od karcinoma predstavlja značajan i sve veći teret društva.
Gen sličan Fc receptoru 5 (FcRH5, poznat i kao FcRL5 ili IRTA2) pripada porodici od šest nedavno identifikovanih gena iz superfamilije imunoglobulina (IgSF). Ova porodica gena usko je povezana sa Fc receptorima sa očuvanom genomskom strukturom, sastavom ekstracelularnog domena Ig i signalnim motivima sličnim inhibitornim (ITIM) i aktivacionim (ITAM) imunoreceptorima na bazi tirozina (Davis et al. Eur. J. imunol. 35:674-80, 2005). Opisano je šest članova porodice FcRH/IRTA receptora: FcRH1/IRTA5, FcRH2/IRTA4, FcRH3/IRTA3, FcRH4/IRTA1, FcRH5/IRTA2 i FcRH6 (Polson et al. Int. Immunol.
18(9):1363-1373, 2006. kDNK FcRH kodiraju transmembranske glikoproteine tipa I sa višestrukim ekstracelularnim domenima sličnim Ig-u i citoplazmatskim domenima koji sadrže konsenzusne signalne motive za aktivaciju i/ili inhibiciju na bazi imunoreceptora tirozina. FcRH geni su strukturno povezani, a njihovi proteinski proizvodi međusobno dele 28-60% ekstracelularne identičnosti. Oni takođe dele 15-31% identičnosti sa svojim najbližim rođacima FcR. Postoji visok stepen homologije između različitih FcRH.
Ligandi za FcRH5 nisu poznati, ali je FcRH5 povezan sa povećanom proliferacijom i nishodnom ekspresijom izotipa tokom razvoja B-ćelija kondicioniranih antigenom (Dement-Brown et al. J. Leukoc. Biol. 91:59-67, 2012). Lokus FcRH5 ima tri glavna izooblika iRNK (FcRH5a, FcRH5b i FcRH5c). Glavni izooblici proteina FcRH5 kodirani ovim transkriptima dele zajedničku aminokiselinsku sekvencu do ostatka 560, sa zajedničkim signalnim peptidom i šest ekstracelularnih domena sličnih Ig-u. FcRH5a predstavlja izlučeni glikoprotein od 759 aminokiselina sa osam domena sličnih Ig-u, nakon kojih sledi 13 jedinstvenih, pretežno polarnih aminokiselina na C-terminusu. FcRH5b se razlikuje od FcRH5a na aminokiselinskom ostatku 560 i produžen je za kratki niz od 32 dodatna ostatka, čija hidrofobnost je kompatibilna sa njegovim vezivanjem na plazma membranu preko GPI sidra. FcRH5c je najduži izooblik čija sekvenca odstupa od FcRH5a na aminokiselini 746. FcRH5c kodira transmembranski glikoprotein tipa I od 977 aminokiselina sa devet ekstracelularnih domena tipa Ig koji sadrže osam potencijalnih N-vezanih mesta glikozilacije, transmembranski domen od 23 aminokiseline i citoplazmatski domen od 104 aminokiseline sa tri konsenzusna motiva vezivanja SH2 koji imaju ITIM konsenzus.
FcRH geni su grupisani zajedno usred klasičnih FcR gena (FcγRI, FcγRII, FcyRIII i FcεRI) u regionu 1q21-23 hromozoma 1. Ovaj region sadrži jednu od najčešćih sekundarnih hromozomskih abnormalnosti povezanih sa malignim fenotipom kod hematopoetskih tumora, posebno kod multiplog mijeloma (Hatzivassiliou et al. Immunity.14:277-89, 2001). FcRH5 se eksprimira samo u B-ćelijskoj lozi, počevši već od pre-B-ćelija, ali ne dostiže punu ekspresiju do faze zrelih B-ćelija. Za razliku od većine poznatih drugih površinskih proteina specifičnih za B-ćeliju (npr. CD20, CD19 i CD22), FcRH5 se i dalje eksprimira u plazma ćelijama, dok su drugi markeri specifični za B-ćeliju smanjeni (Polson et al. Int. Immunol.18:1363-73, 2006). Pored toga, iRNK FcRH5 je prekomerno eksprimirana u ćelijskim linijama multiplog mijeloma sa 1q21 abnormalnostima koje detektuju oligonukleotidni nizovi (Inoue Am. J. Pathol.165:71-81, 2004). Obrazac ekspresije ukazuje da bi FcRH5 mogao biti meta za terapije zasnovane na antitelima za lečenje multiplog mijeloma. Multipli mijelom je malignitet plazma ćelija koji karakterišu skeletne lezije, bubrežna insuficijencija, anemija i hiperkalcemija, a u suštini je neizlečiv trenutnim terapijama. Trenutni tretmani lekovima za multipli mijelom uključuju kombinacije inhibitora proteozoma bortezomiba (VELCADE®), imunomodulatora lenalidomida (REVLIMID®) i steroida deksametazona.
Terapija zasnovana na monoklonskim antitelima (mAb) postala je važan modalitet lečenja raka. Terapije i metode detekcije zasnovane na antitelu specifične za FcRH5c mogu biti posebno efikasne jer specifično prepoznaju ciljne ćelije, FcRH5 povezan sa membranom, za razliku od antitela koja prepoznaju rastvorljive kao i membranske izooblike FcRH5. Međutim, samo poslednji domen FcRH5 sličan Ig-u (domen sličan Ig-u 9) predstavlja jedinstveni ekstracelularni region koji diferencira tri glavna izooblika FcRH5 (npr. FcRH5a, FcRH5b i FcRH5c), i postoji značajna homologija između domena sličnih Ig-u unutar FcRH5. Dalje, poslednji domen sličan Ig-u je u velikoj meri očuvan između FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH5. Bilo koja terapija zasnovana na antitelima koja specifično ciljaju FcRH5 treba da ima minimalnu unakrsnu reaktivnost sa drugim FcRH kako bi se izbegli štetni efekti van cilja (npr. FcRH3 se eksprimira na normalnim NK ćelijama).
S obzirom na gore navedeno, u struci postoji nezadovoljena potreba za bezbednim i efikasnim agensima za upotrebu u lečenju proliferativnih poremećaja ćelije (npr. Kancera, npr. FcRH5-pozitivnih kancera, npr. Multiplog mijeloma).
REZIME PRONALASKA
Predmetni pronalazak je prikazan u priloženim skupu zahteva. Primeri, aspekti ili otelotvorenja koja nisu u skladu sa pronalaskom u ovom opisu i slikama su ovde otkriveni samo u svrhu ilustracije.
Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitela (npr. bispecifična antitela, npr. FcRH5 bispecifična antitela zavisna od T ćelija (TDB)), kompozicije i postupke njihovog korišćenja za lečenje proliferativnih poremećaja ćelija (npr. kancera, npr. FcRH5-pozitivnih kancera, npr. multiplog mijeloma).
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo sadrži vezujući
domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5
antitelo sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, anti-FcRH5 antitelo se vezuje za epitop u domenu sličnom Ig-u 9 FcRH5. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži deo aminokiselina 743-850 SEQ ID NO: 114. U nekim otelotvorenjima, vezujući domen se vezuje za humani FcRH5, FcRH5 majmuna cinomolgusa (cino) ili oba.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje humani FcRH5 sa KDod oko 1 nM do oko 20 nM. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje humani FcRH5 sa KDod oko 1 nM do oko 10 nM.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje cino FcRH5 sa KDod oko 1 nM do oko 50 nM.
U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo sadrži mutaciju mesta aglikozilacije. U nekim otelotvorenjima, mutacija na mestu aglikozilacije je supstituciona mutacija. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju anti-FcRH5 antitela. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je na aminokiselinskom ostatku N297, L234, L235, D265 i/ili P329 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A, D265A i P329G. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je mutacija N297G.
U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je IgG antitelo.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je fragment antitela koji se vezuje za FcRH5. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je izabran iz grupe koja sadrži fragmente bis-Fab, Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, i (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je bis-Fab fragment.
U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je antitelo pune dužine.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je monospecifično antitelo.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je multispecifično antitelo. U nekim otelotvorenjima, multispecifično antitelo je bispecifično antitelo. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži drugi vezujući domen koji vezuje klaster diferencijacije 3 (CD3). U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen se vezuje za epitop na CD3 koji sadrži aminokiselinski ostatak Glu6 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop dalje sadrži jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Gln1, Asp2 i Met7 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2 i Glu6 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop ne sadrži aminokiselinski ostatak Glu5 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop ne sadrži aminokiselinske ostatke Gly3 i Glu5 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop se sastoji od aminokiselinskih ostataka Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen je sposoban da se veže za humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid. U nekim otelotvorenjima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3ε polipeptid ili cino CD3ε polipeptid, datim redosledom. U nekim otelotvorenjima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3γ polipeptid, odnosno cino CD3γ polipeptid. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa KDod oko 100 nM ili manje. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa KDod oko 10 pM do oko 100 nM. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa KDod oko 100 pM do oko 50 nM. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa KDod oko 1 nM do oko 10 nM.
U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 133; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 134; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledeće varijabilne regione teškog lanca FR: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125, (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127, i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen dalje sadrži sledeće varijabilne regione lakog lanca FR: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131, i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.
U drugim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 137; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 138; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledeće varijabilne regione teškog lanca FR: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125, (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127, i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen dalje sadrži sledeće varijabilne regione lakog lanca FR: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131, i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.
U drugim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 153; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 154; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledeće varijabilne regione teškog lanca FR: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147, i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen dalje sadrži sledeće varijabilne regione lakog lanca FR: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 149, (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150; (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151, i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154.
U drugim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160.
U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 172; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 173; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži sledeće varijabilne regione teškog lanca FR: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165; (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen dalje sadrži sledeće varijabilne regione lakog lanca FR: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168, (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169; (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173. U nekim otelotvorenjima, drugi vezujući domen sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173.
U drugim otelotvorenjima, VL2domen je vezan za CL domen (CL2), i VH2je vezan za CH1 domen (CH12), pri čemu CL2sadrži naelektrisani region (CR7), i CH12sadrži naelektrisani region (CR8), i pri čemu CR7u CL2formira naelektrisani par sa CR8u CH12. U nekim otelotvorenjima, CR7sadrži bazni aminokiselinski ostatak, i CR8sadrži kiseli ostatak. U nekim otelotvorenjima, CR7sadrži supstitucionu mutaciju V133K (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, CR7se sastoji od supstitucione mutacije V133K. U nekim otelotvorenjima, CR8sadrži supstitucionu mutaciju S183E (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, CR8se sastoji od supstitucione mutacije S183E.
U drugim otelotvorenjima, VL2domen je povezan sa CL domenom (CL2), i VH2je povezan sa CH1 domenom (CH12), pri čemu (a) CL2sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima F116, L135, S174, S176, i/ili T178 (EU numeracija) i (b) CH12sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima A141, F170, S181, S183 i/ili V185 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, CL2sadrži jednu ili više sledećih supstitucionih mutacija: F116A, L135V, S174A, S176F, i/ili T178V. U nekim otelotvorenjima, CL2sadrži sledeće supstitucione mutacije: F116A, L135V, S174A, S176F i T178V. U nekim otelotvorenjima, CH12sadrži jednu ili više sledećih supstitucionih mutacija: A141I, F170S, S181M, S183A, i/ili V185A. U nekim otelotvorenjima, CH12sadrži sledeće supstitucione mutacije: A141I, F170S, S181M, S183A i V185A. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo sadrži jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu, jedan ili više konstantnih domena teškog lanca je odabran od prvog CH2 domena (CH21), prvog CH3 domena (CH31), drugog CH2 domena (CH22), i drugog CH3 domena (CH32). U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca uparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, CH31i CH32sadrže izbočinu (P1) ili šupljinu (C1), i pri čemu, P1ili C1u CH31može da se pozicionira u C1, odnosno P1, u CH32. U nekim otelotvorenjima, CH31i CH32se sreću na međupovršini između P1i C1. U nekim otelotvorenjima, CH21i CH22sadrže (P2) ili šupljinu (C2), i pri čemu, P2ili C2u CH21može da se pozicionira u C2, odnosno P2u CH22. U nekim otelotvorenjima, CH21i CH22se
1
sreću na međupovršini između P2i C2.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži anti-FcRH5 antitelo koje se vezuje za FcRH5 i CD3, pri čemu anti-FcRH5 antitelo sadrži: (a) krak anti-FcRH5 koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105, pri čemu krak anti-FcRH5 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38E i V133K i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39K, S183E i N297G, i (b) krak anti-CD3 koja sadrži drugi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134, pri čemu krak anti-CD3 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38K i V133E i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39E, S183K i N297G (EU numeracija).
U drugom aspektu, pronalazak sadrži anti-FcRH5 antitelo koje se vezuje za FcRH5 i CD3, pri čemu anti-FcRH5 antitelo sadrži: (a) krak anti-FcRH5 koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105, pri čemu krak anti-FcRH5 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38K i V133E i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39E, S183K i N297G, i (b) krak anti-CD3 koja sadrži drugi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134, pri čemu krak anti-CD3 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38E i V133K i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39K, S183E i N297G (EU numeracija).
U drugom aspektu, pronalazak sadrži anti-FcRH5 antitelo koje se vezuje za FcRH5 i CD3, pri čemu anti-FcRH5 antitelo sadrži: (a) krak anti-FcRH5 koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105, pri čemu krak anti-FcRH5 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38E i V133K i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39K, S183E i N297G, i (b) krak anti-CD3 koja sadrži drugi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134, pri čemu krak anti-CD3 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38K, F116A, L135V, S174A, S176F i T178V i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39E, A141I, F170S, S181M, S183A, V185A i N297G (EU numeracija).
U drugom aspektu, pronalazak sadrži anti-FcRH5 antitelo koje se vezuje za FcRH5 i CD3, pri čemu anti-FcRH5 antitelo sadrži: (a) krak anti-FcRH5 koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105, pri čemu krak anti-FcRH5 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38K i V133E i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39E, S183K i N297G, i (b) krak anti-CD3 koja sadrži drugi vezujući domen koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134, pri čemu krak anti-CD3 sadrži laki lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q38E, F116A, L135V, S174A, S176F i T178V i teški lanac koji sadrži supstitucione mutacije Q39K, A141I, F170S, S181M, S183A, V185A i N297G (EU numeracija).
U nekim otelotvorenjima bilo kog od aspekata pronalaska, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 10 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 10 ml/kg/dan do oko 20 ml/kg/dan kod miša. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 12 ml/kg/dan do oko 16 ml/kg/dan kod miša. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 20 ml/kg/dan do oko 40 ml/kg/dan kod cinomolgusa. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 25 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan kod cinomolgusa. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 30 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan kod cinomolgusa.
U drugom aspektu, pronalazak karakteriše izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu iz prethodnog aspekta.
U drugom aspektu, ćelija domaćin sadrži vektor iz prethodnog aspekta.
U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija sisara. U nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ćelija. U nekim otelotvorenjima, prokariotska ćelija je ćelija E. coli.
U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-FcRH5 antitela iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz prethodnog aspekta u medijumu za uzgajanje. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje rekuperaciju anti-FcRH5 antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za kulturu. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje uzgajanje druge ćelije domaćina koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD3 antitelo koje sadrži vezujući domen koji vezuje CD3. U nekim otelotvorenjima, ćelije domaćina su zajedno uzgajane. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje rekuperaciju bispecifičnih anti-FcRH5 antitela iz ćelija domaćina ili medijuma za kulturu.
U drugom aspektu, pronalazak karakteriše imunokonjugat koji sadrži anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata i citotoksični agens.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži kompoziciju koja sadrži anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od aspekata pronalaska. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi ekscipijens ili razblaživač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljivi ekscipijens je pufer, nosač, stabilizator ili konzervans. U nekim otelotvorenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens.
U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska za upotrebu kao lek.
U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije FcRH5-pozitivnog kancera kod ispitanika kome je to potrebno.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska za upotrebu u poboljšanju imunske funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivan kancer. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je kancer B ćelija. U drugom aspektu, kancer B ćelija je izabran iz grupe koja se sastoji od multiplogi mijeloma (MM), hronične limfoidne leukemije (CLL), limfoma ćelija plašta (MCL), difuznog B krupnoćelijskog limfoma (DLBCL) i folikularnog limfoma (FL). U drugom otelotvorenju, kancer B ćelija je MM.
U drugom aspektu, obezbeđena je upotreba anti-FcRH5 antitela ili kompozicije iz bilo kog od prethodnih aspekata u proizvodnji leka za lečenje ili odlaganje progresije FcRH5-pozitivnog kancera kod ispitanika. U drugom aspektu, obezbeđeni pronalazak ima upotrebu anti-FcRH5 antitela ili kompozicije iz bilo kog od prethodnih aspekata u proizvodnji leka za poboljšanje imunske funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivni kancer. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je kancer B ćelija. U nekim otelotvorenjima, kancer B ćelija je izabran iz grupe koja se sastoji od MM, CLL, MCL, DLBCL i FL. U nekim otelotvorenjima, kancer B ćelija je MM.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži antitelo prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili odlaganja progresije FcRH5-pozitivnog kancera kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku anti-FcRH5 antitela iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska. U drugom aspektu, pronalazak sadrži antitelo prema ovom
1
pronalasku za upotrebu u postupku za poboljšanje imunske funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivan kancer, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku efikasne količine anti-FcRH5 antitela iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je kancer B ćelija. U nekim otelotvorenjima, kancer B ćelija je izabran iz grupe koja se sastoji od MM, CLL, MCL, DLBCL i FL. U nekim otelotvorenjima, kancer B ćelija je MM. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo se vezuje za (a) molekul FcRH5 koji se nalazi na ciljnoj ćeliji i (b) CD3 molekul koji se nalazi na imunološkoj efektorskoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo aktivira imunološku efektorsku ćeliju nakon vezivanja za FcRH5 molekul i CD3 molekul. U nekim otelotvorenjima, aktivirana imunološka efektorska ćelija je sposobna da vrši citotoksično dejstvo i/ili apoptotsko dejstvo na ciljnu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, ciljna ćelija je ćelija plazme. U nekim otelotvorenjima, ćelija plazme je kratkotrajna ćelija plazme. U nekim otelotvorenjima, ćelija plazme je dugovečna ćelija plazme. U nekim otelotvorenjima, ćelija plazme je ćelija mijeloma. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu na ispitaniku anti-FcRH5 antitela u dozi od oko 0,01 mg/kg/ned do oko 50 mg/kg/ned. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu na ispitaniku anti-FcRH5 antitela u dozi od oko 0,1 mg/kg/ned do oko 10 mg/kg/ned. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu na ispitaniku anti-FcRH5 antitela u dozi od oko 1 mg/kg/ned.
U drugim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata primenu na ispitaniku antagonista vezivanja PD-1 ose i/ili dodatnog terapeutskog agensa. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens se primenjuje pre ili posle primene anti-FcRH5 antitela. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens se primenjuje istovremeno sa anti-FcRH5 antitelom. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 ose odabran je iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1, antagonista vezivanja PD-1 i antagonista vezivanja PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105 MEDI4736 (durvalumab) i MSB0010718C (avelumab). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je MPDL3280A (atezolizumab). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 i REGN2810. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje steroid, imunomodulator (IMiD), inhibitor proteozoma (PI), ili njihova kombinacija. U nekim otelotvorenjima, steroid je glukokortikoid. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je deksametazon. U nekim otelotvorenjima, IMiD je lenalidomid. U nekim otelotvorenjima, PI je bortezomib.
U drugim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu anti-FcRH5 antitela, antagonista vezivanja ose PD-1, steroida, IMiD, PI ili njihove kombinacije, iz bilo kog od prethodnih aspekata, intravenski, supkutano, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu anti-FcRH5 antitela, antagonista vezivanja ose PD-1, steroida, IMiD, PI, ili njihove kombinacije, intravenski. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu anti-FcRH5 antitela, antagonista vezivanja ose PD-1, steroida, IMiD, PI, ili njihove kombinacije, supkutano. U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, ispitanik je čovek.
U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju FcRH5 u biološkom uzorku dobijenom od ispitanika, pri čemu postupak obuhvata: (a) kontakt biološkog uzorka sa anti-FcRH5 antitelom iz bilo kog od aspekata pronalaska pod uslovima koji omogućavaju vezivanje anti-FcRH5 antitela za prirodni FcRH5 u biološkom uzorku, i (b) detektovanje da li se formira kompleks između anti-FcRH5 antitela i prirodnog FcRH5 u biološkom uzorku. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je uzorak krvi. U nekim otelotvorenjima ovog aspekta, ispitanik je čovek.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži komplet koji sadrži anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska i uputstvo za upotrebu koje sadrži uputstva za upotrebu anti-FcRH5 antitela za lečenje ili odlaganje progresije FcRH5-pozitivnog kancera kod ispitanika. U drugom aspektu, pronalazak sadrži komplet koji sadrži anti-FcRH5 antitelo iz bilo kog od prethodnih aspekata pronalaska i uputstvo za upotrebu koje sadrži uputstva za upotrebu anti-FcRH5 antitela za poboljšanje imunološke funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivni kancer. U nekim otelotvorenjima ovih aspekata, ispitanik je čovek.
KRATAK OPIS SLIKA SL. 1A je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije racionalnog dizajna (konfiguracija 1) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za konfiguraciju 1, domeni VH1, CL1, VL2i CH12sadrže bazne naelektrisane regione, a domeni VL1,CH11, VH2i CL2sadrže kisele naelektrisane regione.
1
SL. 1B je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije racionalnog dizajna (konfiguracija 2) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za konfiguraciju 2, domeni VH1, CL1, VL2i CH12sadrže kisele naelektrisane regione, a domeni VL1, CH11, VH2i CL2sadrže bazne naelektrisane regione.
SL. 1C je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije dizajna rozete (konfiguracija 1) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za konfiguraciju 1, domeni VH1, CL1i VL2sadrže bazne naelektrisane regione, a domeni VL1, CH11i VH2sadrže kisele naelektrisane regione. Pored toga, domen CH12sadrži šupljinu, a domen CL2sadrži izbočinu. Šupljina i izbočina su prikazani kao crno polje na međupovršini CH12/CL2.
SL. 1D je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije dizajna rozete (konfiguracija 2) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za konfiguraciju 2, domeni VH1, CL1i VL2sadrže kisele naelektrisane regione, a domeni VL1, CH11i VH2sadrže bazne naelektrisane regione. Pored toga, domen CH12sadrži šupljinu, a domen CL2sadrži izbočinu. Šupljina i izbočina su prikazani kao crno polje na međupovršini CH12/CL2.
SL. 1E je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije alternativnog dizajna rozete (alternativna konfiguracija 1) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za alternativnu konfiguraciju 1, domeni VL1, VH2i CL2sadrže kisele naelektrisane regione, a domeni VH1, CH12i VL2sadrže bazne naelektrisane regione. Pored toga, domen CH11sadrži šupljinu, a domen CL1sadrži izbočinu. Šupljina i izbočina su prikazani kao crno polje na međupovršini CH11/CL1.
SL. 1F je šematski dijagram koji prikazuje primer konfiguracije alternativnog dizajna rozete (alternativna konfiguracija 2) FcRH5 TDB koji ima domene VL, VH, CL i CH1, uključujući jedan ili više naelektrisanih regiona. Za alternativnu konfiguraciju 2, domeni VL1, VH2i CL2sadrže bazne naelektrisane regione, a domeni VH1, CH12i VL2sadrže kisele naelektrisane regione. Pored toga, domen CH11sadrži šupljinu, a domen CL1sadrži izbočinu. Šupljina i izbočina su prikazani kao crno polje na međupovršini CH11/CL1.
SL. 2 je poravnanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (VL) odabranih anti-FcRH5 antitela. Promene od 1G7 (pogledajte U.S. pub. br. 2015-0098900) prikazane su u tamnim poljima. Hipervarijabilni regioni (HVR) označeni su linijama iznad i/ili ispod poravnanja. Ove sekvence VL domena su takođe obelodanjene kao SEQ ID NO: 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99 i 101.
SL. 3 je poravnanje sekvenci varijabilnog domena teškog lanca (VH) odabranih anti-
1
FcRH5 antitela. Promene u odnosu na klon 1G7 (pogledajte U.S. pub. br. 2015-0098900) prikazane su u tamnim poljima. Hipervarijabilni regioni (HVR) označeni su linijama iznad i/ili ispod poravnanja. Ove sekvence VH domena su takođe obelodanjene kao SEQ ID NO: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 i 100.
SL. 4 je tabela koja prikazuje uticaj na afinitet vezivanja supstitucija aminokiselina na poziciji 52 naznačenih anti-FcRH5 antitela.
SL. 5A je poravnanje sekvenci varijabilnog domena teškog lanca (VH) hu1G7.v85 i hu1G7.v93. Promene u odnosu na humanu germinativnu sekvencu hlGHV4-59*01 prikazane su u osenčenim poljima. Hipervarijabilni regioni (HVR) označeni su oznakama iznad poravnanja. Ove sekvence VH domena su takođe obelodanjene kao SEQ ID NO: 104 (hu1G7.v85) i 106 (hu1G7.v93).
SL. 5B je poravnanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (VL) hu1G7.v85 i hu1G7.v93. Promene u odnosu na humanu germinativnu sekvencu hIGKV1-16*01 prikazane su u osenčenim poljima. Hipervarijabilni regioni (HVR) označeni su oznakama iznad poravnanja. Ove sekvence VL domena su takođe obelodanjene kao SEQ ID NO: 105 (hu1G7.v85) i 107 (hu1G7.v93).
SL. 6A je poravnanje sekvenci varijabilnog domena teškog lanca (VH) hu1G7.v85.1G7 i konsenzus H4. Promene u odnosu na humanizovani, afinitetno sazreli, i usavršeni klon 1G7 (pogledajte U.S. pub. br. 2015-0098900) prikazane su u osenčenim poljima. Hipervarijabilni regioni (HVR) označeni su oznakama iznad poravnanja. Sekvenca VH domena hu1G7.v85 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 104.
SL. 6B je poravnanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (VL) hu1G7.v85, 1G7, i konsenzusa KI. Promene u odnosu na humanizovani, afinitetno sazreli i usavršeni klon 1G7 prikazane su u osenčenim poljima. Sekvenca VL domena hu1G7.v85 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 105.
SL. 7A prikazuje sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) anti-FcRH5 antitela hu1G7.v93 (SEQ ID NO: 106).
SL. 7B prikazuje sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) anti-FcRH5 antitela hu1G7.v93 (SEQ ID NO: 107).
SL. 8 je grafikon koji prikazuje titar antitela 1G7.v85 i 1G7.v87 antitela.
SL. 9A je prikaz histograma koji upoređuje vezivanje FcRH5/38E4.v1 TDB koji imaju različite krakove anti-FcRH5 (tj. m1G7 („1G7 TDB“), 1G7.v85 („1G7.v85 TDB“) i 1G7.v1.4 („1G7.v1.4 TDB“)) za ćelije koje prekomerno eksprimiraju FcRH3.
SL. 9B je grafikon koji pokazuje da 1G7.v85 TDB ne iscrpljuje ćelije prirodne ubice
1
(NK) u koncentracijama ≤ 20 µg/ml; 1G7.v85 TDB ima srednju EC50 od 25 ng/ml na ćelijama plazme (PC).
SL. 10A je niz grafikona koji upoređuju sposobnost FcRH5 TDB 1G7.v1.4/38E4.v1 („1G7.v1.4 TDB“) da vezuje FcRH3, humani FcRH5 i cino FcRH5.
SL. 10B je niz grafikona koji upoređuju sposobnost 1G7.v85 TDB da vezuje FcRH3, humani FcRH5 i cino FcRH5.
SL. 10C je niz grafikona koji upoređuju sposobnost FcRH5 TDB 1G7/38E4.v1 („1G7 TDB“) da vezuje FcRH3, humani FcRH5 i cino FcRH5.
SL. 10D je niz grafikona koji upoređuju sposobnost kontrolnog antitela da vezuje FcRH3, humani FcRH5 i cino FcRH5.
SL. 11A prikazuje sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) humanizovanog anti-FcRH5 antitela hu7D8.L1H2 dobijenog od zeca. Sekvenca VH domena hu7D8.L1H2 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 108.
SL. 11B prikazuje sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) humanizovanog anti-FcRH5 antitela hu7D8.L1H2 dobijenog od zeca. Sekvenca VL domena hu7D8.L1H2 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 109.
SL. 12A prikazuje sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) anti-FcRH5 antitela 17B1 dobijenog od miša. Sekvence VH domena 17B1 su obelodanjene kao SEQ ID NO: 110.
SL. 12B prikazuje sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) anti-FcRH5 antitela 17B1 dobijenog od miša. Sekvence VL domena 17B1 su obelodanjene kao SEQ ID NO: 111.
SL. 13A prikazuje sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) anti-FcRH5 antitela 15G8 dobijenog od miša. Sekvenca VH domena 15G8 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 112.
SL. 13B prikazuje sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) anti-FcRH5 antitela 15G8 dobijenog od miša. Sekvenca VL domena 15G8 obelodanjena je kao SEQ ID NO: 113.
SL. 14 je niz grafikona koji pokazuju afinitet vezivanja humanizovane varijante anti-FcRH5 antitela 7D8.Rb i h7D8.L1H2 dobijenih od zeca za humani FcRH5 i cino FcRH5.
SL. 15 je niz grafikona koji pokazuju da se FcRH5 TDB 1G7.v85 TDB i hu1G7.v93/38E4.v1 („1G7.v93 TDB“) sa uporedivim afinitetom vezuju za humani FcRH5 kao i za cino FcRH5.
SL. 16A-16B su grafikoni koji prikazuju kinetičku analizu 1G7.v85 TDB koji se vezuje za humani FcRH5 i cino FcRH5 sa konstantom disocijacije (K<D>) od 2,35 nM, odnosno 6,76 nM, izmereno putem BIACORE® u formatu hlgG hvatanja koristeći model vezivanja
1
jednovalentnog afiniteta 1:1.
SL. 17A-17B su grafikoni koji pokazuju povećanu ćelijsku toksičnost indukovanu pomoću FcRH5 ćelija MOLP-2 (tj. humane ćelije multiplog mijeloma koje endogeno eksprimiraju FcRH5) koristeći humanizovane i afinitetno sazrele varijante 1G7 formatirane u bispecifična antitela zavisna od T ćelija (TDB) koja imaju CD3-vezujući krak 38E4.v1 (pogledajte PCT pub. br. WO 2015-095392 A1). Na sl. 17A, procenjeni su 1G7 TDB, hu1G7.v1.1/38E4.v1 („1G7.v1.1 TDB“), hu1G7.v1.2/38E4.v1 („1G7.v1.2 TDB“), hu1G7.v1.3/38E4.v1 („1G7.v1.3 TDB“) i 1G7.v1.4 TDB. Na sl.17B, procenjeni su 1G7.v1.4 TDB, hu1G7.v1.5/38E4.v1 („1G7.v1.5“ TDB), hu1G7.v1.13/38E4.v1 („1G7.v1.13 TDB“), hu1G7.v1.7/38E4.v1 („1G7.v1.7 TDB“) i hu1G7.v1.13.1/38E4.v1 („1G7.v1.13.1“).1G7.v.1.4 TDB poboljšao je ubijanje ciljnih ćelija (EC50) od 5 do 13 puta u odnosu na mišji 1G7 TDB (n = 10).
SL. 18A-18D su grafikoni koji upoređuju sposobnost 1G7.v1.4 TDB i 1G7.v85 TDB da aktiviraju T ćelije (slika 18A), ubijaju ciljne ćelije MOLP-2 (slika 18B), ubijaju ciljne cino ćelije plazme (slika 18C) i ubijaju ciljne cino B ćelije (slika 18D).
SL. 19A je niz histograma koji upoređuju sposobnost 1G7.v85 TDB i hu1G7.v87/38E4.v1 TDB („1G7.v87 TDB“) da se vežu i unakrsno reaguju sa mišjim SVT2 ćelijama koje eksprimiraju humani FcRH5 (panel 1), cino FcRH5 (panel 2) i humani FcRH3 (panel 3).
SL. 19B-19D su grafikoni koji upoređuju sposobnost 1G7.v85 TDB i 1G7.v87 TDB da ubijaju ciljne MOLP-2 ćelije (slika 19B), humane B ćelije (slika 19C) i cino B ćelije (slika 19D).
SL. 20A-20D su grafikoni koji pokazuju smanjenu sposobnost 1G7.v85 TDB da veže FcRH5 nakon podvrgavanja bilo stres testu sa 2,2'-azobis(2-amidopropan)dihidrohloridom (AAPH) (slika 20B) ili stres testu sa svetlošću (slika 20D), u poređenju sa odgovarajućim kontrolim uzorcima koji nisu izlagani stresu (Sl.20A i 20C).
SL. 21A je grafikon koji prikazuje analizu raspodele veličine 1G7.v85 TDB.1G7.v85 TDB izgubio je 0,1% pika monomera nakon dve nedelje stresa u rastvoru his-acetata na pH 5,5.
SL. 21B je grafikon koji prikazuje heterogenost naelektrisanja 1G7.v85 TDB.1G7.v85 TDB izgubio je 7,7% pika monomera nakon dve nedelje stresa u rastvoru his-acetata na pH 5,5 SL. 22A je grafikon koji pokazuje da 1G7.v85 TDB nema primetnu promenu u vidu smanjenog masenog profila mase lakog lanca nakon dve nedelje stresa u rastvoru his-acetata na pH 5,5.
1
SL. 22B je grafikon koji pokazuje da 1G7.v85 TDB nema primetnu promenu u vidu smanjenog masenog profila mase teškog lanca nakon dve nedelje stresa u rastvoru his-acetata na pH 5,5.
SL. 23A je fosfo-SLP76 vestern blot perifernih CD8 ćelija zdravog donora stimulisanih sa 1 µg/ml 1G7/UCHT1.v9 TDB, 10A8/UCHT1.v9 TDB („10A8 TDB“), i anti-gD/UCHT1.v9 TDB („anti-gD TDB“) i ćelija koje eksprimiraju ljudski FcRH5 sa N-terminalnom oznakom gD ekspresije. Blot za ukupni SLP76, što ukazuje na TCR signalizaciju, korišćen je za potvrdu jednakog opterećenja uzorka.
SL. 23B je grafikon koji prikazuje ubijanje ciljnih ćelija FcRH5 sa 1G7/UCHT1.v9 TDB ili anti-gD TDB i CD8<+>T ćelijama.
SL. 23C je šematski dijagram skraćenog konstrukta FcRH5 u kome je gD epitop sada membranski proksimalni.
SL. 23D je grafikon koji prikazuje ubijanje ciljnih ćelija koristeći skraćeni konstrukt FcRH5 sa 1G7 TDB ili anti-gD TDB. Aktivnost proksimalnog 1G7/UCHT1.v9 TDB povećala se za 25 puta (EC50 = 20 pM), a anti-gD TDB je bio u stanju da efikasno posreduje ubijanje ćelija (EC50 = 0,19 nM) kada je uklonjena smetnja izazvana od strane ECD. Skraćeni konstrukt je eksprimiran u 293 ćelijama.
SL. 23E je grafikon koji pokazuje da je ubijanje ciljnih ćelija za pet alternativnih FcRH5 TDB koji prepoznaju membranski proksimalni epitop (isprekidane linije) ekvivalentno ubijanju posredovanom sa 1G7/UCHT1.v9 TDB i znatno bolje od 10A8 TDB.
SL. 24A je histogramsko preklapanje analize protočnom citometrijom matičnih ćelija SVT2, gD-FcRH5 pune dužine i ćelija gD-FcRH5-domena 9.
SL. 24B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija od strane 1G7/UCHT1.v9 TDB, 2H7/ UCHT1.v9 TDB („2H7 TDB“), 3G7/ UCHT1.v9 TDB („3G7 TDB“), 10A8 TDB i anti-gD TDB.
SL. 25A je histogramsko preklapanje šest ćelijskih linija (SVT2-vektor, SVT2-FcRH1, SVT2-FCRH2, SVT2-FcRH3, SVT2-FcRH4 i SVT2-FcRH5), koji pokazuje da se 1G7.v85 TDB vezuje za FcRH5, ali ne i za druge članove porodice.
SL. 25B je histogramsko preklapanje tri ćelijske linije (293 matična, 293-FcRH5 pune dužine i 293-FcRH5-D9-delecija), koji pokazuje da se 1G7.v85 TDB vezuje za membranski proksimalni domen FcRH5.
SL. 25C je histogramsko preklapanje tri ćelijske linije (SVT2-vektor, SVT2-huFcRH5 i SVT2-cino FcRH5), koji pokazuje da se 1G7.v85 TDB vezuje za cino FcRH5 i ljudski FcRH5.
2
SL. 26A-26D daju histogramsko preklapanje tri ćelijske linije (SVT2-vektor, SVT2-huFcRH5 i SVT2-cino FcRH5), koje pokazuje vezivanje 1G7/38E4.v1 TDB („1G7 TDB“) za ćelijsku liniju multiplog mijeloma (MM) i primarne ćelije. Histogramska preklapanja dati su za izotip-PE i 1G7 TDB za ćelije MOLP-2 (slika 26A), humane CD20+ B ćelije (slika 26B), humane CD38+CD138+ ćelije plazme (slika 26C) i CD38+CD138+ MM tumorske ćelije iz aspirata MM koštane srži (slika 26D).
SL. 27A je grafikon koji prikazuje aktivaciju CD8+ ćelija zavisnu od doze nakon stimulacije ciljnim ćelijama (MOLP-2) i 1G7 TDB, detektovanu analizom protočnom citometrijom.
SL. 27B je grafikon koji prikazuje ubijanje od strane 1G7 TDB zavisno od ciljnih ćelija. Insert daje preklapanje protočne citometrije matične Fox-NY ćelijske linije i klonova transficiranih da eksprimiraju nizak ili visok nivo humanog FcRH5. Greške su standardna devijacija triplikata.
SL. 27C-27E su grafikoni koji pokazuju da je 1G7 TDB indukovao proliferacioni odgovor CD8 (5 dana), što je otkriveno merenjem razblaženja intenziteta fluorescencije CSFE pomoću protočne citometrije. Samo ljudske CD8+ ćelije obeležene sa CFSE (slika 27C), kokultura sa MOLP-2 (slika 27D), ili kokultura sa MOLP-2 i 1000 ng/ml 1G7.V85 TDB (slika 27E).
SL. 27F je grafikon koji prikazuje ubijanje ćelija zavisno od cilja sa FcRH5 TDB koji sadrže različite anti-CD3 krake (npr. UCHT1.v9, 38E4.v1 i 40G5c) (pogledajte PCT pub. br. WO 2015/095392 A1).
Anti-CD3 kraci 38E4.v1 (jednovalentni KD0,5 nM, BIACORE®), UCHT1.v9 (jednovalentni KD= 2,5 nM, BIACORE® i Skačard) i 40G5c (jednovalentni KD= 51 nM, BIACORE®) bili su upareni sa anti-FcRH5 krakom m1G7 (KD= 11 nm, BIACORE®) i testirani na vezivanje za prečišćene humane CD8+ ćelije.
SL. 27G je grafikon koji prikazuje ubijanje ćelija zavisno od cilja sa 1G7 TDB i 1G7/38E4.v1 bis-Fab („1G7 bis-Fab“).
SL. 28A je grafikon koji prikazuje ekspresiju FcRH5 u primarnim ćelijama tumora multiplog mijeloma, zdravim donorskim perifernim B ćelijama i plazma ćelijama koštane srži. Ekspresija FcRH5 je analizirana protočnom citometrijom i normalizovana na ekspresiju u MOLP-2 unutrašnjoj i test kontroli. Relativni nivo FcRH5 izračunat je na sledeći način: (geometrijska sredina FcRH5 „X“ /geometrijska sredina kontrole izotipa „X“)/(geometrijska sredina FcRH5 MOLP-2/geometrijska sredina kontrole izotipa MOLP-2).
SL. 28B je grafikon koji prikazuje citotoksičnu aktivnost 1G7.v85 TDB na humanim plazma ćelijama. Mononuklearne ćelije humane koštane srži (BMMC) uzgajane su sa 1G7.v85 TDB, a broj ćelija živih CD38+CD138+ analiziran je protočnom citometrijom.
SL. 28C je grafikon koji prikazuje citotoksičnu aktivnost 1G7.v85 TDB na različitim ćelijama primarnog mijeloma dobijenim od pacijenata. BMMC humanog mijeloma su uzgajane zajedno sa CD8+ T ćelijama izolovanim od zdravog donora i 1G7.v85 TBD.
SL. 28D je grafikon koji pokazuje da je veoma niska ekspresija FcRH5 u ciljnim ćelijama dovoljna za potentnu aktivnost ubijanja. Broj kopija FcRH5 po ćeliji određen je Skačardovim testom.
SL. 28E (gore) je grafikon koji prikazuje qRT-PCR analizu nivoa iRNK FcRH5 u biopsijama koštane srži kod pacijenata sa mijelomom visokog rizika sa porastom 1q21. Nivo ekspresije iRNK izračunat je postupkom delta Ct (dCt). Statistička analiza je urađena pomoću Man-Vitnijevog U testa. (Dole) su slike FISH analize biopsijama primarnog multiplog mijeloma koje pokazuju normalni diploid 1q21 (levo) i smešu približno tri do šest kopija 1q21 (desno). Uzorak tumora identifikovan je kao porast 1q21 kada je > 20% ocenjenih tumorskih ćelija imalo tri ili više opija lokusa 1q21.3.
SL. 29A je histogramsko preklapanje izotipa-PE i anti-FcRH5 klona 1G7-PE, koji prikazuje ekspresiju FcRH5 na cino CD20+ B ćelijama.
SL. 29B je histogramsko preklapanje izotipa-PE i anti-FcRH5 klona 1G7-PE, koji prikazuje ekspresiju FcRH5 na cino na CD45-CD20-CD38+PC+ plazma ćelijama.
SL. 29C-29D su grafikoni koji pokazuju uporedivu citotoksičnu aktivnost zavisnu od doze između cino CD8+ T ćelija i humanih CD8+ T ćelija u in vitro testu ubijanja pomoću SVT2-cino-FcRH5 (slika 29C) i MOLP-2 (slika 29D) sa humanim CD8+ T ćelijama ili cino CD8+ T ćelijama.
SL. 29E je grafikon koji prikazuje in vitro aktivnost ubijanja 1G7.v85 TDB na cino CD20+ B ćelijama (n=14).
SL. 29F je grafikon koji prikazuje in vitro aktivnost ubijanja 1G7.v85 TDB na CD45-CD20-CD38+PC+ ćelijama plazme iz cino koštane srži osam različitih donora (n=8).
SL. 30A je grafikon koji pokazuje da splenične ljudske T ćelije izolovane iz slezine humanizovanih NOD/SCID gama miševa (NSG) imaju uporedivu aktivnost sa perifernim humanim T ćelijama zdravih donora.
SL. 30B je grafikon koji pokazuje da 1G7 TDB tretman indukuje regresiju potkožnih MOLP-2 ksenografta tumora kod humanizovanih NSG miševa. Miševi su tretirani jednom intravenskom dozom vehikuluma ili 1G7.v85 TDB sa 0,5 mg/kg. Navedeni su srednja zapremina tumora (crna podebljana linija), pojedinačne zapremine tumora (tanke linije) i srednja vrednost kontrolne grupe (isprekidana linija).
SL. 31A je grafikon koji prikazuje serumsku koncentraciju FcRH5 TDB iscrtanu tokom trajanja studije nakon primene jedne doze 1G7.v85 TDB sa 1 mg/kg, 2 mg/kg ili 4 mg/kg na tri životinje/grupi. Tabela koja prikazuje parametre farmakodinamike prikazana je ispod.
SL. 31B je grafikon koji prikazuje serumsku koncentraciju FcRH5 TDB (1G7.v85 TDB i 1G7.v87/38E4.v1 TDB („1G7.v87 TDB“)) iscrtanu tokom trajanja studije nakon primene jedne doze anti-gD TDB sa 3 mg/kg ili FcRH5 TDB sa 0,3 mg/kg ili 3 mg/kg na tri životinje/grupi. Tabela koja prikazuje parametre farmakodinamike prikazana je ispod.
SL. 31C-31D su grafikoni koji prikazuju tranzijentnu aktivaciju T ćelija indukovanu sa 1G7.v85 TDB u perifernoj krvi cinomolgusa nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma ili 1G7.v85 TDB (1 mg/kg, 2 mg/kg ili 4 mg/kg) na tri životinje/grupi.
SL. 31E-31H su grafikoni koji prikazuju apsolutni broj CD20+ B ćelija u perifernoj krvi (slika 31E), slezini (slika 31F), mandibularnom limfnom čvoru (slika 31G) i koštanoj srži (slika 31H) kod cinomolgusa nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma ili 1G7.v85 TDB (1 mg/kg, 2 mg/kg ili 4 mg/kg) na tri životinje/grupi. Sl.31F-31H su iscrtane sa srednjom vrednošću grupe i standardnom greškom srednje vrednosti (SEM).
SL. 31I je grafikon koji pokazuje da 1G7.v85 TDB iscrpljuje ćelije plazme koštane srži kod cinomolgusa, pri čemu je postavljena SEM izmerena za grupu.
SL. 31J je grafikon koji prikazuje promenu odgovora nivoa cino IgG na lečenje, izračunatu korišćenjem formule {(nivo IgG pre doze) - (nivo IgG na kraju studije)}/ (nivo IgG pre doze) X 100. Razlika između perioda pre doze i nakon tretmana analizira se nesparenim ttestom. Podaci su iscrtani sa srednjom vrednošću grupe i standardnom greškom srednje vrednosti (SEM).
SL. 32A-32B su grafikoni koji prikazuju apsolutni broj CD4+ T ćelija u perifernoj krvi (slika 32A) i CD8+ T ćelija (slika 32B) kod četiri grupe životinja nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma, 1G7.v85 TDB sa 1 mg/kg, 1G7.v85 TDB sa 2 mg/kg ili 1G7.v85 TDB sa 4 mg/kg.
SL. 32C je grafikon koji pokazuje smanjenje apsolutnog broja CD20+ B ćelija u mezenteričnim limfnim čvorovima nakon tretmana sa 1G7.v85 TDB. Grafikon je postavljen za pojedinačne životinje i srednju vrednost grupe sa SEM.
SL. 32D je grafikon koji prikazuje zauzetost FcRH5 nakon jedne intravenske primene 1G7.v85 TDB sa 1 mg/kg, 2 mg/kg ili 4 mg/kg.
SL. 33A-33F su grafikoni koji pokazuju promenu koncentracije citokina IL-6 (slika 33A), IL-2 (slika 33B), IFN-γ (slika 33C), IL-1Rα (slika 33D), IL-5 (slika 33E) i MCP-1 (slika
2
33F) kod četiri grupe životinja nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma, 1G7.v85 TDB sa 1 mg/kg, 1G7.v85 TDB sa 2 mg/kg, i 1G7.v85 TDB sa 4 mg/kg.
SL. 34 je niz dijagrama koji pokazuju da 1G7.v85 TDB tretman indukuje ekspresiju PD1 u humanim T ćelijama. CD8+T ćelije su 48 sati stimulisane ciljnim ćelijama 1G7.v85 TDB i MOLP-2, a zatim su analizirane protočnom citometrijom.
SL. 35A je grafikon koji prikazuje procenat PD1+ u CD8+T ćelijama u cinomolgusa nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma, 1 mg/kg, 2 mg/kg i 4 mg/kg 1G7.v85 TDB.
1G7.v85 TDB tretman dovodi do indukcije PD1 u T ćelijama cinomolgusa in vivo.
SL. 35B je grafikon koji prikazuje procenat PD1+ u CD4+T ćelijama u cinomolgusu nakon intravenske primene jedne doze vehikuluma, 1 mg/kg, 2 mg/kg i 4 mg/kg 1G7.v85 TDB.
SL. 36A-36D su dijagrami koje pokazuju ekspresiju PD-1 u CD4+T ćelijama iz krvi (slika 36A), CD8+T ćelijama iz slezine (slika 36B), CD8+T ćelijama iz limfnog čvora (slika 36C) i CD8+T ćelijama iz koštane srži (slika 36D), kako je analizirano putem FACS sedam dana nakon doziranja 1G7.v85 TDB ili vehikuluma.
SL. 37A-37B su grafikoni koji pokazuju sposobnost 1G7.v85 TDB da preusmeri aktivnost unapred stimulisanih CD8+ T ćelija da ubiju HEK-293T ćelije koje eksprimiraju FcRH5 i PD-1 („293-FcRH5-PD-L1 ćelije“) u prisustvu ili odsustvu anti-PD-L1 ili anti-PD-1 antitela. Kriva na Sl. 37A je iscrtana sa srednjom vrednošću i standardnom greškom (SD) triplikata.
SL. 38A je grafikon koji prikazuje ubijanje ciljnih ćelija SVT2-FcRH5 putem 1G7.v85 TDB u prisustvu i odsustvu deksametazona (Dex).
SL. 38B je serija grafikona koji prikazuju oslobađanje citokina (tj. IL-2, IL-6, TNF-α, i IFN-γ) nakon tretmana sa 1G7.v85 TDB u prisustvu i odsustvu 1 µM deks.
SL. 39 je šematski crtež koji prikazuje proizvodnju bis-FAB-a iz humanog IgG1. SL. 40A je grafikon koji prikazuje vezivanje FcRH5 pomoću bis-Fab A-D i F(ab')2A kako je određeno ELISA testom.
SL. 40B je grafikon koji prikazuje vezivanje CD3 pomoću bis-Fab A-D i F(ab')2A kako je određeno ELISA testom.
SL. 41 je grafikon koji prikazuje količinu ciljno posredovane aktivacije T ćelije pomoću bis-Fab A-D i F(ab')2A.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. DEFINICIJE
Termin „oko“ koji se ovde koristi se odnosi na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko” za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar.
„Humani akceptorski okvir“ je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih zamena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa.
„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (KD). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin „afinitetno zrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termin „anti-FcRH5 antitelo“ ili „antitelo koje se vezuje za FcRH5“ odnosi se na antitelo koje je sposobno za vezivanje FcRH5 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u cilju FcRH5. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-FcRH5 antitela za nepovezani protein koji nije FcRH5 je manji od oko 10% od
2
vezivanja antitela za FcRH5, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim aspektima otkrića, antitelo koje se vezuje za FcRH5 može imati konstantu disocijacije (KD) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-FcRH5 antitelo se vezuje za epitop FcRH5 koji je konzerviran između FcRH5 različitih vrsta.
Izraz „anti-CD3 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za CD3” se odnosi na antitelo koje je sposobno da veže CD3 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje CD3. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-CD3 antitela za nepovezani protein koji nije CD3 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za CD3, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za CD3 ima konstantu disocijacije (KD) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-CD3 antitelo se vezuje za epitop CD3 koji je konzerviran između CD3 različitih vrsta.
Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela (npr. bis-Fab), dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na bis-Fab; Fv; Fab; Fab, Fab’-SH; F(ab’)2; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
Pod „vezujućim domenom” se podrazumeva deo jedinjenja ili molekul koji se specifično vezuje za ciljani epitop, antigen, ligand ili receptor. Vezujući domeni uključuju, bez ograničenja, antitela (npr. monoklonska, poliklonska, rekombinantna, humanizovana i himerna antitela), fragmente antitela ili njihove delove (npr. bis-Fab fragmenti, Fab fragmenti, F(ab')2, scFv antitela, SMIP, domeni antitela, dijatela, minitela, scFv-Fc, afitela, nanotela i VH i/ili VL domeni antitela), receptore, ligande, aptamere i druge molekule koji imaju identifikovanog partnera u vezivanju.
Kao što se ovde koristi termin „naelektrisani region“ odnosi se na lokaciju polipeptida (npr. antitela) koji uključuje jednu ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) baznih ili kiselih aminokiselina koje su sposobne da formiraju naelektrisani par sa srodnim naelektrisanim regionom koji ima jednu ili više (npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) baznih ili kiselih
2
aminokiselina, kada naelektrisani region i njegov srodno naelektrisani region imaju suprono ukupno relativno naelektrisanje.
Kao što se ovde koristi, termin „naelektrisani par“ odnosi se na vezu koja se formira između dva naelektrisana regiona suprotnog ukupnog naelektrisanja.
„Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju kancera. Primeri za hemoterapeutske agense uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN<®>); alkil-sulfonate, kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL<®>); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (HYCAMTIN<®>), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR<®>), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite, kao što je hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree, kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao što su endiinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegaIl (pogledati, npr. Nicolaou et al. Angew. Chem Inti. Ed. Engl. 33: 183-186, 1994); CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoproteinske enediin antiobiotske hromofore), aklacinomicine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMYCIN®, morfolinodoksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, doksorubicin HCl liposomsku injekciju (DOXIL®), liposomalni doksorubicin TLC D-99 (MYOCET®), pegilovani liposomalni doksorubicin (CAELYX®) i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine, kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite, kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®),
2
kapecitabin (XELODA®), epotilon i 5-fluoruracil (5-FU); kombretastatin, analoge folne kiseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge, kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge, kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni poput kalusterona, dromostanolona propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; anti-adrenalne lekove, kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za obnavljanje folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon, etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtansinoide, kao što su majtansin i ansamitocini; mitogvazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2’-trihlortrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); tiotepu; taksoid, npr. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), albuminskim-inženjeringom proizvedenu nanočestičnu formulaciju paklitaksela (ABRAXANE™) i docetaksela (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, France); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinska sredstva, kao što su cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN®) i karboplatin; vinke, koji sprečavaju polimerizaciju tubulina pri formiranju mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN®), vinkristin (ONCOVIN®), vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®), i vinorelbin (NAVELBINE®); etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin: ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide, kao što su retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonate, kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®) ili risedronat (ACTONEL®); troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid citozina); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena na putu signalizacije, koji je uključen u proliferaciju aberantnih ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); (npr. erlotinib (Tarceva™)); i VEGF-A koji smanjuje ćelijsku proliferaciju; vakcine, kao što su THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina,
2
LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LURTOTECAN®); rmRH (npr. ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosin, COX-2 inhibitor (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteosoma (npr. PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor, kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; inhibitori EGFR-a, inhibitori tirozin kinaze; inhibitori serin-treonin kinaze, kao što je rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibitori farnesiltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od prethodnih jedinjenja; kao i kombinacije dva ili više prethodnih jedinjenja, kao što su CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristina i prednizolona; i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja sa oksaliplatinom (ELOXATIN™), u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom, i farmaceutski prihvatljivim solima, kiselinama ili derivatima bilo kog od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenih.
Hemoterapeutska sredstva, prema definiciji iz ovog dokumenta, obuhvataju „antihormonske agense” ili „endokrine terapeutike” koji deluju tako što regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu pospešiti rast kancera. Oni mogu biti sami hormoni, uključujući, ali ne ograničavajući se na: antiestrogene i selektivne modulatore receptora estrogena (SERM-ovi), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON.cndot.toremifene; aromatazne inhibitore koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksamestan, formestan, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol; i anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; kao i troksacitabin (analog citozina 1,3-dioksolan nukleozid); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena na putu signalizacije, koji je uključen u proliferaciju aberatnih ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras; ribozime kao što su inhibitor ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME® ribozim) i inhibitor ekspresije HER2; vakcine poput vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; vinorelbin i esperamicine (pogledajte U.S. pat. br. 4,675,187), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenog.
2
Termin „imunomodulatorni lek“ ili „IMid“ odnosi se na klasu lekova koji modifikuju odgovor imunog sistema ili funkcionisanje imunog sistema, kao što je putem stimulacije stvaranja antitela i/ili inhibicije aktivnosti ćelija periferne krvi, i uključuju, ali nisu ograničeni na, talidomid (α-N-ftalimido-glutarimid) i njegove analoge, REVLIMID® (lenalidomid), ACTI-MID™ (pomalidomid), OTEZLA® (apremilast) i njihove farmaceutski prihvatljive soli ili kiseline.
Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
Termin „FcRH5“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni FcRH5 koji je rezultat proizvodnje FcRH5 proteina u ćeliji. Termin uključuje FcRH5 iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi i majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Termin takođe uključuje prirodno postojeće varijante FcRH5, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiselina primera za sekvencu humanog FcRH5 proteina je prikazana u SEQ ID NO: 114. Sekvenca aminokiselina primera za sekvencu FcRH5 proteina cinomolgus majmuna je prikazana u SEQ ID NO: 215.
Izraz „klaster diferencijacije 3” ili „CD3”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni CD3 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno, uključujući, na primer, lance CD3ε, CD3γ, CD3α i CD3β. Izraz obuhvata neobrađeni CD3 „pune dužine” (npr. neobrađeni ili nemodifikovani CD3ε ili CD3γ), kao i svaki oblik CD3 nastao kao rezultat procesa obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata varijante CD3 koje se javljaju u prirodi, npr., splajsovane ili alelne varijante. CD3 uključuje, na primer, humani CD3ε protein (NCBI RefSeq No. NP_000724), koji ima 207 povezanih aminokiselina, i humani CD3γ protein (NCBI RefSeq No. NP_000064), koji ima 182 povezane aminokiseline.
„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Podrazumeva se da otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, obuhvataju „sadrže“, „sastoje se” i „sastoje se u suštini od” otelotvorenja.
Termin "citotoksični agens" kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole.
„Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj.
Izrazi „proliferativni poremećaj ćelije” i „proliferativni poremećaj” odnose se na poremećaje koji su u vezi sa određenim stepenom abnormalne proliferacije ćelija. U jednom otelotvorenju, proliferativni poremećaj ćelija je kancer. U jednom otelotvorenju, poremećaj proliferacije ćelije je tumor.
Izrazi „kancer“ i „kancerogeno” odnose se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom/proliferacijom ćelija. Primeri za kancer uključuju, bez ograničenja, mijelom, karcinom, limfom (npr. Hodžkinov i non-Hodžkinov limfom), blastom, sarkom i leukemiju. U nekim otelotvorenjima, kancer je FcRH5-pozitivni kancer. Konkretniji primeri za takve kancere uključuju multipli mijelom (MM), hroničnu limfoidnu leukemiju (CLL), limfom ćelija plašta (MCL), difuzni B krupnoćelijski limfom (DLBCL), folikularni limfom (FL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML), hroničnu mijelomonocitnu leukemiju, akutnu promijelocitnu leukemiju (APL), hronični mijeloproliferativni poremećaj, trombocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju prekursorskih T ćelija (pre-B-ALL), akutnu limfoblastnu leukemiju prekursorskih T ćelija (pre-T-ALL), bolest mastocita, mastocitnu leukemiju, sarkom mastocita, mijeloidne sarkome, limfoidnu leukemiju i nediferenciranu leukemiju. U nekim otelotvorenjima, kancer je kancer B ćelija. Konkretno, kancer može da uključuje stanja koja uključuju proizvodnju viška antitela, kao što je monoklonska gamopatija, amiloidoza lakog lanca, monoklonska gamopatija neodređenog značaja i usamljeni plazmacitomi, izolovani plazmacitom i ekstramedularni plazmacitom.
Izraz „tumor”, koji se ovde koristi, odnosi se na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izrazi
1
„kancer”, „kancerogeni”, „proliferativni poremećaj ćelija”, „proliferativni poremećaj” i „tumor” međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.
Izraz „efektorske funkcije“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Efikasna količina“ jedinjenja, na primer, anti-FcRH5 antitela iz pronalaska ili njegove kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija), je najmanje minimalna količina potrebna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata, kao što je merljivo poboljšanje ili prevencija određenog poremećaja (npr. poremećaj proliferacije ćelija, na primer, kancer). Efikasna količina iz ovog dokumenta može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, kao i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Efikasna količina je takođe ona pri kojoj su bilo koji toksični ili štetni uticaji lečenja manje važni u odnosu na terapeutski korisna dejstva. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su: eliminisanje ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate, kao što su: smanjenje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života onih koji pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavanje dejstva drugih lekova, kao putem ciljanja, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produžetak preživljavanja. U slučaju kancera ili tumora, efikasna količina leka može redukovati broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) metastaze tumora; do izvesne mere inhibirati rast tumora; i/ili do izvesne mere ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina se može dati u jednoj ili više primena. Za potrebe ovog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predstavlja količinu dovoljnu za ostvarivanje profilaktičkog ili terapeutskog lečenja, bilo posredno ili neposredno. Kao što se podrazumeva u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije se može ili ne mora postići u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Shodno tome, "efikasna količina" se može razmatrati u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agensa, a može se razmotriti i davanje jednog agensa u efikasnoj
2
količini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa, može da se postigne, ili je postignut željeni rezultat.
Izraz „Fc region“ u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termin „FcRH5-pozitivna ćelija“ odnosi se na ćeliju koja eksprimira FcRH5 na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je jedan ili više od FcRH5a, FcRH5b, FcRH5d, UniProt identifikatora Q96RD9-2, i/ili FcRH5d. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcRH5c.
Termin „FcRH5-pozitivan kancer“ odnosi se na kancer koji sadrži ćelije koje eksprimiraju FcRH5 na svojoj površini. Za potrebe utvrđivanja da li ćelija eksprimira FcRH5 na površini, smatra se da je ekspresija iRNK FcRH5 u korelaciji sa ekspresijom FcRH5 na površini ćelije. U nekim otelotvorenjima, ekspresija iRNK FcRH5 se određuje postupkom izabranim od hibridizacije in situ i RT-PCR (uključujući kvantitativni RT-PCR). Alternativno, ekspresija FcRH5 na površini ćelije može se odrediti, na primer, korišćenjem antitela na FcRH5 u postupku kao što je imunohistohemija, FACS, itd. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je jedan ili više od FcRH5a, FcRH5b, FcRH5c, UniProt identifikatora Q96RD9-2, i/ili FcRH5d. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcRH5c.
Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „kompletno antitelo“ u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je definisano u ovom dokumentu.
Termin „glikozilovani oblici FcRH5“ odnosi se na prirodne oblike FcRH5 koji su posttranslaciono modifikovani dodavanjem ostataka ugljovodonika.
„Sredstvo inhibicije rasta“ kada je ovde korišćeno, odnosi se na jedinjenje ili smešu koje inhibira rast ćelija, bilo in vitro ili in vivo. U jednom otelotvorenju, sredstvo za inhibiciju rasta je antitelo koje inhibira rast koje sprečava ili smanjuje proliferaciju ćelije koja eksprimira antigen za koji se antitelo veže. U drugom otelotvorenju, sredstvo za inhibiciju rasta može biti ono koje značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri sredstava za inhibiciju rasta obuhvataju sredstva koja blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su sredstva koja indukuju G1 zastoj i zastoj M-faze. Klasični blokatori M-faze uključuju vinke (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II, kao što su: doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ona sredstva koja zaustavljaju G1, isto tako, prelaze u zastoj S-faze, na primer, DNK alkilujuća sredstva, kao što su: tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dalje informacije, mogu se naći u: Mendelsohn i Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, poglavlje 1, naslovljeno: „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs“ autora Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), npr., str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv kancera koji su dobijeni iz drveta tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), dobijen iz evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču obrazovanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.
Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.
„Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci antitela koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom i Winter. J. Mol. Biol. 227:381,1991; Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581,1991. Takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela su metode opisane u Cole et al.
4
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al. J. Immunol., 147(1):86-95,1991. Takođe pogledajte van Dijk i van de Winkel. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001. Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenskoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji endogeni lokusi su onemogućeni, npr. imunizovani ksenomiševi (videti npr. U.S. Pat. br. 6.075.181 i 6.150.584 u vezi sa tehnologijom XENOMOUSE™). Takođe pogledajte, na primer, Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:3557-3562, 2006 vezano za ljudska antitela koja su generisana tehnologijom hibridoma humane B-ćelije.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa, kao u Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH publikacija 91-3242, Bethesda MD (1991), sveske 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al. supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al. supra.
„Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, se odnosi na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Izraz „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR”) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti”). U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3) (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987);
(b) CDR koji se javljaju na ostacima aminokiselina 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) kontakte antigena koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262: 732-745, 1996); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Osim ako nije drugačije naznačeno, ostaci HVR i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema Kabat et al. supra.
„Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali bez ograničenja, citotoksični agens.
„Ispitanik“ ili „pojedinac“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševi i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
"Izolovano" antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC). Za pregled metoda za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman et al. J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007.
"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo” ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD3 antitelo” ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „monoklonsko antitelo“, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
"Golo antitelo" označava antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
„Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (<Κ>) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.
Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
Termin „antagonist vezivanja PD-1 ose” odnosi se na molekul koji inhibira interakciju partnera u vezivanju PD-1 ose sa jednim ili više partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, uništavanje ciljanih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja PD-1 ose odnosi se na antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za jedan ili više partnera u vezivanju. U specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-1 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je MDX-1106 (nivolumab). U još jednom specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je MK-3475 (pembrolizumab). U sledećem specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je CT-011 (pidilizumab). U još jednom specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224. U još jednom specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je MED1-0680. U još jednom specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je PDR001. U još jednom specifičnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 je REGN2810.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-L1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1, B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere u vezivanju. U jednom posebnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1, B7-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima,antagonist koji vezuje PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U još jednom specifičnom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A (atezolizumab, prodaje se kao TECENTRIQ™ sa WHO Drug Information (međunarodna nevlasnička imena za farmaceutske supstance), Recommended INN: List 74, sveska 29, br.3, 2015 (vidite stranu 387)). U drugom posebnom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105. U drugom posebnom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je MSB0015718C. U još jednom posebnom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-L2” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za jedan ili više partnera u vezivanju. U jednom posebnom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste PD-L2 spadaju anti-PD-L2 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera u vezivanju, kao što je PD-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L2 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L2 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.
Termin „protein“, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni protein koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen protein, „kompletne dužine“, kao i svaki oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji
4
omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
U smislu ovog dokumenta, „odlaganje napredovanja” poremećaja ili bolesti podrazumeva odgađanje, ometanje, usporavanje, nazadovanje, stabilizaciju i/ili prolongiranje razvoja bolesti ili poremećaja (npr. proliferativni poremećaj ćelije, npr. kancer). Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u suštini, obuhvatiti prevenciju, u tom smislu što se kod pojedinca ne razvija bolest. Na primer, kasna faza kancera, kao što je razvoj metastaza, može biti odložena.
Termin „epitop“ se odnosi na određeno mesto na molekulu antigena za koje se antitelo vezuje. U nekim otelotvorenjima, posebno mesto na molekulu antigena za koje se vezuje antitelo određuje se dobijanjem otiska sa hidroksilnim radikalom (npr. FcRH5 vezujući domen). U nekim otelotvorenjima, konkretno mesto na molekulu antigena za koji se antitelo vezuje određeno je kristalografijom.
Pod „smanjiti” ili „inhibirati” podrazumeva se sposobnost da se uzrokuje opšte smanjenje, na primer, od 20% ili više, od 50% ili više, ili od 75%, 85%, 90%, 95% ili više. U određenim otelotvorenjima, smanjiti ili inhibirati može se odnositi na efektorsku funkciju antitela koja je posredovana Fc regionom antitela, pri čemu takve efektorske funkcije posebno uključuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP).
Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd. W.H. Freeman and Co., str.91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Videti, npr. Portolano et al. J. imunol.150:880-887, 1993; Clarkson et al. Nature 352:624-628, 1991.
„Varijanta Fc regiona” sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one u sklopu nativne sekvence Fc regiona u pogledu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, poželjno jedne ili više supstitucija aminokiseline. Poželjno je da varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u poređenju sa Fc regionom prirodne sekvence ili Fc regionom matičnog polipeptida, npr. od oko jedan do deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedan do pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu u prirodnoj sekvenci ili u Fc regionu matičnog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde će poželjno imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, a najpoželjnije najmanje oko 90% homologije sa njom, poželjnije najmanje oko 95% homologije sa njom.
Termin „vektor“, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.
Kako se ovde koristi, „primena“ podrazumeva postupak davanja doze jedinjenja (npr. anti-FcRH5 antitela prema pronalasku ili nukleinske kiseline koja kodira anti-FcRH5 antitelo prema pronalasku) ili kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje anti-FcRH5 antitelo prema pronalasku) ispitaniku. Kompozicije koje se koriste u metodama koje su ovde opisane mogu da se primenjuju, na primer, intramuskularno, intravenski, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intraviginalno, intrarektalno, topikalno, intratumorski, peritonealno, supkutano, subkonjunktivno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topikalno, lokalno, inhalacijom, injekcijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom kupanjem ciljnih ćelija, direktno, kateterom, ispiranjem, u kremama ili u lipidnim kompozicijama. Način primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenja ili kompozicije koja se primenjuje i težine stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči).
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se delom zasniva na anti-FcRH5 antitelima. U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela su multispecifična (npr. bispecifična) i vezuju, pored FcRH5 ili njegovog fragmenta, drugi biološki molekul (npr. antigen ćelijske površine, npr. T ćelijski marker, npr. CD3 (npr. CD3ε i/ili CD3γ)). Antitela iz ovog pronalaska su korisna, na primer, za dijagnostikovanje i/ili lečenje ili odlaganje progresije proliferativnog poremećaja ćelija (npr. kancer, npr. FcRH5-pozitivni karcinom, npr. multipli mijelom) kod ispitanika.
A. Primeri za anti-FcRH5 antitela
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v85.
U nekim slučajevima pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v93.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107.
U određenom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.1. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.2. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.3. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje sadrži vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89.
4
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.4. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.5.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.7. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo koje ima vezujući domen koji uključuje (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.13, ili njemu srodno. U nekim slučajevima, na primer, anti-FcRH5 antitelo može sadržati VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99.
U posebnom slučaju, anti-FcRH5 antitelo može biti 1G7.v1.13.1. U nekim slučajevima, na primer, pronalazak pruža anti-FcRH5 antitelo uključujući (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101.
U određenim otelotvorenjima, ovde obezbeđeno antitelo je monoklonsko, humano, humanizovano ili himerno antitelo. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo je IgG antitelo. Anti-FcRH5 može biti antitelo pune dužine i/ili monospecifično antitelo. U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo se može vezati za epitop u Ig-sličnom domenu 9 FcRH5. Na primer, epitop može da sadrži deo aminokiselina 743-850 SEQ ID NO: 114. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo se vezuje za ljudski FcRH5 ili FcRH5 majmuna cinomolgusa (cino), ili oba. U drugim slučajevima, domen vezivanja se ne vezuje specifično za FcRH1, FcRH2, FcRH3 ili FcRH4.
U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 10 ml/kg/dan do oko 45 ml/kg/dan (npr. oko 1 ml/kg/dan, 5 ml/kg/dan, 10 ml/kg/dan, 11 ml/kg/dan, 12 ml/kg/dan, 13 ml/kg/dan, 14 ml/kg/dan, 15 ml/kg/dan, 16 ml/kg/dan, 17 ml/kg/dan ml/kg/dan, 18 ml/kg/dan, 19 ml/kg/dan, 20 ml/kg/dan, 21 ml/kg/dan, 22 ml/kg/dan, 23 ml/kg/dan, 24 ml/kg/dan, 25 ml/kg/dan, 26 ml/kg/dan, 27 ml/kg/dan, 28 ml/kg/dan, 29 ml/kg/dan, 30 ml/kg/dan, 31 ml/kg/dan, 32 ml/kg/dan, 33 ml/kg/dan, 34 ml/kg/dan, 35 ml/kg/dan, 36 ml/kg/dan, 37 ml/kg/ dan, 38 ml/kg/dan, 39 ml/kg/dan, 40 ml/kg/dan, 41 ml/kg/dan, 42 ml/kg/dan, 43 ml/kg/dan ili 44 ml/kg/dan).
U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 1 ml/kg/dan do oko 5 ml/kg/dan, oko 6 ml/kg/dan do oko 10 ml/kg/dan, oko 11 ml/kg/dan do oko 15 ml/kg/dan, oko 16 ml/kg/dan do oko 20 ml/kg/dan, oko 21 ml/kg/dan do oko 25 ml/kg/dan, oko 26 ml/kg/dan l/kg/dan do oko 30 ml/kg/dan, oko 31 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan, oko 36 ml/kg/dan do oko 40 ml/kg/dan, oko 41 ml/kg/dan do oko 45 ml/kg/dan kod miša. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 10 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan kod miša. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 10 ml/kg/dan do oko 20 ml/kg/dan kod miša. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 12 ml/kg/dan do oko 16 ml/kg/dan kod miša.
U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 1 ml/kg/dan do oko 5 ml/kg/dan, oko 6 ml/kg/dan do oko 10 ml/kg/dan, oko 11 ml/kg/dan do oko 15 ml/kg/dan, oko 16 ml/kg/dan do oko 20 ml/kg/dan, oko 21 ml/kg/dan do oko 25 ml/kg/dan, oko 26 ml/kg/dan do oko 30 ml/kg/dan, oko 31 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan, oko 36 ml/kg/dan do oko 40 ml/kg/dan, oko 41 ml/kg/dan do oko 45 ml/kg/dan kod cinomolgusa. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 20 ml/kg/dan do oko 40 ml/kg/dan kod cinomolgusa. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 25 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan kod cinomolgusa. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo ima klirens nakon intravenske injekcije od oko 30 ml/kg/dan do oko 35 ml/kg/dan kod cinomolgusa.
U jednom otelotvorenju, KDse meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab-ova u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr., Chen. et al. J. Mol. Biol.293:865-881, 1999). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su obložene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim su blokirane pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br.269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta et al. Cancer Res.57:4593-4599,
4
1997). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada su ploče osušene, dodato je 150 µl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT ™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
Prema drugom otelotvorenju, KDse meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE®. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se postiglo oko 10 jedinica odgovora (RU) vezanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, injektovan jje 1 M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) injektovano je u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 µl/ min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunata je pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Pogledajte, na primer, Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999. Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM antitela na antigen (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti
4
antitela uključuju, bez ograničenja, bis-Fabs, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med.9:129-134, 2003. Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds., (Springer-Verlag, New York), str.269-315, 1994; videti takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa koji vezuju receptore i koji imaju produžen poluživot in vivo, vidite u U.S. Patentu br.5,869,046.
Fragmenti antitela u kojima su dva Fab povezana preko bis-maleimida se ovde nazivaju bismaleimido-(tio-fab)2ili bis-Fab.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134, 2003; i Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson et al. Nat. Med.9:129-134, 2003.
Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. uU.S. patentu br. 4,816,567; i Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984. U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U drugom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro et
4
al. Front. Biosci.13:1619-1633, 2008, i dalje su opisani, na primer, u Riechmann et al. Nature 332:323-329, 1988; Queen et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; U.S. patentima br.5,821,337, 7,527,791,6, 982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al. Methods 36:25-34, 2005 (opisuje graftovanje regiona za određivanje specifičnosti (SDR)); Padlan Mol. Immunol.
28:489-498, 1991 (opisuje „obnavljanje površine“); Dall’Acqua et al. Methods 36:43-60, 2005 (opisuje „FR mešanje“); i Osbourn et al. Methods 36:61-68, 2005; i Klimka et al. Br. J. Cancer, 83:252-260, 2000 (opisuje pristup „vođene selekcije“ FR mešanja).
Humani regioni okvira koji mogu da se koriste za humanizaciju obuhvataju, bez ograničenja, regione okvira izabrane metodom "najboljeg slaganja" (videti, npr. Sims et al. J. imunol. 151:2296 1993); regione okvira dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; i Presta et al. J. imunol.151:2623, 1993); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira germinativne linije humanog embriona (pogledajte, npr. Almagro et al. Front. Biosci.13:1619-1633, 2008); i regione okvira dobijene pregledanjem FR biblioteka (pogledajte, npr. Baca et al. J. Biol. Chem.272:10678-10684, 1997 i Rosok et al. J. Biol. Chem.271:22611-22618, 1996).
4. Humana antitela
U određenim aspektima koji su ovde razmotreni samo kao referenca, antitelo koje je ovde obezbeđeno je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74, 2001 i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459, 2008.
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125, 2005. Pogledajte takođe, npr. U.S. Patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br.5,770,429 koji opisuje H<U>M<AB>® tehnologiju; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju, i U.S. publikaciju patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje V<ELOCI>M<OUSE>® tehnologiju). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim
4
konstantnim regionom.
Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001, 1984; Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al. J. Immunol., 147: 86, 1991). Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562, 2006. Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268, 2006 (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe su opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937, 2005 i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91, 2005.
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteka
Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda daju, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su opisane, npr. u McCafferty et al. Nature 348:552-554; Clackson et al. Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1992; Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al. J. Mol. Biol.
340(5):1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472, 2004; i Lee et al. J. imunol. Methods 284(1-2):119-132, 2004.
Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter et al. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994. Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao
4
jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al. EMBO J, 12: 725-734, 1993. Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388, 1992. Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US Patent br. 5,750,373, i US Patent Publication br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360. Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela, uključujući FcRH5 bispecifična antitela zavisna od T ćelija (TDB)
U bilo kojem od gore navedenih aspekata, anti-FcRH5 antitelo koje je ovde predviđeno je multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa FcRH5.
U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za FcRH5, a druga je za CD3 (npr. CD3ε ili CD3γ). Takva bispecifična anti-FcRH5 antitela se takođe nazivaju FcRH5 bispecifična antitela zavisna od T ćelija (TDB) ili FcRH5 TDB. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen se vezuje za epitop na CD3 koji sadrži aminokiselinski ostatak Glu6 CD3. U nekim slučajevima, epitop dalje sadrži jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Gln1, Asp2 i Met7 CD3. U nekim slučajevima, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2 i Glu6 CD3. U nekim slučajevima, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3. U nekim slučajevima, epitop ne sadrži aminokiselinski ostatak Glu5 CD3. U nekim slučajevima, epitop ne sadrži aminokiselinske ostatke Gly3 i Glu5 CD3. U nekim slučajevima, epitop se sastoji od aminokiselinskih ostataka Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3.
U nekim drugim slučajevima, drugi vezujući domen je sposoban da se veže za humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid. U nekim slučajevima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3ε polipeptid,odnosno cino CD3ε polipeptid. U nekim slučajevima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3γ polipeptid,odnosno cino CD3γ polipeptid.
U određenim slučajevima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa konstantom disocijacije (KD) od ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). Na primer, u nekim slučajevima, drugi vezujući domen vezuje humani CD3ε polipeptid sa KDod ≤100 nM (npr. ≤ 90 nM, ≤80 nM, ≤ 70 nM, ≤60 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤10 nM, ≤5 nM, ≤ 1 nM, ≤ 750 pM, ≤500 pM, ≤250 pM, ≤100 pM, ≤50 pM, ≤25 pM, ≤10 pM, ≤5 pM ili ≤ 1 pM) ili manje.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120.
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen uključuje VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 133 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 134. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo uključuje drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 125, 126, 127, odnosno 128. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133. U nekim slučajevima, drugi vezujući
1
domen dalje uključuje najmanje jedan region (npr.1, 2, 3 ili 4) okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 129, 130, 131, odnosno 132. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. Shodno tome, u nekim slučajevima, varijanta poluantitela anti-FcRH5 antitela prema ovom pronalasku može biti uparena sa varijantom poluantitela anti-CD3 antitela 38E4.v1 da bi se formirao FcRH5 TDB (tj. anti-FcRH5/38E4.v1 TDB).
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 122; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen uključuje VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 135 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 136. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo uključuje drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 125, 126, 127, odnosno 128. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen dalje uključuje najmanje jedan region (npr.1, 2, 3 ili 4) okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 129, 130, 131, odnosno 132. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. Shodno tome, u nekim slučajevima, varijanta poluantitela anti-FcRH5 antitela prema ovom pronalasku može biti uparena sa varijantom poluantitela anti-CD3 antitela 38E4.v1 da bi se formirao FcRH5 TDB (tj. anti-FcRH5/38E4.v1 TDB).
2
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen uključuje VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 137 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 138. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo uključuje drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 125, 126, 127, odnosno 128. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen dalje uključuje najmanje jedan region (npr.1, 2, 3 ili 4) okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 129, 130, 131, odnosno 132. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138. Shodno tome, u nekim slučajevima, varijanta poluantitela anti-FcRH5 antitela prema ovom pronalasku može biti uparena sa varijantom poluantitela anti-CD3 antitela 38E4.v11 da bi se formirao FcRH5 TDB (tj. anti-FcRH5/38E4.v11 TDB).
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen uključuje VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 153 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 154. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo uključuje drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 145, 146, 147, odnosno 148. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen dalje uključuje najmanje jedan region (npr.1, 2, 3 ili 4) okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 149, 150, 151, odnosno 152. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154. Shodno tome, u nekim slučajevima, varijanta poluantitela anti-FcRH5 antitela prema ovom pronalasku može biti uparena sa varijantom poluantitela anti-CD3 antitela hu40G5c da bi se formirao FcRH5 TDB (tj. anti-FcRH5/hu40G5c TDB).
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160.
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160. U nekim slučajevima, na primer, drugi vezujući domen uključuje VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
4
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnost sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 172 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% (npr.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa, ili sekvencu, SEQ ID NO: 173. U nekim slučajevima, na primer, anti-FcRH5 antitelo uključuje drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan region (npr. 1, 2, 3 ili 4) okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 164, 165, 166, odnosno 167. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen dalje uključuje najmanje jedan region (npr.
1, 2, 3 ili 4) okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 168, 169, 170, odnosno 171. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173. Shodno tome, u nekim slučajevima, varijanta poluantitela anti-FcRH5 antitela prema ovom pronalasku može biti uparena sa varijantom poluantitela anti-CD3 antitela huUCHT1.v9 da bi se formirao FcRH5 TDB (tj. anti-FcRH5/huUCHT1.v9 TDB).
U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu je VL2domen povezan sa CL domenom (CL2) i VH2je povezan sa CH1 domenom (CH12), pri čemu CL2sadrži naelektrisani region (CR7) i CH12sadrži naelektrisani region (CR8), i pri čemu CR8u CH12formira naelektrisani par sa CR7u CL2. U nekim slučajevima, CR8sadrži bazni aminokiselinski ostatak, a CR7sadrži kiseli aminokiselinski ostatak. U nekim slučajevima, CR8sadrži mutaciju supstitucije S183K (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR8se sastoji od mutacije supstitucije S183K. U nekim slučajevima, CR7sadrži mutaciju supstitucije V133E (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR7se sastoji od mutacije supstitucije V133E.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu je VL2domen povezan sa CL domenom (CL2) i VH2je povezan sa CH1 domenom (CH12), pri čemu CL2sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima F116, L135, S174, S176, i/ili T178 (EU numeracija) i CH12sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima A141, F170, S181, S183 i/ili V185 (EU numeracija). U nekim slučajevima, CL2sadrži jednu ili više sledećih mutacija supstitucije: F116A, L135V, S174A, S176F, i/ili T178V. U nekim slučajevima, CL2sadrži sledeće mutacije supstitucije: F116A, L135V, S174A, S176F i T178V. U nekim slučajevima, CH12sadrži jednu ili više sledećih mutacija supstitucije: A141I, F170S, S181M, S183A, i/ili V185A. U nekim slučajevima, CH12sadrži sledeće mutacije supstitucije: A141I, F170S, S181M, S183A i V185A.
U nekim slučajevima, domen VL1je povezan sa konstantnim domenom (CL) lakog lanca (CL1), i VH1je povezan sa prvim konstantnim domenom (CH1) teškog lanca (CH11), pri čemu CL1sadrži naelektrisani region (CR5) i CH11sadrži naelektrisani region (CR6), i pri čemu CR6u CH11formira naelektrisanio par sa CR5u CL1. U nekim slučajevima, CR6sadrži bazni aminokiselinski ostatak, a CR5sadrži kiseli aminokiselinski ostatak. U nekim slučajevima, CR6sadrži mutaciju supstitucije S183K (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR6se sastoji od mutacije supstitucije S183K. U nekim slučajevima, CR5sadrži mutaciju supstitucije V133E (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR5se sastoji od mutacije supstitucije V133E.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu je VL2domen povezan sa CL domenom (CL2) i VH2je povezan sa CH1 domenom (CH12), pri čemu CL2sadrži naelektrisani region (CR7) i CH12sadrži naelektrisani region (CR8), i pri čemu CR7u CL2formira naelektrisani par sa CR8u CH12. U nekim slučajevima, CR7sadrži bazni aminokiselinski ostatak, i CR8sadrži kiseli ostatak. U nekim slučajevima, CR7sadrži mutaciju supstitucije V133K (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR7se sastoji od mutacije supstitucije V133K. U nekim slučajevima, CR8sadrži mutaciju supstitucije S183E (EU numeracija). U nekim slučajevima, CR8se sastoji od mutacije supstitucije S183E.
U nekim slučajevima, na primer, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo, pri čemu je VL2domen povezan sa CL domenom (CL2) i VH2je povezan sa CH1 domenom (CH12), pri čemu CL2sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima F116, L135, S174, S176, i/ili T178 (EU numeracija) i CH12sadrži jednu ili više mutacija na aminokiselinskim ostacima A141, F170, S181, S183 i/ili V185 (EU numeracija). U nekim slučajevima, CL2sadrži jednu ili više sledećih mutacija supstitucije: F116A, L135V, S174A, S176F, i/ili T178V. U nekim slučajevima, CL2sadrži sledeće mutacije supstitucije: F116A, L135V, S174A, S176F i T178V. U nekim slučajevima, CH12sadrži jednu ili više sledećih mutacija supstitucije: A141I, F170S, S181M, S183A, i/ili V185A. U nekim slučajevima, CH12sadrži sledeće mutacije supstitucije: A141I, F170S, S181M, S183A i V185A. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo sadrži jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu, jedan ili više konstantnih domena teškog lanca je odabran od prvog CH2 domena (CH21), prvog CH3 domena (CH31), drugog CH2 domena (CH22), i drugog CH3 domena (CH32). U nekim slučajevima, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca sparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim slučajevima, CH31i CH32sadrže izbočinu (P1) ili šupljinu (C1), i P1ili C1u CH31može da se pozicionira u C1, odnosno P1, u CH32. U nekim slučajevima, CH31i CH32se sreću na međupovršini između P1i C1. U nekim slučajevima, CH21i CH22sadrže (P2) ili šupljinu (C2), i P2ili C2u CH21može da se pozicionira u C2, odnosno P2, u CH22. U nekim slučajevima, CH21i CH22se sreću na međupovršini između P2i C2.
7. Varijante antitela
U određenim čisto ilustrativnim aspektima, razmatraju se varijante aminokiselinskih sekvenci anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. bispecifična anti-FcRH5 antitela iz pronalaska koja se vezuju za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što su FcRH5 TDB antitela iz pronalaska ili njihove varijante). Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, umetanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, na primer, antigen vezujuće karakteristike.
a. Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U pojedinim čisto ilustrativnim aspektima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, na primer, zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 1. Primeri i poželjne supstitucije aminokiselina
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „žarišnim tačkama“ HVR-a, tj. na ostacima koji su kodirani kodonima koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008), i/ili ostacima koji su u kontaktu sa antigenom, pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je npr. u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim čisto ilustrativnim aspektima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kog od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim čisto ilustrativnim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim čisto ilustrativnim aspektima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisni postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisan je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Prema ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) identifikuje se i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa umetanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b. Varijante glikozilacije
U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela iz pronalaska mogu biti izmenjena da bi se povećao ili smanjio stepen do kojeg je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na anti-FcRH5 antitelu iz pronalaska može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije može promeniti efektorsku funkciju antitela, kao što je anti-FcRH5 antitelo (npr. FcRH5 TDB). U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo (npr. FcRH5 TDB) može sadržati mutaciju mesta aglikozilacije. U nekim otelotvorenjima, mutacija na mestu aglikozilacije je supstituciona mutacija. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju anti-FcRH5 antitela za najmanje 1% ili više (npr. 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% ili više). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je na aminokiselinskom ostatku N297, L234, L235, D265 i/ili P329 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A, D265A i P329G. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je mutacija N297G.
Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32, 1997. Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GIcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GIcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednom otelotvorenju, date su varijante anti-FcRH5 antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne i strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je izmereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004. Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Led13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545, 1986; US patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al. posebno primer 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (pogledajte, npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614, 2004; Kanda, Y. et al. Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688, 2006; i WO2003/085107).
Varijante anti-FcRH5 antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GIcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i sar.); US Patent br.6,602,684 (Umana i sar.); i US 2005/0123546 (Umana i sar.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Varijante domena VH, VL, CH1 i CL
U određenim čisto ilustrativnim aspektima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može se uvesti u varijabilni domen teškog lanca (VH, npr. VH1i/ili VH2), varijabilni domen lakog lanca (VL, npr. VL1i/ili VL2), konstantni domen teškog lanca (CH1, npr. CH11i/ili
1
CH12), i/ili konstantni domen lakog lanca (CL, npr. CL1i/ili CL2) anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska ili njegove varijante). Domeni VH, VL, CH1 i/ili CL mogu imati modifikacije aminokiselina (npr. supstitucije) na jednoj ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) pozicija aminokiselina.
U posebnim čisto ilustrativnim aspektima, supstitucije aminokiselina sadrže kisele i/ili bazne aminokiselinske ostatke. Modifikacije aminokiselina mogu formirati naelektrisane regione unutar domena VH, VL, CH1 i/ili CL (npr. regioni koji sadrže kisele i/ili bazne aminokiselinske ostatke). Naelektrisani regioni unutar domena VH, VL, CH1 i/ili CL mogu interagovati sa drugim naelektrisanim regionima suprotnog ukupnog naelektrisanja da bi formirali naelektrisani par. Na primer, modifikacije aminokiselina mogu posredovati u formiranju naelektrisanog para između naelektrisanih regiona prisutnih unutar VL1i VH1domena FcRH5 kraka TDB. U nekim slučajevima, modifikacije aminokiselina mogu posredovati u formiranju naelektrisanog para između naelektrisanih regiona prisutnih unutar domena CL1i CH11FcRH5 kraka TDB. U nekim slučajevima, modifikacije aminokiselina mogu posredovati u formiranju naelektrisanog para između naelektrisanih regiona prisutnih unutar VL2i VH2domena drugog kraka TDB (npr. CD3 kraka TDB). U nekim slučajevima, modifikacije aminokiselina mogu posredovati u formiranju naelektrisanog para između naelektrisanih regiona prisutnih unutar domena CL2i CH12drugog kraka TDB (npr. CD3 kraka TDB). Primeri konfiguracije FcRH5 TDBs koji sadrže VH, VL, CH1, i/ili CL domene varijante su predstavljeni u Sl.1A-1D.
U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo (npr. bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što je FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska) sadrži jednu ili više asimetričnih modifikacija u CH1, i/ili CL regionima kako bi se olakšalo ispravno uparivanje teški/laki lanac. U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo dalje sadrži jednu ili više modifikacija u Fc regionu kako bi se olakšala heterodimerizacija dva kraka (npr. krak anti-FcRH5 i krak anti-CD3) anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB).
U nekim otelotvorenjima, domen CH11sadrži supstituciju aminokiselina na S183 (EU numeracija), a domen CL1sadrži supstituciju aminokiselina na V133 (EU numeracija). U drugim otelotvorenjima, laki lanac prvog kraka (npr. vezujući krak FcRH5) anti-FcRH5 antitela je kapa lanac. U nekim otelotvorenjima, laki lanac drugog kraka (npr. vezujući krak anti-CD3) anti-FcRH5 antitela je kapa lanac. U određenim otelotvorenjima, laki lanci u oba kraka anti-FcRH5 antitela (npr. vezujući krak FcRH5 i vezujući krak CD3) su kapa lanci.
2
U nekim otelotvorenjima, domen CH11sadrži mutaciju S183E, i domen CL1sadrži mutaciju V133K. U drugim otelotvorenjima, domen CH11sadrži mutaciju S183K, i domen CL1sadrži mutaciju V133E.
U nekim otelotvorenjima, domen CH11sadrži mutaciju S183K, domen CL1sadrži mutaciju V133E, domen CH12sadrži mutaciju S183E, i domen CL2sadrži mutaciju V133K.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo dalje sadrži mutaciju dugmeta (npr. izbočina) u domenu CH31i mutaciju rupice (npr. šupljine) u domenu CH32. U određenim otelotvorenjima, mutacija dugmeta sadrži mutaciju T366W (EU numeracija). U određenim otelotvorenjima, mutacija rupice sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri mutacije T366S, L368A i Y407V (EU numerisanje). U određenim otelotvorenjima, anti-FCrH5 antitelo dalje sadrži mutaciju T366V u prvom teškom lancu i mutacije T366S, L368A i Y407V u drugom teškom lancu.
U nekim otelotvorenjima, domen CH11sadrži mutacije A141I, F170S, S181M, S183A i V185A, domen CL1sadrži mutacije F116A, L135V, S174A, S176F i T178V. U nekim drugim otelotvorenjima, domen CH11sadrži mutacije A141I, F170S, S181M, S183A i V185A; domen CL1sadrži mutacije F116A, L135V, S174A, S176F i T178V; domen CH12sadrži mutaciju S183E; i CL2domen sadrži mutaciju V133K.
d. Varijante Fc regiona
U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može se uvesti u Fc region anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što je TDB antitelo iz pronalaska ili njegove varijante), čime se stvara varijanta Fc regiona (vidi npr., US Pub. br.
2012/025153). U nekim drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo sadrži jednu ili više modifikacija u Fc regionu kako bi se olakšala heterodimerizacija dva kraka (npr. krak anti-FcRH5 i krak anti-CD3) anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB).
Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region lgG1, lgG2, lgG3 ili lgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
U određenim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu anti-FcRH5 antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema vezivanje FcγR (stoga, verovatno nema aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula su opisani u US patentu br.5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986) i Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; 5,821,337 (pogledajte Bruggemann, et al. J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). Alternativno, mogu da se koriste neradioaktivni testovi (pogledajte, na primer, ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CYTOTOX 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, npr. Gazzano-Santoro et al. J. imunol. Methods 202:163, 1996; Cragg, M.S. et al. Blood.101:1045-1052, 2003; i Cragg, M.S. i M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743, 2004). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova S.B. et al. Int’I. Immunol. 18(12):1759-1769, 2006).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056 i 8,219,149). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581 i 8,219,149).
U određenim otelotvorenjima, prolin na položaju 329 humanog Fc regiona divljeg tipa u antitelu je supstituisan glicinom ili argininom ili aminokiselinskim ostatkom dovoljno velikim da uništi prolinski sendvič unutar međupovršine Fc/Fc.gama receptora koja se formira između prolina 329 Fc i ostataka triptofana Trp87 i Trp110 FcgRIII (Sondermann et al. Nature.
406:267-273, 2000). U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu dalju supstituciju aminokiselina. U jednom otelotvorenju, dalja supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S, a u još jednom otelotvorenju,
4
najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A Fc regiona humanog IgG1 ili S228P i L235E Fc regiona humanog IgG4 (vidite, npr. US 2012/0251531), a u drugom otelotvorenju, najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A i P329G Fc regiona humanog IgG1.
Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR (pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields, R.L. et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604, 2001).
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U pojedinim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al. J. imunol.164: 4178-4184, 2000.
Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem na neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer et al. J. imunol.117:587, 1976; Kim et al. J. imunol.24:249, 1994), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Pogledajte takođe Duncan et al. Nature 322:738-40, 1988; U.S. Patent br. 5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.
U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo sadrži mutaciju mesta aglikozilacije. Mutacija mesta aglikozilacije može biti mutacija supstitucije. Mutacija mesta aglikozilacije može smanjiti efektorsku funkciju anti-FcRH5 antitela, u poređenju sa nemutiranom verzijom, za najmanje 1% (npr.2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90%) ili više. U nekim slučajevima, supstituciona mutacija je na aminokiselinskom ostatku N297, L234, L235, D265 i/ili P329 (EU numeracija). Pored toga, supstituciona mutacija može biti izabrana iz grupe koju čine N297G, N297A, L234A, L235A, D265A i P329G. U određenim slučajevima, supstituciona mutacija je mutacija N297G.
e. Varijante dugmeta i rupice
Takođe se mogu proizvesti varijante antitela sa dugmetom i rupicom u kojima modifikacija aminokiselina (npr. supstitucija) jednog ili više (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) aminokiselinskih ostataka stvara izbočinu (dugme) ili šupljinu (rupica). U nekim slučajevima, izbočina koja se nalazi na jednom polipeptidu antitela može se pozicionirati u šupljinu koja se nalazi na drugom polipeptidu antitela, tako da se dva konstitutivna polipeptida antitela mogu sresti na međupovršini između izbočine i šupljine. Dugme se može formirati supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka sa jednim ili više većih aminokiselinskih ostataka. Šupljina se može formirati supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka sa jednim ili više manjih aminokiselinskih ostataka. Izbočina ili šupljina može se uvesti u bilo koji krak anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB (npr. krak anti-FcRH5 ili krak anti-CD3)). Modifikacije dugmeta i rupice (npr. Fc domena) posebno su korisne u povećanju ukupnog prinosa, homogenosti i stabilnosti bispecifičnih antitela (npr. TDB). U nekim slučajevima (npr. kada se par izbočina-šupljina nalazi na međupovršinama LC/HC (npr. VH i VL ili CL i CH1)), modifikacije aminokiselina koje uvode modifikacije dugmeta i rupice mogu smanjiti zamenu lakog lanca. U nekim otelotvorenjima, izbočina se formira uvođenjem mutacije T366W u jedan krak anti-FcRH5 antitela (npr. krak anti-FcRH5 ili krak anti-CD3). U nekim otelotvorenjima, mutacija T366W je u anti-FcRH5 kraku. U nekim otelotvorenjima, mutacija T366W je u anti-CD3 kraku. U nekim otelotvorenjima, šupljina se formira uvođenjem mutacije T366W, L368A, i/ili Y407V u jedan krak anti-FcRH5 antitela (npr. krak anti-FcRH5 ili krak anti-CD3). U nekim otelotvorenjima, mutacija T366W, L368A, i/ili Y407V je u anti-FcRH5 kraku. U nekim otelotvorenjima, mutacija T366W, L368A, i/ili Y407V je u anti-CD3 kraku.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (pogledajte Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)) i inženjering „dugme u rupici“ (pogledajte npr. US patent br. 5,731,168). Inženjering multispecifičnih antitela „dugme u rupici“ može da se koristi za generisanje prvog kraka koji sadrži dugme i drugog kraka koji sadrži rupicu u kojoj se može vezati dugme prve ruke. Na primer, TDB antitela iz pronalaska mogu sadržati dugme koje se nalazi na anti-CD3 kraku i rupicu koja se nalazi na kraku koja cilja tumor. Alternativno, TDB antitela iz pronalaska mogu sadržati dugme koje se nalazi na kraku za ciljanje tumora i rupicu koja se nalazi na anti-CD3 kraku. Multispecifična antitela takođe mogu biti konstruisana korišćenjem tehnologije imunoglobulinskog ukrštanja (takođe poznatog kao razmena domena Fab ili CrossMAB format) (pogledajte, npr. W02009/080253; Schaefer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanjem dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte, npr.
US Patent br. 4,676,980, i Brennan et al. Science, 229: 81 (1985)); pomoću leucinskih zatvarača, kako bi se proizvela bispecifična antitela (pogledajte, npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv(sFv) dimera (pogledajte, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr. u Tutt et al. J. imunol.147: 60 (1991).
f. Varijante antitela konstruisane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U određenim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, na primer, u U.S. Patentu br.7,521,541.
g. Drugi derivati antitela
U određenim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo iz ovog pronalaska (npr. bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što je TDB antitelo iz pronalaska ili njegove varijante) koje je ovde obezbeđeno može se dalje modifikovati tako da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(nvinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom.
Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605, 2005). Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.
B. Rekombinantni postupci i kompozicije
Anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. bispecifična anti-FcRH5 antitela iz pronalaska koja se vezuju za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što su TDB antitela iz pronalaska ili njihove varijante) mogu se proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, na primer, kako je opisano u US patentu br.4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo iz ovog dokumenta. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, na primer, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je prokariotska, npr. ćelija E. coli. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-FcRH5 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina). U drugom otelotvorenju, postupak dalje obuhvata uzgajanje druge ćelije domaćina koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD3 antitelo koje sadrži vezujući domen koji vezuje CD3. U nekim otelotvorenjima, ćelije domaćina su zajedno uzgajane. Dalje otelotvorenje obuhvata rekuperaciju bispecifičnog anti-FcRH5 antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za uzgajane. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 i anti-CD3 antitela se proizvode u istoj ćeliji domaćinu (npr. jednoćelijski pristup). U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 i anti-CD3 antitela se proizvode u odvojenim ćelijama domaćinima (npr. dvoćelijski pristup).
U jednoćelijskom i dvoćelijskom pristupu, jedan ili više plazmida koji kodiraju FcRH5 TDB (npr. FcRH5 poluantitelo i CD3 polu-antitelo) uvedeno je u jednu ili više ćelija domaćina za uzgajanje i ekspresiju TDB. U jednom slučaju, jedan plazmid može da kodira i FcRH5 poluantitelo i CD3 poluantitelo. Alternativno, poluantitela mogu biti kodirana odvojenim plazmidima. U drugom slučaju, teški lanac svakog poluantitela je kodiran na prvom plazmidu, dok je laki lanac svakog poluantitela kodiran na drugom plazmidu. U jednoćelijskom pristupu, FcRH5 TDB se proizvodi u jednom domaćinu. U dvoćelijskom pristupu, FcRH5 TDB se proizvodi ekspresijom poluantitela u odvojenim domaćinima (npr. odvojenim kulturama istih ćelija domaćina, ili odvojenim kulturama različitih ćelija domaćina). U dvoćelijskom pristupu, dva domaćina mogu da se uzgajaju u istoj posudi ili u različitim posudama. Dve kulture domaćina mogu se kombinovati pre lize i prečišćavanja FcRH5 TDB ili se dva poluantitela mogu odvojeno prečistiti.
U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska (npr. bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što je FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska) koje je modifikovano tako da uključuje asimetrične modifikacije (npr. mutacije CH1, CL i/ili Fc domena opisanih gore) proizvodi se korišćenjem jednoćelijskog pristupa, što dovodi do poboljšanog pravilnog uparivanja teških lanaca/lakih lanaca i/ili poboljšanim prinosom anti-FcRH5 antitela u poređenju sa anti-FcRH5 antitelom koje nije modifikovano da obuhvati asimetrične modifikacije.
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, pogledajte, npr. US Patente br.
5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523 (pogledajte, npr. Charlton, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, gde je opisana ekspresija fragmenta antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Pogledajte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, i Li et al. Nat. Biotech.24:210-215, 2006.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju tehnologiju PLANTIBODIES™ za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija sisara su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293-ćelije, kao što je opisano npr., u Graham et al. J. Gen Virol. 36:591977); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje Sertolijeve ćelije (TM4 ćelije kao što su opisane, npr. u Mather Biol. Reprod. 23:243-251 1980); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre Buf pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u: Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982; MRC-5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42161980); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr. Yazaki et al. Methods in Molecular Biology, 248:255-268, 2003.
C. Testovi
Anti-FcRH5 antitela (npr. bispecifična anti-FcRH5 antitela iz pronalaska koja se vezuju za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, kao što su TDB antitela iz pronalaska ili njihove varijante) mogu se identifikovati, pretražitiili okarakterisati na osnovu fizičkih/hemijskih svojstava i/ili bioloških aktivnosti različitim testovima poznatim u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, anti-FcRH5 antitelo prema pronalasku se testira na vezivanje za antigen, na primer, poznatim posupcima kao što su ELISA, vestern blot, itd.
U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa anti-FcRH5 antitelom iz ovog pronalaska u pogledu vezivanja za FcRH5.
U primeru kompetitivnog testa, imobilisani FcRH5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za FcRH5 i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za FcRH5 ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani FcRH5 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za FcRH5, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano FcRH5. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani FcRH5 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za FcRH5. Pogledajte, npr. Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-FcRH5 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, na primer, vezivanje za FcRH5, ili njegov peptidni fragment, bilo in vivo, in vitro ili ex vivo. U slučaju multispecifičnog (npr. bispecifičnog) anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. TDB antitelo koje ima jedan anti-FcRH5 krak i jedan krak koji prepoznaje drugi biološki molekul, npr. CD3), biološka aktivnost takođe može uključivati, na primer, aktivaciju efektorskih ćelija (npr. aktivaciju T ćelija (npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelija)), ekspanziju populacije efektorskih ćelija (tj. povećanje broja T ćelija), smanjenje populacije ciljnih ćelija (tj. smanjenje populacije ćelija koje eksprimiraju drugi biološki molekul na svojim ćelijskim površinama), i/ili ubijanje ciljnih ćelija. Obezbeđuju se antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro. U određenim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska se testira na takvu biološku aktivnost, kao što je detaljno opisano u primerima u nastavku ovog teksta.
U nekim otelotvorenjima, aktivnost anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB) obuhvata sposobnost da podrži ubijanje B ćelija i/ili aktivaciju citotoksičnih T ćelija. U određenim otelotvorenjima, FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska ispitano je na takvo uništavanje B-ćelija i/ili aktiviranje biološke aktivnosti citotoksičnog efekta T-ćelija bilo kojim od postupaka opisanih u ovom dokumentu, posebno u primerima. U nekim otelotvorenjima za bilo koji od testova aktivnosti, PBMC mogu biti izolovane iz pune krvi zdravih donora separacijom sa fikolom. U posebnom primeru, humana krv se može sakupiti u heparinizovanim špricevima, i PBMC izolovati koristeći Leucosep i Ficoll Paque Plus. Ako je potrebno, CD4+ T i CD8+ T ćelije mogu biti odvojene pomoću Miltenyi setova prema uputstvu proizvođača.
Dodatno, ćelije se mogu isprati u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS u koji je dodat GlutaMax, penicilin i streptomicin i ~ 0,2 miliona suspendovanih ćelija je dodato u ploču sa U-dnom sa 96 bunarčića. Ćelije se mogu uzgajati u RPMI1640 uz dodatak 10% FBS na 37°C u vlažnom standardnom inkubatoru za uzgajanje ćelija. Za testove uništavanja BJAB ćelija, 20.000 BJAB ćelija može biti inkubirano sa efektorskim ćelijama, u vidu huPBMC ili prečišćenih T-ćelija, u naznačenim razmerama po testu, u prisustvu različitih koncentracija TDB antitela tokom 24 sata. Za endogene testove uništavanja B-ćelija, 200.000 huPBMC može se inkubirati sa različitim koncentracijama TDB antitela tokom 24 sata.
Nakon kultivacije, ćelije se mogu isprati FACS puferom (0,5% BSA, 0,05% Na azida
1
u PBS). Ćelije se zatim mogu obojiti u FACS puferu, isprati FACS puferom i suspendovati u 100 µI FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci se mogu prikupiti na protočnom citometru FACSCalibur i analizirati pomoću FlowJo. Žive B-ćelije se mogu izvesti kao PI-negativne CD19+ ili PI-negativne CD20+ B-ćelije pomoću FACS, a apsolutni broj ćelija može se dobiti sa FITC zrncima dodatim u reakcionu smešu kao interna kontrola brojanja. Procenat (%) uništavanja ćelija se može izračunati na osnovu kontrola koje nisu tretirane TDB-om. Aktivirane T-ćelije se mogu detektovati površinskom ekspresijom CD69 i CD25 koristeći anti-CD69-FITC i anti-CD25-PE.
D. Imunokonjugati
Pronalazak takođe obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska, na primer anti-FcRH5 multispecifično antitelo, na primer FcRH5 TDB opisan ovde konjugovan sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotopi.
U jednom otelotvorenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na majtanzinoid (pogledajte U.S. Patente br. 5,208,020, 5,416,064 i Evropski Patent EP 0 425 235 B1); auristatin kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte U.S. Patente br. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte U.S. Patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al. Cancer Res.53:3336-3342,1993; i Lode et al. Cancer Res. 58:2925-2928, 1998); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz et al. Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey et al. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al. Bioconj. Chem. 16:717-721,2005; Nagy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King et al. J. Med. Chem.45:4336-4343, 2002; i U.S. patent br. 6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan, kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži anti-FcRH5 antitelo (na primer, anti-FcRH5 multispecifično antitelo, na primer FcRH5 TDB) ovde opisano konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali se ne ograničavajući na lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, egzotoksin A lanca (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin,
2
proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kursin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži anti-FcRH5 antitelo (na primer, anti-FcRH5 multispecifično antitelo, na primer FcRH5 TDB) opisano ovde konjugovano sa radioaktivnim atomom da bi se formirao radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili obeležavanje spinova za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonanca, MR), kao što je jod-123, ponovo jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta et al. Science 238:1098, 1987. Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker sa disulfidom (Chari et al. Cancer Res.52:127-131, 1992; U.S. Patent br. 5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC-i ovde izričito razmatraju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju uključujući, bez ograničenja, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).
E. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. bispecifično anti-FcRH5 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, npr. FcRH5 TDB) pripremaju se mešanjem takvog antitela željenog stepena čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača, pufera, stabilizatora i/ili konzervanasa (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela obuhvataju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno dodatno obezbediti dodatni terapeutski agens (npr. hemoterapeutsko sredstvo, citotoksično sredstvo, sredstvo za inhibitore rasta i/ili antihormonsko sredstvo, poput onih koji su ovde navedeni gore). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane
4
svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).
U nekim slučajevima, kompozicija može da sadrži antagonist vezivanja ose PD-1 i/ili dodatno terapeutsko sredstvo. Na primer, antagonist vezivanja ose PD-1 može biti izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A (atezolizumab), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI473 (durvalumab) i MSB0010718C (avelumab), MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 i BGB-108. Dodatno, kompozicija koja sadrži anti-FcRH5 antitelo iz ovog pronalaska (npr. FcRH5 TDB) može da sadrži steroid, imunomodulator (IMiD), inhibitor proteozoma (PI), ili njihovu kombinaciju.
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, na primer, film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
F. Postupci lečenja i preparati
Bilo koje od anti-FcRH5 antitela iz pronalaska (npr. bispecifična anti-FcRH5 antitela iz pronalaska koja se vezuju za FcRH5 i drugi biološki molekul, npr. CD3, npr. FcRH5 TDB) može se koristiti u terapijskim metodama.
U jednom aspektu, dato je anti-FcRH5 antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancer, npr. FcRH5-pozitivan kancer, npr. multipli mijelom (MM)) i/ili poboljšanju imunološke funkcije kod pojedinca. U pojedinim otelotvorenjima, dato je anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeno je anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima poremećaj ćelijske proliferacije (npr. kancer, npr. FcRH5-pozitivan kancer, npr. MM)) koji obuhvataprimenu na pojedincu efikasne količine anti-FcRH5 antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku.
U daljim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u poboljšanju imunske funkcije kod pojedinca koji ima proliferativni poremećaj ćelija, kao što je FcRH5-pozitivni kancer (npr. MM). U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u postupku poboljšanja imunske funkcije kod pojedinca koji ima proliferativni poremećaj ćelija koji obuhvata primenu na pojedincu efikasnog anti-FcRH5 antitela za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije) sposobnih da vrše citotoksično i/ili apoptičko dejstvo na ciljne ćelije (npr. ćelija koja eksprimira drugi biološki molekul prepoznat od strane anti-FcRH5 antitela iz pronalaska, kao što je FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska) kod pojedinca. Anti-FcRH5 antitelo se može vezati i za molekul FcRH5 koji se nalazi na ciljnoj ćeliji i za CD3 molekul koji se nalazi na imunološkoj efektorskoj ćeliji. Ciljna ćelija može biti ćelija plazme, kao što je dugotrajna ili kratkotrajna ćelija plazme. Pored toga, ciljna ćelija može biti ćelija mijeloma. „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, obezbeđena je upotreba anti-FcRH5 antitela iz pronalaska u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju, lek je namenjen za lečenje ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancera, npr FcRH5-pozitivnog kancera, npr. MM)). U dodatnom otelotvorenju, lek je predviđen za upotrebu u postupku lečenja poremećaja ćelijske proliferacije koji se sastoji od davanja efikasne količine leka pojedincu koji ima poremećaj ćelijske proliferacije. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku.
U daljem otelotvorenju, lek je predviđen za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije) sposobnih da vrše citotoksično i/ili apoptotičko dejstvo na ciljne ćelije (npr. ćelija koja eksprimira drugi biološki molekul koji je prepoznat od strane anti-FcRH5 antitela iz ovog pronalaska, kao što je FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska) kod pojedinca. U daljem otelotvorenju, lek je predviđen za upotrebu u postupku poboljšanja imunološke funkcije kod pojedinca koji imaćelijski proliferativni poremećaj, koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine leka za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširivanje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacijeciljnih ćelija (npr. ćelija koja eksprimira drugi biološki molekul prepoznat od strane anti-FcRH5 antitela iz pronalaska, kao što je FcRH5 TDB antitelo iz pronalaska), i/ili ubijanje ciljnih ćelija (npr. ciljne ćelije tumora). „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, postoji obezbeđen metod za lečenje ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancer). FcRH5-pozitivni karcinom može biti kancer B ćelija. U nekim slučajevima, kancer B-ćelija može biti multipli mijelom (MM), hronična limfoidna leukemija (CLL), limfom ćelija plašta (MCL), difuzni B krupnoćelijski limfom (DLBCL) i/ili folikularni limfom (FL). U određenim slučajevima, kancer B ćelija je MM. U drugim slučajevima, FcRH5-pozitivni kancer je kancer B ćelija. Metoda može obuhvatati primenu na pojedincu koji ima takav ćelijski proliferativni poremećaj (npr. kancer, npr. FcRH5-pozitivan kancer, npr. multipli mijelom (MM)) efikasne količine anti-FcRH5 antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
Antitela iz pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. U određenim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je antagonist vezivanja ose PD-1 kao što je MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI473 (durvalumab) i MSB0010718C (avelumab), MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 i/ili REGN2810. Pored toga, na ispitaniku se takođe može primenjivati steroid, imunomodulator (IMiD), inhibitor proteozoma (PI) ili njihova kombinacija. U jednom otelotvorenju, glukokortikoid je deksametazon. U nekim otelotvorenjima, IMiD je lenalidomid. U nekim otelotvorenjima, PI je bortezomib.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-FcRH5 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.
Antitelo iz ovog pronalaska (i/ili bilo koje dodatno terapeutsko sredstvo) može se primenjivati bilo kojim pogodnim putem, uključujući intravenski, supkutano, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, na primer putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti (npr. proliferativni poremećaj ćelija, kancer, npr. kancer pozitivan na FcRH5, npr. MM)), odgovarajuća doza antitela iz predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, od toga da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija.
Kao opšta pretpostavka, terapeutski efikasna količina anti-FcRH5 antitela primenjena na čoveku biće u opsegu od oko 0,01 do oko 100 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da je u pitanju jedna ili više primena. U nekim otelotvorenjima, korišćeno antitelo se, na primer, primenjuje svakodnevno sa oko 0,01 do oko 0,01 do oko 55 mg/kg, 50 mg/kg, 0,01 do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg oko 0,01 do oko 30 mg/kg, oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg. U jednom otelotvorenju, anti-FcRH5 antitelo prema opisu iz ovog dokumenta, daje se ljudima u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg ili oko 1400 mg 1. dana 21-dnevnog ciklusa. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr., 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo se primenjuje u dozi od oko 0,01 mg/kg/ned do oko 10 mg/kg/ned. U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo se primenjuje u dozi od 0,1 mg/kg/ned do oko 10 mg/kg/ned. U drugim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo se primenjuje u dozi od oko 1 mg/kg/ned.
Takve doze mogu se primenjivati povremeno, na primer. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili na primer. oko šest doza anti-FcRH5 antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
U nekim otelotvorenjima, postupci mogu dalje da sadrže dodatnu terapiju. Dodatna terapija može biti radioterapija, hirurški zahvat, hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, terapija monoklonskim antitelima ili kombinacija prethodno navedenih. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija se sastoji od davanja enzimskog inhibitora malog molekula ili antimetastatskog agensa. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija se sastoji od davanja agensa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agensi namenjeni za smanjivanje pojave i/ili težine neželjenih dejstava lečenja, kao što su agensi protiv mučnine, itd.). U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je radioterapija. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je hirurški zahvat. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je kombinacija radioterapije i hirurškog zahvata. U nekim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, dodatna terapija je gama zračenje. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija može biti odvojeno davanje jednog ili više terapeutskih agenasa, kako je prethodno navedeno.
G. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-FcRH5 antitela iz pronalaska korisno je za detektovanje prisustva FcRH5 u biološkim uzorcima. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo.
U jednom otelotvorenju, dato je anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva prirodnog FcRH5 u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-FcRH5 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-FcRH5 antitela sa prirodnim FcRH5, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-FcRH5 antitela i prirodnog FcRH5. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim slučajevima, biološki uzorak je uzorak krvi. U nekim slučajevima, ispitanik je čovek.
U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena anti-FcRH5 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>l,<3>H, i<131>l, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidazu ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.
H. Proizvodi
U drugom aspektu, pronalazak sadrži proizvod koji sadrži antitelo prema pronalasku, a time i materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu proliferativnog poremećaja ćelija (npr. kancer, npr. FcRH5-pozitivan kancer, npr. multipli mijelom (MM)) kod ispitanika (npr. čovek). Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve. U nekim slučajevima, komplet sadrži uputstvo koje sadrži uputstva za upotrebu antitela za lečenje ili odlaganje progresije FcRH5-pozitivnog kancera (npr. MM) kod ispitanika. U drugim slučajevima, komplet sadrži uputstvo koje sadrži uputstva za upotrebu antitela za poboljšanje imunološke funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivan kancer (npr. MM).
III. PRIMERI
Primer 1. Generisanje anti-FcRH5 antitela
Imunizacije i skrining
BALB/c miševi (Charles River, Hollister, CA) imunizovani su sa 2 μg, 10 μg ili 100 μg/injekciji po mišu. Antigeni su suspendovani u monofosforil lipidu A (MPL)/trehaloza dikorinomikolat (TDM) (Ribi) adjuvansu ili Frojndovom adjuvansu i ubrizgani u jastučić šape, peritoneum ili bazu repa svake imunizovane životinje. Miševi su primili ukupno 9 do 18 doza i 1 do 2 prefuziona bustera samo u PBS-u samo putem jastučića šape, intraperitonealno (i.p.) i/ili putem skočnog zgloba 2 do 4 dana pre fuzije. Kampanja imunizacije A, opisana u US pub. br. 2015/0098900, proizvela je matično anti-FcRH5 antitelo 1G7, koje je ovde optimizovano i dalje okarakterisano.
A. Kampanja imunizacije B
Da bi se proizvela antitela specifična za izooblik za membranski proksimalni Ig-domen FcRH5, miševi su imunizovani proteinom E11 (aminokiseline 745-850 SEQ ID NO: 114) sa N-terminalnom His-ekspresionom oznakom koja je eksprimirana u CHO ćelijama. Pet miševa je imunizovano sa 10 μg His-označenog E11 proteina u Ribi adjuvansu i.p. putem. Miševi su primili 18 doza, nakon čega su usledila dva prefuziona bustera samo u PBS-u i.p. sedam i četiri dana pre fuzije. Nakon 18 doza rekombinantnog proteina E11, serum je analiziran na antitela koja vezuju FcRH5 koristeći FACS i titracijom u ELISA koristeći E11 kao antigen. Značajna reaktivnost otkrivena je na SVT2 ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 kompletne dužine, cino FcRH5 kompletne dužine ili E11 protein, ali ne i vektorom transficirane SVT2 ćelije, što ukazuje na to da su antitela koja vezuju FcRH5 prisutna u serumima svih pet imunizovanih miševa. Nakon 20 doza, limfociti imunizovanih miševa su elektrofuzionisani sa
1
P3X63Ag8U.1.22 ćelijama mijeloma miša.
Klonovi su testirani na vezivanje za rekombinantne humane i cino E11 proteine pomoću ELISA. Osam klonova koji su bili unakrsno reaktivni i na humani i na cino FcRH5 u ELISA testirano je na vezivanje za SVT2 ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 kompletne dužine, cino FcRH5 kompletne dužine ili E11 protein putem FACS. Svih osam klonova vezivalo je SVT2 ćelije koje eksprimiraju humani E11 domen, transmembranski domen i citoplazmatske domene.
Da bi se testiralo vezivanje za ćelije kancera koje endogeno eksprimiraju FcRH5 ili koje su transficirane sa FcRH5, ćelije su podignute pomoću EDTA/PBS, a 1x10<5>ćelija je suspendovano u 100 μl i inkubirano sa primarnim antitelima (1 zapremina ne-IgG kvantifikovanog subklonskog supernatanta, 4 μg/ml IgG kvantifikovanog subklonskog supernatanta ili 2 μg/ul prečišćenih monoklonskih antitela). Ćelije su dva puta isprane FACS puferom (PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA) i inkubirane sa 1:1000 razblaženjem kozjeg anti-mišjeg sekundarnog označenog sa PE ili 1:100 kozjeg anti-mišjeg APC. Ćelije su isprane dva puta FACS puferom i analiza protočnom citometrijom je urađena na uređaju FACSCalibur. Direktno ksenonsko obeležavanje antitela izvršeno je prema protokolu proizvođača (Invitrogen), kada je naznačeno. Međutim, samo tri klona su se vezivala za ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 kompletne dužine i nijedan se nije vezivao za ćelije koje su eksprimirale cino FcRH5 kompletne dužine (tabela 2).
TABELA 2. Vezivanje mAb iz kampanje imunizacije B u FACS za ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani FcRH1, 2, 3, 4 i 5, domen humanog E11 i cinomolgus FcRH5
Vezivanje u FACS za SVT2 ćelije koje eksprimiraju:
Čovek Čovek Čovek Čovek Čovek Humani Cinomolgu FcRH1 FcRH2 FcRH3 FcRH4 FcRH5 E11- s mAb TM-ICD* FcRH5 1E6 - - - - -3D8 - - - - - -8G8 - - - - - -11A11 - - - - - -10D9 - - - - -11H6 - - - - - -
2
13D2 - - - - -14E9 - - - - - -*E11 domen, transmembranski domen i citoplazmatski domeni humanog FcRH5 B. Kampanja C za imunizaciju i karakterizaciju mAb
Za kampanju imunizacije C, N-terminalno His-označeni E11 protein proizveden je u CHO ćelijama. Miševi su imunizovani sa početnom injekcijom od 100 μg E11 proteina u kompletnom Frojndovom adjuvansu u bazu repa. Miševi su primili ukupno 17 doza, nakon čega je usledio jedan perfuzioni buster samo u PBS-u i.p. putem i putem skočnog zgloba dva dana pre fuzije (tabela 3).
TABELA 3. Raspored imunizacije za kampanju imunizacije C
4
Nakon 15 doza rekombinantnog proteina E11, nakon čega su sledile ko-injekcije rekombinantnih humanih i cino E11 proteina, serum je analiziran na FcRH5 vezujuća antitela koristeći FACS i titracijom u ELISA koristeći E11 protein kao antigen. Značajna reaktivnost otkrivena je na SVT2 ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 kompletne dužine, cino FcRH5 kompletne dužine ili humani E11 domen, transmembranski domen i citoplazmatske domene, ali ne i vektorom transficirane SVT2 ćelije, što ukazuje na to da su antitela koja vezuju FcRH5 prisutna u serumima svih pet imunizovanih miševa. Nakon konačnog bustera u PBS-u, limfociti imunizovanih miševa su elektrofuzionisani sa P3X63Ag8U.1.22 ćelijama mijeloma miša.
Klonovi su testirani na vezivanje za rekombinantne humane i cino E11 proteine i vezivanje za SVT2 ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 kompletne dužine; cino FcRH5 kompletne dužine; human FcRH1, FcRH2, FcRH3 ili FcRH4 kompletne dužine; ili humani E11 domen, transmembranski domen i citoplazmatske domene FcRH5 putem FACS. U ELISA je bilo 44 klona pozitivna na humani E11 protein i 32 klona pozitivna na cino E11 protein. Od njih je identifikovano ukupno 16 klonova koji su se vezivali za ćelije koje su eksprimirale humani FcRH5 i ćelije koje su eksprimirale cino FcRH5, ali ne i ćelije koje su eksprimirale FcRH1, FcRH2, FcRH3 ili FcRH4, što ukazuje na specifičnu reaktivnost FcRH5 između vrsta (tabela 4).
TABELA 4. Svojstva vezivanja monoklonskih antitela dobijenih u kampanji imunizacije C
Vezivanje u FACS za SVT2 ćelije koje eksprimiraju:
Humani Huma Humani Human Human Huma Cinomo
FcRH1 ni FcRH3 i i ni glus MOLP-2 KD KD mAb
FcRH FcRH4 FcRH5 E11- FcRH5 FACS humani cinomolg 2 TM- vezivanj E11 us E11
ICD* e domen§ domen§ 15G8 - - - - /- /- 0,5 nM 9,1 nM 24H5 - - - - 3,2 nM 255 nM 16H10 - - - - 4,6 nM 338 nM 10A7 - - - - 4,9 nM 229 nM 3C5 - - - - 45 nM 81 nM 17B1 - - - - 68 nM 27 nM - - - - Nije Nije 23E2 urađeno¶ urađeno¶
- - - - - Nije Nije 9B3 urađeno urađeno - - - - - Nije Nije 23B8 urađeno urađeno - - - - - Nije Nije 23G8 urađeno urađeno - - - - - Nije Nije 24F5 urađeno urađeno - - - - - Nije Nije 24G6 urađeno urađeno - - - - - Nije Nije 24C4 /- /- urađeno urađeno - - - - /- - Nije Nije 3C2 urađeno urađeno - - - - Nije Nije 6H3 /- /- -urađeno urađeno 1D10 - - - Nije Nije Nije urađeno urađeno urađeno - Nije Nije Nije 2B6 urađeno urađeno urađeno - Nije Nije Nije 6A6 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije 1C9 urađeno urađeno urađeno 1H10 - - - - - Nije Nije Nije urađeno urađeno urađeno 2E10 - - - - - Nije Nije Nije urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije 6B5 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije 6H1 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije 7A6 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije A10 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije F9 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije E3 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije G9 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije G4 - urađeno urađeno urađeno - Nije Nije Nije E2 - - - - /-
urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije E2 urađeno urađeno urađeno - - - - - Nije Nije Nije A6 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 13C8 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 16E5 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 22C9 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 23B9 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 4H3 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 5B1 urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 1B9 /- urađeno urađeno urađeno 2C3 - - - - - /- - Nije Nije Nije urađeno urađeno urađeno - - - - - - Nije Nije Nije 3G2 /- urađeno urađeno urađeno 2G4 - - - - - - - Nije Nije Nije urađeno urađeno urađeno * E11 domen, transmembranski domen i citoplazmatski domeni humanog FcRH5. § Površinska plazmonska rezonanca BIACORE<®>KD, jednovalentni afinitet. Eksperimenti sa humanim E11 domenom su izvedeni 1 do 3 puta i uprosečeni. Eksperimenti sa E11 domenom cinomolgusa su izvedeni jednom za svako antitelo.
¶ Nisu dobijeni rekombinantni klonovi za antitelo 23E2.
Prečišćeni IgG iz 16 odabranih klonova monoklonskog antitela (mAb) dodatno su okarakterisani za vezivanje za ćelije koje endogeno eksprimiraju humani FcRH5 (MOLP-2 ćelije). Pokazano je da ukupno osam klonova mAb vezuje ćelije mijeloma MOLP-2. Utvrđeno je da su dva od ovih osam klonova mAb suvišna na osnovu analize sekvence i jedan nije molekularno kloniran. Šest molekularno kloniranih MOLP-2-pozitivnih klonova mAb rekombinantno je eksprimirano kao mišji lgG2a i testirano na afinitet površinskom plazmonskom rezonancom u aparatu BIACORE® T200 u formatu za snimanje IgG.
Ukratko, testirana antitela su uhvaćena na protočnim ćelijama 2, 3 ili 4, dok je protočna ćelija 1 bila referenca, na čipu proteina A serije S CM5 (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).
Fragment FcRH5 proteina je korišćen kao analit, sa protokom od 30 μl/min. Između injekcija, površina za hvatanje je regenerisana injekcijom od 30 sekundi sa 10 mM glicina, pH 1,5 pri protoku od 10 μl/min. Interakcije su procenjene na 25 °C u 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,05% Tween 20 (HBSP). Referentni podaci iz referentne protočne ćelije i iz injekcije samo pufera oduzeti su pre kinetičke analize. Kinetičke informacije su izračunate ubacivanjem podataka u 1:1 model vezivanja. Referentno oduzimanje i ubacivanje podataka su izvršeni korišćenjem softvera BIAevaluation (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).
Jednovalentni afiniteti ovih antitela prema humanom E11 domenu kretali su se od 0,5 nM do 68 nM, dok su se afiniteti prema E11 domenu cinomolgusa kretali od 9,1 nM do 338 nM (tabela 4). Samo jedan klon je imao afinitet prema humanom E11 domenu koji je bio veći od antitela 1G7, mAb 15G8. Međutim, razlika u KDizmeđuhumanih i cinomolgusovih E11 domena bila je oko 20 puta, što je ovaj klon učinilo neprikladnim za dalji klinički razvoj. Pored toga, uprkos velikom afinitetu ovog klona antitela prema izolovanom humanom domenu E11, vezivanje ovog klona antitela za MOLP-2 ćelije bilo je veoma slabo; bilo je slabije od klonova sa nižim afinitetima prema izolovanom humanom E11 domenu, što ukazuje na to da se ovaj klon nije dobro vezivao za nativni humani FcRH5 protein.
Primer 2. Stvaranje i karakterizacija varijanti anti-FcRH5 antitela iz kampanje imunizacije A i C
A. Humanizacija anti-FcRH5 monoklonskih antitela iz kampanje imunizacije A Anti-FcRH5 antitelo 1G7 iz kampanje imunizacije A, opisano u US pub. br.
2015/0098900, humanizovano je metodom graftovanja HVR kao što je prethodno opisano (Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599,1997), osim što su okviri konsenzusa VH4 i Vk1 (Dennis, Current Trends in Monoclonal Ant. Develop, and Manufac.9-28, 2010) korišćeni kao akceptorski okviri. Graftovanje teškog lanca takođe je uključivalo mišje ostatke na Kabatovim pozicijama okvira 37, 48, 67, 71, 73, 78, 93 i 94, a graftovanje lakog lanca takođe je uključivalo mišje ostatke na pozicijama okvira 36 i 43 za pravilnu prezentaciju HVR i kontakt VH/VL domena. Brojevi ostataka su prema Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Sekvenca humanizovanog 1G7, koji se ovde naziva hu1G7.v1 ili 1 G7.v1, prikazana je na Sl.
2 i 3.
B. Afinitetno sazrevanje i karakterizacija varijanti hu1G7.v1
Da bi se poboljšala potentnost, humanizovano antitelo hu1G7.v1 je afinitetno sazrelo pomoću displeja faga. Ukratko, prikazane su randomizovane biblioteke fragmenta Fab antitela na površini bakteriofaga M13 i panovane su za vezivače za biotinilovani fragment FcRH5 proteina. Poželjne mutacije su identifikovane sekvenciranjem DNK pojedinačnih klonova. Pretpostavljeno je da će ove poželjne mutacije da dovedu do varijanti sa poboljšanim afinitetom (Li et al. MAbs. 6:437-445, 2014). Klonovi antitela sa odabranim mutacijama testirani su na afinitet površinskom plazmonskom rezonancom (tabele 5A i 5B).
Ukratko, površina za hvatanje humanog IgG generisana je na čipu serije S CM5 koristeći kuplovanje amina i komplet za hvatanje humanog IgG (GE Life Sciences, Piscataway, NJ). Testirana antitela su zatim uhvaćena na protočnim ćelijama 2, 3 ili 4, dok se protočna ćelija 1 koristi kao referenca. Fragment FcRH5 proteina je korišćen kao analit, sa protokom od > 30 μl/min. Između injekcija, površina za hvatanje je regenerisana injekcijom 3 M magnezijum hlorida ili 10 mM glicina, pH 1,5, u trajanju od 30 sekundi. Interakcije su procenjene na 25 °C u 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaC1 i 0,05% Tween 20 (HBSP). Referentni podaci iz referentne protočne ćelije i iz injekcije samo pufera oduzeti su pre kinetičke analize. Kinetičke informacije su izračunate ubacivanjem podataka u 1:1 model vezivanja. Referentno oduzimanje i ubacivanje podataka su izvršeni korišćenjem softvera BIAevaluation (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).
Za početne eksperimente skrininga afiniteta, antitela su uhvaćena direktno iz prečišćenih medijuma za kulturu prikupljenih nakon prolazne transfekcije Expi293 ćelija (Invitrogen) (tabele 5A-5B). Sposobnost svakog antitela da veže fragment proteina FcRH5 procenjena je na 100 nM i 500 nM (osim 1, tabele 5A-5B) ili 0 nM, 20 nM, 100 nM i 500 nM (osim 2, tabele 5A-5B). Asocijacija i disocijacija su praćene pri protoku od 30 μl/min, tokom 180 s, odnosno 600 s. Sve sekvence prisutne u tabeli 5A su obelodanjene u SEQ ID NO: 4-6 (tj. FcRH5 L1, L2, L3 široki konsenzus). Sve sekvence prisutne u tabeli 5B su obelodanjene u SEQ ID NO: 1-3 (tj. FcRH5 H1, H2, H3 široki konsenzus). Uočena su poboljšanja afiniteta do 5,2 puta (tabela 5A). Kako svaka pojedinačna mutacija nije obezbedila tražena poboljšanja, odlučeno je da se kombinuju različite mutacije sa fokusom na VL mutacije S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q i S94P i VH mutacije S28K, L29T i S56T.
TABELA 5A. Skrining afiniteta odabranih antitela
Opseg
Skrini
Eks poboljšan
Klon ng KD
p. ja KD
(nM)
<skrininga>2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 8 9 9 9 9 9 9 9 9 u 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 6 9 0 1 2 3 4 5 6 7 poređenj
u sa
kontrolni
m K A S Q D V S N I V V S A S Y R Y T Q Q H Y S S P Y T uzorcima
hu1G7.v1
1
2
TABELA 5B. Skrining afiniteta odabranih antitela
Eks Skrining
Ref. poređenju
p. KD(nM)
sa
kontrolnim
uzorcima
hu1G7.v1
HC.0
2 22 1,1 SLT R F GV H V I WR G G S T D Y N A A F M S HYYGSQDYALDN 5
4
Biblioteke displeja faga antitela dizajnirane su koristeći tvrdu i meku mutagenezu usmerenu na lokaciju. Biblioteke L188 i L189 koristile su meku mutagenezu za mutiranje VL ostataka 27-34, 50-56, 91-94, i 96 (L188) ili VH ostataka 28-35, 50-58, i 95-100d (L189). Na pozicijama mutageneze, oligonukleotidi sa mekom mutagenezom koristili su 91% nukleotida koji kodira roditelja i 3% nukleotida onog drugog. Biblioteke L190 i L191 koristile su tvrdu mutagenezu (NNK kodone) za mutiranje VL ostataka 27-34, 50-56 i 89-96 (L190) ili VH ostataka 28-35, 50-58 i 95-100d (L191), po jedan kodon, sa najviše tri HVR mutirana istovremeno (Li et al. MAbs.6:437-445, 2014).
Izvedena su najviše četiri kruga selekcije za vezivanje za fragment FcRH5 proteina. Selekcije su izvršene u čvrstoj fazi (ciljni protein adsorbovan direktno na mikroploče) i u rastvoru. Za izbor rastvora, biotinilovani ciljni protein je korišćen da omogući hvatanje kompleksa fag-antitelo-cilj. Klonovi sa odabranim mutacijama su eksprimirani u Expi293 ćelijama (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), a supernatanti pregledani površinskom plazmonskom rezonancom.
Biblioteke displeja faga antitela generisane su Kunkelovom mutagenezom (Kunkel et al. Methods in Enzymology, 154:367-382, 1987) pri čemu se kao obrazac koristi jednolančana DNK proizvedena u CJ236 bakterijama i prečišćena korišćenjem Qiagen QIAprep Spin M13 kompleta (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). Obrazac DNK za početne biblioteke afinitetnog sazrevanja sadržao je zaustavne kodone u HVR-ovima odabranim za mutagenezu; obrazac DNK za narednu „fokusiranu“ biblioteku faga opisanu u nastavku nije koristio obrazac HVR zaustavnih kodona. Ako nije drugačije naznačeno, ostaci u varijabilnim regionima antitela numerisani su prema Kabatovom sistemu. Enzimi su kupljeni od New England Biolabs (Ipswich, MA). Reakcije Kunkelove mutageneze očišćene su pomoću QIAprep mini spin kolona (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) i transformisane u XLI Blue E. coli (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) putem elektroporacije. Nakon rekuperacije u SOC medijumu na 37 °C, kulture su inficirane pomoćnim fagom i inkubirane na 37 °C još 0,5-2 sata pre dodavanja antibiotika karbenicilina i kanamicina. Kulture su zatim inkubirane na 37° C tokom još 4-5 sati nakon čega sledi dalja inkubacija preko noći na 30 °C. Bakteriofag je prečišćen iz izbistrenog medijuma za kulturu taloženjem sa približno 1/6 zapremine reagensa za taloženje (20% PEG, 2,5 M natrijum hlorid). Taloženi fagi su peletirani centrifugiranjem i solubilizovani u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS). Rastvor je dodatno izbistren centrifugiranjem na 14.000 g. Prečišćeni fagi su skladišteni u 50% glicerolu u zamrzivaču na -20 °C i resolubilizovani u PBS-u pre upotrebe.
U pristupu racionalnog dizajna, šest mutacija VL identifikovanih iz eksperimenata faga (S30R, I32L, A51G, T56S, H91Q i S94P) kombinovano je sa dodatnom humanizacionom mutacijom VL S43A i procenjeno u parovima kako bi se procenila kompatibilnost (tabela 6). Za procenu kompatibilnosti odabranih mutacija VL (tabela 6), antitela su uhvaćena direktno iz prečišćenih medijuma za kulturu prikupljenih nakon prolazne transfekcije Expi293 ćelija. Vezivanje fragmenta proteina FcRH5 procenjeno je na 6 nM, 19 nM, 56 nM, 167 nM i 500 nM pri protoku od 30 μl/min. Asocijacija i disocijacija su praćene tokom 300 s, odnosno 600 s. Sekvence otkrivene u tabeli 6 su pojedinačne aminokiseline (tj. broj na vrhu kolone je broj aminokiselina u sekvenci antitela). Rezultati su pokazali da mutacije VL I32L i H91Q, mada pojedinačno poboljšavaju afinitet, nisu pospešile afinitet kada se kombinuju. Međutim, ostale testirane sekvence dale su inkrementalna poboljšanja afiniteta do četiri puta u poređenju sa hu1G7.v1 kontrolom. Na osnovu ovih rezultata, konstruisana su antitela hu1 G7.v1.1, hu1 G7.v1.2, hu1 G7.v1.3 i hu1 G7.v1.4 (Sl.2 i 3). Antitelo hu1G7.v1.1 je konstruisano da sadrži šest mutacija VL S30R, I32L, A51G, T56S, H91Q i S94P. Antitelo hu1G7.v1.2 je konstruisano da sadrži deset mutacija VL S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q i S94P. Antitela hu1G7.v1.3 i hu1G7.v1.4 su zasnovana na hu1G7.v1.1 i konstruisana da izostaveI32L (hu1G7.v1.3) ili H91Q (hu1G7.v1.4).
TABELA 6. Kombinatorna analiza mutacija identifikovanih putem displeja faga antitela
Naziv uzorka KDkontrole*/KDuzorkaHVR-L1 HVR-L2 HVR-L3
* Srednja
br. 30 br. 32 br. 43 br. 51 br. 56 br. 91 br.94 vrednost, n=2
LC.H91Q.S94P 4,1 S I A A T
hu1G7.v1
1,0 S I S A T H S (kontrola)
hu1G7.v1(kontrola) 1,0 S I S A T H S
LC.I32L.H91Q 0,7 S A A T S
Takođe, konstruisana je fokusirana biblioteka faga za istraživanje mutacija od interesa (mutacije VL S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q, S94P; mutacije VH S28K, L29T, S56T) u mnogim različitim kombinacijama. U nastojanju da se dodatno poveća sličnost sa sekvencama humanih antitela, fokusirana biblioteka faga je takođe omogućila ograničene varijacije na pozicijama okvira na sledeći način: S43A u LC, L48I u HC i/ili N73T u HC. Dobijeno je oko 10<8>transformanata. Selekcije su izvršene korišćenjem fragmenta FcRH5 proteina kao „mamca“. Selekcije su u početku vršene sa ciljnim proteinom imobilisanim na čvrstoj fazi, dok su u kasnijim krugovima korišćene selekcije faze rastvora. Antitela hu1G7.v1.5, hu1G7.v1.7, hu1G7.v1.13 i hu1G7.v1.13.1 (Sl.2 i 3) izvedena su iz ove biblioteke.
Podaci o sekvenciranju iz eksperimenata sa fokusiranom bibliotekom faga takođe su podržali koncept (tabele 5A-5B) negativne interakcije između mutacija VL I32L i H91Q. Nakon pet krugova selekcije na fagu i naknadne analize sekvence VL 163, utvrđeno je da je učestalost glutamina na VL poziciji 91 mnogo veća u prisustvu Ile32 (49/70 klonova) nego u prisustvu Leu32 (5/93 klonova). Ovaj efekat nije primećen u biblioteci bez selekcije, u kojoj je Gln91 primećen kod 50% (9/18) analiziranih klonova koji su sadržali leucin na poziciji 32. Ovi rezultati ukazuju na negativnu selekciju klonova koji su sadržali i I32L i H91Q, uprkos pozitivnom obogaćivanju svake od ovih mutacija u drugim kontekstima.
Osetljivost na oksidaciju istražena je inkubiranjem antitela sa 1 mM 2,2'-azobis(2-metilpropionamidin)dihidrohloridom (AAPH) tokom 16 sati, nakon čega je usledila digestija sa tripsinom da bi se stvorili peptidi koji mogu da se analiziraju pomoću analize tečne hromatografije (LC) sa masenom spektrometrijom (MS). Za svaki peptid u uzorku, dobijeno je retenciono vreme na osnovu LC i informacije visoke rezolucije o tačnoj masi i fragmentaciji peptidnih jona (informacije o sekvenci aminokiselina) na osnovu MS. Izdvojeni su jonski hromatogrami (XIC) za željene peptide (nativni i modifikovani peptidni joni) iz skupova podataka u okviru ±10 ppm, a pikovi su integrisani da bi se odredila površina. Relativni procenti modifikacije su izračunati za svaki uzorak na sledeći način: (oblast modifikovanog peptida) I (površina modifikovanog peptida plus površina nativnog peptida) x 100. Ovi relativni procenti su zatim upoređeni između kontrolnih uzoraka i uzoraka tretiranih sa AAPH.
Nakon 16-časovne inkubacije na 40 °C u prisustvu 1 mM AAPH, primećeno je povećanje oksidacije HVR-H2 Trp52 i Met64 (44,5%, odnosno 52,7%). Pored toga, oksidacija Trp52 povećala se sa 2% na 62% nakon stresa uzrokovanog svetlošću, a mutacija Trp-52HCdovela je do gubitka afiniteta za varijante 1 G7.v1.4, kako je izmereno pomoću BIACORE® (slika 4). Zamena Trp52 fenilalaninom, tirozinom, leucinom ili histidinom i zamena Met64 fenilalaninom, izoleucinom, valinom ili leucinom istražene su u kontekstu lakih lanaca antitela hu1G7.v1, hu1G7.v1.3, hu1G7.v1.4, hu1G7.v1.5, hu1G7.v1.6 i hu1G7.v1.7 (Sl. 2 i 3). Konkretno, mutacija W52 u F, Y, L ili H dala je vrednosti K<D>od 119 nM, 131 nM, 92 nM, odnosno 60,4 nM. D<OK JE MUTACIJA>M64<U>V<U>1G7.<V>85<DALA>K<D OD>2,5<N>M. Za skrining afiniteta HVR-H2 Trp52 i Met64 varijanti (tabela 7), antitela su eksprimirana prolaznom transfekcijom Expi293 ćelija i prečišćena pomoću vrhova kolona koje su po porudžbini upakovane sa afinitetnom smolom MaBSelect SuRe (Glygen Corp., Columbia, MD & GE Life Sciences, Piscataway, NJ). Kontrolna antitela hu1G7.v1 i hu1G7.v1.5 su eksprimirana prolaznom transfekcijom 293T ćelija i prečišćena sa MabSelect SuRe. Vezivanje fragmenta proteina FcRH5 na uhvaćena antitela praćeno je na 100 nM i 500 nM. Asocijacija i disocijacija su praćene pri protoku od 40 μl/min, tokom 180 s, odnosno 300 s. Rezultati, prikazani u tabeli 7, pokazali su da se HVR-H2 Met64 može mutirati u valin uz održavanje visokog afiniteta prema FcRH5.
Antitelo hu1G7.v1.4 je izabrano na osnovu afiniteta i selektivnosti prema FcRH5 u odnosu na druge članove porodice FcRH. Da bi se poboljšala otpornost ovog antitela na oksidaciju, mutacija M64V opisana u tabeli 7 takođe je uvedena u VH region. Dobijeno antitelo hu1G7.v1.4.M64V je označeno hu1G7.v85 (Sl.5A-5B) i proizvedeno je kao dvovalentni IgG i kao bispecifično antitelo zavisno od T ćelija (TDB). Sekvenca hu1 G7.v85 predstavljena je na sl. 6A-6B i sl. 5A-5B. Kinetička analiza hu1G7.v85 prikazana je u tabeli 8. Analiza hu1G7.v1.4 je prikazana radi poređenja. Razlike primećene u K<D>hu1G7.v1.4 (tabele 7 i 8) su u granicama eksperimentalnih varijacija koje se očekuju za ove molekule.
Takođe je proizvedena verzija hu1G7.v.1 koja nije afinitetno sazrela, hu1G7.v87, koja poseduje mišje 1G7 HVR u gore opisanom humanizovanom okviru, sa mutacijom M64V za poboljšanje otpornosti na oksidaciju.
TABELA 7. Skrining afiniteta različitih varijanti HVR-H2 pozicije 52 i 54 hu1G7.v1
TABELA 8. Kinetička analiza hu1G7.v1.4 i hu1G7.v85 u hlgG1 i TDB formatu
Dodatna metoda afinitetnog sazrevanja koristila je Sangerovo sekvenciranje za randomizaciju pozicija HVR teškog lanca; međutim, ovom metodom nisu identifikovane poželjne mutacije. Zbog toga je proširen broj pozicija testiranih za varijante i opseg skrininga korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije (Illumina sekvenciranje). Konstruisana je biblioteka u kojoj su odabrane pozicije u varijabilnom regionu teškog lanca randomizovane sa NNK kodonom, koji kodira bilo koju aminokiselinu ili ćilibarni zaustavni kodon. Ovaj dizajn omogućava samo jednu promenu aminokiselina u varijabilnim regionima antitela po klonu. Pozicije su izabrane iz HVR-a i pozicija okvira koje su u direktnom kontaktu ili proksimalne u odnosu na HVR-e. Kabatove pozicije 1, 2, 24 do 40, 43, 45 do 78, 80 do 83, 85, 86, 91, i 93 do 102 su randomizovane. Biblioteka je nastala sintezom DNK (GeneWiz), proizvodeći 75 nezavisnih linearnih fragmenata DNK sa jednom pozicijom u svakom fragmentu koja je randomizovana sa NNK kodonom. Linearni fragmenti DNK su objedinjeni i klonirani u jednovalentni vektor displeja faga fragmenta Fab (Lee et al. J. imunol. Methods 284:119-132, 2004) koji sadrži varijabilni region lakog lanca bez mutacija afinitetnog sazrevanja. Proizvodi ligacije su elektroporisani u E. coli XL-1, superinficirani pomoćnim fagom M13 KO7 (New England Biolabs) i uzgajani kako je opisano. Vezivači su izabrani u tri kruga sortiranja sa humanim ili cinomolgusovim FcRH5 u paralelnim stazama. Za ove selekcije, ELISA ploče obložene neutravidinom (Pierce) korišćene su za hvatanje biotinilovanog humanog ili cinomolgusovog FcRH5 domena 8 na 50 ng/ml u PBS-u. Fag (1 OD268/ml) inkubiran je sa imobilisanim FcRH5 dva sata na sobnoj temperaturi, a nevezani fag je uklonjen ispiranjem 10 puta pomoću PBS-a. Biblioteka i odabrani fag su korišćeni za inficiranje E. coli XL-1, plazmidna DNK je ekstrahovana i inserti su amplifikovani 15-ciklusnom PCR amplifikacijom koristeći Phusion DNK polimerazu (New England Biolabs), nakon čega je usledilo prečišćavanje amplikona agaroznim gelom. DNK iz faga iz originalne biblioteke (2 OD268) ekstrahovana je kompletom za prečišćavanje DNK M13 (Qiagen) i 200 ng DNK korišćeno je
1
kao šablon za amplifikaciju inserta koristeći iste uslove kao iznad. Amplikoni su sekvencirani sekvenciranjem Illumina kao što je prethodno opisano (Koenig et al. J. Biol. Chem.290:21773-21786, 2015). Sekvence su filtrirane i analizirane kao što je prethodno opisano (Koenig et al. J. Biol. Chem. 290:21773-21786, 2015), uklanjajući sve sekvence sa više od jedne mutacije u varijabilnom regionu, sekvence sa mutacijama koje nisu u skladu sa korišćenjem NNK degenerisanog kodona i sekvence sa zaustavnim kodonima. Obogaćivanje je izračunato deljenjem učestalosti date mutacije na datoj poziciji u sortiranom uzorku sa učestalošću iste mutacije u nesortiranom uzorku (početna biblioteka), kao što je prethodno opisano (Fowler et al. Nat. Methods 7:741-746, 2010), koristeći sledeću formulu:
<Ev = log2((Rv,s />∑<Rx,s)/(Rv,i/>∑<Rx,i))>, gde je Ev obogaćivanje mutanta, Rv,s je broj čitanja samutacijom v na poziciji s u sortiranoj populaciji, Rx,s je broj čitanja u sortiranoj populaciji sa mutacijama na istoj poziciji kao varijanta Rv,s, Rv,i je broj čitanja istog mutanta kao Rv,s u ulaznoj, nesortiranoj populaciji i Rx,i je zbir svih varijanti u ulaznoj, nesortiranoj populaciji sa mutacijama na istoj poziciji kao varijanta Rv,i. Rezultati Ev za selekcije sa humanim i cino FcRH5 prikazani su u tabeli 9, odnosno 10, a siva polja predstavljaju mutacije koje nisu identifikovane u izabranom uzorku ili u biblioteci.
Tabela 11 prikazuje mutacije sa rezultatima od najmanje 0,5 u selekcijama sa humanim FcRH5 i najmanje 0 u selekcijama sa cinomolgusovim FcRH5. U tabeli 11, mutacije izabrane za dalju analizu (tj. mutacije koje su bar blago favorizovane za vezivanje za humani FcRH5 i koje su neutralne ili bolje za vezivanje cinomolgusovog FcRH5) istaknute su crnom ili sivom bojom, a mutacija L29T identifikovana Sangerovim sekvenciranjem je istaknuta sivom bojom. Ukupno 11 pozicija imalo je mutacije koje su ispunjavale ove kriterijume, sa više varijanti na nekim pozicijama. Jedna pozicija je imala mutaciju koja je uvela mesto glikozilacije (G54N) i nije izabrana za dalju karakterizaciju. Druga varijanta, L29T, identifikovana je skriningom sa Sangerovim sekvenciranjem, ali je identifikovana samo kod klonova sa mutacijom S56T. Ta varijanta je pokazala prosečno poboljšanje afiniteta samo 1,2 puta. Mutant S56T imao je jak negativan rezultat obogaćivanja od -21 (tabela 9), što sugeriše da mutacija L29T može imati blagotvorno dejstvo koje je zaklonjeno prisustvom druge mutacije S56T u dvostrukom mutantu. Od preostalih devet pozicija izabrana je mutacija sa najvećim rezultatom izuzev pozicija 1 i 65, gde su izabrane dve mutacije. Ove varijante su napravljene sintezom DNK (GenWiz) i eksprimirane kao humani lgG1 u kombinaciji sa lakim lancem hu1G7.v1 (bez mutacija afinitetnog sazrevanja) u Expi293 ćelijama u kulturama od 1 ml. Humane varijante IgG1 prečišćene su hromatografijom sa proteinom A i testirane u sistemu BIACORE® na
1 1
afinitet. Od dve testirane mutacije, samo dve, L29T i S100P, imale su značajan uticaj na afinitet kada su testirane u sistemu BIACORE® sa rastvorljivim humanim FcRH5. Samo mutacija L29T poboljšala je afinitet u tom kontekstu za 2,2 puta, dok je mutacija S100P poboljšala afinitet za 3 puta. Ove mutacije su testirane u izolaciji i u kombinaciji u kontekstu afinitetno sazrelog lakog lanca sa mutacijama I32L, A51G, T56S i S94P prisutnim u hu1G7.v86. L29T u teškom lancu poboljšava afinitet hu1g7.v86 za oko 2 puta, slično efektu u kontekstu lakog lanca bez mutacija. Suprotno tome, SWOP, koji je u kontekstu lakog lanca bez mutacija poboljšao afinitet za 3 puta, poboljšao je afinitet hu1G7.v86 za 1,5 puta. Zajedno, mutacije L29T i S100P poboljšale su afinitet hu1 G7.v86 za 2,5 puta. Stoga, čak i korišćenjem opsežnog pretraživanja sa sekvenciranjem sledeće generacije i testiranjem mnogih pozicija okvira pored pozicija CDR za favorizovane mutacije u teškom lancu, moglo se postići samo 2,5-struko poboljšanje afiniteta. Rezultati su pokazali da su mutacije koje su značajno doprinele afinitetu kada se testiraju pojedinačno imale mnogo manji uticaj na molekule koji su već imali druge mutacije. Ovo se posebno odnosi na SWOP mutaciju u teškom lancu koja je, pojedinačno, poboljšala afinitet hu1g7.v1 za oko 3 puta, ali je u kontekstu molekula sa mutacijama lakog lanca I32L, A51G, T56S i S94P i mutacijom teškog lanca L29T imala mali dodatni uticaj na afinitet (tabela 12, uporedite hu1G7.v91 i hu1G7.v93; hu1G7.v93 sekvenca predstavljena na sl. 7A-7B). Dakle, mada su značajna poboljšanja afiniteta mogla biti postignuta dodavanjem nekoliko mutacija lakom lancu, relativno malo poboljšanje moglo bi se postići uvođenjem mutacija u teški lanac.
TABELA 9. Rezultati obogaćivanja mutacija u hu1G7.v1 odabranih sa humanim FcRH5
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1 2
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
14
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A B C E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
TABELA 10. Rezultati obogaćivanja mutacija u hu1G7.v1 izabranih sa cinomolgusovim FcRH5
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
1
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
11
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
TABELA 11. Mutacije sa ocenama obogaćivanja od najmanje 0,5 u selekcijama sa humanim FcRH5 (tabela 9) i ocenama obogaćivanja od najmanje 0 u selekcijama sa cinomolgusovim FcRH5 (tTabela 10)
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
11
RegionPozicija A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
TABELA 12. Afiniteti hu1G7 varijanti sa mutacijama identifikovanim dubinskim sekvenciranjem biblioteka displeja faga izabranih sa FcRH5
Mutacije (pozicija prema Kabatu) K<D>Obim poboljšanja:
Varijanta Teški lanac Laki lanac (nM) hu1G7.v1 hu1G7.v86 hu1G7.v1 - - 14,6 -A E1S - 14,6 1,0
B E1F - 19,1 0,8
C S28P - 13,3 1,1
Mutacije (pozicija prema Kabatu)KD Obim poboljšanja:
Varijanta Teški lanac Laki lanac (nM) hu1G7.v1 hu1G7.v86 D L29T - 6,7 2,2
E V37Y - 11,0 1,3
F A61P - 11,7 1,2
G M64G - 14,4 1,0
H S65D - 15,0 1,0
I S65P - 16,2 0,9
J K81M - 15,3 1,0
K S82bD - 15,0 1,0
L S100P - 4,8 3,0
S30R, I32L, A51G,
hu1G7.v85 M64V 0,8 17,0
T56S, S94P
I32L, A51G, T56S,
hu1G7.v86 M64V 1,4 10,3
S94P
I32L, A51G, T56S,
hu1G7.v91 M64V, L29T S94P 0,7 20,9 2,0
I32L, A51G, T56S,
hu1G7.v92 M64V, S100P S94P 0,9 15,9 1,5
M64V, L29T, I32L, A51G, T56S,
hu1G7.v93 0,6 25,3 2,5
S100P S94P
Primer 3. Stvaranje i in vitro karakterizacija primera za FcRH5 TDB
Anti-FcRH5 antitela opisana ovde korišćena su za generisanje bispecifičnih antitela zavisnih od T ćelija (TDB) koja sadrže vezujuće determinante anti-humanog FcRH5 na jednom kraku i anti-humanog CD3ɛ na drugom kraku. Determinante vezivanja FcRH5 uključivale su humanizovane i afinitetno sazrele klonove monoklonskih antitela 1G7, 1G7.v85 i 1G7.v87. Humanizovane determinante vezivanja za anti-CD3ɛ uključivale su klon antitela visokog afiniteta 38E4.v1, klon visokog afiniteta 38E4.v11 i klon niskog afiniteta 40G5 (EC50 za hCD3ɛ = 1,0 nM, 50 pM, odnosno 13 nM). Anti-CD3 klonovi 38E4.v1, 38E4.v11, i 40G5c vezuju humani CD3ɛ polipeptid (fragment humanog CD3ɛ polipeptida koji se sastoji od aminokiselina 1-26 ili 1-27 (SEQ ID NO: 174)) i aminokiselinski ostatak Glu5 CD3ɛ nije potreban za vezivanje (vidite takođe PCT pub. br. WO 2015/095392 i U.S. pub. br. 2015-
11
Primeri FcRH5 TDB su okarakterisani radi procene njihovog terapeutskog potencijala. Utvrđeno je da humanizovani molekuli FcRH5 TDB kompletne dužine ubijaju humane ćelije plazme i ćelije tumora primarnog mijeloma dobijene od pacijenta pri izuzetno niskim (pM) dozama i da pokreću robusnu proliferaciju T ćelija. FcRH5 TDB su bili efikasni u suzbijanju rasta ksenografta mijeloma in vivo i doveli su do potpunog iscrpljivanja B ćelija i ćelija plazme kod primata pri dobro podnošenim nivoima doza za koje se očekivalo da će zasititi cilj. Kompletno iscrpljivanje ćelija plazme pružilo je ubedljive dokaze o efikasnosti u mikrookruženju koštane srži. Aktivnost FcRH5 TDB bila je u korelaciji sa nivoom ciljne ekspresije (npr. ekspresija FcRH5), što ukazuje na to da pacijenti sa visokim rizikom od mijeloma sa kopijom hromozoma 1q mogu biti posebno osetljivi na ovu imunoterapiju.
Materijali i metode
A. Antitela
a. Proizvodnja TDB
1. Pristup racionalnog dizajna
Da bi se optimizovala ekspresija i povećao prinos TDB, mutacije su projektovane u Fc, VH, VL, CH1 i CL domenima anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB) kako bi se podstakao nastanak odgovarajućeg monomera antitela. Konkretno, modifikacije aminokiselina koje su uvele naelektrisane regione u domene VH, VL, CH1 i/ili CL pružile su mehanizam za smanjenje pogrešnog uparivanja teških lanaca i lakih lanaca. Srodni naelektrisani regioni koji imaju suprotno ukupno naelektrisanje pokreću se zajedno i pomažu u odgovarajućem uparivanju teškog lanca i lakog lanca, što povećava ukupni proizvodni prinos anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB). Primeri za konfiguraciju racionalnog dizajna, uključujući aminokiselinske modifikacije domena Fc, VH, VL, CH1 i CL, predstavljeni su na sl.1A-1B.
2. Pristup dizajna rozete
Pored toga, ili alternativno, radi optimizacije ekspresije i povećanja prinosa TDB, mutacije su projektovane u Fc, VH, VL, CH1 i CL domenima anti-FcRH5 antitela (npr. FcRH5 TDB) kako bi se podstakao nastanak odgovarajućeg monomera antitela. Pristup dizajna rozete pružio je dodatni mehanizam za pokretanje odgovarajućeg uparivanja teških lanaca i lakih lanaca, pored mutacija naelektrisanog regiona, u vidu mutacija dugmeta i rupice u domenima CH1 i CL. Primeri za konfiguraciju dizajna rozete, uključujući aminokiselinske modifikacije domena Fc, VH, VL, CH1 i CL, predstavljene su na sl.1C-1F.
3. Jednoćelijski pristup za proizvodnju FcRH5 TDB
U jednom pristupu, FcRH5 TDB se mogu proizvesti uzgajanjem ćelija domaćina koje
11
su ko-transficirane sa dva plazmida, od kojih svaki kodira jedan od dva kraka FcRH5 TDB (npr. prvi plazmid koji kodira anti-FcRH5 polu-antitelo i drugi plazmid koji kodira anti-CD3 polu-antitelo). Transfekcija ćelija domaćina (npr. ćelija bakterija, sisara ili insekata) izvršena je u formatu ploče sa 96 bunarčića. Za skrining proizvodnje FcRH5 TDB, približno 2000 do 3000 klonova može se odabrati i proceniti pomoću ELISA i homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF) netaknutog IgG za sposobnost vezivanja ciljnog antigena, FcRH5. Klonovi koji proizvode FcRH5 TDB sposobne da se vežu za FcRH5, ili njegov fragment, izabrani su za proširenje i dalji skrining (npr. na vezivanje za CD3). Najbolji klonovi se zatim mogu odabrati za dalju analizu na osnovu procentna proizvedenih bispecifičnih antitela (bsAb), titra i kvalifikacija performansi (PQ).
Primer za jednoćelijski pristup koji može da se koristi za proizvodnju FcRH5 TBD iz pronalaska opisan je u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US16/28850.
4. Dvoćelijski pristup za proizvodnju FcRH5 TDB
Alternativno, FcRH5 TDB mogu da se proizvedu uzgajanjem hemimera antitela (npr. poluantitela) odvojeno (tj. u dve različite ćelijske linije) korišćenjem fermentacije visoke gustine ćelija i zatim izolovanjem svakog poluantitela nezavisno hromatografijom proteina A. Prečišćena polu-antitela se zatim mogu kombinovati, na primer, u molarnom odnosu 1:1 i inkubirati u 50 mM Tris, pH 8,5 u prisustvu 2 mM DTT tokom 4 sata kako bi se omogućilo komplementarno vezivanje i redukcija disulfida u regionu šarke. Dijaliza u odnosu na isti pufer bez DTT-a tokom 24-48 sati dovela je do stvaranja međulančanih disulfidnih veza.
TDB se mogu alternativno proizvesti transfekcijom dva plazmida, od kojih svaki kodira različite krakove TDB, u odvojene ćelije domaćine. Ćelije domaćini se mogu uzgajati zajedno ili odvojeno. Transfekcija ćelija domaćina može se izvršiti u formatu ploče sa 96 bunarčića. Za skrining proizvodnje TDB, 2000 do 3000 klonova je odabrano i procenjeno pomoću ELISA i homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF) netaknutog IgG za sposobnost vezivanja izabranog antigena (npr. FcRH5). Klonovi koji proizvode TDB sposobne da se vežu za FcRH5, ili njegov fragment, odabrani su za proširenje i dalji skrining. Najbolji klonovi su izabrani za dalju analizu na osnovu procenta proizvedenih bispecifičnih antitela (bsAb), titra i PQ.
5. Primeri proizvodnih metoda
U jednom primeru, koristeći ovu strategiju, FcRH5 TDB su proizvedeni strategijom kokulture koristeći ćelije E. coll koje eksprimiraju jedno poluantitelo (rupicu) i ćelije E. coll koje eksprimiraju drugo poluantitelo (dugme) koje su uzgajane zajedno u bocama za trešenje u unapred određenom odnosu tako da proizvode slične količine svakog poluantitela (vidite,
11
Spiess et al. Nat. Biotechnol. 31(8):753-8, 2013; PCT pub. br. WO 2011/069104). Zatim je sakupljen osnovni rastvor čorbe ko-kultivisanih bakterija, ćelije su poremećene u mikrofluidizatoru i antitela prečišćena afinitetnom tehnikom sa proteinom A. Primećeno je da su se tokom mikrofluidizacije i hvatanja proteina A dva kraka komplementarno vezala i formirala međulančane disulfidne mostove u regionu šarke.
U drugom primeru, bispecifična antitela kompletne dužine proizvedena su kao što je prethodno opisano (Junttila et al. Cancer Res. 74:5561-5571, 2014; Sun et al. Science Trans. Med. 7:287ra270, 2015). Ukratko, dva poluantitela (npr. anti-FcRH5 (npr. optimizovane varijante 1G7) i anti-CD3 (npr. 38E4.v1)) koja sadrže mutacije „dugme“ ili „rupica“ u CH3 domenima eksprimirana su prolaznom transfekcijom CHO ćelija, a zatim su afinitetno prečišćena proteinom A. Jednake količine dva poluantitela su inkubirane sa 200 molarnim viškom redukovanog glutationa na pH 8,5 preko noći na 32 °C kako bi se podstaklo formiranje disulfidnih veza između dugmeta i rupica. Sastavljeno bispecifično antitelo (npr. FcRH5 TDB) prečišćeno je od zagađivača putem hromatografije sa hidrofobnom interakcijom. Čistoća prečišćenih FcRH5 TDB je okarakterisana masenom spektrometrijom, hromatografijom na molekulskim sitima (SEC) i gel elektroforezom.
b. Prečišćavanje FcRH5 TDB
FcRH5 TDB su prečišćeni od zagađivača hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC). Dobijena supstanca je analizirana na nivoe endotoksina pomoću prenosnog sistema za testiranje Endosafe, a sadržaj endotoksina je, po potrebi, smanjen ispiranjem proteina sa 0,1% Triton X-114. Molekulske težine TDB-a analizirane su masenom spektrometrijom (LC-ESI/TCF) kao što je prethodno opisano (Jackman et al. The Journal of Biological Chemistry. 285:20850-9, 2010). FcRH5 TDB su takođe analizirani analitičkom hromatografijom na molekulskim sitima na koloni Zenix SEC-300 (Sepax Technologies USA) koristeći Agilent 1:100 HPLC sistem. Prisustvo rezidualnih fragmenata antitela kvantifikovano je elektroforezom pomoću bioanalizatora 2100 i čipa Protein 230.
c. Obeležena antitela
Sva direktno obeležena antitela za protočnu citometriju, osim onih koja su drugačije pomenuta, kupljena su od kompanije BD Bioscience. Anti-humani PD-1 kupljen je od kompanije Affymetrix. Kozji anti-humani IgG i kozji anti-mišji IgG kupljeni su od kompanije Jackson Immunoresearch. Anti-PC-FITC (klon Vs38c) kupljen je od kompanije DAKO. SLP-76 antitelo za vestern blot kupljeno je od kompanije Cell Signaling Technology. p-SLP76 (Ser376) generisan je u Genentech, Inc.
Za detekciju FcRH5 iz uzoraka multiplog mijeloma (MM) i plazme zdravih donora i B
11
ćelija pomoću FACS-a, anti-FcRH5 antitelo 1G7 je obeleženo sa PE od strane kompanije Southern Biotec. Za mikroskopiju, TDB su obeleženi sa Alexa Fluor 647 koristeći odgovarajući komplet za obeležavanje proteina (ThermoFisher) prema uputstvima proizvođača. TDB su dijalizirani u PBS-u, pH 7,2 pre obeležavanja i rutinski je postignut odnos boja/protein od ~4.
B. Testovi molekulske stabilnosti
Da bi se procenila molekulska stabilnost FcRH5 TDB obavljeni su testovi termičkog stresa na 30 °C do 40 °C tokom četiri nedelje. FcRH5 TDB su inkubirani na 1 mg/ml u 20 mM his-acetatu, 240 mM saharozi, pH 5,5, i procenjeni nakon 2 nedelje. TDB su procenjeni na promenu <5% N deaminacije/D izomerizacije, na promenu <2,5% gubitka monomera putem SEC, i na <16% gubitak glavnog pika IEC 2. nedelje. Korišćeni SEC pufer je bio 0,25 M KCI, 0,2 M K3PO4, pH 6,3. LC-MS analiza je sprovedena u redukovanim uslovima korišćenjem TCEP na 60 °C tokom 10 minuta. LC-MS/MS analiza je sprovedena RCM mapiranjem triptičnih peptida sa DTT redukcijom, IAA zatvaranjem i pH 8,2 digestijom.
Ispitivanje oksidacije AAPH sprovedeno je da bi se procenila <35% Trp oksidacija i <1,1 Met Ox/Met256. FcRH5 TDB su inkubirani u koncentraciji od 1,0 mg/ml i na njih je primenjen stres u 1 mM AAPH tokom 16 sati. Takođe je sproveden test oksidacije svetlosti kako bi se procenio Trp OX/TrpOX_ApoMabW53 >0,5. Za test oksidacije svetlosti, TDB su inkubirani u koncentraciji od 1,0 mg/ml tokom 48 sati i izloženi svetlosti tokom 2,4 miliona luks sati. Oksidacija je procenjena LC-MS/MS analizom sa RCM mapiranjem triptičnih peptida sa DTT redukcijom, IAA zatvaranjem i pH 8,2 digestijom.
C. Ćelijska kultura i stvaranje stabilne ćelijske linije
HEK-293T i HEK-T ćelije koje eksprimiraju kompleks 1G4 TOR i ključne TOR signalne komponente (James et al. Nature 487:64-69, 2012) uzgajane su u DMEM (Sigma Aldrich). Sve ostale ćelijske linije su uzgajane u RPMI. Svi medijumi su dopunjeni sa 10% toplotno inaktiviranim FBS-om (Life Technologies), 1 mm HEPES (Lonza), 2 mM glutaminom, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina (Sigma Aldrich).
Da bi se procenio nastanak imunoloških sinapsi, SVT2 ćelije su inficirane retrovirusom koji kodira FcRH5 kompletne dužine koji ima N-terminalnu gD oznaku ili virusom koji kodira skraćeni FcRH5 (tj. FcRH5 uključujući brisanje aminokiselina 1-744) koji ima N-terminalnu gD oznaku. Da bi se procenila ciljna zavisnost ubijanja FcRH5 TDB, ćelije FOX-NY su inficirane lentivirusom koji kodira FcRH5 kompletne dužine. Pojedinačni klonovi dobijeni od ćelija sa diferencijalnim nivoima ekspresije FcRH5 su zatim izabrani sa 2 μg/ml puromicina.
Da bi se procenio efekat PD-1/PD-L1 signalizacije na aktivnost FcRH5 TDB, 293 ćelije
11
su inficirane lentivirusom koji kodira FcRH5, nakon čega sledi transfekcija plazmida koji kodira humani PD-L1 koristeći lipofektamin (Invitrogen).
D. Analiza vezivanja ćelija radioligandom
Anti-FcRH5 1G7.v85 antitelo je jodovano metodom lodogen do specifične aktivnosti¤ od 20 pCi/μg. Smeše za kompetitivnu reakciju sa konstantnom koncentracijom jodovanog antitela i opadajućim koncentracijama serijski razblaženih neobeleženih antitela stavljene su na ploče sa 96 bunarčića. Ćelijske linije koje eksprimiraju endogeni humani FcRH5 (npr. MOLP-2, RI-1, KARPAS 620 i KMS21-BM) isprane su puferom za vezivanje, koji se sastojao od Dulbekovog modifikovanog Iglovog medijuma (DMEM) sa 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 50 mM HEPES (pH 7,2) i 0,1% natrijum azida, a zatim dodate na ploče sa 96 bunarčića. Kompetitivne reakcije sa ćelijama su ispitane u tri primerka za svaku koncentraciju neoznačenog antitela i inkubirane dva sata na sobnoj temperaturi. Nakon dvočasovne inkubacije, kompetitivne reakcije su prenete na Millipore Multiscreen filter ploču (Billerica, MA) i isprane četiri puta vezujućim puferom da bi se razdvojila slobodna od vezanih jodovanih antitela. Filteri osušeni na vazduhu su prebrojani na gama brojaču Wallac Wizard 2470 gama (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley, MA) a podaci o vezivanju su procenjeni pomoću softvera NewLigand (Genentech), koji koristi algoritam iscrtavanja Munsona i Robarda da bi se odredio afinitet vezivanja antitela (Munson et al. Anal. Biochem.
107:22-39, 1980).
E. Vektori i prolazna transfekcija za mikroskopiju
FcRH5 koji ima N-terminalnu gD oznaku spojen je sa fluorescentnim proteinom mRuby2 tako što je FcRH5 prvo ubačen u lentivirusni vektor pHR-SIN, pre ligacije mRuby2 DNK sekvence u ovaj vektor, stvarajući tako pHR-FcRH5-mRuby2. SFFV promoter u ovom vektoru je naknadno zamenjen promoterom MHSP, što je dalo pHRI-FcRH5-mRuby2, koji koristi slabiji promoter od pHR, što omogućava više fizioloških nivoa ekspresije FcRH5-Ruby. Vektori koji eksprimiraju LCK, ZAP70, CSK/CBP i CD45 su prethodno opisani (James et al. Nature. 487:64-69, 2012). Korišćeni CD45 konstrukt je bio RO izooblik ili konstrukt koji sadrži citoplazmatski domen CD45 sa transmembranskim i vanćelijskim domenima CD43, za koji je poznato da oponaša funkciju CD45. Pre transfekcije konstrukata, HEK ćelije su posejane sa približno 60% konfluencije na ploče sa 6 bunarčića. Vektori su zatim prolazno transficirani u odgovarajućim odnosima koristeći GeneJuice (Novagen), prateći uputstva proizvođača. Ćelije su korišćene u eksperimentima 24-48 sati nakon transfekcije.
F. Mikroskopsko snimanje i analiza
Za snimanje ćelijskih konjugata, 3x10<5>ćelija svakog tipa ćelije koji se snima sakupljene
12
su iz kulture i ponovo suspendovane u 100 μI 20 nM TDB u RPMI-1640 (bez fenol crvenog). Nakon 20-30 min inkubacije kako bi se omogućila konjugacija ćelija, ćelije su isprane PBS-om, ponovo suspendovane u DMEM<gfp2>medijumu za snimanje (Evrogen) i dodate u posude za snimanje od 35 mm (Mattek). Andor sistem konfokalnog mikroskopa sa rotirajućim diskom je korišćen za snimanje ćelija na 37 °C. Svi snimci su analizirani i svi prezentovani snimci su obrađeni na isti način pomoću ImageJ. Oduzeta je pozadina od prezentovanih snimaka, a zatim su isečeni da bi se fokusirali na par ćelija i kontrast je optimizovan. Stepen grupisanja i segregacije proteina određen je korišćenjem intenziteta fluorescentno obeleženih proteina u membrani plazme. Membrana plazme je izabrana ručnim crtanjem linije i prosečan intenzitet fluorescencije membrane plazme unutar međupovršine ćelija-ćelija podeljen je prosečnim intenzitetom fluorescencije membrane plazme izvan međupovršine ćelija-ćelija da bi se izračunao stepen grupisanja ili segregacije. Da bi se generisala slika međupovršine para ćelija konjugovanih pomoću TDB sa z-gomile, gomila slika je prvo pojednostavljena, a zatim isečena da bi se istakao region međupovršine pomoću softvera Huygens.
G. In vitro testovi citotoksičnosti i aktivacije T ćelija
Ciljne ćelije su obeležene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) prema protokolu proizvođača (Life Technology, br. C34554). Ciljne ćelije obeležene CFSE-om i prečišćene CD8+ ćelije pomešane su u odnosu 3:1 efektorske ćelije prema ciljnim ćelijama (E:T) i inkubirane sa TDB tokom 48 sati. Na kraju inkubacije, ćelije su analizirane protočnom citometrijom na uređaju FACSCalibur u formatu automatizacije. Broj živih ciljnih ćelija izračunat je izdvajanjem na CFSE+/Pi-negativne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat na sledeći način: % citotoksičnosti (živi broj ciljnih ćelija bez TDB - živi broj ciljnih ćelija sa TDB)/(živi broj ciljnih ćelija bez TDB) X 100.
a. In vitro test citotoksičnosti ćelijske linije
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i odvajanje CD8+, Cell Titer Glo (Promega) i testovi održivosti zasnovani na protočnoj citometriji (48 h) sprovedeni su kao što su prethodno opisali Junttila et al. Cancer Res.74:5561-5571, 2014. CD8+ ćelije su korišćene kao efektori u odnosu 3:1 efektor prema cilju.
b. Ćelije ljudske plazme i uzorci primarnog multiplog mijeloma
Humani aspirat koštane srži zdravih donora (ALLCELLS) razblažen je u PBS-u, a mononuklearne ćelije koštane srži (BMMC) izolovane su konvencionalnim gradijentnim razdvajanjem(Limfoprep, STEMCELL). Test održivosti protočnom citometrijom korišćen je za testiranje efekta 72-časovnog FcRH5 TDB tretmana na BMMC plazma ćelije. Smrznute ljudske BMMC od pacijenata sa MM kupljene su od kompanije Conversant Bio. BMMC mijeloma su pomešane sa sveže izolovanim CD8+ T ćelijama zdravih donora, i kokultura je tretirana sa FcRH5 TDB tokom 72 h. PL-negativne CD38+CD138+ ćelije su prebrojane protočnom citometrijom.
H. Testovi aktivacije i proliferacije T ćelija
Test aktivacije T ćelija prethodno je opisan u Junttila et al. Cancer Res.74:5561-5571, 2014. Sveže izolovane CD8+ T ćelije su obeležene sa CFSE i pomešane sa ciljnim ćelijama (npr. MOLP-2 ćelije) u odnosu 1:1 i uzgajane zajedno sa 1 μg/ml TDB tokom 48 sati ili pet dana. Ćelije su obojene sa anti-CD8-APC (BD Bioscience, br. 555634), anti-CD69-PE (BD Bioscience, br. 555531), i/ili anti-CD25-APC (BD Bioscience, br. 555434) i razblaživanje intenziteta fluorescencije CFSE analizirano je protočnom citometrijom.
I. Analiza protočnom citometrijom za cino plazma ćelije
Cino aspirati koštane srži su dva puta razblaženi (1:10) u ACK puferu za lizu (Life Technology, br. AI 0492). Ćelije koštane srži cinomolgusa su obojene sa anti-CD45, anti-CD20 i anti-CD38. Nakon ispiranja, ćelije su fiksirane i permeabilizovane IntraStain kompletom (DAKO). Ćelije su zatim obojene sa anti-PC (klon Vs38c). Ćelije plazme cinomolgusa su klasifikovane pomoću protočne citometrije kao CD45-CD20-CD38+PC+.
J. ELISA analiza za nivo cino IgG
Ukupni cino IgG u serumu je kvantifikovan korišćenjem standardnog kolorimetrijskog sendvič ELISA testa. Kozji anti-majmunski IgG (Bethyl A140-202A) i kozji anti-majmunski IgG konjugovan sa peroksidazom rena (HRP) (Bethyl A140-202P) korišćeni su kao antitelo za hvatanje, odnosno detekciju. Cino IgG (Cell Sciences CSI20163A) korišćen je kao standard za kvantifikaciju proteina.
K. Vestern blot analiza
Sveže izolovane ljudske CD8+ T ćelije i 293T-FcRH5 ćelije (odnos 2:1) tretirane su sa 1 μg/ml 1G7.v85/38E4.v1 („1g7.v85 TDB“), 10A8/38E4.v1 („10A8 TDB“), ili anti-GD/38E4.v1 („anti-GD TDB“) TDB i isprane u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) na 4 °C i lizirane RIPA puferom za lizu (Cell Signaling Technology). pSLP76 (Ser376) i SLP76 detektovani su korišćenjem standardnih metoda i antitela vestern blot.
Rezultati
A. Afinitet vezivanja FcRH5 TDB
Među proizvedenim FcRH5 TDB bili su molekuli koji sadrže klon 1G7 kao domen vezivanja FcRH5 i odabrani klonovi kao CD3-vezujući domen, uključujući 38E4.v1, 40G5c i 38.E4.v11. Antitela hu1G7.v1.1 („1G7.v1.1 TDB“), hu1G7.v1.2 („1G7.v1.2 TDB“), hu1G7.v1.3 (1G7.v1.3 TDB”), hu1G7.v1.4 („1G7.v1.4 TDB“), hu1G7.v1.5 („1G7.v1.5 TDB“), hu1G7.v1.7 („1G7.v1.7 TDB“), hu1G7.v1.13 („1G7.v1.13 TDB“), i hu1G7.v1.13.1 („1G7.v1.13.1 TDB“) generisana su kao FcRH5 TDB sa krakom anti-CD3 38E4.v1 i pomoću BIACORE® je utvrđeno, generalno kako je ovde opisano, da imaju visok afinitet prema rastvorljivom fragmentu FcRH5 proteina (tabela 13). Testovi ekspresijei 1G7.v85 i 1G7.v87 u formatima poluantitela, uključujući mutantesa „dugmetom“, dali su titar iznad trake katastrofe (slika 8).
TABELA 13. Procena afiniteta osam izabranih afinitetno sazrelih varijanti u TDB formatu
B. Vezivanje i unakrsna reaktivnost FcRH5 TDB
Mišje SVT2 ćelije transficirane humanim FcRH5, cino FcRH5, humanim FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH4 korišćene su za testiranje vezivanja i unakrsne reaktivnosti FcRH5 TDB. Metoda je izvedena na sledeći način. Uzgajane SVT2 ćelije su podignute korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija bez enzima (Sigma, br. C5914). 1x10<5>ćelija je suspendovano u 100 μl i inkubirano sa FcRH5 TDB sa 3 μg/ml. Ćelije su zatim isprane FACS puferom (PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA) i inkubirane sa kozjim anti-humanim Fc PE (Jackson Immunoresearch, br. 109-116-170) sa razblaženjem 1:100. Ćelije su dva puta isprane FACS puferom pre nego što je analiza protočnom citometrijom izvršena na uređaju FACSCalibur.
Nakon humanizacije i afinitetnog sazrevanja mišjeg 1G7, generisano je osam afinitetno sazrelih varijanti u TDB formatu. Optimizovani 1G7 TDB generisani su u formatu „dugme u rupici“ sa 38E4.v1 kao anti-CD3 krakom. Svih osam varijanti pokazalo je 5 do 15 puta povećan afinitet u odnosu na mišji 1G7 TDB na osnovu BIACORE® u TDB formatu (tTabela 13). Sve varijante su pokazale negativno vezivanje za FcRH1 ili FcRH4, sa različitim stepenom
12
pozitivnog vezivanja za FcRH2 ili FcRH3. 1G7.v1.4 TDB pokazao je najmanju unakrsnu reaktivnost sa FcRH2 i FcRH3 (tabela 14). Vezivanje FcRH5 TDB koji sadrže različite krakove anti-FcRH5 (tj. 1G7, 1G7.v85 ili 1G7.v1.4) za FcRH3 takođe je procenjeno pomoću FACS (slika 9A).
TABELA 14. Vezivanje i unakrsna reaktivnost FcRH5 TDB
Sposobnost 1G7.v1.4, 1G7.v85 i 1G7 TDB da vezuju huFcRH5 i huFcRH3 procenjena je analizom BIACORE® (Sl. 10A-10D). Afiniteti 1G7.v85 TDB i 1G7.v1.4 TDB bili su uporedivi. 1G7.v1.4 TDB vezuje se za humani FcRH5 i humani FcRH3 sa Kdod 2,4 nM, odnosno ~80 nM, a 1G7.v85 TDB vezuje se za humani FcRH5 i humani FcRH3 sa Kdod 2,4 nM, odnosno ~90 nM (Sl. 10A-10D). Dodatne varijante anti-FcRH5 hu7D8.L1H2, 17B1-VH66, 17B1 i 15G8 (sekvence predstavljene na sl. 11A-13B) takođe su generisane u TDB formatu sa anti-CD3 krakom 38E4.v1. hu7D8.L1H2, 17B1 i 15G8 TDB testirani su na vezivanje za humani i cino FcRH5. Rezultati su prikazani na slici 14 i u tabeli 4.
Poređenje vezivanja 1G7.v85 TDB i 1G7.v93 TDB za humani FcRH5 i cino FcRH5 sprovedeno je analizom BIACORE® (slika 15). 1G7.v85 TDB je pokazao KDod 2,1 nM za vezivanje za humani FcRH5 i KDod 7,8 nm za vezivanje za cino FcRH5. 1G7.v93 TDB je pokazao KDod 1,1 nM za humani FcRH5 i 8,1 nm za cino FcRH5.
Izvedeni su eksperimenti kinetičke karakterizacije (vidite tabelu 8). U ovim eksperimentima, vezivanje rastvorljivog FcRH5 proteinskog fragmenta za prečišćena antitela u formatu humanog TDB antitela analizirano je u šest različitih koncentracija različitih od nule (serija razblaženja 1:3, jedna koncentracija ubrizgana dva puta kao replikat). Protok je postavljen na 40 μl/min, a asocijacija i disocijacija su praćene tokom 600 s. Kinetička analiza afiniteta jednovalentnog 1G7.v85 TDB korišćenjem hIgG formata hvatanja i 1:1 modela vezivanja dala je Kdza humani FcRH5 i cino FcRH5 od 2,4 nM, odnosno 6,8 nM (Sl. 16A-16B). Mutacija Met-64HCsklonog mutaciji u Val u 1G7.v85 TDB nije uticala na afinitet vezivanja.
C. In vitro testovi citotoksičnosti
Da bi se procenila funkcija humanizovanih varijanti FcRH5 TDB, testirana je ćelijska citotoksičnost na FcRH5 MOLP-2 ćelijama koje endogeno eksprimiraju FcRH5. Sve varijante su pokazale sličnu aktivnost ubijanja ciljnih ćelija ali značajno povećanu aktivnost u poređenju sa mišjim 1G7 (Sl.17A-17B). U slučaju varijante 1G7.v1.4 TDB, EC50 je poboljšan 5 do 13 puta u odnosu na mišji 1G7 TDB (n = 10).
Na osnovu velike citotoksične aktivnosti i male unakrsne reaktivnosti na druge članove porodice, 1G7.v1.4 TDB je izabran za dalju analizu. Da bi se povećala stabilnost molekula TDB, krak 1G7.v1.4 je mutiran na potencijalnim mestima oksidacije, stvarajući tako usavršenu verziju, 1G7.v85. Dve verzije, 1G7.v1.4 i 1G7.v85, procenjene su u TDB formatu u različitim testovima, uključujući aktivaciju T ćelija, aktivnost ubijanja ciljnih ćelija MOLP-2, iscrpljivanje cino B ćelija in vitro i iscrpljivanje cino ćelija plazme (Sl. 18A-18D). U svim obavljenim testovima, 1G7.v85 TDB se ponašao potpuno isto kao 1G7.v1.4TDB.
Humanizovani i usavršeni 1G7.v87 TDB takođe je upoređen sa 1G7.v85 TDB. U skladu sa svojim manjim afinitetom, 1G7.v87 TDB je pokazao smanjeno vezivanje za humani FcRH5 u odnosu na 1G7.v85 TDB kako je naznačeno analizom protočnom citometrijom (slika 19A).
1G7.v87 je takođe pokazao negativnu unakrsnu reaktivnost na FcRH3.
Citotoksičnost po ciljne ćelije 1G7.v87 TDB i 1G7.v85 TDB procenjena je na MOLP-2CD8+ ćelijama (slika 19B) i na PBMC četiri zdrava donora (Sl. 19C). Kod svih donora, 1G7.v87 TDB je bio negativan na ubijanje humanih B ćelija, dok je 1G7.v85 TDB pokazao određeni stepen pozitivne aktivnosti ubijanja. Testirane su i cino PBMC četiri zdrava donora (slika 19D). Rangiranje EC50 tri verzije 1G7 TDB je konzistentno kod sva tri donora.1G7.v87 TDB je uporediv sa mišjim 1G7 TDB ali ima znatno manju aktivnost od 1G7.v85 TDB.
1G7.v87 TDB je pokazao znatno slabiju aktivnost ubijanja od 1G7.v85 TDB na cino B ćelijama in vitro.1G7.v85 TDB je takođe procenjen na aktivnost na ljudskim NK ćelijama i utvrđeno je da nema aktivnost ubijanja ≤ 20 μg/ml (slika 9B). EC501G7.v85 TDB bio je 5 do 8 puta bolji nego 1G7.v87 TDB.
12
D. Molekularna procena stabilnosti FcRH5 TDB
Hemijska stabilnost hu1G7.v1 pre afinitetnog sazrevanja ukazuje na osetljivost na oksidaciju na Met-64HCi Trp-52HC.1G7.v85 TDB uzorci su izloženi stresu pomoću AAPH i testovima svetlosnog stresa i ispitani na vezivanje FcRH5 pomoću sistema BIACORE®.
1G7.v85 TDB je pokazao smanjeno vezivanje za FcRH5 nakon stres testova sa AAPH i testova svetlosnog stresa u poređenju sa kontrolnim uzorkom bez stresa (Sl. 20A-20D). Stabilnost monomera i heterogenost naelektrisanja 1G7.v85 TDB procenjena je hromatografijom na molekulskim sitima (SEC), odnosno snimljenim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (ICiEF), nakon što su izloženi stresu u puferu sa niskom pH vrednoću (his-acetat, pH 5,5) tokom 2 nedelje (Sl. 21A-21B). Uočljiva promena gubitka pika monomera bila je mala za stabilnost monomera (0,1%) kao i za heterogenost naelektrisanja (7,7%) (Sl.21A-21B). Dalje, nije bilo primetne promene mase lakog lanca ni teških lanaca 1G7.v85 TDB nakon dve nedelje stresa na niskom pH (Sl.22A-22B). Nakon toplotnog stresa na 30 °C tokom 2 nedelje, gubitak pika monomera bio je 0,1% na osnovu SEC i 8% icIEF.
E. Membranski proksimalni epitop je potreban za efikasnu TCR signalizaciju i aktivnost ubijanja FcRH5 TDB
Da bi se okarakterisali molekularni događaji koji dovode do pokretanja receptora T ćelija (TCR) nakon stimulacije FcRH5 TDB, korišćen je rekonstituisani sistem (James et. al. Nature. 487:64-69, 2012) koji omogućava da se početni događaji koji dovode do aktivacije receptora istražuju na kontrolisan način. Koristeći CD8 ćelije zdravih donora, 1G7/UCHT1.v9 TDB dao je vrlo robusnu fosforilaciju SLP76, što ukazuje na TCR signalizaciju, i efikasno je posredovao u ubijanju ciljnih ćelija (Sl. 23A-23B; EC50 = 0.5 nM). Nasuprot tome, anti-gD TDB, koji cilja epitop distalni u odnosu na membranu, nije dao detektabilnu TCR signalizaciju i nije bio u stanju da posreduje u ubijanju T ćelija (Sl.23A-23B). Takođe je potvrđeno da je aktivnost TDB diktirana lokacijom epitopa i veličinom ekstracelularnog domena ciljanjem ćelija koje su eksprimirale jako skraćeni cilj koji je zadržao epitope 1G7 i gD (slika 23C). Aktivnost proksimalnog 1G7/UCHT1.v9 TDB povećana je za 25 puta (slika 23D; EC50 = 20 pM), a gD TDB je bio u stanju da efikasno posreduje u ubijanju ćelija (EC50 = 0,19 nM) kada je uklonjena smetnja koju izaziva ECD. Mogućnost diferencijalnog nivoa ekspresije cilja kao uzrok razlike u aktivnosti između ćelijskih linija isključena je FACS analizom (slika 24A).
Da bi se pokazalo da su razlike u aktivnostima ubijanja povezane sa epitopom, a ne da su svojstva specifičnih klonova antitela, testirano je ukupno pet jedinstvenih klonova antitela koji ciljaju proksimalni domen membrane za FcRH5 u TDB formatu i pokazalo se da je aktivnost svakog klona ~20 puta veća u poređenju sa 10A8 (slika 23E). Endogeni nivo
12
ekspresije FcRH5 kod multiplog mijeloma je nizak (npr. ~100 do ~2000 kopija/ćeliji) i uporediv je sa ćelijskom linijom mijeloma MOLP-2 (npr. ~2200 kopija/ćeliji). Kada su T ćelije ponovo targetovane da ubijaju MOLP-2 ćelije, samo membransko proksimalni TDB su indukovali ubijanje ćelija MOLP-2. Ciljanje srednjeg regiona FcRH5 korišćenjem 10A8 TDB nije dovelo do dovoljno visokog aktiviranja TCR potrebnog za ubijanje ćelija mijeloma (slika 24B).
F. FcRH5 TDB indukuje ćelijsko ubijanje zavisno od cilja i proliferaciju T ćelija Na slici 18A utvrđeno je da 1G7.v1.4 TDB i 1G7.v85 TDB imaju potpuno istu sposobnost aktiviranja T ćelija. 1G7.v85 TDB je procenjen na specifičnost epitopa 1G7 i unakrsnu reaktivnost sa cino (Sl.25A-25C). 1G7/38E4.v1 TDB („1G7 TDB“) vezaivao se za MOLP-2 ćelije, B ćelije zdravih donora, ćelije plazme koštane srži i ćelije tumora primarnog mijeloma u skladu sa očekivanim (Sl. 26A-26D). Pretklinička analiza aktivnosti 1G7 TDB započeta je karakterizacijom mehanizma delovanja koristeći CD8 ćelije zdravih donora. Tretiranje ćelija koje eksprimiraju cilj sa 1G7 TDB dovelo je do aktivacije T ćelije zavisne od doze (slika 27A). Citotoksična aktivnost 1G7 TDB bila je ekskluzivna za ciljanje pozitivnih ćelija i bila je u korelaciji sa nivoom ekspresije FcRH5 (slika 27B). Aktivacija T ćelija stimulacijom sa 1G7 TDB i ciljnom ćelijom dovela je do robusne proliferacije T ćelija. Za pet dana, 95% CD8 ćelija je prošlo čak šest ćelijskih deoba što je pokazano razblaživanjem fluorescentne boje CSFE (Sl. 27C-27E). Doprinos anti-CD3 kraka i Fc domena citotoksičnoj aktivnosti TDB je dalje procenjen, i utvrđeno je da je potreban anti-CD3 krak visokog afiniteta, dok Fc domen nije bio potreban, da bi se postigla citotoksična aktivnost (Sl.27F-27G).
G. FcRH5 TDB posreduje u snažnom ubijanju normalnih ćelija plazme i ćelija primarnog mijeloma dobijenih od pacijenta
Ekspresija FcRH5 u CD138+CD38+ ćelijama multiplog mijeloma i normalnim ćelijama plazme koštane srži proučavana je korišćenjem 1G7.v85 TDB i FACS. Sve tumorske ćelije dobijene od pacijenta i sve normalne plazma ćelije eksprimirale su FcRH5 u svim uzorcima, što ukazuje na 100% prevalenciju u mijelomu (slika 28A). Kod mijeloma je otkrivena značajna varijabilnost nivoa ekspresije između pacijenata. Generalno, nivo ekspresije u tumorskim ćelijama nije značajno povišen u poređenju sa normalnim ćelijama plazme, što sugeriše da razvoj FcRH5 TDB koji štedi normalne ćelije plazme i specifičan je za ćelije tumora, verovatno nije izvodljiv. Nivo ekspresije u normalnim B ćelijama je dosledno i znatno niži u poređenju sa normalnim ćelijama plazme i tumorskim ćelijama multiplog mijeloma.
Gen FcRH5 nalazi se u hromozomskoj tački prekida u 1q21 (Hatzivassiliou et al. Immunity. 14:277-289, 2001). Analiza ~20 biopsija primarnog multiplog mijeloma pokazala je
12
značajnu povezanost između ekspresije FcRH5 RNK i pojačanja 1q21 (slika 28E), što pokazuje da hromozomska translokacija može dovesti do prekomerne ekspresije FcRH5 kod pacijenata sa visokim rizikom od mijeloma.
Sposobnost 1G7.v85 TDB da ubije ćelije plazme analizirana je ciljanjem mononuklearnih ćelija koštane srži (BMMC) izolovanih iz aspirata koštane srži zdravih donora (slika 28B).1G7.v85 TDB indukovao je veoma efikasno i snažno (EC50 = 85-180 pM) ubijanje ćelija plazme zavisno od doze. Slična robusna aktivnost otkrivena je kada su BMMC pacijenata sa multiplim mijelomom podvrgnute tretmanu sa 1G7.v85 TDB (slika 28C). Blizu 100% ubijanja ćelija mijeloma otkriveno je sa visokom potentnošću (EC50 = 60-1200 pM) bez obzira na istoriju lečenja tokom života.
Kako je ekspresija FcRH5 promenljiva kod mijeloma (slika 28A) i aktivnost 1G7.v85 TDB je u korelaciji sa nivoom ekspresije (slika 28D), takođe je istraženo da li bi se očekivalo da pacijenti na donjem kraju spektra ekspresije imaju odgovor na FcRH5 TDB. MOLP-2 ćelijska linija mijeloma identifikovana je kao referentna ćelijska linija koja ima nivo ekspresije FcRH5 koji je sličan prosečnoj ekspresiji u ćelijama plazme i primarnim MM ćelijama (slika 28A). Takođe smo identifikovali nekoliko ćelijskih linija kancera koje eksprimiraju izuzetno nizak nivo cilja i odredili smo broj FcRH5 po ćeliji koristeći Skačardovu analizu. Raspon mesta vezivanja FcRH5 u ovim ćelijskim linijama varirao je od 2200 do čak samo 160 po ćeliji. Uprkos veoma malom broju ciljnih kopija, 1G7.v85 TDB izazvao je robusno ubijanje svih testiranih ćelijskih linija (EC50 = 2-230 pM). Proračuni zauzetosti ukazivali su da je samo ~50 molekula TDB (2% zauzetosti na MOLP-2; EC50 = 58 pM) bilo dovoljno da indukuje aktivaciju T ćelija i apoptozu ciljne ćelije.
Ukratko, FcRH5 se eksprimira kod svih pacijenata sa mijelomom. FcRH5 TDB mogu ubiti ćelije ljudske plazme i ćelije tumora primarnog mijeloma dobijene od pacijenta u pM dozama. Kako je veoma malo TDB potrebno za preusmeravanje aktivnosti T ćelija, molekul snažno ubija ćelije sa vrlo niskom ekspresijom cilja. Rezultati sugerišu da FcRH5 TDB imaju potencijal da budu široko aktivni kod pacijenata sa mijelomom i ne podržavaju isključivanje pacijenata iz terapije na osnovu nivoa ekspresije FcRH5.
H. Cinomolgus majmun (cino) je odgovarajući model za ispitivanje bezbednosti i efikasnosti FcRH5 TDB
FACS analiza perifernih B ćelija i plazma ćelija koštane srži potvrdila je da se FcRH5 eksprimira u celoj B ćelijskoj liniji kod cinomolgusa sličnih ljudima (Sl.29A-29B; Polson et al. Int. Immunol.18:1363-1373, 2006). Sekvence aminokiselina humanog i cino FcRH5 su 89% identične, a 1G7.v85 TDB se vezuje za cino FcRH5 i CD3 sa uporedivim afinitetom. In vitro
12
tretman ciljnih ćelija kojeeksprimiraju cino FcRH5 ili MOLP-2 ćelija koje eksprimiraju humani FcRH5 doveo je do snažnog ubijanja korišćenjem perifernih T ćelija čoveka ili cinomolgusa sa uporedivom efikasnošću (Sl.29C-29D). Dodavanje 1G7.v85 TDB u uzorke PBMC/BMMC cinomolgusa dovelo je do robusnog ubijanja cino B ćelija (slika 29E) i ćelija plazme koštane srži (slika 29F) zavisnim od doze. Na slici 18C, utvrđeno je da 1G7.v1.4 TDB i 1G7.v85 TDB imaju potpuno istu sposobnost ubijanja ćelija plazm e cinomolgusa. Ovi rezultati potvrđuju cinomolgusa kao odgovarajući model za ispitivanje bezbednosti i efikasnosti za anti-FcRH5/CD3.
Primer 4. In vivo karakterizacija reprezentativnih FcRH5 TDB
Materijali i metode
A. In vivo studije efikasnosti na mišjim modelima
a. huNSG/MOLP-2 model ksenografta miša
Ženke humanizovanih NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ (NOD/scid gama; NSG) miševa nabavljene su od The Jackson Laboratory. Na dan ćelijske inokulacije, pet životinja je inokulirano sa 0,2 ml tumorskih ćelija MOLP-2 u koncentraciji od 100 miliona ćelija/ml, u HBSS/matrigelu, supkutano u desni bok. Čim su zapremine tumora dostigle opseg zapremine od 100-250 mm<3>, životinje su randomizovane u dve grupe, grupu sa vehikulumom i terapijsku grupu, i prvi tretmani su tad primenjeni (0. dan). Svi tretmani su primenjivani jednom nedeljno intravenskom (i.v.) injekcijom u repnu venu, ukupno četiri doze. Grupa sa vehikulumom je tretirana sa 0,1 ml 20 mM histidin acetata, pH 5,5, 240 mM saharoze, 0,02% TW-20 pufera. Terapijska grupa je tretirana sa 0,1 ml 1G7.v85 TDB u koncentraciji od 0,5 mg/kg. Tumori su mereni 1-2 puta nedeljno pomičnim merilom tokom trajanja studije, a telesna težina životinja je merene najmanje jednom nedeljno. Tokom trajanja ove studije vršena su klinička zapažanja dva puta nedeljno radi praćenja zdravlja životinja.
B. Toksikološka studija kod majmuna cinomolgusa
Podnošljivost, profil toksičnosti, farmakokinetika (PK) i farmakodinamika (PD) anti-FcRH5 TDB procenjeni su kod naivnih mužjaka majmuna cinomolgusa (cino) u Charles River Laboratories (CRL). Cinomolgusi su tretirani jednom dozom, intravenskom infuzijom (1 h) vehikuluma, 1, 2 ili 4 mg/kg 1G7.v85 TDB i urađena im je nekropsija sedam dana nakon tretmana. Životinje su pažljivo praćene radi detaljnih kliničkih zapažanja, brzine disanja i telesne temperature tokom prvih pet sati i po završetku. Klinička zapažanja pored kaveza i merenje telesne težine su vršeni svakodnevno. Uzorci krvi prikupljeni su venepunkcijom putem femoralne vene pre studije i u odabranim terminima tokom studije za analize hematologije, hemije seruma, koagulacije i ukupnog nivoa antitela PK) i krajnjih tačaka PD. PD se sastojala
12
od merenja citokina (IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12/23, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, i MCP-1), protočne citometrije T-limfocita, B-limfocita, NK ćelija, aktiviranih T-limfocita, PD-1, i cirkulišućeg cino IgG. Koštana srž je sakupljena kod anesteziranih životinja aspiracijom iz predstudije humerusa i pre nekropsije 8. dana radi procene B-limfocita i plazma ćelija protočnom citometrijom. Prilikom nekropsije izmerena je težina organa, a odabrani organi i tkiva su temeljno ispitani bruto i mikroskopskim pregledom. Slezina, mezenterični i mandibularni limfni čvorovi procenjeni su na T-limfocite, B-limfocite i NK ćelije. Svi postupci su izvršeni u skladu sa Zakonom o dobrobiti životinja, Vodičem za negu i upotrebu laboratorijskih životinja i Kancelarijom za dobrobit laboratorijskih životinja.
C. PKPD studija kod majmuna cinomolgusa i miševa
Koncentracije FcRH5 TDB u serumu određene su generičkim ELISA testom. Ovčje anti-humano IgG antitelo je korišćeno kao reagens za hvatanje, a ovčji anti-humani IgG konjugovan sa peroksidazom rena (HRP) korišćen je kao reagens za detekciju. Analiza serumske koncentracije sa vremenom iz dostupnih uzoraka analizirana je nekompartmentalno sa modelom unosa i.v. bolusa (Phoenix™ WinNonlin<®>, verzija 6.3; Pharsight Corporation; Mountain View, CA). Nominalno vreme prikupljanja uzorka i nominalne koncentracije doze korišćene su u analizi podataka. Sve TK analize su zasnovane na podacima o pojedinačnim životinjama.
Rezultati
A. FcRH5 TDB potiskuje rast utvrđenih MOLP-2 tumora kod miševa rekonstituisanih sa humanim imunološkim ćelijama
Kreiranje modela aktivnosti FcRH5 TDB protiv mijeloma kod miševa je izazovno jer anti-CD3 antitela ne reaguju unakrsno sa mišjim CD3, a FcRH5 ortolog ne postoji kod miša. Stoga je model miša sa rekonstituisanim ljudskim imunološkim sistemom uspostavljen presađivanjem CD34+ odabranih ljudskih hematopoetskih matičnih ćelija u ozračene miševe (huNSG miševi). Ljudske CD8+ ćelije sakupljene iz slezine huNSG miševa mogle su da ubiju MOLP2 ćelije in vitro sa efikasnošću koja je uporediva sa humanim perifernim CD8+ ćelijama zdravih donora (slika 30A).20 nedelja nakon transplantacije, huNSG miševi su inokulirani sa pet miliona MOLP-2 ćelija supkutano. Miševi sa utvrđenim tumorima od 100-200 mm<3>tretirani su jednom i.v. dozom vehikuluma ili 0,5 mg/kg FcRH5 TDB. Tretman FcRH5 TDB doveo je do regresije tumora kod svih životinja (slika 30B), što pokazuje da tretman FcRH5 TDB suzbija rast tumora in vivo.
B. FcRH5 TDB ima dug poluživot u serumu
Studija pojedinačne doze dizajnirana je da proceni bezbednost, efikasnost,
1
farmakokinetička (PK) i farmakodinamička (PD) svojstva 1G7.v85 TDB kod nehumanih primata. Cinomolgusi su tretirani jednom sporom infuzijom intravenske doze vehikuluma ili 1-4 mg/kg 1G7.v85 TDB. Životinje su pažljivo praćene da bi se primetila neželjena dejstva. Uzorci krvi su prikupljeni nakon 0, 2, 6 i 24 h za analizu citokina, analizu kliničke patologije i PK/PD odgovor. Studija je prekinuta sedam dana nakon primene lečenja. FcRH5 TDB je pokazao proporcionalnu izloženost dozi (Cmax i AUC) između 1-4 mg/kg i imao je klirens 29-33 ml/dan/kg u svim kohortama (slika 31A), a Cmax na nivou doze od 4 mg/kg bio je 129 μg/ml. Ovo je ~2000 puta više nego što je potrebno da bi se postigao EC50 in vitro ubijanja za ćelije ljudske plazme i MOLP-2. PK studija je takođe sprovedena na SCID.bg miševima, koji nisu vezujući, i utvrđeno je da 1G7.v85 TDB ima uporedive stope klirensa kao anti-gD TDB (slika 31B). Proračuni zauzetosti receptora ukazuju na angažovanost FcRH5 blizu zasićenosti na ćelijama periferne krvi B na Cmax na svim nivoima doza (slika 32D). Ovi rezultati su pokazali da 1G7.v85 TDB ima dug in vivo poluživot i podržava nedeljni ili ređi raspored doziranja.
C. FcRH5 TDB iscrpljuje B ćelije i plazma ćelije koštane srži kod cino
FACS analiza periferne krvi pokazala je snažno farmakološko dejstvo na svim nivoima doze. Tretiranje sa 1G7.v85 TDB dovelo je do aktivacije T ćelija i prolazne limfopenije (marginacioni odgovor) u roku od 24 sata (Sl. 31C-31D). B ćelije su ostale nedetektabilne u krvi sedam dana nakon doze, što ukazuje na to da su iscrpljene putem 1G7.v85 TDB (slika 31E). Nasuprot tome, CD4+i CD8+ ćelije su se oporavile do kraja studije (Sl.32A-32B). Svi dozni nivoi doveli su do potpunog iscrpljivanja B ćelija u slezini i koštanoj srži (Sl.31F i 31H). Tretman sa FcRH5 je indukovao robusno iscrpljivanje B ćelija zavisno od doze i iz limfnih čvorova (Sl.31G i 32C).
Iscrpljivanje ćelija plazme koštane srži cinomolgusa in vivo je ključna krajnja tačka efikasnosti u pretkliničkom razvoju anti-FcRH5/CD3. Potpuno iscrpljivanje plazma ćelija otkriveno je kod životinja tretiranih dozama 2-4 mg/kg (slika 31I). Tretman sa 1G7.v85 TDB takođe je doveo do smanjenja cino IgG zavisnog od doze, što je očekivani sekundarni ishod koji je rezultat iscrpljivanja ćelija plazme. Teoretski, potpuno iscrpljivanje ćelija plazme treba da smanji nivo IgG ~30-40% do 7. dana. Izmereno smanjenje cino IgG bilo je 37% u grupi sa 2 mg/kg i 44% u grupi sa 4 mg/kg (slika 31J). Ukratko, 1G7.v85 TDB su indukovali robustan PD odgovor kod cinomolgusa, u skladu sa njegovim mehanizmom delovanja. Kompletno iscrpljivanje ćelija plazme pruža ubedljive dokaze o efikasnosti u mikrookruženju koštane srži.
D. FcRH5 TDB se dobro podnosi kod cino
1G7.v85 TDB je dobro podnošen kod cino na nivoima doze ≤ 4 mg/kg. Blaga i umerena
1 1
neželjena dejstva koja su otkrivena bili su slična na svim nivoima doza i nismo videli jasan odgovor na dozu. Klinička zapažanja su bila ograničena na reverzibilno povećanje telesne temperature u rasponu od 0,4-1,6 °C u roku od četiri sata nakon doze. Dejstvo na hematologiju se sastojalo od očekivane akutne i reverzibilne limfopenije koja se pripisuje marginaciji. Kao što se očekivalo, otkriveni su dokazi akutnog i reverzibilnog proinflamatornog stanja (povećani CRP, fibrinogen, protrombinsko vreme i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme). Lečenje je izazvalo reverzibilno povećanje ALT, AST i ukupnog bilirubina.
U skladu sa mehanizmom delovanja, 1G7.v85 TDB je indukovao brzo, uglavnom blago/umereno oslobađanje citokina (Sl.33A-33F). Svi nivoi doze izazvali su proinflamatorni odgovor (uključujući IL-6, IL-5, IFN-g, IL-2, IL-13, G-CSF i MCP-1) i antiinflamatorni odgovor da se suprotstavi ovom (IL1R) vrhuncu nakon 2-6 h. Svi citokini su se vratili na normalan nivo u roku od 24 sata. Nisu primećeni znakovi opsežnog ili produženog oslobađanja citokina. Opsežna histopatološka analiza, uključujući detaljnu analizu centralnog nervnog sistema (CNS), nije otkrila značajnu toksičnost po organe. Ukratko, maksimalna tolerisana doza nije dostignuta u studiji. 1G7.v85 TDB je dobro podnošen na nivoima doza za koje se očekuje da zasite cilj i dovoljni su za potpuno iscrpljivanje B ćelija i ćelija plazme. Nije otkriven odgovor na dozu kod neželjenih dejstava.
Primer 5. Kombinovane terapije FcRH5
Da bi se ispitale moguće kombinovane terapije FcRH5, FcRH5 TDB je testiran u kombinaciji sa svakim od dva reprezentativna antagonista vezivanja ose PD-1. Ovi eksperimenti su pokazali da, mada bi povratna signalizacija PD-1/PD-L1 mogla da smanji ubijanje posredovano sa FcRH5 TDB, blokada PD-L1 prevazišla je ovu inhibiciju, što je dovelo do poboljšane terapijske efikasnosti.
Materijali i metode
A. Antitela
Sva obeležena antitela za protočnu citometriju, osim onih koja su drugačije pomenuta, kupljena su od BD Bioscience. Anti-PD-1 antitelo koje je korišćeno je KEYTRUDA® (pembrolizumab), a anti-PD-L1 antitelo je generisano u Genentech, Inc. Kozji anti-humani IgG i kozji anti-mišji IgG kupljeni su od kompanije Jackson Immunoresearch. Anti-PC-FITC (klon Vs38c) kupljen je od kompanije DAKO.
B. Test indukcije i citotoksičnosti PD-1 sa anti-PD-L1
Sveže izolovane ljudske CD8+ T ćelije pomešane su sa MOLP-2 ćelijama u odnosu 1:1 i uzgajane zajedno u prisustvu 1000 ng/ml 1G7.v85 TDB tokom 48 sati. Ćelije su obojene anti-CD8 antitelom obeleženim fluorescein izotiocijanatom (FITC) („anti-CD8-FITC“), anti-CD69
1 2
antitelom konjugovanim sa fikoeritrinom (PE) („anti-CD69-PE“), i anti-PD-1 antitelom konjugovanim sa alofikocijaninom (APC) („PD-1-APC“), i analizirane su protočnom citometrijom. Testiranje citotoksičnosti ćelija HEK-293T koje eksprimiraju FcRH5 i PD-L1 („293-FcRH5-PD-L1 ćelije“) postavljen je, kao što je ovde generalno opisano, sa ili bez 10 mg/ml anti-PD-L1 ili anti-PD-1 antitela i analiziran protočnom citometrijom.
C. Ćelijska kultura i stvaranje stabilne ćelijske linije
Efekat PD-1/PD-L1 signalizacije na aktivnost 1G7.v85 TDB procenjen je infekcijom HEK-293T ćelija lentivirusom koji kodira FcRH5, nakon čega sledi transfekcija humanog plazmida koji kodira PD-L1 pomoću lipofektamina (Invitrogen).
D. In vitro testovi citotoksičnosti i aktivacije T ćelija
Ciljne ćelije su obeležene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) prema protokolu proizvođača (Life Technology, br. C34554). Ciljne ćelije obeležene CFSE-om i prečišćene CD8+ ćelije pomešane su u odnosu 3:1 efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama (E:T) i inkubirane sa 1G7.v85 TDB tokom 24 sata do 48 sati. Na kraju inkubacije, ćelije su analizirane protočnom citometrijom na uređaju FACSCalibur u formatu automatizacije. Broj živih ciljnih ćelija izračunat je izdvajanjem na CFSE+/Pi-negativne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat na sledeći način: % citotoksičnost (živi broj ciljnih ćelija bez TDB - živi broj ciljnih ćelija sa TDB) / (živi broj ciljnih ćelija bez TDB) X 100.
Rezultati
A. PD-1/PD-L1 blokada pojačava aktivnost FcRH5 TDB
Snažan TCR stimulacioni signal može dovesti do imunosupresivnih povratnih informacija koje ograničavaju aktivnost T ćelija. PD-1/PD-L1 put je kritična komponenta ove povratne sprege i terapeutski potvrđeni mehanizam imunološkog bekstva kod nekoliko indikacija tumora. PD-L1 se često eksprimira od strane ćelija tumora mijeloma (Gorgun et al. Amer. Assoc, for Cancer Res. 21:4607-4618, 2015), a njegova signalizacija može ograničiti aktivnost T ćelija kod pacijenata sa mijelomom. PD-1 je odsutan kod T ćelija u mirovanju, indukovanje nakon aktivacije T ćelija i ograničava aktivnost T ćelija kod hronične infekcije (Zou et al. Science Tran. Med. 8:328rv324, 2016). Stimulacija (48 h) putem 1G7.v85 TDB CD8+ ćelija zdravih humanih donora u prisustvu ćelija koje eksprimiraju FcRH5 dovela je do značajne indukcije PD-1 u T ćelijama (slika 34). Povrtani signal se takođe aktivira in vivo. Značajno povećanje PD-1-pozitivnih T ćelija primećeno je u cino T ćelijama pri svim nivoima doze. PD-1 indukcija je otkrivena kod CD8+ kao i CD4+ ćelija u krvi, slezini, limfnim čvorovima i koštanoj srži (Sl.35A-35B i 36A-36D).
1G7.v85 TDB-posredovano ubijanje ciljnih ćelija sa kondicioniranim CD8+ ćelijama
1
procenjeno je u prisustvu i odsustvu antagonista PD-1/PD-L1. Efikasnost 1G7.v85 TDB u kondicioniranju CD8+T ćelija za ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju PD-L1 bila je skromna (slika 37A). Blokiranje PD-1/PD-L1 signalizacije korišćenjem anti-PD-L1 antitela značajno je povećalo efikasnost ubijanja posredovanog sa 1G7.v85 TDB (slika 37A). U konkretnom eksperimentu, kondicionirane CD8+ ćelije su pomešane sa 293-FcRH5-PD-L1 ćelijama i tretirane sa 1G7.v85 TDB samostalno, ili u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom ili anti-PD-1 antitelom (pembrolizumab) (slika 37B). Kombinovani tretman sa anti-PD-L1 antitelom ili anti-PD-1 antitelom (pembrolizumab) značajno je poboljšao efikasnost 1G7.v85 TDB. EC50 za obe kombinovane metode lečenja bio je 0,4 ng/ml, dok je EC50 za lečenje samo sa 1G7.v85 TDB bio 0,63 ng/ml (slika 37B).
Ovi rezultati pokazuju da 1G7.v85 TDB-posredovana aktivacija T ćelija dovodi do indukcije PD-1 u T ćelijama in vitro i in vivo. Ovi rezultati dalje pokazuju da PD-1/PD-L1 signalizacija može ograničiti FcRH5 TDB posredovano ubijanje i da blokada PD-L1 može prevazići ovu inhibiciju i dovesti do poboljšane efikasnosti. Ovi podaci podržavaju upotrebu FcRH5 TDB u kombinaciji sa antagonistom vezivanja ose PD-1, kao što je anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-L1 antitelo.
B. Deksametazon smanjuje odgovor citokina na prvu dozu bez uticaja na aktivnost FcRH5 TDB
Ubijanje ciljnih ćelija takođe je procenjeno u prisustvu i odsustvu deksametazona (Deks), komponente standardne nege kod mijeloma koja ima antiinflamatorno i imunosupresivno dejstvo (slika 38A). IC50 za 1G7.v85 TDB u puferu ili u DMSO bio je 7 pM, odnosno 6 pM. U prisustvu 0,1 μM ili 1 μM deks, IC50 za 1G7.v85 TDB bio je 16 pM, odnosno 25 pM. Kombinovano lečenje sa deksametazonom imalo je samo skroman efekat na efikasnost 1G7.v85 TDB i značajno je smanjilo nivoe IL-2, IL-6, TNF-α, i IFN-γ. Ovi rezultati pokazuju da se deksametazon može koristiti u kombinaciji sa FcRH5 TDB terapijom za ublažavanje odgovora citokina na prvu dozu kod pacijenata (slika 38B).
Primer 6. Proizvodnja i ispitivanje FcRH5 bis-Fab
A. Priprema tio-Fab i šarka-cis-Fab i proizvodnja proteina
Da bi se pripremili fragmenti antitela sa slobodnim sulfhidrilnim grupama, supstitucije cisteina (Cys) uvedene su u konstrukte antitela na različitim pozicijama u varijabilnim ili konstantnim domenima lakih lanaca ili teških lanaca mutagenezom usmerenom na lokaciju kako bi se stvorila tio-mAb, kao što je prethodno opisano u Junutula et al. J. Immunol Methods 332(1-2):41-52, 2008. Tio-Fab su enzimski generisani iz tio-mAb razblaživanjem tio-mAb do 1 mg/ml u 25 mM Tris, pH 8,0, zatim enzimskom digestijom na 37 °C tokom 1 sata korišćenjem
1 4
Lys-C (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA) u odnosu 1:1000 (m:m) enzima i antitela. Lys-C digestija je zaustavljena sa 5 μM inhibitorom proteaze tozil-L-lizin hlormetil ketonom (TLCK) (Bachem, Torrence, CA) i prečišćena katjonskoizmenjivačkom hromatografijom na 5 ml Hi-Trap SP FF koloni (GE Healthcare, Piscataway, NJ) koristeći 50 mM natrijum acetatni pufer i gradijent 0-300-mM NaCl 10 zapremina kolone (CV). Tio-Fab proizvedeni ovom metodom ovde se ponekad nazivaju „enzimski tio-Fab“. U drugom pristupu, konstrukti DNK koji kodiraju Fab koji imaju konstruisani Cys ostatak ili konstrukti DNK koji kodiraju fragmente teškog lanca koji sadrže jedan izvorni Cys ostatak u regionu šarke, bili su subklonirani u ekspresione vektore plazmida i eksprimirani direktno u CHO ćelijama. Tio-Fab proizvedeni ovom metodom se ovde ponekad nazivaju „rekombinantni tio-Fab“. Treći pristup je korišćen za antitela kojima nedostaje konstruisani Cys ostatak i oslanjao se na nativne Cys ostatke prisutne u regionu šarke IgG. Ova metoda se koristi za proizvodnju „šarka-cys-Fab“ i detaljnije je opisana u nastavku.
Za pripremu šarka-cys-Fab od nativnih antitela koja ne sadrže konstruisani cistein za upotrebu u reakcijama sinteze, korišćen je sledeći enzimski postupak, kao što je prikazano na panelu 1 na slici 39. FcRH5 i CD3 matična antitela su digestirana sa pepsinskim (1% m/m) tretmanom u natrijum acetatnom puferu na pH 4,5. Nakon digestije tokom 1 sata, F(ab')2je izolovan iz digestivne smeše hvatanjem na SP-HP katjonizmenjivačkoj smoli i prečišćen sa 10 CV gradijentom soli od 0-1 M NaCI. F(ab')2je zatim redukovan u puferu koji sadrži 25 mm MES, pH 5,8, 2 mM EDTA i 300 mM NaCI. Nakon redukcije sa 1 mM TCEP, Fab su oksidovani, kao što je prikazano na panelu 2 Sl. 39, dodavanjem 5 mM DHAA za ponovni nastanak disulfida između teškog lanca i lakog lanca. Rutinski je primećeno da se, pod ovim uslovima reakcije, ponovo formira samo disulfid između teškog lanca i lakog lanca; dva cisteinska ostatka u regionu šarke ostala su neoksidisana.
Dva slobodna tiola (Cys ostaci) na regionu šarke, kao što je prikazano na panelu 2 slike 39, zatim su reagovala sa 1 M ekvivalentom N-etilmaleimida (NEM) (Sigma Aldrich, Sent Louis, MO). Dobijena smeša koja sadrži pojedinačno modifikovane, dvostruko modifikovane i nemodifikovane Fab je zatim reagovala, kao što je prikazano na panelu 3 slike 39, sa viškom bis-maleimidnog umreživača.
Ovi uslovi reakcije dali su tri proizvoda: Fab sa jednim umreživačem i jednim NEM, Fab sa dva NEM, i Fab koji sadrže samo jedan umreživač. Utvrđeno je da Fab koji sadrži samo jedan umreživač nemaju slobodni cistein. Dakle, pod ovim reakcionim uslovima, jedan umreživač je vrlo efikasno reagovao sa oba cisteina što je dalo molekul u kojem je cistein cikliziran pomoću umreživača. Materijal koji sadrži gornja tri reakciona proizvoda je prečišćen
1
iz reakcione smeše (radi uklanjanja neželjenih reakcionih komponenata) filtracijom gela i korišćen u kuplovanju sa drugim šarka-cys-Fab, kao što je prikazano na panelu 4 slike 39, pripremljenim na sličan način ili sa tio-Fab. Samo cys-Fab šarke ili tio-Fab pripremljeni kako je opisano i koji sadrže jedan umreživač, jedan slobodni maleimid i jedan slobodni sulfhidril mogli su da reaguju u reakcijama sinteze bis-Fab koje su detaljno opisane u nastavku.
B. Ekspresija i prečišćavanje proteina
Da bi se olakšalo prečišćavanje, Fab su eksprimirani sa Flag- ili His-oznakom. Ekspresija u CHO ćelijama je izvršena standardnim procedurama. Afinitetno prečišćavanje nakon uzgajanja ćelija izvršeno je korišćenjem anti-Flag mAb smole ili smole od perlica nikla. Prečišćeni tio-Fab su okarakterisani pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije. Ove karakterizacije su često pokazivale povećanja mase od 275 Da i 306 Da. Utvrđeno je da su ova povećanja mase disulfidni adukti na nesparenom cisteinu koji su uklonjeni redukcijom i oksidacijom kako bi se pripremili tio-Fab za umrežavanje sa bis-maleimidom. Redukcija i oksidacija tio-Fab je izvršena na sledeći način. Prvo, tio-Fab su redukovani tokom 24 sata dodavanjem 2 mM tris (2-karboksietil) fosfin HCI (TCEP-HCI; takođe se naziva TCEP) (Pierce [Thermo Fisher Scientific], Rockford, IL) u puferu koji sadrži 25 mM MES, pH 5,8, 300 ml NaCI i 5 mM EDTA. Nakon redukcije, protein je oksidisan dodavanjem 5 mM dehidroaskorbinske kiseline (DHAA) (Sigma-Aldrich, Sent Louis, MO). Izolovani tio-Fab su analizirani putem SDS-PAGE i masene spektrometrije kako bi se osiguralo da su proteini pravilno redukovani i oksidisani.
C. Sinteza Bis-Fab
Dve različite vrste umreživača mogu da se koriste za kovalentno vezivanje dva Fab: bis-maleimida i para adaptera DBCO-PEG-malemid/bromacetamid-PEG-azid.
Konjugacija pomoću bis-maleimidnih umreživača
U prvoj fazi sinteze bis-Fab korišćeni su tio- Fab ili šarka-cys-Fab sa nesparenim cisteinom. Generalno, tio-Fab ili šarka-cys-Fab bio je u istom puferu u kojem je izvršena redukcija (slika 39, panel 1) i oksidacija (slika 39, panel 2) (MES, pH 5,8, 2 mM EDTA i 300 mM NaCI) pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml. U ovoj fazi postojala su dva potencijalna neželjena proizvoda reakcije: disulfidni dimeri i umreženi dimeri. Koncentracija proteina od 1 mg/ml u ovoj fazi sinteze bila je važna karakteristika reakcije jer je dimerizacija svedena na minimum pri toj koncentraciji proteina. Pored toga, kontrola reakcije korišćenjem pufera niskog pH sa EDTA pomogla je da se smanji dimerizacija.
Petostruki višak bis-maleimidnog umreživača (Quanta BioDESign, Powell, OH) dodat je u reakcionu smešu, kao što je prikazano na panelu 3 na slici 39. Ovaj petostruki višak
1
umreživača takođe je bio od pomoći u smanjenju neželjene dimerizacije. Reakcija je inkubirana na sobnoj temperaturi (RT) ili 37 °C tokom četiri sata do završetka. Smeša je zatim koncentrovana do zapremine pogodne za gel filtraciju. Korišćena je S-200 Tricom kolona od 22 ml (GE Healthcare, Piscataway, NJ) za sintezu količine μg do mg. Ovaj prvi korak gel filtracije omogućio je uklanjanje neiskorišćenog umreživača što daje prečišćeni tio-Fab ili šarka-cys-Fab konjugovan sa umreživačem. Gore opisani uslovi obično su dali najmanje 90% ili više željenog proizvoda. Nijedan tio-Fab ili šarka-cys-Fab nije ostao slobodni tiol jer su svi bili konjugovani sa umreživačem ili vezani disulfidom na drugi tio-Fab ili šarka-cys-Fab preko nesparenih cisteina. Izolovani i prečišćeni tio-Fab (ili šarka-cys-Fab) plus vrste umreživača zatim su dodati u drugi tio-Fab (ili šarka-cys-Fab) i koncentrovani do 5 mg/ml ili više, generalno do zapremine pogodne za gel filtraciju, kao što je prikazano na panelu 4 slike 39. Koncentracija proteina od najmanje 5 mg/ml tokom ove faze sinteze bila je važna za pokretanje reakcije do završetka. Niže koncentracije proteina dovele su do stvaranja samo malih količina umreženih bis-Fab dimera. Bez ograničavanja na teoriju, pretpostavljeno je da je sterni efekat ili promenljiva vezana za viskoznost koja je ometala formiranje umreženih bis-Fab dimera nadvladana povećanjem koncentracija reaktanasa. Pored toga, testiran je niz koncentracija proteina sve do, i uključujući, 65 mg/ml. Pronađena je korelacija između koncentracije proteina i vremena reakcije tako da, što je veća koncentracija proteina, brže je reakcija dostigla završetak. Nakon 2-24 sata na sobnoj temperaturi ili 37 °C, reakcija je završena kako je određeno masenom spektrometrijom. Generalno, jedan reagens je bio u višku i ostao je nekuplovan u konačnoj smeši.
Konjugacija pomoću DBCO-PEG-malemida/bromacetamid-PEG-azida
Jedan od prečišćenih i deblokiranih Fab je reagovao u 5 molarnom višku DBCO-PEG-malemida (br.760676, Sigma) u 50 mM HEPES pH 8 dok je drugi Fab reagovao sa 5 molarnim viškom azid-PEG-maleimida (br. 21097 BroadPharm) u 50 mM HEPES pH 8. Nakon jednočasovne inkubacije na 37 °C, reakcija je proverena masenom spektrometrijom da bi se potvrdio završetak reakcije. Konjugovani Fab su prečišćeni od viška umreživača pomoću SEC i naknadno pomešani u odnosu 1:1 i podešeni na koncentraciju iznad 5 mg/ml i inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi.
Bez obzira na korišćeni umreživač, završena reakcija je ponovo prečišćena gel filtracijom; ovog puta je sakupljen dimerni pik, koji je sadržao 100 kD bis-Fab ireverzibilno umrežen preko slobodne aminokiseline cisteina (u slučaju tio-Fab) ili preko nesparenog cisteina koji se nalazi u regionu šarke (u slučaju nekonstruisanih šarka-cys-Fab). Napredak reakcije tokom oba koraka često je praćen masenom spektrometrijom koja je jasno pokazala
1
prisustvo oba reaktanta i formiranje bis-Fab proizvoda. Čistoća željenog proizvoda nakon druge gel filtracije određena je masenom spektrometrijom i SDS-PAGE. Nakon redukcije i SDS-PAGE analize, ireverzibilno umrežavanje je primećeno na osnovu prisustva opsega 50-kD koji predstavlja umrežene lance koji ne mogu da se redukuju. Koristeći gore opisani postupak u malom obimu, obično su postignuti mikrogramski prinosi sa mikrogramskim količinama polaznih materijala. Pored toga, u većem obimu obično su postignuti miligramski prinosi od miligramskih količina polaznih materijala.
D. Sinteza bis-Fab koji ciljaju CD3 i FcRH5
Stvoreni su bispecifični bis-Fab dobijeni iz dva različita antitela koji ciljaju CD3 i FcRH5. Anti-CD3 matično antitelo koje se koristi može biti bilo koje anti-CD3 antitelo, kao što je 38E4v.1, 38E4.v11 ili 40G5. U jednom otelotvorenju, bis-Fab koristi 38E4.v1 kao anti-CD3 komponentu, sa sekvencom lakog lanca SEQ ID NO: 134 i sekvencom teškog lanca SEQ ID NO: 133. Korišćeno matično antitelo anti-FcRH5 antitela takođe može biti bilo koje anti-FcRH5, na primer, antitela koja su ovde opisana kao što su hu1G7.v85 i hu1G7.v87. Konkretno, jedan primer bis-Fab uključuje varijabilnu sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 105 i varijabilnu sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 104.
Za svako od ovih antitela, rekombinantni tio-Fab su proizvedeni u CHO ćelijama kao što je gore opisano. Zatim su bis-Fab sintetisani od tio-Fab u kombinatornom formatu koristeći matricu sinteze, počevši od približno 2 mg svakog tio-Fab. Različiti tio-Fab su kombinovani da sintetišu četiri jedinstvena bis-Fab molekula. Približno jedan mg svakog bis-Fab je rekuperisan iz sinteze za prikazane primere, ali se očekivalo da prinosi variraju u zavisnosti od različitih tio-Fab. Svaki od bis-Fab dobio je jedinstveni identifikator. Čistoća svakog bis-Fab analizirana je pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije koristeći standardne metode dobro poznate u struci.
Koristeći gore opisani pristup rekombinacije matrice, sintetisan je niz strukturnih varijanti bis-Fab izvedenih od CD3 i FcRH5. Za sintezu bis-Fab izabrane su četiri različite tačke vezivanja; jedna od pozicija je bila u teškom lancu anti-CD3 tio-Fab kraka (npr. na poziciji 76 (Cys76HC)), jedna pozicija je bila u lakom lancu anti-CD3 tio-Fab kraka (npr. na poziciji 22 (Cys22LC)), jedna od pozicija je bila u teškom lancu anti-FcRH5 tio-Fab kraka (npr. na poziciji 114 (Cys114HC)) a jedna pozicija je bila u lakom lancu anti-FcRH5 tio-Fab kraka (npr. na poziciji 149 (Cys149LC)). Ostale pozicije mogu da se koriste za umetanje potrebnih cisteina. Fab koji sadrže tio-tačke vezivanja izvedeni su iz tri različita izvora; (1) tio-mAb sa cisteinskim supstitucijama koje su digestovane sa lizinom-C da bi se tio-Fab oslobodio iz antitela, (2) tio-Fab sa cisteinskim supstitucijama koji su direktno eksprimirani i prečišćeni iz
1
CHO ćelija, i (3) šarka-cys-Fab koji su generisani enzimskom metodom opisanom gore za vezivanje jednog umreživača na region šarke nekonstruisanog antitela nakon digestije pepsinom. Ovaj pristup je dao različite tačke supstitucije u tio-Fab za rekombinaciju sa drugim tio-Fab, što daje strukturne varijante (vidite tabelu 15).
Tabela 15. Pozicija konstruisanih Cys u svakom Fab i odgovarajući brojevi bis-Fab
E. Biološka aktivnost FcRH5 Bis-Fab
Zatim je svaka od strukturnih varijanti bis-Fab testirana na sposobnost vezivanja za svaki od antigena (tj. CD3 i FcRH5) pomoću ELISA testa. Bis-Fab generisan povezivanjem Cys u regionu šarke podsećao je na arhitekturu prirodnog antitela i služio je kao kontrola. Dok su svi bis-Fab konstrukti imali sličnu sposobnost vezivanja za FcRH5 (slika 40A), većina bis-Fab je pokazala smanjeno vezivanje za CD3 u poređenju sa referentnim bis-Fab (slika 40B). Biološka aktivnost je procenjena u in vitro testu aktivacije T ćelija koji je služio kao surogat za aktivnost ubijanja T ćelija (slika 41). Ovaj test je koristio ćelijsku liniju Jurkat (Jurkat-Dual, Invivogen) stabilno transficiranu sa reporterom luciferaze pod kontrolom transkripcionog faktora NF-kB, a prednost korišćenja ovog testa u odnosu na test ubijanja T ćelija bila je što se može koristiti neograničen broj ćelija. U testovima ubijanja ćelija PBMC, broj testova je bio ograničen brojem ćelija koje su se mogle dobiti od jednog donora. Test je izvršen na sledeći način. Odgovarajuća ćelijska linija, kao što je MOLP-2, izabrana je kao ciljna ćelija i uzgajana zajedno sa Jurkatovim ćelijama. Po bunarčiću je dodato 10.000 ciljnih ćelija ćelijske linije i 50.000 efektorskih ćelija (Jurkat) (10.000 ciljnih ćelija po bunarčiću, ukupna zapremina 200 μl, sa odnosom cilj:efektor = 1:5), sa prisustvom ili bez prisustva bis-Fab. Nakon inkubacije preko noći, 10 μl supernatanta iz različitih bunarčića je ispitano na aktivnost luciferaze koristeći 50 μl QUANTI-LUC (Invivogen), a luminiscencija je kvantifikovana na luminometru Envision (Perkin Elmer).
Zanimljivo je da, iako HVR sekvence svake varijante bis-Fab generisane za anti-CD3 ili anti-FcRH5 nisu izmenjene u stvaranju samih bis-Fab, maksimalna količina stimulacije T-ćelija primećena za svaki bis-Fab se razlikovala između bis-Fab, jednostavno u zavisnosti od
1
npozicije cisteinskog konstruisanog umrežavanja. Bez ograničavanja na teoriju, ovo može imati implikacije na to kako se toksičnost i/ili potencija bis-Fab mogu modulisati tako da odgovaraju određenoj terapijskoj ili dijagnostičkoj potrebi. Drugo zapažanje je bilo da su neki bis-Fab (npr. bis-Fab C) imali značajno smanjen afinitet prema CD3, ali su imali aktivnost aktiviranja T ćelija uporedivu sa aktivnošću referentnog F(ab’)2A (Sl.40B i 41, tabela 15).
F. Biološka aktivnost FcRH5 bis-Fab korišćenjem endogenih ljudskih B ćelija Svaka varijanta bis-Fab testirana je na biološku efikasnost u bis-Fab testu ubijanja zavisnom od T ćelija na ubijanje perifernih endogenih B ćelija, na sledeći način: Po bunarčiću je dodato je 200.000 hPBMC-a po bunarčiću, izolovanih od svakog od tri zdrava donora sa bis-Fab ili bez njega. Nakon inkubacije od 48 sati, ćelije su obojene odgovarajućim ćelijskim površinskim antigenom ciljne ćelijske linije (B ćelije = CD20) (5 μl/bunarčiću) i propidijum jodidom za procenu održivosti ćelija, a zatim su analizirane pomoću FACS-a. Aktivnosti ubijanja zavisnog od bis-Fab izračunate su prema sledećoj jednačini: % ubijanja = (1-broj živih ćelija sa bis-Fab/broj živih ćelija bez bis-Fab) x 100. Kao pozitivna kontrola, korišćen je F(ab')2koji je izveden iz FcRH5 TDB antitela sa mutacijom „dugme u rupici“ pri čemu su anti-CD3 i anti-FcRH5 kraci svakog Fab imali istu sekvencu kao i oni koji se koriste za testirane bis-Fab (osim što nema mutacija tačke modifikovanih cisteinom) (vidite npr. Ridgway et al. Protein Eng., 9:617-621, 1996). Generalno, pokazalo se da su podaci mogu reproduktivni, uprkos korišćenju različitih ćelija donora.
Količine FcRH5 bis-Fab koje su ovde testirane potrebne za polumaksimalnu lizu perifernih endogenih humanih B ćelija, ili EC50 vrednost potencije izražene u ng/ml, izračunate su za svaki prethodno testirani bis-Fab. Sve u svemu, očekivalo se da će trendovi potentnosti za svaki bis-Fab testiran u testu endogenih humanih B ćelija pratiti rezultate utvrđene u gore opisanom ELISA testu (Sl.40A-40B).
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
�
��
�
�

Claims (43)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antitelo nalik na anti-Fc receptor 5 (FcRH5) ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5, pri čemu anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 sadrži vezujući domen koji sadrži:
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105;
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107;
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85;
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87;
(e) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89:
(f) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91;
(g) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93;
(h) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97;
(i) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99; ili
(j) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101.
2. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 1, pri čemu se anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 vezuje za epitop u Ig-sličnom domenu 9 FcRH5.
3. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 2, pri čemu epitop sadrži deo aminokiselina 745-850 SEQ ID NO: 114.
4. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 sadrži mutaciju mesta aglikozilacije.
5. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema
2
zahtevu 4, pri čemu, mutacija mesta aglikozilacije je supstituciona mutacija na aminokiselinskom ostatku N297, D265 i/ili P329 prema EU numeraciji.
6. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 4 ili 5, pri čemu, mutacija mesta aglikozilacije je supstituciona mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, D265A i P329G.
7. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 6, pri čemu, mutacija supstitucije je supstituciona mutacija N297G.
8. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo je monoklonsko, humanizovano ili himerno antitelo.
9. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 8, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo je humanizovano antitelo.
10. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od zahteva 1-9, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo je antitelo kompletne dužine.
11. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od zahteva 1-10, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 je multispecifično antitelo.
12. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 11, pri čemu, multispecifično antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži drugi vezujući domen koji vezuje klaster diferencijacije 3 (CD3).
13. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 12, pri čemu drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR:
(a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115;
(b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116;
(c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117;
(d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118;
(e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i
(f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120, ili pri čemu drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR:
(a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115;
(b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116;
(c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121;
(d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118;
(e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119; i
(f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123.
14. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 12, pri čemu drugi vezujući domen sadrži:
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i
(b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.
15. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 12, pri čemu drugi vezujući domen sadrži:
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i
(b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.
16. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 12, pri čemu drugi vezujući domen sadrži:
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153 i
(b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154.
17. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 12, pri čemu drugi vezujući domen sadrži:
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172 i
(b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173.
18. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo kom od zahteva 1-9 i 11-17, pri čemu, fragment antitela koji vezuje FcRH5 je izabran iz grupe koja se sastoji od fragmenata bis-Fab, Fab, Fab'-SH, Fv, scFV i (Fab')2.
19. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od zahteva 12-17, pri čemu anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 sadrži jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, i pri čemu, jedan ili više konstantnih domena teškog lanca su izabrani od prvog CH2 domena (CH21), prvog CH3 domena (CH31), drugog CH2 domena (CH22) i drugog CH3 domena (CH32).
20. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 19, pri čemu, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca je uparen sa drugim konstantnim domenom teškog lanca.
21. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 20, pri čemu CH31i CH32sadrže izbočinu (P1) ili šupljinu (C1), i pri čemu je P1ili C1u CH31može da se pozicionira u C1, odnosno P1u CH32.
22. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema zahtevu 21, pri čemu, CH31i CH32se sreću na međupovršini između P1i C1.
23. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz zahteva
2
21 ili 22, pri čemu P1sadrži mutaciju supstitucije T366W prema EU numeraciji.
24. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od zahteva 21-23, pri čemu C1sadrži mutacije supstitucije T366S, L368A i Y407V prema EU numeraciji.
25. Jedna ili više izolovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-FcRH5 antitelo ili fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo kom od zahteva 1-24.
26. Jedan ili više vektora koji sadrže jednu ili više izolovanih nukleinskih kiselina prema zahtevu 25.
27. Imunokonjugat koji sadrži anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo kom od zahteva 1-24 i citotoksični agens.
28. Kompozicija koja sadrži anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 iz bilo kog od zahteva 1-24, koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili razblaživač.
29. Kompozicija prema zahtevu 28, pri čemu kompozicija dalje sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens.
30. Kompozicija prema zahtevu 29, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1, antagonista vezivanja PD-1 i antagonista vezivanja PD-L2.
31. Kompozicija prema zahtevu 30, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-L1, opciono pri čemu je antagonist vezivanja PD-L1 izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) i MSB0010718C (opelumab), opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je MPDL3280A (atezolizumab).
32. Kompozicija prema zahtevu 30, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-1, opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 i REGN2810.
33. Kompozicija prema zahtevu 30, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-L2, opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin.
34. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo kom od zahteva 1-24 za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije FcRH5-pozitivnog kancera kod ispitanika kome je to potrebno.
35. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 prema bilo
2
kom od patentnih zahteva 1-24 za upotrebu u poboljšanju imunološke funkcije kod ispitanika koji ima FcRH5-pozitivan kancer.
36. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 34 ili 35, pri čemu, FcRH5-pozitivan kancer je B ćelijski kancer.
37. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 34-36, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 se primenjuje na ispitaniku u dozi od oko 0,01 mg/kg/ned do oko 50 mg/kg/ned.
38. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 34-37, pri čemu, anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 treba primeniti na ispitaniku sa antagonistom vezivanja PD-1 ose i/ili dodatnim terapeutskim sredstvom.
39. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 38, pri čemu antagonist vezivanja PD-1 ose i/ili dodatno terapeutsko sredstvo treba primeniti pre, istovremeno sa, ili nakon primene anti-FcRH5 antitela ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje FcRH5.
40. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 38 ili 39, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1, antagonista vezivanja PD-1 i antagonista vezivanja PD-L2.
41. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 40, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-L1, opciono pri čemu je antagonist vezivanja PD-L1 izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durmavalumab), i MSB0010718C (avelumab), opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je MPDL3280A (atezolizumab).
42. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 40, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-1, opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 i REGN2810.
43. Anti-FcRH5 antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje FcRH5 za upotrebu prema zahtevu 40, pri čemu, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-L2, opciono pri čemu, antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin.
2 1
RS20230879A 2015-06-16 2016-06-16 Humanizovana i afinitetno sazrela antitela na fcrh5 i postupci upotrebe RS64662B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562180459P 2015-06-16 2015-06-16
EP16733812.8A EP3310814B1 (en) 2015-06-16 2016-06-16 Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
PCT/US2016/037879 WO2016205520A1 (en) 2015-06-16 2016-06-16 Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64662B1 true RS64662B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=56292933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230879A RS64662B1 (sr) 2015-06-16 2016-06-16 Humanizovana i afinitetno sazrela antitela na fcrh5 i postupci upotrebe

Country Status (32)

Country Link
US (4) US10323094B2 (sr)
EP (2) EP4299073A3 (sr)
JP (4) JP6871874B2 (sr)
KR (2) KR102763347B1 (sr)
CN (2) CN114507289A (sr)
AR (3) AR105026A1 (sr)
AU (3) AU2016280102B2 (sr)
CA (1) CA2986928A1 (sr)
CL (2) CL2017003195A1 (sr)
CO (1) CO2018000244A2 (sr)
CR (1) CR20180031A (sr)
DK (1) DK3310814T5 (sr)
ES (1) ES2957567T3 (sr)
FI (1) FI3310814T3 (sr)
HR (1) HRP20231134T1 (sr)
HU (1) HUE063270T2 (sr)
IL (3) IL256079B2 (sr)
LT (1) LT3310814T (sr)
MA (1) MA42428B1 (sr)
MX (3) MX388965B (sr)
MY (1) MY189840A (sr)
PE (2) PE20180330A1 (sr)
PH (1) PH12017502354A1 (sr)
PL (1) PL3310814T3 (sr)
PT (1) PT3310814T (sr)
RS (1) RS64662B1 (sr)
RU (1) RU2748943C2 (sr)
SI (1) SI3310814T1 (sr)
TW (3) TWI876687B (sr)
UA (1) UA124615C2 (sr)
WO (1) WO2016205520A1 (sr)
ZA (2) ZA201707934B (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
EA201891502A1 (ru) 2013-02-26 2018-12-28 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
TWI725931B (zh) 2013-06-24 2021-05-01 美商建南德克公司 抗ｆｃｒｈ５抗體
KR102357961B1 (ko) 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
KR102411972B1 (ko) 2014-08-04 2022-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
CN107074955B (zh) 2014-11-20 2021-06-22 豪夫迈·罗氏有限公司 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
LT3789402T (lt) 2014-11-20 2022-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompleksinė terapija, naudojant t ląsteles aktyvinančias bispecifines antigeną surišančias molekules ir pd-1 ašį surišančius antagonistus
ES2744540T3 (es) 2014-12-05 2020-02-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-CD79b y procedimientos de uso
US10323094B2 (en) 2015-06-16 2019-06-18 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
IL257696B2 (en) 2015-12-09 2024-11-01 Hoffmann La Roche Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
FI3433280T3 (fi) 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
BR112020000566A2 (pt) 2017-07-28 2020-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag formulação farmacêutica, uso da formulação e invenção
TW201925782A (zh) 2017-11-30 2019-07-01 瑞士商諾華公司 靶向bcma之嵌合抗原受體及其用途
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
TWI848951B (zh) 2018-06-01 2024-07-21 瑞士商諾華公司 針對ｂｃｍａ之結合分子及其用途
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
MX2021007672A (es) * 2018-12-24 2021-09-30 Sanofi Sa Proteinas de union multiespecificas con dominios fab mutantes.
CN119661722A (zh) 2019-02-21 2025-03-21 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
EP3927747A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
JP2022542431A (ja) * 2019-07-30 2022-10-03 キューエルエスエフ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド 二重特異性抗ｌｒｒｃ１５及びｃｄ３イプシロン抗体
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
TWI852680B (zh) 2020-06-19 2024-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與 cd3 及 cd19 結合之抗體
TWI888665B (zh) 2020-11-04 2025-07-01 美商建南德克公司 抗cd20/抗cd3雙特異性抗體之皮下給藥
US12351643B2 (en) 2020-11-04 2025-07-08 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
AU2021373366A1 (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
MX2023012408A (es) 2021-04-30 2023-10-31 Hoffmann La Roche Dosis para tratamiento conjunto con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y conjugado anticuerpo farmaco anti-cd79b.
US12291575B2 (en) 2021-05-14 2025-05-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of CD20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
JP2024523316A (ja) * 2021-06-18 2024-06-28 オートラス リミテッド Ｃａｒ ｔ細胞における、および疾患の処置のための抗ｃｄ３０７ｅ単一ドメイン抗体、その使用
US20240290974A1 (en) 2021-06-18 2024-08-29 Eneos Corporation Method for producing synthetic graphite material for lithium-ion secondary battery negative electrodes, synthetic graphite material for lithium-ion secondary battery negative electrodes, negative electrode for lithium-ion secondary batteries, and lithium-ion secondary battery
CN114644716A (zh) * 2022-04-07 2022-06-21 苏州大学 一种抗bxmas1嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及应用
CA3247048A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech Inc PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS OF MOSUNETUZUMAB AND METHODS OF USE
AR129062A1 (es) * 2022-04-13 2024-07-10 Genentech Inc Composiciones farmacéuticas de proteínas terapéuticas y métodos de uso
IL316738A (en) * 2022-05-11 2024-12-01 Genentech Inc Dosage for treatment with anti-FCRH5/anti-CD3 bispecific antibodies
IL317946A (en) 2022-07-07 2025-02-01 Genentech Inc Combinations of IL15/IL15R alpha heterodimeric fusion proteins and FCRH5XCD3 bispecific antibodies for the treatment of leukemia
AU2023312051A1 (en) 2022-07-22 2025-01-09 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
WO2024102948A1 (en) * 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
CN116789849B (zh) * 2023-04-12 2024-03-08 南京紫珑生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
TW202502811A (zh) 2023-06-01 2025-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｂｃｍａ特異性結合之免疫刺激性抗原結合分子
WO2024246083A1 (en) 2023-06-01 2024-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies targeting bcma and cd28

Family Cites Families (198)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE419355T1 (de) 1992-02-06 2009-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ES2091684T3 (es) 1992-11-13 1996-11-01 Idec Pharma Corp Aplicacion terapeutica de anticuerpos quimericos y radiomarcados contra el antigeno de diferenciacion restringida de los linfocitos b humanos para el tratamiento del linfoma de las celulas b.
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
DE69434136T2 (de) 1993-10-01 2005-12-01 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin-derivate
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6248518B1 (en) 1996-10-29 2001-06-19 Board Of Regents Of University Of Nebraska Method for detecting point mutations in DNA utilizing fluorescence energy transfer
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US20030083461A1 (en) 1997-06-16 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
JP4460155B2 (ja) 1997-12-05 2010-05-12 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート マウス抗体のヒト化
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
JP2002522511A (ja) 1998-08-11 2002-07-23 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション 抗ｃｄ２０抗体の投与を含むｂ細胞リンパ腫の併用療法
ES2543819T3 (es) 1998-11-09 2015-08-24 Biogen Inc. Tratamiento de neoplasias hematológicas asociadas con células tumorales circulantes utilizando anticuerpo quimérico dirigido contra CD20
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0008758A (pt) 1999-01-15 2001-12-04 Genentech Inc Variantes de polipeptìdeos parentais com funçãoefetora alterada, polipeptìdeos, composição ácidonucleico isolado, vetor, célula hospedeira,método para produzir uma variante depolipeptìdeo, método para o tratamento de umadesordem em mamìferos e método para produziruma região fc variante
CA2369292C (en) 1999-04-09 2010-09-21 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of modulating the activity of functional immune molecules
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP2003512821A (ja) 1999-10-04 2003-04-08 メディカゴ インコーポレイテッド 外来性遺伝子の転写調節方法
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
US7105149B1 (en) 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
HK1049843B (en) 1999-11-29 2017-03-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
CA2395660A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EA013563B1 (ru) 2000-10-06 2010-06-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
DK1354034T3 (da) 2000-11-30 2008-03-25 Medarex Inc Transgene transchromosomale gnavere til fremstilling af humane antistoffer
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
IL159177A0 (en) 2001-06-20 2004-06-01 Prochon Biotech Ltd Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
CA2455365C (en) 2001-08-03 2014-07-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR101008758B1 (ko) 2001-09-18 2011-01-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
US7888478B2 (en) 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20050226869A1 (en) 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
WO2003043583A2 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN1930288B (zh) 2002-04-09 2012-08-08 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
WO2003085119A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PT1572744E (pt) 2002-12-16 2010-09-07 Genentech Inc Variantes de imunoglobulina e utilizações destas
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP2272868B1 (en) 2003-06-05 2015-03-04 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
ME01775B (me) 2003-11-05 2011-02-28 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
NZ583292A (en) 2003-11-06 2012-03-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP4658967B2 (ja) 2003-12-24 2011-03-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 造血系起源の腫瘍の治療のための組成物と方法
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
CA2561686C (en) 2004-03-31 2014-12-02 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
BR122019012028B1 (pt) 2004-04-13 2023-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpos anti-p-selectina, molécula de ácido nucléico, vetor, e composição
MXPA06014065A (es) 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
WO2006039238A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Irta2 antibodies and methods of use
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
KR20070115881A (ko) 2005-01-12 2007-12-06 메다렉스, 인코포레이티드 아이아르티에이-2 항체 및 그의 용도
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
PL1874821T3 (pl) 2005-04-26 2013-09-30 Trion Pharma Gmbh Kombinacja przeciwciał i glikokortykoidów do leczenia raka
RU2430112C2 (ru) 2005-06-20 2011-09-27 Дженентек, Инк. Композиции и способы диагностики и лечения опухоли
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
ES2856451T3 (es) 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
CN105837690A (zh) 2006-06-12 2016-08-10 新兴产品开发西雅图有限公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008109533A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
AU2008234019B2 (en) 2007-04-03 2014-05-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific bispecific binders
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 ｃｄ３―입실론 결합 도메인
PT2155783E (pt) 2007-04-03 2013-11-07 Amgen Res Munich Gmbh Domínio de ligação específico inter-espécies
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US9308257B2 (en) 2007-11-28 2016-04-12 Medimmune, Llc Protein formulation
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP2011507933A (ja) 2007-12-26 2011-03-10 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト 免疫複合体の細胞傷害性副作用の低減及び有効性の改善方法
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
WO2009099741A1 (en) 2008-02-01 2009-08-13 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
MX2011000509A (es) 2008-07-15 2011-04-05 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina, proceso para su preparacion y su uso como compuestos antitumorales.
UA104460C2 (uk) * 2009-04-01 2014-02-10 Дженентек, Інк. АНТИТІЛА ДО FсRCH5, ЇХ ІМУНОКОН'ЮГАТИ Й СПОСОБИ ЇХНЬОГО ЗАСТОСУВАННЯ
RU2583270C2 (ru) 2009-04-01 2016-05-10 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА К FcRH5, ИХ ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
SG174992A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
MX353186B (es) * 2009-09-03 2018-01-05 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
JP6184695B2 (ja) 2009-12-04 2017-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
EP2519544A1 (en) 2009-12-29 2012-11-07 Emergent Product Development Seattle, LLC Polypeptide heterodimers and uses thereof
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
US20110256157A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
CN103533943B (zh) 2010-11-10 2018-02-13 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 由cd3特异性结合结构域导致的不良作用的预防
LT2647707T (lt) 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
SG10201602371VA (en) 2011-03-25 2016-04-28 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
KR20160044598A (ko) 2011-03-29 2016-04-25 로슈 글리카트 아게 항체 Fc 변이체
JP2014514314A (ja) 2011-04-20 2014-06-19 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２およびｃｄ３に対する二重特異性抗体
EP2710042A2 (en) 2011-05-16 2014-03-26 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
ME03440B (me) 2011-05-21 2020-01-20 Macrogenics Inc Cd3-vezujući molekuli sposobni za vezivanje za humani i nehumani cd3
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US20150079093A1 (en) 2012-01-13 2015-03-19 Julus-Maximilians-Universität Würzburg Dual antigen-induced bipartite functional complementation
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
BR112015012644A2 (pt) 2012-11-30 2017-12-19 Hoffmann La Roche método para determinar a necessidade de um paciente com câncer, método de tratamento do câncer, composição farmacêutica, uso de um ácido nucleico ou anticorpo e kit;
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
EP2968552B1 (en) 2013-03-14 2020-03-11 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
KR20150132332A (ko) 2013-03-15 2015-11-25 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 (넘버 2) 리미티드 저농도 항체 제형
HK1217023A1 (zh) 2013-05-28 2016-12-16 Numab Innovation Ag 新型抗体
TWI725931B (zh) * 2013-06-24 2021-05-01 美商建南德克公司 抗ｆｃｒｈ５抗體
MX2016000272A (es) 2013-07-12 2016-08-03 Zymeworks Inc Construcciones de unión a los antígenos cd19 y cd3 biespecificos.
BR112016009919A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma
KR102357961B1 (ko) 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
KR102630750B1 (ko) 2013-12-17 2024-01-30 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
KR102411972B1 (ko) 2014-08-04 2022-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SI3221359T1 (sl) 2014-11-17 2020-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metode zravljenja tumorja z uporabo bispecifičnega protitelesa CD3XCD20
ES2744540T3 (es) 2014-12-05 2020-02-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-CD79b y procedimientos de uso
CN114478792A (zh) 2015-01-08 2022-05-13 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
HK1250997A1 (zh) 2015-05-01 2019-01-18 基因泰克公司 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
KR102583058B1 (ko) 2015-05-28 2023-09-25 제넨테크, 인크. 항-cd3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정
CN107708741A (zh) 2015-06-12 2018-02-16 免疫医疗公司 用嵌合抗原受体(car)构建体和表达car构建体的t细胞(car‑t)或nk细胞(car‑nk)进行的疾病疗法
US10323094B2 (en) * 2015-06-16 2019-06-18 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107787331B (zh) 2015-06-17 2022-01-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗her2抗体和使用方法
EP3408671B1 (en) 2016-01-25 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for assaying t-cell dependent bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CN107849132B (zh) 2022-03-08
NZ737942A (en) 2021-10-29
MX2021012307A (es) 2021-11-12
AR133470A2 (es) 2025-10-01
NZ776626A (en) 2025-02-28
TWI825431B (zh) 2023-12-11
HK1252859A1 (zh) 2019-06-06
TW201712036A (zh) 2017-04-01
JP2023156299A (ja) 2023-10-24
MA42428B1 (fr) 2023-10-31
KR20250021639A (ko) 2025-02-13
IL304842A (en) 2023-09-01
SI3310814T1 (sl) 2023-11-30
CL2017003195A1 (es) 2018-05-11
CL2022002771A1 (es) 2023-04-21
IL256079B2 (en) 2024-01-01
RU2018100820A3 (sr) 2020-04-30
ZA201707934B (en) 2021-03-31
DK3310814T5 (da) 2024-10-07
RU2748943C2 (ru) 2021-06-02
AR105026A1 (es) 2017-08-30
KR102763347B1 (ko) 2025-02-10
HRP20231134T1 (hr) 2024-01-05
DK3310814T3 (da) 2023-10-02
TW202426506A (zh) 2024-07-01
JP6871874B2 (ja) 2021-05-19
JP6872069B2 (ja) 2021-05-19
AU2022231722B9 (en) 2025-11-13
AR120262A2 (es) 2022-02-09
TWI731861B (zh) 2021-07-01
AU2022231722A1 (en) 2022-12-01
WO2016205520A8 (en) 2017-05-11
IL256079A (en) 2018-02-28
CR20180031A (es) 2018-05-07
HUE063270T2 (hu) 2024-01-28
AU2016280102B2 (en) 2022-06-16
PL3310814T3 (pl) 2023-12-11
MY189840A (en) 2022-03-11
US20240383984A1 (en) 2024-11-21
MX2021012301A (es) 2021-11-12
US12030947B2 (en) 2024-07-09
CO2018000244A2 (es) 2018-05-31
EP3310814B1 (en) 2023-08-02
EP3310814A1 (en) 2018-04-25
JP2021004243A (ja) 2021-01-14
KR20180023952A (ko) 2018-03-07
NZ776629A (en) 2025-02-28
PE20240218A1 (es) 2024-02-16
PT3310814T (pt) 2023-10-02
US10323094B2 (en) 2019-06-18
FI3310814T3 (fi) 2023-09-21
UA124615C2 (uk) 2021-10-20
IL256079B1 (en) 2023-09-01
MX2017016349A (es) 2018-05-02
CN114507289A (zh) 2022-05-17
WO2016205520A1 (en) 2016-12-22
TWI876687B (zh) 2025-03-11
RU2018100820A (ru) 2019-07-17
TW202204415A (zh) 2022-02-01
ES2957567T3 (es) 2024-01-22
EP4299073A2 (en) 2024-01-03
AU2016280102A1 (en) 2017-12-07
LT3310814T (lt) 2023-10-10
PE20180330A1 (es) 2018-02-13
JP2018527887A (ja) 2018-09-27
US20220048993A1 (en) 2022-02-17
US20160368985A1 (en) 2016-12-22
PH12017502354A1 (en) 2018-06-25
CN107849132A (zh) 2018-03-27
JP2021101703A (ja) 2021-07-15
ZA202007246B (en) 2025-04-30
MA42428A (fr) 2018-05-23
AU2025252574A1 (en) 2025-11-06
IL324108A (en) 2025-12-01
MX388965B (es) 2025-03-20
CA2986928A1 (en) 2016-12-22
US11192950B2 (en) 2021-12-07
EP4299073A3 (en) 2024-03-27
JP7472056B2 (ja) 2024-04-22
US20190315860A1 (en) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7472056B2 (ja) ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
JP7472405B2 (ja) 抗ｃｔｌａ－４抗体
CN115942956B (zh) 抗-ctla-4抗体及其用途
JP7477127B2 (ja) 抗ｃｔｌａ－４抗体の使用
HK40069393A (en) Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
NZ737942B2 (en) Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
HK1252859B (en) Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use