TWI380996B

TWI380996B - 抗ｏｘ４０ｌ抗體

Info

Publication number: TWI380996B
Application number: TW097140328A
Authority: TW
Inventors: Josef Endl; Elsie M Eugui; Maria Elena Fuentes; Yvo Graus; Aran Frank Labrijn; Martin Lanzendoerfer; Paul Parren; Frank Rebers; Ralf Schumacher; Stefan Seeber; De Winkel Jan Van; Vugt Martine Van
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-14
Publication date: 2013-01-01
Also published as: JP4594986B2; WO2006029879A2; MX2007002905A; NO20071430L; WO2006029879A3; RU2395523C2; KR100901090B1; KR20070050972A; SG147444A1; EP2218782A2; TW200911838A; TW200621805A; EP2218782A3; TWI309240B; IL181575A0; AU2005284310A1; CL2010000426A1; EP1791869A2; NZ579022A; ES2433916T3

Description

抗OX40L抗體

本發明概言之係關於抗OX40L抗體，且具體而言，本發明係關於不結合補體因子C1q之抗OX40L抗體、其醫藥組合物及其用途。較佳地，此等抗體係人類或人源化抗體。

人類OX40L(gp34，SwissProt P23510)可藉由CD40/CD40L結合表現於活化B細胞及樹突狀細胞上，並表現於發炎組織內皮細胞上(Review：Weinberg,A.D.，Trends Immunol.23(2002)102－109)。其首先自經HTLV－1感染之人類白血病細胞(此等T－細胞藉由與OX40形成自分泌環而實現永生化)中分離得到。例如，在下列專利及文獻中提及OX40L及針對其之抗體：WO 95/12673；WO 95/21915；WO 99/15200；Baum,P.R.等人，EMBO J.13(1994)3992－4001；Imura,A.等人，Blood 89(1997)2951－2958；Imura,A.等人，J.Exp.Med.183(1996)2185－2195；Kjaergaard,J.等人，J.Immunol.167(2001)6669－6677；Lane,P.，J.Exp.Med.191(2000)201－206；Mallett,S.及Barclay，A.N.，Immunol.Today12(1991)220－223；Mallett,S.等人，EMBO J.9(1990)1063－1068；Ndhlovu,L.C.等人，J.Immunol.167(2001)2991－2999；Ohshima,Y.等人，J.Immunol.159(1997)3838－3848；Rogers，P.R.等人，Immunity 15(2001)445－455；Stber,E.及Strober，W.，J.Exp.Med.183(1996)979－989；Stber,E.等人， Gastroenterology 115(1998)1205－1215；Takahashi,Y.等人，J.Virol.75(2001)6748－6757；Takasawa,N.等人，Jpn.J.Cancer Res.92(2001)377－382；Taylor,L.及Schwarz，H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67－72；Weinberg,A.D.等人，Nature Medicine 2(1996)183－189；Weinberg,A.D.等人，Semin. Immunol.10(1998)471－480；Weinberg,A.D.，Trends Immunol.23(2002)102－109；Wu,T.等人，Transplant.Proc.33(2001)217－218；Higgins,L.M.等人，J.Immunol.162(1999)486－493以及Yoshioka,T.等人，Eur.J.Immunol.30(2000)2815－2823。人類OX40L係瞬時表現於活化CD4＋T細胞上之人類OX40(CD134)的配體。OX40藉由其配體之結合可引發用以活化T細胞之協同刺激信號。據闡述，OX40/OX40L相互作用可引發一雙向信號(Matsumura,Y.等人，J.Immunol.163(1999)3007－3011；Koteni,A.等人，Immunol.Lett.84(2002)1－7)。此外，OX40/OX40L相互作用可調介活化T－細胞對發炎組織中內皮細胞之黏附。由於OX40L僅瞬時表現於活化B細胞、DC以及內皮細胞上，因此針對OX40L之抗體在發炎反應期間應該能夠選擇性阻斷T細胞活化及內皮細胞黏附而不會影響未活化之末稍T細胞。Yoshioka,A.等人(Eur.J.Immunol.30(2000)2815－2823)闡明一中和抗mOX40L mAb在小鼠模型中對於類風濕性關節炎之治療潛力。施用其可顯著改善該疾病之嚴重程度。此抗體在其他相關疾病模型(例如炎性皮膚病、實驗性自體免疫疾病 (EAE)、GVHD、尿炎性腸道疾病)中顯示出類似活性(Yoshioka,A.等人，Eur.J.Immunol 30(1999)2815－2823；Salek－Ardakani，S.等人，J.Exp.Med.198(2003)315－324；Burgess,J.K.等人，J.Allergy Clin.Immunol.113(2004)683－689；Hoshino,A.等人，Eur.J.Immunol.33(2003)861－869；Arestides,R.S.等人，Eur.J Immunol.32(2002)2874－2880；Nohara,C.等人，J.Immunol.166(2001)2108－2115；Weinberg,A.D.等人，J.Immunol.162(1999)1818－1826；Higgins,L.M.等人，J.Immunol.162(1999)486－493；Humphreys,I.R.等人，J.Exp.Med.198(2003)1237－1242；Akiba,H.等人，J.Exp.Med.191(2000)375－380；Ishii,N.等人，Eur.J.Immunol.33(2003)2372－2381；Blazar,B.R.等人，Blood 101(2003)3741－3748；Tsukada,N.等人，Blood 95(2000)2434－2439；Akiba,H.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun。251(1998)131－136)。

已對針對OX40L之抗體在各種疾病模型中之消炎作用進行了研究(Sugamura,K.等人，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420－431)。

Tanaka,Y.等人在Int.J.Cancer 36,(1985)549－555中；Tozawa,H.等人在Int.J.Cancer 41(1988)231－238中以及Miura,S.等人在Mol.Cell.Biol.11(1991)1313－1325中闡述了名為TARM－34及TAG－34之小鼠單株抗體，該二者可與具有人類I型T－細胞白血病病毒(HTLV－I)之人類淋巴細胞系的表面抗原反應。TAG－34抗體可自MBLInternational公司購得。TAG－34亦可結合OX40L。

本發明係關於一種抗體，較佳係關於一種單株抗體，其特徵在於，該抗體可結合OX40L、包含一來源於人類之Fc部分且不會結合人類補體因子C1q及/或NK細胞上之人類Fcγ受體。

本發明進一步係關於一種抗體，較佳係關於一種單株抗體，其特徵在於，該抗體包含一來源於人類之Fc部分，能夠以100奈克之抗體濃度結合OX40L及變性OX40L(在一西方墨點分析中)。此抗體可結合至與單株抗體LC.001結合之抗原決定部位相同的OX40L多肽抗原決定部位上。較佳地，此抗體不會結合人類補體因子C1q及/或NK細胞上之人類Fcγ受體。

本發明抗體之特徵較佳在於該抗體不與補體因子C1q結合，此係指在一ELISA分析測定中該抗體以10微克/毫升之濃度)對C1q之最大結合(Bmax)與抗體LC.001之Bmax相比係其之30%或更低，較佳係20%或更低。

較佳地，該抗體不會結合人類FcγRI、FcγRIIA及/或FcγRIIIA。尤佳係該抗體不會結合NK效應細胞上之人類Fcγ受體。

本發明抗體之特徵較佳在於該抗體不與NK細胞上之Fcγ受體結合，此係指在分析中該抗體以20微克/毫升之濃度對NK細胞之最大結合(Bmax)與抗體LC.001之Bmax相比係其之20%或更低，較佳係10%或更低。

本發明抗體之特徵較佳在於其不會結合FcγRI。此意味該抗體之特徵在於，當在測試該抗體以0.078至10微克/毫升範圍內之濃度對一缺乏FcγRIIA及FcγIIB但可表現重組FcγRI之B－細胞淋巴瘤細胞之結合的一分析中量測時，該抗體之EC50值與LC.001之EC50值相比係其之5倍或更多，較佳係7倍或更多，諸如8倍或更多。

該抗體具有可為需要用針對OX40L之抗體治療之患者帶來利益的新穎及創新性性質，尤其對於一患有發炎病症之患者，尤其係患有類風濕性關節炎、過敏性哮喘以及移植中GvHD之患者(亦參見Sugamura,K.等人，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420－431)。

本發明抗體之特徵較佳在於其係一至少含有一處胺基酸突變(較佳位於人類Fc部分)之IgG4抗體或IgG1抗體，該突變可使其不會結合補體因子C1q及/或不會結合NK細胞上之人類Fcγ受體。

本發明抗體較佳係一嵌合、人類或人源化抗體。

本發明抗體之特徵較佳在於其不會活化補體因子C3。

本發明抗體之特徵較佳在於，其在一BIAcore分析中與OX40L結合之K_D 值低於10^－8 M(10^－12 至10^－8 M)，更佳者係K_D 在10^－12 至10^－9 M範圍內。

本發明抗體之特徵較佳在於其屬於人類亞類IgG4。在本發明一更佳實施例中，該抗體之特徵在於其屬於任一IgG類別，較佳係IgG1或IgG4，其在E233、L234、L235、 G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329(根據EU索引編號)中至少含有一處突變。尤佳係IgG1突變PVA236、L234A/L235A及/或GLPSS331，以及IgG4突變L225E。更佳係該IgG4亞類抗體包含突變S228P或突變S228P及L235E(Angal,S.等人，Mol.Immunol.30(1993)105－108)。

因此，本發明抗體較佳係一人類IgG1亞類抗體，其包含一或多處來自PVA236、GLPSS331及/或L234A/L235A之突變(根據EU索引編號)。

較佳地，本發明抗體在一使用塗佈濃度為0.5微克/毫升之固定OX40L(較佳係固定在一鏈黴抗生物素表面上之生物素化OX40L)之ELISA中可抑制OX40L與OX40之相互作用，其中IC50值至多為4 nM。更佳之IC50值在1至4 nM範圍內。

本發明抗體之特徵較佳在於其不會引發補體相依性細胞毒性(CDC)。

本發明抗體之特徵較佳在於其不會引發抗體相依性細胞毒性(ADCC)。

本發明抗體之特徵較佳在於該抗體可結合OX40L且該抗體包括一獨立選自由下列組成之群的可變區：a)由胺基酸序列SEQ ID NO：1定義之輕鏈(V_L )可變結構域及由SEQ ID NO：2定義之重鏈(V_H )可變結構域；b)由胺基酸序列SEQ ID NO：3定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：4定義之重鏈可變結構域； c)由胺基酸序列SEQ ID NO：5定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：6定義之重鏈可變結構域；d)由胺基酸序列SEQ ID NO：7定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：8定義之重鏈可變結構域；e)由胺基酸序列SEQ ID NO：9定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：10定義之重鏈可變結構域；f)由胺基酸序列SEQ ID NO：11或16定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：12定義之重鏈可變結構域或其一OX40L結合片段。

本發明抗體之特徵較佳在於，人類輕鏈可變區包括一獨立選自由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11及16組成之群的胺基酸序列。

本發明抗體之特徵較佳在於，人類重鏈可變區包括一獨立選自由SEQ ID NO：2、4、6、8、10以及12組成之群的胺基酸序列。

重鏈及輕鏈之CDR區示於SEQ ID NO：17至46中。

本發明抗體之特徵較佳在於，該抗體包括由胺基酸序列SEQ ID NO：1定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：2定義之重鏈可變結構域。

本發明抗體之特徵較佳在於，人類重鏈恒定區包括一獨立選自由SEQ ID NO：14及15組成之群的胺基酸序列。

本發明抗體之特徵較佳在於該抗體包括SEQ ID NO：13之一－輕鏈恒定區。

本發明抗體之特徵較佳在於包括一可變輕鏈及一可變重鏈，其特徵在於該可變重鏈包括CDR1、CDR2及CDR3，且特徵在於CDR3係選自SEQ ID NO：26至29。尤佳係CDR1係選自SEQ ID NO：17至20，CDR2係選自SEQ ID NO：21至25且CDR3係選自SEQ ID NO：26至29。

本發明抗體之特徵較佳在於包括一可變輕鏈及一可變重鏈，其特徵在於該可變輕鏈包括CDR1、CDR2及CDR3，且特徵在於CDR3係選自SEQ ID NO：40至45。尤佳係CDR1係選自SEQ ID NO：30至34，CDR2係選自SEQ ID NO：35至39且CDR3係選自SEQ ID NO：40至45。

本發明抗體之特徵較佳在於以包括一可變重鏈及一可變輕鏈，其特徵在於該可變重鏈包括CDR1、CDR2及CDR3，且特徵在於重鏈CDR3係選自SEQ ID NO：26至29且輕鏈CDR3係選自SEQ ID NO：40至45。尤佳係該可變重鏈包括選自SEQ ID NO：17至20之CDR1、選自SEQ ID NO：21至25之CDR2及選自SEQ ID NO：26至29之CDR3，且該可變輕鏈包括選自SEQ ID NO：30至34之CDR1、選自SEQ ID NO：35至39之CDR2及選自SEQ ID NO：40至45之CDR3。

所有CDR可彼此獨立選擇。較佳係多個CDR之組合。

本發明又一實施例係一結合OX40L之抗體，其特徵在於其由細胞系hu－Mab<hOX40L>LC.001、hu－Mab<hOX40L>LC.005、hu－Mab<hOX40L>LC.010、hu－Mab<hOX40L>LC.019、hu－Mab<hOX40L>LC.029或hu－Mab<hOX40L>LC.033產生。

本發明抗體之特徵較佳在於，該抗體包括獨立選自由下列組成之群的CDR：a)胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈(V_L )可變CDR及SEQ ID NO：2之重鏈(V_H )可變CDR；b)胺基酸序列SEQ ID NO：3之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：4之重鏈可變CDR；c)胺基酸序列SEQ ID NO：5之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：6之重鏈可變CDR；d)胺基酸序列SEQ ID NO：7之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：8之重鏈可變CDR；e)胺基酸序列SEQ ID NO：9之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：10之重鏈可變CDR；f)胺基酸序列SEQ ID NO：11或16之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：12之重鏈可變CDR或其一OX40L結合片段。

本發明又一實施例係一編碼本發明一抗體分子、其一可變鏈或一CDR結構域之核酸分子。

各個鏈上之CDR係由架構胺基酸隔開。

在本發明一較佳實施例中，抗體係一Fab、F(ab')₂ 或一單鏈片段。

本發明又一實施例係一包含本發明核酸分子之載體。

本發明再一實施例係一包含本發明載體之宿主細胞。

本發明另一實施例係一種用來製備一本發明抗體之方法，該方法包括在允許該抗體分子合成之條件下培養本發明之宿主細胞及自該培養物中回收該抗體分子。

本發明又一實施例係一組合物，較佳係本發明抗體之一醫藥或診斷組合物。

本發明再一實施例係一包括一本發明抗體以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑的醫藥組合物。

本發明又一實施例係一種用於治療有治療需要之患者的方法，其特徵在於向該患者施用一治療有效量之本發明抗體。

本發明另一實施例係一本發明抗體用於治療、較佳用於治療發炎疾病、尤佳用於治療及/或預防類風濕性關節炎、哮喘及GvHD(移植物抗宿主疾病)之用途。

本發明又一實施例係一本發明抗體於製備一用於預防及/或治療發炎疾病、較佳用於治療類風濕性關節炎、哮喘及GvHD之藥物中的用途。

本發明另一實施例係一包括一本發明抗體、一本發明核酸分子、一本發明載體或一本發明宿主細胞之診斷套組。

術語「OX40L」意指一屬於TNF－配體家族之II型膜蛋白。其他名稱係ACT－4受體、CD134L、gp34或TNF4_Human。其具有34 KDa之分子量且以登錄號P23510存於SwissProt中。

術語「OX40」意指可結合OX40L之受體。其係一屬於TNF受體家族之I型膜蛋白。另外名稱係ACT－4、OX40L受體、CD134抗原、ACT35抗原、TNR4_Human。其具有50 KDa之分子量且以登錄號P43489存於SwissProt中。

術語「抗體」涵蓋保留本發明之特徵性質之各種形式的抗體，較佳為單株抗體，包括但不限於全抗體、抗體片段、人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體以及基因工程抗體(變體或突變抗體)。尤佳係人類或人源化單株抗體，尤其為重組人類抗體。

本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」指一具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。

術語「嵌合抗體」意指一包括一來自一來源或物種之可變區(即：結合區)以及來自一不同來源或物種之恒定區的至少一部分之單株抗體，其通常由重組DNA技術製備。包括一鼠類可變區及一人類恒定區之嵌合抗體較佳。涵蓋於本發明之其他「嵌合抗體」較佳形式係其中其恒定區已得到不同於原始抗體恒定區之修飾或改變從而產生本發明性質(尤其係有關C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質)之嵌合抗體。亦可將此等嵌合抗體稱為「經類別轉換之抗體」。嵌合抗體係經表現之包括編碼免疫球蛋白可變區之DNA片段及編碼免疫球蛋白恒定區之DNA片段的免疫球蛋白基因的產物。用於產生嵌合抗體的方法已為業內所熟知，包括習用重組DNA技術及基因轉染技術。參見例如，Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851－6855；美國專利第5,202,238號及第5,204,244號。

術語「人源化抗體」意指其中架構或「互補決定區」(CDR)已得到修飾從而包含與親本免疫球蛋白CDR相比具有不同專一性之一免疫球蛋白CDR的抗體。在一較佳實施例中，將一鼠類CDR移植入一人類抗體之架構區以製備「人源化抗體」。參見例如，Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323－327；及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268－270。尤佳CDR對應於彼等可識別嵌合及雙功能抗體之上述抗原之代表序列。涵蓋於本發明之其他形式的「人源化抗體」係彼等抗體，其中恒定區與原始抗體恒定區相比已得到額外修飾或改變以產生本發明之性質，尤其係有關C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質。

本文所用術語「人類抗體」擬包括具有衍生自人類種係免疫球蛋白序列之可變區及恒定區的抗體。人類抗體已為當前技術領域所熟知(van Dijk,M.A.，及van de Winkel,J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368－374)。亦可在轉基因動物(例如，小鼠)中產生人類抗體，該等動物能夠在免疫後在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生整組人類抗體或經選擇之人類抗體。將人類種係免疫球蛋白基因陣列轉移至此種係突變小鼠中可在抗原攻擊後導致人類抗體的產生(參見例如，Jakobovits,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551－2555；Jakobovits,A.等人，Nature 362(1993)255－258；Bruggemann,M.等人，Year Immunol.7(1993)33－40)。亦可在噬菌體展示文庫中產生人類抗體(Hoogenboom,H.R.及Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381－388；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)581－597)。亦可使用Cole等人及Boerner等人之技術製備人類單株抗體(Cole等人，Momoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77頁(1985)；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86－95)。如已提及用於本發明嵌合及人源化抗體之本文所用術語「人類抗體」亦包括彼等在恒定區藉由(例如)「類別轉換」(即：Fc部分之突變或改變(例如自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4之突變))受到修飾以產生本發明性質(尤其係有關C1q結合及/或FcR結合之性質)之抗體。此外，本發明包括針對OX40L且可結合C1q及/或FcR的單株人類抗體。此等人類抗體之特徵為，其對人類OX40L較小鼠OX40L具有更高之選擇性(對小鼠OX40L之結合較對人類OX40L之結合低>30倍)，且直至500 nM濃度亦未顯示對TNFα或CD40L之非專一性結合。此等抗體可用於產生不會結合C1q及/或FcR之抗體。

本文所用術語「重組人類抗體」擬包括所有可藉由重組方法製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如分離自例如NS0或CHO細胞等宿主細胞或分離自一人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如，一小鼠)的抗體、或使用一轉染入一宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。此等重組人類抗體具有呈重排形式之可變區及恒定區。該等本發明重組人類抗體已經受活體內體細胞超突變。因此，重組抗體VH及VL區之胺基酸序列係彼等雖然衍生自人類種係VH及VL序列且與之相關但不會自然地存在於整個人類抗體種係活體內中之序列。

本文所用「可變區」(輕鏈之可變區(VL)、重鏈之可變區(VH))表示輕鏈及重鏈對中每一個直接參與抗體及抗原結合之鏈。可變人類輕鏈及重鏈結構域有相同之通用結構，且每一結構域包含四個其序列高度保守之架構(FR)區，該等FR區經由參個「超變區」(或互補決定區，CDR)連接。架構區採用β－折疊構象，且CDR可形成能連接β－折疊結構之環。每一鏈中之CDR係藉由架構區來保持其參維結構，並與另一鏈中之CDR一起形成抗原結合部位。抗體重鏈及輕鏈之CDR3區在本發明抗體之結合專一性/親和性方面發揮特別重要之作用，且其藉此可提供本發明之另一目的。

本文所用術語「超變區」或「一抗體之抗原結合部分」意指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「架構」或「FR」區係彼等除本文所定義的超變區殘基以外之可變結構域區。因此，抗體之輕鏈及重鏈從N－端至C－端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。每一鏈上之CDR皆由此等架構胺基酸隔開。尤其重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最大之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中之標準定義確定。

本文所用術語「核酸或核酸分子」擬包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳係雙鏈DNA。

當將核酸置於與另一核酸序列之功能關係中時，該核酸係為「以可操作方式連接的」。例如，若一前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA係以可操作方式連接至該多肽DNA上；若一啟動子或增強子可影響一編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子係以可操作方式連接至該編碼序列上；或若一核糖體結合位點經定位後可促進轉譯，則該核糖體結合位點係以可操作方式連接至一編碼序列上。一般而言，「以可操作方式連接的」意指所連接之DNA序列鄰接，且在分泌前導序列之情形中，其既鄰接亦處於閱讀框中。然而，增強子則無需鄰接。利用便利的限制位點處之結合可達成連接。若此等位點不存在，則可根據習知慣例採用合成寡核苷酸接合體或連接子。

如本文所用措辭「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用且所有此等表述皆包括其子代。因此，詞語「轉化子」及「轉化細胞」包括初級受試細胞及源自其之培養物而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量皆可能因特意或無意突變而不精確相同。亦包括同最初轉化細胞中所篩選者具有相同功能或生物學活性之變異子代。當擬使用不同名稱時，可根據上下文而明瞭。

「恒定結構域」並不直接參與將一抗體結合至一抗原上，而係可展現各種效應功能。端視其重鏈恒定區之胺基酸序列而定，抗體或免疫球蛋白可分為下列類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將此等中之若干類別進一步分為亞類(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及 IgA2。將相應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恒定區分別稱作α、ε、γ及μ。本發明抗體較佳屬於IgG類型。

抗體之Fc部分直接參與補體活化、C1q結合、C3活化及Fc受體結合。儘管抗體對補體系統之影響端視一定條件而定，但對C1q之結合可由Fc部分中定義之結合位點引發。此等結合位點為當前技術領域所已知，且闡述於例如下列文獻及專利中：Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555－2560；Brunhouse,R.及Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907－917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338－344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995－1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178－4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161－12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319－324；以及歐洲專利第0 307 434號。此等結合位點係(例如)L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat之EU索引編號，見下文)。IgG1、IgG2及IgG3亞類抗體通常會顯示補體激活、C1q結合及C3活化等功能，而IgG4不會活化補體系統、不會結合C1q且不會活化C3。本文所用術語「源自人類來源之Fc部分」表示一人類IgG4亞類抗體之Fc部分或一已受到修飾從而檢測不到其C1q結合、C3活化及/或FcR結合(如下文定義)之人類IgG1、IgG2或IgG3亞類抗體之Fc部分。「一抗體之Fc部分」係一為熟習此項技術者所熟知之術語，且係基於抗體之木瓜蛋白酶解離來定義。本發明抗體包含一Fc部分，較佳為一源自人類來源之Fc部分且較佳為人類恒定區之所有其他部分。較佳地，Fc部分係一人類Fc部分，且尤佳係來自人類IgG4亞類(較佳在絞鏈區(例如S228P及/或L235E)存在突變)或係一來自人類IgG1亞類之突變Fc部分。最佳係包括選自示於SEQ ID NO：14及15中之區域之重鏈恒定區的Fc部分，其中SEQ ID NO：14具有突變L234A及L235A或SEQ ID NO：15具有突變S228P或突變S228P及L235E。

本發明意指一可結合OX40L且不會結合補體因子C1q及/或Fc受體之抗體。在本發明一較佳實施例中，此等抗體不會引發補體相依性細胞毒性(CDC)及/或抗體相依性細胞毒性(ADCC)。較佳地，此抗體之特徵在於其可結合OX40L、包含一源自人類來源之Fc部分且不會結合補體因子C1q。更佳地，此抗體係一人類或人源化單株抗體。

由抗體Fc區之Fc部分調介之效應功能意指在一抗體結合一抗原後所發揮之效應功能(此等功能包括補體連鎖反應之活化及/或藉由Fc受體之細胞活化)。

可藉由CH50分析來評定補體連鎖反應之功能。將經抗紅細胞抗體(EA)敏化之綿羊紅細胞添加至測試血清中以活化可引起溶血之經典途徑。使用裂解50%紅細胞所需的血清體積確定CH50單位。AP－CH50可量測旁路途徑及末端途徑。除使用兔紅細胞外該方法與其類似。旁路途徑係藉由添加測試血清來活化。

C1q與2個絲胺酸蛋白酶(C1r及C1s)可形成複合物C1－－補體相依性細胞毒性(CDC)途徑之第一組份。為活化補體連鎖反應，C1q需結合至少2個IgG1分子或1個IgM分子(其結合至抗原靶標上)(Ward,E.S.及Ghetie,V.，Ther.Immunol.2(1995)77－94)。Burton,D.R.(Mol.Immunol.22(1985)161－206)闡述，包含胺基酸殘基318至337之重鏈區參與補體固定。據Duncan,A.R.及Winter，G.(Nature 332(1988)738－740)報道，使用定點誘變，Glu318、Lys320及Lys322可形成C1q結合位點。Glu318、Lys320及Lys322殘基在C1q結合中之作用可藉由一含此等殘基之短合成胜肽抑制補體調介之裂解的能力來確認。

術語「補體相依性細胞毒性(CDC)」意指在補體存在下本發明抗體對表現OX40L之人類內皮細胞的裂解。較佳藉由在補體存在下用一本發明抗體處理表現OX40L之人類內皮細胞來量測CDC。該等細胞較佳由鈣黃綠素標記。若抗體在30微克/毫升濃度下誘發20%或更多靶細胞之裂解，則可觀察到CDC。本發明研究者已發現，就本發明抗體性質而言，在一ELISA分析中可降低對補體因子C1q之結合係必須的。在此一分析中，ELISA板基本上由不同濃度範圍之抗體塗佈，並向其中添加純化之人類C1q或人類血清。藉由一針對C1q且連有一經過氧化物酶標記之偶聯物的抗體來檢測C1q結合。以過氧化物酶底物ABTS(2,2'－連氮基－二－[3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸鹽(6)])在405奈米(OD405)處之光密度作為結合(最大結合，Bmax)檢測之量測值。因此本發明意指一抗體，其特徵在於該抗體不與補體因子C1q結合，此意指在此一ELISA分析量測中C1q與本發明一抗體(濃度為10微克/毫升)之最大結合(Bmax)係其與抗體LC.001之觀測Bmax的20%或更低，較佳為10%或更低。

更佳者係，一本發明抗體在一ELISA分析中顯示出對補體因子C3的較低活化。以與C1q分析相同之方式實施該分析。在此一分析中，ELISA板基本上由不同濃度範圍之抗體塗佈，並向其中添加人類血清。藉由一針對C3且連有一經過氧化物酶標記之偶聯物的抗體來檢測C3結合。以過氧化物酸底物ABTS在405奈米(OD405)處之光密度作為結合(最大結合，Bmax)檢測之量測值。因此，本發明意指一抗體，其特徵在於該抗體不與補體因子C3結合，此意指在此一ELISA分析量測中C3與一本發明抗體(濃度為10微克/毫升)之最大結合(Bmax)係與抗體LC.001之Bmax的10%，較佳為5%或更低。

術語「抗體相依性細胞毒性(ADCC)」係一由Fc受體結合調介之功能，且意指在效應細胞存在下一本發明抗體對表現OX40L之靶細胞的裂解。較佳地，在諸如新鮮分離之PBMC(末稍血單核細胞)或自血塊黃層純化之效應細胞(如單核細胞或NK(天然殺傷者)細胞)等效應細胞存在下用一本發明抗體處理一表現OX40L之紅血球細胞(例如表現重組人類OX40L之K562細胞)製備物來量測ADCC。用⁵¹ Cr標記靶細胞且隨後與抗體一起培育。將經標記之細胞與效應細胞一起培育並對上清液加以分析以確定釋放之⁵¹ Cr。對照包括靶標內皮細胞與效應細胞但無抗體之培育。藉由量測抗體對表現Fcγ受體之細胞(諸如，重組表現FcγRI及/或FcγRIIA之細胞或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA))的結合來研究抗體誘發調介ADCC初始步驟之能力。較佳地，量測對NK細胞上FcγR之結合。

Fc受體結合效應功能可由一抗體Fc區與Fc受體(FcR)(其係造血細胞上之專一性細胞表面受體)間之相互作用來調介。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已顯示出可調介免疫複合物吞噬作用對經抗體塗佈之病原體的去除以及通過抗體相依性細胞調介之細胞毒性(ADCC)對經相應抗體塗佈之紅細胞及各種其他細胞靶標(例如腫瘤細胞)的裂解二者(Van de Winkel,J.G.及Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511－524)。FcR係由其對免疫球蛋白同型物之專一性來定義；IgG抗體之Fc受體被稱為FcγR，IgE抗體之Fc受體被稱為FcεR，IgA抗體之Fc受體被稱為FcαR，等等。在(例如)Ravetch,J.V.及Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457－492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25－34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330－341；及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231－248中闡述了Fc受體結合。

受體與IgG抗體Fc結構域(FcγR)之交聯會觸發很多種效應功能，包括吞噬作用、抗體相依性細胞毒性及發炎介質之釋放、以及免疫複合物之清除及抗體產生之調節。在人類中，已鑑別出參個FcγR類別，其係：－FcγRI(CD64)對單體IgG之結合具有很高親和力且可在巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞及嗜酸性粒細胞上表現。在IgG中修飾E233－G236、P238、D265、N297、A327以及P329中至少之一可降低對FcγRI之結合。將位置233至236處之IgG2殘基取代成IgG1及IgG4可使對FcγRI之結合降低10³ 倍並消除人類單核細胞對經抗體敏化之紅血細胞的反應(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613－2624)。

－FcγRII(CD32)對複合IgG之結合具有中等至低親和力且可得到廣泛表現。可將此等受體分成兩種重要類型－－FcγRIIA及FcγRIIB。FcγRIIA可在許多參與殺傷之細胞(例如巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞)上發現且其似乎能夠活化殺傷過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中發揮作用且可在B－細胞、巨噬細胞及在肥大細胞與嗜酸性粒細胞上發現。在B－細胞上，其似乎具有抑制其他免疫球蛋白產生及同型物向(舉例而言)IgE類別轉換的功能。在巨噬細胞上，FcγRIIB用於抑制如藉由FcγRIIA調介之吞噬作用。在嗜酸性粒細胞及肥大細胞上，b形式可有助於藉由IgE結合其單獨受體來抑制此等細胞之活化。例如，發現E233－G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414中至少一個之IgG突變可使對FcγRIIA之結合降低。

－FcγRIII(CD16)對IgG之結合具有中等至低親和力且以兩種類型存在。已發現FcγRIIIA存在於NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及一些單核細胞及T細胞上且其可調介ADCC。FcγRIIIB可在嗜中性粒細胞上高度表現。例如，已發現E233－G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376中至少一個之突變可使對FcγRIIIA之結合降低。

人類IgG1上對Fc受體之結合位點的定位、上述突變位點及用於量測對FcγRI及FcγRIIA之結合的方法在Shields,R.L.等人之JBC 276(2001)6591－6604中闡述。

本文所用術語「Fc受體」意指其特徵為存在一與該受體相關之細胞質ITAM序列的活化受體(參見例如Ravetch,J.V.及Bolland，S.，Annn.Rev.Immunol.19(2001)275－290)。此等受體係FcγRI、FcγRIIA及FcγRIIIA。本發明抗體較佳展現對Fcγ受體，較佳對FcγIIIA之較低結合。較佳地，術語「不結合FcγR」表示，一本發明抗體在10微克/毫升之抗體濃度下對NK細胞之結合係對抗體LC.001之所見結合的10%或更少。

儘管IgG4顯示降低之FcR結合，但其他IgG亞類抗體卻顯示出強結合。然而，若Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物)、Pro329及234、235、236及237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435受到改造，則其係亦可提供降低之FcR結合的殘基(Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591－6604；Lund,J.等人FASEB J.9(1995)115－119；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319－324；及歐洲專利第0 307 434號)。較佳地，一本發明IgG1或IgG2亞類抗體包括突變PVA236、GLPSS331及/或L234A/L235A。一本發明IgG4亞類抗體較佳包括突變L235E。更佳之IgG4突變係S228P或L235E及S228P(參見表1)。

本文所用術語「對OX40L之結合」表示抗體在一BIAcore分析(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)中對人類OX40L之結合。為進一步確認，亦可在一ELISA(其中將純化之OX40L塗佈於微量滴定板上)中或在一FACS分析(其中將經直接或間接標記之抗體結合於表現OX40L之K562細胞上)中測定對OX40L之結合。

在BIAcore分析中，係將抗體結合至一表面上且藉由表面電漿共振(SPR)量測OX40L之結合。結合親和力由ka項(抗體與抗原締合之速率常數)、kd項(解離速率常數)及K_D 項(kd/ka)定義。本發明抗體展現10^－8 M或更低之K_D ，較佳為約10^－12 至10^－9 M(參見實例)。因此，本發明意指一如上所述之抗體，其中該抗體在一BIAcore分析中與OX40L之結合具有一少於10^－8 M之K_D 值，較佳地其中K_D 範圍係10^－12 至10^－9 M。

在OX40L－專一性結合ELISA中，將OX40L塗佈在微量滴定板上，並用一偶聯HRP之抗人類IgG及常用ELISA步驟來檢測抗體對OX40L之結合。此分析中EC₅₀ 值較佳在介於3 nM至8 nM之範圍內。

本文所用術語「抑制OX40對OX40L之結合」意指本發明中所述抗體對人類OX40L之結合，由此抑制 OX40/OX40L相互作用，並藉此抑制OX40L誘發之信號轉導。

較佳地，本發明抗體抑制下列hOX40L/OX40相互作用i)在由一ELISA分析顯示之活體外水平上，其中該抗體係在生物素化OX40L(固相)塗佈濃度為0.5微克/毫升下來阻斷經固定之生物素化OX40L與可溶OX40間的相互作用，其中IC50值係在1 nM至4 nM範圍內，ii)在由一Biacore分析顯示之活體外水平上，其中該抗體係在0.78至100 nM之抗體濃度下來阻斷經固定之OX40與可溶OX40L(10 nM，較佳為hOX40L－His)間的相互作用，其中IC50值係在1 nM至10 nM範圍內，iii)在由一FACS－分析顯示之細胞水平上，其中該抗體可阻斷濃度為2×10⁵ 個細胞/樣品之表現OX40L之K562細胞(K562_OX40L)與OX40間的相互作用，其中IC50值係在4至20 nM範圍內，iv)藉由一OX40－信號轉導分析，其中該抗體可阻斷K562_OX40L誘發之OX40信號轉導於每個樣品中之3×10⁴ 個表現OX40之HeLa－細胞中，此可導致對NFB活化之阻斷，其中IC50值係在1至5 nM範圍內，v)藉由一T－細胞活化分析，其中該抗體係藉由濃度為1.5×10⁵ 個細胞/樣品且PHA濃度為0.75微克/毫升之K562_OX40L來阻斷OX40L誘發之T－細胞活化，其中IC50值係處於1 nM至10 nM範圍內，及/或vi)藉由一T－細胞活化分析，其中該抗體係在一10微克/毫升抗體濃度下藉由活化B細胞或樹突狀細胞(破傷風分析)阻斷OX40L誘發之T細胞活化，且達成40%至60%之抑制。

可製備在一ELISA分析中、在0.5微克/毫升OX40L塗佈濃度及1 nM至4 nM範圍內之IC50值下藉由阻斷固定之OX40L與可溶OX40間之相互作用而顯示抑制作用之抗體。

因此，本發明一更佳實施例意指一抗體，其特徵在於該抗體藉此可抑制OX40/OX40L之相互作用並藉此抑制OX40L誘導之信號轉導。

更佳者係，一本發明抗體直至TNFα或CD40L濃度為500 nM時仍未顯示對TNFα及CD40L之非專一性結合。

更佳者係，一本發明抗體顯示對小鼠OX40L之結合較對人類OX40L之結合至少低30倍.

更佳者係，一濃度為10微克/毫升之本發明抗體並不誘發HUVEC細胞上之OX40L表現的減量調節。

在一更佳實施例中，本發明抗體之特徵在於其包括一獨立選自由下列組合組成之群的可變結構域組合：a)由胺基酸序列SEQ ID NO：1定義之抗體LC.001輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：2定義之抗體LC.001重鏈可變結構域；b)由胺基酸序列SEQ ID NO：3定義之抗體LC.005輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：4定義之抗體LC.005重鏈可變結構域； c)由胺基酸序列SEQ ID NO：5定義之抗體LC.010輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：6定義之抗體LC.010重鏈可變結構域；d)由胺基酸序列SEQ ID NO：7定義之抗體LC.029輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：8定義之抗體LC.029重鏈可變結構域；e)由胺基酸序列SEQ ID NO：9定義之抗體LC.019輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：10定義之抗體LC.019重鏈可變結構域；f)由胺基酸序列SEQ ID NO：11或16定義之抗體LC.033輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：12定義之抗體LC.033重鏈可變結構域。

在一更佳實施例中，本發明抗體之特徵在於其包括一獨立選自由下列組成之群的恒定區：g)由序列SEQ ID NO：13定義之輕/鏈；h)具有一或多個選自L234A及L235A、PVA236或GLPSS331之突變之IgG1同型物SEQ ID NO：14的重/γ鏈；i)IgG4同型物SEQ ID NO：15之重/γ鏈；j)具有突變S228P或突變S228P及L235E之IgG4同型物SEQ ID NO：15之重/γ鏈。

更佳者係每一可變抗體結構域組合a)至f)與γ鏈h)、i)或j)且較佳地與一鏈g)之所有組合。尤佳者係包括各具有由序列SEQ ID NO：13定義之鏈及具有突變L234A及L235A之IgG1同型物SEQ ID NO：14之重/γ鏈的抗體LC.001、 LC.005、LC.010、LC.019、LC.029或LC.033之可變鏈的抗體；包括各具有由序列SEQ ID NO：13定義之鏈及IgG4同型物SEQ ID NO：15之重/γ鏈之抗體LC.001、LC.005、LC.010、LC.019、LC.029或LC.033之可變鏈的抗體；包括各具有由序列SEQ ID NO：13定義之鏈及具有突變S228P之IgG4同型物SEQ ID NO：15之重/γ鏈之抗體LC.001、LC.005、LC.010、LC.019、LC.029或LC.033之可變鏈的抗體。

較佳地，該等抗體包括胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈可變CDR及SEQ ID NO：2之重鏈可變CDR。

較佳抗體之特徵在於該等抗體屬於人類IgG4亞類或另一人類亞類(較佳係IgG1)，其中包括至少一個可引起不結合補體因子C1q及/或失去FCR結合之胺基酸突變。此等較佳變體抗體包括(例如)具有突變L234A及L235A之胺基酸序列SEQ ID NO：14或有或無突變S228P之SEQ ID NO：15。

較佳之本發明抗體係定義為IgG1v1(PVA－236；由E233P規定之GLPSS331；L234V；L235A；ΔG236；A327G；A330S；P331S)、IgG1v2(L234A；L235A)及IgG4v1(S228P；L235E)及IgG4x(S228P)之抗體。

本發明更佳實施例係經分離之抗OX40L抗體，其可結合OX40L且可結合由所沉積雜交瘤細胞系產生之單株抗體LC.005、LC.010或LC.029亦可結合至其上的相同OX40L－抗原決定部位。

本發明又一實施例係一種用於產生一不會結合人類補體因子C1q及/或人類Fcγ受體之針對OX40L之抗體的方法，其特徵在於，一編碼以一低於10^－8 M之KD值結合OX40L之抗體之重鏈的核酸序列受到修飾從而使該經修飾抗體不會結合補體因子C1q及/或NK細胞上之人類Fcγ受體；將該經修飾核酸及編碼該抗體輕鏈之核酸插入一表現載體中，將該載體插入一原核或真核宿主細胞中；表現所編碼蛋白並自宿主細胞或上清液中回收該蛋白。

本發明又一實施例係一種用於產生一不會結合補體因子C1q及/或不會結合人類Fcγ受體之本發明抗體的方法，其特徵在於藉由「類別轉換」對自該等細胞系之一得到之抗體進行修飾，即：較佳定義為IgG1v1(PVA－236、由E233P規定之GLPSS331、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S、P331S)、IgG1v2(L234A、L235A)及IgG4v1(S228P；L235E)及IgG4x(S228P)之Fc部分的改變或突變(例如，由IgG1變為IgG4及/或IgG1/IgG4突變)。

在一更佳實施例中，此等抗體亦包括選自由Fab、F(ab')₂ 及單鏈片段組成之群的抗體片段。

故本文之「變體」抗OX40L抗體意指借助於在親本抗體序列中添加、刪除及/或取代一或多個胺基酸殘基而使其胺基酸序列不同於「親本」抗OX40L抗體胺基酸序列之分子。在較佳實施例中，變體在一或多個親本抗體恒定區或可變區且較佳在恒定區中包括一或多個胺基酸取代。例如，變體在一或多個親本抗體可變區可包括至少一個(例如，自約1至約10個，且較佳自約2個至約5個)取代。通常，變體之胺基酸序列同親本抗體恒定結構域及/或可變結構域序列具有至少90%、更佳至少為95%且最佳至少為99%之胺基酸序列一致性。

本文將有關此序列之一致性或同源性定義為：在序列比對且若必要則引入空位以獲得最大百分比序列一致性之後與親本抗體殘基一致之胺基酸殘基在候選序列中的百分比。抗體序列中之N－末端、C－末端或內部擴展、刪除或插入無一會被認為可影響序列一致性或同源性。變體應保留結合人類OX40L之能力且較佳地具有優於彼等親本抗體性質之性質。例如，由於OX40L不僅可在B－細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞上瞬時表現，而且可在內皮細胞(Kotani,A.等人，Immunol.Lett.84(2002)1－7)、呼吸道平滑肌細胞(＝ASM)(Burgess,J.K.,J.Allergy Clin.Immunol 113(2004)683－689)及微膠質細胞(Weinberg,A.D.等人，J.Immunol.162(1999)1818－1826)上表現，因此變體可在治療類風濕性關節炎及哮喘期間具有降低之副作用。針對OX40L之抗體結合至內皮細胞、ASM及微膠質細胞可導致細胞損傷，且結合至內皮細胞會導致血管滲漏，結合至ASM細胞會導致肺部破壞，結合至微膠質細胞會導致微膠質損傷。

本文之「親本」抗體係一由一用於製備變體之胺基酸序列編碼之抗體。較佳地，該親本抗體具有一人類架構區且具有(若存在)一或多個人類抗體恒定區。例如，親本抗體可以係一人源化或人類抗體，較佳為IgG1型。

此外，本發明抗體還包括彼等具「保守序列修飾」(核苷酸及胺基酸序列修飾)之抗體，該等修飾不影響或改變本發明抗體之上述特徵。可使用諸如定點誘變、PCR介導之誘變等業內已知標準技術來引入修飾。保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有類似側鏈之一胺基酸殘基取代的取代。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如、離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如、天冬胺酸、麩胺酸)、無電荷之極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β－分支側鏈(例如、蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)以及芳香族側鏈(例如、酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。故較佳地，一人類抗OX40L抗體中預計為非必需之胺基酸殘基可由另一來自相同側鏈家族之胺基酸殘基所取代。

胺基酸取代可藉由基於Riechmann，L.等人在Nature 332(1988)323－327中及Queen,C.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029－10033中所述之分子模型之誘變來實施。

本發明進一步包括一種用於產生一抗體之方法，其特徵在於，對編碼一以少於10^－8 M之KD值結合OX40L之抗體重鏈的第一核酸序列加以修飾，以使該經修飾抗體不會結合補體因子C1q及/或NK細胞上之人類Fcγ受體；將該經修飾第一核酸及一編碼該抗體輕鏈之第二核酸插入一表現載體中；並將該載體插入一原核或真核宿主細胞中；在允許該抗體合成之條件下培養該宿主細胞並自該培養物中回收該抗體。

本發明進一步包括一種用於製備一本發明抗體(其包括一源自人類來源之Fc部分)之方法，該方法包括下列步驟：a)用一編碼一本發明親本人類抗體輕鏈之第一核酸序列及一編碼一該親本人類抗體重鏈之第二DNA序列(其中Fc部分經修飾，以使該Fc部分不會結合補體因子C1q及/或Fc受體)轉化一宿主細胞；b)表現該第一及第二DNA序列以製備該抗體重鏈及輕鏈；及c)自該宿主細胞或宿主細胞培養物回收該抗體。

本發明亦包括編碼一上述抗體的核酸分子、包含此等核酸之相應載體以及用於此等載體之相應宿主細胞。本發明涵蓋一種用來製備該等抗體之方法，該方法包括在允許該等抗體分子合成之條件下培養相應宿主細胞並自該培養物中回收該等抗體，例如，藉由在一原核或真核宿主細胞中表現一編碼一重鏈之核酸及一編碼一輕鏈之核酸並自該細胞回收該多肽。

抗體之診斷及治療用途涵蓋於本發明中。在一診斷應用中，本發明提供一種用來確定OX40L蛋白存在之方法，該方法包括將一懷疑含有OX40L之樣品暴露於抗OX40L抗體且測定該抗體對該樣品之結合。OX40L蛋白可藉由其跨膜結構域插入至表現OX40L之細胞的細胞膜中，或可藉由諸如脫落或蛋白水解釋放等機制作為可溶胞外結構域存在於體液中。就此用途而言，本發明提供一種包含此抗體及用於使用該抗體檢測OX40L蛋白之說明書的套組。

本發明抗體可用來在一哺乳動物、較佳在一懷疑具有或患有發炎疾病之患者中預防及/或治療此一疾病。此等疾病包括諸如哮喘等過敏反應。其他應用係治療自體免疫性疾病，包括類風濕性關節炎。

本發明進一步提供一種用來治療一患有上述發炎疾病尤其係患有哮喘及類風濕性關節炎之哺乳動物的方法。

較佳地，本發明抗體可用來治療其症狀用吸入腎上腺皮質類固醇不能充分控制之患者中之嚴重持續性哮喘。患者群體包括具有未充分控制之嚴重持續性哮喘之成人及青少年(年齡在12歲及更大者)。較佳地每月經皮下遞送抗體一次或兩次。較佳地，主終點將會在急性惡化中降低。其他終點包括尖峰呼氣流、日間哮喘症狀、夜醒、生命品質、急診室就醫、無哮喘天數、β－2激動劑使用、類固醇降低或漸減以及對過度反應性之作用。

更佳者係使用本發明抗體進行單一治療或與胺甲蝶呤或其他DMARD(緩和疾病之抗風濕藥)共同治療患有中度至重度活動性類風濕性關節炎之成人。其應每2或4週一次經皮下注射施用。其在一或多種DMARD未能奏效之患者中係一慢性治療。終點將包括患有活動性類風濕性關節炎之成人患者中症候及症狀之減少及對結構損傷加劇之抑制。藉由ACR標準來量測對傷殘之預防及症候與症狀之改善(ACR20>60%，ACR50>35%，ACR70>15%；指標來自美國風濕病學院(American College of Rheumatology)；www.rheumatology.com)。

本發明又一實施例係本發明抗體於製備用以治療此等疾病之藥物中的用途。

本發明亦係關於如上定義之抗體用以製備一醫藥組合物之用途，並包括一含一醫藥有效量之本發明抗體的醫藥組合物，視情況該抗體與一可用來調配醫藥用途抗體的緩衝劑及/或佐劑結合在一起。

本發明進一步提供包括存於一醫藥上可接受之載劑中之此等抗體的醫藥組合物。在一實施例中，醫藥組合物可包含在一種製造物件或套組中。

本發明抗體較佳由重組方式產生。此等方法為此項技術領域中廣泛已知且包括於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離抗體多肽且通常將其純化至醫藥上可接受之純度。進行蛋白質表現時，藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈之核酸或其片段插入至表現載體中。在諸如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌細胞等適宜原核或真核宿主細胞中實施該表現，並自細胞(上清液或裂解後之細胞)回收抗體。

抗體之重組產生為此項技術領域所熟知，且闡述於(例如Makrides,S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183－202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271－282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151－161；Werner，R.G.等人，Arzneimittelforschung 48(1998) 870－880等綜述文獻中。

抗體可以全細胞、細胞裂解物或一經部分純化或實質純之形式存在。藉由標準方法(包括鹼/SDS處理、管柱層析法及其他業內熟知方法)實施純化以去除其他細胞組份或其他雜質，例如其他細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel, F.等人編輯之Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)。

於NS0細胞中之表現闡述於(例如)Barnes, L.M.等人之Cytotechnology 32 (2000)109－123中及Barnes, L.M.等人之Biotech. Bioeng. 73 (2001)261-270中。瞬時表現由(例如)Durocher, Y.等人於Nucl. Acids. Res. 30 (2002)E9中闡述。可變結構域之選殖由Orlandi, R.等人於Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)3833-3837；Carter, P.等人於Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992)4285-4289及Norderhaug, L.等人於J. Immunol. Methods 204 (1997)77-87中闡述。一較佳瞬時表現系統(HEK 293)由Schlaeger, E.-J.及Christensen，K.於Cytotechnology 30 (1999)71-83中及由by Schlaeger, E.-J.於J. Immunol. Methods 194 (1996)191-199中闡述。

例如，適於原核生物的控制序列包括一啟動子、視情況包括一操縱序列、及一核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及聚腺苷酸化信號。

當將核酸置於與另一核酸序列之功能關係中時，該核酸係為「以可操作方式連接的」。例如，若前序列或分泌前導序列之DNA被表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA係以可操作方式連接至該多肽之DNA上；啟動子或增強子若可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子係以可操作方式連接至該編碼序列上；或若核糖體結合位點經定位後可促進轉譯，則該核糖體結合位點係以可操作方式連接至該編碼序列上。一般而言，「以可操作方式連接的」意指經連接之DNA序列鄰接，且在分泌前導序列之情形中，其既鄰接亦處於閱讀框中。然而，增強子則無需鄰接。利用便利的限制位點處之接合可完成連接。若此等限制位點不存在，則可根據習知慣例使用合成性寡核苷酸接合體或連接子。

適於藉由習用免疫球蛋白純化程序(例如，蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法)自培養基中分離出單株抗體。使用習用程序可易於分離並定序編碼單株抗體之DNA及RNA。雜交瘤細胞可作為此DNA及RNA之來源。一旦分離，即可將該DNA插入至表現載體中，然後將該等載體轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以便在宿主細胞中達成重組單株抗體之合成。

藉由將適宜核苷酸變化引入至抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備一人類OX40L抗體之胺基酸序列變體(或突變體)。然而，僅可在極有限範圍內進行此等修飾作用，例如，如上所述。例如，該等修飾作用不會改變上述抗體特徵，諸如IgG同型物及抗原決定部位之結合，但其可提高重組物產生量、蛋白質穩定性或促進純化。

任何不參與維持抗OX40L抗體之正確構象的半胱胺酸殘基亦可被取代(一般用絲胺酸取代)，以提高分子氧化穩定性並阻止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵結添加於抗體中以提高其穩定性，特別係在該抗體係一抗體片段(例如，Fv片段)之情形中。

可藉由各種業內已知方法來製備編碼抗OX40L抗體胺基酸序列變體之核酸分子。此等方法包括但不限於自天然來源分離(對於天然存在之胺基酸序列變體之情形)或藉由對早期製備之人源化抗OX40L抗體變體或非變體形式進行寡核苷酸介導之(或定點)誘變、PCR誘變及序列盒誘變來製備。

本發明亦係關於免疫偶聯物，其包括偶聯至諸如化療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之具酶促活性之毒素或其片段)、放射性同位素(即：一放射性偶聯物)等細胞毒性劑上之本發明抗體。可使用多種雙功能蛋白偶聯劑來製備抗體與細胞毒性劑之偶聯物，該等偶聯劑包括諸如3-(2-吡啶基二硫))丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯雙功能衍生物(諸如鹽酸己二醯亞胺二甲酯)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己烷二胺)、雙-重氮基衍生物(諸如雙(對-重氮基苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)以及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta, E.S.等人在Science 238 (1987)1098-1104中所述來製備一蓖麻毒免疫毒素。經碳-14標記之1-異硫氰酸根苄基-3-甲基二伸乙基參胺五乙酸(MX-DTPA)係一用於將放射性核苷酸結合至抗體上之實例性螯合劑。參見WO 94/11026。

對抗體之另一類型之共價修飾包括以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述之方法將該抗體連接至各種非蛋白質聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯烴)中任一種上。

在另一態樣中，本發明提供分離自一非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)之B-細胞，其可表現人類抗OX40L抗體(例如由一選自由產生本發明抗體之雜交瘤細胞組成之群的細胞系產生之親本抗體)。較佳地，該等經分離B細胞系自一已由一純化或重組形式之OX40L抗原及/或表現OX40L之細胞免疫之非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)得到。較佳地，該非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)具有一包括可編碼本發明抗體全部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組。然後使經分離B細胞永生化以提供一人類抗OX40L抗體之來源(例如雜交瘤)。因此，本發明亦提供一能夠產生本發明人類單株抗體之雜交瘤。在一實施例中，該雜交瘤包括一自一非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)得到之B細胞，該轉基因動物具有一包括可編碼本發明抗體之全部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組，其與一永生化細胞融合。

在一特定實施例中，非人類轉基因動物係一轉基因小鼠，其具有一包括可編碼一本發明抗體之全部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組。可用一OX40L抗原及/或表現OX40L之細胞的純化或富集製備物來免疫該非人類轉基因動物。較佳地，該非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)能夠產生針對OX40L之人類單株抗體的同型物。

可藉由OX40L抗原及/或表現OX40L之細胞的純化或富集製備物免疫具有一包括可編碼一本發明抗體之全部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組的非人類轉基因動物(例如轉基因小鼠)來產生本發明人類單株抗體。然後得到該動物之B細胞(例如脾臟B細胞)並將其與骨髓瘤細胞融合以形成可分泌針對OX40L之人類單株抗體的永生雜交瘤細胞。

在一較佳實施例中，可使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉基因小鼠來產生針對OX40L之人類單株抗體。此等轉基因小鼠(本文中稱為「HuMAb」小鼠)含有一編碼未重排人類免疫球蛋白基因(其包括重(μ及γ)鏈及κ輕鏈(恒定區基因))之人類免疫球蛋白基因微小基因座，以及使內源μ及κ鏈基因座失活之靶標突變(Lonberg, N.等人，Nature 368(1994)856-859)。因此，該等小鼠展現出小鼠IgM或K之表現的降低，且所誘導之人類重鏈及輕鏈轉基因因應於免疫而經受類別轉換及體細胞突變進而產生高親和性人類IgG單株抗體(Lonberg, N.等人，Nature 368 (1994)856-859；論述於Lonberg, N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994)49-101中；Lonberg, N.及Huszar, D.，Intern. Rev. Immunol. 25 (1995)65-93；及Harding, F.及Lonberg, N.，Ann. N. Acad. Sci. 764 (1995)536-546)。HuMAb小鼠之製備闡述於下列文獻中：Taylor, L.等人，Nucleic Acids Res. 20 (1992)6287-6295;Chen, J.等人，Int. Immunol. 5 (1993)647-656;Tuaillon, N.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)3720-3724;Choi, T.K.等人，Nat. Genet. 4 (1993)117-123;Chen, J.等人，EMBO J. 12 (1993)821-830; Tuaillon, N.等人，J. Immunol. 152 (1994)2912-2920; Lonberg, N.等人，Nature 368 (1994)856-859;Lonberg, N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101;Taylor, L.等人，Int. Immunol. 6(1994)579-591; Lonberg, N.及Huszar, D.，Intern, Rev. Immunol. 25 (1995)65-93;Harding, F.及Lonberg, N.，Ann. N. Acad. Sci. 764 (1995)536-546;Fishwild, D.M.等人，Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851，所有該等文獻之全部揭示內容皆以引用方式併入本文中。進一步參閱，美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；第5,545,807號；第 5,770,429號；WO 98/24884;WO 94/25585;WO 93/1227;WO 92/22645以及WO 92/03918。

為產生針對OX40L之完整人類單株抗體，可根據通用方法用一OX40L抗原及/或表現OX40L之細胞的純化或富集製備物免疫HuMAb小鼠，如Lonberg, N.等人在Nature 368 (1994)856-859中；Fishwild, D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851中及WO 98/24884中所述。較佳地，第一次免疫時該等小鼠為6至16周齡。例如，可使用偶聯於KLH上或存於PBS中之可溶OX40L抗原的純化或富集製備物(例如自表現OX40L之細胞純化)經腹膜腔免疫HuMAb小鼠。此可與用表現OX40L之細胞(例如，一腫瘤細胞系)和經分離之OX40L蛋白交替免疫相結合以促進免疫反應。對各種抗原之累積經驗已表明，當初始用存於完全Freund氏佐劑之抗原經腹膜腔(i.p.)免疫且隨後每隔一周用存於不完全Freund氏佐劑之抗原進行i.p.免疫(例如，直至總共6次)時，HuMAb轉基因小鼠反應最佳。可用藉由眼窩後放血得到之血漿樣品監控整個免疫程序過程中之免疫反應。可藉由ELISA篩選血漿，且可使用具有足夠抗OX40L人類免疫球蛋白滴度的小鼠來使相應B細胞永生化。可在宰殺及切除脾臟及淋巴結前3至4天用抗原經靜脈對小鼠加強免疫。對於每一種抗原需免疫若干小鼠。例如，總共免疫12只HCo7及HCo12係HuMAb小鼠。

HCo7小鼠在其內源輕鏈(κ)基因中具有一JKD破壞(如Chen, J.等人在EMBO J. 12 (1993)821-830中所述)、在其內源重鏈基因中具有一CMD破壞(如WO 01/14424實例1中所述)並具有一KCo5人類κ輕鏈轉基因(如Fishwild, D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851中所述)以及一HCo7人類重鏈轉基因(如美國專利第5,770,429號中所述)。

HCo12小鼠在其內源輕鏈(κ)基因中具有一JKD破壞(如Chen, J.等人在EMBO J. 12 (1993)821-830中所述)、在其內源重鏈基因中具有一CMD破壞(如WO 01/14424實例1中所述)並具有一KCo5人類κ輕鏈轉基因(如Fishwild, D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851中所述)以及一HCo12人類重鏈轉基因(如WO 01/14424實例2中所述)。可基於標準方案分離小鼠淋巴細胞並使用PEG將其與一小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生雜交瘤。然後篩選所得到之雜交瘤用於產生抗原專一性抗體。例如，用50% PEG使來自經免疫小鼠之脾臟與淋巴結衍生淋巴細胞的單一細胞懸浮液融合至1/6量之SP 2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)中。以約2×10⁵ 個細胞之量將該等細胞鋪板於平底微量滴定板中，隨後在選擇培養基中培育約2周。

然後藉由ELISA篩選各孔以獲得人類抗OX40L單株IgM及IgG抗體。一旦出現大量雜交瘤生長，就分析培養基，此通常係在10至14天之後。將分泌抗體之雜交瘤重新鋪板並再次篩選，若仍對人類IgG、抗OX40L單株抗體呈陽性，則可藉由限制稀釋將其至少亞選殖2次。然後在活體外培養穩定的亞係以在組織培養基中產生抗體以供定性。

分析樹主要由對IgG之非專一性分析(「IgG-ELISA」)及隨後之專一性ELISA和表觀FACS分析構成以測定抗原對經純化OX40L蛋白或OX40L表現細胞之結合。下一步驟包括功能分析，其中測定抗OX40L抗體與其天然相互作用夥伴(例如可溶的純化OX40)對純化之OX40L或表現於細胞上之OX40L的競爭，例如競爭ELISA或FACS。再下一步包括一其中測定抗OX40L抗體對OX40-信號轉導之阻斷能力的功能分析，例如NFκB-活化(=「NFκB-分析」)。接下來的步驟包括一其中測定抗OX40L抗體對T-細胞活化之阻斷能力的功能分析(「T-細胞活化分析」及「TT-分析」)。

由於CDR序列負責抗體-抗原相互作用，因此有可能藉由在來自一不同人類抗體之架構序列上構建包含本發明CDR序列的表現載體來表現本發明重組抗體(參見例如，Riechmann, L.等人，Nature 332 (1998)323-327;Jones, P.等人，Nature 321 (1986)522-525；及Queen, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)10029-10033)。可自包括種係人類抗體基因序列之公共DNA資料庫獲得此等構架序列。此等種係序列將不同於成熟抗體基因序列，原因在於其不包括完整組裝之可變基因(其在B細胞成熟期間藉由V(D)J連接而形成)。種係基因序列在各個均勻交叉可變區處亦將不同於一高親和性次級完整抗體之序列。

本發明進一步包括一本發明抗體用於活體外診斷OX40L之用途，較佳地係藉由免疫分析法測定一樣品中之OX40L(可溶或結合在膜上)與本發明抗體間之結合。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物(例如，一種醫藥組合物)，其含有與一醫藥上可接受之載劑調配在一起的本發明單株抗體的一種或其組合或其抗原結合部分。更具體而言，該組合物係一醫藥組合物或一診斷組合物，且更進而言之，該醫藥組合物包括一如上定義之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。該組合物必須係無菌的，且係可以注射器遞送之流體。

本文所用「醫藥上可接受之載劑」意指任何及所有生理上兼容之溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑以及諸如此類。載劑較佳適於經靜脈內、經肌內、經皮下、非經腸、經脊髓或經表皮施用(例如，經注射或經輸注施用)。此一載劑較佳係一水性pH經緩衝之溶液(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或組胺酸溶液)，較佳為等滲溶液，此外較佳包含一無機鹽、糖、多元醇及/或一表面活性劑。醫藥上可接受之載劑亦係諸如在Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編輯(1980)中所述者。

抗體濃度較佳係自0.1毫克/毫升至50毫克/毫升。較佳地，在緩衝液濃度為1 mM至200 mM時，經緩衝溶液之pH值係在自4.0至8.0範圍內。較佳鹽係1 mM至200 mM範圍內之氯化鈉及/或磷酸鈉。較佳糖係1%至15%(w/v)範圍內之蔗糖及/或海藻糖。較佳多元醇係1%至15%(w/v)範圍內之甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及/或諸如此類。表面活性劑較佳係0.001%至0.5%(w/v)範圍內之聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)及/或泊洛沙姆(poloxamere)。一較佳醫藥組合物含自0.1毫克/毫升至50毫克/毫升之抗體以及1 mM至200 mM經磷酸鹽緩衝之鹽溶液(pH 4.0至8.0)。

可藉由多種業內已知方法將一本發明組合物施用給一有其需要的患者。如熟習此項技術者所理解：施用途經及/或方式可端視期望之結果而有所變化。

醫藥上可接受之賦形劑或載劑包括無菌水溶液或用於即時製備無菌注射用溶液或分散液之無菌粉劑。用於醫藥活性物質的該等介質及試劑已為業內所熟知。

本文所用片語「非經腸施用」及「以非經腸方式施用」意指除經腸及局部施用以外的其它施用方式，通常係注射方式，且其包括但不限於經靜脈內、經肌內、經動脈內、經鞘內、經莢膜內、經眼窩內、經心臟內、經皮內、經腹膜腔內、經氣管、經皮下、經表皮下、經關節內、經囊下、經蛛網膜下、經脊柱內、硬膜外及經胸骨內注射及輸注。

本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量水平可加以變化，以獲得針對一特定患者、組合物及施用方式可有效達到期望治療效果且不使患者中毒之活性成份量。所選劑量水平將端視各種醫藥動力學因子而定，該等因子包括所用本發明特定組合物或其酯、其鹽或其醯胺之活性、施用路徑、施用時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物一起使用之其他藥物、化合物及/或物質、擬治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、整體健康狀況及先前病史及已為醫學技術領域中所熟知之其他諸如此類因素。一典型的周劑量可在約0.1毫克/公斤至約20毫克/公斤或更高之範圍內變化，端視上述因素而定。

下列實例、參考文獻及序列表係提供用於幫助理解本發明，本發明之真實範圍於隨附專利申請範圍中闡明。應瞭解，可對所列程序實施多種修改，此並不偏離本發明之精神。

序列表說明

SEQ ID NO：1 LC.001 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：2 LC.001 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：3 LC.005 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：4 LC.005 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：5 LC.010 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：6 LC.010 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：7 LC.029 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：8 LC.029 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：9 LC.019 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：10 LC.019 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：11 LC.033 κ輕鏈可變區

SEQ ID NO：12 LC.033 γ重鏈可變區

SEQ ID NO：13 κ輕鏈恒定區

SEQ ID NO：14 γ1重鏈恒定區

SEQ ID NO：15 γ4重鏈恒定區

SEQ ID NO：16 LC.033 κ輕鏈突變可變區

SEQ ID NO：17至45CDR序列

縮寫：

胺基酸縮寫為參字母代碼(Leu)或單字母代碼(L)形式。

S228P表示在IgG4重鏈的位置228處絲胺酸與脯氨酸交換。

L234表示胺基酸亮胺酸處於位置234處(根據EU編號(Kabat))。

L234A表示胺基酸亮胺酸在位置234處變為丙胺酸。

L235A表示胺基酸亮胺酸在位置235處變為丙胺酸。

PVA236表示在PVA中對236區中IgG1之ELLG或IgG4之EFLG進行修改。

GLPSS331表示331區中IgG1之ALPAP或IgG2之GLPAP變為GLPSS。

ΔG236表示位置236處胺基酸經刪除。

IgG4x表示IgG4中之突變S228P。

LC2010-001係LC.001之同義詞。

Fcg與Fcγ同義。

抗體的其他序列修改以類似方式命名。

實例 實例1 可生成抗OX40L抗體之雜交瘤細胞系的產生 雜交瘤培養

將HuMab雜交瘤在37℃及5% CO₂ 下培養於IMDM(Cambrex)、胎牛血清純係1(Fetal Clone I Bovine serum，Perbio Science)、源雜交瘤選殖因子(origin Hybridoma cloning factor)(Igen)、丙酮酸鈉、青黴素/鏈黴素、2-巰基乙醇、HAT(Sigma-Aldrich)以及卡那黴素(Invitrogen)中。

轉基因小鼠之免疫程序

LC2010-001：用1×10⁶ 個HEK293細胞交替免疫6只GG2201係HCo7(2只雄性及4只雌性)(Medarex，San José，CA，USA)以及4只GG2198係HCo12(4只雄性)(Medarex，San José，CA，USA)，並用一人類OX40L(hOX40L)表現載體及20微克hOX40L可溶胞外結構域進行瞬時轉染。總共實施8次免疫，4次用表現hOX40L之細胞進行腹膜腔內(i.p.)免疫且4次用重組蛋白在尾巴基部進行皮下(s.c.)免疫。對於第一次免疫，將100微升1×10⁶ 個HEK293-hOX40L細胞與100微升完全Freund氏佐劑(CFA; Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對於所有其他免疫，使用100微升存於PBS之細胞或將重組蛋白與100微升不完全Freund氏佐劑(ICFA; Difco)混合。

當觀察到抗hOX40L之血清滴度已足夠時，在融合前4及3天額外用15微克存於200微升PBS之hOX40L胞外結構域經靜脈內(i.v.)對小鼠實施2次加強免疫。

LC2010-001來源於HCo12小鼠之一。

LC2010-005、-010、-019、-029及-033：用20微克hOX40L可溶胞外結構域免疫5只GG2201係HCo7(4只雄性及1只雌性)(Medarex，San José，CA，USA)。總共實施7次免疫，4次為經腹膜腔(i.p.)免疫且3次為在尾巴基部之皮下(s.c.)免疫。對於第一次免疫，將100微升重組蛋白與100 微升完全Freund氏佐劑(CFA; Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對於所有其他免疫，將100微升重組蛋白與100微升不完全Freund氏佐劑(ICFA; Difco)混合。

雜交瘤之產生

宰殺小鼠並收集脾臟及位於腹部主動脈及腔靜脈側面之淋巴結。根據標準操作程序實施脾細胞及淋巴結細胞與融合夥伴SP 2.0細胞之融合。

抗原專一性ELISA

藉由抗原專一性ELISA測定經免疫小鼠血清中之抗OX40L滴度。用0.1微克/毫升溶解於PBS之純化OX40L塗佈孔板(96孔平底ELISA板，Greiner)並在室溫下塗佈過夜。其後，在室溫下用PBSTC(含0.05%吐溫20(Sigma-Aldrich Chemie BV)及2%雞血清(Gibco)之PBS)封阻各孔1小時。

將測試血清抽樣按1：50稀釋於PBSTC中並將其添加至各孔中。將免疫前自小鼠獲得之血清以1:100溶解於PBSTC中並用作陰性對照。將一針對人類OX40L之小鼠抗體以1:50溶解在PBSTC中並用作陽性對照。將板在室溫下培育1小時。隨後用PBST(含0.05%吐溫20之PBS)將板洗滌2次。將Gt-α-huIgG-HRP(Jackson)按1:5000稀釋於PBSTC中並將其添加至含測試抽樣及陰性對照之各孔中。將Rb-α-mIgG(Jackson)按1:3000稀釋於PBSTC中並將其添加至含陽性對照之各孔中。將板在室溫下培育1小時。最後，用PBST將板洗滌3次並用新鮮製備之ABTS^® (ABTS:2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)溶液(1毫克/毫升)在室溫下(RT)於暗處顯色30分鐘。量測405奈米處之吸光率。

κ-ELISA

為測定由融合而產生之雜交瘤是否會產生人類抗體而實施κ-ELISA。用按1/10000稀釋在PBS中之大鼠抗人類IgG κ-輕鏈抗體(DAKO)藉由在4℃下過夜培育來塗佈ELISA板。棄去各孔中液體之後，藉由在室溫下與PBSTC(PBSC，補充有0.05%吐溫-20(PBSTC))一起培育1小時來封阻各板。其後，將各孔與雜交瘤培養物上清液(其按1/2稀釋在PBSTC中)一起培育。將在PBSTC中按1/2稀釋之培養基用作陰性對照，將在PBSTC中按1/100稀釋之κ-輕鏈陽性小鼠血清用作陽性對照。隨後，將各孔洗滌3次並在37℃下使其與偶聯有HRP之大鼠抗人類IgG F(ab')₂ (DAKO)(其在PBSTC中按1/2000稀釋)一起培育1小時。將各孔洗滌3次並用新鮮製備之ABTS^® 溶液(1毫克/毫升)在室溫(RT)下於暗處使分析物顯色30分鐘。在一ELISA板讀數器中量測405奈米處之吸光率。

實例2 抗OX40L HuMab可變結構域之選殖及序列分析 (κ-輕及γ1-重鏈)

藉由標準cDNA合成/PCR程序來分離編碼OX40L HuMab輕鏈可變區V_L 及重鏈可變區V_H 之核苷酸序列。

使用GeneRaccr^TM 套組(Invitrogen)自1×10⁶ 至1×10⁷ 個雜交瘤細胞中製備總RNA。將源自雜交瘤之RNA作為用來合成第一鏈cDNA及連接GeneRacer^TM Oligo-dT引物之模板。分別用互補於κ-輕鏈及γ1-重鏈恒定區核苷酸序列之反向輕鏈和重鏈引物及5'-專一性GeneRacer^TM 引物來實施第二鏈cDNA合成及V_L 與V_H 編碼cDNA片段之進一步PCR擴增。使用購自Invitrogen^TM Life Technologies之TOPO^TM TA選殖套組並以pCR4-TOPO^TM 作為選殖載體來選殖PCR產物。藉由使用EcoRI消化之適宜質粒的限制性酶切圖譜來鑑別經選殖的PCR產物且V_L 及V_H 之預期/計算DNA片段大小分別為約740及790 bp。

藉由雙鏈定序來確定經選殖PCR片段之DNA序列。

使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)軟體包(版本10.2)及Vector-NTI 8(InforMax公司)進行總體數據處理。使用GCG模組CLUSTALW比對DNA及蛋白質序列。使用程式GENEDOC(版本2.1)來進行序列比對。

實例3 抗OX40L IgG1 HuMab表現質粒之構建

分別在哺乳動物細胞表現載體中組裝抗OX40L HuMab輕鏈及重鏈編碼基因。

由此可將編碼抗OX40L HuMab輕鏈可變區(V_L )及人類κ-輕鏈恒定區(C_L ，SEQ ID NO:13)之基因片段與抗OX40L HuMab重鏈可變區(V_H )及人類γ1-重鏈恒定區(C_H1 -鉸鏈- C_H2 -C_H3 ，SEQ ID NO:14)之基因片段連在一起。

有關人類輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊(自其可推導出密碼子使用)於Kabat, E.A.等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，NIH出版號91-3242(1991))中給出。

抗OX40L HuMab κ-輕鏈之轉錄單元由下列部分構成：-來自人類巨細胞病毒(HCMV)之立即早期增強子及啟動子，-一包含一Kozak序列之合成5'-UT，-一包含信號序列內含子之鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，-經選殖之抗OX40L HuMab可變輕鏈cDNA，其在5'末端排列有唯一BsmI限制酶切位點且在3'末端排列有一剪接供體位點及唯一NotI限制酶切位點，-基因組人類κ-基因恒定區，其包含內含子2小鼠Ig-κ增強子[Picard, D.及Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82]，以及-人類免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化(「poly A」)信號序列。

抗OX40L HuMab γ1-重鏈之轉錄單元由下列部分構成：-來自人類巨細胞病毒(HCMV)之立即早期增強子及啟動子，-一包含一Kozak序列之合成5'-UT，-一包含信號序列內含子之經修飾鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列， -經選殖之抗OX40L HuMab可變重鏈cDNA，其在5'末端排列有唯一BsmI限制酶切位點且在3'末端排列有一剪接供體位點及唯一NotI限制酶切位點，-基因組人類γ1-重鏈基因恒定區，其包含小鼠Ig μ-增強子(Neuberger, M.S.，EMBO J. 2(1983)1373-1378)，-人類γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(「poly A」)信號序列。

抗OX40L HuMab κ-輕鏈及γ1-重鏈表現質粒之功能部分：除抗OX40L HuMab κ-輕鏈或γ1-重鏈表現序列盒之外，此等質粒包含：-一潮黴素抗性基因-一EB病毒(EBV)複製起始點--oriP，-來自載體pUC18之複製起始點，其允許此質粒在大腸桿菌中複製，及-可在大腸桿菌中賦予氨苄青黴素抗性之β-內醯胺酶基因。

實例4 抗OX40L IgG4 HuMab表現質粒之構建

藉由用人類基因組γ4-恒定區(SEQ ID NO:15)及γ4-免疫球蛋白聚腺苷酸化信號序列代替人類基因組γ1-恒定區及γ1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(「poly A」)信號序列自抗OX40L γ1-重鏈表現質粒得到抗OX40L γ4-重鏈原型表現質粒。

對於抗OX40L HuMab κ-輕鏈之表現，使用與所述用於IgG1者相同之表現質粒(見上文)。

實例5 基於LC.001構建突變體(變體)抗OX40L IgG1及IgG4表現質粒

使用QuickChange^TM 定點誘變套組(Stratagene)藉由野生型表現質粒之定點誘變來構建編碼突變體抗OX40L γ1-及γ4-重鏈之表現質粒。根據EU編號來對胺基酸編號(Edelman, G.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1969)78-85;Kabat, E.A.等人，Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NIH出版號91-3242，Bethesda，MD(1991))。

實例6 重組抗OX40L HuMab之產生

藉由瞬時轉染培養於補充有10%超低IgG FCS(Gibco)、2 mM麩胺醯胺(Gibco)、1% v/v非必需胺基酸(Gibco)及250微克/毫升G418(Roche)之DMEM(Gibco)中的黏附HEK293-EBNA細胞(ATTC CRL-10852)來產生重組HuMab。轉染時使用Fugene^TM 6(Roche)轉染試劑，該試劑(微升)與DNA(微克)之比率在3:1至6:1範圍內。使用自1:2至2:1之輕鏈編碼質粒對重鏈編碼質粒之莫耳比自兩種不同質粒表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈。在轉染後4至11天收集含HuMab之細胞培養物上清液。純化前將上清液保存在-20℃下。

有關人類抗體在(例如)HEK293中重組表現之一般資訊於Meissner, P.等人之Biotechnol. Bioeng. 75(2001)197-203中給出。

實例7 抗體TAG34、LC.001、LC.005、LC.010、LC.019、LC.029、LC.033之親和性分析

儀器：Biacore 3000，流動及反應緩衝液：HBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005%吐溫20，pH 7.4)，25℃。在介於0.78 nM及100 nM之間的7個濃度下於3分鐘內實施分析物之注射並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2次10 mM甘胺酸(pH 2.0)(每次1分鐘)來實施表面(羧甲基化葡聚糖表面，CM)再生。晶片、分析形式及注射順序以及動力學數據對應於下列表中之說明。藉由將動力學數據擬合於1:1 Langmuir結合模型來計算動力學數據。

未量測到TAG34與mOX40L之間的相互作用。

所有Biacore分析之數據評估及數據存入

自樣品曲線中減去陰性對照數據(例如緩衝液曲線)以校準系統內部基線漂移並降低雜訊信號。使用BiaEvaluation版本4.01來分析感應圖譜及計算親和性數據。

實例8 抑制hOX40L與固定化hOX40間相互作用的抗hOX40L抗體 抑制競爭分析

儀器：Biacore 3000，流動及反應緩衝液：HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005%吐溫20，Ph 7.4)，25℃。注射前，在22℃下將分析物(10 nM)及競爭物(8個介於0.78 nM及100 nM之間的濃度)至少預先培育20分鐘。在3分鐘內實施分析物+/-競爭物之注射並用HBS-P洗滌3分鐘。藉由注射2次10 mM甘胺酸(pH2.0)(每次1分鐘)來實施表面再生。晶片、分析形式及注射順序以及動力學數據對應於下表3中之說明。

在溶液中所有抗體皆可抑制OX40L與OX40之結合(溶液親和性)。LC.001及LC.005展現一較TAG34更低之IC50值。

實例9 抗OX40L抗體TAG34、LC.001、LC.005、LC.010、LC.019、LC.029、LC.033之抗原決定部位鑑別

儀器：Biacore 3000，流動及反應緩衝液：HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005%吐溫20，pH7.4)，25℃。藉由所列抗體之間的交叉競爭來測定抗原決定部位基團。注射前，將分析物(50 nM)及競爭物(100 nM)在22℃下至少預先培養20分鐘。在2分鐘內注射分析物+/-競爭物，用HBS-P將其洗滌3分鐘。藉由注射2次10 mM甘胺酸(pH 2.0)(每次1分鐘)來實施表面再生。晶片、分析形式及注射順序以及動力學數據對應於下表4中之說明。

將由TAG34識別之OX40L抗原決定部位定義為抗原決定部位A。一個抗原決定部位基團(A或B)內之抗體展現出交叉抑制活性，而來自不同基團之抗體展現出加性結合信號。LC.019可中和來自基團A以及來自基團B之其他抗體。

實例10 TAG34、LC.001及LC.005對CD40L及TNFα之結合專一性

儀器：Biacore 3000，流動及反應緩衝液：HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005%吐溫20，pH7.4)，25℃。在3分鐘內實施分析物(100 nM及500 nM)之注射並用HBS-P洗滌2分鐘。藉由注射2次100 mM HCl(每次1分鐘)來實施表面再生。晶片、分析形式及注射順序以及動力學數據對應於下表5中之說明。

在此分析中，CD40L對所有抗體或晶片表面皆展現出某種程度之非專一性結合，但在減去背景信號之後此分析顯示不存在TNFα及CD40L(不超過500 nM)對固定化抗體TAG34、LC.001及LC.005的非專一性結合。

實例11 抗體LC.001-IgG1及LC.001-IgG4x之親和性分析

儀器：Biacore 3000，流動及反應緩衝液：HBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005%吐溫20，pH7.4)，25℃。以8個介於0.78 nM至100 nM間的濃度在3分鐘內實施分析物之注射並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2次100 mM HCl(每次1分鐘)來實施表面再生。晶片、分析形式及注射順序以及動力學數據對應於下表中之說明。藉由將動力學數據擬合於1:1 Langmuir結合模型來計算動力學數據。

LC.001及LC.001-IgG4x對hOX40L-His展現出相同親和性。

實例12 用於檢測結合OX40L之抗體的ELISA分析

在室溫下用0.5微克/毫升溶於培育緩衝液(IB=含0.1%吐溫20(Serva)及1%封阻蛋白之PBS)之生物素化OX40L塗佈SA塗佈板(96孔平底ELISA板，Microcoat)1小時。然後用洗滌緩衝液(WB=含有0.1%吐溫20之鹽水)將此等板洗滌2次。

將樣品(細胞培養物上清液或純化之抗體)連續稀釋在IB中並將其添加至各孔中。將板在室溫下培育1小時。隨後用WB將板洗滌2次。然後將針對人類IgG之山羊抗體與POD(Dianova)之偶聯物於IB中稀釋成50奈克/毫升並將其添加至各孔中。將板在室溫下培育1小時。最後，用WB將板洗滌2次並在室溫下(RT)於暗處用即用ABTS^® 溶液(Roche)使其顯色。在最高濃度吸光率達到滿足充分OD後量測405奈米處吸光率。得到之EC50值在3 nM至8 nM範圍內。

實例13 用於檢測抑制人類OX40/人類OX40L間相互作用之抗體的ELISA分析

在室溫下用0.5微克/毫升溶於IB之生物素化OX40L塗佈SA塗佈板(96孔平底ELISA板，Microcoat)1小時。然後用WB(含0.1%(w/v)吐溫^TM 20之PBS緩衝液)將此等板洗滌2次。

將樣品於IB中稀釋成濃度為1微克/毫升並以連續稀釋液形式將其添加至各孔中。為獲得OX40與OX40L之最大結合，在某一孔內僅添加IB。然後向各孔中添加濃度為0.2微克/毫升之偶聯有地高辛(Roche Diagnostics GmbH，DE)的人類OX40溶液。將板在室溫下培育1小時。隨後，用WB將板洗滌2次。將綿羊＜地高辛＞-POD(Roche)於IB中稀釋成50 mU/毫升並將其添加至各孔中。將板在室溫下培育1小時。最後，用WB將板洗滌2次並用即用ABTS^® 溶液(Roche)在室溫下(RT)於暗處使其顯色。10至20分鐘後量測405奈米處之吸光率。得到之IC50值介於1 nM至4 nM之範圍內。

實例14 用於檢測抑制人類OX40與K562細胞上表現之人類OX40L(K562_OX40L細胞)間相互作用之HuMab的FACS-分析

目的：分析測定HuMab hOX40L阻斷經Dig標記之hOX40:hFc融合蛋白與hOX40L表現細胞系K562_hOX40L間相互作用的性質。

程序：以經Dig標記之hOX40:hFc作為「分析試劑」並以HuMab hOX40L作為「競爭物」來實施該分析。

分析試劑：原液0.5微克/微升(以1:10稀釋於PBS中)，100微升抗地高辛-FLUOS(以1:25稀釋於PBS/0.5%BSA/1%封阻劑中)(Roche Diagnostics GmbH，DE)。

於2毫升PBS中洗滌2×10⁵ 個K562_OX40L細胞(生長於 ISF-0中)並將其重懸浮於100微升PBS中。此步驟之後添加存於PBS之競爭物(競爭物/試劑比例係0:1/1:1/1.5:1/2:1/2.5:2/5:1)。此步驟之後在RT及日光下培養，時間為30分鐘。然後添加試劑(存於PBS中)；在RT及日光下培育30分鐘時間。用2毫升PBS洗滌細胞並藉由離心沉澱。添加用於染色之第二抗體(抗地高辛-螢光素，Fab-片段(Roche，1207741))並在4℃下於暗處培育30分鐘。用2毫升PBS洗滌細胞並藉由離心沉澱。此後將細胞重懸浮於0.5毫升PBS中。於一FACS-Scan中實施樣品之量測。

實例15 用於測定抗體對於hOX40/hOX40L信號傳導之抑制能力的功能分析(「NFκB-分析」)

使HeLa野生型(wt)及表現人類OX40之HeLa細胞(HeLa_OX40)生長於最低必需培養基(MEM)、1×丙酮酸鈉、1×非必需胺基酸(Gibco)、10% FCS(且在重組細胞之情形中附加600微克/毫升G418)中。使K562及表現OX40L之K562生長於ISF-O培養基中，且在重組細胞之情形中添加200微克/毫升G418。

將HeLa_wt或HeLa_OX40細胞以3×10⁴ 個細胞/100微升之細胞密度接種於無G418之96孔板中並於一CO₂ 培養箱中過夜培育。以1:1之細胞與細胞比例添加K562_wt或K562_OX40L細胞。將經福爾馬林固定或未經福爾馬林固定之表現OX40L之K562細胞(冷凍於-70℃下)解凍並按1:10稀釋於MEM/10%FCS中；在RT下將K562_OX40L細胞與針對OX40L之抗體預先培養30分鐘。K562_OX40L細胞之刺激時間在30分鐘至150分鐘之間。根據供應商說明書使用購自Active Motif之NE-Kit自細胞核提取蛋白質。使用購自Active Motif之TransAM NFκB-ELISA(根據供應商說明書實施此分析)來測定可引起NFκB活化之OX40-信號傳導。在一Tecan MTP-Reader中於450/620奈米波長吸光率處實施量測。得到之IC50值介於1至5 nM範圍內。

實例16 T-細胞活化分析 分析原理：

以低於最佳濃度之T-細胞有絲分裂原植物凝集素(PHA)活化人類末稍血單核細胞(PBL)，並用過量表現OX40L之K562細胞協同刺激。在分析條件下，於37℃下培育24小時之活化T-細胞可生成IL-2。使用ELISA分析於上清液中量測細胞因子。為測定Mab之阻斷效應，在與PBL共培養之前將K562_OX40L細胞與抗體之適宜稀釋液預先培養1小時。

程序：

藉由密度梯度離心在Histopaque®-1077(Sigma)中自肝素化全血分離人類末稍血單核細胞(PBL)。用漢克氏(Hanks)溶液洗滌之後，使用Turk氏溶液計數細胞，並將細胞以10⁶ 個/毫升濃度重懸於補充有青黴素、鏈徵素及麩胺醯胺(Gibco 10378-016)及10% FBS之RPMI 1640(Gibco)中。將K562對照細胞(野生型)培養於補充有上述物質之相同 RPMI培養基中。將用OX40L轉染之K562細胞培養於補充有終濃度為50毫克/毫升之遺傳素(G418，Gibco)的相同培養基中。用相同培養基將K562細胞(WT或OX40L+)稀釋成1.5×10⁵ 個細胞/毫升，並以50微升/孔(0.75×10⁴ /孔)將其分散於一96孔組織培養板之各孔中。以20微升/孔之體積添加Mab之適宜稀釋液並在37℃下培育1小時。測試各稀釋液，每一稀釋液在兩個孔中重複測試兩次。以100微升/孔之體積(10⁵ 個細胞/孔)添加PBL。PBL與K562細胞之最終比率係約13:1。以20微升/孔(終濃度係0.75微克/毫升)添加PHA(10X)(Sigma L-9132)。用RPMI/10%FCS使每孔總體積達200微升。在37℃下將板於一5% CO₂ -加濕培養箱中培育24小時。將板離心後，收集上清液並藉由ELISA(BD，San Diego，CA，目錄號2627KI)根據廠商說明書測試IL-2。計算IC₅₀ (可阻斷經OX40L刺激之PBL釋放的50% IL-2的Mab濃度)時，需自經K562xOX40L＋細胞刺激之PBL產生之總IL-2中減去對照培養物(PBL+PHA+K562WT)中產生之背景IL-2濃度。IC₅₀ TAG34:0.07μM;LC.001:2nM; LC.005:10 nM。IC₅₀ 值在介於2至10 nM之範圍內。

實例17 測試抗體對由破傷風類毒素刺激之末稍血淋巴細胞之抑制效應的破傷風分析(「TT-分析」)

藉由Ficoll Hypaque自肝素化血液中分離末稍血單核細胞(PBMC)。在大部分情況下本分析使用新鮮分離之PBMC。在一些情況下亦可使用冷藏之PBMC。用於本分析之培養基係含10%人類男性AB血清(Sigma-Aldrich)、2 mM麩胺醯胺及Pen/Strep(抗生素青黴素及鏈黴素之即用混合物(Roche Diagnostics GmbH DE)、重構成於20毫升中之凍乾粉(每1000毫升培養基用2毫升)之RPMI。

為使其黏附於塑料上，將每孔300,000個PBMC於96孔平底板中預先培育過夜。

第二天，於各孔中添加破傷風類毒素(TT)(Chiron Behring)，終濃度為2至5微克/毫升。陽性對照孔(最大增殖/刺激)僅含TT，於其他所有孔中添加抗體(如純化之IgG)，終濃度為10微克/毫升。本分析中包括鼠類Mab TAG-34(終濃度為10微克/毫升)。將培養基自身用作無刺激背景對照。所有分析皆按一式參份實施。

進一步培育(37℃，5%CO₂ ，95%濕度)6天之後，添加³ H-胸腺嘧啶，終濃度為1微居禮(μ Curie)/毫升，且經過16小時之額外培育期之後，收集各板並於β-計數儀中測定納入之³ H-胸腺嘧啶。

實例18 OX40L抗體與小鼠OX40L之交叉反應性

為測定本發明抗體與鼠類OX40L交叉反應之能力，將連續稀釋之抗體及對照抗體與穩定表現mOX40L之K562-mOX40L細胞一起培育。亦評估對K562 WT細胞及穩定表現hOX40L之K562-hOX40L細胞之結合。使用針對鑰孔血藍蛋白(α-KLH)之HuMab抗體作為陰性對照。將抗體RM134L即大鼠抗mOX40L(eBioscience，San Diego，CA) 用作mOX40L表現之陽性對照。將抗體TAG-34即小鼠抗hOX40L(MBL，Nagoya，Japan)用作hOX40L表現之陽性對照。為檢測經結合之人類抗體，使用一偶聯有螢光素(FITC)之山羊抗人類IgG抗體。為檢測經結合之RM134L，使用一生物素化兔抗大鼠IgG抗體(DAKO，Glostrup，Denmark)以及偶聯有藻紅素(PE)之鏈黴抗生物素(DAKO)。為檢測經結合之TAG-34，使用偶聯有FITC之兔抗小鼠IgG抗體。使用Graphpad Prism軟體用非線性回歸(具有可變斜率之S形劑量反應曲線)來確定所測試HuMab在20微克/毫升(Bmax)時有關EC50值或最大結合的計算。

結果：

如由5.16±2.93微克/毫升之EC50值及385.22之Bmax(MFI)值所顯示，本發明LC.001能夠結合hOX40L，但不能結合mOX40L或WT細胞，如分別由11.41及9.67之Bmax(MFI)值所顯示。此外，如由8.19±1.05微克/毫升之EC50值及311.30之Bmax(MFI)值所顯示，本發明LC.001(IgG4)亦能夠有效結合hOX40L，但不能結合mOX40L或WT細胞，如分別由13.47及9.58之Bmax(MFI)值所顯示。如預計般，陰性對照α-KLH未結合任何細胞。因此，本發明OX40L抗體顯示，其對小鼠OX40L之結合較對人類OX40L之結合至少低30倍。

實例19 OX40L HuMab活化補體系統之潛力 C1q及C3c之結合ELISA

為測定本發明抗體誘發C1q結合及C3活化之能力，用連續稀釋之抗體及對照抗體塗佈ELISA板。將非常弱地結合C1q之人類IgG4(The Binding Site，Birmingham，England)用作陰性對照。將人類IgG1(The Binding Site)及α-KLH(IgG1)用作陽性對照。隨後，將已塗佈之抗體與重組C1q或人類混合血清一起培育以作為C3來源。使用針對C1q之兔抗體(DAKO)以及偶聯有辣根過氧化物酶(HRP)之豬抗兔IgG抗體(DAKO)檢測所結合之C1q。使用小鼠抗人類C3c抗體(DAKO)以及偶聯有HRP之兔抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)檢測活化之C3c(經由活化C3產生)。為評估塗佈效率間之差異，用偶聯有HRP之山羊抗人類IgG抗體使經塗佈之抗體顯色。使用Graphpad Prism軟體用非線性回歸(具有可變斜率之S形劑量反應曲線)來確定所測試HuMab在10微克/毫升(Bmax)時有關EC50值或最大結合的計算。

結果：

如由2.19±0.42微克/毫升之EC50值及3.089之Bmax(OD405)值所顯示，本發明LC.001能夠有效結合C1q。此外，如分別由4.17±1.08微克/毫升及2.57±1.51微克/毫升之EC50值所顯示且分別由2.685及3.306之Bmax (OD405)值所顯示，陽性對照人類IgG1及抗KLH二者能夠有效結合C1q。如所預期的那樣，陰性對照人類IgG4未結合C1q，如0.353之OD405 Bmax值所顯示。此外，如0.357之OD405 Bmax值所顯示，本發明LC.001 IgG4x已失去結合C1q之能力。

與C1q結合能力一致，LC.001之C3c沉積以一種抗體-濃度相依方式發生，具有2.67±0.16微克/毫升之EC50值及2.614之Bnax(OD405)值。此外，如分別由5.45±0.36微克/毫升及2.16±0.26微克/毫升之EC50值所顯示且分別由2.543及2.633之Bmax(OD405)值所顯示，陽性對照人類IgG1及抗KLH二者能夠有效沉積C3c。如所預期的那樣，陰性對照人類IgG4未沉積C3c，如0.095之OD405 Bmax值所顯示。引外，如0.090之OD405 Bmax值所顯示，本發明LC.001IgG4x已失去沉積C3c之能力。

實例20 OX40L HuMab結合Fcγ受體I、IIa及IIb之潛力

經IgG誘發之抗體相依性細胞毒性(ADCC)係藉由效應細胞上之Fcγ受體(FcγR)來調介。為測定本發明抗體結合FcγR之能力，將用人類FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb穩定轉染之IIA1.6細胞(源自IIA1細胞之有限稀釋；Jones, B.等人，J. Immunol. 136(1986)348-356)及野生型細胞與連續稀釋之抗體及對照抗體一起培育。使用不結合FcγRI之人類IgG2(The Binding Site有限公司，UK)及不結合FcγRII之人類IgG4(The Binding Site)作為陰性對照。將人類IgG1(The Binding Site)用作FcγRI結合之陽性對照且將人類IgG3(The Binding Site)用作FcγRII結合之陽性對照。使用一針對人類IgG且偶聯有藻紅素(PE)之抗體藉由FACS分析來檢測所結合之抗體。使用Graphpad Prism軟體用非線性回歸曲線擬合(可變斜率)來確定所測試HuMab在10微克/毫升(Bmax)時有關EC50值或最大結合的計算。

如由0.11±0.03微克/毫升之EC50值及8041.54之Bmax(MFI)值所顯示，LC.001能夠有效結合FcγRI(相當於對照IgG1抗體)，但不能結合FcγRIIa及FcγRIIb，如分別由25,06及21,18之Bmax(MFI)值所顯示。

LC.001IgG4x對FcγRI之結合較LC.001更為低效且相當於對照IgG4抗體，具有0.86±0.12微克/毫升之EC50值及6030.07之Bmax(MFI)值。未觀察到LC.001 IgG4x結合FcγRIIa及FcγRIIb(Bmax(MFI)值分別為21.40及19.27)，而對照IgG3抗體能夠結合二者(Bmax(MFI)值分別為536.65及418.59)。因此LC.001IgG4x結合FcγRI之EC50值8倍於抗體LC.001之EC50值。

實例21 OX40L HuMab結合NK細胞上FcγRIIIa之潛力

為測定本發明抗體結合天然殺傷(NK)細胞上FcγRIIIa(CD16)之能力，分離末稍血單核細胞(PBMC)，並在存在或不存在20微克/毫升針對FcγRIIIa之封阻小鼠抗體(抗CD16，純係3G8，RDI，Flanders，NJ)下與20微克/毫升HuMab抗體及對照抗體一起培育以驗證經由FcγRIIIa之結合。將不結合FcγRIIIa之人類IgG2及IgG4(The Binding Site)用作陰性對照。將人類IgG1及IgG3(The Binding Site)用作FcγRIIIa結合之陽性對照。使用經PE標記之小鼠抗人類CD56(NK-細胞表面標記物)抗體(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)以及一經FITC標記之山羊F(ab)₂ 抗人類IgG(Fc)抗體(Protos immunoresearch，Burlingame，CA)藉由FACS分析來檢測結合於NK細胞上之抗體。測定所測試HuMab在20微克/毫升下之最大結合(Bmax)。

如由641.37之Bmax(MFI)值所顯示，LC.001能夠有效結合FcγRIIIa(相當於對照IgG1抗體)。添加一針對FcγRIIIa之封阻抗體可破壞LC.001對NK細胞之結合(與背景染色值145.38相比，Bmax(MFI)值為194.61)。LC.001 IgG4x未結合FcγRIIIa且表現與對照IgG4抗體相當(Bmax(MFI)為170.52)，得到一僅約係LC.001 Bmax之10%的LC.001 IgG4x Bmax。添加一針對FcγRIIIa之封阻抗體對LC.001 IgG4x結合(Bmax(MFI)值為174.26)無影響。

實例22 hMab_hOX40L及MabTAG-34對HUVEC(原代人類臍靜脈內皮細胞/PromoCell)之結合作用

有人闡述內皮細胞可表現hOX40L(Kotani, A.等人，Immunol. Lett. 84(2002)1-7)。人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)可天然表現hOX40L並因此可將其用作「內皮細胞模型」。此分析之目的在於測定HUVEC細胞上之hOX40L在結合抗體TAG-34及LC.001後之命運。

解凍HUVEC並在T175-燒瓶(Sarstedt)中於附加有2%FCS之ECG-M培養基中擴增4天。將細胞鋪於24-孔板中(10,000個細胞/孔)。

3天后將培養基換成ECG-M+0.5% FCS。按10微克/毫升添加抗體(<KLH>(針對鑰孔血藍蛋白之抗體)；TAG-34或LC.001，用於誘發減量調節)並培育2.5小時或24小時。用TAG-34或LC.001將HUVEC細胞重新染色。用針對鼠類IgG且標記有Alexa488(=<m>)或針對人類IgG且標記有Alexa488(=<h>)之二級抗體進行FACS-染色，各用10微克/毫升。在FACS-Scan(Becton Dickinson)中進行FACS量測並計算平均螢光強度(MFI)。

<KLH>抗體用作非專一性陰性對照。

表7顯示，添加LC.001 2.5小時後或24小時後並未引起HUVEC細胞上之OX40L表現之減量調節(比較曲線4與曲線5及6)。然而添加TAG34 2.5小時後以及24小時後皆顯示出(約3-倍)HUVEC細胞上hOX40L表現之強烈減量調節(比較曲線10與曲線11及12)。

濃度為10微克/毫升之本發明抗體不會誘發HUVEC細胞上OX40L表現之減量調節。

實例23 TAG34、LC.001及LC.005之西方墨點分析

製備40至100奈克hOx40L-His(R&D Systems，理論大小為28至34 kDa)及分子量標記物Magik Mark XP(Invitrogen;20、30、40、50、60、80、100、120、220 kDa)以用於凝膠電泳。因此將x微升蛋白質、2.5微升NuPage LDS(十二烷基磺酸鋰鹽)樣品緩衝液(4×)、1微升NuPage還原劑(10×)加10微升H₂ O合併在一起並使其於70℃變性10分鐘。然後將樣品上樣於NuPage凝膠(Novex;10%Bis-Tris)上並在150 V下於1×MOPS電泳緩衝液(Novex)中電泳1小時。

於一半乾室中使用1×NuPage轉移緩衝液(1×緩衝液，0.1%抗氧化劑，10%甲醇)藉由半乾印跡儀(Semi-Dry-Blot)將凝膠印跡於PVDF膜上(Millipore；藉由在甲醇中培育5分鐘及在1×轉移緩衝液中培育10分鐘來將膜活化)，在50 mA電流下持續1小時。在RT下於1×PBS/5%牛奶/0.5%吐溫中將膜震盪封阻1小時。將一級抗體(pAB)稀釋於1×PBS/1%牛奶/0.5%吐溫中、並在添加其之後在4℃下培育過夜。

LC.001:4毫升總體積中有1.9微升(1.6微克)

LC.005:1.1微升(1.6微克)/4毫升

TAG34:1.6微升(1.6微克)/4毫升

於1×PBS/0.5%吐溫中將膜洗滌3次，每次10分鐘。將二級抗體(sAB)稀釋於1×PBS/1%牛奶/0.5 %吐溫中，並在添加其之後在RT下培育1.5小時。對於LC.001及LC.005，使用針對人類IgG之多株抗體(Pierce)(以1:10000稀釋)作為sAB；對於TAG34，使用來自Lumi-Light西方墨點分析套組(Lumi-Light Western Blotting Kit)(Roche)之針對小鼠IgG之多株抗體(以1:400稀釋)作為sAB。用1×PBS/0.5%吐溫將膜洗滌2次，每次30分鐘。根據廠商說明書使用Lumi-Light西方墨點分析套組(Roche)進行檢測。LC.001能夠檢測(經十二烷基磺酸鹽)變性之OX40L而LC.005及TAG34不結合變性OX40L。

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Claims

一種可結合至OX40L之抗體，其特徵在於該抗體包括由胺基酸序列SEQ ID NO：1定義之輕鏈可變結構域及由SEQ ID NO：2定義之重鏈可變結構域。
如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體包括由SEQ ID NO：13定義之κ輕鏈恒定區。
如請求項1或2之抗體，其特徵在於該抗體包括由SEQ ID NO：14定義之恒定區。
如請求項1或2之抗體，其特徵在於該抗體係Fab、F(ab')₂ 或單鏈片段。
一種核酸分子，其編碼如請求項1至4中任一項之抗體。
一種載體，其包含如請求項5之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項6之載體。
一種用於製備如請求項1至4中任一項之抗體的方法，其包括在可合成該抗體之條件下培養如請求項7之宿主細胞及自該培養物中回收該抗體。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至4中任一項之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
如請求項1或2所定義之抗體，其係用於預防及治療發炎疾病。
一種如請求項1至4中任一項所定義之抗體用於製備供預防及治療發炎疾病之藥物的用途。