RS62930B1 - Postupak za pripremu suštinski dijastereomerno čistog fosforodiamidatnog oligomera, fosforodiamidatni oligomer proizveden takvim postupkom i farmaceutska kompozicija koja sadrži fosforodiamidatni oligomer - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Otelotvorenja mogu da se odnose na pripremu suštinski dijastereomerno čistih aktiviranih monomera koji su morfolino podjedinice fosforamidohloridata. Otelotvorenja takođe mogu da se odnose na upotrebu suštinski dijastereomerno čistih aktiviranih fosforilovanih morfolino monomera za pripremu molekula putem reakcija stereospecifičnog kuplovanja.

Pozadina pronalaska

[0002] Sinteza dijastereomerno čistih fosforodiamidatnih oligomera je u velikoj meri zakomplikovana postojanjem hiralnih fosfornih veza. To je u suprotnosti, na primer, sa fosfodiestarskim vezama, koje nemaju hiralni fosfor. Primeri se mogu videti na SL. 1, koja upoređuje fosfodiestar, fosforotioat (koji takođe uključuje hiralni fosfor) i fosforodiamidat

[0003] Postojanje hiralnog fosfora predstavlja značajne izazove za sintetičke pristupe koji uključuju povezivanje niza fosforodiamidatnih nukleotida. Nedostatak stereohemijski čistih reagensa (šabloni, podjedinice, gradivni blokovi) koji omogućavaju stereospecifični nastanak fosforodiamidatnih veza dovodi do reakcije u stereocentru kod koje hiralnost fosfora dobijenog jedinjenja ne može da se kontroliše.

[0004] Kao što je grafički prikazano na SL.2, upotreba dijastereomernih smeša nukleotida za stereohemijski nekontrolisano kuplovanje za pripremu oligonukleotida bilo koje značajne dužine i sekvence daje heterogenu smešu brojnih dijastereomera. Broj dijastereomera je teoretski 2<(n-1)>, gde je n broj nukleotida koji su povezani da grade oligonukleotid. Kao što je prikazano na SL.2, čak i mali oligonukleotid od četiri nukleotida (tetranukleotid) može dovesti do nastanka smeše osam različitih dijastereomera.

[0005] Zbog nastanka značajnog broja dijastereomera mogu biti potrebne osetljive tehnike razdvajanja nakon sinteze. Na prinos željenog proizvoda može nepovoljno uticati upotreba sirovih supstanci za pripremu višestrukih dijastereomera koji nisu poželjni.

[0006] WO2011/150408 opisuje oligonukleotidna jedinjenja koja su korisna kao antisens jedinjenja koja sadrže modifikovane veze između podjedinica i/ili terminalne grupe. US2012/289457 opisuje oligonukleotidna jedinjenja koja su korisna kao antisens jedinjenja, koja su konjugovana sa peptidima koji prodiru u ćeliju.

[0007] Bilo bi korisno da može da se izabere specifični dijastereomer pre sinteze, zatim da se izabrani dijastereomer sintetiše u stereohemijski čistom ili suštinski čistom obliku.

KRATAK SAŽETAK

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu suštinski dijastereomerno čistog fosforodiamidatnog morfolino oligomera koji sadrži hiralne fosforne veze, koji obuhvata:

odabir suštinski stereohemijski čistih fosforamidohloridatnih morfolino monomera; i

sintezu suštinski dijastereomerno čistog fosforodiamidatnog morfolino oligomera putem stereospecifičnog kuplovanja izabranih suštinski stereohemijski čistih fosforamidohloridatnih morfolino monomera, pri čemu se pomenuto stereospecifično kuplovanje vrši u aprotičnom rastvaraču, u prisustvu nenukleofilnog tercijarnog amina ili aromatične baze, na temperaturi do 20°C do 50°C;

pri čemu se suštinski stereohemijski čisti fosforamidohloridatni morfolino monomeri dobijaju razdvajanjem dijastereomerne smeše fosforamidohloridatnih morfolino monomera na suštinski stereohemijski čiste fosforamidohloridatne monomere, i

pri čemu suštinski stereohemijski čist označava enantiomere ili dijastereoizomere koji su u enantiomernom, odnosno dijastereomernom višku, koji je jednak ili veći od 87%, a suštinski dijastereomerno čist označava dijastereoizomere koji su u dijastereomernom višku koji je jednak ili veći od 87%; i

suštinski dijastereomerno čisti fosforodiamidatni morfolino oligomer koji sadrži hiralne fosforne veze dobijen postupkom iz pronalaska, i

farmaceutsku kompoziciju koja sadrži suštinski dijastereomerno čist fosforodiamidatni morfolino oligomer ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, koji sadrže hiralne fosforne veze, proizvedenu postupkom iz pronalaska.

[0009] Dalja otelotvorenja predmetnog opisa mogu da obezbede jedan ili više stereohemijski čistih ili suštinski stereohemijski čistih jedinjenja iz Tabele 1. Dalja otelotvorenja takođe mogu da obezbede enantiomere jedinjenja iz Tabele 1. Stereohemija tih jedinjenja obično se razlikuje od stereohemije jedinjenja iz Tabele 1 usled izmene stereohemije morfolino prstena.

TABELA 1

[0010] R1i R2mogu biti isti ili različiti i mogu biti -H, opciono supstituisani C1-C3 alkil, opciono supstituisani fenil, opciono supstituisani naftil ili, sa azotom za koji su vezani, grade opciono supstituisani heterocikl, koji može biti, na primer, pirolidin, piperazin ili morfolin.

[0011] Opciono supstituisani ostaci mogu biti supstituisani sa jednim ili više od metila, etila, halogena, nitro, metoksi ili cijano.

[0012] R3može biti tritil (Tr) koji može biti supstituisani tritil, uključujući, bez ograničenja, recimo MMTr (p-metoksifenildifenilmetil), opciono supstituisani benzil, 4-metoksibenzil (PMB, MPM), 3,4-dimetoksibenzil, difenilmetil (Dpm), ili sulfonil, koji može biti raskidivi sulfonil. U nekim otelotvorenjima, sulfonil je 2-nitrobenzensulfonil, 4-nitrobenzensulfonil ili 2,4-dinitrobenzensulfonil.

[0013] R4, R5, R6mogu biti -H, ―C(O)R7ili ―C(O)OR7, pri čemu, R7je alkil (metil, etil, izopropil ili drugi C1-C6 alkil), benzil, 2,2,2-trihloretil ili aril (uključujući, bez ograničenja, fenil, 4-metoksi fenil, 4—bromfenil i 4-nitrofenil). R9može biti opciono supstituisani alkil, cijanoetil, acil, karbonat, karbamat, opciono supstituisani benzil, 4-pivaloiloksi benzil i silil.

[0014] U daljim otelotvorenjima, morfolino nukleozidi, pored onih koji su prikazani u Tabeli 1, mogu da se pripreme u dijastereomerno čistom ili suštinski dijastereomerno čistom obliku.

[0015] Otelotvorenja takođe mogu da obezbeđuju postupke za razdvajanje dijastereomernih smeša prethodno otkrivenih jedinjenja na stereohemijski čista ili suštinski stereohemijski čista jedinjenja. Dalja otelotvorenja mogu da obezbede farmaceutske kompozicije koje sadrže stereohemijski čista ili suštinski stereohemijski čista jedinjenja kao što je ovde objavljeno. Dalja otelotvorenja mogu da obezbede farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljive soli stereohemijski čistih ili suštinski stereohemijski čistih jedinjenja kao što je ovde objavljeno. Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju u delotvornim količinama na pacijentima kojima je potrebno lečenje. Farmaceutske kompozicije mogu dalje da uključuju farmaceutski prihvatljive nosače.

[0016] U nekim otelotvorenjima, sledeći ostatak u svakom od jedinjenja iz Tabele 1 može biti supstituisan na pozicijama a, b i e sa jednom ili dve metil grupe, i može biti supstituisan na pozicijama c i d jednom metil grupom. U svakom slučaju, metil grupa može biti orijentisana ka bilo kojoj strani ravni morfolino prstena. U daljim otelotvorenjima, dodatni metilen, opciono supstituisan sa jednom ili više metil grupa, može biti umetnut pored azota u morfolino grupi kako bi se omogućila ekspanzija u sedmočlani prsten.

[0017] Otelotvorenja dalje obezbeđuju pripremu stereohemijski čistih oligonukleotida putem stereospecifičnog kuplovanja aktiviranih monomera. Dalja otelotvorenja obezbeđuju suštinski dijastereomerno čisti oligomer proizveden stereospecifičnim kuplovanjem aktiviranih monomera. Još dalja otelotvorenja obezbeđuju suštinski dijastereomerno čiste kompozicije koje sadrže suštinski dijastereomerno čista jedinjenja, kako su ovde objavljena.

OPIS NEKOLIKO PRIKAZA SLIKA

[0018]

SL. 1 prikazuje fosfodiestarske, fosforotioatne i fosforodiamidatne oligonukleotidne veze.

SL. 2 prikazuje R- i S- fosforne veze u fosforodiamidatnom morfolino oligomeru (PMO). SL.2 takođe prikazuje proliferaciju dijastereomera koja se obično javlja kada se dijastereomerne smeše fosforodiamidatnih oligomernih prekursora koriste za sintezu dinukleotida (dimera), trinukleotida (trimera), tetranukleotida (tetramera) i N-mera.

SL. 3 prikazuje pripremu dijastereomerno čistih dinukleotida, koristeći dijastereomerno čiste fosforamidohloridate i koristeći dijastereomernu smešu fosforamidohloridata.

SL. 4A i SL.4B prikazuju uopštene dijastereomerne smeše fosforamidohloridata koje mogu biti korisne za pripremu dijastereomerno čistih ili suštinski dijastereomerno čistih dijastereomernih podjedinica.

SL. 5 prikazuje pripremu dijastereomerno čistih (homogenih) oligonukleotida koristeći dijastereomerno čiste fosforamidohloridate, kao što je ovde objavljeno.

SL. 6 prikazuje šemu za stereospecifičnu sintezu 16-mernih PMO i diferencijaciju stereoizomera pomoću biofizičkog testa.

SL. 7 prikazuje tačke topljenja za stereoizomere 1 i 2 iz primera koji prikazuje stereospecifičnu sintezu 16-mernih PMO i diferencijaciju stereoizomera biofizičkim testom, kako je objavljeno u nastavku.

SL. 8 prikazuje ORTEP crtež kristalnog jedinjenja 100, kako je objavljeno u nastavku.

SL. 9A i SL. 9B prikazuju ORTEP crteže dva fragmenta jedinjenja 100, kako je objavljeno u nastavku.

DETALJAN OPIS

[0019] Otkrili smo da dva dijastereomera aktiviranih morfolino podjedinica mogu da se sortiraju po svojim fizičkim svojstvima, što omogućava pripremu dijastereomerno čistih izomera. To omogućava pripremu stereohemijski čistih ili suštinski stereohemijski čistih PMO u uslovima kontrolisane reakcije, koji zatim mogu da se koriste za selektivnu pripremu oligonukleotida sa željenom stereohemijom.

[0020] Otelotvorenja takođe mogu da obezbeđuju postupke za razdvajanje dijastereomernih smeša prethodno otkrivenih jedinjenja na stereohemijski čista ili suštinski stereohemijski čista jedinjenja. Nakon što su razdvojeni, čisti dijastereomeri iz nekada dijastereomerne smeše mogu da se koriste da se pripreme dijastereomerno čista jedinjenja putem reakcija stereospecifičnog kuplovanja.

[0021] Dijastereomerno čista jedinjenja i suštinski dijastereomerno čista jedinjenja pripremljena kao što je ovde prikazano mogu biti dijastereomerno čisti fosforodiamidatni oligonukleotidi. Ti dijastereomerno čisti i suštinski dijastereomerno čisti fosforodiamidatni oligonukleotidi mogu imati više primena. Na primer, mogu biti korisni kao lekovi. Mogu da se biraju zbog svojstava koja su potencijalno superiorna u odnosu na svojstva heterogenih smeša (stereo-nasumične smeše) dijastereomera fosforodiamidatnih oligonukleotida. Na primer, mogu da se izaberu zbog razlika u potentnosti, delotvornosti, stabilnosti, bezbednosti i specifičnosti. Dijastereomerno čisti i suštinski dijastereomerno čisti oligomeri mogu imati fizička, hemijska i biološka svojstva koja se razlikuju od svojstava stereohemijski heterogenih smeša oligomera.

[0022] „Stereoizomeri“ se odnosi na izomere koji se razlikuju samo po rasporedu atoma u prostoru.

[0023] „Dijastereomeri“ se odnosi na stereoizomere koji nisu međusobno preslikani prikazi.

[0024] „Enantiomeri“ se odnosi na stereoizomere koji nisu međusobno preslikani odrazi koji se preklapaju. Enantiomeri uključuju „enantiomerno čiste“ izomere koji sadrže suštinski jedan enantiomer, na primer, više najmanje 90%, 92%, 95%, 98%, ili 99%, ili 100% jednog enantiomera.

1

[0025] „Aktivirani monomer“ odnosi se na 5'-O-fosforilovane morfolino podjedinice koje imaju reaktivni fosfor sa odlazećim grupama, uključujući, bez ograničenja, hloridne i halidne odlazeće grupe, koje podležu reakciji izmene sa nukleofilima, uključujući, bez ograničenja, amine i alkohole.

[0026] „R“ i „S“ kao termini koji opisuju izomere odnose se na stereohemijsku konfiguraciju na asimetrično supstituisanim atomima, uključujući, bez ograničenja: ugljenik, sumpor, fosfor i amonijumov azot. Označavanje asimetrično supstituisanih atoma kao „R“ ili „S“ se vrši primenom Kan-Ingold-Prelogovih pravila prioriteta, kao što je dobro poznato stručnjacima za ovu oblast, i opisano u Pravilima za nomenklaturu u organskoj hemiji Međunarodne unije za čistu i primenjenu hemiju (IUPAC). Odeljak E, Stereohemija.

[0027] Enantiomer može da se okarakteriše pomoću smera u kome obrće ravan polarizovane svetlosti, kao što je dobro poznato stručnjacima u oblasti hemije. Ako obrće svetlost u smeru kazaljke na satu (iz ugla posmatrača ka kome svetlost putuje), enantiomer se obeležava sa (+), i označava se kao dekstrorotatorni. Njegov odraz će obrtati ravan polarizovane svetlosti u smeru obrnutom od kazaljke na satu, i obeležava se kao (―) ili levorotatorni. Smer obrtanja ravni polarizovane svetlosti putem enantiomerno čistog jedinjenja, nazvan znak optičke rotacije, može lako da se izmeri standardnim uređajem koji se zove polarimetar.

[0028] „Racemska“ označava smešu koja sadrži jednake delove pojedinačnih enantiomera.

[0029] „Neracemska“ označava smešu koja sadrži nejednake delove pojedinačnih enantiomera. Neracemska smeša može biti obogaćena R- ili S-konfiguracijom, uključujući, bez ograničenja, oko 50/50, oko 60/40 i oko 70/30 smeše R- prema S-enantiomeru ili S- prema R-enantiomeru.

[0030] „Suštinski stereohemijski čist“ i „suštinska stereohemijska čistoća“ odnose se na enantiomere ili dijastereomere koji su u enantiomernom višku, odnosno dijastereomernom višku, koji je 80% ili veći. U nekim otelotvorenjima, „suštinski stereohemijski čist“ i „suštinska stereohemijska čistoća“ odnose se na enantiomere ili dijastereomere koji su u enantiomernom višku, odnosno dijastereomernom višku, koji je jednak ili veći od 87%, jednak ili veći od 90%, jednak ili veći od 95%, jednak ili veći od 96%, jednak ili veći od 97%, jednak ili veći od 98%, ili jednak ili veći od 99%. „Suštinski dijastereomerno čisto“ odnosi se na dijastereomere sa dijastereomernim viškom koji je jednak ili veći od 87%, jednak ili veći od 90%, jednak ili veći od 95%, jednak ili veći od 96%, jednak ili veći od 97%, 98%, ili jednak ili veći od 99%.

[0031] „Enantiomerni višak“ (ee) enantiomera je [(molska frakcija glavnog enantiomera) minus (molska frakcija sporednog enantiomera)]×100. Dijastereomerni višak (de) dijastereomera u smeši dva dijastereomera se definiše analogno tome.

[0032] „Farmaceutski prihvatljiva so“, kako se ovde koristi, odnosi se na kisele adicione soli ili bazne adicione soli jedinjenja iz predmetnog otkrića. Farmaceutski prihvatljiva so je bilo koja so koja zadržava aktivnost matičnog jedinjenja i ne vrši nepotrebno štetno ili neželjeno dejstvo na ispitaniku na kome će se primeniti, i u kontekstu u kome će se primenjivati. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, bez ograničenja, komplekse metala i soli neorganskih i karboksilnih kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli takođe uključuju soli metala kao što su soli aluminijuma, kalcijuma, gvožđa, magnezijuma, mangana, i kompleksne soli. Pored toga, farmaceutski prihvatljive soli uključuju, bez ograničenja, soli kiselina kao što su sirćetna, asparaginska, alkilsulfonska, arilsulfonska, aksetilna, benzensulfonska, benzojeva, bikarbonatna, bisumporna, bivinska, buterna, kalcijum edetat, kamsilicilna, ugljena, hlorobenzojeva, limunska, etilendiamin tetrasirćetna, etandisulfonska, estolna, esilna, etansulfonska, mravlja, fumarna, glukoheptonska, glukonska, glutaminska, glikolna, glikolilarsanilna, heksaminska, heksilrezorcinska, hidrabaminska, bromovodonična, hlorovodoniča, jodovodonična, hidroksinaftoinska, izetionska, mlečna, laktobionska, maleinska, jabučna, malonska, mandelinska, metansulfonska, metilazotna, metilsumporna, mucinska, mukonska, napsilicilna, azotna, oksalna, p-nitrometansulfonska, pamoinska, pantotenska, fosforna, monohidrogen fosforna, dihidrogen fosforna, ftalna, poligalakturonska, propionska, salicilna, stearinska, sukcinska, sulfaminska, sulfanilna, sulfonska, sumporna, taninska, vinska, teoklinska, toluensulfonska, i slično.

[0033] „Delotvorna količina“ kombinacije terapeutskih agensa (npr. jedinjenje 1 i inhibitor CDK 4/6) je količina koja je dovoljna da obezbedi uočljivu terapeutsku korist u poređenju sa HCC ili IHCC koji je ostao nelečen kod ispitanik ili pacijenta.

[0034] Ovde objavljeni aktivni agensi mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kako bi se dobile njegove farmaceutske formulacije. Konkretan izbor nosača i formulacije će zavisiti od konkretnog načina primene za koji je kompozicija predviđena.

[0035] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, odnosi se na netoksični nosač, adjuvans ili vehikulum koji ne uništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim se formuliše. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi ili vehikulumi koji mogu da se koriste u kompozicijama iz ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, sorbinsku kiselinu, kalijum sorbat, smeše delimičnih glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektrolita, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silicijum dioksid, magnezjium trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetil celulozu, poliakrilate, voskove, polietilen glikol i lanolin.

[0036] Kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu biti pogodne za parenteralnu, oralnu primenu, sprej za inhalaciju, topikalnu, rektalnu, nazalnu, bukalnu, vaginalnu primenu ili primenu putem implantiranog rezervoara, itd. U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži sastojke koji su iz prirodnih ili neprirodnih izvora. U nekim otelotvorenjima, formulacija ili nosač mogu da se obezbede u sterilnom obliku. Neograničavajući primeri za sterilni nosač uključuju vodu bez endotoksina ili vodu bez pirogena.

[0037] Termin „parenteralna“, kako se ovde koristi, uključuje supkutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatičke, intralezione i intrakranijalne tehnike injekcije ili infuzije. U konkretnim otelotvorenjima, jedinjenja se primenjuju intravenski, oralno, supkutano ili putem intramuskularne primene. Sterilni injektabilni oblici kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti vodena ili uljana suspenzija. Ove suspenzije mogu biti formulisane u skladu sa tehnikama koje su poznate u struci, koristeći odgovarajuće disperzivne agense ili kvašljivce i suspendujuće agense. Sterilni injektabilni preparat takođe može biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču. U prihvatljive vehikulume i rastvarače koji mogu da se koriste spadaju voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se uobičajeno koriste kao rastvarač ili suspendujući medijum.

[0038] Otelotvorenja iz pronalaska obezbeđuju pripremu stereohemijski čistih izomera ili suštinski stereohemijski čistih izomera, nakon čega sledi upotreba čistih izomera da se stereospecifično pripreme dijastereomerno čisti fosforodiamidatni morfolino oligomeri (PMO). Priprema može biti razdvajanjem dijastereomerne smeše nukleotida fosforamidohloridata.

1

Razdvajanje može da se obavi, na primer, hromatografijom, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi ili „HPLC“. Razdvajanje takođe može da se obavi kristalizacijom.

[0039] Razdvojeni monomeri mogu da se nazivaju „aktivni“ monomeri. Pod „aktivnim“ se podrazumeva da monomeri sadrže fosforamidohloridatni ostatak koji je reaktivan sa različitim nukleofilima, što uključuje, bez ograničenja: amine, alkohole/alkokside, tiol/tiolat, alkil litijum i Grinjarov reagens.

I. Priprema dijastereomernih izomera

[0040] U jednom otelotvorenju, stereohemijski čisti ili suštinski stereohemijski čisti aktivirani monomeri mogu da se pripreme razdvajanjem dijastereomerne smeše monomera. Razdvajanje može da se ostvari postupcima koji omogućavaju razlikovanje stereoizomera koristeći fizička svojstva. Na primer, razdvajanje može da se ostvari hromatografijom ili kristalizacijom. Pogodne vrste hromatografije uključuju, na primer, bez ograničenja, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), simuliranu hromatografiju sa pokretnim slojem, protivstrujnu hromatografiju i druge vrste separativne hromatografije. Na primer, dijastereomerna smeša može biti podvrgnuta HPLC, eluiranjem brze frakcije i spore frakcije. Svaka od ovih frakcija je različita stereohemijski čista ili suštinski stereohemijski čista količina monomera. Kao što je opisano u nastavku, ti monomeri mogu da se koriste za pripremu oligomera sa željenom stereohemijom putem stereospecifičnog kuplovanja koristeći uslove kontrolisane reakcije.

[0041] Dalje smo utvrdili da, nakon što se razdvoje, stereohemijski čisti aktivirani monomeri imaju dovoljnu stabilnost za korišćenje u daljim hemijskim reakcijama. Nadalje, utvrdili smo da stereohemijski čisti aktivirani monomeri mogu da se podvrgnu stereospecifičnim hemijskim reakcijama. Tako, kao što je detaljnije razmotreno u nastavku, ti stereohemijski čisti aktivirani monomeri mogu da se koriste za stereospecifične reakcije kuplovanja za pripremu stereohemijski čistih proizvoda.

[0042] Kao što je prethodno navedeno, otelotvorenja mogu da obezbede jedno ili više stereohemijski čistih ili suštinski stereohemijski čistih jedinjenja iz Tabele 1, koja mogu da se pripreme koristeći različita fizička svojstva stereoizomera. Dalja otelotvorenja takođe mogu da obezbede enantiomere jedinjenja iz Tabele 1. Stereohemija tih jedinjenja obično se razlikuje od stereohemije jedinjenja iz Tabele 1 usled izmene stereohemije morfolino prstena.

TABELA 1

1

1

1

[0043] pri čemu, R3 je opciono supstituisani trifenilmetil (naziva se i „tritil“), opciono supstituisani benzil ili sulfonil. R4, R5 i R6 mogu biti ―C(O)R7 ili ―C(O)OR8, gde je R7 metil, etil ili fenil, a R8 je benzil ili 2,2,2-trihloretil. R9može biti opciono supstituisani alkil, cijanoetil (za upotrebu kao zaštitna grupa, vidite, na primer, U.S. publikaciju patentne prijave br. US2013/0197220), acil, sulfonil, acetal/ketal, karbonat, karbamat, opciono supstituisani benzil, 4-pivaloiloksi benzil i silil.

[0044] U nekim otelotvorenjima, opciono supstituisani benzil je 4-metoksibenzil (PMB, MPM). U nekim otelotvorenjima, sulfonil je raskidivi sulfonil. U nekim otelotvorenjima, sulfonil je 2-nitrobenzensulfonil, 4-nitrobenzensulfonil ili 2,4-dinitrobenzensulfonil.

[0045] R1 i R2 mogu biti isti ili različiti i mogu biti -H, opciono supstituisani C1-C3 alkil, opciono supstituisani fenil, opciono supstituisani naftil ili, sa azotom za koji su vezani, grade opciono supstituisani heterocikl koji može biti, na primer, pirolidin, piperazin ili morfolin.

[0046] Opciono supstituisani ostaci mogu biti supstituisani sa jednim ili više od metila, etila, halogena, nitro ili cijano.

[0047] R3 može biti tritil (Tr) koji može biti supstituisani tritil, uključujući, bez ograničenja, recimo MMTr (p-metoksifenildifenilmetil), benzil, 4-metoksibenzil (PMB, MPM) i 3,4-dimetoksibenzil, difenilmetil (Dpm),

[0048] R4, R5, R6 mogu biti -H, ―C(O)R7 ili ―C(O)OR7, pri čemu, R7 je alkil (metil, etil, izopropil ili drugi C1-C6 alkil) ili aril (uključujući, bez ograničenja, fenil, 4-metoksi fenil, 4— bromfenil i 4-nitrofenil).

1

II. Stereospecifično kuplovanje

[0049] Pored utvrđivanja da tehnologija za razdvajanje može da se koristi za pripremu suštinski stereohemijski čistih količina aktiviranog monomera, utvrdili smo da ti aktivirani monomeri mogu, u nekim reakcionim uslovima, da se koriste za ostvarivanje stereospecifičnog kuplovanja za pripremu stereohemijski čistih dinukleotida, stereohemijski čistih trinukleotida i većih stereohemijski čistih oligomera. Koristeći ovde objavljene postupke, hiralnost novonastale PMO veze može specifično da se kodira putem hiralnosti stereohemijski čistih aktivnih monomera koji se koriste za građenje oligomera.

[0050] Uobičajeni reakcioni uslovi za stereospecifično kuplovanje uključuju reakciju u aprotičnim rastvaračima. Ti rastvarači mogu biti, na primer, ali nisu ograničeni na, acetonitril, tetrahidrofuran (THF), 1,3-dimetilimidazolidinon (DMI), dimetilformamid (DMF), N-metil-2-pirolidinon (NMP), dimetilacetamid (DMAc), dihlormetan (DCM), 1,2-dihloretan (DCE), hloroform, 1,4-dioksan, etil acetat, 2-metiltetrahidrofuran i izopropil acetat. Reakcije kuplovanja mogu da se vrše u prisustvu nenukleofilnih tercijarnih aminskih baza i aromatičnih baza. Pogodne baze uključuju, ali nisu ograničene na, diizopropiletilamin, trietilamin, 2,6-lutidin, trimetilpiridine (kolidine) i N-etilmorfolin. Reakcione temperature mogu biti u rasponu od sobne temperature (oko 20°C) do 50°C. Sonifikacija može da se primeni u nekim slučajevima kako bi se potpomoglo rastvaranje supstrata.

[0051] Kako bi se pokazala izvodljivost stereospecifičnog kuplovanja, više suštinski stereohemijski čistih PMO dinukleotida je pripremljeno putem stereospecifičnog PMO kuplovanja brzo i sporo eluirajućih suštinski stereohemijski čistih aktivnih monomera (fosforamidohloridata). Tabela 2, ispod, rezimira HPLC retencione profile tih suštinski stereohemijski čistih PMO dinukleotida. Tabela poredi retenciona vremena za dinukleotide koji su pripremljeni od kombinacija monomera 5'-kraja, koji su navedeni u levoj strani tabele, sa brže eluirajućim i sporije eluirajućim izomerima monomera 3'-kraja, koji su navedeni na vrhu. Tabela pokazuje da stereospecifično kuplovanje suštinski stereohemijski čistih aktivnih monomera proizvodi različite dijastereomerno čiste dinukleotide sa različitim fizičkim svojstvima.

1

TABELA 2:

2

[0052] Uslovi analitičke HPLC za profilisanje suštinski stereohemijski čistih PMO dinukleotida iz Tabele 2 su navedeni u nastavku:

PRIMERI

III. Primeri dijastereomernog razdvajanja aktiviranih monomera

[0053] Sledeći primeri prikazuju dijastereomerno razdvajanje aktiviranih monomera u skladu sa određenim otelotvorenjima koja su ovde prikazana.

A. U-monomeri

[0054]

dijastereomerna smešabrzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0055] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane U monomere:

[0056] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane U monomere:

[0057] Chiralpak IC, 21 × 250 mm, 5 µ; eluirajte kolonu sa 11 ml/minutu etil acetata, sobna temperatura, detekcija na 260 nm.

[<1>H-NMR podaci za U1]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.18 (br, 1H), 7.45 (m, 6H), 7.15-7.32 (m, 10H), 6.12 (dd, 1H, J= 2.0 & 9.6 Hz), 5.62 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.11 (m, 2H), 3.39 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.65 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.39 (t, 1H, J= 11 Hz)

[<1>H-NMR podaci za U2]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.07 (br, 1H), 7.44 (m, 6H), 7.14-7.34 (m, 10 H), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 9 Hz), 5.61 (d, 1H, 8.0 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.08 (m, 2H), 3.39 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.46 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.38 (t, 1H, J= 11 Hz),

B. A-monomeri

[0058]

dijastereomerna smešabrzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0059] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane A monomere:

[0060] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane A monomere:

Chiralpak IC, 21 × 250 mm, 5 u; eluirajte sa 100% etil acetata pri 15 ml/minutu, sobna temperatura, uv detekcija na 260 nm.

[1H-NMR podaci za A1]

2

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.01 (br, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.00 (m, 3H), 7.58 (m, 1H), 7.4-7.6 (m, 8 H), 7.2-7.4 (m, 10H), 6.42 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 4.51 (m, 1H), 4.12 (m, 3H), 3.54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.62 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.81 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.62 (t, 1H, J= 11 Hz)

[<1>H-NMR podaci za A2]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.04 (br, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.00 (m, 3H), 7.56 (m, 1H), 7.4-7.6 (m, 8H), 7.2-7.4 (m, 10H), 6.41 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 4.51 (m, 1H), 4.12 (m, 3H), 3.54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 1.82 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.63 (t, 1H, J= 11 Hz)

C. C-monomeri

[0061]

dijastereomerna smešabrzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0062] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane C monomere:

[0063] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane C monomere:

Chiralpak IC eluirana pri 15 ml/minutu sa 75% etil acetata i 25% n-heptana. Sobna temperatura i uv detekcija na 260 nm.

[<1>H-NMR podaci za C1]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, 1H, J= 7.8 Hz), 7.43 (m, 6H), 7.33 (d, 1H, J= 7.4 Hz), 7.15-7.32 (m, 9H), 6.18 (dd, 1H, J= 2.2 & 9.2 Hz), 4.42 (m, 1H), 4.08-4.16 (m, 2H), 3.54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.14 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.51 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.25 (m, 1H).

[<1>H-NMR podaci za C2]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (d, 1H, J= 7.8 Hz), 7.43 (m, 6H), 7.32 (d, 1H, J= 7.4 Hz), 7.15-7.32 (m, 9H), 6.19 (dd, 1H, J= 2.1 & 9.2 Hz), 4.41 (m, 1H), 4.06-4.15 (m, 2H), 3.54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.25 (m, 1H)

[0064] D. G-monomeri (guanin mono-zaštićeni)

<dijastereomerna smeša>brzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

2

[0065] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane G monomere:

[0066] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane G monomere:

Chiralpak IC eluirana pri 15 ml/minutu sa 100% etil acetata. Sobna temperatura i uv detekcija na 260 nm.

E. T-monomeri

[0067]

dijastereomerna smešabrzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0068] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane T monomere:

2

[0069] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane T monomere:

Chiralpak IC, 50 × 500 mm, 20 u. Eluirajte kolonu pri 60 ml/minutu etil acetatom, sobna temperatura, detekcija na 260 nm. Retenciona vremena su 25 i 40 minuta.

[1H-NMR podaci za T1]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.4-7.5 (m, 5H), 7.26-7.33 (m, 6H), 7.16-7.22 (m, 3H), 7.04 (d, 1H, J= 1 Hz), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.12 (m, 2H), 3.37 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 1.83 (d, 1H, J= 1 Hz), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.41 (t, 1H, J= 11 Hz))

[1H-NMR podaci za T2]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.4-7.5 (m, 6H), 7.24-7.35 (m, 6H), 7.14-7.22 (m, 3H), 7.03 (s, 1H), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.09 (m, 2H), 3.37 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.48 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.40 (t, 1H, J= 11 Hz)

F. C-monomeri (NBz)

2

dijastereomerna smešabrzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0071] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane C monomere (NBz):

[0072] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane C monomere (NBz):

Chiralpak IB, 20 × 250 mm 5 u, eluirana pri 9 ml/minutu 100% acetonitrilom. Sobna temperatura i uv detekcija na 260 nm. Retenciona vremena su 13 i 16 minuta.

G. G-monomeri (dvostruko zaštićeni guaninom)

[0073]

2

dijastereomerna smeša brzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer:

[0074] Uslovi analitičke HPLC za aktivirane G monomere (dvostruko zaštićeni guaninom):

[0075] Uslovi preparativne HPLC za aktivirane G monomere (dvostruko zaštićeni guaninom):

Chiralpak IA 50 × 500 mm, eluirana pri 60 ml/minutu 100% etil acetatom. Sobna temperatura i uv detekcija na 260 nm. Retenciona vremena su 20 i 24 minuta.

[<1>H-NMR podaci za G1(dvostruko zaštićen guaninom)]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7.4-7.5 (m, 6 H), 7.26-7.32 (m, 6H), 7.16-7.22 (m, 3H), 7.02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6.24 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5.61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5.56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4.48 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 3.47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.23 (d, 1H, J=12 Hz), 3.2 (m, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.57 (t, 1H, J= 12 Hz), 1.33 (s, 9H), 1.33 (t, 6H, J= 7 Hz)

2

[<1>H-NMR podaci za G2(dvostruko zaštićen guaninom)]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7.4-7.5 (m, 6H), 7.26-7.33 (m, 6H), 7.15-7.22 (m, 3H), 7.02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6.23 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5.61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5.56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4.47 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 3.47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.22 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.2 (m, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 1.75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.58 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.33 (s, 9H), 1.33 (t, 6H, J= 7 Hz)

IV. Primeri stereospecifičnog PMO kuplovanja sa dijastereomerno čistim aktiviranim monomerima

[0076] Sledeći primeri objavljuju upotrebu stereospecifičnog kuplovanja za pripremu stereohemijski homogenih proizvoda.

A. Aktivirani U-monomeri (U1 i U2) U-morfolin-NH (1)

[0077]

brzo eluirajući izomer: brzo eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer: kasno eluirajući izomer:

[0078] U1 (11 mg, 0,018 mmol, 1 ekv, 99,0% de) rastvoren je u acetonitrilu (0,11 ml) i pomešan sa diizopropiletilaminom (8 µl, 0,05 mmol, 2,5 ekv.). Dodat je U-morfolin-NH (1; 14 mg, 0,030 mmol, 1,6 ekv.) i primenjena je sonifikacija kako bi se potpomoglo rastvaranje. Nakon 0,5 h mešanja, mali alikvot reakcione smeše je razblažen sa CDCl3i analiziran putem<1>H NMR. Sva preostala reakciona smeša je razblažena acetonitrilom (8 ml) za HPLC i čuvana je u zamrzivaču. Stereospecifični nastanak 2 je potvrđen putem HPLC analize (99,4% de). Prethodni protokol je takođe korišćen za kuplovanje U2 (95,6% de) za stereospecifično dobijanje 3 (96,0% de).

[0079] Uslovi analitičke HPLC za U/U kuplovanje:

[<1>H-NMR podaci za 2]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.6 (m, 4H), 7.2-7.5 (m, 20H), 7.1-7.2 (m, 3H), 6.15 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.73 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.66 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.54 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 4.40 (m, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3.40 (m,

1

3H), 3.11 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.78 (m, 1H), 2.56 (s, 3H; NMe), 2.54 (s, 3H; NMe), 2.48 (m, 1H), 1.47 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.35 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H)

[1H-NMR podaci za 3]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.6 (m, 4H), 7.3-7.5 (m, 11H), 7.2-7.3 (m, 9H), 7.1 (m, 3H), 6.12 (dd, 1H, J= 2.0 & 9.6 Hz), 5.71 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 5.70 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.47 (dd, 1H, J= 2.0 & 10.4 Hz), 4.31 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.24 (m, 1H), 3.07 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.68 (m, 1H), 2.65 (s, 3H; NMe), 2.62 (s, 3H; NMe), 2.26 (m, 1H), 1.45 (t, 1H, J= 12 Hz), 1.29 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H)

B. Aktivirani C-monomeri (C1 i C2) C-morfolin-NH (4)

[0080]

brzo eluirajući izomer: kasno eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer: brzo eluirajući izomer:

[0081] C1 (20 mg, 0,031 mmol, 1 ekv, 93,5% de) rastvoren je/suspendovan u THF-u (0,40 ml) i pomešan sa diizopropiletilaminom (12 µl, 0,069 mmol, 2,3 ekv.). Dodat je morfolino-citozin (4; 16 mg, 0,035 mmol, 1,1 ekv.) rastvoren u THF-u (0,20 ml). Nakon 1,0-2,0 h mešanja, mali alikvot reakcione smeše je razblažen acetonitrilom i analiziran putem LC/MS. Jedan alikvot (30-50 µl) reakcione smeše razblažen je dihlormetanom (0,6 ml) za HPLC analizu. Stereospecifični nastanak 6 je potvrđen putem HPLC analize (94,3% de). Reakciona smeša je

2

neposredno naneta na kolonu silika gela i eluirana gradijentom mobilne faze 0-15% metanola u etil acetatu. Prethodni protokol je takođe korišćen za C/C kuplovanje C2 (90,2% de) za stereospecifično dobijanje 5 (90,0% de).

[0082] Uslovi analitičke HPLC za C/C kuplovanje:

[1H-NMR podaci za 5]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.9 (br, 1H), 7.69 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 7.62 (m, 5H), 7.35-7.44 (m, 13H), 7.21-7.35 (m, 6H), 7.15 (m, 4H), 6.14 (br d, 1H, J= 7.8 Hz), 5.58 (dd, 1H, J= 2.4 & 9.4 Hz), 5.53 (br, 1H), 4.51 (dd, 1H, J= 8.6 & 10 Hz), 4.09 (m, 1H), 3.70-3.80 (m, 4H), 3.60 (dd, 1H, J= 6.3 & 10 Hz), 3.56 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.28 (m, 1H), 2.96 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.69 (s, 3H; NMe), 2.67 (s, 3H; NMe), 2.65 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.31 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.13 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H).

[1H-NMR podaci za 6]

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.57 (br, 1H), 7.62-7.70 (m, 7H), 7.35-7.50 (m, 14H), 7.23-7.35 (m, 4H), 7.12 (m, 4H), 6.31 (m, 1H), 5.79 (m, 1H), 5.70 (m, 1H), 4.61 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.80-3.90 (m, 2H), 3.72 (m, 2H), 3.58 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.58 (s, 3H; NMe), 2.55 (s, 3H; NMe), 2.53 (m, 1H), 2.38 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 1.47 (t, 1H, J= 10 Hz), 1.22 (t, 1H, J= 10 Hz), 1.06 (s, 9H).

C. Aktivirani A-monomeri (A1 i A2)+ U-morfolin-NH (1)

[0083]

brzo eluirajući izomer: kasno eluirajući izomer:

kasno eluirajući izomer: brzo eluirajući izomer:

[0084] A1 (5,9 mg, 0,008 mmol) suspendovan je u acetonitrilu (118 µl). Dodat je diizopropiletilamin (5 µl, 0,03 mmol), zatim morfolino-uracil (1; 4,6 mg, 0,01 mmol). Sonifikacija je primenjena tokom 1 minuta, i dobijena homogena smeša je mešana na

4

ambijentalnoj temperaturi. Nakon mešanja preko noći, smeša (gusta bela pasta) razblažena je smešom acetonitrila (5,0 ml) i metanola (0,30 ml), dajući homogeni bistri rastvor. Mali alikvot je neposredno analiziran pomoću HPLC bez daljeg razblaživanja.

[0085] A2 (F2; 5,0 mg, 0,007 mmol) suspendovan je u acetonitrilu (100 µl). Dodat je diizopropiletilamin (4 µl, 0,02 mmol), zatim morfolino-uracil (4,1 mg, 0,009 mmol). Sonifikacija je primenjena tokom 1 minuta, i dobijena gusta suspenzija je mešana na ambijentalnoj temperaturi. Nakon mešanja preko noći, dodat je acetonitril (5,0 ml) i primenjena je sonifikacija, što daje homogeni bistar rastvor. Mali alikvot je neposredno analiziran pomoću HPLC bez daljeg razblaživanja.

[0086] Uslovi analitičke HPLC za U/A kuplovanje:

D. Aktivirani G-monomeri (G1 i G2) U-morfolin-NH (1)

[0087]

brzo eluirajući izomer:<brzo eluirajući izomer:>

kasno eluirajući izomer:

[0088] G1 (6,5 mg, 0,009 mmol, 1 ekv, 99,9% de) rastvoren je/suspendovan u THF-u (0,13 ml) i pomešan sa diizopropiletilaminom (3,6 µl, 0,02 mmol, 2,2 ekv.). Dodat je morfolino-uracil (1; 4,7 mg, 0,010 mmol, 1,1 ekv.) rastvoren u THF-u (0,07 ml). Nakon 1,0-2,0 h mešanja, mali alikvot reakcione smeše je razblažen acetonitrilom i analiziran putem LC/MS. Jedan alikvot (100 µl) reakcione smeše je razblažen dihlormetanom (0,4 ml) za HPLC analizu. Stereospecifični nastanak 9 je potvrđen putem HPLC analize (99,9% de).

[0089] Uslovi analitičke HPLC za U/G kuplovanje:

[0090] Dijastereomerno suštinski čista jedinjenja, kako su prethodno objavljena, mogu da se koriste za pripremu stereohemijski čistih oligonukleotida i drugih jedinjenja. Primeri potencijalnih oligonukleotida su prikazani, na primer, u Summerton, J (1999). "Morpholino Antisense Oligomers: The Case for an RNase-H Independent Structural Type.". Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1): 141-58; i u Summerton, J; Weller D. (1997). "Morpholino Antisense Oligomers: Design, Preparation and Properties". Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7 (3): 187-95. Oba ova dokumenta su ovde obuhvaćena referencama.

V. Primer stereospecifične sinteze 16-mernih PMO i diferencijacija stereoizomera putem biofizičkog testa

[0091] Ovaj primer prikazuje sintezu usmerenu na par stereohemijski čistih 16-mernih PMO putem stereospecifičnog kuplovanja koristeći aktivirane monomere. Ovi PMO imaju suprotne stereohemijske nizove kao fosforne veze.

[0092] Ciljna sekvenca:

Stereohemijski čisti aktivni monomeri (gradivni blokovi):

[0093]

Ciljni PMO Stereohemijski čisti aktivni monomeri korišćeni za kuplovanje

S

S

[0094] Šema za stereospecifičnu sintezu 16-mernih PMO i diferencijaciju stereoizomera pomoću biofizičkog testa je prikazana na SL.6. 16-merni PMO stereoizomeri 1 i stereoizomer 2 su pripremljeni ručno putem sinteze u čvrstoj fazi na aminometilpolistiren-disulfidnoj smoli (~300 µmol/g nanošenja, vidite U.S. patentna prijava pub. br. 20090131624A1, koja je ovde obuhvaćena referencama) u obimu od 50 mg (početna težina smole).

[0095] Osnovni rastvori za sintezu u čvrstoj fazi:

[0096] Radni ciklus za svako kuplovanje PMO:

[0097] Otpuštanje iz smole i deprotekcija:

U 16-mer vezan za smolu (nakon detritilovanja) dodato je 28% vodeni rastvor amonijaka/etanol 1:3 (V/V) (~5 ml). Smeša je zaptivena i zagrevana na 45°C tokom 20 sati. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, smeša je filtrirana i isprana metanolom. Filtrat je koncentrovan i dijafiltriran nasuprot 15 mM trietilamonijum (TEAA) pufera pH 7,0. Korišćena aparatura je bila Amicon ćelija sa mešanjem (50 ml) sa Ultracel UF membranom od 1 kDa. Uzorci su dijafiltrirani razblaživanjem/koncentrovanjem sve dok prvobitni rastvarač nije redukovan na 1% prvobitne koncentracije (približno 5 ciklusa) i zatim su podvrgnuti prečišćavanju reversno faznom preparativnom HPLC.

[0098] Postupak reversno fazne preparativne HPLC za prečišćavanje PMO:

4

Rastvarač A: 15 mM trietilamonijum acetatni (TEAA)

[0099] LC/MS postupak za procenu kvaliteta PMO:

HPLC kolona Waters BEH C18 Oligo 2,1 × 50 mm 130 angstrema 1,7 um

Vreme ciklusa 30 min

Injekciona zapremina 25 µl diluenta: voda ili 10 mM trietilamin acetat

Supstance i uslovi za merenje tačke topljenja (Tm)

[0100]

[0101] Sažetak za karakterizaciju termalnog topljenja kompleksa stereohemijski različitih PMO sa dobijenim RNK:

[0102] Tačke topljenja za stereoizomere 1 i 2 su prikazane na SL.7. Na osnovu različitih tačaka topljenja, može se zaključiti da su pripremljene zasebne količine suštinski čistih stereoizomera.

VI. Primer stereospecifične sinteze i apsolutne stereohemijske raspodele stereohemijski čistog PMO dinukleotida jedinjenja 100 (5'-TA2-3')

[0103]

[0104] Kasno eluirajući aktivni monomer A (A2; 200 mg, 0,277 mmol, 1 ekv.) rastvoren je u smeši acetonitrila (2,0 ml) i DIPEA (0,12 ml, 0,69 mmol, 2,5 ekv.). Zatim je dodat T-morfolin-NH (1; 146 mg, 0,305 mmol, 1,1 ekv.) i dobijena suspenzija je sonifikovana nekoliko minuta

4

dok nije dobijen bistar rastvor. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon što je kompletna reakcija praćena pomoću LC/MS, smeša je koncentrovana i podvrgnuta hromatografiji na koloni (3% metanola u DCM-u, Biotage SnapUltra 10 g SiO2). Čiste frakcije proizvoda su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom, dajući u potpunosti zaštićen stereohemijski čisti 5'-TA-3' dinukleotid 2 kao belu čvrstu supstancu (240 mg, 0,206 mmol, prinos 74%).

[0105] U potpuno zaštićeni dinukleotid 2 (500 mg, 0,429 mmol) u balonu od 25 ml dodat je 2,2,2-trifluoretanol (TFE; 4,0 ml) i sirćetna kiselina (1,0 ml) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi i praćena pomoću LC/MS. Nakon 30 minuta, reakcija je deaktivirana zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i DCM-om. Dva sloja su razdvojena, i vodeni sloj je ponovo ekstrahovan. Organski slojevi su kombinovani, isprani poluzasićenim vodenim rastvorom soli, osušeni iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani, dajući sirovi proizvod kao belu penu. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (20% MeOH u acetonu, uložak Biotage Snap Ultra 25 g SiO2), dajući delimično zaštićeni dinukleotid 3 kao staklastu čvrstu supstancu (300 mg, 0,325 mmol, prinos 76%).

[0106] Delimično zaštićeni dinukleotid 3 (250 mg, 0,271 mmol) rastvoren je u smeši metanola (12,5 ml) i THF-a (12,5 ml) i tretiran je pomoću 1 M NaOH (10,8 ml) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 22 h (napredak je praćen pomoću LC/MS), smeša je neutralisana dodatkom 1 M HCl (10,8 ml) kako bi se pH podesio na 8 i zatim je pod vakuumom koncentrovana do suva. Ostatak je rastvoren u vodi (5 ml) i ispran pomoću EtOAc (5 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom do suva, dajući sirovi proizvod kao belu čvrstu supstancu (480 mg). Sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na molekulskim sitima (Sephadex<®>LH-20, MeOH/voda 4:1), dajući potpuno deprotektovani dinukleotid jedinjenje 100 kao belu čvrstu supstancu (137 mg, 0,236 mmol, prinos 87%).

[0107] Jedna kap vodenog rastvora jedinjenja 100 (200 mg/ml) zaptivena je u bunarčiću sa čistom vodom tokom jednog dana kako bi se dobili pojedinačni kristali. Rendgenska struktura pojedinačnog kristala je potvrdila apsolutnu konfiguraciju fosforne veze kao S. Ta rendgenska struktura je prikazana ORTEP crtežom na SL. 8. ORTEP crteži zasebnih fragmenata su prikazani na SL.9A i SL.9B. Rendgenski podaci su prikupljeni kako je prikazano u nastavku.

Prikupljanje podataka

[0108] Jedan kristal jedinjenja 100 (C22H33N10O7P) postavljen je na stakleno vlakno. Sva merenja su obavljena na difraktometru koristeći monohromatsko Cu-Kα zračenje grafita.

[0109] Ćelijske konstante i orijentaciona matrica za prikupljanje podataka, dobijeni iz utačnjavanja pomoću najmanjih kvadrata koristeći uglove postavljanja 36.473 pažljivo centrirane refleksije u rasponu od 7,75 < 2θ < 147,10<O>odgovaraju C-centriranoj monokliničnoj ćeliji sa dimenzijama:

a = 33,3523(2) Å

b = 13,80020(11) Å β = 96,8075(6)<O>

c = 14,19956(10) Å

V = 6489,53(8) Å<3>

[0110] ZA Z = 4 i F.W. = 580,54, izračunata gustina je 0,594 g/cm<3>. Na osnovu uslova refleksije: hkl: h+k = 2n razmatranja pakovanja, statističke analize intenziteta distribucije, i uspešnog rešenja i utačnjavanja strukture, određeno je da je prostorna grupa:

C2 (br.5)

[0111] Podaci su prikupljeni na temperaturi od 23 1°C koristeći ω-2θ tehniku skeniranja do maksimalne 2θ vrednosti od 147,7°. Omega skeniranja nekoliko intenzivnih refleksija, napravljena pre prikupljanja podataka, imala su prosečnu širinu na polovini visine od 0,00<O>i upadni ugao od 6,0°. Skeniranja od (0,00 0,00 tan θ)<O>vršena su pri brzini od 0,0<O>/min (u ω)).

4

Redukcija podataka

[0112] Prikupljeno je 50.795 refleksija, od kojih su 12.008 bile jedinstvene (Rint = 0,0453). Podaci su prikupljeni i obrađeni pomoću CrysAlisPro (Rigaku Oxford Diffraction). (CrysAlisPro: softver za prikupljanje i obradu podataka, Rigaku Corporation (2015). Tokyo 196-8666, Japan). Nije primenjena korekcija za raspad.

[0113] Linearni koeficijent apsorpcije, µ, za zračenje Cu-Kα iznosi 6,011 cm<-1>. Primenjena je empirijska korekcija apsorpcije koja je dovela do faktora transmisije od 0,341 do 1,000. Podaci su korigovani na Lorencov i polarizacioni efekat.

Rešavanje i utačnjavanje strukture

[0114] Struktura je rešena direktnim postupcima (SHELXT verzija 2014/5): Sheldrick, G. M. (2014). Acta Cryst. A70, C1437) i proširena pomoću Furijeove tehnike. Atomi koji nisu vodonik utačnjeni su anizotropski. Atomi vodonika utačnjeni su pomoću modela jašućeg atoma (engl. riding model). Finalni ciklus utačnjavanja najmanjih kvadrata kompletne matrice (koristeći minimizovanu funkciju najmanjih kvadrata: (SHELXL verzija 2014/7) (Fo<2>-Fc<2>)<2>gde w = težina najmanjih kvadrata) na F<2>bio je na bazi 12.008 uočenih refleksija i 849 varijabilnih parametara i konvergirao je (najveće pomeranje parametra bilo je 0,00 puta njegova procena) sa neponderisanim i ponderisanim faktorima slaganja:

[0115] Valjanost uklapanja je bila 1,45. Valjanost uklapanja je definisana kao: [∑w(Fo2-Fc2)2/(No-Nv)]<1/2>, gde: No= broj opservacija i Nv = broj promenljivih.

[0116] Korišćene su jedinične težine. Maksimalni i minimalni pik na finalnoj diferencijalnoj Furijeovoj mapi iznosili su 1,79, odnosno -0,69 e-/Å<3>. Finalni Flekov parametar bio je 0,029(7),

4

što ukazuje da je struktura inverzni blizanac. (Parsons, S. i Flack, H. (2004), Acta Cryst. A60, s61; Flack, H.D. i Bernardinelli (2000), J. Appl. Cryst. 33, 114-1148).

[0117] Faktori rasipanja neutralnog atoma preuzeti su iz Internacionalnih tablica za kristalografiju (IT), Vol. C, Table 6.1.1.4. (International Tables for Crystallography, sveska C (1992). Ed. A.J.C. Wilson, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, tabela 6.1.1.4, str.572). Anomalije disperzionih efekata su uključene u Fcalc (Ibers, J. A. & Hamilton, W. C.; Acta Crystallogr., 17, 781 (1964)); vrednosti Δf' i Δf" su one koje su dali Creagh i McAuley. (Creagh, D. C. i McAuley, W.J .; "International Tables for Crystallography", sveska C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, tabela 4.2.6.8, strane 219-222 (1992)). Vrednosti masenih koeficijenata slabljenja su one koje su dali Creagh i Hubbell. (Creagh, D. C. i Hubbell, J.H.; "International Tables for Crystallography", sveska C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, tabela 4.2.4.3, strane 200-206 (1992)). Svi proračuni su obavljeni pomoću kristalografskog softverskog paketa za kristalnu strukturu, osim utačnjavanja, koje je obavljeno pomoću SHELXL verzije 2014/7. (CrystalStructure 4.2: Crystal Structure Analysis Package, Rigaku Corporation (2000-2015). Tokyo 196-8666, Japan; SHELXL Version 2014/7: Sheldrick, G. M. (2008). Acta Cryst. A64, 112-122).

[0118] Kristalografski podaci, merenje intenziteta, i rešavanje i utačnjavanje strukture prikazani su u nastavku:

A. Kristalografski podaci

4

B. Merenje intenziteta

4

C. Rešavanje i utačnjavanje strukture

4

[0119] [<1>H-NMR podaci za jedinjenje 100]

[0120]<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.25 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 5.85 (d, 1H), 5.45 (d, 1H), 4.25 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.6 (m, 2H), 3.4 (m, 4H), 2.90 (m, 4H), 2.60 (d, 6H), 1.8 (s, 3H).

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu suštinski dijastereomerno čistog fosforodiamidatnog morfolino oligomera koji sadrži hiralne fosforne veze, koji obuhvata: odabir suštinski stereohemijski čistih fosforamidohloridatnih morfolino monomera; i sintezu suštinski dijastereomerno čistog fosforodiamidatnog morfolino oligomera putem stereospecifičnog kuplovanja izabranih suštinski stereohemijski čistih fosforamidohloridatnih morfolino monomera, pri čemu se pomenuto stereospecifično kuplovanje vrši u aprotičnom rastvaraču, u prisustvu nenukleofilnog tercijarnog amina ili aromatične baze, na temperaturi do 20°C do 50°C; pri čemu se suštinski stereohemijski čisti fosforamidohloridatni morfolino monomeri dobijaju razdvajanjem dijastereomerne smeše fosforamidohloridatnih morfolino monomera na suštinski stereohemijski čiste fosforamidohloridatne monomere, i pri čemu suštinski stereohemijski čist označava enantiomere ili dijastereoizomere koji su u enantiomernom, odnosno dijastereomernom višku, koji je jednak ili veći od 87%, a suštinski dijastereomerno čist označava dijastereoizomere koji su u dijastereomernom višku koji je jednak ili veći od 87%.
2. 2. Postupak iz zahteva 1, pri čemu se razdvajanje dijastereomerne smeše odvija putem najmanje jednog člana grupe koja se sastoji od hromatografije i kristalizacije.
3. 3. Postupak iz zahteva 2, pri čemu je hromatografija izabrana iz grupe koja se sastoji od tečne hromatografije visokih performansi (HPLC), simulirane hromatografije sa pokretnim slojem, i protivstrujne hromatografije.
4. 4. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-3, pri čemu su suštinski stereohemijski čisti fosforamidohloridatni morfolino monomeri izabrani iz grupe koja se sastoji od jedinjenja formule 20, jedinjenja formule 21, jedinjenja formule 22, jedinjenja formule 23, jedinjenja formule 24, jedinjenja formule 25, jedinjenja formule 26, jedinjenja formule 27, jedinjenja formule 28, jedinjenja formule 29, jedinjenja formule 30 i jedinjenja formule 31

   pri čemu R1i R2mogu biti isti ili različiti, i izabrani su iz grupe koja se sastoji od -H, opciono supstituisanog C1-C3alkila, opciono supstituisanog fenila, opciono supstituisanog naftila, ili sa azotom za koji su vezani grade opciono supstituisani heterocikl koji može biti, na primer, pirolidin, piperazin i morfolin; pri čemu je R3izabran iz grupe koja se sastoji od tritila (Tr), koji može biti supstituisani tritil, uključujući, bez ograničenja, recimo MMTr (p-metoksifenildifenilmetil); opciono supstituisanog benzila, 4-metoksibenzila (PMB, MPM), 3,4-dimetoksibenzila, difenilmetila (Dpm), 4-metoksibenzila i sulfonila; R4, R5i R6su izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, ―C(O)R7i ― C(O)OR7, pri čemu, R7je C1-C6 alkil, benzil, 2,2,2-trihloretil, i aril grupa izabrana od fenila, 4-metoksi fenila, 4-bromfenila i 4-nitrofenila; R9je izabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog alkila, cijanoetila, acila, karbonata, karbamata, opciono supstituisanog benzila, 4-pivaloiloksi benzila i silila, i njihovih enantiomera.
5. 5. Postupak iz zahteva 4, pri čemu je sulfonil raskidivi sulfonil izabran iz grupe koja se sastoji od 2-nitrobenzensulfonila, 4-nitrobenzensulfonila i 2,4-dinitrobenzensulfonila.
6. 6. Suštinski dijastereomerno čisti fosforodiamidatni morfolino oligomer koji sadrži hiralne fosforne veze dobijen postupkom iz bilo kog od zahteva 1 do 5.
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži suštinski dijastereomerno čist fosforodiamidatni morfolino oligomer koji sadrži hiralne fosforne veze iz zahteva 6 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Slika