ES2832531T3

ES2832531T3 - Oligonucleótidos para el tratamiento de enfermedades por expansión de repeticiones

Info

Publication number: ES2832531T3
Application number: ES12808975T
Authority: ES
Inventors: Peter Linsley; Brian Leppert; Gunnar Hanson
Original assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Current assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: JP7057385B2; EP2785729B1; EP3858847A1; JP2022048248A; JP2020078347A; JP2018082717A; HK1202875A1; WO2013082548A1; US10066228B2; JP6718474B2; US11674139B2; US20240209363A1; JP6317675B2; US20140303238A1; EP2785729A1; JP2015506669A; US20190100755A1

Abstract

Un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de tres nucleótidos que tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** Nu1, Nu2 y Nu3 son nucleobases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina. e hipoxantina; n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 que representa el número de repeticiones de la secuencia de nucleótidos (Nu1, Nu2, Nu3); R1 es una porción de fórmula **(Ver fórmula)** q es 0, 1, 2, 3 o 4; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C5 y una porción formamidinilo, y R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C5, o R2 y R3 se unen para formar un anillo heterocíclico de 5-7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5, fenilo, halógeno y aralquilo; R4 se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y aralquilo; Rx se selecciona del grupo que consiste en -OH, un nucleótido, una porción peptídica que penetra en las células y piperazinilo; Ry se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo C1-C6, un nucleótido, una porción peptídica, un aminoácido, una porción formamidinilo y acilo; Rz se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y acilo; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; en el que la secuencia de tres nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en (CCG), (CTG), (TTC), (NGC) y (GNC); y donde N es cualquier nucleótido.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligonucleótidos para el tratamiento de enfermedades por expansión de repeticiones

Campo de la invención

Dentro del contexto de la presente invención, la descripción se refiere al uso de un compuesto antisentido para reducir selectivamente la expresión de una transcripción o proteína mutante producida a partir de la expansión de una repetición de nucleótidos mutante que contiene un alelo asociado con una enfermedad por expansión de repeticiones en relación con la correspondiente transcripción o proteína de tipo salvaje. También dentro del contexto de la presente invención, se refiere a la inhibición específica de alelo de la expresión de Huntington mutante en la enfermedad de Huntington. Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido de la invención, o una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

Antecedentes

Casi 30 trastornos hereditarios en humanos resultan de un aumento en el número de copias de repeticiones simples en el ADN genómico. Estas repeticiones de ADN parecen estar predispuestas a tal expansión porque tienen características estructurales inusuales, que interrumpen las maquinarias de replicación, reparación y recombinación celular. La presencia de expansión de repeticiones de ADN altera la expresión génica en las células humanas, lo que provoca enfermedades.

Uno de estos trastornos hereditarios es la enfermedad de Huntington (EH). La EH es un trastorno neurodegenerativo mortal sin cura que se asocia con deterioro cognitivo, demencia y pérdida de la coordinación motora. Se caracteriza por el aumento progresivo y hereditario de la longitud de las repeticiones de trinucleótidos CAG que codifican un tramo de poliglutamina, en la región de codificación del gen de Huntington (HTT). Estas repeticiones pueden aumentar en número de una generación a otra. El alelo normal del gen HTT contiene menos de 36 repeticiones CAG, mientras que el alelo mutante contiene más de 36 repeticiones. La mayoría de los pacientes con EH son portadores de un alelo normal y un alelo mutante que causa la enfermedad. Funcionalmente, se cree que la acumulación aberrante de repeticiones de CAG confiere una ganancia de función tóxica a la proteína HD mutante, lo que hace que se agregue, forme depósitos de proteínas (es decir, cuerpos de inclusión) e induzca la muerte celular. La gravedad de la enfermedad generalmente refleja la extensión de la expansión de repeticiones en la proteína HTT mutante.

Las opciones terapéuticas para la EH incluyen fármacos de molécula pequeña como haloperidol, tetrabenazina, clonazepam, fluoxitina y sertralina que están diseñados para controlar las manifestaciones fenotípicas de la enfermedad. Si bien estos fármacos pueden mejorar la calidad de vida de los pacientes con EH, no se espera que reviertan o alteren significativamente la progresión de la enfermedad o aumenten la esperanza de vida ni abordan los mecanismos moleculares subyacentes de la enfermedad.

Otra enfermedad caracterizada por una repetición de nucleótidos expandida en el ADN genómico es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada clínicamente por una parálisis progresiva que conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria, por lo general dentro de los dos o tres años de la aparición de los síntomas. La ELA es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental y actualmente no existen terapias efectivas. Una proporción de pacientes con ELA se caracteriza por una gran expansión repetida de hexanucleótidos (GGGGCC), por ejemplo, en el gen C9ORF72 (ver, por ejemplo, Renton et al., Neuron 2011; 72: 257-68 y DeJesus-Hernandez et al., Neuron 2011; 72: 245-56).

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) y tipo 2 (DM2) están asociadas con repeticiones largas de poliCUG y poliCCUG en las regiones 3'-UTR e intrón 1 de la transcripción de la proteína quinasa distrofia miotónica (DMPK) y la proteína 9 de dedo de zinc (ZNF9), respectivamente. Mientras que los individuos normales tienen hasta 30 repeticiones de CTG, los pacientes con DMI tienen una mayor cantidad de repeticiones que van desde 50 a miles. La gravedad de la enfermedad y la edad de aparición se correlacionan con el número de repeticiones. Los pacientes con inicio en la edad adulta muestran síntomas más leves y tienen menos de 100 repeticiones, los pacientes con DM1 de inicio juvenil tienen hasta 500 repeticiones y los casos congénitos suelen tener alrededor de mil repeticiones de CTG. Las transcripciones expandidas que contienen repeticiones CUG forman una estructura secundaria, se acumulan en el núcleo en forma de focos nucleares y secuestran proteínas de unión al ARN (ARN-BP).

El documento US 2010/016215 A1 describe un compuesto antisentido para su uso en el tratamiento de la distrofia miotónica DM1 o DM2, un método para mejorar el direccionamiento antisentido al corazón y los músculos cuádriceps, y un método para tratar DM1 o DM2 en un sujeto mamífero. El oligonucleótido tiene 8-30 bases, con al menos 8 bases contiguas que son complementarias a las repeticiones poliCUG o poliCCUG en la región 3'UTR del ARNm de la proteína quinasa distrofia miotónica (DMPK) en DM1 o DM2, respectivamente. Conjugado al oligonucleótido hay un péptido que penetra en las células que tiene la secuencia (RXRR(B/X)R)2XB, donde R es arginina; B es beta-alanina; y cada X es -C(O)-(CH2) n-NH-, donde n es 4-6. El compuesto antisentido es eficaz para bloquear selectivamente el secuestro de la proteína 1 similar a muscleblind (MBNL1) y/o CUGBP, en el corazón y el músculo cuádriceps en un modelo animal de distrofia miotónica.

El documento WO 2008/036127 A2 describe morfolino oligómeros que contienen enlaces intersubunitarios catiónicos y no cargados. Los oligómeros son análogos de oligonucleótidos que contienen secuencias predeterminadas de porciones de emparejamiento de bases. La presencia de enlaces catiónicos entre subunidades en los oligómeros, típicamente a un nivel de aproximadamente 10-50% de los enlaces totales, proporciona una actividad antisentido mejorada, en diversas aplicaciones antisentido, en relación con los correspondientes oligómeros no cargados. También se proporcionan tales oligómeros conjugados con porciones transportadoras de péptidos, en los que los transportadores se componen preferiblemente de subunidades de arginina o dímeros de arginina, alternando con subunidades de aminoácidos neutros.

El documento WO 2011/150408 A2 describe análogos de oligonucleótidos que comprenden enlaces intersubunitarios modificados y/o se proporcionan grupos terminales 3' y/o 5' modificados. Los compuestos descritos son útiles para el tratamiento de enfermedades en las que la inhibición de la expresión de proteínas o la corrección de productos de corte y empalme de ARNm aberrantes produce efectos terapéuticos beneficiosos.

El documento WO 2012/150960 A1 describe análogos de oligonucleótidos conjugados con péptidos transportadores. Los compuestos descritos son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, por ejemplo, enfermedades en las que la inhibición de la expresión de proteínas o la corrección de productos de corte y empalme de ARNm aberrantes produce efectos terapéuticos beneficiosos.

Existe la necesidad de enfoques terapéuticos nuevos y/o mejorados para tratar enfermedades por expansión de repeticiones. Una posible ruta para tratar enfermedades por expansión de repeticiones, como la EH y la ELA, sería la reducción selectiva o la eliminación del producto génico de un alelo mutante que causa la enfermedad y que contiene repeticiones expandidas.

Resumen de la invención

La presente invención, como se establece en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de tres nucleótidos que tiene la fórmula:

Nu-i, Nu2 y Nu3 son nucleobases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina. e hipoxantina;

n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 que representa el número de repeticiones de la secuencia de nucleótidos (Nu-i, Nu2, Nu3);

R1 es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C5 y una porción formamidinilo, y R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C5, o

R2 y R3 se unen para formar un anillo heterocíclico de 5-7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5, fenilo, halógeno y aralquilo;

R4 se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y aralquilo;

Rx se selecciona del grupo que consiste en -OH, un nucleótido, una porción peptídica que penetra en las células y piperazinilo;

Ry se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo C1-C6, un nucleótido, una porción peptídica, un aminoácido, una porción formamidinilo y acilo;

Rz se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y acilo; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos;

en el que la secuencia de tres nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en (CCG), (CTG), (TTC), (NGC) y (GNC); y

donde N es cualquier nucleótido.

En algunas realizaciones, la secuencia de tres nucleótidos repetida es (GCT)7.

En algunas realizaciones, Ry es un nucleótido G.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también se refiere a un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención o a una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

Las realizaciones de la invención son el objeto de las reivindicaciones dependientes y/o se describen a lo largo de la presente descripción y figuras.

Dentro del contexto de la presente invención, la divulgación incluye, en un aspecto, un método para reducir selectivamente la expresión de un ARNm o proteína producida a partir de un alelo que contiene una repetición de nucleótidos expandida mutante con respecto a un alelo de tipo salvaje. El método comprende poner en contacto una célula con un oligonucleótido antisentido de suficiente longitud y complementariedad con la repetición de nucleótidos expandida de manera que hibrida específicamente con el ARNm mutante. En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de la invención tiene enlaces APN. En otras realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un tipo diferente de enlace catiónico, tal como enlaces etpip.

Dentro del contexto de la presente invención, la divulgación se refiere a un oligonucleótido antisentido de 10-40 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia complementaria a una repetición de ADN expandido que está asociada con una enfermedad humana, donde el antisentido comprende un nucleótido que tiene una fórmula:

en la que Nu es una nucleobase;

R1 es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

R2 y R3 se unen para formar un anillo heterocíclico de 5-7 miembros opcionalmente que contiene un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5, fenilo, halógeno y aralquilo;

Rx se selecciona del grupo que consiste en HO-, un nucleótido, una porción peptídica que penetra en las células y piperazinilo;

Ry se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo C1-C6, un nucleótido, una porción peptídica, un aminoácido, una porción formamidinilo y acilo; y

Rz se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y acilo; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Nu se puede seleccionar del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina e hipoxantina. Por ejemplo, Nu puede ser timina o uracilo.

En una realización de la invención, R1 se selecciona del grupo que consiste en

También se describe en el presente documento dentro del contexto de la invención que el nucleótido tiene la fórmula:

en la que Rx, Ry, Rz y Nu son los indicados anteriormente.

Se describe en este documento dentro del contexto de la invención que un oligonucleótido antisentido de la descripción incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (CCG)n, (CTG)n, (TTC)n, (NGC)n, (GNC)n, (CAGG)n, (AGAAT)n y (CGCG4CG4)n, donde N es cualquier nucleótido y n es de 3 a 10. En una realización de la invención, la secuencia es (GCT)7 y Ry es opcionalmente un nucleótido G.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es útil para tratar una enfermedad humana asociada con una repetición expandida, como la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la distrofia miotónica tipo 1 y tipo 2.

De acuerdo con la invención, un oligonucleótido comprende una secuencia repetida de tres nucleótidos que tiene la fórmula:

Nui, Nu2 y Nu3 son nucleobases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina e hipoxantina;

n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 que representa el número de repeticiones de la secuencia de nucleótidos (Nu1, Nu2, Nu3);

R1 es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C5 y una porción formamidinilo, y R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C5, o R2 y R3 se unen para formar un heterocíclico de 5-7 miembros. anillo que contiene opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5, fenilo, halógeno y aralquilo;

De acuerdo con la invención, la secuencia de tres nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en (CCG), (CTG), (TTC), (NGC), (GNC), donde N es cualquier nucleótido. En una realización, el oligonucleótido comprende una secuencia (GCT)n, en la que n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, y comprende al menos un enlace internucleosídico que está cargado positivamente a pH fisiológico. En otras realizaciones, la secuencia repetida de tres nucleótidos es (GCT)7 Ry es opcionalmente un nucleótido G.

También se describe en el presente documento dentro del contexto de la invención un oligonucleótido que comprende una secuencia repetida de cuatro, cinco o seis nucleótidos. Una secuencia de 4 nucleótidos representativa tiene una fórmula:

Nu-i, Nu2, Nu3 y Nu4 (o Nu5, Nu6, etc.) son nucleobases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina e hipoxantina;

n es un número entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 que representa el número de repeticiones de la secuencia de nucleótidos (Nu-i, Nu2, Nu3 y Nu4 opcionalmente Nu5, Nu6, etc.);

Ri es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

R2 y R3 se unen para formar un heterocíclico de 5-7 miembros. anillo que contiene opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5, fenilo, halógeno y aralquilo;

Ry se selecciona del grupo que consta de hidrógeno, un alquilo C1-C6, un nucleótido, una porción peptídica, un aminoácido, una porción formamidinilo y acilo; y

En una realización de la invención, el oligonucleótido antisentido no está cargado. En realizaciones adicionales, se carga el oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, uno o más enlaces internucleotídicos en el oligonucleótido antisentido pueden tener un enlace catiónico tal como una modificación de APN. Los oligonucleótidos modificados contienen nucleobases T, A, C, G, U o un análogo de las mismas. Preferiblemente, el enlace internucleotídico modificado se deriva de una subunidad T, C o A.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido se conjuga con una porción peptídica, tal como un transportador de péptidos que penetra en las células, por ejemplo, un péptido rico en arginina (por ejemplo, (Arg)aGly).

El oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de cuatro nucleótidos puede ser (CAGG)n, en el que n es 3-10. Dichos oligonucleótidos son útiles para tratar la distrofia miotónica de tipo 1. Además, el oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de cinco nucleótidos puede ser (AGAAT)n, en el que n es 3-10. Tales oligonucleótidos son útiles para tratar la ataxia espinocerebelosa 10. Además, el oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de seis nucleótidos puede ser (GGCCCC)n, en el que n es 3-10. Tales oligonucleótidos son útiles para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Aún otras realizaciones de la invención están dirigidas a un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia establecida en la Tabla I (y el Listado de Secuencias). Tales oligonucleótidos antisentido son útiles para tratar una enfermedad como se establece en la Tabla I.

Otros aspectos de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden un oligonucleótido antisentido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describe en el presente documento dentro del contexto de la invención el uso de tales oligonucleótidos en la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades asociadas con repeticiones expandidas de ADN. Dichas composiciones se pueden administrar a sujetos para tratar enfermedades asociadas con repeticiones expandidas de ADN tales como enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y distrofia miotónica tipo 1 y tipo 2.

Aún otros aspectos descritos dentro del contexto de la invención se refieren a métodos para diagnosticar un trastorno hereditario asociado con una repetición expandida de ADN mediante transferencia Northern que comprende:

a. extraer el ARN total de una muestra o células de tejido homogeneizado;

b. aislar el ARNm;

c. separar el ARNm por tamaño usando electroforesis en gel;

d. transferir el ARNm a una membrana;

e. inmovilizar el ARNm en la membrana; y

f. usar una sonda para detectar una repetición expandida, en donde la sonda es un oligonucleótido de la invención.

Otro aspecto se refiere a un método para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto con un trastorno de repetición de polinucleótidos al tratamiento con terapia con oligonucleótidos. Este método comprende:

i. aislar células del sujeto;

ii. cultivar las células;

iii. introducir un oligonucleótido en las células;

iv. aislar ARNm o proteína de las células;

v. transcribir de forma inversa y amplificar el ARNm usando cebadores específicos de genes para una repetición de polinucleótidos que causa una transcripción, en la que los cebadores específicos de genes flanquean ambos extremos de la repetición de polinucleótidos;

vi. cuantificar los niveles de un ARNm o proteína que causan la enfermedad por repetición de un polinucleótido mutante y un ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia; y

vii. comparar los niveles del ARNm o proteína que causan la enfermedad por repetición del polinucleótido mutante con los niveles del ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia, y

viii. determinar que el sujeto responde a la terapia con oligonucleótidos si los niveles del ARNm o proteína que causa la enfermedad por repetición del polinucleótido mutante son más bajos que los del ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia.

Breve descripción de las figuras

Figs. 1 y 2: Preparación del soporte sólido para síntesis de oligómeros morfolino.

Figs. 3 y 4: La síntesis en fase sólida de oligómeros morfolino.

Fig. 5: Representación esquemática del amplicón de los alelos HTT. Este diagrama se basa en el registro del gen NCBI (número de acceso NM_002111.6) con la longitud de la expansión de repetición del triplete NCBI CAG intercambiada por la expansión del alelo mutante en la línea de fibroblastos GM04281.

Fig. 6: Curvas de respuesta a la dosis de fibroblastos de pacientes con enfermedad de Huntington tratados con oligonucleótidos. Los oligonucleótidos LNA, PMO y APN contienen la misma secuencia: 5' GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT G 3' (Id. de Sec. n°: 21). El oligonucleótido LNA (pedido de Exiqon) contiene una cadena principal de ADN con una modificación de LNA en cada base de timina (T) (7 modificaciones en total). El oligonucleótido APN contiene el esqueleto de PMO con una modificación de apn en cada base T (7 modificaciones en total). El oligonucleótido de PMO contiene el esqueleto de PMO sin modificaciones adicionales a la base T o cualquier enlace entre subunidades. Las células de los paneles A, B y C se nucleofectaron con el oligonucleótido LNA, PMO o APN, respectivamente.

La intensidad de la banda de gel que representa el alelo HTT de tipo salvaje o mutante de las células de fibroblastos GM04281 (Coriell) se normalizó a la intensidad de la banda de tipo salvaje o mutante correspondiente de la muestra tratada más baja. Cada punto representa la media de los niveles de expresión normalizados de dos réplicas en cada concentración, y se combinaron dos experimentos independientes para producir el conjunto de datos anterior. La cuantificación de la intensidad del gel se realizó con ImageQuant (GE). La normalización de la intensidad, el cálculo de CE50 y la selectividad se analizaron con Microsoft Excel y R. Los puntos de datos y las curvas se trazaron en Graphpad Prism. Fig. 7: CE50 y selectividad de oligonucleótidos LNA, PMO y APN. Los compuestos son los mismos que los descritos en la Fig. 6. El análisis de expresión de ARNm de los alelos HTT mutantes y de tipo salvaje de fibroblastos GM04281 nucleofectados con oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), PMO o APN se realizó como se describe en la Fig. 6. Los valores medios de CE50 para cada alelo se calcularon a partir del conjunto de datos presentado en la Fig.6, así como la selectividad para el alelo mutante se calculó a partir de la CE50 de los alelos de tipo salvaje y mutante de fibroblastos nucleofectados con el mismo oligonucleótido, usando R y Graphpad Prisma. Los datos muestran que los oligonucleótidos PMO y APN muestran una mayor selectividad por el alelo mutante que LNA. Además, la potencia del oligonucleótido APN, basada en los valores de CE50, se mejora con respecto al oligonucleótido PMO.

Fig. 8: Curvas de respuesta a la dosis de fibroblastos de pacientes con enfermedad de Huntington tratados con oligonucleótidos. Los compuestos son los mismos que los descritos en la Fig. 6. Estos datos se analizaron de la misma manera que en la Fig. 6, sin embargo, se combinaron tres experimentos independientes. Los datos de todos los oligonucleótidos se representan en el mismo gráfico.

Fig. 9: Los compuestos de PMO y APN muestran selectividad por el ARNm de HTT mutante. Estos datos se analizaron de la misma manera que la tabla de la Fig. 7, sin embargo, se combinaron tres experimentos independientes.

Fig. 10: RT-PCR de alelos HTT mutantes y de tipo salvaje. El ARN de fibroblastos GM04281 nucleofectados con el oligonucleótido apn (GCT)7G (Id. de Sec. n°: 21) a las concentraciones indicadas se amplificó por RT-PCR como se describe en los Métodos. Los geles que contienen las reacciones resultantes se analizaron como se describe en los Métodos y en la Fig. 6.

Fig. 11: PMO y APN, pero no los compuestos LNA, reducen selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje. Los compuestos son los mismos que los descritos en la Fig. 6. El análisis de la expresión de proteínas de la proteína HTT mutante y de tipo salvaje de fibroblastos GM04281 nucleofectados con oligonucleótidos p Mo (panel izquierdo), APN (panel central) o LNA (panel derecho) se realizó como se describe en el Ejemplo 24. Tres días después de la nucleofección, se prepararon lisados de proteínas. Se procesaron cantidades iguales de proteína total de cada muestra tratada en geles de SDS-PAGE de tris-acetato duplicados y se transfirieron a nitrocelulosa. Las transferencias se sondaron con un anticuerpo primario anti-HTT (MAB2166, Millipore) o anti-p-actina (A1978, Sigma) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con cy5. Las transferencias resultantes se escanearon en un Typhoon Trio (GE) y la intensidad de la señal de la proteína HTT mutante y normal se cuantificó por separado con el software ImageQuant (GE) (panel inferior). La intensidad de la señal de las bandas HTT normal (inferior) y mutante (superior) se normalizó a la señal de p-actina dentro de cada carril, y luego cada banda HTT se normalizó a la intensidad de la banda HTT normal o mutante correspondiente de una muestra de control sin tratar en una transferencia separada. Los resultados de la expresión de proteínas se representan para cada alelo (normal, línea continua; mutante, línea discontinua) como el porcentaje medio de expresión de la proteína HTT, /- 1 DE.

Fig. 12: PMO modificado con APN reduce selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje. Los datos de la Fig. 11 se utilizaron para determinar y trazar la relación de expresión de la proteína HTT de tipo salvaje a mutante para cada uno de los oligonucleótidos modificados con PMO, APN y LNA.

Fig. 13: Estructuras ejemplares de modificaciones catiónicas relacionadas con APN y plus. Se muestran especies ejemplares de modificaciones catiónicas relacionadas con APN y relacionadas con plus. Las modificaciones relacionadas con APN incluyen APN y map, y las modificaciones relacionadas con plus incluyen plus, meda y etpip. Aunque las modificaciones ejemplificadas se refieren a timina, cualquier base (por ejemplo, timina, citosina, guanina, adenina) puede modificarse con las modificaciones catiónicas relacionadas con APN y relacionadas con plus.

Fig. 14: Los oligonucleótidos con modificaciones de la cadena principal relacionadas con APN y relacionadas con plus reducen selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje. Se nucleofectaron fibroblastos GM04281 como se describe en la Fig.11 con los oligonucleótidos modificados indicados a diversas concentraciones (0,16 |iM, 0,8 |iM, 10 |iM y 20 |iM), y se determinó la relación de expresión de la proteína HTT de tipo salvaje a mutante como se describe en Figs. 11 y 12. Los oligonucleótidos modificados con APN y mapT (panel izquierdo) y oligonucleótidos modificados con etpipT, medaT y plusT (panel derecho) redujeron selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje.

Fig. 15: Los oligonucleótidos modificados con APN y etpip muestran una alta selectividad por la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje. Para la comparación, los datos de APN, etpipT, PMO y control de la Fig. 14 se trazaron en el mismo gráfico. Mientras que los oligonucleótidos modificados con APN y etpipT exhibieron una alta selectividad para reducir la expresión de HTT mutante en relación con HTT de tipo salvaje, APN mostró una mayor selectividad por HTT mutante a dosis más bajas.

Fig. 16: La modificación de APN mejora la actividad de EGFP en comparación con PMO después de la inyección de ICV. El modelo de ratón transgénico de eGFP en el que el transgén de eGFP-654 se expresa uniformemente en todo el cuerpo se ha descrito previamente (Sazani, Gemignani et al. 2002). Este modelo usa un ensayo de corte y empalme para la actividad en el que los oligómeros modificados de la presente invención bloquean el empalme aberrante y restauran el empalme correcto del pre-ARNm de la proteína verde fluorescente mejorada modificada (eGFP). El nivel de eGFP traducido es proporcional a la potencia de los oligómeros antisentido y su concentración en el sitio de acción. Este modelo animal proporciona un ensayo in vivo para la corrección de empalme inducida por oligonucleótidos antisentido a través de un marcador de ganancia de función.

Las modificaciones específicas de PMO-X de los compuestos descritos en este ejemplo fueron 0-1-0-730 (PMO): GCT ATT ACC TTA Ac C CAG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 22) y NG- 10-0245 (APN): GCapnT AapnTapnT ACC TapnTA a Cc CAG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 22). Se administró PMO con carga neutra, o PMO modificado con cargas catiónicas en el esqueleto (APN), dirigido al transgén eGFP en el ventrículo lateral izquierdo de ratones EGFP-654 mediante una única inyección intracebreroventricular (ICV) usando un aparato estereotáxico. Las dosis consistieron en 5 mg/kg (panel izquierdo, PMO o APN) para todos los ratones o abarcaron un rango de dosis (panel derecho, 2,5 hasta 40 mg/kg, solo APN). Dos semanas después de la inyección, se sacrificó a los ratones y se extrajo el cerebro y se cortó por la mitad sagitalmente en la línea media en los hemisferios izquierdo y derecho. Se tomaron imágenes de cada hemisferio en un Typhoon Trio (GE) colocando la superficie de corte boca abajo en la placa de superficie plana. Las exploraciones se recogieron usando un láser de 488 nm para excitar la fluorescencia de eGFP. Las imágenes resultantes se analizaron con el software ImageQuant (GE) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada hemisferio. La intensidad de fluorescencia total detectada dentro de cada hemisferio se dividió por el número de píxeles presentes en ese hemisferio para producir un valor de fluorescencia promedio independiente del área para cada mitad del cerebro. Los resultados de la actividad para cada animal superviviente en un grupo de tratamiento se expresan como puntos en el gráfico de dispersión. La fluorescencia media del grupo está indicada por la línea horizontal, /- 1 DE (panel izquierdo). Se realizó el mismo experimento con diferentes dosis de compuesto APN (panel derecho). Una imagen representativa de typhoon en ratones eGFP-654 tratados con solución salina, PMO y APN que muestra la localización de la señal EGFP demuestra que la actividad del oligómero inyectado con ICV se expresa preferentemente dentro de regiones específicas del cerebro (panel inferior).

Descripción detallada

Definiciones

Como se usa en este documento, "nucleobase" (Nu), "porción de emparejamiento de bases" o "base" se usan indistintamente para referirse a una base de purina o pirimidina que se encuentra en el ADN o ARN nativo (uracilo, timina, adenina, citosina y guanina), así como análogos de las purinas y pirimidinas de origen natural, que confieren propiedades mejoradas, como la afinidad de unión al oligonucleótido. Los análogos ejemplares incluyen hipoxantina (el componente base del nucleósido inosina); 5-metil citosina; pirimidinas modificadas con propinilo C5, 9-(aminoetoxi) fenoxazina (pinza G) y similares.

Otros ejemplos de porciones de emparejamiento de bases incluyen, pero no se limitan a, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina que tienen sus correspondientes grupos amino protegidos por grupos protectores de acilo, 2-fluorouracilo, 2-fluorocitosina, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, análogos de pirimidina como pseudoisocitosina y pseudouracilo y otras nucleobases modificadas como purinas sustituidas en 8, xantina o hipoxantina (los dos últimos son los productos de degradación natural). Las nucleobases modificadas descritas en Chiu y Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar y Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313, también se contemplan.

Otros ejemplos de porciones de emparejamiento de bases incluyen, pero no se limitan a, nucleobases de tamaño expandido en las que se han añadido uno o más anillos de benceno. Reemplazos de bases nucleicas descritos en el catálogo de Glen Research (www.glenresearch.com); Krueger AT et al., Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6 , 553-543; Romesberg, F.E. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627, se contemplan como útiles para la síntesis de los oligómeros descritos en este documento. A continuación se muestran algunos ejemplos de estas nucleobases de tamaño expandido:

Una nucleobase unida covalentemente a una ribosa, un análogo de azúcar o un morfolino comprende un nucleósido. Los "nucleótidos" se componen de un nucleósido junto con un grupo fosfato. Los grupos fosfato se enlazan covalentemente a nucleótidos adyacentes entre sí para formar un oligonucleótido. Como se usa en el presente documento, un "oligonucleótido" es una secuencia lineal de nucleótidos, o análogos de nucleótidos, que permite que la nucleobase se hibride con una secuencia diana en un ARN mediante emparejamiento de bases Watson-Crick, para formar un heterodúplex oligonucleótido:ARN dentro de la secuencia diana. Los términos "oligonucleótido antisentido", "oligómero antisentido", "oligómero" y "compuesto" pueden usarse indistintamente para referirse a un oligonucleótido.

Un "oligómero morfolino" o "PMO" se refiere a un oligonucleótido que tiene un esqueleto que soporta una nucleobase capaz de unirse por enlaces de hidrógeno a polinucleótidos típicos, en donde el polímero carece de una porción del esqueleto de azúcar pentosa, pero en su lugar contiene un anillo morfolino. Por tanto, en un PMO, una estructura de anillo morfolino soporta una porción de emparejamiento de bases, para formar una secuencia de porciones de emparejamiento de bases que se diseña típicamente para hibridar con una diana antisentido seleccionada en una célula o en un sujeto en tratamiento. Un oligómero "morfolino" ejemplar comprende estructuras de subunidades morfolino unidas entre sí por enlaces fosforamidato o fosforodiamidato, uniendo el nitrógeno morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 4' de una subunidad adyacente, comprendiendo cada subunidad una nucleobase de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante uniones de hidrógeno específicas de base, a una base en un polinucleótido. Los oligómeros morfolino (incluidos los oligómeros antisentido) se detallan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.698.685; 5.217.866; 5.142.047; 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.521.063; 5.506.337 y solicitudes de patente estadounidenses pendientes 12/271.036; 12/271.040; y publicación PCT número WO/2009/064471.

Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente como formadores de los "enlaces internucleosídicos" del oligonucleótido. El enlace internucleosídico natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Un grupo "fosforamidato" comprende fósforo que tiene tres átomos de oxígeno unidos y un átomo de nitrógeno unido, mientras que un grupo "fosforodiamidato" comprende fósforo que tiene dos átomos de oxígeno unidos y dos átomos de nitrógeno unidos. En los enlaces intersubunitarios catiónicos o no cargados de los oligómeros PMO y/o PMOX descritos en el presente documento, un nitrógeno siempre está pendiente de la cadena principal. El segundo nitrógeno, en un enlace fosforodiamidato, es típicamente el nitrógeno del anillo en una estructura de anillo morfolino.

"PMOX" se refiere a oligómeros de fosforodiamidato morfolino que tienen un átomo de fósforo con (i) un enlace covalente al átomo de nitrógeno de un anillo morfolino y (ii) un segundo enlace covalente al nitrógeno del anillo de un 4-aminopiperdin-1-ilo (es decir, APN) o un derivado de 4-aminopiperdin-1-ilo. Los oligómeros de PMOX se describen en la solicitud PCT n° PCT/US11/38459. "PMOapn" o "APN" se refiere a un oligómero de PMOX en el que un átomo de fósforo está unido a un grupo morfolino y al nitrógeno del anillo de un 4-aminopiperdin-1-ilo (es decir, APN).

Como se usa en el presente documento, LNA se refiere a oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueados. "LNA" es un miembro de una clase de modificaciones llamadas ácido nucleico en puente (BNA). El BNA se caracteriza por un enlace covalente que bloquea la conformación del anillo de ribosa en un fruncido de azúcar C30-endo (northern). Para LNA, el puente está compuesto por un metileno entre las posiciones 2'-O y 4'-C. LNA mejora la preorganización del esqueleto y el apilamiento de bases para aumentar la hibridación y la estabilidad térmica.

Un oligonucleótido "se hibrida específicamente" con un polinucleótido diana si el oligómero hibrida con la diana en condiciones fisiológicas, con una Tm sustancialmente superior a 45 °C, preferiblemente al menos 50 °C, y típicamente 60 °C-80 °C o más alto. Tal hibridación corresponde preferiblemente a condiciones rigurosas de hibridación. A una fuerza iónica y un pH dados, la Tm es la temperatura a la que el 50% de una secuencia diana se hibrida con un polinucleótido complementario. Tal hibridación puede ocurrir con complementariedad "cercana" o "sustancial" del oligómero antisentido con la secuencia diana, así como con complementariedad exacta.

Una secuencia diana puede tener una complementariedad "cercana" o "sustancial" a la secuencia diana y aún funcionar para el propósito de la presente invención, es decir, aún ser "complementaria". Preferiblemente, los compuestos análogos de oligonucleótidos empleados en la presente invención tienen como máximo un desajuste con la secuencia diana de 10 nucleótidos, y preferiblemente como máximo un desajuste de 20. Alternativamente, los oligómeros antisentido empleados tienen al menos un 90% de homología de secuencia, y preferiblemente al menos un 95% de homología de secuencia, con las secuencias de reconocimiento ejemplares como se designa aquí. "Repetición de nucleótido expandido" o "expansión de repetición" o "repetición de polinucleótido expandido" se refiere a una mutación en la que una repetición de nucleótido normalmente polimórfica en un gen de tipo salvaje experimenta un cambio mutacional por el cual la repetición se ha expandido en longitud por la inserción de repeticiones de nucleótidos simples. Esta mutación dinámica es diferente a las mutaciones convencionales porque la repetición expandida puede sufrir más cambios, generalmente expansión continua, con cada sucesiva generación. Como se usa en el presente documento, el término "ARNm mutante" se usa indistintamente con "ARNm causante de la enfermedad por repetición de polinucleótido mutante" para referirse a un ARNm que tiene una mutación causante de la enfermedad por repetición de polinucleótido.

Como se usa en el presente documento, el término "ARNm de tipo salvaje" o "ARNm normal de referencia" se refiere a un ARNm que no contiene una mutación polinucleotídica repetida que causa la enfermedad. En el contexto de la enfermedad de Huntington, el alelo normal del gen de Huntington contiene menos de 36 repeticiones CAG. Por consiguiente, el ARNm normal de referencia se refiere a un ARNm de HTT que contiene menos de 36 repeticiones de CAG. No es necesario que el número de repeticiones de polinucleótidos sea idéntico entre individuos con la misma enfermedad por repetición de polinucleótidos, ya que existe una variación en el número de repeticiones entre individuos. Por ejemplo, mientras que un sujeto con enfermedad de Huntington puede tener, por ejemplo, 28 repeticiones CAG para el alelo HTT normal y 80 repeticiones CAG para el alelo ^hT^tmutante, otro sujeto puede tener 13 repeticiones CAG para el alelo HTT normal y 60 repeticiones para el alelo HTT mutante.

Como se usa en este documento, el término "alelo mutante" se refiere a un alelo de un gen que es capaz de causar una enfermedad. El término "alelo normal" se refiere a un alelo de un gen que no es capaz de causar una enfermedad. En el contexto de la enfermedad de Huntington, un alelo normal del gen HTT contiene menos de 36 repeticiones CAG, mientras que un "alelo mutante" contiene más de 36 repeticiones CAG.

"Un par de electrones" se refiere a un par de electrones de valencia que no están enlazados ni compartidos con otros átomos.

Los términos "péptido penetrante celular' (CPP) o "una porción peptídica que mejora la captación celular' se usan indistintamente y se refieren a péptidos penetrantes celulares catiónicos, también llamados "péptidos de transporte", "péptidos transportadores" o " dominios de transducción de péptidos". Los péptidos tienen la capacidad de inducir la penetración celular dentro del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de las células de una población de cultivo celular dada y permiten la translocación macromolecular dentro de múltiples tejidos in vivo tras la administración sistémica. En una realización, el péptido que penetra en las células es un transportador de péptidos rico en arginina. En otra realización, el péptido que penetra en las células es Penetratina o el péptido Tat. Estos péptidos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. n° 2010-0016215 A1. Un enfoque particularmente preferido para la conjugación de péptidos con oligonucleótidos antisentido se puede encontrar en la publicación PCT WO2012/150960. Una realización preferida de un oligonucleótido conjugado con péptido utiliza glicina como enlazador entre la CPP y el oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de la invención se pueden acoplar a un péptido rico en arginina, como (Arg)6Gly (6 arginina y 1 glicina unidas a un oligonucleótido). Como ejemplo, este péptido se puede conjugar con un PMO y se conoce como "R6-G-PMO".

Por "aislado" se entiende material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado" u "oligonucleótido aislado", como se usa en este documento, puede referirse a un polinucleótido que se ha purificado o eliminado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se elimina de las secuencias adyacentes al fragmento en el genoma. El término "aislar' en lo que concierne a células se refiere a la purificación de células (por ejemplo, fibroblastos, linfoblastos) de un sujeto fuente (por ejemplo, un sujeto con una enfermedad por repetición de polinucleótidos). En el contexto de ARNm o proteína, "aislar" se refiere a la recuperación de ARNm o proteína de una fuente, por ejemplo, células.

Como se usa en el presente documento, "longitud suficiente" se refiere a un oligonucleótido antisentido que es complementario de al menos 8, más normalmente 8-30, nucleobases contiguas en una repetición expandida del ARN mutante. Un oligonucleótido antisentido de longitud suficiente tiene al menos un número mínimo de nucleótidos para ser capaz de hibridar específicamente con una repetición expandida en el ARN mutante. Preferiblemente, un oligonucleótido de longitud suficiente tiene de 10 a 40 nucleótidos de longitud, incluidos oligonucleótidos de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 nucleótidos. En una realización, un oligonucleótido de longitud suficiente tiene de 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En otra realización, un oligonucleótido de longitud suficiente tiene una longitud de 15 a aproximadamente 25 nucleótidos. En otra realización más, un oligonucleótido de longitud suficiente tiene una longitud de 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. En una realización, la longitud del oligonucleótido antisentido para tratar la EH es de 22 nucleótidos.

Como se usa en este documento, los términos "poner en contacto una célula", "introducir' o "administrar' se refieren a la administración de los oligonucleótidos de la invención en una célula mediante métodos rutinarios en la técnica, por ejemplo, transfección (por ejemplo, liposomas, calcio-fosfato, polietilenimina), electroporación (p. ej., nucleofección), microinyección.

Como se usa en el presente documento, el término "cuantificar", "cuantificación" u otras palabras relacionadas se refieren a determinar la cantidad, masa o concentración en una unidad de volumen de un ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, péptido, polipéptido o proteína.

Como se usa en este documento, "tratamiento" de un sujeto (por ejemplo, un mamífero, como un ser humano) o una célula es cualquier tipo de intervención usada en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica y se puede realizar de forma profiláctica o después del inicio de un evento patológico o contacto con un agente etiológico.

Características estructurales de los oligonucleótidos

En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de la invención no está cargado. En otras realizaciones, se carga el oligonucleótido antisentido.

Se describe en el presente documento dentro del contexto de la invención que el oligonucleótido antisentido puede ser un "oligómero morfolino", "PMO", "PMOX", "PPMO" o "PMO+". Además, el oligonucleótido antisentido, por ejemplo, PMO, puede modificarse de cualquier manera conocida en la técnica. Se pueden modificar uno o más enlaces internucleotídicos en el oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, uno o más enlaces internucleotídicos en el oligonucleótido antisentido pueden tener una modificación catiónica. La modificación catiónica puede ser una modificación de APN. Preferiblemente, los enlaces internucleotídicos modificados se derivan de una subunidad T, C o A. Por ejemplo, en una realización, el PMO puede comprender una modificación catiónica. El PMO puede ser un PMO modificada por APN, que puede denominarse "PMOapn" o "APN".

Un oligonucleótido sustancialmente no cargado puede modificarse, de acuerdo con un aspecto de la invención, para incluir enlaces cargados, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 enlaces no cargados, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 enlaces no cargados. En ciertas realizaciones, se puede observar una mejora óptima en la actividad antisentido cuando aproximadamente el 25% de los enlaces de la cadena principal son catiónicos. En ciertas realizaciones, se puede ver una mejora con un pequeño número, por ejemplo, 10-20% de enlaces catiónicos, o cuando el número de enlaces catiónicos está en el rango de 50-80%, tal como aproximadamente 60%.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se pueden preparar mediante síntesis en fase sólida por etapas, empleando métodos detallados en las referencias citadas anteriormente y a continuación con respecto a la síntesis de oligonucleótidos que tienen una mezcla o enlaces de cadena principal catiónicos y no cargados. En algunos casos, puede ser deseable añadir porciones químicas adicionales al compuesto antisentido, por ejemplo, para mejorar la farmacocinética o para facilitar la captura o detección del compuesto. Tal porción puede unirse covalentemente, de acuerdo con métodos sintéticos estándar. Por ejemplo, la adición de una porción de polietilenglicol u otro polímero hidrófilo, por ejemplo, una que tenga 1-100 subunidades monoméricas, puede ser útil para mejorar la solubilidad.

Se puede unir una porción indicadora, tal como fluoresceína o un grupo radiomarcado, con fines de detección. Alternativamente, el marcador indicador unido al oligómero puede ser un ligando, como un antígeno o biotina, capaz de unirse a un anticuerpo marcado o estreptavidina. Al seleccionar una porción para la unión o modificación de un compuesto antisentido, generalmente es deseable, por supuesto, seleccionar compuestos químicos de grupos que sean biocompatibles y probablemente tolerados por un sujeto sin efectos secundarios indeseables.

En algunas realizaciones, los compuestos antisentido se pueden construir para que contengan un número seleccionado de enlaces catiónicos intercalados con enlaces no cargados del tipo descrito anteriormente. Los enlaces entre subunidades (como se definen en las reivindicaciones adjuntas), tanto catiónicos como no cargados, preferiblemente son enlaces que contienen fósforo, que tienen la estructura:

donde W es S u O, y es preferiblemente O, X = R1, NR11R12 u OR16, Y = O o NR17, y cada uno de dichos enlaces en el oligómero se selecciona de:

(a) enlace no cargado (a), donde cada uno de R11, R12, R16 y R17 se selecciona independientemente entre hidrógeno y alquilo C1-C6; o

(b1) enlace catiónico (b1), donde R1 es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C5 y una porción formamidinilo, y R3 se selecciona del grupo c formado por hidrógeno y alquilo C1-C5, o

R2 y R3 se unen para formar un anillo heterocíclico de 5-7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, donde el anillo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C5 , fenilo, halógeno y aralquilo; R4 se selecciona del grupo que consiste en nulo, hidrógeno, alquilo C1-C6 y aralquilo;

(b2) enlace catiónico (b2), donde X = NR11R12 e Y = O, y NR11R12 representa un grupo piperazino opcionalmente sustituido de la fórmula

donde

cada R es independientemente H o CH3,

R14 es H, CH3 o nulo, y

R13 es seleccionado de H, alquilo C1-C6, arilo sustituido o no sustituido de 5-7 miembros, heteroarilo o anillo heterocíclico que contiene hasta 2 heteroátomos seleccionados de los grupos que consisten en N y O, C(=NH)NH2, ZL-NRR, ZL- NHC (= NH) NH2, ZL-COOH, ZL-SH, ZL-PPh3, Z^l-R21-R22, colato y [C(O)CHR'NH]mH, donde: Z es C(O) o un enlace directo, L es un enlazador opcional de hasta 18 átomos de longitud, preferiblemente hasta 12 átomos, y más preferiblemente hasta 8 átomos en de longitud, con enlaces seleccionados de alquilo, alcoxi y alquilamino, R' es una cadena lateral de un aminoácido natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, m es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4; R21 es un anillo arilo de 5-7 miembros y R22 es un anillo heteroarilo de 5-7 miembros que contiene hasta 4 heteroátomos seleccionados de los grupos que consisten en N y O;

(b3) enlace catiónico (b3), donde X = NR11R12 e Y = O, R11 = H o CH3, y R12 = LNR13R14R15, donde L, R13 y R14 son como se definieron anteriormente, y R15 es H, alquilo C1-C6 , o (alcoxi) alquilo C1-C6; y

(b4) enlace catiónico (b4), donde Y = NR17 y X = OR16, y R17 = LNR13R14R15, donde L, R13, R14 y R15 son como se definieron anteriormente, y R16 es H o alquilo C1-C6;

y al menos uno de dichos enlaces se selecciona de enlaces catiónicos (b1), (b2), (b3) y (b4).

Un oligómero puede incluir al menos dos enlaces consecutivos de tipo (a) (es decir, enlaces no cargados). Al menos el 5% de los enlaces en el oligómero pueden ser enlaces catiónicos (es decir, tipo (b1), (b2), (b3) o (b4)); por ejemplo, 10% a 60%, y preferiblemente 20-50% de los enlaces pueden ser enlaces catiónicos.

En una realización de la invención, al menos un enlace es del tipo (b1), en el que q es 1, R2 y R3 son hidrógeno y R4 es nulo.

Al menos un enlace puede ser de tipo (b2), donde, preferiblemente, cada R es H, R14 es H, CH3 o nulo, y R13 se selecciona de H, alquilo C1-C6, C(=NH)Nh2 y C(O)-L-NHC(=NH)NH2. Las dos últimas realizaciones de R13 proporcionan una porción guanidinilo, ya sea unido directamente al anillo de piperazina o colgando de un grupo enlazador L, respectivamente. Para facilitar la síntesis, la variable Z en R13 es preferiblemente C(O) (carbonilo), como se muestra.

El grupo enlazador L, como se indicó anteriormente, contiene enlaces en su esqueleto seleccionados de alquilo (por ejemplo, -CH2-CH2-), alcoxi (-CO-) y alquilamino (por ejemplo, -CH2-NH-), con la condición de que los átomos terminales en L (por ejemplo, los adyacentes al carbonilo o nitrógeno) sean átomos de carbono. Aunque son posibles los enlaces ramificados (por ejemplo, -CH2-CHCH3-), el enlazador preferiblemente no está ramificado. El enlazador puede ser un enlazador hidrocarbonado. Dicho enlazador puede tener la estructura - (CH2) n-, donde n es 1-12, preferiblemente 2-8, y más preferiblemente 2-6.

Las subunidades morfolino (nucleótido) generalmente tienen la estructura:

donde Pi es una porción de emparejamiento de bases, y los enlaces representados anteriormente conectan el átomo de nitrógeno de (i) al carbono 5' de una subunidad adyacente. Las porciones Pi de emparejamiento de bases pueden ser iguales o diferentes, y generalmente están diseñadas para proporcionar una secuencia que se une a un ácido nucleico diana.

El uso de los tipos de enlace (b1), (b2) (b3) y (b4) anteriores para unir subunidades morfolino se puede ilustrar gráficamente como sigue:

Preferiblemente, pero no necesariamente, todos los enlaces catiónicos en el oligómero son del mismo tipo; es decir, todos de tipo (b1), todos de tipo (b2), todos de tipo (b3) o todos de tipo (b4).

Los enlaces catiónicos pueden seleccionarse de enlaces (b2') y (b2") como se muestra a continuación, donde (b2') se denomina en el presente documento un enlace "Pip" y (b2") se denomina en este documento un Enlace "GuX":

En las estructuras anteriores, W es S u O, y preferiblemente es O; cada uno de R11 y R12 se selecciona independientemente entre hidrógeno y alquilo C1-C6, y es preferiblemente metilo o etilo; y A representa hidrógeno o alquilo C1-C6 en uno o más átomos de carbono en (b2') y (b2"). Preferiblemente, los carbonos del anillo en el anillo de piperazina no están sustituidos; sin embargo, pueden incluir sustituyentes que no interfieran, tales como metilo. Preferiblemente, como máximo uno o dos átomos de carbono están así sustituidos. En realizaciones adicionales, al menos el 10% de los enlaces son de tipo (b2') o (b2"); por ejemplo, 10% -60% y preferiblemente 20% a 50%, de los enlaces pueden ser de tipo (b2') o (b2").

El oligómero puede no contener enlaces del tipo (b2') anterior. Alternativamente, el oligómero puede no contener enlaces de tipo (b2) donde cada R es H, R13 es H o CH3 y R14 es H, CH3 o nulo.

Las subunidades de morfolino también pueden estar unidas por enlaces intersubunitarios no basados en el fósforo, como se describe más adelante, donde al menos un enlace se modifica con un grupo catiónico colgante como se describe anteriormente.

Se podrían usar otros enlaces análogos de oligonucleótidos que no están cargados en su estado no modificado pero que también podrían tener un sustituyente amina colgante. Por ejemplo, un átomo de nitrógeno 5' en un anillo morfolino podría emplearse en un enlace sulfamida o un enlace urea (donde el fósforo se reemplaza con carbono o azufre, respectivamente) y modificarse de una manera análoga al átomo de nitrógeno 5' en la estructura (b4) anterior.

Se proporcionan oligómeros que tienen cualquier número de enlaces catiónicos, incluidos oligómeros completamente enlazados de forma catiónica. Preferiblemente, sin embargo, los oligómeros están parcialmente cargados, teniendo, por ejemplo, 10% -80%. En realizaciones preferidas, aproximadamente del 10% al 60%, y preferiblemente del 20% al 50% de los enlaces son catiónicos.

En una realización, los enlaces catiónicos están intercalados a lo largo del esqueleto. Los oligómeros parcialmente cargados contienen preferiblemente al menos dos enlaces no cargados consecutivos; es decir, el oligómero preferiblemente no tiene un patrón estrictamente alterno a lo largo de toda su longitud.

También se consideran oligómeros que tienen bloques de enlaces catiónicos y bloques de enlaces no cargados; por ejemplo, un bloque central de enlaces no cargados puede estar flanqueado por bloques de enlaces catiónicos, o viceversa. En una realización, el oligómero tiene regiones 5', 3' y central de aproximadamente la misma longitud, y el porcentaje de enlaces catiónicos en la región central es mayor de aproximadamente el 50%, preferiblemente mayor de aproximadamente el 70%.

Los oligómeros para uso en aplicaciones antisentido generalmente varían en longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 subunidades, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 30 subunidades y típicamente de 15 a 25 bases. Por ejemplo, un oligómero de la invención que tiene 19-20 subunidades, una longitud útil para un compuesto antisentido, puede tener idealmente de dos a diez, por ejemplo, de cuatro a ocho, enlaces catiónicos, y el resto de enlaces no cargados. Un oligómero que tiene 14-15 subunidades puede tener idealmente de dos a siete, por ejemplo, 3, 4 o 5, enlaces catiónicos y el resto de enlaces no cargados.

Cada estructura de anillo morfolino soporta una porción de emparejamiento de bases, para formar una secuencia de porciones de emparejamiento de bases que se diseña típicamente para hibridar con una diana antisentido seleccionada en una célula o en un sujeto que está siendo tratado. El resto de emparejamiento de bases puede ser una purina o pirimidina que se encuentra en el ADN o ARN nativo (p. ej., A, G, C, T o U) o un análogo, como hipoxantina (el componente básico del nucleósido inosina) o 5-metil citosina.

Como se indicó anteriormente, ciertas realizaciones están dirigidas a oligómeros que comprenden nuevos enlaces entre subunidades, que incluyen oligómeros PMO-X y aquellos que tienen grupos terminales modificados (como se define en las reivindicaciones adjuntas). En algunas realizaciones, estos oligómeros tienen una mayor afinidad por el ADN y el ARN que los oligómeros no modificados correspondientes y demuestran mejores propiedades de distribución celular, potencia y/o distribución tisular en comparación con los oligómeros que tienen otros enlaces entre subunidades. Los oligómeros pueden comprender al menos un enlace entre subunidades de tipo (B) como se define en el presente documento. Los oligómeros también pueden comprender uno o más enlaces entre subunidades de tipo (A) como se define en el presente documento. Las características y propiedades estructurales de los diversos tipos de enlaces y oligómeros se describen con más detalle en la siguiente discusión. La síntesis de estos y de oligómeros relacionados se describe en la Solicitud de Estados Unidos de propiedad conjunta n° 13/118.298.

Dentro del contexto de la presente invención, la descripción proporciona un oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia diana que está asociada con una enfermedad humana, y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una fórmula:

donde Nu es una nucleobase;

Ri se selecciona como una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

Rz se selecciona del grupo que consiste en un nulo, hidrógeno, un alquilo C1-C6 y acilo, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Nu puede seleccionarse del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo, citosina e hipoxantina. Más preferiblemente, Nu es timina o uracilo.

Aproximadamente el 50-90% de los grupos R1 pueden ser dimetilamino (es decir, R1'). Preferiblemente alrededor del 66% (dos tercios) de los grupos R1 puede ser dimetilamino.

R1 puede seleccionarse del grupo que consiste en

Preferiblemente, al menos un nucleótido del oligonucleótido tiene la fórmula:

en la que Rx, Ry, Rz y Nu son como se indicó anteriormente. Preferiblemente, Nu es timina o uracilo.

Aunque la timina (T) es la porción de emparejamiento de bases preferido (Nu o Pi) que contiene las modificaciones químicas descritas anteriormente, cualquier subunidad de bases conocida por un experto en la técnica puede usarse como porción de emparejamiento de bases.

Oligonucleótidos antisentido

En el presente documento, dentro del contexto de la presente invención, se describe el uso de un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (CCG)n, (CTG)n, (TTC)n, (NGC)n, (GNC)n, (cAGG)n, (AGAAT)n y (CGCG4CG4)n (Id. de Sec. n°: 23), donde N es cualquier nucleótido y n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (GCT)n y (G2C4)n. Un oligonucleótido antisentido preferido es (GCT)n. En este último aspecto, n puede ser aproximadamente 7. En una realización de la invención, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia (GCT)7G (Id. de Sec. n°: 21). También se describe en el presente documento dentro del contexto de la invención que el oligonucleótido antisentido es (G2C4)n, con un intervalo preferido para n de 3 a 10, más preferiblemente 4.

En la Tabla 1 se muestran ejemplos de secuencias de oligonucleótidos antisentido de la invención que son adecuadas para tratar diversos trastornos de repetición expandida.

Enfermedad de Huntington

La EH es un trastorno neurodegenerativo fatal sin cura que se asocia con deterioro cognitivo, demencia y pérdida de la coordinación motora. Se caracteriza por el aumento progresivo y hereditario de la longitud de las repeticiones de trinucleótidos CAG que codifican un tramo de poliglutamina, en la región de codificación del gen de Huntington (HTT). Estas repeticiones pueden aumentar en número de una generación a otra. El alelo normal del gen HTT contiene menos de 36 repeticiones CAG, mientras que el alelo mutante contiene más de 36 repeticiones. La mayoría de los pacientes con EH son portadores de un alelo normal y un alelo mutante que causa la enfermedad. Funcionalmente, se cree que la acumulación aberrante de repeticiones de CAG confiere una ganancia de función tóxica a la proteína de EH mutante, lo que hace que se agregue, forme depósitos de proteínas (es decir, cuerpos de inclusión) e induzca la muerte celular. La gravedad de la enfermedad generalmente refleja la extensión de repeticiones expandidas en la proteína HTT mutante.

Preferiblemente, la estructura oligomérica del PMOapn para tratar la EH es

5'GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT G 3 '(no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21) Cualquier base (es decir, timina, adenina, citosina y guanina) de los oligonucleótidos antisentido de la invención puede modificarse con un enlace catiónico (como se describe en las reivindicaciones adjuntas, por ejemplo, un enlace apn). En el PMOapn que se muestra arriba, la timina (T) tiene un enlace apn entre la citosina, que está indicado por el superíndice apn. Otros enlaces tienen preferiblemente un dimetilamino unido al átomo de fósforo. La secuencia anterior es complementaria a la repetición expandida en el ARN mutante de Huntington. Las secuencias de otros oligonucleótidos antisentido ejemplares para el tratamiento de la EH se muestran a continuación:

AON#1: 5'-CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG-3' (Id. de Sec. n°: 3)

AON#2: 5'-CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG-3' (Id. de Sec. n°: 4)

Estas secuencias de oligonucleótidos antisentido pueden modificarse mediante cualquiera de los enlaces catiónicos entre subunidades descritos en el presente documento.

DM1/DM2

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) y tipo 2 (DM2) están asociadas con repeticiones largas de polyCUG y polyCCUG en las regiones 3'-UTR e intrón 1 de la transcripción de la proteína quinasa distrofia miotónica (DMPK) y la proteína de dedo de zinc 9 (ZNF9), respectivamente. Mientras que los individuos normales tienen hasta 30 repeticiones de CTG, los pacientes con DM1 tienen una mayor cantidad de repeticiones que van desde 50 a miles. La gravedad de la enfermedad y la edad de aparición se correlacionan con el número de repeticiones. Los pacientes con inicio en la edad adulta muestran síntomas más leves y tienen menos de 100 repeticiones, los pacientes con DM1 de inicio juvenil tienen hasta 500 repeticiones y los casos congénitos suelen tener alrededor de mil repeticiones de CTG. Las transcripciones expandidas que contienen repeticiones CUG forman una estructura secundaria, se acumulan en el núcleo en forma de focos nucleares y secuestran proteínas de unión al ARN (ARN-BP).

A continuación se muestran oligonucleótidos antisentido ejemplares para el tratamiento de DM1:

AON#1: 5'-CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG-3' (Id. de Sec. n°: 9)

AON#2: 5'-CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG-3' (Id. de Sec. n°: 10)

A continuación se muestran ejemplos de oligonucleótidos antisentido para tratar DM2:

AON#1: 5'- CAG GCA GGC AGG CAG GCA GG-3' (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 5) AON# 2: 5'- CAG GCA GGC AGG CAG GCA GGC AGG CAG-3' (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 6)

ELA

Otra enfermedad caracterizada por una repetición expandida de nucleótidos en el ADN genómico es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada clínicamente por una parálisis progresiva que conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria, por lo general dentro de los dos o tres años de la aparición de los síntomas. La ELA es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental y actualmente no existen terapias efectivas. Una proporción de pacientes con ELA se caracteriza por una gran expansión de repeticiones de hexanucleótidos (GGGGCc ), por ejemplo, en el gen C9ORF72 (ver, por ejemplo, Renton et al., Supra, y DeJesus-Hernandez et al., Supra.

La Tabla 1 describe "(C4GC4GCG)n" y "(CGCG4CG4)n" como Id. de Sec. n° 43 y 44, respectivamente. Las Id. de Sec. n° 1, 2, 5, 6 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 no están cubiertas por las reivindicaciones.

En una realización, el oligonucleótido antisentido para tratar ALS asociado con repeticiones de (G4C2)n comprende la secuencia (G2C4)™ (Id. de Sec. n°: 24). A continuación se muestran otros ejemplos de oligonucleótidos antisentido para tratar la ELA:

AON#1: 5'-GGC CCC GGC CCC GGC CCC GGC CCC-3' (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 15)

AON#2: 5'-GGC CCC GGC CCC GGC CCC GGC GGC CCC GGC-3' (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 16)

Métodos de la invención

En un aspecto, dentro del contexto de la presente invención, la descripción proporciona un método para reducir selectivamente la expresión de un ARNm mutante o proteína producida a partir de una repetición de nucleótidos mutante que contiene un alelo asociado con una enfermedad por repetición de nucleótidos en relación con el correspondiente ARNm o proteína de tipo salvaje, que comprende poner en contacto una célula con un oligonucleótido antisentido de longitud suficiente y complementariedad con la repetición de nucleótidos expandida de manera que hibrida específicamente con el ARNm mutante. En una realización, el oligonucleótido comprende una secuencia (GCT)n, en la que n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, y comprende al menos un enlace internucleosídico que está cargado positivamente a pH fisiológico. Preferiblemente, n es 7. Más preferiblemente, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia (GCT)zG (Id. de Sec. n°: 21).

Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido puede tener un enlace internucleosídico con un nitrógeno básico y un grupo alquilo, arilo o aralquilo. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido comprende un morfolino.

Además, el oligonucleótido antisentido puede tener al menos un enlace internucleosídico que está cargado positivamente a pH fisiológico. El oligonucleótido antisentido puede tener al menos un enlace internucleosídico que exhibe un pKa entre 5,5 y 12.

Aunque no está ligado a la teoría, se cree que el grupo APN cargado positivamente o los derivados de APN en el oligómero PMOX facilitan la unión a los fosfatos cargados negativamente en la repetición expandida del ARNm mutante. Por tanto, la formación de un hetrodúplex entre el ARN mutante y el oligómero PMOX puede mantenerse unido por una fuerza de atracción iónica, así como por el emparejamiento de bases de Watson-Crick.

En el presente documento, dentro del contexto de la invención, también se describe un método para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto con una enfermedad por repetición de polinucleótidos al tratamiento con terapia con oligonucleótidos que comprende:

i. aislar células del sujeto,

ii. cultivar las células,

iii. introducir un oligonucleótido en las células,

iv. aislar ARNm o proteína de las células,

v. opcionalmente transcribir de forma reversa y amplificar el ARNm usando cebadores específicos de genes para una transcripción causante de enfermedad por repetición de polinucleótidos, en la que los cebadores específicos de genes flanquean ambos extremos de la repetición de polinucleótidos,

vi. cuantificar los niveles de un ARNm o proteína que causa la enfermedad por repetición de polinucleótidos mutantes y un ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia, y

vii. comparar los niveles del ARNm o proteína que causa la enfermedad por repetición de polinucleótidos mutantes con los niveles del ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia, y

viii. determinar que el sujeto responde a la terapia con oligonucleótidos si los niveles del ARNm o proteína que causa la enfermedad por repetición de polinucleótidos mutantes son más bajos que los del ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia.

Las células se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en fibroblastos, linfoblastos y glóbulos blancos. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden aplicar a ensayos para determinar la capacidad de respuesta de cualquier sujeto dado con una enfermedad por repetición de polinucleótidos a la terapia con oligonucleótidos de la presente invención. Por tanto, los ensayos de la presente invención son útiles para determinar si un sujeto con una enfermedad por repetición de polinucleótidos es un candidato para la terapia con oligonucleótidos.

Para determinar si la terapia con oligonucleótidos descrita en el presente documento dentro del contexto de la presente invención será una opción viable para sujetos con una enfermedad por repetición de polinucleótidos, es decir, si un sujeto responderá a la terapia con oligonucleótidos, las células se aíslan de los sujetos, seguido del ensayo de la capacidad de los oligonucleótidos de la invención para disminuir la expresión de ARNm o de proteína de un transcrito o proteína que causa una enfermedad por repetición de polinucleótido diana.

Las células para aislar de pacientes con enfermedades por repetición de polinucleótidos no están limitadas y pueden ser, por ejemplo, linfoblastos, glóbulos blancos (WBC) o fibroblastos. Los métodos para cultivar, establecer, inmortalizar y pasar estas células son rutinarios en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2000; Capítulo 28. Preferiblemente, las células son fibroblastos. Los glóbulos blancos y los linfoblastos se pueden obtener fácilmente de muestras de sangre de pacientes utilizando técnicas reconocidas en la técnica descritas, por ejemplo, en el documento US2011/0136151. Además, se pueden establecer líneas celulares a partir de estas células aisladas mediante inmortalización con un virus como el virus de Epstein-Barr o el antígeno T de SV40, como se lleva a cabo habitualmente en la técnica (p. ej., Mali et al., Stem Cells 2008; 26: 1998 2005; También-Rallo et al., European J Human Genetics 2010; 19: 1059-65). Preferiblemente, el agente inmortalizante es el antígeno T de SV40. El cultivo y el pase de células aisladas y las líneas celulares establecidas se llevan a cabo usando métodos de cultivo celular estándar, tales como los descritos en, por ejemplo, US2011/0136151 y Villegas et al., Current Protocols in Molecular Biology. 2005; 28.3.1-28.3.9.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención se pueden introducir en células aisladas o líneas celulares establecidas usando métodos reconocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, métodos de transfección estándar (por ejemplo, fosfato de calcio basado en liposomas), electroporación (por ejemplo, nucleofección) y microinyección. Los agentes de transfección, por ejemplo, agentes a base de liposomas, están disponibles comercialmente como kits (por ejemplo, Superfect de Qiagen; Lipofectamine 2000 de Invitrogen; Fugene de Roche), y los métodos para usar estos agentes de transfección estarán de acuerdo con las instrucciones recomendadas por el fabricante. Los kits para realizar la nucleofección (por ejemplo, el kit Nucleofector) están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Lonza (Basilea, Suiza). La nucleofección se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.

Los métodos para aislar ARNm y/o proteína de células o líneas celulares establecidas son rutinarios en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2011; Capítulos 4 y 10. Los kits para aislar ARNm y proteínas también están disponibles comercialmente (p. ej., RNeasy Mini Kit de Qiagen; kit Illustra RNAspin 96 de GE; Total Protein Extraction Kit de Millipore).

Los métodos para generar ADNc son rutinarios en la técnica e implican la transcripción inversa del ARNm aislado con la enzima transcriptasa inversa. Los kits de síntesis de ADNc basados en transcriptasa inversa están disponibles en, por ejemplo, Invitrogen (sistema de síntesis de primera hebra SuperScript III) y Epicenter (kit de síntesis de primera hebra de ADNc de transcriptasa inversa de alto rendimiento MMLV). Los kits que combinan la síntesis de ADNc de la primera hebra con la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos de genes también están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Invitrogen (sistema Superscript III One-Step RT-PCR con Platinum Taq ADN polimerasa) y Qiagen (Qiagen OneStep RT-PCR Kit).

Los métodos para cuantificar el ARNm son rutinarios en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes incluyen análisis de transferencia Northern, hibridación in situ y síntesis combinada de ADNc y PCR o PCR cuantitativa. En una realización preferida, el ARNm se cuantifica mediante síntesis de ADNc seguida de PCR con cebadores específicos de genes que flanquean ambos extremos de la repetición polinucleotídica que causa la repetición de la secuencia que causa la enfermedad (por ejemplo, CAG en HTT para la enfermedad de Huntington). Los métodos de cuantificación de proteínas también son rutinarios en la técnica e incluyen, por ejemplo, análisis de transferencia Western y ensayos ELISA. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2011; Capítulos 4, 10, 15).

Los niveles de ARNm de alelo mutante y de alelo normal o producto de PCR amplificado a partir de ADNc generado a partir de ARNm se pueden comparar usando diversos métodos reconocidos en la técnica. En una realización, los productos de PCR ("amplicón") se pueden cuantificar en un gel de agarosa mediante densitometría usando, por ejemplo, el software ImageJ (NIH, Maryland, EE. UU.). En otra realización, la cuantificación se lleva a cabo usando PCR cuantitativa (véase, por ejemplo, Fraga et al., Current Protocols Essential Laboratory Techniques 2008, 00: 10.3.1-10.3.34).

La presente descripción también proporciona la formulación y administración del oligómero descrito. Por consiguiente, en una realización, la presente descripción se dirige a una composición que comprende un oligómero como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El suministro eficaz del oligómero antisentido al ácido nucleico diana es un aspecto importante del tratamiento. Las rutas de suministro de oligómeros antisentido incluyen, pero no se limitan a, varias rutas sistémicas, incluidas las rutas oral y parenteral, por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e intrínseca. amuscular, así como por inhalación, transdérmica y tópica. La ruta apropiada puede ser determinada por un experto en la técnica, según sea apropiado para la condición del sujeto bajo tratamiento. La circulación vascular o extravascular, el sistema sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son algunos sitios no limitantes donde se puede introducir el ARN.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden administrarse al sistema nervioso de un sujeto mediante cualquier método reconocido en la técnica. Por ejemplo, la inyección en sangre periférica de los oligonucleótidos antisentido de la invención se puede usar para administrar dichos reactivos a neuronas periféricas por medios difusivos y/o activos. Alternativamente, los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden modificarse para promover el cruce de la barrera hematoencefálica (BHE) para lograr el suministro de dichos reactivos a las células neuronales del sistema nervioso central (SNC). Los recientes avances específicos en la tecnología de oligonucleótidos antisentido y las estrategias de administración han ampliado el alcance del uso de oligonucleótidos antisentido para trastornos neuronales (Forte, A., et al. 2005. Curr. Drug Targets 6: 21-29; Jaeger, LB y WA Banks.

2005. Methods Mol. Med. 106: 237-251; Vinogradov, SV, et al. 2004. Bioconjug. Chem. 5: 50-60). Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de la invención se pueden generar como compuestos de ácido nucleico peptídico (PNA). Se ha identificado que cada uno de los reactivos de PNA cruza la BHE (Jaeger, L. B. y W. A. Banks. 2005. Methods Mol. Med. 106: 237-251). También se ha descrito que el tratamiento de un sujeto con, por ejemplo, un agente vasoactivo, promueve el transporte a través de la BHE (Id). La unión de los oligonucleótidos antisentido de la invención a agentes que se transportan activamente a través de la BHE también se puede usar como mecanismo de administración. Además, los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden administrarse intracerebroventricularmente (icv).

Los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden administrarse mediante métodos transdérmicos (por ejemplo, mediante la incorporación de los oligonucleótidos antisentido en, por ejemplo, emulsiones, con tales oligonucleótidos antisentido opcionalmente empaquetados en liposomas). Dichos métodos de administración transdérmicos y mediados por emulsión/liposomas se describen para la administración de oligonucleótidos antisentido en la técnica, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 6.965.025.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención también pueden administrarse mediante un dispositivo implantable. El diseño de tal dispositivo es un proceso reconocido en la técnica, con, por ejemplo, el diseño de implante sintético descrito en, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.969.400.

Se pueden introducir oligonucleótidos antisentido en células usando técnicas reconocidas en la técnica (por ejemplo, transfección, electroporación, fusión, liposomas, partículas poliméricas coloidales y vectores virales y no virales, así como otros métodos conocidos en la técnica). El método de administración seleccionado dependerá al menos de las células a tratar y la ubicación de las células y será evidente para el experto en la técnica. Por ejemplo, la localización se puede lograr mediante liposomas con marcadores específicos en la superficie para dirigir el liposoma, inyección directa en tejido que contiene células diana, captación mediada por receptores específicos, vectores virales o similares.

Como se conoce en la técnica, los oligonucleótidos antisentido se pueden administrar usando, por ejemplo, métodos que implican captación mediada por liposomas, conjugados de lípidos, captación mediada por polilisina, captación mediada por nanopartículas y endocitosis mediada por receptores, así como modos de administración adicionales no endocíticos, como microinyección, permeabilización (p. ej., permeabilización de estreptolisina-O, permeabilización de péptidos aniónicos), electroporación y varios métodos de administración no invasivos no endocíticos que se conocen en la técnica (consúltese Dokka y Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49).

Los oligonucleótidos antisentido se pueden administrar en cualquier vehículo o transportador conveniente que sea fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede incluir cualquiera de una variedad de vehículos estándar farmacéuticamente aceptables empleados por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), agua, etanol acuoso, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua o emulsiones de triglicéridos, comprimidos y cápsulas. La elección del transportador fisiológicamente aceptable adecuado variará dependiendo del modo de administración elegido. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones.

Los compuestos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido) de la presente invención se pueden utilizar generalmente como ácido libre o base libre. Alternativamente, los compuestos de esta invención se pueden usar en forma de sales de adición de ácidos o bases. Las sales de adición de ácido de los compuestos amino libres de la presente invención pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica, y pueden formarse a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen ácido maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, metanosulfónico, acético, trifluoroacético, oxálico, propiónico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinámico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutámico y bencenosulfónico.

Los ácidos inorgánicos adecuados incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico. Las sales de adición de base incluyen aquellas sales que se forman con el anión carboxilato e incluyen sales formadas con cationes orgánicos e inorgánicos tales como los elegidos entre los metales alcalinos y alcalinotérreos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, magnesio, bario y calcio), así como el ión amonio y sus derivados sustituidos (por ejemplo, dibencilamonio, bencilamonio, 2-hidroxietilamonio y similares). Por tanto, el término "sal farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar todas y cada una de las formas de sal aceptables.

Además, los profármacos también se incluyen dentro del contexto de esta invención. Los profármacos son vehículos unidos covalentemente que liberan un compuesto in vivo cuando dicho profármaco se administra a un paciente. Los profármacos se preparan generalmente modificando grupos funcionales de tal manera que la modificación se escinde, ya sea mediante manipulación rutinaria o in vivo, produciendo el compuesto original. Los profármacos incluyen, por ejemplo, compuestos de esta invención en los que los grupos hidroxi, amina o sulfhidrilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un paciente, se escinde para formar los grupos hidroxi, amina o sulfhidrilo. Por tanto, los ejemplos representativos de profármacos incluyen (pero no se limitan a) derivados de acetato, formiato y benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de los oligonucleótidos antisentido de la invención. Además, en el caso de un ácido carboxílico (-COOH), se pueden emplear ésteres, tales como ésteres metílicos, ésteres etílicos y similares.

En algunos casos, se pueden emplear liposomas para facilitar la captación del oligonucleótido antisentido en las células. (Véase, por ejemplo, Williams, SA, Leukemia 10 (12): 1980-1989, 1996; Lappalainen et al., Antiviral Res. 23: 119, 1994; Uhlmann et al., antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle, Chemical Reviews, Volumen 90, No. 4, 25 páginas 544-584, 1990; Gregoriadis, G., Capítulo 14, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, págs. 287-341, Academic Press, 1979). Los hidrogeles también pueden usarse como vehículos para la administración de oligómeros antisentido, por ejemplo, como se describe en el documento WO 93/01286. Alternativamente, los oligonucleótidos se pueden administrar en microesferas o micropartículas. (Véase, por ejemplo, Wu, G.Y. y Wu, C.H., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, 30 1987). Alternativamente, el uso de microburbujas llenas de gas complejadas con los oligómeros antisentido puede mejorar el suministro a los tejidos diana, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.245.747. También pueden usarse composiciones de liberación sostenida. Estos pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados tales como películas o microcápsulas.

El oligonucleótido antisentido puede administrarse a un sujeto mamífero, por ejemplo, un ser humano o un animal doméstico, que presente los síntomas de un trastorno de repetición de polinucleótidos, en un vehículo farmacéutico adecuado. Se contempla que el oligonucleótido antisentido reduce selectivamente la expresión de una proteína mutante en el sujeto.

En un aspecto del método, el sujeto es un sujeto humano, por ejemplo, un paciente al que se le ha diagnosticado una enfermedad por repetición de polinucleótidos. La condición del paciente también puede dictar la administración profiláctica de un oligonucleótido antisentido de la invención, por ejemplo, en el caso de un paciente que (1) está inmunodeprimido; (2) es víctima de quemaduras; (3) tiene un catéter permanente; o (4) está a punto de someterse o se ha sometido recientemente a una cirugía. En una realización preferida, el oligonucleótido antisentido está contenido en un vehículo farmacéuticamente aceptable y se administra por vía oral. En otra realización preferida, el oligómero está contenido en un vehículo farmacéuticamente aceptable y se administra por vía intravenosa (i.v.).

El compuesto antisentido se puede administrar en una cantidad y manera eficaz para dar como resultado una concentración máxima en sangre de al menos 200-400 nM de oligonucleótido antisentido. Normalmente, se administran una o más dosis de oligómero antisentido, generalmente a intervalos regulares, durante un período de aproximadamente una a dos semanas.

Las dosis preferidas para la administración oral son de aproximadamente 1 a 1000 mg de oligonucleótido para 70 kg. En algunos casos, pueden ser necesarias dosis de más de 1000 mg de oligonucleótido/paciente. Para administración i.v., las dosis preferidas son de aproximadamente 0,5 mg a 1000 m g de oligómero para 70 kg. El oligonucleótido antisentido se puede administrar a intervalos regulares durante un período de tiempo corto, por ejemplo, diariamente durante dos semanas o menos; una vez cada 2 días; una vez cada 3 días; una vez cada 3 a 7 días; una vez cada 3 a 10 días; una vez cada 7 a 10 días; una vez cada dos semanas; una vez al mes o cada dos, tres, cuatro, cinco o seis meses. Sin embargo, en algunos casos, el oligonucleótido se administra de forma intermitente durante un período de tiempo más largo, por ejemplo, durante varias semanas, meses o años. La administración puede ir seguida de, o al mismo tiempo que la administración de un antibiótico u otro tratamiento terapéutico. El régimen de tratamiento puede ajustarse (dosis, frecuencia, vía, etc.) según se indique, en base a los resultados de inmunoensayos, otras pruebas bioquímicas y examen fisiológico del sujeto en tratamiento.

Un régimen de tratamiento in vivo eficaz que utiliza los oligonucleótidos antisentido de la invención puede variar según la duración, la dosis, la frecuencia y la vía de administración, así como la condición del sujeto en tratamiento (es decir, administración profiláctica versus administración en respuesta a infección localizada o sistémica). Por consiguiente, tal terapia in vivo requerirá a menudo un seguimiento mediante pruebas apropiadas para el tipo particular de trastorno en tratamiento, y los correspondientes ajustes en la dosis o el régimen de tratamiento, para lograr un resultado terapéutico óptimo.

El tratamiento se puede controlar, por ejemplo, mediante indicadores generales de enfermedad conocidos en la técnica. La eficacia de un oligonucleótido antisentido administrado in vivo de la invención puede determinarse a partir de muestras biológicas (tejido, sangre, orina, etc.) tomadas de un sujeto antes, durante y después de la administración del oligonucleótido antisentido. Los ensayos de tales muestras incluyen (1) monitorizar la presencia o ausencia de formación de heterodúplex con secuencias diana y no diana, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, un ensayo electroforético de movilidad en gel; (2) monitorizar la cantidad de un ARNm o proteína mutante en relación con un ARNm o proteína de tipo salvaje de referencia según se determina mediante técnicas estándar como RT-PCR, transferencia Northern, ELISA o transferencia Western.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es absorbido activamente por células de mamífero. En realizaciones adicionales, el oligonucleótido antisentido puede conjugarse con una porción de transporte (por ejemplo, péptido de transporte) como se describe en el presente documento para facilitar dicha captación.

Métodos de tratamiento

En el presente documento, dentro del contexto de la invención, también se describen métodos para reducir la expresión de ARNm o la expresión de proteínas usando los oligonucleótidos antisentido de la presente invención con fines terapéuticos (por ejemplo, tratar sujetos con trastornos de repetición de polinucleótidos). Por consiguiente, dentro del contexto de la invención, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un individuo afectado por un trastorno de repetición de polinucleótidos caracterizado por la expresión aberrante de un ARNm mutante o proteína que contiene una repetición de polinucleótido asociada a la enfermedad.

Las células de un sujeto que tiene, por ejemplo, EH, pueden ponerse en contacto con un oligonucleótido antisentido de la invención para reducir la expresión de ARNm o proteína producida a partir del alelo HTT mutante. Además, las células de un sujeto que tiene un trastorno de repetición de polinucleótidos diferente (p. ej., uno de los enumerados en la Tabla 1) que se beneficiarían de la expresión reducida de una proteína producida a partir de un alelo que contiene una repetición de polinucleótido mutante pueden ponerse en contacto con un oligonucleótido antisentido de la invención. Las secuencias diana y las secuencias ejemplares de oligonucleótidos antisentido también se describen en la Tabla 1.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención se pueden administrar a sujetos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) trastornos asociados con la expresión aberrante de un ARNm o proteína producida a partir de un alelo que contiene una repetición de polinucleótidos mutante. Junto con dicho tratamiento, se puede considerar la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto o fármaco extraño). Las diferencias en el metabolismo de los agentes terapéuticos pueden provocar una toxicidad grave o un fracaso terapéutico al alterar la relación entre la dosis y la concentración en sangre del fármaco farmacológicamente activo. Por tanto, un médico o clínico puede considerar aplicar el conocimiento obtenido en estudios farmacogenómicos relevantes para determinar si administrar un agente terapéutico así como adaptar la dosis y/o régimen terapéutico de tratamiento con un agente terapéutico.

Comparación de la expresión de la transcripción de HTT mutante en respuesta al tratamiento con oligonucleótidos PMOapn, PMO y LNA

Al realizar el proceso descrito en este documento dentro del contexto de la invención, se realizó una comparación en paralelo de la expresión de ARNm entre oligonucleótidos de PMOapn, PMO y LNA. Los resultados son visibles en las figuras 6-10. Los oligómeros LNA, PMO y APN contienen la misma secuencia: 5' GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT G 3' (Id. de Sec. n°: 21). Los oligómeros de LNA (ordenados de Exiqon) contienen un esqueleto de ADN con una modificación de LNA en cada base T (7 modificaciones en total). Los oligómeros de APN contienen la estructura de PMO con una modificación de apn en cada base T (7 modificaciones en total). Los oligómeros de PMO contienen el esqueleto de PMO sin modificaciones adicionales en ningún enlace entre subunidades.

Las células se nucleofectaron con el oligo LNA, PMO o APN, respectivamente. Véase el Ejemplo 23. El ARN restante 48 horas después del proceso de nucleotransfección se cuantificó usando PCR con transcriptasa inversa y los productos de PCR se procesaron en un gel de acrilamida. La intensidad de la banda de gel que representa el alelo HTT de tipo salvaje o mutante de las células de fibroblastos GM04281 (Coriell) se normalizó a la intensidad de la banda de tipo salvaje o mutante correspondiente de la muestra tratada más baja. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Cada punto en los gráficos representa la media de los niveles de expresión normalizados de dos réplicas en cada concentración, y se combinaron dos experimentos independientes para producir el conjunto de datos en la Fig. 6. La cuantificación de la intensidad del gel se realizó con ImageQuant (GE). La normalización de la intensidad, el cálculo de CE50 y la selectividad se analizaron con Microsoft Excel y R.

Los valores medios de CE50 para cada alelo se calcularon a partir del conjunto de datos presentado en la figura 6, así como la selectividad para el alelo mutante se calculó a partir de la CE50 de los alelos de tipo salvaje y mutante de fibroblastos nucleofectados con el mismo oligo, usando R y Graphpad Prism. En la Fig. 7 y la Fig. 9A se muestra una comparación cuantitativa de los resultados. Una comparación de la CE50 muestra que las células tratadas con los oligos de PMO y APN tienen una expresión de ARNm reducida del alelo mutante en relación con el alelo de tipo salvaje en comparación con el LNA. Además, la potencia del oligo APN, basada en los valores de CE50, es mejor con respecto al oligo PMO.

Los resultados muestran la reducción inesperada en los niveles de ARNm mutante que se cree que es responsable de la enfermedad de Huntington por los oligómeros de PMO, APN y LNA, y que los oligonucleótidos de APN fueron más selectivos para reducir la expresión de ARNm mutante en oligómeros PMO o LNA. Un experto en la técnica apreciará que este método para reducir la expresión de ARNm de enfermedades por repetición puede aplicarse a otros ARNm de enfermedades por repetición, tales como los que causan ELA y enfermedades por repetición que tienen repeticiones expandidas de trinucleótidos CAG. En el oligonucleótido antisentido, n es preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.

Comparación de la expresión de la proteína HTT mutante en respuesta al tratamiento con oligonucleótidos de PMOapn, PMO y LNA

Los resultados anteriores se ampliaron a un análisis de la expresión de la proteína HTT mutante, dado que la enfermedad de Huntington y muchas otras enfermedades por expansión de repeticiones, finalmente se manifiestan debido a la ganancia tóxica de función asociada con la expresión de una proteína producida a partir de un alelo que contiene la repetición de un polinucleótido mutante.

La Fig. 11 muestra una comparación en paralelo de la selectividad de oligonucleótidos PMOapn, PMO y LNA que tienen las mismas secuencias y modificaciones que las descritas para las Figs. 6-10. Las células GM-04281 se nucleofectaron como se describe para las Figs. 6-10. Véase el Ejemplo 24. Se prepararon lisados de proteínas y se sometieron a análisis de transferencia Western usando anticuerpo primario anti-HTT o anti-p-actina. Las transferencias resultantes se escanearon en un Typhoon Trio (GE) y la intensidad de la señal de la proteína HTT mutante y normal se cuantificó por separado con el software ImageQuant (GE). La intensidad de la señal de las bandas HTT normal (inferior) y mutante (superior) se normalizó a la señal de p-actina dentro de cada carril, y luego cada banda HTT se normalizó a la intensidad de la banda HTT normal o mutante correspondiente de una muestra de control no tratada en una mancha separada. Los resultados de la expresión de proteínas se representan para cada alelo (normal, línea continua; mutante, línea discontinua) como el porcentaje medio de expresión de la proteína HTT, /- 1 DE. La Fig. 12 muestra los mismos datos representados como una relación de expresión de la proteína HTT de tipo salvaje a mutante. Como se muestra en las Figs. 11 y 12, con respecto a los oligonucleótidos PMO y LNA modificados, los oligonucleótidos APN modificados mostraron una alta selectividad para reducir la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje.

Los resultados muestran la reducción inesperada en los niveles de proteína HTT mutante por APN-, y en menor grado PMO-, pero no oligonucleótidos modificados con LNA. Un experto en la técnica apreciará que este método para reducir la expresión de la proteína de la enfermedad por repetición puede aplicarse a otros ARNm de la enfermedad por repetición, tales como los que causan ALS y enfermedades por repetición de nucleótidos que tienen repeticiones expandidas de trinucleótidos CAG. La Tabla 1 enumera otras enfermedades por repetición a las que se puede aplicar esta tecnología, junto con oligonucleótidos antisentido ejemplares para cada una de las enfermedades.

Comparación de la expresión de la proteína HTT mutante en respuesta al tratamiento con oligonucleótidos antisentido con modificaciones relacionadas con APN y Plus

La selectividad de oligonucleótidos antisentido se ensayaron los enlaces entre subunidades APN- (es decir, APN y map) y relacionados con plus (es decir, plus, meda y etpip) para reducir la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje.

PMO-apnT: GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT G (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

PMO-mapT: GCmapTGCmapTGCmaPTGCmaPTGCmapTGCmapTGCmapTG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

PMOplus: GC+TGC+TGC+TGC+TGC+TGC+TGC TG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

PMO-medaT: GCmedaTGCmedaTGCmedaTGCmedaTGCmedaTGCmedaTGCmedaTG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

PMO-EtpipT: GCEtpipTGCEtpipTGCEtpipTGCEtpipTGCEtpipTGCEtpipTGCEtpipTG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

En la Fig. 13 se muestran estructuras ejemplares para modificaciones catiónicas relacionadas con APN y plus. Se nucleofectaron células GM-04281 como se describe para las Figs. 6-10 y las muestras de proteína se analizaron como se describe para las Figs. 11 y 12. Véase el ejemplo 25.

Los resultados muestran que los oligonucleótidos que tienen enlaces intersubunitarios relacionados con APN o plus mostraron una selectividad inesperadamente alta para reducir la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje. En particular, de los compuestos probados, los oligonucleótidos modificados con APN y etpipT mostraron la mayor selectividad por la proteína HTT mutante (Figuras 14 y 15). Un experto en la técnica apreciará que se pueden incorporar modificaciones catiónicas alternativas (por ejemplo, enlaces intersubunitarios relacionados con plus) en oligonucleótidos antisentido de la invención para reducir la expresión de proteínas mutantes asociadas con enfermedades por repetición de nucleótidos, tales como ELA y enfermedades por repetición que tienen repeticiones expandidas de trinucleótidos CAG. La Tabla 1 enumera otras enfermedades por repetición a las que se puede aplicar esta tecnología, junto con oligonucleótidos antisentido ejemplares para cada una de las enfermedades.

La preparación de PMO-X con enlazadores internucleósidos de nitrógeno básicos

Las subunidades de morfolino, los enlaces intersubunitarios modificados y los oligómeros que los comprenden se pueden preparar como se describe en los ejemplos y en las patentes de EE.UU. números 5.185.444 y 7.943.762. Las subunidades de morfolino se pueden preparar de acuerdo con el siguiente esquema de reacción general I.

Esquema de reacción 1. Preparación de la subunidad m orfolino

Con referencia al esquema de reacción 1, en el que B representa una porción de emparejamiento de bases y PG representa un grupo protector, las subunidades de morfolino se pueden preparar a partir del correspondiente ribonucleósido (1) como se muestra. La subunidad morfolino (2) puede protegerse opcionalmente por reacción con un precursor de grupo protector adecuado, por ejemplo cloruro de tritilo. El grupo protector 3' generalmente se elimina durante la síntesis de oligómeros en estado sólido como se describe con más detalle a continuación. La porción de emparejamiento de bases puede protegerse de forma adecuada para la síntesis de oligómeros de fase sólida. Los grupos protectores adecuados incluyen benzoílo para adenina y citosina, fenilacetilo para guanina y pivaloiloximetilo para hipoxantina (I). El grupo pivaloiloximetilo se puede introducir en la posición N1 de la base heterocíclica hipoxantina. Aunque se puede emplear una subunidad de hipoxantina no protegida, los rendimientos en las reacciones de activación son muy superiores cuando la base está protegida. Otros grupos protectores adecuados incluyen los descritos en la solicitud de Estados Unidos en trámite n° 12/271.040.

La reacción de 3 con el compuesto de fósforo activado 4 da como resultado subunidades de morfolino que tienen la porción de enlace deseada 5. Los compuestos de estructura 4 se pueden preparar usando cualquier número de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, tales compuestos pueden prepararse mediante la reacción de la amina correspondiente y el oxicloruro de fósforo. A este respecto, el material de partida de amina se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos en los Ejemplos y en la Patente de Estados Unidos N° 7.943.762.

Los compuestos de estructura 5 pueden usarse en la síntesis de oligómeros automatizada en fase sólida para la preparación de oligómeros que comprenden los enlaces entre subunidades. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Brevemente, un compuesto de estructura 5 puede modificarse en el extremo 5' para que contenga un enlazador a un soporte sólido. Por ejemplo, el compuesto 5 puede estar unido a un soporte sólido mediante un enlazador que comprende L11 y L15. Un método ejemplar se demuestra en las Figuras 1 y 2. Una vez soportado, el grupo protector (p. ej., tritilo) se elimina y la amina libre se hace reaccionar con una porción de fósforo activado de un segundo compuesto de estructura 5. Esta secuencia se repite hasta que se se obtiene la longitud del oligo deseada. El grupo protector en el extremo terminal 5' puede eliminarse o dejarse si se desea una modificación 5'. El oligonucleótido puede eliminarse del soporte sólido utilizando varios métodos, por ejemplo, tratamiento con DTT seguido de hidróxido de amonio como se muestra en las Figuras 3 y 4.

La preparación de subunidades de morfolino modificadas y oligómeros de morfolino se describe con más detalle en los Ejemplos. Los oligómeros morfolino que contienen cualquier número de enlaces modificados se pueden preparar usando métodos descritos en el presente documento, métodos conocidos en la técnica y/o descritos por ref. referencia en este documento. También se describen en los ejemplos modificaciones globales de oligómeros morfolino preparados como se describió previamente (ver, por ejemplo, la publicación PCT WO2008036127).

El término "grupo protector" se refiere a porciones químicas que bloquean algunas o todas las porciones reactivas de un compuesto y evitan que dichas porciones participen en reacciones químicas hasta que se elimine el grupo protector, por ejemplo, las porciones enumeradas y descritas en T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed. John Wiley & Sons (1999). Puede ser ventajoso, cuando se emplean diferentes grupos protectores, que cada grupo protector (diferente) sea eliminable por medios diferentes. Los grupos protectores que se escinden en condiciones de reacción totalmente dispares permiten la eliminación diferencial de dichos grupos protectores. Por ejemplo, los grupos protectores pueden eliminarse mediante ácido, base e hidrogenolisis. Los grupos tales como tritilo, dimetoxitritilo, acetal y terc-butildimetilsililo son lábiles a los ácidos y pueden usarse para proteger restos reactivos de carboxi e hidroxi en presencia de grupos amino protegidos con grupos Cbz, que se pueden eliminar por hidrogenolisis, y grupos Fmoc, que son lábiles a las bases. Las porciones de ácido carboxílico pueden bloquearse con grupos lábiles de bases tales como, sin limitación, metilo o etilo, y las porciones hidroxi reactivas pueden bloquearse con grupos lábiles de bases tales como acetilo en presencia de aminas bloqueadas con grupos lábiles de ácidos tales como carbamato de terc-butilo, o con carbamatos que son estables tanto en ácidos como en bases pero que se eliminan hidrolíticamente.

Las porciones reactivas de ácido carboxílico e hidroxilo también se pueden bloquear con grupos protectores que se eliminan hidrolíticamente, tales como el grupo bencilo, mientras que los grupos amina se pueden bloquear con grupos lábiles de bases tales como Fmoc. Un grupo protector de amina particularmente útil para la síntesis de compuestos de Fórmula (I) es la trifluoroacetamida. Las porciones reactivas con ácido carboxílico pueden bloquearse con grupos protectores eliminables por oxidación tales como 2,4-dimetoxibencilo, mientras que los grupos amino coexistentes pueden bloquearse con sililcarbamatos lábiles al fluoruro.

Los grupos de bloqueo alilo son útiles en presencia de grupos protectores de ácidos y bases, ya que los primeros son estables y pueden eliminarse posteriormente mediante catalizadores metálicos o de ácido pi. Por ejemplo, un ácido carboxílico bloqueado con alilo se puede desproteger con una reacción catalizada con paladio (0) en presencia de grupos protectores de carbamato de t-butilo lábil en ácido o acetato amina lábil en base. Otra forma más de grupo protector es una resina a la que se puede unir un compuesto o intermedio. Mientras el residuo esté unido a la resina, ese grupo funcional se bloquea y no puede reaccionar. Una vez liberado de la resina, el grupo funcional está disponible para reaccionar.

Los grupos de bloqueo/protección típicos se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, las siguientes porciones:

A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich-Fluka. Se obtuvieron benzoil adenosina, benzoil citidina y fenilacetil guanosina de Carbosynth Limited, Reino Unido.

La síntesis de PMO, PMO+, PPMO y PMO-X que contienen modificaciones de enlace adicionales como se describe en este documento se realizó utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en las solicitudes estadounidenses pendientes n° 12/271,036 y 12/271,040 y la publicación PCT número WO/2009/064471.

El PMO con una modificación de tritilo 3' se sintetiza esencialmente como se describe en la publicación PCT número WO/2009/064471 con la excepción de que se omite la etapa de destritilación.

Procedimiento A para la preparación de subunidades activadas:

A una solución agitada de 6 (1 eq.) en diclorometano se le añadió POCh (1,1 eq.), seguido de diisopropiletilamina (3 eq.) a 0 °C, enfriado en un baño de hielo. Después de 15 minutos, se retiró el baño de hielo y la solución se dejó calentar a temperatura ambiente durante una hora. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó tres veces con ácido cítrico acuoso al 10%. Después de secar sobre MgSO4, la capa orgánica se pasó a través de un lecho corto de gel de sílice y se concentró al vacío. El fosforoamidodicloruro resultante (4) se usó directamente para el siguiente paso sin purificación adicional.

A una solución del fosforoamidodicloruro (4) (1 eq.), 2,6-lutidina (1 eq.) en diclorometano se añadió una solución de Mo(Tr)T (7) (0,5 eq.)/diclorometano, seguido de N-metilimidazol (0,2 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó tres veces con ácido cítrico acuoso al 10%. Después de secar sobre MgSO4, la capa orgánica se filtró y luego se concentró. El producto (8) se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/hexanos) y luego se almacenó a -20°C. La estructura fue confirmada por análisis LCMS.

Procedimiento B para la preparación de subunidades activadas:

A una solución de POCh (1,1 eq.) en diclorometano se le añadió 2,6-lutidina (2 eq.), seguido de la adición gota a gota de una solución de Mo(Tr)T (7) (1 eq.)/diclorometano a 0°C. Después de 1 hora, la solución de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó rápidamente tres veces con ácido cítrico acuoso al 10%. El fosfodicloridato deseado (9) se obtuvo después de secar sobre MgSO4 y evaporar el disolvente.

A una solución del fosforodicloridato (1 eq.) en diclorometano se le añadió gota a gota amina (1 eq.)/diclorometano a la solución a 0 °C. Después de 15 minutos, se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Una vez completada la reacción, el producto (8) en forma de un sólido blanco se recogió mediante precipitación con la adición de hexanos, seguido de filtración. El producto se almacenó a -20 °C después de secar al vacío. La estructura fue confirmada por análisis LCMS.

Ejemplo 1: fosforodicloridato de ((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il) -4-tritilmorfolin-2-il)metil

A una solución de DCM enfriada (baño de hielo/agua) (20 ml) de oxicloruro de fósforo (2,12 ml, 22,7 mmol) se le añadió gota a gota 2,6-lutidina (4,82 ml, 41,4 mmol) y luego se añadió gota a gota una solución de DCM (20 ml) Mo(Tr)T (2) (10,0 g, 20,7 mmol) durante 15 min (temperatura int. 0-10 °C), luego se retiró el baño y se continuó agitando a temperatura ambiente durante 20 min. La reacción se lavó con una solución de ácido cítrico (40 ml x 3, 10% p/v ac), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta una espuma blanca (9,79 g) y luego se usó directamente para el siguiente procedimiento.

Ejemplo 2: (4-(dimetilamino)piperidin-1-il) fosfonocloridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

A una solución de DCM enfriada (baño de hielo/agua) (5 ml) del diclorofosfato del ejemplo 1 (5,00 g, 5,00 mmol) se le añadió una solución de DCM (5 ml) de la piperidina (0,61 g, 4,76 mmol). gota a gota, luego se retiró el baño y se continuó agitando a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se cargó directamente en la columna. La cromatografia [columna de SO2 (40 g), eluyente DCM/EtOH (gradiente 1:0 a 1:1)] para producir el compuesto del título (2,5 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C46H55N8O7P 862,4, encontrado m/z = 863,6 (M+1).

Ejemplo 3: cloruro de 1-(1-(cloro((6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)fosforilo) piperidin-4-il)-1-metilpirrolidin-1-io

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (0,6 g) como un sólido blanco. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C49H60N8O7P 903,4, encontrado m/z = 903,7 (M+).

Ejemplo 4 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-metilpiperazin-1-il)fosfonocloridato de ((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

A una solución de DCM enfriada (baño de hielo/agua) (10 ml) de oxicloruro de fósforo (1,02 ml, 11,0 mmol) se le añadió gota a gota 2,6-lutidina (3,49 ml, 29,9 mmol) y luego una solución de DCM (10 ml) de metil piperazina (1,00 g, 10,0 mmol) gota a gota y se continuó agitando durante 1 h. Se añadió una solución de DCM (10 ml) de Mo(Tr)T (2) (4,82, 10,0 mmol) y NMI (79 |il, 1,0 mmol) y se agitó 4 h, luego se cargó directamente en la columna. La cromatografía [columna de SO2 (80 g), DCM/Acetona con eluyente de TEA al 2% (gradiente de 1:0 a 0:1)] para producir el compuesto del título (0,8 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C43H48N7O8P 834,4, encontrado m/z = 835,5 (M+1).

Ejemplo 5 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-etilpiperazin-1-il) fosfonocloridato de ((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4 para producir el compuesto del título (11,5 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C45H53N8O7P 848,4, encontrado m/z = 849,7 (M+1).

Ejemplo 6 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-etilpiperazin-1-il)fosfonocloridato de ((2S, 6 R)-6-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4 para producir el compuesto del título (4,5 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C52H56N11O6P 961,4, encontrado m/z = 962,8 (M+1).

Ejemplo 7 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-isopropilpiperazin-1-il) fosfonocloridato de ((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4 para producir el compuesto del título (3,5 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado. para el derivado de 1- (4-nitrofenil) piperazina C46H55N8O7P 862,4, encontrado m/z = 863,7 (M+1).

Ejemplo 8 (no cubierto por las reivindicaciones): metil (2-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fosforamidocloridato de ((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4 para producir el compuesto del título (1,0 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C44H48F3N8O8P 904,3, encontrado m/z = 903,7 (M-1).

Ejemplo 9 (no cubierto por las reivindicaciones): metil(2-(2,2,2-trifluoro-N-metilacetamido)etil)fosforamidodoridato de ((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

El compuesto del título se sintetizó de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 4 para producir el compuesto del título (1,8 g) como una espuma blanca. ESI/MS calculado. para el derivado de 1- (4-nitrofenil) piperazina C45H50F3N8O8P 918,3, encontrado m/z = 1836,6 (2M+).

Ejemplo 10 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(2,2,2-trifluoroacetamido)piperidin-1-il)fosfonocloridato de ((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

A una solución enfriada (baño de hielo/agua) de oxicloruro de fósforo (17,7 ml, 190 mmol) en DCM (190 ml) se le añadió gota a gota 2,6-lutidina (101 ml, 864 mmol) y luego Mo(Tr)T (2) (83,5 g, 173 mmol) en porciones durante 15 min (temp. interna 0-10 °C) y se agitó. Después de 30 min, se añadió gota a gota la 4-aminopiperidina monotrifluoroacetamida (48,9 g, ~ 190 mmol) durante 15 min (temperatura interna 0-8 °C) y se agitó. Después de 1 hora, se añadió gota a gota DIPEA (50 ml) (temperatura interna 0-10 °C) y se agitó 1 hora. La reacción se lavó con una solución de ácido cítrico (500 ml x 3, 10% p/v ac), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un aceite viscoso que se cargó directamente en la columna. La cromatografia [columna de SO2 (330 g), eluyente de hexanos/EtOAc (gradiente 1:0 a 0:1 )] para producir el compuesto del título (91,3 g, rendimiento del 70%) en forma de una espuma blanca. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C43H48N7O8P 930,9, encontrado m/z = 954,4 (M+Na).

Los ejemplos 13-37 se prepararon mediante el procedimiento A descrito anteriormente.

Ejemplo 11 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(1-(2,2,2-trifluoroacetil)piperidin-4-il)piperazin-1-il)fosfonocloridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 12: (4-morfolinopiperidin-1-il)fosfonocloridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 13 (no cubierto por las reivindicaciones): bis(3-(2,2,2-trifluoroacetamido)propil)fosforamidodoridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-trrtilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 14: [1,4'-bipiperidina]-1'-Mfosfonocloridato de (6-(5-metN-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-N)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Los ejemplos 15 a 20 siguientes se prepararon mediante el procedimiento B descrito anteriormente.

Ejemplo 15 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(pirimidin-2-il)piperazin-1-N)fosfonocloridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-N)-4-tritilmorfolin-2-N)metNo

Ejemplo 16 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(2-(dimetilamino)etN)piperazin-1-N)fosfonocloridato de (6-(5-metN-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-N)-4-tritilmorfolin-2-N)metNo

Ejemplo 17 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-fenilpiperazin-1-il)fosfonodoridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 18 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(2,2,2-trifluoro-N-metilacetamido)piperidin-1-il)fosfonodoridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 19 (no cubierto por las reivindicaciones): metil(3-(2,2,2-trifluoro-N-metilacetamido)propil) fosforamidocloridato de (6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 20 (no cubierto por las reivindicaciones): (4-(2,2,2-trifluoroacetamido)piperidin-1-il)fosfonocloridato de ((2S, 6R) -6-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

Ejemplo 21: clorhidrato de dicloruro de (4-(pirrolidin-1-il) piperidin-1-il)fosfónico

A una solución enfriada (baño de hielo/agua) de oxicloruro de fósforo (5,70 ml, 55,6 mmol) en DCM (30 ml) se le añadió 2,6-lutidina (19,4 ml, 167 mmol) y una solución de DCM (30 ml) de 4-(1 -pirrolidinil)-piperidina (8,58 g, 55,6 mmol) y se agitó durante 1 hora. La suspensión se filtró y el sólido se lavó con un exceso de éter dietílico para proporcionar la pirrolidina del título (17,7 g, 91% de rendimiento) como un sólido blanco. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil) piperazina C19H30N5O4P 423,2, encontrado m/z = 422,2 (M-1).

Ejemplo 22: clorhidrato de (4-(pirrolidin-1-il)piperidin-1-il)fosfonocloridato de ((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metilo

A una solución enfriada y agitada (baño de hielo/agua) del diclorofosforamidato del Ejemplo 21 (17,7 g, 50,6 mmol) en DCM (100 ml) se añadió una solución de DCM (100 ml) de Mo(Tr)T (2) (24,5 g, 50,6 mmol), 2,6-lutidina (17,7 ml, 152 mmol) y 1-metilimidazol (0,401 ml, 5,06 mmol) gota a gota durante 10 minutos. Se dejó que el baño se calentara hasta la temperatura ambiente mientras se agitaba la suspensión. Después de 6 horas, la suspensión se vertió sobre éter dietílico (1 l), se agitó durante 15 minutos, se filtró y se lavó el sólido con más éter para producir un sólido blanco (45,4 g). El producto crudo se purificó por cromatografía [columna de SO2 (120 gramos), eluyente DCM/MeOH (gradiente 1:0 a 6:4)], y las fracciones combinadas se vertieron en éter dietílico (2,5 l), se agitaron 15 min, se filtraron y el sólido resultante se lavó con éter adicional para proporcionar el compuesto del título (23,1 g, rendimiento del 60%) como un sólido blanco. ESI/MS calculado para el derivado de 1-(4-nitrofenil)piperazina C48H57N8O7P 888,4, encontrado m/z = 887,6 (M-1).

Preparación de oligómeros de morfolino

Preparación de fenilcarbamato de tritil piperazina 1b (ver Figura 1): A una suspensión enfriada del compuesto 1a en diclorometano (6 ml/g 11) se añadió una solución de carbonato de potasio (3,2 eq.) en agua (carbonato de potasio 4 ml/g). A esta mezcla de dos fases se le añadió lentamente una solución de cloroformiato de fenilo (1,03 eq.) en diclorometano (2 g/g de cloroformiato de fenilo). La mezcla de reacción se calentó a 20 °C. Una vez completada la reacción (1-2 h), se separaron las capas. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre carbonato de potasio anhidro. El producto 1b se aisló por cristalización en acetonitrilo. Rendimiento = 80%.

Preparación de carbamato alcohol 1c: se suspendió hidruro de sodio (1,2 eq.) en 1 -metil-2-pirrolidinona (32 ml/g de hidruro de sodio). A esta suspensión se le añadieron trietilenglicol (10,0 eq.) y el compuesto 1b (1,0 eq.). La suspensión resultante se calentó a 95 °C. Una vez completada la reacción (1-2 h), la mezcla se enfrió a 20 °C. A esta mezcla se le añadió diclorometano al 30%/metil terc-butil éter (v:v) y agua. La capa orgánica que contiene el producto se lavó sucesivamente con NaOH acuoso, ácido succínico acuoso y cloruro de sodio acuoso saturado. El producto 1c se aisló por cristalización en diclorometano/metil terc-butil éter/heptano. Rendimiento = 90%.

Preparación del ácido de la cola 1d: A una solución del compuesto 1c en tetrahidrofurano (7 ml/g 36) se le añadió anhídrido succínico (2,0 eq.) y DMAP (0,5 eq.). La mezcla se calentó a 50 °C. Una vez completada la reacción (5 h), la mezcla se enfrió a 20 °C y se ajustó a pH 8,5 con NaHCO3 acuoso. Se añadió metil terc-butil éter y el producto se extrajo en la capa acuosa. Se añadió diclorometano y la mezcla se ajustó a pH 3 con ácido cítrico acuoso. La capa orgánica que contiene producto se lavó con una mezcla de tampón citrato a pH = 3 y cloruro de sodio acuoso saturado. Esta solución de diclorometano de 1d se utilizó sin aislamiento en la preparación del compuesto 1e.

Preparación de 1e: A la solución del compuesto 1d se le añadió imida del ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB) (1,02 eq.), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq.) y luego clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (1,1 eq.). La mezcla se calentó a 55 °C. Una vez completada la reacción (4-5 h), la mezcla se enfrió a 20°C y se lavó sucesivamente con ácido cítrico 0,2 M/salmuera 1:1 y salmuera. La solución de diclorometano se sometió a intercambio de disolvente a acetona y luego a N,N-dimetilformamida, y el producto se aisló por precipitación en acetona/N,N-dimetilformamida en cloruro de sodio acuoso saturado. El producto bruto se volvió a suspender varias veces en agua para eliminar la N,N-dimetilformamida residual y las sales. Rendimiento = 70% de 1e del compuesto 1c. La introducción de la "Cola" activada en el anclaje de disulfuro-resina se realizó en NMP mediante el procedimiento utilizado para la incorporación de las subunidades durante la síntesis en fase sólida.

Preparación del soporte sólido para la síntesis de oligómeros de morfolino (ver Figura 2): Este procedimiento se realizó en un recipiente de péptido encamisado y silanizado (hecho a medida por ChemGlass, NJ, E^e. UU.) Con una frita de vidrio de porosidad gruesa (40-60 |im), agitador superior y llave de paso de teflón de 3 vías para permitir que el N2 burbujee a través de la frita o una extracción al vacío. El control de temperatura se logró en el recipiente de reacción mediante un baño de agua circulante.

Las etapas de tratamiento/lavado de la resina en el siguiente procedimiento consisten en dos operaciones básicas: fluidización de la resina y extracción con disolvente/solución. Para la fluidización de la resina, se colocó la llave de paso para permitir que el N2 fluyera hacia arriba a través de la frita y se añadió el tratamiento/lavado de resina especificado al reactor y se dejó que penetrara y humedeciera completamente la resina. Luego se inició la mezcla y la suspensión de resina se mezcló durante el tiempo especificado. Para la extracción de disolvente/solución, se detuvo el mezclado y el flujo de N2 y se puso en marcha la bomba de vacío y luego se colocó la llave de paso para permitir la evacuación del tratamiento/lavado de resina a los desechos. Todos los volúmenes de tratamiento/lavado de resina fueron de 15 ml/g de resina a menos que se indique lo contrario.

A la resina de aminometilpoliestireno (malla 100-200; sustitución de N2 de ~ 1,0 mmol/g; 75 g, 1 eq., Polymer Labs, Reino Unido, parte # 1464-X799) en un recipiente de péptido encamisado y silanizado se añadió 1-metil-2-pirrolidinona (NMP; 20 ml/g de resina) y se dejó que la resina se hinchara en agitación durante 1-2 h. Tras la evacuación del disolvente de hinchamiento, la resina se lavó con diclorometano (2 x 1-2 min), diisopropiletilamina al 5% en isopropanol/diclorometano al 25% (2 x 3-4 min) y diclorometano (2 x 1-2 min). Después de la evacuación del lavado final, la resina se fluidizó con una solución de anclaje disulfuro 2a en 1 -metil-2-pirrolidinona (0,17 M; 15 ml/g de resina, ~ 2,5 eq.) y la mezcla de resina/reactivo se calentó a 45°C °C durante 60 h. Una vez completada la reacción, se interrumpió el calentamiento, se evacuó la solución de anclaje y se lavó la resina con 1-metil-2-pirrolidinona (4 x 3-4 min) y diclorometano (6 x 1-2 min). La resina se trató con una solución de dicarbonato de dietilo al 10% (v/v) en diclorometano (16 ml/g; 2 x 5-6 min) y luego se lavó con diclorometano (6 x 1-2 min). La resina 2b se secó bajo una corriente de N2 durante 1-3 horas y luego al vacío hasta un peso constante (±2%). Rendimiento: 110-150% del peso de resina original.

Determinación de la carga de resina de disulfuro de aminometilpoliestireno: La carga de la resina (número de sitios reactivos potencialmente disponibles) se determina mediante un ensayo espectrométrico para el número de grupos trifenilmetil (tritilo) por gramo de resina.

Se transfiere un peso conocido de resina seca (25 ± 3 mg) a un matraz aforado silanizado de 25 ml y se añaden ~ 5 ml de ácido trifluoroacético al 2% (v/v) en diclorometano. El contenido se mezcla agitando suavemente y luego se deja reposar durante 30 min. El volumen se lleva hasta 25 ml con ácido trifluoroacético adicional al 2% (v/v) en diclorometano y el contenido se mezcla completamente. Usando una pipeta de desplazamiento positivo, se transfiere una alícuota de la solución que contiene tritilo (500 |iL) a un matraz aforado de 10 mL y el volumen se lleva a 10 mL con ácido metanosulfónico.

El contenido de catión tritilo en la solución final se mide por absorbancia UV a 431,7 nm y la carga de resina se calcula en grupos tritilo por gramo de resina (|imol/g) usando los volúmenes, diluciones y coeficiente de extinción apropiados (e: 41 |imol- 1cm-1) y peso de resina. El ensayo se realiza por triplicado y se calcula una carga media. El procedimiento de carga de resina en este ejemplo proporcionará resina con una carga de aproximadamente 500 |imol/g. Se obtuvo una carga de 300-400 en |imol/g si la etapa de incorporación del ancla de disulfuro se realiza durante 24 horas a temperatura ambiente.

Carga de la cola: usando la misma configuración y volúmenes que para la preparación de resina de disulfuro de aminometilpoliestireno, la cola puede introducirse en la molécula. Para la etapa de acoplamiento, se usó una solución de 1e (0,2 M) en NMP que contenía 4-etilmorfolina (NEM, 0,4 M) en lugar de la solución de anclaje disulfuro. Después de 2 horas a 45 °C, la resina 2b se lavó dos veces con diisopropiletilamina al 5% en isopropanol al 25%/diclorometano y una vez con DCM. A la resina se le añadió una solución de anhídrido benzoico (0,4 M) y NEM (0,4 M). Después de 25 min, la camisa del reactor se enfrió a temperatura ambiente y la resina se lavó dos veces con diisopropiletilamina al 5% en isopropanol/diclorometano al 25% y ocho veces con DCM. La resina 2c se filtró y se secó a alto vacío. La carga de la resina 2c se define como la carga de la resina de disulfuro de aminometilpoliestireno 2b original utilizada en la carga de cola.

Síntesis en fase sólida: Se prepararon oligómeros de morfolino en un sintetizador de péptidos automatizado Gilson AMS-422 en columnas de reacción de polipropileno Gilson de 2 ml (número de pieza 3980270). Se colocó un bloque de aluminio con canales para el flujo de agua alrededor de las columnas mientras se sentaban en el sintetizador. El AMS-422 agregará alternativamente soluciones de reactivo/lavado, se mantendrá durante un tiempo específico y evacuará las columnas usando vacío.

Para oligómeros en el intervalo de hasta aproximadamente 25 subunidades de longitud, se prefiere la resina de disulfuro de aminometilpoliestireno con una carga cercana a 500 |imol/g de resina. Para oligómeros más grandes, se prefiere la resina de disulfuro de aminometilpoliestireno con una carga de 300-400 |imol/g de resina. Si se desea una molécula con cola de 5', la resina que se ha cargado con la cola se elige con las mismas pautas de carga.

Se prepararon las siguientes soluciones de reactivos:

Solución de destritilación: ácido cianoacético al 10% (p/v) en diclorometano/acetonitrilo 4:1; solución de neutralización: 5% de diisopropiletilamina en diclorometano/isopropanol 3:1;

Solución de acoplamiento: 0,18 M (o 0,24 M para oligómeros que han crecido más de 20 subunidades) subunidad morfolino activada de la base deseada y tipo de enlace y N-etilmorfolina 0,4 M, en 1,3-dimetilimidazolidinona. Se usó diclorometano (DCM) como lavado de transición separando los diferentes lavados de solución de reactivo.

En el sintetizador, con el bloque ajustado a 42 °C, a cada columna que contenía 30 mg de resina de aminometilpoliestirendisulfuro (o resina de cola) se le añadieron 2 ml de 1 -metil-2-pirrolidinona y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar 2 veces con 2 mL de diclorometano, se empleó el siguiente ciclo de síntesis:

Etapa Volumen Entrega Tiempo de retención

Destritilación 1,5 ml Colector 15 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralización 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Acoplamiento 350 ul-500 ul Jeringa 40 minutos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralización 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Las secuencias de los oligómeros individuales se programaron en el sintetizador para que cada columna reciba la solución de acoplamiento adecuada (A, C, G, T, I) en la secuencia adecuada. Cuando el oligómero en una columna había completado la incorporación de su subunidad final, la columna se retiró del bloque y se realizó un ciclo final manualmente con una solución de acoplamiento compuesta por cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo (0,32 M en DMI) que contenía 4-etilmorfolina 0,89 M.

Escisión de la resina y eliminación de bases y grupos protectores de la cadena principal: Después de la metoxitritilación, la resina se lavó 8 veces con 2 ml de 1 -metil-2-pirrolidinona. Se añadió un ml de una solución de escisión que consta de 1,4 ditiotreitol 0,1 M (DTT) y trietilamina 0,73 M en 1-metil-2-pirrolidinona, se tapó la columna y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 min. Pasado ese tiempo, la solución se drenó en un vial Wheaton de 12 ml. La resina muy encogida se lavó dos veces con 300 |il de solución de escisión. A la solución se le añadieron 4,0 ml de amoniaco acuoso concentrado (almacenado a -20°C), el vial se cerró herméticamente (con tapón de rosca revestido de teflón) y la mezcla se agitó para mezclar la solución. El vial se colocó en un horno a 45 °C durante 16-24 horas para efectuar la escisión de los grupos protectores de la base y la estructura.

Aislamiento inicial de oligómeros: la solución de amoniolisis en viales se retiró del horno y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución se diluyó con 20 ml de amoniaco acuoso al 0,28% y se pasó a través de una columna de 2,5 x 10 cm que contenía resina Macroprep HQ (BioRad). Se utilizó un gradiente de sal (A: amoniaco al 0,28% con B: cloruro de sodio 1 M en amoniaco al 0,28%; B al 0-100% en 60 min) para eluir el pico que contenía metoxitritilo. Las fracciones combinadas se combinaron y se procesaron adicionalmente dependiendo del producto deseado.

Desmetoxitritilación de oligómeros de morfolino: las fracciones combinadas de la purificación de Macroprep se trataron con H3PO4 1 M para reducir el pH a 2,5. Después de la mezcla inicial, las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente durante 4 minutos, momento en el que se neutralizaron a pH 10-11 con amoniaco/agua al 2,8%. Los productos se purificaron mediante extracción en fase sólida (SPE).

Se empaqueta Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Filadelfia, PA) (3 ml) en columnas fritadas de 20 ml (columnas de cromatografía BioRad Econo-Pac (732-1011)) y la resina se enjuaga con 3 ml de lo siguiente : 0,28% de NH4OH/80% de acetonitrilo; NaOH 0,5 M/etanol al 20%; agua; H3PO450 mM/acetonitrilo al 80%; agua; 0,5 NaOH/etanol al 20%; agua; NH4OH al 0,28%.

La solución de la desmetoxitritilación se cargó en la columna y la resina se enjuagó tres veces con 3-6 ml de amoniaco acuoso al 0,28%. Se colocó un vial Wheaton (12 ml) debajo de la columna y el producto se eluyó mediante dos lavados con 2 ml de acetonitrilo al 45% en amoniaco acuoso al 0,28%. Las soluciones se congelaron en hielo seco y los viales se colocaron en un liofilizador para producir un polvo blanco esponjoso. Las muestras se disolvieron en agua, se filtraron a través de un filtro de 0,22 micras (Pall Life Sciences, filtro de jeringa Acrodisc de 25 mm, con una membrana HT Tuffryn de 0,2 micras) utilizando una jeringa y se midió la densidad óptica (DO) en un espectrofotómetro UV para determinar las unidades de DO del oligómero presente, así como la muestra para su análisis. A continuación, las soluciones se volvieron a colocar en viales Wheaton para su liofilización.

Análisis de oligómeros de morfolino: se usó espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar la composición de fracciones en purificaciones, así como para proporcionar evidencia de identidad (peso molecular) de los oligómeros. Las muestras se procesaron después de la dilución con una solución de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (ácido sinapínico), 3,4,5-trihidroxiacetofenona (THAP) o ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) como matrices.

Se realizó HPLC de intercambio catiónico (SCX) usando una columna Dionex ProPac SCX-10, 4x250 mm (Dionex Corporation; Sunnyvale, CA) usando 25 mM pH = 5 acetato de sodio 25% acetonitrilo (Tampón A) y 25 mM pH = 5 acetato de sodio 25% acetonitrilo cloruro de potasio 1,5 M (tampón B) (gradiente 10-100% B en 15 min) o 25 mM KH2PO425% acetonitrilo a pH = 3,5 (tampón A) y 25 mM KH2PO425% acetonitrilo a pH = 3,5 con 1,5 M cloruro de potasio (tampón B) (Gradiente 0-35% B en 15 min). El primer sistema se utilizó para oligómeros cargados positivamente que no tienen un péptido unido, mientras que el segundo se utilizó para conjugados de péptidos. Purificación de oligómeros de morfolino por cromatografía de intercambio catiónico: la muestra se disuelve en acetato de sodio 20 mM, pH = 4,5 (tampón A) y se aplica a una columna de resina de intercambio catiónico Source 30 (GE Healthcare) y se eluye con un gradiente de Cloruro de sodio 0,5 M en acetato de sodio 20 mM y acetonitrilo al 40%, pH = 4,5 (tampón B). Las fracciones reunidas que contienen el producto se neutralizan con amoniaco acuoso concentrado y se aplican a una columna Amberchrome SPE. El producto se eluye, congela y liofiliza como antes.

Ejemplo 23: Reducción selectiva del ARNm de HTT mutante con respecto al ARNm de HTT de tipo salvaje utilizando oligonucleótidos PMO, APN y LNA modificados.

Se cultivaron fibroblastos derivados de pacientes de un individuo con enfermedad de Huntington (línea celular Coriell GM04281; 69 repeticiones CAG) de acuerdo con protocolos estándar en MEM de Eagle con FBS al 10%. Las células se pasaron 3-5 días antes del experimento y eran aproximadamente un 80% confluentes en la nucleofección. Los oligonucleótidos se prepararon como soluciones madre 1-2 mM en agua sin nucleasas (no tratada con DEPC) a partir de las cuales se hicieron las diluciones apropiadas para la nucleofección. Se tripsinizaron los fibroblastos, se contaron, se centrifugaron a 90 g durante 10 minutos y se resuspendieron 1-5x10e5 células por pocillo en solución de nucleofección P2 (Lonza). A continuación, se añadieron la solución de oligonucleótidos y las células a cada pocillo de una tira de 16 pocillos de Nucleocuvette y se pulsaron con el programa EN-150. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se transfirieron a una placa de 12 pocillos por duplicado. El ARN total se aisló de las células tratadas después de 48 horas usando el kit GE Illustra 96 Spin siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El ARN recuperado se almacenó a -80 °C antes del análisis.

Se realizó PCR con transcriptasa inversa para amplificar alelos HTT de tipo salvaje y mutante usando el sistema de RT-PCR de un solo paso SuperScript III (Invitrogen). Se sometieron a transcripción inversa 100 ng de ARN total aislado de células nucleofectadas y se amplificaron con los siguientes cebadores y condiciones específicos de genes: HTT-Fwd 5'--atggcgaccctggaaaagctgat 3' (Id. de Sec. n°: 25); HTT-Rev 5' TGAGGCAGCAGCGGCTG 3' (Id. de Sec. n°: 26); Programa de PCR: 60 °C durante 30 min de incubación a temperatura ambiente; Desnaturalización a 95 °C, hibridación a 60 °C, extensión a 72 °C, 35 ciclos. La solución de amplificación proporcionada en el kit One-Step se complementó con dCTP (GE) marcado con Cy5 para permitir la visualización de la banda por fluorescencia. Después de la amplificación, los productos de PCR se procesaron en un gel prefabricado de acrilamida/TBE al 10% (Invitrogen) y se visualizaron en un Typhoon Trio (GE) utilizando el láser de excitación de 633 nm y el filtro de emisión BP 30 de 670 nm con el plano focal en la superficie de la platina (véase, por ejemplo, la Fig. l0). Los geles se analizaron con ImageQuant (GE) para determinar las intensidades de las bandas de los alelos mutantes y de tipo salvaje.

Se realizó una comparación en paralelo del ARNm de HTT mutante entre oligonucleótidos PMOapn, PMO y LNA. Los resultados son visibles en los gráficos. 6-10. Los oligonucleótidos LNA, PMO y APN contienen la misma secuencia: 5' GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT G 3' (Id. de Sec. n°: 21). Los oligonucleótidos de LNA (ordenados a Exiqon) contienen una estructura de ADN con una modificación de LNA en cada base T (7 modificaciones totales, no cubiertas por las reivindicaciones). Los oligonucleótidos de APN contienen el esqueleto de PMO con una modificación de apn en cada base T (7 modificaciones en total, no cubiertas por las reivindicaciones). Los oligonucleótidos PMO contienen un esqueleto de PMO sin modificaciones adicionales a ningún enlace entre subunidades (no cubierto por las reivindicaciones).

Las células se nucleofectaron con el oligonucleótido LNA, PMO o APN como se describió anteriormente. El ARN restante 48 horas después del proceso de nucleotransfección se cuantificó mediante PCR con transcriptasa inversa y los productos de PCR se procesaron en un gel de acrilamida. La intensidad de la banda de gel que representa el alelo HTT de tipo salvaje o mutante de las células de fibroblastos GM04281 (Coriell) se normalizó a la intensidad de la banda de tipo salvaje o mutante respectiva de la muestra tratada más baja. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Cada punto en los gráficos representa la media de los niveles de expresión normalizados de dos réplicas en cada concentración, y se combinaron dos experimentos independientes para producir el conjunto de datos en la Fig. 6. La cuantificación de la intensidad del gel se realizó con ImageQuant (GE). La normalización de la intensidad, el cálculo de CE50 y la selectividad se analizaron con Microsoft Excel y R.

Los valores medios de CE50 para cada alelo se calcularon a partir del conjunto de datos presentado en la Figura 6, así como la selectividad para el alelo mutante se calculó a partir de la CE50 de los alelos de tipo salvaje y mutante de fibroblastos nucleofectados con el mismo oligonucleótido, usando R y Graphpad Prism. Una comparación cuantitativa de los resultados se muestra en la Fig. 7 y la Fig. 9. Una comparación de la CE50 muestra que las células tratadas con los oligonucleótidos PMO y APN tienen una expresión de ARNm reducida del alelo mutante sobre el alelo de tipo salvaje en comparación con LNA. Además, la potencia del oligonucleótido APN, basada en los valores de CE50, mejora con respecto al oligonucleótido PMO.

Los resultados muestran la reducción inesperada en los niveles de ARNm mutante que se cree que es responsable de la enfermedad de Huntington por los oligonucleótidos PMO, APN y LNA, y que los oligonucleótidos APN fueron más selectivos para reducir la expresión de ARNm mutante que los oligonucleótidos PMO o LNA.

Ejemplo 24: Reducción selectiva de la proteína HTT mutante relativa a la proteína HTT de tipo salvaje mediante oligonucleótidos PMO y APN modificados.

Dado el hallazgo de que los oligonucleótidos PMO, APN y LNA modificados redujeron la expresión del ARNm de HTT mutante en mayor medida que el ARNm de HTT de tipo salvaje (Ejemplo 23), y el hecho de que la enfermedad de Huntington finalmente se manifiesta como resultado de la ganancia tóxica de la función asociada con la expresión de la proteína HTT mutante, se evaluaron los efectos del tratamiento con oligonucleótidos PMO, APN y LNA modificados sobre la expresión de la proteína HTT mutante y de tipo salvaje. Las secuencias y modificaciones de los oligonucleótidos son como se describen en el Ejemplo 23.

Se realizaron experimentos para determinar la expresión de la proteína HTT mutante y de tipo salvaje en células tratadas con oligonucleótidos APN, PMO y LNA modificados dirigidos a la región de repetición de trinucleótidos del ARN de HTT humano. Las células se nucleofectaron (Lonza) usando un rango de dosis en pocillos duplicados usando fibroblastos GM04281 (Coriell) de un paciente humano con enfermedad de Huntington. Después de tres días, se prepararon lisados de proteínas utilizando técnicas de lisis estándar y se utilizó el ensayo de BCA para determinar las concentraciones de proteínas de las muestras resultantes de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Se procesaron cantidades iguales de proteína total de cada muestra tratada en geles de SDS-PAGE de tris-acetato duplicados y se transfirieron a nitrocelulosa. Las transferencias se sondaron con un anticuerpo primario anti-HTT (MAB2166, Millipore) o anti-p-actina (A1978, Sigma) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con cy5. Las transferencias resultantes se escanearon en un Typhoon Trio (GE) y la intensidad de la señal de la proteína HTT mutante y normal se cuantificó por separado con el software ImageQuant (GE). La intensidad de la señal de las bandas HTT normal (inferior) y mutante (superior) se normalizó a la señal de p-actina dentro de cada carril, y luego cada banda HTT se normalizó a la intensidad de la banda HTT normal o mutante correspondiente de una muestra de control no tratada en una transferencia a parte. Los resultados de la expresión de proteínas se representan para cada alelo (normal, línea continua; mutante, línea discontinua) como el porcentaje medio de expresión de la proteína HTT, /- 1 DE.

Los gráficos de la Fig. 11 se trazaron basándose en el análisis densitométrico de las bandas de proteína HTT de las transferencias Western (Fig. 11, panel inferior). PMO (Fig. 11, panel izquierdo) y APN (Fig. 11, panel central) redujeron selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje, con una mayor selectividad para HTT mutante observada con APN. Por el contrario, LNA no redujo selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje (Fig. 11, panel derecho). La alta selectividad de los oligonucleótidos modificados APN para HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje en comparación con los oligonucleótidos PMO o LNA modificados también es evidente cuando la expresión de HTT se representa como la relación entre HTT de tipo salvaje y HTT mutante (Figura 12). De hecho, el tratamiento con oligonucleótidos modificados LNA aumentó la relación WT/HTT mutante hasta aproximadamente 5 a una concentración de 4 |iM, mientras que los oligonucleótidos PMO y LNA modificados tenían relaciones WT/HTT mutante similares de aproximadamente 2 a la misma concentración, aunque el tratamiento con oligonucleótidos PMO modificados mostró una modesta tendencia de aumento en la relación WT/HTT mutante de 0,16 |iM a 20 |iM. Estos resultados sugieren colectivamente que los oligonucleótidos modificados APN son más eficaces para reducir selectivamente la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje que los oligonucleótidos PMO o LNA modificados, y que los oligonucleótidos LNA modificados no redujeron selectivamente la expresión de HTT mutante proteína en relación con la proteína HTT de tipo salvaje.

Ejemplo 25: Reducción selectiva de la proteína HTT mutante relativa a la proteína HTT de tipo salvaje usando oligonucleótidos con enlaces intersubunitarios catiónicos relacionados con APN y Plus

Para evaluar la selectividad de oligonucleótidos con otros tipos de enlaces entre subunidades catiónicas para reducir la expresión de la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje, se analizaron oligonucleótidos con enlaces entre subunidades relacionadas con APN-(es decir, APN y map) y plus ( es decir, plus, meda y etpip).

PMO-apnT: GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnT GCapnTG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

PMOplus: GC+TGC+TGC+TGC+TGC+TGC+TGC+TG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 21)

En la Fig. 13 se muestran estructuras ejemplares para modificaciones catiónicas relacionadas con APN y plus. Se realizaron experimentos como se describe en el Ejemplo 24.

Como se muestra en la Fig. 14, los oligonucleótidos modificados con enlaces relacionados con APN, es decir, APN y mapT, mostraron una mayor selectividad para HTT mutante sobre HTT de tipo salvaje que los oligonucleótidos PMO modificados de acuerdo con la evaluación de la relación WT/HTT mutante (Fig. 14, panel izquierdo). Todos los oligonucleótidos modificados con enlaces relacionados con plus (es decir, plusT, medaT y etpipT) también mostraron selectividad para HTT mutante sobre HTT de tipo salvaje en comparación con los oligonucleótidos PMO modificados, y los oligonucleótidos modificados con etpipT demostraron la mayor selectividad (Fig. panel derecho). Cuando se ensayó la selectividad de los oligonucleótidos APN y etpipT modificados en el mismo ensayo, ambos tuvieron una selectividad sustancialmente mayor para HTT mutante en relación con HTT de tipo salvaje en comparación con PMO. Además, mientras que los oligonucleótidos APN y etpipT modificados mostraron un grado similar de selectividad, los oligonucleótidos APN modificados exhibieron un mayor grado de selectividad a concentraciones más bajas. Estos resultados sugieren que los oligonucleótidos APN y etpipT modificados tienen la mayor selectividad para reducir la proteína HTT mutante en relación con la proteína HTT de tipo salvaje entre los oligonucleótidos probados.

Ejemplo 26: Administración ICV in vivo de PMO y APN en ratones EGFP-654

Los experimentos en apoyo de la invención usaron un ensayo basado en eGFP para la actividad antisentido in vivo para evaluar oligómeros que comprenden enlaces intersubunitarios modificados de la invención. El modelo de ratón transgénico de eGFP en el que el transgén de eGFP-654 se expresa uniformemente en todo el cuerpo se ha descrito previamente (Sazani, Gemignani et al. 2002). Este modelo usa un ensayo de corte y empalme para la actividad en el que los oligómeros modificados de la presente invención bloquean el empalme aberrante y restauran el empalme correcto del pre-ARNm de la proteína verde fluorescente mejorada modificada (eGFP). En este enfoque, la actividad antisentido de cada oligómero es directamente proporcional a la regulación positiva del marcador eGFP. Como resultado, los efectos funcionales del mismo oligómero se pueden controlar en casi todos los tejidos. Esto contrasta con los oligómeros dirigidos a genes cuya expresión está restringida o es fenotípicamente relevante solo en ciertos tejidos. En los ratones eGFP-654, el pre-ARNm fue fácilmente detectable en todos los tejidos, aunque se encontraron cantidades más pequeñas en la médula ósea, la piel y el cerebro. El nivel de eGFP traducido es proporcional a la potencia de los oligómeros antisentido y su concentración en el sitio de acción. La RT-PCR del ARN total aislado de varios tejidos mostró la expresión de la transcripción de eGFP-654 en todos los tejidos estudiados.

Las modificaciones específicas de PMO-X de los compuestos descritos en este ejemplo se muestran a continuación: 0-1-0-730 (PMO): GCT ATT ACC TTA ACC CAG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 22) NG-10-0245 (APN): GCapnT AapnTapnT ACC TapnTA ACC CAG (no cubierto por las reivindicaciones, Id. de Sec. n°: 22)

Se administró PMO con carga neutra, o PMO modificado con cargas catiónicas de cadena principal (APN), dirigido al transgén eGFP en el ventrículo lateral izquierdo de ratones EGFP-654 mediante una única inyección intracebreroventricular (ICV) usando un aparato estereotáxico. Las dosis consistieron en 5 mg/kg (panel izquierdo, PMO o APN) para todos los ratones o abarcaron un rango de dosis (panel derecho, 2.5 hasta 40 mg/kg, solo APN). Dos semanas después de la inyección, se sacrificó a los ratones y se extrajo el cerebro y se cortó por la mitad sagitalmente en la línea media en los hemisferios izquierdo y derecho. Se tomaron imágenes de cada hemisferio en un Typhoon Trio (GE) colocando la superficie de corte boca abajo en la placa de superficie plana. Las exploraciones se recogieron usando un láser de 488 nm para excitar la fluorescencia de eGFP. Las imágenes resultantes se analizaron con el software ImageQuant (GE) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada hemisferio. La intensidad de fluorescencia total detectada dentro de cada hemisferio se dividió por el número de píxeles presentes en ese hemisferio para producir un valor de fluorescencia promedio independiente del área para cada mitad del cerebro. Los resultados de la actividad para cada animal superviviente en un grupo de tratamiento se expresan como puntos en el gráfico de dispersión. La fluorescencia media del grupo está indicada por la línea horizontal, /- 1 DE.

Como se muestra en la Fig. 16 (panel izquierdo), mientras que la solución salina no indujo la expresión de EGFP en el cerebro, el tratamiento con PMO y APN sí lo hizo, con la inyección de oligonucleótidos APN modificados induciendo la expresión de EGFP en mayor medida que con la inyección de oligonucleótidos PMO modificados. La inyección de oligonucleótidos APN modificados también aumentó la expresión de EGFP de una manera dependiente de la dosis (Fig. 16, panel derecho). Una imagen typhoon representativa de ratones eGFP-654 tratados con solución salina, PMO y APN muestra que la localización de la señal EGFP demuestra que la actividad del oligómero inyectado ICV se expresa preferentemente dentro de regiones específicas del cerebro (Fig. 16, panel inferior). En conjunto, estos resultados indican que la actividad de los oligómeros en el cerebro aumenta mediante la modificación catiónica del esqueleto de PMO.

Ejemplo 27: Uso terapéutico de oligonucleótidos antisentido in vivo

Cualquiera de los oligonucleótidos antisentido, con cualquiera de los enlaces catiónicos, preferiblemente enlaces APN, descritos en este documento se puede usar en modelos animales de enfermedades por repetición de nucleótidos conocidas en la técnica. Tales modelos animales incluyen, pero no se limitan a ratones BACHD, YAC128 y R6/2 para la enfermedad de Huntington (p. ej., como se describe en Kordasiewicz et al., Neuron 2012; 74: 1031 44), y HSALR para DM1 (p. ej., como se describe en Wheeler et al., Nature 2012; 488: 111-5). Aunque actualmente no existen modelos animales de ELA con repeticiones expandidas de nucleótidos, dichos modelos se pueden generar fácilmente usando métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, reemplazando el locus del gen C9ORF72 de tipo salvaje en ratones con un gen C9ORF72 mutante que tiene repeticiones de hexanucleótidos GGGGCC expandidas (véase, por ejemplo, DeJesus-Hernandez et al., supra; Renton et al, supra) (es decir, ratones mutantes knock-in C9ORF72).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia repetida de tres nucleótidos que tiene la fórmula:

Ri es una porción de fórmula

q es 0, 1, 2, 3 o 4;

donde N es cualquier nucleótido.

2. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que la secuencia repetida de tres nucleótidos es (GCT)7.

3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que Ry es un nucleótido G.

4. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

5. Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.