RS55551B1 - Hinazolinoni kao inhibitori humane fosfatidilinozitol 3-kinaze delta - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Predmetni pronalazak se generalno odnosi na enzime fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K), i naročito na selektivne inhibitore aktivnosti PI3K i metode korišćenja takvih inhibitora.

POZADINA

[0002]Ćelijsko signaliziranje putem 3'-fosforilisanih fosfoinozitida je implicirano u raznovrsne ćelijske procese, npr., malignu transformaciju, signaliziranje faktora rasta, inflamaciju i imunitet (videti Rameh et a!., J. Biol. Chem., 274:8347-8350 (1999) za pregled). Enzim odgovoran za generisanje ovih fosforilisanih produkata signaliziranja je fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI 3-kinaza; PI3K). PI3K je oiriginalno identifikovana kao aktivnost povezana sa virusnim onkoproteinima i faktorom rasta receptora tirozinske kinaze koja fosforiliše fosfatidilinozitol (PI) i njegove fosforilisane derivate na 3'-hidroksilu inozitolnog prstena (Panavotou et al., Trends Celi Biol 2:358-60 (1992)).

[0003]Nivoi fosfatidiltnozitol-3,4,5-trifosfata (PIP3), aktivacija primarnog produkta PI 3-kinaze, se povećavaju nakon tretmana ćelija sa raznovrsnim agonistima. Zbog toga se veruje, da je aktivacija PI 3-kinaze uključena u raspon ćelijskih odgovora uključujući ćelijski rast, diferencijaciju i apoptozu (Parker etal., Curr. Biol., 5:577-99 (1995); Yao et al., Science, 267:2003-05 (1995)). Iako nizvodne mete fosforilisanih lipida generisane prema aktivaciji PI 3-kinaze nisu karakterisane, nastajanje dokaza sugerišu da su plekstrinski homologni domen i FYVE-prst domen-sadržavajući proteine aktivirani prilikom vezivanja na razne fosfatidilinozitol lipide (Sternmark et al., 1 Cell. Sci., 112:4175-83 (1999); Lemmon et al., Trends Cell Biol., 7:237-42 (1997)). In vitro, neke izoforme protein kinaze C (PKC) su direktno aktivirane od strane PIP3, i pokazano je da su PKC -povezana protein kinaza, PKB, aktivirane od strne PI 3-kinaze (Burgering et al., Nature, 376:599-602 (1995)).

[0004]Za sada, familija enzima PI 3-kinaze je podeljena u tri klase na osnovu njihovih supstrata specifičnosti. Klasa I PI3Ks može fosforilisati fosfatidilinozitol (PI), fosfatidilinozitol-4-fosfat, i fosfatidilinozitol-4,5-bifosfat (PIP2) da proizvede fosfatidi I i nozitol-3-fosfat (PIP), fosfatidilinozitol-3,4-bifosfat, i fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat, respektivno. Klasa II PI3Ks fosforiliše PI i fosfatidilinozitol-4-fosfat, dok Klasa III PI3Ks može fosforilati samo PI.

[0005]Inicijalno prečišćavanje i molekularno kloniranje PI 3-kinaze je otkrilo da se heterodimer sastoji od p85 i pllO podjedinica (Otsu et al., Cell, 65:91-104 (1991); Hiles et al., Cell, 70:419-29 (1992)). Od tada, četiri različite Klase I PI3Ks su identifikovane, označene PI3K a, p, 5 i v, svaka se sastojeći od zrazličite 110 kOa katalitičke podjedinice i regulatorne podjedinice. Još konkretnije, tri katalitičke podjedinice, tj., pllOa, pllOB i pllOy, su svaka u interakciji sa istom regulatornom podjedinicom, tj., p85, dok je pllOVu interakciji sa različitom P101 regulatornom podjedinicom. Kao što je opisano ispod, obrasci ekspresije svake od ovih PI3Ks u humanim ćelijama i tkivima su takođe različiti. Iako je generalno akumulirano bogatstvo informacija o ćelijskim funkcijama PI 3-kinaza, uloge pojedinačnih izoformi su u velikoj meri nepoznate.

[0006]Opisano je kloniranje goveđeg pllOa. Ovaj protein je identifikovan kao povezan sa protenom pekarskog kvasca: Vps34p, proteinom uključenim u procesuiranje vakuolarnog proteina. Takođe je pokazano da je rekombinantni pllOa produkt povezan sa p85a, da se dobije aktivnost PI3K u transfektovanim COS-lćelijama. Videti Hiles et al., Cell, 70, 419-29 (1992).

[0007]Kloniranje drugog humanog PllO izoforrna, označenog pliop, je opisano u Hu et al., Mol. Cell. Biol., 13:7677-88

(1993). Rečeno je da je ovaj izoform povezan sa p85 u ćelijama, i da je sveprisutno izražen, kao pllB mRNA je nađen u brojnim humanim i mišjim tkivima, kao i u humanim endotelijalnim ćelijama umbilikalne vene, Jurkat humanim T-ćelijama leukemije, 293 humanim embrionalnim ćelijama bubrega, 3T3 fibroblastima miševa, HeLa ćelijama i NBT2 ćelijama karcinoma bešike pacova. Tako Širok izraz sugeriŠe da je izoform pllOB u širem smislu važan u signalnim putevima.

[0008]Identifikacija pll05 izoforrna PI 3-kinaze je opisana u Chantrv et al., J. Biol. Chem., 272:19236-41 (1997). Uočeno je da je humani pll05 izoform izražen u obliku ograničenog tkiva. On je izražen u visokim nivoima u limfođtima i limfoidnim tkivima, što ukazuje na to da protein može imati ulogu u PI 3-kinazi posredovanom signaliziranju u imunom sistemu. Detalji koje se odnose na pllOS izoform se takođe mogu naći u U.S. Patent Nos. 5,858,753; 5,822,910; and 5,985,589.Videti takođe, Vanhaesebroeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4330-5 (1997), and International Publication No WO 97/46688.

[0009]U svakoj od PBKo, p i 5 podtipova, p85 podjedinica deluje na lokalizaciji PI 3-kinaze za plazma membranu interakcijom njezine SH2 domene sa fosforilisanim ostacima tirozina (prisutnih u odgovarajućem kontekstu sekvence) u ciljanim proteinima (Rameh et al., Cell, 83:821-30 (1995)). Dve izoforme p85 su identifikovane, p85a, koja je širom prisutna, i p85p, koja je primarno nađena u mozgu i limfnim tkivima (Volinia et al., Oncogene, 7:789-93 (1992)). Asocijacija p85 podjedinice za PI 3-kinazu pila, p, ili 5 katalitičkih podjedinica izgleda da je potrebna za katalitičku aktivnost i stabilnost ovih enzima. Osim toga, vezivanje Ras proteina takođe reguliše ushodne aktivnosti PI 3-kinaze.

[0010]Kloniranje pll0y je otkrilo još dalju složenost unutar familije PI3K enzima (Stovanov et al., Science, 269:690-93

(1995)). pllOYizoforrna je usko povezana sa pllOa i pllOB (45-48% identiteta u katalitičkoj domeni), ali kao što je navedeno ne koristiti p85 kao ciljajuću podjedinicu. umesto toga, pllOy sadrži dodatni domen nazvan "Plekstrinski homologni domen" blizu svog amino terminusa. Ovaj domen dozvoljava interakciju pllOy sa Pv podjedinicama heterotrimernih G proteina i izgleda da ova interakcija reguliše njegovu aktivnost.

[0011]plOl regulatorna podjedinica za PDK gama je originalno klonirana kod svinje, i humani ortolog je identifikovan naknadno (Krugmann et al., J. Biol. Chem., 274:17152-8 (1999}). Izgleda da je interakcija između N-terminalnog regiona PlOl sa N-termtnalnim regionom pllOYkritična za PI3Ky activaciju preko Gpy pomenutog iznad.

[0012]Konstitutivno aktivan PDK polipeptid je opisan je u International Publication No. WO 96/25488. Ova publikacija otkriva pripremu himernog fuzionog proteina u kojem je 102-ostatak fragmenta p85 poznat kao inter-SH2 (1SH2) regiona fuzionisan preko regiona spojnice na N-terminusu pllO miša. p85 iSH2 domen je očigledno u stanju da aktivira PI3K aktivnost na način uporediv sa intaktnim p85 (Klippel et al., Mol. Cell. Biol., 14:2675-85 (1994)).

[0013]Tako, PI 3-kinaze mogu biti definisane njihovom iđentičnošću aminokiselina ili njihovom aktivnošću. Dodatni članovi ove rastuće genske familije uključuju više distancirano povezanih iipidnih i proteinskih kinaza uključujući Vps34 TORI, TOR2 pekarskog kvasca (i njihove homologe kod sisara kao što su FRAP i mTOR), genski produkt ataksije teleangiektazije (ATR) i katalitičku podjedinicu DNA-zavisne proteinske kinaze (DNA-PK). Videti generalno, Hunter, Cell, 83:1-4(1995).

[0014]PI 3-kinaza se takođe pojavljuje da bude uključena u brojne aspekte aktivacije leukocita. Aktivnost PI 3-kinaze povezane sa p85 je pokazala da se fizički veže sa citoplazmatskim domenom CD28, koji je važnan kostimulativni molekul za aktivaciju T-ćelija u odgovoru na antigen (Pages etal., Nature, 369:327-29 (1994); Rudd, Immunitv, 4:527-34 (1996)). Aktivacija T ćelija kroz CD28 snižava prag za aktivaciju putem antigena i povećava magnitudu proliferativnog odgovora. Ovi efekti su povezani sa povećanjem u transkripciji brojnih gena uključujući i interleukin-2 (IL2), važan faktor rasta T ćelije (Fraser et al., Science, 251:313-16 (1991)), Mutacija CD28 koja uzrokuje da više ne može biti u interakciji sa PI 3 kinazom dovodi do nemogućnosti inicijacije produkcije IL2, sugerišući važnu ulogu PI 3-kinaze u aktivaciji Tćelija.

[0015]Specifični inhibitori protiv pojedinačnih članova familije enzima obezbeđuju neprocenjive alate za dešifrovanje funkcija svakog enzima. Dva jedinjenja, LY294002 i vortmanin, se široko se koriste kao inhibitori PI 3-kinaze. Ova jedinjenja, su međutim, nespecifični inhibitori PI3K, jer ne prave razliku između četiri člana Klase I PI 3-kinaza. Na primer, vrednosti IC5o vortmanina protiv svake od raznih Klase I PI 3-kinaza su u rasponu od 1-10 nM. Siično, IC50vrednosti za LY294002 protiv svake od ovih PI 3-kinaza je oko 1 uM (Fruman et al., Ann. Rev. Biochem., 67:481-507 (1998)). Dakle, korisnost ovih jedinjenja u proučavanju uloge pojedinih klase I PI 3-kinaza je ograničen.

[0016]Na osnovu istraživanja koja koriste vortmanin, postoji dokaz da je funkcija PI 3-kinaze takođe potrebna u nekim aspektima signaliziranja u leukocitima preko G-proteinskih sparenih receptora (Thelen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4960-64 (1994)). Štaviše, pokazano je da vortmanin i LY294002 blokiraju migraciju neutrofiia i oslobađanje superoksida. Međutim, pošto ova jedinjenja ne prave razliku između različitih izoformi PI3K, ostaje nejasno koji su konkretni izoform PI3K i izoformi uključeni u ovim fenomenima.

[0017]U pogledu gornjih razmatranja, jasno je da postojeće znanje nedostaje s obzirom na strukturne i funkcionalne karakteristike enzima PI 3-kinaze, uključujući subcelularnu lokalizaciju, aktiviranje stanja, afinitete supstrata, i slično. Štaviše, dalje treba razjasniti funkcije koje ovi enzimi obavljaju u normalnim i bolesnim tkivima. Konkretna, funkcija PI3KČ u leukocitima nije prethodno naznačena, i znanje koje se odnosi na njegovu funkciju u humanoj fiziologiji čoveka ostaje ograničeno. Koekspresija u ovim tkivima drugih PI3K izoformi je do sada zbunjivala napore za odvajanje aktivnosti svakog enzima. Dalje, razdvajanje aktivnosti različitih P13K izoenzima možda neće biti moguće bez identifikacije inhibitora koji pokazuju selektivne karakteristike inhibidje. Zaista, podnosioci zahteva nisu trenutno svesni da su takvi selektivni, ili bolje, spedfični, inhibitori PI3K izoenzima demonstrirani.

[0018]Tako, postoji potreba u struci za dalju strukturnu karakterizaciju PI3K5 polipeptida. Takođe postoji potreba za funkcionalnu karakterizaciju PI3K5. Dalje, razumevanje PI3K5 zahteva dalju razradu strukturnih interakcija pllOč, i za njegovu regulatornu podjedinicu i sa drugim proteinima u ćeliji. I dalje ostaje potreba za selektivnim ili specifičnim inhibitorima PI3K izoenzima, tako da funkcije svakog izoenzima mogu biti bolje naznačene. Konkretno, selektivni ili specifičnim inhibitori! PI3K5 su poželjni za istraživanje uloge ovog izoenzima i za razvoj lekova da moduliraju aktivnost izoenzima.

[0019]WO 03/035075 i WO 01/81346 otkrivaju jedinjenja koja su korisna u metodama inhibiranja aktvnosti PI3K5 i metodama tečenja bolesti, kao što su poremećaji imuniteta i inflamacije, u kojima PI3K5 igra ulogu u funkciju leukođta. WO 01/30768 opisuje hinazolinone korisne u lečenju ćelijskih proliferativnih bolesti i poremećaja povezanih sa KSP aktivnošću kinezina.

REZIME PRONALASKA

[0020]Jedan aspekt ovog pronalaska je da obezbedi jedinjenja sposobna da inhibiraju biološku aktivnost humane PI3K5. Drugi aspekt ovog pronalaska je da obezbedi jedinjenja koja inhibiraju PI3KS selektivno u odnosu na druge PI3K izoforme. Još jedan aspekt ovog pronalaska je da obezbedi jedinjenja kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodi za selektivno moduliranje aktivnosti humane PI3K5 i time pomažu lečenju bolesti posredovanih disfunkcijom PI3K5. Još jedan aspekt ovog pronalaska je da obezbedi metod za karakteriziranje funkcije humane PI3K6.

[0021]Drugi aspekt ovog pronalaska je da obezbedi jedinjenja kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodi narušavanja funkdje leukođta koja obuhvata dovođenje u dodir leukođta sa jedinjenjem koje selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u leukodtima. Leukociti mogu sadržavati ćelije izabrane iz grupe koja se sastoji od neutrofiia, B limfocita, T limfocita i bazofilia.

[0022]Na primer, u slučajevima kada leukociti sadrže neutrofile, metoda obuhvata ometanje najmanje jedne funkcije neutrofiia izabrane iz grupe koja se sastoji od stimulisanog oslobađanja superoksida, stimulisane egzodtoze i hemotaktične migracije. Poželjno, metoda suštinski ne ometa bakterijsku fagocitozu ili uništavanje bakterija pomoću neutrofiia. U slučajevima kada leukociti sadrže B limfocite, metoda obuhvata narušavanje proliferacije 8 limfocita ili produkciju antitela od strane B limfodta. U slučajevima kada leukociti sadrže T limfocite, metoda obuhvata narušavanje proliferacije T limfodta. U slučajevima kada leukociti sadrže bazofile, metoda obuhvata narušavanje oslobađanje histamina od strane bazofila.

[0023]Poželjno je da je PI3K5 inhibitor selektivan. Poželjno je da je PI3K5 inhibitor najmanje oko 100-struko selektivniji za inhibiciju pll05 u odnosu na pllOa, najmanje oko 40-struko selektivniji u odnosu na pllOB, i najmanje oko 10-struko selektivniji u odnosu na pl 10y u biohemijskom testu.

[0024]Jedinjenja prema predmetnom pronalasku su kao što je definisano u patentnim zahtevima. Takođe su otkrivena jedinjenja koja su sposobna da inhibiraju aktivnost P13K5 i imaju strukturnu formulu (I):

pri čemu

X i Y, su nezavisno, N ili CR<C>;

ZjeN-R'iliO;

R<1>su iste i predstavljaju vodonik, halo, ili Ci .3alkil;

R<J>i R<3>, su nezavisno, vodonik, halo, ili G.3alkil;

R'je vodonik, halo, 0R<a>, CN, C2^alkinil, C(=0)R<=>, CC=0)NR<a>R<B>, C^heterocikloaikil,

Ci.jalkilenC36heteroa'kloalkil, OCi.3alkilenOR<a>, OCi jalkilenNR^R*, OC,-3alkilenC3.6cikloalkil,

OC3^heterocikloalkil, OCi-3alkilenC=CH, ili OC13alkilenCC=0)NRi<R>'<1>;

R5 je Ci-salkil, CH2CF3, fenil, CFUCsCH, Ci 3alkilenORe, C,-,alkilenNR<a>R<«>, ili CS4alkilenNHC(=0)0R3, R6 je vodonik, halo, ili NR'R";

R<7>je vodonik ili R<5>i R<7>su uzeti zajedno sa atomima na koje su vezani tako da formiraju peto ili šestočlani zasićeni prsten; R<s>jeCl-3alkil, halo, CF3, ili CH;C36heterocikloaikil;

nje 0,1, ili 2;

R<a>je vodonik, C^alkil, ili CI-bGHs;

R" je vodonik ili CJ 3alkil; i

R<c>je vodonik, Ci-3alkil, ili halo,

pri čemu kada su R'grupe različite od vodonika, R: i R<*>su iste;

ili farmaceutski prihvatljiva so, ili solvat (npr., hidrat) od njih.

[0025]Takođe su otkrivena jedinjenja strukturne formule (II), i koja su sposobna da inhibiraju aktivnost P13K5:

pri čemu X, Y, Z, R<1>kroz R<s>, R<s>, R<*>, R<c>, i n su kao što je definisano iznad,

ili farmaceutski prihvatljiva so, ili solvat (npr, hidrat) od njih.

[0026]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi lečenja medicinskog stanja posredovanog od strane neutrofiia obuhvatajući primenjivanje na sisaru kojem je potrebna terapijski efikasna količina jedinjenja prema patentnim zahtevima. Primeri medicinskih stanja koja se mogu lečiti uključuju ona stanja koja su karakterisana neželjenom funkcijom neutrofiia izabranih iz grupe koja se sastoji od stimulisanog oslobađanja superoksida, stimulisane egzocitoze i hemotaktične migracije. Poželjno, fagocitna aktivnost ili uništavanje bakterija od strane neutrofiia je u suštini neinhibirana.

[0027]Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi narušavanja funkcije osteoklasta koji obuhvata dovođenje u kontakt osteoklasta sa jedinjenjem prema patentnim zahtevima.

[0028]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi ublažavanja poremećaja koštane resorpcije kod sisara kojem je to potrebno, obuhvatajući davanje sisaru terapijski efikasne količine jedinjenja prema patentnim zahtevima. Poželjni poremećaj koštane resorpcije prikladan za lečenje je osteoporoza.

[0029]Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi inhibiranja rasta ili proliferaciji ćelija kancera hematopoetskog porekla sadržavajući dovođenje u kontakt ćelija kancera sa jedinjenjem prema patentnim zahtevima. Jedinjenje može biti korisno u inhibiranju rasta ili proliferaciji kancera izabranih iz grupe koja se sastoji od limfoma, multiplog mijeloma, i leukemije.

[0030]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi inhibiranja aktivnosti kinaze PI35 polipeptida obuhvatajući dovođenje u kontakt PI3K5 polipeptida sa jedinjenjem prema zahtevima.

[0031]Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje za upotrebu u metodi narušavanja funkcije leukođta obuhvatajući dovođenje u kontakt leukođta sa jedinjenjem prema patentnim zahtevima.

[0032]Ovde su otkrivena jedinjenja strukturne formule (I) ili (II) koja inhibiraju aktivnost PI3K5 u biohemijskim i ćelijski-baziranim testovima, i pokazuju terapijsku korist u lečenju medicinskih stanja gde je aktivnost PI3K5 suvišna ili nepoželjna.

[0033]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi farmaceutske kompozicije sadržavajući jedno ili više jedinjenja prema patentnim zahtevima, i kompozicije za upotrebu u terapijskom lečenju, pri čemu inhibicija PI3K5 polipeptida, in vivo ili eks vivo, obezbeđuje terapijsku korist ili je istraživanje ili dijagnostički interes.

[0034]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi proizvodni artikal za humanu farmaceutsku upotrebu sadržavajući:

(a) farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima; i,

(b) spremnik, koji opđono dalje sadrži uputstvo za upotrebu obezbeđujući da je kompozicija korisna u lečenju bolesti ili poremećaja posredovanih od strane aktivnosti PI3K5.

[0035]Drugi aspekt predmetnog pronalaska je da obezbedi:

(a) farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima; i,

b) spremnik, koji opciono dalje sadrži uputstvo za upotrebu obezbeđujući da je kompozicija korisna u lečenju poremećaja resorpcije kostiju ili kancera hematopoetskog porekla.

[0036]Ovi i drugi aspekti i prednosti predmetnog pronalaska će biti jasniji iz sledećeg detaljnog opisa poželjnih izvođenja, koja su obezbeđena da poboljšaju razumevanje pronalaska bez ograničavanja obima pronalaska.

DETALJAN OPIS POŽELJNIH IZV OĐENJA

[0037]Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja selektivno inhibiraju aktivnost PI3K6. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenja kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodi inhibiranja aktivnosti PI3K5, uključujući metode selektivnog moduliranja aktivnosti PI3K5 izozima (u daljem tekst izozim ili izoenzim) u ćelijama, naročito leukođtima, osteoklastima i ćelijama kancera. Oni uključuju in vitro, in vivo i ex vivo aplikacije.

[0038]Od naročite koristi su jedinjenja pronalaska za upotrebu u metodi selektivnog moduliranja aktivnosti PI3K5 u kliničkim uslovima za poboljšanje bolesti ili poremećaja posredovanih aktivnošću PI3K6. Tako, lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše prekomerna ili neodgovarajuća aktivnost PI3K5 može biti tretirano putem primene selektivnih modulatora PI3K5.

[0039]Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže selektivni inhibitor PI35 koji ima strukturu prema patentnim zahtevima. Takođe su obezbeđeni proizvodni artikli koji sadrže jedinjenje selektivnog inhibitora PI3K5 (ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje) i instrukcije za korišćenje jedinjenja. Druge metode pronakaska od njih uključuju omogućavanje dalje karakterizacije fiziološke uloge izozima.

[0040]Ovde opisane metode imaju koristi iz upotrebe jedinjenja koja selektivno inhibiraju, i poželjno specifično inhibiraju, aktivnost PI3K5 u ćelijama, uključujući ćelije in vitro, in vivo, ili ex vivo. Ćelije tretirane metodama otkrivenim ovde, uključuju one koje eksprimiraju endogeni PI3K5, pri čemu endogeni pokazuje da ćelije eksprimiraju rekombinantni odsutni PI3K5 uvođenjem u ćelije jednog ili više polinukleotida kodirajući PI3K5 polipeptid ili njegov biološki aktivni fragment. Metode otkrivene ovde takođe obuhvataju upotrebu ćelija koje eksprimiraju egzogeni PI3K5, pri čemu su jedan ili više polinukleotida kodirajući PI3K5 ili njegov biološki aktivni fragment uvedeni u ćeliju korišćenjem rekombinantnih procedura.

[0041]Ćelije mogu biti in vivo, tj. na živom subjektu, npr, sisaru, uključujući i ljude, pri čemu PI3K5 inhibitor može biti korišćen u terapiji da inhibira PI3K6 activnost kod subjekta. Alternativno, ćelije mogu biti izolovane kao diskretne ćelije ili u tkivu, za ex vivo ili in vitro metode. In vitro metode obuhvaćene ovim pronalaskom mogu sadržavati korak dovođenja u kontakt PI3K5 enzima ili njegovog biološki aktivnog fragmenta sa inhibitorom jedinjenja ovog pronalaska. P13K6 enzim može uključiti prečišćeni i izolovani enzim, pri čemu je enzim izdvojen iz prirodnog izvora (npr., ćelija ili tkiva koji normalno eksprimiraju PI3K6 polipeptid odsutne modifikacije putem rekombinantne tehnologije) ili izolovan iz ćelija modifikovan rekombinantnim tehnikama da izraze egzogeni enzim.

[0042]Jedinjenja iz ovog pronalaska potencijalno inhibiraju pll05. Tipična jpotentnost je izražena kao koncentracija jedinjenja koja je potrebna da se postigne određeni rezultat. Što je veća potencija, potrebno je manje jedinjenja da izvede svoju namenjenu funkciju. In vitro potencija je tipično izražena u smislu izmerenih vrednosti ICso korišćenjem testa doza-odgovor. ICso vrednosti mogu biti izmerene dovođenjem u kontakt osetljivog sistema testa, sa jedinjenjem od interesa u rasponu koncentracija, uključujući koncentracije pri kojima se ne opaža nikakav ili minimalni efekat, preko većih koncentracija kod kojih se posmatra parcijalni efekt, da zasićenja koncentracija kod kojih se posmatra maksimalni efekat. Teorijski, takva ispitivanja efekta reakcije na dozu jedinjenja inhibitora mogu biti opisana kao sigmoidalna kriva eksprimirajući stepen inhibicije kao funkciju koncentracije kada je grafički prikazana na logaritamskoj skali. Kriva takođe teoretski prolazi kroz tačku na kojoj je koncentracija dovoljna da se smanji aktivnost pllOč enzima do nivoa koji je 50% od razlike između minimalne i maksimalne enzimske aktivnosti posmatrane u testu. Ova koncentracija je definisana kao Inhibitorna Koncentracija kod 50% inhibicije ili ICsovrednosti.

[0043]ICM vrednosti mogu biti određene bilo korišćenjem konvencionalnih biohemijskih (acelularnih) tehnika testiranja ili tehnika testiranja baziranih na ćeliji dobro poznatim prosečnom stručnjaku sa ovog područja tehnike. Primer takvog testa je obezbeđen primerima ispod. Poželjno, ICsovrednosti su dobijene izvođenjem relevantnog testa najmanje dva puta, sa ICsavrednošću izraženom kao prošek (aritmetička sredina, ili "srednja") dobijenih pojedinačnih vrednosti. Poželjnije, test se ponavlja od 3 do 10 (ili više) puta, sa ICm vrednošću izraženom kao srednja vrednost od dobijenih vrednosti. Još poželjnije, ispitivanje se izovodi nekoliko puta dovoljnim za generisanje statistički pouzdane srednje vrednosti ICso, korišćenjem statističkih metoda koje su poznate prosečnom stručnjaku sa ovog područja tehnike.

[0044]Jedinjenja formula (I) i (II) pokazuju neočekivano niske vrednosti IC50u odnosu na PI3K5, odgovarajući na neočekivano visoku in vitro potenciju. U različitim izvođenjima, jedinjenja formule (I) i (II), kada su ispitana kao što je opisano u Primeru 14 ispod, pokazuju PI3KoTCso vrednosti manje od oko 250 nM, manje od oko 200 nM, manje od oko 150 nM, manje od oko 125 nM, manje od oko 100 nM, manje od oko 75 nM, manje od oko 50 nM, manje od oko 25 nM, mane od oko 10 nM, i druge manje od oko 5 nM. U drugim izvođenjima, jedinjenja iz pronalaska pokazuju vrednosti ICbo od oko 0.1 nM do oko 5 nM.

[0045]Jedinjenja formule (I) i (U) su selektivni inhibitori PI3K5. Termin "selektivni inhibitor PI3K5 " kao što se ovde koristi se odnosi se na jedinjenje koji inhibira PI35 izozim efikasnije od drugih izozima familije PI3K. "Selektivni inhibitor PI3K5 " jedinjenja podrazumeva da bude selektivniji za PI3K6 od jedinjenja konvencionalno i generički označenih inhibitora PI3K, npr., vortmanina ili LV294002. Istovremeno, vortmanin i LY294002 se smatraju "neselektivni inhibitori PI3K. "Štaviše, jedinjenja prema ovom pronalasku selektivno negativno regulišu PI3K5 ekspresiju ili aktivnost i poseduju prihvatljiva farmakološka svojstava za upotrebu u terapijskim metodama iz pronalaska.

[0046]Prema tome, selektivni inhibitor se alternativno može razumeti da se odnosi na najmanje jedno jedinjenje koje pokazuje inhibitomu koncentraciju od 50% (IC5o) u odnosu na PI3K6 koja je najmanje oko 50-puta, najmanje oko 100-puta, najmanje oko 150-puta, najmanje oko 200-puta, najmanje oko 250-puta, najmanje oko 300-puta, najmanje oko 350-puta, najmanje oko 400-puta, najmanje oko 500-puta, najmanje oko 600-puta, najmanje oko 700-puta, najmanje oko 800-puta, najmanje oko 900-puta, ili najmanje oko 1000 puta niža od vrednosti IC50 za PI3Ka. U alternativnim izvođenjima, termin selektivni inhibitor se može razumeti da se odnosi na najmanje jedno jedinjenje koje pokazuje ICso u odnosu na PI3K5 koja je je najmanje oko 5-puta, najmanje oko 10-puta, najmanje oko 20-puta, najmanje oko 30-puta, najmanje oko 40-puta, najmanje oko 50-puta, najmanje oko 60-puta, najmanje oko 70- puta, najmanje oko 80-puta, najmanje oko 90-puta, ili najmanje oko 100 puta niža od ICsoza PI3Ky. U daljim izvođenjima, termin selektivni inhibitor se može razumeti da se odnosi na najmanje jedno jedinjenje koje pokazuje IC50u odnosu na P13K5 koja je najmanje oko 5-puta, najmanje oko 10-puta, najmanje oko 20-puta, najmanje oko 30-puta, najmanje oko 40-puta, najmanje oko 50-puta, najmanje oko 75-puta, najmanje oko 100-puta, najmanje oko 125-puta, najmanje oko 150-puta, najmanje oko 175-puta, najmanje oko 200-puta, najmanje oko 250- puta, najmanje oko 300-puta ili najmanje oko 350-puta niža od vrednosti IGaza PI3K6. Selektivni inhibitori se tipično primenjuju u takvoj količini da selektivno inhibiraju PI3KB, kao što je opisano iznad.

[0047]Najpoželjnija jedinjenja iz ovog pronalaska, zbog toga, imaju nisku vrednost ICS0naspram PI3K6 (tj., jedinjenje je potentni inhibitor), i selektivna su u odnosu na inhibiranje PI3K5 u pogledu na najmanje jedan od PI3Ko , PI3KB i PI3Ky.

[0048]"In vivo" označava unutar živog subjekta, kao unutar životinje ili čbveka. U ovom kontekstu, agensi mogu biti korišćeni terapijski in vivo da uspore ili eliminišu proliferaciju nenormalnog repliciranja ćelija. Agensi takođe mogu biti korišćeni in vivo, kao profilaktički da se spreči nenormalna ćelijska proliferacija ili ispoljavanje simptoma povezanih sa njima.

[0049]"Ex vivo" znači izvan živog subjekta. Primjeri ex vivo ćelijskih populacija uključuju ćelijske kulture i biološke uzorke, kao što su uzorci tečnosti ili tkiva od ljudi ili životinja. Takvi uzorci mogu biti dobijeni metodama dobro poznatim u tehnici. Primeri uzoraka biološke tečnosti uključuju krv, cerebrospinalnu tečnost, urin, pljuvačku. Primeri uzoraka tkiva uključuju tumore i biopsije. U ovom kontekstu, predmetna jedinjenja mogu biti u brojnim prijavama, i terapijski i eksperimentalno.

[0050]Termin "spremnik" označava bilo koju posudu i poklopac za nju, pogodnu za držanje, otpremanje, doziranje i/ili rukovanje farmaceutskim produktom.

[0051]Termin "uputstvo za upotrebu" označava informaciju koja prati produkt koja obezbeđuje opis kako se primenjuje produkt, zajedno sa podacima o sigurnosti i efikasnosti koji su potrebni da lekar, apotekar ili pacijent donese informisanu odluku u vezi upotrebe produkta. Za farmaceutski produkt koji je odobren za upotrebu kod ljudi ili životinja, odobravajući organ može odrediti sadržaj uputstva za upotrebu, i takvo uputstvo za upotrebu se može odnositi na neformalno kao "etiketa" za produkt.

[0052]U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodi inhibiranja funkcije leukođta. Određenije, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodama inhibiranja ili suzbijanja funkcija neutrofiia i T i B limfocita. U pogledu neutrofiia, neočekivano je nađeno da inhibicija aktivnosti PI3K5 inhibira funkcije neutrofiia. Na primer, uočeno je da jedinjenja iz ovog pronalaska izazivaju inhibiciju klasičnih funkcija neutrofiia, kao što su stimutisana produkcija superoksida, stimulisana egzođtoza i hemotaktična migracija. Međutim, dalje je uočeno da jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima, za upotrebu u metodi iz ovog pronalaska dozvoljava supresiju određenih funkcija neutrofiia, dok suštinski ne utiče na druge funkcije ovih ćelija. Na primer, uočeno je da fagocitoza bakterija pomoću neutrofiia nije suštinski inhibirana putem selektivnog PI35 inhibitora jedinjenja iz ovog pronalasksa.

[0053]Tako, predmetni pronalazak uključuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodama inhibiranja funkcije neutrofiia, bez suštinske inhibicije fagođtoze bakterija. Neutrofiine funkcije pogodne za inhibiciju u skladu sa ovom metodom uključuju bilo koju funkciju posredovanu putem aktivnosti PI3K5 ili ekspresije. Takve funkcije uključuju, bez ograničenja, stimulisano osobađanje superoksida, stimulisanu egzocitozu ili degranulaciju, hemotaktičnu migraciju, adheziju vaskularnog endotela (npr., povezivanje/ valjanje neutrofiia, aktiviranje aktivnosti neutrofiia i/ili zastoj neutrofiia na endotelu), transmuralnu dijapedezu, ili emigraciju kroz endotel u perifernim tkivima. Uopšteno, ove funkcije se mogu zajednički nazvati "inflamatorne funkcije", jer se obično odnose na odgovor neutrofiia na inflamaciju. Inflamatorne funkcije neutrofiia mogu se razlikovati od bakterijskog uništavanja funkcija izloženih od strane ovih ćelija, na primer, fagocitoze i uništavanja bakterija. Prema tome, predmetni pronalazak dalje uključuje jedinjenje kako je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodama lečenja bolesnih stanja u kojima je jedna ili više inflamatornih funkcija neutrofiia abnormalna ili nepoželjna.

[0054]Jedinjenja iz postojećeg pronalaska mogu biti korišćena za inhibiciju endogenog imunog odgovora stimulisanog sa najmanje jednim endogenim faktorom bez suštinskog inhibiranja egzogenog imunog odgovora stimulisanog sa najmanje jednim egzogenim faktorom kao što je otkriveno u US 2005/0043239 Al. Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu takođe biti korišćena da inhibiraju endogeni imuni odgovor stimulisan sa najmanje jednim endogenim faktorom bez suštinskog inhibiranja imunih odgovora, kao što je otkriveno u US 2005/0043239 Al. Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska sa više prednosti dozvoljavaju lečenje stanja povezanih sa nepoželjnom endogenim imuno odgovorom stimulisanim sa najmanje jednim endogenim faktorom bez ugrožavanja sposobnosti u borbi protiv infekcije.

[0055]Jedinjenja iz postojećeg pronalaska mogu takođe biti korišćena da inhibiraju akumulaciju leukocita kao što je otkriveno u US 2005/0054614 Al. Jedinjenja mogu takođe biti korišćena da inhibiraju vezivanje leukocita za endotelijalne ćelije i da inhibiraju transmigraciju leukođta u inflamatorno tkivo, kao što je otkriveno u US 2005/0043239 Al. Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska sa više prednosti dozvoljavaju pojedinacima koji imaju inflamatorno stanje gde su pronađeni leukociti da budu akumulirani na mestu povrede ili inflamatornog tkiva.

[0056]Dalje je utvrđeno da PI3K5 igra ulogu u stimulisanoj proliferaciji limfocita, uključujući B ćelije i T ćelije. Štaviše, PI3K6 izgleda igra ulogu u stimulisanom izlučivanju antitela pomoću B ćelija. Selektivni PI3K5 inhibitor jedinjenja iz ovog pronalaska je korišćen da se uspostavi da ovaj fenomen može biti ukinut inhibicijom PI3K5. Tako, predmetni pronalazak uključuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodama korišćenja jedinjenja strukturne formule (I) ili (II), za inhibiciju proliferacije limfocita, ili za inhibiranje proizvodnje antitela od strane B limfocita. Predmetni pronalazak takođe uključuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u metodama lečenja bolesnih stanja u kojima je jedna ili više od ovih funkcija limfocita abnormalna ili nepoželjna.

[0057]Ove metode mogu biti primemene korišćenjem racemske smese jedinjenja iii specifičnog enantiomera. U poželjnim izvođenjima, korišćena su jedinjenja S-enantiomera.

[0058]Ove metode mogu biti primenjene korišćenjem, na primer, sledećih jedinjenja pronalaska (S)-5-fluoro-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on.

[0059]Otkrivena jedinjenja uključuju: (R)-5-fluoro-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 6-fluoro-3- fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-difiuoro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamtno)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3<2,6-difiuoro-fenil)-2-[l-(2-ftuoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[l-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-benziloksi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-2-benziloksi-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-benziloksi-l-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-benziloksi-l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4 on; 3-(4-fiuoro-fenil)-5-meti!-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(4-fluoro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(4-fluoro-fenil)-2-[l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilam^

(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino}-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[i-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-fiuorofenil)-5-metil-2-[l-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4- ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-il)-pirolidin-2-il]-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-hidroksi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[fenil-(9H-purin-6-ilamino)-metil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[(2-amino-9H-purin-6-ilamino}-fenil-metil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-1-on; 2-[(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-fenil-metil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[fenil-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-metil]-3H-hinazolin-4-on; 5-fluoro-3-fenil-2-[l-{9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-fluoro-3-fenil-3H-hinazolin^-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-hloro-3-fenil-3H-hinazoiin-4-on; [5-(5-metil-4-okso-3-fenil-3,4-dihidro-hinazolin-2-ii)-5-(9H-purin-6-ilamino)-pentil]- benzil estar karbaminske kiseline; [5-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-5-(5-metil-4-okso-3-fenil-3,4-dihidro-hinazolin-2-il)-pentil]- benzil estar karbaminske kiseline; [4-(5-metil-4-okso-3-fenil-3,4-dihidro-hinazolin-2-il)-4-(9H-purin-6-ilamino)-butil]- benzil estar karbaminske kiseline; [4-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-4-(S-metil-4-okso-3-fenil-3,4-dihidro-hinazolin-2-il)-butil]- benzil estar karbaminske kiseline; 3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-itamino)-eb'l]-3H-hinazolin-4-on; 2-[5-amino-l-(9H-purin-6-ilamino)-pentil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on); 2-[5-amino-l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-pentil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-Dimetil-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-dimetii-fenil)-5-metil-2-(l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-morfolin-4-ilmetil-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-morfolin-4-ilmetil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[4-amino-l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-butil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 6-fluoro-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-6-fiuoro-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-tert-butoksi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-metil-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-metil-fenil)-5-metil-3l-l-hinazolin-4-on; 3-(3-hloro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etilj-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-2-hidrokshetil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-fluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-difiuoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-fluoro-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; S-hloro-3-(3-fluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6Hlamino)-etil]-5-hloro-3-(3-fluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-trifluorometil-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H hinazolin-4-on; 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-3-(2,5-difiuorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-eitl]-3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-dihloro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-dihloro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-

fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-hloro-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-Narnino)-butil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3,5-dihlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-mea>2-[l-(5-metil-7H-pirolo[2,3-d3pirimidin-4-ilamino)-etii]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-[2-hidroksi-l-(9H-purin-

6-ilamino)-etii]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3<5-difluorofenil)-5-metil-2-[lK9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-3-(3,5-dir1uoro-fenil)-5-metil-3H-hin 3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(5-bromo-7H-pirolo[23-d]pirimidin^-ilamirio)-etil]-3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-fluoro-fenil)-5-men'l-2-[l-(5-ir>etil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin^-ilamino)-eti on; 3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etili-3-(3,5-difluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 6,7-difluoro-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazotin-4-on; 6-fluoro-3-(3-fluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[4-dietilamincj-l-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(3,5-dilfuoro-fenil)-5-rrffitil-2-[l<9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazotin-4-on; 5-fluoro-2-[l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-fluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-difluoro-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-meb1-3-fenil-2-[3,3,3-trirluoro4-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-hidroksi-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3<3-metoksi-fenil)-5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-hinazolin-4-on; 3-[3-(2-dimetilamino-etoksi)-fenil]-5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etit}-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-ciklopropilmetoksi-fenil)-5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-hinazolin-4-on; 5-metil-3-(3-prop-2-iniloksi-fenil)- 2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-hinazolin-4-on; 2-(l-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]-etil}-3<3-hidroksifenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-{l-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]-etil}-3-(3-metoksifenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-{l-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]etil}-3-(3^iklopropi!metol<si-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-{l-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]-etil}-5-metil-3-(3-prop-2-iniloksi-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-etinil-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 3-{5-metil-4-okso-2-tl-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-4H-hinazolin-3-i!}-benzonitril; 3-{5-metil-4-okso-2-{l-[9H-purin-6-ilamino)-etil]-4H-hinazolin-3-il}-benzamid; 3-(3-acetil-fenil)-5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-hinazolin-4-on; 2-(3-(5-metil-4-okso-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-4H-hinazolin-3-il-fenoksi acetamid; 5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3-[3-(tetrahidropuran-4-iloksi)-fenil]-3H-hinazolin-4-on; 3-[3-(2-metoksietoksi)-fenil]-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 6-fluoro-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-[3-(tetrahidro-piran^-i!oksi)-fenil]-3H-hinazolin-4-on; 3-[3-(3-dimeb'lamino-propoksi)-fenil]-5-rrreti^^ 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-ebnil-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 3-{2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-S-metil-4-okso-4H-hinazolin-3-il}-benzonitril; 3-{2-[l-{2-amino-9H-purin-6-ilamino)-eOIJ-5-metil-4-olcso-4H-hinazolin-3-il}-benzamid; 3-{2-[l-(2-amino-9H-purin-6Hlarnino)-etil]-5-metil-4-okso-4H-hinazolin-3-il}-benzamid; 5-metil-3-(3-morfolin-4-il-fenil)-2-[l-(9H-purin- 6-ilamino)-etil]-3H-hinazo!in-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-(3-morfolin-4-il-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6Hiamino)-eb'l]-3-[3-(2-m^ hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-eb'l]-3-[3-(2-dim^ 2-tl-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-but-3-inil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 2-(l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-but-3-inil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-(3,S-dirluoro-fenil)-2-[l-(9H-pLrin-6H'lamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propi^ 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-hloro-3-C3,S-difluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3,S-difluoro-fenil)-6-fluoro-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-(2,6-difluoro-fenil)-2-[l-(9H-purtn-6-namino)-propil]-3H-hinazolin-4-on; 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-hloro-3-(2/6-difluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; S-metit-3-fenil-2-[l-(9H-purin-6-iloksi)-etiQ-3H-hinazolin-4-on.

[0060]Ove metode mogu biti primenjene korišćenjem jedinjenja koja ispoljavaju PI3K5 inhibitornu aktivnost. Naročito, otkrivene metode mogu biti primenjene korišćenjem jedinjenja koji imaju opštu strukturnu formulu (I):

pri čemu

X i Y, su nezavisno, N ili CR<C>;

Zje N-R7 ili O;

R<1>su iste i predstavljaju vodonik, halo, ili CY3alkil;

R<?>i R<3>, su nezavisno, vodonik, halo, ili Ca.3 alkil;

R"je vodonik, halo, OR<s>, CN, Cz^alkinil, C(=0)R<a>, C(=0)NR<i>R", Cj^heterocikloalkil,

Ci-3alkilenCMheterocikloalkil, OQ.3alkilenOR', OCi3alkilenNR<a>R<b>, OC,-3a!kilenC3.«cikloalkil,

OC34heterocikloalkil, OC,.3alkilenCsCH, ili OCi-3alkilenC(=0) NR<a>R";

R<5>je C,.5alkil, CH;CF3, fenil, CH2CsCH, C,-3alkilenOR<e>, CI-=alkilenNRaRt, ili C!-ialkilenNHC(=0)OR<a>,

R<6>je vodonik, halo, ili NR<a>R<6>;

RJ je vodonik ili R<5>i R'su uzeti zajedno sa atomima na koje su vezani tako da formiraju peto ili šestočlani zasićeni prsten; R* je C.-j alkil, halo, CF3, ili CHjC^heterocikloalkil;

n je 0, 1, ili 2;

R<a>je vodonik, C^aikil, ili CHjCeHj;

Rb je vodonik ili Ci-3alkil; i

R<c>je vodonik, Ci-3alkil, ili halo,

pri čemu kada su R'grupe različite od vodonika, R7 i R" su iste;

ili farmaceutski prihvatljivu so, ili solvat (npr., hidrat) od njih.

[0061]Jedinjenja predmetnog pronalaska su selektivni inhibitori aktivnosti PI3K5. Jedinjenja pokazuju inhibiciju PI3K5 u biohemijskim testovima, i selektivno ometaju funkciju PI3K5 eksprimirajući ćelije u testovima baziranim na ćeliji. Kao što je opisano ovde, ova jedinjenja su pokazala sposobnost da inhibiraju određene funkcije neutrofiia i drugih leukocita, kao i funkcije osteoklasta.

[0062]Jedinjenja otkrivena ovde imaju generalnu strukturnu formulu (I) ili (II), ili farmaceutski prihvatljivu so od njih, ili solvat od njih:

pri čemu su X, Y, Z, R<1>preko R<s>, R", R<s>, R<c>, i n kao što su definisani iznad.

[0063]Pokazujući veću potentnost u odnosu na druga jedinjenja su jedinjenja pri čemu Rs je G-3 alkil, F, Cl ili CF3. Alternativno, n je 0 (kao da ne postoji R<8>supstituent).

[0064]Pokazujući takvu povećanu potentnost, X i Y su nezavisno N ili CH. Dalje pokazujući povećanu potentnost, X je N i Y je CH. Alternativno, X i Y mogu biti takođe oba CH. Dalje pokazujući povećanu potentnost, R<6>je vodonik, halo, ili NH3.

[0065]Neočekivano, potentcija protiv PI3K5 je sačuvana kada je R<1>ista. U strukturnoj formuli (I) i (II), R<7>i R" se mogu razlikovati, pod uslovom da R<1>je H. Kada je R<1>H, slobodna rotacija je neočekivano dopuštena oko veze koja spaja supstituent fenil prstena, na hinazolin prsten i jedinjenja povoljno ne pokazuju atropizomerizam (tj. multipla formacija dijastereoizomera je izbegnuta). Alternativno, R<7>i R" mogu biti iste, tako da jedinjenja pogodno ne pokazuju atropizomerizam.

[0066]Kao što se ovde koristi, termin "alkil" je definisan kao pravo lančane ili razgranate ugrjikovodonične grupe koje sadrže naznačen broj atoma ugljenika, npr., metil, etil, i pravi lanac ili razgranate propil i butil grupe.

[0067]Termini "G-3 alkilen" i "Cnalkilen" su definisani kao grupe ugljovodonika koje sadrže naznačeni broj atoma ugljenika, i jedan vodonik manje nego odgovarajuća alkil grupa.

[0068]Termin "Cj^lkinil" je definisan kao grupa ugljovodonika koja sadrži naznačeni broj atoma ugljenika i trostruku vezu ugljenik-ugljenik.

[0069] Termin"C3^cikloalkil" je definisan kao ciklična grupa ugljovodonika koja sadrži naznačeni broj atoma ugljenika.

[0070]Termin "C2<heterocikloalkil" je slično definisan kao cikioalkil, osim što prsten sadrži jedan ili dva heteroatoma izabrana iz grupe koju čine 0, NR<a>i S.

[0071]Termin "halo" je definisan kao fluor, brom, hlor, i jod.

[0072]U poželjnim izvođenjima, Z je N-R<7>, i biciklični prstenasti sistem sadržavajući X i Y je

[0073]U drugim poželjnim izvođenjima , R<1>je vodonik, fluor, hlor, metil, ili

R<2>je vodonik, metil, hlor, ili fluor; R<3>je vodonik ili fluor; R<6>je NH2, vodonik, ili fluor; R' je vodonik ili R! i R<7>su uzeti zajedno da formiraju R<8>je metil, trifluorometil, hlor, ili fluor; R" je vodonik, fluor, hlor, OH, OCH3, OCH2C=CH, 0(CH2)2N(CH3)2, C(=0)CH3, C=CH, CN, C(=0)NH2, OCH2C(=0)NH2, 0(CH2)2OCH3, 0(CH2)2N(CHj)2,

i R<5>je metil, etil, propil, fenil, CH2OH, ChhOCHjCiHs, CH2CF3, CH2OC(CH3)3, CH2CsCH, (CH2)3N(C2Hs)j, (CHj)3NH2, (CH2)4NH2, (CH2)3NHC(=0)OCHjCsHs, ili (CH2)4NHC(=0)OCH2C6H5; R'je vodonik, metil, fluor, ili brom; i n je 0 ili 1.

[0074]Opšte je prihvaćeno da biološki sistemi mogu pokazivati odgovore koje su veoma osetljivi na apsolutnu stereohemijsku prirodu jedinjenja kojima su izloženi. Videti, EJ. Ariens, Medicinal Research Reviews, 6:451-66 (1986); EJ. Ariens, Medicinal Research Reviews, 7:367-87 (1987); K.W. Fowler, Handbook of Stereoisomers: Therapeutic Drugs, CRC Press, edited by Donald P. Smith, pp. 35-63 (1989); and S.C. Stinson, Chemical and Engineering News, 75:38-70

(1997).

[0075]Zbog toga, jedinjenja ovog pronalaska uključuju sve moguće stereoizomere i geometrijske izomere jedinjenja strukturne formule (I), i uključuju ne samo racemska jedinjenja već i optički aktivne izomere takođe. U poželjnim izvođenjima, jedinjenje ovog pronalaska je S-enanb'omer.

[0076]Kada se želi jedinjenje strukturne formule (I) kao pojedinačni enentiomer, on se može dobiti bilo rezolucijom konačnog produkta ili stereospecifičnom sintezom, bilo iz izomerno Čistog početnog materijala ili upotrebom hiralnog pomoćnog reagensa. Na primer, videti Z. Ma et al., Tetrahedron: Asvmmetrv, 8(6), pages 883-88 (1997). Rezolucija konačnog produkta, intermedijera ili početnog materijala može se postići bilo kojim pogodnom metodom poznatom u tehnici. Specifični stereoizomeri, naročito, S-enantiomeri jedinjenja pronalaska, pokazuju odličnu sposobnost da inhibiraju aktivnost kinaze PI3K6.

Metode za Identifikovanje Aktivnosti Negativnih Regulatora PI3K5

[0077]PI3K5 protein, kao i njegovi fragmenti koji poseduju biološku aktivnost, mogu biti korišćeni23skrining pretpostavljenog inhibitora jedinjenja u bilo kojoj od različitih tehnika skrininga ieka. Inhibitor PI3K5 je jedinjenje koje smanjuje ili ukida sposobnost PI3K5 da izvrši bilo koju od svojih bioloških funkcija. Primer takvih jedinjenja je agens koji smanjuje sposobnost PI3K8 polipeptida da fosforiliše fosfatidilinozitol ili ciljne odgovarajuće strukture unutar ćelije. Selektivnost jedinjenja koje negativno reguliše PI3K 6 aktivnost se može proceniti poređenjem njegove aktivnosti na PI3K5 sa njegovom aktivnošću na druge proteine. Selektivni inhibitori uključuju, na primer, antitela i druge proteine ili peptide koji se specifično vežu na polipeptid PI3K5, oligonukleotide koji se specifično vežu na polipeptide PI3K6 i druga nepeptidna jedinjenja (npr., izolovane ili sintetske organske molekule) koji specifično međusobno reaguju sa PI3K5 polipeptidima. Inhibitori takođe uključuju jedinjenja kao što je opisano iznad, ali koja međusobno reaguju sa specifično vezujućim partnerom polipeptida PI3K5.

[0078]Trenutno poželjni ciljevi za razvoj selektivnih inhibitora PI3K5 uključuju, na primer: (1) citoplazmatske oblasti PI3K5 polipeptida koje kontaktiraju druge proteine i/ili lokalizuju PI3K5 unutar ćelije; (2) oblasti PI3K5 polipeptida koji vežu specifične vezujuće partnere; (3) oblasti P13K6 polipeptida koji vežu supstrat; (4) alosterna regulatorna mesta PI3K6 polipeptida koja mgu ili ne mogu direktno međusobno delovati sa

aktivnim mestom nakon regulatornog signala;

(5) oblasti PI3K6 polipeptida koja posreduju muttimerizaciju.

Na primer, jedan cilj za razvoj modulatora je identifikovana regulatorna interakcija p8S sa P1105, koja može biti uključena u aktivaciji i/ili subćelijskoj lokalizaciji pll06 ostatka. Ipak drugi selektivni modulatori uključuju one koji prepoznaju specifične regulatorne ili PI3K 5 kodirajuće nukleotidne slekvence. Modulatori PI3K 5 aktivnosti mogu biti terapijski korisni u lečenju širokog raspona bolesti i fizioloških stanja u kojima je uključena abnormalna aktivnost PI3K5.

[0079]Prema tome, ovde su otkrivene metode karakterišući potenciju testnog jedinjenja kao inhibitora PI3K5 polipeptida, navedena metoda koja obuhvata korake: (a) merenja aktivnosti PI3K5 polipeptida u prisustvu testnog jedinjenja; (B) poređenja aktivnosti PI3K6 polipeptida u prisustvu testnog jedinjenja na aktivnost PI3K5 polipeptida u prisustvu ekvivalentne količine referentnog jedinjenja (npr., jedinjenje ima poznatu potenciju prema PI3K 6), pri čemu niža aktivnost P13K5 polipeptida u prisustvu testnog jedinjenja nego u prisustvu referentnog pokazuje da je testno jedinjenje jači inhibitor nego referentno jedinjenje, i viša aktivnost PI3K6 polipeptida u prisustvu testnog jedinjenja nego u prisusatvu referentnog pokazuje da je testno jedinjenje manje potentan inhibitor nego referentno jedinjenje.

[0080]Ovde su otkrivene metode karakterišući potenciju testnog jedinjenja kao inhibitora PI3K5 polipeptida, obuhvatajua korake: (a) određivanja količine referentnog jedinjenja (npr., PI3K5 inhibitora jedinjenja otkrića) koje inhibira aktivnost PI3K8 polipeptida od strane referentnog procenta inhibicije, time definišući referentnu inhibitornu količinu za referentno jedinjenje; (b) određivanja koliane testnog jedinjenja koje inhibira aktivnost PI3K5 polipeptida od strane referentnog procenta inhibicije, time definišući referentnu inhibitornu količinu za test jedinjenje; (c) poređenja količine inhibitorne reference za test jedinjenje prema količini inhibitorne reference za referentno jedinjenje, pri čemu niža referentna inhibitorna količina za test jedinjenje negoZ3referentno jedinjenje ukazuje da je testno jedinjenje jači inhibitor nego referento jedinjenje i viša količina inhibitorne reference za test jedinjenje nego za referentno jedinjenje ukazuje da je test jedinjenje manje potentan inhibitor nego referentno jedinjenje. U jednom aspektu, metoda koristi količinu inhibitorne reference koja je količina jedinjenja koja inhibira aktivnost PI3K5 polipeptida za 50%, 60%, 70%, odnosno 80%. U drugom aspektu, metoda koristi količinu inhibitorne reference koja je količina jedinjenja koje inhibira aktivnost PI3K6 polipeptida za 90%, 95%, ili 99%. Ove metode obuhvataju određivanje količine inhibitorne reference jedinjenja u in vitro biohemijskom testu, u in vitro testu baziranom na ćelijama ili u in vivo testu.

[0081]Ovde su otkrivene metode identifikovanja inhibitora aktivnosti P13K5, obuhvatajući korake: (i) merenja aktivnosti PI3K5 polipeptida u prisustvu ili odsustvu testnog jedinjenja, i (ii) identifikovanja kao inhibitora testnog jedinjenja koje smanjuje PI3K5 aktivnost i da se takmiči sa jedinjenjem iz otkrića za vezivanje na PI3K5. Dalje, otkrivene su metode za identifikovanje jedinjenja koja inhibiraju aktivnost PI3K5, obuhvatajući korake (i) kontaktiranja PI3K5 polipeptida sa jedinjenjem iz otkrića u prisustvu ili odsustvu testnog jedinjenja, i (ii) identifikovanja testnog jedinjenja kao inhibitora PI3K5 aktivnosti pri čemu se jedinjenje takmiči sa jedinjenjem iz pronalaska za vezanje na PI3K5. Otkriće zbog toga obezbeđuje metodu za skrining za kandidate inhibitorne aktivnosti PI3K5 i/ili potvrdu načina delovanja kandidata takvih inhibitora. Takve metode se mogu koristiti u odnosu na druge PI3K izoforme paralelno da se ustanovi komparativna aktivnost testnog jedinjenja preko izoformi i/ili u odnosu na jedinjenje iz ovog pronalaska.

[0082]U ovim metodama , PI3K5 polipeptid može biti fragment p!105 koji ispoljava aktivnost kinaze, tj., fragment koji obuhvata katalitičko mesto pllOS. Alternativno, PI3K5 polipeptid može biti fragment iz pllOo-vezujućeg domena p85 i obezbeđuje metod za identifikaciju alosternog modulatora PI3K5. Metode mogu biti korišćene u ćelijama izražavajući ekspresiju ćelija PI3K6 ili njegove podjedinice, bilo endogeno ili egzogeno. Prema tome, polipeptid korišćen u takvim metodama može biti slobodna u rastvoru, pričvršćen za čvrstu podlogu, modifikovan da bude prikazan na površini ćelije ili lokalizovan intracelularno. Modulacija aktivnosti ili formiranje vezujućeg kompleksa između veznih PI3K5 polipeptida i agensa koji se ispituje mogu zatim biti izmereni.

[0083]Humani PI3K polipeptidi su podložni biohemijskim testovima ili visokopropusnom skriningu na bazi ćelija (HTS) prema metodama koje su poznate i izvode se u tehnici, uključujući sisteme melanofore ispitivanja u istraživanju receptor ligandskih interakcija, sisteme testa bazirane na kvascu i sisteme ekspresije ćelije sisara. Za pregled, videti Jayawickreme et al., Curr Opin Biotechnol, 8:629-34 (1997). Automatizovani i minijaturizovani HTS testovi se takođe podrazumevaju kao što je opisano, na primer, u Houston et al., Curr Opin Biotechnol, 8:734-40 (1997).

[0084]Takvi testovi HTS su korišćeni za osiguranje biblioteke jedinjenja da identifikuju određena jedinjenja koja pokazuju željeno svojstvo. Svaka biblioteka jedinjenja može biti korišćena, uključujući hemijske biblioteke, biblioteke prirodnih produkata i kombinatorne biblioteke koje sadrže slučajne ili dizajnirane oligopeptide, oligonukleotide ili druga organska jedinjenja. Hemijske biblioteke mogu sadržavati poznata jedinjenja, vlasničke strukturne analoge poznatih jedinjenja ili jedinjenja koja su identifikovana iz skrininga prirodnog produkta.

[0085]Biblioteke prirodnog produkta su kolekcije materijala koje su izolovane iz prirodnih izvora, obično, mikroorganizma, životinja, biljki ili morskih organizama. Prirodni produkti su izolovani iz svojih izvora fermentacijom mikroorganizama, zatim izolacijom i ekstrakcijom fermentadjskog bujona ili direktnom ekstrakcijom iz mikroorganizama ili samih tkiva (biljaka ili životinja). Biblioteke prirodnog produkata uključuju poliketide, neribozomalne peptide i varijante (uključujući varijante koje se javljaju neprirodno) od njih. Za pregled, videti Cane et al., Science, 282:63-68 (1998).

[0086]Kombinatorne biblioteke su sastavljene od velikog broja srodnih jedinjenja, kao što su peptidi, oligonukleotidi ili druga organska jedinjenja kao smeša. Takva jedinjenja su relativno jednostavana za dizajn i pripremu od strane tradicionalne automatizovane sinteze protokola, PCR, kloniranjem ili pogodnim sintetskim metodama. Od posebnog interesa su peptidne i oligonukleotidne kombinatorne biblioteke.

[0087]Još druge biblioteke od interesa uključuju peptid, protein, peptidomimetik, muItiparalelnu sintetičku kolekciju, rekombinatorne i polipeptidne biblioteke. Za pregled kombinatorne hernije i biblioteka stvorenih tako, videti Myers, Curr Opin Biotechnol, 8:701- 07 (1997).

Terapijska Upotreba Inhibitora

PI3KS Aktivnost

[0088]Pronalazak obezbeđuje jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima za primenu u metodi za selektivno ili specifično inhibiranje aktivnosti PI3K6 terapijski ili profilaktički koristeći jedinjenja iz pronalaska. Metoda obuhvata primenu selektivnog ili specifičnog inhibitora PI3K5 aktivnosti na pojedincu kojemu je to potrebno u količini dovoljnoj da inhibira PI3K5 aktivnost. Jedinjenje može biti korišćeno za lečenje ljudi ili životinja koji pate od, ili su podložni stanju, čiji su simptomi ili patologija posredovani od strane PI3K 5 ekspresijom ili aktivnošću.

[0089]"Lečenje" kao što se ovde koristi se odnosi na prevenciju poremećaja kod životinje koja može imati predispoziciju za poremećaj, ali još nije dijagnostikovano da ga ima; inhibiranje poremećaja, tj. zaustavljanje njegovog razvoja; olakšavanje poremećaja, tj., uzrokujući njegovu regresiju; ili ublažavanje poremećaja, smanjenje težine simptoma povezanih sa poremećajem. "Poremećaj" je namenjen da obuhvati medicinske poremećaje, bolesti, stanja, sindrome i slično, bez ograničenja.

[0090]Jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u metodama obuhvataju različite načine lečenja životinjskog subjekta, poželjno sisara, poželjnije primata, još poželjnije čoveka. Među životinjama sisara koje se mogu ieati su, na primer, ljudi; domaće životinje (kućni ljubimo), uključujući pse i mačke; životinje sa farme, uključujući goveda, konje, ovce, svinje i koze; laboratorijske životinje, uključujući pacove, miševe, kuniće, zamorce, i nehumane primate; i zoo primerke. Životinje koje nisu sisari uključuju, na primer, ptice, ribe, reptile i vodozemce.

[0091]Jedinjenje za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska može biti korišćeno za lečenje subjekata terapijski ili profilaktički, koji pate od, ili su podložni, inflamatornom poremećaju. Jedan aspekt ovog pronalaska proizilazi iz uključivanja PI3K5 u posredovane aspekte infiamatornog procesa. Bez namere da se vezuje za bilo koju teoriju, postavljena je teorija da zato što inflamacija uključuje procese obično posredovane od strane leukocita (npr, neutrofiia i limfocita) aktivaciju i hemotaktičku transmigraciju, i zato što PI3K6 može postredovati takve pojave, antagonisti PI3K5 mogu biti korišćeni za suzbijanje povreda povezanih sa inflamadjom.

[0092]"Inflamatomi poremećaj", kao što se ovde koristi, se može odnositi na bilo koju bolest, poremećaj ili sindrom u kojem suvišni ili neregulisani inflamatomi odgovor vodi znatnim inflamatornim simptomima, oštećenju tkiva domaćina ili gubitku funkdje tkiva. " Inflamatomi poremećaj" se takođ odnosi na patološko stanje posredovano prilivom leukocita i/ili neutrofilnom hemotaksom.

[0093]"Inflamacija" kao što se ovde koristi se odnosi na lokalizovani, zaštitni odgovor izazvan povredom ili oštećenjem tkiva, koji služi za uništavanje, razblaživanje ili izolaciju (odvajanje) i agensa koji uzrokuje povredu i povređenog tkiva. Inflamacija je povezana sa prilivom leukocita i/ili neutrofilnom hemotaksom. Inflamacija može biti rezultat infekcije sa patogenim organizmima i virusima, i od neinfekcijskih agenasa kao što je trauma ili reperfuzija nakon infarkta miokarda ili moždanog udara, imunog odgovora na strani antigen, i autoimunih odgovora. Prema tome, inflamatomi poremećaji pogodni pronalasku obuhvataju poremećaje povezane sa reakcijama specifičnog odbrambenog sistema kao i sa reakcijama nespecifičnog odbrambenog sistema.

[0094]Kako se ovde koristi, termin "specifični, odbrambeni sistem" se odnosi na komponentu imunološkog sitema koji reaguje na prisustvo specifičnih antigena. Primeri inflamacija koje su posledica odgovora specifičnog odbrambenog sistema obuhvataju klasičan odgovor na strane antigene, autoimune bolesti i odloženi tip odgovora hipersenzitivnosti posredovan T-ćelijama. Hronične inflamatorne bolesti, odbacivanje čvrstog transplantiranog tkiva i organa, npr., bubrega i transplantacije koštane srži, i bolesti odbacivanja grafta domaćina - graft versus host bolesti (GVHD), dalji su primeri inflamatornih reakcija specifičnog odbrambenog sistema.

[0095]Termin "nespecifičan odbrambeni sistem" kao što se ovde koristi se odnosi na inflamatorne poremećaje koji su posredovani leukocitima koji su nesposobni za imunološku memoriju (npr., granulociti i makrofagi). Primeri inflamacija koje rezultiraju, barem delimično, iz reakcije nespecifičnog odbrambenog sistema uključuju inflamacije povezane sa stanjima kao što su kod odraslih (akutni) respiratorni distres sindrom (ARDS) ili sindromi višestrukih povreda organa; reperfuziona povreda; akutni glomerulonefritis; reaktivni artritis; dermatoze sa akutnim inflamatornim komponentama; akutni purulentni meningitis ili drugi inflamatomi poremećaji centralnog nervnog sistema, kao moždani udar; opekotine; inflamatorna bolest creva; sindromi povezani sa transfuzijom granulocita; i citokinom-indukovana toksičnost.

[0096]"Autoimuna bolest" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koju grupu poremećaja u kojima je povreda tkiva povezana sa humoralnim ili sa ćelijski-posredovanim odgovorima vlastitih telesnih sastojaka. "Alergijska bolest" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koji simptom, oštećenje tkiva ili gubitak funkcije tkiva koji proizilazi iz alergije. "Artritis" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koju bolest koja je karakterisana inflamatornim lezijama zglobova koji se mogu pripisati različitoj etiologiji. "Dermatitis" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koju od velike familije oboljenja kože koje su karakterisane inflamacijom kože što se može pripisati raznovrsnim etiologijama. "Odbacivanje transplantata" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koju imuno reakciju usmerenu protiv ugrađenog tkiva, kao što su organi ili ćelije (npr, koštane srži), karakterisanu gubitkom funkcije ugrađenog i okolnog tkiva, bolom, oticanjem, leukocitozom i trombocitopenijom.

[0097]Jedinjenja za upotrebu u terapijskim metodama iz predmetnog pronalaska uključuju metode za lečenje poremećaja povezanih sa aktivacijom inflamatornih ćelija. "Aktivacija inflamatornih ćelija" se odnosi na indukciju od strane stimulansa (uključujući, ali ne ograničavajući na, citokine, antigene ili auto-antitela) proliferativnog ćelijskog odgovora, produkcijom rastvorivih medijatora (uključujući, ali ne ograničavajući se na citokine, radikale kiseonika, enzime, prostanoide ili vazoaktivne amine) ili ekspresijom ćelijske površine novim ili povećanim broja medijatora (uključujući, ali ne ograničavajući se na, većinu histokompatibilnih antigena ili molekula ćelijske adhezije) u inflamatornim ćelijama (uključujući, ali ne ograničavajući na monocite, makrofage, T limfocite, B limfocite, granulocite (tj. polimorfonuklearne leukocite, kao što su neutrofili, bazofili i eozinofili), mastocite, dendritske ćelije, Langerhansove ćelije i endotelijane ćelije). Stručnjacima sa ovog područja tehnike će biti jasno da aktivacija jednog ili kombinacije ovih fenotipova u ovim ćelijama može doprineti inicijaciji, perpetuaciji ili egzacerbaciji inflamatornog poremećaja.

[0098]Nađeno je da jedinjenja iz predmetnog pronalaska inhibiraju oslobađanje superoksida od strane neutrofiia. Superoksid je oslobođen od strane neutrofiia kao odgovor na bilo koji od različitih stimulansa, uključujući signale infekcije, kao mehanizam uništavanja ćelija. Na primer, poznato je da se oslobađanje superoksida indukuje od strane faktora nekroze tumora alfa (TNFa), koji se oslobađa od strane makrofaga, mastocita i limfocita nakon kontakta sa komponentama ćelijskog zida bakterija, kao što su lipopolisaharidi (LPS). TNFa je izuzetno potentni i promiskuitetni aktivator inflamatornih procesa, koji je uključen u aktivaciju neutrofiia i raznih drugih tipova ćelija, indukciju leukocita/adheziju endotelijalnih ćelija, groznicu, poboljšanu produkciju MHC klase I, stimulisanje angiogeneze. Alternativno, oslobađanje superoksida može biti stimulisano pomoću formil-Metionin-Leucil-Fenilalanina (fMLP) ili drugih peptida koji su blokirani na N-terminusu pomoću formiliranog metionina. Takvi peptidi se normalno ne nalaze u eukariotima, ali su fundamentalno karakteristika bakterije, i signaliziraju prisustvo bakterija u imuno sistemu. Leukociti eksprimirajući fMLP receptor, npr., neutrofiia i makrofaga, su stimulisani da migriraju do gradijenata ovih peptida (tj. hemotaksa) prema mestu infekcije. Kao što je pokazano ovde, jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju stimulisano oslobađanje superoksida pomoću neutrofiia kao odgovor na bilo TNFa ili fMLP. Ostale funkcije neutrofiia, uključujući stimulisanu egzocitozu i usmerenu hemotaktičnu migraciju, takođe su pokazale da će biti inhibirane od strane inhibitora PI3K5 pronalaska. Prema tome, može se očekivati da će jedinjenja iz ovog pronalaska biti korisna u lečenju poremećaja, kao što su inflamatomi poremećaji, koji su posredovani nekim ili svim ovim funkcijama neutrofiia.

[0099]Predmetni pronalazak omogućava metode lečenja takvih bolesti kao su artritične bolesti, artritis, monoartikularni artritis, osteoartritis, giht artritis, spondilitis; Behčetova bolest; sepsa, septički šok, endotoksični šok, gram negativna sepsa, gram pozitivna sepsa i sindrom toksičnog šoka; sindrom višestrukog oštećenja organa kao posledica septikemije, traume ili hemoragije; oftalmičkii poremećaji, kao što su alergijski konjuktivitis, vemalni konjuktivitis, uveitis, i oftalmopatija povezana štitnjačom; eozinofilni granulom; plućne ili respiratorne bolesti kao što su astma, hronični bronhitis, alergijski rinitis, ARDS, hronična plućna inflamatorna bolest (npr, hronična opstruktivna plućna bolest), silikoza, plućna sarkoiđoza, zapaljenje plućne maramice, alveolitis, vaskulitis, emfizem, upala pluća, bronhiektazija i trovanje kiseonikom; reperfuziona povreda miokarda, mozga ili ekstremiteta; fibroza i cistična fibroza; keloidna formacija ili formacija ožiljnog tkiva; ateroskleroza; autoimune bolesti, kao što su sistemski eritematozni lupus (SLE), autoimuni tireoiditis, multipla skleroza, neki oblici dijabetesa, i Rejnov sindrom; poremećaji odbacivanja transplantata, kao što su GVHD i odbacivanje alografta; hronični glomerulonefritis; inflamatorne bolesti creva, kao što su hronične inflamatorne bolesti creva (CIBD), Kronova bolest, ulcerozni kolitis, i nekrotizirajući enterokolitis; inflamatorne dermatoze, kao što su kontaktni dermatitis, atopijski dermatitis, psorijaza ili urtikarija; groznica i mialgija zbog infekcije, inflamatomi poremećaji centralnog i perifernog nervnog sistema, kao što su meningitis, encefalitis, i povrede mozga ili kičmene moždine zbog manjih trauma; Sjogrenov sindrom; bolesti koje uključuju leukocitnu dijapedezu; alkoholni hepatitis; bakterijska upala pluća; kompleksne antigen-antitelo posredovane bolesti; hipovolemijski šok; Tip I dijabetes melitus; akutna i odložena hipersenzitivnost; bolesna stanja zbog diskrazije leukocita i metastaze; opekotine; sindromi povezai sa transfuzijom granulocita; i citokinom-indukovana toksičnost.

[0100]Jedinjenja koja se koriste u postupku mogu biti korisna u lečenju subjekata koji pate od stanja ili su izloženii, reperfuzionoj povredi, tj., povredi koja proizlazi iz situacija u kojima tkivo ili organ doživljava period ishemije, praćen reperfuzijom. Termin "ishemija" se odnosi na lokalizovanu anemiju tkiva zbog opstrukcije dotoka arterijske krvi. Prolazna ishemija praćena reperfuzijom karakteristično rezultira u aktivaciji neutrofiia i transmigraciji kroz endotel krvnih sudova u zahvaćenom području. Akumulacija aktiviranih neutrofiia opet rezultira u generisanju metabolita reaktivnog kiseonika, koji oštećuju komponente zahvaćenog tkiva ili organa. Ovaj fenomen "reperfuzione povrede" je obično povezan sa stanjima kao što je vaskularni moždani udar (uključujući globalnu i fokalnu ishemiju), hemoragijski šok, ishemiju ili infarkt miokarda, presađivanje organa, i cerebralni vazospazam. Za ilustraciju, reperfuziona povreda nastaje pri prestanku srčanih procedura bajpasa ili tokom srčanog zastoja kad srce nakon onemogućenog primanja krvi, počinje reperfuziju. Očekuje se da će inhibicija aktivnosti PI3K5 rezultirati smanjenjem količine reperfuzione povrede u takvim situacijama.

[0101]U odnosu na nervni sistem, globalna ishemija se javlja kada protok krvi u ćelom mozgu prestaje u trajanju. Globalna ishemija može biti rezultat srčanog zastoja. Fokalna ishemija se javlja kada je deo mozga lišen svog normalnog snabdevanja krvlju. Fokalna ishemija možebiti rezultat tromboembolitičke okluzije cerebralnog krvnog suda, traumatske povrede glave, edema ili tumora mozga. Čak i ako su prolazne, i globalna i fokalna ishemija mogu uzrokovati velika oštećenja neurona. Iako oštećenje nervnog tkiva nastaje tokom nekoliko sati ili čak dana nakon početka ishemije, neko trajno oštećenje nervnog tkiva se može razviti u početnim minuta nakon prestanka dotoka krvi u mozak.

[0102]Ishemija se može pojaviti u srcu u infarktu miokarda i drugim kardiovaskularnim poremećajima u kojima su koronarne arterije opstruirane, kao rezultat ateroskleroze, tromba ili spazma. Prema tome, pronalazak se smatra korisnim za lečenje oštećenja srčanog tkiva, naročito oštećenja usled srčane ishemije ili uzrokovanog reperfuzionom povredom kod sisara.

[0103]U drugom aspektu, selektivni inhibitori PI3K6 iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni za upotrebu u metodama lečenja bolesti kostiju, posebno bolesti u kojima je funkcija osteoklasta abnormalna ili nepoželjna. Kao što je prikazano niže, jedinjenja prema ovom pronalasku inhibiraju funkciju osteoklasta in vitro. Prema tome, upotreba takvih jedinjenja i drugih selektivnih inhibitora PI3K5 mogu biti od vrednosti ln lečenja osteoporoze, P3džetove bolesti, i poremećaja povezanih sa resorpcijom kosti.

[0104]U daljem aspektu, ovaj pronalazak uključuje inhibitore PI3K5 jedinjenja za upotrebu u metodama da inhibiraju rast ili proliferaciju ćelija kancera hematopoetskog porekla, poželjno ćelija kancera limfoidnog porekla, poželjnije ćelija kancera povezanih ili izvedenih iz B limfocita ili B limfocita matičnih ćelija. Karcinomi pogodni za lečenje korišćenjem metode iz ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, limfome, npr., maligne neoplazme limfoidnih i retikuloendotelijalnih tkiva, kao što je Burkitov limfom, Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinovi limfomi, limfocitni limfom i slično; multipli mijelom; leukemija, kao što je limfocitna leukemija, hronična mijeloidna (mijelogena) leukemija, i slično. U poželjnom izvođenju, predmetni inhibitor PI3K6 jedinjenja može biti korišćen da inhibira ili kontroliše rast ili proliferaciju ćelija hronične mijeloidne (mijelogene) leukemije. Druge ćelije kancera, hematopoetskog porekla ili na drugi način, koje izražavaju pll05 takođe mogu biti tretirane primenom inhibitora PI3K6 postojećeg pronalaska (C. Sawyer et al., Cancer Research, 63(7), 1667-75 (2003)).

[0105]U drugom aspektu, pronalazak uključuje jedinjenje za upotrebu u metodi suzbijanja funkcije bazofila i/ili mastocita, na taj način omogućavajući lečenje bolesti ili poremećaja koji su karakterisani prekomernim ili nepoželjnim bazofilima i/ili aktivnošću mastocita. Prema tome, ovo jedinjenje može biti korišćeno za selektivnu inhibiciju ekspresije ili aktivnosti PI3K5 u bazofilima i/ili mastocitima. Poželjno, metoda koristi inhibitor PI3K5 u količini dovoljnoj da inhibira stimulisano oslobađanje histamina od strane bazofila i/ili mastocita. Prema tome, sadašnji selektivni inhibitori PI3K5 mogu biti od koristi za primenu u metodi lečenja bolesti karakterisane oslobađanjem histamina, tj., alergijskih poremećaja, uključujući poremećaje kao što je hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), astma, ARDS, emfizem i srodne bolesti.

Farmaceutske kompozije inhibitora aktivnosti PI3K5

[0106]Jedinjenje predmetnog pronalaska može biti primenjeno kao 6'sti hemijski produkt, ali je obično i poželjno, da se jedinjenje primeni u obliku farmaceutske kompozicije ili formulacije. Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže predmetni modulator aktivnosti PI3K5 i biokompatibilni farmaceutski nosač, adjuvans ili prenosnik. Kompozicija može uključiti modulaciju aktivnosti PI3K5 bilo kao pojedinačnog aktivnog agensa ili u kombinaciji sa drugim agensima, kao što su oligo- ili polinukleotidi, oligo- ili polipeptidi, lekovi ili hormoni pomešani sa ekscipijentom ili drugim farmaceutski prihvatljivim nosačima. Nosači i drugi sastojci mogu biti smatrani farmaceutski prihvatljivim ukoliko su kompatibilni sa drugim sastojcima formulacije i da nisu štetni za primaoca.

[0107]Tehnike za formulaciju i primenu farmaceutskih kompozicija mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990. Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti proizvedene korišćenjem bilo koje konvencionalne metode, npr., procesima mešanja, rastvaranja, granulisanja, pravljenja dražeja, mrvljenja, emulgovanja, inkapsuliranja, zatvaranja, topljenja -uvijanja, sušenja-raspršivanja, ili liofilizacije. Optimalna farmaceutska formulacija može biti određena od strane stručnjaka u ovom području tehnike, u zavisnosti od načina primene i željene doze. Takve formulacije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo, i brzinu klirensa in vivo primenjenog agensa. U zavisnosti od stanja koje se leči, ove farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane i primenjene sistemski ili lokalno.

[0108]Farmaceutske kompozicije su formulisane da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosače, i opciono mogu sadržavati eksdpijente i pomoćne supstance koje olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u pripravke koji mogu biti upotrebljeni farmaceutski. Način primene generalno određuje priroda nosača. Na primer, formulacije za parenteralnu primenu mogu sadržavati vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi. Nosači pogodni za parenteralnu primenu mogu biti izabrani između fiziološkog rastvora, puferizovanog fiziološkog rastvora, dekstroze, vode i drugih fiziološki kompatibilnih rastvora. Poželjni nosači za parenteralnu primenu su fiziološki kompatibilni puferi kao što su Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki puferizovani rastvor soli. Za tkivo ili ćelijsku primenu, se koriste penetranti koji odgovaraju određenoj barijeri koja ih mora propustiti u formulaciji. Takvi penetranti su generalno poznati u tehnici. Za pripravke koji sadrže proteine, formulacija može uključivati stabilizatore, kao što su polioli (npr., saharoza) i/ili surfaktanti (npr., nejonski surfaktanti), i slično.

[0109]Alternativno, formulacije za parenteralnu primenu mogu sadržavati disperzije ili suspenzije aktivnih jedinjenja pripremljene kao odgovarajuće uljane injekcione suspenzije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, kao što je susamovo ulje, i sintetske estre masnih kiselina, kao što su etil oleat ili trigliceridi, ili lipozomi. vodene injekdone suspenzije mogu sadržavati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijum karboksimetilceluloza, sorbitol, dekstran, i smeše od njih. Opdono, suspenzija može takođe sadržavati pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi se omogućila priprema visoko koncentrovanih rastvora. Vodeni polimeri koji obezbeđuju pH-osetljivo rastvaranje i/ili produženo oslobađanje aktivnog agensa takođe mogu biti korišćeni kao prevlake ili matriks strukture, npr, metakrilni poiimeri, kao što je EUDRAG1T® series available from Rohm America Inc. (Piscataway, NJ). Emulzije, na primer, ulje-u-vodi i voda-u-ulju disperzije, takođe mogu biti korišćene, opciono stabilizovane agensom za emulgovanje ili dispergovanje (površinski aktivne supstace; surfaktanti). Suspenzije mogu sadržavati agense za suspendovanje kao što su etoksilisani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, guma tragakant i smeše od njih.

[0110]Lipozomi koji sadrže aktivni agens takođe mogu biti korišćeni za parenteralnu primenu. Lipozomi su generalno izvedeni iz fosfolipida ili drugih lipidnih supstnci. Kompozicije u obliku lipozoma mogu takođe sadržavati druge sastojke, kao što su stabilizatori, konzervansi, ekscipijenti i slično. Poželjni lipidi uključuju fosfolipide i fosfatidil holine (ledtine), i prirodne i sintetske. Metode formiranja lipozoma su poznate u tehnici. Videti, npr., Prescott (Ed.), Methods in Cell Biologv, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, New York (1976).

[0111]Farmaceutske kompozicije sadržavajući agens u dozama pogodnim za oralnu primenu mogu biti formulisane korišćenjem farmaceutski prihvatljivih nosača dobro poznatih u tehnici. Pripravci formulisani za oralnu primenu mogu biti u obliku tableta, pilula, kapsula, kesica, dražeja, pastila, tečnosti, gelova, sirupa, emulzija, eliksira, suspenzija ili praha. Za ilustraciju, farmaceutski pripravci za oralnu upotrebu mogu biti dobijeni kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim eksdpijentom, opciono mlevenjem dobijene smeše, i obradom smeše granula, posle dodavanja pogodnih pomoćnih supstanci po potrebi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeje. Oralne formulacije mogu upotrebiti tečne nosače slične po tipu koji su opisani za parenteralnu upotrebu, npr., puferisane vodene rastvore, suspenzije i slično.

[0112]Poželjne oralne formuladje uključuju tablete, dražeje i želatinske kapsule. Ovi pripravci mogu sadržavati jedan ili eksdpijente, koji uključuju, bez ograničenja: a) razblaživače, kao što su šećeri, uključujući laktozu, dekstrozu, saharozu, manitol, ili sorbitol; b) veziva, kao što su magnezijum aluminijum silikat, škrob iz kukuruza, pšenice, pirinča, krompira itd .; c) celulozne materijale kao što su metilceluloza, hidroksipropilmetil celuloza i natrijum karboksimetilceluloza, polivinilpirolidon, gume, kao što su gumiarabika i tragakant guma, i proteine, kao što su želatin i kolagen; d) agense za dezintegraciju ili rastvaranje, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, škrob, agar, alginska kiselina ili soli od njih, kao što je natrijum alginat, ili šumeće kompozicije; e) lubrikante, kao što je silicijum, talk, stearinska kiselina ili njene magnezijumova ili kalcijumova so i polietilen glikol; f) arome i zaslađlvači; d) agense za dezintegraciju ili rastvaranje, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, škrob, agar, alginska

kiselina ili

g) boje ili pigmenti, npr.,da se identifikuje produkt ili da se okarakteriše količina (doza) aktivnog jedinjenja; i

h) druge sastojke, kao što su konzervansi, stabilizatori, agensi za bubrenje, agensi za emulgovanje, promoteri

rastvora, soli za regulisanje osmotskog pritiska, i puferi.

[0113]Želatinske kapsule uključuju tzv. "push-fit "-dvodelne kapsule od želatina, kao i meke, hermetički zatvorene kapsule napravljene od želatina i omotača kao što je glicerol ili sorbitol. Tzv. "push-fit" -dvodelne kapsule mogu sadržavati aktivni sastojak (sastojke) pomešan sa filerima, vezivima, lubrikantima, i/ili stabilizatorima, itd. U mekim kapsulama, aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin ili tečni polietilen glikol sa ili bez stabilizatora.

[0114] Jezgradražeja se mogu obezbediti sa pogodnim omotačima kao što su koncentrovani rastvori šećera, koji mogu takođe sadržavati gumu arabiku, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titanijum dioksid, rastvore za lakiranje, i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača.

[0115]Farmaceutska kompozicija može biti obezbeđena kao so aktivnog agensa. Soli su više rastvorljive u vodenim ili drugim protonskim rastvaračima nego u odgovarajućim oblicima slobodne kiseline ili baze. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u tehnici. Jedinjenja koja sadrže ostatke kiseline mogu formirati farmaceutski prihvatljive soli sa pogodnim katjonima. Pogodni farmaceutski prihvatljivi katjoni uključuju, na primer, katjone alkalnih metala (npr., natrijuma ili kalijuma) i katjone zemnoalkalnih metala (npr., kalcijuma ili magnezijuma).

[0116] Jedinjenjastrukturne formule (I) i (II) koja sadrže osnovne delove grupe mogu formirati farmaceutski prihvatljive adicione soli sa pogodnim kiselinama. Na primer, Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1 (1977), opisuju farmaceutski prihvatljive soli u detalje. Soli mogu biti pripremljene in situ za vreme konačne izolacije i prečišćavanja jedinjenja prema pronalasku ili odvojeno, reagovanjem funkcije slobodne baze sa pogodnom kiselinom.

[0117]Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku su generalno poželjne u meodama iz pronalaska. Kao što se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljive soli" se odnosi na soli ili cviterionske forme jedinjenja strukturne formule (I) ili (II). Pogodni farmaceutski prihvatljivi katjoni uključuju katjone alkalnih metala (npr., natrijuma ili kalijuma) i katjone zemno alkalnih metala (npr., kalcijuma ili magnezijuma). Pored toga, farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja strukturne formule (I) ili (II) koje sadrže bazični centar su kisele adicione soli sa farmaceutski prihvatljivim kiselinama. Primeri kiselina koje mogu biti korišćene za formiranje farmaceutski prihvatljivih soli uključuju neorganske kiseline kao što su hlorovodonična, bromovodonična, sumporna i fosforna, i organske kiseline kao što su oksalna, maleinska, sukcinska, malonska, i limunska. Neograničavajući primeri soli jedinjenja prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, sulfat, bisulfat, 2-hidroksietansulfonat, fosfat, hidrogen fosfat, acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, butirat, kamforat, kamforsulfonat, citrat, diglukonat, glicerolfosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, format, sukcinat, malonat, fumarat, maleat, metansulfonat, mesitilensulfonat, naftilensulfonat, nikotinat, 2-naftalensulfonat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, trihloroacetat, trifiuoroacetat, glutamat, bikarbonat, paratoluensulfonat, undekanoat, laktat, citrat, tartrat, glukonat, benzen sulfonat, ii p-toluensulfonat soli. Pored toga, dostupne amino grupe prisutne u jedinjenjima iz pronalaska mogu biti kvatemizovane sa metil, etil, propil, i butil hloridima, bromidima, i jodidima; dimetil, dietil, dibutil, i diamil sulfatima; decil, lauril, miristil, i steril hloridima, bromidima, i jodidima; i benzil i fenetil bromidima.

[0118]U svetlu gore navedenog, bilo koje pozivanje na jedinjenja predmetnog pronalaska pojavljujući se ovde, je namenjeno da uključi farmaceutski prihvatljive soli, solvate, i kvaternarne derivate od njih.

[0119]Kompozicije koje sadrže jedinjenje prema pronalasku formulisano u farmaceutski prihvatljivom nosaču može biti pripremljeno, smešteno u odgovarajući spremnik, i označeno za lečenje naznačenog stanja. Prema tome, ovde se takođe razmatra članak o proizvodnji, kao što je spremnik koji sadrži dozni oblik jedinjenja predmetnog pronalaska, i oznaka sa uputstvima za upotrebu jedinjenja. Kompleti su takođe razmatrani. Na primer, komplet može sadržavati dozni oblik farmaceutske kompozicije i uputstvo za upotrebu koje sadrži instrukcije za upotrebu kompozicije u lečenju medicinskog stanja. U svakom slučaju, stanja naznačena na oznaci mogu uključivati lečenje inflamatornih poremećaja, kancera, i slično.

Metode primene inhibitora aktivnosti PI3K9

[0120]Farmaceutske kompozicuje koje obuhvataju inhibitor aktivnosti PI3K6 mogu biti primenjene na subjektu bilo kojom konvencionalnom metodom, uključujući parenteralne ili enteralne tehnike. Načini parenteralne primene uključuju one u kojima je kompoziciju potrebno dati osim kroz gastrointestinalni trakt, na primer, injekcijama intravenski, intraarterijski, intraperitonealno, intramedularno, intramuskulamo, intraartikularno, intratekalno, intraventrikularno. Enteralni načini primene uključuju, na primer, oralnu, bukalnu, sublingvalnu, i rektalnu primenu. Transepitelijalni načini primene uključuju, na primer, transmukoznu primenu i transdermalnu primenu. Transmukozna primena uključuje, na primer, enteralnu primenu kao i nazalnu, inhalacionu i primenu duboko u pluća; vaginalnu primenu; i bukalnu i sublingvalnu primenu. Transdermalna primena uključuje pasivne ili aktivne transdermalne ili transkutane načine, uključujući, na primer, flastere i uređaje za jontoforezu, kao i lokalnu primenu pasta, melema, ili masti. Parenteralna primena se može takođe ostvariti upotrebom tehnike visokog pritiska, npr., POVVDEPJECT<5>.

[0121]Hiruške tehnike uključuju implantaciju depoa (rezervoara) kompozicija, osmotskih pumpi i slično. Poželjan put primene za lečenje inflamacije može biti lokalna ili topikalna isporuka za lokalizovane poremećaje kao što je artritis, ili sistemska isporuka za distribuirane poremećaje, npr., intravenska isporuka za reperfuzionu povredu ili za sistemska stanja kao što je septikemija. Za druge bolesti, uključujući one koje se odnose na respiratorni trakt, npr., hroničnu opstruktivnu bolest pluća, astmu i emfizem, primena se može postići inhalacijom ili primenom duboko u pluća sprejevima, aerosolima, prahom i slično.

[0122]Za lečenje neoplastičnih bolesti, posebno leukemija i drugih distribuiranih kancera, uobičajeno je poželjna parenteralna primena. Biće poželjno da ih formulacije jedinjenja optimiziraju za biodistribuciju nakon parenteralne primene. Inhibitor PI3K5 jedinjenja može biti primenjen pre, za vreme ili nakon primene hemoterapie, radioterapije i/ili operacije.^

[0123]Štaviše, terapijski indeks inhibitora PI3K5 jedinjenja može biti povećan modifikovanjem ili derivatiziranjem jedinjenja za ciljanu isporuku u ćelije kancera eksprimirajući marker koji identifikuje ćelije kao takve. Na primer, jedinjenja mogu biti vezana za antitelo koje prepoznaje marker koji je selektivan ili specifičan za ćelije kancera, tako da se jedinjenja dovode u blizinu ćelija da bi mogla delovati lokalno, kao što je prethodno opisano (videti, na primer, Pietersz et al., Immunol. Rev., 129:57 (1992); Trail et al., Science, 261:212 (1993); i Rowlinson-Busza et al., Curr. Opin. Oncol., 4:1142 (1992)). Tumor-usmerena isporuka ovih jedinjenja pojačava terapijskii učinak, između ostalog, minimiziranjem potencijalnih nespecifičnih toksičnosti koje mogu biti posledica zračenja ili hemoterapije. U drugom aspektu, inhibitor PI3K5 jedinjenja i radioizotopa ili hemoterapijski agensi mogu biti konjugovani na isto anti-tumor antitelo.

[0124]Za lečenje koštanih poremećaja resorpcije ili poremećaja posredovanim sa osteoklastima, inhibitori PI3K5 mogu biti isporučeni bilo kojom pogodnom metodom. Fokalna primena može biti poželjna, kao putem intraartikularne injekcije. U nekim slučajevima, može biti poželjno da se sparuju jedinjenja za deo koji može da cilja jedinjenja na kosti. Na primer, inhibitor PI3K5 se može se vezati za jedinjenja sa visokim afinitetom za hidroksiapatit, koji je glavni sastojak kostiju. To se može postići, na primer, prilagođavajući metodu sparivanja tetraciklina razvijenu za ciljanu isporuku estrogena u kost (Orme etal, Bioorg. Med. Chem. Lett., 4((l):1375-80 (1994)).

[0125]Da bi bili efikasni terapijski u moduliranju ciljeva centralnog nervnog sisatema, agensi bi trebalo da lako prodiru kroz moždanu krvnu barijeru kada se periferno primenjuju. Jedinjenja koji se ne mogu da prodru kroz krvno moždanu barijeru, međutim, ipak se mogu efikasno davati intravenskim putem.

[0126]Kao što je navedeno iznad, karakteristike samog agensa i formulacija agensa mogu delovati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo, i brzinu klirensa in vivo primenjenog agensa. Takve farmakokinetičke i farmakodinamičke informacije mogu biti prikupljene putem predkliničkih in vitro i in vivo ispitivanja, kasnije potvrđenih kod ljudi tokom kliničkih ispitivanja. Tako, za bilo koje jedinjenje korišćeno u metodama pronalaska, terapijski efikasna doza se može početno proceniti iz biohemijskih i/ili testova baziranih na ćelijama. Zatim, doza može biti formulisana u životinjskim modelima da se postigne željena cirkulišuća koncentracija raspona koja modulira ekspresiju PI3K5 ili aktivnost. Kako se sprovode klinička ispitivanja dalje informacije će se pojaviti u vezi odgovarajućih nivoa doza i trajanja lečenja za različite bolesti i stanja.

[0127]Toksičnost i terapijska efikasnost takvih jedinjenja može biti određena standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LDSo(letalna doza kod 50% populacije) i ED50 (terapijski efikasna doza kod 50% populacije). Odnos doza između toksičnih i terapijskih efekata je "terapijski indeks" koji je opično izražen kao odnos LDso/EDso. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju velike terapijske indekse, tj., toksična doza je suštinski veća od efikasne doze. Podaci dobijeni iz takvih ispitivanja ćelijskih kultura i dodatnih ispitivanja na životinjama mogu biti korišćeni u formulisanju raspona doze za upotrebu kod ljudi. Doza takvih jedinjenja je poželjno unutar raspona đrkulišućih koncentracija koje uključuju ED50sa malo ili bez toksičnosti.

[0128]U skladu sa predmetnim pronalaskom, može biti upotrebljen bilo koji efikasni režim primene koji reguliše vreme i ređosled doza. Jedinjenja i farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u postojećem pronalasku uključuju one u kojima je aktivni sastojak primenjen u efikasnoj količini da se postigne nameravana svrha. Specifičnije, "terapijski efikasna količina" označava količinu koja je dovoljna da modulira ekspresiju ili aktivnost PI3K5, i samim tim leči pojedinca koji boluje odi indikacije, ili da ublaži postojeće simptome indikacije. Određivanje terapijski efikasne količine je u okviru sposobnosti stručnjaka u ovom području tehnike, posebno s obzirom detaljnog otkrića obezbeđenog ovde.

[0129]Primeri nivoa doza kod ljudskog subjekta su reda veličine od oko 0.001 miligram aktivnog agensa po kilogramu telesne težine (mg/kg) do oko 1000 mg/kg. Obično, dozne jedinice aktivnog agensa sadrže od oko 0.01 mg do oko 1000 mg, poželjno od oko 0.1 mg do oko 100 mg, u zavisnosti od indikacije, puta primene, i ozbiljnosti stanja, na primer. U zavisnosti od puta primene, pogodna doza se može izračunati prema teiesnoj težini, površini tela ili veličini organa. Konačni režim doziranja je određen od strane nadležnog lekara u pogledu dobre medicinske prakse, s obzirom na različite faktore koji modifikuju delovanje lekova, npr., specifičnu aktivnost jedinjenja, identitet i ozbiljnost stanja bolesti, način reagovanja pacijenta, starost, stanje, telesnu težinu, pol i način ishrane pacijenta, i ozbiljnost svake infekcije. Dodatni faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju vreme i učestalost davanja, kombinacije leka, reakciju osetljivosti, toleranciju/odgovor na terapiju. Dalje podešavanje odgovarajuće doze za lečenje koje uključuje bilo koju od ovde pomenutih formulacija se vrši rutinski od strane iskusnog stručnjaka bez nepotrebnog eksperimentisanja, posebno s obzirom informacije o doziranju i otkrivenim analizama, kao i farmakokinetičkim podacima posmatranim u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Odgovarajuće doze se mogu utvrditi pomoću uspostavljenih testova za određivanje koncentracije agensa u teiesnoj tečnosti ili drugog uzorka zajedno sa podacima odgovora na dozu.

[0130]Učestalost doziranja zavisi od farmakokinetičkih parametara agensa i puta primene. Doza i primena su prilagođene da obezbede dovoljne nivoe aktivnog dela ili da bi se održao željeni efekat. Prema tome, farmaceutske kompozicije mogu biti davane u jednoj dozi, višestrukim diskretnim dozama, kontinuiranoj infuziji, sa produženim oslobađanjem iz depoa ili kombinacijom od njih, što je potrebno za održavanje željenog minimalnog nivoa agensa. Kratko delovanje farmaceutskih kompozicija (t.j. kratko vreme poluraspada) može biti primenjeno jednom dnevno ili više puta dnevno (npr., dva, tri, ili četiri puta dnevno). Dugo delovaanje farmaceutskih kompozicija može biti primenjeno svaka 3 do 4 dana, svake nedelje, ili jednom svake dve nedelje. Pumpe, kao što su supkutane, intraperitonealne ili subduralne pumpe, mogu biti korišćene za kontinuiranu infuziju.

[0131]Sledeći primeri su obezbeđeni da dalje pomažu u razumevanju pronalaska, te pretpostavljaju razumevanje kovencionalnih metoda koje su dobro poznate prosečnim stručnjacima sa ovog područja tehnike na koje se primeri odnose, na primer, izgradnju vektora i plazmida, inserciju gena koji kodiraju polipeptide u takve vektore i plazmide, ili uvođenje vektora i plazmida u ćelije domaćina. Takve metode su opisane detaljno u brojnim publikacijama uključujući, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press (1989), Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); and Ausubel et al. (Eds.), Short Protocols in Molecular Biologv, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc. (1999). Određeni materijali i stanja opisani u nastavku teksta su namenjeni da ilustruju određene aspekte pronalaska i ne trebaju se smatrati da ograničavaju njegov razuman obim.

PRIMER 1

Priprema i Prečišćavanje Rekombinantnog PI3Ka, B, i 5

[0132]Rekombinantni PI3K heterodimerni kompleksi koji se sastoje od PllO katalitičkih podjedinica i p85 regulatorne podjedinice su prekomerno eksprimirani korišćenjem BAC-TO-BAC<®>HT ekspresionog sistema bakulovirusa (GIBCO/BRL), zatim prečišćeni za upotrebu u biohemijskim analizama. Četiri klase I PI 3-kinaza su klonirane u vektore bakulovirusa kako sledi: pllOd: FLAG^-označena verzija humanog pllO 5 (SEQ ID NOS: 1 i 2) (videti Chantry et al., J. Biol. Chem., 272:19236-41 (1997)) je subklonirana korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNA u BamHl-Xbal mestu ekspresionog vektora pFastbac HTb ćelije insekta (Ufe Technologies, Gaithersburg, MD), tako da je klon bio u okviru sa His tagom vektora. FLAG<®>sistem je opisan u U.S. Patent Nos. 4,703,004; 4,782,137; 4,851,341; i 5,011,912, i reagensi su dostupni od Eastman Kodak Co. pllOa: Slično metodu korišćenom za pllO 5, opisanom iznad, FLAG<®->označena verzija od pllO a (videti Volinia et al., Genomics, 24(3):427-77 (1994)) je subklonirana u BamHl-Hindlll mestima od pFastbac HTb (Life Technologies) tako da je klon bio u okviru sa His tagom vektora. pllOB: A pllO 8 (videti Hu et al., Mol. Cell. Biol., 13:7677-88 (1993)) klon je pojačan iz humanog MARATHON® Spremna biblioteka cDNA slezene (Clontech, Palo Alto CA) prema protokolu proizvođača korišćenjem sledećih prajmera: 5 'prajmer je napravljen da sadrži FLAG<*>oznaku u okviru sa pllOB sekvencom. Nakon amplifikacije, fLAG* pl 10 6 sekvenca je subklonirana korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika u EcoRl-Notl mestima pFastbac HTa (LifeTechnologies), tako da je klon u okviru sa His tagom vektora.

[0135]pllOy: pll0y cĐNA (videti Stoyanov et al., Science, 269:690-93 (1995)) je amplificiran iz ljudske Marathon Ready slezine cDNA biblioteke (Clontech) prema protokolu proizvođača korišćenjem sledećih prajmera:

FLAG<®>tag je naknadno povezan na 5' kraj od pllO y sekvence i kloniran u BamHl-Spel mestima od pFastbac HTb (Life Technologies) korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNA, sa FLAGS:-110 y sekvence u okviru sa His tagom vektora.

[0138]p8So: BamHl-EcoRl fragment od FLAG<*->označen p85 cDNA (videti Skolnik et al., Cell, 65:83-89 (1991)) je subkloniran u BamHl-EcoRl mesta dvojnog vektora pFastbac (Life Technologies).

[0139]Rekombinantni bakulovirusi koji sadrže gore navedene klonove su generisani korišćenjem protokola preporučenog proizvođača (Life Technologies). Bakulovirusi eksprimirajući i His-označenu pllOa, pllOB ili pll05 katalitičku podjedinicu i p85 podjedinicu su zajedno inficirani u ćelije insekta Sf21. Da se obogati heterodimerni enzimski kompleks, višak količine bakulovirusa eksprimirajući p8S podjedinicu je zaražen i His-oznaČena PllO katalitička podjedinica u kompleksu sa p85 je prečišćena na koloni sa afinitetom nikla. Pošto se pllOy ne povezuje sa p85, Sf21 ćelije su zaražene sa rekombinantnim bakulovirusima eksprimirajući samo His-označenu pllOy. U alternativnom pristupu, plOl može biti kloniran u bakulovirus, da se omogući koekspresija sa njegovim poželjnim vezujućim partnerom pllOy.

[0140]72 sata post-inficirane Sf21 ćelije (3 litre) su sakupljene i homoge nizova ne u hipotoničnom puferu (20 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 5 mM KCI, kompletnom koktelu inhibitora proteaze (Roche Biochemicals, Indianapolis, IN), korišćenjem tzv." Dounce" homogenizatora. Homogenati su centrifugirani na 1,000 x g tokom 15 minuta. Supernatanti su nakon toga centrifugirani na 10,000 x g tokom 20 minuta, praćeni centrifugiranjem na 100,000 x g tokom 60 min. Rastvorljiva frakcija je odmah sipana u 10 mL HITRAP<®>kolonu sa afinitetom nikla (Pharmacia, Piscataway, NJ) koja je uravnotežena sa 50 mL Pufera A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 0.5 M NaCI, 10 mM imidazol). Kolona je detaljno oprana sa puferom A, i eluirana sa linearnim gradijentom od 10-500 mM imidazola. Slobodna p85 podjedinica je uklonjena sa kolone tokom koraka ispiranja i samo je heterodimerni enzimski kompleks eluiran na 250 mM imida20la. Frakcije alikvota od nikla su analizirane putem 10% SDS-poliakrilamidne gel elektroforeze (SDS-PAGE), obojene sa SYPRO<s>Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), i kvanu'fikovane sa STORM® Phospholmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Aktivne frakcije su spojene i direktno sipane u 5 mL Hi-Trap Heparin kolonu pre izjednačenja sa puferom B koji sadrži 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCI, 2 mM ditiotreitola (DTT). Kolona je isprana sa 50 mL pufera B i eluirana s linearnim gradijentom od 0.05-2 M NaCI. Jedan pik-maksimum koji sadrži PI3K enzimski kompleks je eluiran na 0.8 M NaCI. SDS-poliakrilamid gel analiza je pokazala da prečišćene PI3K enzimske frakcije sadrže l:i stehiometrijskog kompleksa od PllO i p85 podjedinica. Profil protein enzimskog kompleksa za vreme heparin hromatografije odgovara onoj aktivnosti lipida kinaze. Aktivne frakcije su sipane i zamrznute u tečnom azotu.

PRIMERI 2- 6

[0141]Zato što je PI3KS izražen u značajnim nivoima u leukocitima, važno je proučiti efekte selektivnog inhibitora PI3K5 na funkcije leukocita. Prema tome, ispitani su efekti inhibicije PI3K 5 kod nekoliko tipova leukocita. Ispitivani su neutrofili da se odrede efekti koje selektivna inhibicija PI3K6 može izazvati (Primer 2, ispod). Iznenađujuće je pronađeno da se selektivna inhibicija aktivnosti PI3K6 javlja značajno povezana sa inhibicijom nekih, ali ne svih karakterističnih funkcija aktivisanih neutrofiia. Pored toga, efekti inhibicije PI3K5 na funkcije B ćelije i T-ćelije takođe su ispitani (Primeri 3-4, ispod). Šta više, kako je PI3K5 takođe izražen u osteoklastima, efekat inhibicije PI3K5 na funkciju ovih specijalizovanih ćelija je ispitan (Primer 5, ispod).

PRIMER 2

Karakterizacija uloge PI3K8 u funkciji neutrofiia

[0142]Efekti inhibitora PI3K 5 prema pronalasku na funkcije neutrofiia kao što su generisanje superoksida, egzoritoza elastaze, hemotaksa i uništavanje bakterija mogu biti testiratni.

A. Priprema neutrofiia iz humane krvi

[0143]Alikvoti (8 mL) heparinizovane krvi od zdravih dobrovoljaca su naneti na 3 mL jastučiće od 7.3% FTCOLL"

(Sigma, St. Louis, MO) i 15.4% HYPAQUE<f*>(Sigma) i centrifugirani na 900 rpm tokom 30 min na sobnoj temperaturi u stolnoj centrifugi (Beckman). Neutrofilom-bogata traka iznad FICOLL<®->HYPAQUE<®>jastučića je sakupljena i isprana sa Hankovim balansiranim rastvorom soli (HBSS) koji sadrži 0.1% želatina. Rezidualni eritrociti su uklonjeni hipotoničnom lizom sa 0.2% NaCI. Pripravak neutrofiia je ispran dva puta sa HBSS koji sadrži 0.1% želatina i odmah je korišcen.

B. Merenie podukci je superoksida iz neutrofiia

[0144]Generisanje superoksida je jedno od obeležja aktivacije neutrofiia. Mnoštvo aktivatora potencira stvaranje superoksida od strane neutrofiia. Meren je efekat predmetnog inhibitora PI3K5 na stvaranje superoksida pomoću tri različita agonista: TNFla, IgG i fMLP, od kojih svaki predstavlja zasebnu klasu aktivatora. Generisani superoksid neutrofiia je meren praćenjem promene apsorpcije nakon redukcije citohroma C modifikacijom metode opisane od Green et al., (pp. 14.5.1-14.5.11 in Supp. 12, Curr. Protocols Immunol. (Eds., Colligan et al.) (1994)), kao što sledi. Pojedinačni bunarčići od 96 bunarčića mikrotitarske ploče su prevučeni preko noći na 4°C sa 50 uL od2mg/rnL rastvora humanog fibrinogena ili IgG. Bunarčići su isprani sa PBS i sledeći reagensi su dodati u svaki bunarčić: 50 uL od HBSS ili superoksid dismutaza (1 mg/mL), 50 ul od HBSS ili TNFlo (50 ng/mL), 50 uL citohroma C ( 2.7 mg/mL) i 100UL prečišćene humane neutrofilne suspenzije (2 x lO'ćelija/mL). Ploča je centrifugirana tokom 2 min na 200 rpm, i apsorpcija na 550 nm je praćena tokom 2 sata. Da se izmeri relativna količina stvorenog superoksida, dobijene vrednosti iz superoksid dismutaze-koja sadrži bunarčiće su oduzete od svih, i normalizovane na vrednosti dobijen iz bunarčića bez bilo kakvog inhibitora.

[0145]Jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju TNF-indukovani superoksid generisanjem neutrofiia na način zavisan od koncentracije. Pored toga, generisanje superoksida indukovano od strane IgG nije značajno inhibirano jedinjenjima predmetnog pronalaska.

[0146]Efekat jedinjenja predmetnog pronalaska na stvaranje superoksida indukovanog od strane drugog potentnog induktora, bakterijskog peptida formilovanog-Met-Leu-Phe (fMLP), može takođe biti istražen. Kao stvaranjeTNF-indukovanog superoksida, fMLP-indukovani superoksid je takođe inhibiran jedinjenjima predmetnog pronalaska. Ovi rezultati pokazuju da inhibitor PI3K5 jedinjenja predmetnog pronalaska može sprečiti indukciju specifičnog stimulansa superoksida stvaranjem neutrofiia, što ukazuje da je PI3K6 uključen u ovaj proces.

C. Merenie egzocitoze elastaze iz neutrofiia

[0147]Pored stvaranja superoksida, aktivirani neutrofili takođe reaguju oslobađanjem nekoliko proteaza koje su odgovorne za uništavanje tkiva i hrskavice za vreme inflamacije. Kao pokazatelj oslobađanja proteaze, efekat predmetnog jedinjenja na egzocitozu elastaze je izmeren. Egzođtoza elastaze je kvantifikovana modifikacijom procedure opisane od Ossanna et al. (J. Clin. Invest, 77:1939-51 (1986)), kako sledi. Prečišćeni humani neutrofili (0.2 x 10<s>) (tretirani i sa DMSO ili serijsko razblaženo predmetno jedinjenje u DMSO) su stimulisani sa fMLP u PBS koji sadrži 0.01 mg/mL citohalasina B, 1.0 uM natrijum azida (NaN3), 5 ug/mL L-metionina i 1 uM fMLP tokom 90 min na 37°C u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarića. Na kraju perioda inkubacije, ploča je centrifugirana tokom 5 min na 1000 rpm, i 90 uL supernatanta je preneseno u 10 pL od 10 mM rastvora supstrata peptid elastaze, MeO-suc-Ala-Ala- Pro-val-pNA, pri čemu MeO-suc=metoksi-sukdnil; pNA=p-nitroanilid (Calbiochem, San Diego, CA). Apsorpcija na 410 nm je praćena tokom 2 sata u čitaču mikrotitarske ploče sa 96 bunarića. Da se izmeri relativna količina agzocitoze elastaze, sve vrednosti apsorpcije su normalizovane na vrednosti bez bilo kakvog inhibitora. PI3K 5 inhibitor jedinjenja predmetnog pronalaska inhibira fMLP-značajno indukiovanu egzocitozu elastaze, i to na način koji zavisi od doze.

D. Merenie fMLP- indukovane humane migracije neutrofiia

[0148]Neutrofili imaju bitnu sposobnost da migriraju kroz tkiva, i jedan su od prvih tipova ćelija za dolazak na mesta inflamacije ili povrede tkiva. Izmeren je efekat predmetnih jedinjenja na migraciju neutrofiia prema koncentracionom gradijentu fMLP. Dan pre nego što su izvedeni testovi migracije, 6 bunarića na mikroktitarskim pločama je obloženo sa rekombinantnim ICAM-l/Fc fuzionim proteinom (Van der Vleren et al., Immunitv, 3:683-90 (1995)) (25 pg/mL u bikarbonatnom puferu, pH 9.3) i ostavljeno preko noći na 4°C. Posle ispiranja, 1% rastvora agaroze, u RPMM640 sa 0.5% albumina goveđeg seruma (BSA), je dodato u bunariće sa ili bez inhibitora, i ploče su smeštene u frižider pre probijanja otvora u želatiniziranu agarozu da se stvore plakovi (1 centralni otvor okružen sa 6 perifernih po bunariću).

[0149]Humani neutrofili su dobijeni kao što je opisano iznad i ponovo suspendovani u RPMI medijumu obogaćenom sa 0.5% BSA na 5 x IO<6>ćelija/mL. Posle kombinovanja jednakih zapremina neutrofilne suspenzije i medijuma (bilo sa DMSO ili serijskim razblaženim testiranim jedinjenjem u DMSO), neutrofili su podeljeni na jednake delove u perifernie otvore, dok je cen- tralni otvor primio fMLP (5 uM). Ploče su inkubirane na 37°C u prisustvu 5% C02tokom 4h, nakon čega sledi prestanak migracije dodatkom 1% rastvora glutaraldehida u D-PBS. Posle uklanjanja agaroznog sloja, bunarići su isprani sa đestilovanom vodom i osušeni.

[0150]Analiza migracije neutrofiia se sprovodi na Nikon DIAPHOT' obrnutom mikroskopu (lx objektiv) video radnog mesta korišćenjem programa NIH 1.61. Korišćenjem Microsoft Excel i Table Curve 4 (SSPS Inc., Chicago IL) programa, đobijen je indeks migracije za svako od ispitivanih stanja. Indeks migracije je definisan kao oblast ispod krive predstavljajući broj migriranih neutrofiia u odnosu na mrežastu udaljenost migracije po ćeliji.

[0151]PI3K5 inhibitor jedinjenja predmetnog pronalaska ima uticaj na migraciju neutrofiia, inhibirajući ovu aktivnost na način zavisan od doze.

E. Merenie baktericidnog kapaciteta neutrofiia

[0152]S obzirom da PI3K6 inhibitor jedinjenja predmetnog pronalaska deluje na određene funkcije neutrofiia, bilo da jedinjenja utiču na neutroftl- posredovano uništavanje bakterija je od interesa. Efekat jedinjenja na neutrofil-povezano uništavanje Stafilokokus aureusa je proučavano prema metodi opisanoj od Clark and Nauseef (pp. 7.23.4-7.23.6 in Vol. 2, Supp. 6, Curr. Protocols Immunol. (Eds., Colligan et al.) (1994)). Prečišćeni humani neutrofili (5 x 10<s>ćelija/mL) (tretirani bilo sa DMSO ili serijski razblaženim predmetnim jedinjenjem u DMSO-u) su pomešani sa autolognim serumom. Preko noći zasađene ćelije S. aureus su isprane, resuspendovane u HBSS, i dodate u serum opsonizovanih neutrofiia u odnosu 10: 1. Neutrofili se ostavljeni da intemaliziraju bakterije fagocitozom inkubiranjem na 37°C tokom 20 minuta. Neinternalizirane bakterije su uništene sa 10 jedinica/mL lizostafina na 37°C tokom 5 minuta, i ukupna smeša je rotirana na 37°C. Uzorci su povučeni u razliđtim vremenima do 90 minuta i neutrofili su lizirani razbla živa njem u vodi. Bakterije sposobne za život su brojene nanošenjem odgovarajućih razblaživača na Triptikaza-soja-agar ploču i brojanjem S. aureus kolonija nakon rasta preko noći.

[0153]Uništavanje S. aureusa posredovano neutrofilima je slično u uzorcima tretiranim sa DMSO (kontrola) i sa predmetnim jedinjenjem. Dakle, PI3K5 inhibitor ne utiče značajno na sposobnost neutrofiia da uništi S. aureus, što upućuje da PI3K6 nije uključen u ovom putu funkcije neutrofiia.

PRIMER 3

Karakterizacija uloge PI3KS u funkciji B limfocita

[0154]Efekti inhibitora PI3-kinaze na funkcije B ćelije, uključujući klasične indekse kao što su proizvodnja antitela i specifična proliferacija-indukovana stmulansom su takođe proučavani.

A. Priprema i stimulacija B ćelija iz periferne humane krvi

[0155]Heparinizovana krv (200 mL) od zdravih dobrovoljaca je pomešana sa jednakom zapreminom D-PBS, nanesenom na 10 x 10 mL FICOLL-PAQUE<!*>(Pharmacia), i centrifugirana na 1600 rpm tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su prikupljeni iz FICOLL<*>/seruma interfejs, postavljene na 10 mL seruma goveđeg fetusa (FBS) i centrifugirane na 800 rpm tokom 10 min da se uklone trombociti. Posle ispiranja, ćelije su inkubirane sa DYNAL<®>Antibodv Mix (B ćelijski komplet) (Dynal Corp., Lake Success, NY) tokom 20 min na 4-8°C. Nakon uklanjanja nevezanog antitela, PBL su pomešani sa anti-mišjim IgG prevučenim magnetnim kuglicama (Dynal) tokom 20 min na 4-8°C uz lagano mućkanje i zatim eliminacijom obeleženih ne-B-ćelija na magnetskom separatom kuglice. Ova procedura je ponovljena još jednom. B ćelije su resuspendovane u RPMI-1640 sa 10% FBS, i držane na ledu do dalje upotrebe.

B. Merenje proizvodnje antitela od strane humanih B ćelija

[0156]Da se prouči proizvodnja antitela, B ćelije su podeljene u alikvote u 50-75 x 10<3>ćelija/ bunariću u 96 bunarića na mikrotitarskoj ploči sa ili bez inhibitora, na koju se IL-2 (100 U/ml) i PANSORBIN® (Calbiochem) Stafilokokus aureus ćelije (1 : 90.000) dodate. Deo medijuma je uklonjen nakon 24-36h, i sveži medijum (sa ili bez inhibitora) i IL-2 je dodat. Kulture su inkubirane na 37°C, u prisustvu COjinkubatora za dodatnih 7 dana. Uzorci za svako stanje (u triplikatu) su uklonjeni, i analizirani za IgG i IgM, što je mereno ELIZA testom. Ukratko, IMMULON* 4 96-bunarića mikrotitarskih ploča su prevučene (50 pL/bunariću) bilo sa 150 ng/mL magarećeg antihumanog IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove PA), ili 2 ug/mL magarećeg antihumanog IgG + IgM (H + L) (Jackson ImmunoResearch) u bikarbonatnom puferu, i ostavljeni preko noći na 4°C. Nakon ispiranja tri puta sa fosfatnim puferisanim slanim rastvorom koji sadrži 0.1% TWEEN<®->80 (PBST) (350 pL/bunariću), i blokiranja sa 3% kozjim serumom u PBST (100 uL/bunariću) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, uzorci (100 mL/bunariću) B ćelije razblaženi u iskorišćenom medijumu u PBST su dodati. Za IgG ploče raspon razblaženja je 1: 500 do 1: 10000, i za IgM 1:50 do 1: 1000. Posle 1 sata, ploče su izložene biotin-konjugovanom antihumanom IgG (100 ng/mL) ili antihumanom IgM (200 ng/mL) (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 min, nakon čega sledi streptavidin-HRP (1; 20000) tokom 30 min, i konačno, TMB rastvoru (1: 100) sa HJOi(1: 10000) tokom 5 min, sa 3 x PBST ispiranja između koraka. Razvijanje boje je zaustavljeno pomoću rastvora H2SO4, i ploče su očitane na EUZA čitaču ploča.

[0157]Jedinjenja iz predmetnog pronalaska inhibiraju produkciju antitela.

C.Merenje B ćelijske proliferacije u od<g>ovoru IgM stimulacije na p ovršini ćelije

[0158]U gore navedenom eksperimentu, B ćelije su stimulisane korišćenjem PANSORBIN<*.>Efekat jedinjenja predmetnog pronalaska na odgovor B ćelijske proliferacije kada su stimulisane preko njihove ćelijske površine IgM korišćenjem anti-IgM antitela je takođe izmeren. Mišje ćelije slezene (Balb/c) su stavljene u mikrotitarske pločice sa 96 bunarića na 2 x 10<5>ćelija po bunariću u 10% FBS/RPMI. Odgovarajuća razblaženja testiranog inhibitora u kompletnom medijumu su dodata ćelijama i ploče su inkubirane tokom 30-60 minuta pre dodatka stimulansa. Prateći prethodnu inkubaciju sa testnim inhibitorom, pripremu F(ab')2kozjeg antitela specifično za p-lanac miša IgM je dodat u bunariće u konačnoj koncentrađji od 25 ug/mL. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 3 dana i 1 pCi od [<3>H]- timidina je dodat u svaki bunarić za poslednja četiri sata kulture. Ploče su sakupljene na vlakbaste filtere, isprane, i inkorporacija radioaktivnog obeleživača je određena korišćenjem beta brojača (Matrix 96, Packard Instrument Co., Dovvners Grove, IL) i izražena kao brojanje po minuti (CPM).

[0159]Jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju anti-IgM-stimulisanu B ćelijsku proliferaciju na način koji zavisi od doze. Zato što jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju proliferaciju B ćelija, predviđeno je da ova jedinjenja i drugi PI3K5 inhibitori mogu biti korišćeni za supresiju nepoželjne proliferacije B ćelija u kliničkim uslovima. Na primer, kod maligniteta u B ćelijama, B ćelije u različitim fazama diferencijacije pokazuju neregulisanu proliferaciju. Na temelju rezultata prikazanih iznad, može se zaključiti da se selektivni inhibitori PI3K5 mogu koristiti za kontrolu, ograničenje ili inhibiraju rasta takvih ćelija.

PRIMER 4

Karakterizacija uloge PI3K9 u funkciji T Limfocita

[0160]Merena je proliferacija T ćelija kao odgovor na kostimulaciju CD3+CD28. T ćelije su prečišćene iz krvi zdravih ljudi putem negativne selekcije korišćenjem antitelo obložene magnetske kuglice prema protokolu proizvođača (Dynal) i resuspendovane u RPMI. Ćelije su tretirane bilo sa DMSO ili serijskim razblaženjem predmetnog jedinjenja u DMSO, i stavljene su po 1 x 10<s>ćelija/bunariću na ploču sa 96 bunarića prethodno prevučenim sa kozjim anti-mišjim IgG. Mišja monoklonalna anti-CD3 i anti-CD28 antitela su zatim dodata u svaki bunarić za 0.2 ng/mL i 0.2 ug/ml, respektivno. Ploča je inkubirana na 37°C tokom 24 sata, i [<3>H]-timidin (1 pCi /bunariću) je dodat. Nakon druge inkubacije od 18 sati, ćelije su sakupljene sa automatskim sakupljačem ćelija, isprane, i inkorprisana radioaktivnost je kvantifikovana.

[0161]Iako predmetni PI3K5 inhibitor jedinjenja inhibira anti-CD3- i anti-CD28-indukovanu proliferaciju Tćelija, efekat nije tako jak kao efekat na B ćelije ili na neke od funkcija neutrofiia. Prema tome, predmetna jedinjenja nisu toksična za ćelije generalno.

PRIMER 5

Karakterizacija uloge PI3K5 u funkciji Osteoklasta

[0162]Da se analizira efekat predmetnih PI3K6 inhibitora jedinjenja na osteoklaste, mišje ćelije koštane srži su izolovane i diferencirane na osteoklastima putem tretiranja ćelija sa Makrofagnim Stimulišućim Faktorom Kolonije 1 (mCSF-1-1) i Osteoprotegerin^Ligandom (OPGL) u medijumu koji sadrži serum, tj. (oMEM sa 10% toplotno inaktivisani FBS, Sigma) tokom 3 dana. Četvrtog dana, kada su se razvili osteoklasti, medijum je uklonjen i ćelije su prikupljene. Osteoklasti su zasejani na preseke dentina na 105 ćelija/bunariću u medijumu za rast, tj., aMEM koji sadrži 1% seruma i 2% BSA sa 55 ug/mL OPGL i 10 ng/mL mCSF Posle 3 sata, medijum je promenjen na 1% seruma i 1% BSA, sa ili bez osteopontina (25 ug/ml) i inhibitora PI3K (100 nM). Medijum je menjan svaka 24 sata sa svežim osteopontinom i inhibitorima. Na 72 sata, medijum je uklonjen i dentinske površine su isprane sa vodom da bi se uklonili ostaci ćelija i obojili sa hematoksilin kiselinom. Višak mrlja je ispran i dubine jama su kvantifikovane korišćenjem konfokalne mikroskopije.

[0163]Predmetni inhibitori PI3-kinaze imali su inhibitorni efekat na funkciju osteoklasta. Oba nespecifična inhibitora LV294002 i vortmanin su inhibirali aktivnost osteoklasta. Međutim, predmetni PI3K5 inhibitor jedinjenja je imao veći efekat, i u nekim slučajevima je skoro potpuno inhibirana aktivnost osteoklasta.

PRIMER 6

Karakterizacija uloge PI3K5 u bazofilnoj funkciji

[0164]Procena efekta jedinjenja pronalaska na funkciju bazofila je testirana, korišćenjem konvencionalnog testa oslobađanja histamina, generalno u skladu sa metodom opisanom u Miura et al., 1 Immunol., 162:4198-206 (1999). Ukratko, obogaćeni bazofili su prethodno inkubirani sa testnim jedinjenjima u razliatim koncentracijama od 0.1 nM do 1.000 nM tokom 10 minuta na 37°C. Zatim, poliklonalni kozji antihumai IgE (0.1 ug/mL) ili fMLP je dodat, i ostavljen da se inkubira tokom dodatnih 30 minuta. Oslobođeni histamin u supernatantu je izmeren korišćenjem automatizovane fluorometrijske tehnike.

[0165]Smanjenje oslobađanja histamina zavisno od doze je uočeno za predmetna jedinjenja, kada su bazofili stimulisani sa anti-IgE. Ova supresija oslobađanja histamina je u suštini 100% na 1.000 nM. Predmetno jedinjenje nije izazvalo nikakav efekat kada su bazofili stimulisani sa fMLP. Poređenja radi, neselektivni PI3K inhibitor LY294002 je testiran na 0.1 nM i 10.000 nM, pokazujući gotovo 100% inhibiciju oslobađanja histamina pri najvećoj koncentraciji.

[0166]Ovo ukazuje da predmetni inhibitori PI3K5 aktivnosti mogu biti korišćeni za supresiju oslobađanja histamina, koji je jedan od medijatora alergije. Pošto su aktivnosti različitih PI3-kinaza potrebne za promet proteina, lučenje, i egzocitozu u mnogim tipovima ćelije, iznad se sugeriše da oslobađanje histamina od strane drugih ćelija, kao što su mastociti, takođe može biti prekinuto putem delta-selektivnih inhibitora PI 3-kinaze.

PRIMERI HEMDSKE SINTEZE

[0167]Specifični neograničavajući primeri su prikazani ispod. U tehnici se podrazumeva da zaštitne grupe mogu biti korišćene gde je to potrebno u skladu sa opštim principima sintetičke hernije. Ove zaštitne grupe se uklanjaju u završnim korađma sinteze pod baznim, kiselim ili hidrogenol'rtičkim uslovima očiglednim stručnjacima u ovom području tehnike. Korišćenjem odgovarajuće manipulacije i zaštite prema bilo kojim hemijskim funkcijama, sinteza jedinjenja strukturne formule (I) ili (II) koje nisu specifično postavljene ovde mogu biti ostvarene putem metoda analognih sa šemama i prikazanim sintetičkim procedurama koje su postavljene ispod.

[0168]Osim ako nije drugačije naznačeno, svi polazni materijali su dobijeni od komercijalnih dobavljača i upotrebljeni bez daljeg prečišćavanja. Sve reakcije i hromatografske frakcije su analizirane putem tankoslojne hromatografije (TLC) na 250 mm pločama silika gela, vizuelizirane sa ultraljubičastim (UV) svetlom ili mrljom joda (L). Produkti i intermedijeri su obično prečišćeni fleš hromatografijom ili reverznom-fazom tečne hromatografije visokih performansi.

[0169]Sledeće skraćenice su korišćene u sintetičkim primerima: aq (vodeni), h (sat), min (minuta), sat'd (zasićen), eq (ekvivalenti), THF (tetrahidrofuran), RT (sobna temperatura), EtN (trietilamin), Zn (cinkov metalni prah), n-BuOH (n-butil alkohol), n-BuLi (n-butil litijum), t-BuOH (tercijarni butil alkohol), NaCI (natrijum hlorid), MgSOi(magnezijum sulfat) BOC(C(=0) OtBu), CDCI3(deuterzovani hloroform), MtBe (metil terc-butil etar), HzO (voda), CHCI3(hloroform), HCI (hlorovodonična kiselina), MeOH (metanol), NaOH (natrijum hidroksid), NaOMe (natrijum metoksid), TFA (trifluorosirćetna kiselina), K2CO3(kalijum karbonat), SOCIj(tionil hlorid), CH3CI2(metilen hlorid), EtOAC (etil acetat), DMF (dimetilformamid), EtOH (etanol), DMSO (dimetil sulfoksid), NaHCOj(natrijum bikarbonat), TLC (tankoslojna hromatografija), HPLC (tečna hromatografija visokih performansi), elektrosprej ionizacija-masena spektrometrija (ESI-MS) ili MS (ES), HOBT (hidroksibenzotriazol), EDC (etildietilaminopropilkarbodiimid), DIEA (diizopropiletilamin), HOAc (sirćetna kiselina), ACCUFLUOR<®>NFSi (N-fluorobis(fenilsulfonil) amin), i druge, slične standardne skraćenice su korišćene ovde.

PRIMER 7(Referenca)

PRIPREMA INTERM EDDARNIH JEDINJENJA

4- htoro- 5- fluoro- 7H- pirolor2f3- cllpirimidin ( 1)

[0170]Rastvor 4-hloro-5-bromo-7H-pirolo[2,3-đ]pirimidin (800 mg, 3.45 mmol) u THF (50 mL) na -78°C je tretiran sa n-BuU (1.6 M u heksanu, 2.2 ekv., 7.6 mmol, 4.7 mL) u kapima, i mesari tokom 30 minuta na istoj temperaturi. Smeša je tretirana sa rastvorom ACCUFLUOR<®>NFSi (2.0 ekv., 7 mmol, 2.2 g) u THF (10 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se ugreje do sobne temperature, mešana je tokom 10b, i zatim koncentrovana do suvoće. Ostatak je rastvoren u EtOAc (100 mL), ispran sa vodom (3 x 15 mL) i koncentrovanim rastvorom soli (15 mL), osušen sa Na2S04, i prečišćen pomoću reverzne faze HPLC (10 x 250 mm C18 Luna kolona, 4.7 mL/min, 10-90% acetonitrila u vodi preko 20 min) da se obezbedi intermedijarno jedinjenje 1. ESI-MS m/z = 172.1 (MH<*>).

[0171]Reakcija opisana iznad i intermedijarno jedinjenje 1 su prikazani ispod.

2- amino- 6- morfolin- 4- ilmetil- N- fenil- benzamid( 2)

[0172]Intermedijarno jedinjenje 2 je pripremljeno prema procedurama postavljenim u koracima A-F ispod.

6- nitro- benzojeve kiseline metil estar( 3)

[0173]Korak A: Rastvor 6-nitro-benzojeve kiseline u benzenu je tretiran sa tionil hloridom (2.5 ekv.) i mešan na refluksu tokom 8h. Posle evaporacije, ostatak je rastvoren u hloroformu i zatim tretiran sa metanolom. Posle mešanja na refluksu tokom 3 sata, smeša je evaporisana dase dobije jedinjenje 3.

2- bromometil- 6- nitro- benzojeve kiseline metilestar ( 4)

[0174]Korak B: Smeša jedinjenja 3 (2 g), N-bromosukcinimida (1.93 g), i benzoil peroksida (0.124 g) u ugljenik tetrahloridu (30 mL) je mešana na refluksu preko noći. Posle hlađenja, čvrste supstance su izdvojene filtriranjem, i filtrat je koncentrovan da se dobije jedinjenje 4 kao sirovo, žuto ulje.

2- morfolin- 4- ilmetil- 6- nitro- benzojeve kiseline metil estar ( 5)

[0175]Korak C: Smeša jedinjenja 4 (3.5 g, sirovog materijala), morfolin (0.99 g), kalijum karbonat (2.89 g), i kalijum jodid (1.66 g) u DMF (22 mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je sipana u vodu (30 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 30 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani sa koncentrovanim rastvorom soli (30 mL), osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovan! do ostatka. Sirovi materijal je pređšćen fleš hromatografijom (silika gel, 30-50% etil acetat/heksani) da se dobije jedinjenje 5 kao žuta čvrsta supstanca.

2- morfolin- 4- ilmetil- 6- nitro- benzojeva kiselina ( 6)

[0176]Korak D: Rastvor jedinjenja 5 (0.85 g) i NaOH (0.304 g) u smeši vode (9 mL), metanola (5 mL), i THF (45 mL) je mešan na refluksu tokom 24 h, i koncentrovan do suvoće. Ostatak je rastvoren u vodi, i rastvor je ohlađena na 0°C i podešen na pH 7 sa 10%-tnim kalijum hidrogen sulfatom. Smeša je koncentrovana do suvoće, ostatak je tretiran sa metanolom i filtriran da se uklone čvrste supstance. Filtrat je koncentrovan, da bi se dobilo jedinjenje 6 kao žuta čvrsta supstanca.

2- morfoHn- 4- ilmetil- 6- nitro- N- fenil- benzamjd ( 7)

[0177]Korak E: Rastvor jedinjenja 6 (0.62 g, 2.3 mmol) u THF (50 mL) je tretiran sa tionil hloridom (0.94 mL), mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 h, i evaporisan do suvoće. Ostatak je rastvoren u THF (50 mL) i tretiran sa anilinom (0.58 mL, 6.4 mmol) i diizopropiletilaminom (1.12 mL, 6.4 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 4 h, koncentrovana, rastvorena u dihlorometanu (50 mL), isprana sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (25 mL) i koncentrovanim rastvorom soli (25 mL), osušena sa natrijum sulfatom i koncentrovana. Sirovi ostatak jedinjenja 7 je zatim prečišćen fleš hromatografijom (5% metanola u dihlorometanu).

2- amino- 6- mQfrolin- 4- ilmetil- N- fenit-benzamidf2^

[0178]Korak F: Rastvor jedinjenja 7 (0.3 g) i 10% Pd/C (30 mg) u metanolu (35 mL) je mešan pod vodonikom (1 atm) tokom 1.5 h. Smeša je filtrirana kroz CEUTE<®>i filtrat je koncentrovan da se obezbedi žuti čvrsti produkt, intermedijarno jedinjenje 2. ESI-MS m/z = 312 (MH<*>).

[0179]Koraci A-F i jedinjenja 2-7 su prikazani u reakcionoj šemi ispod.

3- morfolin- 4- ilmetil- fenilamin ( 8)

[0180]Intermedijarno jedinjenje 8 (prikazano ispod) je pripremljeno prema procedurama postavljenim u koracima A i B.

4- ( 3- nitrobenzil) morfolin ( 9)

[0181]Korak A: 250 mL, jednogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i kondenzatorom za refluks je napunjena sa l-hlorometil-3-nitrobenzenom (10.0 g, 58.3 mmol), morfolinom (15.0 g, 175 mmol) i toluenom (75 mL), i rastvor je zagrevan na refluksu tokom 2.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnoj temperaturi, zatim je isprana sa IN vodenim rastvorom natrijum hidroksida (2 x 50 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa etil-acetatom (3 x 50 mL), i kombinovani ekstrakti su osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje 9 kao beličasta čvrsta supstanca. 'H NMR (CDCb) 5 (ppm) 8.22 (s, IH), 8.12 (d, IH, J = 8.2 Hz), 7.68 (d, IH, J = 7.6 Hz), 7.49 (t, IH, J = 7.9 Hz), 3.73 (m, 4H), 3:59 (s, 2H), 2.46 (m, 4H).

3- morfolin- 4- ilmetil- fenllamin ( 8)

[0182]Korak B: 250-mL, trogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa mehaničkom mešalicom i kondenzatorom za refluks je napunjena sa jedinjenjem 9 (12.7 g, 57.4 mmol), prahom gvožđa (40.0 g, 71.7 mmol), 2N hlorovodoničnom kiselinom (20 mL) i etanolom (75 mL). Dobijena suspenzija je zagrevana na refluksu tokom 2 sata. Nakon tog vremena smeša je ostavljena da se ohladi i filtrirana je kroz sloj CEUTE<®>521. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom, ostatak je razblažen sa vodom (100 mL) i učinjen baznim sa čvrstim kalijum karbonatom do pH 10. Smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 75 mL), i kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 8 kao tamno viskozno ulje. 'H NMR (CDCk) 5 (ppm) 7.09 (t, IH, J = 8.1 Hz), 6.70 (m, 2H), 6.58 (m, IH), 3.70 (m, 4H), 3.40 (bs, 2H), 2.44 (m, 4H). Intermedijarno jedinjenje 8 je prikazano ispod.

6- brotno- 9- f2- trimetilsilanil-etoksimetil)-9H-purin (101

[0183]500-mL, jednogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je napunjena sa 6-bromopurinom (10.4 g, 52.0 mmol), kalijum karbonatom (21.5 g, 156 mmol), 4A motekularim sitima (22.6 g), dimetilformamidom (200 mL) i 2-(trimetilsilil) etoksimetil hloridom (13.2 g, 78.0 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 18h na sobnoj temperaturi, zatim je filtrirana pomoću CELrTE<®>521. Koncentracija filtrata pod visokim vakumom i zatim hromatografija na koloni su dale 57% prinosa od intermedijarnog jedinjenja 10 kao beličaste čvrste supstance m.p. 49-52°C;<!>H NMR (DMSOd6) 5 (ppm) 8.95 (s, IH), 8.86 (s, IH), 3.69 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 0.93 (t, 2H, J = 8.2 Hz), 0.08 (s, 9H); m/z = 330 (M+H). Intermedijarno jedinjenje 10 je prikazano ispod.

2- amino- 6- bromo- 9-( 2- trimetilsililetoksi) metil- 9H- purin flll

[0184]Intermedijarno jedinjenje 11 je pripremljeno korišćenjem metode opisane iznad s obzirom na intermedijarno jedinjenje 10, ali 2-amino-6-bromopurin je korišćen umesto 6-bromopurina. Intermedijarno jedinjenje 11 je prikazano ispod.

2- di- tert- butilotoikart»nilamino- 6- bro

[0185]250-mL, jednogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je očišćena azotom i napunjena sa intermedijarnim jedinjenjem 11 (11.7 g, 34.0 mmol), di-tert-butil dikarbonatom (22.2 g, 102 mmol), DMAP (581mg, 4.76 mmol) i anhidrovanim tetrahidrofuranom (150 mL). Reakciona smeša je mešana tokom 18h na sobnoj temperaturi, i evaporisana do suvoće. Hromatografija na koloni đobijenog ostatka je dala intermedijarno jedinjenje 12 kao belu čvrstu supstancu. m.p 93-95 °C; 'H NMR (DMSO-d6) 5 (ppm) 8.99 (s, IH), 5.71 (s, 2H), 3.66 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 1.47 (s, 18H), 0.92 (t, 2H, J = 8.2 Hz); m/z = 546 (M+H). Intermedijarno jedinjenje 12 je prikazano ispod.

6- hloro- 9-( 2- trirnetilsilanil- etoksimetin- 9H- purin ( 13)

[0186]Intermedijarno jedinjenje 13 je pripremljeno je korišćenjem iznad opisane metode s obzirom na intermedijarno jedinjenje 10, ali 6-hloropurin je upotrebljen umesto 6-bromopurina. Intermedijarno jedinjenje 13 je prikazano ispod.

OPSTE PROCEDURE

[0187]Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti pripremjena sledećim metodama. Dodatna jedinjenja su pripremljena upotrebom jedne od sleđećih metoda i izborom odgovarajućih polaznih materijala i reagenasa. Opšte procedure i specifične procedure za sintetizovanje predmetnih jedinjenja su takođe postavljene u U.S. Patent No. 6,518,277.

PRIMER 8 (Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0188]Jedinjenja u skladu sa opštom formulom I (prikazana iznad) su pripremljena prema primernim sintetskim procedurama opisanim ispod.

5-metil-3-fenil-2-[l-f9 H- purin- 6- ilaminol- Dropil1- 3H- hinazolin- 4- on ( 14)

[0189] Jedinjenje(14) je pripremljeno prema procedurama postavljenim u koracima A-D ispod.

2- amino- 6- metil- N- fenil- benzamid ( 15)

[0190]Korak A: Tionil hlorid (14.5 mL, 198 mmol) je dodat u rastvor 2-amino-6-metilbenzojeve kiseline (10.0 g, 66.1 mmol) u benzenu (250 mL). Dobijena suspenzija je zagrevana do refluksa i mešana preko noći. Posle hlađenja, reakcija je koncentrovana u vakumu, i dobijeni ostatak je rastvoren u hloroformu (300 mL). Anilin (15 mL, 165 mmol) je dodat, i smeša je zagrevana do refluksa. Nakon tri sata, reakcija je ostavljena da se ohladi, i dobijena suspenzija je filtrirana. Filtrat je podvrgnut fleš hromatografiji, i sirovi produkt je rekristalisan iz izopropanola da se obezbedi jedinjeje 15 kao žuta kristalna čvrsta supstanca. MS (ES): m/z 227 (M + H), 134.<!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 10.26 (s, IH), 7.75 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.32 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 7.07 (t, IH, J = 7.3 Hz), 7.00 (t, IH, J = 7.8 Hz), 6.58 (d, IH, J = 8.1 Hz), 6.46 (d, IH, J = 7.4 Hz), 4.98 (br. s, 2H), 2.21 (s, 3H). Reakcija opisana iznad, i jedinjenje 15 su prikazani ispod.

ri-( S- metil- 4- oksoO- fenil- 3. 4^ ihidrohinazolin- 2- il) propi kiseline benzil estar ( 16)

[0191]Korak B: Jedinjenje 15 (1.20 g( 5.30 mmol) je kombinovano sa 2 benziloksikarbonilaminobuternom kiselinom 2,5-diokso-pirolidin-l-il estrom (2.13 g, 6.36 mmol), dimetilaminopiridinom (915 mg, 7.49 mmol), i diizopropiletilaminom (1.10 mL, 6.36 mmol) u toluenu (15 mL). Smeša je zagrevana do 110°C i mešana na toj temperaturi tokom 22 sata. Posle hlađenja, reakcija je prečišćena sa fleš hromatografijom da se obezbedi hinazolinon (16) kao bledo žuta čvrsta supstanca. MS (ES): m/z 428 (M + H). 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) o 10.26 (s, IH), 7.75 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.32 (t, 2H, J= 7.8 Hz), 7.07 (t, IH, J = 7.3 Hz), 7.00 (t, IH, J= 7.8 Hz), 6.58 (d, IH, J= 8.1 Hz), 6.46 (d, IH, J = 7.4 Hz), 4.98 (br. s, 2H), 2.21 (s, 3H). Reakcija opisana iznad, i jedinjenje 16 su prikazani ispod.

2-( l- amino- propil)- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 9- on ( 17)

[0192]Korak C: Katalitička količina 10% Pd/C je dodata u rastvor jedinjenja 16 (691 mg, 1.62 mmol) u etanolu (8 mL). Dobijena smeša je stavljena pod atmosferu vodonika (pritisak balonom) i ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je filtrirana, i filtrat koncentrovan u vakumu. Dobijeni sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom da bi se dobio slobodni amin, jedinjenje 17 kao bledo žuto ulje. (ES): m/z 294 (M + H), 237. 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 7.68 (t, IH, J = 7.7 Hz), 7.49 - 7.63 (m, 3H), 7.43 - 7.49 (m, IH), 7.36 - 7.43 (m, IH), 7.19 - 7.34 (m, 2H), 4.03 - 4.19 (m, IH), 2.72 (s, 3H), 2.04 (br. s, 2H), 1.63 - 1.79 (m, IH), 1.29 - 1.44 (m, IH), 0.68 (t, 3H,J = 7.3 Hz). Reakcija opisana iznad, i jedinjenje 17 su prikazani ispod.

[0193]Korak C (Alternativna procedura): Trifluorosirćetna kiselina je dodata u rastvor Boc-zaštićenog amina jedinjenja 16 u dihlorometanu. Dobijeni rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi sve dok su LCMS i TLC pokazale potpuni utrošak početnog materijala. Reakcija je koncentrovana u vakumu i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom da se obezbedi slobodni amin 17.

5- metjl- 3- fenil- 2- ri-( 9H- purm- 6- ilamino)- propill-3 H- hinazoliri- 4- on ( 14)

[0194]Korak D: Jedinjenje 17 (100 mg, 0.341 mmol) je kombinovano sa 6-bromo purinom (75 mg, 0.375 mmol) i diizopropileb'laminom (65uL, 0.375 mmol) u n-butanolu (1.0 mL). Reakcija je hermetički zatvorena , zagrevana do 120°C i mešana tokom 18 sati. Rastvor je ostavljen da se ohladi, i zatim koncentrovan u vakumu. Dobijeni ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC, da se obezbedi jedinjenje 14 kao maslinasto zelena Čvrsta supstanca. (ES): m/z 412 (M + H), 206. 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 8.96 - 9.06 (br. m, IH), 8.53 (br. s, IH), 8.51 (s, IH), 7.68 (t, IH, J = 7.8 Hz), 7.45 - 7.62 (m, 6H), 7.31 (d, IH, J = 7.3 Hz), 4.76 - 4.86 (m, IH), 2.73 (s, 3H), 1.98 - 2.11 (m, IH), 1.76 - 1.94 (m, IH), 0.79 (t, 3H, J = 7.2 Hz). Reakcija opisana iznad, i jedinjenje 14 su prikazani ispod.

2- ri-( 2- lfuoro- 9H- purin- 6- ilamino)-^

[0195]Jedinjenje 18 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na Jedinjenje 14, ali 2-fluoro-6-hloropurin je korišćen umesto 6-bromopurina u koraku D. ESI-MS m/z 416.1 (MH<+>). Jedinjenje 18 je prikazano uispod.

3-( 2, 6- dlffuoro- fenil)- 5- metM- 2- fl-( 9H- purin- 6Mlamino)-etin-3H-hinazolin-4-on (19)

[0196]Jedinjenje 19 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluorolanilin je korišćen umesto anilina u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino- propionska kiselina 2,5-dioksopirolidin-1-il estar je bio supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 434.1 (MH<*>). Jedinjenje 19 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- etn^ (20)

[0197]Jedinjenje 19 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 449.5 (MH<+>). Jedinjenje 20 je prikazano ispod.

3-( 2. 6- diftuoro- fenn)- 2-[ l-( 2- lfuoro- 9H- p^

[0198]Jedinjenje 21 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin- 1-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura {TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-f)uoro-6-hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D.<*>HNMR (MeOH-d*): 5 8.22-8.17 (m, IH); 7.76-7.62 (m, 2H); 7.47-7.45 (m, 1 H); 7.38-7.33 (m, 1.2H); 7.30-7.17 (m, IH); 6.88-6.75 (m, IH); 5.30-5.27 (m, 0.5H); 5.09-5.07 (m, 0.5H); 2.778 (s, 3H); 1.62-1.50 (m, 3H). Jedinjenje 21 je prikazano ispod.

3-( 2, 6- difluoro- fenil)- 5- metH^

[0199]Jedinjenje 22 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-đifluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 433 (MH<*>). Jedinjenje 22 je prikazano ispod.

2- ri- f2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- propM1- 5- nietM- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on (23)

[0200]Jedinjenje 23 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 427 (M + H), 214. Jedinjenje 23 je prikazano ispod.

5- metil- 3- fenil- 2- fl-( 7H- pirolor2, 3- dlpirim^ ( 24)

[0201]Jedinjenje 24 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 7-deaza-6- hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 411 (M + H), 206. Jedinjenje 24 je prikazano ispod.

2dl^fliiaffl=ar^

[0202]Jedinjenje 25 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-fluoro-6-hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 430 (M + H), 446. Jedinjenje 25 je prikazano ispod.

5- met3l- 3- fenil- Z- fl-( 9H- purin- 6- ilarnino)- etin- 3H- hinazolin- 4- on (26)

[0203]Jedinjenje 26 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. MS (ES): m/z 398 (M + H). Jedinjenje 26 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- eUi1- 5- metil- 3- fenit- 3H- hinazolin- 4- on ( 27)

[0204]Jedinjenje 27 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butoksikarbonilamino-propionsake kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 413.1 (MH<+>). Jedinjenje 27 je prikazano ispod.

2- r2- benzilQksi- l-( 9H- Purin- 6- ilamino)- etin- S- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin-4-on (28)

[0205]Jedinjenje 28 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-benziloksi-2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. MS (ES): m/z 504 (M + H), 396, 261. Jedinjenje 28 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amirw- 9H- purin- 6- Mamino)- 2- te^^

[0206]Jedinjenje 29 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-benziloksi-2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il ester je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 519 (M + H), 411, 261. Jedinjenje 29 je prikazano ispod.

2-[ 2- benzitoksi- l-( 7H- piroio[ 2, 3- dlpM^ ( 30)

[0207]Jedinjenje 30 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-benziloksi-2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 503 (M + H), 395. Jedinjenje 30 je prikazano ispod.

2- f2- benziloksi- l-( 2- fluoro- 9H- purin- 6- ilam ( 31)

[0208]Jedinjenje 31 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-benziloksi-2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-fluoro-6-hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 522 (M + H), 414, 261. Jedinjenje 31 je prikazano ispod.

3-( 4- flutH- o- fenil)- S- metil- 2- ri-( 9H^^

[0209]Jedinjenje 32 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali sa sledećim izmenama: 4-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziioksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 416.1 (MH<+>). Jedinjenje 32 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- purin- 6- Hamino)^ ( 331

[0210]Jedinjenje 33 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 4-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 431.1 (MH<*>). Jedinjenje 33 je prikazano ispod.

3-( 4- fluQrQ- fenil)- 2- fl-( 2- fluoro^ 9H- puirn- 6- ilamino)- etil]- 5- meti!- 3H- hina ( 34)

[0211]Jedinjenje 34 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 4-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-piroliđin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-fluoro-6-hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 434.1 (MH"). Jedinjenje 34 je prikazano ispod.

3-( 4- fluoro- feniiy5- metil- 2- fl-( 7H- pii^ ( 35)

[0212]Jedinjenje 35 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 4-fiuoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 415.1 (MH<*>). Jedinjenje 35 je prikazano ispod.

5- metil- 3- fenil- 2- ri-( 7H- pirolo[ 2F3- d] pirimidin- 4- ilamino)- etin- 3H- hinazolin- 4- on ( 36)

[0213]Jedinjenje 36 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-h!oro-7H-pirolo[2,3-dJpirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 397 (MH<*>). Jedinjenje 36 je prikazano ispod.

3-( 3- fluoro- fCTil)- 5- metil- 2- ri-( 9H- puri ( 37)

[0214]Jedinjenje 37 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. 'HNMR (dmso-dt): 8.30-8.28 (m, 2H); 7.70-7.49 (m, 3H); 7.44-7.30 (m, 4H); 4.91-4.88 (m, IH); 2.72-2.68 (m, 3h); 1.50-1.48 (m, 3H). Jedinjenje 37 je prikazano ispod.

2- ri- f2- amino- 9H- Puirn- 6- ilamino)- etil]- 3-( 3- fluoro- fenil)- 5- met3l- 3H-hinazol^ ( 38)

[0215]Jedinjenje 38 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. 'H NMR (dmso-df,); 8.16-8.12 (m, IH); 7.74-7.69 (m, IH); 7.62-7.53 (m, 2H); 7.46-7.12 (m, 6H); 4.96 (bs, IH); 2.74-2.67 (m, 3H); 1.47-1.45 (m, 3H). Jedinjenje 38 je prikazano ispod.

3-( 3- fluoor- fenil)- 5- metil- 2- fl-( 7H- p^ ( 39)

[0216]Jedinjenje 39 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supostituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 415.1 (MH<+>). Jedinjenje 39 je prikazano ispod.

5- meOI- 3- fenit- 2- ri- f9H- Puirn- 6- il>pirolidin-2-il]- 3H- hinazolin- 4- on f40)

[0217]Jedinjenje 40 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali piroliđin-1,2-dikarboksilne kiseline 1-tert-butjl estar 2-(2,5-diokso-pirolidin-l-il) estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estarukoraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. MS (ES); m/z 424 (M + H), 212. Jedinjenje 40 je prikazano ispod.

2-[ 2- hidroksi- l-( 9H- purin- 6- ilamlno)- etil1- 5- metH- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 41)

[0218]Suspenzija jedinjenja 28 (60 mg, 0.097 mmol), Pd(0H)2(cat.) i vodeni Na2C03(0.5 mL) u etanotu (2.5 mL) je hidrogenizovana na 45 psi tokom 14 dana. Smeša je filtrirana da bi se uklonili rastvarači i dobijeni filtrat je prečišćen putem HPLC, da se obezbedi produkt 41 kao bela čvrsta supstanca. MS (ES): m/z 414 (M + H), 396, 261. Jedinjenje 41 je prikazano ispod.

5- metil- 3- fenil- 2- rfenil- f9H- purin- 6- ilamino)- metil1- 3H- hina2olin- 4- on ( 42)

[0219]Jedinjenje 42 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali tert-butoksikarbonilamino-fenil-sirćetne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. MS (ES): m/z 460 (M + H), 325. Jedinjenje 42 je prikazano ispod.

2- r( 2- amino- 9H- purin- 6- Hamino)- fen^^^ ( 43)

[0220]Jedinjenje 43 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali tert-butoksikarbonilamino-fenil-sirćetne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonitaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-if estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 475 (M + H). Jedinjenje 43 je prikazano ispod.

2- f( 2- fluoor- 9H- purin- 6HlaminoHenil- met^ ( 44)

[0221]Jedinjenje 44 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali tert-butoksikarbonilamino-fenil- sirćetne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-fluoro-6-hloropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 478 (M + H), 325. Jedinjenje 44 je prikazano ispod.

5- meti>3- fenil- 2-[ fenil-( 7H- pii^ o[ 2, 3^] pirimidm^ ( 45)

[0222]Jedinjenje 45 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali tert-butoksikarbonilamino-fenil- sirćetne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 459 (M + H), 230. Jedinjenje 45 je prikazano ispod.

5- fluoro- 3- fenil- Z- ri- f9H- purin- 6- ilarnino)- ean- 3H- hinazolin- 4- Qn ( 46)

[0223]Jedinjenje 46 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6- ftuoro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metit-benzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 402.3 (MH<*>). Jedinjenje 46 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amiro- 9H- purin- 6- ilamino)- etin^ ( 47)

[0224]Jedinjenje 47 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-fluoro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-mebl-benzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butokstkarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-arnino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 417.2 (MH<*>). Jedinjenje 47 je prikazano ispod.

2- f l-( 2- amino- 9H- p^ ( 48)

[0225]Jedinjenje 48 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzoijevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziioksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 433 (M + H), 177. Jedinjenje 48 je prikazano ispod.

[ 5-( 5- meat1- 4- olgo- 3- fenH- 3. 4- dihidi^ benzil estar

karbaminske kiseline (49)

[0226]Jedinjenje 49 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 6-benziloksikarbonilamino-2-tert-butoksikarbonilamino-heksanske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 589 (MH<*>). Jedinjenje 49 je prikazano ispod.

rs- f2- ainino- 9H- purin- 6- ilamino)- 5- f5- metil- 4- oksq- 3- fenil- 3r4- dih

karbaminske kiseline benzil estar ( 50)

[0227]Jedinjenje 50 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 6-benziloteikarbonilamino-2-tert-butoksikarbonilamino-heksanske kiseline 2,5-diokso-piroliđin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 604

(MF<T>). Jedinjenje 50 je prikazano ispod.

[ 4-( 5- nietil- 4- olcso- 3- feni>- 3f4- dihidro- hinazplin- 2- ilV4-( 9H- purin^- ilamlno)- butil]- karba minske kiseline

benzil estar (51)

[0228]Jedinjenje 51 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 6-benziloksikarbonilamino-2-tert-butoksikarbonilamino-pentanske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 575 (MH<*>). Jedinjenje 51 je prikazano ispod.

r4-( 2- amino- 9H- Purin- 6- ilammol- 4-( 5- me

karbaminske kiseline benzil estar ( 52)

[0229]Jedinjenje 52 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 6-benziloksikrbonilamino-2-tert-butoksikarbonilamino-pentanske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku Đ. ESI-MS m/z 590

(MH<*>). Jedinjenje 52 je prikazano ispod.

3- fenil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 3H- hinazolin- 4- on ( 53)

[0230]Jedinjenje 53 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali antranilna kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propioniske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benzitoksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-dtokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. MS (ES): m/z 384.1 (M + H). Jedinjenje 53 je prikazano ispod.

2- r5- amino-l-(9H-pu irn- 6- ilamino)- p^ ntil]- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on) ( 54)

[0231]Smeša jedinjenja 49 (28.5 mg) i paladijuma na ugljeniku (10 mg, 10% Pđ) u etanolu (2 mL), je promućkana sa vodonikom (40 psi) tokom 48 sati. Smeša je filtrirana kroz CEUTE<®>i filtrat je koncentrovan da se dobije produkt 54. ESI-MS m/z 455 (MH<*>). Jedinjenje 54 je prikazano ispod.

2- r5- amino- l-( 2- amtno- 9H- purin- 6- »amm ( 55)

[0232]Jedinjenje 55 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 54, ali jedinjenje 50 je supstituisano za jedinjenje 49. ESI-MS m/z 470 (MF<T>). Jedinjenje 55 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilammo)- etil1- 3-( 2. 6- Dimetil- fentl)- 5- rnetil- 3H- hinazolin- 4- on ( 56)

[0233]Jedinjenje 56 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-dimetilanilin je supstituisan za anilin u koralku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiaekline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 441 (MH<+>). Jedinjenje 56 je prikazano ispod.

3-( 2. 6- dimetil- fenM)- S- metil- 2- ri-( 9H- puirn- 6- ilamino)- etil1- 3H- hina2Qlin- 4- on ( 57)

[0234]Jedinjenje 57 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-dimetilanilin je supstituisan za anilin u koralku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 426 (MH<*>). Jedinjenje 57 je prikazano ispod.

5- motfolin- 4- ilmetil- 3- fenil- 2-[l-(9H-<p>urin-6- llamino)- etin- 3H- h ( 58)

[0235]Jedinjenje 58 je pripremljeno upotrebom koraka B, C i D u opštoj proceduri opisanoj iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali intermedijarno jedinjenje 2 je supstituisano za produkt koraka A u korak B (korak A zbog toga nije bio potreban), 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonitaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 483 (MH<+>). Jedinjenje 58 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- eOn- 5- m ( 59)

[0236]Jedinjenje 59 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 58, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 498 (MH<+>). Jedinjenje 59 je prikazano ispod.

2-[ 4- amino- l-( 2- amiiH>- 9H- purin- 6- ilamm^ ( 60)

[0237]Jedinjenje 60 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 54, ali jedinjenje 52 je supstituisano za jedinjenje 49. ESI-MS m/z 456 (MH<*>). Jedinjenje 60 je prikazano ispod.

6- fluoro- 3- fenil- 2- fl-( 9H- purin- 6- ilamino)- etilV3H- hinazotin- 4- on f61)

[0238]Jedinjenje 61 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-5-fluorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-5-meitlbenzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku C, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 402 (MF<T>). Jedinjenje 61 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- etil1- 6- nuQrQ- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 62)

[0239]Jedinjenje 62 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 61, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 417 (MH'). Jedinjenje 62 je prikazano ispod.

2- r2- tert- butoksi- l-( 9H- purin- 6- ilamino)- ebl1- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 63)

[0240]Jedinjenje 63 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-benziloksikarbonilamino-3-tert-butoksi-propionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B. MS (ES): m/z 470 (M + H), 396, 261. Jedinjenje 63 je prikazano ispod.

3-( 3- meti^ fenil)- 5- metil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etil]- 3H- hinazolin- 4- on ( 64)

[0241]Jedinjenje 64 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali m-toluidin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. 'H NMR (dmso-d6): 8.41-8.36 (m, 2H); 7.71-7.66 (m, IH); 7.53-7.51 (m, 5H); 4.97 (m, IH); 2.72 (s, 3H); 2.39 (s, 1.5H); 2.09 (s, 1.5H); 1.50-1.48 (m, 3H). Jedinjenje 64 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- et^^ ( 65)

[0242]Jedinjenje 65 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali m-toluidin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D.<!>H NMR (dmso): 8.94-8.92 (m, IH); 8.18 (s, IH); 7.75-7.68 (m, IH); 7.58-7.51 (m, IH); 5.07-4.96 (m, IH); 2.79-2.73 (m, 3H); 2.40 (s, 1.5H); 1.91 (s, 1.5H); 1.48-1.43 (m, 3H). Jedinjenje 65 je prikazano ispod.

3- f3- hloro- fenil)- 5- metil- 2- ri-( 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 3H- hinazolin- 4- on ( 66)

[0243]Jedinjenje 66 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-hloroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. 'H NMR (dmso-d6): 8.40-8.31 (m, 2H); 7.73-7.66 (m, IH); 7.55-7.32 (m, 6H); 5.04-4.86 (m, IH); 2.72 (s, 3H); 1.52-1.50 (m, 3H). Jedinjenje 66 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- etil1- 3- f3- hloro- fenil)- 5- meti1- 3H- hinazol ( 67)

[0244]Jedinjenje 67 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 66, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 447.2 (MH<*>). Jedinjenje 67 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- tlamino)- 2- hM^ (68)

[0245]Jedinjenje 68 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-benziloksikarbonilamino-3-tert-butoksi-propionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. Dobijeni 2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-2-tert-butoksi-etil]-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-on je zatim rastvoren u trifluorosirćetnoj kiselini i ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi tokom 5 sati. Prečišćavanje putem LC je obezbedilo produkt 68 kao belu čvrstu supstancu. MS (ES): m/z 429 (M + H), 215, 206, 151. Jedinjenje 68 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 3^^ ( 69)

[0246]Jedinjenje 69 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 417.1 (MH<+>). Jedinjenje 69 je prikazano ispod.

2- ri- f2- amirro- 9H- puirn- 6- ilamino)- etin- 3-^

[0247]Jedinjenje 70 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluoroaniltn je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 435.1 (MH<+>). Jedinjenje 70 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amirKi- 9H- purin- 6- ilainino)- propil]- 5- fIuoro- 3- fenil- 3H- hinazolin ( 71)

[0248]Jedinjenje 71 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-5-fluorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-5-metilbenzojevu kiselinu u koraku A, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 431 (MH<+>). Jedinjenje 71 je prikazano ispod.

5- htoro- 3-( 3- fluoro- fenil)- 2-[ l-( 9H- pw^ (72?

[0249]Jedinjenje 72 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6- hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzojevu kiselinu i 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuternu kiselinu 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 436.1 (MF<T>). Jedinjenje 72 je prikazano ispod.

2- fl-( Z- amiro- 9H- puri n- 6- ilamino^ f73)

[0250]Jedinjenje 73 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzojevu kiselinu, i 3-fiuoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 451.1 (MH<*>). Jedinjenje 73 je prikazano ispod.

3- fenil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- Hamino)- etil]- 5- trifl ( 74)

[0251]Jedinjenje 74 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-N-fenil-6-triftuorometil-benzamid je korišćen na mestu jedinjenja 15 u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterenu kiselinu 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena. MS (ES); m/z 452 (M + H). Jedinjenje 74 je prikazano ispod.

[0252]2-amino-N-fenil-6-trifluorometil-benzamid je pripremljen dodavanjem anilina (1.0 ekv.} u suspenziju 2-amino-6-(trifluorometil)-benzojeve kiseline trihidrata (1.0 g, 4.0 mmol, 1.3 ekv.) i polistiren-karbodiimida (3.6 g, 1.1-1.7 ekv.) u THF (40 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati, zatim je filtrirana. Filtrat je koncentrovan u vakumu i prečišćen fleš hromatografijom, da se obezbedi 2-amino-N-fenil-6-trifluorornetil-benzamid kao žuta čvrsta supstanca.

3-( 2f6- difluoro- fenil)- 5- metil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- namino)- porpi|]- 3H- hinazolin-^

[0253]Jedinjenje 75 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluoroanlin je supstituisan za anilin u koraku A. ESI-MS m/z 448 (MH<+>). Jedinjenje 75 je prikazano ispod.

3-( 2, 6- dinuoro- fenil)- 5- roetil- 2-[ H ( 76)

[0254]Jedinjenje 76 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propioske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 434.1 (MH '). Jedinjenje 76 je prikazano ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- Purin- 6- HamiTO^ ( 77)

[0255]Jedinjenje 77 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 75, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 463 (MH<*>), Jedinjenje 77 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 3- f2. 6- difluor- o- fenin- 5- meUI- 3H- hinazolin- 4- on ( 78)

[0256]Jedinjenje 78 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 76, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 449 (MH<*>). Jedinjenje 78 je prikazano ispod.

3-( 3. 5- dihloro- fenil)- 5- irietil- 2-r i-( 9H- Purin- 6- ilamino)- etil1- 3H- hina20lin- 4- on ( 79)

[0257]Jedinjenje 79 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3,5-dihloroanilin je supstituisan za anilin u koraku 1, i 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuteme kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 467 (MH<*>). Jedinjenje 79 je prikazano ispod.

3-f2. 6- dihloro- fenil)- 5- meHI- 2- ri-( 9H- ptiirn- 6- ilamino)- etin- 3H- hinazolin- 4- on ( 80)

[0258]Jedinjenje 80 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2,6-dihloroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 467 (MH<*>). Jedinjenje 80 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- itamino)- eBn- 3-( 2, 6-^ ( 81)

[0259]Jedinjenje 81 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 80, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 482 (MH<*>). Jedinjenje 81 je prikazano ispod.

5- hloro- 3- fenil- 2- ri-( 9H- purin- 6- ilamino)- propill- 3H- hinazolin- 4- on ( 82)

[0260]Jedinjenje 82 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6- hloro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metil-benzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, ESI-MS m/z 432 (MH<+>). Jedinjenje 82 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- propin- 5- hloro^ ( 83)

[0261]Jedinjenje 83 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 447 (MH<*>). Jedinjenje 83 je prikazano ispod.

S- metil- 3- fenil- 2- ri- f9H- purin- 6- ilamino)- butil1- 3H- hinazolin- 4- on (84)

[0262]Jedinjenje 84 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-benzitoksikarbonilamino-pentanske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B. MS (ES): m/z 426 (M + H), 213. Jedinjenje 84 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- buHn- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 85)

[0263]Jedinjenje 85 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-benztloksikarbonilamino-pentanske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 441 (M + H), 221. Jedinjenje 85 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- e^

[0264]Jedinjenje 86 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 482 (MH<+>). Jedinjenje 86 je prikazano ispod.

S- nreOI- 3-( 3- mofrolm- 4- ilmeti'^

[0265]Jedinjenje 87 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali intermedijarno jedinjenje 8 je supstituisano za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-đioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuteme kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 497 (MF<T>). Jedinjenje 87 je prikazano ispod.

2-ri-f2-amino-9H-puri ii- 6- ilamino)- et3l]- 5- metil- 3-( 3- morfolin- 4- ilm (88)

[0266]Jedinjenje 88 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 87, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 498 (MH<*>). Jedinjenje 88 je prikazano ispod.

2»[ l-( 5- bromo- 7H- pirolo[ 2. 3- d] piirmidin- 4- Hamino)- etrn- 5- meU ( 89)

[0267]Jedinjenje 89 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butksikarbonilamino- propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-piro(idin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i 4-hloro-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (pripremljen kao u J. Med. Chem. 1988, 31, 2086-2092) je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 411.1 (MH<*>). Jedinjenje 89 je prikazano ispod.

S- roetjl- 2-[ l-( 5- metil- 7H- pirolor2, 3- d] pirimidin- 4- ilam^ ( 90)

[0268]Jedinjenje 90 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butoksikarbonilamino- propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C i 4-hloro-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (pripremljen kao u J. Med. Chem.1990, 33, 1984-1992) je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 411.1 (MH<*>). Jedinjenje 90 je prikazano ispod.

2- fl-( 5- fluorQ- 7H- pirQlo[ 2, 3- d] pirimidin- 4- ilaminQ)- etjl]- 5- m (91)

[0269]Jedinjenje 91 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C, i intermedijarno jedinjenje 1 je supstituisano za 6-bromopurin. ESI-MS m/z 415.1 (MH<+>). Jedinjenje 91 je prikazano ispod.

2-[ 2- hidroksi- l-( 9H- purin- 6- ilamino)- e* jn- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 92)

[0270]Jedinjenje 92 je pripremljeno dodavanjem trifluorosirćetne kiseline u rastvor 2-[2-tert-butoksi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on u dihlorometanu. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi temperaturi tokom 18 sati, zatim koncentrovan u vakumu. Prečišćavanje putem LC je obezbedilo produkt u obliku bele čvrste supstance. MS (ES): m/z 400 (M + H), 382, 200, 136. Jedinjenje 92 je prikazano ispod.

[0271]2-[2-tert-butoksi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-hinazolin-4-on je pripremljen korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-6-hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzojevu kiselinu u koraku A, 2-benziloksikarbonilamino-3-tert-butoksi-propionske kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i stanja koja se koriste u koraku C su uklonjena i za zaštitne grupe benzila i hloro supstituent A-prstena.

3-( 3, 5- difluoro- fen»)- 5- metil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- i>amino)- propin- 3H- h ( 93)

[0272]Jedinjenje 93 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3,5-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A. ESI-MS m/z 448 (MH<*>). Jedinjenje 93 je prikazano ispod.

2-[ l-( 2- amino- 9H- purin- 6- i' amino)- propil1- 3-( 3, 5^ (94)

[0273]Jedinjenje 94 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 90, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 463 (MH<+>). Jedinjenje 94 je prikazano ispod.

3-( 33- difluoro- fen^ (95)

[0274]Jedinjenje 95 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali antranilna kiselina je supstituisana za 2-amino-6-meti!benzojevu kiselinu i 3,5-difluoroanilin za anilin u koraku A, 2-tertbutoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 420 (MH<*>). Jedinjenje 95 je prikazano ispod.

2-[ l-( 5- bromo- 7H- pi!^ or23- dlpirim

(96)

[0275]Jedinjenje 96 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuteme kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 494 (MH<*>). Jedinjenje 96 je prikazano ispod.

3- f3- fluoor- fenHVS- metil- 2- ri-( 5- meti^

[0276]Jedinjenje 97 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 429 (MH<*>). Jedinjenje 97 je prikazano ispod.

3- fenil- 2-[ l- f9H- purin- 6- ilamino)- propil]- 3H- hinazolin- 4- on ( 98)

[0277]Jedinjenje 98 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali antranilna kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metil-benzojevu kiselinu u koraku A. MS (ES): m/z 398 (M + H), 199. Jedinjenje 98 je prikazano ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- puirn- 6- i' ammo)^ Mn- 3- f^ f99)

[0278]Jedinjenje 99 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 95, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z 435 (MH<*>). Jedinjenje 99 je prikazano ispod.

2- fl- f2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- propH]- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 100)

[0279]Jedinjenje 100 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali antranilna kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metil-benzojevu kiselinu u koraku A, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. MS (ES): m/z 413 (M + H), 207. Jedinjenje 100 je prikazano ispod.

6, 7- difluorcH3- fenil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etil1- 3H- hinazolin- 4- on ( 101)

[0280]Jedinjenje 101 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-4,5-difluoro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metil-benzojevu kiselinu u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-propionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekđja) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 420 (MH<*>). Jedinjenje 101 je prikazano ispod.

6- fluOTO- 3-( 3- fluoi^ fenil)- 2-[ l-( 9H- puirn- 6- ilamino)- eti»]- 3H- hinazolin- 4- on ( 102)

[0281]Jedinjenje 102 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 14, ali 2-amino-5-fluoro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-meitl-benzojevu kiselinu u korakuA, 2-tert-butoksikarbonilaminopropionske kiseline 2,5-dioksopirolidin-l-il estar je supstituisan za 2-benziloksikarbonilaminobuterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar u koraku B, i alternativna procedura (TFA deprotekcija) je korišćena u koraku C. ESI-MS m/z 420 (MH<+>). Jedinjenje 102 je prikazano ispod.

2- f4- dietalamino- l-( 9H- purin- 6- ilaminQ)- butil1- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 103)

[0282]Jedinjenje 103 je pripremljeno prateći korake A-D ispod,

[ 4- amino- l-( 5- metil- 4- okso- 3- fenil- 3, 4- dihidro^ kiseline tert- butil estar

(104)

[0283]Korak A: 10-mL, jednogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa 10% patadijumom na ugljeniku (30 mg, 50 % vlažnosti). Rastvor [4-benziloksikarbonilamino-l-(5-metil-4-okso-3-fenil-3,4-dihidro-hinazolin-2-il)-butil]- karbaminske kiseline tert-butil estra (produkt iz koraka B procedure za jedinjenje 51) (100 mg, 0.18 mmol) u etanolu (2 mL) i polimetilhidroksiloksan (130 mg) su zatim dodati sekvencijalno. Reakciona smeša je mešana na 50°C tokom 3 sata, i zatim ohlađena do sobne temperature. Smeša je filtrirana kroz sloj CEUTE<9>i filtrat evaporisan do suvoće. Naknadno prečišćavanje dobijenog sirovog produkta putem hromatografije na koloni je dalo prinos od 62% jedinjenja 101 kao bele čvrste supstance.<l>H NMR (CO,OD) 5 7.55-7.69 (m, 5H), 7.33-7.49 (m, 2H), 7.30 (d, IH, J = 7.3 Hz), 4.29 (m, IH), 2.77 (s, 3H), 2.38-2.47 (m, 2H), 1.72-1.88 (m, IH), 1.57-1.79 (m, IH), 1.13-1.55 (m, 4H), 1.40 (s, 9H). Iznad opisana reakcija i jedinjenje 104 su prikazani ispod.

[ 4- PietilamirK)- l-( 5- metil- 4- oteo- 3- fenH- 3, 4- dihidro- hinazolin- 2- il)- butil]- kartami kiseline tert- butil

estar ( 1Q5)

[0284]Korak B: 10-mL, jednogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 104 (100 mg, 0.24 mmol) i 1,2-dihioroetanom (2 mL). Acetalđehid (42 mg, 0.85 mmol) i natrijum triacetoksiborohidrid (400 mg, 1.90 mmol) su dodati subsekvencijalno. Reakciona smeša je mešana tokom 18 sati na sobnoj temperaturi, evaporisana do suvoće, i dobijeni ostatak je rastvoren u metanolu (20 mL). Ovaj metanolski rastvor je tretiran sa 10%-tnim paladijumom na ugljeniku (5 mg, 50% vlažnosti), mešan tokom 30 min, evaporisan do suvoće, i podeljen između 10% vodenog rastvora kalijum karbonata (20 mL) i metilen hlorida (20 mL). Organski sloj je odvojen i osušen preko natrijum sulfata. Rltracija organskog sloja praćena koncentracijom je dala jedinjenje 105 kao žuto ulje, koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja. 'H NMR (CDCI3) 7.51-7.63 (m, 5H), 7.41 (d, IH, J = 7.4 Hz), 7.29 (d, IH, J = 7.15 Hz), 7.22 (d, IH, J = 7.1 Hz), 6.10 (d, IH, J = 8.8 Hz), 4.38-4.52 (m, IH), 2.81 (s, 3H), 2.32-2.50 (m, 4H), 2.08-2.27 (m, 2H), 1.47-1.73 (m, 4H), 1.42 (s, 9H, 1.25-1.38 (m, IH), 0.96 (t, 6H, J = 7.2 Hz); ESI-MS m/z = 479 (MH<+>). Iznad opisana reakcija i jedinjenje 105 su prikazani ispod.

2-fl-amino-4-dieaiamino-butilV5- meitl- 3- fenil- 3H- hinazQlin- 4- on ( 106)

[0285]Alternativna procedura deprotekrije opisana iznad u odnosu na pripremu jedinjenja 14 (i posebno pripremu jedinjenja 17) se koristi za deprotekciju jedinjenja 105. Reakcija i jedinjenje 106 su prikazani ispod.

2- f4- Dietilamino- l-( 9H- purin- 6- ilamino)- butil1- 5- metil- 3- fenil- 3H- hina2olin- 4- on ( 103)

[0286]Jedinjenje 103 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure obezbeđene iznad u koraku D procedure za jedinjenje 14, ali jedinjenje 106 je korišćeno kao slobodan amin. ESI-MS m/z 497 (MH+). Reakcija i jedinjenje 103 su prikazani ispod.

PRIMER 9(Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0287]Jedinjenja u skladu sa opštom formulom I (prikazanom iznad), uključujući hiralna jedinjenja koja imaju opštu formulu U (prikazanu iznad), su bila pripremljena u skladu sa koracima A-E sintetske šeme prikazane ispod.

( Si- S- fluofo- 3- fenM- 2- ri-( 9H- purin- 6- ilamino)- propil1- 3H- hinazolin- 4- on ( 107)

[0288]Sinteza jedinjenja u skladu sa formulom I je prvo prikazana korišćenjem koraka A-E, koji obezbeđuju sintetsku proceduru za jedinjenje 107, čija je struktura prikazana ispod.

2- f1uoro- 6- nitro- N- fenil- benzamid ( 108?

[0289]Korak A: Rastvor 2-fluoro-6-nitrobenzojeve kiseline (100 g, 0.54 mol) i dimetilformamida (5 mL) u dihlorometanu (600 mL) je tretiran u kapima sa oksalil hloridom (2 M u dihlorometanu, 410 mL, 0.8 mol, 1.5 ekv.) preko 30 min. Posle mešanja 2h na sobnoj temperaturi, reakcija je koncentrovana do narandžastog sirupa sa nekim prisutnim čvrstim supstancama. Sirup je rastvoren u suvom dioksanu (80 mL) i polako dodat u suspenziju anilina (49 mL, 0.54 mol, 1 ekv.) i natrijum bikarbonata (90 g, 1.08 mol, 2 ekv.) u smeši dioksana (250 mL ) i vode (250 mL) na 6°C. Temperatura je dostiglagla 27°C na kraju dodavanja. Posle 30 minuta, reakciona smeša je tretirana sa vodom (1.2 L). Precipitat je sakupljen putem vakumske filtracije, ispran sa vodom (300 mL), osušen na vazduhu u levku,i osušen u vakumu na 50°C tokom 24h da se dobije produkt beličaste čvrste supstance (139 g, 99%). 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 10.82 (s, IH), 8.12 (d, J = 7.7 Hz, IH), 7.91-7.77 (m, 2H), 7.64 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.38 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.15 (t, J = 7.4 Hz, IH), ESI-MS m/z 261 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 108 su prikazani ispod.

( S)-[ l-( 2- fluoro- 6- nitro- benzoil)- fenil- aminokarbonil]- propi»- karbaminske kiseline tert- butil estar ( 109)

[0290]Korak B: Suspenzija jedinjenja 108 (0.5 mol) i dimetilformamida (5 mL) u tionil hloridu (256 mL, 2.5 mol, 5 ekv) je mešana na 85°C tokom 5 sati. Reakciona smeša je koncentrovana u vakumu do braon sirupa. Sirup je rastvoren u dihlorometanu (200 mL) i polako dodat u ratvor N-BOC-L-2-aminobuterne kiseline (112 g, 0.55 mol, 1.1 ekv.) i trietilamina (77 mL, 0.55 mol, 1.1 ekv.) u dihlorometanu (600 mL) na 10 °C. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 3h, soli su uklonjene putem filtracije, i rastvor je ispran sa 100 mL vode, zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, vodom, 5% limunskom kiselinom, i zasićenom rastvoprom natrijum hlorida. Organska faza je osušena sa magnezijum sulfatom i koncentrovana do crvenog sirupa. Sirup je rastvoren u dihlorometanu (450 mL) i prečišćen putem fleš hromatografije na sloju silikagela (15 x 22 on, 4 L suve silike) eluiran sa heksanima/etil acetat (10%, 8 L; 15%, 8 L; 20%, 8 L; 25%, 4 L) da se dobije jedinjenje 109 kao beličasta čvrsta supstanca (147 g, 66%). 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 8.13 (d, J = 8.0 Hz, IH), 7.84 (t, J = 8.6 Hz, IH), 7.78-7.67 (m, IH), 7.65-7.49 (m, 3H), 7.40-7.28 ( m, 2H), 7.19 (d, J = 7.5 Hz, IH), 4.05 (broad s, IH), 1.75-1.30 (m, 2H), 1.34 (s, 9H), 0.93 (broad s, 3H). ESI-MS m/z 446.3 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 109 su prikazani ispod.

( S)- fl- f5- lfuoro- 4- olcso- 3- fenil- 3, 4- dipidro- to kiseline tert-butH estar

( 110)

[0291]Korak C: Rastvor jedinjenja 109 (125 mmol, 1 ekv.) u sirćetnoj kiselini (500 mL) je tretiran sa cinkovim prahom (48.4 g, 740 mmol, 6 ekv.) dodatim u 3 porcije, i reakcijska smeša je ostavljena da se ohladi do ispod 35°C između dodataka. Poste mešanja tokom 2h na sobnoj temperaturi, čvrste supstance su izdvojene filtriranjem putem vakumske filtracije i isprane sa sirćetnom kiselinom (50 mL). Filtrat je koncentrovan u vakumu, rastvoren u EtOAc (400 mL), ispran sa vodom (300 mL) i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (300 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa vodom (200 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (2 x 200 mL), zasićenim NaCI (100 mL), osušeni sa MgS04 i koncentrovani do sirupa. Sirup je rastvoren u toluenu (200 mL) i prečišćen putem fleš hromatografije na sloju silika gela (13 x 15 cm, 2 L suve silike) ispran sa heksanima/etil-acetat (10%, 4 L, 15%, 4 L; 17,5 %, 8 L; 25%, 4 L), da se dobije jedinjenje 110 kao beličasta penasta čvrsta supstanca (33.6 g, 69%). 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 7.83 (td, J = 8.2, 5.7 Hz, IH), 7.64-7.48 (m, 5H), 7.39 (opšti d, J = 7.6 Hz, IH), 7.30 (dd, J = 8.3 Hz, IH), 7.23 (d, J = 7.6 Hz, IH), 4.02-3.90 (m, IH), 1.76-1.66 (m, IH), 1.62-1.46 (m, IH), 1.33 (s, 9H), 0.63 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS m/z 398.3 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 110 su prikazani ispod.

fS)- 2-( l- aroino- propil)- 5- fluoro- 3- fenil- 3rl- hinazolin- 4- on ( 111)

[0292]Korak D: Rastvor jedinjenja 110 (85 mmol) u dihlorometanu (60 mL) je tretiran sa trifluorosirćetnom kisaelinom (60 mL). Reakciona smeša je mešana tokom lh, koncentrovana u vakumu, podeljena između dihlorometana (150 mL) i 10% K2CO3(količini dovoljnoj za održavanje pH veće od 10). Vodeni sloj je ekstrahovan sa dodatnim dihlorometanom (100 mL), i kombinovani organski slojevi su isprani sa vodom (50 mL) i koncentrovanim rastvorom soli (50 mL). Posle sušenja sa Mg S04, rastvor je koncentrovan da se obezbedi jedinjenje 111 kao beličasta čvrsta supstanca (22 g, 88%).

'H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 7.73-7.65 (m, IH), 7.62-7.49 (m, 4H), 7.32-7.22 (m, 2H), 7.13-7.06 (m, IH), 3.42 (dd, J = 7.5, 5.2 Hz, IH), 1.87-1.70 (m, IH), 1.58-1.43 (m, IH), 0.80 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI-MS m/z 298.2 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 111 su prikazani ispod.

( S)- 5- fluoro~ 3- fenil- 2- ri-( 9H- PUirn- 6- to ( 107 )

[0293]Korak E: Suspenzija jedinjenja 111 (65.6 mmol, 1 ekv.), 6-bromopurina (14.6 g, 73.4 mmol, 1.1 ekv.), i DIEA (24.3 mL, 140 mmol, 2 ekv.) u tert-butanolu (40 mL) je mešana tokom 24 h na 80°C. Reakciona smeša je koncentrovana u vakumu i tretirana sa vodom da se dobije sirovi produkt koji je sakupljen putem vakumske filtracije, ispran sa vodom i osušen na vazduhu. Polovina dobijenog čvrstog produkta je rastvorena u MeOH (600 mL), koncentrovana na silika gelu (300 mL suvog)_ i prečišćena putem fleš hromatografie (7.5 x 36 cm, eluirana sa 10 L 4% MeOH/CHjCIj), da bi se dobio čvrsti produkt. Čvrsti produkt je zatim rastvoren u EtOH (250 mL) i koncentrovan u vakumu do jedinjenja 107 kao svetio žute čvrste supstance (7.2 g, 50%). 'H NMR (300 MHz, 80°C, DMSO-d6) 5 12.66 (opšti s, IH), 8.11 (s, IH), 8.02 (opšti s, IH), 7.81-7.73 (m, IH), 7.60-7.42 (m, 6H), 7.25-7.15 (m, 2H), 4.97 (opštiS, IH), 2.02-1.73 (m, 2H), 0.79 (t, 1 = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS m/z 416.2 (MH<+>). C, H, N elementarna analiza (CjjHuNtOF-EtOH"0.4 H20). Hiralna čistoća 99.8:0.2 (S:R) pomoću hiralne HPLC (4.6 x 250 mm. Hiralpak ODH kolona, 20°C, 85:15 heksani: EtOH, 1 mL/min, uzorak napunjen na koncentraciji od 1 mg/mL u EtOH ). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 107 su prikazani ispod.

( S)- 3- fenil- 2- ri- f9H- purin- 6- Hamino)- etil1- 3H- hinazolin- 4- on( 112)

[0294]Jedinjenje 112 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitrobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitro-benzojevu kiselinu u koraku A i N-BOC-L-alanin je supstituisan za N-BOC L-2-aminobuternu kiselinu u koraku B. ESI-MS m/z 384.3 (MH"). Hiralna čistoća 99.5: 0.5 (S:R). Jedinjenje 112 je prikazano ispod.

( SV6- f1uoro- 3- fenil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etil)- 3H- hinazolin- 4- Qn ( 113)

[0295]Jedinjenje 113 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitro-5-fluorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitrobenzojevu kiselinu u koraku A, i N-BOC-L-alanin je supstituisan za N-BOC-L-2-aminobuternu kiselinu u koraku B. ESI-MS m/z 402.3 (MH<*>). Hiralna čistoća 99.9:0.1 (S:R). Jedinjenje 113 je prikazano ispod.

( S)- 3-( 3, 5- difluoro- fenil)- 5- metil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)-erjl 1- 3H- hinazolin- 4- on ( 114)

[0296]Jedinjenje 114 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitro-5-metilbenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitrobenzojevu kiselinu i 3,5-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, i N-BOC-L-alanin je supstituisan za N-BOC-L-2-aminobuternu kiselinu u koraku B. ESI-MS m/z 434.3 (MH<*>). Jedinjenje 114 je prikazano ispod.

( S)- 5- fluoor- 2-[ l-( 2- fluoro- 9H- purin- 6- HaminQ?- etin- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- o fllS)

[0297]Jedinjenje 115 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitro-6-fluorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitrobenzojevu kiselinu u koraku A, N-BOC-L-alanin je supstituisan za N-BOC-L-2-aminobuternu kiselinu u koraku B, i 6-hloro-2-fluoropurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku E. ESI-MS m/z 420.3 (MH<*>). 100:0 (S:R). Jedinjenje 115 je prikazano ispod.

fS)- 3-( 3- nuoro- fenil)- 2- fl-( 9H- Purin- 6- ilaminoVetin- 3H- h

[0298]Jedinjenje 116 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitrobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitrobenzojevu kiselinu i 3-fluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, i N-BOC-L-alanin je supstituisan za N-BOC-L-2-aminobuternu kiselinu u koraku B. ESI-MS m/z 402.3 (MH<*>). Hiralna čistoća 96:4 (S:R). Jedinjenje 116 je prikazano ispod.

( S)- 5- hloro- 3-( 3, 5- dilfuoro- fenil)- 2^^ ( 11?)

[0299]Jedinjenje 117 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitro-5-hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitrobenzojevu kiselinu, i 3,5-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A. ESI-MS m/z 468.3 (MH<*>). Hiralna čistoća 100:0 (S:R). Jedinjenje 117 je prikazano ispod.

( S)- 3-( 2, 6- difluoor- fenil)- 5- metil- 2-[ l-( 9H- r^rin-6-ilamino)- et» ( 118)

[0300]Jedinjenje 118 je pripremljeno korišćenjem alternativnog koraka B u odnosu na pripremu jedinjenja 107, ali opšta procedura opisana iznad za jedinjenje 107 je inače generalno praćena za svaki od koraka A, C i D.

H-( 2, 6- difluoro- fenil)- 2- metil- 6- nitro- benzamtd( 118a)

[0301]Korak A: Jedinjenje 118a je pripremljeno praćenjem procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-nitro-5-metilbenzojeva kiselina je supstituisana za 2-fluoro-6-nitro-benzojevu kiselinu i 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin.

L-{ 2-[( 2, 6- difluorci- fenilH2- metil- 6- nifr^ kiseline

tert-butil estar (118b i

[0302]Korak B: Jedinjenje 118b je pripremljeno tretiranjem rastvora jedinjenja 118a (13.8 g, 47 mmol) u THF (200 mL)

u kapima sa rastvorom kalijum heksametildisilaziđa (KHMDS) (0.5 M u toluenu, 95 mL, 47 mmol, 1 ekv.) na O'C i mešanjem reakcione smeše tokom 30 min na istoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim tretirana sa L-2-tert-

butoksikarbonilamino-propionske kiselie 2,5-diokso-pirolidin-l-il estrom (13.5 g, 47 mmol, 1 ekv.) i mešana na istoj temperaturi tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je ugašena sa vodom (50 mL) i koncentrovana u vakumu. Ostatak je rastvoren u etil acetatu (300 mL), i ispran sa 100 mL svakim od sledećih: (1) vodom, (2) zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, (3) vodom, (4) 5% limunskom kiselinom, (5) vodom, i (6) koncentrovanim rastvorom soli. Organski sloj je osušen sa MgSO« i koncentrovan do sirupa. Sirovi materijal je rastvoren u dihlorometanu (75 mL) i prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (7.5 x 40 cm), eluiran sa 20% EtOAc u heksanima (10 L 20%, zatim 6 L 33%).

[0303]Koraci C i D su izvedeni kao što je opisano u odnosu na pripremu jedinjenja 107. ESI-MS m/z 434.3 (MH<+>). Hiralna čistoća 100: 0 (S:R). Jedinjenje 118 je prikazano ispod.

( S)- 3-(2. 6- difluoro- fenili- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamtno)- etil1- 3H- hinazolin- 4- on f! 19)

[0304]Jedinjenje 119 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 118, ali 2-nitrobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-nitro-5-metilbenzojevu kiselinu. ESI-MS m/z 420.3 (MH<*>). Hiralna čistoća 100:0 (S:R). Jedinjenje 119 je prikazano ispod.

5- Metil- 3- fenil- 2- f3. 3. 3- tjinuoro- l- f9H- puirn- 6- ilamino)- propil]- 3H- hinazolin- 4- on ( 120)

[0305]Jedinjenje 120 je pripremljeno korišćenjem opšte procedure opisane iznad u odnosu na jedinjenje 107, ali 2-metil-6-nitro-benzojeva kiselina je supstituisana za 2-ftuoro-6-nitro-benzojevu kiselinu u koraku A i 2-tert-butoksikarbonilamino-4,4,4-trifluoro-buterna kiselina je supstituisana za 2-tert-butoksikarbonilamino-buternu kiselinu u koraku B. ESI-MS m/z 466 (MH<+>). Jedinjenje 120 je prikazano ispod.

P RIMER 10(Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0306]Jedinjenja koja imaju opštu formulu I (prikazanu ispod) su bila pripremljena u skadu sa koracima A-D sintetske šeme pod nazivom "Procedura C" prikazane ispod. Alternativna sintetska šema pod nazivom "Šema D" iiustruje dodatne sintetske puteve za jedinjenja koja imaju formulu I.

Procedura C;

[0307]

[0308]Sinteza jedinjenja u skladu sa procedurom C i Šemom D je prvo prikazana putem sintetske procedure za 3-(3-hidroksi-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on, takođe se odnosi na jedinjenje 121, čija je struktura prikazana ispod.

3-(3-Hidroati-fen il)- 5- metil- 2- fl-( 9H- purin^

[0309]Jedinjenje 121 je pripremljeno prateći korake A-D ispod, i korišćenjem jedinjenja 122 (ispod) u koraku A.

3-( tert- butil dimetilsililoksi) fenilamin ( 122)

[0310]250 mL, trogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa tert-butildimetilsilil hloridom (12.5 g, 82.8 mmol), imidazolom (7.64 g, 112 mmol), i anhdrovanim DMF (60mL). 3-aminofenol (10.0 g, 91.7 mmol) je dodat u dobijeni rastvor. Posle mešanja tokom 12 h na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je sipana u vodu (300 mL). Dobijena suspenzija je ekstrahovana sa heksanima (3 x 300 mL), i ekstrakti su kombinovani, osušeni preko natrijum sulfata, i filtrirani. Koncentracija filtrata praćena hromatografijom na koloni je dala jedinjenje 122 kao svetio žuto ulje.<!>H NMR (DMSO-ds) 5 (ppm), 6.84 (t, IH, J = 7.9 Hz), 6.16 (d, IH, J = 6.7 Hz), 6.10 (m, IH), 5.97 (d, IH, J = 9.1 Hz), 4.98 (s, 2H), 0.95 (s, 9H), 0.16 (s, 6H); m/z = 224 (M+H).

2- amino- 6- meOI- N-[( 3- tert- butil- dirnetil- silanoksi)- fenill- benzamid (123)

[0311]Korak A: 5-L, trogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa tzv."gas bubbler", mehaničkom mešalicom, refluksnim kondenzatorom je napunjena sa 6-amino-2-metilbenzojevom kiselinom (25 g, 16.8 mmol), toluenom (300 mL), i tionil hloridom (50 ml). Reakciona smeša je refluksovana tokom 1 h do prestanka razvijanja gasa. Dobijena smeša je zatim ohlađena i koncentrovana pod sniženim pritiskom na 50°C. Anhidrovani THF (400 mL) i DIEA (90 mL) su dodati u dobijeni ostatak, praćeni jedinjenjem 122 (37 g, 1.0 ekv). Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim ugašena dodavanjem 20% vodenog kalijum karbonata (250 mL). Organski sloj je odvojen i koncentrovan do suvoće pod sniženim pritiskom. Trituracija ostatka sa MtBE (70 mL), filtracija i sušenje su dali jedinjenje 123. Priprema jedinjenja 123 je generalno prikazana iznad kao korak A Procedure C.

1- <r3-( 3- Hidroksi* fenil)- 5- metil- 4- okso- 3. 4- dihidfo- hinazolin- 2- il]- etil>- kart^ kiseli ne - tert butil

estar (124)

[0312]Korak B: 100-mL, trogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je prečišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 123 (10 g, 28 mmol), N-tert-butiloksikarbonilalanin N-hidroksisukcinimid estrom (9.60 g, 1.0 ekv.), DMAP (1.90 g), DIEA (6 mL), 4A molekularnih sita (1.20 g), i anhidrovanog toluena (100 mL). Dobijena smeša je zagrevana u uljanoj kupki na 80°C tokom 24 h. 1-Hidroksibenzotriazol (3.78 g) je bio dodat u reakciju, i zagrevanje je nastavljeno tokom dodatnih 48h. Posle hlađenja, toluen (10 mL) i CELTTP<*>(0.70 g) su dodati u toplu reakcionu smešu, praćeni filtracijom i evaporacijom filtrata da bi se dobio braon ostatak. Ostatak je rastvoren u CH2CI2(15 mL) i tretiran sa rastvorom tetrabutilammonijum fluorida (5.12 g) u MeOH (15 mL). Posle mešanja tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je evaporisana do suvoće pod sniženim pritiskom, i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni da se dobije 81% prinosa jedinjenja 124 kao beličaste čvrste supstance. Priprema jedinjenja 124 je generalno prikazana iznad kao korak B Procedure C.

2- ( l- amino- etil)- 3-( 3- hidrc>ksi- fenil)- 5- metil- 3H- hinazolin- 4- on ( 125)

[0313]Korak Cl: 100-mL, trogrla, laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je napunjena sa jedinjenjem 124 (4.50 g, 11.18 mmol) u CHjCI; (15 mL) i TFA (15 mL). Posle mešanja tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 125, koje je korišćeno kao takvo u sledećem koraku.

3- f3- hidroksi- fenil)- 5- metil- 2-/ l- r9-( 2- tirmetilsHanH- etoksimetil)- 9H

4- on ( 126)

[0314]Korak C2: Prečišćena azotom, 50 mL jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je napunjena sa jedinjenjem 125 (2.4 g, 8.16 mmol), intermedijarnim jedinjenjem 10 (2.70 g, 1.0 ekv.), n-butanolom (20 mL) i DIEA (4.2 mL). Smeša je zagrevana na 100°C tokom 4 sata, zatim ohlađena do sobne temperature. Koncentracija reakcione smeše pod visokim vakumom, praćena hromatografijom na koloni je dala jedinjenje kao belu čvrstu supstancu. Priprema jedinjenja 126 je generalno prikazana iznad kao korak C Procedure C.

3- f3- hidroksi- fenil)- 5- metil- 2- ri- f9H- PUirn- 6- Hamino)- etil1- 3H- hina20lin- 4- on f! 21)

[0315]Korak D: 100-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom, opremljena sa magnetnom mešalicom je napunjena sa jedinjenjem 126 (294 mg, 0.5 mmol), MeOH (15 mL) i 4N hlorovodičnom kiselinom (15 mL), i reakciona smeša je zagrevana tokom 5h na 40°C. Evaporacija metanola pod smanjenim pritiskom, praćena bazifikacijom na pri 10 sa 10%-tnim vodenim kalijum karbonatom je dala beli precipitat. Precipitat je filtriran, ispran sa vodom i osušen preko noći u vakumu na sobnoj temperaturi da bi se dobilo jedinjenje 121 kao bela čvrsta supstanca. m/z = 414 (M + H). Priprema jedinjenja 121 je generalno prikazana iznad kao korak D Procedure C.

3- f3- metoksi- fenH)- 5- metJI- 2- <l- f9-( 2- trimeHl5ilanil- etoksimetil)- 9H- puri

4- on ( 127)

[0316]100-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom, opremljena sa magnetnom mešalicom je napunjena sa jedinjenjem 126 (370 mg, 0.68 mmol), kalijum karbonatom (235 mg, 1.70 mmol), i DMF (4 mL). Dobijena smeša je mešana tokom 5 min, i zatim je dodat metil jodid (435 mg, 3.10 mmol). Posle mešanja tokom sledećeg lh na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je evaporisana do suvoće pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobio prinos od 82% jedinjenja 127 kao svetio žuto ulje.<!>H NMR (CDjOD) 5 (ppm) 8.20 (m, 2H), 6.99-7.66 (m, 7 H), 5.58 (s, 2H), 5.15 (bs, IH), 3.62 (dt, 2H, J = 1.8, 8.0 Hz), 3.32 (s, 3H), 2.78 (s, 3H), 1.55 (m, 3H), 0.88 (m, 2H), -0.07 (s 9H); m/z = 558 (M+H).

3-( 3- metoksi- fenil)- S- metil- 2-^l- r9H- purin- 6- ilamino1- etil>- 3H- hinazolin- 4- on ( 128)

[0317]Jedinjenje 127 je reagovalo u skladu sa procedurom opisanom iznad za jedinjenje 121 (korak D) da se obezbedi jedinjenje 128. m/z = 428 (M+H). Struktura jedinjenja 128 je prikazana ispod.

3-(3-Metoksi-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin^4-on (128)

3- r3-( 2- dimetilamino- etoksi)- fenil1- 5- metH- 2- <l- r9H- purin- 6- i»amino]- etl>- 3H- hinazotOT ( 129)

[0318]Jedinjenje 126 (300 mg, 0,54 mmol) je tretirano sa 2-hloro etil dimetilamin hidrohloridnom soli, na 90°C tokom 17h, korišćenjem procedure opisane iznad za jedinjenje 127, Dobijeno jedinjenje je zatim tretirano sa 4N HCI u MeOH, korišćenjem procedure opisane za jedinjenje 121 (korak D). Dobijeno je jedinjenje 129. m/z = 485 (M + H). Struktura jedinjenja 129 je prikazana ispod.

3-[3-(2-Dimetilamino-etoksi)-fenil]-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin^-on (129)

3- f3- ciklopropilmetoksKenil)- S- m^ (130)

[0319]Jedinjenje 126 (300 mg, 0.54 mmol) je tretirano sa bromometil ciklopropanom korišćenjem procedure koja je istaknuta za jedinjenje 127, na sobnoj temperaturi tokom 24h. Ovaj intermedijar je tretiran sa 4N HCI u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 121 (korak D). m/z = 468 (M+H). Struktura jedinjenja 130 je prikazana ispod.

3-(3-Ciklopropilmetoksi-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on (130)

5- metil- 3-( 3- prop- 2- iniloksi- fefHl)- 2-^ ( 131)

[0320]Jedinjenje 126 (300 mg, 0.54 mmol) je tretirano sa propargil bromidom na sobnoj temperaturi tokom 24h korišćenjem procedure opisane iznad za jedinjenje 127. Ovaj intermedijer je zatim tretiran sa 4N HCI u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 121 (korak D). m/z = 467 (M+H). Struktura jedinjenja 131 je prikazana ispod.

5-Metil-3-(3-prop-2-iniloksi-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on (131)

2-{l-[ 2- amino- 9H- purin- 6- Hammo1eOI>- 3-( 3- hidorksifenil)- 5- mettl- 3H ( 1321

[0321]Jedinjenje 132 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A i B ispod.

2~ f l-[ 2- diteTt- butiloksikarbonHamino- 9-( 2- tri^

hidroksifenil)- 5- metil- 3H- hinazolin- 4- on ( 133)

[0322]Korak A: Prečišćena azotom, 50 mL jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je napunjena sa jedinjenjem 125 (3.02 g, 10.2 mmol), intermedijarnim jedinjenjem 12 (5.56 g, 1.0 ekv.), n-butanolom (20 mL) i DIPEA (6.0 mL). Smeša je zagrevana na 100°C tokom lh, zatim ohlađena do sobne temperature. Koncentracija reakcione smeše pod visokim vakumom, praćena hromatografijom na koloni je dala jedinjenje 133 kao belu čvrstu supstancu.

2- fl-[ 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino] etil)- 3- f3- hidroksifenil)- 5- metil- 3H- hinazolin- 4- on ( 132)

[0323]Korak B: Jedinjenje 133 je rastvoreno u MeOH (3 mL), tretirano sa 4N HCI (3 ml) i zagrevano na 40°C tokom 6h. Reakciona smeša je zatim koncentrovana na približno pola zapremine i podeljena između vode (5 mL) i etil acetata (10 mL). Vodeni sloj je izdvojen, bazifikovan sa kalijum karbonatom do pH 10 i filtriran. Posle ispiranja filterskog kolača sa vodom (5 mL) i sušenja pod vakumom, jedinjenje 132 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca. m/z= 429 (M+H). Struktura jedinjenja 132 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-eti!]-3-(3-hidroksi-fenil)-5-metil-3H-hinazolin^-on (132)

2- f l-[ 2- amino- 9H- purin- 6- i>amino] etilV3- f3- metoksifenil )- 5- metil- 3H- hina2olin- 4- on ( 134)

[0324]Jedinjenje 133 (300 mg, 0.39 mmol) je tretirano sa metil jodidom korišćenjem procedure opisane uznad za jedinjenje 127. Ovaj intermedijer je zatim tretiran sa 4N HCI u skladu sa procedurom opisanom iznad za jedinjenje 132 (korak D). m/z = 443 (M+H). Struktura jedinjenja 134 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-puhn-6-ilamino)-etil]-3-(3-metoksi-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on (134)

2- fl- r2- amino- 9H- purin- 6- ilaminoJetil>- 3-( 3- ciklopropilmetoksi- fe ( 135)

[0325]Jedinjenje 133 (231 mg, 0.30 mmol) je tretirano sa ciklopropil metil bromidom korišćenjem procedure opisane uznad za jedinjenje 127. Generisani intermedijer je zatim tretiran sa 4N HCI u MeOH u skladu sa procedurom opisanom iznad za jedinjenje 132 (korak B). m/z = 483 (M+H). Struktura jedinjenja 135 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-ciklopropilmetoksi-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on (135)

2- il-[ 2- amino- 9H- purin- 6Hlaminoletil>- 5- metil- 3-( 3- prop- 2Hniloto ( 136)

[0326]Jedinjenje 133 (231 mg, 0.30 mmol) je tretirano sa propargil bromidom korišćenjem procedure opisane iznad za jedinjenje 127. Generisani intermedijer je zatim tretiran sa 4N HCI u MeOH u skladu sa procedurom opisanom iznad za jedinjenje 132 (korak B). m/z = 467 (M+H). Struktura jedinjenja 136 je prikazana ispod.

2- [l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-(3-prop-2-iniloksi-fenil)-3H-hinazolin-4-on (136)

3- ( 3- etinil- fenil)- 5- metil- 2- fl-( 9H- purin- 6- ilamm^ ( 137)

[0327]Jedinjenje 137 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A-C ispod.

Trifluorometan sulfonske kiseline 3- f5- metil- 4- okso- 2-^ l- r9- f2- trimetilsilanil- etoksirnetil)- 9H- purirt- 6-

ilamino]- etil>- 4H- hinazolin- 3- il)- fenil estar ( 138)

[0328]Korak A: 50-mL, tro-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom, opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 126 (500 mg, 0.92 mmol), trietilaminom (218 mg, 2.16 mmol), anhidrovanim metilen hloridom (10 mL) i N-feniltrifluorometansulfonimidom (496 mg, 1.39 mmol). Posle mešanja tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je podeljena između metilen htorida (50 mL) i 10% vodenog kalijum karbonata (50 mL). Organska faza je izdvojena, osušena preko natrijum sulfata i filtrira. Koncentracija filtrata praćena hromatografijom na koloni je dala prinos od 77% jedinjenja 138 kao beličaste čvrste supstance.<!>H NMR (DMSO-d6) 5 (ppm) 8.32 (bs, IH), 7.48-8.18 (m, 7H), 7.30 (d, IH, J = 8.0 Hz), 5.51 (s, 2H), 4.75-4.85 (m, IH), 3.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.72 (s, 3H), 1.46 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.83 (dt, 2H, J = 1.6, 8.1 Hz), -0.09 (s, 9H).

5- Metil- 2- n- r9-( 2- trimetilsitiletok

hirtazolin- 4- on ( 139)

[0329]Korak B: 5-mL reakđona posuda opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 138 (220 mg, 0.33 mmol), dihlorobis(trifenilfosfin)paladijumom(II) (27.1 mg, 0.039 mmol), i anhidrovanim DMF (1 mL). Trietilamin (146 mg, 1.44 mmol) i (trimetilsilil)acetilen (102 mg, 1.04 mmol) su dodati, i reakciona smeša je mešana tokom lOh na 90°C i dodatnih 8 h na 100°C. Evaporacija reakdone smeše do suvoće praćena prečišćavanjem hromatografije na koloni je dala 63% prinosa jedinjenja 139 kao beličaste čvrste supstance. 'H NMR(CD30A)6 (ppm) 7.43-8.33 (m, 8H), 7.30 (d, IH, J = 6.6 Hz), 5.64 (s, 2H), 5.14 (bs, IH), 3.68 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.81 (s, 3H), 1.59-1.64 (m, 3H), 0.94 (m, 2H), 0.32 (s, 9H), -0.09 (s, 9H).

3-( 3- etinil- fenM)- 5- metil- 2- ri-( 9H- purin- 6- ilaniino)-etil1-3 H- hinazolin- 4- on ( 137)

[0330]Korak C: Jedinjenje 139 (113 mg, 0.18 mmol) je tretirano sa 4N HCI u MeOH prema proceduri opisanoj za jedinjenje 121 (korak D). Ovo je dalo jedinjenje 137. m/z = 422 (M+H). Struktura jedinjenja 137 je prikazana ispod.

3-(3-Etinil-fenil)-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-eti!]-3H-hinazolin^l-on (137)

3- <5- me01- 4- Qkso- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etil1- 4H- hinazolin- 3- il>- benzon ( 140)

[0331]Jedinjenje 140 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A i B ispod.

3-( 5- metil- 4- o»^- 2- <l-[ 9-( 2- trimeW^^

il) benzonitril( 141)

[0332]Korak A: 5-mL reakciona posuda je opremljena sa magnetnom mešalicom i napunjena sa jedinjenjem 138 (200 mg, 0.300 mmol), tetrakis(trifenilfosfin)paladijumom (34.0 mg, 0.029 mmol), cink cijanidom (70 mg, 0.60 mmol) i anhidrovanim DMF (1 mL). Freuda je očišćena azotom, zagrevana na 120°C tokom 35 sata, zatim ohlađena do sobne temperature i sipana u zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (25 mL). Dobijena suspenzija je ekstrahovana sa metilen hloridom (3 x 20 mL), i organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko natrijum sulfata i filtrirani. Koncentriacija filtrata praćena prečišćavanjem putem hromatografie na koloni je dala prinos od 66% jedinjenja 141 kao bele čvrste supstance. 'H NMR (CDCfj) 5 (ppm) 8.30 (d, IH, J = 6.9 Hz), 7.58-8.02 (m, 7H), 7.30 (d, IH, J = 7.0 Hz), 5.60 (s, 2H), 5.07 (bs, IH), 3.65 (m, 2H), 2.84 (s, 3H), 1.58 (d, 3H, J = 6.7 Hz), 0.96 (m, 2H), 0.02 (s, 9H).

3- f5- Metil- 4- okso- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 4H- hinazolin- 3- H>- benzon

[0333]Korak B: Jedinjenje 141 je tretirano sa 4N HCL u MeOH tokom 1 sata korišćenjem procedure opisane za jedinjenje 121 (korak B) da se obezbedi jedinjenje 140. m/z = 423 (M+H). Struktura jedinjenja 140 je prikazana ispod.

3-{5-Mettt-4-okso-2-[l-(9^ (140)

3H>- MetH- 4H) tao- 2-{ l-[ 9H- purin- 6- ilamfa^ ( 142)

[0334]Jedinjenje 142 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A i B ispod.

3-( 5- MetH- 4- ofcso- 2-- ri- r9-( 2- trimetilsilMetoksim^

il) benzamid f! 43)

[0335]Korak A: 100-mL, tro-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je očišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 141 (219 mg, 0.40 mmol) i anhidrovanim metilen hloridom (15 mL). N,N-Dietilhidroksilamin (146 mg, 1.64 mmol) je dodat u dobijeni rastvor, i reakciona smeša je zagrevana tokom 16h na 50°C, ohladđena do sobne temperature, i zatim evaporisana do suvoće pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni da se dobije prinos od 97% jedinjenja 143 kao bele čvrste supstance. m.p 195-197°C; 'H NMR (CDCI3) 5 (ppm) 8.34 (d, IH, J = 10.9 Hz), 7.59-8.06 (m, 7H), 7.28 (m, IH), 6.95 (bs, IH), 6.00 (bs, 2H), 5.60 (s, 2H), 5.28 (bs, IH), 3.62 (t, 2H, J = 8.4 Hz), 2.85 (s, 3H), 1.53 (dd, 3H, J = 6.7, 10.8 Hz), 0.96 (t, 2H, J= 8.3 Hz), 0.01 (s, 9H); m/z = 571 (M+H).

3-^ 5- Metil- 4- okso- 2-{ l- r9H- purin- 6- ilami^ ( 142)

[0336]Korak B: Jedinjenje 143 je tretirano sa 4N HCL u MeOH tokom 1.5 sata korišćenjem procedure opisane za jedinjenje 121 (korak D) da se obezbedi jedinjenje 142. m/z = 441 (M+H). Struktura jedinjenja 142 je prikazana ispod.

3-{5-MeBI-4-okso-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etit]-4H-hinazolin-3-il)-benzamid (142)

3-( 3- acetH- fenil)- 5- metii- 2- n-[ 9H- puri^

[0337]Jedinjenje 139 je tretirano sa 4N HCI u MeOH na 70°C tokom 16 sati u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 121 (korak D). Ova reakcija je dala jedinjenje 144, čija je struktura prikazana ispod, m/z = 440 (M+H)

3-(3-Acetil-feni!)-S-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-ebl]-3H-hinaz (144)

2-( 3-( 5- metil- 4- okso- 2-{ l-[ 9H- purin- 6- Hamm^ acetamid ( 145)

[0338]Jedinjenje 126 (300 mg, 0.54 mmol) je tretirano sa 2 bromo acetamidom korišćenjem procedure istaknute iznad za jedinjenje 127. Reakcija je bila pod refluksom tokom 24 sati u CH3CN. Ovaj intermedijer je tretiran sa 4N HCI u MeOH tokom 1 sata, praćen procedurom opisanom za jedinjenje 121 (korak D), da se obezbedi jedinjenje 145. m/z = 471 (M+H). Struktura jedinjenja 145 je prikazana ispod.

2-(3-{5-Metil-4-okso-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]^H-hinazolin-3-il}-fenoksi)-acetamid (145)

5-metil-2-< l- f9H- puirn- 6- ilamino1^^ ( 146)

[0339]25-mL, tro-gria laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je prečišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 126 (270 mg, 0.5 mmol), tetrahidro piran-4-ol (60 uL), trifenilfosfinom (560 mg), THF(5 mL), i dietil azodikarboksilatom (340 uL ). Posie mešanja tokom 16 sati na sobnoj temperaturi, reakcijska smeša je evaporisana do suvoće i ostatak je rastvoren u metanolu (3 mL), tretiran sa 4N hlorovodoničnom kiselinom (3 mL), i zagrevan na 40°C tokom 6 sati. Reakdona smeša je zatim koncentrovana na približno pola zapremine i podeljena između vode (5 mL) i etil acetata (10 mL). Vodeni sloj je izdvojen, bazifikovan sa kalijum karbonatom do pH 10 i filtriran. Posle ispiranja filterskog kolača sa vodom (5 mL) i sušenja pod vakumom, jedinjenje 146 je dobijeno. m/z = 498 (M+H). Struktura jedinjenja 146 je prikazana ispod.

5-Metil-2-[l-(9H-purin-6-ilam^ (146)

3- r3-( 2- meot^ etoksi)- fenil1- 5- metil- 2-[ l-( 9H- purin- 6- namino)- etil]- 3H- hinazolin- 4- on ( 147)

[0340]Jedinjenje 126 (300 mg, 0.54 mmol) je tretirano sa totuen 4-suifonske kiseline 2-metoksi etil estrom na 50°C tokom 42h korišćenjem procedure opisane iznad za jedinjenje 127. Generisani intermedijer je zatim tretiran sa 4N HCI u MeOH, korišćenjem procedure opisane iznad za jedinjenje 121 (korak 0) m/z= 487 (M+H):

343-(2-Metoksi-etol<si)-renil]-5-metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazolin-4-on (147)

6- fluoro- 2- fl-( 9H- purin- 6- Hamino) ettl1^ ( 148)

[0341]Jedinjenje 148 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A i B ispod.

6- nuoro- 3- f3- hidroksi- fenilV2-^ l-[ 9-( 2- trimetilsi<anU- etoksimeUI)- 9H- pufin- 6ila m) no- etil>- 3H- hinazQlin-4- on ( 149)

[0342]Korak A: Jedinjenje 149 je dobijeno iz 6-amino 3-fluoro benzojeve kiseline korišćenjem procedura opisanih iznad za jedinjenja 123,124, 125, i 126.

6- fluoro- 2-[ l-( 9H- purin- 6- ilamino) etill- 3- f3-( teto ( 148)

[0343]Korak B: Jedinjenje 148 je dobijeno iz jedinjenja 149 korišćenjem procedure opisane za jedinjenje 146. m/z = 502 (M+H). Struktura jedinjenja 148 je prikazana ispod.

6-Fluoro-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-[3-(tetrahidro-piran-4-iloksi)-fenil]-3H-hinazolin-4-on (148)

3- r3- f3- dimethilamino- propoksi)- fenil1- 5- metil-2-ri-( 9H- purin- 6H ( 150)

[0344]Jedinjenje 150 je dobijeno praćenjem opšte procedure opisane za jedinjenje 146, ali 3-dimetilamino-l-propanol je korišćen umesto tetrahidropiran-4-ol. m/z= 499 (M+H). Struktura jedinjenja 150 je prikazana ispod.

3-[3-(3-Dimen'lamino-pro|X)^ (150)

2- ri- <2- amlno- 9H- puirn- 6- ilamino)- etill- 3- f3- etinil- fenH)- 5- metil- 3H- hina fl51)

[0345] Jedinjenje151 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A i B ispod.

Trifluorometan sulfonske kiseline 3-{2- ri-( 2- di tert- butiloksikaii>onilaminQ- 9-( 2- Wmetilsililetoksimetil)-purin- 6ilamino)- etin- 5- metil- 4- okso- 4rl- hinazolin- 3- il')- fenil estar ( 152)

[0346]Korak A: Jedinjenje 152 je dobijeno iz jedinjenja 133, koje je reagovalo u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 138.

2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- etin- 3-( 3- ettnih^ ( 151)

[0347]Korak B: Jedinjenje 151 je dobijeno iz jedinjenja 152, koje je reagovalo u skladu sa procedurama za jedinjenja 139 i 137 (korak C). m/z = 437 (M+H). Struktura jedinjenja 151 je prikazana ispod.

2- [l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-etinil-fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on (151)

3- f2- ri-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- etill- 5- metil^ ( 153)

[0348]Jedinjenje 153 je dobijeno iz jedinjenja 152, koje je reagovalo u skladu sa procedurom za jedinjenja 141 i 140 (korak D) opisanom ovde. m/z = 438 (M+H). Struktura jedinjenja 153 je prikazana ispod.

3-{2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamiro^ (153)

3- <2- fl-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilam8no)- etil1- 5- metil- 4- okso- 4H- hinazolin- 3- H>- benza ( 154)

[0349]Jedinjenje 154 je dobijeno prvo reagovanjem jedinjenja 152 u skladu sa procedurom za jedinjenje 141. Reakdoni produkt je zatim dalje reagovao u skladu sa procedurom za jedinjenja 143 i 142 (korak B). m/z = 456 (M+H). Struktura jedinjenja 154 je prikazana ispod.

3-{2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil3-5-metil-4-okso-4H-hinazolin-3-il}-benzamid (154)

3- <2-[ l-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- etil]- 5- metil- 4- okso- 4H- hinazolin- 3- il>- penzarnid ( 155)

[0350]Jedinjenje 155 je dobijeno prvo reagovanjem jedinjenja 151 u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 139. Ovaj reakcioni produkt je tretiran u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 144. m/z= 455 (M+H). Struktura jedinjenja 155 je prikazana ispod.

3-(3-Acetil-fenii)-2-[l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3H-hinazolin-4-on (155)

5- meOI- 3- f3- iTjwrfo1in- 4- il- fenM)-^ ( 156)

[0351]Jedinjenje 156 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavjenom u koracima A i B ispod.

5- metil- 3-( 3- morfolino- 4- ii- fenilV2-^

hinazolin- 4- on ( 157)

[0352]Korak A: 3-mL reakciona posuda je napunjena sa jedinjenjem 138 (96.1 mg, 0.142 mmol), paladijum(II) acetatom (3.20 mg, 0.014 mmol), cezijum karbonatom (84.2 mg, 0.258 mmol) i (+J-BINAP (tj., 2,2'-bis(difeniIfosfino)-l,l'-binaftil) (13.8 mg, 0.022 mmol). Posuda je zatim isprana mlazom azota tokom 10 min. Toluen (0.3 mL) i morfolin (18 pL) su zatim dodati, i rastvor je zagrevan na 100°C tokom 6 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa dihlorometanom (5 mL), filtriran, i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Preparativna HPLC ostatka je dala jedinjenje 157 kao žuto ulje. *H NMR (CH3OD) 6 (ppm) 8.24-8.30 (m, 2H), 7.48-7.72 (m, 3H), 7.33 (m, 2H), 6.94-7.13 (m, 3H), 5.56 i 5.64 (dva s, CH; rotamer odnos 1:10), 5.15-5.30 (m, IH), 3.90 (m, 2H), 3.76 (m, 2H), 3.67 (m, 2H), 3.28 (m, IH), 2.97-3.15 (m, 3H), 2.84 (s, 3H), 1.62 (m, 3H), 0.96 (m, 2H), -0.03 (s, 9H).

5- metil- 3-( 3- ororfolin- 4- iNfeniQ- 2- ri-( 9H- puri^^ ( 156)

[0353]Korak B: Jedinjenje 156 je pripremljeno reagovanjem jedinjenja 157 u skladu sa procedurom za pripremu jedinjenja 137 (konačni korak C). m/z=483(M+H). Struktura jedinjenja 156 je prikazana ispod.

5-Metil-3-(3-morfolin-4-il-fenil)-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-hinazo!in^-on (156)

2- ri- f2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- eMn«5- metil- 3-( 3- morfoHn- 4- H- fe ( 158)

[0354]Jedinjenje 158 je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom za jedinjenje 129, ali jedinjenje 133 je korišćeno umesto jedinjenja 126. m/z=498 (M+H). Struktura jedinjenja 158 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-meitl-3-(3-morfolin-4-il-fenil)-3H-hinazolin-4-on (158)

2-ri-(2-aml no- 9H- puirn- 6- ilamino)- etin^

[0355]Jedinjenje 159 je pripremljeno reagovanjem jedinjenja 133 u skladu sa procedurom za pripremu jedinjenja 147.

m/z = 487 (M+H). Struktura jedinjenja 159 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-[3-(2-metol<si-etoksi)-fenil]-5-metil-3rl-hinazolin-4-on (159)

2- fl-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilamino)- etin- 3-[ 3-( 2- dimethilamino- etoksi)- fenH1- 5-

on( 160i

[0356]Jedinjenje 160 je pripremljeno reagovanjem jedinjenja 133 u skladu sa procedurom za pripremu jedinjenja 146.

m/z= 500 (M+H). Struktura jedinjenja 160 je prikazana ispod.

2-[l-(2-Amino-9H-purin-6-itamino)-et^ (160)

PRIMER 11(Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0357]Jedinjenja koja imaju opštu formulu I (prikazanu iznad) su pripremljena u skladu sa koracima A-D u sintetičkoj šemi pod nazivom "Procedura E" prikazanoj ispod. Procedura E obezbeđuje dodatnu alternativnu metodu za pripremu jedinjenja sa različitim bočnim lancima dodatih za linker između hinazolinona i prstenova purina jedinjenja pronalaska. Iako je propargil funkcionalna grupa ilustrativno prikazana, ilustrovana metoda u Proceduri E je primenjiva na mnogim poznatim funkcionalnim grupama.

Procedura E

[0358]

2- ri- f2- ammo- 9H- purin- 6- ilamino)- but- 3- inil1- 5- metU- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 16D

[0359]Jedinjenje 161 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A-D ispod.

2-[( Benzhidriliden- amino>- metin- 5- mea' l- 3- fenH- 3H- hinazo1in- 4- on ( 162)

[0360]Korak A: 100-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je napunjena sa 2-aminometil-5-metil-3-fenil-3H-hinazolin-4-ori (2.91 g, 11.0 mmol), benzhidrilidenaminom (2.39 g, 13.2 mmol), i 1,2-dihIoroetanom (15 mL). Reakciona smeša je zagrevana na refluksu tokom 4h pod atmosferom azota i zatim ohlađena do sobne temperature. Koncentracija pod smanjenim pritiskom praćena prečišćavanjem hromatografijom na koloni je dala jedinjenje 162 kao narandžastu čvrstu supstancu. m.p. 49°C (dec);'H NMR (DMSO-de) 5 (ppm) 7.22-7.78 (m, 17H), 6.74 (m, IH), 4.17 (s, 2H), 2.74 (s, 3H); m/z = 430 (M+H). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 162 su prikazani ispod.

2- fl-( Benzhidriliden- amino)- but- 3- inin- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 163)

[0361]Korak B: 25-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je očišćena azotom i napunjena sa jedinjenjem 162 (500 mg, 1.20 mmol) i anhidrovanim THF (4 mL). IM rastvora kalijum tertbutoksida u THF (1.40 mL, 1.40 mmol) je dodat u porcijama. Posle mešanja tokom 20 min na sobnoj temperaturi, 80% rastvor propargil bromida u toluenu (210 pL, 1.89 mmol) je dodat, i reakcija je mešana tokom dodatnih 15 min na sobnoj temperaturi. Zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (5 mL) je zatim dodat, slojevi su odvojeni, i vodeni sloj ekstrahovan etil-acetatom (2 x 10 mL). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje ostatka hromatografijom na koloni je dalo produkt kao žutu čvrstu supstancu. 'H NMR (CD3OD) 5 7.72 (m, 2H), 7.24-7.67 (m, 3H), 6.77 (m, 3H), 4.61 (t, IH, J = 7.1 Hz), 3.01-3.11 (m, IH), 2.76 (s, 3H), 2.57 (m, IH), 2.23 (t, IH, J = 2.5 Hz). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 163 su prikazani ispod.

2-( l- amino- but- 3- inil)- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazoHn- 4- on ( 164)

[0362]Korak C: 50-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom je napunjena sa jedinjenjem 163 (193 mg, 0.41 mmol) i dietil etrom (5 mL). 2N rastvor hlorovodonične kiseline (5 mL) je dodat u jednoj porciji. Posle mešanja tokom 1.5h na sobnoj temperaturi, natrijum hlorid (750 mg, 12,8 mmol) je dodat u reakđonu smešu i mešanje je nastavljeno dodatnih 10 min. Dobijeni precipitat je filtriran, ispran sekvencijalno sa dietil etrom (0.5 mL), 2N hlorovodoničnom kiselinom (1 mL) i MtBE (2x1 mL). Sušenje pod vakumom na 45°C tokom 2 sata je dalo produkt kao ružičastu čvrstu supstancu. 'H NMR (DMSO-d6) 5 8.82 (s, 3H), 7.79 (t, IH, J = 7.7 Hz), 7.41-7.66 (m, 6H), 7.42 (d, IH, 3 = 7.3 Hz), 3.91 9s, IH), 3.11 (m, IH), 2.87 (m, IH), 2.75 (s, 3H), 2.54-2.67 (m, IH). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 164 su prikazani ispod.

5- metil- 3- fenil- 2-[ l-( 9H- puirn- 6- Hamino)- but- 3- inH1- 3H- hinazolin- 4- on ( 161)

[0363]Korak D: Jedinjenje 161 je pripremljeno reagovanjem jedinjenja 164 pripremljenog praćenjem procedure za pripremu Jedinjenja 14 (korak D) upotrebom tri ekvivalenta điizopropiletjlamina umesto jednog. ESI-MS m/z = 422 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 161 su prikazani ispod.

2- fl-( 2- amino- 9H- puirn- 6- ilammo)- but- 3- inH]- 5- metil- 3- fenil- 3H- hina2Qlin- 4- on ( 165)

[0364]Jedinjenje 165 je pripremljeo prateći opštu proceduru opisanu iznad za pripremu jedinjenja 161, ali 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku D. ESI-MS m/z = 437 (MH<*>).

PPJJHEJL12 (Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0365]jedinjenja koja imaju opštu formulu I (prikazanu iznad) su pripremljena u skladu sa koracima A-E u sintetičkoj šemi pod nazivom "Procedura K" prikazanoj ispod. Procedura K obezbeđuje dodatnu alternativnu metodu pripremanja takvih jedinjenja preko oksazin intermedijera (korak C).

Procedura K

[0366]

5- hloro- 3-( 3, 5- difluoro- fenil)- 2-[ l-( 9H- pu^ ( 166)

[0367]Jedinjenje 166 je pripremljeno u skladu sa procedurama postavljenim u koracima A-E ispod.

2- amino- 6- hloro- N-( 3, 5- difluoro- fenil)- ben2amid ( 167)

[0368]Korak A: Jedinjenje 167 je pripremljeo prateći proceduru za pripremu jedinjenja 15 (korak A), ali 2-amino-6-hlorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-metilbenzojevu kiselinu i 3,5- difluoroanilin je supstituisan za anilin. Reakcija opisana iznad i jedinjenje 167 su prikazani ispod.

{ l-[ 3- hloro- 2-( 3r5- difluoro- fenHkarbamoil)- fe^ kiseline tert- butil estar

( 168)

[0369]Korak B: 100-mL, jedno-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i refluksnim kondenzatorom je napunjena sa jedinjenjem 167 (10.6 mmol), N-tert-butiloksikarbonil-D,L-alanin N-hidroksisukdnimid estrom (3.64 g, 12.7 mmol), 4-N,N-dimetilaminopiridinom (710 mg, 5.82 mmol) i 4A molekularnih sita (3.00 g). Boca je očišćena sa azotom, i anhidrovani toluen (15 mL.) i N,N-diizopropiletilamin (1.64 g, 2.22 mmol) su dodati. Reakdona smeša je zagrevana na 90°C tokom 7 h, i dobijena suspenzija je filtrirana topla. Koncentracija filtrata pod sniženim pritiskom je dala svetio braon čvrstu supstancu, koja je prečišćena putem hromatografije na koloni (silika gel, EtOAc/heksani). Ovo je dalo 86% prinosa od jedinjenja 168 kao bele čvrste supstance. m.p. 194-196°C (dec); 'H NMR (DMSO-d6) 5 (ppm) 10.96 (s, IH), 9.46 (s, IH), 7.84 (d, IH, J = 7.8 Hz), 7.51-7.36 (m, 4H), 7.19 (d, IH, J = 6.8 Hz), 6.99 (t, IH, J = 9.3 Hz), 4.10 (t, IH, J - 7.0 Hz),1.31 (s, 9H),1.16 (d, 3H, J = 6.9 Hz); m/z = 454 (M+H). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 168 su prikazani ispod.

{l-[5-hloro-4-(3,5-dilfuoro-fenilimino)-4H-benzo[d][l,3]oksazin-2-il]-etil>-karbamiriske kiseline tert-butil estar (169)

[0370]Korak C: 100-mL, tro-grla laboratorijska boca sa okruglim dnom opremljena sa magnetnom mešalicom i termometrom je očišćena sa azotom i napunjena sa jedinjenjem 168 (3.30 mmol), anhidrovanim metilen hloridom (25 mL), N,N-điizopropiIetilaminom (4.60 g, 35.7 mmol) i trifenilfosfinom (3.98 g, 15.2 mmol). Reakdona smeša je zatim ohlađena do 0-5°C u led/voda kupki. Jod (3.61 g, 14.2 mmol) je zatim dodat u porcijama u reakcionu smešu preko 1 h. Kad je dodavanje završeno, hladna kupka je uklonjena, i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 30 min. Reakcija je zatim ugašena sa 10% vodenim rastvorom kalijum karbonata (25 mL), organski slojevi su izdvojeni, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Hromatografija na koloni dobijene čvrste supstance (silica gel, EtOAc/heksani) je dala 52% prinosa jedinjenja 169 kao bele čvrste supstance. m.p. 117-118 °C; 'H NMR (DMSO-de.) 6 (ppm) 7.72-7.60 (m, 2H), 7.42 (dd, IH, J = 7.6 Hz, 1.3 Hz), 7.31 (d, IH, J = 7.0 Hz), 6.95 (t, IH, J = 9.3 Hz), 6.82 (m, 2H), 4.27 (m, IH), 1.33 (s, 9H), 1.28 (d, 3H, J = 7.2 Hz); m/z = 436 (M+H). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 169 su prikazani ispod.

2-(l-aminc^etil)-5-hloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-3rl-hinazoliii-4-on { 170)

[0371]Korak D: Rastvor jedinjenja 169 (1.68 mmol) u piperidinu (2 mL) je mešan tokom 3h na sobnoj temperaturi. Evaporacija reakcione smeše do suvoće pod visokim vakumom je dala žutu penu. Ova pena je rastvorena u 4M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu (4 mL) i mešana tokom 17 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim koncentrovana do suvoće, bazifikovana sa 10% vodenim rastvorom kalijum karbonata (40 mL) i ekstrahovana sa MTBE (3 x 20 mL). Kombinovanje organskih ekstrakata, sušenje preko natrijum sulfata i koncentrovanje do suvoće je dalo čvrsti ostatak. Ovaj ostatak je rastvoren u d-hloroformu (5 mL), i zagrevan tokom ISh na 50°C. Posle hlađenja do sobne temperature, reakdona smeša je isprana sa vodom (3 x 10 mL), osušena preko natrijum sulfata i evaporisana do suvoće, dajući 98% prinosa jedinjenja 170 kao bele čvrste supstance. m.p. 200-202°C; 'H NMR (CDCIj) 6 (ppm) 7.65 (m, 2H), 7.49 (m, IH), 7.01 (t, IH, J = 6.6 Hz), 6.89 (m, 2H), 3.68 (m, IH), 1.33 (d, 3H, 3 = 6.6 Hz), 1.25 (s, 2H); m/z = 336 (M+H). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 170 su prikazani ispod.

5- hloro- 3-( 3, 5- difluoor- fenil)- 2-[ l-( 9H^ ( 166)

[0372]Korak E: Jedinjenje 166 je pripremljeno reagovanjem jedinjenja 170 u skladu sa procedurom za pripremu jedinjenja 107 (konačna procedura). ESI-MS m/z 454.3 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 166 su prikazani ispod.

2- ri- f2- amino- 9H- purin- 6- ilammo)- propin (171)

[0373]Jedinjenje 171 je pripremljeno prateći opštu proceduru za jedinjenje 161 (koraci A-E), ali 2-tert-butoksikarbonilamino-buterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za N-tert-butiloksikarbonil-D,L-alanin N-hidroksisukcinimid estar u koraku B, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku E. ESI-MS m/z 454.3 (MH<*>). Struktura jedinjenja 171 je prikazana ispod.

2- ri;f2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- eitl]- 5-^ ( 172)

[0374]Jedinjenje 172 je pripremljeno prateći opštu proceduru za jedinjenje 161 (koraci A-E), ali 2-smino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku E. Struktura jedinjenja 172 je prikazana ispod.

3-( 3. 5- difluoro- fenil)- 6- lfuoro- 2-[ l-( 9H- pu^^ ( 173)

[0375]Jedinjenje 173 je pripremljeno prateći opštu proceduru za jedinjenje 161 (koraci A-E), ali 2-amino-5-fluorobenzojeva kiselina je supstituisana za 2-amino-6-hlorobenzojevu kiselinu u koraku A. ESI-MS m/z 438.2 (MH<+>). Struktura jedinjenja 173 je prikazana ispod.

5- hloro- 3-( 2, 6- diflucro- fe^^

[0376]Jedinjenje 174 je pripremljeno prateći opštu proceduru za jedinjenje 161 (koraci A-E), ali 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, i 2-tert-butoksikarbonilamino-buterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za N-tert-butiloksikarbonil-D,L-alanin N-hidroksisukcinimid estar u koraku B . ESI-MS m/z 468.2 (MH<*>). Struktura jedinjenja 174 je prikazana ispod.

2- ri-( 2- amino- 9H- purin- 6- ilamino)- pro

[0377]Jedinjenje 175 je pripremljeno prateći opštu proceduru za jedinjenje 161 (koraci A-E), ali 2,6-difluoroanilin je supstituisan za anilin u koraku A, 2-tert-butoksikarbonilamino-buterne kiseline 2,5-diokso-pirolidin-l-il estar je supstituisan za N-tert-butiloksikarbonil-0,L-alanin N-hidroksisukđnimid estar u koraku B, i 2-amino-6-bromopurin je supstituisan za 6-bromopurin u koraku E. ESI-MS m/z 483.2 (MH<*>). Struktura jedinjenja 175 je prikazana ispod.

PIMER 13 (Referenca)

PRIPREMA JEDINJENJA

[0378]Jedinjenja koja imaju opštu formulu I (prikazanu ispod) su bila pripremljena u skadu sa koracima A-G sintetske šeme pod nazivom "Procedura L" prikazane ispod.

5- meBI- 3- fenil- 2- fl-( 9H- purin- 6- ilol<si)- etil1- 3H- hinazo<m ( 176)

[0379]Jedinjenje 176 je pripremljeno u skladu sa procedurama izloženim u koracima A-G ispod.

sirćetna kiselina l-( 3- metil- 2- fenilkart>amoil- fenilkarbamoin- etil estar( 177)

[0380]Korak A: (S}-2-Acetokstpropionil hlorid (5.469 g, 36.32 mmol) je dodat u rastvor jedinjenja 15 (6.788 g, 30 mmol) u dihlorometanu (150 mL). Precipitat je odmah formiran. Reakcija je mešana tokom 25h i precipitat je izdvojen filtriranjem. Filtrat je ispran sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (3 x 50 mL) i osušen (MgSO-s). Filtradja i koncentracija filtrata je dala braon čvrstu supstancu (7.6 g). Prečišćavanje putem fleš hromatografije (1:2 EtOAc: heksani-> EtOAc->10:l EtOAc:MeOH) praćeno rekristalizacijom od nečistih frakcija iz EtOAc: hexani je dalo jedinjenje 177 kao čvrstu supstancu. ESI-MS m/z = 341 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 177 su prikazani ispod.

sirćetna kiselina l- f5- metil- 4- fenilirriino- 4H- benzofd1[ 1. 31oksazin- 2 il)- etil estar ( 178)

[0381]Korak B: Jedinjenje 177 (0.34 g, 1.0 mmol) je rastvoreno u dihlorometanu (25 mL). Trifenilfosfin (1.311 g, 5 mmol) je dodat u rastvor, praćen jodom (1.269 g, 5 mmol) i DIEA (1.9 mL, 11 mmol). Reakcija je poklopljena i mešana tokom 4 dana. Reakcija je ugašena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (25 mL). Organski sloj je izdvojen, osušen (MgS04), filtriran, i filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da se dobije tamno braon guma (2.886 g). Prečišćavanje putem fleš hromatografije (CrfeCb) je dalo imino-l,3-oksazin jedinjenje 178 kao žuto ulje. ESI-MS m/z = 323 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 178 su prikazani ispod.

sirćetna kiselina l- metil- 2-( 3- nwtil- 2- fenilkart»amoi1- fenilimino)- 2- piperidin- l- il- etil estar ( 179)

[0382]Korak C: Piperidin (1 mL) je dodat u jedinjenje 178 (0.161 g, 0.5 mmol) i reakciona smeša je mešana tokom 19.5h. Reakciona smeša je zatim koncentriovana pod sniženim pritiskom da bi se dobila žuta guma. Trituracija sa 1:4 EtOAc: heksani je dala malu količinu jedinjenja 179 (0.041 g). Fleš hromatografija (1:4 EtOAcheksani) filtrata je dala samo delimično odvojivu smešu očekivanih produkata, acetoksihinazolinon jedinjenja 179 i hidroksihinazolinona (ukupna masa 0.122 g). ESI-MS m/z = 408 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 179 su prikazani ispod.

sir ćetna kiselina l- f5- fnetil- 4- okso- 3- fenil- 3. 4- dihidro- hlna 2olin- 2- il)- etil estar ( 180)

[0383]Korak D: Jedinjenje 179 (0.037 g, 0.09 mmol) je rastvoreno u acetonitrilu (10 mL) i reakciona smeša je zagrevana na refluksu tokom 3h. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostatak je rastvoren u smeši etil acetata (10 mL) i IM HCI (5 mL). Posle odvajanja vodenog sloja, organski sloj je ispran sa dodatnim IM HCI (2x5 mL), zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (3x5 mL), vodom (2x5 mL) i zasićenim koncentrovanim rastvorom soli (5 mL). Rastvor je osušen (MgSO<), filtriran, i filtrat koncentrovan pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje 180. ESI-MS m/z = 323 (MH<*>). Proizvod je gotovo potpuno racemizovan na ovoj tački (hiralna čistoća je bila 46:54 S:R). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 179 su prikazani ispod.

2-( l- hidroksi- etil)- 5- metil- 3- fenil- 3H- hinazolin- 4- on ( 181)

[0384]Korak E: Jedinjenje 180 (0.011 g, 0.034 mmol) je rastvoreno u metanolu (2 mL), i kalijum karbonat (0.012 g, 0.085 mmol) je dodat. Reakciona smeša je mešana tokom 20 minuta, i zatim je dodata voda (20 mL). Smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 10 mL) i kombinovani organski ekstrakti su isprani sa zasićenim koncentrovanim rastvorom soli (10 mL). Organski rastvor je osušen (MgSO*), filtriran i koncentrovan pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje 181. ESI-MS m/z = 281 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 181 su prikazani ispod.

5- meBl- 3- fenil- 2- <l-[ 9-( 2- Mmetil^ ( 182)

[0385]Korak F: Rastvor jedinjenja 181 (0.069 g, 0.25 mmol) u THF (5 mL) je tretiran sa natrijum hidridom (0.007 g, 0.27 mmol) i mešan tokom 10 min. Rastvor intermedijamog jedinjenja 13 (0.077 g, 0.27 mmol) u THF (l mL) je dodat u reakcionu smešu. Boca originalno sadržavajući intermedijarno jedinjenje 13 je isprana sa dodatnim THF (1 mL), i frakcije od ispiranja su takođe dodate u reakcionu smešu. Reakcija je ostavljena da se odvija, i dodatni natrijum hidrid (0.005 g, 0.21 mmol) je dodat na 21.5h, i 23h. Reakcija je ugašena nakon ukupno 24 h dodatkom zasićenog rastvora amonijum hlorida (5 mL). Smeša se ekstrahovana sa dihlorometanom (3x5 mL), i kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko MgSOf. Posle filtriracije, filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom, i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (1:1 EtOAc: heksani -> 3:2 EtOAc:heksani), da se dobije jedinjenje 182. ESI-MS m/z = 529 (MH<*>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 182 su prikazani ispod.

S- Metil- 3- fenil- 2- ri- f9H- Durin- 6- iloksi^ etin- 3H- hinazolin- 4- on f! 76.

[0386]Jedinjenje 182 (0.053 g, 0.1 mmol) je rastvoreno u smeši metanola (2 mL) i 4M HCI (2 mL). Smeša je mešana i zagrevana do 40°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je uklonjena sa izvora toplote i ostavljena da se ohladi. Reakciona smeša je zatim filtrirana kroz čep od GFA (stakleno vlakano) filter papira i filtrat je koncentrovan da bi se uklonio samo metanol. Ostatak je podešen na pH 10 dodatkom 10% rastvora kalijum karbonata. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtriracijom i prečišćena putem RP-HPLC (C18 Luna kolona, 10x250 mm, 4,7 mL/ min, 10-90% CHjCN u vodi na 18 min, sa svim rastvaračima koji sadrže 0.05% mravlje kiseline) da se dobije jedinjenje 176 kao pahuljasto bela čvrsta supstanca nakon liofilizacije. 'H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 6 13.40, br s, IH; 8.40, s, IH; 8.35, s, IH; 7.66, t, J = 7.8 Hz, IH; 7.48 - 7.58, m, 4H; 7.31-7.36, m, 2H; 7.20 - 7.23, m, IH; 5.65, q, J = 6.6 Hz, IH; 2.73, s, 3H; 1.65, d, J = 6.6 Hz, 3H. ESI-MS m/z = 399 (MH<+>). Reakcija opisana iznad i jedinjenje 176 su prikazani ispod.

PJ3 JMER 14

Biohemijski testovi PI3K potencije i selektivnosti

Biohemijski testovi koji koriste 20 uM ATP

[0387]Primenom metode opisane u Primeru 2, jedinjenja ovog pronalaska su testirana na inhibitornu aktivnost i potenciju prema PI3K5, i na selektivnost za PI3K5 naspram druge Klase I PI3K izozima. U Tabeli 1, IC5jvrednosti (uM) su date za PI3K5 ("Delta"), i mogu biti izračunate za druge izoforme koristeći odnose ICM vrednosti ispod. Za ilustraciju selektivnosti jedinjenja, odnosi ICM vrednosti jedinjenja za PI3Ko, PI3KB i PI3Ky u odnosu na PI3KČ su date, redom, kao što je "Alfa/Delta Odnos", "Beta/Delta Odnos" i" Gama/Delta Odnos".

[0388]Inicijalni testovi selektivnosti su izvedeni identično protokolu testa selektivnosti u Primeru 2, osim korišćenja 100 pL tzv. "Ecostint" za detekciju radioaktivnog obeleživača. Naknadni testovi selektivnosti su urađeni na sličan način koristeći isti 3X supstrat bujona, osim što su one sadržavale 0.05 mCi/mL y[<3J>P]ATP i 3 mM PIP2. Naknadni testovi selektivnosti su takođe iste 3Xbujone enzima, osim što one sada sadržavale 3 nM od bilo kog datog PI3K izoforrna.

[0389]Za sve testove selektivnosti, testna jedinjenja su izmerena i rastvorena u 10-50 mM zaliha u 100% DMSO (u zavisnosti od njihove odgovarajuće rastvorljivosti) i pohranjena na -20° C. Jedinjenja su odmrznuta (na sobnoj temperaturi ili 37°C), razblažena do 300 mM u vodi iz koje se izvodilo 3-struko razblaženje serija u vodi. Iz ovih razblaženja, 20 mL je dodato u ispitivane bunarčiće duž bez vode, korišćene za enzim (pozitivnu) kontrolu i bez enzima (pozadinu) kontrole. Ostatak testa je izveden u suštini prema testu protokola selektivnosti u Primeru 2.

PRIMER 15

Podaci Testa bazirani na ćeliji za Inhibitornu aktivnost PI3KS

[0390]Koristeći metode opisane u Primeru 2, jedinjenja ovog pronalaska su testirana za inhibitornu aktivnost i potenciju u testu oslobađanja neutrofilne (PMN) elastaze. Podaci iz ovih testova su prikazani u Tabeli 1. U Tabeli 1, prikazane vrednosti su efekasne koncentracije jedinjenja (ECso; uM).

Claims (1)

1. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so od njega.