PT85563B

PT85563B - Processo para a preparacao de derivados de acridinio quimioluminescentes e para a realizacao de imunoensaios de luminosciecncia utilizando esses derivados

Info

Publication number: PT85563B
Application number: PT85563A
Authority: PT
Inventors: Tonio Kinkel; Peter Molz; Gerd Schnorr; Helmut Strecker; Heinz-Jurgen Skrzipczyk; Henning Lubbers
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1987-08-20
Publication date: 1990-05-31
Also published as: EP0257541B1; JPS6357572A; FI90542B; EP0647628B1; JPH0699401B2; PT85563A; NO873520L; CA1341402C; FI873609A7; GR3019470T3; JPH07179428A; DK437187D0; EP0647628A1; IE74678B1; NO171725B; DE3628573A1; FI873609A0; IE960911L; IE872245L; DK437187A

Description

ESSES DERIVADOS»

Memória descritiva objectivo da presente invenção são derivados de acridínio quimioluminescentes, o processo para a sua preparação e a sua utilização em imunoensaios de luminescência»

Os compostos luminescentes já têm uma aplicação muito diversificada. São utilizados como indicadores em bio-ensaios, imunoensaios de enzimas e imunoensaios luminiseentes (ver W. P. Collins Alternative Immunoassays, editora John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1965) ruas também são utilizados em ensaios de hibridizaçao de ácidos nucleioos (ver J.A. Mathews et al, Analytical Biochemistry», 151, 205-209, 1985).. Além disso os compostos quimioluminescentes são utilizados na análise »flow injection analysis», em detectores pós-colur.a na oro— matografia líquida, na investigação de correntes e em fontes de luz artificiais.

*?* 1 * ·*

S3*

Nos imunoensaios quimioluminescentes al» cançaram importância significativa em particular 2 tipos de estruturas de substâncias de marcação quimiolumin.escente^ Trata» ou de isoMethods

LVIIj ., assim como nas Patentes Britânicas

618 419 e 2 618 5

071· Encontra-se dos compostos de V. G-. i/ood_} J_o

-se neste caso, por um lado, dos derivados de luminol luminol que foram descritos por H. R. Schrõder et al, in Enzymology”, Academic Press Inc., Nova Iorque, vol I978, págs. 424 e segs

008 247 e 2 041 920, nas Patentes Alemãs 2 assim como no pedido de Patente Europeia 135 uma panorâmica sobre as utilizações práticas isoluminol como indicadores luminescentes em Clin. Chem. Clin. Biochem. .22, 1984, 905-918.

11,

Por outro lado, também tem tido aplicação como substâncias de marcação quimioluminescentes compostos ésteres de acridinio. Os ésteres de acridínio deste tipo são já conhecidos da Patente Americana 3 352 791, das Patentes Britânicas 1 316 363 e 1 461 877, assim como do pedido de Patente Europeia 82 636· A utilização dos ésteres de acridínio como substâncias de marcação em imunoensaios ó descrita por Veeks et al, Clin. Chem. 29/8 (1983) 1474-1479· Também já 6 conhecida a utilização de ésteres de fenantridínio como substâncias de marcação em imunoensaios de quimioluniinescência do pedido de Patente Europeia 17θ 415·

A quimioluminescência dos ésteres de acridínio pode ser iniciada, por adição de uma solução alcalina de peréxido de hidrogénio. Para o mecanismo da quimioluminescência

F. McCapra fornece uma explicação elucidativa em Acc. Cheia<> Re 9, 201, 1976. Neste caso, como é evidente, e decisiva a nature za do grupo dissociável, tanto para o rendimento em quantos de luz,como também para a estabilidade hidrolítica.

Os ésteres de acridínio conhecidos até ao presente, relativamente aos compostos de luminol e de isoluminol, têm a vantagem de um maior rendimento em quantos, de luz que também não é prejudicado por proteínas ligadas ao in2 ι

dicador (ver Weeks et al, Clin. Chem. 29/8 (1983) 1474-1479).

Se bem que os ésteres de acridínio-fenilo conhecidos do pedido de Patente Buropeia 82 636, no caso da es<* timulação da quimioluminescencia por oxidantes moderados, se distingam por uma. elevada sensibilidade de indicação, têm no entanto em aplicações práticas inconvenientes prejudiciais. So<* bretudo a ligação de éster fenílico em sistemas aquosos, mesmo ã temperatura ambiente, e muito frágil. Resulta daqui que nas condições de oxidação ali indicadas os esteres fenílicos de a» cridínio apresentam uma emissão lumionas que só e apreciável passados cerca de 10 segundos, isto S, que se extingue em mais de 95$. comparação com estes, outros processos de ensaio não isotópicos têm tempos de medida muito mais curtos e permitem, por consequência, uma carga mais alta da amostra.

objectivo da presente invenção era, por conseguinte, descobrir novos derivados da acridínio que, com elevados rendimentos de quantos de luz, apresentassem uma cinética de reacção mais rápida e permitissem por conseguinte tem» pos de medida mais curtos para um imunoensaio de luminescênciao

Verificou-se agora que estas exigências são satisfeitas por derivados de acridínio quimioluminescentes de fórmula I

em que R¹ representa hidrogénio, um. radical alquilo, alcenilo ou alcinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo benzilo ou o o arilo, R· e R representam hidrogénio, um grupo alquilo com 1 ι

St' a 4 átomos de carbono, um grupo amino substituído ou não subs*.

tituído, um grupo carboxi, alcoxi, ciano, nitro ou halogenio,

R representa um radical no qual um grupo sulfonamido está li*' gado directamente, através do átomo de azoto, ao grupo carboni lo, ou um radical tioalquilo ou tioarilo de fórmula II

S - X - R⁵ (li) na qual X representa um grupo alifático de cadeia linear ou rs. mificada ou um grupo aromático que pode conter também heteroK átomos, e R representa uai grupo reactivo que em condições es* peciais pode estabelecer uma ligação selectiva com grupos arni* no, carboxi, tiol ou outros grupos funcionais em substâncias de interesse biológico, e A representa um aniao que nã.O influenoia a qúitnioluminescência.

Entre as substâncias de interesse biológico contam-se sobretudo antigenes. Nesta expressão englobam«se também hormonas, esteróides, medicamentos, metabolitos de medicamentos, toxinas, alcaloides e também anticorpos.

anião que nao influência a quimiolumi» nescéncia pode ser um an^ão tetraf luorborato, per clorato, halogeneto, alquilsultato, halogenosulfonato, alquilsulfonato ov arilsulfonato· Também poderão utilizar-se outros aniões desde que nao prejudiquem nem diminuam a cjuimioluminescência o

Por arilo entendem-se radicais de hidro*' carbonetos aromáticos, especjLalmente fenilo e naftiloo For grupos aromáticos contendo heteroátornos entendem-se hidrocarbone·tos aromáticos que contém um átomo de azoto ou de oxigénio, especialmente quinoleina, indol, pirol e piridina·

Entre os halogénios enumeram-se fluor, cloro, bromo e iodo.

Os grupos feréncia grupos alquilamino ou alquilo possui 1 a 4 átomos de amino substituídos são de predialquilamino em que cada grupo carbono, podendo os radicais al» ι

quilo estar por sua vez monossubstituídos, por exemplo coe hl» droxi. Pode igualmente tratar-se de uni radical morfolino no ca»> so de grupos amino substituídos» Os radicais alcoxi indicados

3 para R' e Ir são de preferencia os que contêm 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo.

Os grupos alifáticos de cadeia linear ou ramificada leno com 1 mencionados para X são de preferencia radicais a 5 átomos de carbono* alquá Em geral escolhem-se derivados de acridinio nos quais X representa um grupo metileno, etileno, propile» no ou então um gruco orto, meta ou para-fenileno, Para melhoramento da solubilidade em água dos derivados de acridínio estes grupos podem também transportar substituintes hidrófilos contendo heteroátomos.

Ê particularmente importante, no que se refere às possibilidades de utilização dos derivados de acri5 # dínio de acordo com a invenoão, o substituinte R . Através de uma escolha apropriada deste grupo o derivado de acridfnio manifesta uma reactividade tao elevada cjue, mesmo em condiçSes mo«« deradas, pode estabelecer.uma ligação selectiva com um grupo funcional da substância biológica a caracterizar. Os grupos apropriados estão representados na lista a seguir.

ο (+)

(halogeneto) (ião alcalino/⁴^ halogeneto

derivados de

Em muitos casos acridínio de acordo com revelaram-se adequados a invenção nos quais Ii' representa um grupo de fórmula III

(III)

Alem disso, sao também preferidos coinpos1 tos de acridínio nos quais R representa um grupo metilo» São pois utilizados com frequência especial compostos de acridínio de acordo com a invenção que correspondem à fórmula IV

Se no derivado de acridínio de acordo com 4 a invenção o radical R representar um radical sulfonamido, aquele pode então corresponder de preferencia á fórmula V

X - R⁵

-¾ (v) ^S0₉ - R ou ã fórmula VI (VI) nas quais X e 3. têm os significados anteriormente indicados e R na fórmula V representa um radical alquilo ou alcenilo coe 1 a 10 átomos de carbono, um grupo amino preferivelmente mono ou dissubstituído por grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbo< no, um grupo morfolino, substituídos por grupos hidroxi, amino, de carbono ou ariloxi, e R na fórmula adicionalmente, hidrogénio.

tar ainda derivados ã formula na qual A benzilo ou arilo que também podem esta:? aleoxi com 1 a 4 átomos VI podem também represem

Os representantes de acridínio de acordo com a típicos desta classe de invenção correspondem

VII

e X têm os significados mencionados (VII)

Através da presente invenção passa, portanto a dispor-se de duas novas classes de compostos de acridínio_?distinguindo-.se uma das classes por um grupo tioléster e a ou« <tra por uma estrutura de sulfonaraida. Os derivados de acridínio-acilsulfonamida possuem uma estabilidade mais elevada e os ésteres tiólicos uma cinética mais rápida do que a dos compostos de éster acridlofenílicos até agora conhecidos. Ambas as classss de compostos se distinguem ainda por um elevado rendimento lu« minoso.

—ϊ 8 — t

Uma das vantagens essenciais doscompostos de acridínio de acordo com a invenção, com grupos dissociáveis contendo tiolésteres, relativamente aos ésteres de acridíniofe· nilo conhecidos do Pedido de Patente Europeia 82 636, reside ηε, cinética de reacção essencialmente mais rápida da emissão luminosa· Deste modo, o tioléster de acridínio (composto 6) de acordo com a invenção, preparado de acordo com o exemplo 1, pa» ra um segundo dextempo de medida fornece um rendimento lamino» so superior segundo um factor igual a 10 nas mesmas condições de oxidação. Este alto rendimento luminoso, acompanhado simultaneamente por tempos de medida mais curtos, possibilita uma carga de amostra no luminómetro essencialmente superior_e

Assim, a fig. 1 mostra a cinética da emissão luminosa de um conjugado de anticorpo do tioéster de acridínio (composto 6) preparado de acordo com o exemplo 1 e a figo 2 mostra a do conjugado de anticorpo do metossulfato de 4--(2-succinimidil-oxicarboniletil) -f enil-lO-metilacridínio-9-carboxilato (Pedido de Patente Europeia 82 636, pág. 10). Estimulam-se 100yil de cada uma das soluções indicadoras por adição de 350yil (tampão KClAaOH 0,05 M, pÉ 13 + 0,1$ de H^O^) para emissão quimioluminescente e r'egista-se durante um intervalo de tempo de 10 segundos.

Na fig. 1 a emissão luminosa máxima é alcançada logo após 0,66 segundos e após 0,88 segundos caiu já para metade. Pelo contrário, na fig. 2 a emissão luminosa máxi^< ma é alcançada apenas após 1,77 segundos e só após .2,88 segundos cai de novo para metade.

Ê absolutamente inesperado o facto de a acridínio-9-carboxilamida, substituída por sulfonilo no átomo de azoto da amida, apresentar uma quimioluminescéncia pronunciada, visto que se sabe que a acridínio-9-carboxilamida, ao contrário dos acridínio-9-carboxilatos, não manifesta qualquerr quimioluminescéncia (ver S. McOapra em H. Carruthers e JoK_o

- 9 «

Sutherland: ^rogress in Organic Chem., vol. 8, 231-277, 1973, Butterworth, Londres).

Os acridínio-9-carboxiltioatos de acordo cor. a invenção são preparados do seguinte modo.

A acridina ou os seus derivados com R

Q e/ou Ic no anel fenilo condensado são levados a reagir, de acordo com o proces ocfescrito por Lehmstedt e Hundertmark em Ber. 63, 1229 (I93O), em etanol/ácido acético e cianeto de potássio com obtenção de 9«cianoacridina. A partir deste, depois da recristalização, porreacção com ácido sulfiírico e nitrifo de sódio obtém-se o ácido acridino-9-carboxílico ou o ácido acrid5no-9-carboxílico substituído por R /R de forma correspondente ao processo descrito por Lehmstedt e Wirth eni Ber<> 61_s2044 (1928). Por reacção do ácido acidrino-9-carboxílico ou do

3 ácido acridino-p-carboxílico substituído por R /R³ com cloreto de tionilo obtém-se o composto de fórmula VIII

(VIIl) na qual Y tem o significado de cloro. 3m vez de um halogéneo pode também introduzir-se no composto VIII com o significado de Y um grupo oxicarbonil-alquilo com 1 a 5 átomos de carbono na parte alquilo, oxicarbonilarilo ou imidazolida·

Os derivados de acridina substituídos por 2 3

R /'R^J podem ser sintetizados facilmente por processos conhecidos da literatura. Estas sínteses estão descritas por exemplo em:

Comprehensive Eeterocyclic Chemistry: Editores A Katritzky₉

C.K. Rees, Vol. 2, P. 395 e seg., Pergamon Press, 1984 ou Heterocyclic Compounds, Vol. 9» Acridines and Cond. 2&» Edition, R.M. Àcheson, John Uiley and Sons, 1973· cloreto de ácido de fórmula VIII e então submetido a reacção com um ácido tiolcarboxílico de fórmula IX

HS « X - COOH (IX) por exemplo com o ácido 2-mercaptobenzóico em condiçoes alcali·· nas, com obtenção de ácido tiolestercarboxílico que em seguida é esterificado com um composto apropriado para a preparação do radical R , por exemplo com Nwh.idroxisuccini.mida. Seguidamente o composto de acridina é alquilado na posição 10 segundo processos conhecidos da literatura. Para uma metilação prestasse sobretudo o tetrafluorborato de trimetiloxónio, mas também se obtêm compostos de acridínio com bons rendimentos de quimiolu* minescência com sulfato de dimetilo, fluorsulfonato de metilo, toluenossulfonato de metilo ou trifluormetanossulfonato d© metilo ·

Para a preparação dos derivados de acridi·· niossulfonamida de acordo com a invenção parte-se igualmente do cloreto de ácido acridino-9-carboxílico de fórmula (VIIl)₀Este composto é então submetido a reacçao com um.a sulfonamida primária ou secundária, de preferência cora um ácido sulfonamidocarboxílico bloqueado de fórmula X

H	0
6 t	!í
R^Õ - SO - N- X -	c - oz	(X)
ou de fórmula XI
H
6 * R - N - S0_o - X -	. cooz	(XI)

nas quais X e têm os significados anteriormente referidos e Z representa um radical de bloqueio do grupo carboxi que em seguida é dissociado. Como exemplo pode utilizar-se para esta reacção como grupo de bloqueio o éster benzílico de N-benzenos sulfonilglicina. 0 ácido resultante depois da dissociação do i

grupo de bloqueio é então transformado no radical R^ com uma. amida apropriada, por exemplo com N~h.idroxissuccinimida. partir deste último composto obtém-se o composto de acridínio cjui·· mioluminescente por processos conhecidos da literatura, proso» vendo-se a. alquilação no átomo de azoto em -posição 10»

Os compostos de acridínio resultantes po dem então ser submetidos a reacção com uma substancia de intersse biológico, por exemplo com um antigene, um anticorpo, uma.

hormona, um medicamento, um metabolito de medicamento, uma toxina ou um alcaloide, para se obter o composto luminescenteo Neste caso o derivado de acridínio é ligado, quer directamente quer através de uma molécula ponte, como polilisina, ácido poliglutâmico ou polivinilamina, â substância com interesse biológico, com formação de um conjugado estável imunológicamente activo. Sste conjugado é também caracterizado como indicador (tracer) e ó utilizado nos imunoensaios de luminescência descritos adiante. Para, os imunoensaios de luminescência de acor do com a invenção para determinação de uma substância antigene numa amostra de líquido corporal segundo um processo competitivo ou segundo um. processo de sandwich, e necessário pelo menos um componente imunologicamente activo que seja imobiliza^ do sobre uma fase sólida, e também o indicador iuminescente.O iniuiioensaio de luminescência pode ser agora realizado por diversos modos.

Uma possibilidade consiste em incubar-se o anticorpo imobilizado, que reage especificamente com o antigene, con; uma amostra do líquido a ensair e com um conjugado do antigene e de um derivado de acridínio cjuimioluminescente (indicador de antigene), separar a amostra e o indicador não ligado, pôr em contacto o indicador com um oxidante para causar uma emissão luminosa e em seguida, a partir da intensidade da emissão luminosa, determinar a quantidade do antigene presente >

Uma outra possibilidade para a realização *· 12 i

do imunoensaio de luminescência consiste em se incubar ura anticorpo imobilizado, que reage especificamente com antigene, com uma amostra do líquido a ensair e com um conjugado derivado de um segundo anticorpo que reage especificamente e um derivado de acridínio quimioluninescente, se separar a amostra e o conjugado marcado não ligado, pôr em contacto o conjugado marcado ligado com um oxidante para originar uma emissão luminosa e a partir do valor da intensidade da emissão luminosa determinado, a determinação da quantidade do antigene presente.

Os imunoensaios de luminescência anteriormente mencionados podem também ser realizados separando-se antes da adição do conjugado marcado, o liquido a ensair do anticorpo imobilizado.

Noutro imunoensaio de luminescência, realizável em conformidade com a invenção não se imobiliza o anticorpo mas sim o antigene. Assim, um antigene imobilizado, que reage especificamente com o anticorpo, pode ser incubado com uma amostra do líquido a ensaiar e uma solução de um conjugado obtido do anticorpo e de um derivado de acridínio quimiolumines' cente, em seguida separa-se a amostra e o conjugado marcado não ligado, e promove-se depois o contacto do conjugado marcado ligado com um oxidante. Ocorre então urna emissão luminosa a partir de cuja intensidade pode ser determinada a quantidade do antigene presente.

Uma outra variante consiste em se incubar um antigene imobilizado, que reage especificamente ao anticorpo, com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um derivado de acridínio quimioluminescente, separar-se o conjugado marcado que não reagiu, adicionar-se um.a amostra do líquido a ensaiar, separar-se de novo em seguida a amostra, ρδτ-se em contacto com um oxidente o conjugado marcado ligado para se originar uma emissão lumionaa e, a partir desta, determinar-se então a quantidade do antigene presente.

i

Finalmente o imunoensaio de luminescência também pode ser realizado segundo ur? modo no qual um antigena imobilizado, que reage es ecif icaraente com o antieorpo, />

e incu bado com uma solução de um conjugado do anticorpo e de um deri vado de acridínio quimioluminescente, é adicionada uma amostra do líquido a ensaiar, separam-se a amostra e o conjugado não ligado, leva-se ao contacto com um oxidante o conjugado marcada ligado e a partir do valor obtido da emissão luminosa determi na-se a quantidade de antigene presente.

á preparação dos compostos de acridínio de acordo com a invenção é demonstrada nos exemplos 1 a 3«

Exemplo 1

9-cianoacridina (1)

/.idiciona-se à acridina (10 g) em 45 ml de etanol 3,3 ml de ácido acético e, gota a gota, unia solução de 5,25 g de cianeto de potássio em 8 ml de água, aquece-se a mistura reactiva ao refluxo durante 2 h, arrefece-se e eliminam-se os componentes voláteis em vácuo. 0 resíduo e triturado com 3θ ml de soda cáustica 2 N, filtra-se e depois de uma lavagem por 2 vezes com soda cáustica 2N e água, deixa-se em repouso ao ar durante algum tempo enquanto húmido. 0 produto bruto e tritu» rado em cloreto de metileno, a substancia insolúvel é eliminada por filtração, lavada com cloreto de metileno, as fases orgânicas depois de reunidas são concentradas e recristaliza«se a 9-cianoacridina com acetato de n-butilo.

Rendimento: 5θ%» pf: 183**185°C

IR: 2230 cm”¹

Acido acridino-9-carboxílico (2)

Adiciona-se 9-cianoacridina (5 g) lentamen te e às porções a 40 ml de ácido sulfúrico concentrado e a mis» tura ó aquecida durante 2 h a 9θ-95°θ, © depois da adição de

8,5 g de NaNO_? agita-se por mais 2 h a esta temperatura» A solução quente é adicionada a-620 ml de água gelada, agitando-se rapidamente, o sedimento ê isolado por filtração e dissolvido num mínimo possível de soda cáustica 2N. a solução é filtrada e acidificada com ácido sulfúrico a 5θ%, o ácido acridino-9-carboxílico que precipita e isolado por filtração e seco em vácuo.

Rendimento: 95% pf- 288-289^PC

IR: 3440(br), 32OO(br), 2600-2500(br), 1980; 1650; 1605, 1420 cm¹

Cloridrato de cloreto do ácido acridino-9-carboxílioo (3) acido acrid±no-9-carboxílico (5g) θ adi cionado ãs porções a 5θ ml de SOCl^ recém-destilado e é aquecido ao refluxo durante 5 h; a solução, depois de límpida, é concentrada por descilação até ao começo de formação de um se* dimento, completando-se a precipitação por meio da adição de ciclohexano e arrefecimento. Por filtração do sedimento e secagem em vácuo obtém-se o cloridrato do cloreto do ácido acridino-Jp-carboxílico *

Rendimento: 90% pf« 223°C.

Análise elementar (calculada como C^H C1N0 x HC1) Calculado: C 60,5 H 2,8 N 5,0 Cl 25,5 Obtido: C 59,4 H 3,3 N 5,0 Cl 25,2

Ãcido fenil-2¹-ο9Γ6οχίϋοο^οηΐάίηο-9-ΐΐοο3Γ6οχϊ1ίίΐο (4) cloridrato do cloreto do ácido acridino

-9-carboxili.co (30 g) é posto em suspensão em 7.20 ml de cloret de metileno, adiciona-se-lhe ácido tiossalicflico (17,7 g) θ ml de trietilamina, e agita-se a solução, que se torna lím- 15 pida, durante 10 min. à temperatura ambiente, continuamenteo

Depois da extracção do dissolvente o resíduo é misturado com ί

g de carbonato de sódio e 1400 ml de água, a solução resul» tante é concentrada até ap aparecimento de um sedimento e fil« tra-se para o isolamento deste. 0 filtrado e saturado com cioreto de sódio e o sedimento, c;ue precipita deste modo, é igual·» mente isolado por filtração. A solução aquosa dos depois de reunidos é acidificada a 80°C com ácido duto que predipita é isolado por filtração e seco

Rendimento: 80% pf.: 261-265°C.

sedimentos acético, em vácuo

NMR (DMSO, 100 MHz): ) = 7,6-8,4 ppm, Multipleto complexo IR: 1680 cm-¹ (s), 1720 (m) 1260 (s)

2*»(succinimidoiloxicarbonil)-fenilacridino-9-tiocarboxilato (j'

A uma suspensão de 10 g do ácido

carboxílico em lpO ml de tetrahidrofurano anidro adicionam-se a 0°C 3,2 g de N-hidroxisuccinimida, seguidamente adicionam-se a - 20°C 6,9 g de diciclohexilcarbodiimida (DCC) e deixa-se em repouso 2 h a -20°C, agitando-se seguidamente durante urna noi« te ã temperatura ambiente. Depois da adição de 0,28 ml de ácido acético agita-se durante 1 h, em seguida adiciona-se acetato de etilo (25 ml) e filtra-se para separação do sedimentoo filtrado é concentrado e depois da recristalização com clorobenze·· no õbtém-se o 2*-(Buccinimidoiloxicarbonil) *»f enilacridino-9«

-tiocarboxilato de côr amarela clara.

Rendimento: 80% pf.: 19S-200°C

IR: 1810 cm^-1, I78O, 1745, 1225, 1205

NMR (DMSO), 100 MHz):2,95 ppm (s, 4ll) 7,7-8,4 ppm (m, 12H) * - (succinimidoiloxicarbonil)-fenil-10-metilacridxnio-9-tiocar boxilato-tetrafluoroborato (6) g do N-hidroxisuccinimidato (5) são aquecidos a 80QC dutante 8 horas conjuntamente com 7,8 g de tetrafluorborato de trimetiloxónio em 40 ml de 1,2»dicloroetano e agitam-se depois continuamente durante uma noite à temperatu· ί

r? ambiente. 0 sedimenBc e removido por filtração e fervido cob 1,2-dicloroetanc. A fase organica depois de reunida é con» centra·:· :’ e ^cristalizada com acetona-éter diisopropílico_oRendimento: 40% ponto de fusão: 245°C.

IR: 3440 cm¹ (br), 1800, 1780, 174o(s), 1670, 1065(s)

NMR (DMSO), 100 MHz) ; q) = 3,0 ppm (s, 4ll), 4,95 ppm (s, levemente alargado, 3H), 7,9-3,6 (m, ΧΟΗ) , 9,9 ppm (d, 2Ii)

Exemple 2

A preparação do succinimidoiloxicarbon.il« metil-lO^metilacridínio-p-tiocarboxilato-tetrafluorborato par» tindo-se do cloreto de ácido (3) e do ácido tiolglicólico 4 rea lizada analogamente ã síntese dc composto (6). Os rendimentos dos passos de síntese individuais, assim como a caracterização espectroscópica dos produtos (7) até (9), são indicados a se* guir:

Carboximetilacridino-9-tiocarboxilato (7)

Rendimento: 60% ponto de fusão: 218°G (com decomposição)

IR.: 3440 cm¹ (br), 2400(br), 195O(br), 1710(m), 1660(s), ) IO7O (m)

NMR (DMSO, 100 MHz): 7= 4,25 ppm (s, 2H); 7,6^8,4 (m, 8H) saccinimidoiloxicarbonilmetilacridi.no-9-tiocarboxilato (8) Rendimento: 80%

IR: 3440 cm¹ (br), 2930, 1820, 1785, 174o(s), 1205, 1165

NMR (DMSO, 100 liliz); <J= 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2íl),

7,6-8,3 ppm (m, 8H) succinimidoiloxicarbonilmetil~10:aetilacridínio-9-'tioçarboxila*· to-tetrafluorborato (9)

Rendimento: 40% p.f.: 250 C

IR: 3440 cm¹ (br), 1810, 1780, 1755(s), 1538, 1350, 1060 ‘ _M 17 ί

NMR (DMSO, 100 MHz); ó- 2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppnij (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H)

Exemplo 3

N-benzenosulfonil-N-(benziloxicarbonilmetil) amida (1θ) acridino-9-carbox: il

3,3 g do éster benzílico de N-benzenossul»· fonilglicina são misturados em 110 ml de terahidrofurano'com I30 mg de 4-(dimetilamino)-piridina e 6 ml de trietilamina, pas sados 10 minutos adicionam-se 3 g de cloridrato do cloreto do ácido acridino-9-carboxílico e aquece-se ao refluxo durante 6 horas a suspensão resultante. 0 sedimento é isolado por filtra·· -ção, o dissolvente é extraído, o resíduo é tomado em cloreto de metileno e agitado rapidamente com so,da cáustica 2N. A fase orgânica da secagem com sulfato de magnésio ê concentrada e o re·. síduo resultante é recristalizado com tolueno/heptano.

Rendimento: 7θ% ponto de fusão: $8°G

IR: 3440 cm¹ (br), 1735, 1680, 1357, 1165

NMR (DMSO, 10C MHz): 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H),

7,0-8,4 ppm (m, 18H)

N-benzenossulfonil-N-(carboximetil)-acridino-9-oarboxilamida (11)

Unia solução de 1 g de N-benzenossulfonil— -N-(benziloxicarbonilmetil)-acridino-9-carboxilamida em 60 ml de ácido acético, é hidrogenada à temperatura ambiente e à pres são normal mediante a adição de 2 ml de ácido clorídrico concentrado e Pd/C (a 10%); depois do termo da reacção o catalisador é recuperado por filtração, a partir do filtrado obtém-se por concentração o ácido carboxílico naforma de um sólido amarelo .

NMR (DMSO, 100 MHz): $= 5,0 ppm (s,

2H), 7,1-8,5 ppm (m, 13K) composto (11) é submetido a reacção com — 18 —

N-hidroxisuccinimida analogamente à preparação de (5) para ob« tenção de N-benzenossulf onil<-N-( succinimidoiloxicarbonilmetil)« -acridino-9-carboxilamida (12). 0 composto (12) é quaternízado com tetrafluorborato de trimetiloxónio, como descrito para o composto (6), obtendo-se N-benzenosulfonil-N-(succinimidoiloxi» carbonilmetil) -10-metilacrid ínio-9-carboxilamido**tetraf luerbo»* rato (13)·

Exemplo 4

N-fenil-N-( 4-benziloxicarbonilbenzenosulf onil) -acridino-9-carw boxilamida (14) g de 4-(N~fenilsulfamido)-benzoato de benzilo são misturados em 300 ml de cloreto de metileno com 360 mg de 4-(diraetilamino)-piridina e 16,6 ml de trietilamina, passados 10 min. adicionam-se 8,34 g do cloridrato do cloreto do ácido acridino-wg-catboxílico (3) θ aquece-se ao refluxo 16 h Λ solução depois de arrefecida é rapidamente agitada com soda cáustica 2N, a fase orgânica depois de separada e lavada com água, seca com sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo e re« cristalizado com tolueilo/heptano.

Rendimento: 70% pf.: 161-163°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): S- 5,5 ppm (s,2E), 6.8-8.6 ppm (m,22H)

Bromidrato de N-fenil-N-(4-carboxibenzenosulfor.il)-acric!ino-9^w-carboxilamida (15)

8,58 g de N~fenil-N-(4~benziloxicarbonil» benzenosulf onil)-acridino-9-carboxilaJnida (14) sao aquecidos a 60°C durante 2 h em 3θ ml de ácido bromídrico a 33% ^eK ácido acético, depois do arrefecimento adicionam-se 60 ml de éter diisopropílico, filtra-se para separação do sedimento e seca·* -se em vácuo.

Rendimento: 95% pf.^: 255°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): X= 6.8-9 ppm (m) <ί. .....

N-fenil-N-(4-succinimidoiloxicarbonilbenzenosulfonil)-acridino«· -9-carboxilamida (16)

5,63 g de bromidra.ro de N-fexiil-N-(4-car« boxibenzenossulfonil)-acridino-9-carboxilamida (15) em 250 ml de tetrahidrofurano são misturados com 2,8 ml de trietilamina, arrefece-se a -15 0 e mistura-se com 0,96 ml de cloroformiato de etilo. Agita-se continuamente durante 20 niin., adicionam-se depois 1,15 g de N-hidroxisuccinimida, agita-se de n.ovo 3 h. a -15 C, deixa-se aquecer naturalmente ate a temperatura ambiente e agita-se durante uma noite. Filtra-se para separação do sedimento, concentra-se o filtrado, toma-se o resíduo com cloreto de metileno, lava-se a solução resultante cor.i água, solução de hidrogenocarbonato de sódio e de novo com água, e seca.» -se com sulfato de sódio. A fase orgânica 4 concentrada e o re·· síduo 4 recristalizado com tolueno.

Rendimento! 5θ% pf·! 226°C (com decomposição) NMR(DMS0, 100 MHz)í 2,95 ppm (s,4h), 8 6·⁸*·θ·7 PP® (m,17H) N-fenil-N~(4-succinimidoiloxicarbonilbenzenosulfonil)-10-meti-_ lacridínio-Ç-carboxilaniido-fluorsulfona to (17)

1,16 g de N-fenil-N-(4-succini'.nido±lox.i~ carbonilbenzenosulfonil)-acridino-9«carboxilamida (16) são agitados â temperatura ambiente durante 24- h em 60 ml de 1,2«· -dicloroetano com 0,3 ml de fluorsulfonato de metilo, o sadimento precipitado 4 separado por filtração e seco em vácuo o Rendimentoí 65%·

IR: 3420 cm¹ (br), 3100(br)j 18O5(w), 177θ(»ι) 1745(s), 1700(.·η), l?85(m), 1280(m), 1255(s), 1230(è), 12O5(s), NMR(DM50, 100 kHz):í= 2,95 ppm (s,4H), 4.75 ppm (s,br,3H), £ = 7.0-9.0 ppm (m, 17I-I)

Espectro de massa! m/z= 594! M (catião).

Exemplo 5

cinimidoiloxicarbonilbenzenosulfonil)-lO-metilacridínio-p-carboxilamido-f luorsulf onato (21) partindo-se de 4-./N-( 4^-136 toxifenil)«sulfamidoJZ-benzeoato de benzilo e do cloridrato do cloreto do ácido acridino-9-carboxílico (3) realiza-se analogamente â sintese do composto (17) (ver exemplo 4). Os rendimentos dos passos individuais da síntese, assim como a caracterização espectroscópica, são indicadas adiante.

N-(4-metoxifenil)-N-(4-benziloxicarbonil-benzenosulfonil)-acridino-9-carboxilamida (18)

Rendimento: 70$ pf. s 182~183°C

NMR(dMSO, 100 MHz): 3,5 ppm (s,3H), 5,5 ppm (s,2H),

6.35-6.63 ppm (d,br,2Ií), 7.05-7«2 ppm (d,br,2H)_s á= 7.35-8.5 ppm (m,17K)

Bromidrato de N-(4-metoxifenil)-N-(4-carboxibenzenosulfonil)-acridino-9-carboxilamida (19)

Rendimento: 95% pf·· 273° (com decomposição).

NMR(DMS0, 100 MHz): £ = 3.5 ppm (s,3Il), £ = 6.4-6.6 ppm (d,br,2H) 7.O5-7.2 ppm (d,br,2H), £= 7.7-8.5 ppm (m,12H)

N-( 4-metoxif enil) -N-( 4-succinimidoiloxicarbonilbenzenossulf oniJ -acridino-9-ca^boxilamida (20)

Rendimentos 5θ% pf· 232~23^°0

NMR(DMS0, 100 Iffiz):í= 2,95 ppm (s,4ll), J= 3·5 ppm (θ,3Η)_?1= 6.4-6.6 ppm (d,br,2H), 7*05-7.25 ppm (d,br,2H), <$= 7.8-8.6 ppm (m,12H) IR: 3050 cm¹ 18O5(w), 1780(m), 174O(s), 1700(m), 15O5(m), 137O(ni), 1250(m), 1200(s), 1185

Fluorsulfonato de N-(4-metoxifenil)-N-(4-succinimidoiloxicarbonilbenzenosulfonil)-10-metilacridínio-9-carboxilamida (21) — 21 —

Ã substância não precipita depois da reacção, sendo isolada por concentração da solução e trituração do resíduo com éter diisopropílico.

Rendimento: 80%

NMR(DM30, 100 MHz):^ = 2,95 ppm (s,4H), £= 3,5 ppm (s,3Il),

4.8 ppm (s,br,3H), 6.45-6.7 ppm (d,br,2H), 7»2-7»4 ppm (d,br,2H), 7*7-9 ppm (m.1211) espectro de massa: m/.<= 264 (catião)

IR: 3440 cm¹ (br), 310C, 2950, 1805(^), 1775(»), 174O(s), 1695(m), 1610(m), 15O5(m), 1375(m), 1280(m), 1250(s), 1205(s).

Exemplo 6

A preparação de fluorsulfonato de N-(4-me·· toxifenil)-N-(3-succinimidoiloxicarbonil-benzenosulfonil)-10« -metilacridinio-9-carboxilamida (25) partindo-se do 3-/Ν-(4*«metoxif enil)-sulfamido?-benze a to de benzilo e do cloridrato do cloreto do ácido acridino-Q-carboxílico (3) θ realizada analogamente à síntese do composto (1?) (ver exemplo 4). 0s rendimentos dos passos individuais da síntese, assim como a caracterização espectroscópica, estão indicados a seguir.

N-(4-metoxifeni1)-N-(3-benzi1oxicarbonilbenzan0s alf cril)-acridino-9-cayboxilaniida ( 2 2)

Rendimento: 7θ% pf·: 168-17θ°Ο

NMR(DM30, 100 MHz): £ = 3·5 ppm (s,3H), Γ=5·45 PP» (s,2H), 6= 6.5 PP^ra (s,br,2H), £ = 7·1 PP» (br,2H), S- 7· 3-S .8 ppm (m,17H)

Bromidrato de N-(4~metoxifenil)-N-(3-carbQxibenzenosalfonil)-a··» cridino-9-carboxilamida (23)

Rendimento: _90$ pf.: 264 C — 22—

Α*

NMR(DHSO, 100 MHz): $= 3.5 ppm (s,3H), £= 6.4-6.6 ppm (d,br,2H), 7.0-7.2 ppm (d,br, 2H) ,<f= 7.6-8.8 ppm (m,12H)

N-(4-metoxifenil)-N-(3-succinimidoiloxicarbonilbenzenosulfonil -acridino-9~carboxilamida (24)

Rendimento: 50% pf.: 223*225°C

NMR (DMSO, 100 MHz) :^= 2.95 ppm (s,4H),S = 3.5 ppm (s,3H), £= 6.4-6.6 ppm (d,br,2H),^ = 7.O-7.2 ppm (d,br, 2H) , cí= 7.4-8.9 ppm (m,12H)

IR: 35OO cm”¹ (br), 3060, 2950, 2840, 1805(w), 1785(111), 174O(s), 1700(m), 1510(m), 138O(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m)

Fluorsulfonato de N-(4-metoxifenil)-N-(3-succinimidoiloxicarbo» nilbenzenosulf onil) -10-metilacridjCnio~9-carboxilamida. (25)

Rendimento: 90%

NMR(DMSO, 100 MHz): 2.95 ppm (s,4H), £ = 3.55 ppm (s,3H), $ = 4.8 ppm (s,br,3H),$= 6,45-6.7 (d,br,2H), £= 7.05-7.3 ppm (d,br,2H),X= 7-5-0.9 ppm (m,12H)

IR: 35OO cm¹ (br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 174o(s),35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 138O(m), 125O(s), 1205(s), 1170(s) espectro de massas m/z= 624 M⁺ (catião)

Exemplo 7

Preparaç^ao d^ema indicador (.tracer) para o imunoensaio de quimioluminescência de o(-f etoproteínas

100 de um anticorpo (1 mg/ml), 11,5 /U1 do acridfniotioóster preparado de acordo com o exemplo 1 (composto (6)) (1 mg/ml em DMSO e 600yul do tampão de conjugação (0,01 M fosfato, pH 8,0) são incubados durante 15 min. Seguidamente adicionam-se-lhes 200 yil de lisina (10 mg/ml) e procede-se à incubação durante mais 15 min. Este preprado é transferido para uma coluna PD 10 (Sephadex G 25, meio fosfato 0,lM, pH 6,3 como eluente). Recolhem-se 10 gotas por fracçãoo As frac çSes individuais, depois de uma diluição apropriada, são ensaia das quanto à sua actividade de quimioluminescencia (35°βΐ de

- 23 « oxidante: 0,1% de Η^Οβ em NaOH O,1N). As fracções de indicador (12 pico de actividade) são reunidas e armazenadas a 4-°C_e

Exemplo 8

Realização do imunoensaio de, quimioluminescência de t£-fetoproteina yul de padrão por amostra e 15θ yul de um tampão (fosfato; O,1M pH 6,3, 1% de Tween 20, 0,1% de albumina de soro de vitelo, 0,1 M NaCl, 0,01% de NaN^) são agitados 15 min. num tubo de ensaio onde já se encontrava o anticorpo monoclonal anti-^FP. beguJdamente lava-se 2 vezes com 1 ml de tampão. Adicionam-se 200 ^il do indicc^dor numa diluição convenien te durante 15 min. Lava-se novamente por 2 vezes com 1 ml do taii pão. A medição da quimioluminescência é iniciada com 350/al de um oxidante (0,1% de em NaOH 0,lN, 2 segundos de tempo de medida)·

A fig. 3 mostra a evolução típica de uma curva padrão de um ensaio imunocjuimioluminometrico (iCMá) para a ς^-fetoproteina (aFP).

Claims

REIVINDICAÇÕES fr* 1 - W

Processo para a preparação de derivados de acridínio quimioluminescentes de fórmula (i) na qual R representa hidrogénio, um radical alquilo, alcenilo ou alcinilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo benzilo ou 2 ° arilo, R e R⁷ representam hidrogénio, uia grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, uíh grupo amino substituído ou não substituído, um grupo carboxi, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, z 4 ciano ou nitro,ou halogenio, R representa um radical no qual um grupo sulfonamido está ligado directamente, através do áto

mo de azoto, ao grupo carbonilo, ou um grupo tioalquilo ou tio arilo de fórmula II -S-X-R⁵ (ΙΣ) em que -çr ai. representa um grupo alifático de cadeia linear ou ra- mifiçada ou um grupo aromático, o qual pode também conter he-

teroátomos, e R^ representa um grupo reactivo que em condições especiais pode estabelecer uma ligação selectiva com grupos a« mino, carboxi, tiol, ou outros grupos funcionais, em substân» z Θ cias de interesse biologico, e k representa um anião que não influencia a quimioluminescéncia, caracterizado pelo facto dínio de fórmula, VIII de se fazer reagir um composto de acri com 1 a 5 átomos de carbono no grupo alquilo, oxicarbonilarilo ou imidazolilo, primeiro com uma sulfonamida primária ou secundária ou com um ácido tiolcarboxílico de fórmula IX

Hb - X - GOOH (IX.) em que X tem o significado indicado acima, e seguidamente se fazer reagir o ácido obtido para obtenção do derivado de acri—
5 z dínio pretendido contendo o radical R , o qual seguidamenre e ainda quaternizado no átomo de c^zoto do grupo acridfnioo

25 Processo para a preparação de derivados de acridínio de acordo com a reivindiccioão 1 e nos quais 11' re.· presenta um grupo sulfonamido substituído de fórmula V •ΈΓ (V) ou de fórmula VI

-Μ (VI) « X - R^J em que X e R têm os significados mencionados anteriormente e

R.6 _na fórmula V representa um radical alquilo ou um radical alcenilo com 1 a 10 átomos de carbono, um grupo amino substituídc, um grupo benzilo ou um grupo arilo que também podem estar substituídos por hidroxi, amino, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbo«
6 » no ou ariloxi, e R na formula VI representa ainda adicionalmente aos substituintes mencionados um átomo de hidrogénio, ca·' racterizado pelo facto de se fazer reagir um composto de fórmula VIII com um ácido sulfonamido-carboxílico bloqueado de fórmula XHO

6 * ”

R. » SO »» N ** X w C — OZ(x) ou de fórmula XI

H

R⁶ - N - S0₂ - X - COOZ(XI) em que

X e R têm os significados mencionados anteriormente e Z e uni radical que bloqueia o grupo carboxi, o qual e dissociado em seguida, e se fazer reagir o ácido obtido deste modo com obten-> ção do derivado de acridínio contendo o radical R , o qual é seguidamente cuaternizado no átomo de azoto do grupo acridínio«

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uni derivado de acridínio em que X representa um grupo metileno, etileno, propileno, ou um grupo orto, meta ou para-fenileno.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um derivado de acridínio no qual R⁵ representa um grupo de fórmula III (ill)

5 - *·

Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um derivado de acridínio de fórmula IV significados anteriormente indicados_o em que A e X têm os

27 w — 6Processo anteriores caracterizado pelo acridínio de fórmula VII de acordo com as reivindicações facto de se obter um derivado de na qual Λ e X têm os significados anteriormente indicados.

Processo para a preparação de ura composto luminescente caracterizado pelo fescto de se ligar um derivado de acridínio, quando obtido por um processo de acordo com as reivindicações anteriores, directamente ou através de uma molé*> cuia ponte, a uma proteína, a utn polipeptídeo, ou a uma outra substância de interesse biológico, com formação de um conjugado estável imunologicamente activo.

» 8a <.

Processo para a realização de um imunoensaio de luminescência para determinação de uma substância anti·. gene numa amostra de líquido, caracterizado pelo facto de se imobilizar, num processo competitivo ou num processo de sandwich”,ρθΐο menos ..um componente imunologicamente activo sobre uma fase sólida, e pelo menos um outro componente, o indicador, um composto luminescente preparado pelo processo da reivindicação 7.
9Processo de acordo com a. reivindicação 8 caracterizado pelo facto de

a) se incubar um anticorpo imobilizado, que reage especificamente a um antigene, com uma amostrei do líquido a ensaiar e um conjunto obtido do antigene e de um derivado de acridínic quimioluminescente de acordo com a invenção;

b) se separar a amostra o conjugado marcado não ligado;

c) se por em contacto θ conjugado marcado ligado com um oxidante para causar uma emissão luminosa e

d) a partir da intensidade medida da emissão luminosa, determinar-se a Quantidade do antigene presente.

- 10® Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de, antes da adição do conjugado marcado, se separar o líquido a ensaiar do anticorpo imobilizado.

- 11® Processo de acordo com a reivindicação 8_?caracterizado pelofacto de

a) se incubar um anticorpo imobilizado, que reage especificamente com o antigene, com uma amostra do líquido a ensaiar e com um conjugado de um 2® anticorpo que reage especificamente e de um derivado de acridínio quimioluninescente de acordo com a invenção;

b) se separar a amostra e o conjugado marcado não ligado;

c) se pôr em contacto o conjugado marcado ligado com um oxidante para se provocar uma emissão luminosa e

i) a partir da intensidade da emissão luminosa medida, se determinar a quantidade do antigene presente.

caracterizado pelo cado, se separar o

Processo de acordo com a reivindicação 11 facto de, antes da adição cio conjugado marlíquido a ensaiar do anticorpo imobilizado₀

- 13& Processe de acordocom a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de

a) se incubar um antigene imobilizado que reage especificamente com o anticorpo, com uma amostra do líquido a ensaiar e uma solução de um conjugado obtido a partir do anticorpo e de um derivado de acridínio quimioluminescente de acordo com a invenção;

b) se separar a amostra e o conjugado marcado não ligado;

c) se pôr em contacto o conjugado marcado ligado com um oxidan·* te para se provocar uma emissão luminosa e

d) a partir da intensidade medida da emissão luminosa, minar a quantidade do antigene presente.

- 14& Processo de acordo com a. reivindicação 8 caracterizado pelo facto de

a) se incubar um antigene imobilizado, que reage especificamen>te com o anticorpo, com uma solução de um cojugado obtido do anticorpo e de um derivado de acridínio quimioluminescente de acordo com a invenção;

b) se separar o conjugado marcado não reagido,

c) se adicionar uma amostra do líquido a ensaiar,

d) se separar novamente a amostra,

e) se pôr em contacto o conjugado marcado ligado com um oxidante para se provocar uma emissão luminosa e

d) a partir da intensidade medida da emissão luminosa, se determinar a quantidade do antigene presente.

- 15® ^rocesso de acordo com a reivindicação 8 caraeterizado pelo facto de

a) se incubar um antigene imobilizado que reage especificament com o anticorpo, com uma solução de um conjugado obtido do anticorpo e de um derivado de acridínio quimioluminescente de acordo com a invenção;

b) se adicionar urna amostra do líquido a. ensaiar}

c) se separar a amostra e o conjugado não ligado;

d) se pôr em contacto o conjugado marcado ligado com um oxidan te para se provocar uma emissão luminosa e

d) a rartir da intensidade medida da emissão luminosa se deter minar a quantidade do antigene presente.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado. na República Federal Alemã, em 22 de Agosto de 1086, sob o n? P J6 28 573·θ·