FI90542B - Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä - Google Patents

Description

1 90542

Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä

Keksinnön kohteena ovat kemiluminoivat akridiini-5 johdannaiset, menetelmät niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä.

Luminoivilla yhdisteillä on jo monipuolista käyttöä. Niitä käytetään indikaattoreina eläinkokeissa, ent-syymi-immunoanalyyseissä ja luminesenssi-immunoanalyy-10 seissä (vrt. W.P. Collins "Alternative Immunoassays",

Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), mutta niitä käytetään myös nukleiinihappohybridointianalyyseis-sä (vrt. J.A. Matthews ym. "Analytical Biochemistry", 151, 205 - 209, 1985). Lisäksi kemiluminoivia yhdisteitä 15 käytetään "flow injection analyysin" yhteydessä, "post column" -detektoreina nestekromatografiässä, virtaustut-kimuksessa ja keinotekoisissa valolähteissä.

Kemiluminesenssi-immunoanalyysien yhteydessä huomattavampaa merkitystä on saavuttanut erityisesti kaksi 20 kerniluminoivien merkkiaineiden rakennetyyppiä. Kyseessä ovat tällöin toisaalta luminoli- tai isoluminolijohdannaiset, joita ovat selostaneet H.R. Schroeder ym., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Voi. LVII, 1978, 424 ff, samoin kuin ne, joita on selos-25 tettu GB-patenteissa 2 008 247 ja 2 041 920, DE-patentti-julkaisuissa 2 618 419 ja 2 618 511, samoin kuin EP-pa-tenttihakemuksessa 137 071. Yleiskatsaus isoluminoliyh-disteiden käytöstä käytännön sovellutuksissa luminesens-si-indikaattoreina on löydettävissä julkaisusta W.G.

• 30 Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, 905 - 918.

Toisaalta akridiniumesteriyhdisteille on löytynyt käyttöä myös kemiluminoivina merkkiaineina. Niiden kaltaisia akridiniumestereitä tunnetaan myös US-patentin 3 352 791, GB-patenttien 1 316 363 ja 1 461 877 sekö EP-35 patenttihakemuksen 82 636 perusteella. Akridiniumesterien 2 > Π 5 42 käyttöä merkkiaineina immunoanalyyseissä on selostettu julkaisussa Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479. Myös fenantridiniumesterien käyttö merkkiaineena luminesenssi-immunoanalyyseissä tunnetaan jo EP-patentti-5 hakemuksen 170 415 perusteella.

Akridiniumesterien kemiluminointi voidaan käynnistää lisäämällä alkalista H202-liuosta. Kemiluminoinnin mekanismista vakuuttavan selostuksen on esittänyt F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976. Tällöin ratkaiseva 10 merkitys on ilmeisesti poistuvan ryhmän laadulla sekä va-lokvanttituoton että myös hydrolyyttisen stabiilisuuden kannalta.

Toistaiseksi jo tunnettujen akridiniumesterien etuna luminoli- ja isoluminoliyhdisteisiin nähden on 15 suurempi valokvanttituotto, johon myöskään indikaattoriin sitoutuneilla proteiineilla ei ole haitallista vaikutusta (vrt. Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479).

Vaikkakin EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella 20 tunnetuilla akridiniumfenyyliestereillä kemiluminoinnin aktivoitumisessa mietojen hapetusaineiden vaikutuksesta on erinomaisen suuri näyttöherkkyys, niillä on käytännön sovellutusten kannalta häiritseviä varjopuolia. Ennen kaikkea fenyyliesterisidos on vesipitoisissa seoksissa jo 25 huoneen lämpötilassakin hyvin labiili. Lisäksi siinä mainituissa hapetusolosuhteissa akridiniumfenyyliestereillä esiintyy valoemissiota, joka vasta noin 10 sekunnin kuluttua on vaimentunut oleellisesti, se on yli 95-%risesti. Tähän verrattuna toisten ei isotooppisten 30 analyysimenetelmien mittausajat ovat huomattavasti ly hyempiä ja mahdollistavat siten suuremman näytteiden läpikulun.

Tämän keksinnön tehtävänä oli sen vuoksi saada käytettäväksi uusia akridiniumjohdannaisia, joilla suu-35 ren valokvanttituoton ohella on nopeampi reaktiokinetiik- 3 90542 ka ja mahdollistavat siten lyhyet mittausajat luminesens-si-immunoanalyysissä.

Keksinnön kohteena on kaavan (I) mukainen, kemilu-minoiva akridiniumjohdannainen 5 R1 L yf IL J (i» io 0=C-R4 jossa R1 on vety tai 1-10 hiiliatomia sisältävä alkyy-15 liryhmä, R* on kaavan (V) mukainen substituoitu sulfon-amidiryhmä .X-R5 (V) 20 ^"S02-R6 tai kaavan (VI) mukainen substituoitu sulfonamidiryhmä /R6 25 _NC (VI) ^so2-x-r5 tai kaavan (II) mukainen tioalkyyli- tai tioaryyliryhmä '30 -S - X - R5 (II) jolloin X on haaroittunut tai suora C^-Cs-alkyleeniryhmä tai orto-, meta- tai parafenyleeniryhmä, R5 on kaavan III mukainen ryhmä ·· ·-: 35 4 90542 0 V| II / , -C-O-N (III) ^- 5 O' R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu 1-4 hiiliatomia sisältävällä alkoksilla, ja A© on anioni, jolla ei ole haitallista vaikutusta kemiluminointiin.

Biologisesti mielenkiintoisilla aineilla tarkoite-10 taan ennen kaikkea antigeenejä. Tämän käsitteen piiriin sisältyvät myös hormonit, steroidit, lääkeaineet, lääke-ainemetaboliitit, toksiinit, alkaloidit ja myös vasta-aineet.

Kemiluminointiin haitallisesti vaikuttamaton anio-15 ni voi olla tetrafluoriboraatti-, perkloraatti-, haloge- nidi-, alkyylisulfaatti-, halogeenisulfonaatti-, alkyyli-sulfonaatti- tai aryylisulfonaattianioni. Myöskin jokaista muuta anionia voidaan käyttää, mikäli se ei sammuta tai heikennä kemiluminointia.

20 Yleensä akridiniumjohdannaisiksi valitaan sellai sia, joissa X on metyleeni-, etyleeni-, propyleeni- tai orto-, meta- tai para-fenyleeniryhmä. Akridiniumjohdan-naisten vesiliukoisuuden parantamiseksi näissä ryhmissä voi olla myös heteroatomeja sisältäviä, hydrofiilisiä 25 substituentteja.

Erityinen merkitys keksinnön mukaisten akridinium-johdannaisten käyttömahdollisuuksien kannalta on substi-tuentilla R5. Valitsemalla tämä ryhmä sopivalla tavalla akridiinijohdannainen saa niin suuren reaktiivisuuden, 30 että se jo lievissä olosuhteissa voi selektiivisesti muodostaa sidoksen osoitettavan biologisen aineen reaktioky-kyisen ryhmän kanssa. Keksinnön mukaisissa yhdisteissä R5 on I: 5

0 °>H

-C-O-N (HI) 5

Lisäksi ensisijaisina pidetään myös akridiniumjohdannaisia, joissa R1 on metyyliryhmä. Erityisen usein käytetään sen vuoksi keksinnön mukaisia akridiniumyhdis-teitä, jotka vastaavat kaavaa IV

10 CH-3

\J

lii II ^ 15 X ° Vn (iv)

cH

20 joissa A:11a ja X:llä on edellä mainitut merkitykset.

Kun keksinnön mukaisissa akridiniumjohdannaisissa tähde R4 on sulfoniamiditähde, silloin se voi vastata ensisijaisesti kaavaa V

. ; 25 ^ x-R5 -N<^ (V) so2-r6

tai kaavaa VI

: 30 /R6 -N (VI) >VnSsso2-x-r5 35 joissa X:llä ja R5:llä on edellä mainitut merkitykset ja 6 90542 R6 on kaavassa V fenyyliryhmä, jossa voi myös olla subs-tituenttina alkoksi, jossa on 1 - 4 hiiliatomia.

Tämän keksinnön mukaisen akridiniumjohdannaisluo-kan tyypilliset edustajat vastaavat kaavaa VII 5 CH, ^ Il i 1 αθ 10 ϊ >n

O N-X-C-O-N

\ ^ s02-C3 15 '- jossa Ailia ja X:llä on edellä mainitut merkitykset.

Tämän keksinnön myötä saadaan siis käytettäväksi kaksi uutta akridiniumyhdisteiden luokkaa, jolloin toiselle luokalle on ominaista tioliesteriryhmittymä ja toi-20 selle sulfoniamidirakenne. Akridiniumasyylisulfoniamidi-johdannaisten stabiilisuus on suurempi, tioliesterien kinetiikka on nopeampi kuin tähän saakka tunnettujen akri-diniumfenyyliesteriyhdisteiden. Molemmilla yhdisteluokil-la on sen lisäksi suurempi valontuotto.

25 Keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden, joissa on tioliesteripitoisia poistuvia ryhmiä, merkittävänä etuna on EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella tunnettuihin akridiniumfenyyliestereihin verrattuna valoemis-sion oleellisesti nopeampi reaktiokinetiikka. Siten esi-30 merkin 1 mukaisesti valmistettu keksinnön mukainen akri-diniumtioesteri (yhdiste 6) yhden sekunnin mittausaikana antaa 10 kertaa suuremman valontuoton samoissa hapetus-olosuhteissa. Tämä suuri valontuotos samanaikaisten lyhyiden mittausaikojen ohella mahdollistaa oleellisesti 35 suuremman näyteläpäisyn luminometrissä.

Il 7 90542

Siten kuvio 1 esittää esimerkin 1 mukaisesti valmistetun akridiniumtioesterin (yhdiste 6) vasta-ainekon-jugaatin valoemission kinetiikkaa ja kuvio 2 4-(2-sukkii-ni-imidyyli-oksikarbonyylietyyli)fenyyli-10-metyyliakri-5 dinium-9-karboksylaatti-metosulfaatin (EP-patenttihakemus 82 636, sivu 10) vasta-ainekonjugaatin valoemission kinetiikkaa. 100 μ1:η suuruisten kulloinkin kyseessä olevien merkkiaineliuosten kemiluminointi herätetään lisäämällä 350 μΐ 0,05-mol. KCl/NaOH-puskuria pH 13 + 0,1 % H202 ja 10 tallennetaan 10 sekunnin ajanjaksoin.

Kuviossa 1 maksimi valoemissio saavutetaan jo 0,66 sekunnin kuluttua ja on pudonnut 0,88 sekunnin kuluttua jo jälleen puoleen. Sitä vastoin kuviossa 2 maksimi valo-emissio saavutetaan vasta 1,77 sekunnin kuluttua ja on 15 pudonnut vasta 2,88 sekunnin kuluttua jälleen puoleen.

Kuvioista 1 ja 2 ilmenee, että keksinnön mukaisil la tioalkyyliesterityyppisillä yhdisteillä on selvästi lyhyempi valoemissioaika kuin läheisimmillä tekniikan tasosta tunnetuilla yhdisteillä (EP-A 82 636). Kuvioista la 20 ja 2a puolestaan ilmenee, että myös keksinnön mukaisilla asyylisulfonamidityyppisillä yhdisteillä on sama tekninen teho. Näissä kuvioissa on verrattu keksinnön mukaisten asyylisulfonamidityyppisten yhdisteiden (ASAM) ja tunnettujen fenyyliesterityyppisten yhdisteiden (AE) valoemis-25 siokinetiikkaa keskenään. Tuloksista havaitaan, että keksinnön mukaiset asyylisulfonamidityyppiset yhdisteet osoittavat välittömästi mittauksen alettua huomattavasti korkeamman signaalin kuin tunnetut fenyyliesterityyppiset yhdisteet. Täten kaikilla keksinnön mukaisilla yhdisteil-30 lä on sama tekninen teho.

Täysin odottamatonta on, että amidityppeen sulfo-nyylisubstituoidulla akridinium-9-karboksyylihappoamidil-la on erinomainen kemiluminointi, sillä tunnettua on, että akridinium-9-karboksyylihappoamidilla päinvastoin kuin 35 akridinium-9-karboksyylihappoestereillä ei esiinny min- 8 90542 käänlaista kemiluminointia (vrt. F. McCapra, W.

Carruthers ja J.K. Sutherland: Progress in Organic Chem., Voi. 8, 231 - 277, 1973, Butterworth, Lontoo).

Keksinnön mukaisia akridinium-9-karboksyylihappo-5 tioestereitä voidaan valmistaa seuraavaa tietä:

Akridiinin annetaan reagoida Lehmstedfin ja Hundertmark'in julkaisussa Ber. 63, 1229 (1930) esittämän menetelmän mukaisesti etanoli/jääetikassa ja kaliumsyani-din läsnä ollessa 9-syaaniakridiiniksi. Tästä saadaan 10 uudelleen kiteyttämisen jälkeen antamalla reaktion tapahtua rikkihapon ja natriumnitriitin kanssa Lehmstedfin ja Wirth'in julkaisussa Ber. 61, 2044 (1928) selostaman menetelmän mukaisesti akridiini-9-karboksyylihappoa. Antamalla akridiini-9-karboksyylihapon reagoida tionyylik- 15 loridin kanssa, saadaan kaavan VIII mukaista yhdistettä r2-000~ r3 | (VIII)

A

20 OY

jossa Y merkitsee klooria. Halogeenin asemesta Y:n paikalle yhdisteeseen VIII voidaan sijoittaa myös oksikarbo-nyyli-C1.5-alkyyli-, oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsoli-diryhmä.

25 Happokloridin (VIII) annetaan sitten reagoida kaa van IX mukaisen tiolikarboksyylihapon, HS-X-COOH (IX) 30 esim. 2-merkaptobentsoehapon kanssa aikalisissä olosuhteissa tioliesterikarboksyylihapoksi, joka sen jälkeen esteröidään tähteen R5 valmistamiseen soveltuvan yhdisteen, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa. Tämän jälkeen akridiiniyhdisteen 10-asema alkyloidaan kirjaili- 9 90542 suuden tuntemien menetelmien mukaisesti. Metylointiin soveltuu ennen kaikkea trimetyylioksoniumtetrafluoriboraat-ti, joskin myös dimetyylisulfaatin, metyylifluorisulfonaa-tin, tolueenisulfonihappometyyliesterin tai trifluorime-5 taanisulfonihappometyyliesterin kanssa saadaan hyviä kemi-luminoivan akridiumyhdisteen saantoja.

Keksinnön mukaisten akridinium-sulfoniamidijohdannaisten valmistamiseksi lähdetään myös akridiini-9-karbok-syylihappokloridista (VIII). Tämän yhdisteen annetaan sit-10 ten reagoida primaarisen tai sekundaarisen sulfoniamidin, ensisijaisesti suojatun kaavan X mukaisen sulfoniamidi-karboksyylihapon H 0 15 R6 - S02 - N - X - C - OZ (X) tai kaavan XI mukaisen suojatun sulfoniamidikarboksyyli-hapon

20 H

R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) kanssa, joissa kaavoissa X:llä ja R^:lla on edellä mainitut merkitykset ja Z on karboksiryhmää suojaava tähde, 25 joka sen jälkeen lohkaistaan pois. Tätä reaktiota varten suojaryhmänä voidaan käyttää esimerkiksi N-bentseenisulfo-nyyliglysiinibentsyyliesteriä. Suojaryhmän lohkaisemisen jälkeen syntyvä happo muutetaan sitten sopivan, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa, tähteeksi R^. Tästä 30 saadaan kemiluminoivaa akridiniumyhdistettä kirjallisuuden tuntemin menetelmin alkyloimalla 10-asemassa oleva typpi.

Saadut akridiniumyhdisteet voivat sitten reagoida biologisesti mielenkiintoisen aineen, esim. antigeenin, 35 vasta-aineen, hormonin, lääkeaineen, lääkeainemetaboliit-tien, toksiinin tai alkaloidin kanssa luminoivaksi yhdis- 10 90542 teeksi. Tällöin akridiniumjohdannainen sitoutuu joko suoraan tai siltamolekyylin, kuten polylysiinin, polyglutamii-nihapon tai polyvinyyliamiinin välityksellä biologisesti mielenkiintoiseen aineeseen muodostaen stabiilin, immuno-5 logisesti aktiivisen konjugaatin. Tätä konjugaattia nimitetään myös merkkiaineeksi ja sitä käytetään seuraavassa selostetuissa luminesenssi-immunoanalyyseissä. Keksinnön mukaista luminesenssi-immunoanalyysiä varten, antigeenin määrittämiseksi nestenäytteessä asianmukaisen tai Sandwich-10 menetelmän mukaisesti, tarvitaan ainakin yksi immunologi-sesti aktiivinen komponentti, joka on kiinnittyneenä kiinteään faasiin ja lisäksi luminoivaa merkkiainetta. Lumi-nesenssi-immunoanalyysi voidaan sitten suorittaa eri tavoin.

15 Eräänä mahdollisuutena on se, että antigeenin kans sa spesifisesti reagoivia kiinnitettyjä vasta-aineita inku-boidaan tutkittavan nesteen näytteen ja antigeenin ja ke-miluminoivan akridiniumjohdannaisen (antigeenimerkkiaine) konjugaatin kanssa, näyte ja sitoutumaton merkkiaine ero-20 tetaan, sitoutunut merkkiaine saatetaan hapetusaineen yhteyteen valoemission aiheuttamiseksi ja sitten mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

Toisena mahdollisuutena aluminesenssi-immunoanalyy-25 sin suorittamiseksi on se, että antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä vasta-ainetta tutkittavan nesteen näytteen kanssa inkuboidaan toisen, spesifisesti reagoivan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin kanssa, näyte ja sitoutumaton, merkit-30 ty konjugaatti erotetaan, sitoutunut, merkitty konjugaat-ti saatetaan hapetusaineen yhteyteen, valoemission aiheuttamiseksi ja mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

Edellä mainitut luminesenssi-immunoanalyysit voi-35 daan suorittaa myös siten, että tutkittava neste erotetaan t! 11 90542 kiinnittyneestä vasta-aineesta ennen merkityn konjugaatin lisäämistä.

Toisissa keksinnön mukaisesti suoritettavissa olevissa luminesenssi-immunoanalyyseissä kiinnitettynä ei ole 5 vasta-aine, vaan antigeeni.

Siten vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä antigeeniä voidaan inkuboida tutkittavan nesteen näytteen ja vasta-aineen ja kemiluminoivan akridi-niumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, sitten näyte 10 ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan ja sen jälkeen sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen ha-petusaineen kanssa. Tällöin tapahtuu valoemissiota, jonka voimakkuudesta voidaan määrittää läsnä olevan antigeenin määrä.

15 Eräs muu muunnelma perustuu siihen, että vasta-ai neen kanssa spesifisesti reagoivaa, kiinnitettyä antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, reagoitumaton, merkitty konjugaatti erotetaan, lisätään näytettä tutkit-20 tavasta nesteestä, sen jälkeen näyte erotetaan uudelleen, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetus-aineen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja tästä määritetään sitten läsnä olevan antigeenin määrä.

Lopuksi luminesenssi-immunoanalyysi voidaan suorit-25 taa myös sillä tavalla, että vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, lisätään näyte tutkittavasta nesteestä, näyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, si-30 toutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetusai-neen kanssa ja sitten mitatusta valoemissiosta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

Keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden valmistus esitetään esimerkein 1-3.

12 90 542

Esimerkki 1 9-syaaniakridiini (1)

Akridiiniin (10 g), joka on 45 ml:ssa etanolia, lisätään 3,3 ml jääetikkaa ja tiputtamalla liuos, jossa on 5 5,25 g kaliumsyanidia 8 ml:ssa vettä, reaktioseosta läm mitetään kiehuttaen kaksi tuntia, jäähdytetään ja haihtuvat osat imetään pois vakuumissa. Jäännöstä sekoitetaan 30 ml:n kanssa 2-norm. NaOH, suodatetaan ja kahteen kertaan 2 norm. NaOH:11a ja vedellä pesemisen jälkeen tuot-10 teen annetaan olla jonkin aikaa kosteana ilmassa. Raaka-tuotetta sekoitetaan metyleeniklorissa, liukenematon aine suodatetaan erilleen ja pestään metyleenikloridilla, yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja raaka syaaniakridiini kiteytetään uudelleen n-butyyliasetaa-15 tista.

Saanto: 50 %. Sulamispiste: 183 - 5°C.

IR: 2230 cm-1

Akridiini-9-karboksyylihappo (2) 9-syaaniakridiini (5 g) lisätään hitaasti annoksit-20 tain 40 ml:aan väkevää H2SO^ ja seosta lämmitetään kaksi tuntia 90 - 95°C:ssa; sen jälkeen kun on lisätty 8,5 g NaN02 sekoitetaan edelleen kaksi tuntia tässä lämpötilassa. Kuuma liuos lisätään nopeasti sekoittaen 620 ml:aan ... jäävettä, sakka suodatetaan erilleen ja liuotetaan mahdol- 25 lisimman pieneen määrään 2-norm. NaOH. Liuos suodatetaan ja tehdään happameksi 50-%:isella H2SO(j:llä, erilleen laskenut akridiini-9-karboksyylihappo suodatetaan eril-leen ja kuivataan vakuumissa.

Saanto: 95 %. Sulamispiste: 288 - 9°C.

·. 30 IR: 3440 (br), 3 200 (br), 2600-2500 (br), 1980; 1650; 1605; 1420 cm"1

Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (3)

Akridiini-9-karboksyylihappo (5 g) lisätään annoksittain 50 ml:aan vastatislattua SOCI2 ja lämmitetään kie-35 huttaen viisi tuntia; kirkas liuos konsentroidaan tislaamalla, kunnes alkaa muodostua sakkaa, saostuminen täyden- I, 13 90542 netään lisäämällä sykloheksaania ja jäähdyttämällä- Suodattamalla sakka erilleen ja kuivaamalla vakuumissa saadaan akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia. Saanto: 90 %. Sulamispiste: 223°C.

5 Alkuaineanalyysi (laskettu yhdisteelle C^H^CINO x HC1) Laskettu: C 60,5 H 2,8 H 5,0 Cl 25,5 Saatu: C 59,4 H 3,3 N 5,0 Cl 25,2 (Fenyyli-21-karboksyylihappo)akridiini-9-tiokarbok-sylaatti (4) 10 Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (30 g) suspendoidaan 720 ml:aan metyleenikloridia, lisätään tiosalisyylihappoa (17,7 g) ja 50 ml trietyyliamii-nia, sen jälkeen kirkastuvaa liuosta sekoitetaan 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun liuotin on 15 imetty pois, jäännökseen lisätään 35 g soodaa ja 1 400 ml vettä, saatua liuosta konsentroidaan, kunnes ilmestyy sakkaa, tämä suodatetaan erilleen. Suodos kyllästetään NaCl:lla ja myöskin tällöin alas laskenut sakka suodatetaan erilleen. Yhdistettyjen sakkojen vesiliuos tehdään 20 80°C:ssa happameksi jääetikkahapolla, alas laskenut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.

Saanto: 80 %. Sulamispiste: 261 - 5°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 7,6-8,4 ppm, kompleksinen multipletti IR: 1680 cm-1 (s), 1720 (m) 1260 (s) 25 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakri-diini-9-tiokarboksylaatti (5)

Suspensioon, jossa on 10 g tioliesterikarboksyyli-happoa 190 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania, lisätään 30 0°C:ssa 3,2 g N-hydroksisukkiini-imidiä, sitten -20°C:ssa 6,9 g disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) ja sen jälkeen sekoitetaan -20°C:ssa kaksi tuntia, sitten yön ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun on lisätty 0,28 ml jää-' : etikkaa, sekoitetaan tunnin ajan, sitten lisätään etyyli- 35 asetaattia (25 ml) ja sakka suodatetaan erilleen. Suodos haihdutetaan kuiviin ja klooribentseenistä uudelleen- 14 90 542 kiteyttämisen jälkeen saadaan vaaleankeltaista 2'-(sukkiini -imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakridiini-9-tiokarboksy-laattia.

Saanto: 80 %. Sulamispiste: 198 - 200°C.

5 IR: 1810 cm"1, 1780, 1745, 1225, 1205 NMR (DMSO), 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s. 4Ή), 7,7-8,4 ppm (m, 12H) 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyli-10-10 metyyliakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluori- boraatti (6) 3 g N-hydroksisukkiini-imidiesteriä (5) lämmitetään 7,8 g:n kanssa trimetyylioksoniumtetrafluoriboraattia 40 ml:ssa 1,2-dikloorietaania kahdeksan tuntia 80°C:ssa 15 ja sen jälkeen sekoitetaan yön ajan huoneen lämpötilassa. Sakka suodatetaan erilleen ja kiehautetaan 1,2-dikloori-etaanin kanssa. Yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja kiteytetään uudelleen asetoni-di-isopropyyli-eetteriseoksesta.

20 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 245°C.

IR: 3440 cm"1 (br), 1800, 1780, 1740(s), 1670, 1065(s) NMR (DMSO, 100 MHz); 5= 3,0 ppm (s, 4H), 4,95 ppm (s, hieman leventyn.3H), 7,9-8,6 (m, 10H), 9,9 ppm (d, 2H) 25

Esimerkki 2

Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyli-10-metyy-liakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraatin valmistus, lähtemällä happokloridista (3) ja tioglykoli-30 haposta, tapahtuu yhdisteen (6) synteesin mukaisesti. Yk--- sityisten synteesivaiheiden saannot samoin kuin tuotteiden (7) - (9) spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seu-raavassa:

Karboksimetyyliakridiini-9-tiokarboksylaatti (7) 35 Saanto: 60 %. Sulamispiste: 218°C (hajoten).

l· 15 90542 IR: 3440 cm-1 (br) , 2400(br), 1950(br), 1710(m), 1660(s), 1070(m) NMR (DMSO, 100 MHz): δ= 4,25 ppm (s, 2H); 7,6-8,4 (m, 8H) 5 Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyliakridiini-9- tiokarboksylaatti (8)

Saanto: 80 %.

IR: 3440 cm-1 (br), 2930, 1820, 1785, 1740(a), 1205, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz); 6= 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2H), 10 7,6-8,3 ppm (m, 8H)

Sukkiini-iInidoyylioksikarbonyyl·imetyyli-10-metyyli-akridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraat-ti (9) 15 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 250°C.

IR: 3440 cm"1 (br) , 1810, 1780, 1735(a), 1538, 1350, 1060 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppm, (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H) 20

Esimerkki 3 N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbonyyli-metyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (10) 3,3 g:aan N-bentseenisulfonyyliglysiinibentsyyli-25 esteriä, joka on 110 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisätään 130 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiiniä ja 6 ml trietyyli-amiinia, 10 minuutin kuluttua lisätään 3 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia ja muodostunutta suspensiota lämmitetään kuusi tuntia kiehuttaen. Sakka 30 suodatetaan erilleen, liuotin imetään pois, jäännös liuotetaan metyleenikloridiin ja sekoitetaan lyhyt aika 2-norm. NaOH:n kanssa. MgSO^:lla kuivaamisen jälkeen orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja saatu jäännös kiteytetään uudelleen tolueeni/heptaaniseoksesta.

35 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 58°C.

16 90542 IR: 3440 cm-1 (br), 1735, 1680, 1357, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H), 7,0-8,4 ppm (m, 18H ) 5 N-bentseenisulfonyyli-N-(karboksimetyyli)akridiini- 9-karboksyylihappoamidi (11) I g N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbo-nyylimetyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia hydrataan 60 ml:ssa jääetikkaa lisäämällä 2 ml väkevää HC1 ja Pd/C:tä 10 (10 %) huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa; reaktion päätyttyä katalyytti suodatetaan pois, suodoksesta saadaan kuiviin haihduttamalla karboksyylihappoa keltaisena kiinteänä aineena.

NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,0 ppm (s, 2H), 7,1-8,5 ppm (m, 1 3H) 15

Yhdisteen (11) annetaan reagoida N-hydroksisukkii-ni-imidin kanssa samalla tavalla kuin valmistettaessa yhdistettä (5), N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyyli-oksikarbonyylimetyyliakridiini-9-karboksyylihappoamidiksi 20 (12). (12) kvaternoidaan (6):n yhteydessä selostetulla ta valla N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyylioksikar-bonyylimetyyli)-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidi-tetrafluoriboraatiksi (13) .

Esimerkki 4 25 N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibentseeni- sulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (14) II g:aan 4-(N-fenyylisulfamido)bentsoehappobentsyy-liesteriä, joka on 300 ml:ssa metyleenikloridia, lisätään 360 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiiniä ja 16,6 ml trietyyli- 30 amiinia, 10 minuutin kuluttua lisätään 8,34 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia (3) ja lämmitetään kiehuttaen 16 tuntia. Jäähdytettyä liuosta sekoitetaan lyhyen ajan 2-norm. NaOH:n kanssa, erotettu orgaa-ninen faasi pestään vedellä, kuivataan Na2S0^:lla ja haih-35 dutetaan kuiviin. Jäännös kiteytetään uudelleen tolueeni/ - heptaaniseoksesta.

I: 17 90542

Saanto: 70 %. Sulamispiste: 161 - 163°C.

NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 5,5 ppm (s,2H), 6= 6,8-8,6 ppm (m,22H) N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli)akridii-5 ni-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidi (15) 8,58 g N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibent-seenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia (14) lämmitetään 30 ml:ssa 33-%:ista HBr:n jääetikkaliuosta kaksi tuntia 60°C:ssa, jäähdyttämisen jälkeen siihen lisätään 10 60 ml di-isopropyylieetteriä, sakka suodatetaan imussa erilleen ja kuivataan vakuumissa.

Saanto: 95 %. Sulamispiste: 255°C.

NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 6,8-9 ppm (m) 15 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli- bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-di (16) 5,63 g:aan N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli) akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidia (15), 20 joka on 250 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisätään 2,8 ml trietyyliamiinia, jäähdytetään -15°C:seen ja lisätään 0,96 ml kloorimuurahaishappoetyyliesteriä. Sekoitetaan 20 minuuttia, lisätään 1,15 g N-hydroksisukkiini-imidiä, sekoitetaan kolme tuntia -15°C:ssa, annetaan lämmetä huo-25 neen lämpötilaan ja sen jälkeen sekoitetaan yön ajan. Sakka suodatetaan pois, suodos haihdutetaan kuiviin, jäännös liuotetaan metyleenikloridiin, saatu liuos pestään vedellä, NaHCO^-liuoksella ja vedellä ja kuivataan Na2S04:lla. Orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja 30 jäännös kiteytetään uudelleen tolueenista.

Saanto: 50 %. Sulamispiste 226°C (hajoten).

: NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 6,8-8,7 ppm (m,17H) 18 90542 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-karb-oksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (17) 1,16 g N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbo-5 nyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-dia (16) sekoitetaan 60 ml:ssa 1,2-dikloorietaania 0,3 ml:n kanssa metyylifluorisulfonaattia 24 tuntia huoneen lämpötilassa, alas laskeutunut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.

10 Saanto: 65 %.

IR: 3420 cm"1 (br), 3100(br), 1805(w), 1770(m) 1745(a), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(a), 1230(a), 1205(a), NMR(DMS0, 100 MHz): 5= 2,95 ppm (s,4H), 6= 4,75 ppm (s,br, 3H), 6= 7,0-9,0 ppm (m,17H) 15

Massaspektri: m/z = 594 : M+ (kationi)

Esimerkki 5 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-20 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (21) valmistus lähtemällä 4-/“N- (4 '-metoksifenyyli) sulfamido_/bentsoehappo-bentsyyliesteristä ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mukaisesti (ks. esimerkkiä 4). Yksityisten synteesivaiheiden i 25 saannot samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seuraavassa.

N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-amidi (18) 30 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 182 - 183°C.

: NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 5,5 ppm (s,2H), 6= 6,35-6,63 ppm (a,br,2H), 6= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,35-3,5 ppm (m,17H) ti 19 90542 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (19)

Saanto: 95 %. Sulamispiste: 273°C (hajoten).

5 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br, 2H), δ= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6 = 7,7-8,5 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-10 syylihappoamidi (20)

Saanto: 50 %. Sulamispiste: 232 - 234°C.

NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6 = 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6*7,05-7,25 ppm (d,br,2H), 6= 7,8-8,6 ppm (m,12H) IR: 3050 cm-1 1305(w), 1730(m), 15 1740(b), 1700(m), 1505(m), 1370(m), 1250(a), 1200(b), 1185 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-20 nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (21)

Aine ei saostu erilleen reaktion aikana, se saadaan talteen haihduttamalla liuos kuiviin ja sekoittamalla jäännöstä di-isopropyylieetterin kanssa.

.*·. Saanto: 80 %.

. .·. 25 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 3,5 ppm (s,3H), : 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6= 6,45-6,7 ppm (d,br,2H), 6= 7,2-7,4 pprn (d,br,2H), 6= 7,7-9 ppm (m,12H)

Massaspektri: m/z = 624 M+ (kationi) 30 IR; 3440 cm"1 (br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 1740(b), 1695(m), 1610(m), 1505(m), 1375(m), 1280(m), 1250(b), 1205(b).

Esimerkki 6 35 N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi- karbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9- 20 90 5 42 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (25) valmistus lähtemällä 3-/N-(4'-metoksifenyyli)sulfamidojbentsoehappo-bentsyyliesteristä ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mu-5 kaisesti (ks. esimerkkiä 4). Yksityisten synteesivaiheiden saanto samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seuraavassa.

N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-10 amidi (22)

Saanto: 70 %. Sulamispiste 168 - 170°C.

NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6 = 5.45 ppm (s,2H), 6= 6,5 ppm (s,br,2H), 6= 7,1 ppm (br,2H), 6= 7,3-3,8 ppm (m,17H ) 15 N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (23)

Saanto: 90 %. Sulamispiste: 264 C.

20 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6.4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,6-8,8 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-25 syylihappoamidi (24)

Saanto: 50 %. Sulamispiste: 223 - 225°C.

NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (a,4H), 6= 3,5 ppm (s,3H), 5=6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,4- 8,9 ppm (m,12H) 30 iR. 3500 cm"1 (br), 3060, 2950, 2840, 1805(v), 1785(m), 1740(a), 1700(m), 1510(m), 1380(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m) 2i 90 542 N- (4-metoksifenyyli) -N- (3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (25) Saanto: 90 %.

5 NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 3,55 ppm (s,3H), 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6 = 6,45-6,7 (d,br,2H), δ= 7,05-7,3 ppra (d,br,2H), 6= 7,5-8,9 ppm (m,12H) IR: 3500 cm"1 (br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 1740(s),35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250(s), 1205(s), 1170(s) 10

Esimerkki 7

Merkkiaineen valmistus x-fetoproteiini-kemilumine-senssi-immunoanalyysiä varten 100 ^,ul vasta-ainetta (1 mg/ml) , 11,5 ^ul esimer-15 kin 1 mukaisesti valmistettua akridiniumtioesteriä (yhdiste 6) (1 mg/ml DMSO:ssa) ja 600 ^ul konjugaatiopusku- ria (0,01-mol. fosfaattia, pH 8,0) inkuboidaan 15 minuuttia. Sen jälkeen lisätään 200 ^ul lysiiniä (10 mg/ml) ja inkuboidaan edelleen 15 minuuttia. Tämä erä siirretään 20 PD-10-pylvääseen (Sephadex G 25 Medium, 0,1-mol. fosfaattia, pH 6,3, liuottimena). Kootaan 10 pisaran fraktioita. Yksityisistä fraktioista testataan sopivan laimennuksen :jälkeen niiden kemiluminesenssiaktiivisuus (350 ^ul hape-. tinta: 0,1 % Η£θ2^3 0,1-nomr. NaOH:ssa). Merkkiainefrak- . .·. 25 tiot (1. aktiivisuuspiikki) yhdistetään ja varastoidaan 4°C:ssa.

Esimerkki 8 . o^-fetoproteiinin kemiluminesenssi-immunoanalyysin suorittaminen 30 50 ^ul standardi/näytettä ja 150 ^ul puskuria (fos- : faatti? 0,1-mol., pH 6,3, 1 % Tween 20, 0,1 % naudanseeru- ; mialbumiinia, 0,1-mol. NaCl, 0,01 % NaN^) ravistellaan 15 minuuttia monoklonaalisella anti-AFF-vasta-aineella pinnoitetuissa pienissä putkissa. Sen jälkeen pestään kaksi 35 kertaa 1 ml :11a puskuria.

22 90 542

Sopivana laimennuksena lisätään 200 ^ul merkkiainetta ja ravistellaanl5 minuuttia. Pestään uudelleen kaksi kertaa 1 ml :11a puskuria. Kemiluminointimittaus aloitetaan 350 ^ul:lla hapetinta (0,1 % H2°2 0,1-norm. NaOH:ssa, 5 kahden sekunnin mittausaika).

Kuvio 3 esittää tyypillistä immuuni-kemiluminomet-risen analyysin (ICMA) standardikäyrän kulkua oi-fetopro-teiinin (AFP) osalta.

t:

Claims (15)

23. j 5 4 2

1. Kaavan (I) mukainen, kemiluminoiva akridinium-johdannainen 5 R1 iT T I a® (i) io y 0=C-R4 jossa R1 on vety tai 1-10 hiiliatomia sisältävä alkyy-15 liryhmä, R4 on kaavan (V) mukainen substituoitu sulfon-amidiryhmä ,X-R5 -Νγ (V) 20 ^v"S02-R6 tai kaavan (VI) mukainen substituoitu sulfonamidiryhmä 25 -N ^ (VI) ^so2-x-r5 tai kaavan (II) mukainen tioalkyyli- tai tioaryyliryhmä

30 -S - X - R5 (II ) jolloin X on haaroittunut tai suora C^-Cj-alkyleeniryhmä tai orto-, meta- tai parafenyleeniryhmä, R5 on kaavan III mukainen ryhmä

24 S ' 5 4 2 0 °>H Il 7 -C-O-N (III) 5 R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu 1-4 hiiliatomia sisältävällä alkoksilla, ja A® on anioni, jolla ei ole haitallista vaikutusta kemiluminointiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjoh-10 dannainen, tunnettu siitä, että X on metyleeni-, etyleeni-, propyleeni- tai orto-, meta- tai para-fenylee-niryhmä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjoh-dannainen, tunnettu siitä, että sillä on kaava IV 15 ch3 f^vV^i I A© 20. o V-, <iv) ^ \ H /

0 S-X-C-O-N o jossa A:11a ja X:llä on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut 25 merkitykset.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjohdannainen, tunnettu siitä, että sillä on kaava VII ch3 y\ « y~\ mi) 35. n-X-C-O-N \ 25 9Γ: S42 jossa A:11a ja X:llä on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut merkitykset.

5. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten akri-diniumjohdannaisten valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että kaavan VIII mukaisen akridiiniyhdisteen ^ ^ (VIII) 10 O Y jossa Y merkitsee halogeenia, oksikarbonyyli-C^j-alkyy-li-, oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsolidiryhmää, anne-15 taan ensin reagoida primaarisen tai sekundaarisen sulfon-amidin tai kaavan IX mukaisen tiolikarboksyylihapon kanssa, HS - X - COOH (IX) 20 jossa kaavassa X:llä on patenttivaatimuksessa 1 kuvatut merkitykset, ja sitten saatu happo muutetaan ryhmän R5 sisältäväksi, halutuksi akridiinijohdannaiseksi, jonka akridiinirungon typpiatomi sen jälkeen vielä kvaternoi-25 daan.

6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten, kaa van (V) mukaisia substituoituja sulfonamidiryhmiä sisältävien yhdisteiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kaavan VIII mukaisen yhdisteen annetaan reagoida 30 suojatun sulfonamidi-karboksyylihapon kanssa, jolla on kaava X H 0 6 1 1' R - S02 -N-X-C-OZ (X) tai kaava XI 35

26 S:r' 5 42 H 6 * R - N - S02 - X - COOZ (XI) 5 joissa X:llä ja R6:lla on patenttivaatimuksessa 4 kuvatut merkitykset ja Z on karboksiryhmän suojaryhmä, joka lohkaistaan sen jälkeen pois, ja tällöin muodostunut happo muutetaan ryhmän R5 sisältäväksi halutuksi akridiniumjohdannaiseksi, jonka akridiinirungon typpiatomi sitten vie- 10 lä kvaternoidaan.

7. Luminoiva yhdiste, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen akridiniumjohdannainen on immobilisoitu suoraan tai siltamolekyylin välityksellä proteiiniin, polypeptidiin tai muuhun biologiseen ainee- 15 seen muodostaen stabiilin, immunologisesti aktiivisen konjugaatin.

8. Luminesenssi-immunoanalyysi antigeenisen aineen määrittämiseksi nestenäytteessä, jonka yhteydessä kompe-titiivisessa tai Sandwich-menetelmässä ainakin yksi immu- 20 nologisesti aktiivinen komponentti on immobilisoitu kiin teään faasiin ja ainakin yksi muu komponentti, merkkiaine, merkitsee patenttivaatimuksen 7 mukaista luminoivaa yhdistettä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssiim- 25 munoanalyysi, tunnettu siitä, että a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa, immo-bilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavan nesteen näytteen ja antigeenin ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin 30 kanssa; b) näyte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kosketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi 35 ja li 27 9.1542 d) mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitä, että ennen mer- 5 kityn konjugaatin lisäämistä tutkittava neste erotetaan immobilisoidusta vasta-aineesta.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitä, että a) antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa immo-10 bilisoitua vasta-ainetta inkuboidaan tutkittavan nesteen näytteen ja toisen, spesifisesti reagoivan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kerniluminoivan akridi-niumjohdannaisen konjugaatin kanssa; b) näyte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti 15 erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kosketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi ja d) mitatusta valoemission voimakkuudesta määrite-20 tään läsnä olevan antigeenin määrä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitä, että ennen merkityn konjugaatin lisäystä tutkittava neste erotetaan immobilisoidusta vasta-aineesta.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi- immunoanalyysi, tunnettu siitä, että a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa, im-mobilisoitua antigeeniä inkuboidaan tutkittavan nesteen näytteen ja vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukai- 30 sen, kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa; b) näyte ja sitoutumaton, merkitty konjugaatti erotetaan; c) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos- 35 ketukseen hapettimen kanssa, valoemission aiheuttamiseksi Ja o rs c ,ι o 28 - > f £- d) mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.

14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitä, että 5 a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa, im- mobilisoitua antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, b) reagoimaton, merkitty konjugaatti erotetaan, 10 c) lisätään tutkittavan nesteen näyte, d) sen jälkeen näyte erotetaan jälleen, e) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kosketukseen hapettimen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja 15 f) mitatusta valoemission voimakkuudesta määrite tään läsnä olevan antigeenin määrä.

15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen luminesenssi-immunoanalyysi, tunnettu siitä, että a) vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa, im-20 mobilisoitua antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen, kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, b) lisätään tutkittavan nesteen näyte, c) näyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, 25 d) sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan kos ketukseen hapettimen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja e) mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä. tl 29 >·. 5 42