FR2625565A1 - Esters, thioesters et amides chimioluminescents perfectionnes, et analyses les utilisant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des composés chimioluminescents présentant une stabilité accrue en solution aqueuse. Le groupement chimioluminescent est un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre 1 un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée la liaison, l'hétéro-atome étant à un état d'oxydation qui rend cet atome de carbone sensible à l'attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence, et 2 un noyau ou système cyclique aryle, contenant au moins un noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, deux au moins de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison. Application : compositions et kits analytiques renfermant lesdits groupements chimioluminescents, destinés à des analyses par liaison spécifique.

Description

La présente invention a pour objet des analyses et immuno-essais utilisant comme marqueur des conjugués chimioluminescents.

Certains composés émettent de la lumière ou "entrent en chimioluminescence" par traitement avec un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire å pH élevé. La lumière est produite par la dégradation d'un intermédiaire chimique qui est formé par 1 'attaque du peroxyde ou de l'oxygène moléculaire au niveau d'un centre carboné hybridé sp2 ou sp3. Le centre .carboné qui est attaqué peut constituer une partie d'une chaîne, d'un noyau ou d'un système cyclique.

Les caractéristiques et le comportement de certains de ces composés chimioluminescents sont décrits plus en détail par McCapra dans "Chemiluminescence of
Organic Compounds", dans Proqress in Oraanic Chemistrv, volume 8, Carruthers and Sutherland ed. (Wiley & Sons 1973), qui est cité å titre de référence dans le présent mémoire.

Des composés chimioluminescents ont été utilisés comme marqueurs dans des analyses expérimentales, comprenant des immuno-essais, depuis de nombreuses années.

Des exemples d'une telle utilisation peuvent être trouves dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Ne 4 383 031, 4 380 580, 4 226 993 et de nombreux autres brevets.

Cependant, en général, ces composés n'ont pas été utilisés dans des analyses commerciales en raison de leur manque de stabilité dans des solutions aqueuses. Ce manque de stabilité est particulièrement important pour la souscatégorie de composés chimioluminescents comprenant certains esters, thioesters et amides. Ces composes réagissent conformément à la réaction générale représentée ci-dessous pour les esters

dans laquelle A représente un noyau ou système cyclique aryle et B représente un noyau ou système cyclique hétérocyclique. Les composés de cette sous-catégorie tendent à "perdre leur chimioluminescence" en raison de l'hydrolyse prématurée de la liaison ester, thioester ou amide. Une fois la liaison hydrolysée, le composé n'engendre plus efficacement de chimioluminescence.Si le composé est utilisé comme marqueur dans une analyse, le marqueur perd progressivement sa capacité à entrer en chimioluminescence, donnant ainsi des résultats analytiques non fiables.

En conséquence, il est souhaitable de proposer des esters, thioesters et amides chimioluminescents, destinés à être utilisés dans des analyses, qui ne soient pas aussi sensibles à l'hydrolyse et présentent ainsi une stabilité accrue en solution aqueuse.

Conformément à la présente invention, il est révélé des analyses par liaison spécifique qui utilisent un composé, c'est-à-dire un groupement, chimioluminescent qui possède une stabilité accrue en solution aqueuse. Le groupement chimioluminescent est un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre (1) un noyau ou système cyclique hetérocyclique contenant un atome de carbone auquel la liaison est fixée, l'hétéro-atome à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend cet atome de carbone sensible à l'attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence, et (2) un noyau ou système cyclique aryle. Le noyau ou système cyclique aryle contient au moins un noyau hexagonal substitué.Le noyau hexagonal substitué porte deux ou plus de deux substituants, dont au moins deux bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison. Un ou plusieurs des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison peuvent être un groupe électrophile. Le noyau hexagonal substitué peut porter un ou plusieurs substituants supplémentaires, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison. Ces substituants supplémentaires peuvent également être des groupes électrophiles.

L'atome de carbone dans le noyau ou système cyclique hétérocyclique, auquel la liaison est fixée, peut porter egalement un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant O, N,
S et C, R représentant n'importe quel groupe et n étant un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable. I1 est décrit d'autres groupements chimioluminescents qui sont caractérisés par la présence d'un noyau ou système cyclique hétérocyclique et d'un substituant secondaire de formule RnX-, la liaison ester, thioester ou amide - étant située entre le noyau ou système cyclique hét8rocyclique et un groupe partant. Les groupements chimioluminescents décrits peuvent également comprendre des substituants en positions péri à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique.

De même, conformément à la présente invention, il est décrit des compositions comprenant ces groupements chimioluminescents et des kits analytiques renfermant ces groupements chimioluminescents.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels figurent les abréviations suivantes, destinées à identifier différents groupements
"P" représente un ester phénylique d'acridinium
"DM" représente un ester (2,6-diméthyl)- phénylique d'acridinium
"DMC" représente un ester (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl) phénylique d'acridinium ;
"DM5" représente un ester (2,6-diméthyl-3 chlorosulfonyl) phénylique d'acridinium ;
"DMN" représente un ester (2,6-diméthyl-4nitro)phénylique d'acridinium
"Quat" représente un ester (2,6-diméthyl-4triméthylammonio)phénylique d'acridinium ; acridinium
"DMB" représente un ester (2,6-diméthyl-4bromo)phénylique d'acridinium
"C2" ou "C2NHS" représente un ester 4-(2succinimidylcarboxyéthyl)phénylique d'acridinium ; acridinium
"DME" représente un ester (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phénylique de 9-éthoxy-acridane ; et
"TA" signifie température ambiante.

- La figure 1 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 35C.

- La figure 2 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 45 C.

-La figure 3 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de
N-méthylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 35 C.

- La figure 4 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de différents esters de N-methylacridinium dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 45 C.

- La figure 5 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 6,3, à 4 C.

- La figure 6 est un graphique représentant les resultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters DXN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 7,3, à 4 C.

- La figure 7 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate à pH 8,0, à 4 C.

- La figure 8 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 6,3, à 4 C.

- La figure 9 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgG-esters
DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 7,3, à 4C.

- La figure 10 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton, à pH 8,0, à 4 C.

- La figure ll est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (à la place de la sérumalbumine humaine) à pH 6,3, à 4-C.

- La figure 12 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (å la place de la sérum albumine humaine) à pH 7,3, à 4'C.

- La figure 13 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués IgGesters DMN, DMC- et C2NHS dans un tampon standard au phosphate, en l'absence d'IgG de mouton et en présence de 0,1% de sérum-albumine bovine (à la place de la sérumalbumine humaine) à pH 8,0, à 4 C.

- La figure 14 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué ester
C2NHS-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 15 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 16 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMC-IgG dans un tampon standard au phosphate à température ambiante, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 17 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué ester
C2NHS-IgG dans un tampon standard au phosphate à 37 C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 18 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMC-IgG dans un tampon standard au.phosphate à 37'C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 19 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG (produit avec un excès molaire de marqueur égal à 20x) dans un tampon standard au phosphate à 37*C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- la figure 20 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du conjugué DMN-IgG (produit avec un excès molaire, de marqueur égal à 5x) dans du tampon standard au phosphate à 37-C, à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

- La figure 21 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 6,9, à 37 C.

- La figure 22 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 7,0, à 37 C.

- La figure 23 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 7,3, à 37 C.

- La figure 24 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 8,0, à 37 C.

- La figure 25 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN, DMC et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 6,3, à 37 C.

- La figure 26 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués esters
DMN et C2NHS-IgG dans un tampon à l'azide à pH 5,9, à température ambiante et à 4 C.

- La figure 27 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 6,3, à 35 C.

- La figure 28 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et et (2,6-diméthyl-4-nitro)phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate a pH 6,3, à 45 C.

- La figure 29 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2, 6-diméthyl)phénylique et (2,6-diméthyl-4-nitro)phényli- que de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 35 C.

- La figure 30 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative d'esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2,6-diméthyl-4-nitro)phénylique de N-méthyl-acridane dans un tampon au phosphate à pH 8,0, à 45'C.

- La figure 31 est un spectre UV-lumière visible du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

- La figure 32 est un spectre de masse par bombardement atomique rapide du N-méthyl-acridane-9-éthoxy9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

La figure 33 est un spectre RMN des protons à 300 MHZ du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylat de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

- La figure 34 est un spectre RMN des protons à 300 MHz du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle.

- La figure 35 est un graphique d'une analyse d'échantillons de TSH de référence utilisant comme marqueur du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

- La figure 36 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative du DMC et du DME dans un tampon au bicarbonate (0,1M de bicarbonate, 9,6, à 25-C.

- la figure 37 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et DNE-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH (100mM de phosphate, 150mM de NaCl, 0,001% de
Thimerosal, 0,4% de sérum-albumine bovine, 0,1 mg/ml de gamma-globuline murine, 0,1 mg/ml de gamma-globuline de chèvre) à pH 6,0, à 25C.

- La figure 38 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et
DME-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH, à pH 6,0, à 30 C.

- La figure 39 est un graphique représentant les résultats de stabilité comparative de conjugués DMC et
DME-TSH dans un tampon de dilution renfermant un anticorps anti-TSH a pH 6,0, à 35 C; et
- La figure 40 est un spectre RMN des protons à 300 MHz du 1,3-diméthyl-N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9- carboxylate de phényle.

Les groupements chimioluminescents de la présente invention répondent a l'une ou l'autre des deux formules schématiques suivantes

Dans les formules schématiques, la partie "L" encadrée par des pointillés contient la "liaison" ester, thioester ou amide qui est située entre deux noyaux ou systèmes cycliques substitués représentés par le cercle désigné par "Q" et le cadre en traits pleins désigné par "R3". La nature de la liaison L, qu'il s'agisse d'un ester, d'un thioester ou d'un amide, est déterminée par la nature de
R4, représentant respectivement -O-, -S- ou -N(S02CF3). De préférence, la liaison est une liaison ester.

Q est un noyau ou système cyclique hétérocyclique auquel la liaison ester, thioester ou amide L est fixée au niveau d'un atome de carbone a l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique qui (1) est hybridé sp2, sp3 et (2) est sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence. La possibilité de rendre sensible l'atome de carbone à une telle attaque est déterminée par l'état d'oxydation de l'hétéro- atome à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique.Si l'atome de carbone auquel la liaison est fixée est hybridé sp2, l'hétéro-atome doit être à un état positif d'oxydation (ctest-à-dire avoir une charge positive ; par exemple, telle qu'elle est obtenue par une
N-alkylation ou N-oxydation). Si l'atome de carbone auquel est fixée la liaison est hybridé sp3, l'hétéro-atome doit être a l'état neutre d'oxydation (c'est-à-dire dépourvu de charge).Lorsque l'hétéro-atome est l'azote, des états convenables d'oxydation peuvent seulement être atteints si l'atome d'azote est substitué avec un groupe alkyle (y compris un groupe fonctionnalisé), un groupe aryle (y compris un groupe fonctionnalisé), un groupe O- (si l'atome d'azote est à un état positif d'oxydation) ou OH (si l'atome d'azote est à l'état neutre d'oxydation). Lorsque l'hétéro-atome est à ses états "convenable" d'oxydation, l'atome de carbone est sensible à l'attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour produire l'intermédiaire chimioluminescent.

Des noyaux ou systèmes cycliques hétérocycliques dans lesquels l'hétéro-atome est à un état positif d'oxydation comprennent, sans limitation, l'acridinium, le benz (a)acridinium, le benz(b)acridinium, le benz [c) acridi- nium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium. Des noyaux ou systèmes cycliques dans lesquels 1'hétéro-atome est a l'état neutre d'oxydation comprennent les formes réduites des noyaux ou systèmes cycliques précités.Ces noyaux ou systèmes cycliques sont dérivés des noyaux ou systèmes cycliques suivants
Série de l'acridine Série de l'azole

Acridine

Brenz[a]acridine

Benz[b]acridine

Benz[c]acridine

1,2,4-triazole

Isoxazole

Isothiazole

1,2-azole

Imidazole

Benzimidazole
Série de la quinoléine

Quinoléine

Isoquinoléine

Cations quinolinium

Quinoléines à substitution cyclique en C3, C4, C5
Série de la pyridine/pyrimidine Divers

Pyridine

Pyrimidine

Pyridazine

Pirazines

Phénanthridine

Quinoxaline
Le noyau ou système cyclique hétérocylique peut être dépourvu de substituants accessoires, non représentés sur les formules schématiques. En variante, le noyau ou système cyclique hétérocyclique peut être substitué facultativement à n'importe quelle position, y compris sur l'hetero-atome, avec des groupes représentés sur la formule schématique. Ces noyaux et systèmes cycliques, qu'ils soient facultativement substitués ou bien dépourvus de ces substituants accessoires, sont considérés dans la présente invention comme étant désignés par l'expression "noyau ou système cyclique hétérocyclique".

Les substitutions accessoires possibles peuvent être fonctionnelles ou non fonctionnelles. Les substitutions accessoires fonctionnelles comprennent celles destinées à produire des interactions péri autour de la liaison L, accroître la solubilité du groupement, accroître l'efficacité de chimioluminescence du groupement et, de préférence, fixer le groupement à une protéine ou à une autre matière. Des groupes utiles pour la fixation du groupement a une protéine ou une autre matière comprennent, mais à titre non limitatif, des chaînes alkyle, alcényle, alcynyle, alkylamino, oxoalkyle, thioalkyle ou alkyloxocarbonyle (ramifiées ou non ramifiées), facultativement fonctionnalisées, ou des groupes aryle facultativement fonctionnalisées. Les groupes aryle peuvent être reliés aux noyaux ou systèmes cycliques hétérocycliques par une chaîne alkyle, alcényle, alcynyle, alkylamino, oxoalkyle, thioalkyle ou alkyloxocarbonyle. D'autres chaînes, en plus de celles énumérées, sont bien connues dans la pratique.

Des fonctionnalités accessoires comprennent, à titre non limitatif, n'importe laquelle des fonctionnalités suivantes
-CO2R, dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou aryle

dans laquelle R représente un résidu d'un alcool fonctionnel
-S02C1
-NCS

- N(CH3)(CH2)mCl, dans laquelle m est supérieur ou égal à 1
- N3 et d'autres fonctionnalités photolabiles
- NH2, ou des ions, des sucres, des polyamines et des composés polyoxyliques (par exemple polyoxyéthylène, polyoxybutylène, etc.). D'autres chaînes, groupes et fonctionnalités utiles pour la fixation des composés de la présente invention à une protéine sont décrits par Ji dans "Bifunctional Reagents", Meth. Enzymology 91:580 (1983), qui est cité å titre de référence dans le présent mémoire.Des procédés de jonction de ces groupes de fixation à une protéine et à d'autres matières utilisent la liaison covalente et des forces chimiques faibles et sont bien connues dans la pratique.

Les substituants péri, qui peuvent provoquer des interactions péri, comprennent n'importe quel groupe qui peut provoquer un encombrement stérique par rapport à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée et/ou par rapport à l'atome de carbone à l'intérieur de la liaison ester, thioester ou amide. Les substituants péri préférés comprennent des groupes alkyle courts (par exemple méthyle, éthyle) et des groupes aryle (par exemple phényle). Les substituants péri, s'ils sont présents, sont situés sur des atomes de carbone à l'intérieur du noyau ou système cyclique hétérocyclique qui sont "adjacents" à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée. Les groupements peuvent comprendre plus d'un substituant péri.Par exemple, des substituants péri peuvent être placés dans les positions suivantes
(a) dans des acridiniums et acridanes : sur C1
et C8
(b) dans des phénanthridiniums et phénanthridi
niums réduits : sur C7 ; et
(c) dans des quinoliniums et quinoliniums
réduits : sur C3.

Le noyau ou système cyclique aryle, représenté par R3, comprend au moins un noyau hexagonal substitué. La liaison ester, amide ou thioester est directement fixée à ce noyau hexagonal. R3 peut représenter, mais à titre non limitatif, les groupes phényle, naphtalène et anthracène, qui répondent aux formules structurales suivantes

Naphtalène

Anthracènes

Phényle
R3 peut être substitué à n'importe quelle position, y compris, mais à titre non limitatif, aux positions décrites ci-dessous pour Rl, R2 et R2'. Une substitution, y compris
R1, R2 et R2', peut également être utilisée pour fixer le groupement à une protéine ou une autre matière. Des groupes appropriés à cet effet sont décrits ci-dessous.

R2 et R2' sont des groupes volumineux qui sont situés sur R3 de manière à empêcher par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison L entre R3 et le noyau ou système cyclique hétérocyclique Q. De préférence, lorsque R3 est un noyau phényle avec la liaison ester fixée en position 1, R2 et R2' sont situés en positions 2 et 6 (ortho).R2 et R2' peuvent être identiques ou différer l'un de l'autre, l'un ou l'autre pouvant représenter
un groupe alkyle ou un groupe alkyle faculta
tivement fonctionnalisé
un groupe aryle ou un groupe aryle facultative
ment fonctionnalisé
- un groupe OR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe NR2, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe NR3+, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe COO
- un groupe COOH
- un groupe COOR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe COR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe (CF2)nCF3, dans lequel n a une
valeur de 0 à 10
- un groupe CN
- un groupe NH3+
- un groupe NO2
- un groupe N(CH3)3+
- un groupe SR, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe SR2+, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
- un groupe S02R, dans lequel R représente un
groupe alkyle ou aryle
un halogène.

L'encombrement stérique requis peut également être fourni par d'autres noyaux à l'intérieur d'un groupement R3 polycyclique, qui sont "adjacents" au noyau hexagonal auquel la liaison ester est fixée. Par exemple, si R3 représente un groupe naphtalène et si une liaison ester est fixée en position 1, R2 peut être un groupe méthyle en position 2 et R2' est le noyau "adjacent" contenant 7 à 10 atomes de carbone. Dans de tels cas, le noyau adjacent est considéré dans la présente invention comme étant un substituant (sur le noyau hexagonal à l'intérieur de R3) qui bloque par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison.

R1 peut être tout groupe électrophile sur R3, mais est de préférence choisi entre -No2, -SO2Cl, -Br, -N(CH3)3+ et -H. Telle qu'elle est utilisée tout au long de ce mémoire descriptif et des revendications annexées, l'expression "groupe électrophile" désigne tout groupe qui possède une valeur sigmap supérieure ou égale à 0,0. Des tables de valeurs sigmap pour différents groupes peuvent être trouvées dans l'article de Hansch et collaborateurs,
J. Med. Chem. 16(11):1209-1213 (1977) et l'article de
Hansch et Leo, "Substituent Constants for Correlation
Analysis in Chemistry and Biology", ch. 6, pp. 49-52 (John
Wiley & Sons, New York 1979), tous deux étant cités à titre de référence dans le présent mémoire.

Pour certains groupements, R1 et l'un des groupes R2 et R2', ou bien ces deux groupes, sont des groupes électrophiles (qui peuvent être identiques ou différents l'un de l'autre). Si plus d'un groupe parmi R1,
R2 et R2' sont des groupes électrophiles, il est préféré que la valeur sigmap additive pour les seuls groupes qui sont des groupes électrophiles (c'est-à-dire en excluant les groupes ayant des valeurs de sigmap inférieures à 0,0) soit inférieure ou égale à environ 1,0. Certains groupements ayant une valeur sigmap additive supérieure à 1,0 sont instables.

Les groupements de la présente invention peuvent également être fixés à une protéine ou à une autre matière par des substituants sur R3. Certains groupes électrophiles peuvent être utilisés comme moyens de fixation. Parmi les groupes électrophiles appréciés, un groupe 502 Cl peut être utilisé pour fixer un groupement à.

une protéine ou une autre matière. En variante, n'importe lequel des groupes précités pour la fixation au noyau ou système cyclique hétérocyclique Q peut également être utilisé s'il peut être fixé à titre de substituant du groupe R3. Des procédés de jonction de ces groupes de fixation à une protéine et à d'autres matières utilisent à la fois la liaison covalente et des forces chimiques faibles et sont bien connus dans la pratique.

Dans la formule schématique II ci-dessus, Z représente un substituant secondaire fixé à l'atome de carbone auquel la liaison ester, thioester ou amide est fixée lorsque cet atome de carbone est hybridé sp3. Z peut représenter, mais à titre non limitatif
-H
- un halogène
- CN
- OR
- NR2
- NR3+
- SR - SR2+
- S2R
- NRCO2R
- NHNR2
- NRNR2
- NHOR
- ONR2
- CR(CN)2
- CR(COR)2
- CR2N 2
- CsCOR
En général, outre un atome d'hydrogène et un halogène, Z peut représenter n'importe quel groupe nucléophile de formule générale RnX, dans laquelle X représente O, N, S ou C (avec des variations appropriées de n pour tenir compte des variations de valence dans X) et dans laquelle
R représente n'importe quel substituant (de préférence un groupe alkyle, un groupe aryle, un amino-acide ou un sucre, facultativement substitué), plusieurs groupes R pouvant facultativement former des structures cycliques (par exemple dans les groupes Z :

Rn et RnX peuvent également être (ou être dérivés de) un médicament ou une molécule stéroïdienne.

Dans des composés dans lesquels Z représente un groupe de formule RnX, Z sert de groupement de "blocage" qui inhibe ou empêche l'hydrolyse de la liaison ester, thioester ou amide, réduisant ainsi la probabilité d'instabilité de ces composés. L'effet de blocage est provoqué (1) par l'encombrement stérique du groupe RnX qui bloque physiquement l'attaque par des composés chimiques qui induiraient ou augmenteraient l'hydrolyse de la liaison ester, thioester ou amide (par exemple des composés qui formeraient une pseudo-base au niveau du neuvième atome de carbone d'un composé d'acridinium), et (2) par des effets électroniques produits par le passage de l'hybridation sp2 à l'hybridation sp3 de l'atome de carbone (qui rend le comportement de la liaison ester, thioester ou amide plus analogue à celui d'un ester, thioester ou amide aliphati que). Lorsque les composés renfermant un groupe RnX sont amenés à engendrer une chimioluminescence, ils doivent tout d'abord être traités avec un acide qui clive le groupe RnX, permettant ainsi l'induction de la réaction de chimioluminescence par addition d'un peroxyde, d'une base ou d'un autre inducteur (un traitement avec un acide n'est pas requis pour des composés dans lesquels Z représente H ou un halogène).Le caractère et la structure du groupe RnX sont limités par deux facteurs seulement : (1) les dimensions du groupe RnX doivent être telles que le groupe puisse être ajouté à des composés de la présente invention au cours de la synthèse décrite ci-dessous ou bien par d'autres procédés de synthèse (c'est-à-dire que le composé de formule RnXH, duquel dérive le groupe RnX au cours de la synthèse, ne peut être volumineux au point que des effets stériques rendent impossible la synthèse à partir de ce composé d'un composé de la présente invention renfermant un tel groupe RnX), et (2) le groupe RnX doit présenter un caractère stérique et chimique tel qu'il puisse être clivé de la molécule avec un acide avant l'induction de la réaction chimioluminescente.

D'autres groupements de la présente invention répondent à la formule schématique suivante

dans laquelle Q, Z, L et R4 répondent aux définitions précitées et R5 est n'importe quel groupe partant. Outre les groupements dans lesquels R5 représente la somme
R1+R2+R2'+R3 (de la manière décrite précédemment dans la formule schématique II), des groupements appréciés comprennent des groupements dans lesquels R5 représente un noyau ou système cyclique aryle qui est substitué ou non substitué. Ces groupements peuvent également comprendre des substituants péri, de la manière décrite précédemment.Le
N-méthyl-1,3-diméthylacridane-9-méthoxy-9-carboxylate de phényle, qui répond à la formule suivante

est un groupement apprécié qui porte un groupe Z/RnX (CH30- sur C9), porte un substituant péri (CH3- sur C1) et est un ester de phényle non substitué.

D'autres groupements de la présente invention répondent à la formule schématique suivante

dans laquelle S02-R"-Y est un groupe partant, Q, Z, L et R4 répondent aux définitions précitées, R' et R" sont choisis entre des groupes alkyle, alkylène, aryle, alkyle facultativement substitué, alkylène facultativement substitué, aryle facultativement substitué, alkyloxy, aryloxy, halogéno, amino facultativement protégé, aminohydroxy substitué, hydroxy protégé, oxo, thio, imino, mercapto facultativement substitué, un noyau hétérocyclique et un groupe hétéroalkyle, et Y est choisi entre l'hydrogène, un groupe carboxy, un halogénure de carbonyle, un halogénure de sulfonyle, des groupes carboalkyoxy, carboxamido, carboaryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato, sulfo, N-succinimidycarboxy et N-maléimide. Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment.

D'autres groupements encore de la présente invention répondent à la formule schématique suivante :

dans laquelle V-R"' est un groupe partant, Q, Z et L répondent aux définitions précitées, V représente le groupe aliphatique ou aromatique, R"' représente un groupe qui est utile pour la fixation du groupement à -une protéine ou d'autres membres de liaison spécifique (de la manière décrite précédemment). Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment.

D'autres groupements de la présente invention répondent à la formule schématique suivante

dans laquelle Q, Z et L répondent aux définitions précitées, W est un groupe partant et SW représente un groupe sulfonamido ou sulfocarbonyle. Ces groupements peuvent comprendre également des substituants péri, de la manière décrite précédemment.

Les groupements chimioluminescents perfectionnés décrits ci-dessus sont utiles dans une large gamme d'analyses par liaison spécifique destinées à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon. Le terme "présence" désigne dans la présente invention la détection qualitative et/ou quantitative d'un analyte. Ces analyses peuvent s'adresser à n'importe quel analyte qui peut être détecté par l'utilisation du groupement chimioluminescent perfectionné, conjointement avec des réactions de liaison spécifique. Ces analyses comprennent, sans limitation, des immuno-essais, des analyses de liaison de protéines et des analyses d'hybridation d'acides nucléiques.

Dans un immuno-essai classique, l'analyte est immunoréactif et sa présence dans un échantillon peut être déterminée par sa réaction immunologique avec un réactif analytique. Dans une analyse classique de liaison de protéines, la présence d'un analyte dans un échantillon est déterminée par la réactivité de liaison spécifique de l'analyte avec un réactif analytique, cette réactivité étant autre qu'une réactivité immunologique. Des exemples de cette réactivité comprennent la reconnaissance enzymesubstrat et l'affinité de liaison de l'avidine pour la biotine. Dans l'analyse classique d'hybridation d'acides nucléiques, la présence d'un analyte dans un échantillon est déterminée par une réaction d'hybridation de l'analyte avec un réactif analytique.L'acide nucléique représentant l'analyte (présent habituellement sous forme d'ADN ou d'ARN bicaténaire) est habituellement converti tout d'abord en une forme monocaténaire et est immobilisé sur un support (par exemple un papier à base de nitrocellulose). L'acide nucléique servant d'analyte peut en variante être soumis à une électrophorèse dans une matrice de gel. Puis, l'analyte immobilisé peut être hybridé (ctest-à-dire lié spécifiquement) au moyen d'une séquence complémentaire d'acide nucléique.

Les analyses précitées par liaison spécifique peuvent être effectuées suivant des modèles analytiques très divers. Ces modèles analytiques se répartissent en deux catégories principales. Dans la première catégorie, l'analyse utilise un conjugué chimioluminescent qui comprend le groupement chimioluminescent perfectionné fixé à une matière à liaison spécifique. L'expression "matière à liaison spécifique" désigne dans la présente invention n'importe quelle matière qui se lie spécifiquement par une réaction immunologique, une réaction de liaison de protéines, une réaction d'hybridation d'acide nucléique et toute autre réaction dans laquelle la matière réagit spécifiquement avec une classe restreinte de composés biologiques, biochimiques ou chimiques.Dans cette catégorie d'analyses, le conjugué chimioluminescent participe à une réaction de liaison spécifique et la présence d'un analyte dans l'échantillon est proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant le conjugué chimioluminescent. L'analyse est effectuée en laissant les réactions de liaison spécifique requises se produire dans des conditions réactionnelles convenables. La formation de produits de réaction de liaison spécifique contenant le conjugué chimioluminescent est déterminée en mesurant la chimioluminescence de ces produits contenant le conjugué chimioluminescent ou bien en mesurant la chimioluminescence d'un conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi ou ayant partiellement réagi, non présent dans ces produits.

Cette première catégorie de modèles analytiques est illustrée par les analyses en sandwich, les analyses compétitives, les analyses d'antigènes de surface, les analyses par saturations successives, les analyses par déplacements compétitifs et les analyses par extinction.

Dans un modèle en sandwich, la matière à liaison spécifique à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, peut se lier spécifiquement à l'analyte. L'analyse utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent. Le corps réactionnel peut être fixé à une phase solide, comprenant, à titre non limitatif, des bandelettes, des perles, des tubes, des feuilles de papier ou de polymère. Dans de tels cas, la présence de l'analyte dans un échantillon est proportionnelle à la chimioluminescence de la phase solide une fois les réactions de liaison spécifique terminées.Ces modèles analytiques sont décrits plus en détail dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 652 533, N 4 383 031, N 4 380 580 et N 4 226 993, qui sont cités à titre de référence dans le présent mémoire.

Dans un modèle par compétition, l'analyse utilise un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel et à la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. Le corps réactionnel peut être fixé à une phase solide ou bien, en variante, des produits de réaction contenant le corps réactionnel peuvent être précipités au moyen d'un second anticorps ou par d'autres procédés connus. Dans ce modele par compétition, la présence de l'analyte est "proportionnelle", c'est-à-dire inversement proportionnelle, à la chimioluminescence de la phase solide ou du précipité. Une autre description de ce modèle analytique peut être trouvée dans les brevets des Etats
Unis d'Amérique précités.

Dans un autre modèle analytique, l'analyte peut être présent sur, ou être lié à, un composé biologique, biochimique ou chimique plus volumineux. Ce type de modèle est illustré par une analyse d'antigènes de surface. Dans ce modèle, la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte et la présence de l'analyte est proportionnelle au complexe analyte-conjugué chimioluminescent formé à titre de produit de réaction. Cela est illustré. par la fixation du groupement chimioluminescent à un anticorps qui est spécifique d'un antigène de surface présent sur une cellule. La présence de l'antigène de surface cellulaire est indiquée par la chimioluminescence des cellules une fois la réaction terminée.Les cellules proprement dites peuvent être utilisées conjointement avec un système de filtration pour séparer le complexe analyteconjugué chimioluminescent qui est formé sur la surface de la cellule à partir du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Cela est décrit plus en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 652 533.

Le groupement chimioluminescent perfectionné peut être utilisé en plus des modèles analytiques additionnels connus dans la pratique, comprenant, à titre non limitatif, la saturation séquentielle et le déplacement compétitif, deux modèles utilisant un conjugué chimioluminescent, dans lesquels (1) la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement, et (2) l'analyte se lient spécifiquement à un corps réactionnel.

Dans le cas de la saturation séquentielle, on fait réagir tout d'abord l'analyte avec le corps réactionnel, puis on fait réagir le conjugué chimioluminescent avec le corps réactionnel n'ayant pas réagi restant. Dans le cas du déplacement compétitif, le conjugué chimioluminescent déplace de manière compétitive l'analyte qui s'est déjà lié au corps réactionnel.

Dans un modèle par extinction, l'analyse utilise un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, et à la matière à liaison spécifique, à laquelle est fixé le groupement chimioluminescent, pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel. Un groupement d'extinction est fixé au corps réactionnel. Lorsqu'il est amené à proximité immédiate du groupement chimioluminescent, le groupement d'extinction diminue ou éteint la chimioluminescence du groupement chimioluminescent. Dans ce modèle par extinction, la présence de l'analyte est proportionnelle à la chimioluminescence du groupement chimioluminescent.Une description plus détaillée de ce modèle peut être trouvée dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 220 450 et N 4 277 437, qui sont cités à titre de référence dans le présent mémoire.

En ce qui concerne les modèles analytiques décrits ci-dessus et dans les modèles décrits ci-dessous, l'ordre dans lequel les réactifs analytiques sont ajoutés et amenés à réagir peut varier largement, comme cela est bien connu dans la pratique. Par exemple, dans une analyse en sandwich, le corps réactionnel lié à une phase solide peut être amené à réagir avec un analyte présent dans un échantillon et, après cette réaction, la phase solide contenant l'analyte complexé peut être séparée de l'echan- tillon restant. Après cette étape de séparation, le conjugué chimioluminescent peut être amené à réagir avec le compl-exe sur la phase solide. En variante, la phase solide, l'échantillon et le conjugué chimioluminescent peuvent être ajoutés les uns aux autres simultanément et amenés à réagir avant séparation.A titre d'autres variantes, moins appréciées, l'analyte présent dans l'échantillon et le conjugué chimioluminescent peuvent être amenés à réagir avant l'addition du corps réactionnel sur la phase solide.

Des variantes similaires concernant les étapes de mélange et de réaction sont possibles pour des modèles analytiques par compétition, ainsi que pour d'autres modèles connus dans la pratique. L'expression "permettre dans des conditions convenables une formation notable" de produits de réaction de liaison spécifique désigne dans le présent mémoire les nombreuses variantes différentes concernant l'ordre d'addition et de réaction des réactifs analytiques.

Dans la deuxième catégorie de modèles analytiques, l'analyse utilise un groupement chimioluminescent perfectionné non conjugué. La présence de l'analyte dans l'échantillon est proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique qui ne contiennent pas eux-mêmes le groupement chimioluminescent.

Au lieu de cela, le groupement chimioluminescent entre en chimioluminescence proportionnellement à la formation de ces produits de réaction.

Dans un exemple de cette deuxième catégorie de modèles, l'analyse utilise un corps réactionnel capable de se lier å l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel qui provoque l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent. Cela est illustré par une analyse enzyme-substrat simple dans laquelle l'analyte est le glucose, servant de substrat, et le corps réactionnel est l'enzyme appelé glucose-oxydase. La formation du complexe enzyme-substrat active le groupement chimioluminescent. Cette analyse enzyme-substrat pour le glucose est décrite dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 3 964 870 et Ne 4 427 770, tous deux cités à titre de référence dans le présent mémoire.Cette analyse enzymesubstrat est une analyse par liaison spécifique en ce sens que le substrat se lie spécifiquement au site actif de l'enzyme pratiquement de la même manière qu'un antigène se lie à un anticorps. Dans cette analyse, l'enzyme se lie spécifiquement au substrat, ayant pour résultat la production d'un peroxyde qui, à son tour, provoque l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent.

Les analyses faisant également partie de la deuxième catégorie d'analyses sont celles dans lesquelles la formation des produits de réaction active ou inhibe l'entrée en chimioluminescence du groupement chimioluminescent d'une manière moins directe. Dans cette analyse, un premier corps réactionnel, qui présente une réaction croisée avec l'analyte, est fixé à un enzyme, tel que la glucose-oxydase, à proximité de son site actif. Un second corps réactionnel qui est spécifique de l'analyte et de la matière immunoréactive est ajouté à l'échantillon et l'enzyme modifié en présence du substrat (å savoir le glucose).Lorsque le second corps réactionnel se lie au premier corps réactionnel situé à proximité du site actif sur l'enzyme, le second corps réactionnel bloque le site actif de manière que le substrat ne puisse se lier a l'enzyme au niveau du site actif ou que la liaison du substrat au niveau du site actif soit notablement réduite.

Le second corps réactionnel bloquant l'enzyme de cette manière inhibe la production d'un peroxyde par l'enzyme qui aurait, à son tour, activé le groupement chimioluminescent.

Cependant, l'analyte présent dans l'ëchantillon fixe le second corps réactionnel, empêchant ainsi le second corps réactionnel d'inhiber la production de peroxyde. La présence de l'analyte est proportionnelle à la chimioluminescence du groupement.

Les analyses placées dans les deux catégories précitées de modèles analytiques peuvent être hétérogènes ou homogènes. Dans des analyses hétérogènes, les produits de réaction, dont la formation est proportionnelle à la présence d'analyte dans l'échantillon, sont séparés des autres produits de la réaction. La séparation peut être effectuée par n'importe quel moyen, comprenant, à titre non limitatif, la séparation d'une phase liquide d'une phase solide par filtration, microfiltration, double précipitation d'anticorps, centrifugation, chromatographie d'exclusion dimensionnelle, enlèvement d'une phase solide (par exemple une bandelette) d'une solution d'échantillon, ou électrophorèse. Par exemple, dans une analyse en sandwich, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi.

Dans une analyse d'antigènes de surface, le complexe analyte-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Dans une analyse par comp4tition, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. Dans une analyse par saturation séquentielle et dans une analyse par déplacement compétitif, le complexe corps réactionnel-conjugué chimioluminescent est séparé du conjugué chimioluminescent n'ayant pas réagi. En variante dans des analyses homogènes, les produits de réaction ne sont pas séparés.Après avoir laissé réagir les réactifs analytiques, il est possible de mesurer la chimioluminescence dans le mélange analytique total, que ce mélange soit en solution, sur une phase solide ou bien réparti entre différentes membranes constituant les couches d'une bandelette ou d'un autre support solide. L'analyse du glucose au moyen de glucoseoxydase et d'un groupement chimioluminescent représente une analyse homogène simple dans laquelle une séparation est inutile. L'analyse par extinction illustre une analyse homogène plus complexe dans laquelle une séparation est inutile. Il est envisagé que l'une ou l'autre catégorie de modèles analytiques puisse donner lieu à des modèles hétérogènes ou homogènes.

Enfin, l'expression "mesurer la chimioluminescence" désigne, lorsque cela est pertinent, l'acte consistant à séparer les produits de reaction de liaison spécifique, dont la formation est proportionnelle à la presence d'analyte dans l'échantillon, des autres produits de réaction. Elle désigne également, lorsque cela est pertinent, les actes consistant (l) à traiter le groupement chimioluminescent avec un acide pour séparer un groupe Z (à savoir RnX) du groupement et/ou (2) à induire la chimioluminescence du groupement chimioluminescent dans le cas des modèles analytiques dans lesquels la formation des produits de réaction n'active pas elle-même le groupement chimioluminescent.

SYNTHESE DES GROUPEMEMTS
Les exemples suivants illustrent la synthèse de certains groupements chimioluminescents de la présente invention.

Exemple 1
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate (ou d'autres ions complémentaires tels que les ions chlorure, trifluoracétate, sulfate, etc.), de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

Le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

VOIR PAGE SUIVANTE

La condensation de l'isatine (1) avec le résorcinol (2) donne l'acide 3-hydroxyacridine-9-carboxylique (3). La réaction avec le 4-bromobutyrate de benzyle donne l'ester (4) avec le groupe 3-hydroxy éthérifié.L'hydrolyse au moyen d'une base élimine les deux groupes benzyle, ayant pour résultat l'acide dicarboxylique (5). La rebenzylation sélective dé la fonction carboxylique du groupe propyloxy donne l'acide 9-carboxylique (6). L'estérification avec le 2,6-diméthyl-4-nitrophénol et la méthylation de l'azote de l'acridine donne le composé (8). L'élimination de la protection du groupe carboxyle avec HBr et la condensation avec le N-hydroxysuccinimide au moyen de DCC donne le fluorosulfonate de 5- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.

Du chlorure de 4-bromobutyryle (13,8 g, 75 mmoles) a été introduit dans un ballon à fond rond de 100 ml. Le ballon a été refroidi à -20 C au moyen d'un bain de neige carbonique/tétrachlorure de carbone. De l'acétate d'éthyle (50 ml) contenant de la N-méthylmorpholine (7,58 g, 75 mmoles, 8,2 ml) a été ajouté avec soin. Au moyen d'une ampoule à robinet, de l'alcool benzylique (6,97 g, 6,67 ml, 6,64 mmoles) a été ajouté goutte à goutte. Après l'addition, le bain a été enlevé et le mélange a été agité pendant 2 heures. Le produit a été transféré dans une ampoule à décanter en utilisant de l'acétate d'éthyle (50 ml), a été lavé une fois avec du bicarbonate de sodium (10 %), puis à deux reprises avec de l'eau et a été déshydraté avec du sulfate de sodium anhydre.L'évaporation des solvants a donné du 4-bromobutyrate de benzyle sous forme d'une huile (rendement = 91 %).

De l'isatine (1) (1,88 g) a été ajoutée lentement à une solution d'hydroxyde de potassium (5,07 g, 0,09 mole) dissoute dans de l'eau (3,5 ml). Le réacteur a été chauffé à environ 50 C dans un bain d'huile. Une quantité supplémentaire d'environ 10 ml d'eau a été ajoutée goutte à goutte. Du résorcinol (2) (10 g, 0,089 mole) a été ajouté et la température a été portée à 100C tout en poursuivant l'agitation, ayant pour résultat la formation d'un mélange fondu. Une quantité supplémentaire d'isatine (1) (1,88 g) a été ajoutée. Le réacteur (ballon à fond rond et à 3 cols) a été relié à un dispositif d'admission d'azote et la vapeur d'eau a été éliminée par balayage avec le courant d'azote. Le mélange a été agité pendant 4 heures à 125'C.De l'eau (70 ml) a été ajoutée et le contenu a été dissous par agitation continue. Après transfert du mélange dans un ERLENMEYER, le volume a été porté à 200 ml avec de l'eau. Le pH a été ajusté à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. La filtration et le lavage des substances solides avec de l'eau ont donné l'acide acridine-carboxylique brut. Puis celui-ci a été dissous dans NaOH 2N (100 ml) et la solution a été filtrée à travers de la Celite. Le culot de Celite a été lavé avec 200 ml de NaOH 1N. Le filtrat a été acidifié au moyen de
HCl concentré à pH 2,0. Le précipité d'acide 2-bydroxy- acridine-9-carboxylique (3) a été filtré, lavé avec de l'eau et déshydraté sous vide sur P205 (rendement = 42 %).

L'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (3) (4 g, 0,017 mole), du 4-bromobutyrate de benzyle (14,6 g, 0,057 mole) et du carbonate de césium (22,16 g, 0,068 mole) ont été dissous dans du DMSO (125 ml) dans un ballon à fond rond de 250 ml. Le ballon a été chauffé à environ 50C dans un bain d'huile. Après agitation du mélange à cette température pendant 1 heure, le mélange a été versé dans de l'éau (1 litre). Le produit précipité a été soumis à une extraction avec du chloroforme après avoir rendu basique ia suspension aqueuse au moyen de bicarbonate de sodium.La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné le -3-(3-benzyloxyzarbonyl)propyloxy-9-(3-benzylOxyzarbonyl- propyl) -acridine-carboxylate (4) qui a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant du chloroforme comme solvant. Les fractions ayant un Rf égal à 0,36 par CCX avec un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 9/1 ont été rassemblées. Les solvants ont été évaporés (rendement = 55 %).

Le 3-(3-benzyloxycarbonyl)propyloxy-9-(3 benzyloxycarbonylpropyl) -acridine-carboxylate (4) (4,93 g, 8,3 mmoles) a été ajouté à un mélange de NaOH 2N (300 ml) et de méthanol (300 ml). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 48 heures. Le méthanol a été éliminé sur un évaporateur rotatif et la solution a été acidifiée au moyen d'acide chlorhydrique concentré à pH 6,0. Les substances solides précipitées ont été filtrées, lavées à l'eau et dissoutes dans l'acétate d'éthyle. La solution a été déshydratée, puis les solvants ont été évaporés, donnant de l'acide 3-(3-carboxy)propyloxyacridine-9-carboxylique (5) (rendement = 92,8 %).

L'acide 3-(3-carboxy)propyloxy-acridine-9carboxylique (5) (1,5 g, 4,6 mmoles) a été dissous à chaud dans de la DMAP (80 ml, 1,3-diméthyl-3, 4,5,6-tétrahydro- 2('IH)-pyrimidone). De l'alcool benzylique (0,5 ml, 0,52 g, 4,8 mmoles), du 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1,04 g, 5,Q mmoles) et de la N,N-diméthylaminopyridine (0,2 g, 1,6 mmole) ont été ajoutés au mélange réactionnel qui a été préalablement refroidi dans un bain de neige carbonique/CCl4. Le mélange a été agité pendant 15 heures au moyen d'un dispositif d'admission d'azote à température ambiante. Le mélange a été ajouté à une solution de chlorure de sodium saturée (320 ml). L'acide 3-(3-benzyl oxycarbonyl) propyloxy-acridine-9-carboxylique (6) a été filtré et a été lavé avec une petite quantité d'eau. Le produit a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHCl3/MeOH dans le rapport 95/5 (rendement = 26 %).

L'acide 3-(3-benzyloxycarbonyl)propyloxyacridine-9-carboxylique (6) (0,5 g, 1,2 mmole) et du chlorure de para-toluenesulfonyle (0,46 g, 2,4 mmoles) ont été dissous dans de la pyridine (20 ml). La solution a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CCl4 pendant 15 minutes. Du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (0,2 g, 1,2 mmole) a été ajouté, le bain de refroidissement a été enlevé et le mélange a été agité pendant 15 heures à température ambiante. Celui-ci a été ajouté à de l'eau (450 ml) et le pH a été ajusté à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. Le produit a été filtré, lavé à l'eau et déshydraté sous vide. Le produit brut a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant du chloroforme comme solvant.Les fractions ayant un Rf égal à 0,8 par CCM au moyen d'un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 1:1 ont été rassemblées. L'évaporation du solvant a donné du 3-(3-benzyloxycarbonyl)pr0pyloxy- acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (7) (rendement = 47 %).

L'acridine (7) (0,32 g, 0,56 mmole) a été dissoute dans du chlorure de méthylène anhydre (4 ml) et du fluorosulfate de méthyle (0,27 ml, 3,36 mmoles, 6 équivalents molaires) a été ajouté. Le mélange a été agité pendant 15 heures à température ambiante. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté. Le fluorosulfonate de 3-(3 benzyloxycarbonyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (8) a été filtré et lavé à l'éther (50 mil). Le rendement était quantitatif.

L'ester d'acridinium protégé par un groupe benzyle (8) (250 ng) a été traité avec un mélange HBr 30 %/acide acétique (3 ml) pendant 2 heures à 55 C. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté pour précipiter le produit. La filtration et le lavage des substances solides avec de l'éther ont donné du fluorosulfonate de 3-(3 carboxyl) propyloxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthyl-4-nitro)phényle (9). La cristallisation dans I'acétonitrile a donné le composé pur (rendement = 80 %).

L'acridinium débarrassé de sa protection (9) (67 mg, 0,13 mmole), dans un ballon à fond rond et à 2 cols de 50 ml, a été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (10 ml). Du dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 33 mg, 0,16 mmole) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 45 minutes à température ambiante. Du N-hydroxysuccinimide (17 mg, 0,15 mmole) a été ajouté et la réaction a été poursuivie pendant 2,5 heures. Une quantité supplémentaire de DCC (14 mg) et de N-hydroxysuccinimide (8 mg) a été ajoutée et les mêmes quantités ont été ajoutées à nouveau au bout de 1,5 heure. 1,5 heure après la dernière addition, de l'acide acétique cristallisable (1,7 litre) a été ajouté pour désactiver le DCC en excès. Le solvant a été éliminé sous vide.

Le produit brut a été purifié sur une colonne de CLHP semi-prêparative Dynamax C18 (disponible dans le commerce auprès de Rainin Instrument Co., Inc. Woburn,
Massachusetts) en utilisant un mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60/40, comme phase mobile à un débit de 1,8 ml/min en utilisant pour la détection la longueur d'onde de 360 nm. La fraction au temps de rétention égale à 9,4 minutes a été recueillie et les solvants ont été éliminés sous vide. Le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl ) propyloxy-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (10) a été déshydraté sous vide dans un dessiccateur contenant de l'anhydride phosphorique (rendement = 33 %). SM : FAB, matrice de thioglycérol, 586 (M+).CLHP : Dynamax C18
Rainin (10 mm x 25 mm), mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60:40, débit 1,8 ml/min, temps de rétention 9,4 minutes, détecté à 360 nm.

Exemple 2
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle qui répond à la formule suivante

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle est synthétisé conformément au schéma. suivant

L'estérification de l'acide acridine-9-carboxylique . (11) avec le 2,6-diméthoxyphénol (12) par l'intermédiaire du chlorure d'acide donne l'ester (13). La méthylation de l'azote de 1'acridine avec le fluorosulfate de méthyle et la chlorosulfonation ultérieure avec l'acide chlorosulfonique donnent le marqueur (15). Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.

De. l'acide acridine-9-carboxylique (11) (6,10 g, 0,027 mole) dans un ballon à fond de 250 ml a été mélangé à du chlorure de thionyle (130 ml) et le mélange a été chauffé au reflux pendant 2 heures sous agitation. Le chlorure de thionyle en excès a été éliminé dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été traité avec du benzène (75 ml) et le solvant a été évaporé sous vide pour éliminer les traces de chlorure de thionyle. Le résidu de chlorure d'acridine-9-carbonyle (11) a été mélangé à de la pyridine (130 ml) et du 2,6-diméthoxyphénol (12) (4,16 g, 0,027 mole) a été ajouté. Le mélange a été chauffé en utilisant un bain d'eau (environ 60çC) pour dissoudre la totalité des substances solides. Après 15 heures d'agitation à température ambiante, le mélange a été versé dans 1 litre d'eau. La suspension a été acidifiée avec de l'acide chlorhydrique concentré à pH 2,0. Le produit solide a été filtré, lavé à l'eau et dissous dans le chloroforme.

La déshydratation (sulfate de sodium anhydre) et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (13). Celui-ci a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport 98:2. Les fractions ayant un Rf égal à 0,19 par CCM au moyen du même solvant ont été rassemblées et l'évaporation des solvants a donné l'ester pur (13) (rendement = 30 %).

De l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (13) (2,01 g, 5,6 mmoles) a été dissous dans du dichlorométhane (110 ml, anhydre) dans un ballon à fond rond de 250 ml. Du fluorosulfate de méthyle (4,60 ml, 6,48 g, 56 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'éther anhydre (100 ml) a été ajouté et les substances solides précipitées de couleur jaune brillant ont été filtrées après agitation de la suspension pendant 0,5 heure. La substance solide a été lavée soigneusement avec de l'éther (environ 100 ml), puis avec du pentane (50 ml). L'acridinium a été recristallisé dans l'acétonitrile, donnant du fluorosulfonate d' acridinium-9-carboxylate de 2,6-diméthoxyphényle (14) (rendement = 81 %).

Dans un ballon sec à fond rond et à deux cols de 25 ml, on a introduit le fluorosulfonate de lo-méthyl- acridinium-9-carboxylate de (2 , 6-diméthoxy) phényle (14) (101,7 mg, 0,215 mole), un barreau magnétique d'agitation et du CH2C12 (5 ml). La suspension a été agitée et refroidie à -20C dans un bain de CC14/neige carbonique. De l'acide chlorosulfonique (72 1, 0,125 g, 1,07 mmole) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie à -20'C pendant 30 minutes. Puis on a laissé le mélange réactionnel se réchauffer lentement à température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures.De l'éther anhydre (5 ml) a été introduit dans le réacteur, provoquant la formation d'un précipité de couleur jaune clair. Celuici a été filtré et lavé soigneusement à l'éther. La déshydratation sous vide a donné le fluorosulfonate d'acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (15) (rendement = 93,4 %). SM : FAB, matrice de dithiothréitol/dithioérythritol, 472 (M+).

Exemple 3
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle qui répond à la formule suivante

Du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétise par le même procédé d'estérification que le fluorosulfonate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle, le phénol substitué utilisé dans la synthèse du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle étant remplacé par le 2,6-diméthyl-4-bromophénol.

Exemple 4
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle qui répond à la formule suivante

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-3-chlorosuîfonyl) phényle a été synthétisé par le même procédé que le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle, le 2,6-diméthoxyphénol étant remplacé par le 2,6-diméthylphénol dans l'étape d'estérification.

Exemple 5
Un autre groupement de la présente invention est le 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propionyloxy-9, 10- dihydro-N-méthyl-acridane-9-carboxylate de (2,6-diméthyl4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

Le 3- (3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9, 10-dihydro-N- méthyl-acridane-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle a été synthétisé à partir de l'acide dérivé de l'acridinium (9). La réduction de l'acide (9) avec le cyanoborohydrure de sodium donne l'acridane qui est ensuite transformé en l'ester de NHS par le procédé utilisant un anhydride mixte. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.

L'acide dérivé de l'acridinium (9) (210 mg, 0,37 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1M, à pH 5,2 (60 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (190 mg) dans l'acétonitrile (5 ml) a été ajoutée goutte à goutte à la solution d'acridinium. Cela a eu pour résultat la disparition de la couleur jaune de la solution.

L'agitation a été poursuivie pendant 15 minutes. De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solutions ont été éliminées dans un évaporateur rotatif. Le résidu, sous forme d'une suspension dans l'eau, a été soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. La phase organique a été lavée a l'eau et déshydratée. L'élimination des solvants a donné du 3-(3-carboxy)propyloxy-9,10-dihydro-acridane-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (rendement = 90 %).

L'acide dérivé de l'acridane (125 mg, 0,255 mmole) et de la N-méthylmorpholine (28 1) ont été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (15 ml). Le mélange a été refroidi dans un bain de CCl4/neige carbonique, sous atmosphère d'azote. Du chloroformiate d'isobutyle (35 1) a été ajouté, le mélange a été agité pendant 3 minutes et du
N-hydroxysuccinimide (35 mg), dissous dans l'acétonitrile (2 ml), a été ajouté. Après agitation à -20 C pendant 15 minutes, on a enlevé le bain de CCl4/neige carbonique et on a laissé le mélange réactionnel se réchauffer à température ambiante. Au bout de 2 heures, les solvants ont été évaporés et le résidu soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. Le chlorhydrate de N-méthylmorpholine insoluble a été éliminé par filtration. Le filtrat a été concentré et de l'hexane (20 ml) a été ajouté. Le refroidissement a pour résultat la cristallisation de 3-(3succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-9,10-dihydro-N-méthylacridane-9-carboxylate de. (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényle'.

Les cristaux ont été finalement filtrés et lavés à l'hexane (rendement = 70 %). SM : FAB, matrice de dithiothréitol/dithioérythritol, 588 (M+ +1), CLHP : Novapak C18 Waters (3,9 mm x 15 mm) (disponible dans le commerce auprès de Millipore Corporation, Waters Chromatography Division,
Milford, Xassachusetts), mélange CH3CN/H2O (0,1 % d'acide trifluoracétique) dans le rapport 60:40, débit 1,0 ml/min, temps de rétention 6,34 minutes, détecté à 280 nm.

Exemple 6
Un autre groupement de la présente invention est le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4nitro)phényle, qui répond à la formule suivante

Le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

La réaction de 1'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (16) avec le 4-bromobutyronitrile donne un ester (17).

L'hydrolyse de l'ester et la réestérification avec le 2,6diméthyl-4-nitrophénol donne le composé (19). La méthylation avec le fluorosulfate de méthyle et la transformation du groupe cyano en l'imidate au moyen d'acide chlorhydrique gazeux et de méthanol donne le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (21). Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.

De 1 'acide 3-hydroxy-9-acridine-carboxylique (16) (2 g, 8,4 mmoles), du 4-bromobutyronitrile (5,87 ml, 8,74 g, 34 mmoles) et du carbonate de césium (11,08 g, 34 mmoles) ont été dissous dans du DMSO anhydre (50 ml) dans un ballon à fond rond de 100 ml. Le mélange a été chauffé à environ 50ec dans un bain d'eau, sous agitation.

Au bout de 3 heures, le mélange a été versé dans de l'eau (600 ml). Les substances solides ont été filtrées et ont été dissoutes dans le chloroforme. La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné l'ester (3-cyano)propylique de l'acide 3-(3-cyano)propoxy-acridine-9carboxylique (17). Puis celui-ci a été dissous dans le toluène (50 ml) et du cyclohexane (150 ml) a été ajouté. Le produit pur (17) s'est séparé, puis a été filtré et déshydraté. Le produit déshydraté a été purifié par chromatographie sur couche mince en utilisant de l'acétate d'éthyle comme phase mobile (Rf = 0,58) (rendement = 78,6 %).

L'ester cyanopropylique (17) (3,73 g, 10 nimolès) a été dissous dans un mélange de NaOH 0,5N (90 ml) et de méthanol (90 ml) et a été agité dans un bain d'eau 6a-c en utilisant un condenseur à reflux pendant 2,5 heures. Le méthanol a été éliminé dans un évaporateur rotatif et le produit a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle après acidification de la phase aqueuse au moyen d'acide chlorhydrique concentré. La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné l'acide 3-(3 cyano) propoxy-acridine-9-carboxylique (18) (rendement = 80 %).

L'acide carboxylique (18) (4,62 g, 15 mmoles) a été dissous dans de la pyridine (130 ml) et la solution a été refroidie dans un bain CC14/neige carbonique. Du chlorure de para-toluenesulfonyle (5,8 g, 30 mmoles) a été ajouté et le bain a été enlevé. Après 15 minutes d'agitation à température ambiante, du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (2,8 g, 16,8 mmoles) a été ajouté. Au bout de 18 heures à température ambiante, de l'eau (10 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide.Le résidu a été dissous dans du chloroforme (200 ml) et la phase organique a été lavée avec une solution de bicarbonate de sodium saturée (2 x 100 ml), de l'eau (2 x 100 ml), HC1 1N (1 x 100 ml) et, finalement, avec de l'eau (2 x 100 ml). La déshydratation et l'évaporation du solvant ont donné du 3 (3-cyano)propoxy-acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle (19) qui a été chromatographié dans une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange acétate d'éthyle/hexane (7:3) (rendement = 74,5 %).

L'ester (19) (1,6 g, 3,52 mmoles) a été dissous dans du chlorure de méthylène anhydre (50 ml) et, sous atmosphère d'azote, du fluorosulfate de méthyle (1,6 ml, 17,6 mmoles) a été ajouté. La solution a été agitée à température ambiante pendant 20 heures. De l'éther anhydre (100 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate de 3-(3cyano) propoxy-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle (20) a été filtré, lavé à l'éther et déshydraté sous vide (rendement = 84,7 %).

L'ester d'acridinium (20) (4 mg, 7,4 x 10-3 mmoles) 'a été dissous dans du méthanol (0,5 ml) dans un ballon à 2 cols de 5 ml. On a fait barboter soigneuse- ment de l'acide chlorhydrique gazeux anhydre pendant 10 minutes. De l'éther anhydre (3 ml) a été ajouté. Le chlorhydrate de chlorure de 3-oxo-butyrimidate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (21) a été séparé et lavé à l'éther. La substance solide a été déshydratée sous vide et a été entreposée dans un dessiccateur contenant de l'anhydride phosphorique.

ExemDle 7
Un autre groupement de la présente invention est le fluorosulfonate de N-méthylphénanthridinium-6- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond à la formule suivante

Le fluorosulfonate de N-méthylphénanthridinium-6carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

Du 2-aminobiphényle (16,9 g, 0,1 mole) a été dissous dans de la pyridine anhydre (30 ml) et de l'anhydride acétique (lu,5 ml, 0,11 mole) a été ajouté. La solution a été agitée brièvement par secousses, a été refroidie à température ambiante et laissée au repos pendant 15 heures.Après l'addition d'eau (50 ml), le Nacétyl-2-aminobiphényle (22) a été séparé par filtration et recristallisé dans une solution aqueuse d'éthanol, donnant 19,6 g d'aiguilles de couleur blanche (rendement = 93 %).

Le N-acétyl-2-aminobiphényle (22) (19 g, 0,09 mole) a été chauffé doucement au reflux avec du chlorure de phophoryle fraîchement distillé (45 ml, 0,49 mole) pendant 80 minutes. Puis la solution a été refroidie dans de la glace et le précipité (chlorhydrate de 6-méthylphénanthridine) a été séparé par filtration, dissous dans l'eau et rendu alcalin au moyen d'ammoniaque.

Puis lNa solution a été soumise à une extraction avec de l'éther (4 x 75 ml). L'extrait a été déshydraté sur du sulfate de sodium et l'éther a été éliminé sous vide.

L'huile de couleur jaune résultante a été dissoute dans du cyclohexane bouillant (400 ml) et, par refroidissement, a donné des aiguilles blanches de 6-méthylphénanthridine (23) (rendement = 63 %).

La 6-(2-hydroxy-l-hydroxyméthyléthyl)phénanthridine (24) a été préparée en traitant la 6méthylphénanthridine (23) avec du formaldéhyde suivant le procédé de Morgan et Walls, J. Chem. Soc. 34:2447 (1931), qui est cité à titre de référence dans le présent mémoire. Des aiguilles blanches de 6-(2-hydroxy-1hydroxyméthyléthyl)-phénanthridine (24) se sont formées (rendement = 57%)..

Un mélange de 6- (2-hydroxy-l-hydroxyméthyl) - phénanthridine (24) (6 g, 31 mmoles) et de dioxyde de sélénium finement pulvérisé (3,8 g, 34 mmoles) a été chauffé au reflux dans l'acétate d'éthyle (125 ml) pendant 10 heures. Puis la solution de couleur rouge fonce a. été filtrée à chaud à travers de la Celite, avant évaporation à siccité. La substance solide résultante a été digérée dans de l'acide chlorhydrique 1M chaud (125 ml), a été filtrée et partiellement neutralisée avec du bicarbonate de sodium.

Le précipité initial de couleur rouge a été éliminé par filtration avant neutralisation totale de la solution. La substance solide résultante de couleur jaune pâle a été séparée par filtration et recristallisée dans un mélange acétone/éther de pétrole, donnant 2,7 g de 6-formylphénanthridine (rendement = 42%).

La 6-carboxyphénanthridine (25) a été préparée par oxydation à l'acide chromique de la 6-formylphénanthridine suivant le procédé de Morgan et Walls, J. Chem. Soc.

34:2447 (1931) qui est cité à titre de référence dans le présent mémoire. Une poudre blanche du produit (25) s'est formée (rendement égal = 60%).

De la 6-carboxyphénanthridine (25) (662 mg, 3 mmoles) a été dissoute dans de la pyridine anhydre (14 ml) et refroidie à 0C. Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,15 g, 6 mmoles) a été ajouté, suivi par du 2,6-diméthyl4-nitrophénol (501 mg, 3 mmoles) et le mélange a été laissé au repos pendant une nuit à 4'C. La solution résultante de couleur brune a été agitée dans un mélange de glace et d'eau. Le précipité a été séparé par filtration et a été chromatographié sur du gel de silice en utilisant un mélange chloroforme/hexane (1:1) pour obtenir du phénanthridine-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (26) (rendement 60%).

L'ester (26) (369 mg, 1 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml) dans un ballon sec à fond rond à deux cols de 25 ml. La suspension a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CC14, sous atmosphère d'azote. De l'acide chlorosulfoné (342 1, 6 mmoles) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie å -20-C pendant 30 minutes. Puis on a laissé le mélange se réchauffer lentement à température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures.

De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté et les substances solides précipitées ont été filtrées et lavées à l'éther.

La déshydratation a donné du fluorosulfonate de N-méthyl phénanthridinium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (27) (rendement = 90%).

Exe=Dle 8
Un autre groupement de la présente invention est le fluorosulfonate de 5,6-dihydro-N-méthylphénanthridi- nium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle qui répond a la formule suivante

Le fluorosulfonate de 5,6-dihydro-N-méthylphénanthridinium-6-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle est synthétisé à partir de l'analogue de phénanthridinium non réduit (27). Le phénanthridinium (27) (398 mg, 0,8 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1 M, à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (410 mg) dans l'acétonitrile (10 ml) a été ajoutée goutte à goutte à la solution de phénanthridinium.Cela a eu pour résultat la disparition de la couleur jaune de la solution. L'agitation a été poursuivie pendant 15 minutes.

De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau et soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique a été lavée et déshydratée. L'élimination des solvants a donné du fluorosulfonate de 5, 6-dihydro-N-méthyîphénanthridinium-6- carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro)phényle (rendement = 90%).

Exemple 9
Un autre groupement dans la présente invention est le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonylphényle), qui répond à la formule suivante

le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4- carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonylphényle) est synthétisé conformément au schéma suivant

De l'acétophénone (29) (120 g, 1 mole) et de l'isatine (30) (147 g, 1 mole) ont été chauffées au reflux pendant 10 heures dans de l'eau et de méthanol, avec de l'hydroxyde de potassium (17 g). L'acide 2-phényl-quinoléine-4-carboxylique (31) a été séparé de méthanol sous forme d'aiguilles de couleur blanche (rendement 84%).

L'acide 2-phényl-quinoléine-carboxylique (31) (735 mg, 3 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml) et refroidi dans un bain d'eau et de glace. Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,15 g, 6 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 15 minutes.

Du 2,6-diméthoxyphénol (462 mg, 3 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. La solution a été versée dans un mélange d'eau et de glace (300 ml) et le 2-phényl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (32) a été filtré. Les substances solides ont été déshydratées et purifiées sur une colonne de gel de silice en utilisant un mélange chloroforme/hexane (1:1) (rendement = 50%).

L'ester (32) (381 g, 1 mmole) a été dissous dans du chlorure de méthylène anhydre (3 ml) et du fluorosulfate de méthyle (492 1, 0,69 g, 6 mmoles) a été ajouté. Après 15 heures d'agitation a température ambiante sous atmosphère d'azote, de l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté. Le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinoléine- 4-carboxylate de (2,6-diméthoxy)phényle (33) a été filtré, lavé à l'éther et déshydraté (rendement = 95%).

L'ester (33) (200 mg, 0,4 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml), dans un ballon sec à fond rond et à deux cols de 25 ml. La suspension a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CCl4, sous atmosphere d'azote. De l'acide chlorosulfonique (144 1, 2 mmoles) a été ajouté et l'agitation a été poursuivie à -20iC pendant 0,5 heure. Puis on a laissé le mélange. se réchauffer lentement a température ambiante et on l'a agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures. De l'éther anhydre (20 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate de 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (34) a été filtré, lavé å l'éther et déshydraté (rende ment.= 90%).

Exemple 10
Un autre groupement de la présente invention est le 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle qui répond à la formule suivante

Le 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétisé à partir du 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4- carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-bromo) phényle par réduction avec du cyanoborohydrure de sodium. Le quinolinium non réduit a été obtenu par le même mode opératoire que le groupement (2, 6-diméthyl-4-bromo) phénylacridinium décrit ci-dessus, 1'acridine étant remplacée par la quinoléine.

L'ester de quinolinium (500 mg, 0,9 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate 0,1M à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (56 mg, 0,9 mmole) dans un mélange d'acétonitrile/tampon (10 ml) a été ajoutée. Après agitation pendant 2 minutes, le mélange a été acidifié à pH 2,0 et de ltacétonitrile (100 ml) a été ajouté. Les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau.et a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle.La déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné du 2-phényl-1,4-dihydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromopphényle (rendement = 70%).

Exemr > le 11
Un autre groupement de la présente invention est le 2-phényl-1,2,3,4-tétrahydro-N-méthyl-quinoléine-4- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle, qui répond à la formule

Le 2-phényl-1,2,3,4-tétrahyro-N-méthyl- quinoléine-4-carbqxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle a été synthétisé à partir du 2-phényl-N-méthyl-quinolinium-4carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle par réduction avec le cyanoborohydrure de sodium. Le quinolinium non réduit a été obtenu par le même mode -opératoire que le composé de (2,6-diméthyl-4-bromo)phénylacridinium décrit ci-dessus, l'acridine étant remplacée par la quinoléine.

L'ester de quinolinium (500 mg, 0,9 mmole) a été dissous dans un mélange dans le rapport 1:1 d'acétonitrile et de tampon au phosphate (0,lM à pH 5,2 (80 ml). Une solution de cyanoborohydrure de sodium (560 mg, 9,0 mmoles) dans un mélange acétonitrile/tampon (20 ml) a été ajoutée;
Après agitation pendant 30 minutes, le mélange a été acidifié à pH 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1N et a été agité pendant un temps supplémentaire de 5 minutes. De l'acétonitrile (100 ml) a été ajouté et les solvants ont été éliminés dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été mis en suspension dans l'eau et a été soumis å une extraction avec de l'acétate d'éthyle.La déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné du 2-phényl 1,2,3, 4-tétrahydro-N-méthyl-quinoléine-4-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-bromo)phényle (rendement = 80%).

Exemple 12
Un autre groupement apprécié de la présente invention est le difluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle qui répond à la formule suivante

le difluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle est synthétisé conformément au schéma suivant

Le N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthyl-4-triméthylammonio)phényle (35) a été obtenu par estérification de l'acide acridine-9-carboxylique avec le 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (36). Le produit (37) a été réduit en l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4 amino)phényle (38) au moyen de zinc.Deux groupes méthyle ont été introduits sur le groupe amino par traitement avec l'ioduré de méthyle. Puis la transformation en dérivé quaternaire et la formation d'acridinium ont été effectuées en utilisant du fluorosulfate de méthyle. Ces réactions sont décrites plus en détail ci-dessous.

De l'acide acridine-9-carboxylique (35) (3,05 g, 0,014 mole) dans un ballon à fond rond de 250 ml a été mélangé à du chlorure de thionyle (65 ml) et le mélange a été chauffé au reflux pendant 2 heures sous agitation. Le chlorure de thionyle en excès a été éliminé dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été traité avec du benzène (75 ml) et le solvant a été évacué sous vide pour éliminer les traces de chlorure de thionyle. Le résidu de chlorure d'acridine-9-carbonyle a été mélangé à de la pyridine (65 ml) et du 2,6-diméthyl-4-nitrophénol (36) (2,25 g, 0,014 mole) a été ajouté. Le mélange a été chauffé en utilisant un bain d'eau (environ 60'C ) pour dissoudre la totalité des substances solides. Au bout de 15 heures d'agitation à température ambiante, le mélange a été versé dans 1 litre d'eau.La suspension a été acidifiée avec de l'acide chlorhydrique concentré à pH 2,0. Le produit solide a été filtré, lavé à l'eau et dissous dans le chloroforme.

La déshydratation (sulfate de sodium anhydre) et l'évaporation du chloroforme ont donné l'ester brut).

L'ester brut a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHC13/EtOAc dans le rapport de 98:2. Les fractions ayant un Rf égal à 0,6 par CCM avec le même solvant ont été rassemblees et l'évaporation des solvants a donné l'acridi- ne-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro)phényle (37) (rendement = 30%).

L'ester de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle (37) (1,16 g, 3,1 mmoles) a été dissous dans de l'acide acétique (50 ml) par chauffage dans un bain d'huiie à environ 65'C.

Du chlorure stanneux (1,5 g) a été dissous dans de l'acide chlorhydrique concentré (10 ml) et a été ajouté à la solution d'ester. Le mélange a été agité pendant 45 minutes, puis a été versé dans de l'eau (750 ml). L'extraction avec du chloroforme (3 x 200 ml) a éliminé l'ester de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle n'ayant pas réagi. La phase aqueuse a été rendue basique avec du bicarbonate de sodium et a été soumise à une extraction avec du chloroforme (4 x 200 ml). La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-amino)phényle (38) (rendement = 25%).

L'amino-ester (38) (64 mg, 0,18 mmole) a été dissous dans du nitrométhane (5 ml). De l'iodure de méthyle (1 ml) et de la pyridine (0,1 ml) ont été ajoutés. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. Du méthanol (2 ml) a été -ajouté, puis le mélange a été agité pendant un temps supplémentaire de 2 heures. Les solvants ont été évaporés et le résidu a été traité avec de l'eau (10 ml), puis a été soumis à une extraction avec du chloroforme (4 x 20 ml) après avoir rendu la solution basique. La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné de l'acridine-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4diméthylamino)phényle (39) (rendement = 50%).

Le diméthylamino-éther (39) (154 mg, 0,41 mmole) a été dissous dans du chlorure de méthylène (2 ml).

Du fluorosulfate de méthyle (265 ml, 3,28 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'éther anhydre (15 mî) a été ajouté et les substances solides précipitées ont été filtrées et lavées à l'éther. La déshydratation a donné du N-méthyl acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylam- monio)phényle (40) (rendement = 50%). SM. FAB, matrice de thioglycérol, m/e 400 (M+).

MARQUAGE D'UNE PROTEINE D'UNE AUTRE XATIERE
AVEC DES GROUPEMENTS CHIMIOLUMINESCENTS
Exemple 13
Un conjugué de la présente invention comprend de la progestérone liée à un produit d'addition du ss-D- thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. Le conjugué de progestérone au produit d'addition du ss-D- thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle répond à la formule suivante

Le conjugué de progestérone est synthétisé conformément au schéma suivant

Du 3,5-diméthoxy-4-hydroxybenzamide (41) (3,0 g, 15,2 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (15 ml) et la solution a été refroidie dans un bain de neige carbonique/CC14.Du chlorure d'acétyle (1,4 ml, 1,54 g, 19,7 mmoles) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Du méthanol (1 ml) et de l'eau (5 ml) ont été ajoutés et les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Le résidu a été traité avec de l'eau (50 ml) acidifiée avec de l'acide chlorhydrique dilué et a été soumis à une extraction avec de l'acétate d'éthyle. Le lavage à l'eau, la déshydratation et l'évaporation de l'acétate d'éthyle ont donné de l'acétate de 2,6-diméthoxy4-carboxamidophényle (42) (2,2 g) qui a été recristallisé dans l'acétate d'éthyle (rendement = 60%).

L'acétate de phényle (42) (1,27 g, 5,33 mmoles) a été dissous dans le tétrahydrofuranne anhydre (125 ml).

Une solution de diborane dans le THF (1,0 M, 10,9 ml, 10,9 mmoles) a été ajoutée et le mélange a été chauffé au reflux pendant 4 heures. Après refroidissement à température ambiante, de l'eau (2 ml) et de l'acide chlorhydrique (1,0 N, 5 ml) ont été ajoutés. Après agitation pendant 30 minutes, les solvants ont été éliminés sous vide. Le résidu a été soumis à l'extraction avec du chloroforme. Puis le chloroforme a été déshydraté et éliminé sous vide. Le 2,6diméthoxy-4-aminométhylphénol (43) a été utilisé dans l'étape suivante sans autre purification.

Du chloroformiate de benzyle (1,050 ml, 1,25 g, 7,3 mmoles) a été ajouté à une solution de l'amine brute (43) dans la pyridine anhydre (10 ml) et le mélange a été agité pendant 3 heures à température ambiante. De l'eau (5 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide. De l'eau (30 ml) a été ajoutée au résidu et le mélange a été acidifié au moyen de HC1 dilué. L'extraction avec de l'acétate d'éthyle, le lavage à l'eau, la déshydra tation et l'évaporation du solvant ont donné du 2,6diméthoxy-4- (benzyloxycarbonylamino) méthylphénol (44) sous forme d'une huile (rendement = 70% au total).

De l'acide acridine-9-carboxylique (754 mg, 3,38 mmoles) a été dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml). Du chlorure de p-toluènesulfonyle (1,28 g, 6,76 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité a température ambiante pendant 30 minutes. Du 2,6-diméthoxy4-(benzyloxycarbonylamino)méthylphénol (44) (1,18 g, 3,76 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 heures. De l'eau (10 ml) a été ajoutée et les solvants ont été éliminés sous vide. Le résidu a été dissous dans le chloroforme et la phase chloroformique a été lavée successivement avec de l'eau,
HCl 0,1 N et une solution de bicarbonate de sodium.La déshydratation et l'évaporation du chloroforme ont donné lester brut qui a été chromatographié sur une colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange CHCl3/acétate d'éthyle dans le rapport 1:1. L'évaporation des solvants des fractions rassemblées a donné de l'acridine-9-carboxylate de [2,6-diméthoxy-4-(benzyloxycarbonyl- amino)méthyl)phényle (45) (rendement = 22%).

L'acridine (45) (296 mg, 0,57 mmole) a été dissoute dans du chlorure de méthylène anhydre (5 ml). Du fluorosulfate de méthyle (277 1, 3,4 mmoles) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 heures. De l'éther anhydre (25 ml) a été ajouté et le fluorosulfonate d'acridinium-9-carboxylate de [2,6diméthoxy-4-(benzyloxycarbonylamino)méthyl]phényle précipité (46) a eté filtré, lavé à l'éther et déshydraté (rendement = 998).

L'acridinium (46) (107 mg, 0,169 mmole) a été mis en suspension dans du chlorure de méthylène anhydre (2 ml). De l'acide chlorosulfonique (53 1, 92 mg, 0,797 mmole) a été ajouté, puis le ballon a été refroidi dans un bain de neige carbonique/CC14. Le contenu du ballon a été agité pendant 30 minutes et le bain a été enlevé.

Après une agitation supplémentaire à température ambiante pendant 1,5 heure, de l'éther anhydre (2Oml) a été ajouté.

Le produit précipité a été filtré et déshydraté sous vide.

Le fluorosulfonate d-'acridinium-9-carboxylate de 2,6diméthoxy-4-aminométhyl-3-chlorosulfonyl)phényle (41) a été utilisé directement dans la réaction suivante.

Le chlorure de sulfonyle (47) (129 mg) a été agité à température ambiante dans un mélange de méthanol (12,5 ml) et d'eau (12,5 ml) pendant 3 heures. De l'acétonitrile (35 ml) a été ajouté et les solvants ont été évaporés. Le résidu a été déshydraté sous vide sur de l'anhydride phosphorique. Le fluorosulfonate d'acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-4-aminométhyl-3-oxo- sulfonyl)phényle (48) a été utilisé directement pour la réaction suivante.

De l'hémisuccinate de progestérone (90 mg, 0,209 mmole) et de la N-méthylmorpholine (22 1, 209 mmoles) ont été dissous dans du DMF anhydre (2 ml). La solution a été refroidie dans un bain de neige carboni que/CCî4 et du chloroformiate d'isobutyle (30 1, 0,229 mmole) a été ajouté. Au bout de 2 minutes, une solution de l'acridinium (42) (101 mg, 0,143 mmole) dans le diméthylsulfoxyde (2 ml) contenant de la N-méthylmorpholine (3,14 1, 0,28 mmole) a été ajoutée. L'agitation a été poursuivie à -20'C pendant 10 minutes et le bain de refroidissement a été enlevé. Après agitation à température ambiante pendant 7 heures, trois gouttes d'eau ont été ajoutés. Les solvants ont été éliminés sous vide et de l'acétate d'éthyle a été ajouté au résidu. Le précipité huileux a été lavé à plusieurs reprises avec de l'acétate d'éthyle par trituration avec de l'acétonitrile (2 ml), l'huile s'est séparée sous forme de substances solides. Le produit a. été purifié par CLHP en utilisant une colonne semi-preparative Dynamax C18 (10 mm x 250 mm) (disponible dans le commerce auprès de Rainin Instrument Co., Inc.,
Woburn, Massachusetts) en utilisant comme phase mobile un mélange CH3CN/H2O (0,1% d'acide trifluoracétique) dans le rapport 55/45, à un débit de 2,75 ml/min. Le pic apparaissant au temps de rétention de 6,00 minutes a été recueilli.

L'évaporation des solvants a donné le conjugué (49) (rendement = 30%). SM : FAB, matrice de thioglycérol,895 (M+, sans aucun ion complémentaire).

Le conjugué de progestérone (49) (1,1 mg) dans un mélange de CH3CN (1 ml) et H20 (200 1) a été traité avec du 8-D-thioglucose (0,29 mg) sous forme d'une solution dans l'eau (72 1). Au bout de 10 minutes, les solvants ont été totalement éliminés sous vide, donnant le produit d'addition de p-D-thioglucose représenté ci-dessus.

ExemDle 14
Le mode opératoire suivant pour la fixation à une protéine peut s'appliquer de manière générale à des groupements de la présente invention.

De l'IgG de souris (Sigma, 1 mg) a été dissoute dans 0,9 ml de tampon au phosphate (100 mM, pH 8,0, 150 mM). Puis la solution a été divisée en trois portions égales de 0,33 mg/0,3 ml (0,0022 mole). Environ 0,3 mg d'un groupement de la présente invention a été dissous dans environ 0,4 ml de DMF de manière à obtenir 0,022 mole de groupement dans 15 1 de DMF.

0,022 mole du composé de la présente invention a été mélangée à 0,0022 mole de IgG dans un tube de microcentrifugation en matière plastique. Au bout de 15 minutes, une quantité supplémentaire de 0,022 mole de compose a été introduite dans le tube de microcentrifugation (le rapport molaire du composé à la protéine était égal à 20:1). Après un temps supplémentaire de 15 minutes, les quantités en excès du composé de la présente invention ont été désactivées avec une solution de chlorhydrate de lysine (10 1 dans 100 mM de tampon Pi, i pH 8,0) pendant 15 minutes.

En variante1 les aliquotes de 0,0055 mole du composé de la présente invention ont été utilisées à la place de portions de 0,022 mole (le .rapport molaire du composé à la protéine est égal i 5:1).

Des colonnes en verre Biorad (1 cm x 50 cm) (disponibles dans le commerce auprès de Biorad, Chemical
Division, Richmond, Californie) ont été garnies avec du
Sephadex G-50-80 préalablement gonflé et désaéré dans du tampon au phosphate (100 mM, pH 6,3, 150 mM de NaCl, 0,001% de TMS) à un volume de lit de 45 ml. La solution réactionnelle a été passée à travers les colonnes à un débit de 0,3-0,4 ml/min. Des fractions de 0,5 ml ont été recueillies. Les fractions protéiques marquées ont été détectées en diluant 20 1 de chaque fractions 1 ml et en déterminant la chimioluminescence produite avec 30 1 de la solution diluée. Puis les fractions marquées ont été rassemblées.

Les fractions de conjugués rassemblées ont été dialysées pour améliorer la pureté du conjugué immunoréactif. Les fractions rassemblées ont été dialysées contre 500 ml de tampon au phosphate à pH 6,3 (100 mM, pH 6,3, 150 mM de NaCi, 0,001% de TMS) en un temps de 24 heures, avec trois changements de tampon.

Exemple 15
Des groupements contenant un noyau ou système cyclique hétérocyclique non réduit peuvent être transformés en leurs formes réduites équivalentes bien que ces groupements non réduits soient fixés à une protéine ou une autre matière. Cela peut être effectué en utilisant un agent réducteur tel que le cyanoborohydrure de sodium. Le procédé de production d'un conjugué acridinium/IgG est décrit ci-dessous. Le même mode opératoire peut être appliqué à la réduction d'autres conjugués.

L'IgG marquée avec un dérivé d'acridinium reprEsentatif (100 g) dans du tampon au phosphate (400 1) (pH 6,0, 100 mM, 150 mM de NaCi, 0,001% de Thimerosal) a été traitée avec une solution fraîchement préparée (10 1) contenant du cyanoborohydrure de sodium (10'7 mole). Après deux heures d'incubation & température ambiante, la transformation du marqueur & base d'acridinium présent sur l'anticorps en acridane est totale, comme permettent de le constater les spectres W-lumière visible indiquant l'apparition d'une bande a 280 nm et la disparition de la bande 9 360 nm. Ces formes réduites conservaient toutes leurs propriétés immunologiques.

PROTOCOLES ANALYTIQUES
Exemple 16
1. Constituants
A) Anticorps marqué (conjugué) : anti
prolactine de lapin purifiée par affinité
conjuguée à du fluorosulfonate de N-méthyl
acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3
chlorosulfonyl)phényle. Tampon de mise en
réserve : tampon au phosphate 10 mM, NaCl
100 mM, pH 6,0, 0,001% de Thimerosal, 0,4% de
SAB.

B) Anticorps de capture : anti-prolactine
de lapin (6 g/ml) sous forme de phase solide
sur des tubes de Nunc (disponible dans le
commerce auprès de Midland Scientific,
Roseville, Minnesota).

C) Tubes revêtus de phase solide : des
tubes de Nunc secs ont été préparés de la
manière suivante
1) 0,3 ml de l'anticorps de capture
par tube à 6 g/ml dans du tampon au STP
(sérum physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, phosphate 10 mM,
NaCl 100 mM, NaN3 10 mM) a été introduit
à la pipette dans des tubes de Nunc.

2) Les tubes ont été incubés pendant
18 à 14 heures.

3) Les tubes ont été lavés à deux
reprises avec le tampon au STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec
2,0% de SAB dans du tampon au STP.

L'incubation a été effectuée pendant un
temps inférieur ou égal à 4 heures à
température ambiante.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec du tampon au STP.

6) Les tubes ont été déshydratés å
température ambiante.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4'C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval. 0,5, 30, 100 et 200 ng/ml/ml.

2. Protocoles analvtioues
1) 25 1 d'échantillon ou d'étalon
ont été introduits à la pipette dans les
tubes revêtus d'anticorps.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été
ajoutés.

3) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement.

4) Les tubes ont été incubés pendant
1 heure à température ambiante sur un
appareil d'agitation rotative.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec de l'eau désionisée.

6) La chimioluminescente a été
comptée pendant 2 secondes (pompe 1
HN03 0,1 N + 0,258 H202 ; pompe 2
NaOH 0,25 N + 0,125% CTAC) dans un
analyseur LumaTag (disponible dans le
commerce aupres de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

ExemDle 17
1. Constituants
A) Conjugués de progestérone avec le produit d'addition de 8-D-thioglucose sur le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle : 20 pg/ml de conjugué de progestérone dans du tampon au phosphate (pH 6,0, phosphate 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de sérum-albumine humaine, 0,001% de Thimerosal).

B) Anticorps principal : anti-progestérone de lapin (Cambridge Medical Diagnostics) dans du tampon au phosphate (pH 6,0, phosphate 200 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de sérum-albumine humaine, 0,01% de CHAPS, 5 g de Danazol).

C) Tubes revêtus de phase solide : tubes de Nunc secs revêtus avec 2,5 g d'anti-fc de lapin, obtenu i partir de chèvre, et bloqués avec 0,5% de SAB. Les tubes ont été préparés de la manière suivante
1) Les tubes ont été incubés pendant
1 heure avec 2,5 g/ml d'anti-fc de
lapin, obtenu à partir de chèvre, (500 1)
à température ambiante.

2) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec de l'eau distillée.

3) Les tubes ont été incubés
immédiatement pendant 3 heures avec 0,5%
de SAB (500 1) à température ambiante.

4) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec de l'eau distillée.

5) Les tubes ont été séchés pendant
une nuit à une humidité relative de 40%,
à température ambiante.

6) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur à 4 C.

D) Matrice de sérum : sérum de boeuf
Antech.

E) Etalons : 0,013, 0,38, 1,31, 7,31, 16,6 et 37,0 ng/ml.

2. Protocoles analytiques
1) 50 1 d'échantillon ou d'étalon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus d'anticorps.

2) 100 1 de tampon renfermant le conjugué ont été ajoutés.

3) 100 1 de tampon renfermant l'anticorps principal ont été ajoutés.

4) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement.

5) Les tubes ont été incubés pendant 2 heures à 37c.

6) Les tubes ont été décantés et lavés avec 150 mM de NaCl dans 0,1% de Tween (1 ml), puis â 3 reprises avec de l'eau distillée.

7) On a inversé les tubes et on les a laissé s'égoutter.

8) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N + 0,25% H2O2 ; pompe 2 : NaOH 0,25 N + 0,125%
CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

Exemple 18
I. Constituants
A) Anticorps marqué : anti-TSH, obtenu à partir de chèvre, purifié par affinité, conjugué à du fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle.

B) Tampon de mise en réserve : 100 mM de phosphate, 0,145 M de NaCl, 0,001% de Thimerosal, 0,4% de SAB, 0,1 mg/ml de globulines de souris et 0,1 mg/ml de globulines de chèvre, à pH 6,0.

C) Anticorps de capture : anti-TSH monoclonal (2 g/ml) sous forme d'une phase solide sur des tubes de Nunc. Procédé de préparation des tubes de Nunc portant une phase solide
1) 0,4 ml de l'anticorps de capture
à 2 g/ml dans du tampon au STP (sérum
physiologique tamponné avec un phosphate,
pH 7,2-7,4, 10 mM de phosphate, 100 mM de
NaCl, 10 mM de NaN3) a été introduit dans
chaque tube.

(2) Les tubes ont été incubés
pendant 18 à 24 heures.

3) Les tubes ont été lavés à 3
reprises avec le tampon au STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec
2,0% de SAB dans du tampon au STP et
incubés pendant un temps inférieur ou
égal à 4 heures à température ambiante.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec du tampon au STP.

6) Les tubes ont été séchés à
température ambiante.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4'C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval, 0, 0,5 , 2,5, 10, 25 et 100 UI/ml.

2. Protocoles analvtiaues
1) 200 1 d'échantillon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été ajoutés.

3) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement.

4) Les tubes ont été incubés pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur par secousses.

5) Les tubes ont été lavés en utilisant un appareil de lavage Biotomic (disponible dans le commerce auprès de Ocean Scientific, Inc.,
Garden Grove, Californie).

6) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNo3 0,1N + 0,25%
H202 ; pompe 2 : NAOH 0,25 N + 0,125% CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics, Eden
Prairie, Minnesota).

Exemple 19
1. Constituants
A) Anticorps marqué : anti-prolactine de lapin, purifiée par affinité, conjuguée à du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle.

Tampon de mise en réserve : tampon au phosphaté 10 mM, 100 mM de NaCi, pH 6,0, 0,001% de
Thimerosal, 0,4% de SAB.

B) Anticorps de capture : anti-prolactine de lapin (6 g/ml) sous forme de phase solide sur des tubes de Nunc.

C) Tubes revêtus de phase solide : des tubes de Nunc sec ont été préparés de la manière suivante
1) 0,3 ml de l'anticorps de capture
par tube à 6 g/ml dans du tampon au STP
(sérum physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, 10 mM de phospha
te, 100 mM de NaCl, 10 mM de NaN3) a été
introduit à la pipette dans des tubes de
Nunc.

2) Les tubes ont été incubés pendant
18 à 24 heures.

3) Les tubes ont été lavés à deux
reprises avec le tampon au STP.

4) Les tubes ont -été bloqués avec
2,0t de SAB dans du tampon au STP.

L'incubation a été effectuée pendant un
temps inférieur ou égal à 4 heures à
température ambiante.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec du tampon au STP.

6) Les tubes ont été séchés à
température ambiante.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur, à 4"C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval. 0, 5, 30, 100 et 100 ng/ml/ml
2. Protocoles analytiques
1) 25 1 d'échantillon ou d'étalon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus d'anticorps.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été
ajoutés.

3) Les tubes ont été agités doucement par
tourbillonnement.

4) Les tubes ont été incubés pendant 1
heure à température ambiante sur un appareil
d'agitation rotative.

5) Les tubes ont été lavés à 3 reprises
avec de l'eau désionisée.

6) La chimioluminescence a été comptée
pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N
+ 0,25% H202 ; pompe 2 : NaOH 0,25N + 0,1258
CTAC] dans un analyseur LumaTag (disponible
dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota).

ETUDES DE STABILITE
Conformément aux études suivantes de stabilité, les groupes et conjugués de la présente invention sont de préférence entreposés et utilisés dans des analyses à un pH d'environ 6,5 à environ 7,5. Les groupements et conjugués présentent une stabilité accrue à d'autres pH dans certaines conditions ; cependant, l'accroissement n'est pas dépendant des conditions dans l'intervalle de pH préféré.

Exemple 20
La stabilité comparative a été déterminée en comparant le nombre de jours (tl/2) nécessaire pour qu'un groupement perde 50% de sa chimioluminescence. La stabilité de certains groupements non liés à une protéine ou une autre matière a été contrôlée à température ambiante et à 4'C. Les groupements ont été entreposés dans un tampon (pH 6,0, 50 mM de Pi, 0,1% de SAB).Le fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl) propyloxy-N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle n'a présenté aucune perte'appréciable du nombre de coups après 98 jours à température ambiante et à 4"C. Le fluorosulfonate de 3 (3-succinimidyl-oxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium 9-carboxylate de (2,6-isopropyl-4-nitro)phényle n'a présenté aucune perte appréciable de nombre de coups après 312 jours à température ambiante et à 4'C.Pour le difluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle, t1/2 est égal à 105 jours à température ambiante et t1/2 n'a pas été atteint après 105 jours à 4'C. Pour le fluorosulfonate de
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle, tl/2 est égal à 50 jours à température ambiante, tl/2 n'a pas été atteint à 4 C au bout de 130 jours.. Pour le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl-4-propanoyl)phényle, tl/2 est égal à 24 jours à température ambiante et était supérieur à 95 jours à 4'C.

Pour le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxy- late de (2,6-diméthyl)phényle, tl/2 était égal à 50 jours à température ambiante. En comparaison, des groupements ne portant pas les substituants figurant sur les groupements de la présente invention possédaient un tl/2 moyen inférieur à 8 jours à température ambiante et approximativement égal à 32 jours à 4 C.

Exemple 21
La stabilité comparative des esters de Nméthyl-acridinium de phényle, de (2,6-diméthyl)phényle, de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle, de (2, 6-diméthyl- 3-chlorosulfonyl)phényle, de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, de (2,6-diméthyl-4-triméthylammonio)phényle, et de (2,6diméthyl-4-bromo)phényle a été observée dans un tampon au phosphate (100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001% de
Thimerosal, 0,005% de sérum-albumine humaine) à pH 6,3 et à pH 8,0, par incubation a 35 C et 45 C. Les résultats de stabilité pour ces composés, a pH 6,3 à 35C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 1 et 2.Les résultats de stabilité pour ces composés, à pH 8,0, a 35 C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 3 et 4. Tous les composés portant un groupe phényle substitué (å l'exception du composé portant un groupe (2,6diméthyl)phényle, ont présenté une stabilité accrue, comparativement au composé nu. Le composé portant un groupe (2,6-diméthyl)phényle était moins stable que le composé portant un groupe phényle nu à pH 6,3 à 35 c, mais présentait une stabilité accrue à pH 8,0 à 35'C et aux deux pH & 45 C.

Exemple 22
La stabilité de conjugués d'IgG de souris avec du fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyl- oxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4- nitro)phényle et du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle, à différentes températures et à différents pH, a été étudiée et comparée à la stabilité de conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.Le fluorosulfonate de
N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle répond à la formule suivante

Le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidylcarboxyéthyl) phényle diffère des composés de la présente invention en ce qu'il ne possède pas de groupe électrophile ou de substituants en positions 2,6 sur le noyau phényle. Le fluorosulfonate de N-méthyl acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle a été publié dans la littérature et est couramment utilisé dans des applications utilisant la chimioluminescence.

De la manière indiquée ci-dessous, la diminution du nombre de coups pour un conjugué donné résulte de l'hydrolyse de la liaison ester dans le marqueur chimioluminescent. En conséquence, lorsque la stabilité du marqueur diminue, la vitesse de diminution du nombre de coups dans le conjugué diminue.

Des conjugués d'IgG de souris et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4nitro)phényle, de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2, 6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl) phényle et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à 4 c. Les conjugués ont été entreposés dans trois solutions de tampon différentes à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

Le premier tampon contenait 100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001 % de Thimerosal, 0,1 % de sérumalbumine humaine, 20 mg/l de IgG de mouton ("tampon standard au phosphate11). Les résultats de stabilité dans le tampon standard au phosphate à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont présentés, respectivement, sur les figures 5, 6 et 7.

Le deuxième tampon était du tampon standard au phosphate sans IgG de mouton. Les résultats de stabilité dans le deuxième tampon à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont pré sentés, respectivement, sur les figures 8, 9 et 10.

Le troisième tampon était du tampon standard au phosphate sans IgG de mouton et avec 0,1 % de sérumalbumine bovine à la place de la sérum-albumine humaine.

Les résultats de stabilité dans le troisième tampon à pH 6,3, 7,3 et 8,0 sont présentés, respectivement, sur les figures 11, 12 et 13.

Dans chaque tampon, à chaque pH, les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et de fluorosulfonate de Nméthyl acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG et de fluorosulfonate de .N-méthyl-acridin ium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.

Des conjugués d'IgG de souris avec du fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4 nitro)p: yle, du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et du fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à température ambiante.(environ 23C) ("TA") et à 37 C. Les conjugués ont été entreposés dans du tampon standard au phosphate à pH 6,3, 7,3 et 8,0.

Les résultats de stabilité à température ambiante aux trois pH pour les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle, de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle sont présentés, respectivement, sur les figures 14, 15 et 16. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG et de fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidyl- carboxyéthyl)phényle et de fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle à 37 C, aux trois pH, sont présentés, respectivement, sur les figures 17 et 18.Les figures 19 et 20 résument les résultats de stabilité pour un conjugué d'IgG et de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle à 37ec aux trois pH. Les figures 19 et 20 présentent des résultats pour des conjugués de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle produits en utilisant, respectivement, un excès molaire de 20x de fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl- acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et un excès molaire de 5x de fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle dans le protocole de conjugaison.

A -chaque pH et à température ambiante et à 37 c, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxyzarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium- 9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2 succinimidyicarboxyéthyl)phényie ont été entreposés a 37 C dans du tampon à l'avide (50 mM de Pi, 100 mM de NaCl, 0,1 % de sérum-albumine bovine, 10 mM d'azide de sodium) à pH 6,9, 7,0, 7,3 et 8,0. Les résultats de stabilité dans le tampon à l'azide, à pH 6,9, 7,0, 7,3 et 8,0, sont pré sentés-, respectivement, sur les figures 21, 22, 23 et 24.

A des pH supérieurs à 7,3, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl)- propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle et lé fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl) phényle. A pH 6,9 et 7,0, seul le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxy carbonyl)propyloxy-N-methyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentait une stabilité accrue.Le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3- chlorosulfonyl)phényle n'était pas notablement plus stable que le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle à pH 6,9 et 7,0.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinlum-9-carboxylate de 4-(2 succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à 37'C dans du tampon à l'azide à pH 6,3. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-methyl- acridinium-9-carboxylate de (2, 6-diméthyl-4-nitro) phényle, le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2succinimidylcarboxyéthyl)phényle dans le tampon à l'azide à pH 6,3 à 37'C sont présentés sur la figure 25.

Les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3- (3-succinimidyloxycarbonyl) propyioxy-N-méthyl-acridinium- 9-carboxylate de (2,6-dimêthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4 (2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle ont été entreposés à température ambiante et à 4'C dans du tampon à l'azide à pH 5,9. Les résultats de stabilité pour les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)- propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N-méthylacridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle dans le tampon à l'avide à pH 5,9 sont présentés sur la figure 26.

A des pH inférieurs à 6,3 à 37 C, les conjugués d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3-succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle et le fluorosulfonate de N méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle présentaient une stabilité réduite, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4-(2-succinimidylcarboxyéthyl)phényle.A pH 5,9, à température ambiante et à 4-C, le conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de 3-(3 succinimidyloxycarbonyl)propyloxy-N-méthyl-acridinium-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentait une stabilité réduite, comparativement au conjugué d'IgG avec le fluorosulfonate de N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de 4- (2-succinimidylcarboxyéthyle.

Exemple 23
La stabilité comparative des esters phénylique, (2,6-diméthyl)phénylique et (2, 6-diméthyl-4-nitro) - phénylique de N-méthyl-acridane a été examinée dans du tampon au phosphate (100 mM de Pi, 150 mM de NaCl, 0,001 % de Thimerosal, 0,005 % de sérum-albumine humaine) à pH 6,3 et à pH 8,0, par incubation à 35 C et 45 C. Les résultats de stabilité pour ces composés à pH 6,3, à 35 C et a 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 27 et 28.

Les résultats de stabilité pour ces composés à pH 8,0, à 35 C et 45 C, sont présentés, respectivement, sur les figures 29 et 30. Les composés portant un groupe (2,6diméthyl)phényle et un groupe (2,6-diméthyl-4-nitro)phényle présentaient une stabilité accrue, comparativement au composé portant un groupe phényle nu.

GROUPEMENTS CHIMIOLUMINESCENTS ADDITIONNELS
Exemple 24
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention, portant un groupe RnX sur l'atome de carbone auquel est fixée la liaison ester, est le N-méthylacr. 9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlor vlyl)phényle, qui répond à la formule suivante

Le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle est synthétisé à partir du N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3- chlor @@@@fonyl)phényle par deux procédés différents, décrits ci-dessous.

1. Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)
Une colonne de C18 (Rainin, Dynamax 6,0 nm, 250 mm x 10 mm) a été équilibrée avec un mélange d'éthanol et d'acétonitrile (jusqu'à 10 %) contenant environ 0,05 % d'une amine tertiaire (par exemple la triéthylamine). Du Nméthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle a été dissous dans la phase mobile et injecté au sommet de la colonne. La fraction principale, s'éludant avec une absorbance maximale à 280 -m, a été recueillie à un débit de 2,0-2,5 ml/min. Le solvant a été immédiatement éliminé totalement sous vide.Puis le résidu a été traité avec une petite quantité de benzène pour éliminer les traces d'alcool et pour éliminer l'humidité du produit final, le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle. Ce procédé de
CLHP constitue le procédé préféré de synthèse, puisqu'il donne un produit beaucoup plus pur. Cependant, le procédé de CLHP peut ne pas être approprié pour certains nucléophiles. Lorsque le procédé de CUP ne convient pas, le procédé utilisant un anion nucléophile, décrit ci-dessous, peut être utilisé.

2. Traitement du comPOsé de départ avec un anion nucléophile
Le N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6 diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (0,013 mmole, 7,5 mg) a été dissous dans de méthanol absolu (3 ml), sous atmosphère d'azote. Une solution de tertio-butylate de potassium dans l'éthanol absolu (2 mg/ml) a ajoutée goutte à goutte (en utilisant une seringue étant aux gaz) a la solution, sous agitation énergique, de N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle jusqu'à disparition totale de la couleur jaune de la solution. Puis l'éthanol a été totalement éliminé sous vide.Le résidu a été traité avec de l'éther anhydre (2 ml) et approximativement 1 g de sulfate de sodium anhydre. La séparation de la solution éthérée et l'évaporation du solvant ont donné du N-méthyl-acridane-9éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-sulfonyl)phényle sous forme d'une substance solide de couleur blanche (2,5 mg).

Du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylat (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle a été produit en utilisant à la fois les procédés de synthèse par CLHP et au moyen d'un anion nucléophile, à partir du N-méthylacridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chloro- sulfonyl)phényle. Le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle a été produit au moyen du procédé de synthèse utilisant un anion nucléophile, à partir du N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle.

3. Autres synthèses
Les deux procédés de synthèse décrits ci-dessus peuvent être utilisés pour produire n'importe lequel des composés de la présente invention portant un groupe RnX. Si un composé nucléophile autre que l'méthanol doit céder le groupe RnX, méthanol est remplacé par le composé nucléophile désiré dans les procédés de synthèse. Si un acridinium, un phénanthridinium, etc., différents sont désirés, le N-méthyl-acridinium-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3 chlorosulfonyl)phényle peut être remplacé par le composé auquel le groupe RnX doit ête ajouté dans les procédés de synthèse décrits ci-dessus. Dans la plupart des cas, un changement du composé nucléophile nécessite également un changement de solvant (par exemple, si le méthanol est le composé nucléophile désiré, l'méthanol ne peut être utilisé comme solvant en raison d'une compétition pour l'addition).

Dans de tels cas, le nouveau composé nucléophile peut être utilisé comme solvant de remplacement, s'il est approprié, ou bien un solvant non protique, non nucléophile (par exemple le THF) peut être utilisé en remplacement.

D'autres procédés de synthèse, comprenant, à titre non limitatif, le traitement avec un solvant nucléophile, peuvent également être utilisés pour produire des groupements portant un groupe RnX.

Exemple 25
Pour confirmer la possibilité de mise en oeuvre des procédés de synthèse décrits dans l'exemple 24, les produits ont été analysés par spectroscopie UV-lumière visible, par spectroscopie de masse par bombardement atomique rapide et par RMN des protons à 300 MHz.

La figure 31 représente un spectre UV-lumière visible du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:chloroforme). La figure 32 est un spectre de masse par bombardement atomique rapide du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (m/e = 472,1 ; M+ - OCH2CH3). L'intégrité du groupement chlorure de sulfonyle est confirmée par le pic d'abondance d'isotope à 472+2=474.

La figure 33 représente un spectre RMN des protons à 300 MHZ du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:CDCi3).

La figure 34 représente un spectre RMN des protons à 300 MHz du N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9- carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle (solvant:CDCl3).

ExemPle 26
Du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phenyle a été utilisé comme marqueur dans une analyse de TSH, de la manière suivante
1. Constituants
A) Anticorps marqué : de i'anti-TSH de chèvre, purifié par affinité, a été conjugué à du N-méthylacridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3chlorosulfonyl)phényle de la manière suivante : une solution de l'anticorps anti-TSH (approximativement 100 Sg) dans du tampon au bicarbonate (0,lM, pH 9,6) a été traitée avec un excès molaire de 25x de N-méthyl-acridane-9-éthoxy- 9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle sous forme de solution dans le DMF. Le mélange réactionnel a été purifié sur une colonne de Sephadex G25 (superfin) à écoulement rapide (Pharmacia) -en utilisant un dispositif de
CLHP.Le pic de protéine a été recueilli à un débit approximativement égal à 0,75 ml/min avec une phase mobile de tampon au phosphate (pH 6,0) contenant approximativement 20 % d'éthanol. Après changement du tampon, la préparation d'anticorps marqué a été diluée avec du tampon de mise en réserve pour parvenir approximativement à 100 000 unités/100 ul dans un analyseur LumaTag TM (disponible dans le commerce auprès de London Diagnostics,
Eden Prairie, Minnesota) après une dilution au 1/10.

B) Tampon de mise en réserve : 100 mM de phosphate, 0,145 M de NaCi, 0,001 iÓ de Thimerosal, 0,4 % de
SAB, 0,1 mg/ml de globulines de souris et 0,1 mg/ml de globulines de chèvre, pH 6,0.

C) Anticorps de capture : anti-TSH monoclonal (2 pg/ml) sous forme d'une phase solide sur des tubes de
Nunc. Procédé de préparation de tubes de Nunc portant une phase solide
1) 0,4 ml de l'anticorps de capture à
2 pg/ml dans du tampon au STP (sérum
physiologique tamponné avec un
phosphate, pH 7,2-7,4, 10 mM de
phosphate, 100 mM de NaCi, 10 mM de
NaN3) a été introduit dans chaque
tube.

2) Les tubes ont été incubés pendant 18
à 24 heures.

3) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec le tampon au STP.

4) Les tubes ont été bloqués avec 2,0 %
de SAB dans du tampon au STB et
incubés pendant un temps inférieur à
4 heures à température ambiante.

5) Les tubes ont été lavés à trois
reprises avec du tampon au STP.

6) Les tubes ont été séchés & tempéra
ture ambiante.

7) Les tubes ont été entreposés dans
des sacs en matière plastique pour
congélateur à 4 C.

D) Etalons : préparés dans du sérum de cheval.

0, 0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 10, 25 et 50 UI/ml.

E) Solution de lavage : tampon au sérum physiologique contenant de la SAB.

2. Protocole analytique
1) 200 l d'échantillon ont été introduits à la pipette dans les tubes revêtus.

2) 100 1 d'anticorps marqué ont été ajoutés.

3) Les tubes ont été agités doucement par tourbillonnement.

4) Les tubes ont été incubés pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur par secousses.

5) 1 ml de solution de lavage a été introduit dans chaque tube.

6) Les tubes ont été lavés en utilisant un appareil de lavage Biotomic (disponible dans le commerce auprès de Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, Californie).

7) La chimioluminescence a été comptée pendant 2 secondes [pompe 1 : HNO3 0,1 N + 0,25 % de H202 pompe 2 : NaOH 0,25 N + 0,125 % de CTAC) dans un analyseur
LumaTag TM (disponible dans le commerce auprès de London
Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota).

L'addition de HNO3 au mélange analytique contenant l'anticorps marqué provoque la séparation du groupe éthoxy en Cg de la molécule d'acridinium avant induction de la réaction de chimioluminescence par addition de NaOH. Une courbe de référence pour l'analyse est présentée sur la figure 35.

Exemple 27
Les stabilités du N-méthyl-acridinium-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle ("DMC") et du N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9-carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle ("DME") ont été comparées à pH 9,6 à 25'C. Les composés ont été dissous dans le DMF (approximativement 0,5 mg/ml). Puis 10 p1 de la solution ont été ajoutés à 1 ml de tampon au bicarbonate (0,lM de bicarbonate, 0,00025 % de Thimerosal, 0,1 % de sérum-albumine bovine). La solution a été diluée davantage pour parvenir à approximativement 300 000 coups dans 10 1.

Les résultats obtenus par l'étude de stabilité sont présentés sur la figure 36. Le DME s'est révélé être plus stable que le DMC au cours du temps.

Les stabilités du conjugué TSH marqué au DMC et du conjugué TSH marqué au DME ont été comparées à pH 6,0 à 25, 30 et 35 C. Les résultats obtenus à partir de l'étude de stabilité sont présentés sur les figures 37 à 39. Le conjugué TSH marqué au DME s'est révélé être plus stable au cours du temps.

Exemple 28
Un groupement chimioluminescent apprécié de la présente invention, portant un groupe RnX sur l'atome de carbone auquel est fixée la liaison ester et portant un substituant péri, est le N.-méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9- méthoxy-9-carboxylate de phényle, qui répond à la formule suivante

Le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9-méthoxy-9-carboxylate de phényle a été synthétisé à partir du N-méthyl-1,3diméthyl-acridinium-9-carboxylate de phényle suivant le procédé de CLHP décrit ci-dessus. Pour produire du N méthyl-1,3-dimethyl-acridinium-9-carboxylate de phényle, de la 3,5-diméthylaniline et du bromobenzène ont été amenés à réagir dans des conditions de réaction d'Ullmann par extension, donnant la N-phényl-N-(3,5-diméthyl)phénylamine.

La réaction de la N-phényl-N-(3,5-diméthyl)phénylamine avec le chlorure d'oxalyle a donné la N-phényldiméthylisatine intermédiaire. Par cyclisation dans des conditions basiques, l'acide 1,3-diméthyl-acridine-9-carboxylique a été formé. L'ester phénylique d'acridine a été formé par estérification avec le phénol, de la manière décrite précédemment. Le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridinium-9carboxylate de phényle a été produit à partir de l'ester d'acridine de la manière décrite ci-dessus.

Pour confirmer la possibilité de mise en oeuvre du procédé de synthèse décrit dans cet exemple, le N méthyl-1,3-diméthyl-acridane-9-methoxy-9-carboxylate de phényle a été analysé par RMN des protons à 300 MHz (solvant : CDC13). Le spectre est présenté sur la figure 40.

Il va de soi que de la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.

Claims (86)

REVENDICATIONS

1. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé a une matière à liaison spécifique et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit ou desdits produits de tion de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit ou desdits produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit ou lesdits produits de réaction de liaison spécifique

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxyôation qui rend cet atome de carbone sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au moins un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant 0, N,

S et C, R est n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.

2. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyste et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe analyte-conjugué chimioluminescent.

3. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, et (ii) à la matière à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-corps réactionnel et dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ; et

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ou (ii) dudit conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel.

4. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la matière å liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent ; et

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent.

5. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne contenant pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique ; et

å mesurer la chimioluminescence dudit groupement chimioluminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique ;

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant -å un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible à une attaque par un peroxv -u de l'oxygène moléculaire pour former un intermudfiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au moins un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupé comprenant O, N,

S et C, R représente n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.

6. Analyse par liaison spécifique suivant la revendicrtion 5, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel.

7. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 1 ou 5, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi dans le groupe comprenant -CN, -OR, -NR2, -NR3+, -SR, -SR2+ -S2R, -NRCO2R, -NHNR2, -NRNR2, -NHOR, -ONR2, -CR(CN)2, -CR(COR)2, -CR2NO2, -C#COR,

8. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que chacun des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est choisi entre les groupes -CH3, -OCH3 et isopropyle.

9. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce qu'au moins l'un des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est un groupe électrophile.

10. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau hexagonal substitué porte au moins tn substituant supplémentaire, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison, au moins un substituant supplémentaire étant un groupe électrophile.

11. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 10, caractérisee en ce qu'au moins un substituant supplémentaire est choisi entre les groupes -NO2 -SO2C1, -Br, -N(CH3)3+ et -H.

12. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 11, caractérisée en ce que le groupe électrophile est un groupe -H.

13. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène.

14. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 13, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle.

15. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 14, caractérisée en ' ce que la somme des valeurs sigmap pour tous les substituants présents sur le groupe phényle, qui sont des groupes électrophiles, est inférieure ou égale à environ 1,0.

16. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b)acridinium, le benz[c)acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazoler le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium.

17. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication ' 16, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou du phénanthridinium.

18. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 17, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -OCH3 et -OCH2CH3.

19. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-éthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

20. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9 carboxylate de (2,6-diméthoxy-3-chlorosulfonyl)phényle.

21. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 18, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est le N-méthyl-acridane-9-méthoxy-9carboxylate de (2,6-diméthyl-3-chlorosulfonyl)phényle.

22. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique porte au moins un substituant péri, en position péri par rapport a l'atome de carbone auquel est fixée la liaison.

23. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 22, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe alkyle ou aryle.

24. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 23, caractérisée en ce qu'au moins un groupe substituant péri est un groupe -CH3.

25. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant les revendications 1 à 24.

26. Composition suivant la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un partenaire de liaison spécifique.

27. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend un flacon contenant au moins la composition suivant la revendication 25 ou 26.

28. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé à une matière à liaison spécifique et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, et

à mesurer la chimioluminescence (i) du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans le ou les produits de réaction de liaison spécifique

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un groupe partant

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant O, N,

S- et C, R représente n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.

29. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement å l'analyte et le ou les produits de réaction de liaison spécifique sont constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-conjugué chimio luminescent ; et

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe analyte-conjugué chimioluminescent.

30. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel et (ii) à la matiere à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-corps réactionnel et dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel.

31. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe corps réactionnel-analyte conjugué chimioluminescent t et

& mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent.

32. Analyse par liaison spécifique destinée à déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de 1'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle & la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne contenant pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de liaison spécifique ; et

à mesurer la chiminoluminescence dudit groupement chimioluminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible & une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un groupe partant

l'atome de carbone auquel est fixée ladite liaison portant un substituant secondaire de formule RnX, dans laquelle X est choisi dans le groupe comprenant O, N,

S et C, R représente n'importe quel groupe et n est un nombre choisi de manière que X possède une valence convenable.

33. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement å la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel.

34. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 28 ou 32, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -CN, -OR, 'NR2 , -NR3+, -SR, -SR2+, -S2R, -NRC02 R, -NHNR2, -NRNR2 -NHOR, -ONR2, -CR(CN)2, -CR(COR)2, -CR2N02, -C-COR,

35. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupe partant est un noyau ou système cyclique aryle.

36. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 35, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène.

37. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 36, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle.

38. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 37, caractérisée en ce que le noyau phényle est non substitué.

39. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est un amide et le groupe partant est un groupe de formule NR'(S02-R"-Y), dans laquelle R' et R" sont choisis entre des groupes alkyle, alkylène, aryle, alkyle facultativement substitué, alkyléne facultativement substitué, aryle facultativement substitué, alkyloxy, aryloxy, halogéno, amino facultativement protégé, aminohydroxy substitué, hydroxy protégé, oxo, thio, imino, mercapto facultativement substitué, un noyau hétérocyclique et un groupe hétéro-alkyle, et Y est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, et des groupes carboxy, halogénure de c onyle, halogénure de sulfonyle, carbo-alkoxy, carboxamido, carbo-aryloxy, cyano, carboximido, isocyanato, isothiocyanato, sulfo, N-succinimidylcarboxy et Nmaléimido.

40. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent est un thioester et le groupe partant est un gl de formule V-R"', dans laquelle V représente un groupe aliphatique ou aromatique et R"' représente un groupe qui est utile pour la fixation dudit groupement à un partenaire de liaison spécifique.

41. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 40, caractérisée en ce que le groupe partant est un groupe sulfonamido ou sulfocarbonyle.

42. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b]acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium.

43. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 42, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou du phénanthridinium.

44. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 43, caractérisée en ce que le substituant secondaire est choisi entre les groupes -OCH3 et -OCH2CH3.

45. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 42, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique porte au moins un substituant péri, en position péri par rapport à l'atome de carbone auquel est fixée la liaison.

46. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 45, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe alkyle ou aryle.

47. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 46, caractérisée en ce qu'au moins un substituant péri est un groupe -CH3.

48. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 47, caractérisée en ce que le groupe chimioluminescent est le N-méthyl-1,3-diméthyl-acridinium9-méthoxy-9-carboxylate de phényle.

49. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant l'une quelconque des revendications 28 à 48 et un partenaire de liaison spécifique.

50. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend la composition suivant la revendication 49.

51. Analyse par liaison spécifique destinée & déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un conjugué chimioluminescent comprenant un groupement chimioluminescent fixé å une matière à liaison spécifique et (il) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle & la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une format ion notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) du ou des produits de réaction de liaison spécifique contenant ledit conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans le ou les produits de réaction de liaison spécifique

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est située entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible à une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au moins un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagonal substitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison.

52. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement à l'analyte, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués d'un complexe analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe analyte-conjugué chimioluminescent.

53. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps réactionnel qui peut se lier spécifiquement (i) à l'analyste pour former un complexe analyte-corps réactionnel et (ii) à la matière à liaison spécifique pour former un complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe analyte-corps réactionnel et dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ;; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel ou (ii) du conjugué chimioluminescent non présent dans ledit complexe conjugué chimioluminescent-corps réactionnel.

54. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51, caractérisée en ce que la matière à liaison spécifique peut se lier spécifiquement & l'analyte, ladite analyse utilisant en outre un corps réactionnel pouvant se lier spécifiquement audit analyte pour former un complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, le ou les produits de réaction de liaison spécifique étant constitués dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent, ladite analyse consistant en outre

à permettre dans des conditions convenables une formation notable dudit complexe corps réactionnel-analyteconjugué chimioluminescent ; et

à mesurer la chimioluminescence (i) dudit complexe corps réactionnel-analyte-conjugué chimioluminescent ou (ii) du conjugué chimioluminescent non prés > ns ledit complexe corps réactionnel-analyte- conj. - mioluminescent.

55. Analyse par liaison spécifique destinée & déterminer la présence d'un analyte dans un échantillon, (i) ladite analyse utilisant un groupement chimioluminescent et (ii) la présence de l'analyte dans ledit échantillon étant proportionnelle à la formation d'un ou plusieurs produits de réaction de liaison spécifique ne conte pas ledit groupement chimioluminescent, ledit groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique, ladite analyse consistant

à permettre dans des conditions convenables une formation notable du ou des produits de réaction de liaison spécifique ; et

& mesurer la chimioluminescence dudit groupement ch ~luminescent provoquée par la formation du ou des produits de réaction de liaison spécifique

caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à choisir comme groupement chimioluminescent un ester, thioester ou amide dans lequel la liaison ester, thioester ou amide est situee entre

un noyau ou système cyclique hétérocyclique contenant un atome de carbone auquel est fixée ladite liaison, l'hétéro-atome présent dans ledit noyau ou système cyclique hétérocyclique étant à un état d'oxydation qui rend ledit atome de carbone sensible & une attaque par un peroxyde ou de l'oxygène moléculaire pour former un intermédiaire qui se dégrade pour engendrer une chimioluminescence ; et

un noyau ou système cyclique aryle, ledit noyau ou système cyclique aryle contenant au mc?s un noyau hexagonal substitué, ledit noyau hexagc ubstitué portant deux ou plus de deux substituants, au moins deux de ces substituants bloquant par encombrement stérique l'hydrolyse de ladite liaison.

56. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 55, caractérisée en ce qu'elle utilise en outre un corps reactionnel pouvant se lier à l'analyte pour former un complexe analyte-corps réactionnel, le groupement chimioluminescent entrant en chimioluminescence proportionnellement à la formation dudit complexe analyte-corps réactionnel.

57. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que chacun des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est choisi entre les groupes -CH3, -OCH3 et isopropyle.

58. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce qu'au moins l'un des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison est un groupe électrophile.

59. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, carractérisée en ce que le noyau hexagonal substitué porte au moins un substituant supplémentaire, en plus des substituants qui bloquent par encombrement stérique l'hydrolyse de la liaison, au moins un substituant supplémentaire étant un groupe électrophile.

60. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 59, caractérisée en ce qu'au moins un substituant supplémentaire est choisi entre les groupes -NO2, -SO2C1, -Br, -N(CH3)3+ et -H.

61. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 60, caractérisée en ce que le groupe électrophile est un groupe -H.

62. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est choisi entre les groupes phényle, naphtalène et anthracène.

63. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 62, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique aryle est un groupe phényle.

64. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que la somme des valeurs sigmap pour tous les substituants présents sur le groupe phényle, qui sont des groupes électrophiles, est inférieure ou égale à environ 1,0.

65. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

66. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

67. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupe chimioluminescent répond à la formule

68. Analyse. par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond i la formule

69. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

70.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

71. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

72. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond å la formule

73. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule :

74. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

75.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

76. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 63, caractérisée en ce que le groupement chimioluminescent répond à la formule

77.Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benzEa]acridinium, le benztb]- acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2azole, un cation imidazole, un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyri-: um, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthriainium et le quinoxalinium.

78. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 77, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le quinolinium et le .phénanthridinium.

79. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 78, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est 1 lacridinium.

80. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 51 ou 55, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite d'un membre choisi dans le groupe comprenant l'acridinium, le benz[a]acridinium, le benz[b)acridinium, le benz[c]acridinium, un cation 1,2,4-triazole, un cation isoxazole, un cation isothiazole, un cation 1,2-azole, un cation imidazole, .un cation benzimidazole, le quinolinium, l'isoquinolinium, le quinolizinium, un quinolinium à substitution cyclique, le pyridinium, le pyrimidinium, le pyridazinium, le pyrazinium, le phénanthridinium et le quinoxalinium.

81. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 80, caractérisée en ce que le noyau ou système cyclique hétérocyclique est une forme réduite de l'acridinium, du quinolinium ou dru phénanthridinium.

82. Analyse par liaison spécifique suivant Ia revendication 80, caractérisée en ce que l'atome de carbone porte un substituant choisi dans le groupe comprenant -H, un groupe -CN, un halogène, les groupes -OR, -NR2, -NR3+, -SR, -SR2+ et -S2R, R représentant un groupe alkyle, un groupe aryle, un amino-acide ou un sucre.

83. Analyse par liaison spécifique suivant la revendication 81, caractérisée en ce que le conjugué répond à la formule

84. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend le groupement chimioluminescent suivant l'une quelconque des revendications 51 à 83.

85. Composition suivant la revendication 84, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un partenaire de liaison spécifique lié au groupement.

86. Article manufacturé sous forme d'un kit d'analyse par liaison spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend un flacon contenant au moins la composition suivant la revendication 84 ou 85.