PT1712920E

PT1712920E - Diagnóstico precoce de doenças conformacionais

Info

Publication number: PT1712920E
Application number: PT06015975T
Authority: PT
Inventors: Claudio Soto-Jaro; Gabriela Saborio
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2009-04-09
Also published as: DK1712920T3; WO2002004954A3; CA2413078C; SK18582002A3; ES2322660T3; AU2001264089B2; BRPI0112262B1; BR0112262A; WO2002004954A2; DE60121958D1; CZ200336A3; BRPI0112262B8; NO20030059L; US7351526B2; IL153824A; JP2004503748A; CN1449497A; ATE426816T1; EP1299729B1; SK287768B6

Description

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DESCRIÇÃO "DIAGNÓSTICO PRECOCE DE DOENÇAS CONFORMACIONAIS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se com um método de diagnóstico ou de detecção de doenças conformacionais mediante o ensaio de um marcador (i.e. o conformador patogénico) de tais doenças numa amostra, cujo método compreende um sistema de amplificação cíclico para incrementar os níveis do conformador patogénico. Em particular, a doença conformacional é a Doença de Alzheimer. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As doenças conformacionais são um grupo de patologias aparentemente não relacionadas umas com as outras, mas partilhando uma semelhança notável nas manifestações clinicas que reflectem os seus mecanismos moleculares de iniciação e auto-associação partilhados, com consequente deposição e dano de tecido. 0 interesse estrutural é devido ao facto de que cada uma destas doenças variadas provém de uma transição conformacional aberrante numa proteína subjacente, originando caracteristicamente agregação proteica e deposição de tecido. Em termos médicos, a manifestação destas doenças conformacionais reflecte este mecanismo molecular, tipicamente com um início lento e insidioso quando a transição está a ocorrer numa proteína normal, mas com um início mais súbito quando ocorre numa variante instável da proteína. Dois exemplos de significado especial de tais doenças conformacionais são as Encefalopatias 2

Espongiformes Transmissíveis e a demência de Alzheimer, uma doença que ameaça saturar os sistemas de cuidados de saúde no mundo desenvolvido (para uma revisão ver Carrell et al., 1997) .

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE) também conhecidas como doenças de prião são um grupo de doenças neurodegenerativas que afectam seres humanos e animais. A doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), kuru, a doença de Gerstmann-Straussler-Scheiker (GSS) e a insónia familiar fatal (FFI) em seres humanos assim como o tremor epizoótico e a encefalopatia espongiforme bovina (BSE) em animais são algumas das doenças TSE (Prusiner, 1991).

Embora estas doenças sejam relativamente raras em seres humanos, o risco da transmissibilidade da BSE para os seres humanos através da cadeia alimentar captou a atenção das autoridades de saúde pública e da comunidade científica (Cousens et al., 1997, Bruce et al., 1997).

Estas doenças são caracterizadas por um período de incubação extremamente longo, seguido por uma doença clínica breve e invariavelmente fatal (Roos et al., 1973). Não existe, até à data, terapia disponível. A característica chave das doenças de prião é a formação de uma proteína conformada anormalmente designada PrPSc, que é uma versão modificada pós-translacionalmente de uma proteína normal, designada PrPc (Cohen e Prusiner, 1998). Não foram detectadas diferenças químicas para distinguir entre isoformas PrP (Stahl et al., 1993) e a conversão parece envolver uma variação conformacional através da qual o conteúdo helical α da proteína normal diminui e a 3 quantidade de folha β aumenta (Pan et al., 1993) . As variações estruturais são seguidas por alterações nas propriedades bioquímicas: a PrPc é solúvel em detergentes não desnaturantes, a PrPSc é insolúvel; a PrPc é prontamente digerida por proteases, enquanto que a PrPSc é parcialmente resistente, resultando na formação de um fragmento truncado terminalmente em N conhecido como a forma "PrPres" (Baldwin et al., 1995; Cohen e Prusiner, 1998), "PrP 27-30" (27-30 kDa) ou "PK-resistente" (resistente à proteinase K).

Presentemente não existe um diagnóstico preciso para as TSE (WHO Report, 1998, Budka et al., 1995, Weber et al., 1997). As tentativas de desenvolvimento de um teste de diagnóstico para as doenças de prião são dificultadas pela evidente carência de uma resposta imunológica à PrPSc. O diagnóstico clinico da CJD é actualmente baseado na combinação de demência progressiva sub-aguda (inferior a 2 anos), mioclono, e disfunção neurológica multifocal, associada a um electroencefalograma periódico caracteristico (EEG) (WHO Report, 1998, Weber et al., 1997). No entanto, na variante de CJD (vCJD), a maioria das formas iatrogénicas da CJD e até 40 % dos casos esporádicos não possuem anormalidades no EEG (Steinhoff et al., 1996). Em média a precisão do diagnóstico clinico é cerca de 60% para a CJD e altamente variável para outras doenças relacionadas com prião. O diagnóstico clinico é mais preciso somente no último estágio da doença quando já foram desenvolvidos sintomas claros (Weber et al., 1997). A análise genética é útil para o diagnóstico de doenças de prião herdadas, mas estas representam apenas 15 % dos casos. A imagiologia neurológica é útil apenas para excluir outros estados de demência rapidamente progressiva devido a 4 lesões estruturais do cérebro (Weber et al., 1997). As descobertas obtidas por imagiologia do cérebro por tomografia computorizada (CT) e imagiologia de ressonância magnética (MRI) dependem principalmente do estágio da doença. A CT é muito menos sensível e na fase precoce não é detectada atrofia em 80 % dos casos (Galvez e Cartier, 1983) . Foram detectados sinais hiperintensos de MRI nos gânglios basais para além de atrofia (Onofrji et al., 1993) . Tal como as variações observadas por CT, estas alterações não são de modo nenhum específicas.

Dados recentes identificaram várias proteínas neuronais, astrocíticas e gliais que são elevadas na CJD (Jimi et al., 1992). A proteína S-100, as isoenzimas específicas para neurónio e a ubiquitina são significativamente aumentadas no fluido cerebrospinal (CSF) na fase inicial da doença com concentrações decrescentes durante o curso da doença (Jimi et al., 1992) . Um marcador de morte neuronal, a proteína 14-3-3, foi proposta como um teste específico e sensível para a CJD esporádica (Hsich et al., 1996). No entanto, não é útil para o diagnóstico da vCJD, e muito menos específica nas formas genéticas. Como a proteína 14-3-3 poderá estar presente nos CSF de pacientes com outros estados, o teste não é recomendado por WHO como um rastreio geral para a CJD e é reservado para confirmar o diagnóstico clínico (WHO Report, 1998).

Por combinação dos dados clínicos com os marcadores bioquímicos é conseguido um êxito superior no diagnóstico. No entanto, de acordo com o diagnóstico operacional correntemente em utilização na European Surveillance da CJD, o diagnóstico definitivo é estabelecido apenas mediante o exame neuropatológico e a detecção da PrP quer 5 por imuno-histoquímica, histo-transferência ou transferência de western (Weber et al., 1997, Budka et al., 1995). A formação de PrPSc não é apenas a causa mais provável da doença, mas é também o melhor marcador conhecido. A detecção da PrPSc em tecidos e células correlaciona-se vastamente com a doença e com a presença de infecção por TSE, e os tratamentos que inactivam ou eliminam a infecção por TSE também eliminam a PrPSc (Prusiner, 1991) . A identificação da PrPSc em tecidos humanos ou animais é considerada a chave para o diagnóstico da TSE (WHO Report, 1998). Uma limitação importante a esta abordagem é a sensibilidade, uma vez que as quantidades de PrPSc são elevadas (suficientes para a detecção com métodos convencionais) apenas no CNS nos últimos estágios da doença. No entanto, foi demonstrado que em estágios mais iniciais da doença há uma distribuição generalizada da PrPSc (em pequenas quantidades), especialmente no sistema linfo-reticular (Aguzzi, 1997). De facto, foi relatada a presença da PrPSc no tecido tonsilar palatino e no apêndice obtido de pacientes com a vCJD (Hill et al., 1997). Embora não seja conhecido quanto precoce no decurso da doença tonsilar ou na biópsia do apêndice poderia ser utilizada no diagnóstico da vCJD, foi demonstrado que em ovelhas geneticalmente susceptíveis ao tremor epizoótico, a PrPSc poderia ser detectada no tecido tonsilar pré-sintomaticamente e logo no período de incubação. No entanto, até agora a PrPSc não foi detectada nestes tecidos em qualquer caso de CJD ou GSS esporádicas (Kawashima et al., 1997). 6 A proteína normal é expressa nos glóbulos brancos e nas plaquetas do sangue e consequentemente é possível que algumas células sanguíneas possam conter a PrPSc em indivíduos afectados (Aguzzi, 1997). Isto aumenta a possibilidade de uma análise sanguínea para a CJD, mas isto requereria um ensaio com um grau de sensibilidade muito maior do que aqueles correntemente disponíveis. A replicação do prião ocorre hipoteticamente quando a PrPSc no inoculo infectante interactua especificadamente com a

PrPc hospedeira, catalisando a sua conversão na forma patogénica da proteína (Cohen et al., 1994). Este processo ocorre desde muitos meses a anos para alcançar uma concentração de PrPSc suficiente para desencadear os sintomas clínicos. A unidade de infecção de PrPSc parece ser uma estrutura oligomérica rica em folha β, que converte a proteína normal mediante a sua integração no agregado crescente (Figura 1). A conversão foi mimada in vitro através da mistura de PrPc purificada com um excesso molar de 50 vezes da PrPSc previamente desnaturada (Kocisko et al., 1994).

Os sistemas de conversão in vitro descritos até hoje possuem uma eficiência baixa, uma vez que requerem um excesso de PrPSc e portanto não são úteis para os fins de diagnóstico uma vez que não podem monitorizar quantidades não detectáveis do marcador. A razão para a baixa eficiência é que o número de oligómeros da PrPSc (unidades de conversão) permanece fixo durante o decurso do ensaio. As unidades de conversão crescem sequencialmente pelos extremos e como consequência tornam-se maiores, mas não aumentam em número (Figura 1). 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Descobriu-se agora um método de diagnóstico ou de detecção da Doença de Alzheimer que é caracterizado por uma transição conformacional da proteína β-amilóide entre a forma não patogénica e a patogénica e em que a transição conformacional pode ser propagada desde a forma patogénica da proteína β-amilóide para uma forma não patogénica da proteína β-amilóide, através do ensaio de um marcador da referida doença numa amostra, cujo método compreende: (i) contactar a referida amostra com uma quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i); e (iii) determinar a presença e/ou quantidade da referida forma patogénica da proteína β-amilóide na amostra, sendo a forma patogénica um marcador da presença da referida doença; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida amostra/forma não patogénica da proteína β- amilóide e os passos (ia) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de levar a cabo 0 passo (iii). Preferencialmente, o ciclo é repetido desde 5 a 40 vezes, o mais preferencialmente 5-20 vezes antes de se levar a cabo o passo (iii). A Doença de Alzheimer é caracterizada por uma transição conformacional de uma proteína subjacente. Esta "proteína subjacente" é uma proteína que é capaz de adoptar uma conformação não patogénica e uma conformação patogénica. A referida proteína envolvida na doença de Alzheimer é a proteína amilóide. A quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide que é utilizada no passo (i) (e opcionalmente no passo (ib)) será geralmente uma quantidade conhecida, embora esta não seja necessária no caso de se desejar meramente estabelecer a presença ou ausência da forma patogénica da proteína β-amilóide.

Preferencialmente, a quantidade de forma não patogénica da proteína β-amilóide que é utilizada no passo (i) (e opcionalmente no passo (ib)) será uma quantidade em excesso. Geralmente, a razão inicial de forma não patogénica para forma patogénica (se presente na amostra) será superior a 100:1, preferencialmente superior a 1000:1 e o mais preferencialmente superior a 1000000:1.

Numa forma preferida de realização posterior da invenção, a forma não patogénica no passo (i) está presente num homogeneizado cerebral de um sujeito saudável e/ou poderá ser-lhe adicionada, antes de se realizar o passo (i); neste caso, portanto, o homogeneizado cerebral contendo um excesso (preferencialmente conhecido) da forma não patogénica da proteína β-amilóide é adicionado durante o passo (i) . Preferencialmente, o homogeneizado cerebral do sujeito saudável provém das mesmas espécies a partir das quais provém a amostra a ser analisada (e.g. homogeneizado cerebral humano para a amostra humana a ser analisada, homogeneizado cerebral de rato para a amostra de rato a ser analisada). Mais preferencialmente, a forma não patogénica da proteína β-amilóide está presente numa fracção específica do homogeneizado cerebral, por exemplo nas jangadas lipídicas do homogeneizado cerebral. A preparação de tais fracções pode ser levada a cabo por exemplo como descrito em Sargiacomo M et al. 1993. 9

Assim a invenção relaciona-se adicionalmente com um método ou ensaio como descrito aqui em que um tecido ou fracção de tecido é adicionado à forma não patogénica da proteina β-amilóide no passo (i). Preferencialmente, o tecido é tecido cerebral, ou um homogeneizado ou fracção dele derivada, de um sujeito saudável (i.e. um onde a forma patogénica da proteina β-amilóide não está presente).

Foi relatado (Kocisko et ai., 1994) que as formas menos glicosiladas de PrPc são preferencialmente convertidas na forma PrPSc. Em particular, a PrPc que foi tratada com fosofolipase C especifica de fosfatidilinositol foi rotineiramente mais eficientemente convertida na forma patogénica que a PrPc completa, mais fortemente glicosilada. É portanto aqui descrito um método ou ensaio adicional em que o conformador não patogénico é PrPc que possui um nivel de glicosilação reduzido (em particular glicosilação ligada a N) em comparação com a PrPc de tipo selvagem. Preferencialmente, a PrP° foi tratada para remover alguma, toda ou uma quantidade significativa da glicosilação antes da sua utilização como um conformador não patogénico nos métodos e ensaios descritos aqui; e mais preferencialmente, o conformador não patogénico é PrPc que é essencialmente não glicosilado.

No caso de diagnóstico de TSE, se estiverem presentes agregados da forma patogénica na amostra, durante o passo (i) irão induzir a transição PrPc^PrPSc e durante o passo (ii) tais agregados irão ser quebrados em unidades menores ainda não infecciosas, cada uma das quais é ainda capaz de induzir a conversão de outra PrPc. Este tipo de método é aqui designado "amplificação cíclica" e está representado 10 na Figura 2. Este sistema resulta num aumento exponencial da quantidade de PrPSc eventualmente presente na amostra que pode facilmente ser detectada. É portanto possível calcular a quantidade de PrPSc inicialmente presente na amostra partindo da quantidade conhecida de PrPc, determinando a quantidade de PrPSc presente na amostra no final do ensaio e considerando o número de ciclos realizados.

Se, pelo contrário, a PrPSc não estiver presente (quer como tal ou na forma de agregados) na amostra, nenhuma molécula de PrPc será convertida na PrPSc e no final do ensaio o marcador estará completamente ausente (nenhuma forma patogénica será detectada na amostra).

Foi mostrado que a unidade infecciosa da PrPSc é um oligómero rico em folha β, que pode converter a proteína normal mediante a sua integração no agregado crescente, quando adquire as propriedades associadas à forma anormal (resistência à protease e insolubilidade) Jarrett e Lansbury, Jr., 1993, Caughey et al., 1997). Após incubação as duas formas da PrP, a espécie oligomérica aumenta o seu tamanho por recrutamento e transformação de moléculas PrPc. Este processo possui eficiência baixa, uma vez que depende de um número fixo de oligómeros que crescem pelas extremidades. O número de unidades de conversão não é aumentado no decurso da reacção quando apenas se tornam maiores. É assumido que este processo é o acontece no corpo humano e no do animal após a infecção; um processo conhecido por demorar meses ou mesmo vários anos. Nesta invenção descreve-se um procedimento para quebrar os oligómeros noutros mais pequenos, cada um dos quais é em seguida capaz de converter a PrPc. 11

Portanto, o sistema tem aplicações directas no diagnóstico de doenças conformacionais, e em particular doenças conformacionais transmissíveis, tais como TSE por amplificação das quantidades de outro modo não detectáveis de PrPSc em diferentes tecidos ou fluidos biológicos. 0 sistema poderá permitir a identificação precoce de pessoas em risco de desenvolver TSE e poderá também ser muito útil para seguir bioquimicamente a eficácia dos compostos terapêuticos de TSE durante os ensaios clínicos.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção a amostra a ser analisada é sujeita a um passo de "pré-tratamento", que tem o propósito de "concentrar selectivamente" na amostra a forma patogénica da proteína β-amilóide que é para ser detectada.

No caso da TSE foi relatado que ambas a PrPc e a PrPSc estão localizadas numa região especial da membrana plasmática que é resistente a tratamento com detergente suave (tal como Triton X-100 arrefecido em gelo) devido ao teor relativamente elevado de colesterol e glicosfingolípidos (M. Vey et al., 1996) . Estes domínios de membrana são denominados jangadas lipídicas ou membranas resistentes a detergente (DRM) ou domínios tipo caveolae (CLDs) e são ricos em proteínas de sinalização, receptores e proteínas ancoradas com GPI. Confirmou-se que 100 % da PrPc no cérebro está ligada a esta fracção, que contém < 2 % da totalidade das proteínas (ver Exemplo 6 e Figura 7). Assim, o passo único de isolamento de jangadas lipídicas a partir da amostra permite um enriquecimento dramático em PrPc. Foram obtidos resultados semelhantes pelo Requerente no isolamento de jangadas lipídicas a partir de homogeneizado 12 cerebral com tremor epizoótico, no qual a PrPSc se recuperou nas jangadas.

Assim, uma forma de realização da invenção inclui um passo em que a amostra a ser analisada é sujeita a um passo de pré-tratamento para concentrar selectivamente a forma patogénica da proteína β-amilóide na amostra.

Os passos (i) e (ia) são preferencialmente realizados sob condições fisiológicas (pH, temperatura e força iónica) e, mais preferencialmente, são também adicionados à solução inibidores de protease e detergentes. As condições serão escolhidas de modo a permitir qualquer forma patogénica da proteína β-amilóide, se presente na amostra, converta a forma não patogénica da proteína β-amilóide na forma patogénica da proteína β-amilóide formando assim um agregado ou oligómeros de conformador patogénicos. As condições fisiológicas adequadas serão prontamente evidentes para aquelas pessoas peritas na técnica. A duração da incubação será durante um tempo que permitirá alguma, toda ou uma porção significativa da forma não patogénica da proteína β-amilóide seja convertida na forma patogénica da proteína β-amilóide, assumindo que a amostra contém alguma forma patogénica da proteína β-amilóide. 0 tempo será facilmente determinável por aquelas pessoas peritas na técnica. Preferencialmente, cada incubação será entre 1 minuto e 4 horas, o mais preferencialmente 30 minutos e 1 hora, e particularmente preferencialmente aproximadamente 60 minutos. 13 0 passo de incubação (ia) poderá também compreender o passo adicional (ib) que compreende a adição de uma quantidade adicional da forma não patogénica da proteína β-amilóide.

Podem ser utilizados vários métodos para desagregar os agregados durante o passo (ii) do método da presente invenção. Eles incluem: o tratamento com solventes (tais como dodecilsulfato de sódio, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, guanidina, ureia, trifluoroetanol, ácido trifluroacético diluído, ácido fórmico diluído, etc.), modificação das características físico-químicas da solução tais como pH, temperatura, força iónica, constante dieléctrica, e métodos físicos, tais como tratamento com ultra-sons, irradiação laser, congelação/descongelação, prensa tipo French, incubação em autoclave, pressão elevada, agitação, homogeneização moderada, outros tipos de irradiação, etc. 0 tratamento com ultra-sons é o método preferido de acordo com a invenção. A desagregação poderá ser levada a cabo durante um período que desagregue algum, todo ou uma porção significativa dos agregados que se formaram durante o passo (ii). Não é necessário que todos os agregados se desagreguem em qualquer um dos passos de desagregação. Deste modo, o número de unidades de conversão é aumentado em cada passo de desagregação. A duração da desagregação será prontamente determinável por aquelas pessoas peritas na técnica e poderá depender do método de desagregação utilizado. Preferencialmente, a desagregação é levada a cabo durante 1 segundo até 60 minutos, o mais preferencialmente 5 segundos até 30 minutos e particularmente preferencialmente, 5 segundos até 10 14 minutos. Se a desagregação for realizada por tratamento com ultra-sons, o tratamento com ultra-sons é preferencialmente durante 5 segundos até 5 minutos, e o mais preferencialmente durante 5 até 30 segundos. O tratamento com ultra-sons foi utilizado no passado como parte de vários métodos para purificar a PrP com o objectivo de aumentar a solubilidade de agregados grandes, mas nunca foi descrito para amplificar a conversão in vitro da PrP. A utilização de um aparelho de ultra-sons de sonda única tradicional impõe um problema para manusear muitas amostras simultaneamente, tal como um teste de diagnóstico irá requerer. Existem no mercado alguns aparelhos de ultra-sons de microplaca com formato de 96 poços, que proporcionam o tratamento com ultra-sons em todos os poços ao mesmo tempo e que podem ser programados para operação automática. Estes aparelhos de ultra-sons podem ser facilmente adaptados para serem utilizados no método de diagnóstico da presente invenção.

Assim uma forma de realização da invenção relaciona-se com a utilização, no passo (ii), de um aparelho de ultra-sons de poços múltiplos.

A detecção do conformador patogénico recentemente convertido, e.g. PrPSc (iii) após o procedimento de amplificação ciclica descrito nos passos (i) a (ii) poderia ser levado a cabo de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos. A detecção especifica da PrPSc é usualmente (mas não sempre, ver adiante) efectuada através de um primeiro passo de separação das duas isoformas PrP 15 (proteína normal e proteína patogénica). A separação é feita com base nas propriedades bioquímicas peculiares da PrPSc que a distinguem da maioria das proteínas normais do corpo, nomeadamente: a PrPSc é parcialmente resistente ao tratamento com protease e é insolúvel mesmo na presença de detergentes não desnaturantes. Portanto o primeiro passo após o procedimento de amplificação é usualmente a remoção ou a separação da PrPc da amostra, quer por tratamento com proteases ou por centrifugação para separar a proteína solúvel (PrPc) da insolúvel (PrPSc) . Em seguida, a detecção da PrPSc pode ser efectuada por qualquer um dos métodos seguintes, inter alia: A) Imuno-transferência após a SDS-PAGE. Isto é efectuado através de um procedimento de rotina bem conhecido por aquelas pessoas peritas na técnica e utilizando alguns dos muitos anticorpos anti-PrP comercialmente disponíveis. B) Ensaio Elisa. A detecção em fase sólida pode ser realizada quer por um simples ensaio no qual a amostra é carregada na placa e a quantidade de PrP é detectada em seguida mediante a utilização de anticorpos anti-PrP ou mais preferencialmente através da utilização de Elisa sandwich no qual a placa é previamente revestida com um anticorpo anti-PrP, que captura especificamente a PrP a partir da amostra, que é finalmente detectada através da utilização de um segundo anticorpo anti-PrP. Ambas as formas de Elisa podem também ser utilizadas com anticorpos anti-PrP marcados (radioactividade, fluorescência, biotina, etc.) para aumentar adicionalmente a sensibilidade da detecção. 16 C) Ensaios de radioactividade. A PrPc normal utilizada como um substrato para o procedimento de amplificação pode ser marcada radioactivamente (3H, 14C, 35S, 125I, etc.) antes do inicio do procedimento e após a remoção da PrPc não convertida, a radioactividade da PrPSc recentemente convertida poderá ser quantificada. Este procedimento é mais quantitativo e não se baseia na utilização de anticorpos. D) Ensaios de fluorescência. A PrPc normal utilizada como um substrato para o procedimento de amplificação pode ser marcada com sondas de fluorescência antes do inicio do procedimento e após a remoção da PrPc não convertida, a fluorescência da PrPSc recentemente convertida poderá ser quantificada. É possível que o ensaio de fluorescência possa não requerer a remoção da PrPc não convertida, porque as propriedades de fluorescência da PrPc e PrPSc poderão ser diferentes devido à conformação distinta das duas isoformas. E) Ensaios de agregação. É bem conhecido que a PrPSc (e não a PrPc) é capaz de se agregar formando fibrilhas amilóides ou estruturas tipo vara. Portanto a detecção de PrpSc poderia ser efectuada através da utilização dos métodos utilizados para quantificar a formação deste tipo de agregados, incluindo microscopia electrónica, tingimento com corantes específicos (vermelho do Congo, Tioflavina S e T, etc.), e ensaios turbidimétricos. Os ensaios de agregação não requerem o passo de separação das duas isoformas, porque é conhecido que a PrPc normal não se agrega. F) Ensaios estruturais. As diferenças mais importantes entre a PrP normal e a patogénica são as suas estruturas 17 secundárias e terciárias. Portanto, podem ser utilizados os métodos que permitem a avaliação estrutural de proteinas, incluindo RMN, Dicroismo circular, Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, Espectroscopia de Raman, fluorescência intrínseca, absorção de UV, etc. 0 anticorpo monoclonal PrP mais vastamente utilizado é o "3F4" (Kascsak et al., 1987), que é um anticorpo monoclonal derivado de um murganho imunizado com PrPres 263K de hamster (o conformador resistente à protease). Este anticorpo é também capaz de reconhecer o conformador não patogénico dos hamsters e seres humanos, mas não o dos cérebros de bovino, murganho, rato, ovelha ou coelho; é também capaz de se ligar ao conformador patogénico humano, mas apenas após a desnaturação da proteína.

Tais anticorpos poderão ser marcados para permitir a fácil detecção do marcador. Por exemplo foram utilizadas por alguns cientistas medidas de fluorescência de resolução no tempo com anticorpo 3F4 marcado com európio (Safar et al., 1998).

Os métodos de detecção descritos acima são utilizados de acordo com a invenção para a detecção de um conformador patogénico, i.e. a forma patogénica da proteína β-amilóide.

Numa forma de realização alternativa a forma não patogénica da proteína β-amilóide adicionada em excesso poderá ser marcada e detectável de modo que a quantidade da forma não agregada da proteína β-amilóide no final do ensaio irá permitir uma determinação da quantidade de forma patogénica da proteína β-amilóide presente inicialmente na amostra. 18

De acordo com uma forma de realização alternativa adicional, a forma patogénica da proteína β-amilóide (o marcador) poderá ser detectada directamente com um anticorpo dirigido contra ela.

Em termos mais abrangentes poderá ser adicionado um marcador ou uma unidade marcadora à forma patogénica da proteína β-amilóide, à forma não patogénica da proteína β-amilóide ou a um anticorpo contra uma das formas da proteína β-amilóide dependendo do tipo de ensaio que é realizado.

Outro objectivo da invenção é um ensaio para um marcador da Doença de Alzheimer que é caracterizado por uma transição conformacional da proteína β-amilóide entre uma forma não patogénica e uma patogénica e em que a transição conformacional pode ser propagada a partir da forma patogénica da proteína β-amilóide para uma forma não patogénica da proteína β-amilóide, na amostra, cujo ensaio compreende os passos seguintes: (i) contactar a referida amostra com uma quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i) ; e (iii) determinar a presença e/ou a quantidade da referida forma patogénica da proteína β-amilóide na amostra, sendo a forma patogénica um marcador para a presença da referida doença; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida amostra/ forma não patogénica da proteína β-amilóide e os passos (ia) e (ii) formar um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de levar a cabo o passo (iii) .

Preferencialmente, os ciclos são repetidos desde 5 a 40 vezes, e o mais preferencialmente 5 a 20 vezes. 19

Um objectivo adicional da presente invenção é um kit (conjunto) de diagnóstico para utilizar no ensaio especificado, que compreende uma quantidade conhecida da forma não patogénica da proteina β-amilóide, uma placa de micro-titulação de poços múltiplos e um aparelho de ultra-sons de poços múltiplos.

Utilizando o método da invenção, é possivel detectar 1 a 10 fg da forma patogénica da proteina β-amilóide inicialmente

_2Q presente numa amostra, que é equivalente a 3 até 30 x 10 moles. A amostra será geralmente uma amostra ou tecido biológico, e qualquer tal amostra ou tecido biológico pode ser ensaiado com o método da presente invenção. No caso de um tecido, o ensaio e o método da presente invenção poderão ser levados a cabo em homogeneizados ou directamente em amostras ex vivo. Os métodos e ensaios serão geralmente levados a cabo em amostras ex vivo ou in vivo.

Preferencialmente, a amostra é um fluido biológico, tal como sangue, linfa, urina ou leite; tecido cerebral, espinal-medula, tecido tonsilar ou tecido do apêndice; uma amostra derivada do sangue tal como células fantasma do sangue ou preparações da camada leuco-plaquetária; ou uma preparação de membrana plasmática tais como jangadas lipidicas, membranas resistentes ao detergente ou dominios tipo caveolae. A amostra poderá alternativamente ser uma composição compreendendo um composto (particularmente uma proteina) derivada de uma fonte humana ou animal, tal como a hormona do crescimento, ou um extracto de tecido, tal como o extracto pituitário. Uma tal composição de amostra 20 poderá estar contaminada com uma forma patogénica da proteína β-amilóide. A amostra poderá também compreender um produto ou bebida alimentar, ou uma porção de um produto ou bebida alimentar (quer destinada ao consumo humano ou ao consumo animal) de modo a estabelecer a presença ou a ausência da forma patogénica da proteína β-amilóide nesse produto ou bebida.

Preferencialmente, o conformador não patogénico adicionado no passo (i) será da mesma espécie que a amostra. Poderá, por exemplo, ser derivado de uma forma (e.g. tecido) saudável (i.e. não patogénica) da amostra biológica a ser testada. Alternativamente, a forma não patogénica da proteína β-amilóide poderá ser produzida sinteticamente ou recombinantemente, utilizando meios conhecidos na técnica.

Entender-se-á, no entanto, que a forma não patogénica da proteína β-amilóide não necessita estar na forma pura ou mesmo substancialmente pura. Na maioria dos casos, a forma não patogénica da proteína β-amilóide estará na forma de um tecido homogeneizado ou de uma sua fracção que contém a forma não patogénica relevante da proteína β-amilóide. Os exemplos preferidos incluem homogeneizados cerebrais e fracções derivadas a partir dos mesmos, e.g. jangadas lipídicas.

Preferencialmente, a amostra e/ou a forma não patogénica da proteína β-amilóide será de origem humana ou de um animal doméstico, e.g. uma vaca, ovelha, cabra ou gato.

Outro objectivo da presente invenção é providenciar um método para identificar um composto que modula a transição 21 conformacional da proteína α-amilóide entre uma forma não patogénica e uma patogénica, compreendendo: (1) contactar uma quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide com uma quantidade da forma patogénica da proteína β-amilóide (1) na presença do referido composto e (2) na ausência do referido composto; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i); e (iii) determinar a quantidade da forma patogénica da proteína β-amilóide (1) na presença do referido composto e (2) na ausência do referido composto; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida forma patogénica/não patogénica da proteína β-amilóide e os passos (ia) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii).

Se a quantidade de forma patogénica da proteína β-amilóide medida na presença do composto for superior à medida na ausência, significa que o composto é um factor que "catalisa" a transição conformacional; se tal quantidade for inferior, significa que o composto é um factor que inibe tal transição.

De acordo com o método acima, "identificar" deverá também ser interpretado como significando "examinar" uma série de compostos.

Um "marcador" ou "unidade marcadora" poderá ser qualquer composto empregue como um meio de detecção de uma proteína. 0 marcador ou a unidade de marcação poderá estar ligado à 22 proteína através de interacções iónicas ou covalentes, ligação de hidrogénio, interacções electrostáticas ou intercalação. Exemplos de marcadores e unidades de marcação incluem, mas não estão limitadas a conjugados de corantes fluorescentes, biotina, digoxigenina, radionucleótidos, substâncias, enzimas e receptores quimioluminescentes, tal que a detecção da proteína marcada seja através de fluorescência, conjugação a estreptavidina e/ou avidina, quantificação da radioactividade ou quimioluminescência, interacções catalíticas e/ou ligando-receptor. Preferencialmente é um marcador de fluorescência ou de fosforescência. 0 termo "doenças conformacionais" refere-se a um grupo de patologias derivadas de uma propagação de uma transição conformacional aberrante de uma proteína subjacente, originando agregação proteica e deposição de tecido. Tais doenças podem também ser transmitidas por uma variação conformacional induzida, propagada a partir de um conformador patogénico para o seu conformador normal ou não patogénico e neste caso são designadas aqui por "doenças conformacionais transmissíveis". Exemplos de tais tipos de doenças são as encefalopatias de prião, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e sua equivalente humana doença de Creutzfeld-Jakob (CJD) , na qual a proteína subjacente é a PrP. 0 termo "CJD esporádica" abreviado como "sCJD" refere-se à manifestação mais comum da Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Esta doença ocorre espontaneamente em indivíduos com uma idade média de aproximadamente 60 a uma taxa de 1 por milhão por ano de indivíduos por toda a terra. 23 0 termo "CJD iaterogénica" abreviado como "iCJD" refere-se à doença resultante de infecção acidental de pessoas com priões humano. O exemplo mais notado da mesma é a infecção acidental de crianças com priões humanos a partir de preparações contaminadas de hormona de crescimento humano. 0 termo "CJD familiar" refere-se a uma forma de CJD, que ocorre raramente em famílias e é inevitavelmente provocada por mutações do gene da proteína do prião humano. A doença resulta de uma patologia dominante autosomal. Os membros da família que herdam as mutações sucumbem à CJD. 0 termo "Doença de Gerstmann-Strassler-Scheinker" abreviada como "GSS" refere-se a uma forma herdada da doença de prião humano. A doença produz-se a partir de uma patologia dominante autosomal. Os membros da família que herdam o gene mutante sucumbem à GSS. 0 termo "prião" deverá significar uma partícula transmissível conhecida por provocar um grupo de tais doenças conformacionais transmissíveis (encefalopatias espongiformes) em seres humanos e em animais. O termo "prião" é uma contracção das palavras "proteína" e "infecção" e as partículas são constituídas em grande parte se não exclusivamente por moléculas PrPSc.

Os priões são distintos das bactérias, vírus e viróides. Os priões conhecidos incluem aqueles que infectam animais para provocar o tremor epizoótico, uma doença degenerativa, transmissível do sistema nervoso de ovelhas e cabras assim como as encefalopatias espongiformes bovina (BSE) ou doença das vacas loucas e encefalopatias espongiformes felina de gatos. Quatro doenças de prião conhecidas que afectam os 24 seres humanos são (1) kuru, (2) Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) Doença de Gerstmann-StrasslerScheinker (GSS), e (4) insónia familiar fatal (FFI). Como utilizado aqui prião inclui todas as formas de prião provocando todas ou qualquer uma destas doenças ou outras em quaisquer animais utilizados e em particular em seres humanos e em animais de quinta domesticados.

Os termos "gene PrP" e "gene de proteína de prião" são utilizados intervariavelmente aqui para descrever material genético que expressa as proteínas de prião e polimorfismos e mutações tais como aquelas listadas aqui sob um sub-título "Mutações Patogénicas e Polimorfismos". 0 gene PrP pode ser de qualquer animal incluindo os animais "hospedeiro" e "de teste" descritos aqui e qualquer um e todos os seus polimorfismos e mutações, sendo reconhecido que os termos incluem outros genes PrP diferentes que estão ainda por descobrir. 0 termo "gene PrP" refere-se geralmente a qualquer gene de qualquer espécie que codifica qualquer forma de sequências de um aminoácido PrP incluindo qualquer proteína de prião. Algumas sequências de PrP conhecidas são descritas em Gabriel et al., 1992, que é aqui incorporada por citação para revelar e descrever tais sequências.

As abreviações utilizadas aqui incluem: CNS para o sistema nervoso central; BSE para a encefalopatia espongiforme bovina; CDJ para a Doença de Creutzfeldt-Jakob; FFI para a insónia familiar fatal; GSS para a Doença de Gerstmann-Strassler-Scheinker;

PrP para a proteína de prião;

PrPG para a forma normal, não patogénica da PrP; 25

PrSc para a isoforma patogénica ou "tremor epizoótico" da PrP (que é também o marcador para as doenças de prião).

Mutações Patogénicas e Polimorfismos

Existe um número de mutações patogénicas conhecidas no gene PrP humano. Adicionalmente, existem polimorfismos conhecidos nos genes PrP dos seres humanos, ovelhas e bovinos. 0 que se segue é uma lista não limitante de tais mutações e polimorfismos:

TABELA DE MUTAÇÃO

Mutações humanas patogénicas

Inserção de 2-octa-repetições Inserção de 4-octa-repetições Inserção de 5-octa-repetições Inserção de 6-octa-repetições Inserção de 7-octa-repetições Inserção de 8-octa-repetições Inserção de 9-octa-repetições

Polimorfismos em seres humanos Codão 129 Met/val Codão 219 Glu/Lys

Polimorfismos em ovelhas Codão 171 Arg/Glu Codão 136 Ala/Val

Polimorfismos em bovinos 5 ou 6 octa-repetições

Mutações humanas patogénicas

Polimorfismos em seres humanos

Polimorfismos em ovelhas

Polimorfismos em bovinos

Codão 102 Pro-Leu Codão 105 Pro-Leu Codão 117 Ala-Val Codão 145 Stop Codão 178 Asp-Asn Codão 180 Val-Ile Codão 198 Phe-Ser Codão 200 Glu-Lys Codão 210 Val-Ile Codão 217 Asn-Arg Codão Met-Ala 26 A sequência de aminoácido normal, que ocorre na grande maioria dos indivíduos, é referida como a sequência de PrP tipo selvagem. Esta sequência tipo selvagem é sujeita a certas variações polimórficas características. No caso da PrP humana, produzem-se dois aminoácidos polimórficos nos resíduos 129 (Met/Val) e 219 (Glu/Lys) . A PrP das ovelhas possui dois polimorfismos de aminoácidos nos resíduos 171 e 136, enquanto que a PrP bovina tem quer cinco ou seis repetições de uma sequência motivo de oito aminoácidos na região terminal amino da proteína de prião madura. Enquanto que nenhum destes polimorfismos são em si mesmo patogénicos, parecem influenciar as doenças de prião. Diferentes destas variações normais da proteína de prião de tipo selvagem, foram identificadas certas mutações do gene PrP humano que alteram quer os resíduos de aminoácidos específicos de PrP ou o número de octa-repetições que se segregam com as doenças de prião humano herdadas.

De modo a providenciar um significado adicional à tabela anterior que mostra as mutações e os polimorfismos, pode-se fazer referência às sequências publicadas dos genes de PrP. Por exemplo, um gene PrP de frango, animal bovino, ovelha, rato e murganho é revelado e publicado em Gabriel et al., 1992. A sequência para o hamster Sírio é publicada por Baslet et al., 1986. 0 gene PrP de ovelha é publicado por Goldmann et al., 1990. A sequência do gene PrP para animal bovino é publicada por Goldmann et al., 1991. A sequência para o gene Prp de frango é publicada por Harris et al., 1991. A sequência do gene PrP para a marta é publicada em Kretzschmar et al., 1992. A sequência do gene PrP humano é publicada por Kretzschmar et al., 1986. A sequência do gene PrP para o murganho é publicada por Locht et al., 1986. A 27 sequência do gene PrP da ovelha é publicada por Westaway et al., 1994. Todas essas publicações revelam e descrevem o gene PrP e a sequência de aminoácidos de PrP. É também aqui descrito um método para detectar a presença de uma forma patogénica da proteina β-amilóide numa amostra (preferencialmente uma amostra de sangue ou cérebro), compreendo: (i) contactar a amostra com uma quantidade de proteina β-amilóide não patogénica; (ia)incubar a amostra/proteina β-amilóide não patogénica; (ii) desagregar qualquer agregado formado durante o passo (ia) ; repetir os passos (ia)-(ii) duas ou mais vezes; e em seguida (iii) determinar a presença e/ou a quantidade de proteina β-amilóide patogénica na amostra. É adicionalmente descrito um método para diagnosticar a doença de Alzheimer num paciente, compreendendo: tomar uma amostra (preferencialmente uma amostra de sangue ou de cérebro) do paciente; (i) contactar a amostra com uma quantidade de proteina β-amilóide não patogénica; (ia) incubar a amostra/ proteina β-amilóide não patogénica; (ii) desagregar quaisquer agregados formados durante o passo (ia);

Repetir os passos (ia)-(ii) duas ou mais vezes; e em seguida (iii) determinar a presença e/ou quantidade de proteina β-amilóide patogénica da amostra. 28 São também descritos aparelhos para utilizar nos métodos descritos acima, particularmente aparelhos compreendendo uma placa de micro-titulação, um aparelho de ultra-sons de poços múltiplos e uma quantidade de uma forma não patogénica de proteina β-amilóide. É descrito aqui um método para o diagnóstico detecção de uma doença conformacional, caracterizado por uma transição conformacional de uma proteina subjacente entre um conformador não patogénico e um patogénico, mediante o ensaio de um marcador da referida doença na amostra, cujo método compreende (i) contactar a referida amostra com uma quantidade conhecida de conformador não patogénico, (ii) desagregar os agregados eventualmente formados durante o passo (i) e (iii) determinar a presença e/ou a quantidade do referido conformador patogénico na amostra. Preferencialmente, os passos (i) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii) , mais preferencialmente os passos (i) e (ii) formam um ciclo, que é repetido desde 5 a 40 vezes antes de se levar a cabo o passo (iii). É aqui descrito um ensaio para um marcador de uma doença conformacional caracterizada por uma transição conformacional de uma proteina subjacente entre um conformador não patogénico e um patogénico, na amostra, cujo ensaio compreende os passos seguintes: (i) contactar a referida amostra com uma quantidade conhecida de conformador não patogénico, (ii) desagregar os agregados eventualmente formados durante o passo (i) e (iii) determinar a presença e/ou a quantidade do referido conformador patogénico na amostra. Preferencialmente, os 29 passos (i) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii). É descrito adicionalmente um método para identificar um composto que modula a transição conformacional de uma proteina subjacente entre um conformador não patogénico e um patogénico, compreendendo: (i) contactar uma quantidade conhecida do conformador não patogénico com uma quantidade conhecida do conformador patogénico na presença e na ausência do referido composto, (ii) desagregar os agregados eventualmente formados durante o passo (i), (iii) determinar a quantidade de conformador patogénico na presença e na ausência do referido composto. A invenção será agora ilustrada por meio dos Exemplos comparativos seguintes, que não se deverão considerar como limitantes de algum modo da presente invenção. Os Exemplos referir-se-ão às Figuras especificadas aqui adiante.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Representação esquemática da conversão PrPc —> PrPSc. A unidade infecciosa de PrPSc é um oligómero rico em folha β, que converte a PrPc através da sua integração no agregado crescente, onde adquire as propriedades associadas a PrPSc.

Figura 2. Representação diagramática do procedimento de amplificação cíclica. 0 sistema é baseado em ciclos de incubação de PrPSc na presença de excesso de PrPc seguidos de ciclos de tratamento com ultra-sons. Durante os periodos de incubação, a PrPSc oligomérica é aumentada por 30 incorporação de PrPc no agregado crescente, enquanto que durante o tratamento com ultra-sons os agregados são quebrados com a finalidade de multiplicar as unidades de conversão. Na figura, são mostrados dois ciclos de tratamento com ultra-sons/incubação.

Figura 3. Amplificação de PrPSc por ciclos de tratamento com ultra-sons. Uma pequena quantidade de homogeneizado de cérebro com tremor epizoótico contendo a PrPSc foi incubado com homogeneizado de cérebro de rato saudável (linha 1, experiência de controlo) ou com homogeneizado de cérebro de hamster saudável (linhas 2 e 3) . A última amostra foi dividida em dois grupos um dos quais foi sujeito a cinco ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons (linha 3). Metade das amostras acima foram carregadas directamente num gel e tingidas para determinar a proteína total com Coomasie (painel A) . A outra metade foi tratada com PK e submetida a imunotransferência utilizando o anticorpo anti-PrP 3F4 (painel B). O Painel C mostra alguns controles em que o homogeneizado de cérebro saudável foi incubado sozinho (linhas 1 e 2) ou na presença de homogeneizado de cérebro com tremor epizoótico diluído (linhas 3 e 4). Metade das amostras (linhas 2 e 4) foi sujeita a 5 ciclos de tratamento com ultra-sons/incubação. As linhas 2, 3 e 4 foram tratadas com proteinase K.

Figura 4. Sensibilidade do sistema de amplificação ciclica.

Foi estudada a concentração mínima de PrPSc que pode ser utilizada para a detecção após amplificação por diluição em série do homogeneizado de cérebro com tremor epizoótico e incubação com homogeneizado de cérebro de hamster saudável com ou sem tratamento com ciclos de ultra-sons. O painel A mostra a experiência de controlo em que o cérebro de 31 hamster com tremor epizoótico foi diluído em série num homogeneizado de cérebro de rato. 0 painel B corresponde à experiência em que diluições em série do cérebro de hamster com tremor epizoótico foram incubadas com cérebro de hamster saudável e sujeitas a 5 ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons. A avaliação densitométrica das imunotransferências em A e B é mostrada no painel C. As diluições foram feitas considerando como material de partida o cérebro e foram as seguintes: 100 (linha 1), 200 (linha 2), 400 (linha 3), 800 (linha 4), 1600 (linha 5) e 3200 (linha 6).

Figura 5. Relação entre o sinal de PrPres e o número de ciclos de amplificação. O homogeneizado de cérebro com tremor epizoótico diluído foi incubado com um excesso de homogeneizado de cérebro de hamster saudável. As amostras foram sujeitas a 0, 5, 10, 20 ou 40 ciclos e o sinal de PrPres foi avaliado por imunotransferência.

Figura 6. Amplificação de PrPSc em amostras de sangue. O sangue de rato tratado com heparina foi adicionado ao homogeneizado de cérebro de hamster com tremor epizoótico para se atingir uma diluição final de 10:1. Esta mistura foi incubada durante 15 min à TA. Foram feitas diluições em série 10 vezes deste material usando sangue de rato tratado com heparina. As amostras foram sujeitas a 11 ciclos de incubação - tratamento com ultra-sons e o sinal de PrPres foi avaliado por imunotransferência.

Figura 7: A proteína de prião está presente nas jangadas lipídicas. As jangadas lipídicas (também chamadas a fracção de membrana resistente a detergente ou DRM) foram isoladas utilizando uma modificação dos protocolos descritos 32 previamente. Cem mg de tecido cerebral foi homogeneizado em 1 ml de PBS contendo triton X-100 1 % e lx de cocktail completo de inibidores da protease (Boehringer). 0 tecido foi homogeneizado com 10 passagens através de uma agulha de seringa 22G e incubado durante 30 minutos a 4 °C num agitador rotativo. A amostra foi diluida 1:2 em sacarose a 60 % e colocada no fundo de um tubo de centrífuga. 7 mL de sacarose a 35 % foram colocados cuidadosamente sobre a amostra. 1,5 mL de sacarose a 15 % foram dispostos no topo do gradiente. O tubo foi sujeito a centrifugação a 150000 g durante 18 horas a 4o C. As jangadas lipidicas flutuam na interface da sacarose a 15 % - 35 % (painel A) . Foram recolhidas diferentes fracções e analisadas para determinar a proteína total por tingimento com nitrato de prata (painel B) e por imunotransferência para detectar a PrP (painel C) . Para remover a sacarose da amostra, a fracção de jangada lipídica foi recolhida por lavagem em PBS e sujeita a centrifugação a 28000 rpm durante 1 h a 4o C. A pastilha sólida foi lavada e ressuspensa em PBS contendo Triton X-1000 a 0,5 %, SDS a 0,5 % e inibidores de protease. Toda a PrPC foi localizada nesta fracção (painel D) .

Figura 8: Os factores necessários para a amplificação estão presentes nas jangadas lipidicas. As jangadas lipidicas foram isoladas a partir do cérebro de hamster saudável como descrito na Figura 2 e misturadas com PrPSc diluída 700 vezes altamente purificada a partir do cérebro de hamster com tremor epizoótico. As amostras foram quer congeladas (linha 3) ou amplificadas durante 20 h (linha 4). As linhas 1 e 2 representam os mesmos procedimentos mas utilizando homogeneizado de cérebro total para amplificação. 33

Figura 9: Detecção pré-sintomática de PrPSc no cérebro de hamster. Os hamsters foram inoculados intra-cerebralmente (i.c.) com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (grupo de controlo) ou com homogeneizado cerebral com tremor epizoótico diluido 100 vezes. Cada semana 4 hamsters por grupo foram sacrificados e os cérebros foram extraídos e homogeneizados. Metade das amostras foi congelada imediatamente (barras brancas) e a outra metade sujeita a 20 ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons (barrras negras). Todas as amostras foram tratadas com PK e sujeitas a imunotransferência. A intensidade das bandas foi avaliada por densitometria. Cada barra representa a média de amostras de 4 animais. Não foi observada detecção em qualquer dos cérebros de controlo quer com ou sem amplificação e estes resultados não são mostrados na Figura.

Figura 10: Amplificação de PrPSc humana. Os estudos foram realizados utilizando amostras de cérebro de 11 casos confirmados de CJD esporádica diferentes, bem como 5 de CJD familiar e 4 controlos emparelhados pela idade, que incluíram pacientes afectados por outras patologias neurológicas. O cérebro foi homogeneizado e sujeito a 20 amplificações de amostras. Os resultados representativos de um controlo (A) e três casos diferentes (1, 2, 3) de CJD esporádica (B) são mostrados na Figura.

Figura 11: Detecção de PrPSc no sangue após preparação de células fantasma do sangue. Foram preparadas células fantasma do sangue a partir de 0,5 mL de sangue tratado com heparina proveniente de hamsters saudáveis (C) e afectados com tremor epizoótico (Sc) como descrito no texto. Metade das amostras não foi sujeita a amplificação e a outra 34 metade foi misturada com homogeneizado de cérebro de hamster normal e sujeita a 20 ciclos de amplificação. Todas as amostras foram seguidamente tratadas com PK e analisadas por imunotransferências. É mostrada uma experiência representativa na Figura.

Figura 12: Detecção de PrPSc no sangue após extracção com sarcosil. 0,5 mL de sangue tratado com heparina proveniente de hamsters saudáveis (C) e afectados com tremor epizoótico (Sc) foram sujeitos a extracção com sarcosil como descrito no texto. Metade das amostras não foi sujeita a amplificação e a outra metade foi misturada com homogeneizado cerebral de hamster normal e sujeito a 20 ciclos de amplificação. Todas as amostras foram em seguida tratadas com PK e analisadas por imunotransferências. São mostradas na Figura uma amostra representativa de animais de controlo e duas de animais afectados com tremor epizoótico.

Figura 13: Detecção de PrPSc no sangue após purificação das jangadas lipidicas. As jangadas lipídicas foram extraídas como descrito no texto a partir de 0,5 mL de sangue tratado com heparina proveniente de hamsters saudáveis (C) e afectados com tremor epizoótico (Sc) . Metade das amostras não foi sujeita a amplificação e a outra metade foi misturada com homogeneizado cerebral de hamster normal e sujeito a 20 ciclos de amplificação. Todas as amostras foram seguidamente tratadas com PK e analisadas por imunotransferências. Uma amostra representativa de animais de controlo e duas de animais afectados com tremor epizoótico são mostradas na Figura. 35

Figura 14: Detecção de PrPSc no sangue após preparação da camada leuco-plaquetária. A fracção da camada leuco-plaquetária de sangue foi separada por centrifugação a partir de 0,5 mL de sangue tratado com heparina proveniente de hamsters saudáveis (C) e afectados com tremor epizoótico (Sc) . Metade das amostras não foi sujeita a amplificação e a outra metade foi misturada com homogeneizado cerebral de hamster normal e sujeito a 20 ciclos de amplificação. Todas as amostras foram seguidamente tratadas com PK e analisadas por imunotransferências. Uma experiência representativa é mostrada na Figura.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Amplificação de PrP resistente a PK por conversão cíclica in vitro. O homogeneizado cerebral de hamster extraído de animais com tremor epizoótico foi diluído até que o sinal de PrPSc foi apenas detectado por imunotransferência após tratamento com proteinase K (PK) (Figura 3B, linha 1). O tratamento com PK é feito rotineiramente no campo para distinguir entre as formas normal e anormal de PrP, que diferem na sua sensibilidade à degradação com protease (a PrPSc é parcialmente resistente e a PrPc degrada-se) (Prusiner, 1991). A forma de PrP que é resistente ao tratamento com PK será denominada a partir de agora PrPres. A incubação de uma amostra de homogeneizado cerebral com tremor epizoótico diluído com homogeneizado cerebral de hamster saudável, contendo um excesso de PrPc, resultou num incremento do sinal de PrPres (Figura 3B, linha 2). 36

Isto sugere que a incubação dos dois homogeneizados cerebrais resultou na conversão de PrPc em PrPSc. Quando as amostras foram incubadas sob as mesmas condições mas sujeitas a cinco ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons, a quantidade de PrPres foi incrementada dramaticamente (Figura 3B, linha 3). A análise densitométrica de imunotransferência indica que o sinal de PrPres foi incrementado 84 vezes por amplificação ciclica em comparação com o sinal de PrPres apresentado no homogeneizado diluido de cérebro afectado de tremor epizoótico (linha 1). A conversão está dependente da presença de PrPSc dado que não foi observada PrPres quando o homogeneizado cerebral de hamster normal foi incubado sozinho sob as mesmas condições quer com ou sem tratamento com ultra-sons (Figura 3C, linha 2). Para determinar os artefactos da transferência, a proteina total carregada no gel foi mantida constante (Figura 3A) por adição de homogeneizado cerebral de rato à amostra diluida com tremor epizoótico, tirando vantagem do facto de que a PrP de rato não é detectada pelo anticorpo utilizado para a imunotransferência. EXEMPLO 2

Sensibilidade da detecção por amplificação cíclica Para avaliar a concentração minima de PrPSc que pode ser utilizada para detecção após amplificação, o homogeneizado cerebral com tremor epizoótico foi diluído em série directamente em homogeneizado cerebral de hamster saudável. Sem incubação, o sinal de PrPres diminui progressivamente até ser completamente indetectável a uma diluição de 800 vezes (Figura 4A,C). Em contraste quando a mesma diluição foi incubada com homogeneizado cerebral de hamster saudável 37 e sujeita a 5 ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons, o limite de detecção de PrPres diminuiu drasticamente. Na realidade, foi facilmente detectado um sinal claro mesmo a uma diluição de 3200 vezes (Figura 4B,C) . EXEMPLO 3

Incremento exponencial em PrPres com o número de ciclos Para estudar se a intensidade do sinal de PrPres após o ciclo de amplificação depende do número de ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons realizados, o homogeneizado cerebral com tremor epizoótico diluído foi incubado com um excesso de homogeneizado cerebral de hamster saudável. As amostras foram sujeitas a 0, 5, 10, 20 ou 40 ciclos e o sinal de PrPres avaliado relativamente ao sinal de imunotransferência. Os níveis de PrPres aumentaram exponencialmente com o número de ciclos de incubação/tratamento com ultra-sons (Figura 5) . Este resultado sugere que o incremento do número de ciclos poderia diminuir adicionalmente os limites de detecção. EXEMPLO 4

Experiências de tratamento com ultra-sons em amostras de sangue por adição de PrPSc O sangue de rato tratado com heparina foi adicionado com homogeneizado cerebral de hamster com tremor epizoótico para atingir uma diluição final de 10:1. Esta mistura foi incubada durante 15 min à TA.

Foram efectuadas diluições em série de 10 vezes deste material usando sangue de rato tratado com heparina. 50 μΐ de cada diluição foram sujeitos a centrifugação a 3000 rpm durante 10 min. O plasma foi separado das pastilhas 38 sólidas. 10 μΐ de plasma foram misturados em 50 μΐ de homogeneizado cerebral de hamster saudável contendo o substrato de PrPc para reacção de conversão. As amostras foram sujeitas a 11 ciclos de incubação-tratamento com ultra-sons. Como um controlo as mesmas amostras foram misturadas em 50 μΐ de homogeneizado cerebral de hamster saudável e mantidas a -20 °C até serem necessárias. 15 μΐ de amostras de controlo foram digeridas com proteinase K, separadas por SDS-PAGE e analisadas por transferência de western e a PrPSc foi detectada como revelado na secção de "Métodos".

Os resultados são apresentados na Figura 6. Estes resultados mostram um claro aumento na detecção da proteína após o procedimento de amplificação, que é especialmente evidente à concentração mais baixa de PrPSc (por exemplo na diluição 1280). Se compararmos tais resultados com aqueles obtidos em tecidos de cérebro infectados temos a confirmação que o processo de amplificação trabalha de forma semelhante no sangue. EXEMPLO 5

Amplificação cíclica de elevado rendimento A utilização de um aparelho de ultra-sons tradicional de sonda única impõe um problema para o manuseamento de muitas amostras simultaneamente, como um método de diagnóstico requererá. Adaptou-se o sistema de amplificação cíclica a um aparelho de ultra-sons de microplaca com formato de 96 poços (Misonix 431MP- 20kHz), que proporcionou o tratamento com ultra-sons a todos os poços ao mesmo tempo e que pode ser programado para operação automática. Este melhoramento não só diminui o tempo de processamento, como também 39 previne a perda de material quando comparado com a utilização de uma sonda única. A contaminação cruzada é eliminada dado que não existe a intrusão directa da sonda na amostra. Esta última é essencial para o manuseamento de amostras infecciosas e minimizar os resultados positivos falsos. Vinte ciclos de 1 h de incubação seguidos por tratamento com impulsos de ultra-sons de 15 segundos ou 30 segundos originaram uma amplificação significativa do sinal de PrPres, semelhante ao observado previamente utilizando um aparelho de ultra-sons tradicional. EXEMPLO 6

Os factores necessários para amplificação estão numa fracção de membrana resistente ao detergente A localização sub-celular onde ocorre a conversão de PrP durante a patogénese da doença não está ainda elucidada. Contudo, foi relatado que ambas a PrPc e a PrPSc estão localizadas numa região especial da membrana plasmática que é resistente ao tratamento com detergentes suaves devido ao seu teor relativamente elevado de colesterol e glicosfingolipidos (Vey et al., 1996/ Harmey et al., 1995). Estes domínios de membrana são chamados jangadas lipídicas ou membranas resistentes a detergentes (DRM) e são ricos em proteínas de sinalização, receptores e proteínas ancoradas a GPI. Confirmou-se que 100 % da PrPc no cérebro está ligada a esta fracção, que contém < 2 % das proteínas totais (Figura 7). Assim, o simples passo de isolamento das jangadas lipídicas permite um enriquecimento espectacular na PrPc. Foram obtidos resultados semelhantes no isolamento de jangadas lipídicas do homogeneizado de cérebro com tremor epizoótico, em que a PrPSc foi recuperada nas jangadas. 40

Para avaliar se os factores necessários para amplificar a PrP estão contidos nas jangadas lipidicas, estas foram purificadas a partir do cérebro de animais saudáveis e adicionadas pequenas quantidades de PrPSc altamente pura extraida do cérebro de animais doentes. A amplificação nas jangadas lipidicas foi equivalente à obtida com o extracto de cérebro total (Figura 8), dado que a quantidade de PrPres produzida após amplificação for semelhante em ambas as condições. Este resultado indica que todos os elementos requeridos para a conversão e amplificação da PrP (incluindo o denominado "Factor X"; (Telling et al,. 1995)) estão contidos neste dominio de membrana especializado. Por conseguinte, a identificação e o isolamento dos factores necessários para a conversão da PrP deve ser possível pela separação adicional de proteínas das jangadas lipidicas e a monitorização da sua actividade por amplificação cíclica. Adicionalmente, as jangadas lipidicas constituem um substituinte possível para a utilização do homogeneizado de cérebro total no procedimento de amplificação cíclica como uma fonte do substrato de PrPc e de outros factores endógenos implicados na conversão. EXEMPLO 7

Diagnóstico pré-sintomático em animais experimentais Para estudar o diagnóstico pré-sintomático de hamsters infectados experimentalmente com o tremor epizoótico, avaliaram-se 88 amostras de cérebro em diferentes estágios durante a fase pré-clínica, metade dos quais foram controlos não infectados. O cérebro foi recolhido todas as semanas (4 por cada grupo) e sujeito a 20 ciclos de amplificação. Os resultados mostraram que o método é capaz de detectar a proteína anormal no cérebro mesmo na segunda semana após a inoculação, muito antes dos animais 41 desenvolverem quaisquer sintomas (Figura 9) . Sem a amplificação cíclica, a PrPSc foi detectada no cérebro às seis semanas após a infecção, apenas 4 semanas antes do aparecimento de doença clínica. Não foi detectada amplificação em qualquer dos animais de controlo que não foram infectados com o tremor epizoótico. EXEMPLO 8

Aplicação de amplificação cíclica a amostras de cérebro humano

Para analisar a aplicação do procedimento de amplificação cíclica a amostras humanas de cérebro de pessoas (cadáveres) afectados pela doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), incubaram-se homogeneizados de cérebro de diversos pacientes de CJD (ou controlos normais) com homogeneizado de cérebro humano saudável e levado a cabo sem o procedimento de amplificação cíclica. Os resultados mostram que existia uma amplificação significativa nas amostras de cérebro de CJD esporádica analisadas e em nenhuma nas 4 amostras de controlo (Figura 10). Interessantemente, a amplificação foi obtida apenas nas amostras que tinham mostrado ser infecciosas e assim capazes de converter a PrPc não mutada, enquanto que não funcionou quando a proteína mutante não é capaz de a proteína de tipo selvagem. Estes dados suportam a conclusão que o método funciona em amostra humanas de forma semelhante à mostrada anteriormente para as amostras animais. EXEMPLO 9

Diagnóstico no sangue por amplificação cíclica

Os estudos de infecção sugeriram que pelo menos em animais experimentais a PrPSc está presente no sangue de animais em 42 fase avançada (Brown et al., 2001). De modo a realizar uma detecção no sangue da PrPSc por amplificação ciclica, preferiu-se em primeiro lugar concentrar selectivamente a amostra na proteína a ser detectada e eliminar a maior parte das proteínas do sangue muito abundantes tais como a albumina ou a hemoglobina. Os seguintes quatro diferentes protocolos mostraram-se eficazes para este propósito. 1. Preparação de células fantasma do sangue O sangue de hamster tratado com heparina foi sujeito a centrifugação a 2500 rpm a 4 o C. O plasma e a fracção celular foram separados e congelados a —80° C até serem necessários. 0,5 mL de embalagem de células sanguíneas foram lavados 3 vezes em 12-15 vol de PBS fresco frio, pH 7,6. As células foram novamente suspensas em 12-15 vol de tampão de fosfato de sódio 20 mOsM pH 7,6 e agitadas suavemente durante 20 min em gelo, em seguida centrifugadas a 30000 rpm durante 10 min a 4o C. O sobrenadante foi eliminado, a pastilha sólida foi lavada 3 vezes em 20 mOsM de tampão de fosfato de sódio. A pastilha sólida final foi novamente suspensa em PBS contendo 0,5 % de Triton X-100, 0,5 % de SDS e inibidores da protease. 15 μΐ desta suspensão foi misturada v/v com 10 % de homogeneizado cerebral de hamster saudável e sujeito a 20 ciclos de incubação-tratamento com ultra-sons. 20 μΐ de amostras sujeitas a ultra-sons e de controlo foram digeridas com proteinase K, separadas por SDS-PAGE e analisadas por transferência de western e a PrPSc foi detectada como revelado na secção de "Métodos". Os resultados mostram a detecção de PrPSc após o procedimento de amplificação em amostras de sangue de animais infectados (Figura 11). Nas amostras de sangue de animais não infectados não existe 43 sinal após amplificação. Sem amplificação não é possível detectar a presença de PrPSc (Figura 11). 2. Extracção com sarcosil 0 sangue de hamster tratado com heparina foi sujeito a centrifugação a 2500 rpm a 4o C. 0,5 mL de embalagem de células sanguíneas foram diluídos (v/v) em 20 % de sarcosil e incubados durante 30 minutos. A amostra foi sujeita a centrifugação numa centrífuga Beckman TL100 e ultra centrifugada a 85000 rpm durante 2 horas a 4o C. A pastilha sólida foi lavada e ressuspensa em PBS contendo Triton X-100 a 0,5 %, SDS a 0,5 % de inibidores da protease. 15 μΐ desta suspensão foram misturadas v/v com 10 % de homogeneizado cerebral de hamster saudável e sujeitos a 20 ciclos de incubação-tratamento com ultra-sons. 20 μΐ de amostras tratadas com ultra-sons e de controlo foram digeridas com proteinase K, separadas por SDS-PAGE e analisadas por transferência de western e a PrPSc foi detectada como revelado na secção de "Métodos". Os resultados mostram a detecção de PrPSc após o procedimento de amplificação em amostras de sangue de animais infectados (Figura 12). Nas amostras de sangue a partir de animais não infectados não existe sinal após a amplificação. Sem amplificação não é possível detectar a presença de PrPSc (Figura 12). 3. Extracção da jangada lipídica

O sangue de hamster tratado com heparina foi sujeito a centrifugação a 2500 rpm a 4o C. 0,5 mL de embalagem de células sanguíneas foram diluídos (v/v) em PBS com Triton X-100 a 1 % e incubados durante 30 minutos a 4 o C. A amostra foi diluída 1:2 em sacarose a 60 % e colocada no fundo de um tubo de centrífuga. 7 mL de sacarose a 35 % 44 foram colocados cuidadosamente sobre a amostra. 1,5 mL de sacarose a 15 % foi distribuída na parte superior do gradiente. 0 tubo foi sujeito a centrifugação a 150000 rpm durante 18 horas a 4 o C. As jangadas lipídicas foram recuperadas e lavadas em PBS e sujeitas a centrifugação a 28000 rpm durante 1 h a 4o C. A pastilha sólida foi lavada e ressuspensa em PBS contendo Triton X-1000 a 0,5 %, SDS a 0,5 % e inibidores da protease. 15 μΐ desta suspensão foram misturados v/v com 10 % de homogeneizado cerebral de hamster saudável e sujeitos a 20 ciclos de incubação-tratamento com ultra-sons. 20 μΐ das amostras sujeitas a ultra-sons e de controlo foram digeridas com proteinase K, separadas por SDS-PAGE e analisadas por transferência de western e a PrPSc foi detectada como revelado na secção de "Métodos". Os resultados mostraram a detecção de PrPSc após o procedimento de amplificação em amostras de sangue de animais infectados (Figura 13) . Em amostras de sangue de animais não infectados não há sinal após a amplificação. Sem amplificação não é possível detectar a presença de PrPSc (Figura 13). 4. Preparação da camada leuco-plaquetária O sangue de hamster tratado com heparina foi sujeito a centrifugação a 1500 rpm a 4o C durante 10 min. A camada leuco-plaquetária foi recuperada cuidadosamente utilizando procedimentos comuns e mantida a -80° C até ser necessária. A camada leuco-plaquetária congelada foi ressuspensa em PBS contendo Triton X-100 a 5 %, SDS a 0,5 % e inibidores da protease. 15 μΐ desta suspensão foram misturados v/v com 10 % de homogeneizado de cérebro de hamster saudável e sujeitos a 20 ciclos de incubação-tratamento com ultra-sons. 20 μΐ de amostras sujeitas a ultra-sons e de 45 controlo foram digeridas com proteinase K, separadas por SDS-PAGE e analisadas por transferência de western e a PrpSo foi detectada como revelado na secção de "Métodos". Os resultados mostram a detecção de PrPSc após o procedimento de amplificação no sangue de amostras de animais infectados (Figura 14). Em amostras de sangue de animais não infectados não há sinal após a amplificação. Sem amplificação não é possível detectar a presença de PrPSc (Figura 14) .

MÉTODOS

Preparação de homogeneizados cerebrais.

Foram obtidos cérebros de hamsters dourados Sírios saudáveis ou infectados com a estirpe de tremor epizoótico adaptada 263 K após decapitação e congelamento imediato em gelo seco e mantidos a -80° C até serem utilizados. Os cérebros foram homogeneizados em PBS e inibidores da protease (p/v) a 10 %. Foram adicionados detergentes (0,5 % de Triton X-100, 0,05 % de SDS) e clarificados com centrifugação a baixa velocidade (10000 rpm) durante 1 min.

Preparação das amostras e amplificação cíclica.

Foram feitas diluições em série de homogeneizado cerebral com tremor epizoótico directamente no homogeneizado cerebral saudável. 30 μΐ destas diluições foram incubados a 31° C com agitação. Em cada hora foi efectuado um ciclo de tratamento com ultra-sons (5 impulsos de 1 segundo cada) utilizando um micro-aparelho de ultra-sons com a agulha imersa na amostra. Estes ciclos foram repetidos várias vezes (5-20).

Detecção de PrPSc. 46

As amostras foram digeridas com 100 μg/ml de PK durante 90 min a 37° C. A reacção foi interrompida com PMSF 50 mM. As amostras foram separadas por SDS-PAGE (sob condições de desnaturação) e foram sujeitas a electro-transferência em membrana de nitrocelulose em tampão de transferência de CAPS ou tris-glicina com 10 % de metanol durante 45 min a 400 mA. O tingimento da proteína total reversível foi realizada antes do bloqueamento da membrana com 5 % de leite desnatado. Depois disto, a membrana foi incubada durante 2 horas com o anticorpo monoclonal 3F4 (1:50000).

Foram realizadas quatro lavagens de 5 min cada com PBS, Tween 2 0 a 0,3 % antes da incubação com a peroxidase de rábano marcada com anticorpos anti-rato secundários (1:5000) durante 1 h. Após lavagem, a reactividade na membrana foi desenvolvida com o kit (conjunto) de quimiolumenescência ECL (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante.

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Lisboa, 31 de Março de 2009

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de diagnóstico ou de detecção da Doença de Alzheimer que é caracterizado por uma transição conformacional da proteína β-amilóide entre a forma não patogénica e a patogénica e em que a transição conformacional pode ser propagada desde a forma patogénica da proteína β-amilóide para uma forma não patogénica da proteína β-amilóide, através do ensaio de um marcador da referida doença numa amostra, cujo método compreende: (i) contactar a referida amostra com uma quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i) ; e (iii) determinar a presença e/ou quantidade da referida forma patogénica da proteína β-amilóide na amostra, sendo a forma patogénica um marcador da presença da referida doença; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida amostra/forma não patogénica da proteína β-amilóide e os passos (ia) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii). 2. 0 método da reivindicação 1, em que o ciclo é repetido desde 5 a 40 vezes antes de se levar a cabo o passo (iii).

3. O método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que passo (i) é levado a cabo sob condições fisiológicas.

4. O método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a quantidade da forma não patogénica no passo (i) é uma quantidade em excesso. 2 5. 0 método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a amostra a ser analisada é sujeita a um pré-tratamento para concentrar selectivamente a forma patogénica na amostra.

6. Um ensaio para um marcador da Doença de Alzheimer que é caracterizado por uma transição conformacional da proteina β-amilóide entre a forma não patogénica e a patogénica e em que a transição conformacional pode ser propagada a partir de uma forma patogénica da proteina β-amilóide para uma forma não patogénica de β-amilóide proteina, numa amostra, cujo ensaio compreende os passos seguintes: (i) contactar a referida amostra com uma quantidade da forma não patogénica da proteina β-amilóide; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i); e (iii) determinar a presença e/ou quantidade da referida forma patogénica da proteina β-amilóide na amostra, sendo a forma patogénica um marcador da presença da referida doença; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida amostra/forma não patogénica da proteina β-amilóide e os passos (ia) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii).

7. Um kit (conjunto) de diagnóstico para utilizar no ensaio da reivindicação 6 que compreende uma quantidade conhecida da forma não patogénica da proteina β-amilóide, uma placa de micro-titulação de poços múltiplos e um aparelho de ultra-sons de poços múltiplos. 3

8. Um método para identificar um composto que modula a transição conformacional da proteína β-amilóide entre uma forma não patogénica e uma patogénica, compreendendo: (i) contactar uma quantidade da forma não patogénica da proteína β-amilóide com uma quantidade da forma patogénica da proteína β-amilóide (1) na presença do referido composto e (2) na ausência do referido composto; (ii) desagregar quaisquer agregados eventualmente formados durante o passo (i); e (iii) determinar a quantidade da forma patogénica da proteína β-amilóide (1) na presença do referido composto e (2) na ausência do referido composto; em que o passo (i) compreende o passo (ia) de incubação da referida forma patogénica/ não patogénica da proteína β-amilóide e os passos (ia) e (ii) formam um ciclo que é repetido pelo menos duas vezes antes de se levar a cabo o passo (iii). Lisboa, 31 de Março de 2009