ES2322660T3 - Diagnostico precoz de enfermedades conformacionales. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico o detección de la enfermedad de Alzheimer que se caracteriza por una transición conformacional de una proteína a-amiloide entre una forma no patogénica y una patogénica y en el que la transición conformacional se puede propagar desde una forma patogénica de proteína a-amiloide a una forma no patogénica de proteína a-amiloide, mediante el ensayo de un marcador de dicha enfermedad dentro de una muestra, el cual método comprende: (i) poner en contacto dicha muestra con una cantidad de la forma no patogénica de proteína a-amiloide; (ii) desagregar cualesquiera agregados formados finalmente durante la etapa (i); y (iii) determinar la presencia y/o la cantidad de dicha forma patogénica de proteína a-amiloide dentro de la muestra, siendo la forma patogénica un marcador para la presencia de dicha enfermedad, en el que la etapa (i) comprende la etapa (ia) de incubación de dicha muestra/forma no patogénica de proteína aamiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa (iii).
Description
Diagnóstico precoz de enfermedades
conformacionales.
La presente invención se refiere a un método
para el diagnóstico o detección de enfermedades conformacionales
mediante el ensayo de un marcador (es decir del conformador
patogénico) de dichas enfermedades dentro de una muestra, el cual
método comprende un sistema de amplificación cíclico para
incrementar los niveles del conformador patogénico. En particular,
la enfermedad conformacional es la enfermedad de Alzheimer.
Las enfermedades conformacionales son un grupo
de trastornos aparentemente no relacionados unos con otros, pero
que participan de una similitud sorprendente en sus presentaciones
clínicas que reflejan sus mecanismos moleculares compartidos de
iniciación y de auto-asociación, con la consiguiente
deposición y daño del tejido.
El interés estructural se debe al hecho de que
estas variadas enfermedades se originan cada una a partir de una
transición conformacional anormal en una proteína subyacente, que da
lugar característicamente a una agregación de la proteína y a la
deposición del tejido. Médicamente, la presentación de estas
enfermedades conformacionales refleja este mecanismo molecular,
típicamente con un inicio lento e insidioso cuando la transición se
está produciendo en una proteína normal, pero un inicio más súbito
cuando ella se produce en una variante inestable de la proteína.
Dos ejemplos de especial significado de dichas enfermedades
conformacionales son las encefalopatías espongiformes transmisibles
y la demencia de Alzheimer, una enfermedad que amenaza saturar los
sistemas de cuidado de la salud en el mundo desarrollado (para una
revisión véase Carrel y colaboradores, 1977).
Las encefalopatías espongiformes transmisibles
(TSE) conocidas también como enfermedades de prión son un grupo de
enfermedades neuro-degenerativas que afectan a los
seres humanos y a los animales. La enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD), kuru (infección viral
progresiva y fatal), la enfermedad de
Gerstmann-Straussler-Scheiker (GSS)
y el insomnio fatal familiar (FFI) en los seres humanos así como
también la escrapia (enfermedad vírica de las ovejas) y la
encefalopatía espongiforme bovina (BSE) en los animales son algunas
de las enfermedades TSE (Prusiner, 1991).
Aunque estas enfermedades son relativamente
raras en los seres humanos, el riesgo de la capacidad de transmisión
de la BSE a los seres humanos a través de la cadena alimenticia ha
llamado la atención de las autoridades de la salud pública y de la
comunidad científica (Cousens y colaboradores, 1997, y Bruce y
colaboradores, 1997).
Estas enfermedades se caracterizan por un
período de incubación extremadamente prolongado, seguido de una
breve e invariablemente enfermedad clínica fatal (Roos y
colaboradores, 1973), Hasta la fecha no se dispone de ninguna
terapia.
La característica clave de la enfermedad es la
formación de una proteína anormalmente conformada denominada
PrP^{Sc}, la cual es una versión modificada
post-traducción de una proteína normal, denominada
PrP^{C} (Cohen y Prusiner, 1998). No se han detectado diferencias
químicas para distinguir entre las isoformas PrP (Stahl y
colaboradores, 1993) y la conversión parece implicar un cambio
conformacional por medio del cual el contenido en hélice \alpha
de la proteína normal disminuye y la cantidad de lámina \beta se
incrementa (Pan y colaboradores, 1993). Los cambios estructurales
van seguidos de alteraciones en las propiedades bioquímicas: la
PrP^{C} es soluble en los detergentes no desnaturalizantes,
mientras que la PrP^{Sc} es insoluble; la PrP^{C} es fácilmente
digerida por las proteasas, mientras que la PrP^{Sc} es
parcialmente resistente, lo que da lugar a la formación de un
fragmento truncado terminalmente en N conocido como "PrPres"
(Baldwin y colaboradores, 1995; Cohen y Prusiner, 1998), "PrP
27-30" (27-30 kDa) o forma
"resistente a PK" (resistente a la proteinasa K).
En el momento presente no se dispone de un
diagnóstico seguro de la TSE (WHO Report, Budka y colaboradores,
1995, y Weber y colaboradores, 1997): Los intentos para desarrollar
un ensayo diagnóstico para las enfermedades de prión son
dificultados por la evidente carencia de una respuesta inmune a la
PrP^{Sc}. El diagnóstico clínico de la CJD se basa actualmente en
la combinación de la demencia progresiva subaguda (menos de 2 años),
mioclono, y disfunción neurológica multifocal, asociada con un
electroencefalograma (EEG) periódico característico (WHO Report,
1998, Weber y colaboradores, 1997). Sin embargo, la variante de CJD
(vCJD), la mayor parte de las formas iatrogénicas de la CJD y hasta
un 40% de los casos esporádicos no presentan anormalidades en el
EEG (Steinhoff y colaboradores, 1996). Como promedio la seguridad
del diagnóstico clínico es de alrededor del 60% para la CJD y
altamente variable para las otras enfermedades relacionadas con los
priones. El diagnóstico clínico es más seguro sólo en la etapa
avanzada de la enfermedad cuando se han desarrollado claros síntomas
(Weber y colaboradores, 1997).
El análisis genético es útil para el diagnóstico
de las enfermedades de prión heredadas, pero este representa sólo
un 15% de los casos. La neuro-imagen es útil sólo
para excluir otros estados de demencia rápidamente progresiva
debido a las lesiones estructurales del cerebro (Weber y
colaboradores, 1997). Los hallazgos obtenidos por imagen del
cerebro mediante tomografía computerizada (CT) e imagen por
resonancia magnética (MRI) dependen principalmente de la fase de la
enfermedad. La CT es mucho menos sensible y en la fase inicial no se
detecta atrofia en un 80% de los casos (Galvez y Cartier, 1983). Se
han detectado señales hiperintensas de MRI en los ganglios basales
además de atrofia (Onofrji y colaboradores, 1993). Al igual que con
los cambios observados mediante CT, estas alteraciones no son en
modo alguno específicas.
Datos recientes han identificado varias
proteínas neuronales, astrocíticas, y gliales que están elevadas en
las CJD (Jimi y colaboradores, 1992). La proteína
S-100, la isoenzima específica de la neurona y la
ubiquitina están significativamente incrementadas en el fluido
espinal cerebral (CSF) en la fase inicial de la enfermedad con
concentraciones decrecientes a lo largo del curso de la enfermedad
(Jimi y colaboradores, 1992). Un marcador de la muerte neuronal, la
proteína 14-3-3, ha sido propuesto
como un ensayo específico y sensible para la CJD esporádica (Hsich
y colaboradores, 1996). Sin embargo, no es útil para el diagnóstico
de la vCJD, y mucho menos específico en las formas genéticas. Como
la proteína 14-3-3 puede estar
presente en el CSF (fluido espinal cerebral) de pacientes con otras
afecciones, el ensayo no está recomendado por WHO como un examen
general para la CJD y se reserva para confirmar el diagnóstico
clínico (WHO Report, 1998).
Mediante la combinación de los datos clínicos
con los marcadores bioquímicos se consigue un éxito más elevado en
el diagnóstico. Sin embargo, de acuerdo con el diagnóstico
operacional actualmente en uso en la European Surveillance de la
CJD, el diagnóstico definitivo se establece sólo mediante el examen
neuropatológico y la detección de la PrP^{Sc} bien mediante
inmuno-histoquímica,
histo-transferencia o transferencia Western (Weber
y colaboradores, 1997, y Budka y colaboradores, 1995).
La formación de PrP^{Sc} no es solo la causa
la más probable de la enfermedad, sino que es también el mejor
marcador conocido. La detección de PrP^{Sc} en los tejidos y en
las células se correlaciona ampliamente con la enfermedad y con la
presencia de infección por TSE, y los tratamientos para inactivar o
eliminar la infección por TSE eliminan también la PrP^{Sc}
(Prusiner, 1991). La identificación de PrP^{Sc} en los tejidos de
los seres humanos o de los animales se considera clave para el
diagnóstico de la TSE (WHO Report, 1998). Una importante limitación
a este método es la sensibilidad, puesto que las cantidades de
PrP^{Sc} son elevadas (suficientes para su detección por los
métodos convencionales) sólo en el CNS (sistema nervioso central)
en las etapas más avanzadas de la enfermedad. Sin embargo, se ha
demostrado que en las etapas iniciales de la enfermedad existe una
distribución generalizada de PrP^{Sc} (en bajas cantidades),
especialmente en el sistema linfo-reticular
(Aguzzi, 1997). En verdad, se ha informado de la presencia de
PrP^{Sc} en el tejido tonsilar del paladar y en el apéndice
obtenido de pacientes con vCJD (Hill y colaboradores, 1977). Aunque
no se conoce cuán temprano en el curso de la enfermedad tonsilar o
en la biopsia del apéndice podría ser usada en el diagnóstico de la
vCJD, se ha mostrado que en las ovejas genéticamente susceptibles a
la escrapia, la PrP^{Sc} podría ser detectada en el tejido
tonsilar pre-sintomáticamente y pronto en el período
de incubación. Sin embargo, la PrP^{Sc} no se ha detectado en
estos tejidos hasta ahora en cualesquiera casos de CJD o GSS
esporádicas. (Kawashima y colaboradores, 1997).
La proteína normal se expresa en los glóbulos
blancos y en las plaquetas de la sangre y por lo tanto es posible
que algunas células sanguíneas puedan contener PrP^{Sc} en
individuos afectados (Aguzzi, 1997). Esto aumenta la posibilidad de
un análisis de sangre para la CJD, pero esto requeriría un ensayo
con un mucho mayor grado de sensibilidad que los actualmente
disponibles.
La replicación del prión se produce
hipotéticamente cuando la PrP^{Sc} en el inóculo infectante
interactúa específicamente con la PrP^{Sc} huésped, catalizando
su conversión en la forma patogénica de la proteína (Cohen y
colaboradores, 1994). Este proceso tiene lugar durante muchos meses
a años para alcanzar una concentración de PrP^{Sc} suficiente
para activar los síntomas clínicos.
La unidad de infección de la PrP^{Sc} parece
ser una estructura oligomérica rica en lámina \beta, que
convierte la proteína normal mediante su integración en el agregado
creciente (Figura 1). La conversión ha sido imitada in vitro
mediante la mezcla de PrP^{C} purificada con un exceso molar de 50
veces de la PrP^{Sc} previamente desnaturalizada (Kocisko y
colaboradores, 1994).
Los sistemas de conversión in vitro
descritos hasta ahora tienen una eficacia baja, puesto que ellos
requieren un exceso de PrP^{Sc} y por lo tanto no son útiles para
los propósitos de diagnóstico debido a que ellos no pueden
controlar cantidades indetectables del marcador. La razón para la
baja eficacia es que el número de oligómeros de PrP^{Sc}
(unidades de conversión) permanece fijo a través del curso del
ensayo. Las unidades de conversión crecen secuencialmente por los
extremos y como consecuencia ellas llegan a ser más grandes, pero
no se incrementa su número (Figura 1).
Los autores de la invención han encontrado ahora
un método para el diagnóstico o detección de la enfermedad de
Alzheimer, el cual se caracteriza por una transición conformacional
de proteína \beta-amiloide entre una forma no
patogénica y una patogénica y en el que la transición
conformacional se puede propagar desde una forma patogénica de
proteína \beta-amiloide a una forma no patogénica
de proteína \beta-amiloide mediante el ensayo de
un marcador de dicha enfermedad dentro de una muestra, método que
comprende:
(i) poner en contacto dicha muestra con una
cantidad de la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide;
(ii) desagregar cualesquiera agregados formados
finalmente durante la etapa (i); y
(iii) determinar la presencia y/o la cantidad
de dicha forma patogénica de proteína
\beta-amiloide dentro de la muestra, siendo la
forma patogénica un marcador de la presencia de dicha enfermedad; en
el que la etapa (i) comprende la etapa (ia) de incubación de dicha
muestra/forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii). Preferiblemente, el ciclo se repite desde 5 a 40 veces, y lo
más preferiblemente 5-20 veces antes de llevar a
cabo la etapa (iii)..
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La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por
una transición conformacional de una proteína subyacente. Esta
"proteína subyacente" es una proteína que es capaz de adoptar
una conformación no patogénica y una conformación patogénica. Dicha
proteína implicada en la enfermedad de Alzheimer es la proteína
\beta-amiloide.
La cantidad de la forma no patogénica de
proteína \beta-amiloide que se utiliza en la etapa
(i) (y opcionalmente en la etapa (ib)) será generalmente una
cantidad conocida, aunque esto no necesita ser el caso si uno
meramente desea establecer la presencia o la ausencia de la forma
patogénica de proteína \beta-amiloide.
Preferiblemente, la cantidad de forma no
patogénica de proteína \beta-amiloide que se usa
en la etapa (i) (y opcionalmente en la etapa (ib)) será una
cantidad en exceso. Generalmente, la relación inicial de forma no
patogénica a forma patogénica (si está presente en la muestra) será
mayor de 100:1, preferiblemente mayor de 1000:1, y lo más
preferiblemente mayor de 1.000.000:1.
En una realización posterior preferida de la
invención, la forma no patogénica en la etapa (i) está presente en
un homogeneizado de cerebro de un sujeto sano y/o se puede añadir a
ella, antes de realizar la etapa (i); en este caso, por lo tanto,
el homogeneizado de cerebro que contiene un exceso (preferiblemente
conocido) de la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide se añade durante la etapa (i).
Preferiblemente, el homogeneizado de cerebro del sujeto sano
procede de las mismas especies de las que procede la muestra a ser
analizada (por ejemplo homogeneizado de cerebro humano para la
muestra de humano a ser analizada, homogeneizado de cerebro de una
rata para la muestra de rata a ser analizada). Más preferiblemente,
la forma no patogénica de proteína \beta-amiloide
está presente en una fracción específica del homogeneizado de
cerebro, por ejemplo en las balsas de lípidos
(lipids-rafts) del homogeneizado de cerebro. La
preparación de dichas fracciones se puede realizar por ejemplo
según se describe por Sargiacomo M y colaboradores,
1993.
Así, la invención adicionalmente se refiere a un
método o ensayo según se describe en la presente invención en el
que un tejido o una fracción de tejido se añade a la forma no
patogénica de proteína \beta-amiloide en la etapa
(i). Preferiblemente, el tejido es tejido cerebral, o un
homogeneizado o fracción obtenida a partir del mismo, procedente de
un sujeto sano (es decir uno en el que no está presente la forma
patogénica de proteína \beta-amiloide).
Se ha informado (Kocisko y colaboradores, 1994)
que las formas menos glucosiladas de PrP^{C} se convierten
preferencialmente en la forma PrP^{Sc}. En particular, la
PrP^{C} que se trató con la fosfolipasa C específica de
fosfatidil-inositol era rutinariamente más
eficazmente convertida en la forma patogénica que la PrP^{C} más
fuertemente glucosilada y completa. Por lo tanto, se describe en
esta memoria un método o ensayo adicional, en el que la forma no
patogénica es PrP^{C} que tiene un nivel reducido de glucosilación
(en particular de glucosilación ligada a N) en comparación con la
PrP^{C} tipo salvaje. Preferiblemente, la PrP^{C} ha sido
tratado para separar algo, todo o una cantidad significativa de la
glucosilación con anterioridad a su uso como el conformador no
patogénico en los métodos y ensayos descritos en la pre-
sente invención; y más preferiblemente, el conformador no patogénico es PrP^{C} que está esencialmente sin glucosilar.
sente invención; y más preferiblemente, el conformador no patogénico es PrP^{C} que está esencialmente sin glucosilar.
En el caso del diagnóstico de la TSE, si están
presentes agregados de la forma patogénica dentro de la muestra,
durante la etapa (i) ellos inducirán la transición PrP^{C}
- -> PrP^{Sc} y durante la etapa (ii) dichos agregados
se descompondrán en unidades infectivas todavía más pequeñas, cada
una de las cuales es todavía capaz de inducir la conversión de otra
PrP^{C}. Esta clase de método se denomina en la presente invención
"amplificación cíclica" y se representa en la Figura 2. El
sistema da lugar a un incremento exponencial en la cantidad de
PrP^{Sc} finalmente presente en la muestra que puede ser
fácilmente detectada. Por lo tanto, es posible calcular la cantidad
de PrP^{Sc} inicialmente presente en la muestra de partida a
partir de la cantidad conocida de PrP^{C}, determinando la
cantidad de PrP^{Sc} presente dentro de la muestra al final del
ensayo y considerando el número de ciclos efectuados.
Si, por el contrario, no está presente la
PrP^{Sc} en la muestra (bien como tal o en la forma de agregados),
ninguna molécula de PrP^{C} se convertirá en PrP^{Sc} y al
final del ensayo el marcador estará completamente ausente (ningún
conformador patogénico se detectará en la muestra).
Se ha mostrado ahora que la unidad infectiva de
PrP^{Sc} es un oligómero rico en lámina \beta, el cual puede
convertir la proteína normal mediante su integración en el agregado
creciente, cuando ella adquiere las propiedades asociadas con la
forma anormal (resistencia a la proteasa e insolubilidad) (Jarret y
Landsbury, Jr., 1993, Caughey y colaboradores, 1997). Después de la
incubación de las dos formas de PrP, las especies oligoméricas
incrementan su tamaño mediante el reclutamiento y la transformación
de las moléculas de PrP^{C}. Este procedimiento tiene una baja
eficacia, puesto que depende de un número fijo de oligómeros que
crecen por los extremos. El número de unidades de conversión no se
incrementa en el curso de la reacción cuando ellos sólo llegan a
ser más grandes. Se supone que este procedimiento es lo que sucede
en el cuerpo humano o en el del animal después de la infección; un
procedimiento que se conoce dura meses o incluso varios años. En
esta invención se describe un procedimiento para descomponer los
oligómeros en unos más pequeños, cada uno de los cuales es entonces
capaz de convertir la PrP^{C}.
Por lo tanto, el sistema tiene aplicaciones
directas en el diagnóstico de las enfermedades conformacionales, y
en particular de las enfermedades conformacionales transmisibles,
tales como la TSE mediante la amplificación de las cantidades de
otro modo indetectables de PrP^{Sc} en diferentes tejidos o
fluidos biológicos. El sistema puede permitir la identificación
temprana de personas en riesgo de desarrollar la TSE y puede ser
también muy útil para seguir bioquímicamente la eficacia de los
compuestos terapéuticos de la TSE durante los ensayos clínicos.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención la muestra a ser analizada se somete a una etapa de
"tratamiento previo", que tiene el propósito de "concentrar
selectivamente" en la muestra la forma patogénica que se va a
detectar.
En el caso de la TSE se ha informado que tanto
la PrP^{C} como la PrP^{Sc} están localizadas en una región
especial de la membrana plasmática que es resistente a un
tratamiento con detergente suave (tal como Triton
X-100 enfriado con hielo) debido al contenido
relativamente elevado de colesterol y de glucoesfingolípidos (M.
Vey y colaboradores, 1996). Estos dominios de membrana se denominan
balsas de lípidos o membranas resistentes a los detergentes (DRM) o
dominios semejantes a caveolas (CLDs) y son ricas en proteínas
señales, receptores y proteínas ancladas con GPI
(glicosilfosfatidilinositol). Se ha confirmado que el 100% de la
PrP^{C} en el cerebro está unida a esta fracción, la cual
contiene < 2% de las proteínas totales (véase el Ejemplo 6 y la
Figura 7). Así, la etapa sencilla de aislamiento de balsas de
lípidos de la muestra permite un enriquecimiento espectacular en
PrP^{C}. Resultados similares se obtuvieron por el Solicitante en
el aislamiento de balsas de lípidos procedente de homogeneizado de
cerebro con escrapia, en el cual la PrP^{Sc} se recuperaba en las
balsas.
Así una realización de la invención incluye una
etapa en la que la muestra a ser analizada se somete a una etapa de
tratamiento previo para concentrar selectivamente la forma
patogénica de proteína \beta-amiloide en la
muestra.
Las etapas (i) y (ia) se efectúan
preferiblemente bajo condiciones fisiológicas (pH, temperatura y
concentración iónica) y, más preferiblemente, se añaden también
inhibidores de la proteasa y detergentes a la disolución. Las
condiciones se elegirán de tal modo como para permitir que cualquier
forma patogénica de proteína \beta-amiloide, si
está presente en la muestra, convierta la forma no patogénica de
proteína \beta-amiloide en la forma patogénica de
proteína \beta-amiloide, formando así un agregado
u oligómero de conformadores patogénicos. Las condiciones
fisiológicas apropiadas serán fácilmente evidentes para aquellas
personas especializadas en la técnica.
La duración de la incubación será durante un
tiempo que permitirá que algo, todo o una porción significativa de
la forma no patogénica de proteína \beta-amiloide
sea convertida en la forma patogénica de proteína
\beta-amiloide, suponiendo que la muestra
contenga algo de forma patogénica de proteína
\beta-amiloide. El tiempo será fácilmente
determinable por aquellas personas especializadas en la técnica.
Preferiblemente, cada incubación estará entre 1 minuto y 4 horas,
lo más preferiblemente entre 30 minutos y 1 hora, y particularmente
preferible de aproximadamente 60
minutos.
minutos.
La etapa de incubación (ia) puede comprender
también la etapa adicional (ib) que comprende la adición de una
cantidad adicional de forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide.
Se pueden usar varios métodos para desagregar
los agregados durante la etapa (ii) del método de la presente
invención. Ellos incluyen: el tratamiento con disolventes (tal como
dodecilsulfato de sodio, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, guanidina,
urea, trifluoroetanol, ácido trifluoroacético diluido, ácido fórmico
diluido, etc.), la modificación de las características
químico-físicas de la disolución tales como el pH,
temperatura, concentración iónica, constante dieléctrica, y métodos
físicos, tales como el tratamiento con ultrasonidos, la irradiación
con láser, congelación/descongelación, prensa tipo French,
incubación en autoclave, presión elevada, agitación,
homogeneización suave, otras clases de irradiación, etc. El
tratamiento con ultrasonidos es el método preferido de acuerdo con
la invención.
La desagregación se puede realizar durante un
tiempo que desagregue algo, todo o una porción significativa de los
agregados que se han formado durante la etapa (ii). No es necesario
que todos los agregados se desagreguen en una cualquiera de la
etapa de desagregación. De este modo, el número de unidades de
conversión se incrementa en cada etapa de desagregación.
El tiempo de desagregación será fácilmente
determinable por aquellas personas especializadas en la técnica y
puede depender del método de desagregación usado. Preferiblemente,
la desagregación se realiza durante 1 segundo a 60 minutos, lo más
preferiblemente 5 segundos a 30 minutos y particularmente
preferiblemente durante 5 segundos a 5 minutos, y lo más
preferiblemente durante 5 a 30 segundos. Si la desagregación se
realiza mediante tratamiento con ultrasonidos, el tratamiento con
ultrasonidos se efectúa preferiblemente durante 5 segundos a 5
minutos, y lo más preferiblemente durante 5 a 30 segundos.
El tratamiento con ultrasonidos se ha usado en
el pasado como parte de varios métodos para purificar PrP con el
objetivo de incrementar la solubilidad de los grandes agregados,
pero nunca se ha descrito para amplificar in vitro la
conversión de la PrP.
El uso de un aparato de ultrasonidos de sonda
única tradicional impone un problema para el manejo de muchas
muestras simultáneamente, tal como lo requiere un ensayo de
diagnóstico. Existen en el mercado algunos aparatos de ultrasonidos
de microplaca con formato de 96 pocillos, que proporciona el
tratamiento con ultrasonidos a todos los pocillos al mismo tiempo y
que se puede programar para su operación automática. Estos aparatos
de ultrasonidos se pueden adaptar fácilmente para ser usados en el
método de diagnóstico de la invención.
Así una realización de la invención se refiere
al uso, en la etapa (ii), de un aparto de ultrasonidos
multi-pocillos.
La detección del conformador patogénico
recientemente convertido, por ejemplo PrP^{Sc}, (iii) después del
procedimiento de amplificación cíclico descrito en las etapas (i) a
(ii) se puede realizar de acuerdo con cualquiera de los métodos
conocidos. La detección específica de PrP^{Sc} se efectúa
usualmente (pero no siempre, véase más adelante) mediante una
primera etapa de separación de las dos isoformas de la PrP (proteína
normal y proteína patogénica). La separación se efectúa sobre la
base de las peculiares propiedades bioquímicas de la PrP^{Sc} que
se distingue de la mayor parte de las proteínas normales del cuerpo,
a saber: la PrP^{Sc} es parcialmente resistente al tratamiento
con proteasa y es insoluble incluso en la presencia de detergentes
no desnaturalizantes. Por lo tanto la primera etapa después del
procedimiento de amplificación es usualmente la remoción o
separación de la PrP^{C} en la muestra, bien mediante el
tratamiento con proteasas o mediante centrifugación para separar la
proteína soluble (PrP^{C}) de la insoluble (PrP^{Sc}). Después
de esto, la detección de la PrP^{Sc} se puede efectuar mediante
cualquiera de los siguientes métodos, entre otros:
A) inmunotransferencia después de la
SDS-PAGE. Esto se efectúa a través de un
procedimiento de rutina bien conocido por aquellas personas con
especialidad en la técnica y usando algunos de los muchos
anticuerpos anti-PrP disponibles
comercialmente.
B) Ensayo Elisa (ensayo inmunoenzimático). La
detección en fase sólida se puede efectuar bien mediante un simple
ensayo en el que la muestra se carga sobre la placa y la cantidad de
PrP^{Sc} se detecta después de esto mediante el uso de
anticuerpos anti-PrP o más preferiblemente mediante
el uso de Elisa tipo emparedado en el que la placa se reviste en
primer lugar con un anticuerpo anti-PrP que captura
específicamente la PrP de la muestra, que es finalmente detectada
mediante el uso de un segundo anticuerpo anti-PrP.
Se pueden usar ambas formas de Elisa con
anti-cuerpos anti-PrP marcados
(radiactividad, fluorescencia, biotina, etc.) para incrementar
adicionalmente la sensibilidad de la detección.
C) Ensayos de radiactividad. La PrP^{C} normal
usada como un substrato para el procedimiento de amplificación se
puede marcar radiactivamente (con 3H, 14C, 35S, 125I, etc.) antes de
comenzar el procedimiento y después de la separación de la
PrP^{C} sin convertir, se puede cuantificar la radiactividad de la
PrP^{Sc} recientemente convertida. Este procedimiento es más
cuantitativo y no se basa en el uso de anticuerpos.
D) Ensayos de fluorescencia. La PrP^{C} normal
usada como un substrato para el procedimiento de amplificación se
puede marcar con sondas de fluorescencia antes de comenzar el
procedimiento y después de la separación de la PrP^{C} sin
convertir, se puede cuantificar la fluorescencia de la PrP^{Sc}
recientemente convertida. Es posible que el ensayo de fluorescencia
no pueda requerir la separación de la PrP^{C} sin convertir,
debido a que las propiedades de fluorescencia de la PrP^{C} y de
la PrP^{Sc} pueden ser diferentes debido a la conformación
diferenciada de las dos isoformas.
E) Ensayos de agregación. Es bien conocido que
la PrP^{Sc} (y no ela PrP^{C}) es capaz de agregarse formando
fibrillas amiloides o estructuras del tipo bastones. Por lo tanto la
detección de la PrP^{Sc} se puede efectuar mediante el uso de los
métodos empleados para cuantificar la formación de estos tipos de
agregados, que incluyen la microscopía electrónica, la tinción con
colorantes específicos (rojo Congo; Tioflavin S y T, etc.), y los
ensayos turbidimétricos. Los ensayos de agregación no requieren la
etapa de separación de las dos isoformas, debido a que se conoce
que la PrP normal no se agrega.
F) Ensayos estructurales. Las más importantes
diferencias entre la PrP normal y la patogénica son sus estructuras
secundarias y terciarias. Por lo tanto, se pueden usar métodos que
permiten la evaluación estructural de las proteínas, incluyendo la
RMN, dicroísmo circular, espectroscopía de infrarrojos por
transformada de Fourier, espectroscopía Raman, fluorescencia
intrínseca, absorción en el UV, etc.
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El anticuerpo monoclonal PrP lo más ampliamente
usado es "3F4" (Kascsak y colaboradores, 1987), que es un
anticuerpo monoclonal obtenido a partir de un ratón inmunizado con
PrPres 263 K de hámster (el conformador resistente a la proteasa).
Este anticuerpo es también capaz de reconocer el conformador no
patogénico de los hámsteres y de los seres humanos, pero no el de
los cerebros de bovinos, ratón, rata, oveja o conejo; él es también
capaz de unir el conformador patogénico de los seres humanos, pero
sólo después de la desnaturalización de la proteína.
Dichos anticuerpos de pueden marcar para
permitir la fácil detección del marcador. Por ejemplo las medidas
de fluorescencia de resolución en el tiempo con anticuerpo 3F4
marcado con europio se han usado por algunos científicos (Safar y
colaboradores, 1998).
Los métodos de detección descritos anteriormente
se pueden usar, de acuerdo con la invención, para la detección de
un conformador patogénico, la forma patogénica de proteína
\beta-amiloide.
En una realización alternativa la forma no
patogénica de proteína \beta-amiloide añadida en
exceso se puede marcar y detectar de tal manera que la cantidad de
la forma sin agregar al final del ensayo permitirá una
determinación de la cantidad de forma patogénica de proteína
\beta-amiloide inicialmente presente en la
muestra.
De acuerdo con una realización adicional
alternativa, la forma patogénica de proteína
\beta-amiloide (el marcador) se puede detectar
directamente con un anticuerpo dirigido contra ella.
En términos más amplios se puede añadir un
marcador o resto marcador a la forma patogénica de proteína
\beta-amiloide, a la forma no patogénica de
proteína \beta-amiloide o a un anticuerpo contra
una de las formas de proteína \beta-amiloide
dependiendo de la clase de ensayo que se realiza.
Otro objeto de la invención es un ensayo para un
marcador de la enfermedad de Alzheimer que se caracteriza por una
transición conformacional de una proteína subyacente entre una forma
no patogénica y una patogénica y en el que la transición
conformacional se puede propagar desde una forma patogénica de
proteína \beta-amiloide a una forma no patogénica
de proteína \beta-amiloide, dentro de una muestra,
el cual ensayo comprende las etapas siguientes: (i) poner en
contacto dicha muestra con una cantidad de la forma no patogénica de
proteína \beta-amiloide; (ii) desagregar
cualesquiera agregados formados finalmente durante la etapa (i); y
(iii) determinar la presencia y/o la cantidad de dicha forma
patogénica de proteína \beta-amiloide dentro de la
muestra, siendo la forma patogénica un marcador para la presencia
de dicha enfermedad; en donde la etapa (i) comprende la etapa (ia)
de incubación de dicha muestra/forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii). Preferiblemente, los ciclos se repiten desde 5 a 40 veces, y
lo más preferiblemente 5 a 20 veces.
Un objeto adicional de la presente invención es
un kit de diagnóstico para su uso en el ensayo especificado, que
comprende una cantidad de la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide, y una placa de
micro-valoración y un aparato de ultrasonidos
multi-pocillos.
Usando el método de la invención, es posible
detectar 1 a 10 fg (femto gramos) de forma patogénica de proteína
\beta-amiloide inicialmente presente en la
muestra, que es equivalente a entre 3 y 30 x 10^{-20} moles.
La muestra será generalmente una muestra o
tejido biológico, y se puede ensayar cualquiera de dicha muestra o
tejido biológico con el método de la presente invención. En el caso
de un tejido, el ensayo y el método de la presente invención se
pueden realizar sobre los homogeneizados o directamente sobre
muestras ex vivo. Los métodos de ensayo se realizarán
generalmente sobre muestras ex vivo o in vitro.
Preferiblemente, la muestra es un fluido biológico, tal como
sangre, linfa, orina o leche; tejido del cerebro, médula espinal,
tejido tonsilar o tejido del apéndice; una muestra obtenida de la
sangre tal como fantasmas de los glóbulos de la sangre o
preparaciones de capa superficial leuco-plaquetaria;
o una preparación de membrana de plasma tal como balsas de lípidos,
membranas resistentes a los detergentes o dominios semejantes a
caveolas. La muestra puede ser alternativamente una composición que
comprende un compuesto (particularmente una proteína) obtenida a
partir de una fuente humana o animal, tal como la hormona del
crecimiento, o un extracto de tejido, tal como un extracto de
pituitaria. Dicha composición de muestra puede estar contaminada con
una forma patogénica de proteína
\beta-amiloide.
La muestra puede comprender también un producto
o bebida alimenticia, o una porción de un producto o bebida
alimenticia (bien destinado al consumo de los seres humanos o al
consumo animal) con el fin de establecer la presencia o la ausencia
de una forma patogénica de proteína \beta-amiloide
en ese producto o bebida.
Preferiblemente, el conformador no patogénico
añadido en la etapa (i) será de la misma especie de la muestra. El
se puede obtener, por ejemplo, de una forma (por ejemplo, un tejido)
sano (es decir, no patogénico) de la muestra biológica a ser
ensayada. Alternativamente, la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide se puede producir sintéticamente o
mediante recombinación, usando medios conocidos en la técnica.
Se entenderá, sin embargo, que la forma no
patogénica de proteína \beta-amiloide no necesita
estar en una forma pura o incluso sustancialmente pura. En la mayor
parte de los casos, la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide estará en la forma de un
homogeneizado de tejido o una fracción del mismo que contiene la
forma patogénica de proteína \beta-amiloide
pertinente. Ejemplos preferidos incluyen los homogeneizados de
cerebro y las fracciones obtenidas de los mismos, por ejemplo balsas
de lípidos.
Preferiblemente, la muestra y/o la forma no
patogénica de proteína \beta-amiloide serán de
origen humano o de un animal doméstico, por ejemplo una vaca,
oveja, cabra o gato.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para la identificación de un compuesto que
modula la transición conformacional de una proteína
\beta-amiloide entre una forma no patogénica y
patogénica, que comprende:
(i) poner en contacto una cantidad de la forma
no patogénica de proteína \beta-amiloide con una
cantidad de la forma patogénica de proteína
\beta-amiloide (1) en la presencia de dicho
compuesto y (2) en la ausencia de dicho compuesto;
(ii) desagregar cualesquiera agregados formados
finalmente durante la etapa (i); y
(iii) determinar la cantidad de la forma
patogénica de proteína \beta-amiloide (1) en la
presencia de dicho compuesto y (2) en la ausencia de dicho
compuesto; en donde la etapa (i) comprende la etapa (ia) de
incubación de dicha forma patogénica/no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii).
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Si la cantidad de forma patogénica de proteína
\beta-amiloide medida en la presencia del
compuesto es más elevada que la medida en la ausencia, ello
significa que el compuesto es un factor que "cataliza" la
transición conformacional; si dicha cantidad es más baja, ello
significa que el compuesto es un factor que inhibe dicha
transición.
De acuerdo con el método anterior, el término
"identificación" se debe interpretar que significa "el
rastreo" de una serie de compuestos.
Un "marcador" o "resto marcador" puede
ser cualquier compuesto empleado como un medio para detectar una
proteína. El marcador o resto marcador puede estar unido a la
proteína vía interacciones iónicas o covalentes, enlace de
hidrógeno, interacciones o intercalación electrostáticas. Ejemplos
de marcadores y restos marcadores incluyen, pero no se limitan a,
conjugados de colorantes fluorescentes, biotina, digoxigenina,
radionucleótidos, sustancias, enzimas y receptores
quimioluminiscentes, de tal manera que la detección de la proteína
marcada sea mediante fluorescencia, conjugación a estreptaviden y/o
avidin, cuantificación de la radiactividad o quimioluminiscencia,
interacciones catalíticas y/o de ligando-receptor.
Preferiblemente es un marcador fluorescente o fosforescente.
La expresión "enfermedades
conformacionales" se refiere a un grupo de trastornos que se
originan a partir de una propagación de una transición
conformacional anómala de una proteína subyacente, que da lugar a la
agregación de la proteína y a la deposición del tejido. Dichas
enfermedades se pueden transmitir también mediante un cambio
conformacional inducido, propagado a partir de un conformador
patogénico a su conformador normal o no patogénico y en este caso
ellas se denominan en la presente invención "enfermedades
conformacionales transmisibles". Ejemplos de dichas clases de
enfermedades son las encefalopatías de prión, que incluyen la
encefalopatía espongiforme bovina (BSE) y su equivalente en los
seres humanos la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(CJD), en las que la proteína subyacente es la PrP.
La expresión "CJD esporádica", abreviada
como "sCJD", se refiere a la más común manifestación de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Esta
enfermedad se presenta espontáneamente en individuos con una edad
media de aproximadamente 60 a una tasa de 1 por millón por año de
individuos a través de la tierra.
La expresión "CJD iatrogénica" abreviada
como "iCJD" se refiere a la enfermedad que se produce a partir
de la infección accidental de personas con priones humanos. El
ejemplo más señalado de la misma es la infección accidental de
niños con priones humanos a partir de preparaciones contaminadas de
la hormona del crecimiento humano.
La expresión "CJD familiar" se refiere a
una forma de CJD que se produce raramente en familias y está causada
inevitablemente por mutaciones del gen de la proteína de prión
humano. La enfermedad se produce a partir de un trastorno dominante
autosomal. Los miembros de la familia que heredan las mutaciones
sucumben a la CJD.
La expresión "enfermedad de
Gerstmann-Strassler-Scheinker",
abreviada como "GSS", se refiere a una forma heredada de la
enfermedad de prión humano. La enfermedad se produce a partir de un
trastorno dominante autosomal. Los miembros de la familia que
heredan el gen mutante sucumben a la GSS.
El "termino" prión significa una partícula
transmisible conocida por dar lugar a un grupo de enfermedades
conformacionales transmisibles (encefalopatías espongiforme) en los
seres humanos y en los animales. El término "prión" es una
contracción de las palabras "proteína" e "infección" y las
partículas están constituidas en gran parte si no exclusivamente de
moléculas de PrP^{Sc}.
Los priones se diferencian de las bacterias, los
virus y los viroides. Los priones conocidos incluyen los que
infectan a los animales para dar lugar a la escrapia, una enfermedad
degenerativa y transmisible del sistema nervioso de las ovejas y
cabras así como también las encefalopatías espongiformes de los
felinos de los gatos. Cuatro enfermedades de prión conocidas que
afectan a los seres humanos son (1) kuru, (2) la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) la enfermedad de
Gerstmann-Strassler-Scheinker''
(GSS), y (4) el insomnio familial fatal (FFI). Según se usa en la
presente invención el prión incluye todas las formas de priones que
dan lugar a todas o a cualquiera de estas enfermedades u otras en
cualesquiera animales usados y en particular en los seres humanos y
en animales de granja domesticados.
Las expresiones "gen PrP" y "gen de
proteína de prión" se usan en la presente invención de manera
indistinta para describir un material genético que expresa las
proteínas de prión y los polimorfismos y mutaciones tales como los
listados en la presente invención en el subtitular "Mutaciones
patogénicas y polimorfismos". El gen PrP puede ser de cualquier
animal incluyendo los animales "huéspedes" y "de ensayo"
descritos en la presente invención y cualquiera y todos los
polimorfismos y mutaciones de los mismos, reconociéndose que las
expresiones incluyen otros diferentes a los genes PrP que están
todavía por descubrir.
La expresión "gen PrP" se refiere
generalmente a cualquier gen de cualesquiera especies que codifica
cualquier forma de unas secuencias de aminoácidos de PrP que
incluyen cualquier proteína de prión. Algunas secuencias de PrP
comúnmente conocidas se describen por Gabriel y colaboradores, 1992,
que se incorporan en la presente invención como referencia para
descubrir y describir dichas secuencias.
\newpage
Las abreviaturas usadas en la presente invención
incluyen:
CNS para el sistema nervioso central;
BSE para la encefalopatía espongiforme
bovina;
CJD para la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob:
FFI para el insomnio familiar fatal;
GSS para la enfermedad de
Gerstmann-Strassler-Scheinker;
PrP para la proteína de prión;
PrP^{C} para el conformador normal, y no
patogénico de la PrP;
PrP^{Sc} para la isoforma patogénica o
"infectiva de escrapia" de la PrP (que es también el marcador
para las enfermedades de prión).
Existen un cierto número de mutaciones
patogénicas conocidas en el gen PrP humano. Además, existen
polimorfismos conocidos en los genes PrP de los seres humanos, las
ovejas y los bovinos.
La siguiente es una lista no limitante de dichas
mutaciones y polimorfismos:
La secuencia de aminoácido normal, que se
produce en la gran mayoría de los individuos, se conoce como la
secuencia de la PrP del tipo salvaje: Esta secuencia del tipo
salvaje se somete a ciertas variaciones polimórficas
características. En el caso de la PrP humana, dos amino-ácidos
polimórficos se producen en los restos 129 (Met/Val) y 219
(Glu/Lys). La PrP de las ovejas tiene dos polimorfismos de
aminoácidos en los restos 171 y 136, mientras que la PrP bovina
tiene cinco ó seis repeticiones de una secuencia motivo de ocho
aminoácidos en la región terminal amino de la proteína de prión
madura. Mientras que ninguno de estos polimorfismos son por si
mismos patogénicos, ellos parecen influenciar las enfermedades de
prión. Diferentes de estas variaciones normales de la proteína de
prión del tipo salvaje, se han identificado ciertas mutaciones del
gen PrP humano que alteran bien los restos de aminoácidos
específicos de la PrP o el número de octarepeticiones que se
segregan con las enfermedades de prión humano
heredadas.
heredadas.
Con el fin de proporcionar un significado
adicional a la Tabla anterior que muestra las mutaciones y
polimorfismos, se puede hacer referencia a las secuencias
publicadas de los genes PrP. Por ejemplo, un gen PrP de pollo,
animal bovino, oveja, rata y ratón se describe y se publica por
Gabriel y colaboradores, 1992. La secuencia para el hámster Sirio
se publica por Baslet y colaboradores, 1986. El gen de PrP de oveja
se publica por Goldmann y colaboradores, 1990. La secuencia del gen
PrP del pollo se publica por Harris y colaboradores, 1991. La
secuencia del gen PrP del visón se publica por Kretzschmar y
colaboradores, 1992. La secuencia del gen PrP humano se publica por
Kretzschmar y colaboradores, 1986. La secuencia del gen PrP del
ratón se publica por Locht y colaboradores, 1986. La secuencia del
gen PrP de la oveja se publica por Westaway y colaboradores, 1994.
Estas publicaciones descubren y describen todas ellas el gen PrP y
la secuencia de aminoácidos de la PrP.
La invención proporciona también un método para
detectar la presencia de una forma patogénica de proteína
\beta-amiloide con una muestra (preferiblemente
una muestra de sangre o de cerebro) que comprende:
(i) poner en contacto la muestra con una
cantidad de proteína \beta-amiloide no
patogénica;
- (ia)
- incubar la muestra/proteína \beta-amiloide no patogénica
(ii) desagregar cualesquiera agregados formados
durante la etapa (ia);
- repetir las etapas (ia)-(ii) dos o más veces; y a continuación
(iii) determinar la presencia y/o la cantidad
de proteína \beta-amiloide patogénica dentro de la
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe, además, un método para diagnosticar
la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende:
tomar una muestra del paciente (preferiblemente
una muestra de sangre o de cerebro);
(i) poner en contacto la muestra con una
cantidad de proteína \beta-amiloide no
patogénica;
- (ia)
- incubar la muestra/proteína \beta-amiloide no patogénica;
(ii) desagregar cualesquiera agregados formados
durante la etapa (ia);
- repetir las etapas (ia)-(ii) dos o más veces; y a continuación
(iii) determinar la presencia y/o la cantidad
de proteína \beta-amiloide patogénica dentro de la
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta memoria se describe un método para la
detección diagnóstica de una enfermedad conformacional,
caracterizada por una transición conformacional de una proteína
subyacente entre un conformador no patogénico y uno patogénico
mediante el ensayo de un marcador de dicha enfermedad dentro de una
muestra, método que comprende (i) poner en contacto dicha muestra
con una cantidad conocida del conformador no patogénico, (ii)
desagregar los agregados formados finalmente durante la etapa (i) y
(iii) determinar la presencia y/o la cantidad de dicho conformador
patogénico dentro de la muestra. Preferiblemente, las etapas (i) y
(ii) forman un ciclo el cual se repite al menos dos veces antes de
realizar la etapa (iii), lo más preferiblemente las etapas (i) y
(ii) forman un ciclo el cual se repite desde 5 a 40 veces antes de
realizar la etapa (iii).
En esta memoria se describe un ensayo para un
marcador de una enfermedad conformacional, caracterizado por una
transición conformacional de una proteína subyacente entre un
conformador no patogénico y uno patogénico dentro de una muestra,
ensayo que comprende las siguientes etapas: (i) poner en contacto
dicha muestra con una cantidad conocida del conformador no
patogénico, (ii) desagregar los agregados formados finalmente
durante la etapa (i) y (iii) determinar la presencia y/o la
cantidad de dicho conformador patogénico dentro de la muestra.
Preferiblemente, las etapas (i) y (ii) forman un ciclo el cual se
repite al menos dos veces antes de realizar la etapa (iii).
\newpage
Se describe, además, un método para identificar
un compuesto que modula la transición conformacional de una
proteína subyacente entre un conformador no patogénico y uno
patogénico, que comprende:
(i) poner en contacto una cantidad conocida del
conformador no patogénico con una cantidad conocida del conformador
patogénico en presencia y en ausencia de dicho compuesto,
(ii) desagregar los agregados formados
finalmente durante la etapa (i),
(iii) determinar la cantidad del conformador
patogénico en presencia y en ausencia de dicho compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se ilustrará ahora por medio de los
Ejemplos Comparativos siguientes, los cuales no se deben considerar
como que limitan de algún modo la presente invención. Los Ejemplos
se referirán a las Figuras especificadas en la presente invención
más adelante.
Figura 1. Representación esquemática de la
conversión de PrP^{C} - -> PrP^{Sc}. La unidad de
infección de PrP^{Sc} es un oligómero rico en lámina \beta, que
convierte la PrP^{C} mediante su integración en el agregado
creciente, en el que ella adquiere las propiedades asociadas con la
PrP^{Sc}.
Figura 2. Representación esquemática del
procedimiento de amplificación cíclico. El sistema se basa en
ciclos de incubación de PrP^{Sc} en la presencia de un exceso de
PrP^{C} seguido de ciclos de tratamiento con ultrasonidos.
Durante los períodos de incubación, la PrP^{Sc} oligomérica se
alarga mediante la incorporación de PrP^{C} en el agregado
creciente, mientras que durante el tratamiento con ultrasonidos los
agregados se descomponen con el fin de multiplicar las unidades de
conversión. En la Figura, se muestran dos ciclos de tratamiento con
ultrasonidos/incubación.
Figura 3. Amplificación de PrP^{Sc}
mediante ciclos de tratamiento con ultrasonidos. Una pequeña
cantidad de homogeneizado de cerebro afectado de escrapia que
contiene PrP^{Sc} se incubó con homogeneizado de cerebro de rata
sano (pista 1, experimento de control) o con homogeneizado de
cerebro de hámster sano (pistas 2 y 3). La última muestra se
dividió en dos grupos uno de los cuales se sometió a cinco ciclos de
incubación/tratamiento con ultrasonidos (pista 3). La mitad de las
muestras anteriores se cargó directamente en un gel y se tiño para
determinar la proteína total con Coomasie (panel A). La otra mitad
se trató con PK y se sometió a inmunotransferencia usando al
anticuerpo anti-PrP 3F4 (panel B). El panel C
muestra algunos controles en los que el homogeneizado de cerebro
sano se incubó solo (pistas 1 y 2) o en la presencia de
homogeneizado de cerebro afectado de escrapia (pistas 3 y 4). La
mitad de las muestras (pistas 2 y 4) se sometieron a cinco ciclos de
tratamiento con ultrasonidos/incubación. Las pistas 2,3 y 4 se
trataron con proteinasa K.
Figura 4. Sensibilidad del sistema de
amplificación cíclico. Se estudió la concentración mínima de
PrP^{Sc} que se puede usar para la detección después de la
amplificación mediante la dilución en serie del homogeneizado de
cerebro afectado de escrapia y la incubación con homogeneizado de
cerebro de hámster sano con o sin ciclos de tratamiento con
ultrasonidos. El panel A muestra el experimento de control en el que
el cerebro de hámster afectado de escrapia se diluyó en serie en
homogeneizado de cerebro de rata. El panel B corresponde al
experimento en el que las diluciones en serie de cerebro de hámster
afectado de escrapia se incubaron con cerebro de hámster sano y se
sometieron a 5 ciclos de incubación/tratamiento con ultrasonidos. La
evaluación densitométrica de las inmunotransferencias en A y B se
muestra en el panel C. Las diluciones se efectuaron considerando
como material de partida el cerebro y eran las siguientes; 100
(pista 1), 200 (pista 2), 400 (pista 3), 800 (pista 4), 1600 (pista
5) y 3200 (pista 6).
Figura 5. Relación entre la señal de PrPres y
el número de ciclos de amplificación. Homogeneizado de cerebro
afectado de escrapia se incubó con un exceso de homogeneizado de
cerebro de hámster sano. Las muestras se sometieron a 0, 5, 10, 20
ó 40 ciclos y la señal de PrPres se evaluó mediante
inmuno-transferencia.
Figura 6. Amplificación de PrP^{Sc} en
muestras de sangre. Sangre de rata tratada con heparina se
adicionó con homogeneizado de cerebro de hámster afectado de
escrapia para alcanzar una dilución final de 10:1. Esta mezcla se
incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se efectuaron
diluciones en serie a 10 veces de este material usando sangre de
rata tratada con heparina. Las muestras se sometieron a 11 ciclos de
incubación-tratamiento con ultrasonidos y la señal
de PrPres se evaluó mediante
inmuno-transferencia.
Figura 7. La proteína de prión está presente
en las balsas de lípidos. Se aislaron balsas de lípidos
(denominadas también la fracción de membrana resistente a los
detergentes o DRM) usando una modificación de los protocolos
previamente descritos. Cien mg de tejido cerebral se homogeneizó en
1 ml de PBS que contiene 1% de Triton X-100 y 1x de
un cóctel completo de inhibidores de la proteasa (Boehringer). El
tejido se homogeneizó con 10 pasos a través de la aguja de
jeringuilla 22G y se incubó durante 30 minutos a 4ºC sobre un
agitador rotatorio. La muestra se diluyó a 1:2 en sacarosa del 60%
y se colocó en el fondo de un tubo de centrifuga. Se colocaron
cuidadosamente 7 ml de sacarosa del 35% sobre la muestra. Se dispuso
en capas 1,5 ml de sacarosa del 15% en la parte superior del
gradiente. El tubo se centrifugó a 150.000 g durante 18 horas a 4ºC.
Las balsas de lípidos sobrenadan en la interfase de la sacarosa del
15%-35% (panel A). Se recogieron las diferentes fracciones y se
analizaron para determinar la proteína total mediante tinción con
nitrato de plata (panel B) e inmunotransferencia para detectar la
PrP (panel C). Para separar la sacarosa de la muestra, la fracción
de balsa de lípidos se recuperó mediante lavado en PBS y se
centrifugó a 28.000 rpm durante 1 hora a 4ºC. El gránulo se lavó y
se volvió a suspender en PBS que contiene 0,5% de Triton
X-100, 0,5% de SDS e inhibidores de la proteasa.
Toda la PrP^{C} estaba localizado en esta fracción (panel D).
Figura 8. Los factores necesarios para la
amplificación están presentes en las balsas de lípidos. Se
aislaron balsas de lípidos del cerebro de hámster sano según se
describe en la Figura 2 y se mezcló con PrP^{Sc} diluida 700
veces altamente purificada procedente del cerebro de hámster
afectado de escrapia. Las muestras bien se congelaron (línea 3) o
se amplificaron durante 20 horas (línea 4). Las líneas 1 y 2
representan los mismos procedimientos pero usando el homogeneizado
de cerebro total para la amplificación.
Figura 9. Detección
pre-sintomática de PrP^{Sc} en cerebro de
hámster. Se inocularon hámsteres
intra-cerebralmente (i.c.) con disolución salina
(grupo de control) o con homogeneizado de cerebro afectado de
escrapia diluido 100 veces. Cada semana se sacrificaron 4 hámsteres
por grupo y se extrajeron y homogeneizaron los cerebros. La mitad
de las muestras se congelaron inmediatamente (barras blancas) y la
otra mitad se sometió a 20 ciclos de incubación-/tratamiento con
ultrasonidos (barras negras). Todas las muestras se trataron con PK
y se sometieron a inmuno-transferencia. La
intensidad de las bandas se evaluó mediante densitometría. Cada
barra representa la media de muestras de 4 animales. No se observó
detección en ninguno de los cerebros de control bien sin o con
amplificaciones y estos resultados no se muestran en la Figura.
Figura 10. Amplificación de PrP^{Sc}
humana. Los estudios se efectuaron usando muestras de cerebro de
11 casos confirmados diferentes de CJD esporádica, así como también
5 de CJD familiar y 4 controles emparejados por la edad, que
incluían pacientes afectados por otros trastornos neurológicos. Se
homogeneizó el cerebro y se sometió a 20 amplificaciones de las
muestras. En la Figura se muestran los resultados representativos
de un control (A) y de tres casos diferentes (1, 2, 3) de CJD
esporádica (B).
Figura 11. Detección de PrP^{sc} en sangre
después de la preparación de sombras de células sanguíneas. Se
prepararon sombras de células sanguíneas (células sanguíneas
desprovistas de hemoglobina) a partir de 0,5 ml de sangre tratada
con heparina procedente de hámsteres sanos (C) y afectados de
escrapia (Sc) según se describe en el texto. La mitad de las
muestras no se sometieron a amplificación y la otra mitad se
mezclaron con homogeneizado de cerebro de hámster normal y se
sometieron a 20 ciclos de amplificación. A continuación todas las
muestras se trataron con PK y se analizaron mediante
inmunotransferencia. En la Figura se muestra un experimento
representativo.
Figura 12. Detección de PrP^{Sc} en sangre
después de la extracción con sarcosilo. 0,5 ml de sangre tratada
con heparina procedente de hámsteres sanos (C) y afectados de
escrapia (Sc) se sometió a extracción con sarcosilo según se
describe en el texto. La mitad de las muestras no se sometieron a
amplificación y la otra mitad se mezclaron con homogeneizado de
cerebro de hámster normal y se sometieron a 20 ciclos de
amplificación. A continuación todas las muestras se trataron con PK
y se analizaron mediante inmuno-transferencia. Una
muestra representativa de animales de control y dos de animales
afectados de escrapia se presentan en la Figura.
Figura 13. Detección de PrP^{Sc} en sangre
después de la purificación de las balsas de lípidos. Se
extrajeron balsas de lípidos según se describe en el texto a partir
de 0,5 ml de sangre tratada con heparina procedente de hámsteres
sanos (C) y afectados de escrapia (Sc). La mitad de las muestras no
se sometieron a amplificación y la otra mitad se mezclaron con
homogeneizado de cerebro de hámster normal y se sometieron a 20
ciclos de amplificación. A continuación todas las muestras se
trataron con PK y se analizaron mediante inmunotransferencia. Una
muestra representativa de animales de control y dos de animales
afectados de escrapia se presentan en la Figura.
Figura 14. Detección de PrP^{Sc} en sangre
después de la preparación de capas superficiales de plasma
coagulado. Se separó la fracción de sangre de capa superficial
leuco-plaquetaria mediante centrifugación a partir
de 0,5 ml de sangre tratada con heparina procedente de hámsteres
sanos (C) y afectados de escrapia (Sc). La mitad de las muestras no
se sometieron a amplificación y la otra mitad se mezclaron con
homogeneizado de cerebro de hámster normal y se sometieron a 20
ciclos de amplificación. A continuación todas las muestras se
trataron con PK y se analizaron mediante inmunotransferencia. En la
Figura se muestra un experimento representativo.
Homogeneizado de cerebro de hámster extraído de
animales afectados de escrapia se diluyó hasta que la señal de
PrP^{Sc} era apenas detectada mediante inmunotransferencia después
de su tratamiento con proteinasa K (PK) (Figura 3B, pista 1). El
tratamiento con PK se efectúa de rutina en el campo para distinguir
entre las formas normal y anormal de PrP, que difieren en su
sensibilidad a la degradación con proteasa (la PrP^{Sc} es
parcialmente resistente y la PrP^{C} se degrada) (Prusiner, 1991).
La forma de PrP que es resistente al tratamiento con PK se
denominará a partir de ahora PrPres. La incubación de una muestra de
homogeneizado de cerebro afectado de escrapia diluido con
homogeneizado de cerebro de hámster sano que contiene un exceso de
PrP^{C}, dio lugar a un incremento en la señal de PrPres (Figura
3B, pista 2).
Esto sugiere que la incubación de los dos
homogeneizados de cerebro dio lugar a la conversión de PrP^{C} en
PrP^{Sc}. Cuando las muestras se incubaron bajo las mismas
condiciones pero sometidas a cinco ciclos de incubación/tratamiento
con ultrasonidos, la cantidad de PrPres se incrementó
espectacularmente (Figura 3B, pista 3). El análisis densitométrico
de la inmunotransferencia indica que la señal de PrPres se
incrementó 84 veces por amplificación cíclica en comparación con la
señal de PrPres presentada en el homogeneizado diluido de cerebro
afectado de escrapia (pista 1).
La conversión depende de la presencia de
PrP^{Sc}, puesto que no se observó PrPres cuando el homogeneizado
de cerebro de hámster normal se incubó solo bajo las mismas
condiciones bien con o sin tratamiento con ultrasonidos (Figura 3C,
pista 2). Para determinar los mecanismos de la transferencia, la
proteína total cargada en el gel se mantuvo constante (Figura 3A)
mediante la adición de homogeneizado de cerebro de rata a la muestra
diluida afectada de escrapia, aprovechando el hecho de que la PrP
de rata no se detecta por el anticuerpo usado en la
inmunotransferencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la concentración mínima de
PrP^{Sc} que se puede usar para la detección después de la
amplificación, el homogeneizado de cerebro afectado de escrapia se
diluyó en serie directamente en homogeneizado de cerebro de hámster
sano. Sin incubación, la señal de PrPres disminuye progresivamente
hasta que era completamente indetectable a una dilución de 800
veces (Figura 4A, C). Por contraste cuando la misma dilución se
incubó con homogeneizado de cerebro de hámster sano y se sometió a
5 ciclos de incubación/tratamiento con ultrasonidos, el límite de
detección de la PrPres se disminuyó espectacularmente. En verdad,
una señal clara se detectó fácilmente incluso a una dilución de
3200 veces (Figura 4B, C).
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar si la intensidad de la señal de
PrPres después de la amplificación cíclica depende del número de
ciclos de incubación/tratamiento con ultrasonidos, homogeneizado de
cerebro afectado de escrapia diluido se incubó con un exceso de
homogeneizado de cerebro de hámster sano. Las muestras se sometieron
a 0, 5, 10, 15, 20 ó 40 ciclos y la señal de PrPres se evaluó
mediante inmuno-transferencia. Los niveles de PrPres
se incrementaron exponencialmente con el número de ciclos de
incubación/tratamiento con ultrasonidos (Figura 5). Este resultado
sugiere que el incremento del número de ciclos puede disminuir más
los límites de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Sangre de rata tratada con heparina se adicionó
con homogeneizado de cerebro de hámster afectado de escrapia para
alcanzar una dilución final de 10:1. Esta mezcla se incubó durante
15 minutos a temperatura ambiente.
Se efectuaron diluciones en serie de 10 veces de
este material usando sangre de rata tratada con heparina. 50 \mul
de cada dilución se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. Se
separó el plasma de los gránulos. 10 \mul de plasma se mezclaron
con 50 \mul de homogeneizado de cerebro de hámster sano que
contiene el substrato de PrP^{C} para la reacción de conversión.
Las muestras se sometieron a 11 ciclos de incubación/tratamiento
con ultrasonidos. Como un control las mismas muestras se mezclaron
en 50 \mul de homogeneizado de cerebro de hámster sano y se
mantuvieron a -20ºC hasta que se necesitaban. 15 \mul de las
muestras de control y las tratadas con ultrasonidos se digirieron
con proteinasa K, se separaron mediante SDS-PAGE y
se analizaron mediante transferencia Western y se detectó la
PrP^{Sc} según se describe en la sección "Métodos".
Los resultados se presentan en la Figura 6.
Estos resultados muestran un claro incremento en la detección de la
proteína después del procedimiento de amplificación, que es
especialmente evidente a la concentración de PrP^{Sc} más baja
(por ejemplo a la dilución 1280). Si se comparan dichos resultados
con los obtenidos sobre los tejidos de cerebro infectados, se tiene
la confirmación de que el procedimiento de amplificación funciona
similarmente en la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de un aparato de ultrasonidos tradicional
de sonda única impone un problema para el manejo de muchas muestras
simultáneamente, como requerirá un ensayo diagnóstico. Se ha
adaptado el sistema de amplificación cíclica a un aparato de
ultrasonidos de microplaca de formato de 96 pocillos (Mixonix 431MP
- 20 KHz), que proporciona ultrasonidos a todos los pocillos al
mismo tiempo y que se puede programar para su operación automática.
Esta mejora no sólo disminuye el tiempo de tratamiento, sino que
también impide la pérdida de material cuando se compara con el uso
de una sonda única. La contaminación cruzada se elimina puesto que
no existe una intrusión directa de la sonda en la muestra. Lo
último es esencial para el manejo de las muestras infecciosas y
minimizar los resultados positivos falsos. Veinte ciclos de 1 hora
de incubación seguida de impulsos de ultrasonidos de 15 segundos ó
30 segundos proporcionaron una amplificación significativa de la
señal de PrPres, similar a la observada previamente usando un
aparato de ultrasonidos tradicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La localización subcelular en la que se produce
la conversión de la PrP durante la patogénesis de la enfermedad no
está todavía dilucidada. Sin embargo, se ha informado que tanto la
PrP^{C} como la PrP^{Sc} están localizadas en una región
especial de la membrana plasmática que es resistente al tratamiento
con detergente suaves debido a su contenido relativamente elevado
de colesterol y de gluco-esfingolípidos (Vey y
colaboradores, 1996; Harmey y colaboradores, 1995). Estos dominios
de membrana se denominan balsas de lípidos o membranas resistentes
a los detergentes (DRM) y son ricos en proteínas señal, receptores y
proteínas ancladas con GPI. Se ha confirmado que el 100% de la
PrP^{C} en el cerebro está unida a esta fracción, la cual contiene
< 2% de las proteínas totales (Figura 7). Así, la sencilla etapa
de de aislamiento de la balsa de lípidos permite un enriquecimiento
espectacular en la PrP^{C}. Resultados similares se obtuvieron en
el aislamiento de las balsas de lípidos del homogeneizado de
cerebro afectado de escrapia, en la que se recuperó PrP^{Sc} de
las balsas.
Para evaluar si los factores necesarios para la
amplificación de la PrP están contenidos en las balsas de lípidos,
se purificaron las mismas a partir del cerebro de animales sanos y
se añadieron pequeñas cantidades de PrP^{Sc} elevadamente pura
extraída del cerebro de animales enfermos. La amplificación en las
balsas de lípidos era equivalente a la obtenida con el extracto de
cerebro total (Figura 8), puesto que la cantidad de PrPres
producida después de la amplificación era similar en ambas
condiciones. Este resultado indica que todos los elementos
requeridos para la conversión y amplificación de la PrP (incluyendo
el denominado "Factor X"; (Telling y colaboradores, 1995))
están contenidos en este dominio de membrana especializado. Por lo
tanto, la identificación y aislamiento de los factores necesarios
para la conversión de la PrP debe ser posible mediante la
separación adicional de proteínas de las balsas de lípidos y
controlando su actividad mediante la amplificación cíclica. Además,
las balsas de lípidos constituyen un posible reemplazo para el uso
del homogeneizado de cerebro total en el procedimiento de
amplificación cíclico como una fuente de substrato de PrP^{C} y de
otros factores endógenos implicados en la conversión.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar el diagnóstico
pre-sintomático de hámsteres infectados
experimentalmente con escrapia, se evaluaron 88 muestras de cerebro
en diferentes etapas durante la fase pre-clínica, la
mitad de las cuales eran controles no infectados. Se tomaba el
cerebro cada semana (4 por cada grupo) y se sometía a 20 ciclos de
amplificación. Los resultados mostraron que el método era capaz de
detectar la proteína anormal en el cerebro incluso a la segunda
semana después de la inoculación, mucho antes de que los animales
desarrollaran cualesquiera síntomas (Figura 9). Sin amplificación
cíclica, la PrP^{Sc} se detectó en el cerebro seis semanas después
de la infección, sólo 4 semanas antes de la aparición de la
enfermedad clínica. No se detectaba amplificación en cualquiera de
los animales de control que no fueron infectados con escrapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la aplicación del procedimiento de
amplificación cíclico a muestras de seres humanos de cerebro de
personas (cadáveres) afectados de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD), se incubaron homogeneizados
de cerebro de varios pacientes de CJD (o controles normales) con
homogeneizado de cerebro humano sano y se realizó el procedimiento
de amplificación cíclico. Los resultados muestran que existía una
amplificación significativa en las muestras de cerebro de CJD
esporádica analizadas y en ninguna de las 4 muestras de control
(Figura 10). Interesantemente, la amplificación se obtuvo sólo en
las muestras que habían mostrado ser infecciosas y así capaces de
convertir la PrP^{C} no mutada, mientras que no funcionó cuando la
proteína mutante no es capaz de convertir la proteína tipo salvaje.
Estos datos soportan la conclusión de que el método funciona en las
muestras humanas de manera similar a como se mostró antes para las
muestras animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios de infección sugieren que al menos
en animales experimentales la PrP^{Sc} está presente en sangre en
animales en fase avanzada (Brown y colaboradores, 2001). Con el fin
de efectuar la detección en sangre de la PrP^{Sc} mediante
amplificación cíclica, se prefiere en primer lugar concentrar
selectivamente la muestra en la proteína a ser detectada y eliminar
la mayor parte de las proteínas de la sangre muy abundantes tales
como la albúmina y la hemoglobina. Los siguientes cuatro protocolos
diferentes se han mostrado eficaces para este propósito.
Sangre de hámster tratada con heparina se
centrifugó a 2500 rpm a 4ºC. El plasma y la fracción celular se
separaron y se congelaron a -80ºC hasta que se necesitaran. 0.5 ml
del paquete de células sanguíneas se lavó 3 veces con
12-15 volúmenes de PBS frío y de nuevo aporte, de pH
7,6. Las células se volvieron a suspender en 12-15
volúmenes de tampón de fosfato de sodio 20 mOsM de pH 7,6 y se agitó
suavemente durante 20 minutos sobre hielo, a continuación se
centrifugó a 30.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El material
sobrenadante se eliminó, el gránulo se lavó tres veces con tampón
de fosfato de sodio de 20 mOsM. El gránulo final se volvió a
suspender en PBS que contiene 0,5% de Triton X-100,
0,5% de SDS e inhibidores de la proteasa. 15 \mul de esta
suspensión se mezcló v/v con 10% de homogeneizado de cerebro de
hámster sano y se sometió a 20 ciclos de incubación/tratamiento con
ultrasonidos. 20 \mul de las muestras tratadas con ultrasonidos y
de las de control se digirieron con proteinasa K, se separaron
mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante
transferencia Western y se detectó la PrP^{Sc} según se describe
en la sección "Métodos". Los resultados muestran la detección
de la PrP^{Sc} después del procedimiento de aplicación en las
muestras de sangre de animales infectados (Figura 11). En las
muestras de sangre de animales no infectados no existe señal después
de la amplificación. Sin amplificación no es posible detectar la
presencia de PrP^{Sc} (Figura 11).
Sangre de hámster tratada con heparina se
centrifugó a 2500 rpm a 4ºC. 0,5 ml del paquete de células
sanguíneas se diluyó (v/v) en sarcosilo del 20% y se incubó durante
30 minutos. La muestra se centrifugó en una centrifuga Beckman
TL100, y se ultracentrifugó a 85.000 rpm durante 2 horas a 4ºC. El
gránulo se lavó y volvió a suspender en PBS que contiene 0,5% de
Triton X-100, 0,5% de SDS e inhibidores de proteasa.
15 \mul de esta suspensión se mezcló v/v con 10% de homogeneizado
de cerebro de hámster sano y se sometió a 20 ciclos de
incubación/tratamiento con ultrasonidos. 20 \mul de las muestras
tratadas con ultrasonidos y de las de control se digirieron con
proteinasa K, se separaron mediante SDS-PAGE y se
analizaron mediante transferencia Western y se detectó la
PrP^{Sc} según se describe en la sección "Métodos". Los
resultados muestran la detección de la PrP^{Sc} después del
procedimiento de aplicación en las muestras de sangre de animales
infectados (Figura 12). En las muestras de sangre de animales no
infectados no existe señal después de la amplificación. Sin
amplificación no es posible detectar la presencia de PrP^{Sc}
(Figura 12).
Sangre de hámster tratada con heparina se
centrifugó a 2500 rpm a 4ºC, 0,5 ml del paquete de células
sanguíneas se diluyó (v/v) en PBS con 1% de Triton
X-100 y se incubó durante 30 minutos a 4ºC. La
muestra se diluyó 1:2 en sacarosa del 60% y se colocó en el fondo
de un tubo de centrífuga. 7 ml de sacarosa del 35% se colocaron
cuidadosamente sobre la muestra. 1,5 ml de sacarosa del 15% se
distribuyó en la parte superior del gradiente. El tubo se
centrifugó a 150.000 rpm durante 18 horas a 4ºC. Las balsas de
lípidos se recuperaron y se lavaron con PBS y se centrifugaron a
28.000 rpm durante una hora a 4ºC. El gránulo se lavó y se volvió a
suspender en PBS que contiene 0,5% de Triton X-100,
0,5% de SDS e inhibidores de proteasa. 15 \mul de esta suspensión
se mezcló v/v con 10% de homogeneizado de cerebro de hámster sano y
se sometió a 20 ciclos de incubación/tratamiento con ultrasonidos.
20 \mul de las muestras tratadas con ultrasonidos y de las de
control se digirieron con proteinasa K, se separaron mediante
SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia
Western y se detectó la PrP^{Sc} según se describe en la sección
"Métodos". Los resultados muestran la detección de la
PrP^{Sc} después del procedimiento de aplicación en las muestras
de sangre de animales infectados (Figura 13). En las muestras de
sangre de animales no infectados no existe señal después de la
amplificación. Sin amplificación no es posible detectar la
presencia de PrP^{Sc} (Figura 13).
Sangre de hámster tratada con heparina se
centrifugó a 1500 rpm a 4ºC durante 10 minutos. La capa superficial
leuco-plaquetaria se recuperó cuidadosamente usando
procedimientos estándar y se mantuvo a -80ºC hasta que era
necesaria. La capa superficial leuco-plaquetaria se
volvió a suspender en PBS que contiene 0,5% de Triton
X-100, 0,5% de SDS e inhibidores de proteasa. 15
\mul de esta suspensión se mezcló v/v con 10% de homogeneizado de
cerebro de hámster sano y se sometió a 20 ciclos de
incubación/tratamiento con ultrasonidos. 20 \mul de las muestras
tratadas con ultrasonidos y de las de control se digirieron con
proteinasa K, se separaron mediante SDS-PAGE y se
analizaron mediante transferencia Western y se detectó la PrP^{Sc}
según se describe en la sección "Métodos". Los resultados
muestran la detección de la PrP^{Sc} después del procedimiento de
aplicación en las muestras de sangre de animales infectados (Figura
14). En las muestras de sangre de animales no infectados no existe
señal después de la amplificación. Sin amplificación no es posible
detectar la presencia de PrP^{Sc} (Figura 14).
Se obtuvieron cerebros de hámsteres sirios de
color oro sanos o infectados con la cepa de escrapia adaptada 263 K
después de su decapitación e inmediatamente se congelaron en hielo
seco y se mantuvieron a -80ºC hasta que se usaron. Los cerebros se
homogeneizaron en PBS y 10% de inhibidores de proteasa
(peso/volumen). Se añadieron detergentes (0,5% de Triton
X-100, y 0,05% de SDS) y se clarificó con
centrifugación a baja velocidad (10.000 rpm) durante 1 minuto.
Se efectuaron diluciones en serie del
homogeneizado de cerebro afectado de escrapia directamente en el
homogeneizado de cerebro sano. 30 \mul de estas diluciones se
incubaron a 37ºC con agitación. Se efectuó cada hora un ciclo de
tratamiento con ultrasonidos (5 pulsos de 1 segundo cada uno) usando
un microaparato de ultrasonidos con la aguja inmersa en la muestra.
Estos ciclos se repitieron varias veces (5-20).
Las muestras se digirieron con 100 \mug/ml de
PK durante 90 minutos a 37ºC. La reacción se paralizó con PMSF 50
mM. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE
(bajo condiciones de desnaturalización) y se sometieron a
electro-transferencia en membrana de nitrocelulosa
en tampón de transferencia de CAPS o de tris-glicina
con 10% de metanol durante 45 minutos a 400 mA. La tinción de la
proteína total reversible se efectuó antes del bloqueo de la
membrana con 5% de leche sin grasa. Después de esto, la membrana se
incubó durante 2 h con el anticuerpo monoclonal 3F4 (1:50.000). Se
efectuaron cuatro lavados de 5 minutos cada uno con PBS, 0,3% de
Tween 20 antes de la incubación con la peroxidasa de rábano picante
marcada con anticuerpos anti-ratón secundarios
(1:5000) durante 1 hora. Después del lavado se desarrolló la
reactividad en la membrana con el kit de quimioluminiscencia ECL
(Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Claims (8)
1. Un método para el diagnóstico o detección de
la enfermedad de Alzheimer que se caracteriza por una
transición conformacional de una proteína
\beta-amiloide entre una forma no patogénica y una
patogénica y en el que la transición conformacional se puede
propagar desde una forma patogénica de proteína
\beta-amiloide a una forma no patogénica de
proteína \beta-amiloide, mediante el ensayo de un
marcador de dicha enfermedad dentro de una muestra, el cual método
comprende:
- (i)
- poner en contacto dicha muestra con una cantidad de la forma no patogénica de proteína \beta-amiloide;
- (ii)
- desagregar cualesquiera agregados formados finalmente durante la etapa (i); y
- (iii)
- determinar la presencia y/o la cantidad de dicha forma patogénica de proteína \beta-amiloide dentro de la muestra, siendo la forma patogénica un marcador para la presencia de dicha enfermedad,
en el que la etapa (i) comprende la etapa (ia)
de incubación de dicha muestra/forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii).
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el ciclo se repite desde 5 a 40 veces antes de realizar la etapa
(iii).
3. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (i) se realiza bajo
condiciones fisiológicas.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la cantidad de la forma no
patogénica en la etapa (i) es una cantidad en exceso.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra a ser analizada
se somete a un tratamiento previo para concentrar selectivamente la
forma patogénica en la muestra.
6. Un ensayo para un marcador de la enfermedad
de Alzheimer que se caracteriza por una transición
conformacional de una proteína \beta-amiloide
entre una forma no patogénica y una patogénica y en la que la
transición conformacional se puede propagar desde una forma
patogénica de proteína \beta-amiloide a una forma
no patogénica de proteína \beta-amiloide, dentro
de una muestra, el cual ensayo comprende las etapas siguientes:
- (i)
- poner en contacto dicha muestra con una cantidad de la forma no patogénica de proteína \beta-amiloide;
- (ii)
- desagregar cualesquiera agregados formados finalmente durante la etapa (i); y
- (iii)
- determinar la presencia y/o la cantidad de dicha forma patogénica de proteína \beta-amiloide dentro de la muestra, siendo la forma patogénica un marcador para la presencia de dicha enfermedad,
en el que la etapa (i) comprende la etapa (ia)
de incubación de dicha muestra/forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un kit de diagnóstico para su uso en el
ensayo de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende una
cantidad conocida de la forma no patogénica de proteína
\beta-amiloide, una placa de
micro-valoración multi-pocillos y
un aparato de ultrasonidos multi-pocillos.
8. Un método para la identificación de un
compuesto que modula la transición conformacional de una proteína
\beta-amiloide entre una forma no patogénica y una
patogénica, que comprende:
- (i)
- poner en contacto una cantidad de la forma no patogénica de proteína \beta-amiloide con una cantidad de la forma patogénica de proteína \beta-amiloide (1) en la presencia de dicho compuesto y (2) en la ausencia de dicho compuesto;
- (ii)
- desagregar cualesquiera agregados formados finalmente durante la etapa (i); y
- (iii)
- determinar la cantidad de la forma patogénica de proteína \beta-amiloide (1) en la presencia de dicho compuesto y (2) en la ausencia de dicho compuesto;
en el que la etapa (i) comprende la etapa (ia)
de incubación de dicha forma patogénica/no patogénica de proteína
\beta-amiloide y las etapas (ia) y (ii) forman un
ciclo que se repite al menos dos veces antes de realizar la etapa
(iii).
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| EP00127892 | 2000-12-20 | ||
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| EP01102732 | 2001-02-07 |
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