KR20240091073A - 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 실시형태는 세포의 성분을 분석하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 단일 세포의 성분을 분석하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 방법 및 조성물은 핵산을 서열분석하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 방법 및 조성물은 핵산, 단백질, 세포 소기관, 및/또는 세포 대사산물을 식별 및/또는 정량분석하는 것에 관한 것이다.

Description

세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물 {The method and the composition for analyzing the cellular constituent}

본 출원의 실시형태는 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 출원은 단일 세포의 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 출원은 단일 세포 유형을 식별하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법 및 조성물은 핵산을 서열분석하는 것에 관한 것이다. 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 이러한 단일 세포의 조성 상태를 유도하기에 유용하다.

생물학적 샘플에 존재하는 특이적인 핵산 서열의 검출은 예를 들어, 미생물을 식별 및 분류하기 위한 방법, 전염성 질환을 진단하기 위한 방법, 유전 이상을 검출 및 특징분석하기 위한 방법, 암과 연관된 유전자 변화를 식별하기 위한 방법, 질환에 대한 유전적 감수성을 연구하기 위한 방법 및 다양한 치료 유형에 대한 반응을 측정하기 위한 방법으로서 사용되어 왔다. 생물학적 샘플에서 특이적인 핵산 서열을 검출하기 위한 일반적인 기술은 핵산 서열분석이다.

핵산 서열분석 방법은 주로 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert)에 의해서 사용된 화학적 분해 방법 및 생어(Sanger)에 의해서 사용된 가닥 신장 방법으로부터 발달하였다. 최근 몇몇 서열분석 방법이 사용되는데, 이것은 단일 서열분석 실시에서 핵산 모두를 병렬 가공하는 것을 가능하게 한다. 이와 같이, 단일 서열분석 실시로부터 생성된 정보는 방대할 수 있다.

도 1은 단일 세포 내용물을 중합체 매트릭스 중에 내장시키거나 또는 비드에 부착시킴으로써 생성된 DNA 인접성 보존 요소(contiguity preserving element: CE)의 4 티어 조합 인덱싱(tier combinatoric indexing)의 개략도. 구획-특이적인 인덱스가 각각의 조합 풀링(pooling) 및 재분포 단계(티어)에 부착되어 있다. 도시된 예에서, 4개의 티어는 (결찰, 중합효소 연장, 태그화(tagmentation) 등의 반복되는 순회를 통해서) 함께 연관된 4개의 인덱스를 유발하여, 용이한 서열분석 판독을 가능하게 한다. 대안적으로, DNA를 포함하는 인접성 보존 요소는 매트릭스 내에 캡슐화되거나 비드 상에 고정된 구획화된 DNA 분할물(compartmentalized DNA partition)(즉, 본래 DNA 샘플을 하위샘플링하는 DNA 희석)에 의해서 생성될 수 있다. 희석의 이러한 유형은 단계화(phasing) 응용 및 조립 응용에 유용하다.
도 2는 2 티어 조합 인덱싱 방법을 사용하여 단일 세포 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법(여기서 제1 수준 인덱스는 태그화(트랜스포존(transposon) 내의 구획-특이적인 인덱스)를 통해서 부착되고, 제2 티어 인덱스는 PCR(PCR 프라이머 상의 구획-특이적인 인덱스)에 의해서 부착됨. 단일 세포 용기의 내용물(즉, 게놈 DNA 또는 cDNA)는 임의적인 전체 게놈 증폭(WGA) 또는 전체 전사체 증폭 단계를 사용할 수 있다.
도 3은 CE, 예컨대 액적(droplet) 내의 단일 세포의 내용물로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법을 도시한 도면. 도시된 예에서, 인덱스는 상이한 샘플을 표지하는 데 사용된다.
도 4는 제안된 조합 인덱싱 방법을 통해서 분석될 수 있는 단일 세포의 대표적인 내용물을 도시한 도면.
도 5A 및 5B는 캡슐화로부터 인접성 보존 요소(CE)를 생성하고, CE, 예컨대 중합체 비드 내에 갇힌 단일 세포의 내용물을 용해시키기 위한 예시적인 개략적인 실시형태를 도시한 도면. 세포를 예를 들어, 중합체 비드 내에 내장시킨다. 단일 세포로부터의 성분 모두는 비드 내에서 또 다른 것에 근접하게 유지된다. 이어서, 하나 이상의 성분을 증폭, 변형(cDNA 합성)시키고, 그 후에 인덱스 또는 태그를 사용하에 표지화할 수 있다. 도 5C는 캡슐화, 증폭/cDNA, 또는 중합 단계에서 암호화 DNA 서열(예컨대 플라스미드)을 스파이킹함으로써 샘플 인덱싱이 달성될 수 있는 예시적인 개략적인 실시형태를 도시한 도면. 각각의 샘플은 암호화 플라스미드 또는 암호화 플라스미드의 조합물의 상이한 세트를 사용하여 제조된다. 모든 조합방식으로 인덱싱된 CE는 상응하는 조합방식으로 인덱싱된 샘플 암호화 라이브러리 요소를 생산할 것이다. 이러한 방식에서, 모든 라이브러리 요소는 이의 본래 CE 및 본래 샘플에 다시 맵핑될 수 있다.
도 6은 CE, 예컨대 중합체 매트릭스 비드 내에 단일 세포 내용물을 캡슐화하기 위한 개략도.
도 7은 직접 표면 포획에 의한 세포 성분의 고 처리량 분석법의 예시적인 개략도. "A"는 세포의 수집물을 나타낸다. "B"는 표면-결합된 트랜스포좀(transposome)을 나타낸다. "C"에서, 세포는 표면 상으로 유동한다. "D"에서 세포는 용해되고, 세포의 성분은 세포가 포획되는 부위 주변에서 제어된 방식으로 확산된다. "E"에서 핵산은 트랜스포좀에 의해서 포획(태그화)된다. 세포막이 용해되는지 또는 핵이 용해되는지에 따라서 상이한 세포 성분이 포획된다. 성분-특이적인 포획 모이어티(즉, 항체, 수용체, 리간드)를 사용함으로써, 다양한 세포 성분이 포획될 수 있다. 포획된 분자의 분석을 포획 표면 상에서 직접 수행할 수 있다. 대안적으로, 포획된 분자를 수획하고, 상이한 표면 상에서 분석할 수 있다. 이 경우에, 제1 표면은 다수의 면적(즉, 패드)으로 제조되고, 각각의 패드는 동일한 패드 상에 포획된 분자가 동일한 식별 바코드를 공유할 것이도록 동일한 바코드를 공유하는 올리고(oligo)로 코팅된다.
도 8은 비드 상의 인접성 보존 요소를 사용하여 핵산을 분석하는 예시적인 개략도.
도 9A 내지 D는 예시적인 모델링 전략을 도시한 도면.
도 10은 인접 요소를 생성하기에 유용한 입자를 생성하는 방법을 도시한 도면.

본 발명의 일부 양상은 인접성 보존 요소(CE) 내에 보존 또는 내장 또는 함유된 단일 세포의 성분을 평가하는 것에 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.

일 양상에서 본 명세서에는 단일 세포로부터의 복수의 분석물 유형을 분석하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 인접성 보존 요소(CE)를 제공하고, 각각의 CE는 단일 세포를 포함한다. 세포를 단일 세포 내의 복수의 분석물이 CE 내에서 방출되도록 CE 내에서 용해시킨다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티(reporter moiety)의 각각의 유형이 분석물의 각각의 유형에 특이적이도록 복수의 유형의 리포터 모이어티를 제공한다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 단일 세포를 식별한다. 분석물의 각각의 유형이 분석물 유형에 특이적인 리포터 모이어티를 포함하도록 복수의 분석물을 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 리포터 모이어티를 포함하는 분석물을 포함하는 CE를 조합한다. 일부 실시형태에서, 상기 리포터 모이어티를 포함하는 분석물을 포함하는 조합된 CE를 구획화한다. 일부 실시형태에서 추가 리포터 모이어티를 제공하고, 분석물이 2개 이상의 상이한 리포터 모이어티를 포함하도록 분석물을 포함하는 분석물과 조합한다. 분석물의 특질(identity)을 검출하고, 리포터 모이어티가 단일 세포로부터의 분석물의 공급원을 식별하도록 리포터 모이어티를 포함하는 분석물을 분석한다.

일부 실시형태에서, 예시적인 복수의 분석물은 DNA, RNA, cDNA, 단백질, 지질, 탄수화물, 세포내 세포 소기관(예를 들어, 핵, 골지체, 리보솜, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체, 세포막 등), 세포 대사산물, 조직 분절, 세포, 단일 세포, 세포 또는 단일 세포로부터의 내용물, 세포 또는 단일 세포로부터 단리된 핵산 또는 세포 또는 단일 세포로부터 단리되고 추가로 변형된 핵산 또는 무세포 DNA(예를 들어, 태수(placental fluid) 또는 혈장으로부터)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 게놈 DNA 및 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 폴리 A 테일(poly A tail)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 및 mRNA를 동시에 CE 내에서 고체 지지체 상에 고정시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA의 고정화는 고체 지지체에 대한 mRNA의 고정화에 대해서 순차적이다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA를 트랜스포좀 복합체와 조합하고, 트랜스포존 단부를 고체 지지체 상에 고정시키고, mRNA를 고체 지지체 상에 고정된 올리고(dT) 프로브의 혼성화에 의해서 고체에 고정시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA를 트랜스포좀 복합체와 조합하고, 임의로, mRNA가 고체 지지체 상에 고정된 올리고 (dT) 프로브의 혼성화에 의해서 고체에 고정되도록 트랜스포존 단부는 고체 지지체 상에 고정된 상보 서열에 혼성화한다. 다른 방법을 사용하여 마찬가지로 mRNA를 고정시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 유동 셀 표면이다. 일부 실시형태에서, 고체 표면은 반응 용기의 벽이다.

일부 실시형태에서, 방법은 CE 내에 보존 또는 내장 또는 함유된 핵산을 서열분석하는 단계를 포함한다. 특히, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 실시형태는 핵산 템플레이트를 제조하고, 그로부터 서열 데이터를 수득하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에 제공된 방법 및 조성물에 관한 것이며, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 발명의 일부 실시형태는 CE 내에서 DNA를 제조하여 표적 핵산으로부터 단계화 및 서열 조립 정보를 수득하고, 이러한 템플레이트로부터 단계화 및 서열 조립 서열 정보를 수득하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 제공된 특정 실시형태는 단편화된 핵산의 연관된 단부의 물리적인 근접성을 유지시키기 위해서 인테그라제(integrase), 예를 들어 전이효소(transposase)를 사용하고; 각각의 CE로부터의 개별 라이브러리를 생성하기 위해서 조합 인덱싱을 사용하는 것에 관한 것이다. CE로부터 일배체형(haplotype) 정보를 수득하는 것은 표적 핵산에서 상이한 대립유전자들(예를 들어, SNP, 유전적 이상 등) 간의 구별을 포함한다. 이러한 방법은 표적 핵산에서 상이한 대립유전자를 특징분석하고, 서열 정보에서 오류율을 감소시키는 데 유용하다.

일 실시형태에서, 템플레이트 핵산을 CE, 예컨대 액적 중에 희석시킬 수 있다. 임의적인 전체 게놈 증폭을 사용할 수 있고, 표적 핵산의 일배체형 등가물에 대략 동등한 많은 양의 템플레이트 핵산으로부터 서열 정보를 수득할 수 있다.

추가 실시형태, 염색체의 다수의 복사체가 동일한 구획에 존재할 수 있도록 템플레이트 핵산을 구획화할 수 있고, 본 명서세에 제공된 이중 또는 다중 인덱싱의 결과로서, 일배체형이 여전히 또한 측정될 수 있다. 즉, 템플레이트 핵산을 버추얼 구획(virtual compartment)을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 핵산을 몇몇 제1 구획 사이에 분포시켜서, 각각의 구획의 핵산에 제1 인덱스를 제공하고, 핵산을 조합하고, 핵산을 몇몇 제2 구획 사이에 분포시키고, 각각의 구획의 핵산에 제2 인덱스를 제공할 수 있다. 이롭게는, 이러한 인덱싱은 핵산을 단일 구획 중에서 핵산의 일배체형에 동등한 양으로 단순히 희석하는 것에 비해서 핵산의 더 높은 농도에서 일배체형 정보를 수득할 수 있게 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "구획"은 다른 것으로부터 무엇인가를 분리 또는 단리하는 면적 또는 부피를 의미하고자 한다. 예시적인 구획은 바이알, 튜브, 벽, 액적, 볼러스, 비드, 용기, 표면 특징부 또는 물리적인 힘, 예컨대 유량, 자력(magnetism), 전기 전류 등에 의해서 분리된 면적 또는 부피를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

구획을 제조하기 위한 예시적인 방법이 도 10에 도시되어 있다. 기둥을 갖는 규소 마스터 플레이트를 사용하여 웰을 하이드로젤의 시트에 각인시킬 수 있다(하이드로젤 내의 웰은 기둥의 역상이다). 하이드로겔 내의 생성된 웰에 표적 분석물 또는 다른 시약과 함께 입자(예를 들어, 젤 또는 중합체)를 형성하는 물질을 충전시킬 수 있다. 이어서, 입자를 용해시키지 않는 기술에 의해서 하이드로젤 시트를 용해시킬 수 있다. 이어서, 입자를 수집하고, 본 명세서에 언급된 방법을 사용하여 조작할 수 있다.

본 명세서에 제공된 일부 실시형태에서, 템플레이트 라이브러리는 트랜스포좀을 사용하여 제조된다. 일부 이러한 라이브러리에서, 표적 핵산을 단편화할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 일부 실시양태는 가까운 단편의 물리적인 인접을 위해서 서열 정보를 유지시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 표적 핵산에 가까운 템플레이트 핵산 단편의 회합을 유지시키기 위해서 인테그라제를 사용하는 것을 포함한다. 이롭게는, 단편화된 핵산의 물리적 근접성을 유지시키기 위해서 이러한 인테그라제를 사용하는 것은 동일한 본래 분자로부터의 단편화된 핵산, 예를 들어, 염색체가 동일한 구획에서 발생할 가능성을 증가시킨다.

본 명세서에 제공된 다른 실시형태는 핵산의 각각의 가닥으로부터 서열 정보를 수득하는 것에 관한 것인데, 이것은 서열분석 정보에서 오류율을 감소시키기에 유용할 수 있다. 핵산의 각각의 가닥으로부터 서열 정보를 수득하기 위해서 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법은, 각각의 가닥이 구될 수 있고, 각각의 가닥의 산물이 또한 구별될 수 있도록 제조될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법 중 일부는 핵산을 분석하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 표적 핵산의 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조하는 단계, 템플레이트 핵산의 라이브러리로부터 서열 데이터를 수득하는 단계, 및 이러한 서열 데이터로부터 표적 핵산의 서열 표현을 조립하는 단계를 포함한다.

일반적으로, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에 제공된 방법 및 조성물에 관한 것이고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에 제공된 방법은 특징부를 표적 핵산에 삽입하기에 유용한 트랜스포좀을 사용하는 것에 관한 것이다. 이러한 특징부는 단편화 부위, 프라이머 부위, 바코드, 친화성 태그, 리포터 모이어티 등을 포함한다.

본 명세서에 제공된 실시형태에서 유용한 방법에서, 템플레이트 핵산의 라이브러리를 표적 핵산을 포함하는 CE로부터 제조한다. 복수의 독특한 바코드를 표적 핵산 전체에 삽입 또는 부착함으로써 라이브러리를 제조한다. 일부 실시형태에서, 각각의 바코드는 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함하고, 그들 사이에 배치된 단편화 부위를 갖는다. 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열은 서로와 쌍을 이루도록 식별 또는 설계될 수 있다. 쌍을 이루는 것은 제1 바코드가 제2 바코드와 연관되도록 정보성일 수 있다. 이롭게는, 쌍을 이룬 바코드 서열을 사용하여 템플레이트 핵산의 라이브러리로부터 서열분석 데이터를 조립할 수 있다. 예를 들어, 제1 바코드 서열을 포함하는 제1 템플레이트 핵산 및 제1 템플레이트 핵산과 쌍을 이룬 제2 바코드 서열을 포함하는 제2 템플레이트 핵산은, 제1 템플레이트 핵산 및 제2 템플레이트 핵산이 표적 핵산의 서열 표현에서 서로에 가까운 서열을 표현한다는 것을 나타낸다. 이러한 방법을 사용하여 표준 게놈의 요건 없이도, 신규 표적 핵산의 서열 표현을 조립할 수 있다.

일부 실시형태에서, 각각의 단일 세포로부터의 표적 핵산이 독특한 바코드(예를 들어, 바코드의 독특한 조합)을 포함하여, 상이한 단일 세포로부터의 상이한 표적 핵산으로부터 용이하게 식별될 수 있도록 다중 조합 바코딩을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서 CE는 단일 세포로부터의 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CE 내의 표적 핵산은 상이한 CE 내의 표적 핵산과 상이한 식별 가능한 독특한 바코드를 가질 것이다.

일부 실시형태에서, 단일 세포 내의 성분이 상이한 단일 세포로부터의 성분으로부터 식별될 수 있도록 핵산에 더하여 단일 세포 내의 성분, 예를 들어 단백질, 세포 소기관, 지질, 또는 세포막에 다중 조합 표지 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, CE는 단일 세포 내의 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CE 내의 단일 세포의 성분은 상이한 CE 내의 단일 세포의 성분과 상이한 식별 가능한 독특한 표지(들)를 가질 것이다.

일부 실시형태에서, 다중 조합 바코딩 방법을 단일 세포로부터의 표적 핵산에 사용할 수 있고, 다중 조합 표지 방법을 단일 세포 내의 성분에 함께 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 조합 바코딩 및 조합 표지를 단일 세포를 포함하는 CE 내에서 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 조합 바코딩 및 조합 표지는 단일 세포를 포함하는 다수의 CE에 대해서 병렬로 수행할 수 있다.

일부 실시형태에서, CE 내에 보존, 내장, 고정 또는 함유된 단백질을 서열분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 단백질을 독특하게 표지한다. 일부 실시형태에서, CE 내에 보존, 내장, 고정 또는 함유된 단백질을 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해서 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질의 식별 및 또는 서열분석은 핵산의 서열 정보를 모으는 것과 함께 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "핵산" 및/또는 "올리고뉴클레오타이드" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 함께 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드 단량체를 지칭한다. 핵산은 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 포함하지만; 일부 실시형태에서, 핵산 유사체는 예를 들어, 포스포르아마이드(문헌[Beaucage, et al., Tetrahedron, 49:1925 (1993)]; [Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970)]; [Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977)]; [Letsinger, et al.,Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986)]; [Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984)], [Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)]; 및 [Pauwels,et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)]), 포스포로티오에이트(문헌[Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991)]; 및 미국 특허 제5,644,048호), 포스포로다이티오에이트(문헌[Briu, et al.,J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)]), O-메틸포스포로아미다이트 연결(문헌[Eckstein, Oligonucleotides and 유사체s: A Practical Approach, Oxford University Press] 참고), 및 펩타이드 핵산 골격 및 연결(문헌[Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al.,Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993)]; [Carlsson, et al.,Nature, 380:207 (1996)] 참고)을 포함하는, 다른 유형의 골격을 가질 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

다른 유사 핵산은 양성(positive) 골격(문헌[Denpcy, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)]); 비이온성 골격(미국 특허 제5,386,023호; 제5,637,684호; 제5,602,240호; 제5,216,141호; 및 제4,469,863호; 문헌[Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991)]; [Letsinger, et al.,J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)]; [Letsinger, et al.,Nucleosides & Nucleotides, 13:1597 (1994)]; [Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook]; [Mesmaeker, et al.,Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994)]; [Jeffs, et al.,J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994)]; [Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)]) 및 비-리보스(미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호, 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Coo])을 갖는 것을 포함한다. 핵산은 또한 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유할 수 있다(문헌[Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169 176] 참고). 상기 문헌은 참고로 본 명세서에 포함된다.

리보스-포스페이트 골격의 변형은 추가 모이어티, 예컨대 표지의 부가를 용이하게 하거나, 또는 특정 조건하에서 이러한 분자의 안정성을 증가시키기 위해서 수행될 수 있다. 또한, 자연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물을 제조할 수 있다. 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 자연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물을 제조할 수 있다. 핵산은 명시된 바와 같이 단 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 또는 단 가닥 서열 둘 모두의 부분을 함유할 수 있다. 예컨대, 환경 샘플, 추가로 예시적인 혼합된 조직 샘플을 위한 혼합된 샘플 또는 동일한 종의 상이한 개체, 질환 샘플, 예컨대 암 관련 핵산 등을 위한 혼합된 샘플로부터의 메타게놈 샘플(metagenomic sample)에서와 같이, 핵산은 단일 세포, 다중 세포, 또는 다중 종으로부터의 DNA, 예를 들어, 게놈 또는 cDNA, RNA 또는 혼성체일 수 있다. 핵산은 데옥시리보-뉴클레오타이드 및 리보-뉴클레오타이드의 임의의 조합물, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔탄인, 하이포잔탄인, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 및 염기 유사체, 예컨대 나이트로피롤(3-나이트로피롤 포함) 및 나이트로인돌 (5-나이트로인돌 포함) 등을 비롯한, 염기의 임의의 조합물을 함유할 수 있다.

일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 1종의 잡다한 염기를 포함할 수 있다. 잡다한 염기는 1종을 초과하는 상이한 유형의 염기와 염기-쌍을 이룰 수 있다. 일부 실시형태에서, 잡다한 염기는 적어도 2종의 상이한 유형의 염기, 및 3종 이하의 상이한 유형의 염기와 염기-쌍을 이룰 수 있다. 잡다한 염기의 예는 아데닌, 티민, 또는 사이토신과 쌍을 이룰 수 있는 이노신을 포함한다. 다른 예는 하이포잔틴, 5-나이트로인돌, 아시클릭(acylic) 5-나이트로인돌, 4-나이트로피라졸, 4-나이트로이미다졸 및 3-나이트로피롤(문헌[Loakes et al.,Nucleic Acid Res. 22:4039 (1994)]; [Van Aerschot et al.,Nucleic Acid Res. 23:4363 (1995)]; [Nichols et al.,Nature 369:492 (1994)]; [Bergstrom et al.,Nucleic Acid Res. 25:1935 (1997)]; [Loakes et al., Nucleic Acid Res. 23:2361 (1995)]; [Loakes et al.,J. Mol. Biol. 270:426 (1997)]; 및 [Fotin et al.,Nucleic Acid Res. 26:1515 (1998)])을 포함한다. 적어도 3종, 4종 또는 그 초과의 유형의 염기와 염기-쌍을 이룰 수 있는 잡다한 염기가 또한 사용될 수 있다. 상기 참고 문헌은 참고로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드 유사체" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 일반적으로 다른 어디에 기술된 바와 같이 변형된 뉴클레오타이드 염기 부분, 변형된 펜토스 부분 및/또는 변형된 포스페이트 부분, 및 폴리뉴클레오타이드의 경우에, 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 합성 유사체를 지칭할 수 있다(예를 들어, 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980]; [Englisch, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:613-29, 1991]; [Agarwal, Protocols for polynucleotides and Analogs, Humana Press, 1994]; 및 [S. Verma and F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998]). 일반적으로, 변형된 포스페이트 부분은 인 원자가 +5 산화 상태로 존재하고, 산소 원자 중 하나 이상이 비-산소 모이어티, 예를 들어, 황으로 대체된 포스페이트의 유사체를 포함한다. 예시적인 포스페이트 유사체는 회합된 반대이온(이러한 반대이온이 존재하면), 예를 들어 H⁺, NH₄ ⁺, Na⁺를 포함하는, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트, 보로노포스페이트를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 변형된 뉴클레오타이드 염기 부분의 예는 5-메틸사이토신(5mC); C-5 프로피닐-C 및 C-5 프로피닐-U를 포함하지만 이에 제한되지 않는 C-5-프로피닐 유사체; 2-아미노 아데닌 또는 2-아미노-dA로서도 공지된, 2,6-다이아미노퓨린; 하이포잔틴, 유사우리딘, 2-티오피리미딘, 아이소사이토신(isoC), 5-메틸 isoC, 및 아이소구아닌(isoG; 예를 들어, 미국 특허 제5,432,272호 참고)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 변형된 펜토스 부분은 Bz-A-LNA, 5-Me-Bz-C-LNA, dmf-G-LNA, 및 T-LNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 락킹된(locked) 핵산(LNA) 유사체(예를 들어 문헌[The Glen Report, 16(2):5, 2003]; [Koshkin et al.,Tetrahedron 54:3607-30, 1998)] 참고), 및 2'- 또는 3'-변형체(여기서 2'- 또는 3'-위치는 수소, 하이드록시, 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 알릴옥시, 아이소프로폭시, 부톡시, 아이소부톡시 및 페녹시), 아지도, 아미도, 알킬아미노, 플루오로, 클로로 또는 브로모임)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 포스페이트 유사체, 아키랄(achiral)을 갖는 유사체 및 하전되지 않은 소단위간 연결(예를 들어, 문헌[Sterchak, E. P. et al., Organic Chem., 52:4202, 1987]), 및 아키랄 소단위간 연결을 갖는 하전되지 않은 모르폴리노계 중합체(예를 들어, 미국 특허 제5,034,506 참고)를 포함한다. 일부 뉴클레오타이드간 연결 유사체는 모르폴리데이트, 아세탈, 및 폴리아마이드-연결된 헤테로사이클을 포함한다. 유사상보(pseudocomplementary) 펩타이드 핵산("PNA")을 비롯한, 펩타이드 핵산으로서 공지된, 뉴클레오타이드 유사체의 한 부류에서, 종래의 당 및 뉴클레오타이드간 연결은 2-아미노에틸글리신 아마이드 골격 중합체로 대체되어 있다(예를 들어, 문헌[Nielsen et al.,Science, 254:1497-1500, 1991]; [Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 1895-1897 1992]; [Demidov et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5953-58, 2002]; [Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, Nielsen, ed., Horizon Bioscience, 2004] 참고). 상기 참고 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "판독물의 서열분석" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 중합체에서 단량체의 순서를 나타내는 신호를 수득하기 위해서 수행되는 물리적 또는 화학적 단계의 반복적인 공정을 지칭할 수 있다. 신호는 단일 단량체 분해능 또는 더 낮은 분해능에서 단량체의 순서를 나타낼 수 있다. 특정 실시형태에서, 단계는 핵산 표적 상에서 시작되고, 핵산 표적에서 염기의 순서를 나타내는 신호를 수득하도록 수행될 수 있다. 공정은 이의 전형적인 완결까지 수행될 수 있는데, 이것은 보통 공정으로부터의 신호가 표적의 염기를 타당한 수준의 확실성으로 더 이상 구별할 수 없는 지점에 의해서 정의된다. 바람직한 경우, 완결은 더 빨리, 예를 들어, 서열 정보의 바람직한 양이 수득되었을 때, 일어날 수 있다. 판독물의 서열분석은 단일 표적 핵산 분자 상에서, 또는 동일한 서열을 갖는 표적 핵산의 집단 상에서 동시에, 또는 상이한 서열을 갖는 표적 핵산 분자의 집단 상에서 동시에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 판독물의 서열분석은 신호 획득이 시작된 하나 이상의 표적 핵산 분자로부터 신호가 더 이상 수득되지 않을 때 종결된다. 예를 들어, 판독물의 서열분석은 고체상 물질 상에 존재하는 1종 이상의 표적 핵산 분자에 대해서 시작될 수 있고, 그 물질로부터의 하나 이상의 표적 핵산 분자가 제거되었을 때 종결될 수 있다. 서열분석은 서열분석 실시가 시작되었을 때 물질 상에 존재하는 표적 핵산의 검출을 달리 중단함으로써 종결될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열분석 표현" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 중합체에서 단량체 단위의 순서 및 유형을 의미하는 정보를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 이러한 정보는 핵산 중의 뉴클레오타이드의 순서 및 유형을 나타낼 수 있다. 정보는 예를 들어, 표시, 영상, 전자 매체, 기호 시리즈, 숫자 시리즈, 문자 시리즈, 색상 시리즈 등을 비롯한 임의의 다양한 포맷으로 존재할 수 있다. 정보는 단일 단량체 분해능이거나 더 낮은 분해능으로 존재할 수 있다. 예시적인 중합체는 핵산, 예컨대 뉴클레오타이드 단위를 갖는 DNA 또는 RNA이다. 일련의 "A", "T", "G", 및 "C" 문자는 단일 뉴클레오타이드 분해능에서, DAN 분자의 실제 서열과 상관될 수 있는 DNA에 대한 널리-알려진 서열 표현이다. 다른 예시적인 중합체는 아미노산 단위를 갖는 단백질 및 당류 단위를 갖는 다당류이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "적어도 일부" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 총량의 임의의 분획을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "적어도 일부"는 총량의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.9% 또는 100%를 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출하다" 및/또는 이의 문법적인 등가물은 분석물의 존재 또는 현존을 식별하고/하거나 분석물의 개별 성분, 예를 들어 서열 정보를 식별하고/하거나 이러한 분석물의 양을 정량분석하는 것을 지칭할 수 있다.

단편화 부위

루핑된(looped) 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서에서, 연결기는 단편화 부위를 포함할 수 있다. 단편화 부위는 제1 바코드 서열과 제2 바코드 서열 간의 정보적인 회합이 아닌 물리적인 회합을 절단하는 데 사용될 수 있다. 절단은 생화학적, 화학적 또는 다른 수단에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단편화 부위는 다양한 수단에 의해서 단편화될 수 있는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단편화 부위는 제한 엔도뉴클레아제 부위; RNAse로 절단 가능한 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드; 특정 화학 작용제의 존재하에서 절단 가능한 뉴클레오타이드 유사체; 퍼아이오데이트로의 처리에 의해서 절단 가능한 다이올 연결; 화학적 환원제로 절단 가능한 다이설파이드기; 광화학적 절단에 적용될 수 있는 절단 가능한 모이어티; 및 펩티다제 효소 또는 다른 적합한 수단에 의해서 절단 가능한 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개WO 2012/061832호를 참고하기 바라며, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

프라이머 부위

일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 프라이머에 혼성화될 수 있는 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 증폭, 서열분석 등에 유용한 적어도 제1 프라이머 부위를 포함할 수 있다

일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 "서열분석 어댑터(adaptor)" 또는 "서열분석 어댑터 부위", 즉 프라이머에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 부위를 포함하는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 증폭, 서열분석 등에 유용한 적어도 제1 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서, 연결기는 서열분석 어댑터를 포함할 수 있다. 루핑된 트랜스포좀을 포함하는 추가 실시형태에서, 연결기는 적어도 제1 프라이머 부위 및 제2 프라이머 부위를 포함한다. 이러한 실시형태에서 프라이머 부위의 배향은 제1 프라이머 부위에 혼성화된 프라이머 및 제2 프라이머 부위에 혼성화된 프라이머가 동일한 배향이거나 또는 상이한 배향으로 존재하도록 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 연결기는 제1 프라이머 부위, 제2 프라이머 부위를 포함할 수 있고, 이것은 그들 사이에 배치된 증폭 가능하지 않은 부위를 갖는다. 증폭 가능하지 않은 부위는 제1 프라이머 부위와 제2 프라이머 부위 사이에서 폴리뉴클레오타이드 가닥의 연장을 차단하는 데 유용하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드 가닥은 프라이머 부위 중 하나에 혼성화된다. 증폭 가능하지 않은 부위는 또한 연쇄체를 예방하는 데 유용할 수 있다. 증폭 가능하지 않은 부위의 예는 뉴클레오타이드 유사체, 비-뉴클레오타이드 화학 모이어티, 아미노산, 펩타이드, 및 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭 가능하지 않은 부위는 A, C, G 또는 T와 유의하게 염기-쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 일부 실시형태는 제1 프라이머 부위, 제2 프라이머 부위를 포함하고, 그들 사이에 배치된 단편화 부위를 갖는 연결기를 포함한다. 다른 실시형태는 미국 특허 제7,741,463호에 기술된 바와 같은 방향성 서열분석에 유용한 차상(forked) 또는 Y-형 어댑터 설계를 사용할 수 있고, 이의 개시 내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

프라이머 결합 부위의 예시적인 서열은 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(P5 서열) 및 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(P7 서열)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

리포터 모이어티

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포터 모이어티" 및 이의 문법적인 등가물은 임의의 식별 가능한 태그, 표지, 인덱스, 바코드 또는 연구되는 분석물의 조성, 특질 및/또는 공급원을 결정하게 하는 기를 지칭할 수 있다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자는 다수의 상이한 종의 리포터 모이어티가 개별적으로 또는 1종 이상의 상이한 리포터 모이어티와 조합하여 본 명세서에 기술된 방법 및 조성과 함께 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 실시형태에서, 1종을 초과하는 상이한 리포터 모이어티를 사용하여 1종을 초과하는 분석물을 동시에 분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 상이한 리포터 모이어티를 동시에 사용하여 단일 세포 또는 단일 세포의 성분을 독특하게 식별할 수 있다.

특정 실시형태에서, 리포터 모이어티는 신호를 방출할 수 있다. 신호의 예는 형광, 화학발광, 생물발광, 인광, 방사성, 열량, 이온 활성, 전자 또는 전기화학발광 신호를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 리포터 모이어티는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에 열거되어 있으며, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 어댑터일 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 리포터 모이어티를 포함할 수 있다. 루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서, 연결기 또는 어댑터는 리포터 모이어티를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 신호를 방출할 수 없다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 핵산 단편, 예컨대 바코드, 독특한 분자 인덱스, 플라스미드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터는 핵산 태그로 표지된 항체 또는 친화성 시약을 포함할 수 있다. 핵산 태그는 예를 들어, 근접 결찰 검정법(proximity ligation assay: PLA) 또는 근접 연장 검정법(proximity extension assay: PEA)을 통해서 검출 가능할 수 잇다.

일부 실시형태에서, 리포터 모이어티의 세트를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티의 세트는 리포터 모이어티의 하위세트의 혼합물을 포함할 수 있고, 여기서 리포터 모이어티의 각각의 하위세트는 분석물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물의 상이한 유형에 대해서 특이적이다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티의 세트는 리포터 모이어티의 하위세트의 혼합물을 포함할 수 있고, 여기서 리포터 모이어티의 각각의 하위세트는 서로 상이하지만, 분석물의 동일한 유형에 대해서 특이적이다.

바코드

일반적으로, 바코드는 1종 이상의 특정 분석물, 예컨대 핵산, 단백질, 대사산물 또는 본 명세서에 언급되거나 관련 기술 분야에 공지된 다른 분석물을 식별하는 데 사용될 수 있는 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 인공 서열일 수 있거나, 또는 전위(transposition) 동안 발생된 자연 발생 서열, 예컨대 이전에 병치된 DNA 단편의 단부에서 동일한 플랭킹(flanking) 게놈 DNA 서열(g-코드)일 수 있다. 바코드는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100개 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바코드를 포함하는 핵산의 집단에서 바코드의 적어도 일부는 상이하다. 일부 실시형태에서, 바코드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%가 상이하다. 보다 이러한 실시형태에서, 바코드의 전부가 상이하다. 바코드를 포함하는 핵산의 집단에서 상이한 바코드의 다양성은 무작위로 생성되거나 또는 비-무작위로 생성될 수 있다.

일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 적어도 하나의 바코드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개의 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀과 같이, 제1 트랜스포존 서열은 제1 바코드를 포함하고, 제2 트랜스포존 서열은 제2 바코드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루핑된 트랜스포좀에서와 같이, 트랜스포존 서열은 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함하는 바코드를 포함한다. 상기 실시형태 중 일부에서, 제1 바코드 서열은 제2 바코드 서열과 쌍을 이루도록 식별 또는 설계될 수 있다. 예를 들어, 알고 있는 제1 바코드 서열은 서로에 쌍을 이룬다고 알려진 복수의 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함하는 표준 테이블을 사용하여 알고 있는 제2 바코드 서열과 쌍을 이룬다는 것을 알 수 있다.

또 다른 예에서, 제1 바코드 서열은 제2 바코드 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 바코드 서열은 제2 바코드 서열의 역 상보를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열은 상이하다. 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열은 이중-암호(bi-code)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 바코드가 템플레이트 핵산의 제조에서 사용된다. 이해될 바와 같이, 광범위한 수의 사용 가능한 바코드가 각각의 템플레이트 핵산 분자가 독특한 식별을 포함하는 것을 허용한다. 템플레이트 핵산의 혼합물에서 각각의 분자의 독특한 식별은 몇몇 응용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 독특하게 식별된 분자는 다수의 염색체를 갖는 샘플, 게놈, 세포, 세포 유형, 세포 질환 상태, 및 종, 예를 들어 일배체형 서열분석, 모 대립유전자 구별, 메타게놈 서열분석 및 게놈의 샘플 서열분석에서 개별 핵산 분자를 식별하는 데 적용될 수 있다. 예시적인 바코드 서열은 TA태그CCT, A태그AGGC, CCTATCCT, GGCTCTGA, AGGCGAAG, TAATCTTA, CAGGACGT 및 GTACTGAC를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

연결기

루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태는 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함하고, 그 사이에 배치된 연결기를 갖는 트랜스포존 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 연결기는 존재하지 않을 수 있거나, 하나의 뉴클레오타이드를 다른 것에 연결하는 당-포스페이트 골격일 수 있다. 연결기는 예를 들어, 뉴클레오타이드, 핵산, 비-뉴클레오타이드 화학 모이어티, 뉴클레오타이드 유사체, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 연결기는 핵산을 포함한다. 연결기는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결기는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 연결기는 예를 들어 PCR, 회전 환 증폭, 가닥 치환 증폭 등에 의해서 증폭 가능할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결기는 증폭 가능하지 않은 모이어티를 포함할 수 있다. 증폭 가능하지 않은 연결기의 예는 유기 화학 연결기, 예컨대 알킬, 프로필, PEG; 비-자연 염기, 예컨대 IsoC, isoG; 또는 DNA-기반 증폭 방법에서 증폭하지 않는 임의의 기를 포함한다. 예를 들어, isoC, isoG 쌍을 함유하는 트랜스포존은 상보 isoG 및 isoC가 결여된 dNTP 혼합물로 증폭될 수 있어서, 삽입된 트랜스포존을 통해서 어떤 증폭도 일어나지 않는 것을 보장한다.

일부 실시형태에서, 연결기는 단-가닥 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결기는 5'-3' 배향, 5'-5' 배향, 또는 3'-3' 배향으로 트랜스포존 서열을 커플링한다.

친화성 태그

일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 친화성 태그를 포함할 수 있다. 루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서, 연결기는 친화성 태그를 포함할 수 있다. 친화성 태그는 다양한 응용, 예를 들어 혼성화 태그에 혼성화된 표적 핵산의 벌크 분리에 유용할 수 있다. 추가 응용은 예를 들어, 전이효소/트랜스포존 복합체 및 트랜스포존 삽입된 표적 DNA, 표적 RNA 또는 표적 단백질을 정제하기 위해서 친화성 태그를 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 태그" 및 이의 문법적인 등가물은 다-성분 복합체의 성분을 지칭할 수 있는데, 여기서 다-성분 복합체의 성분은 서로와 특이적으로 상호작용하거나 서로에 결합한다. 예를 들어, 친화성 태그는 각각 스트렙타비딘 또는 니켈에 결합할 수 있는 비오틴 또는 폴리-His를 포함할 수 있다. 다-성분 친화성 태그 복합체의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에 열거되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

고체 지지체

고체 지지체는 2-차원 또는 3-차원일 수 있거나, 평탄한 표면(예를 들어, 유리 슬라이드)을 포함할 수 있거나, 형상화될 수 있다. 고체 지지체는 유리(예를 들어, 제어 공극 유리(controlled pore glass: CPG)), 석영, 플라스틱(예컨대 폴리스티렌(저가교-결합 및 고가교-결합 폴리스티렌), 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)), 아크릴 공중합체, 폴리아마이드, 규소, 금속(예를 들어, 알칸티올레이트-유래된 금), 셀룰로스, 나일론, 라텍스, 덱스트란, 젤 매트릭스(예를 들어, 실리카젤), 폴리아크롤레인, 또는 복합재를 포함할 수 있다.

적합한 3-차원 고체 지지체는, 예를 들어 구체, 미세입자, 비드, 나노입자, 중합체 매트릭스 예컨대 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 알기네이트, 막, 슬라이드, 플레이트, 마이크로머신드 칩(micromachined chip), 튜브(예를 들어, 모세관 튜브), 마이크로웰, 미세유체 장치, 채널, 필터, 유동 셀, 핵산, 단백질 또는 세포의 고정화에 적합한 구조체를 포함한다. 고체 지지체는 템플레이트 핵산 또는 프라이머의 집단을 포함하는 영역을 가질 수 있는 매트릭스 또는 평탄한 어레이를 포함할 수 있다. 예는 뉴클레오사이드-유래된 CPG 및 폴리스티렌 슬라이드; 유도체화된 자성 슬라이드; 폴리에틸렌 글리콜과 그래프팅된 폴리스티렌 등을 포함한다.

일부 실시형태에서, 고체 지지체는 미소구체 또는 비드를 포함한다. 본 명세서에서 "미소구체" 또는 "비드" 또는 "입자" 또는 문법적인 등가물은 작은 개별 입자를 의미한다. 적합한 비드 조성물은 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성 물질, 토리아 졸, 탄소 흑연, 이산화티타늄, 라텍스 또는 가교-결합된 덱스트란, 예컨대 세팔로스(Sepharose), 셀룰로스, 나일론, 가교-결합된 미셀 및 테플론을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니고, 뿐만 아니라 고체 지지체를 위해서 본 명세서에 서술된 임의의 다른 물질이 모두 사용될 수 있다. 뱅스 래보러토리스, 피셔 인더스트리(Bangs Laboratories, Fishers Ind.)로부터의 "미소구체 검출 가이드(Microsphere Detection Guide)"가 도움이 되는 가이드이다. 특정 실시형태에서, 미소구체는 자성 미소구체 또는 비드이다. 일부 실시형태에서, 비드는 색 코드화될 수 있다. 예를 들어, 루미넥스(Luminex)(미국 텍사스주 오스틴 소재)로부터의 마이크로플렉스(MicroPlex)(등록상표) 미소구체가 사용될 수 있다.

비드는 구체일 필요는 없고; 불규칙적인 입자가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 즉 100nm 내지 밀리미터, 즉, 1mm의 범위이고, 약 0.2마이크로미터 내지 약 200마이크로미터의 비드가 바람직하고, 약 0.5 내지 약 5마이크로미터가 특히 바람직하지만, 일부 실시형태에서 더 작고 더 큰 비드가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 직경이 약 1, 1.5, 2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 15, 또는 20㎛m일 수 있다.

일부 실시형태에서, 비드는 항체 또는 다른 친화성 프로브를 포함할 수 있다(전형적인 부착 프로토콜에 대해서는 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Immobilized Biomolecules in Analysis. A Practical Approach. Cass T, Ligler F S, eds. Oxford University Press, New York, 1998. pp 1-14] 참고). 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성일 수 있고, 다른 실시형태에서, 항체는 다클론성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 세포 표면 에피토프에 대해서 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 세포 내부의 단백질에 대해서 특이적일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 템플레이트는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 관련 기술 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 핵산을 고체 지지체의 표면에 부착, 앵커링(anchoring) 또는 고정시킬 수 있다.

분석물

분석물은 기능, 조성, 특질 및/또는 이의 공급원이 연구되는 생물분자이다. 예시적인 분석물은 DNA, RNA, cDNA, 단백질, 지질, 탄수화물, 세포내 세포 소기관, (예를 들어, 핵, 골지체, 리보솜, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체, 세포막 등), 세포 대사산물, 조직 분절, 세포, 단일 세포, 세포 또는 단일 세포로부터의 내용물, 세포 또는 단일 세포로부터 단리된 핵산, 또는 세포 또는 단일 세포로부터 단리되고 추가로 변형된 핵산, 또는 (예를 들어, 태수 또는 혈장으로부터의) 무세포 DNA를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

표적 핵산

표적 핵산은 임의의 관심 핵산을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 핵산은 CE, 예컨대 매트릭스, 액적, 에멀젼, 고체 지지체, 또는 액체 및 효소 시약 내에서 핵산의 인접성을 유지하지만 액체 및 효소 시약에 대한 접근성을 허용하는 구획 내에 함유되거나, 갇히거나, 내장되거나 또는 고정된 임의의 관심 핵산을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 DNA, cDNA, WGA의 산물, RNA, 펩타이드 핵산, 모르폴리노 핵산, 락킹된 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 핵산들의 혼합 샘플, 배수체 DNA (즉, 식물 DNA), 이들의 혼합물 및 이들의 혼성체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 게놈 DNA 단편 또는 이의 증폭된 복사체가 표적 핵산으로서 사용된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, cDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA가 사용된다.

표적 핵산은 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 단일중합체 서열을 포함한다. 표적 핵산은 또한 반복 서열을 포함할 수 있다. 반복 서열은 예를 들어, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500 또는 1000개의 뉴클레오타이드 또는 그 초과를 비롯한 임의의 다양한 길이일 수 있다. 반복 서열은 인접하게 또는 비-인접하게, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20회, 또는 그 초과를 비롯하여 임의의 다양한 횟수로 반복될 수 있다.

본 명세서에 기술된 일부 실시형태는 단일 표적 핵산을 이용할 수 있다. 다른 실시형태는 복수의 표적 핵산을 이용할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 복수의 표적 핵산은 복수의 동일한 표적 핵산, 일부의 표적 핵산이 동일한 복수의 상이한 표적 핵산, 또는 모든 표적 핵산이 상이한 복수의 표적 핵산을 포함할 수 있다. 복수의 표적 핵산을 이용하는 실시형태는 다중 포맷으로 수행될 수 있어서 시약이 예를 들어 하나 이상의 챔버에서 또는 어레이 표면 상에서 표적 핵산에 동시에 전달된다. 일부 실시형태에서, 복수의 표적 핵산은 특정 유기체의 게놈의 실질적으로 전부를 포함할 수 있다. 복수의 표적 핵산은 예를 들어, 게놈의 적어도 약 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 비롯한, 특정 유기체의 게놈의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 일부는 게놈의 최대 약 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%인 상한을 가질 수 있다.

표적 핵산은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 단일 유기체로부터 수득된 핵산 분자로부터 또는 하나 이상의 유기체를 포함하는 자연 공급원으로부터 수득된 핵산 분자의 집단으로부터 제조될 수 있다. 핵산 분자의 공급원은 세포 소기관, 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 표적 핵산 분자의 공급원으로서 사용될 수 있는 세포는 원핵성(박테리아 세포, 예를 들어, 에세리키아(Escherichia), 바실루스(Bacillus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 클라마이디아(Chlamydia), 네이세리아(Neisseria), 트레포네마(Treponema), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 보렐리아(Borrelia), 레기오넬라(Legionella), 슈도모나스(Pseudomonas), 마이코박테리움(Mycobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 에르위니아(Erwinia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속); 아르케아온(archeaon), 예컨대 크레나르캐오타(crenarchaeota), 나노아르캐오타(nanoarchaeota) 또는 유리아르캐오티아(euryarchaeotia); 또는 진핵성, 예컨대 진균, (예를 들어, 효모), 식물, 원생동물 및 다른 기생충, 및 동물(곤충(예를 들어, 드로소필라(Drosophila)종), 선충(예를 들어, 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)), 및 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 원숭이, 비-인간 영장류 및 인간) 포함)일 수 있다.

표적 핵산 및 템플레이트 핵산은 관련 기술 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 특정 관심 서열이 풍부해질 수 있다. 이러한 방법의 예는 국제 특허 공개WO/2012/108864호에 제공되어 있고, 이것은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 템플레이트 라이브러리 제조 방법 동안 추가로 풍부해질 수 있다. 예를 들어, 핵산은 트랜스포좀의 삽입 전에, 트랜스포좀의 삽입 후에 그리고/또는 핵산의 증폭 후에, 특정 서열이 풍부해질 수 있다.

또한, 일부 실시형태에서, 표적 핵산 및/또는 템플레이트 핵산은 고도로 정제될 수 있고, 예를 들어, 핵산은 본 명세서에 제공된 방법을 사용하기 전에 오염물이 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 품질 및 크기를 유지시키는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하는 것, 예를 들어 표적 DNA의 단리 및/또는 직접적인 전위는 아가로스 플러그를 사용하여 수행될 수 있는 것이 이롭다.

일부 실시형태에서, 표적 핵산은 생물학적 샘플 또는 환자 샘플로부터 수득될 수 있다. 용어 "생물학적 샘플" 또는 "환자 샘플"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 샘플, 예컨대 1종 이상의 세포, 조직, 또는 체액을 포함한다. "체액"은 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌 척수액, 흉수, 눈물, 락탈 덕트 유체(lactal duct fluid), 림프, 가래, 소변, 양수, 또는 정액을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 샘플은 "무세포"인 체액을 포함할 수 있다. "무세포 체액"은 약 1% (w/w) 미만의 전체 세포 물질을 포함한다. 혈장 또는 혈청은 무세포 체액의 예이다. 샘플은 자연 또는 합성 기원의 시편(즉, 비세포로 제조된 세포 샘플)을 포함할 수 있다.

용어 "혈장"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 혈액 중에서 발견되는 무세포 유체를 지칭한다. "혈장"은 관련 기술 분야에 공지된 방법(예를 들어, 원심분리, 여과 등)에 의해서 혈액으로부터 전체 세포 물질을 제거함으로써 혈액으로부터 수득될 수 있다.

템플레이트 핵산을 제조하는 특정 방법

일부 실시형태는 템플레이트 핵산의 제조 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "템플레이트 핵산"은 서열 정보를 수득하기 위한 기재를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 템플레이트 핵산은 표적 핵산, 이의 단편, 또는 적어도 하나의 트랜스포존 서열을 포함하는 이의 임의의 복사체, 이의 단편, 또는 이의 임의의 복사체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 템플레이트 핵산은 서열분석 어댑터, 예컨대 서열분석 프라이머 부위를 포함하는 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CE는 표적 핵산을 포함할 수 있다.

템플레이트 핵산를 제조하는 일부 방법은 트랜스포존 서열을 표적 핵산에 삽입하여, 템플레이트 핵산을 제조하는 것을 포함한다. 일부 삽입 방법은 효소, 예컨대 전이효소 또는 인테그라제의 존재하에서, 트랜스포존 서열 또는 서열들을 표적 핵산에 통합시키기에 충분한 조건하에서, 본 명세서에 제공된 트랜스포존 서열을 표적 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, CE는 이러한 표적 핵산을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열을 표적 핵산에 삽입하는 것은 무작위적이 아닐 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 특정 부위에서 통합을 억제하는 단백질을 포함하는 표적 핵산과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 트랜스포존 서열은 단백질을 포함하는 게놈 DNA, 염색질을 포함하는 게놈 DNA, 뉴클레오솜을 포함하는 게놈 DNA, 또는 히스톤을 포함하는 게놈 DNA에 통합되는 것이 억제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 표적 핵산 내의 특정 서열에서 트랜스포존 서열을 통합시키기 위해서 친화성 태그와 회합될 수 있다. 예를 들어, 트랜스포존 서열은 특이적인 핵산 서열을 표적으로 하는 단백질, 예를 들어, 히스톤, 염색질-결합 단백질, 전사 인자, 개시 인자 등, 및 특정 서열-특이적인 핵산-결합 단백질에 결합하는 항체 또는 항체 단편과 회합될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 친화성 태그, 예컨대 비오틴과 회합되고, 친화성 태그는 핵산-결합 단백질과 회합될 수 있다. 일부 실시형태에서, CE는 이러한 표적 핵산을 포함할 수 있다.

일부 트랜스포존 서열을 표적 핵산에 통합시키는 동안, 통합 부위에서 표적 핵산의 몇몇 연속적인 뉴클레오타이드가 통합된 산물에서 복제된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 통합된 산물은 표적 핵산 내의 통합된 서열의 각각의 단부에서 복제된 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 태그" 또는 "g-태그"는 통합된 트랜스포존 서열의 각각의 단부에서 복제된 표적 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 트랜스포존 서열의 삽입에 의해서 생성될 수 있는 핵산의 단-가닥 부분은 관련 기술 분야에 널리 공지된 다양한 방법에 의해서, 예를 들어, 리가제, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 중합효소를 사용함으로써 수리될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 복수의 트랜스포존 서열을 표적 핵산에 삽입한다. 일부 실시형태는 각각의 통합된 트랜스포존 서열들 간의 평균 거리가 표적 핵산에서 연속적인 뉴클레오타이드의 특정 수를 포함하도록 복수의 트랜스포존 서열의 표적 핵산 내로의 통합을 달성하기에 충분한 조건을 선택하는 것을 포함한다.

일부 실시형태는 또 다른 트랜스포존 서열 또는 서열들 내로의 삽입이 아닌 트랜스포존 서열 또는 서열들의 표적 핵산 내로의 삽입을 달성하기에 충분한 조건을 선택하는 것을 포함한다. 다양한 방법을 사용하여 트랜스포존 서열이 또 다른 트랜스포존 서열에 삽입할 가능성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 제공된 실시형태에 유용한 이러한 방법의 예를 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

일부 실시형태에서, 조건은 통합된 트랜스포존 서열들 간의 표적 핵산에서의 평균 거리가 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드이도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 통합된 트랜스포존 서열들 간의 표적 핵산에서의 평균 거리는 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 통합된 트랜스포존 서열들 간의 표적 핵산에서의 평균 거리는 적어도 약 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 90kb, 100kb, 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 통합된 트랜스포존 서열들 간의 표적 핵산에서의 평균 거리는 적어도 약 100kb, 200kb, 300kb, 400kb, 500kb, 600kb, 700kb, 800kb, 900kb, 1000kb, 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오타이드이다. 이해될 바와 같이, 선택될 수 있는 일부 조건은 표적 핵산을 특정 수의 트랜스포존 서열과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법의 일부 실시형태는 트랜스포존 서열의 적어도 일부를 상이한 표적 핵산 내에 통합시키는 것을 달성하기에 충분한 조건을 선택하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물의 바람직한 실시형태에서, 표적 핵산 내에 통합된 각각의 트랜스포존 서열은 상이하다. 트랜스포존 서열의 특정 부분을 상이한 표적 서열 내에 통합시키는 것을 달성하기 위해서 선택될 수 있는 일부 조건은 트랜스포존 서열의 집단의 다양성 정도를 선택하는 것을 포함한다. 이해될 바와 같이, 트랜스포존 서열의 다양성은 이러한 트랜스포존 서열의 바코드의 다양성으로 인해서 부분적으로 유발된다. 따라서, 일부 실시형태는 바코드의 적어도 일부가 상이한 트랜스포존 서열의 집단을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열의 집단에서 바코드의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%가 상이하다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 통합된 트랜스포존 서열의 적어도 일부는 동일하다.

템플레이트 핵산을 제조하는 일부 실시형태는 표적 핵산을 포함하는 서열을 복사하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태는 프라이머를 표적 핵산에 통합된 트랜스포존 서열의 프라이머 부위에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 프라이머는 프라이머 부위에 혼성화되고, 연장될 수 있다. 복사된 서열은 적어도 하나의 바코드 서열 및 표적 핵산의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복사된 서열은 제1 바코드 서열, 제2 바코드 서열, 및 그 사이에 배치된 표적 핵산의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 복사된 핵산은 적어도 제2의 복사된 핵산의 제2 바코드 서열과 쌍을 이루도록 식별되거나 설계될 수 있는 제1의 복사된 핵산의 제1 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 서열분석 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열분석 데이터는 서열분석 프라이머를 사용하여 수득된다. 더 많은 실시형태에서, 프라이머 부위를 포함하는 어탭터는 핵산의 각각의 단부에 그리고 이러한 프라이머 부위로부터 증폭된 핵에 결찰될 수 있다.

템플레이트 핵산을 제조하는 일부 실시형태는 하나 이상의 트랜스포존 서열의 적어도 일부 및 표적 핵산의 적어도 일부를 포함하는 서열을 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 적어도 일부는 표적 핵산 내에 통합된, 통합된 트랜스포존 서열의 프라이머 부위에 혼성화된 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 증폭된 핵산은 제1 바코드 서열, 및 제2 바코드 서열을 포함할 수 있고, 그들 사이에 배치된 표적 핵산의 적어도 일부를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 증폭된 핵산은 적어도 제2의 증폭된 서열의 제2 바코드 서열과 쌍을 이룰 것이라고 식별될 수 있는 제1의 증폭된 핵산의 제1 바코드 서열을 포함할 수 있다.

템플레이트 핵산을 제조하는 일부 방법은 단-가닥 연결기를 포함하는 트랜스포존 서열을 삽입하는 것을 포함한다. 일례에서, 트랜스포존 서열(ME-P1-연결기-P2-ME; 모자이크 단부-프라이머 부위 1-연결기-프라이머 부위 2-모자이크 단부)을 표적 핵산 내에 삽입한다. 삽입된 트랜스포존/연결기 서열을 갖는 표적 핵산은 연장되고, 증폭될 수 있다.

본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일 실시형태에서, 단부-태깅된 표적 핵산 단편(태그화된 단편 또는 태그화)을 생산하기 위해서 대칭의 수송 가능한 단부 서열을 갖는 트랜스포좀을 사용한다. 따라서 각각의 태그화된 단편은 지향성(directionality)이 결여된 동일한 단부를 함유한다. 이어서, 트랜스포존 단부 서열을 사용한, 단일 프라이머 PCR을 사용하여 템플레이트 복사체 수를 2n에서 2n ^*2 ^x 로 증폭시킬 수 있고, 여기서 x는 PCR 사이클의 수에 상응한다. 후속 단계에서, 프라이머를 갖는 PCR을 추가 서열, 예컨대 서열분석 어댑터 서열에 부가할 수 있다.

일부 실시형태에서, 각각의 템플레이트 핵산은 적어도 하나의 다용도 프라이머 부위를 혼입하는 것이 이로울 수 있다. 예를 들어, 템플레이트 핵산은 제1 다용도 프라이머 부위를 포함하는 제1 단부 서열, 및 제2 다용도 프라이머 부위를 포함하는 제2 단부 서열을 포함할 수 있다. 다용도 프라이머 부위는 다양하게 응용될 수 있고, 예컨대 하나 이상의 템플레이트 핵산의 증폭, 서열분석 및/또는 식별에 사용할 수 있다. 제1 다용도 프라이머 부위 및 제2 다용도 프라이머 부위는 동일하거나, 실질적으로 유사하거나, 유사하거나, 상이할 수 있다. 다용도 프라이머 부위는 관련 기술 분야에 널리 공지된 다양한 방법, 예를 들어 프라이머 부위의 핵산에 대한 결찰, 테일드(tailed) 프라이머를 사용한 핵산의 증폭 및 다용도 프라이머 부위를 포함하는 트랜스포존 서열의 삽입에 의해서 핵산 내에 도입될 수 있다.

트랜스포좀

"트랜스포좀"은 통합 효소, 예컨대 인테그라제 또는 전이효소, 및 통합 인식 부위, 예컨대 전이효소 인식 부위를 포함하는 핵산을 포함한다. 본 명세서에 제공된 실시형태에서, 전이효소는 전위 반응을 촉매작용할 수 있는 전이효소 인식 부위를 갖는 기능성 복합체를 형성할 수 있다. 전이효소는 전이효소 인식 부위에 결합할 수 있고, 때때로 "태그화"라 지칭되는 공정에서 전이효소 인식 부위를 CE 내에서 표적 핵산 내에 삽입할 수 있다. 일부 이러한 삽입 사건에서, 전이효소 인식 부위의 하나의 가닥이 표적 핵산 내로 전달될 수 있다. 일례에서, 트랜스포좀은 2개의 소단위를 포함하는 이량체 전이효소, 및 2개의 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 전이효소는 2개의 소단위를 포함하는 이량체 전이효소, 및 인접한 트랜스포존 서열을 포함한다.

일부 실시형태는 과활성 Tn5 전이효소 및 Tn5-유형 전이효소 인식 부위(문헌[Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)]), 또는 R1 및 R2 단부 서열을 포함하는 MuA 전이효소 및 Mu 전이효소 인식 부위(문헌[Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983]; [Savilahti, H, et al.,EMBO J., 14: 4893, 1995])의 사용을 포함할 수 있다. ME 서열은 또한 통상의 기술자에 의해서 최적화되는 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 문헌은 참고로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에 제공된 조성물 및 방법의 특정 실시양태에서 사용될 수 있는 전위 시스템의 더 많은 예는 스타필로코쿠스 아우레수스(Staphylococcus aureus) Tn552(문헌[Colegio et al.,J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001]; [Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002]), Ty1(문헌[Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994] 및 국제 특허 공개 제WO 95/23875호), 트랜스포존 Tn7(문헌[Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996]; [Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996]), Tn/O 및 IS10(문헌[Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996]), 마리너 전이효소(Mariner transposase)(문헌[Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996]), Tc1(문헌[Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996]), P 요소(문헌[Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004]), Tn3(문헌[Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990]), 박테리아 삽입 서열(문헌[Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996]), 레트로바이러스(문헌[Brown, et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989]), 및 효모의 레트로트랜스포존(문헌[Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989])을 포함한다. 더 많은 예는 IS5, Tn10, Tn903, IS911, 및 전이효소과 효소의 조작된 버전(문헌[Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub 2009 Oct 16]; [Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5])을 포함한다. 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 인테그라제의 더 많은 예는 레트로바이러스 인테그라제 및 이러한 레트로바이러스 인테그라제, 예컨대 HIV-1, HIV-2, SIV, PFV-1, RSV로부터의 인테그라제에 대한 인테그라제 인식 서열을 포함한다.

트랜스포존 서열

본 명세서에 제공된 조성물 및 방법의 일부 실시형태는 트랜스포존 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 적어도 하나의 전이효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 적어도 하나의 전이효소 인식 부위 및 적어도 하나의 바코드를 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 유용한 트랜스포존 서열은 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에 제공되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 제1 전이효소 인식 부위, 제2 전이효소 인식 부위, 및 그 사이에 배치된 바코드를 포함한다.

비-인접한 트랜스포존 서열을 갖는 트랜스포좀

본 명세서에 제공된 일부 트랜스포좀은 2개 이상의 트랜스포존 서열을 포함하는 전이효소를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 2개의 트랜스포존 서열은 서로에 연결되어 있지 않고, 즉 트랜스포존 서열은 서로와 비-인접하다. 이러한 트랜스포좀의 예는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2010/0120098호를 참고하기 바라며, 이의 개시내용은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

루핑된 구조체

일부 실시형태에서, 트랜스포좀은 2개의 전이효소 소단위에 결합하여 "루핑된 복합체" 또는 "루핑된 트랜스포좀"을 형성하는 트랜스포존 서열 핵산을 포함한다. 일례에서, 트랜스포좀은 이량체 전이효소 및 트랜스포존 서열을 포함한다. 루핑된 복합체는 본래 표적 DNA의 정렬된 정보를 유지하고, 표적 DNA를 단편화하지 않으면서, 트랜스포존이 표적 DNA 내에 삽입되는 것을 보장할 수 있다. 인식될 바와 같이, 루핑된 구조체는 표적 핵산의 물리적인 연결성을 유지시키면서, 프라이머, 바코드, 인덱스 등을 표적 핵산에 삽입할 수 있다. 일부 실시형태에서, CE는 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 루핑된 트랜스포좀의 트랜스포존 서열은 트랜스포존 서열이 단편화되어 2개의 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀을 생성할 수 있도록 단편화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 트랜스포좀은 트랜스포존이 삽입한 이웃하는 표적 DNA 단편이 검정법의 후기 단계에서 애매하게 조립될 수 있는 암호 조합물을 수용하는 것을 보장하기에 유용하다.

트랜스포존 서열을 제조하는 특정 방법

본 명세서에 제공된 트랜스포존 서열은 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 예시적인 방법은 직접 합성법 및 헤어핀 연장법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 직접 합성법에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 포함하는 트랜스포존 서열은 화학 합성법을 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 포스포르아미다이트 전구체, 예컨대 보호된 2'-데옥시뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체로부터 유도된 것을 사용하는 고체상 합성법이다. 트랜스포존 서열분석의 예시적인 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/061832호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서, 단 가닥 연결기를 포함하는 트랜스포존 서열을 제조할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결기는 제1 전이효소 인식 서열을 포함하는 트랜스포존 서열이 제2 전이효소 인식 서열을 포함하는 제2 트랜스포존 서열에 5'에서 3' 배향으로 커플링하도록 트랜스포좀의 트랜스포존 서열을 커플링한다. 일부 실시형태에서, 연결기는 제1 전이효소 인식 서열을 포함하는 트랜스포존 서열을 제2 전이효소 인식 서열을 포함하는 제2 트랜스포존 서열에 5'에서 5' 배향으로 또는 3'에서 3' 배향으로 커플링한다. 트랜스포좀의 트랜스포존 서열을 5'에서 5' 배향으로 또는 3'에서 3' 배향으로 커플링하는 것은 전이효소 인식 요소, 특히 모자이크 요소(ME 또는 M)가 서로와 상호작용하는 것을 방지하는 데 이로울 수 있다. 커플링된 트랜스포존 서열은 알데하이드기 또는 옥시아민기를 포함하는 트랜스포존 서열을 제조함으로써 제조될 수 있다. 알데하이드기 및 옥시아민기는 상호작용하여 공유 결합을 형성하여 트랜스포존 서열을 커플링할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상보 서열을 포함하는 트랜스포좀을 제조할 수 있다. 일 실시형태에서, 전이효소를 상보 테일을 포함하는 트랜스포존 서열과 함께 적재한다. 테일은 혼성화하여 연결된 트랜스포존 서열을 형성한다. 혼성화는 트랜스포좀들 간의 혼성화 가능성을 감소시키도록 희석 조건에서 일어날 수 있다.

표적화된 삽입

본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 표적 핵산의 특정 표적화된 서열에 삽입될 수 있다. dsDNA로의 전위가 ssDNA 표적으로의 전위보다 더 효율적일 수 있다. 일부 실시형태에서, dsDNA는 ssDNA로 변성되고, 올리고뉴클레오타이드 프로브(20 내지 200개의 염기)와 어닐링(annealing)된다. 이들 프로브는 본 명세서에 제공된 트랜스포좀을 갖는 통합 부위로서 효율적으로 사용될 수 있는 dsDNA의 부위를 생성한다. 일부 실시형태에서, dsDNA는 recA-코팅된 올리고 프로브를 사용하여 D-루프를 형성하고, 이어서 트리플렉스(triplex)를 형성하는 것을 사용하여 표적화될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, D-루프는 Tn4430 전이효소를 포함하는 트랜스포좀에 대한 바람직한 기재이다. 더 많은 실시형태에서, dsDNA에서 관심 영역은 서열-특이적인 DNA 결합 단백질, 예컨대 아연-집게(zinc-finger) 복합체 및 특이적인 DNA 영역에 대한 다른 친화성 리간드를 사용하여 표적화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 표적 핵산에서 미스매칭된 위치의 바람직한 기재를 갖는 전이효소를 포함하는 트랜스포좀을 사용하여 표적 핵산 내로의 삽입을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 MuA 전이효소, 예컨대 HYPERMU(에피센터(Epicenter))는 미스매칭된 표적에 대해서 선호성을 갖는다. 일부 이러한 실시형태에서, 미스매치를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 단-가닥 표적 핵산에 어닐링한다. MuA 전이효소, 예컨대 HYPERMU를 포함하는 트랜스포좀을 사용하여 표적 핵산의 미스매칭된 서열을 표적화할 수 있다.

인접성 보존 요소(CE)

인접성 보존 요소(CE)는 하나 이상의 검정법 단계를 통해서 아주 근접(또는 인접)하게 적어도 2종, 또는 그 초과, 또는 모든 분석물을 보존하고, 분석 시약에게 접근을 제공하는 물리적인 독립체이고, 이것은 분석물의 근접성을 잃지 않으면서 수회 풀링(pooling) 및 분열(splitting)될 수 있다.

일부 실시형태에서, CE는 고체 지지체일 수 있다. 일 실시형태에서, CE는 에멀젼 또는 액적일 수 있다. 일부 실시형태에서, CE는 젤, 하이드로젤, 또는 젤 비드이다. 일부 실시형태에서, CE는 고체 지지체, 예컨대 비드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 항체, 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 바코드를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CE는 WGA, RCA, 또는 임의의 핵산 시약의 축합에 의해서 생성된 DNA 나노볼을 구성할 수 있다.

일부 실시형태에서, CE는 중합체 매트릭스, 예컨대 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 알기네이트 등에 세포로부터 또는 단일 세포로부터의 핵산, 또는 (WGA 등으로부터의) 이의 증폭 산물을 내장시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, CE 내의 세포 또는 단일 세포의 내용물의 인접성은 (예컨대 중합체 매트릭스 내의) 캡슐화, 비드 상의 고정화 또는 포획을 통해서 성분의 다른 성분에 대한 물리적인 근접성을 보존하고, 풀링 및 재분포의 반복되는 순회를 통해서 CE 내에서 인접성 정보를 효과적으로 유지시킴으로써 유지된다. CE의 수집물이 독립적으로 풀링 및 분열되고, 검정 시약과 반응되고, 다시 풀링 및 분열되는 등 이러한 것이 수행될 수 있지만 개별 CE를 구성하는 분석물의 인접성을 유지하는 특징은 상이한 분열 및 풀 단계를 통해서 조합 인덱싱을 가능하게 한다.

일부 실시형태에서, 인접성 보존 요소 내의 분석물은 수용액, 효소(단편화효소(fragmentase), 중합효소, 리가제, 전이효소, 카이나제, 제한 엔도뉴클레아제, 프로테아제, 포스파타제, 리파제), 핵산 어댑터, 핵산 바코드, 표지를 포함한 검정 시약에 접근 가능하다.

일부 실시형태에서, CE는 세포 또는 단일 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, CE는 세포 또는 단일 세포로부터의 핵산, 예컨대 DNA, mRNA, 또는 cDNA; 단백질, 다당류, 지질 및 핵산을 비롯한, 세포 또는 단일 세포의 거대 분자, 뿐만 아니라 세포 또는 단일 세포로부터의 소분자, 예컨대 1차 대사산물, 2차 대사산물, 및 자연 산물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 핵산을 포함하는 CE를 형성하기 전에 증폭, 예컨대 PCR 또는 전체 게놈 증폭을 겪는다. 일부 실시형태에서, DNA 및 mRNA의 분석은 병렬로 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, CE의 1종 이상의 분석물을 1종 이상의 표지로 표지한다. 예시적인 표지는 DNA 바코드 또는 인덱스, 형광 표지, 화학발광 표지, RNA 바코드 또는 인덱스, 방사성 표지, 표지를 포함하는 항체, 표지를 포함하는 비드를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 실시형태에서, 방법은 (a) 표적 핵산을 포함하는 CE를 복수의 제1 용기로 구획화하는 단계; (b) 제1 인덱스를 각각의 제1 용기의 표적 핵산에 제공하여, 제1 인덱싱된 핵산을 수득하는 단계; (c) 제1 인덱싱된 핵산을 조합하는 단계;(d) 제1 인덱싱된 템플레이트 핵산을 복수의 제2 용기로 구획화하는 단계; (e) 제2 인덱스를 각각의 제2 용기의 제1 인덱싱된 템플레이트 핵산에 제공하여, 제2 인덱싱된 핵산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 a 내지 e는 a 내지 e 시리즈로부터의 하나 이상의 단계의 추가 사이클을 사용하여 계속되어 추가적인 버추얼 구획을 유도할 수 있다. 이러한 조합 인덱싱 방법을 사용하여 제한된 수의 물리적인 구획으로부터 다수의 버추얼 구획을 효과적으로 생성할 수 있다.

일부 실시형태에서, 방법은 (a) 부착된 핵산 리포터를 갖는 비-핵산 분석물(예를 들어 단백질)을 포함하는 CE를 제공하는 단계; (b) CE를 복수의 제1 용기로 구획화하는 단계; (c) 제1 인덱스를 각각의 제1 용기의 표적 핵산 리포터에 제공하여, 제1 인덱싱된 표적 핵산 리포터를 수득하는 단계; (c) 제1 인덱싱된 핵산 리포터를 조합하는 단계; (d) 제1 인덱싱된 CE를 복수의 제2 용기로 구획화하는 단계; (e) 제2 인덱스를 각각의 제2 용기의 제1 인덱싱된 핵산 리포터에 제공하여, 제2 인덱싱된 핵산 리포터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 a 내지 e는 a 내지 e 시리즈로부터의 하나 이상의 단계의 추가적인 사이클로 계속되어 추가적인 버추얼 구획을 유도할 수 있다. 구획화 단계는 핵산 증폭 또는 포획 단계, 예컨대 PLA, PEA 또는 핵산을 포획 또는 증폭시키는 다른 기술을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 포르말린-고정된, 파라핀 내장된 조직을 섹션으로 나눌 수 있고, 각각의 섹션을 CE에 첨가한다. 이어서, 각각의 CE를 내용물 또는 서열에 대해서 분석할 수 있고, 후속 단계에서 각각의 슬라이드의 내용물의 2D 또는 3D 맵을 수득할 수 있다.

일부 실시형태에서, 핵산 또는 핵산들을 핵산을 한정된 공간에 가두지만, 증폭(PCR, 전체-게놈 증폭, 무작위 프라이머 연장 등), 결찰, 전위, 혼성화, 제한 소화 및 DNA 돌연변이유발을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 단계를 수행하기 위해서 시약 접근을 허용하는 매트릭스 내에 내장시킬 수 있다. 돌연변이유발의 예는 실수-유발 연장, 알킬화, 바이설파이트 전환, 및 활성화-유도된(시티딘) 데아미나제 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 실시형태에서, CE를 사용하는 방법 및 조성물을 돌연변이유발 조립 접근부과 함께 조합하여 DNA 서열 정보의 조립을 상당히 개선시킬 수 있다. 게놈 DNA를 복수의 CE로 단편화 및 분할(partitioning)할 수 있고, 각각의 CE는 게놈의 분획을 포함한다. 게놈의 상이한 분획은 상이한 바코드를 수용하여, 게놈의 분획이 독립적으로 조립되는 것을 허용한다. 더 큰 도전 중 하나는 반복부의 조립이다. 반복부를 조립하는 한 방법은 문헌[Levy, D. and Wigler, M. (2014) Facilitated sequence counting and assembly by template mutagenesis. Proc. of the Natl. Acad. Sci., 111 (43). E4632-E4637. ISSN 0027-8424]에 요약되어 있다. 조립 접근법은 또한 미국 특허 제US20140024537호(발명의 명칭: Determining Haplotypes And Phasing of Haplotypes)에 논의되어 있고, 본 출원은 이의 전문이 참고로 포함된다. 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

DNA 단편의 분할과 돌연변이유발 또는 관련된 접근법을 조합하는 방법을 위해서, 분할은 CE, 웰, 인덱스, 버추얼 인덱스, 물리적인 구획, 액적 등을 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이유발은 실수-유발 연장, 알킬화, 바이설파이트 전환, 및 활성화-유도된(시티딘) 데아미나제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 방법에 의해서 수행될 수 있다. 핵산을 CE로 분할하는 방법 및 돌연변이유발 접근법은 유용할 수 있고, 종래의 방법은 반복부 또는 어려운 영역을 조립하는 것에 도전이 된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 언급된 방법은 변이체 단계화, (신규) 게놈 조립, 집단 전체에 걸친 이질성을 측정하고, 세포-대-세포 차이를 측정하기 위한 세포의 집단의 스크리닝을 위해서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 세포 또는 단일 세포로부터의 cDNA를 용기에서 단리하고, 상기에 기술된 바와 같은 버추얼 구획화 접근법을 통해서 인덱싱된 CE로 전환시킨다. 이것은 1000, 10,000, 100,000 및 훨씬 더 많은 수의 상이한 인덱싱된 단일 세포 라이브러리로부터의 유전자 발현 및 전사 프로파일링을 가능하게 한다.

일부 실시형태에서, 분석될 수 있는 단일 세포의 수는 푸아송(Poisson) 샘플링으로 인해서 버추얼 구획의 총 수의 대략 10%이다. 각각의 단계에서 96-웰 구획을 사용한 4 티어 인덱싱 방법의 경우, 총 10%X96X96X96X96 = 8백만개 초과의 단일 세포가 총 4X 96=384개의 물리적인 구획을 사용하여 하나의 실험에서 분석될 수 있다. 도 3의 예에서, 4 조합 희석 및 풀링 단계를 사용하여 많은 수의 버추얼 구획(독특한 인덱스 조합을 함유하는 분자 또는 DNA 라이브러리 요소의 세트)을 생성한다. 이 예에서, 인접한 DNA 용기는 중합체 매트릭스(예를 들어 PAM = 폴리아크릴아마이드) 내의 단일 세포의 내용물의 캡슐화에 의해서 생성된다. 게놈 분석을 위한 바람직한 특정 실시형태에서, 단일 세포의 게놈 DNA 내용물을 MDA(WGA 다중 변위 증폭 반응(multiple displacement amplification reaction))에 의해서 증폭시킨다. 이러한 단일 세포 MDA 산물은 조합 인덱싱 방법을 통해서 진행하는 DNA 용기를 구성한다. 유전자 발현을 위해서, 단일 세포 cDNA 제제를 피셀리(Picelli)(Picelli, 2014)에 의해서 기술된 바와 같은 단일 세포 용기로부터 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 초기 인덱스를 단편화(효소) 및 어댑터 결찰을 사용하는 표준 라이브러리 제조 기술을 통해서, 또는 전이효소 복합체를 사용하는 태그화를 통해서 게놈 DNA 또는 cDNA에 부착한다. 바람직한 실시형태에서, 결찰 또는 PCR을 통해서 후속 인덱스를 라이브러리에 부착한다. 결찰이 바람직한데, 그 이유는 인덱싱된 어댑터를 순차적인 방식으로 부가하는 것이 용이하기 때문이다. 최종 단계는 단지 인덱싱된 PCR 또는 결찰 및 PCR을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 표적 핵산은 히스톤/단백질-보호된다(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Buenrostro et al. Nature Methods 10, 1213-1218 (2013) doi:10.1038/nmeth.2688] 참고). 응용은 에피제노믹 프로파일링(epigenomic profiling), 개방 염색질의 분석 및 DNA-결합 단백질 및 뉴클레오솜 위치를 포함한다.

일부 실시형태에서, 인접성 보존 요소는 단일 세포를 포함할 수 있고, 세포로부터의 핵산은 증폭될 수 있다. 이어서, 각각의 인접성 보존 요소는 조합 인덱싱 방법을 통해서 독특하게 인덱싱될 수 있다. 더 짧은 서열분석 판독물을 독특한 인덱스를 기초로 분류할 수 있다. 긴 합성 판독물은 독특한 인덱스를 기초로 개별적으로 신규로 조립될 수 있다(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[McCoy et al. Plosone 2014 (DOI: 10.1371/journal.pone.0106689) Illumina TruSeq Synthetic Long-Reads Empower De Novo Assembly and Resolve Complex, Highly-Repetitive Transposable Elements]).

일부 실시형태에서, CE는 세포의 내용물, 예를 들어, 단백질, 세포 소기관, RNA, DNA, 리보솜, 항체, 스테로이드, 전문화된 구조, 글리칸, 지질, 소분자, 생물학적 경로에 영향을 미칠 수 있는 분자, 단당류 및 다당류, 알칼로이드, 1차 및 2차 대사산물을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, CE 내의 세포 소기관은 상이하게 염색될 수 있다. 세포 소기관 염색 시약의 예는 세포 소기관 또는 세포 구조물을 선택적으로 또는 비-선택적으로 표지할 수 있는 세포 소기관 표적화된 형광 단백질(셀룰로 라이츠(Cellular Lights)(상표명)), 전통적인 세포 소기관 염색제 또는 염료 컨주게이트이다.

일부 실시형태에서, CE 내의 관심 분석물은 단백질이다. 단백질은 바코드 또는 대안적인 표지로 표지될 수 있다. 바코드 또는 표지는 전통적인 어레이 또는 서열-기반 방법을 사용하여 판독될 수 있다. 근접 결찰 접근법 및 항체-인덱스 서열을 사용하여 바코드 서열의 검출과 함께 단백질을 검출하여(본원에 참고로 포함된 문헌[Fredriksson et al. Nature Biotechnology 20, 473 - 477 (2002)]) 각각의 개별 세포에서 단백질의 특질 및 존재비를 설정할 수 있다. 단백질은 생체내 및 시험관내 부위-특이적인 화학 표지 전략을 비롯한 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법(www.piercenet.com/cat/protein-antibody-labeling)에 의해서 표지될 수 있다.

근접 결찰(Duo-link PLA, www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/molecular-biology-products.html?TablePage=112232138, 다중 근접 결찰 검정법(Multiplexed proximity ligation assay) 유럽 특허 제EP 2714925 A1호)이 인접성 보존 요소에서 사용을 위해서 채택될 수 있는 단백질, 단백질-단백질 상호작용 및 번역후 변형의 검출을 위한 예이다. 이러한 방법을 사용하여 인접성 보존 요소에서 특이적인 단백질 또는 단백질 복합체를 검출 및 정량분석할 수 있다. 작업 흐름의 한 예는 다음과 같다: (1) 인접성 보존 요소 또는 요소들을 제조하는 단계, (2) 관심 단백질에 특이적인 1차 항체의 쌍 또는 1차 항체의 쌍들을 세척 및 부가하는 단계, (3) 바코드-표지된 항체로 세척 및 염색하는 단계. 용기에서 인접성 보존 요소의 각각의 집단은 상이한 바코드 표지된 항체를 수용한다. 근접 결찰을 통해서 특이적인 단백질에 대해서 독특한 바코드를 함유하는 1차 항체의 쌍 또는 1차 항체의 쌍들, 증폭 가능한 산물이 형성될 수 있다. 하나의 바코드는 관심 단백질에 대해서 특이적일 수 있지만, 다른 바코드는 특이적인 인접성 보존 요소 및 또는 세포에 단백질을 배정하는 데 사용된다. 하나 이상의 분열-및-풀 단계를 통해서, 분획은 상이하게 표지될 수 있다. 이와 같이, 개별 인접성 보존 요소의 내용물은 각각의 인접성 보존 요소를 개별적으로 다수의 병렬 단계로 가공할 필요 없이 분석될 수 있다. 그것은 10, 100, 1000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000. 100,000,000개 및 그 초과의 인접성 보존 요소를 이러한 방식으로 가공하는 데 특히 매우 이롭다. 스테로이드 및 소분자는 단백질에 대해서 기술된 바와 유사한 방식으로 검출될 수 있다. 바코드 표지된 항체는 스테로이드에 대해서 개발될 수 있다(문헌[Hum Reprod. 1988 Jan;3(1):63-8.Antibodies against steroids. Boesze P et al.]). 대안적으로, 형광 염료 및 방사성 컨주게이트가 기술되어 있다(www.jenabioscience.com/cms/en/1/catalog/2305_fluorescent_hormones.html). 스테로이드를 위한 이들 항체 컨주게이트는 상기에 기술된 바와 같이 가공될 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 인접성 보존 요소의 하나 이상의 성분을 검출할 수 있다. 인접성 보존 요소의 하나 이상의 성분은 화학-발광, 형광, 방사성 프로브, DNA-태그, 바코드 및 인덱스로 표지될 수 있다. 증폭 전략을 사용하여 신호를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 회전 환 증폭(RCA)을 사용하여 분석물을 검출할 수 있다. 이어서, RCA 산물을 서열분석, 형광 해독기(프로브)에 의해서 검출할 수 있다. 추가로, 마이크로어레이, 단백질 어레이, 서열분석, 나노-기공 서열분석, 차세대 서열분석, 모세관-전기영동, 비드-어레이를 판독을 위해서 사용할 수 있다.

세포의 내용물의 인접성 설정

일부 실시형태에서, 세포 또는 단일 세포의 내용물, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 세포 소기관, 대사산물, 소분자(이에 제한되지 않음)의 인접성은 인접성 보존 요소(CE)에서 보존될 수 있다. CE는 액적 내의 내용물의 캡슐화, (캡슐화 후) 중합체 매트릭스 중의 내용물의 내장, 및 내용물의 비드에 대한 부착을 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 방법에 의해서 생성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, CE는 검정 시약, 예컨대 수성 완충액, 효소(중합효소, 리가제, 전이효소 등), 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 어댑터, 트랜스포존, 및 프라이머 등에 침투성이다. 인덱싱된 라이브러리가 상기에 기술된 바와 같이 이러한 CE로부터 생성된다. 물리적인 구획으로의 희석, 구획 특이적인 인덱스의 부착, 추가 구획으로의 풀링 및 재희석의 반복되는 순회는 다수의 버추얼 구획의 기하급수적인 생성으로 이어진다. 적절하게 설계되는 경우, 결국 각각의 CE의 내용물은 독특한 바코드로 실제적으로 인덱싱될 것이다. 도 1의 예로서, 4 티어 인덱싱 방법은 단지 4X96=384의 총 물리적인 구획을 갖는 많은 수의 버추얼 구획 및 인덱스(> 8천4백만) 로 이어진다. 바람직한 실시형태에서, 구획-특이적인 인덱스를 태그화, 결찰 또는 PCR을 통해서 각각의 구획화 티어에서 첨가한다. 바람직한 실시형태에서, 각각의 단계에서 각각의 물리적인 구획은 독특한 인덱스를 갖는다. 후속 구획화는 동일하거나 상이한 인덱스를 사용할 수 있다. 동일한 인덱스가 하나의 구획화 티어로부터 다음까지 사용되면, 최종 서열 스트링 내의 인덱스의 위치는 그 구획 및 구획화 티어를 식별할 것이다.

액적을 사용한 세포 성분의 분석

일 실시형태에서, CE는 에멀젼 또는 액적일 수 있다. 일 실시형태에서, CE는 오일과 접촉된 액적이다. 일례에서, 핵산을 포함하는 CE는 액적, 구획 또는 비드 내의 핵산 샘플의 희석물 및 분할물을 포함한다. 일 실시형태에서, 액적은 세포 또는 단일 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일 세포를 포함하는 CE는 액적, 구획, 또는 비드 내의 단일 세포의 희석물 및 분할물을 포함한다.

일부 실시형태에서, "액적"은 액적 액추에이터(actuator) 상의 액체의 부피일 수 있는데, 이것은 충전제 유체에 의해서 적어도 부분적으로 경계가 이루어져 있을 수 있다. 예를 들어, 액적은 충전제 유체에 의해서 완전히 둘러싸일 수 있거나 또는 충전제 유체 및 액적 액추에이터의 하나 이상의 표면에 의해서 경계가 이루어져 있을 수 있다. 액적은 매우 다양한 형상을 보유할 수 있는데; 비제한적인 예는 일반적으로 디스크 형상, 슬러그(slug) 형상, 절단된 구체, 타원체, 구형, 부분적으로 압착된 구체, 반구체, 난형, 원통형, 및 액적 작업, 예컨대 합병 또는 분열 동안 형성되거나 또는 액적 액추에이터의 하나 이상의 표면과 그러한 형상의 접촉의 결과로서 형성된 다양한 형상을 포함한다.

액적 액추에이터를 사용하여 매우 다양한 액적 작업을 수행한다. 액적 액추에이터는 전형적으로 공간에 의해서 분리된 2개의 기재를 포함한다. 기재는 액적 작업을 수행하기 위한 전극을 포함한다. 공간은 전형적으로 액적 액추에이터 상에서 조작될 유체와 비혼화성인 충전제 유체로 충전된다. 공간에 노출되는 표면은 전형적으로 소수성이다. 유전 물질(게놈) 및 이의 발현(기능적 게놈)의 분석, 프로테오믹스, 조합 라이브러리 분석 및 다른 복합 생물분석 응용이 액적에서 수행될 수 있고, 이어지는 작업은 분석 액적 액추에이터 상에서 수행될 수 있다. 액적 액추에이터를 사용한 액적 조작 방법은 각각 미국 출원 공개 제20100130369호 및 제20130203606호에 개시되어 있고, 이들 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다.

"액적 액추에이터"는 액적을 조작하기 위한 장치를 의미한다. 액적 액추에이터의 예에 대해서는, 파물라(Pamula) 등의 미국 특허 제6,911,132호(발명의 명칭 "Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques", 등록일 2005년 6월 28일); 파물라 등의 미국 특허 공개 제20060194331호(발명의 명칭 "Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board", 공개일 2006년 8월 31일); 폴락(Pollack) 등의 국제 특허 공개 제WO/2007/120241호(발명의 명칭 "Droplet-Based Biochemistry", 공개일 2007년 10월 25일); 쉔더로브(Shenderov)의 미국 특허 제6,773,566호(발명의 명칭 "Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same", 등록일 8월 10일, 2004; 쉔더로브의 미국 특허 제6,565,727호(발명의 명칭 "Actuators for Microfluidics Without Moving Parts", 등록일 2003년 5월 20일); 김(Kim) 등의 미국 특허 공개 제20030205632호(발명의 명칭 "Electrowetting-driven Micropumping", 공개일 2003년 11월 6일); 김 등의 미국 특허 공개 제20060164490호(발명의 명칭 "Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle", 공개일 2006년 7월 27일); 김 등의 미국 특허 공개 제20070023292호(발명의 명칭 "Small Object Moving on Printed Circuit Board", 2007년 공개일 2월 1일); 샤(Shah) 등의 미국 특허 공개 제20090283407호(발명의 명칭 "Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics", 공개일 2009년 11월 19일); 김 등의 미국 특허 공개 제20100096266호(발명의 명칭 "Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip", 공개일 2010년 4월 22일); 벨레브(Velev)의 미국 특허 제7,547,380호(발명의 명칭 "Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface", 등록일 2009년 6월 16일); 스터링(Sterling) 등의 미국 특허 제7,163,612호(발명의 명칭 "Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like", 등록일 2007년 1월 16일); 베커(Becker) 등의 미국 특허 제7,641,779호(발명의 명칭 "Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing", 등록일 2010년 1월 5일); 베커 등의 미국 특허 제6,977,033호(발명의 명칭 "Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing", 등록일 2005년 12월 20일); 데크레(Decre) 등의 미국 특허 제7,328,979호(발명의 명칭 "System for Manipulation of a Body of Fluid", 등록일 2008년 2월 12일); 야마카와(Yamakawa) 등의 미국 특허 공개 제20060039823호(발명의 명칭 "Chemical Analysis Apparatus", 공개일 2006년 2월 23일); 우(Wu)의 미국 특허 공개 제20110048951호(발명의 명칭 "Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes", 공개일 2011년 3월 3일); 파울렛(Fouillet) 등의 미국 특허 공개 제20090192044호(발명의 명칭 "Electrode Addressing Method", 공개일 2009년 7월 30일); 파울렛 등의 미국 특허 제7,052,244호(발명의 명칭 "Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces", 등록일 2006년 5월 30일); 마찬드(Marchand) 등의 미국 특허 공개 제20080124252호(발명의 명칭 "Droplet Microreactor", 공개일 2008년 5월 29일); 아다치(Adachi) 등의 미국 특허 공개 제20090321262호(발명의 명칭 "Liquid Transfer Device", 공개일 2009년 12월 31일); 로욱스(Roux) 등의 미국 특허 공개 제20050179746호(발명의 명칭 "Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or Several Solid Substrates", 공개일 2005년 8월 18일); 및 딘드사(Dhindsa) 등의 문헌["Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality", Lab Chip, 10:832-836 (2010)]을 참고하기 바라며, 이들의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 특정 액적 액추에이터는 그들 사이에 액적 작업 갭이 배열된 하나 초과의 기재 및 하나 이상의 기재와 회합되고(예를 들어, 그 상에 적층되고/되거나 그것에 부착되고/되거나 그 내에 내장되고) 하나 이상의 액적 작업을 수행하도록 배열된 전극을 포함할 것이다. 예를 들어, 특정 액적 액추에이터는 기저부(또는 하부) 기재, 기재와 회합된 액적 작업 전극, 기재 및/또는 전극의 상부의 하나 이상의 유전층, 및 임의로 기재, 유전층 및/또는 액적 작업 표면을 형성하는 전극의 상부의 하나 이상의 소수성 층을 포함할 것이다. 상부 기재가 또한 제공될 수 있는데, 이것은 일반적으로 액적 작업 갭으로서 지칭되는, 갭에 의해서 액적 작업 표면으로부터 분리되어 있다. 상부 및/또는 하부 기재 상의 다양한 전극 배열은 상기 참고 특허 및 출원에 논의되어 있고, 특정 신규 전극 배열은 본 개시내용의 설명에 논의되어 있다. 액적 작업 동안, 액적은 접지 전극 또는 기준 전극과 계속 접촉하거나 자주 접촉하게 유지되는 것이 바람직하다. 접지 전극 또는 기준 전극은 갭에서 갭과 대면하는 상부 기재, 갭과 대면하는 하부 기재와 회합될 수 있다. 전극이 두 기재 상에 제공되는 경우, 전극을 제어 또는 모니터링하기 위해서 액적 액추에이터 장비에 전극을 커플링시키기 위한 전기 접촉부가 하나 또는 둘 모두의 플레이트와 회합될 수 있다. 일부 경우에, 단지 하나의 기재가 액적 액추에이터와 접촉하도록 하나의 기재 상의 전극이 다른 기재에 전기적으로 커플링된다. 일 실시형태에서, 전도성 물질(예를 들어, 에폭시, 예컨대 마스터 본드(MASTER BOND)(상표명) 중합체 시스템 EP79, 마스터 본드, 인크.(Master Bond Inc.)(미국 뉴저지주 해컨색 소재)로부터 입수 가능함)이 하나의 기재 상의 전극과 다른 기재 상의 전기 경로 사이에 전기 연결을 제공하고, 예를 들어, 상부 기재 상의 접지 전극이 이러한 전도성 물질에 의해서 하부 기재 상의 전기 경로에 커플링될 수 있다. 다수의 기재가 사용되는 경우, 스페이서가 기재 사이에 제공되어 그들 사이의 갭의 높이를 결정하고, 온-액추에이터 분배 저장소를 한정한다. 스페이서 높이는 예를 들어, 적어도 약 5㎛, 100㎛, 200㎛, 250㎛, 275㎛ 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 스페이서 높이는 최대 약 600㎛, 400㎛, 350㎛, 300㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 스페이서는 예를 들어, 상부 또는 하부 기재로부터의 돌출부의 층 및/또는 상부 기재와 하부 기재 사이에 삽입된 물질로 형성될 수 있다. 액체가 액적 작업 갭으로 전달될 수 있는 유체 경로를 형성하기 위해서 하나 이상의 개구부가 하나 이상의 기재에 제공될 수 있다. 하나 이상의 개구부는 일부 경우에 하나 이상의 전극과 상호작용하도록 배열될 수 있고, 예를 들어 액체를 사용하여 액적 작업 전극에 의해서 액적 작업이 수행되는 것을 허용하도록 개구부를 통해서 유동된 액체가 하나 이상의 액적 작업 전극과 충분히 근접하도록 배열될 수 있다. 기저부(또는 하부) 및 상부 기재는 일부 경우에 하나의 통합 성분으로서 형성될 수 있다. 하나 이상의 기준 전극이 기저부(또는 하부) 및/또는 상부 기재 상에 그리고/또는 갭 내에 제공될 수 있다. 기준 전극 배열의 예는 상기 참고 특허 및 특허 출원에 제공되어 있다. 다양한 실시형태에서, 액적 액추에이터에 의한 액적의 조작은 전극 매개될 수 있고, 예를 들어 전기습윤(electrowetting) 매개되거나, 유전이동(dielectrophoresis) 매개되거나, 쿨롱힘(Coulombic force) 매개될 수 있다. 본 개시내용의 액적 액추에이터에서 사용될 수 있는 액적 작업을 제어하기 위한 다른 기술의 예는 유체역학적 유체 압력을 유도하는 장치, 예컨대 기계적인 원칙을 기초로 작동하는 것(예를 들어, 외부 시린지 펌프, 공압 막 펌프, 진동 막 펌프, 진공 장치, 원심력, 압전기/초음파 펌프 및 음향력(acoustic force)); 전기 또는 자기 원칙을 기초로 작동하는 것(예를 들어 전기삼투 유동, 동전기 펌프, 자성유체 플러그, 전기수력학적 펌프, 자기력을 사용한 인력 또는 반발력 및 자기유체역학적 펌프); 열역학 원칙을 기초로 작동하는 것(예를 들어 기체 방울 생성/상-변화-유도된 부피 팽창); 다른 유형의 표면-습윤 원칙을 기초로 작동하는 것(예를 들어, 전기습윤 및 광전기습윤(optoelectrowetting), 뿐만 아니라 화학적, 열적, 구조적 및 방사성 유도된 표면장력 구배); 중력을 기초로 작동하는 것; 표면장력을 기초로 작동하는 것(예를 들어, 모세관 작용); 정전기력을 기초로 작동하는 것(예를 들어, 전기삼투 유동); 원심 유동을 기초로 작동하는 것(컴팩트 디스크 상에 배치되고 회전되는 기재); 자기력을 기초로 작동하는 것(예를 들어, 진동하는 이온이 유동을 유발함); 자기유체역학력을 기초로 작동하는 것; 및 진공 또는 차동 압력을 기초로 작동하는 것을 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 기술 중 2개 이상의 조합을 사용하여 본 개시내용의 액적 액추에이터에서 액적 작업을 수행할 수 있다. 유사하게, 상기 중 하나 이상을 사용하여 액체를 예를 들어, 또 다른 장치 내의 저장소로부터, 또는 액적 액추에이터의 외부 저장소(예를 들어, 액적 액추에이터 기재와 회합된 저장소 및 저장소로부터 액적 작업 갭으로의 유동 경로)로부터 액적 작업 갭으로 전달할 수 있다. 본 개시내용의 특정 액적 액추에이터의 액적 작업 표면은 소수성 물질로부터 제조될 수 있거나 그것을 소수성으로 만들기 위해서 코팅되거나 처리될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 액적 작업 표면의 적어도 일부 또는 전부는 예를 들어, 침착에 의해서 또는 용액 중의 폴리- 또는 퍼-플루오르화된 화합물 또는 중합성 단량체와 같은 화합물을 사용하는 동일계(in situ) 합성법을 사용함으로써 저표면-에너지 물질 또는 화학물질로 유도체화될 수 있다. 예는 테플론(TEFLON)(등록상표) AF(듀폰(DuPont)(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로부터 입수 가능함), 사이톱(cytop)과의 물질의 구성원, 소수성 코팅 및 초소수성(superhydrophobic) 코팅인 플루오로펠(FLUOROPEL)(등록상표)과의 코팅(사이토닉스 코퍼레이션(Cytonix Corporation)(미국 메릴랜드주 벨츠빌 소재)으로부터 입수가능함), 실란 코팅, 플루오로실란 코팅, 소수성 포스포네이트 유도체(예를 들어, 아쿨론, 인크(Aculon, Inc)로부터 판매되는 것), 및 노벡(NOVEC)(상표명) 전자 코팅(쓰리엠 컴퍼니(3M Company)(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터 입수 가능함), 플라즈마-강화 화학 증착(plasma-enhanced chemical vapor deposition: PECVD)용의 다른 플루오르화된 단량체 및 PECVD용 유기실록산(예를 들어, SiOC)을 포함한다. 일부 경우에, 액적 작업 표면은 약 10nm 내지 약 1,000nm 범위의 두께를 갖는 소수성 코팅을 포함할 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 액적 액추에이터의 상부 기재는 전기 전도성 유기 중합체를 포함하고, 이어서 이것은 액적 작업 표면을 소수성으로 만들기 위해서 소수성 코팅으로 코팅되거나 달리 처리된다. 예를 들어, 플라스틱 기재 상에 침착된 전기 전도성 유기 중합체는 폴리(3,4-에틸렌다이옥시티오펜) 폴리(스티렌설포네이트)(PEDOT:PSS)일 수 있다. 전기 전도성 유기 중합체 및 대안적인 전도성 층의 다른 예는 폴락 등의 국제 특허 공개 제WO/2011/002957호(발명의 명칭 ""Droplet Actuator Devices and Methods", 공개일 2011년 1월 6일)에 기술되어 있고, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 하나 또는 두 기재는 기재로서 인쇄 회로 기판(PCB), 유리, 인듐 주석 산화물(ITO)-코팅된 유리, 및/또는 반도체 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 기재가 ITO-코팅된 유리인 경우, ITO 코팅은 바람직하게는 적어도 약 20nm, 50nm, 75nm, 100nm 또는 그 초과의 두께이다. 대안적으로 또는 추가로, 두께는 최대 약 200nm, 150nm, 125nm 또는 그 미만일 수 있다. 일부 경우에, 상부 및/또는 하부 기재는 유전체, 예컨대 폴리이미드 유전체로 코팅된 PCB 기재인데, 일부 경우에 이것은 액적 작업 표면을 소수성으로 만들기 위해서 소수성 코팅으로 코팅되거나 달리 처리될 수 있다. 기재가 PCB를 포함하는 경우, 하기 물질이 적합한 물질의 예이다: 미츠이(MITSUI)(상표명) BN-300(미츠이 케미컬즈 어메리카, 인크.(MITSUI Chemicals America, Inc.)(미국 캘리포니아주 산호세 소재)로부터 입수 가능함); 아를론(ARLON)(상표명) 11N(아를론, 인크(Arlon, Inc)(미국 캘리포니아주 산타 안나 소재)로부터 입수 가능함); 넬코(NELCO)(등록상표) N4000-6 및 N5000-30/32(파크 일렉트로케미컬 코프.(Park Electrochemical Corp.)(미국 뉴욕주 멜빌 소재)로부터 입수 가능함); 이솔라(ISOLA)(상표명) FR406(이솔라 그룹(Isola Group)(미국 애리조나주 챈들러 소재)로부터 입수 가능함), 특히 IS620; 플루오로중합체과(그것은 낮은 배경 형광을 갖기 때문에 형광 검출에 적합함); 폴리이미드과; 폴리에스터; 폴리에틸렌 나프탈레이트; 폴리카보네이트; 폴리에터에터케톤; 액정 중합체; 사이클로-올레핀 공중합체(COC); 사이클로-올레핀 중합체(COP); 아라미드; 써마운트(THERMOUNT)(등록상표) 부직포 아라미드 보강재(듀폰(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로부터 입수 가능함); 노멕스(NOMEX)(등록상표) 브랜드 섬유(듀폰(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로부터 입수 가능함); 및 종이. 다양한 물질이 또한 기재의 유전체 성분으로서 사용하기에 적합하다. 예는 하기를 포함한다: 증착 유전체, 예컨대 파릴렌(PARYLENE)(상표명) C(특히 유리 상의 것), 파릴렌(상표명) N, 및 파릴렌(상표명) HT(고온(상표명), 약 300℃)(파릴렌 코팅 서비스즈, 인크.(Parylene Coating Services, Inc.)(미국 텍사스주 케이티 소재)로부터 입수 가능함); 테플론(등록상표) AF 코팅; 사이톱; 솔더마스크(soldermask), 예컨대 액체 광영상화 가능한 솔더마스크(예를 들어, PCB 상의 것), 예컨대 타이요(TAIYO)(상표명) PSR4000 시리즈, 타이요(상표명) PSR 및 AUS 시리즈(타이요 어메리카, 인크.(Taiyo America, Inc.)(미국 네버랜드주 카손 시티 소재)로부터 입수 가능함)(열 제어를 포함하는 응용을 위한 양호한 열 특징), 및 프로비머(PROBIMER)(상표명) 8165(열 제어를 포함하는 응용을 위한 양호한 열 특징)(헌츠만 어드밴스트 머티리얼스 어메리카 인크.(Huntsman Advanced Materials Americas Inc.)로부터 입수 가능함); 건식 필름 솔더마스크, 예컨대 바크렐(VACREL)(등록상표) 건식 필름 솔더마스크 라인의 것(듀폰(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로부터 입수 가능함); 필름 유전체, 예컨대 폴리이미드 필름(예를 들어, 캡톤(KAPTON)(등록상표) 폴리이미드 필름, 듀폰(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로부터 입수 가능함), 폴리에틸렌, 및 플루오로중합체(예를 들어, FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌; 폴리에스터; 폴리에틸렌 나프탈레이트; 사이클로-올레핀 공중합체(COC); 사이클로-올레핀 중합체(COP); 상기에 열거된 임의의 다른 PCB 기재 물질; 흑색 매트릭스 수지; 폴리프로필렌; 및 흑색 가요성 회로 물질, 예컨대 듀폰(상표명) 피라룩스(Pyralux)(등록상표) HXC 및 듀폰(상표명) 캡톤(등록상표) MBC(듀폰(미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)로부터 입수 가능함). 액적 수송 전압 및 및 진동수(frequency)는 특이적인 검정 프로토콜에서 사용되는 시약을 사용하는 수행을 위해서 선택될 수 있다. 설계 파라미터는 달라질 수 있고, 예를 들어 온-액추에이터 저장소의 수 및 배치, 독립적인 전극 연결부의 수, 상이한 저장소의 크기(부피), 자석/비드 세척 대역의 배치, 전극 크기, 전극간 피치, 및 (상부 기재와 하부 기재 간의) 갭 높이는 특정 시약, 프로토콜, 액적 부피 등과 함께 사용하기 위해서 달라질 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 기재는 예를 들어, 침착을 사용하거나 또는 용액 중의 폴리- 또는 퍼-플루오르화된 화합물 또는 중합성 단량체와 같은 화합물을 사용하는 동일계 합성법을 사용함으로써 저표면-에너지 물질 또는 화학물질로 유도체화될 수 있다. 예는 테플론(등록상표) AF 코팅 및 침지 코팅 또는 분무 코팅을 위한 플루오로펠(등록상표), 플라즈마-강화 화학 증착(PECVD)용의 다른 플루오르화된 단량체 및 PECVD용 유기실록산(예를 들어, SiOC)을 포함한다. 추가로, 일부 경우에, 액적 작업 표면의 일부 부분 또는 전부는 배경 노이즈, 예컨대 배경 형광을 PCB 기재로부터 감소시키기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 노이즈-감소 코팅은 흑색 매트릭스 수지, 예컨대 토레이 인더스트리즈, 인크.(Toray industries, Inc.)(일본 소재)로부터 입수 가능한 흑색 매트릭스 수지를 포함할 수 있다. 액적 액추에이터의 전극은 전형적으로 제어기 또는 프로세서에 의해서 제어되는데, 이것 자체는 시스템의 부품으로서 제공되고, 이것은 프로세싱 기능뿐만 아니라 데이터 및 소프트웨어 저장 및 입력 및 출력 능력을 포함할 수 있다. 시약은 액적 작업 갭 또는 액적 작업 갭에 유동적으로 커플링된 저장소에서 액적 액추에이터 상에 제공될 수 있다. 시약은 액체 형태, 예를 들어, 액적으로 존재할 수 있거나, 그것은 액적 작업 캡 또는 액적 작업 갭에 유동적으로 커플링된 저장소에서 재구성 가능한 형태로 제공될 수 있다. 재구성 가능한 시약은 전형적으로 재구성을 위해서 액체와 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급된 방법 및 장치와 함께 사용하기에 적합한 재구성 가능한 시약의 예는 매트렐(Meathrel) 등의 미국 특허 제7,727,466호(발명의 명칭 "Disintegratable Films for Diagnostic Devices", 등록일 2010년 6월 1일)에 기술된 것을 포함하고, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

"액적 작업"은 액적 액추에이터 상에서의 액적의 임의의 조작을 의미한다. 액적 작업은 예를 들어, 하기를 포함한다: 액적 액추에이터에 액적을 적재하는 것; 공급원 액적으로부터 하나 이상의 액적을 분배하는 것; 액적을 둘 이상의 액적으로 분열, 분리 또는 나누는 것; 액적을 임의의 방향으로 하나의 위치에서 또 다른 위치로 수송하는 것; 둘 이상의 액적을 단일 액적으로 합병 또는 조합하는 것; 액적을 희석하는 것; 액적을 혼합하는 것; 액적을 교반하는 것; 액적을 탈형시키는 것; 액적을 제자리에 유지시키는 것; 액적을 인큐베이션시키는 것; 액적을 가열하는 것; 액적 증발시키는 것; 액적을 냉각시키는 것; 액적을 배치하는 것; 액적을 액적 액추에이터로부터 수송하는 것; 본 명세서에 기술된 다른 액적 작업; 및/또는 상기한 것의 임의의 조합. 용어 "합병하다", "합병", "조합하다", "조합" 등은 둘 이상의 액적으로부터 하나의 액적을 생성하는 것을 기술하기 위해서 사용된다. 이러한 용어가 둘 이상의 액적과 관련하여 사용되는 경우, 둘 이상의 액적을 하나의 액적으로 조합하기에 충분한 액적 작업의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, "액적 A를 액적 B와 합병하는 것"은 액적 A를 정지 액적 B와 접촉하게 수송하거나, 액적 B를 정지 액적 A와 접촉하게 수송하거나, 액적 A 및 액적 B를 서로 접촉하게 수송함으로써 달성될 수 있다. 용어 "분열" 또는 "분리" 또는 "나누는 것"은 생성된 액적의 부피와 관련하여 임의의 특정 결과를 암시하는 것이 의도되지 않거나(즉, 생성된 액적의 부피가 동일하거나 상이할 수 있음), 생성된 액적의 수와 관련하여 임의의 특정 결과를 암시하는 것이 의도되지 않는다(생성된 액적의 수는 2, 3, 4, 5 또는 그 초과일 수 있음). 용어 "혼합"은 액적 내에서 하나 이상의 성분의 보다 균질한 분포를 생성하는 액적 작업을 지칭한다. "적재" 액적 작업의 예는 미소투석법 적재, 압력 보조 적재, 로보틱 적재, 능동 적재, 및 피펫 적재를 포함한다. 액적 작업은 전극-매개될 수 있다. 일부 경우에, 액적 작업은 표면 상에서 친수성 영역 및/또는 소수성 영역을 사용하거나 그리고/또는 물리적인 장애물에 의해서 추가로 용이해진다. 액적 작업의 예에 대해서는 "액적 액추에이터"의 정의하에 상기에 언급된 특허 및 특허 출원을 참고하기 바란다. 임피던스 또는 커패시턴스 감지 또는 영상화 기술을 때때로 사용하여 액적 작업의 결과를 측정 또는 확인할 수 있다. 이러한 기술의 예는 스터머(Sturmer) 등의 미국 특허 공개 제20100194408호(발명의 명칭 "Capacitance Detection in a Droplet Actuator", 공개일 2010년 8월 5일)에 기술되어 있고, 이의 전체 개시내용은 참고로 본 명세서에 포함된다. 일반적으로, 감지 또는 이미지화 기술을 사용하여 특정 전극에서 액적의 유무를 확인할 수 있다. 예를 들어, 액적 분할 작업 이후에 종착 전극에서 분배된 액적의 존재는 액적 분배 작업이 효과적이었음을 확인한다. 유사하게, 검정 프로토콜에서 적절한 단계에서 검출 스팟에서 액적의 존재는 액적 작업의 이전의 세트가 검출을 위한 액적을 성공적으로 제조하였음을 확인해 줄 수 있다. 액적 수송 시간은 상당히 빠를 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 하나의 전극으로부터 다음 것으로의 액적의 수송은 약 1초, 또는 약 0.1초, 또는 약 0.01초, 또는 약 0.001초를 초과할 수 있다. 일 실시형태에서, 전극은 AC 모드로 작동되지만, 영상화를 위해서 DC 모드로 변경된다. 액적의 풋프린트(footprint) 면적을 위해서 액적 작업을 수행하는 것은 전기습윤 면적에 유사한 것이 도움이 되고; 즉, 1x-, 2x- 3x-액적은 각각 1, 2, 및 3개의 전극을 사용하여 유용하게 제어되고 작동된다. 액적 풋프린트가 주어진 시간에서 액적 작업을 수행하기 위해서 사용 가능한 전극의 수보다 많으면, 액적 크기와 전극의 수 간의 차이가 전형적으로 1을 초과하지 않아야 하고; 즉, 2x 액적이 1개의 전극을 사용하여 유용하에 제어되고, 3x 액적은 2개의 액적을 사용하여 유용하게 제어된다. 액적이 비드를 포함하는 경우, 액적 크기는 액적을 제어하는, 예를 들어 액적을 수송하는 전극의 수에 동일한 것이 유용하다.

일부 양상에서, 핵산 라이브러리는 CE, 예컨대 액적을 사용하여 세포 또는 단일 세포로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 완충액 중에 현탁시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액을 액적 액추에이터에 도입할 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 각각의 액적이 단일 세포를 포함하도록 세포 현탁액을 포함하는 액적의 어레이를 분배할 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 세포 용해 완충액을 포함하는 시약 액적의 어레이를 분배할 수 있다(용해 완충 액적). 용해 완충액 액적 및 단일 세포를 포함하는 세포 현탁액 액적의 어레이를 전극 매개된 작업을 사용하여 조합하여, 세포 용해물 액적이 단일 세포의 성분을 포함하도록 세포 용해물 액적을 형성할 수 있다. 독특한 핵산 바코드, 트랜스포존 및 적합한 효소(예를 들어, 단편화효소, 중합효소, 리가제, 전이효소, 역전사효소 등)를 포함하는 반응 시약을 액적 액추에이터에 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 및/또는 바코드는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 각각의 시약 액적이 독특한 핵산 바코드 및 적합한 효소를 포함하도록 반응 시약을 포함하는 시약 액적의 어레이를 분배할 수 있다. 세포 용해물 액적 및 시약 액적을 전극 매개된 작업을 사용하여 조합하여 제1 바코딩 액적의 어레이를 형성할 수 있는데, 여기서 단일 세포로부터의 핵산은 핵산이 바코드를 포함하도록 시약 액적으로부터의 효소에 의해서 행동한다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물 액적 내의 mRNA는 세포 용해물 액적 및 시약 액적이 조합되고, cDNA가 바코드를 포함할 수 있을 때 역전사될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드는 프라이머 결합 부위 및 독특한 분자 인덱스를 포함할 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 제1 바코딩 액적을 시약 액적과 수회 추가로 조합하여 제2 바코드 액적, 제3 바코드 액적의 어레이 등을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조합의 각각의 순회를 위해서, 바코드는 상이하다. 따라서 바코드 액적과 시약 액적의 조합의 다회의 순회는 조합 바코딩을 생성할 것이다. 마지막에 상이한 액적으로부터의 핵산을 풀링하고 서열분석한다. 서열분석 정보는 세포로부터의 핵산의 서열분석 정보를 드러낼 수 있고, 임의로는 또한 핵산의 공급원(예를 들어 세포 또는 단일 세포)을 식별할 수 있다. 이러한 정보는 핵산이 질환과 연관된 돌연변이, 예컨대 유전된 유전자 질환 또는 암을 포함한다면 값진 것이다.

일부 양상에서, 본 출원의 방법은 프로테오믹스를 위해서 적용될 수 있다. 비드 현탁액을 액적 액추에이터에 도입하여 액적의 어레이에서 각각의 액적이 단일 비드를 포함하도록 비드 현탁액으로부터 액적의 어레이를 분배함으로써 액적을 함유하는 비드의 어레이를 제조할 수 있다(본 명세서에 참고로 포함된 미국 출원 공개 제20100130369호 참고). 비드는 항체 또는 다른 친화성 프로브를 포함할 수 있다(전형적인 부착 프로토콜의 경우, 본 명세서에 포함된 문헌[Immobilized Biomolecules in Analysis. A Practical Approach. Cass T, Ligler F S, eds. Oxford University Press, New York, 1998. pp 1-14] 참고). 일부 실시형태에서, 항체는 세포 표면 에피토프에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성일 수 있고, 다른 실시형태에서, 항체는 다클론성일 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 비드 현탁액 액적의 어레이를 단일 세포를 포함하는 액적의 어레이와 조합하여 비드 상의 항체가 세포 표면 단백질에 결합하도록 비드 액적 상에 세포의 어레이를 산출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 세포 내부의 단백질에 대해서 특이적일 수 있다. 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 비드 상의 항체가 세포 내의 단백질에 결합하여 비드 액적 상에 단백질의 어레이를 산출하도록 비드 현탁액 액적의 어레이를 단일 세포 용해물을 포함하는 액적의 어레이와 조합할 수 있다. 임의로, 전극 매개된 액적 작업을 사용하여, 단백질이 독특하게 표지될 수 있도록 비드 액적 상의 단백질의 어레이를 단백질 표지 시약을 포함하는 시약 액적의 어레이와 조합할 수 있다. 결합된 단백질을 회합된 표지로부터 또는 다른 수단(SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, ELISA 등)에 의해서 검출할 수 있다. 단백질의 특질 및 단백질의 공급원을 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로테오믹 데이터는 서열분석 데이터와 상관관계가 있을 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체는 단백질에 제한되지 않는 다른 생물분자에 특이적일 수 있다. 이러한 생물분자는 다당류 또는 지질을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 이러한 생물분자의 특질 및 공급원은 상기에서 생성된 서열 데이터와 상관관계가 있을 수 있다.

동일계 세포 분석

일부 실시형태에서, 세포 및 이의 성분을 동일계에서 분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 유동 셀을 통해서 통과시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유동 셀"는 1종 이상의 유체 시약이 유동할 수 있는 표면을 갖는 챔버를 의미하고자 한다. 일반적으로, 유동 셀은 유체의 유동을 용이하게 하도록 유입 개구부 및 유출 개구부를 가질 것이다. 본 개시내용의 방법에서 용이하게 사용될 수 있는 유동셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 예는 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 제WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제 특허 제WO 91/06678호; 제WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 제7,211,414호; 제7,315,019호; 제7,405,281호, 및 제2008/0108082호에 기술되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 실시형태에서, 유동 셀은 어레이를 하우징할 수 있다. 핵산 서열분석을 위해서 사용되는 어레이는 흔히 핵산 특정부의 무작위 공간 패턴을 가질 수 있다. 예를 들어, 일루미나 인크.(Illumina Inc.)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수 가능한 하이세크(HiSeq)(상표명) 또는 마이세크(MiSeq)(등록상표) 서열분석 플랫폼은 무작위 시딩하고 이어서 브릿지 증폭에 의해서 핵산 어레이를 형성할 때 유동 셀을 사용한다. 그러나, 패턴화된 어레이를 또한 핵산 서열분석 또는 다른 분석 응용을 위해서 사용할 수 있다. 예시적인 패턴화된 어레이, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법은 미국 특허 제13/787,396호; 제13/783,043호; 제13/784,368호; 제2013/0116153 A1호; 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0316086 A1호에 언급되어 있고, 이들 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다. 이러한 패턴화된 어레이의 특징부를 사용하여 단일 핵산 템플레이트 분자를 포획하여 예를 들어, 브릿지 증폭을 통해서 균질한 집락의 후속 형성을 시딩할 수 있다. 이러한 패턴화된 어레이는 핵산 서열분석 응용에 특히 유용하다.　

일부 실시형태에서, 유동 셀 표면은 포획 모이어티, 예컨대 항체를 포함하여 그것을 통해서 통과한 세포를 유동 셀 표면 상에 고정시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유동 셀 표면 상의 항체는 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 암 세포의 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있어서, 유동 셀 표면 상에 암 세포가 풍부해질 수 있다.

일부 실시형태에서, 세포는 세포를 유동 셀에 통과시키기 전에 관련 기술 분야에 공지된 세포 분류 기술에 의해서 다양한 방식으로 분류될 수 있다. 예시적인 세포 분류 기술은 형광 활성화 세포 분류법, 또는 유세포 분석기를 사용하는 FACS, 자기-활성화 세포 분류법(MACS)(밀테니이 바이오테크 인크.(Miltenyi Biotec Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 또는 표지된 세포의 튜브가 자기장 내부에 배치되는 칼럼-미포함 세포 기술에 의한 것을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 양성으로 선택된 세포는 튜브 내에 보유되지만, 음성으로 선택된 세포는 액체 현탁액 중에 존재한다(스템셀 테크놀로지스 인크.(STEMCELL Technologies Inc.), 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재).

일부 실시형태에서, 유동 셀을 통과한 세포를 유동 셀 내에서 용해시켜서, 유동 셀 중에서 세포의 핵산(DNA 및 RNA)을 방출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 용해 전에 유동 셀 상에 고정시킨다. 세포 용해 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이것은 초음파처리, 프로테아제 처리, 삼투압 충격에 의한 것, 고염 처리를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 전체 RNA를 역전사시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 독특한 바코드를 세포로부터의 핵산, 예를 들어 DNA, RNA, 또는 cDNA에 도입할 수 있다. 바코드를 핵산에 도입하는 방법은 상기에 논의되어 있고, 넥스테라(Nextera)(상표명) 기술, 리가제, 중합효소를 사용한 태그화를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 바코드는 세포 공급원의 식별에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드는 프라이머 결합 부위를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서 다수의 바코드를 핵산에 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 바코드는 서로 상이하다. 일부 실시형태에서, 바코드를 갖는 핵산을 분산시키고; 다시 풀링하여, 추가 바코드를 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드 도입 이후에 또는 바코드 도입 동안, 핵산을 단편화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단편화된 핵산을 유동 셀에 분산시키기 전에 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드를 포함하는 단편화된 핵산을 포획 프로브를 포함하는 유동 셀의 상이한 부분에 분산시켜서, 유동 셀 상에 고정시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정된 단편화된 핵산을 브릿지 증폭에 적용할 수 있다.

상기 양상의 일부 실시형태에서, 유동 셀을 통해서 통과한 세포는 단일 세포이다. 일부 실시형태에서, 전체 전사체를 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포로부터 또는 단일 세포로부터의 DNA 및 RNA를 서열 정보를 위해서 동시에 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포로부터 또는 단일 세포로부터의 단백질을 특질 및 서열 정보에 대해서 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포로부터 또는 단일 세포로부터의 다른 분석물, 예컨대, 지질, 탄수화물, 세포내 세포 소기관을 평가할 수 있다.

템플레이트 핵산의 단편화

템플레이트 핵산을 제조하는 일부 실시형태는 표적 핵산을 단편화하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코딩되거나 인덱싱된 어댑터를 단편화된 표적 핵산에 부착한다. 어댑터를 관련 기술 분야에 널리 공지되 임의의 수의 방법, 예컨대 결찰(효소적 또는 화학적), 태그화, 중합효소 연장 등을 사용하여 부착할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀의 삽입이 표적 핵산의 단편화를 유발할 수 있다. 루핑된 트랜스포좀을 포함하는 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열을 포함하는 표적 핵산을 트랜스포존 서열의 단편화 부위에서 단편화할 수 있다. 본 명세서에 제공된 실시형태에서 유용한 표적 핵산을 단편화하기에 유용한 방법의 추가 예는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208705호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0208724호 및 국제 특허 출원 공개WO 2012/061832호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

단일 분자의 태그화

본 발명은 개별 분자가 추적 및 식별될 수 있도록 분자를 태그화하는 방법을 제공한다. 이어서, 벌크 데이터를 디콘볼루션(deconvolution)시키고, 개별 분자에 대해서 다시 변환시킬 수 있다. 개별 분자를 구별하고, 정보를 본래 분자에 대해서 다시 관련시키는 능력은 본래 분자로부터 최종 산물로의 공정이 본래 집단의 (화학량론적) 표현을 변화시키는 경우 특히 중요하다. 예를 들어, 증폭은 본래 표현을 왜곡시킬 수 있는 복제(예를 들어, PCR 복제 또는 바이어싱된(biased) 증폭)로 이어진다. 이는 메틸화 상태 콜(call), 복사체 수, 비-균일 증폭으로 인한 대립유전자 비율 및/또는 증폭 바이어스를 변경할 수 있다. 개별 분자를 식별함으로써, 암호-태그화는 가공 후 동일한 분자들을 구별한다. 이와 같이, 복제 및 증폭 바이어스를 필터링하여, 분자의 본래 표현 또는 분자의 집단의 정확한 결정이 허용될 수 있다.

독특하게 태그화된 단일 분자의 이점은 본래 풀 중의 동일한 분자가 이의 태그화로 인해서 독특하게 식별된다는 것이다. 추가 하류 분석에서, 이들 독특하게 태그화된 분자는 이제 구별될 수 있다. 이러한 기술은 증폭이 사용되는 검정 방법에서 활용될 수 있다. 예를 들어 증폭은 분자의 혼합된 집단의 본래 표현을 왜곡시킨다고 공지되어 있다. 독특한 태그화가 사용되지 않았다면, 본래 표현(예컨대 복사체 수 또는 대립유전자 비율)은 표현에서 각각의 분자에 대해서 (공지된 또는 공지되지 않은) 바이어스를 설명할 필요가 있을 것이다. 독특한 태그화를 사용하여, 표현은 복제물을 제거하고, 각각 독특한 태그를 갖는 분자의 본래 표현을 계수함으로써 정확하게 측정될 수 있다. 따라서, 단지 진짜 서열 또는 관심 서열이 추가 분석을 위해서 선택되도록 데이터가 필터링되기 때문에 바이어스의 두려움 없이, cDNA를 증폭시킬 수 있고, 서열분석할 수 있다. 동일한 바코드를 갖는 다수의 판독물 전체에서 컨센서스(consensus)를 취함으로써 정확한 판독물을 작제할 수 있다.

본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 검정법의 초기 단계에서 본래 집단을 태그화하는 것이 바람직하지만, 태그화는 초기 단계가 바이어스를 도입하지 않거나 중요하지 않으면 후기 단계에서 일어날 수 있다. 이들 응용 중 임의의 것에서, 바코드 서열의 복잡성은 태그화된 개별 분자의 수보다 더 커야 한다. 이는 상이한 표적 분자가 상이하고 독특한 태그를 수용하는 것을 보장한다. 이와 같이, 특정 길이(예를 들어, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 또는 200개의 뉴클레오타이드 길이)의 무작위 올리고뉴클레오타이드의 풀이 바람직하다. 태그의 무작위 풀은 암호 스페이스(code space) 4 ⁿ 을 갖는 태그의 큰 복잡성을 나타내고, 여기서 n은 뉴클레오타이드의 수이다. 추가 암호(설계되던지 또는 무작위이든지 간에)를 상이한 단계에서 혼입하여 추가 검사, 예컨대 오류 보정을 위한 패러티 검사로서 제공한다.

본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일 실시형태에서, 개별 분자(예컨대 표적 DNA)를 독특한 표지, 예컨대 독특한 올리고 서열 및/또는 바코드에 부착한다. 표지의 부착은 결찰, 화학물질 커플링, 흡착, 트랜스포존 서열의 삽입 등에 의해서 일어날 수 있다. 다른 수단은 증폭(예컨대 PCR, RCA 또는 LCR에 의함), 복사(예컨대 중합효소에 의한 부가), 및 비-공유 상호작용을 포함한다.

특이적인 방법은 각각의 템플레이트가 암호 스페이스 내에서 개별 코드를 수용할 것이어서, 다른 앰플리콘과 차별될 수 있는 독특한 앰플리콘을 산출하도록 바코드(예를 들어 설계된 서열 또는 무작위 서열)를 PCR 프라이머에 포함시키는 것을 포함한다. 이러한 개념은 중합효소 증폭을 사용하는 임의의 방법, 예컨대 골든게이트(GoldenGate)(상표명) 검정법 및 미국 특허 제7,582,420호, 제7,955,794호 및 제8,003,354호에 개시된 검정법에 적용될 수 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 암호-태그화된 표적 서열을 롤링-서클 증폭과 같은 방법에 의해서 순환 및 증폭시켜서 암호-태그화된 앰플리콘을 산출할 수 있다. 유사하게, 암호를 또한 RNA에 부가할 수 있다

템플레이트 핵산의 분석 방법

본 명세서에 기술된 기술의 일부 실시형태는 템플레이트 핵산의 분석 방법을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 서열분석 정보를 템플레이트 핵산으로부터 수득할 수 있고, 이 정보를 사용하여 1종 이상의 표적 핵산의 서열 표현을 생성할 수 있다.

본 명세서에 기술된 서열분석의 일부 실시형태에서, 연결된 판독 전략이 사용될 수 있다. 연결된 판독 전략은 적어도 2개의 서열분석 판독물을 연결한 서열분석 데이터를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 서열분석 판독물은 제1 마커를 함유할 수 있고, 제2 서열분석 판독물은 제2 마커를 함유할 수 있다. 제1 마커 및 제2 마커는 표적 핵산의 서열 표현에 가까운 각각의 서열분석 판독물로부터의 서열분석 데이터를 식별할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 마커는 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 제1 바코드 서열은 제2 바코드 서열과 쌍을 이룰 수 있다. 다른 실시형태에서, 마커는 제1 숙주 태그 및 제2 숙주 태그를 포함할 수 있다. 더 많은 실시형태에서, 마커는 제1 숙주 태그를 갖는 제1 바코드 서열, 및 제2 숙주 태그를 갖는 제2 바코드 서열을 포함할 수 있다.

템플레이트 핵산을 서열분석하는 방법의 예시적인 실시형태는 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 제1 프라이머 부위에 혼성화된 서열분석 프라이머를 사용하여 제1 바코드 서열을 서열분석하는 단계; 및 (b) 제2 프라이머에 혼성화된 서열분석 프라이머를 사용하여 제2 바코드 서열을 서열분석하는 단계. 결과는 템플레이트 핵산을 이의 게놈 이웃에 연결하는 것을 돕는 2개의 서열 판독물이다. 충분히 긴 판독물 및 충분히 짧은 라이브러리 단편을 고려하면, 이들 두 판독물을 정보적으로 합병시켜 전체 단편을 포괄하는 하나의 긴 판독물을 제조할 수 있다. 바코드 서열 판독물 및 삽입으로부터 존재하는 9 뉴클레오타이드 복제된 서열을 사용하여, 이제 판독물을 이의 게놈 이웃에 연결시켜 훨씬 더 긴 "연결된 판독물"을 인실리코로 형성할 수 있다.

이해될 바와 같이, 템플레이트 핵산을 포함하는 라이브러리는 복제 핵산 단편을 포함할 수 있다. 복제 핵산 단편의 서열분석은 복제 단편을 위해서 컨센서스 서열을 생성하는 것을 포함하는 방법에서 이롭다. 이러한 방법은 템플레이트 핵산 및/또는 템플레이트 핵산의 라이브러리에 컨센서스 서열을 제공하기 위한 정확성을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에 기술된 서열분석 기술의 일부 실시형태에서, 서열 분석은 실시간으로 수행된다. 예를 들어, 실시간 서열분석은 서열분석 데이터를 동시에 획득 및 분석함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열분석 데이터를 수득하기 위한 서열분석 공정은 표적 핵산 서열 데이터의 적어도 일부가 수득된 후 또는 전체 핵산 판독물이 서열분석되기 전을 비롯한, 다양한 지점에서 종결될 수 있다. 예시적인 방법, 시스템 및 추가 실시양태는 국제 특허 공개 제WO 2010/062913호에 제공되어 있고, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

연결된 판독물 전략을 사용하여 짧은 서열분석 판독물을 조립하는 방법의 예시적인 실시형태에서, 바코드를 포함하는 트랜스포존 서열을 게놈 DNA에 삽입하고, 라이브러리를 제조하고, 템플레이트 핵산의 라이브러리에 대해서 서열분석 데이터를 수득한다. 쌍을 이룬 바코드를 식별함으로써 템플레이트의 블록을 조립할 수 있고, 이어서 더 큰 콘틱을 조립한다. 일 실시형태에서, 조립된 판독물을 중첩 판독물을 사용한 암호 짝지움을 통해서 더 큰 콘틱으로 추가로 조립할 수 있다.

본 명세서에 기술된 서열분석 기술의 일부 실시형태는 오류 검출 및 보정 특징부를 포함한다. 오류의 예는 서열분석 공정 동안 염기 콜 내의 오류, 및 단편의 더 큰 콘틱으로의 조립 시의 오류를 포함할 수 있다. 이해될 바와 같이, 오류 검출은 데이터 세트에서 오류의 존재 또는 가능성을 검출하는 것을 포함할 수 있고, 이와 같이, 오류의 위치 또는 오류의 수를 검출하는 것은 필요하지 않을 수 있다. 오류 보정을 위해서, 데이터 세트에서 오류의 위치 및/또는 오류의 수에 관련된 정보가 유용하다. 오류 보정 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예는 해밍 거리의 사용, 검사합 알고리즘의 사용을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개2010/0323348호; 미국 특허 제7,574,305호; 및 미국 특허 제6,654,696호를 참고하기 바라며, 이들의 개시내용은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다).

네스팅된(nested) 라이브러리

대안적인 방법은 상기 접합 태그화 방법 및 네스팅된 서열분석 라이브러리의 제조를 포함한다. 네스팅된 하위-라이브러리는 암호-태그화된 DNA 단편으로부터 생성된다. 이는 게놈 전체를 통한 덜 빈번한 트랜스포존 태그화를 가능하게 할 수 있다. 이것은 또한 (네스팅된) 서열분석 판독물의 더 큰 다양성을 생성할 수 있다. 이들 인자는 커버리지 및 정확도의 개선으로 이어질 수 있다.

하위-샘플링 및 전체 게놈 증폭은 출발 분자의 특정 집단의 다수의 복사체를 생성할 수 있다. 이어서, DNA 단편을 트랜스포존-특이적인 단편화에 의해서 생성하는데, 여기서 각각의 단편은 단편을 매칭 암호(동일하던지, 상보적이던지 또는 달리 정보적으로 연결되던지 간에)를 갖는 본래 이웃에 다시 연결하는 것을 가능하게 하는 암호를 수용한다. 태그화된 단편을 무작위 방법 또는 서열-특이적인 방법, 예컨대 효소 소화, 무작위 전단, 트랜스포존-기반 전단 또는 다른 방법에 의해서 적어도 2회 단편화하여, 암호-태그화된 DNA 단편의 하위-라이브러리를 생성한다. 이미 기술된 방법의 유용한 변형에서, 암호-태그화된 단편은 하류 풍부화 목적을 위해서 비오틴 또는 다른 친화성 작용기를 함유하는 트랜스포존을 사용하여 우선적으로 단리될 수 있다. 후속 라이브러리 제조는 네스팅된 DNA 단편을 서열분석 템플레이트로 전환시킨다. 쌍을 이룬-단부 서열분석은 DNA 단편 및 표적 DNA의 암호-태그의 서열의 결정을 유발한다. 동일한 암호-태그에 대해서 네스팅된 라이브러리가 생성되기 때문에, 긴 DNA 단편은 짧은 판독물을 사용하여 서열분석될 수 있다.

서열분석 방법

본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 서열분석 기술과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 측정하기 위한 공정은 자동화 공정일 수 있다.

본 명세서에 기술된 서열분석 방법의 일부 실시형태는 합성에 의한 서열분석(SBS) 기술, 예를 들어, 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기술에 의한 서열분석을 포함한다. 파이로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 초기 가닥에 혼입될 때 무기 파이로포스페이트(PP_i)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghiet al., Analytical Biochemistry 242(1): 84-9 (1996)]; [Ronaghi, M.Genome Res. 11(1):3-11 (2001)]; [Ronaghiet al., Science 281(5375):363 (1998)]; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다).

SBS의 또 다른 예시적인 유형에서, 예를 들어, 미국 특허 제7,427,67호, 미국 특허 제7,414,1163호 및 미국 특허 제7,057,026호(이들 각각의 이들의 전문이 참고고 포함됨)에 기술된 바와 같이, 예를 들어 절단 가능한 염료 표지 또는 광염색 가능한 염료 표지를 함유한 가역적인 종결자 뉴클레오타이드의 단계식 부가에 의해서 사이클 서열분석이 성취된다. 일루미나 인크.에 의해서 상업화된 이러한 접근법은 또한 국제 특허 출원 공개 제WO 91/06678호 및 제WO 07/123744호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 형광-표지된 종결자의 사용 가능성(여기서 두 말단은 역상이 될 수 있고, 형광 표지가 절단될 수 있음)은 효율적인 순환 가역 종결(cyclic reversible termination: CRT) 서열분석을 가능하게 한다. 중합효소를 또한 공동-조작하여 이들 변형된 뉴클레오타이드로부터 효율적으로 혼입 및 연장시킬 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 추가로 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 출원 공개 제2007/0166705호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0188901호, 미국 특허 제7057026호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0240439호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0281109, PCT 공개 제WO 05/065814호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900호, PCT 공개 제WO 06/064199호 및 PCT 공개 WO 07/010251호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

본 명세서에 기술된 서열분석 기술의 일부 실시형태는 결찰 기술에 의한 서열분석을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 DNA 리가제를 사용하여 뉴클레오타이드를 혼입하고, 이러한 뉴클레오타이드의 혼입을 식별한다. 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 제6,969,488호, 미국 특허 제6,172,218호, 및 미국 특허 제6,306,597호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.

본 명세서에 기술된 서열분석 방법은 다수의 상이한 표적 핵산이 동시에 조작되도록 다중 포맷으로 이롭게 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상이한 표적 핵산을 공통 반응 용기 내에서 또는 특정 기재의 표면 상에서 처리할 수 있다. 이는 서열분석 시약의 편리한 전달, 미반응 시약의 제거 및 혼입 사건의 검출을 다중 방식으로 허용한다. 표면-결합된 표적 핵산을 사용하는 실시형태에서, 표적 핵산은 어레이 포맷으로 존재할 수 있다. 어레이 포맷에서, 표적 핵산은 전형적으로 공간적으로 구별 가능한 방식으로 표면에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 직접 공유 부착, 비드 또는 다른 입자에 대한 부착 또는 중합효소와의 회합 또는 표면에 부착된 다른 분자에 의해서 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(또는 특징부로서도 지칭됨)에서 표적 핵산의 단일 복사체를 포함할 수 있거나, 동일한 서열을 갖는 다수의 복사체가 각각의 부위 또는 특징부에 존재할 수 있다. 다수의 복사체는 본 명세서에 추가로 상세하게 기술된 바와 같은 증폭 방법, 예컨대 브릿지 증폭 또는 에멀젼 PCR에 의해서 제조될 수 있다.

본 명세서에 언급된 방법은 예를 들어, 적어도 약 10특징부/㎠, 100특징부/㎠, 500특징부/㎠, 1,000특징부/㎠, 5,000특징부/㎠, 10,000특징부/㎠, 50,000특징부/㎠, 100,000특징부/㎠, 1,000,000특징부/㎠, 5,000,000특징부/㎠, 10⁷특징부/㎠, 5x10⁷특징부/㎠, 10⁸특징부/㎠, 5x10⁸특징부/㎠, 10⁹특징부/㎠, 5x10⁹특징부/㎠, 또는 그 초과를 비롯한, 임의의 다양한 밀도로 특징부를 갖는 어레이를 사용할 수 있다.

서열분석 데이터에서 오류율을 감소시키는 방법

본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 서열분석 데이터에서 오류율을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이중-가닥 표적 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 상이한 바코드와 각각 회합시킨다. 각각의 가닥을 증폭시키고, 서열 정보를 증폭된 가닥의 다수의 복사체로부터 수득하고, 표적 핵산의 컨센서스 서열 표현을 중복 서열 정보로부터 생성한다. 따라서, 서열 정보는 각각의 가닥으로부터 기원하고, 그것으로부터 식별될 수 있다. 따라서, 서열 오류가 식별 및 감소될 수 있는데, 여기서 하나의 가닥으로부터 기원한 서열 정보는 다른 가닥으로부터의 서열 정보와 불일치한다.

일부 실시형태에서, 표적 핵산의 센스 및 안티센스 가닥을 상이한 바코드와 회합시킨다. 바코드는 어댑터의 결찰 및 트랜스포존 서열의 삽입을 비롯한, 다양한 방법에 의해서 표적 핵산과 회합될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, Y-어댑터를 표적 핵산의 적어도 하나의 단부에 결찰시킬 수 있다. Y-어댑터는 이중-가닥 서열 및 비-상보 가닥(각각의 가닥이 상이한 바코드를 포함함)을 포함할 수 있다. 각각의 바코드를 사용하여 본래 센스 또는 안티센스 가닥을 식별할 수 있도록 결찰된 Y-어댑터를 갖는 표적 핵산을 증폭시키고, 서열분석할 수 있다. 유사한 방법은 문헌[Kinde I. et al., (2011) PNAS 108:9530-9535]에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 트랜스포존 서열을 삽입함으로써 표적 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 상이한 바코드와 회합된다. 일부 이러한 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 비-상보성 바코드를 포함할 수 있다.

이러한 방법의 일부 실시형태는 (a) 제1 서열분석 어댑터 및 제2 서열분석 어댑터를 포함하고, 그들 사이에 배치된 이중-가닥 표적 핵산의 적어도 일부를 갖는 템플레이트 핵산으로부터 서열 데이터를 수득하는 단계를 포함하는 표적 이중-가닥 핵산의 가닥으로부터 서열 정보를 수득하는 것을 포함하며, 여기서: (i) 제1 서열분석 어댑터는 이중-가닥 제1 바코드, 단-가닥 제1 프라이머 부위 및 단-가닥 제2 프라이머 부위를 포함하고, 여기서 제1 프라이머 부위 및 제2 프라이머 부위는 비-상보적이고, (ii) 제2 서열분석 어댑터는 이중-가닥 제2 바코드, 단-가닥 제3 프라이머 부위 및 단-가닥 제4 프라이머 부위를 포함하고, 여기서 제3 프라이머 부위 및 제4 프라이머 부위는 비-상보적이다. 일부 실시형태에서, 템플레이트 핵산의 센스 가닥의 제1 프라이머 부위 및 템플레이트 핵산의 안티센스 센스 가닥의 제3 프라이머 부위는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 바코드는 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 서열분석 어댑터는 제1 프라이머 부위 및 제2 프라이머 부위를 커플링시키는 단-가닥 헤어핀을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 표적 핵산의 각각의 단부는, 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로부터의 연장 산물이 서로로부터 구별될 수 있도록, 상이한 바코드를 포함하는 어댑터와 회합된다. 일부 실시형태에서, 프라이머 부위 서열 및 바코드는, 센스가닥에 어닐링된 프라이머로부터의 연장이 안티센스 가닥에 어닐링된 프라이머로부터의 연장의 산물과 구별될 수 있도록 선택된다. 예에서, 3' 센스 프라이머 부위는 3' 안티센스 프라이머 부위와 동일하지만, 5' 센스 및 5' 안티센스 프라이머 부위 둘 모두와 상이하다. 3' 센스 프라이머 부위 및 3' 안티센스 프라이머 부위에 어닐링된 프라이머의 연장은 각각의 가닥으로부터 하기 산물을 산출할 것이다:

센스 가닥: (5') 바코드2 - [표적 서열] - 바코드1 (3')

안티센스 가닥: (5') 바코드 1 - [표적 서열] - 바코드2 (3')

따라서, 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로부터의 연장 산물은 서로로부터 구별될 수 있다. 예시적인 방법은 문헌[Schmitt M.W., et al., PNAS (2012) 109:14508-13]에 설명되어 있고, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 일부 이러한 방법에서, 바코드 및 프라이머 부위는 어댑터의 결찰 및 트랜스포존 서열의 삽입을 비롯한 다양한 방법에 의해서 표적 핵산과 회합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포존 서열은 어댑터에 헤어핀을 제공하도록 설계될 수 있다. 헤어핀은 표적 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 물리적인 인접성을 유지시키는 능력을 제공한다. 본 명세서에 기술된 연결기를 포함하는 트랜스포존 서열을 사용하는 헤어핀을 포함하는 템플레이트 핵산을 제조할 수 있다. 연결기의 예는 단-가닥 핵산을 포함한다.

이중-가닥 표적 핵산의 각각의 가닥으로부터 서열 정보를 수득하기 위해서 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조하는 일부 실시양태는 (a) 전이효소 및 (i) 제1 전이효소 인식 부위, 제1 프라이머 부위, 및 제1 바코드를 포함하는 제1 트랜스포존 서열, 및 (ii) 제2 전이효소 인식 부위, 제2 프라이머 부위, 및 제2 바코드를 포함하는 제2 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀의 집단을 제공하는 단계(여기서, 제1 트랜스포존 서열은 제2 트랜스포존 서열과 비-인접함); 및 (b) 트랜스포좀을 상기 제1 트랜스포존 서열 및 제2 트랜스포존 서열이 이중-가닥 표적 핵산 내에 삽입하도록 하는 조건하에서 이중-가닥 핵산과 접촉시켜서, 이중-가닥 표적 핵산의 각각의 가닥으로부터 서열 정보를 수득하기 위한 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀의 집단은 전이효소 및 제3 전이효소 인식 부위 및 제4 전이효소 인식 부위를 포함하고, 그들 사이에 바코드 서열을 갖는 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀을 추가로 포함하고, 상기 바코드 서열은 제3 바코드 및 제4 바코드를 포함하고, 그들 사이에 배치된 서열분석 어댑터를 갖고, 상기 서열분석 어댑터는 제3 프라이머 부위 및 제4 프라이머 부위를 포함하고, 그들 사이에 배치된 연결기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 템플레이트 핵산의 센스 가닥의 제1 프라이머 부위 및 템플레이트 핵산의 안티센스 센스 가닥의 제3 프라이머 부위는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태는 또한 (c) 트랜스포존 서열을 포함하는 템플레이트 핵산에 대해서 선택하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 트랜스포존 서열은 제2 트랜스포존 서열과 비-인접하고, 트랜스포존 서열은 연결기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결기는 포획 프로브와 결합하도록 채택된 친화성 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 His, 비오틴, 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 바코드는 상이하다. 일부 실시형태에서, 연결기는 단-가닥 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 게놈 DNA를 포함한다.

일배체형 정보의 수득 방법

본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 표적 핵산으로부터 일배체형 정보를 수득하는 방법을 포함한다. 일배체형 정보는 표적 핵산, 예컨대 게놈의 특정 유전자좌에서 상이한 서열의 유무를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 정보는 대립유전자의 모체 및 부체 복사체에 대해서 수득될 수 있다. 배수체 유기체에서, 서열 정보는 적어도 하나의 일배체형에 대해서 수득될 수 있다. 이러한 방법은 또한 표적 핵산으로부터 서열 정보를 입수하는 데 있어서 오류율을 감소시키기에 유용하다.

일반적으로, 일배체형 정보를 수득하는 방법은, 각각의 구획이 핵산의 일배체형에 대략 동일하거나, 핵산의 일배체형에 대략 동일하거나 그 미만인 많은 양의 핵산을 포함하도록 핵산을 하나 이상의 구획 내에 분포시키는 것을 포함한다. 이어서 정보를 각각의 구획으로부터 수득하여, 일배체형 정보를 수득할 수 있다. 템플레이트 핵산을 복수의 용기 내에 분포시키는 것은, 단일 용기가 대립유전자 또는 SNP의 단일 복사체를 포함하거나, 단일 용기로부터 수득된 컨센서스 서열 정보가 대립유전자 또는 SNP의 서열 정보를 반영할 가능성을 증가시킨다. 이해될 바와 같이, 일부 이러한 실시형태에서, 템플레이트 핵산을 복수의 용기 내에서 구획화하기 전에 템플레이트 핵산을 희석시킬 수 있다. 예를 들어, 각각의 용기는 표적 핵산의 일배체형 등가물에 대략 동일한 많은 양의 표적 핵산을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기는 1 미만의 표적 핵산의 일배체형 등가물을 포함할 수 있다.

일배체형 정보를 측정하는 방법, 버추얼 구획을 사용한 일배체화(haplotyping) 방법, 일배체화를 위해서 표적 핵산을 제조하는 방법은 국제 공개 제WO/2014/142850호에 기술되어 있고, 이것은 본 명세서에 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1― 템플레이트 인접성 유지

본 실시예는 CE 내에서 템플레이트 핵산의 인접성 정보를 유지시키는 방법을 설명한다. Tn5 전이효소가 템플레이트 DNA 사후-좌위(post-transposition)에 결합되어 존재하는 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀을 사용하여 템플레이트 핵산을 제조한다. 표적 핵산을 Tn5 전이효소, 및 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀과 접촉시킨다. SDS로 추가로 처리된 샘플은 템플레이트 핵산의 다양한 단편의 스미어(smear)로서 나타날 수 있고, SDS로 처리되지 않은 샘플은 추정 고분자량 템플레이트 핵산의 보유를 나타낼 수 있다. 따라서, 핵산이 단편화될 수 있더라도, 가까운 서열은 여전히 전이효소에 의해서 서로와 회합될 수 있다.

추가의 또 다른 예시적인 방법에서, 인감 염색체를 포함하는 표적 핵산을 갖는 비-인접한 트랜스포존 서열을 포함하는 트랜스포좀을 사용하여 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조한다. CE는 표적 핵산을 포함한다. DNA의 일배체형 블록이 샘플에 대해서 관찰될 수 있는데, 여기서 전이효소는 SDS 사후-희석에 의해서 제거된다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 실시함으로써, 표적 핵산은 좌위되고, 희석되고, 서열분석 라이브러리로 변형되는 경우 표적 온전성을 유지할 수 있다.

용어 "포함하는"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "비롯한", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방형이고, 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해서 수식되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 수치 파라미터는 수득하려는 목적하는 특성에 따라서 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도 그리고 본 출원에 대해서 우선권 주장하는 임의의 출원에서 임의의 청구범위의 범주에 동일한 원칙의 출원을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 유효 숫자의 수 및 통상의 반올림 접근법에 비추어 이해되어야 한다.

상기 설명은 본 발명의 몇몇 방법 및 물질을 개시한다. 본 발명은 방법 및 물질에서의 변형, 뿐만 아니라 제조 방법 및 장비에서의 변경이 가능하다. 이러한 변형은 본 개시내용의 고려사항 또는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 결론적으로, 본 발명은 본 명세서에는 개시된 특정 실시형태로 제한되고자 함이 아니며, 그것은 본 발명의 진실된 범주 및 사상 내의 모든 변형 및 대안을 포함한다.

공개 출원 및 미공개 출원, 특허 및 참고 문헌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 인용된 모든 문헌은 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함되고, 본 명세서의 일부가 된다. 참고로 포함된 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 경우에, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 문헌에 대해서 대체 및/또는 우선시되고자 한다.

실시예 2―단일 세포 전체 전사체 서열분석

본 실시예는 cDNA의 전체 길이 전체에서 균일하게 바코딩하는 방법 및 바코드를 사용하여 cDNA의 인접성 정보를 측정할뿐만 아니라 세포 공급원을 식별하는 방법, 즉 mRNA와 연관된 단일 세포를 식별하는 방법을 기술한다.

본 실시예는 단일 세포의 전사체를 서열분석하는 방법을 설명한다. 본 실시에에서, 액적 미소유체를 사용하여 개별 포획 비드 상에 다수의 단일 세포의 전사체를 포획하고, 이어서 인접 보존 전위 및 조합 인덱싱(CPT-seq)을 사용하여 각각의 단일 세포의 전사체로부터 유래된 cDNA를 바코딩한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다수의 바코딩 공정을 사용하여 단일 세포 cDNA를 인덱싱하는데, 여기서 제1 바코드는 태그화 반응에서 부가되고, 제2 바코드는 PCR 증폭 반응에서 부가된다.

일례에서, 폴리-A+ RNA를 단일 세포로부터 포획하고, 포획된 폴리-A+ RNA를 복합 서열분석 라이브러리의 생성을 위해서 벌크로 가공한다.

방법은 하기 단계를 포함할 수 있다. 단계 1에서, 단일 세포로부터의 RNA를 포획 비드 상에 포획한다. 예를 들어, 다수의 단일 세포(예를 들어, 약 1000개의 단일 세포)를 용해 완충액 및 포획 비드를 포함하는 개별 액적(즉, 평균, 액적 당 하나의 세포 및 하나의 비드)에 캡슐화한다. 폴리-dT 포획 서열 및 PCR 프라이머 서열을 포함하는 복수의 포획 프로브가 포획 비드의 표면 상에 고정된다. 액적의 용해 완충액 조성물은 단일 세포의 세포질 막을 해리시켜 세포질 RNA를 방출시킨다. 방출된 폴리-A+ RNA는 RNA 상의 폴리-A+ 서열의, 공동-캡슐화된 포획 비드의 표면 상에 고정된 올리고-dT 포획 서열에 대한 혼성화에 의해서 포획된다. 이제 각각의 포획 비드는 단일 세포의 전사체로부터의 폴리-A+ RNA를 포함한다. 단일 세포로부터의 모든 폴리-A+ RNA는 포획 비드 상에서 서로에 근접하게 유지된다.

단계 2에서, 그 상에 단일-세포 폴리-A+ RNA를 갖는 포획 비드를 다수의 액적(예를 들어, 약 1000개의 포획 비드)으로부터 풀링하고, 이중-가닥 cDNA를 합성한다. 예를 들어, 포획 비드를 풀링하고, 세척하고, 제1 가닥 cDNA를 가닥 스위칭을 할 수 있는 RNAse H 마이너스 역전사효소를 사용하여 합성한다. 가닥 스위치 프라이머를 제1 가닥 cDNA 합성 동안 포함시켜, cDNA의 3' 단부에서 다용도 프라이머 부위의 배치를 허용한다. 이어서, 이중-가닥 cDNA를 다용도 프라이머 및 고 충실도 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 반응(예를 들어, 1 내지 2 사이클의 PCR)으로 제조한다. 각각의 포획 비드는 이제 단일 세포로부터의 폴리-A+ RNA로부터 역전사된 cDNA를 포함한다.

단계 3에서, 그 상에 이중-가닥 cDNA를 갖는 포획 비드를, 웰 당 약 10개의 포획 비드가 존재하도록, 96-웰 플레이트의 웰에 분포시킨다.

단계 4에서, 각각의 웰 내의 이중-가닥 cDNA를 96종의 독특하게 인덱싱된 트랜스포좀을 사용하여 태그화한다. 단일-세포 인접성을 보존하면서, 태그화를 사용하여 cDNA를 어댑터 및 인덱스 서열을 사용하여 변형시킨다. 태그화 반응에서 사용된 96종의 독특하게 인덱싱된 트랜스포좀 복합체의 조립이 하기에 보다 상세하게 기술되어 있다. 태그화 반응은 이분 바코드의 제1 부분을 각각의 미래의 cDNA 단편에 부가한다. 각각의 포획 비드는 이제 단일 세포로부터의 태그화된 cDNA를 포함한다.

단계 5에서, 모든 웰 내의 포획 비드를 수집하고, 풀링하고, 세척하고, 웰 당 약 10개의 포획 비드가 존재하도록, 또 다른 96-웰 플레이트의 웰 내에 재분포시킨다. 개별 세포로부터의 mRNA/cDNA는 개별 비드의 표면 상에 남아있고, 전이효소는 단편화된 cDNA에 결합되어 유지되어, 단편을 해리로부터 유지시킨다.

단계 6에서, 전이효소 및 태그화된 cDNA를 포획 비드로부터 방출시킨다. 예를 들어, SDS(1% SDS) 용액의 분취물을 각각의 웰에 첨가하여 결합된 전이효소 및 태그화된 cDNA를 포획 비드로부터 방출시킨다.

단계 7에서, 각각의 웰에서 태그화된 cDNA를 P5 또는 P7 서열 및 독특한 바코드 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 예를 들어, 바코딩된 P5 및 P7 프라이머의 96종의 독특한 조합 중 하나를 각각의 웰에 첨가하고, 태그화된 cDNA 단편을 증폭시킨다. PCR 반응은 각각의 cDNA 단편에 이분 바코드의 나머지 부분을 부가한다. 각각의 cDNA 단편은 이제 4개의 바코드 서열; 즉, 태그화 반응에서 부가된 2개의 서열 및 PCR 증폭 동안 첨가된 2개의 서열을 포함한다. 따라서, 개별 세포로부터의 mRNA/cDNA는 태그화 인덱스 및 증폭 단계를 통해서 첨가된 PCR 인덱스의 조합에 의해서 식별된다.

단계 8에서, 각각의 웰로부터의 바코딩된 cDNA 단편을 풀링 및 서열분석한다.

본 실시예에서, 96 x 96 조합 인덱싱을 사용하여 약 1000개의 단일 세포를 바코딩하고, 두 세포가 동일한 바코드를 가질 가능성은 약 5%이다. 처리량은 "구획"의 수를 증가시킴으로써 용이하게 규모 확대될 수 있다. 예를 들어, 384 x 384 조합 바코딩(약 147,456개의 버추얼 구획)을 사용함으로써, 약 10,000개의 단일 세포를 병렬로 개별적으로 바코팅할 수 있고, 두 세포가 동일한 바코드를 가질 가능성은 약 3%이다.

본 실시예는 또한 조합 바코딩 프로토콜로 이분 바코드의 제1 부분을 첨가하기 위해서 96종의 독특한 바코딩된 트랜스포좀 복합체를 조립하는 공정을 기술한다. 공정은 하기 단계를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 A에서, 개별 인덱싱된 올리고뉴클레오타이드(각각은 이의 3' 단부에서 Tn5 모자이크 단부(ME) 서열을 함유함)를 다용도 5' 포스포릴화된 ME 상보 올리고뉴클레오타이드(pMENTS)에 어닐링함으로써 20종의 독특하게 인덱싱된 트랜스포존을 형성한다. 예를 들어, P5 서열, 독특한 8 염기 "i5" 인덱스 서열, 다용도 커넥터 서열 다용도 커넥터 A-C15: 및 ME 서열을 포함하는 인덱싱된 올리고뉴클레오타이드 1110을 ME 상보 서열 1115에 어닐링한다. ME 상보 서열 1115는 인덱싱된 올리고뉴클레오타이드 1110에서 ME 서열에 상보적인 다용도 5' 포스포릴화된 올리고뉴클레오타이드(pMENTS)이다. 다용도 커넥터 서열 A-C15를 사용하여 차후에 커스텀(custom) 인덱스 2 서열분석 프라이머를 어닐링한다.

어닐링 반응의 제2 세트(즉, 12개의 개별 어닐링 반응)를 수행하여 각각 P7 서열에 가까운 독특한 8 염기 "i7" 인덱스 서열을 포함하는 12개의 트랜스포존의 제2 세트를 형성한다. 예를 들어, P7 서열, 독특한 8 염기 i7 인덱스 서열, 다용도 커넥터 서열 B-D15 및 ME 서열을 포함하는 인덱싱된 올리고뉴클레오타이드 1120을 ME 상보 서열 1115에 어닐링한다. 다용도 커넥터 서열 B-D15를 추후에 사용하여 커스텀 인덱스 1 서열분석 프라이머를 어닐링한다.

단계 B에서, 어닐링된 P5_i5 트랜스포존 1125(즉, 각각 독특한 8 염기 i5 인덱스 서열을 갖는 8종의 P5_i5 트랜스포존 1125) 및 어닐링된 P7_i7 트랜스포존 1130(즉, 독특한 8 염기 i7 인덱스 서열을 갖는 12종의 트랜스포존 1130)을 Tn5 전이효소를 사용하여 개별 반응으로 조립하여 트랜스포좀 복합체를 형성한다. 예를 들어, 각각의 어닐링된 P5_i5 트랜스포존 1125를 Tn5 전이효소 1135와 함께 약 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션시켜서 P5_i5 트랜스포좀 복합체 1140을 형성한다. 유사하게 각각의 어닐링된 P7_i7 트랜스포존 1130을 Tn5 전이효소 1135와 함께 약 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션시켜서 P7_i7 트랜스포좀 복합체 1145를 형성한다.

단계 C에서, P5_i5 트랜스포좀 복합체 1140의 분취물을 P7_i7 트랜스포좀 복합체 1145의 분취물과 조합함으로써 96종의 독특한 트랜스포좀 복합체를 제조한다. 예를 들어, P5_i5 트랜스포좀 복합체 1140을 96-웰 플레이트의 A행 내지 H행에 분취하고, P7_i7 트랜스포좀 복합체 1145를 동일한 96-웰 플레이트의 1열 내지 12열에 분취한다. 8종의 P5_i5 트랜스포좀 복합체 1140 및 12종의 P7_i7 트랜스포좀 복합체 1145의 조합은 96종의 상이한 인덱스 조합을 생성한다.

조립된 트랜스포좀 복합체를 평가하기 위해서, 단일 태그화 반응 및 단일 PCR 반응을 사용하여 10종의 단일 세포로부터의 서열분석 라이브러리를 제조하였다. 10개의 단일 세포로부터 cDNA를 포함하는 10개의 포획 비드를 풀링하고, P5_i5_1과 P7_i7_1 트랜스포좀 믹스를 사용하여 태그화하였다. 이어서, 태그화된 cDNA를 포획 비드로부터 방출시키고, 바코딩된 P5 및 P7 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜서 서열분석 라이브러리를 생성하였다. 이어서, 서열분석 라이브러리에서 단편 크기 분포를 바이오어날라이저(Bioanalyzer)를 사용하여 분석하였다 일부 실시형태에서, PCR 후에 클린 업(clean up)을 수행한다. 일부 실시형태에서, 제2 SPRI 클린 업을 제1 SPRI 클린 업 후에 수행한다. 일부 실시형태에서, 바이오어날라이저에서 분석하기 전에 샘플을 10-배 희석시킨다.

또 다른 예에서, 2종의 상이한 트랜스포좀 복합체 믹스를 사용하여 100개의 단일 세포로부터 서열분석 라이브러리를 제조하였다. 본 실시예에서, 분열 및 풀 프로토콜을 사용하여 트랜스포좀 복합체를 평가하였다. 100개의 단일 세포로부터 cDNA를 포함하는 100개의 포획 비드를 2종의 태그화 반응에 분포시켰는데, 한 태그화 반응은 P5_i5_2와 P7_i7_2 트랜스포좀 믹스를 사용하여 수행하였고, 제2 태그화 반응은 P5_i5_3과 P7_i7_3 트랜스포좀 믹스를 사용하여 수행하였다. 태그화 반응 후, 각각의 반응으로부터의 포획 비드를 풀링하고, 바코딩된 P5 PCR 프라이머와 P7 PCR 프라이머의 2종의 독특한 조합물(즉, P5 PCR 프라이머와 P7 PCR 프라이머의 제1 조합물, 및 P5 PCR 프라이머와 P7 PCR 프라이머의 제2 조합물)을 사용한 PCR 증폭을 위해서 재분포시켜서 2종의 서열분석 라이브러리를 생성하였다. 이어서, 각각의 서열분석 라이브러리의 단편 크기 분포를 바이오어날라이저를 사용하여 분석하였다. 단일 0.7x SPRI 클린-업 단계 후에 바코딩된 라이브러리를 분석하였다.

Claims (61)

1. 하기 단계들을 포함하는, 복수의 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법:
   (a) 복수의 인접성 보존 요소(contiguity preserving element: CE)를 제공하는 단계로서, 각각의 CE는 단일 세포를 포함하는, 상기 제공하는 단계;
   (b) 상기 단일 세포를 상기 CE 내에서 용해시키는 단계로서, 상기 단일 세포 내의 상기 분석물은 상기 CE 내에서 방출되는, 상기 용해시키는 단계;
   (c) 제1 리포터 모이어티(reporter moiety)를 각각의 CE의 상기 단일 세포 내의 제1 분석물에 제공하는 단계;
   (d) 제2 리포터 모이어티를 각각의 CE의 상기 단일 세포 내의 제2 분석물에 제공하는 단계;
   (e) 상기 CE의 상기 제1 분석물 및 상기 제2 분석물의 적어도 일부가 상기 제1 리포터 모이어티 및 상기 제2 리포터 모이어티를 각각 포함하도록 상기 분석물을 변형시키는 단계;
   (f) 상기 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물을 포함하는 상기 CE를 조합하는 단계;
   (g) 각각 상기 제1 리포터 모이어티 및 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하는 상기 제1 분석물 및 상기 제2 분석물을 포함하는 상기 CE를 복수의 구획(compartment)으로 구획화하는 단계;
   (h) 제3 리포터 모이어티를 각각의 CE의 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 상기 제1 분석물에 제공하는 단계;
   (i) 제4 리포터 모이어티를 각각의 CE의 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하는 상기 제2 분석물에 제공하는 단계;
   (j) 적어도 일부의 제1 분석물이 상기 제1 리포터 모이어티 및 상기 제3 리포터 모이어티를 포함하고, 적어도 일부의 제2 분석물이 상기 제2 리포터 모이어티 및 제4 리포터 모이어티를 포함하도록 상기 분석물을 더 변형시키는 단계; 및
   (k) 각각의 구획의 상기 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물을 분석하는 단계로서, 상기 분석은 각 분석물의 공급원인 단일 세포를 검출하는 것인, 상기 분석물을 분석하는 단계;
   여기서, 상기 제1 및 제2 분석물은 서로 다른 유형이고, 상기 유형은 게놈 DNA, cDNA, RNA, 단백질, 지질, 탄수화물, 세포 소기관 및 세포 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티 및 제2 리포터 모이어티는 상기 분석물의 상기 분석물의 공급원을 식별하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 리포터 모이어티의 조합물은 상기 분석물의 상기 공급원을 식별하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물의 검출은 동시에 수행되는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분석물은 게놈 DNA이고, 상기 제2 분석물은 cDNA 또는 RNA인, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 제1 리포터 모이어티 및 제2 리포터 모이어티를 포함하도록 상기 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA의 적어도 일부를 변형시키는 단계는 상기 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를, 트랜스포존(transposon) 서열의 적어도 일부가 상기 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA에 삽입되도록 하는 조건하에서 복수의 트랜스포좀(transposome)과 접촉시키는 것을 포함하되, 각각의 트랜스포좀은 전이효소(transposase) 및 상기 제1 리포터 모이어티 또는 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하는 트랜스포존 서열을 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 단계 (g)는 상기 전이효소를 상기 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA로부터 제거하는 것을 더 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 전이효소는 단계 (e)에서 상기 분석물을 변형시킨 후에 제거되는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 전이효소의 제거는 세제 첨가, 온도 변화, pH 변화, 프로테아제 첨가, 샤프론 첨가, 염 농도 변화, 및 가닥-치환 중합효소(strand-displacing polymerase) 첨가로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
10. 제6항에 있어서, 단계 (e)는 상기 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA의 일부를 복수의 트랜스포좀과 접촉시키는 것을 포함하되, 각각의 트랜스포존은 제1 리포터 모이어티를 포함하는 제1 트랜스포존 서열, 상기 제1 트랜스포존 서열과 인접하지 않은 제2 트랜스포존 서열, 및 상기 제1 트랜스포존 서열 및 상기 제2 트랜스포존 서열과 연관된 전이효소를 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 제1 트랜스포존 서열은 제1 프라이머 부위를 포함하고, 상기 제2 트랜스포존 서열은 제2 프라이머 부위를 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 제1 프라이머 부위는 제1 바코드를 더 포함하고, 상기 제2 프라이머 부위는 제2 바코드를 더 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티, 상기 제2 리포터 모이어티, 상기 제3 리포터 모이어티, 또는 상기 제4 리포터 모이어티는 바코드를 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 하나의 분석물은 단백질이되, 임의로 상기 단백질은 핵산 리포터 모이어티로 표지되고, 추가로 임의로 상기 핵산 리포터 모이어티는 조합방식으로 유래된 바코드 세트를 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 단백질은 단일 세포로부터 유래한, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 내지 (j)를 적어도 1회 더 반복하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 반복되는 단계 (c) 내지 (j) 각각에서 추가 리포터 모이어티는 상기 제1 리포터 모이어티, 상기 제2 리포터 모이어티, 상기 제3 리포터 모이어티, 및 상기 제4 리포터 모이어티와 상이한, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
18. 하기 단계들을 포함하는, 복수의 단일 세포의 분석물을 분석하는 방법:
    (a) 인접성 보존 요소(CE)를 제공하는 단계로서, 각각의 CE는 적어도 하나의 분석물을 포함하고, 상기 각각의 CE의 적어도 하나의 분석물은 단일 세포의 성분인, 상기 제공하는 단계;
    (b) 상기 적어도 하나의 분석물을 포함하는 상기 CE를 복수의 제1 구획으로 구획화하는 하는 단계;
    (c) 제1 리포터 모이어티를 상기 복수의 제1 구획 내의 각각의 CE의 분석물에 제공하는 단계로서, 상기 제1 리포터 모이어티는 상기 CE를 식별하고, 상기 각각의 CE의 분석물에 제공되는 상기 제1 리포터 모이어티는 나머지 각각의 CE의 분석물에 제공되는 제1 리포터 모이어티와 상이하며, 각각의 단일 세포에 고유한 것인, 상기 제공하는 단계;
    (d) 상기 CE의 적어도 일부의 분석물이 제1 리포터 모이어티를 포함하도록 상기 분석물을 변형시키는 단계;
    (e) 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물을 포함하는 상기 CE를 조합하는 단계;
    (f) 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물을 포함하는 상기 CE를 복수의 제2 구획으로 구획화하는 단계;
    (g) 제2 리포터 모이어티를 각각의 CE의 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물에 제공하는 단계;
    (h) 적어도 일부의 분석물이 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하도록 상기 분석물을 더 변형시키는 단계; 및
    (i) 각각의 제2 구획의 상기 제1 리포터 모이어티 및 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하는 상기 분석물을 분석하는 단계로서, 상기 제1 리포터 모이어티 및 선택적으로 상기 제2 리포터 모이어티는 각각의 단일 세포를 식별할 수 있는 것인, 상기 분석물을 분석하는 단계.
19. 제18항에 있어서, 상기 분석물은 핵산을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 핵산은 DNA를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 DNA는 게놈 DNA를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
22. 제19항에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 cDNA를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
23. 제18항에 있어서, 상기 분석물은 조직 분절, 세포 소기관, 지질, 탄수화물, 및 세포 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분석물을 분석하는 방법.
24. 제19항에 있어서, 단계 (d)는 상기 핵산을 트랜스포존 서열의 적어도 일부가 상기 핵산 내에 삽입하도록 하는 조건하에서 각각 전이효소 및 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 트랜스포존 서열을 포함하는 복수의 트랜스포좀과 접촉시키는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 단계 (d)는 상기 핵산을 복수의 트랜스포좀과 접촉시키는 것을 포함하되, 각각의 트랜스포존은 제1 리포터 모이어티를 포함하는 제1 트랜스포존 서열, 상기 제1 트랜스포존 서열과 인접하지 않는 제2 트랜스포존 서열, 및 상기 제1 트랜스포존 서열 및 상기 제2 트랜스포존 서열과 연관된 전이효소를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
26. 제24항에 있어서, 단계 (f)는 상기 전이효소를 구획화된 제1 인덱싱된(indexed) 템플레이트 핵산으로부터 제거하는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 전이효소는 단계 (d) 이후에 제거되는, 분석물을 분석하는 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 전이효소는 단계 (i) 전에 제거되는, 분석물을 분석하는 방법.
29. 제26항에 있어서, 상기 전이효소를 제거하는 것은 세제 첨가, 온도 변화, pH 변화, 프로테아제 첨가, 샤프론 첨가, 염 농도 변화, 및 가닥-치환 중합효소 첨가로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
30. 제25항에 있어서, 상기 제1 트랜스포존 서열은 제1 프라이머 부위를 포함하고, 상기 제2 트랜스포존 서열은 제2 프라이머 부위를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 제1 프라이머 부위는 제1 바코드를 더 포함하고, 상기 제2 프라이머 부위는 제2 바코드를 더 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
32. 제19항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티는 프라이머를 포함하고, 단계 (d)는 상기 핵산을 적어도 하나의 프라이머와 함께 증폭시키는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
33. 제19항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티는 프라이머를 포함하고, 단계 (d)는 상기 핵산을 적어도 하나의 프라이머로 결찰시키는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
34. 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 플라스미드를 상기 CE에 제공하는 것을 더 포함하되, 상기 플라스미드는 단계 (d) 내지 (h)에서 상기 제1 리포터 모이어티 및/또는 상기 제2 리포터 모이어티를 포함하도록 변형되고, 상기 제1 리포터 모이어티 또는 상기 리포터 모이어티를 포함하는 상기 플라스미드는 상기 CE를 식별하는, 분석물을 분석하는 방법.
35. 제18항에 있어서, 상기 분석물은 단백질인, 분석물을 분석하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 단백질은 단일 세포로부터 유래한, 분석물을 분석하는 방법.
37. 제18항에 있어서, 단계 (c) 내지 (h)를 적어도 1회 더 반복하는, 분석물을 분석하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 추가 단계 각각에서 리포터 모이어티의 추가 세트는 리포터 모이어티의 상기 1 세트 및 상기 제2 세트와 상이한, 분석물을 분석하는 방법.
39. 제18항에 있어서, 상기 분석물은 mRNA 또는 cDNA인, 분석물을 분석하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 mRNA 또는 cDNA는 단일 세포로부터 유래한, 분석물을 분석하는 방법.
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 CE는 상기 mRNA 또는 cDNA를 고정시킬 수 있는 고체 지지체를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 고체 지지체는 상기 고체 지지체 상에 고정된 올리고(oligo) (dT) 프로브를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티는 제1 바코드 서열을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
44. 제39항에 있어서, 상기 제2 리포터 모이어티는 제2 바코드 서열을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
45. 제39항에 있어서, 단계 (d)는 상기 cDNA를 트랜스포존 서열의 적어도 일부가 상기 cDNA 내에 삽입하도록 하는 조건하에서 각각 전이효소 및 상기 제1 리포터 모이어티를 포함하는 트랜스포존 서열을 포함하는 복수의 트랜스포좀과 접촉시키는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 단계 (d)는 상기 cDNA를 복수의 트랜스포좀과 접촉시키는 것을 포함하되, 각각의 트랜스포존은 제1 리포터 모이어티를 포함하는 제1 트랜스포존 서열, 상기 제1 트랜스포존 서열과 인접하지 않은 제2 트랜스포존 서열, 및 상기 제1 트랜스포존 서열 및 상기 제2 트랜스포존 서열과 연관된 전이효소를 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
47. 제45항에 있어서, 단계 (f)는 상기 전이효소를 구획화된 제1 인덱싱된 템플레이트 핵산으로부터 제거하는 것을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 전이효소는 단계 (d) 이후에 제거되는, 분석물을 분석하는 방법.
49. 제47항에 있어서, 상기 전이효소는 단계 (i) 전에 제거되는, 분석물을 분석하는 방법.
50. 제47항에 있어서, 상기 전이효소를 제거하는 것은 세제 첨가, 온도 변화, pH 변화, 프로테아제 첨가, 샤프론 첨가, 염 농도 변화, 및 가닥-치환 중합효소 첨가로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는, 분석물을 분석하는 방법.
51. 제39항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티 및 상기 제2 리포터 모이어티는 상기 분석물의 공급원을 식별하는, 분석물을 분석하는 방법.
52. 제39항에 있어서, 상기 리포터 모이어티의 조합물은 상기 분석물의 공급원을 식별하는, 분석물을 분석하는 방법.
53. 제39항에 있어서, 단계 (d) 내지 (i)를 적어도 1회 더 반복하는, 분석물을 분석하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 추가 단계 각각에서 리포터 모이어티의 추가 세트는 리포터 모이어티의 상기 제1 세트 및 상기 제2 세트와 상이한, 분석물을 분석하는 방법.
55. 제1항 내지 제3항 또는 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 세포는 질환과 연관된, 분석물을 분석하는 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 단일 세포는 암과 연관된, 분석물을 분석하는 방법
57. 제55항에 있어서, 상기 단일 세포는 유전 질환과 연관된, 분석물을 분석하는 방법.
58. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리포터 모이어티, 상기 제2 리포터 모이어티, 상기 제3 리포터 모이어티, 또는 상기 제4 리포터 모이어티는 프라이머 결합 부위를 포함하는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
59. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분석물, 상기 제2 분석물, 또는 두 분석물 모두는 핵산인, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 리포터 모이어티를 포함하는 상기 핵산은 세포 분석 전에 증폭되는, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 핵산의 상기 분석은 서열분석에 의한 것인, 단일 세포의 적어도 2종 이상의 분석물을 분석하는 방법.