KR102383799B1 - 서열-기반의 유전 검사용 대조군을 제조하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
서열-기반의 유전 검사용 대조군을 제조하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
이중-가닥 주형 핵산, 예컨대 세포 유리 DNA로부터 생성된 핵산 단편을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 조성물은 라이브러리 제조 방법의 품질, 기기, 예컨대 서열결정 기기의 교정, 및/또는 핵산 서열결정 검사에 대한 밸리데이션을 위한 양성 또는 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. 또한, 핵산 단편의 제조 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2018년 4월 2일자 출원된 미국 가출원 제62/651,453호의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 다른 것들 보다도, 양성 또는 음성 대조군으로서 사용될 수 있고 시퀀싱, 즉, 서열결정(sequencing) 방법의 밸리데이션(validation)을 보조하는 핵산 라이브러리의 제조, 및 라이브러리에서 과다-표현되는(over-represented) 및 과소-표현되는(under-represented) 서열을 식별하기 위한 진단제에 관한 것이다.
출생전 스크리닝 및 진단은 일상적인 산전 관리의 일부이다. 유전 및 염색체 질환의 출생전 진단을 위한 침습성 검사가 존재하지만; 양수검사 또는 융모막 융모 생검은 대략 1%의 유산 위험을 갖는다. 모체 혈액 중 순환 세포-유리 DNA의 존재에 기초한 비-침습성 검사는 모체 말초 혈액 시료로부터의 태아 핵산을 사용하여 태아 염색체 이상을 결정한다. 비-침습성 방법은 출생전 진단을 위한 태아 유전 물질(fetal genetic material)의 대안적이며 더욱 안전한 공급원을 제공한다.
차세대 서열결정(NGS) 기술의 개선은 서열결정 속도와 데이터 출력을 크게 증가시켜, 현재의 서열결정 플랫폼의 거대한 시료 처리량을 초래하였다. 상기 개선은 임상 검사실 내의 진단 기법에서 NGS의 신속한 발전을 초래하였다. 비교적 짧은 시간에 전체 게놈을 서열결정하게 하는 NGS 기술은 침습성 시료추출 방법과 연관된 위험 없이 하나의 염색체로부터 기원한 유전 물질을 또 다른 것의 유전 물질과 비교할 기회를 제공한다.
NGS 기술의 서열결정 플랫폼은 플랫폼이 그의 의도된 용도에 관하여 신뢰성 있는 결과를 생성할 것임을 확인하기 위하여 밸리데이션으로부터 이익을 얻는다. 밸리데이션은 각 검정에 포함되고, 시스템 설치의 적격성을 평가하고, 주기적 성능 적격성 평가를 수행하고, 임상 검정에 대한 결과의 적격성을 평가하기 위한 양성 및 음성 대조군의 이용에 의해 보조된다. 음성 대조군으로서 사용될 수 있는 생물학적 시료는 상대적으로 풍부하며, 수득하기 용이하다. 예를 들어, 다운 증후군에 대한 출생전 검정이 시행 중이면, 음성 대조군은 다운 증후군을 갖지 않는 태아를 가진 임신한 여성으로부터의 혈액 시료일 수 있다. 음성 대조군과 대조적으로, 양성 대조군으로서 사용될 수 있는 생물학적 시료는 수득이 용이하지 않다.
생물학적 시료를 모방하는 합성 양성 대조군은 상업적으로 이용 가능하지만; 그들은 전형적으로 하나 이상의 결함을 갖는다. 세포-유리 DNA를 대체하는 것으로 의도되는 합성 양성 대조군에서의 DNA는 흔히 크기가 균일하지만, 생물학적 시료에서의 세포-유리 DNA는 크기가 균일하지 않다. 합성 양성 대조군에서의 DNA는 종종 세포-유리 DNA를 대체할 것으로 의도되는 DNA의 공급원으로서 사용되는 게놈의 균일한 커버리지를 갖지만, 생물학적 시료에서의 세포-유리 DNA는 반드시 공급원의 게놈의 균일한 커버리지를 갖는 것은 아니다. 다량의 DNA를 제공하는 현재의 방법은 세포-유리 DNA 단편 길이를 모방하지 않으며, 심지어 처리 후에도, 커버리지와 길이 둘 모두에 상당한 편차가 존재한다. 합성 양성 대조군에서의 이들 결함은 NGS 기술로부터의 데이터의 통계적 분석에 영향을 가지며, 편재를 도입한다.
많은 응용에서 양성 또는 음성 대조군으로서 사용될 수 있는 핵산 단편의 집합물, 예컨대 라이브러리의 제조 및 이용 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체로부터 수득되는 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 포함하는 시료를 제공하는 단계 및 범용 어댑터를 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션(ligation)시켜, 범용 어댑터에 의해 플랭킹된(flanked) 주형 핵산을 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 범용 어댑터는 이중 가닥 핵산의 영역을 포함한다. 방법은 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하는 단계 및 범용 어댑터의 적어도 일부를 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 양 말단으로부터 제거하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 재생된 주형 핵산(regenerated template nucleic acid: reDNA)을 초래하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 시료는 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함한다.
일 실시형태에서, 대상체는 병원체 감염, 예컨대 박테리아 병원체 또는 바이러스 병원체에 의해 야기되는 감염을 갖는 것으로 의심된다. 일 실시형태에서, 시료는 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함한다.
일 실시형태에서, 이중-가닥 주형 핵산은 DNA이며, 일부 실시형태에서, 세포 유리 DNA(cell free DNA: cfDNA)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 임신한 인간이며, 이중-가닥 주형 핵산은 태아 및 모체 핵산의 혼합물을 포함한다. 일 실시형태에서, 태아는 유전 질환을 포함하지 않으며, 또 다른 실시형태에서, 태아는 유전 질환을 포함한다. 유전 질환의 일례는 이수성, 예컨대 삼염색체이다. 삼염색체의 예는 21번 삼염색체, 18번 삼염색체, 13번 삼염색체, 9번 삼염색체, 8번 삼염색체, 22번 삼염색체, XXX, XXY 또는 XYY를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 유전 질환은 뉴클레오타이드 서열의 과소-표현을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 신생물을 갖는 것으로 의심된다. 이러한 대상체에서 시료는 순환 종양 DNA 및 세포 유리 정상 DNA를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 라이게이션시키는 단계 이전에, 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 말단이 블런트(blunt) 말단이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은 라이게이션시키는 단계 이전에, 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 3' 말단이 3' 오버행 구조로서 종결되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 범용 어댑터는 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 라이게이션시키는 단계는 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 영역을 주형 핵산의 각 말단에 공유적으로 부착시킨다.
일 실시형태에서, 증폭시키는 단계는 지수적 증폭 반응, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 증폭시키는 단계는 낮은 오차율을 갖는 DNA 중합효소를 포함한다.
일 실시형태에서, 범용 어댑터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하며, 제거하는 단계는 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 제한 엔도뉴클레아제에 노출시키고, 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제의 절단 부위 및 인식 부위는 분리될 수 있으며, 유용한 제한 엔도뉴클레아제의 예에는 SapI, MlyI 또는 BpuEI가 포함된다. 일 실시형태에서, reDNA는 주형의 각 말단에 범용 어댑터의 일부를 보유하며, 또 다른 실시형태에서, reDNA는 주형의 각 말단에 범용 어댑터의 일부를 보유하지 않는다. 일 실시형태에서, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머는 포획제(capture agent), 예컨대 비오틴을 포함한다.
범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 일 실시형태에서, 제거하는 단계는 어댑터-주형-어댑터 분자를 포획제에 결합시키는 화합물을 갖는 표면과 접촉시켜 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하고, 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제에 노출시켜 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함할 수 있으며, 제거된 범용 어댑터는 표면에 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 분리하는 단계는 제거된 범용 어댑터 및 reDNA를 포함하는 혼합물을 포획제에 결합시키는 화합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 화합물은 표면에 부착되며, 제거된 범용 어댑터는 표면에 결합된다. 표면의 일례는 비드이다. 방법은 결합된 제거 범용 어댑터를 갖는 표면을 제거하여 reDNA로부터 제거된 범용 어댑터의 분리를 초래하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제거하는 단계는 소정의 크기 범위 내에 속하는 reDNA의 선택을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체로부터 수득되는 시료로부터 기원하는 복수의 reDNA를 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 reDNA는 주형이다. 방법은 범용 어댑터를 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션시켜 범용 어댑터에 의해 플랭킹된 주형 핵산을 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 범용 어댑터는 (i) 이중 가닥 핵산의 영역, 및 (ii) 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 포함하여, 주형의 적어도 일부의 서열을 결정하기 위한 서열결정 라이브러리를 초래한다.
일 실시형태에서, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역은 적어도 하나의 범용 신장 프라이머 결합 부위를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역은 블런트 말단 구조로서 종결된다. 일 실시형태에서, 복수의 주형은 블런트 말단 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역은 3' 오버행 구조로서 종결된다. 일 실시형태에서, 3' 오버행 구조는 예를 들어, 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 오버행 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 3' 오버행 구조는 T 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다. 일 실시형태에서, 주형은 이중 가닥 핵산의 영역의 3' 오버행 구조에 상보적인 3' 오버행 구조를 포함한다.
방법은 복수의 증폭 부위를 포함하는 표면을 제공하는 단계로서, 증폭 부위가 유리 3' 말단을 갖는 적어도 2개의 부착된 단일 가닥 핵산 집단을 포함하는 단계, 및 증폭 부위를 갖는 표면을, 각각 개별 어댑터-주형-어댑터 분자로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하기에 적합한 조건 하에서 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자의 수는 증폭 부위의 수를 초과하며, 어댑터-주형-어댑터 분자는 증폭 부위에 유체 접근할 수 있고, 증폭 부위의 각각은 몇몇의 어댑터-주형-어댑터 분자에 대한 소정의 용량을 포함한다. 일 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 (i) 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 수송 속도로 증폭 부위로 수송하는 것과, (ii) 증폭 부위에 존재하는 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 증폭 속도로 증폭시키는 것을 동시에 포함하며, 평균 증폭 속도는 평균 수송 속도를 초과한다.
또한, 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 어댑터-주형-어댑터 분자를 포함하며, 범용 어댑터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 예컨대 SapI, MlyI 또는 BpuEI를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성되는 복수의 reDNA를 포함하며, 인공 생물학적 유체를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 인공 생물학적 유체는 인공 혈장을 포함한다.
핵산 검출 검사에서의 대조군의 이용 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다. 방법은 복수의 본 명세서에 기재된 reDNA를 제공하는 단계, 검사 시료 상에서 그리고 reDNA 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계, 및 대조군으로서 reDNA를 사용하여 핵산 검출 검사로부터의 결과를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 핵산 검출 검사는 예를 들어, 서열결정 또는 마이크로어레이 분석을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 검출 검사는 효소적 과정을 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수득되는 복수의 reDNA 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. reDNA는 예를 들어, (i) 라이브러리 제조 방법의 품질을 위한 대조군, (ii) 서열결정 기기를 위한 교정 대조군, (iii) 어레이 기기를 위한 교정 대조군, (iv) 핵산 서열결정 검사를 위한, 예컨대 서열결정-기반의 비침습적 출생전 검사 또는 서열결정-기반의 종양 검출 검사를 위한 밸리데이션 대조군, 또는 (v) 서열결정-기반의 동반 진단 검사를 위한 밸리데이션 대조군일 수 있다. 일 실시형태에서, 동반 진단 검사를 사용하여, 치료적 처치가 치료 요법에서 적합할지 여부를 결정하기 위하여 시료 내의 유전적 변이체 및/또는 관심 서열의 존재 또는 동일성을 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어는 다르게 특정되지 않는 한, 관련 분야에서의 그들의 통상의 의미를 취하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용되는 몇몇의 용어 및 그들의 의미는 하기에 제시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 해당 분야에서의 그의 용도와 일치하는 것으로 의도되고, 자연 발생 핵산 또는 그의 기능적 유사체를 포함한다. 특히 유용한 기능적 유사체는 핵산에 서열 특이적 방식으로 혼성화할 수 있거나 또는 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 자연 발생 핵산은 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 함유하는 백본을 갖는다. 유사체 구조는 해당 분야에 공지된 다양한 것들 중 임의의 것을 비롯한 교대 백본 연결을 가질 수 있다. 자연 발생 핵산은 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, 리보핵산(RNA)에서 발견됨)을 갖는다. 핵산은 해당 분야에 공지된 이러한 당 모이어티의 다양한 유사체 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 핵산은 고유 또는 비-고유 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 고유 데옥시리보핵산은 아데닌, 티민, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보핵산은 우라실, 아데닌, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산에 포함될 수 있는 유용한 비-고유 염기는 해당 분야에 공지되어 있다. 용어 "주형" 및 "표적"은 핵산에 대한 언급에서 사용되는 경우 본 명세서에 언급된 방법 또는 조성물과 관련하여 핵산에 대한 의미론적인 식별자로서 의도되고, 달리 명확하게 지시하는 것을 넘어서 핵산의 구조 또는 기능을 필수적으로 제한하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "주형 단편" 및 관련 용어(예를 들어, "주형 핵산 단편, "주형 분자" 및 "주형 핵산 분자")는 궁극적으로, 예컨대 어레이 상에서 서열결정하거나, 조성물을 생성하는데 사용하기 위해 요망되는 핵산 분자를 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "어댑터" 및 그의 파생어, 예를 들어, 범용 어댑터는 일반적으로 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 라이게이션될 수 있는 임의의 선형 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 시료 중에 존재하는 임의의 주형 서열의 3' 말단 또는 5' 말단과 실질적으로 비-상보성이다. 일부 실시형태에서, 적합한 어댑터 길이는 약 10 내지 100개 뉴클레오타이드, 약 12 내지 60개 뉴클레오타이드 및 약 15 내지 50개 뉴클레오타이드의 길이의 범위이다. 일반적으로, 어댑터는 뉴클레오타이드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 절단 가능한 기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 하나 이상의 범용 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어, 범용 프라이머의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 또는 실질적으로 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 하류 오차 보정, 식별 또는 서열결정을 보조하도록 본 명세서에 바코드로도 지칭되는 인덱스를 포함할 수 있다. 용어 "어댑터(adaptor)" 및 "어댑터(adapter)"는 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "범용 서열"은 분자가 또한 서로 상이한 서열의 영역을 갖는 둘 이상의 핵산 분자, 예를 들어, 어댑터-주형-어댑터 분자에 공통인 서열의 영역을 지칭한다. 분자 집합물의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 서열, 예를 들어, 범용 신장 프라이머 결합 부위의 일부에 상보성인 범용 포획 핵산의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 포획을 가능하게 할 수 있다. 범용 신장 프라이머 결합 부위의 비-제한적인 예는 P5 및 P7 프라이머와 동일하거나 이와 상보성인 서열을 포함한다. 유사하게, 분자의 집합물의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 서열, 예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위의 일부에 상보성인 범용 프라이머의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 복제 또는 증폭을 가능하게 할 수 있다. 이에 따라, 범용 포획 핵산 또는 범용 프라이머는 범용 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 주형 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 상이한 주형 서열의 하나의 말단 또는 양 말단에 범용 어댑터(본 명세서에 어댑터로도 지칭됨)를 부착하도록 변형될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 분자의 집합물의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 어댑터가 부착되는 주형 분자로부터의 범용 어댑터의 일부, 예를 들어, 범용 제거 서열의 제거를 가능하게 할 수 있다.
증폭 프라이머, 예를 들어, 범용 프라이머 신장 프라이머를 지칭하는 경우, 용어 "P5" 및 "P7"이 사용될 수 있다. 용어 "P5'"(P5 프라임) 및 "P7'"(P7 프라임)은 각각 P5 및 P7의 상보물을 지칭한다. 임의의 적합한 증폭 프라이머가 본 명세서에 제시된 방법에서 사용될 수 있으며, P5 및 P7의 이용이 단지 예시적인 실시형태인 것이 이해될 것이다. 유동 셀 상에서의 증폭 프라이머, 예컨대 P5 및 P7의 이용은 WO 2007/010251호, WO 2006/064199호, WO 2005/065814호, WO 2015/106941호, WO 1998/044151호 및 WO 2000/018957호의 개시내용에 의해 예시된 바와 같이 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 임의의 적합한 정방향 증폭 프라이머는 고정화되든지 용액 중이든지, 상보성 서열로의 혼성화 및 서열의 증폭을 위하여 본 명세서에 제시된 방법에서 유용할 수 있다. 유사하게, 임의의 적합한 역방향 증폭 프라이머는 고정화되든지 용액 중이든지, 상보성 서열로의 혼성화 및 서열의 증폭을 위하여 본 명세서에 제시된 방법에서 유용할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 제시된 바와 같은 핵산의 포획 및 증폭에 적합한 프라이머 서열을 설계하고 이용하는 방법을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭시키다", "증폭시키는" 또는 "증폭 반응" 및 그들의 파생어는 일반적으로 핵산 분자의 적어도 일부가 적어도 하나의 추가의 핵산 분자로 복제되거나 또는 카피되는 임의의 작용 또는 과정을 지칭한다. 추가의 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 적어도 일부 부분과 실질적으로 동일하거나 또는 실질적으로 상보성인 서열을 선택적으로 포함한다. 표적 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 추가의 핵산 분자는 독립적으로 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 증폭은 핵산 분자의 선형 또는 지수적 복제를 선택적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 증폭은 등온 조건을 사용하여 수행될 수 있고; 다른 실시형태에서, 이러한 증폭은 써모사이클링(thermocycling)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭은 단일 증폭 반응에서 복수의 표적 서열의 동시의 증폭을 포함하는 멀티플렉스 증폭이다. 일부 실시형태에서, "증폭"은 단독으로 또는 조합하여, DNA 및 RNA 기반 핵산의 적어도 일부 부분의 증폭을 포함한다. 증폭 반응은 당업자에게 공지된 증폭 과정 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭 조건" 및 그의 파생어는 일반적으로 하나 이상의 핵산 서열을 증폭시키기에 적합한 조건을 지칭한다. 이러한 증폭은 선형이거나 또는 지수적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 조건은 등온 조건을 포함할 수 있거나, 대안적으로 써모사이클링 조건, 또는 등온 조건과 써모사이클링 조건의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 증폭시키기에 적합한 조건은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 조건을 포함한다. 전형적으로, 증폭 조건은 핵산, 예컨대, 하나 이상의 표적 서열을 증폭시키거나, 하나 이상의 어댑터에 라이게이션된 증폭된 표적 서열, 예를 들어, 어댑터-라이게이션된 증폭된 표적 서열을 증폭시키기에 충분한 반응 혼합물을 지칭한다. 일반적으로, 증폭 조건은 증폭 또는 핵산 합성을 위한 촉매, 예를 들어, 중합효소; 증폭될 핵산에 대하여 어느 정도의 상보성을 보유하는 프라이머; 및 뉴클레오타이드, 예컨대, 핵산에 혼성화된 후 프라이머의 신장을 촉진시키기 위한 데옥시리보뉴클레오타이드 트라이포스페이트(dNTP)를 포함한다. 증폭 조건은 핵산으로의 프라이머의 혼성화 또는 어닐링, 프라이머의 신장 및 신장된 프라이머가 증폭 중인 핵산 서열로부터 분리되는 변성 단계가 요구될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 전형적으로, 증폭 조건은 써모사이클링을 포함할 수 있고; 일부 실시형태에서, 증폭 조건은 어닐링, 신장 및 분리 단계가 반복되는 복수의 사이클을 포함한다. 전형적으로, 증폭 조건은 양이온, 예컨대, Mg++ 또는 Mn++를 포함하고, 다양한 이온 강도의 개질제를 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "재증폭" 및 그의 파생어는 일반적으로 증폭된 핵산 분자의 적어도 일부가 임의의 적합한 증폭 과정(일부 실시형태에서 "2차" 증폭으로 지칭됨)을 통해 추가로 증폭되어, 재증폭된 핵산 분자를 생성하는 임의의 과정을 지칭한다. 2차 증폭은 증폭된 핵산 분자가 생성되었던 원래의 증폭 과정과 동일할 필요도 없고; 재증폭된 핵산 분자가 증폭된 핵산 분자와 완전히 동일하거나 완전히 상보성일 필요도 없으며; 필요한 것은 재증폭된 핵산 분자가 증폭된 핵산 분자 또는 그의 상보물의 적어도 일부를 포함하는 것이다. 예를 들어, 재증폭은 1차 증폭과 상이한 표적-특이적 프라이머를 포함하는 상이한 프라이머 및/또는 상이한 증폭 조건의 사용을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중합효소 연쇄 반응"("PCR")은 K. B. Mullis의 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호의 방법을 지칭하는데, 이것은 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중에서 관심 폴리뉴클레오타이드의 세그먼트의 농도를 증가시키는 방법을 기술한다. 관심 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 이러한 과정은 매우 과량의 2가지 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 요망되는 관심 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 DNA 혼합물에 도입하는 단계에 이어서, DNA 중합효소의 존재 하에서의 일련의 써모사이클링 단계로 이루어진다. 2가지 프라이머는 관심 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 그들의 각각의 가닥에 상보성이다. 혼합물은 먼저 더 높은 온도에서 변성된 다음, 프라이머는 관심 분자의 폴리뉴클레오타이드 내의 상보성 서열에 어닐링된다. 어닐링 후, 프라이머는 중합효소를 사용하여 신장되어 새로운 상보성 가닥의 쌍을 형성한다. 변성, 프라이머 어닐링 및 중합효소 신장 단계를 수회 반복하여(써모사이클링으로 지칭됨) 고농도의 요망되는 관심 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 세그먼트를 수득할 수 있다. 요망되는 관심 폴리뉴클레오타이드(앰플리콘)의 증폭된 세그먼트의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되고, 따라서 이러한 길이는 제어 가능한 파라미터이다. 이러한 과정의 반복으로 인해서, 이 방법은 "중합효소 연쇄 반응"(이하 "PCR")으로 지칭된다. 관심 폴리뉴클레오타이드의 요망되는 증폭된 세그먼트가 혼합물 중에서 우세한 핵산 서열(농도 면에서)이 되기 때문에, 그들은 "PCR 증폭된" 것으로 칭해진다. 상기에 논의된 방법에 대한 변형에서, 표적 핵산 분자를 복수의 상이한 프라이머 쌍, 일부 경우에, 관심 표적 핵산 분자당 하나 이상의 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭시켜, 멀티플렉스 PCR 반응을 형성할 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 "멀티플렉스 증폭"은 적어도 하나의 표적-특이적 프라이머를 사용한 시료 내의 2개 이상의 표적 서열의 선택적인 비-무작위 증폭을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 멀티플렉스 증폭은 단일 반응 용기 내에서 표적 서열의 일부 또는 전부가 증폭되도록 수행된다. 주어진 멀티플렉스 증폭의 "플렉시" 또는 "플렉스"는 일반적으로 단일의 멀티플렉스 증폭 동안 증폭되는 상이한 표적-특이적 서열의 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 플렉시는 약 12-플렉스, 24-플렉스, 48-플렉스, 96-플렉스, 192-플렉스, 384-플렉스, 768-플렉스, 1536-플렉스, 3072-플렉스, 6144-플렉스 또는 그 초과일 수 있다. 몇몇 상이한 방법(예를 들어, 젤 전기영동 이후의 농도계, 생물분석기 또는 정량적 PCR을 사용한 정량화, 표지된 프로브와의 혼성화; 비오티닐화된 프라이머의 혼입 이후의 아비딘-효소 컨쥬게이트 검출; 증폭된 표적 서열 내로의 32P-표지된 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 혼입)에 의해 증폭된 표적 서열을 검출하는 것이 또한 가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머" 및 그의 파생어는 일반적으로 관심 표적 서열에 혼성화할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전형적으로, 프라이머는 뉴클레오타이드가 중합효소에 의해 중합될 수 있는 기질로서 기능하지만; 일부 실시형태에서, 프라이머는 합성된 핵산 가닥 내에 혼입되어, 또 다른 프라이머가 혼성화할 수 있는 부위를 제공하여, 합성된 핵산 분자에 상보성인 새로운 가닥의 합성을 프라이밍할 수 있다. 프라이머는 뉴클레오타이드 또는 그의 유사체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 그의 유사체, 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 이 용어는 등가물로서, 뉴클레오타이드 유사체로부터 제조된 DNA, 예컨대 세포 유리 DNA(cfDNA) 또는 RNA의 유사체를 포함하도록 이해되어야 하고, 단일 가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드에 적용 가능하도록 이해되어야 한다. 이 용어는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 또한 예를 들어, 역전사효소의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 DNA에 상보성이거나 또는 이를 카피하는, cDNA를 포함한다. 이 용어는 분자의 1차 구조 만을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA"), 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포 유리 DNA"("cfDNA") 및 세포 유리 순환 DNA("cffDNA")는 상호 교환 가능하게 사용되며, 대상체에 존재하는 경우 세포와 회합되지 않는 DNA를 지칭한다. cfDNA는 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 타액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 대상체의 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 대상체 및 비-인간 대상체, 예컨대 포유동물을 지칭한다. 본원의 예가 인간에 관한 것이고, 언어가 주로 인간에 관한 것이지만, 본 개시내용의 개념은 임의의 동물로부터의 게놈에 적용 가능하며, 수의학, 동물 과학, 연구소 등의 분야에 유용하다.
본 명세서에 정의되는 바와 같이, "시료" 및 그의 파생어는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 주형을 포함하는 것으로 의심되는 임의의 시편, 배양물 등을 포함한다. 시료는 하나 이상의 핵산을 함유하는 임의의 생물학적(예를 들어, 임상적 또는 수술적) 시료를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 시료는 "액체 생검", 예를 들어, 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 세척액, 뇌척수액, 정액, 땀, 눈물, 타액, 대변 등의 결과이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "혈액", "혈장" 및 "혈청"은 그의 분획 또는 가공된 부분을 명시적으로 포함한다. 유사하게, 시료를 생검, 면봉표본(swab), 도말표본(smear) 등으로부터 취하는 경우, "시료"는 생검, 면봉표본, 도말표본 등으로부터 유래되는 가공된 분획 또는 부분을 명시적으로 포함한다.
본 명세서에서 용어 "모체 시료"는 임신한 대상체로부터 수득되는 생물학적 시료를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "라이브러리" 및 "서열결정 라이브러리"는 그들의 5' 말단에 공통 서열과, 그들의 3' 말단에 공통 서열을 공유하는 주형 분자의 집합물 또는 복수의 주형 분자를 지칭한다. 그들의 3' 및 5' 말단에 공지된 공통 서열을 함유하는 주형 분자의 집합물은 3' 및 5' 변형된 라이브러리로도 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "관심 서열"은 본 명세서에 기재된 질환, 예를 들어, 유전 질환 또는 신생물을 갖는 개체에 비한 건강한 개체에서의 서열 표현의 차이와 연관된 핵산 서열을 지칭한다. 관심 서열은 질환에서 잘못 표현되는(misrepresented), 즉, 과다- 또는 과소-표현되는(결실 포함) 염색체 상의 서열일 수 있다. 관심 서열은 질환의 발생 및/또는 진행에서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있거나, 의심되는 서열일 수 있다. 관심 서열은 또한 염색체의 일부 또는 염색체일 수 있다. 예를 들어, 관심 서열은 이수성 질환에서 과다-표현되는 염색체 또는 그의 부분, 또는 암에서 과소-표현되는 종양-억제자를 인코딩하는 유전자 또는 그의 부분일 수 있다. 관심 서열은 병원체 게놈, 예를 들어, 바이러스 또는 미생물 게놈의 일부일 수 있다. 관심 서열은 유전적 변이체, 예컨대 단일 뉴클레오타이드 다형성일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이수성"은 전체 염색체 또는 염색체의 부분의 소실 또는 획득에 의해 야기되는 유전 물질의 불균형을 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "염색체 이수성"은 전체 염색체의 소실 또는 획득에 의해 야기되는 유전 물질의 불균형을 지칭하며, 생식선 이수성 및 모자이크 이수성을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "부분 이수성"은 염색체의 소실 또는 획득, 예를 들어, 부분적 일염색체 및 부분적 삼염색체에 의해 야기되는 유전 물질의 불균형을 지칭하며, 전좌, 결실 및 삽입으로부터 초래되는 불균형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신생물"은 조직의 비정상적인 성장을 지칭하며, 그것이 덩어리를 형성하면, 이는 전형적으로 종양으로 지칭된다. 신생물은 악성(암) 또는 양성(암이 아님)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자" 및 그의 파생어는 일반적으로 표적-특이적 프라이머 및 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 어댑터-주형-어댑터 서열을 증폭시킴으로써 생성된 핵산 서열을 지칭한다. 증폭된 어댑터-주형-어댑터 서열은 주형 서열에 대하여 동일한 센스(즉, 양성 가닥) 또는 안티센스(즉, 음성 가닥) 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "라이게이션시키는", "라이게이션" 및 그들의 파생어는 일반적으로 2개 이상의 분자를 함께 공유적으로 연결시키는 과정, 예를 들어, 2개 이상의 핵산 분자를 서로 공유적으로 연결시키는 과정을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 라이게이션은 핵산의 인접 뉴클레오타이드 간의 닉(nick)을 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 라이게이션은 제1 핵산 분자의 말단과 제2 핵산 분자의 말단 사이에 공유 결합을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 라이게이션은 하나의 핵산의 5' 포스페이트기와 제2 핵산의 3' 하이드록실기 사이에 공유 결합을 형성하여, 라이게이션된 핵산 분자를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로 본 개시내용의 목적을 위하여, 증폭된 표적 서열을 어댑터에 라이게이션시켜, 어댑터-라이게이션된 증폭된 표적 서열을 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "블런트-말단화" 및 "말단-수선"은 상호 교환 가능하게 이중-가닥 DNA 분자의 양 가닥이 염기쌍으로 종결되게 하는 효소 과정을 지칭하며, 블런트-말단화 효소로부터 블런트-말단 생성물을 정제하는 것을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "테일링(tailing)"은 DNA의 3' 말단에 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 전형적으로 아데닌을 부가하는 효소 과정을 지칭하며, 테일링 효소로부터 테일링된 생성물을 정제하는 것을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리가제" 및 그의 파생어는 일반적으로 2개의 기질 분자의 라이게이션을 촉매작용시킬 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 리가제는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 사이의 닉의 연결을 촉매작용시킬 수 있는 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리가제는 하나의 핵산 분자의 5' 포스페이트와 또 다른 핵산 분자의 3' 하이드록실 사이에 공유 결합의 형성을 촉매작용시켜, 라이게이션된 핵산 분자를 형성할 수 있는 효소를 포함한다. 적합한 리가제는 T4 DNA 리가제, T4 RNA 리가제 및 에스케리키아 콜라이(E. coli) DNA 리가제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "라이게이션 조건" 및 그의 파생어는 일반적으로 2개의 분자를 서로 라이게이션시키기에 적합한 조건을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 라이게이션 조건은 핵산 사이의 닉 또는 갭을 시일링(sealing)하기에 적합하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 닉 또는 갭은 해당 분야에서의 그 용어의 사용과 일치한다. 전형적으로, 닉 또는 갭은 효소, 예컨대, 리가제의 존재 하에서 적절한 온도 및 pH에서 라이게이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, T4 DNA 리가제는 약 70 내지 72℃의 온도에서 핵산 사이의 닉을 연결할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유동 셀"은 하나 이상의 유체 시약이 유동될 수 있는 고체 표면을 포함하는 챔버를 지칭한다. 본 개시내용의 방법에서 용이하게 사용될 수 있는 유동 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 예는 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497호; US 7,057,026호; WO 91/06678호; WO 07/123744호; US 7,329,492호; US 7,211,414호; US 7,315,019호; US 7,405,281호 및 US 2008/0108082호에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 핵산에 대한 언급에서 사용되는 경우 용어 "앰플리콘"은 핵산의 카피 생성물을 의미하고, 여기서 생성물은 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부와 동일하거나 그에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 앰플리콘은 예를 들어, PCR, 회전환 증폭(RCA), 라이게이션 신장, 또는 라이게이션 연쇄 반응을 비롯한, 주형으로서 핵산 또는 그의 앰플리콘을 사용하는 임의의 다양한 증폭 방법에 의해 생성될 수 있다. 앰플리콘은 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일의 카피(예를 들어, PCR 생성물) 또는 뉴클레오타이드 서열의 다수의 카피(예를 들어, RCA의 콘카타머 생성물(concatameric product))를 갖는 핵산 분자일 수 있다. 표적 핵산의 제1 앰플리콘은 전형적으로 상보성 카피이다. 후속 앰플리콘은 제1 앰플리콘의 생성 이후에, 표적 핵산으로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성된 카피이다. 후속 앰플리콘은 표적 핵산에 실질적으로 상보성이거나 표적 핵산에 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 부위"는 하나 이상의 앰플리콘이 생성될 수 있는 어레이 내의 또는 어레이 상의 부위를 지칭한다. 증폭 부위는 그 부위에서 생성되는 적어도 하나의 앰플리콘을 함유하거나, 보유하거나 또는 그에 부착되도록 추가로 구성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상대적인 위치에 따라 서로 구별될 수 있는 부위의 집단을 지칭한다. 어레이의 상이한 부위에 존재하는 상이한 분자는 그 어레이 내의 부위의 위치에 따라 서로 구별될 수 있다. 어레이의 개별 부위는 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 부위는 특정 서열을 갖는 단일 표적 핵산 분자를 포함할 수 있거나, 부위는 동일한 서열(및/또는 그의 상보성 서열)을 갖는 몇몇 핵산 분자를 포함할 수 있다. 어레이의 부위는 동일한 기판 상에 위치된 상이한 특징부일 수 있다. 예시적인 특징부는 기판 내의 웰, 기판 내 또는 기판 상의 비드(또는 다른 입자), 기판으로부터의 돌출부, 기판 상의 릿지(ridge) 또는 기판 내의 채널을 비제한적으로 포함한다. 어레이의 부위는 각각 상이한 분자를 보유하는 개별 기판일 수 있다. 개별 기판에 부착되는 상이한 분자는, 기판이 회합된 표면 상의 기판의 위치에 따라 또는 액체 또는 젤 중의 기판의 위치에 따라 식별될 수 있다. 개별 기판이 표면 상에 위치된 예시적인 어레이는 비제한적으로 웰 내에 비드를 갖는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용량"은 부위 및 핵산 물질에 대한 언급에서 사용되는 경우 그 부위를 점유할 수 있는 핵산 물질의 최대량을 의미한다. 예를 들어, 이 용어는 특정 조건에서 그 부위를 점유할 수 있는 핵산 분자의 총 수를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 핵산 물질의 총 질량 또는 특정 조건에서 그 부위를 점유할 수 있는 특정 뉴클레오타이드 서열의 카피의 총수를 비롯한 다른 측정치가 마찬가지로 사용될 수 있다. 전형적으로, 표적 핵산에 대한 부위의 용량은 표적 핵산의 앰플리콘에 대한 부위의 용량과 실질적으로 동등할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포획제"는 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산)에 부착, 보유 또는 결합할 수 있는 물질, 화학물질, 분자 또는 그의 모이어티를 지칭한다. 예시적인 포획제는 비제한적으로 표적 핵산의 적어도 일부에 상보성인 포획 핵산, 표적 핵산(또는 그에 부착된 연결 모이어티)에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합쌍의 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등), 또는 표적 핵산(또는 그에 부착된 연결 모이어티)과 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 시약을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "클론 집단"은 특정 뉴클레오타이드 서열에 대하여 균질한 핵산의 집단을 지칭한다. 균질한 서열은 전형적으로 적어도 10개의 뉴클레오타이드 길이이지만, 예를 들어, 적어도 50, 100, 250, 500 또는 1000개의 뉴클레오타이드 길이를 비롯하여, 훨씬 더 길 수 있다. 클론 집단은 단일 표적 핵산 또는 주형 핵산으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 클론성 집단 내의 모든 핵산이 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 것이다. 소수의 돌연변이(예를 들어, 증폭 인공물로 인함)가 클론성에서 벗어나지 않으면서 클론 집단에서 일어날 수 있는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "수송"은 유체를 통한 분자의 이동을 지칭한다. 이 용어는 수동 수송, 예컨대, 그들의 농도 구배(예를 들어, 수동 확산)에 따른 분자의 이동을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 능동 수송을 포함할 수 있고, 이에 의해 분자는 그들의 농도 구배를 따라 또는 그들의 농도 구배에 대하여 이동할 수 있다. 따라서, 수송은 에너지를 적용하여 목적하는 방향으로 또는 목적하는 위치, 예컨대, 증폭 부위로 하나 이상의 분자를 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "각각"은 물품의 집합물에 대한 언급에 사용되는 경우, 집합물 내의 개별 물품을 식별하도록 의도되지만, 문맥에서 명백하게 다르게 언급되지 않는 한, 반드시 집합물 내의 모든 물품을 지칭하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물, 용품, 핵산 또는 핵과 관련하여 "제공하는"은 조성물, 용품, 핵산 또는 핵을 제조하거나, 조성물, 용품, 핵산 또는 핵을 구매하거나, 또는 다르게 화합물, 조성물, 용품 또는 핵을 수득하는 것을 의미한다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소 중 하나 또는 전부 또는 열거된 요소 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 상황 하에서 특정 이익을 제공할 수 있는 본 개시내용의 실시형태를 지칭한다. 그러나, 다른 실시형태가 동일하거나 다른 상황 하에서 또한 바람직할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 언급은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 암시하지 않고, 본 개시내용의 범주로부터 다른 실시형태를 배제하도록 의도되지 않는다.
용어 "포함한다" 및 그의 변형은 이들 용어가 설명 및 청구범위에 존재하는 경우 제한적인 의미를 갖지 않는다.
실시형태가 용어 "포함하다", "포함한다", 또는 "포함하는" 등과 함께 본 명세서에 기재되는 경우에는 언제나, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시형태도 또한 제공되는 것이 이해된다.
달리 명시되지 않는 한, 단수 표현 및 "적어도 하나"는 상호 교환 가능하게 사용되고, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
또한 본 명세서에서, 종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
본 명세서 전체에서 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", 또는 "일부 실시형태" 등에 대한 언급은 그 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특징부, 구성, 조성물 또는 특징이 본 개시내용의 적어도 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체의 다양한 위치에서 이러한 어구의 존재는 본 개시내용의 동일한 실시형태를 반드시 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특징부, 구성, 조성물 또는 특징이 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
별개의 단계를 포함하는 본 명세서에 개시된 임의의 방법의 경우, 단계는 임의의 실행 가능한 순서로 행해질 수 있다. 그리고, 적절한 경우, 2개 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 행해질 수 있다.
본 개시내용의 상기 과제의 해결 수단은 본 개시내용의 각각의 개시된 실시형태 또는 모든 구현예를 기재하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 설명은 더욱 특히 예시적인 실시형태를 예시한다. 본 출원의 몇몇의 위치에서, 예의 목록을 통해 지침이 제공되며, 이 예는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 오직 대표적인 그룹으로서 제공되며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안된다.
본 개시내용의 예시적인 실시형태의 하기의 상세한 설명은 하기의 도면과 함께 읽는 경우 최적으로 이해될 수 있다.
도 1은 본 개시내용에 따른 일반적인 예시적 방법의 일반적인 블록 다이어그램을 보여준다.
도 2는 도 1의 방법에 일반적으로 예시된, 범용 어댑터를 부가하고, 어댑터를 증폭시키고, 제거하기 위한 일 실시형태의 더욱 상세한 다이어그램을 보여준다.
도 3은 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(30)의 개략적인 도면을 보여준다. 도시된 분자(30)는 이중-가닥 주형 영역(31) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(32)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(32)는 범용 제거 서열(33) 및 범용 프라이머 결합 부위(34)를 포함한다.
도 4는 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(40)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(40)는 이중-가닥 주형 영역(41) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(42)를 포함한다. 범용 어댑터는 단일-가닥 영역(43) 및 이중-가닥 영역(44)을 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(42)는 범용 제거 서열(45), 범용 신장 프라이머 결합 부위(46) 및 시료-특이적 인덱스(47)를 포함한다.
도 5는 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(50)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(50)는 이중-가닥 주형 영역(51) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(52)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(52)는 범용 프라이머 결합 부위(53)를 포함한다.
도 6은 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(60)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(60)는 이중-가닥 주형 영역(61) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(62)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(62)는 범용 프라이머 결합 부위(63)를 포함한다. 범용 프라이머 결합 부위(63)에 결합하는 범용 프라이머(64)도 또한 도시된 실시형태에 나타나 있다. 도시된 실시형태에서, 범용 프라이머(64)는 시료-특이적 인덱스(65) 및 범용 신장 프라이머 결합 부위(66)를 포함한다.
개략도는 반드시 일정한 비율로 도시된 것은 아니다. 도면에서 사용된 유사한 번호는 유사한 성분을 지칭할 수 있다. 그러나, 주어진 도면에서 성분을 지칭하기 위한 번호의 사용은 동일한 번호로 표지된 또 다른 도면에서의 성분을 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 성분을 지칭하기 위한 상이한 번호의 사용은 상이한 번호의 성분이 다른 번호의 성분과 동일하거나 유사할 수 없다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다.
도 1은 본 개시내용에 따른 일반적인 예시적 방법의 일반적인 블록 다이어그램을 보여준다.
도 2는 도 1의 방법에 일반적으로 예시된, 범용 어댑터를 부가하고, 어댑터를 증폭시키고, 제거하기 위한 일 실시형태의 더욱 상세한 다이어그램을 보여준다.
도 3은 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(30)의 개략적인 도면을 보여준다. 도시된 분자(30)는 이중-가닥 주형 영역(31) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(32)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(32)는 범용 제거 서열(33) 및 범용 프라이머 결합 부위(34)를 포함한다.
도 4는 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(40)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(40)는 이중-가닥 주형 영역(41) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(42)를 포함한다. 범용 어댑터는 단일-가닥 영역(43) 및 이중-가닥 영역(44)을 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(42)는 범용 제거 서열(45), 범용 신장 프라이머 결합 부위(46) 및 시료-특이적 인덱스(47)를 포함한다.
도 5는 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(50)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(50)는 이중-가닥 주형 영역(51) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(52)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(52)는 범용 프라이머 결합 부위(53)를 포함한다.
도 6은 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에 따라 생성될 수 있는 어댑터-주형-어댑터 분자(60)의 개략도를 보여준다. 도시된 분자(60)는 이중-가닥 주형 영역(61) 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터(62)를 포함한다. 도시된 실시형태에서, 범용 어댑터(62)는 범용 프라이머 결합 부위(63)를 포함한다. 범용 프라이머 결합 부위(63)에 결합하는 범용 프라이머(64)도 또한 도시된 실시형태에 나타나 있다. 도시된 실시형태에서, 범용 프라이머(64)는 시료-특이적 인덱스(65) 및 범용 신장 프라이머 결합 부위(66)를 포함한다.
개략도는 반드시 일정한 비율로 도시된 것은 아니다. 도면에서 사용된 유사한 번호는 유사한 성분을 지칭할 수 있다. 그러나, 주어진 도면에서 성분을 지칭하기 위한 번호의 사용은 동일한 번호로 표지된 또 다른 도면에서의 성분을 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 성분을 지칭하기 위한 상이한 번호의 사용은 상이한 번호의 성분이 다른 번호의 성분과 동일하거나 유사할 수 없다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다.
예시적인 실시형태의 상세한 설명
재현성의 결정, 시스템 설치의 적격성 평가, 주기적 성능 적격성 평가의 수행, 임상 검정을 위한 결과의 적격성 평가 등을 위하여 양성 또는 음성 대조군으로서 사용될 수 있는 라이브러리의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 방법은 주형으로서 사용될 수 있는 단편화된 핵산을 포함하는 대조군 시료를 제공하는 단계(도 1, 블록 10), 및 범용 어댑터를 핵산 단편의 각 말단에 부가하는 단계(도 1, 블록 11; 도 2, 블록 21)를 포함한다. 부가된 범용 어댑터의 결과는 도 2, 블록 22에 나타나 있다. 어댑터에 의해 플랭킹된 단편을 증폭시켜(도 1, 블록 12), 증폭 생성물, 예를 들어, PCR 생성물을 초래하지만(도 2, 블록 23); 라이브러리 내의 단편의 서열의 결정에 관한 방법과 대조적으로, 어댑터를 이후에 제거한다(도 1, 블록 13; 도 2, 블록 24). 결과는 대조군 시료에 원래 존재하는 단편화된 핵산을 포함하는 핵산의 증폭된 라이브러리이다(도 2, 블록 25). 이러한 증폭된 단편의 집단은 또한 본 명세서에서 재생된 주형 핵산, 재생된 DNA 또는 reDNA와 상호 교환 가능하게 지칭된다. 이러한 증폭된 라이브러리는 예를 들어, 검사 시료가 이수성을 포함하는지 여부를 결정하기 위한 표준 방법에서 대조군으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이수성의 존재 또는 부재에 대하여 검정할 검사 시료를 수득하고(도 1, 블록 14), 어댑터의 부가와 같이 서열결정을 위해 준비할 수 있다(도 1, 블록 15). 동일한 방법에서, 대조군도 또한 부가되는 어댑터를 가질 수 있으며(도 1, 블록 15), 검사 및 대조군 시료 둘 모두를 고정화 및 서열결정을 위해 처리한다(도 1, 블록 16). 어댑터의 제거(도 1, 블록 13)로부터 초래되는 reDNA 단편, 예를 들어, reDNA 라이브러리는 원래의 생물학적 시료에서 관찰되는 크기와 유사하거나 이와 동일한 크기의 단편의 집단 및 원래의 생물학적 시료와 유사하거나 이와 동일한 게놈 커버리지를 포함하는 많은 이점을 제공한다. 추가의 이점은 단편의 말단에 부착된 어댑터(또는 그의 부분)를 남길 수 있는 다른 처리 방법과 달리, 본 명세서에 제시된 방법은 어댑터의 임의의 단편 또는 물질을 증폭시키기 위해 사용되는 과정의 부생성물을 남기지 않는다.
본 명세서에 제공되는 라이브러리를 사용하여 하나 이상의 관심 서열의 양이 상이한 것으로 알려져 있거나, 이것이 의심되는 주형의 혼합물을 포함하는 시료(대조군 시료 또는 검사 시료)에서 임의의 관심 서열의 카피수 변이(CNV)를 결정할 수 있다. 관심 서열은 질환과 연관된 것으로 알려져 있거나 이것이 의심되는 수십개의 염기 내지 수백개의 염기, 수천만개의 염기 및 전체 염색체까지의 범위의 게놈 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 복수의 이중-가닥 주형 핵산, 예를 들어, 대조군 시료(도 1, 블록 10), reDNA(어댑터 제거의 결과, 도 1, 블록 13) 또는 검사 시료(도 1, 블록 14) 중 하나 이상을 제공하는 단계를 포함한다. 주형 핵산은 본질적으로 공지된 또는 미공지된 서열의 임의의 핵산일 수 있다. 그것은 예를 들어, 게놈 DNA의 단편일 수 있다. 일 실시형태에서, 주형 핵산은 세포 유리 DNA(cfDNA)이다. 일 실시형태에서, 주형은 생물학적 시료로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 주형은 그들이 각각의 주형 단편의 말단에서 범용 서열, 예를 들어, 범용 어댑터에 존재하는 서열의 대체에 의해 증폭에 적합하도록 처리될 수 있다. 일 실시형태에서, 주형 단편은 또한 서열이 결정되도록 처리될 수 있으며, 서열결정은 주형의 전체 또는 일부의 서열의 결정을 초래할 수 있다. 주형은 또한 cDNA로의 역전사에 의해 RNA 시료로부터 수득될 수 있다.
주형은 시료로부터 이중-가닥 DNA(dsDNA) 형태(예를 들어, 게놈 DNA 단편, cfDNA, PCR 및 증폭 생성물 등)로 기원하거나, DNA 또는 RNA로서, 시료로부터 단일-가닥 형태로 기원할 수 있으며, dsDNA 형태로 전환될 수 있다. 일부 실시형태, 예컨대 주형이 대조군으로서 사용될 실시형태(예를 들어, 도 1, 블록 10)에서, 핵산 시료로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열이 알려져 있을 수 있다. 다른 실시형태, 예컨대 주형이 검사 시료로부터의 것인 실시형태에서, 핵산 시료로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열은 알려져 있지 않을 수 있다(예를 들어, 도 1, 블록 14).
일 실시형태에서, 시료로부터의 주형은 RNA 분자이다. 이러한 실시형태의 일 양태에서, 시료로부터 단리된 RNA를 먼저 해당 분야에 공지된 기법을 사용하여 이중-가닥 DNA로 전환시킨다.
일 실시형태에서, 시료로부터의 주형은 DNA 분자이다. 일 실시형태에서, 주형은 유기체의 전체 유전자 상보물을 나타내며, 인트론 및 엑손 서열 둘 모두, 및 비-코딩 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는 게놈 DNA 분자이다. 일 실시형태에서, 주형은 특정 하위-세트의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 특정 염색체 또는 cfDNA를 나타낸다. 더욱 특히, 주형은 인간, 예컨대 인간 게놈 DNA 분자, 인간 염색체 또는 인간 cfDNA이다. 주형을 임의의 무작위 단편화 과정 이전 및 이후에, 그리고 범용 어댑터 서열의 라이게이션 이전 또는 이후에, 화학적으로 또는 효소적으로 처리할 수 있다.
일 실시형태에서, 시료는 단일의 개체로부터의 것일 수 있다. 단일의 개체의 일례는 임신한 여성이다. 여성이 가진 태아는 관심 서열, 예를 들어, 유전 질환을 갖거나 또는 이를 갖지 않는 태아일 수 있다. 여성이 가진 태아가 유전 질환을 갖는지 여부를 결정하기 위한 방법은 본 명세서에 개시된 방법, 및 양수검사 및 서열결정 방법을 포함하는 숙련자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다(Lo 등의 WO2009/013496호; Quake 등의 WO2007/092473호; Rava 등의 미국 특허 공개 2012/0270739호). 단일의 개체의 또 다른 예는 질환, 예컨대 비제한적으로 유전 질환, 선천성 유전 장애, 유전적 돌연변이, 신생물, 자가면역 질병 또는 이식을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되는 사람이다. 단일의 공급원으로부터의 시료는 2개 이상의 별개의 형태의 유전 물질, 예컨대 모체 대상체로부터 수득되는 모체 및 태아 핵산, 또는 예를 들어, 신생물을 갖는 대상체로부터 수득되는 정상 및 신생물 핵산을 함유할 수 있다. 추가로, 단일의 공급원으로부터의 시료는 쌍둥이, 세쌍둥이 등을 임신한 대상체 또는 다수의 별개의 신생물을 갖는 대상체와 같이, 다수의 별개의 형태의 유전 물질을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 별개의 형태의 유전 물질은 대상체 및 침습성 유기체, 예컨대 기생충, 박테리아 또는 바이러스 감염 등으로부터의 것일 수 있다.
일 실시형태에서, 시료는 대조군 시료로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 대조군 시료는 대조군으로서 사용될 수 있는 reDNA 단편의 집단, 예를 들어, reDNA 라이브러리를 초래하도록 처리되는 것이다(예를 들어, 어댑터 제거의 결과, 도 1, 블록 13). 시료로부터의 라이브러리의 제조 방법이 알려져 있다(예를 들어, Gormley 등의 US 7,741,463호; Rava 등의 미국 특허 공개 2012/0270739호 참조). 전형적으로, 증폭된 라이브러리 내의 관심 서열의 카피수 변이는 시료가 대조군으로서 사용될 수 있도록 알려져 있거나, 결정된다. 예를 들어, 시료가 임신한 여성으로부터의 것이면, 태아의 관심 서열의 카피수 변이가 결정될 수 있다. 태아가 특정 질환, 예컨대 이수성을 갖는다면, 시료는 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 태아가 이수성을 갖지 않는다면, 시료는 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재되고, 도 1에 개략적으로 나타나 있는 바와 같이(블록 10 내지 13 참조), 증폭된 라이브러리를 초래하도록 대조군 시료가 처리된다.
또 다른 실시형태에서, 시료는 검사 시료이다(예를 들어, 도 1, 블록 14). 일 실시형태에서, 검사 시료는 검사 시료 내의 관심 서열의 카피수 변이를 결정하기 위해 충분한 수의 뉴클레오타이드의 서열을 결정하도록 처리되는 것이다. 이것은 건강한 개체 또는 본 명세서에 기재된 유전 질환을 갖는 개체를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 검사 시료는 예를 들어, 바이러스 또는 미생물 감염을 나타낼 수 있는 관심 병원체 서열의 존재를 결정하기 위하여 충분한 수의 뉴클레오타이드의 서열을 결정하도록 처리되는 것이다. 일 실시형태에서, 검사 시료는 하나 이상의 유전적 변이체 또는 관심 서열, 예컨대 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 대립유전자의 삽입, 결실, 재배열 또는 특정 돌연변이의 존재를 결정하기 위하여 충분한 수의 뉴클레오타이드의 서열을 결정하도록 처리되는 것이다. 유전적 변이체(예를 들어, SNP 또는 돌연변이)의 식별을 동반 진단 검사로서 사용하여, 특정 개체에 대한 치료법의 적용 가능성을 결정할 수 있다.
관심 서열의 예는 유전 질환, 예컨대, 비제한적으로 이수성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이수성은 완전한 염색체 삼염색체 또는 일염색체, 또는 부분 삼염색체 또는 일염색체이다. 부분 이수성은 염색체의 일부의 소실 또는 획득에 의해 야기되며, 불균형 전좌, 불균형 역위, 결실 및 삽입으로부터 초래되는 염색체 불균형을 포함한다. 가장 흔하게 알려져 있는 삶과 양립 가능한 이수성은 21번 삼염색체, 즉 다운 증후군(DS)이며, 이는 21번 염색체의 일부 또는 전부의 존재에 의해 야기된다. 드물게, DS는 21번 염색체의 전부 또는 일부의 추가의 카피가 또 다른 염색체(통상 14번 염색체)에 부착되게 하여, 단일의 이상 염색체를 형성하는 선천성 또는 특발성 결함에 의해 야기될 수 있다. DS는 지적 장애, 심각한 학습 어려움 및 심장병과 같은 장기적인 건강 문제에 의해 야기되는 과잉의 사망률과 관련이 있다. 임상적 유의성이 알려져 있는 다른 이수성에는 에드워드(Edward) 증후군(lS 삼염색체)과 파타우(Patau) 증후군(13번 삼염색체)이 포함되며, 이는 처음 몇개월 생 내에 빈번하게 치사이다. 성 염색체의 수와 관련된 이상도 알려져 있으며, X 일염색체, 예를 들어, 여성 출생시 터너 증후군(XO) 및 삼중 X 증후군(XXX) 및 남성 출생시 클라인펠터 증후군(XXY) 및 XYY 증후군을 포함하며, 이는 모두 불임 및 지적 기능의 감소를 포함하는 다양한 표현형과 연관된다.
삼염색체는 21번 삼염색체(T21; 다운 증후군), lS 삼염색체(TIS; 에드워드 증후군), 16번 삼염색체(Tl 6), 22번 삼염색체(T22; 묘안 증후군), 15번 삼염색체(T15; 프래더 윌리 증후군), 13번 삼염색체(T13; 파타우 증후군), S 삼염색체(TS; 워카니(Warkany) 증후군) 및 XXY(클라인펠터 증후군), XYY 또는 XXX 삼염색체일 수 있다. 다양한 다른 삼염색체 및 부분 삼염색체가 단일의 개체 유래의 시료에 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 이들은 1 q32-44 부분 삼염색체, 삼염색체를 갖는 9p 삼염색체, 4번 삼염색체 모자이시즘(mosaicism), 17p 삼염색체, 4q26-qter 부분 삼염색체, 9번 삼염색체, 2p 부분 삼염색체, lq 부분 삼염색체 및/또는 6p 부분 삼염색체/6q 일염색체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단일의 개체 유래의 시료에 존재할 수 있는 다른 유전 질환은 임신 유산에 관여하는 것으로 알려져 있는 X 염색체 일염색체 및 부분 일염색체, 예컨대, 13번 일염색체, 15번 일염색체, 16번 일염색체, 21번 일염색체 및 22번 일염색체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 1 Sp 일염색체는 1 S 염색체의 단완(short arm)(p)의 전부 또는 부분이 결실된(일염색체) 희귀한 염색체 장애이다. 상기 장애는 전형적으로 작은 키, 다양한 정도의 정신 지체, 언어 지연, 두개 및 얼굴(두개안면) 영역의 기형, 및/또는 추가의 신체적 이상을 특징으로 한다. 관련된 두개안면 결함은 사례마다 범위 및 중증도가 크게 달라질 수 있다. 15번 염색체의 구조 또는 카피의 수의 변화에 의해 야기되는 질환은 15번 염색체의 동일한 부분, 15q11-q13 영역에서 유전자 활성의 소실을 수반하는 안젤만 증후군 및 프래더-윌리 증후군을 포함한다. 몇몇의 전좌 및 미세결실이 보인자 부모에서는 무증상일 수 있으나, 자손에서 주요 유전병을 야기할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 15q11-q13 미세결실을 보유하는 건강한 모체는 심각한 신경퇴행 장애인 안젤만 증후군을 지닌 아이를 출산할 수 있다. 따라서, 본 개시내용을 사용하여 태아에서 그러한 결실을 식별할 수 있다. 13q 부분 일염색체는 13번 염색체의 장완(q)의 조각이 소실되는 경우(일염색체) 초래되는 희귀한 염색체 장애이다. 13q 부분 일염색체를 지니고 태어난 유아는 낮은 출산 체중, 머리 및 얼굴(두개안면 영역)의 기형, 골격 이상(특히 손과 발), 및 다른 신체적 이상을 나타낼 수 있다. 정신 지체가 이러한 질환의 특징이다. 이러한 장애를 갖고 태어난 개체 중에서 유년기 동안의 사망률이 높다. 13q 부분 일염색체의 거의 모든 경우가 명백한 이유 없이 무작위로 발생한다(산발적). 디조지 증후군으로도 알려진 22q 11.2 결실 증후군은 22번 염색체의 작은 조각의 결실에 의해 야기되는 증후군이다. 결실(22 q 11.2)은 염색체 쌍 중 하나의 장완 상의 염색체의 중간 근처에서 일어난다. 이러한 증후군의 특징은 동일한 가족의 구성원 사이에서도 광범하게 달라지고, 신체의 많은 부분에 영향을 미친다. 특징적인 징후 및 증상은 선천성 심장병, 폐쇄에 관한 신경근 문제와 가장 흔히 관련되는 구개에서의 결함(연인두폐쇄 부전(velo-pharyngeal insufficiency)), 학습 장애, 얼굴 특징에서의 가벼운 차이, 및 재발성 감염과 같은 선천성 결함을 포함할 수 있다. 염색체 영역 22q 11.2의 미세결실은 20 내지 30배 증가된 조현병의 위험과 관련된다. 일 실시형태에서, 부분 일염색체는 18p 일염색체, 15번 염색체의 부분 일염색체(15q11-q13), 13q 부분 일염색체 및 22번 염색체의 부분 일염색체일 수 있다.
일 실시형태에서, 이수성을 갖는 단일의 개체는 태아이다. 일 실시형태에서, 이수성을 갖는 단일의 개체는 모체이다. 모체에 존재할 수 있는 이수성의 예는 소형의 과다 마커 염색체(SMC); t(11;14)(p15;p13) 전좌; 불균형 전좌 t(8;11)(p23.2;p15.5); 11q23 미세결실; 스미스마제니스 증후군 17p11.2 결실; 22q13.3 결실; Xp22.3 미세결실; 10p14 결실; 20p 미세결실, 디조지 증후군[del(22)(q11.2q11.23)], 윌리엄스 증후군(7q11.23 및 7q36 결실); 1p36 결실; 2p 미세결실; 신경섬유종증 유형 1(17q1 1.2 미세결실), Y q 결실; 울프-허쉬호른 증후군(WHS, 4p16.3 미세결실); 1p36.2 미세결실; 11q14 결실; 19q13.2 미세결실; 루빈스타인-테이비(16p13.3 미세결실); 7p21 미세결실; 밀러-디커 증후군(17p13.3), 17p11.2 결실; 및 2q37 미세결실에 대한 모자이크를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방법은 선천적 결함의 조기의 결정에 더하여, 게놈 내의 유전 서열의 표현의 임의의 이상의 결정에 적용될 수 있다. 암 환자로부터의 혈장 및 혈청 DNA가 측정 가능한 양의 종양 DNA를 함유하며, 이것이 종양 DNA의 대용 공급원으로서 회수되고 사용될 수 있는 것이 나타났다. 종양은 이수성 또는 부적절한 수의 유전자 서열 또는 심지어 전체 염색체를 특징으로 한다. 따라서, 개체 유래의 시료 내의 주어진 서열, 즉, 관심 서열의 양의 차이의 결정은 의학적 질환, 예를 들어, 신생물의 진단에 사용될 수 있다. 신생물의 예는 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 및 모세포종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 암은 폐암, 유방암 및 전립선암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암 환자 내의 순환 cfDNA에서 결정될 수 있는 암과 연관된 게놈 불안정성의 식별은 잠재적인 진단 및 예후 도구이다. 관심 서열은 신생물의 발생 및/또는 진행에서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있거나, 이것이 의심되는 것을 포함한다. 관심 서열의 예는 본 명세서에 기재된 바와 같이 암 세포에서 증폭되거나 결실되는 핵산 서열을 포함한다.
많은 고형 종양, 예컨대 유방암이 몇몇의 유전적 이상의 누적을 통하여 시작부터 전이까지 진행하는 것으로 여겨진다. [문헌[Sato et al., Cancer Res., 50:7184-7189 [1990]]; 문헌[Jongsma et al., J Clin Pathol: Mol Path 55:305-309 [2002]]]. 이러한 유전적 이상은 그들이 누적되는 경우 증식 이점, 유전적 불안정성 및 약물 내성을 신속하게 일으키기 위해 수반되는 능력, 및 향상된 혈관형성, 단백질분해 및 전이를 부여할 수 있다. 유전적 이상은 열성 "종양 억제자 유전자" 또는 우성으로 작용하는 종양유전자에 영향을 줄 수 있다. 이형접합성(LOH)의 소실을 야기하는 결실 및 재조합은 돌연변이된 종양 억제자 대립유전자를 노출시킴으로써 종양 진행에서 주요 역할을 수행하는 것으로 여겨진다.
cfDNA는 폐암(문헌[Pathak et al. Clin Chem 52: 1833-1842 [2006]]), 전립선암(문헌[Schwartzenbach et al. Clin Cancer Res 15:1032-8 [2009]]) 및 유방암(문헌[Schwartzenbach et al]. breast-cancer-research.com/content/11/5/R71에서 온라인 이용 가능[2009])을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 악성종양으로 진단받은 환자의 순환계에서 관찰된 바 있다. 암 환자 내의 순환 cfDNA에서 결정될 수 있는 암과 관련된 게놈 불안정성의 식별은 잠재적인 진단 및 예후 도구이다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 암, 예를 들어, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 및 모세포종을 갖는 것으로 의심되거나 이를 갖는 것으로 알려진 대상체로부터 유래되는 주형의 혼합물을 포함하는 시료 내의 관심 서열의 CNV를 평가한다. 일 실시형태에서, 시료는 말초 혈액로부터 유래되고(처리되고) 정상 및 암 세포로부터 유래된 cfDNA의 혼합물을 포함하는 혈장 시료이다. 또 다른 실시형태에서, CNV가 존재하는지 여부를 결정하는 것이 필요한 생물학적 시료는 혈청, 땀, 눈물, 소변, 가래, 귀 유출액, 림프액, 타액, 뇌척수액, 세척액, 골수 현탁액, 질 유출액, 자궁경부내 세척액, 뇌액, 복수, 모유, 호흡관, 장관 및 비뇨생식관의 분비액, 및 류코포레시스 시료를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 생물학적 유체로부터의, 또는 조직 생검, 면봉표본 또는 도말표본 내의 암성 및 비암성 세포로부터 기원한 주형의 혼합물로부터 유래된다.
인간 고형 종양과 관련된 우성으로 작용하는 유전자는 전형적으로 과발현 또는 변경된 발현에 의해 그들의 효과를 발휘한다. 유전자 증폭은 유전자 발현의 상향조절을 야기하는 일반적인 메커니즘이다. 세포유전학 연구로부터의 증거는 유의미한 증폭이 50% 초과의 인간 유방암에서 발생함을 나타낸다. 가장 현저하게, 17번 염색체(17(17q21-q22)) 상에 위치하는 프로토-종양유전자 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 증폭은 세포 표면 상의 HER2 수용체의 과발현을 초래하여, 유방암 및 다른 악성종양에서 과도한 그리고 이상조절된 신호전달을 야기한다(문헌[Park et al, Clinical Breast Cancer 8:392-401 [2008]]). 다양한 종양유전자가 다른 인간 악성종양에서 증폭되는 것으로 밝혀졌다. 인간 종양에서의 세포 종양유전자의 증폭의 예는 전골수세포 백혈병 세포주 HL60, 및 소세포 폐암종 세포주에서의 c-myc, 원발성 신경모세포종(III기 및 IV기), 신경모세포종 세포주, 망막모세포종 세포주 및 원발성 종양, 및 소세포 폐암종 세포주 및 종양에서의 N-myc, 소세포 폐암종 세포주 및 종양에서의 L-myc, 급성 골수성 백혈병 및 결장 암종 세포주에서의 c-myb, 상피모양 암종 세포, 및 원발성 신경아교종에서의 c-erbb, 폐, 결장, 방광 및 직장의 원발성 암종에서의 c-K-ras-2, 유선 암종 세포주에서의 N-ras의 증폭을 포함한다(문헌[Varmus H., Ann Rev Genetics 18: 553-612 (1984)])[문헌[Watson et. al., Molecular Biology of the Gene (4th ed.; Benjamin/Cummings Publishing Co. 1987)]에 인용됨].
종양 억제자 유전자를 포함하는 염색체 결실은 고형 종양의 발생 및 진행에서 중요한 역할을 수행할 수 있다. 염색체 13q14에 위치한 망막모세포종 종양 억제자 유전자(Rb-1)는 가장 광범하게 특성화된 종양 억제자 유전자이다. Rb-1 유전자 생성물인 105 kDa의 핵인단백질은 세포 주기 조절에서 명백히 중요한 역할을 수행한다(문헌[Howe et al, Proc Natl Acad Sci (USA) 87:5883-5887 [1990]]). Rb 단백질의 변경되거나 소실된 발현은 점 돌연변이 또는 염색체 결실을 통한 두 유전자 대립유전자 모두의 불활성화에 의해 야기된다. Rb-i 유전자 변경은 망막모세포종뿐 아니라 다른 악성종양, 예컨대 골육종, 소세포 폐암(문헌[Rygaard et al, Cancer Res 50: 5312-5317 (1990)]) 및 유방암에도 존재하는 것으로 밝혀졌다. 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 연구는 그러한 종양 유형이 13q에서 이형접합성을 빈번하게 소실하였다고 지적하였는데, 이는 Rb-1 유전자 대립유전자 중 하나가 총 염색체 결실로 인해 소실되었음을 시사한다(문헌[Bowcock et al., Am J Hum Genet, 46: 12 [1990]]). 중복, 결실 및 6번 염색체 및 다른 파트너 염색체를 수반한 불균형 전좌를 포함하는 1번 염색체 이상은 1번 염색체의 영역, 특히 1q21-1q32 및 1p1 1-13이 발병기전에 있어 골수증식성 신생물의 만성 및 진행기 둘 모두와 관련이 있는 종양유전자 또는 종양 억제자 유전자를 제공할 수 있었음을 나타낸다(문헌[Caramazza et al, Eur J Hematol84:191-200 [2010]]). 골수증식성 신생물은 또한 5번 염색체의 결실과 연관된다. 5번 염색체의 완전한 소실 또는 사이질 결실은 골수이형성 증후군(MDS)에서 가장 일반적인 핵형 이상이다. 분리된 del(5q)/5q- MDS 환자는 골수증식성 신생물(MPN) 및 급성 골수성 백혈병을 발생시키는 경향이 있는, 추가의 핵형 결함을 지닌 환자보다 더욱 유리한 예후를 갖는다. 불균형 5번 염색체 결실의 빈도는 Sq가 조혈 줄기/전구 세포(HSC/HPC)의 성장 조절에서 근본적인 역할을 갖는 하나 이상의 종양-억제자 유전자를 지니고 있다는 견해를 도출하였다. 5q31 및 5q32 상에 집중된 일반적으로 결실된 영역(CDR)의 세포유전학 맵핑으로 리보솜 서브유닛 RPS14, 전사 인자 Egr1/Krox20 및 세포골격 리모델링 단백질, 알파-카테닌을 포함하는 후보 종양-억제자 유전자를 식별하였다(문헌[Eisenmann et al, Oncogene 28:3429-3441 [2009]]). 신선한 종양 및 종양 세포주의 세포유전학 및 대립유전자형 연구는, 3p25, 3p21-22, 3p21.3, 3p12-13 및 3p14를 포함하는 3P 염색체 상에서 몇몇의 별개의 영역으로부터의 대립유전자 소실이 폐, 유방, 신장, 두경부, 난소, 자궁경부, 결장, 췌장, 식도, 방광 및 다른 기관의 광범한 스펙트럼의 주요 상피암에 수반되는 가장 빠르고 가장 빈번한 게놈 이상임을 밝혀 내었다. 몇몇의 종양 억제자 유전자를 염색체 3p 영역에 대해 맵핑하였고, 사이질 결실 또는 프로모터 과메틸화가 암종의 발생에서 3p 또는 3번 전체 염색체의 소실에 선행하는 것으로 여겨진다(문헌[Angeloni D., Briefings Functional Genomics 6:19-39 [2007]]).
다운 증후군(DS)을 갖는 신생아 및 아동은 종종 선천성 일과성 백혈병이 존재하고, 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병의 위험이 증가된다. 약 300개의 유전자를 지니는 21번 염색체는 백혈병, 림프종, 및 고형 종양에서의 수많은 구조적 이상, 예를 들어, 전좌, 결실, 및 증폭에 수반될 수 있다. 더욱이, 21번 염색체 상에 위치한 유전자는 종양발생에서 중요한 역할을 수행하는 것이 확인된 바 있다. 신체 수치뿐 아니라 구조적 21번 염색체 이상은 백혈병과 관련되며, 21q에 위치하는 RUNX1, TMPRSS2, 및 TFF를 포함하는 특정 유전자는 종양발생에서 역할을 수행한다(문헌[Fonatsch C Gene Chromosomes Cancer 49:497-508 [2010]]).
관심 서열의 다른 예는 병원체 서열을 포함한다. 병원체는 원핵 병원체, 진핵 병원체 또는 바이러스 병원체일 수 있다. 원핵 병원체의 예는 그람-음성 병원체 및 그람-양성 병원체를 포함한다. 진핵 병원체의 예는 진균, 효모 및 원생동물 병원체를 포함한다. 많은 병원체의 게놈은 알려져 있으며, 병원체의 존재를 식별하는데 사용하기 위한 관심 서열로서의 특정 서열의 선택은 당업자에게 일상적이다.
관심 서열의 예는 또한 유전적 변이체, 예컨대 대립유전자의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 삽입, 결실, 재배열 또는 특정 돌연변이를 포함한다. 이러한 관심 서열의 존재 또는 부재의 식별은 예를 들어, 치료법이 특정 개체에게 유리할지 여부를 예측하고, 치료제의 유효 투여량을 예측하고, 치료법을 모니터링하고/거나 조정하고, 특정 개체에게 치료법을 맞춤화하기 위하여 동반 진단 검사에 사용될 수 있다.
시료는 고분자량 물질, 예컨대 게놈 DNA(gDNA)를 포함할 수 있다. 시료는 저분자량 물질, 예컨대 cfDNA를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 저분자량 물질은 효소적으로 또는 기계적으로 단편화된 DNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 게놈 DNA는 주형으로서 사용되며, 그것은 이용 가능한 길이, 예컨대 수백개 염기쌍의 길이로 단편화된다. 다른 실시형태에서, cfDNA는 주형으로서 사용되며, cfDNA는 짧은 단편으로서 존재하기 때문에, 단편화는 전형적으로 필요하지 않다. 예를 들어, 태아 cfDNA는 300 bp 미만의 단편으로서 혈류에서 순환하며, 모체 cfDNA는 약 500 내지 1,000 bp의 단편으로서 순환하는 것으로 추정된 바 있다(문헌[Li et al., 2004, Clin Chem, 50: 1002-1011]). 무작위 단편화는 효소적, 화학적 또는 기계적 수단에 의한 비-정렬된 방식의 시료로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자의 단편화를 지칭한다. 이러한 단편화 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 표준 방법을 사용한다(문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition]). 일 실시형태에서, 단편화는 문헌[Gunderson et al.](WO2016/130704호)에 개시된 방법을 사용한다. 명확성을 위하여, 이러한 더 작은 단편의 특이적인 PCR 증폭을 통하여 더 큰 조각의 핵산의 더 작은 단편을 생성하는 것은 더 큰 조각의 핵산 서열이 온전하게 유지되기 때문에(즉, PCR 증폭에 의해 단편화되지 않기 때문에), 더 큰 조각의 핵산의 단편화와 동등하지 않다. 더욱이, 무작위 단편화는 파단부를 포함히는 그리고/또는 그 주변의 서열 동일성 또는 뉴클레오타이드의 위치와 관계 없이 단편을 생성하도록 설계된다. 더욱 특히, 무작위 단편화는 기계적 수단, 예컨대 분무화 또는 초음파분해에 의해 이루어져, 약 50개 염기쌍 길이 내지 약 1500개 염기쌍 길이, 더욱 특히 50 내지 700개 염기쌍 길이, 더욱 특히 50 내지 400개 염기쌍 길이의 단편을 생성한다. 가장 특히, 상기 방법을 사용하여 50 내지 150개 염기쌍 길이의 더 작은 단편을 생성한다.
기계적 수단(예를 들어, 분무화, 초음파분해 및/또는 하이드로쉐어(Hydroshear))에 의한 폴리뉴클레오타이드 분자의 단편화는 5' 포스페이트가 결여된 말단을 포함하여, 블런트 및 3'- 및 5'-오버행 말단의 이질적인 혼합을 갖는 단편을 초래한다. 더욱이, cfDNA는 또한, 블런트 및 3'- 및 5'-오버행 말단의 이질적인 혼합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이에 따라 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 주형의 말단을 말단-수선에 의해 수선하는 것이 바람직하다. 말단-수선을 해당 분야에 알려져 있는 방법 또는 키트를 사용하여 달성하여, 예를 들어, 클로닝 벡터의 블런트 부위로의 삽입에 최적인 말단을 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산의 집단의 단편 말단은 블런트 말단이며, 선택적으로, 단편 말단은 또한 인산화된다. 포스페이트 모이어티는 효소적 처리를 통하여, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 테일링에 의하여 단일 오버행 뉴클레오타이드를 갖는 주형을 제조한다. 테일링은 예를 들어, 단일의 데옥시뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시아데노신(A)을 DNA 분자, 예를 들어, PCR 생성물의 3' 말단에 부가하는 비주형-의존적 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖는 특정 유형의 DNA 중합효소, 예컨대 Taq 중합효소 또는 클레나우 엑소 마이너스(Klenow exo minus) 중합효소를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 효소를 사용하여 단일의 뉴클레오타이드 'A'를 이중-가닥 표적 단편의 각각의 가닥의 블런트 말단인 3' 말단에 부가할 수 있다. 따라서, 'A'를 Taq 또는 클레나우 엑소 마이너스 중합효소를 사용한 반응에 의해 이중-가닥 표적 단편의 각각의 말단 수선된 가닥의 3' 말단에 부가할 수 있는 한편, 범용 어댑터는 범용 어댑터의 이중-가닥 핵산의 각각의 영역의 3' 말단에 존재하는 양립 가능한 'T' 오버행이 있는 T-구축물일 수 있다. 이러한 말단 변형은 또한 자가-라이게이션을 방지하여, 조합된 라이게이션된 어댑터-주형-어댑터 분자의 형성을 향한 편재가 존재하게 한다.
본 명세서에 기재된 주형은 각각의 말단에 범용 어댑터를 포함할 수 있으며, 이러한 분자는 본 명세서에 어댑터-주형-어댑터 분자로서 지칭된다. 어댑터-주형-어댑터 분자의 제조 방법은 범용 어댑터를 이중-가닥 주형 분자의 각각의 말단에 부착하는 단계를 포함한다. 이중-가닥 주형 분자는 대조군 시료(도 1, 블록 10), 검사 시료(도 1, 블록 14), 또는 reDNA 단편의 집단, 예를 들어, 라이브러리(도 1, 블록 13)로부터의 것일 수 있다. 부착은 라이게이션을 사용하여 표준 라이브러리 제조 기법을 통해 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, 먼저 동일한 범용 어댑터 분자를 라이게이션시킴으로써 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성한다. 범용 어댑터 분자는 이중-가닥 핵산의 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 범용 어댑터는 또한, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 포함한다. 이중-가닥 및 단일 가닥 영역을 갖는 범용 어댑터는 또한 "불일치된 어댑터"로도 지칭되며, 이의 일반적인 특징은 하기에 정의되어 있으며, 문헌[Gormley et al.](미국 특허 제7,741,463호) 및 문헌[Bignell et al.](미국 특허 제8,053,192호)에 추가로 기술된다.
범용 어댑터의 이중-가닥 영역은 전형적으로 5개 이상의 연속 염기쌍을 포함하는 짧은 이중-가닥 영역이다. 이 용어는 2개의 가닥이 어닐링된 핵산의 이중-가닥 영역을 지칭하며, 임의의 특정 구조적 입체형태를 암시하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중-가닥"은 핵산 분자에 대한 언급에 사용되는 경우, 핵산 분자 내의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 상보성 뉴클레오타이드에 수소 결합되는 것을 의미한다. 하나 이상의 뉴클레오타이드 불일치가 이중-가닥 영역 내에서 용인될 수 있되, 단, 2개의 가닥이 표준 라이게이션 조건 하에서 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있음이 이해될 것이다. 부분 이중-가닥 핵산은 그의 뉴클레오타이드 중 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 상보성 뉴클레오타이드에 수소 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, 범용 어댑터의 2개의 가닥은 이중-가닥 영역에서 100% 상보성이다.
일반적으로, 이중-가닥 영역은 기능의 소실 없이 가능한 한 짧은 것이 유리하다. 이러한 맥락에서, "기능"은 이중-가닥 영역이 숙련자에게 알려져 있는 효소-촉매작용된 핵산 라이게이션 반응을 위한 표준 반응 조건(예를 들어, 효소에 적절한 라이게이션 완충제 중에서 4℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서의 인큐베이션) 하에서 안정한 듀플렉스를 형성하여, 범용 어댑터를 형성하는 2개의 가닥이 주형 분자로의 범용 어댑터의 라이게이션 동안 부분적으로 어닐링되어 유지되게 하는 능력을 지칭한다. 이중-가닥 영역은 프라이머 신장 또는 PCR 반응의 어닐링 단계에 통상적으로 사용되는 조건 하에서 안정할 필요는 없다.
동일한 범용 어댑터가 각각의 표적 분자의 양 말단에 라이게이션되기 때문에, 각각의 어댑터-주형-어댑터 분자에서 주형 서열은 범용 어댑터의 이중-가닥 영역으로부터 유래된 상보성 서열에 의해 플랭킹될 것이다. 이중-가닥 영역 및 이에 따라, 어댑터-주형-어댑터 구축물 내의 그로부터 유래된 상보성 서열이 더 길수록, 어댑터-주형-어댑터 구축물이 프라이머 신장 및/또는 PCR에 사용되는 어닐링 조건 하에서 이들 내부 자가-상보성의 영역에서 다시 폴딩되고, 스스로 염기-쌍형성될 수 있는 가능성이 더 크다. 따라서, 이러한 영향을 감소시키기 위하여 이중-가닥 영역이 20개 이하, 15개 이하 또는 10개 이하의 염기쌍 길이인 것이 일반적으로 바람직하다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 영역의 안정성은 증가될 수 있으며, 이에 따라, 표준 왓슨-크릭 염기쌍보다 더 강력한 염기-쌍형성을 나타내는 비-천연 뉴클레오타이드의 포함에 의해 그의 길이는 잠재적으로 감소된다.
본 명세서에 사용하기 위한 범용 어댑터는 일반적으로 어댑터의 "라이게이션 가능한" 말단, 즉, 라이게이션 반응에서 이중-가닥 표적 단편에 연결되는 말단을 형성하는 이중-가닥 영역을 포함할 것이다. 범용 어댑터의 라이게이션 가능한 말단은 블런트일 수 있거나, 다른 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 짧은 5' 또는 3' 오버행이 존재하여, 라이게이션을 용이하게 하거나/촉진시킬 수 있다. 범용 어댑터의 라이게이션 가능한 말단에서의 5' 말단 뉴클레오타이드는 전형적으로 인산화되어, 표적 폴리뉴클레오타이드 상의 3' 하이드록실 기로의 포스포다이에스터 결합을 가능하게 한다.
범용 어댑터의 이중-가닥 영역은 전형적으로 범용 제거 서열 및 범용 프라이머 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 범용 제거 서열은 범용 프라이머 결합 부위로서 사용될 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 다른 범용 서열, 예컨대 범용 신장 프라이머 결합 부위가 존재할 수 있다.
제거 서열로도 지칭되는 범용 제거 서열은 범용 어댑터가 결합되는 주형으로부터 범용 어댑터를 제거하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이며, 예를 들어, 제거 서열의 이용은 어댑터-주형-어댑터 분자를 3가지 개별 분자: 주형 및 2개의 범용 어댑터로 전환시키는데 도움을 줄 수 있다. 범용 어댑터를 제거하기 위한 다른 방법은 비-천연 뉴클레오타이드 및 비-천연 백본 연결의 이용을 포함한다. 범용 어댑터는 선택적으로 포스포다이에스터 및 비-포스포다이에스터 백본 연결의 혼합에 의해 연결되는 천연 및 비-천연 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함할 수 있다. 어댑터-주형-어댑터 분자로부터 범용 어댑터의 절단을 용이하게 하기 위하여 다른 비-뉴클레오타이드 변형이 포함될 수 있다. 이러한 비-천연 뉴클레오타이드 및 연결은 본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, 어댑터-주형-어댑터 분자의 증폭 동안 범용 어댑터 내로 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 제거 서열은 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열은 제한 엔도뉴클레아제가 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다. 임의의 제한 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있으며, 임의의 유용한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열은 숙련자에게 알려져 있다. 일 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 II형, III형 또는 IV형 효소이다. 일 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 제한 부위에서 이중-가닥 DNA를 절단하는 것이다. 또 다른 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 인식 부위로부터 특정 거리에서 이중-가닥 DNA를 절단하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 남아 있는 단편으로부터 인식 부위를 절단하는 것이다. 인식 부위 근처에서 이중-가닥 DNA를 절단하는 유용한 제한 엔도뉴클레아제의 예는 MlyI, SapI 및 BpuEI을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
숙련자는 인식 부위로부터 특정 거리에서 절단하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 것이 제거 후에 최종 생성물, 즉, 주형 및 범용 어댑터의 조성에 대한 제어를 허용하는 것을 이해할 것이다. 제거 서열이 인식 부위로부터 특정 거리에서 절단하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위인 일 실시형태에서, 인식 부위를 이중-가닥 영역 내에 배치하여, 모든 범용 어댑터 서열의 제거(예를 들어, 범용 어댑터의 제거 후의 결과가 어댑터-주형-어댑터 분자를 생성하기 위해 사용되는 주형과 동일한 주형 분자)를 초래할 수 있다. 제거 서열이 인식 부위로부터 특정 거리에서 절단하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위인 또 다른 실시형태에서, 인식 부위를 이중-가닥 영역에 배치하여, 일부 범용 어댑터 서열의 제거(예를 들어, 범용 어댑터의 제거 후의 결과가 주형, 및 어댑터-주형-어댑터 분자를 생성하기 위해 사용되는 범용 어댑터의 일부인 주형 분자)를 초래할 수 있다. 제거 서열이 인식 부위로부터 특정 거리에서 절단하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위인 또 다른 실시형태에서, 인식 부위를 이중-가닥 영역에 배치하여, 모든 범용 어댑터 서열 및 각 말단에 위치하고 범용 어댑터에 인접한 주형 서열의 일부의 제거(예를 들어, 범용 어댑터의 제거 후의 결과가 어댑터-주형-어댑터 분자를 생성하기 위해 사용하되는 비-천연 발생 및 더 짧은 버전의 주형인 주형 분자)를 초래할 수 있다.
일 실시형태에서, 범용 어댑터는 또한, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 포함한다. "불일치된 영역"으로도 지칭되는 이러한 영역은 범용 어댑터를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 서열이 2개의 가닥이 프라이머 신장 또는 PCR 반응을 위한 표준 어닐링 조건 하에서 서로 완전히 어닐링할 수 없게 하는 정도의 비-상보성을 나타내는 영역을 지칭한다. 불일치된 영역은 효소-촉매작용된 라이게이션 반응을 위한 표준 반응 조건 하에서 어느 정도의 어닐링을 나타낼 수 있되, 단 2개의 가닥은 증폭 반응의 어닐링 조건 하에서 단일 가닥 형태로 전환된다. 일 실시형태에서, reDNA 및 검사 시료로부터의 단편화된 핵산으로의 어댑터의 부가(도 1, 블록 15)는 이중-가닥 영역 및 단일-가닥 영역 둘 모두를 갖는 범용 어댑터의 부가를 초래한다. 부가는 하나의 단계(예를 들어, 이중-가닥 영역 및 단일-가닥 영역 둘 모두를 갖는 범용 어댑터의 라이게이션) 또는 하나 초과의 단계(예를 들어, 이중-가닥 영역을 갖는 범용 어댑터의 라이게이션에 이어서 단일-가닥 영역을 부가하기 위한 증폭)에서 이루어질 수 있다.
불일치된 영역 내의 불일치는 가닥 중 하나 상에 단일 가닥 영역이 존재하도록 하나의 가닥이 다른 것보다 더 긴 형태를 취하거나, 2개의 가닥이 혼성화하지 않고 이에 따라 양 가닥 상에 단일 가닥 영역을 형성하도록 선택되는 서열의 형태를 취할 수 있다. 불일치는 또한, 범용 어댑터 구축물의 양 말단이 서로 혼성화하고, 듀플렉스를 형성할 수 있지만, 중심 영역은 그렇지 않은 "버블(bubble)"의 형태를 취할 수 있다. 불일치된 영역을 형성하는 가닥(들)의 부분은 동일한 2개의 가닥의 다른 부분이 어닐링되어 하나 이상의 이중-가닥 영역을 형성하는 조건 하에서 어닐링되지 않는다. 의심을 피하기 위하여, 이후에 라이게이션을 겪는 폴리뉴클레오타이드 듀플렉스의 3' 말단에 단일-가닥 또는 단일 염기 오버행이 본 개시내용의 맥락에서 "불일치된 영역"을 구성하지 않음이 이해되어야 한다.
단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역은 전형적으로 적어도 하나의 범용 신장 프라이머 결합 부위를 포함한다. 범용 프라이머 신장 결합 부위에 상보성인 범용 포획 핵산의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산, 예를 들어, 다수의 상이한 어댑터-주형-어댑터 분자를 포획하기 위하여 범용 프라이머 신장 결합 부위를 사용할 수 있다.
선택적으로, 하나 이상의 다른 범용 서열이 존재할 수 있다. 일 실시형태에서, 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역은 또한 적어도 하나의 시료-특이적 인덱스를 포함한다. 시료-특이적 인덱스는 어레이 상의 특정 주형의 공급원의 특징적인 마커로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 시료-특이적 인덱스는 라이브러리 제조 단계의 부분으로서 주형에 부가되는 범용 어댑터의 부분인 뉴클레오타이드의 합성 서열이다. 따라서, 시료-특이적 인덱스는 특정 시료의 주형 분자의 각각에 부착되는 핵산 서열이며, 이의 존재는, 주형 분자를 분리한 시료를 나타내거나, 이를 식별하기 위해 사용된다.
바람직하게는, 시료-특이적 인덱스는 최대 20개 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 4 내지 6개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 4개 뉴클레오타이드 인덱스는 동일한 어레이 상의 256개의 시료의 다중화의 가능성을 제공하며, 6개 염기 태그는 4096개의 시료가 동일한 어레이 상에서 처리되게 한다.
불일치된 영역의 길이에 대한 하한은 전형적으로 기능, 예를 들어, i) 프라이머 신장, PCR 및/또는 서열결정을 위한 프라이머의 결합(예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위로의 프라이머의 결합) 또는 ii) 표면으로의 어댑터-주형-어댑터의 고정화를 위한 범용 포획 핵산의 결합(예를 들어, 범용 프라이머 신장 결합 부위로의 범용 포획 핵산의 결합)에 적합한 서열을 제공할 필요에 의해 결정될 것이다. 이론적으로, 일반적으로 범용 어댑터의 전체 길이를 최소화하여, 예를 들어, 라이게이션 단계 후에 어댑터-주형-어댑터 구축물로부터 미결합된 범용 어댑터의 분리를 용이하게 하는 것이 유리한 것을 제외하고, 불일치된 영역의 길이에 상한이 존재하지 않는다. 따라서, 일반적으로 불일치된 영역이 50개 미만 또는 40개 미만 또는 30개 미만 또는 25개 미만의 연속 뉴클레오타이드 길이여야 하는 것이 바람직하다.
범용 어댑터의 정확한 뉴클레오타이드 서열이 일반적으로 본 개시내용에 비제한적이지만, 불일치된 영역 내의 개별 가닥의 서열은 개별 가닥 중 어느 것도 표준 어닐링 조건 하에서 자가-어닐링, 헤어핀 구조의 형성 등을 야기할 수 있는 임의의 내부 자가-상보성을 나타내지 않게 해야 한다. 불일치된 영역 내의 가닥의 자가-어닐링은 그것이 이러한 가닥으로의 프라이머의 특이적인 결합을 방지하거나 감소시킬 수 있기 때문에 회피되어야 한다.
일 실시형태에서, 범용 어댑터는 어댑터-주형-어댑터 분자로부터 어댑터의 후속 제거에 필요한 모든 서열을 포함한다(도 1, 블록 13). 일 실시형태에서, 범용 어댑터는 후속 증폭 및/또는 서열결정을 위한 어레이 상의 어댑터-주형 어댑터 분자의 고정화에 필요한 모든 서열을 포함한다(도 1, 블록 16). 또 다른 실시형태에서, 증폭 단계를 사용하여 고정화 및 서열결정 이전에 각각의 어댑터-주형-어댑터 분자에 존재하는 범용 어댑터를 추가로 변형시킨다(도 1, 블록 16). 예를 들어, 주형의 일부의 뉴클레오타이드 서열을 결정해야 하는 그들 실시형태에서, 초기 프라이머 신장 반응은 범용 프라이머 결합 부위를 사용하여 수행될 수 있으며, 각각의 개별 어댑터-주형-어댑터 분자의 양 가닥에 상보성인 신장 생성물이 형성되고, 범용 신장 프라이머 부위를 부가한다. 생성된 프라이머 신장 생성물 및 선택적으로 그의 증폭된 카피는 집합적으로 고정화된 다음 서열결정될 수 있는 주형 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 제공한다.
라이게이션 방법을 사용하여, 범용 어댑터를 주형에 연결시킬 수 있다. 본 명세서에 유용한 라이게이션 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 표준 방법을 사용한다. 이러한 방법은 리가제 효소, 예컨대 DNA 리가제를 사용하여, 이러한 경우에 범용 어댑터 및 이중-가닥 주형의 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 말단의 연결을 시행하거나 촉매작용시켜, 공유적 연결이 형성되게 한다. 범용 어댑터는 주형 상에 존재하는 3'-OH로의 라이게이션을 용이하게 하기 위하여 5'-포스페이트 모이어티를 함유할 수 있다. 이중-가닥 주형은 잔류의 또는 효소 처리 단계를 사용하여 부가되는 5'-포스페이트 모이어티를 함유하며, 수선되고, 선택적으로 오버행 염기 또는 염기들에 의해 신장되어, 라이게이션에 적합한 3'-OH를 제공한다. 이러한 맥락에서, 연결은 이전에 공유 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드 가닥의 공유적 연결을 의미한다. 본 개시내용의 특정 양태에서, 이러한 연결은 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 간의 포스포다이에스터 결합의 형성에 의해 일어나지만, 다른 공유적 연결(예를 들어, 비-포스포다이에스터 백본 연결)의 수단이 사용될 수 있다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, 일 실시형태에서, 라이게이션에 사용되는 범용 어댑터는 완전하다. 예를 들어, 범용 어댑터를 부가하여 reDNA 라이브러리를 생성하는 경우에(도 1, 블록 11), 범용 어댑터는 이중-가닥 영역 및 범용 서열, 예컨대 범용 프라이머 결합 부위, 범용 제거 서열 또는 그의 조합을 포함할 수 있다(도 3). 범용 어댑터가 reDNA 단편 또는 검사 시료로부터의 단편화된 핵산의 집단에 부가되는 경우에(도 1, 블록 15), 범용 어댑터는 예를 들어, 범용 제거 서열, 범용 프라이머 결합 부위, 범용 신장 프라이머 결합 부위, 시료-특이적 인덱스 또는 그의 조합을 함유하는 이중-가닥 및 단일-가닥 영역을 포함할 수 있다(도 4). 숙련자는 각각의 단편의 집단에 대한 상이한 인덱스의 이용이 서열결정 후에 나중의 주형 분자의 공급원의 식별을 가능하게 할 것과 같이, reDNA 및 검사 시료 DNA로의 부가를 위한 상이한 범용 어댑터의 이용의 이점을 용이하게 이해할 것이다. 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 사용하여 서열결정을 위하여 고정화된 시료를 제조할 수 있다(도 1, 블록 16).
또한, 본 명세서에 논의된 바와 같이, 일 실시형태에서, 라이게이션에 사용되는 범용 어댑터는 범용 서열, 예컨대 범용 프라이머 결합 부위를 가질 수 있는 이중-가닥 영역을 포함한다(도 5). 생성된 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자(도 1, 블록 15)를 추가의 범용 서열, 예컨대 범용 신장 프라이머 결합 부위 및 시료-특이적 인덱스를 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다(도 6). 이중-가닥 표적 단편에 라이게이션되는 범용 프라이머로의 특정 서열, 예컨대 범용 신장 프라이머 결합 부위의 부가 방법은 PCR 기반의 방법을 포함하며, 해당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Bignell et al.](미국 특허 제8,053,192호) 및 문헌[Gunderson et al.](WO2016/130704호)에 기재되어 있다.
범용 어댑터를 추가의 범용 서열을 포함하도록 변형시키는 그들 실시형태에서, 증폭 반응이 준비된다. 증폭 반응의 내용은 당업자에게 공지되어 있으며, 증폭 반응에 필요한 적절한 기질(예컨대 dNTP), 효소(예를 들어, DNA 중합효소) 및 완충제 성분을 포함한다. 일반적으로 증폭 반응은 증폭 반응의 각 사이클의 프라이머 어닐링 단계에서 마주치는 조건 하에서 증폭될 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부에 특이적으로 어닐링될 수 있는 종종 "정방향" 및 "역방향" 프라이머(프라이머 올리고뉴클레오타이드)로 표기되는 적어도 2개의 증폭 프라이머를 필요로 한다. 특정 실시형태에서, 정방향 및 역방향 프라이머는 동일할 수 있다. 따라서, 범용 프라이머는 어닐링 단계 동안 증폭될 폴리뉴클레오타이드 분자(또는 주형을 단일 가닥으로 생각한다면 그의 상보물) 내의 범용 서열, 예컨대 범용 프라이머 결합 부위에 어닐링될 수 있는 뉴클레오타이드의 서열인 '범용 프라이머 결합 부위-특이적 부분'을 포함한다.
본 개시내용의 실시형태에 따라, 범용 프라이머는 모든 시료에 대하여 범용일 수 있거나, 정방향 또는 역방향 프라이머 중 하나는 시료 공급원을 코딩하는 인덱스 서열을 보유할 수 있다. 범용 프라이머는 라이게이션된 어댑터의 인덱스 영역에 걸쳐 혼성화할 수 있으며, 이 경우에 각 시료 핵산에 독특한 프라이머를 사용하는 것이 유리하다. 증폭 반응은 2개 초과의 범용 프라이머로 수행될 수 있다. 라이게이션된 어댑터-어댑터 이량체의 증폭을 방지하기 위하여, 범용 프라이머는 라이게이션된 어댑터의 전체를 가로질러 라이게이션된 주형(또는 그의 3' 말단에 부착되는 dNTP) 내로 혼성화되는 뉴클레오타이드를 함유하도록 변형될 수 있다. 이러한 제1 범용 프라이머를 변형시키고 처리하여, 가닥의 엑소뉴클레아제 분해의 방지를 도울 수 있으며, 이에 따라, 인덱싱된 프라이머의 각각을 개별적으로 변형시키고 처리하는 것보다 모든 시료를 증폭시킬 수 있는 제1 범용 프라이머를 갖는 것이 유리할 수 있다. 인덱싱된 프라이머는 증폭 반응에서 시료 특이적 제3 프라이머로서 도입될 수 있지만, 엑소뉴클레아제 분해를 감소시키기 위하여 특별히 변형되고 처리될 필요가 없다. 이러한 실시형태의 경우에, 인덱스를 보유하는 제3 범용 프라이머는 제1 범용 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 함유하여, 그것을 사용하여, 제1 범용 프라이머의 신장으로부터 초래되는 듀플렉스를 증폭시킬 수 있게 할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 '증폭될 폴리뉴클레오타이드 분자'는 증폭 반응에 첨가되는 원래의 또는 출발 어댑터-주형-어댑터 서열을 지칭한다. 정방향 및 역방향 범용 프라이머에서 '범용 프라이머 결합 부위-특이적 부분'은 증폭 반응의 시작 시에 존재하는 원래의 또는 초기 어댑터-주형-어댑터에 어닐링될 수 있는 서열을 지칭하며, '범용 프라이머 결합 부위-특이적 부분'의 길이에 대한 언급은 출발 어댑터-주형-어댑터 분자에 어닐링되는 프라이머 내의 서열의 길이에 관한 것이다. 프라이머가 제1 증폭 사이클에서 출발 어댑터-주형-어댑터 분자에 어닐링되지 않는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다면, 이러한 서열은 증폭 생성물로 카피될 수 있음이 이해될 것이다. 이에 따라, 제1 및 이후의 사이클의 증폭에서 생성되는 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자는 출발 어댑터-주형-어댑터 분자보다 더 길 수 있다.
불일치된 어댑터가 상이한 길이일 수 있기 때문에, 각각의 가닥의 3' 및 5' 말단에 부가되는 어댑터 서열의 길이는 상이할 수 있다. 범용 프라이머는 또한 서로 상이한 길이의 것일 수 있으며, 상이한 길이의 어댑터에 혼성화할 수 있으며, 이에 따라 각각의 가닥의 말단에 부가되는 길이가 제어될 수 있다. 네스티드(nested) PCR의 경우에, 3개 이상의 범용 프라이머는 이전의 앰플리콘을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머보다 더 길도록 설계될 수 있으며, 그래서 부가되는 뉴클레오타이드의 길이가 완전히 제어 가능하며, 요망된다면 수백개의 염기쌍일 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 범용 프라이머는 13개의 염기를 라이게이션된 어댑터에 부가하며, 제3 범용 프라이머는 추가의 27개의 염기를 부가하여, 앰플리콘의 하나의 말단이 어댑터-표적 구축물의 단완보다 40개 염기가 더 길게 한다. 어댑터의 단완은 20개 염기 길이이며, 이는 제조된 주형이 주형에 더하여 말단에서 60개의 부가되는 염기를 포함하는 것을 의미한다. 제2 범용 프라이머는 어댑터의 장완보다 25개 염기가 더 길며, 이는 32개 염기 길이에 더하여 시료에 부가되는 dATP 뉴클레오사이드에 걸쳐 혼성화하는 추가의 T이다. 따라서, 제조되는 주형은 게놈 단편에 더하여 부가되는 dATP에 더하여, 57개의 알려져 있는 염기를 포함한다. 따라서, 각각의 주형 듀플렉스의 완전한 하나의 가닥은 5' 말단으로부터 60개의 알려져 있는 염기, T, 게놈 단편, A, 57개의 알려져 있는 염기-3' 말단을 포함한다. 이러한 가닥은 서열: 5'-57개의 알려져 있는 염기, T, 게놈 단편, A, 60개의 알려져 있는 염기-3' 말단에 대하여 완전히 상보성이다. 길이 57 및 60은 임의적이며, 설명의 목적을 위하여 나타나 있으며, 제한하는 것으로 생각해서는 안된다. 부가되는 서열의 길이는 요망되는 실험 설계에 따라 20 내지 100개 이상의 염기일 수 있다.
정방향 및 역방향 프라이머는 어댑터 서열의 전체 및 표적 서열의 적어도 하나의 염기(또는 표적 가닥 상의 3'-오버행으로서 부가되는 뉴클레오타이드 dNTP)에 혼성화하기에 충분한 길이의 것일 수 있다. 정방향 및 역방향 프라이머는 또한 어댑터 구축물을 넘어서 신장되는 영역을 함유할 수 있으며, 이에 따라, 범용 프라이머는 적어도 20 내지 100개 염기 길이일 수 있다. 정방향 및 역방향 프라이머는 유의미하게 상이한 길이의 것일 수 있으며; 예를 들어, 하나는 20 내지 40개 염기일 수 있는 한편, 다른 것은 40 내지 100개 염기 길이일 수 있다. 정방향 및 역방향 프라이머의 범용 어댑터 특이적인 부분의 뉴클레오타이드 서열은 존재하는 임의의 다른 표적 서열로의 비-특이적인 혼성화를 최소화시키면서, 증폭 반응의 어닐링 단계의 조건 하에서 증폭될 어댑터-주형-어댑터 분자로의 특이적인 혼성화를 달성하도록 선택된다.
숙련자는 만족스러운 수준의 특이적인 어닐링이 완벽하게 상보성이지 않은 서열로 달성될 수 있기 때문에, 범용 어댑터 특이적 부분이 100% 상보성인 것이 엄격하게 필요하지 않음을 이해할 것이다. 특히, 범용 어댑터 특이적 부분 내의 1개의 또는 2개의 불일치는 통상 특이성에 유해하게 영향을 미치지 않고 용인될 수 있다. 따라서, 용어 '범용 프라이머 결합 부위-특이적 부분'은 어댑터-주형-어댑터 분자의 범용 어댑터와 100% 상보성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그러나, 프라이머가 그들의 각각의 프라이머-결합 서열 이외의 어댑터-주형-어댑터의 영역에 비-특이적으로 어닐링되지 않는 요건은 충족되어야 한다.
범용 프라이머는 일반적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 구조이다. 그들은 또한, 천연 및 비-천연 염기의 혼합물, 및 또한 천연 및 비-천연 백본 연결을 함유할 수 있되, 단, 임의의 비-천연 변형은 프라이머로서의 기능--증폭 반응의 조건 동안 폴리뉴클레오타이드 가닥에 어닐링하고 새로운 상보성 폴리뉴클레오타이드의 합성을 위한 개시 점으로서 작용하는 능력을 방해하지 않는다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 방법은 어댑터-주형-어댑터 분자로부터의 범용 어댑터의 제거를 포함할 수 있다(도 1, 블록 13). 일 실시형태에서, 범용 어댑터는 범용 제거 서열을 사용함으로써 제거될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 화학적 절단 방법, 예컨대 비제한적으로 무염기 부위의 절단, 리보뉴클레오타이드의 절단, 광화학적 절단, 반-메틸화된 DNA의 절단, 링커(예를 들어, 펩티드 링커, pH 감수성 링커, 감열성 링커)의 절단, 메틸화 또는 물리적 힘을 사용하여, 어댑터-주형-어댑터 분자로부터 범용 어댑터를 제거할 수 있다. 이들 다른 방법은 전형적으로 비-천연 뉴클레오타이드, 비-천연 백본 연결 또는 그의 조합의 이용을 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 범용 프라이머는 천연 및 비-천연 뉴클레오타이드의 혼합, 포스포다이에스터 및 비-포스포다이에스터 백본 연결의 혼합, 다른 비-뉴클레오타이드 변형 또는 그의 조합을 포함하여, 어댑터-주형-어댑터 분자로부터 범용 어댑터의 절단을 용이하게 할 수 있다. 이러한 대안적인 뉴클레오타이드, 연결 및/또는 변형을 함유하는 범용 프라이머의 이용은 대안적인 뉴클레오타이드, 연결 및/또는 변형을 함유하는 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래한다.
용어 "화학적 절단"은 비-핵산 및/또는 비-효소적 화학 시약을 사용하여, 이중-가닥 어댑터-주형-어댑터 분자의 하나의 또는 양 가닥의 절단을 촉진/달성하는 임의의 방법을 포함한다. 필요하다면, 어댑터-주형-어댑터 분자의 하나의 또는 양 가닥은 하나 이상의 비-뉴클레오타이드 화학 모이어티 및/또는 비-천연 뉴클레오타이드 및/또는 비-천연 백본 연결을 포함하여, 소정의 절단 부위에서 화학적 절단 반응을 가능하게 할 수 있다. 전형적으로, 화학적 절단에 적합한 부위는 상기 부위를 포함하는 범용 프라이머를 사용하여 어댑터-주형-어댑터 분자 내로 도입된다.
일 실시형태에서, 어댑터-주형-어댑터 분자의 하나의 가닥은 과요오드산염(예를 들어, 과요오드산나트륨)으로의 처리에 의한 절단을 가능하게 하는 다이올 연결(예를 들어, US2012/0270739호 참조)을 포함할 수 있다. 다이올 연결은 소정의 절단 부위에 위치할 수 있으며, 이의 정확한 위치는 사용자에 의해 선택될 수 있다. 1개 초과의 다이올이 절단 부위에 포함될 수 있는 것이 이해될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 쇄 내로의 혼입에 적합한 포스포르아미디트 화학에 기초한 다이올 링커 유닛은 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 피델리티 시스템즈 인코포레이티드(Fidelity systems Inc.)로부터) 상업적으로 입수 가능하다. 하나 이상의 다이올 유닛은 자동화된 화학적 DNA 합성을 위한 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 사용하기 위하여 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입될 수 있다.
다이올 링커는 다이올의 절단을 촉진시키는 임의의 물질일 수 있는 "절단제"로의 처리에 의해 절단된다. 바람직한 절단제는 과요오드산염, 바람직하게는 수성 과요오드산나트륨(NaIO4)이다. 다이올을 절단하기 위한 절단제(예를 들어, 과요오드산염)으로의 처리 후에, 절단된 생성물을 "캡핑제"로 처리하여, 절단 반응에서 생성되는 반응성 종을 중화시킬 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 캡핑제는 아민, 예컨대 에탄올아민을 포함한다. 유리하게는, 캡핑제(예를 들어, 에탄올아민)를 절단제(예를 들어, 과요오드산염)와 함께 혼합물에 포함시켜, 반응성 종이 형성되자 마자 그들이 캡핑되게 할 수 있다.
"무염기 부위"는 염기 성분이 제거된 폴리뉴클레오타이드 쇄 내의 뉴클레오사이드 위치로서 정의된다. 무염기 부위는 뉴클레오사이드 잔기의 가수분해에 의하여 생리학적 조건 하에서 DNA에서 천연적으로 발생할 수 있지만, 인공의 조건 하에서 또는 효소의 작용에 의해 화학적으로 형성될 수도 있다. 무염기 부위는 일단 형성되면, (예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 다른 단일-가닥 절단 효소로의 처리, 열 또는 알칼리로의 노출에 의해) 절단될 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오타이드 가닥의 부위-특이적 절단을 위한 수단을 제공한다.
바람직하지만, 비-제한적인 실시형태에서, 무염기 부위는 어댑터-주형-어댑터 분자의 범용 어댑터의 소정의 위치에서 생성될 수 있다. 소정의 절단 부위에 데옥시우리딘(U)을 포함하는 범용 프라이머가 사용된다. 이어서, 효소 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)를 사용하여, 증폭된 reDNA 라이브러리의 구성원으로부터 우라실 염기를 제거하여, 하나의 가닥 상에 무염기 부위를 생성할 수 있다. 이어서, 무염기 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥은 엔도뉴클레아제(예를 들어, EndoIV 엔도뉴클레아제, AP 리아제, FPG 글리코실라제/AP 리아제, EndoVIII 글리코실라제/AP 리아제), 열 또는 알칼리로의 처리에 의해 무염기 부위에서 절단될 수 있다.
또한, 무염기 부위는 데옥시우리딘 이외의 비-천연/변형된 데옥시리보뉴클레오타이드에서 생성되고, 엔도뉴클레아제, 열 또는 알칼리로의 처리에 의해 유사한 방식으로 절단될 수 있다. 예를 들어, 범용 프라이머는 8-옥소-구아닌 또는 데옥시이노신을 포함할 수 있다. 8-옥소-구아닌은 FPG 글리코실라제로의 노출에 의해 무염기 부위로 전환될 수 있다. 데옥시이노신은 AlkA 글리코실라제로의 노출에 의해 무염기 부위로 전환될 수 있다. 이어서, 이에 따라 생성된 무염기 부위는 전형적으로 적합한 엔도뉴클레아제(예를 들어, EndoIV, AP 리아제)로의 처리에 의해 절단될 수 있다.
일 실시형태에서, 절단될 이중-가닥 핵산 분자는 적절한 글리코실라제(무염기 부위를 생성하기 위함) 및 하나 이상의 적합한 엔도뉴클레아제(후속적으로 절단하기 위함)를 함유하는 혼합물에 노출될 수 있다. 이러한 혼합물에서, 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제는 전형적으로 적어도 약 2:1의 활성 비로 존재할 것이다. 특정 실시형태에서, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New Englad Biolabs)로부터 이용 가능한 USER 시약(NEB #M5505S)은 우라실 염기에서의 단일의 뉴클레오타이드 갭의 생성을 위해 사용된다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하는 범용 프라이머가 사용될 수 있다. (추가의 비-뉴클레오타이드 화학 모이어티, 비-천연 염기 또는 비-천연 백본 연결과 함께 또는 이것 없이) 다르게 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥 내로의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드의 혼입은 데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 간의 포스포다이에스터 결합을 선택적으로 절단할 수 있는 화학적 작용제를 사용하는 또는 리보뉴클레아제(RNAse)를 사용하는 절단을 위한 소정의 부위를 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, 절단될 가닥은 화학적 절단을 위한 소정의 부위를 제공하기 위하여 단일의 리보뉴클레오타이드를 함유한다.
데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 간의 포스포다이에스터 결합을 선택적으로 절단할 수 있는 적합한 화학적 절단제는 금속 이온, 예를 들어, 희토류 금속 이온(특히 La+, 특히 Tm+, Yb+ 또는 Lu+(문헌[Chen et al. Biotechniques. 2002, 32: 518-520]; 문헌[Komiyama et al. Chem. Commun. 1999, 1443-1451])), Fe(3) 또는 Cu(3), 또는 상승된 pH로의 노출, 예를 들어, 염기, 예컨대 수산화나트륨으로의 처리를 포함한다. "데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 간의 포스포다이에스터 결합의 선택적 절단"은 화학적 절단제가 동일한 조건 하에서 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 없는 것을 의미한다.
리보뉴클레오타이드(들)의 염기 조성은 일반적으로 중요하지 않지만, 화학적(또는 효소적) 절단을 최적화시키기 위해 선택될 수 있다. 절단이 금속 이온, 특히 희토류 금속 이온으로의 노출에 의해 수행되어야 한다면, 예를 들어, rUMP 또는 rCMP가 일반적으로 바람직하다.
리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드 사이 또는 2개의 리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합은 또한 RNase에 의해 절단될 수 있다. 적절한 기질 특이성의 임의의 엔도시토시스 리보뉴클레아제가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 리보뉴클레아제로의 절단을 위하여, 2개 이상의 연속 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 2 내지 10개 또는 5 내지 10개의 연속 리보뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 RNase가 특정 잔기 후의 절단에 대한 특이성을 갖는 것을 제외하고, 리보뉴클레오타이드의 정확한 서열은 일반적으로 중요하지 않다. 적합한 RNase는 예를 들어, C 및 U 잔기 후에 절단하는 RNaseA를 포함한다. 이에 따라, RNaseA로 절단하는 경우에, 절단 부위는 C 또는 U인 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드를 포함해야 한다.
하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 혼입시킨 범용 프라이머는 적절한 리보뉴클레오타이드 전구체를 사용한 올리고뉴클레오타이드 화학적 합성을 위한 표준 기법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다.
용어 "광화학적 절단"은 광 에너지를 사용하여 이중-가닥 핵산 분자의 하나의 또는 양 가닥의 절단을 달성하는 임의의 방법을 포함한다.
광화학적 절단을 위한 소정의 부위는 이중-가닥 분자의 가닥 중 하나에서 비-뉴클레오타이드 화학적 스페이서 유닛에 의해 제공될 수 있다. 적합한 광화학적 절단 가능한 스페이서는 하기의 구조를 갖는 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치(Glen Research)(카탈로그 번호 10-4913-XX)에 의해 공급되는 PC 스페이서 포스포아미디트(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)부티르아미도메틸)-1-(2-니트로페닐)-에틸]-2-- 시아노에틸-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트)를 포함한다:
스페이서 유닛은 UV 광원으로의 노출에 의해 절단될 수 있다.
이러한 스페이서 유닛은 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성을 위한 표준 기법을 사용하여 고체 표면으로의 부착을 가능하게 하는 티오포스페이트 기와 함께, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착될 수 있다. 편리하게, 이러한 스페이서 유닛은 고체상 증폭에 의한 광 절단 가능한 이중-가닥 핵산 분자의 합성을 위해 사용될 정방향 또는 역방향 증폭 프라이머 내로 혼입될 수 있다.
이중-가닥 핵산 분자의 하나의 가닥의 부위-특이적 절단은 또한 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오타이드를 혼입시킨 범용 프라이머를 사용한 다음, 증폭된 reDNA 라이브러리의 구성원을 메틸화된 뉴클레오타이드(들)를 포함하는 인식 서열에 특이적인 엔도뉴클레아제 효소로 절단함으로써 달성될 수 있다.
메틸화된 뉴클레오타이드(들)를 전형적으로 상보성 가닥 상의 비-메틸화된 데옥시리보뉴클레오타이드의 상보성 스트레치를 갖는 이중-가닥 어댑터-주형-어댑터 분자의 하나의 가닥의 영역에 혼입시켜, 2개의 가닥의 어닐링이 반메틸화된 듀플렉스 구조를 생성하게 할 것이다. 이어서, 반메틸화된 듀플렉스는 적합한 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 절단될 수 있다.
하나 이상의 메틸화된 뉴클레오타이드를 혼입시킨 범용 프라이머는 적절하게 메틸화된 뉴클레오타이드 전구체를 사용한 자동화된 DNA 합성을 위한 표준 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
프라이머는 추가로 비-뉴클레오타이드 화학적 변형, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 내성을 증가시키기 위한 백본 변형을 갖는 포스포로티오에이트를 포함할 수 있되, 다시, 변형은 프라이머 기능을 방지하지 않는다. 변형은 예를 들어, 고체 지지체, 예를 들어, 비오틴 모이어티로의 프라이머의 부착을 용이하게 할 수 있다. 특정 변형은 그들 자체가 프라이머로서의 분자의 기능을 개선시키거나, 몇몇의 다른 유용한 기능을 제공하여, 예컨대 프라이머(또는 그로부터 유래된 신장된 폴리뉴클레오타이드 가닥)가 고체 지지체로부터 절단될 수 있도록 절단을 위한 부위를 제공할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 US 9,085,802호 참조).
인덱스가 범용 어댑터에 부착되는 일 실시형태에서, 증폭은 풀링된 또는 풀링되지 않은 시료 중 어느 하나에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 인덱스는 범용 프라이머의 일부이며, 이에 따라, 각각의 시료는 풀링 이전에 독립적으로 증폭된다. 그 다음, 풀링된 핵산 시료는 서열결정을 위해 처리될 수 있다.
reDNA를 제공하기 위한 어댑터-주형-어댑터 분자로부터의 어댑터의 제거 후에(도 1, 블록 13), 시료는 주형 분자로부터 제거된 어댑터를 분리하기 위한 조건에 노출될 수 있다. 제거된 어댑터로부터의 요망되는 reDNA의 분리는 포획제의 이용에 의해 보조될 수 있다. 일 실시형태에서, 포획제는 어댑터-주형-어댑터 분자의 증폭 동안 어댑터-주형-어댑터 분자에 첨가된다(도 1, 블록 12). 예를 들어, 어댑터-주형-어댑터 분자를 증폭시키기 위해 사용되는 범용 프라이머는 포획제, 예컨대 수용체-리간드 결합쌍의 구성원을 포함할 수 있다. 유용한 수용체-리간드 결합쌍의 예는 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질 및 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자는 리간드인 포획제를 포함한다. 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 어댑터를 제거하는 조건에 노출시킨다(예를 들어, 범용 제거 서열이 제한 엔도뉴클레아제 부위인 경우 제한 엔도뉴클레아제로의 노출). 일 실시형태에서, reDNA 및 제거된(비부착된) 어댑터의 혼합물을 이어서 리간드 및 수용체의 결합에 적합한 조건 하에서 리간드의 수용체에 노출시키며, 수용체에 결합되는 제거된 어댑터를 reDNA로부터 분리시킨다. 일 실시형태에서, 수용체는 표면에 결합되거나, 부착된 어댑터를 분리하기 위하여 사용될 수 있는 제2 리간드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 리간드의 수용체를 포함하는 표면과 접촉시키고, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자는 분자의 하나의 또는 양 말단에서 표면에 결합하게 된다. 어댑터를 제거하는 조건으로의 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자의 이후의 노출(예를 들어, 범용 제거 서열이 제한 엔도뉴클레아제 부위인 경우 제한 엔도뉴클레아제로의 노출)은 제거된 어댑터가 표면 및 유리 주형, 즉, reDNA에 결합되게 한다. 표면은 임의의 적합한 형상(평면, 예컨대 슬라이드 또는 곡선형, 예컨대 비드)의 비활성 기판 또는 매트릭스(예를 들어, 플라스틱, 유리)일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 주형 분자로부터 제거된 어댑터를 분리하는데 유용한 조건은 소정의 크기 범위, 예컨대 150 내지 400개 뉴클레오타이드 길이 또는 150 내지 300개 뉴클레오타이드를 선택하는 조건을 포함한다. 소정의 크기 범위의 선택 방법은 겔-전기영동을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 적합한 과정, 예컨대 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체상 가역성 고정화 상자성 비드를 사용하여 요망되는 DNA 분자를 비부착된 어댑터로부터 분리하고, 크기에 기초하여 reDNA를 선택할 수 있다. 고체상 가역성 고정화 상자성 비드는 베크만 쿨터(Beckman Coulter)(Agencourt AMPure XP), 써모피셔(Thermofisher)(MagJet), 오메가 바이오텍(Omega Biotek)(Mag-Bind), 프로메가(Promega) 비드(프로메가) 및 카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems)(카파 퓨어 비드(Kapa Pure Beads))로부터 상업적으로 입수 가능하다.
어댑터의 제거 이전 또는 이후에, 수많은 화합물 및 조성물이 초래될 수 있다. 예를 들어, 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 포함하는 화합물 또는 조성물이 제공된다. 본 명세서에 제공되는 또 다른 조성물은 reDNA 단편의 집단, 예를 들어, reDNA 라이브러리이다. 일 실시형태에서, 조성물은 reDNA 단편의 집단을 1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖, 예를 들어, 10 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖ 또는 50 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 150 내지 400개 뉴클레오타이드 길이 또는 150 내지 300개 뉴클레오타이드 길이의 크기 범위를 갖는 reDNA 단편의 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 집단은 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 뉴클레오타이드 내지 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 또는 400개 뉴클레오타이드 길이의 범위이다.
본 명세서에 제공된 또 다른 조성물은 인공 생물학적 유체에 존재하는 reDNA 단편의 집단, 예를 들어, reDNA 라이브러리이다. 어떠한 방식으로든 이론에 제한하고자 하지 않지만, 인공의 생물학적 유체 중 reDNA 단편의 집단의 이용은 천연 검사 시료를 모방하는 합성 양성 및 음성 대조군을 제공한다. 합성 대조군에서 reDNA는 천연 검사 시료에서 관찰되는 크기 분포를 가지며, 합성 대조군에서 reDNA의 게놈 커버리지는 또한 천연 검사 시료에서 관찰되는 것과 유사하다. 인공 생물학적 유체는 천연의 검사 시료와 합성 양성 및 음성 대조군 사이에 추가의 유사성의 수준을 부가한다.
인공 생물학적 유체는 천연 생물학적 유체를 모방하는 유체이다. 일반적으로, 천연 생물학적 유체는 단편화된 핵산이 대상체로부터 수득될 수 있는 유체일 수 있다. 예는 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 세척액, 뇌척수액, 정액, 땀, 눈물, 타액, 대변 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 인공 생물학적 유체는 수성 유체 및 천연 유체의 다른 성분을 포함하여, 인공 유체는 천연 유체를 모방한다. 예를 들어, 인공 혈장은 전해질, 알부민, 피브리노겐, 응고 인자, 완충제 및/또는 다른 성분을 포함하는 천연 혈장의 구성성분의 일부를 포함할 수 있다. 혈장은 종종 성분, 예컨대 CaCl2, 시트르산염 또는 그의 조합으로의 전혈의 처리에 의해 생성되며, 이에 따라, 일부 실시형태에서, 인공 혈장은 CaCl2, 시트르산염 또는 그의 조합을 포함한다. 생물학적 유체, 예컨대 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 세척액, 뇌척수액, 정액, 땀, 눈물, 타액, 대변 등의 성분이 알려져 있으며, 숙련자에 의해 용이하게 재생성될 수 있다. 대안적으로, 인공 혈장은 상업적으로 입수 가능하다(미국 미네소타주 블루밍턴 소재의 이뮤노케미스트리 테크놀로지즈(ImmunoChemistry Technologies)). 인공 생물학적 유체는 또한 성분, 예컨대 비제한적으로 항미생물제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.
reDNA 단편의 집단, 예를 들어, reDNA 라이브러리를 천연 생물학적 시료 중 단편화된 핵산의 농도를 모방하는 농도로 인공 생물학적 유체에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 검사 시료가 임신한 여성으로부터의 혈장 시료인 실시형태에서, 적절한 reDNA 라이브러리를 검사 시료 중 cfDNA의 농도와 유사한 농도로 혈장 시료에 기초한 인공 생물학적 유체에 첨가함으로써 합성 대조군이 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 인공 생물학적 유체는 1 나노그램/밀리리터(ng/㎖) 내지 1000 ng/㎖, 예를 들어, 10 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 또는 50 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖의 농도로 reDNA 라이브러리를 포함할 수 있다.
본원의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공급원으로부터의 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 이어서 서열결정 이전에 고정화시키고 증폭시킨다(도 1, 블록 16). 하나 이상의 공급원으로부터의 어댑터-주형-어댑터 분자를 기판에 부착시키는 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 마찬가지로, 고정화된 어댑터-주형-어댑터 분자를 증폭시키기 위한 방법은 브릿지(bridge) 증폭 및 역학적 배제 증폭을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 서열결정 이전의 고정화 및 증폭 방법은 예를 들어, 문헌[Bignell et al.](US 8,053,192호), 문헌[Gunderson et al.](WO2016/130704호), 문헌[Shen et al.](US 8,895,249호) 및 문헌[Pipenburg et al.](US 9,309,502호)에 기재되어 있다.
풀링된 시료를 포함하는 시료는 서열결정을 위하여 제제 중에서 고정화될 수 있다. 서열결정은 단일 분자의 어레이로서 수행될 수 있거나, 또는 서열결정 이전에 증폭될 수 있다. 증폭은 하나 이상의 고정화된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 고정화된 프라이머(들)는 편평한 표면 상의 또는 비드의 풀 상의 론(lawn)일 수 있다. 비드의 풀은 유제의 각각의 "구획" 내에 단일 비드를 갖는 유제 내로 단리될 수 있다. "구획"당 단지 하나의 주형의 농도로, 단일 주형만이 각각의 비드 상에서 증폭된다.
용어 "고체상 증폭"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 고체 지지체 상에서 수행되거나 이것과 함께 수행되어 증폭된 생성물의 전부 또는 일부가 그들이 형성될 때 고체 지지체 상에 고정화되게 하는 임의의 핵산 증폭 반응을 지칭한다. 특히, 이 용어는 고체상 중합효소 연쇄 반응(고체상 PCR) 및 고체상 등온 증폭을 포함하는데, 이것은 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 고체 지지체 상에 고정된 것을 제외하고는 표준 용액상 증폭과 유사한 반응이다. 고체상 PCR은 시스템, 예컨대, 유제(여기서 하나의 프라이머가 비드에 앵커링되고, 나머지는 자유 용액 중에 존재함) 및 고체상 겔 매트릭스 내의 콜로니 형성(여기서 하나의 프라이머가 표면에 앵커링되고, 나머지는 자유 용액 중에 존재함)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체의 노출된 층 내의 또는 그 상의 상이한 영역의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역 중 하나 이상은 하나 이상의 범용 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 범용 프라이머가 존재하지 않는 사이(interstitial) 영역에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 행 및 열로 존재하는 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 반복되는 배열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 무작위 배열일 수 있다. 본 명세서에 언급된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국 특허 제8,778,848호, 제8,778,849호 및 제9,079,148호, 및 미국 특허 공개 제2014/0243224호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 표면 내의 웰 또는 함몰부의 어레이를 포함한다. 이것은 일반적으로 해당 분야에 공지된 바와 같이 다양한 기법, 예컨대, 비제한적으로 포토리소그래피, 스탬핑 기법, 성형 기법 및 마이크로에칭 기법을 사용하여 제작될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 사용되는 기법은 어레이 기판의 조성 및 형상에 좌우될 것이다.
패턴화된 표면 내의 특징부는 유리, 규소, 플라스틱 또는 패턴화된 공유적으로 연결된 겔, 예컨대, 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/184796호, WO 2016/066586호, 및 WO 2015/002813호 참조)를 갖는 다른 적합한 고체 지지체 상의 웰의 어레이의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)일 수 있다. 이 과정은 다수회의 사이클을 사용한 서열결정 실행에 걸쳐 안정적일 수 있는 서열결정을 위해 사용되는 겔 패드를 생성한다. 웰로의 중합체의 공유적 연결은 다양한 용도 동안 구조화된 기판의 수명 내내 구조화된 특징부 내에 겔을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 많은 실시형태에서, 겔은 웰에 공유적으로 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 조건에서 구조화된 기판의 어느 부분에도 공유적으로 부착되지 않은 실란 부재 아크릴아미드(SFA, 예를 들어, 미국 특허 제8,563,477호 참조)가 겔 물질로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 구조화된 기판은 고체 지지체 물질을 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)로 패턴화시키고, 패턴화된 지지체를 겔 물질(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 그의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대, SFA의 아지도 분해된(azidolyzed) 버전(아지도-SFA))로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 폴리싱을 통해, 겔 코팅된 지지체를 폴리싱하여 웰 내에 겔을 보유하지만 웰 사이의 구조화된 기판의 표면 상의 사이 영역로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머 핵산이 겔 물질에 부착될 수 있다. 이어서 표적 핵산(예를 들어, cfDNA)의 용액을 폴리싱된 기판과 접촉시켜, 개별 표적 핵산이 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰에 씨딩되게 할 것이지만; 표적 핵산은 겔 물질의 부재 또는 비활성으로 인하여 사이 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 핵산의 증폭은 웰로 한정될 것인데, 그 이유는 사이 영역 내의 겔의 부재 또는 비활성이 성장하는 핵산 콜로니의 외측으로의 이동을 방지하기 때문이다. 이러한 과정은 편리하게 제조 가능하고, 확대 가능하고, 종래의 마이크로- 또는 나노제작 방법을 이용한다.
본 개시내용은 단지 하나의 증폭 프라이머가 고정화된(다른 프라이머는 통상 자유 용액 중에 존재함) "고체상" 증폭 방법을 포함하지만, 정방향 및 역방향 프라이머가 둘 모두가 고정되는 고체 지지체가 제공되는 것이 바람직하다. 실제로, 고체 지지체 상에 고정화된 '복수'의 동일한 정방향 프라이머 및/또는 '복수'의 동일한 역방향 프라이머가 존재할 것인데, 그 이유는 증폭 과정이 증폭을 유지시키기 위해 과량의 프라이머를 필요로 하기 때문이다. 본 명세서에서 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 언급은 이에 따라 문맥에서 달리 제시하지 않는 한 '복수'의 이러한 프라이머를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 주어진 증폭 반응은 증폭될 주형에 대해 특이적인 적어도 하나의 유형의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 유형의 역방향 프라이머가 필요하다. 그러나, 특정 실시형태에서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 동일한 서열의 주형-특이적 부분을 포함할 수 있고, 완전히 동일한 뉴클레오타이드 서열 및 구조(임의의 비-뉴클레오타이드 변형을 포함함)를 가질 수 있다. 다시 말해서, 단지 하나의 유형의 프라이머를 사용하여 고체-상 증폭을 수행하는 것이 가능하고, 이러한 단일-프라이머 방법은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 다른 실시형태는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용할 수 있는데, 이것은 동일한 주형-특이적 서열을 함유하지만, 일부 다른 구조 특징이 상이하다. 예를 들어, 하나의 유형의 프라이머는 다른 것에 존재하지 않는 비-뉴클레오타이드 변형을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 모든 실시형태에서, 고체-상 증폭을 위한 프라이머는 바람직하게는 단일 지점 공유적 부착에 의해 프라이머의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 고체 지지체에 고정화되어, 그의 동족 주형에 어닐링시키기에 자유로운 프라이머의 주형-특이적 부분 및 프라이머 신장을 위해 자유로운 3' 하이드록실기를 남긴다. 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 공유적 부착 수단이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 선택된 부착 화학은 고체 지지체의 성질, 및 그것에 적용되는 임의의 유도체화 또는 작용화에 좌우될 것이다. 프라이머 그 자체는 비-뉴클레오타이드 화학적 변형일 수 있는 모이어티를 포함하여 부착을 용이하게 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 프라이머는 5' 말단에 황-함유 친핵체, 예컨대, 포스포로티오에이트 또는 티오포스페이트를 포함할 수 있다. 고체-지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 경우에, 이러한 친핵체는 하이드로겔에 존재하는 브로모아세트아미드기에 결합할 수 있다. 프라이머 및 주형을 고체 지지체에 부착시키는 더욱 특정한 수단은 WO05/065814호에 완전히 기재된 바와 같은, 중합된 아크릴아미드 및 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드(BRAPA)로 구성된 하이드로겔로의 5' 포스포로티오에이트 부착을 통한 것이다.
본 개시내용의 특정 실시형태는 예를 들어, 생물분자, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드로의 공유적 부착을 가능하게 하는 반응성 기를 포함하는 중간체 물질의 층 또는 코팅을 적용함으로써 "작용화"된 비활성 기판 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 슬라이드, 중합체 비드 등)로 구성된 고체 지지체를 이용할 수 있다. 이러한 지지체의 예는 비활성 기질, 예컨대, 유리 상에 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 실시형태에서, 생물분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)는 중간체 물질(예를 들어, 하이드로겔)에 직접 공유적으로 부착될 수 있지만, 중간체 물질 그 자체는 기판 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 기판)에 비-공유적으로 부착될 수 있다. 용어 "고체 지지체로의 공유적 부착"은 이에 따라 이러한 유형의 배열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
풀링된 시료는 비드 상에서 증폭될 수 있고, 여기서 각각의 비드는 정방향 및 역방향 범용 프라이머를 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따라 제조되는 주형의 라이브러리를 사용하여, 고체-상 증폭 및 더욱 특히 고체상 등온 증폭에 의해 미국 특허 공개 제2005/0100900호, 미국 특허 제7,115,400호, WO 00/18957호 및 WO 98/44151호에 기재된 것과 유사한, 핵산 콜로니의 클러스터링된 어레이를 제조한다. 용어 "클러스터" 및 "콜로니"는 복수의 동일한 고정화된 핵산 가닥 및 복수의 동일한 고정화된 상보성 핵산 가닥으로 구성된 고체 지지체 상의 별개의 부위를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 용어 "클러스터링된 어레이"는 이러한 클러스터 또는 콜로니로부터 형성된 어레이를 지칭한다. 이와 관련하여, 용어 "어레이"는 클러스터의 정렬된 배열을 필요로 하는 것으로서 이해되지 않을 것이다.
용어 "고체상" 또는 "표면"은 프라이머가 평평한 표면, 예를 들어, 유리, 실리카 또는 플라스틱 현미경 슬라이드에 부착된 평면 어레이 또는 유사한 유동 셀 디바이스 중 어느 하나; 1개 또는 2개의 프라이머가 비드에 부착되고, 비드가 증폭되는 비드; 또는 비드가 증폭된 후 표면 상의 비드의 어레이를 의미하도록 사용된다.
클러스터링된 어레이는 WO 98/44151호에 기재된 바와 같은 써모사이클링 과정, 또는 온도가 일정하게 유지되고, 신장 및 변성의 사이클이 시약의 변화를 사용하여 수행되는 과정 중 어느 하나를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 등온 증폭 방법은 특허 출원 제WO 02/46456호 및 미국 특허 공개 제2008/0009420호에 기재되어 있다. 등온 과정에서 필요한 더 낮은 온도로 인하여, 이것이 특히 바람직하다.
본 명세서에 기재되거나 해당 분야에 일반적으로 공지된 증폭 방법 중 임의의 것을 범용 또는 표적-특이적 프라이머와 함께 사용하여 고정화된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 것이 이해될 것이다. 증폭에 적합한 방법은 미국 특허 제8,003,354호에 기재된 바와 같은, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 증폭 방법을 사용하여 하나 이상의 관심 핵산을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 멀티플렉스 PCR을 비롯한 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 사용하여 고정화된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 지향된 프라이머는 증폭 반응에 포함된다.
폴리뉴클레오타이드의 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오타이드 신장 및 라이게이션, 회전환 증폭(RCA)(문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]) 및 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 검정(OLA)(일반적으로 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호, EP 0 320 308 B1호; EP 0 336 731 B1호; EP 0 439 182 B1호; WO 90/01069호; WO 89/12696호; 및 WO 89/09835호 참조) 기술을 포함할 수 있다. 이들 증폭 방법이 고정화된 DNA 단편을 증폭시키도록 설계될 수 있는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 라이게이션 프로브 증폭 또는 관심 핵산에 특이적으로 지향된 프라이머를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 검정(OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 지향된 프라이머를 함유하는 프라이머 신장-라이게이션 반응을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭시키도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 신장 및 라이게이션 프라이머의 비제한적인 예로서, 증폭은 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 예시된 바와 같은 골든게이트(GoldenGate) 검정(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나, 인코포레이티드(Illumina, Inc.))을 위해 사용된 프라이머를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은 예를 들어, 문헌[Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 예시된 바와 같은 다중 치환 증폭(MDA), 또는 예를 들어, 미국 특허 제6,214,587호에 의해 예시된 바와 같은 등온 가닥 치환 핵산 증폭을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용에 사용될 수 있는 다른 비-PCR-기반 방법은 예를 들어, 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995]; 미국 특허 제5,455,166호, 및 제5,130,238호, 및 문헌[Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기재된 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 예를 들어, 문헌[Lage et al., Genome Res. 13:294-307 (2003)]에 기재된 과분지화 가닥 치환 증폭(hyper-branched strand displacement amplification)을 포함한다. 게놈 DNA의 무작위 프라이머 증폭을 위해 가닥-치환 Phi 29 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소 큰 단편, 5'->3' 엑소-와 함께 등온 증폭 방법이 사용될 수 있다. 이들 중합효소의 사용은 그들의 높은 진행도 및 가닥 치환 활성을 이용한다. 높은 진행도는 중합효소가 10 내지 20 kb 길이인 단편을 생성시킬 수 있게 한다. 상기에 언급된 바와 같이, 낮은 진행도 및 가닥-치환 활성을 갖는 중합효소, 예컨대, 클레나우 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서 더 작은 단편이 생성될 수 있다. 증폭 반응, 조건 및 성분의 추가의 설명은 미국 특허 제7,670,810호의 개시내용에 상세하게 언급되어 있다.
본 개시내용에서 유용한 또 다른 폴리뉴클레오타이드 증폭 방법은 예를 들어, 문헌[Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)]에 기재된 바와 같은, 불변 5' 영역에 이어서 무작위 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머의 집단을 사용하는 태깅된 PCR(Tagged PCR)이다. 제1 라운드의 증폭을 수행하여, 무작위로 합성된 3' 영역으로부터의 개별 혼성화에 기초한 열 변성된 DNA 상에서 다수의 개시를 가능하게 한다. 3' 영역의 성질로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에서 무작위적인 것으로 고려된다. 그 후, 비결합된 프라이머를 제거할 수 있고, 불변 5' 영역에 상보성인 프라이머를 사용하여 추가 복제가 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 등온 증폭은 배제 증폭(ExAmp)으로도 지칭되는 역학 배제 증폭(KEA)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 라이브러리는 증폭 시약을 반응시켜 증폭 부위가 씨딩된 개별 표적 핵산으로부터의 실질적으로 클론 집단의 앰플리콘을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 반응은 각각의 증폭 부위의 용량을 채우기에 충분한 수의 앰플리콘이 생성될 때까지 진행된다. 이러한 방식으로 이미 씨딩된 부위를 용량까지 채우는 것은 표적 핵산이 그 부위에 랜딩하고, 증폭하여, 그 부위에서 클론 집단의 앰플리콘을 생성시키는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 핵산이 그 부위에 도착하기 전에 증폭 부위가 용량까지 채워지지 않더라도 명백한 클론성이 달성될 수 있다. 일부 조건 하에서, 제1 표적 핵산의 증폭은, 그 부위로 수송되는 제2 표적 핵산으로부터의 카피의 생성을 효과적으로 초과하거나 압도하도록 충분한 수의 카피가 제조되는 점까지 진행될 수 있다. 예를 들어, 직경이 500 nm보다 더 작은 원형 특징부 상에서 브릿지 증폭 과정을 사용하는 실시형태에서, 제1 표적 핵산에 대한 14 사이클의 지수적 증폭 후에, 동일한 부위에서의 제2 표적 핵산으로부터의 오염은 일루미나 서열결정 플랫폼 상에서의 합성에 의한 서열결정 분석에 악영향을 미치기에 불충한 수의 오염된 앰플리콘을 생성할 것이 결정된 바 있다.
어레이 내의 증폭 부위는 특정 실시형태에서 완전히 클론성일 수 있지만 그럴 필요는 없다. 오히려, 일부 응용을 위해서, 개별 증폭 부위는 제1 표적 핵산으로부터의 앰플리콘이 우세하게 존재할 수 있고, 제2 표적 핵산으로부터의 낮은 수준의 오염된 앰플리콘도 또한 가질 수 있다. 어레이는, 오염 수준이 어레이의 후속 사용에 허용 가능하지 않은 영향을 갖지 않는 한 낮은 수준의 오염된 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이를 검출 응용에서 사용하려는 경우, 허용 가능한 수준의 오염은 허용 가능하지 않은 방식으로 검출 기법의 신호 대 노이즈 또는 분해능에 영향을 주지 않는 수준일 것이다. 따라서, 명백한 클론성은 일반적으로 본 명세서에 언급된 방법에 의해 제조된 어레이의 특정 사용 또는 응용에 관련될 것이다. 특정 응용을 위해 개별 증폭 부위에서 허용 가능할 수 있는 예시적인 오염 수준은 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25%의 오염된 앰플리콘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 어레이는 이들 예시적인 수준의 오염된 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이 내의 증폭 부위 중 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어는 100%가 일부 오염된 앰플리콘을 가질 수 있다. 어레이 또는 부위의 다른 집합에서, 부위 중 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과가 클론성이거나 또는 명백하게 클론성일 수 있다.
일부 실시형태에서, 또 다른 사례 또는 과정이 일어나는 것을 효과적으로 배제하기에 충분히 신속한 속도로 과정이 일어나는 경우 역학적 배제가 일어날 수 있다. 예를 들어, 핵산 어레이의 제조를 고려하여, 어레이의 부위를 용액으로부터의 표적 핵산으로 무작위로 씨딩하고, 표적 핵산의 카피를 증폭 과정에서 생성하여 씨딩된 부위 각각을 용량까지 채운다. 본 개시내용의 역학적 배제 방법에 따라서, 씨딩 및 증폭 과정은 증폭 속도가 씨딩 속도를 초과하는 조건 하에서 동시에 진행될 수 있다. 이와 같이, 카피가 제1 표적 핵산이 씨딩된 부위에서 제조되는 비교적 신속한 속도는 제2 핵산이 증폭을 위한 부위를 씨딩하는 것을 효과적으로 배제시킬 것이다. 역학적 배제 증폭 방법은 미국 출원 공개 제2013/0338042호의 개시내용에서 상세하게 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
역학적 배제는 증폭을 개시하기 위해 상대적으로 느린 속도(예를 들어, 표적 핵산의 제1 카피의 느린 제조 속도) 대 표적 핵산의(또는 표적 핵산의 제1 카피의) 후속 카피를 제조하기 위해 상대적으로 신속한 속도를 이용할 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 역학적 배제는 표적 핵산 씨딩의 상대적으로 느린 속도(예를 들어, 상대적으로 느린 확산 또는 수송) 대 부위를 표적 핵산 씨드의 카피로 채우기 위한 증복이 일어나는 상대적으로 신속한 속도로 인하여 일어난다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 역학적 배제는 부위에 씨딩된 표적 핵산의 제1 카피의 형성의 지연(예를 들어, 지연된 또는 느린 활성화) 대 부위를 채우기 위하여 후속 카피가 제조되는 상대적으로 신속한 속도로 인해 일어날 수 있다. 이러한 예에서, 개별 부위는 몇몇의 상이한 표적 핵산으로 씨딩될 수 있다(예를 들어, 몇몇 표적 핵산이 증폭 이전에 각각의 부위에서 존재할 수 있다). 그러나, 임의의 주어진 표적 핵산을 위한 제1 카피 형성은 무작위로 활성화되어, 제1 카피 형성의 평균 속도가, 후속 카피가 생성되는 속도에 비하여 상대적으로 느리게 할 수 있다. 이러한 경우, 개별 부위가 몇몇 상이한 표적 핵산으로 씨딩될 수 있지만, 역학적 배제는 그들 표적 핵산 중 오직 하나가 증폭되게 할 것이다. 더욱 구체적으로, 일단 제1 표적 핵산이 증폭을 위해서 활성화되면, 그 부위는 그의 카피로 용량까지 신속하게 채워져 제2 표적 핵산의 카피가 그 부위에서 제조되는 것을 방지할 것이다.
증폭 시약은 앰플리콘 형성을 용이하게 하고, 일부 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예는 재조합효소이다. 재조합효소는 반복된 침습/신장을 허용함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합효소는 중합효소에 의한 표적 핵산의 침습 및 앰플리콘 형성을 위한 주형으로서 표적 핵산을 사용한 중합효소에 의한 프라이머의 신장을 용이하게 할 수 있다. 이러한 과정은, 앰플리콘이 침습/신장의 각각의 라운드로부터 생성되어, 후속 라운드에서 주형으로서 제공되는 연쇄 반응으로서 반복될 수 있다. 이러한 과정은 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있는데, 그 이유는 (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않기 때문이다. 이와 같이, 재조합효소-촉진된 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 증폭을 용이하게 하기 위해 재조합효소-촉진된 증폭 시약 중에 ATP 또는 다른 뉴클레오타이드(또는 일부 경우에 그의 비-가수분해 가능한 유사체)를 포함시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 재조합효소와 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물이 특히 유용한데, 그 이유는 SSB가 증폭을 추가로 용이하게 할 수 있기 때문이다. 재조합효소-촉진된 증폭을 위한 예시적인 제형은 트위스트디엑스(TwistDx)(영국 캠브릿지 소재)에 의해 트위스트앰프(TwistAmp) 키트로서 상업적으로 판매되는 것을 포함한다. 재조합효소-촉진된 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은 US 5,223,414호 및 US 7,399,590호에 언급되어 있다.
앰플리콘 형성을 용이하게 하고, 일부 경우에 앰플리콘 형성 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약 중에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 헬리카제이다. 헬리카제는 앰플리콘 형성의 연쇄 반응을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. 이러한 과정은 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있는데, 그 이유는 (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않기 때문이다. 이와 같이, 헬리카제-촉진된 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 헬리카제와 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물이 특히 유용한데, 그 이유는 SSB가 증폭을 추가로 용이하게 할 수 있기 때문이다. 헬리카제-촉진된 증폭을 위한 예시적인 제형은 바이오헬릭스(Biohelix)(미국 매사추세츠주 비벌리 소재)로부터 아이소앰프(IsoAmp) 키트로서 상업적으로 판매되는 것을 포함한다. 추가로, 헬리카제 단백질을 포함하는 유용한 제형의 예는 US 7,399,590호 및 US 7,829,284호에 기재되어 있다.
앰플리콘 형성을 용이하게 하고, 일부 경우에 앰플리콘 형성 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약 중에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 원점 결합 단백질이다.
표면으로의 어댑터-주형-어댑터 분자의 부착 후에, 고정화 및 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 적어도 일부에서 서열이 결정된다. 서열결정은 임의의 적합한 서열결정 기법을 사용하여 수행될 수 있으며, 가닥 재합성을 비롯하여, 고정화되고 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 서열을 결정하기 위한 방법은 해당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Bignell et al.](US 8,053,192호), 문헌[Gunderson et al.](WO2016/130704호), 문헌[Shen et al.](US 8,895,249호), 및 문헌[Pipenburg et al.](US 9,309,502호)에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 핵산 검출 검사로도 지칭되는 다양한 핵산 서열결정 기법과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용 가능한 기법은 핵산이 어레이 내의 고정된 위치에 부착되어 그들의 상대적인 위치가 변화되지 않고, 그 어레이가 반복적으로 영상화되는 것이다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오타이드 염기 유형을 서로 구별하는 데 사용되는 상이한 표지와 일치하는, 상이한 색상 채널에서 영상이 수득되는 실시형태가 특히 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 과정은 자동화 과정일 수 있다. 바람직한 실시형태는 합성에 의한 서열결정("SBS") 기법을 포함한다. 핵산 서열결정 기법은 또한 마이크로어레이 분석을 위해 사용될 수 있다.
SBS 기법은 일반적으로 주형 가닥에 대한 뉴클레오타이드의 반복적으로 부가를 통한 초기 핵산 가닥의 효소적 신장을 포함한다. 전통적인 SBS 방법에서, 단일 뉴클레오타이드 단량체가 각각의 전달에서 중합효소의 존재 하에 표적 뉴클레오타이드에 제공될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법에서, 하나 초과의 유형의 뉴클레오타이드 단량체가 전달에서 중합효소의 존재 하에 표적 핵산에 제공될 수 있다.
SBS는 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 단량체 또는 임의의 종결자 모이어티가 결여된 것들을 사용할 수 있다. 종결자가 결여된 뉴클레오타이드 단량체를 사용하는 방법은 본 명세서에 추가로 상세하게 언급된 바와 같이, 예를 들어, γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열결정 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 포함한다. 종결자가 결여된 뉴클레오타이드 단량체를 사용하는 방법에서, 각각의 사이클에 추가되는 뉴클레오타이드의 수는 일반적으로 가변적이고, 주형 서열 및 뉴클레오타이드 전달 방식에 좌우된다. 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 단량체를 사용하는 SBS 기법에 있어서, 종결자는 디데옥시뉴클레오타이드를 사용하는 전통적인 생거(Sanger) 서열결정에 대한 경우에서와 같이 사용되는 서열결정 조건 하에서 효과적으로 비가역적일 수 있거나, 종결자는 솔렉사(Solexa)(현재 일루미나, 인코포레이티드)에 의해 개발된 서열결정 방법에 대한 경우에서와 같이 가역적일 수 있다.
SBS 기법은 표지 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 단량체 또는 표지 모이어티가 결여된 것들을 사용할 수 있다. 따라서, 혼입 사례는 표지의 특징, 예컨대, 표지의 형광; 뉴클레오타이드 단량체의 특징, 예컨대, 분자량 또는 전하; 뉴클레오타이드의 혼입의 부산물, 예컨대, 피로포스페이트의 방출 등을 기반으로 검출될 수 있다. 2개 이상의 상이한 뉴클레오타이드가 서열결정 시약 중에 존재하는 실시형태에서, 상이한 뉴클레오타이드는 서로 구별 가능할 수 있거나, 대안적으로 2개 이상의 상이한 표지는 사용 중인 검출 기법 하에서 구별 가능하지 않을 수 있다. 예를 들어, 서열결정 시약 중에 존재하는 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 표지를 가질 수 있고, 그들은 솔렉사(현재 일루미나, 인코포레이티드)에 의해 개발된 서열결정 방법에 의해서 예시된 바와 같이 적절한 광학 장치를 사용하여 구별될 수 있다.
바람직한 실시형태는 피로시퀀싱 기법을 포함한다. 피로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 초기 가닥 내에 혼입될 때 무기 피로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9]; 문헌[Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11]; 문헌[Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363]; 미국 특허 제6,210,891호; 제6,258,568호 및 제6,274,320호). 피로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼라제에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생성된 광자를 통해 검출된다. 서열결정될 핵산은 어레이 내의 특징부에 부착될 수 있고, 어레이를 영상화하여, 어레이의 특징부에서의 뉴클레오타이드의 혼입으로 인해 생성되는 화학발광 신호를 캡처할 수 있다. 영상은 어레이를 특정 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, A, T, C 또는 G)으로 처리한 후 얻어질 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드 유형의 부가 후에 수득되는 영상은 어레이 내의 어떤 특징부가 검출되는 지에 관하여 상이할 것이다. 영상의 이들 차이는 어레이 상의 특징부의 상이한 서열 내용을 반영한다. 그러나, 각각의 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않고 유지될 것이다. 영상은 본 명세서에 언급된 방법을 사용하여 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형으로 어레이를 처리한 후 수득되는 영상은 가역적 종결자-기반의 서열결정 방법을 위해 상이한 검출 채널로부터 수득되는 영상에 대하여 본 명세서에 예시된 것과 동일한 방식으로 취급될 수 있다.
SBS의 또 다른 예시적인 유형에서, 순환 서열결정은 예를 들어, WO 04/018497호 및 미국 특허 제7,057,026호에 기재된 바와 같이 예를 들어, 절단 가능한 또는 광표백 가능한 염료 표지를 함유하는 가역적 종결자 뉴클레오타이드의 단계식 첨가에 의해서 달성된다. 이러한 접근법은 솔렉사(현재 일루미나 인코포레이티드)에 의해 상업화되고 있고, 또한 WO 91/06678호 및 WO 07/123,744호에 기재되어 있다. 종결이 역전될 수 있고, 형광 표지가 절단될 수 있는 형광-표지된 종결자의 이용 가능성은 효율적인 순환식 가역적 종결(cyclic reversible termination: CRT) 서열결정을 용이하게 한다. 중합효소는 또한 이들 변형된 뉴클레오타이드로부터 효율적으로 혼입 및 신장하도록 동시-조작될 수 있다.
바람직하게는 가역적 종결자-기반의 서열결정 실시형태에서, 표지는 SBS 반응 조건 하에서 신장을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 검출 표지는 예를 들어, 절단 또는 분해에 의해 제거 가능할 수 있다. 영상은 어레이된 핵산 특징부 내로의 표지의 혼입 이후에 캡처될 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 사이클은 어레이에 4개의 상이한 뉴클레오타이드 유형을 동시에 전달하는 것을 포함하고, 각각의 뉴클레오타이드 유형은 스펙트럼적으로 별개의 표지를 갖는다. 이어서 각각 4개의 상이한 표지 중 하나에 대하여 선택적인 검출 채널을 사용하여 4개의 영상이 수득될 수 있다. 대안적으로, 상이한 뉴클레오타이드 유형은 순차적으로 첨가될 수 있고, 어레이의 영상은 각각의 첨가 단계 사이에 수득될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 각각의 영상은 특정 유형의 뉴클레오타이드가 혼입된 핵산 특징부를 보여줄 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 내용으로 인하여 상이한 영상에 존재하거나 존재하지 않을 것이다. 그러나, 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않고 유지될 것이다. 이러한 가역적 종결자-SBS 방법으로부터 수득된 영상은 본 명세서에 언급된 바와 같이 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 영상 캡처 단계 이후에, 표지를 제거할 수 있고, 가역적 종결자 모이어티를 뉴클레오타이드 첨가 및 검출의 후속 사이클을 위해 제거할 수 있다. 표지가 특정 사이클에서 검출된 이후에 그리고 후속 사이클 이전에 표지를 제거하는 것은 백그라운드 신호 및 사이클 사이의 크로스토크(crosstalk)를 감소시키는 이점을 제공할 수 있다. 유용한 표지 및 제거 방법의 예는 본 명세서에 언급되어 있다.
특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 단량체의 일부 또는 전부는 가역적 종결자를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 가역적 종결자/절단 가능한 형광단은 3' 에스테르 연결을 통해 리보스 모이어티에 연결된 형광단을 포함할 수 있다(문헌[Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)]). 다른 접근법은 종결자 화학물질을 형광 표지의 절단로부터 분리한 바 있다(문헌[Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)]). 루파렐(Ruparel) 등은 작은 3' 알릴기를 사용하여 신장을 차단하지만, 팔라듐 촉매로의 짧은 처리에 의해 용이하게 해제될 수 있는 가역적 종결자의 개발을 기재하였다. 형광단을 장파장 UV광으로의 30초 노출에 의해 용이하게 절단될 수 있는 광 절단 가능한 링커를 통해 염기에 부착시켰다. 따라서, 이황화물 환원 또는 광 절단 중 어느 하나를 절단 가능한 링커로서 사용할 수 있다. 가역적 종결에 대한 또 다른 접근법은 dNTP 상에 체적이 큰 염료를 배치한 후 일어나는 자연 종결의 사용이다. dNTP 상의 하전된 체적이 큰 염료의 존재는 입체 및/또는 정전기 장애를 통해 효과적인 종결자로서 작용할 수 있다. 하나의 혼입 사례의 존재는 염료가 제거되지 않는 한 추가 혼입을 방지한다. 염료의 절단은 형광단을 제거하고, 종결을 효과적으로 역전시킨다. 변형된 뉴클레오타이드의 예는 또한 미국 특허 제7,427,673호 및 제7,057,026호에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있는 추가의 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 공개 제2007/0166705호, 제2006/0188901호, 제2006/0240439호, 제2006/0281109호, 제2012/0270305호, 및 제2013/0260372호, 미국 특허 제7,057,026호, PCT 공개 제WO 05/065814호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100900호, 및 PCT 공개 제WO 06/064199호, 및 제WO 07/010,251호에 기재되어 있다.
일부 실시형태는 4개 미만의 상이한 표지를 사용하여 4개의 상이한 뉴클레오타이드의 검출을 사용할 수 있다. 예를 들어, SBS는 미국 특허 공개 제2013/0079232호에 포함된 문헌에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 첫 번째 예로서, 한 쌍의 뉴클레오타이드 유형이 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 다른 것과 비교하여 그 쌍 중 하나의 구성원에 대한 강도의 차이를 기반으로 또는 그 쌍의 다른 구성원에 대하여 검출된 신호에 비하여 명백한 신호가 나타나게 하거나 사라지게 하는 그 쌍의 하나의 구성원의 변화(예를 들어, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통함)를 기반으로 구별될 수 있다. 두 번째 예로서, 4개의 상이한 뉴클레오타이드 유형 중 3개가 특정 조건 하에서 검출될 수 있는 반면, 제4 뉴클레오타이드 유형은 그러한 조건 하에서 검출 가능한 표지가 결여되어 있거나 또는 그러한 조건 하에서 최소한으로 검출된다(예를 들어, 백그라운드 형광 등으로 인한 최소 검출). 핵산 내로의 처음 3개의 뉴클레오타이드 유형의 혼입은 그들의 각각의 신호의 존재에 기초하여 결정될 수 있고, 핵산 내로의 제4 뉴클레오타이드 유형의 혼입은 임의의 신호의 부재 또는 최소 검출에 기초하여 결정될 수 있다. 세 번째 예로서, 하나의 뉴클레오타이드 유형은 2개의 상이한 채널에서 검출되는 표지(들)를 포함할 수 있는 반면, 다른 뉴클레오타이드 유형은 채널 중 하나 이하에서 검출된다. 상기에 언급된 3개의 예시적인 구성은 상호 배타적인 것으로 간주되지 않고, 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 모든 3개의 예를 조합한 예시적인 실시형태는 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장에 의해 여기되는 경우 제1 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dATP), 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 제2 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dCTP), 제1 채널 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장 및/또는 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 두 채널 모두에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 갖는 dTTP) 및 어느 하나의 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는 표지가 결여된 제4 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 표지를 갖지 않는 dGTP)을 사용하는 형광-기반의 SBS 방법이다.
추가로, 미국 특허 공개 제2013/0079232호에 포함된 문헌에 기재된 바와 같이, 서열결정 데이터는 단일 채널을 사용하여 수득될 수 있다. 이러한 소위 1-염료 서열결정 접근법에서, 제1 뉴클레오타이드 유형은 표지되지만, 표지는 제1 영상이 생성된 후에 제거되고, 제2 뉴클레오타이드 유형은 제1 영상이 생성된 후에만 표지된다. 제3 뉴클레오타이드 유형은 제1 영상 및 제2 영상 둘 모두에서 그의 표지를 보유하고, 제4 뉴클레오타이드 유형은 두 영상 모두에서 표지되지 않은 채로 유지된다.
일부 실시형태는 라이게이션 기법에 의한 서열결정을 사용할 수 있다. 이러한 기법은 DNA 리가제를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 혼입시키고, 이러한 올리고뉴클레오타이드의 혼입을 식별한다. 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 올리고뉴클레오타이드가 혼성화하는 서열 내의 특정 뉴클레오타이드의 동일성과 상관관계가 있는 상이한 표지를 갖는다. 다른 SBS 방법에서와 같이, 영상은 핵산 특징부의 어레이를 표지된 서열결정 시약으로 처리한 후 수득될 수 있다. 각각의 영상은 특정 유형의 표지가 혼입된 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 내용으로 인하여 상이한 영상에서 존재하거나 존재하지 않을 것이지만, 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않고 유지될 것이다. 라이게이션-기반의 서열결정 방법으로부터 수득되는 영상은 본 명세서에 언급된 바와 같이 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있는 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 제6,969,488호, 제6,172,218호 및 제6,306,597호에 기재되어 있다.
일부 실시형태는 나노포어 서열결정을 사용할 수 있다(문헌[Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)]; 문헌[Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis", Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)]; 문헌[Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003)]). 이러한 실시형태에서, 표적 핵산이 나노포어를 통과한다. 나노포어는 합성 포어 또는 생물학적 막 단백질, 예컨대, α-용혈소일 수 있다. 표적 핵산이 나노포어를 통과하기 때문에, 각각의 염기-쌍은 포어의 전기 전도도의 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다(미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)]; 문헌[Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007)]; 문헌[Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)]). 나노포어 서열결정으로부터 수득되는 데이터는 본 명세서에 언급된 바와 같이 저장, 처리 및 분석될 수 있다. 특히, 데이터는 본 명세서에 언급된 광학 영상 및 다른 영상의 예시적인 처리에 따른 영상으로서 처리될 수 있다.
일부 실시형태는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 사용할 수 있다. 뉴클레오타이드 혼입은 예를 들어, 미국 특허 제7,329,492호 및 제7,211,414호에 기재된 바와 같이 형광단-보유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호작용을 통해서 검출될 수 있거나, 또는 뉴클레오타이드 혼입은 예를 들어, 미국 특허 제7,315,019호에 기재된 바와 같은 제로-모드 도파관으로 그리고 예를 들어, 미국 특허 제7,405,281호 및 미국 특허 공개 제2008/0108082호에 기재된 바와 같은 형광 뉴클레오타이드 유사체 및 조작된 중합효소를 사용하여 검출될 수 있다. 조명은 표면-테더링된 중합효소 주변의 젭토리터-스케일 체적으로 제한될 수 있어서, 형광 표지된 뉴클레오타이드의 혼입은 낮은 백그라운드와 함께 관찰될 수 있다(문헌[Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003)]; 문헌[Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; 문헌[Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]). 이러한 방법으로부터 수득되는 영상은 본 명세서에 언급된 바와 같이 저장, 처리 및 분석될 수 있다.
일부 SBS 실시형태는 신장 생성물 내로의 뉴클레오타이드의 혼입 시에 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열결정은 이온 토렌트(Ion Torrent)(미국 코네티컷주 소재의 길포드(Guilford), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 자회사)로부터 상업적으로 입수 가능한 전기 검출기 및 관련 기법 또는 미국 특허 공개 제2009/0026082호; 제2009/0127589호; 제2010/0137143호; 및 제2010/0282617호에 기재된 서열결정 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 표적 핵산을 역학적 배제를 사용하여 증폭시키기 위한 본 명세서에 언급된 방법은 양성자를 검출하는 데 사용되는 기질에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 언급된 방법을 사용하여 양성자를 검출하는 데 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 생성할 수 있다.
상기 SBS 방법은 멀티플렉스 포맷으로 유리하게 수행되어 다수의 상이한 표적 핵산이 동시에 조작되게 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상이한 표적 핵산은 일반적인 반응 용기 내에서 또는 특정 기판의 표면 상에서 처리될 수 있다. 이것은 멀티플렉스 방식으로 서열결정 시약의 편리한 전달, 미반응 시약의 제거 및 혼입 사례의 검출을 가능하게 한다. 표면-결합된 표적 핵산을 사용한 실시형태에서, 표적 핵산은 어레이 포맷에 존재할 수 있다. 어레이 포맷에서, 표적 핵산은 전형적으로 공간적으로 구별 가능한 방식으로 표면에 결합될 수 있다. 표적 핵산은 직접적인 공유적 부착, 비드 또는 다른 입자로의 부착 또는 표면에 부착된 중합효소 또는 다른 분자로의 결합에 의해 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(특징부로도 지칭됨)에서 표적 핵산의 단일 카피를 포함할 수 있거나 또는 동일한 서열을 갖는 다수의 카피가 각각의 부위 또는 특징부에 존재할 수 있다. 다수의 카피는 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같은 증폭 방법, 예컨대, 브릿지 증폭 또는 에멀젼 PCR에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에 언급된 방법은, 예를 들어, 적어도 약 10개의 특징부/㎠, 100개의 특징부/㎠, 500개의 특징부/㎠, 1,000개의 특징부/㎠, 5,000개의 특징부/㎠, 10,000개의 특징부/㎠, 50,000개의 특징부/㎠, 100,000개의 특징부/㎠, 1,000,000개의 특징부/㎠, 5,000,000개의 특징부/㎠, 또는 그 초과를 비롯한 다양한 밀도 중 임의의 것으로 특징부를 갖는 어레이를 사용할 수 있다.
본 명세서에 언급된 방법의 이점은, 그들이 복수의 표적 핵산의 신속하고 효율적인 검출을 동시에 제공한다는 점이다. 따라서, 본 개시내용은 해당 분야에 공지된 기법, 예컨대, 상기에 예시된 것들을 사용하여 핵산을 제조 및 검출할 수 있는 통합된 시스템을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 통합된 시스템은 증폭 시약 및/또는 서열결정 시약을 하나 이상의 고정화된 DNA 단편에 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있고, 시스템은 성분, 예컨대, 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등을 포함한다. 유동 셀은 표적 핵산의 검출을 위하여 통합된 시스템에서 구성되고/거나 사용될 수 있다. 예시적인 유동 셀은 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0111768호 및 미국 가특허 제13/273,666호에 기술되어 있다. 유동 셀에 대해서 예시된 바와 같이, 통합된 시스템의 유체 성분 중 하나 이상이 증폭 방법 및 검출 방법을 위해 사용될 수 있다. 예로서 핵산 서열결정 실시형태를 고려하여, 통합된 시스템의 유체 성분 중 하나 이상이 본 명세서에 언급된 증폭 방법을 위해 그리고 서열결정 방법, 예컨대 상기에 예시된 것들에서 서열결정 시약의 전달을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합된 시스템은 증폭 방법을 수행하고, 검출 방법을 수행하기 위한 개별 유체 시스템을 포함할 수 있다. 증폭된 핵산을 생성할 수 있고, 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합된 서열결정 시스템의 예는 비제한적으로 MiSeqTM 플랫폼(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나, 인코포레이티드) 및 미국 가특허 제13/273,666호에 기재된 디바이스를 포함한다.
본 명세서에 기재된 reDNA는 다양한 응용에서 대조군으로서 유용하다. 예를 들어, reDNA는 해당 분야에 알려져 있는 임의의 적합한 서열결정 기법을 사용하여 서열결정될 수 있다. reDNA의 조성물은 임의의 수의 알려져 있는 특징, 예컨대 알려져 있는 염색체 카피수, 알려져 있는 G/C 함량, 염색체 및/또는 게놈에 걸친 알려져 있는 서열의 분포 또는 다른 알려져 있는 특성을 가질 수 있으며, 이와 같이, 본 명세서에 제시된 조성물은 실험 조건에서의 변화를 설명하기 위하여 서열결정 방법에서 대조군으로서 사용될 수 있다. 일례로서, reDNA 라이브러리가 특정 G/C 함량을 갖는 것으로 알려져 있다면, 라이브러리를 멀티플렉스 서열결정 시행에 포함시켜, 임의의 서열결정 분석이 예상되는 G/C 함량으로부터 임의의 편차를 생성하는 지를 식별할 수 있다.
일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 라이브러리 제조 방법의 품질을 위한 대조군일 수 있다. 예를 들어, 서열결정 라이브러리의 제조는 DNA 말단 수선, A-테일링, 어댑터의 라이게이션 및/또는 증폭 단계를 포함하는 다양한 단계를 포함할 수 있다. 이들 단계 중 임의의 것이 임의의 특징, 예컨대 게놈 또는 염색체에 걸친 분포, 서열의 유형, G/C 함량, 단편의 길이 등에 대하여 편재를 생성하는 경우에, 편재는 하류 분석, 예컨대 서열결정 분석에서 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 서열결정 기기를 위한 대조군일 수 있다. 유사하게, reDNA 조성물은 어레이 기기를 위한 대조군일 수 있다. 예를 들어, 서열결정 기기 또는 어레이 기기는 세척을 위한 유체 전달, 뉴클레오타이드 혼입, 증폭, 스캐닝, 화학적 단계, 예컨대 절단 반응, 고체상 증폭, 가열/냉각, 여기 광의 생성, 형광 방출 신호의 검출, 카메라 및 스테이지의 이동 및 고체 지지체 상의 현미경 특징부의 스캐닝을 포함하는 다양한 기능을 수행할 수 있다. 이들 단계 중 임의의 것이 임의의 특징, 예컨대 게놈 또는 염색체에 걸친 분포, 서열의 유형, G/C 함량, 단편의 길이 등을 향한 편재를 생성하는 경우에, 편재는 하류 분석, 예컨대 서열결정 분석 또는 어레이 분석에서 검출될 수 있다. 기기는 편재 또는 오작동을 유발하는 임의의 과정, 조건 또는 성분을 조정하거나 보정하도록 교정될 수 있다.
일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 핵산 서열결정 검사를 위한 밸리데이션 대조군일 수 있다. 예를 들어, 서열결정-기반의 검사는 하나 이상의 유전적 이상, 예컨대 SNP 변이체, 이수성, 삽입, 결실, 반복 신장, 재배열 등을 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 서열결정-기반의 비침습적 출생전 검사를 위한 밸리데이션 대조군으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 서열결정-기반의 종양 검출 검사를 위한 밸리데이션 대조군으로서 사용된다. 검사가 희귀한 이상을 위해 개발 중인 이러한 실시형태의 일례에서, 검사의 감도 및/또는 특이성을 보장하기 위한 다수의 밸리데이션 검사를 수행하기 위하여 충분한 생물학적 시료를 수득하는 것이 어려울 수 있다. 따라서, 예를 들어, 희귀한 이상을 갖는 개체로부터 수득되는 cfDNA로부터 유래된 reDNA 조성물은, 그것이 밸리데이션 연구 동안 검사의 다수의 또는 비제한된 반복 시행을 가능하게 하기에 충분한 많은 양으로 생성될 수 있기 때문에, 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, reDNA 조성물은 서열결정-기반의 동반 진단 검사를 위한 밸리데이션 대조군으로서 사용된다. 동반 진단 검사는 개체가 치료적 처치에 대한 후보로서 개체에게 자격을 주는 유전적 특징을 갖는 지를 결정하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 동반 진단 검사는 시료 중 유전적 변이체의 존재 또는 동일성을 결정하여, 치료적 처치가 치료 요법에서 적합할지 여부를 결정한다. 이러한 실시형태에서, 진단 검사는 검사가 반복 가능하며, 요망되는 감도 및/또는 특이성을 갖는 것을 보장하기 위하여 다수회 밸리데이션시킬 필요가 있을 수 있다. 따라서, 예를 들어, 유전적 특징을 지니는 개체로부터 수득되는 cfDNA로부터 유래된 reDNA 조성물은, 그것이 밸리데이션 연구 동안 검사의 다수의 또는 비제한된 반복 시행을 가능하게 하기에 충분한 많은 양으로 생성될 수 있기 때문에, 유용할 수 있다.
예시적인 실시형태
실시형태 1. 대상체로부터 수득되는 복수의 이중-가닥 주형 핵산의 시료를 제공하는 단계;
범용 어댑터를 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션시켜, 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계로서,
복수의 어댑터-주형-어댑터 분자의 각각이 범용 어댑터에 의해 플랭킹된 주형 핵산을 포함하며,
범용 어댑터가 이중 가닥 핵산의 영역을 포함하는 단계; 및
복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하는 단계;
증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 양 말단으로부터 범용 어댑터를 제거하여, 비부착된 범용 어댑터 및 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 초래하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 2. 이중-가닥 주형 핵산이 DNA인 실시형태 1의 방법.
실시형태 3. 이중-가닥 주형 핵산이 세포 유리 DNA(cfDNA)인 실시형태 1 또는 2의 방법.
실시형태 4. 대상체가 임신한 인간이며, 이중-가닥 주형 핵산이 태아 및 모체 핵산의 혼합물을 포함하는 실시형태 1 내지 3 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 5. 시료가 cfDNA를 포함하는 실시형태 1 내지 4 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 6. 태아가 유전 질환을 포함하지 않는 실시형태 1 내지 5 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 7. 태아가 유전 질환을 포함하는 실시형태 1 내지 6 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 8. 유전 질환이 이수성인 실시형태 1 내지 7 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 9. 이수성이 삼염색체인 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 10. 삼염색체가 21번 삼염색체, 18번 삼염색체, 13번 삼염색체, 9번 삼염색체, 8번 삼염색체, 22번 삼염색체, XXX, XXY 또는 XYY인 실시형태 1 내지 9 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 11. 유전 질환이 뉴클레오타이드 서열의 과소-표현을 포함하는 실시형태 1 내지 10 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 12. 대상체가 신생물을 갖는 것으로 의심되는 실시형태 1 내지 11 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 13. 시료가 순환 종양 DNA 및 세포 유리 정상 DNA를 포함하는 실시형태 1 내지 12 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 14. 시료가 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함하는 실시형태 1 내지 13 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 15. 라이게이션시키는 단계 이전에, 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 말단을 블런트 말단이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 1 내지 14 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 16. 라이게이션시키는 단계 이전에, 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 3' 말단이 3' 오버행 구조로서 종결되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 1 내지 15 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 17. 범용 어댑터가 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 추가로 포함하며, 라이게이션시키는 단계가 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 영역을 주형 핵산의 각 말단에 공유적으로 부착시키는 실시형태 1 내지 16 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 18. 증폭시키는 단계가 지수적 증폭 반응을 포함하는 실시형태 1 내지 17 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 19. 지수적 증폭 반응이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 실시형태 1 내지 18 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 20. 증폭시키는 단계가 낮은 오차율을 갖는 DNA 중합효소를 포함하는 실시형태 1 내지 19 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 21. 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하며, 제거하는 단계가 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 제한 엔도뉴클레아제에 노출시키고, 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함하는 실시형태 1 내지 20 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 22. 제한 엔도뉴클레아제의 절단 부위 및 인식 부위가 분리된 실시형태 1 내지 21 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 23. 제한 엔도뉴클레아제가 SapI, MlyI 또는 BpuEI인 실시형태 1 내지 22 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 24. reDNA가 상기 주형의 각 말단에 범용 어댑터의 일부를 보유하는 실시형태 1 내지 23 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 25. 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머가 포획제를 포함하는 실시형태 1 내지 24 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 26. 포획제가 비오틴을 포함하는 실시형태 1 내지 25 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 27. 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하며, 제거하는 단계가 어댑터-주형-어댑터 분자를 리간드에 결합하는 화합물을 포함하는 표면과 접촉시켜 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하고, 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제에 노출시켜 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함하며, 제거된 범용 어댑터가 표면에 결합되는 실시형태 1 내지 26 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 28. 제거하는 단계가 제거된 범용 어댑터를 reDNA로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는 실시형태 1 내지 27 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 29. 분리하는 단계가 제거된 범용 어댑터 및 reDNA를 포함하는 혼합물을 리간드에 결합하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하며, 화합물이 표면에 부착되며, 제거된 범용 어댑터가 표면에 결합되는 실시형태 1 내지 28 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 30. 표면이 비드를 포함하는 실시형태 1 내지 29 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 31. 결합된 제거 범용 어댑터를 포함하는 표면을 제거하여 reDNA로부터 제거된 범용 어댑터의 분리를 초래하는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 1 내지 30 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 32. 제거하는 단계가 소정의 크기 범위 내에 속하는 reDNA의 선택을 포함하는 실시형태 1 내지 31 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 33. 대상체로부터 수득되는 시료로부터 기원하는 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 제공하는 단계로서,
각각의 reDNA가 주형인, 상기 복수의 reDNA를 제공하는 단계;
범용 어댑터를 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션시켜 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계로서,
복수의 어댑터-주형-어댑터 분자의 각각이 범용 어댑터에 의해 플랭킹된 주형 핵산을 포함하며,
범용 어댑터가 (i) 이중 가닥 핵산의 영역, 및 (ii) 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 포함하여, 그에 의해 주형의 적어도 일부의 서열을 결정하기 위한 서열결정 라이브러리를 생성하는, 방법.
실시형태 34. 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역이 적어도 하나의 범용 신장 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는 실시형태 33의 방법.
실시형태 35. 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역이 블런트 말단 구조로서 종결되는 실시형태 33 또는 34의 방법.
실시형태 36. 복수의 주형이 블런트 말단 구조를 포함하는 실시형태 33 내지 35 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 37. 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역이 3' 오버행 구조로서 종결되는 실시형태 33 내지 36 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 38. 3' 오버행 구조가 예를 들어, 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 오버행 구조를 포함하는 실시형태 33 내지 37 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 39. 3' 오버행 구조가 T 뉴클레오타이드의 오버행을 포함하는 실시형태 33 내지 38 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 40. 주형이 이중 가닥 핵산의 영역의 3' 오버행 구조에 상보성인 3' 오버행 구조를 포함하는 실시형태 33 내지 39 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 41. 복수의 증폭 부위를 포함하는 표면을 제공하는 단계로서,
증폭 부위가 유리 3' 말단을 갖는 적어도 2개의 부착된 단일 가닥 핵산 집단을 포함하는 단계, 및
증폭 부위를 포함하는 표면을 각각이 개별 어댑터-주형-어댑터 분자로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하기에 적합한 조건 하에서 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 33 내지 40 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 42. 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자의 수가 증폭 부위의 수를 초과하며, 어댑터-주형-어댑터 분자가 증폭 부위에 유체 접근할 수 있고, 증폭 부위의 각각이 몇몇의 어댑터-주형-어댑터 분자에 대한 소정의 용량을 포함하는 실시형태 33 내지 41 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 43. 접촉시키는 단계가 (i) 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 수송 속도로 증폭 부위로 수송하는 것과, (ii) 증폭 부위에 존재하는 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 증폭 속도로 증폭시키는 것을 동시에 포함하며, 평균 증폭 속도가 평균 수송 속도를 초과하는 실시형태 33 내지 42 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 44. 실시형태 1의 어댑터-주형-어댑터 분자를 포함하는 조성물로서, 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는, 조성물.
실시형태 45. 제한 엔도뉴클레아제가 SapI, MlyI 또는 BpuEI인 실시형태 44의 조성물.
실시형태 46. 인공 생물학적 유체를 추가로 포함하는, 실시형태 1의 방법에 의해 생성되는 복수의 reDNA를 포함하는, 조성물.
실시형태 47. 인공 생물학적 유체가 인공 혈장을 포함하는 실시형태 46의 조성물.
실시형태 48. 대상체가 박테리아 또는 바이러스 감염을 갖는 것으로 의심되는 실시형태 1 내지 32 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 49. 시료가 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함하는 실시형태 1 내지 32 및 48 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 50. 시료가 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함하는 실시형태 1 내지 32, 48 및 49 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 51. a. 실시형태 1의 방법을 사용하여 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 제공하는 단계;
b. 검사 시료 상에서 그리고 단계 (a)에서 수득되는 reDNA 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계;
c. reDNA를 대조군으로서 사용하여 핵산 검출 검사로부터의 결과를 분석하는 단계를 포함하는 핵산 검출 검사에서의 대조군의 사용 방법.
실시형태 52. 핵산 검출 검사가 서열결정을 포함하는 실시형태 51의 방법.
실시형태 53. 핵산 검출 검사가 마이크로어레이 분석을 포함하는 실시형태 51 또는 52의 방법.
실시형태 54. 핵산 검출 검사가 효소적 과정을 포함하는 실시형태 51 내지 53 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 55. 실시형태 1의 방법을 사용하여 수득되는 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA) 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 56. reDNA가 라이브러리 제조 방법의 품질을 위한 대조군인 실시형태 55의 방법.
실시형태 57. reDNA가 시퀀싱 기기를 위한 교정 대조군인 실시형태 55 또는 56의 방법.
실시형태 58. reDNA가 어레이 기기를 위한 교정 대조군인 실시형태 55 내지 57 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 59. reDNA가 핵산 서열결정 검사를 위한 밸리데이션 대조군인 실시형태 55 내지 58 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 60. reDNA가 서열결정-기반의 비침습적 출생전 검사를 위한 밸리데이션 대조군인 실시형태 55 내지 59 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 61. reDNA가 서열결정-기반의 종양 검출 검사를 위한 밸리데이션 대조군인 실시형태 55 내지 60 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 62. reDNA가 서열결정-기반의 동반 진단 검사를 위한 밸리데이션 대조군인 실시형태 55 내지 61 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시형태 63. 동반 진단 검사가 시료 내의 유전적 변이체의 존재 또는 동일성을 결정하여, 치료적 처치가 치료 요법에서 적합할지 여부를 결정하는 실시형태 55 내지 62 중 어느 한 실시형태의 방법.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 실시예, 물질, 양 및 절차는 본 명세서에 언급된 바와 같은 본 개시내용의 범주 및 목적에 따라 넓게 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
실시예 1
목적
본 실시예에는 인간 혈장의 사용에 대한 대안으로서 실험에서 사용될 수 있는 혈장 대조군 물질의 생성이 기재된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 과정 동안 단리되고 정제된 cfDNA 투입물(reDNA)을 수십개의 플레이트만큼의 물질을 공급하기에 충분하게 농축시켜, 긴 기간에 걸쳐 사용될 수 있는 유전적으로 유사한 cfDNA의 큰 원액을 제공한다. 또한, 사용자는 이러한 제조된 DNA의 시료를 혈장 희석액 내로 스파이킹하여, 인간 혈장에 대해 정량적으로 유사한 대체물을 생성할 수 있다. 이러한 대안적인 혈장 희석액은 cfDNA가 필요한 실험에서 인간 혈장의 질을 모방하는 데 사용될 수 있어, 인간 혈장이 필요한 더욱 중요한 실험을 위하여 인간 혈장을 남길 수 있다.
표 1에는 본 실시예에 사용되는 용어가 정의된다.
재료 및 장비
인간 혈장으로부터 추출된 cfDNA(세포-유리 DNA)와 함께 사용하기 위하여 이러한 작업흐름을 설계하였다. cfDNA는 160 내지 170 bp의 크기 중간값을 갖는 것으로 예상되었다.
사용되는 장비는 표 2에 기재되어 있다. 사용되는 참고문헌 및 표준 프로토콜은 표 3에 기재되어 있다. 사용되는 시약은 표 4에 기재되어 있다. 사용되는 프라이머는 표 5에 기재되어 있다.
주형 DNA의 증폭
시약 제조 및 취급
라이브러리를 기재된 바와 같이(미국 특허 제9,323,888호), 그러나 VeriSeq NIPT 어댑터 플레이트를 주문 제작 Y-어댑터로 대체하고, 플레이트를 PCR 믹스로 용리시켜 제조하였다.
SapI 어댑터를 표 6에 따라 희석 완충제 중에 1:100 희석하고, 와류 혼합기를 사용하여 10초 동안 혼합하였다. 주문 제작 어댑터 믹스(30 ㎕)를 에펜도르프(Eppendorf) 스커티드(Skirted) 트윈(Twin)-Tec 96 웰 플레이트로 옮겼다.
SPRI 비드를 4℃ 보관으로부터 제거하고, 로티세리(rotisserie) 상에 배치하고, 실온에서 대략 30분 동안 회전시켰다. 96-웰 풀-스커트(full-skirt) cfDNA 시료 플레이트를 4℃ 또는 -20℃ 보관으로부터 제거하고, 필요하다면 완전히 해동시키고, 와류 혼합기를 사용하여 20초 동안 혼합하고, 1000g에서 20초 동안 원심분리하였다.
향상된 PCR 믹스, 비오티닐화된 프라이머 및 재현탁 완충제를 사용한 비드 용리를 위하여 PCR 믹스를 제조하였다.
인비트로겐 쿠비트 DNA 1000 검정 키트를 위한 시약을 해동시켰다.
변형된 VeriSeq NIPT 48 라이브러리
해밀턴 스타 런(Star Run) 대조군을 개봉하고, Veriseq NIPT 방법(버전 1.4 또는 그 이후)을 제조처 지침을 사용하여 시행하였다. 액체 검출 점검 후에, 트랙 47 상의 캐리어의 위치 5에서 용리 완충제 또는 HT1을 함유하는 20 ㎖ 저장소를 제거하였다.
비드 건조 단계 이후, 및 방법에서 HT1 또는 용리 완충제가 석출되기 이전에, 트랙 19 내지 24 상에서 관찰되는 3x2 멀티플렉스 캐리어의 위치 5에서 SPRI 비드 플레이트를 제거하였다. 대안적으로, 시약을 함유하는 20 ㎖ 저장소를 제거하면, 해밀턴이 HT1 또는 용리 완충제를 석출시키지 않을 것이기 때문에, 방법이 완료되게 할 수 있다.
웰당 50 ㎕의 PCR 믹스로 비드를 용리시키기 위하여, 플레이트를 포일 밀봉재로 덮고, 와류에 의해 혼합하고, 원심분리기에서 회전 침강시키고, 최소 2분 동안 용액이 투명해질 때까지 플레이트 자석 상에 배치하였다. 상청액(50 ㎕)을 에펜도르프 풀-스커트 트윈-tec 96 웰 플레이트로 옮겼다.
PCR 증폭
시료 플레이트를 써모사이클러 상에 배치하고, EPM14 프로그램을 선택하였다. EPM 14 프로그램은 표 7에 요약되어 있다. EPM14의 완료 후에, 플레이트를 써모사이클러로부터 제거하였다. 추가의 사이클의 PCR이 존재하지 않는다면, 다음 섹션: "스트렙트아비딘 결합, 분해 및 정제"로 진행시켰다.
정량화 및 희석(2차 PCR에 대해서만)
PCR 생성물(50 ㎕)을 총 1 ㎖의 1:20 희석을 위하여 1.5 ㎖ 또는 2 ㎖ 튜브에서 950 ㎕의 재현탁 완충제(RB)와 합하였다. 용액을 와류 혼합기를 사용하여 혼합하고, 회전 침강시켰다.
쿠비트 판독기를 제조처에 의해 권고된 바와 같이 사용하였다. 쿠비트 판독을 시료당 10 ㎕의 시료 투입물을 갖는 2개의 개별 튜브를 사용하고, 생성된 판독물의 평균을 구하여 수행하였다. 60 pg/㎕로의 희석 후에, 요망되는 부피의 1:20 EPM 14 생성물을 적절한 부피의 튜브(5 ㎖, 15 ㎖ 또는 50 ㎖ 폴리프로필렌 튜브)에서 표기된 부피의 재현탁 완충제와 합하였다. 최종 희석액을 혼합하고, 회전 침강시키고, 남아 있는 1:20 희석 원액을 장래의 이용을 위하여 -20℃에서 유지하였다.
2차 PCR 증폭
EPM 14 생성물(60 pg/㎕의 25 ㎕)을 새로운 96 웰 플레이트에 첨가하였다. PCR 믹스(25 ㎕)를 총 50 ㎕의 부피를 위하여 이러한 용액에 첨가하고, 혼합하였다. 플레이트를 써모사이클러 상에 배치하고, 표 8에 요약된 EPM 13 프로그램을 선택하였다.
PCR을 행한 후에, 플레이트를 써모사이클러로부터 제거하였다. 시료 반복검증물을 적절한 크기의 튜브(5 ㎖, 15 ㎖ 또는 50 ㎖ 폴리프로필렌) 내에 풀링하고, 생물분석기 DNA 1000 칩을 시행하여, PCR 증폭을 확인하였다. 5 마이크로리터의 시료를 15 ㎕의 재현탁 완충제로 희석하여, 1:4 희석액을 생성한 후 생물분석기에서 시행하였다. 증폭된 라이브러리에 대한 피크 크기는 260 내지 270bp 가까이에 집중되었다.
산출물 및 보관
플레이트를 같은 날 나중에 사용하기 위하여 2℃ 내지 8℃에서 밀봉하고 보관하거나, 하룻밤 이상 보관하기 위하여 -20℃ 내지 -15℃ 에서 밀봉하고 보관할 수 있다.
스트렙트아비딘 결합, 분해 및 정제
시약 제조 및 취급
다이나비드 마이원(MyOne) 스트렙트아비딘 T1을 실온에서 최대 30분 동안 로티세리 상에 배치하였다. 반응은 딥-웰 플레이트 또는 적절한 부피의 폴리프로필렌 튜브에서 일어날 수 있다. 각 분해 반응을 위하여, 표 9에 따라, 충분한 분해 믹스를 생성한다. 필요한 총 반응만큼 부피를 배로 하여 충분한 믹스를 제조한다. SapI 분해 믹스를 필요할 때까지 얼음에서 또는 4℃에서 유지한다. DNA 1000 생물분석기 시약을 적어도 30분 동안 실온에서 암소에서 인큐베이션시킨다.
스트렙트아비딘 비드 세척
분해될 각 시료에 있어서, 표 10으로부터의 스트렙트아비딘 비드의 부피를 반응 용기 내로 분배하였다.
동일 부피의 1x 비드 세척액을 스트렙트아비딘 비드가 있는 각각의 튜브에 첨가하고, 혼합하였다. 1x 비드 세척액은 동일한 부피의 증류수 및 마이원 T1 비드 세척액이었다. 마이원 T1 비드 세척액을 미리 제조하고, 2℃ 내지 8℃에서 보관할 수 있다. 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA 및 2M NaCl을 합함으로써 마이원 T1 비드 세척액을 제조할 수 있다. 용액이 투명해질 때까지(최소 1분), 혼합물을 자석 상에 배치하였다. 상청액의 절반(1/2)을 제거하고, 용기를 자석에서 제거하였다. 이를 총 3회의 세척을 위하여 추가 2회 반복하였다. 세척된 비드의 용기를 자석에서 제거하였다.
제한 분해
용액이 투명해질 때까지(최소 1분) 세척된 비드가 있는 반응 용기를 자석 상에 배치하였다. 모든 상청액을 제거하여, 용기에 비드만이 남아 있게 하였다. 표 10에 나타낸 PCR 생성물의 부피를 건조된 비드에 첨가하고, 혼합하여, 비드를 재현탁화시켰다. 결합 믹스를 1500 RPM 및 20℃에서 20분 동안 에펜도르프 써모믹서(Eppendorf ThermoMixer) 상에서 혼합하였다. 용기를 잠시 회전 침강시킨 후에, 용액이 투명해질 때까지(최소 1분) 용기를 자석 상에 배치하였다. 튜브가 자석 상에 있는 동안 모든 상청액을 제거하였다. 표 10에 나타낸 분해 믹스의 부피를 용기에 첨가하고, 용기를 1500 RPM 및 37℃에서 1시간 동안 에펜도르프 써모믹서 상에 배치하였다. 인큐베이션 후에, 표 10으로부터의 적절한 부피의 EDTA를 반응 용기에 첨가하고, 혼합하고, 회전 침강시키고, 용액이 투명해질 때까지(최소 2분) 용기를 자석 상에 배치하였다.
상청액 시료(이제 reDNA로 지칭됨)를 새로운 적절한 부피의 폴리프로필렌 용기로 조심히 옮겼다. 정제된 시료 풀(시행 이전에 5 ㎕의 시료를 5 ㎕의 재현탁 완충제로 희석하여, 1:2를 생성함)을 생물분석기 DNA 하이-센스(High-Sense) 칩 상에서 시행하여, 분해를 확인하였다. cfDNA에 대한 피크 크기는 165 내지 170bp 가까이에 집중되었다. 비정상적인 생물분석기 프로파일을 갖는 시료를 재검사 및/또는 폐기하였다. QC 요건을 만족하는 동일한 시료의 분해를 적절한 부피의 폴리프로필렌 튜브 내로 풀링하였다. 장기간 보관을 위하여 시료를 -20℃에서 보관하였다.
대조군 물질의 생성
시약 제조 및 취급
해동 후에, 10 ㎕의 reDNA를 10 ㎕의 재현탁 완충제와 합함으로써 reDNA 시료의 1:2 시료 희석액의 분취액을 생성하였다. 염료의 1:200 희석액을 쿠비트 시약 및 쿠비트 완충제를 사용하여 생성하였다.
불활성화된 DNA(deDNA)의 생성
불활성화된 DNA(deDNA)는 임의의 효소 활성(라이게이션 포함)을 방지하는 5' 역위된 ddt 변형을 갖는 비-인간 170bp 서열로부터 증폭된 DNA이다.
300 ㎕의 용리 완충제와 50 ㎕의 각각의 역방향 및 정방향 프라이머(총 100 ㎕)을 조합함으로써 역위된 ddt PCR 프라이머 칵테일을 위한 프라이머 믹스를 제조하였다. 주형 DNA를 50 pg/㎕로 희석하였다. 주형은 이전에 증폭된 deDNA 또는 신선하게 주문된 인공 170bp 중 어느 하나일 수 있다. 25 마이크로리터의 기질 DNA를 25 ㎕의 역위된 ddt PCR 프라이머 칵테일과 합하고, 써모사이클러 상에 배치하고, EPM 14를 사용하여 시행하였다. 완료 후에, 모든 반응물을 풀링하였다. deDNA를 -20℃에서 보관할 수 있다.
쿠비트 정량화
reDNA 및 deDNA 시료당 2개의 개별 튜브를 사용하여 1:2 시료 희석으로, 쿠비트 판독을 수행하였으며, 하나의 튜브에는 10 ㎕(고) 시료 투입물이 존재하며, 하나의 튜브에는 5 ㎕(저) 투입물이 존재한다.
고농도 튜브의 쿠비트 측정치(ng/㎖)와 40을 곱하고, 저농도 튜브의 쿠비트 측정치(ng/㎖)와 80을 곱함으로써 최종 농도를 결정하였다. 고농도와 저농도 판독물 사이의 차이가 2가지 농도 판독물 중 더 낮은 것의 30% 초과이면, 쿠비트 정량화를 재-수행하였다. 고농도 및 저농도 판독물 최종 농도를 최종 농도(이제 pg/㎕)로서 평균을 구하였다. reDNA 원액을 -20℃ 보관으로부터 해동시킨 임의의 시간에 쿠비트 정량화를 수행하였다.
인공 혈장의 생성
생성된 각각의 900 ㎕ 인공 혈장은 50% 혈장 희석제(미국 미네소타주 블루밍턴 소재의 이뮤노케미스트리 테크놀로지즈(ImmunoChemistry Technologies)), 2 mM EDTA, 3.5 ng의 reDNA, 3.5 ng의 deDNA 및 채워질 때까지 dPBS를 함유하였다.
적절한 부피의 폴리프로필렌 용기에서, 적절한 부피의 혈장 희석제를 첨가하고, 상당한 부피가 생성되면, 교반-막대를 사용하여 혼합하였다. 적절한 부피의 용기에서, 필요한 총 dPBS를 측정하였다. 2개의 적절한 부피의 폴리프로필렌 용기(적어도 4x deDNA 및 reDNA 부피)에서: 용기를 측정된 저장소로부터의 dPBS로 50%까지 채우고, 적절한 부피의 reDNA 및 deDNA를 첨가하고(튜브당 하나), 적절한 부피의 EDTA를 reDNA 튜브에 첨가하고, 저장소로부터 남아 있는 dPBS를 혈장 희석제가 있는 믹스 용기 내로 첨가하고, 교반-막대 또는 역전을 사용하여 혼합하였다. deDNA 및 reDNA 튜브를 밀봉하고, 격렬하게 와류 혼합하였다. deDNA 튜브 내용물을 믹스 용기에 첨가하고, 5분 동안 혼합한 다음, reDNA 튜브 내용물을 믹스 용기에 첨가하고, 최소 30분 동안 혼합하였다.
인공 혈장을 정상의 인간 모체 혈장으로서 사용될 때까지 -80℃ 동결기에서의 장기간 보관을 위하여 스크루 탑(screw top) 튜브 내로 분취하였다.
실시예 2
reDNA의 특성화
이러한 검사의 목적은 reDNA 또는 reDNA 단편이 유래되는 상응하는 cfDNA 중 어느 하나에서 수행되는 비침습적 출생전 검사의 지표(metrics)를 비교하는 것이었다. reDNA를 실시예 1에 기재된 바와 같이 건강한 임신으로부터 수득되는 전혈로부터 유래된 혈장으로부터 추출된 cfDNA로부터 생성하였다. 혈액을 건강한 남성 및 여성 태아의 혼합을 포함하는 48건의 임신으로부터 수득하였다. 혈액을 적절한 동의 하에 환자로부터 수득하였다.
서열결정-기반의 비침습적 출생전 검사를 원래의 cfDNA, 및 cfDNA로부터 유래된 reDNA 상에서 수행하였다. 검사를 미국 특허 제10,095,831호에 기재된 바와 같이 수행하였으며, 이의 내용은 그의 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 검사로부터의 서열결정 지표 및 다른 NIPT 검사 지표는 단편 크기 및/또는 커버리지에 기초한 태아 분율, NIPT 검사 결과 통계학, 예를 들어, t-통계학 및 로그 우도비(LLR)를 포함하였다.
하기 표에 요약된 일차 NIPT 지표는 reDNA가 지속적으로 그리고 비례하여 일치되는 혈장 시료와 동등하였음을 나타낸다. reDNA의 임의의 편재는 재현 가능하며, 지속적이었다. 예를 들어, ChrX의 짧은 및 긴 판독물 간의 관계가 혈장 및 reDNA 시료에서 유지되었다. 결과는 reDNA가 NIPT 검사 밸리데이션을 위한 대조군으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
[표 10]
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물 및 전자적으로 이용 가능한 자료(예를 들어, GenBank 및 RefSeq에서의 뉴클레오타이드 서열 제출물, 및 예를 들어, SwissProt, PIR, PRF, PDB에서의 아미노산 서열 제출물, GenBank 및 RefSeq에서의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역물 포함)의 완전한 개시내용은 그들의 전문이 참조로 포함된다. 간행물에 언급된 보충 자료(예컨대, 보충 표, 보충 도면, 보충 자료 및 방법, 및/또는 보충 실험 데이터)는 마찬가지로 그들의 전문이 참조로 포함된다. 본 출원의 개시내용과 본 명세서에 참조로 포함된 임의의 문서의 개시내용(들) 간에 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시내용이 우선해야 한다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 단지 이해의 명확성을 위해 제공된다. 불필요한 제한은 그로부터 이해되지 않아야 한다. 본 개시내용은 나타내고 기재된 정확한 상세사항에 제한되지 않고, 당업자에게 자명한 변형이 청구범위에 의해서 정의된 본 개시내용에 포함될 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해서 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 언급된 수치 파라미터는 본 개시내용에 의해 수득하고자 하는 목적하는 특성에 따라서 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도 그리고 청구범위의 범주와 동등한 학설을 제한하려는 시도가 아니지만, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 개시내용의 넓은 범주를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 언급된 수치는 가능한 한 정확하게 기록된다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 그들의 각각의 시험 측정치에서 발견된 표준 편차에서 필연적으로 발생하는 범위를 함유한다.
모든 제목은 읽는 이의 편의를 위한 것이며, 달리 그렇게 명시되지 않는 한 제목 뒤에 오는 본문의 의미를 제한하기 위하여 사용되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ILLUMINA, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING CONTROLS FOR SEQUENCE-BASED
GENETIC TESTING
<130> IP-1602-PCT
<140> PCT/US2019/025304
<141> 2019-04-02
<150> US 62/651,453
<151> 2018-04-02
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga cttgaggtcg gatagctctt ct 42
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gtcggatagc gccactatga gcatattcgg tttacctcag attgtataat tgatgacgat 60
aaacattcac cggagaagat ctaacgtaag tatatagtta taactgaacc gttcgaacac 120
ttactccgtt tacttaatta cgccttactg tcatgcctgg ctcgtaagtt 170
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Claims (73)
- 복수의 재생된 주형 핵산(regenerated template nucleic acid: reDNA)을 제조하기 위한 방법으로서,
대상체로부터 수득되는 시료로부터 유래하는, 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 제공하는 단계;
범용 어댑터를 상기 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션(ligation)시켜, 상기 범용 어댑터에 의해 플랭킹된(flanked) 주형 핵산을 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계로서,
상기 범용 어댑터가 이중 가닥 핵산의 영역을 포함하는 단계; 및
상기 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하는 단계;
상기 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 양 말단으로부터 범용 어댑터의 적어도 일부를 제거하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 이중-가닥 주형 핵산이 DNA인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이중-가닥 주형 핵산이 세포 유리 DNA(cell free DNA: cfDNA)를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체가 임신한 인간이며, 상기 이중-가닥 주형 핵산이 태아 및 모체 핵산의 혼합물을 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 복수의 이중-가닥 주형 핵산이 cfDNA를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 태아가 유전 질환을 포함하지 않는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 태아가 유전 질환을 포함하는, 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 유전 질환이 이수성인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 이수성이 삼염색체인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 삼염색체가 21번 삼염색체, 18번 삼염색체, 13번 삼염색체, 9번 삼염색체, 8번 삼염색체, 22번 삼염색체, XXX, XXY 또는 XYY인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유전 질환이 뉴클레오타이드 서열의 과소-표현(under-representation)을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체가 신생물을 갖는 것으로 의심되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 복수의 이중-가닥 주형 핵산이 순환 종양 DNA 및 세포 유리 정상 DNA를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 이중-가닥 주형 핵산이 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 라이게이션시키는 단계 이전에, 상기 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 말단을 블런트(blunt) 말단이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 라이게이션시키는 단계 이전에, 상기 복수의 이중-가닥 주형 핵산을 처리하여, 3' 말단이 3' 오버행 구조로서 종결되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 범용 어댑터가 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 추가로 포함하며, 상기 라이게이션시키는 단계가 상기 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 영역을 상기 주형 핵산의 각 말단에 공유적으로 부착시키는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증폭시키는 단계가 지수적 증폭 반응을 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 지수적 증폭 반응이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증폭시키는 단계가 낮은 오차율을 갖는 DNA 중합효소를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하며, 상기 제거하는 단계가 상기 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 제한 엔도뉴클레아제에 노출시키고, 상기 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제의 절단 부위 및 인식 부위가 분리된 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제가 SapI, MlyI 또는 BpuEI인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 reDNA가 상기 주형의 각 말단에 상기 범용 어댑터의 일부를 보유하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 reDNA가 상기 주형의 각 말단에 상기 범용 어댑터의 일부를 보유하지 않는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 범용 프라이머 및 상기 제2 범용 프라이머가 포획제(capture agent)를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 포획제가 비오틴을 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하며, 상기 제거하는 단계가 상기 어댑터-주형-어댑터 분자를 상기 포획제에 결합하는 화합물을 포함하는 표면과 접촉시켜, 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 초래하고, 상기 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 상기 결합된 증폭 어댑터-주형-어댑터 분자를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제에 노출시켜 제거된 범용 어댑터 및 복수의 reDNA를 초래하는 것을 포함하며, 상기 제거된 범용 어댑터가 상기 표면에 결합되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제거하는 단계가 상기 제거된 범용 어댑터를 상기 reDNA로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 분리하는 단계가 상기 제거된 범용 어댑터 및 상기 reDNA를 포함하는 혼합물을 상기 포획제에 결합하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 화합물이 표면에 부착되며, 상기 제거된 범용 어댑터가 상기 표면에 결합되는, 방법.
- 제28항 또는 제30항에 있어서, 상기 표면이 비드를 포함하는, 방법.
- 제28항 또는 제30항에 있어서, 상기 결합된 제거 범용 어댑터를 포함하는 표면을 제거하여 상기 reDNA로부터 상기 제거된 범용 어댑터의 분리를 초래하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제거하는 단계가 소정의 크기 범위 내에 속하는 reDNA의 선택을 포함하는, 방법.
- 서열결정 라이브러리를 제조하기 위한 방법으로서,
대상체로부터 수득되는 시료로부터 기원하는 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 제공하는 단계로서, 각각의 reDNA가 주형인, 상기 복수의 reDNA를 제공하는 단계;
범용 어댑터에 의해 플랭킹된 주형 핵산을 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하기 위해 범용 어댑터를 상기 주형 핵산의 양 말단에 라이게이션시키며, 여기서, 상기 범용 어댑터가 (i) 이중 가닥 핵산의 영역, 및 (ii) 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역을 포함하고,
그에 의해 주형의 적어도 일부의 서열을 결정하기 위한 서열결정 라이브러리(sequencing library)를 생성하는 단계를 포함하되, 상기 reDNA는 제1항에 따른 방법에 의해 제공되는, 방법. - 제34항에 있어서, 상기 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역이 적어도 하나의 범용 신장 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역이 블런트 말단 구조로서 종결되는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 복수의 주형이 블런트 말단 구조를 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 단일-가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역에 대하여 원위인 이중 가닥 핵산의 영역이 3' 오버행 구조로서 종결되는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 3' 오버행 구조가 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 오버행 구조를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 3' 오버행 구조가 T 뉴클레오타이드의 오버행을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 주형이 상기 이중 가닥 핵산의 영역의 3' 오버행 구조에 상보성인 3' 오버행 구조를 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서,
복수의 증폭 부위를 포함하는 표면을 제공하는 단계로서,
상기 증폭 부위가 유리 3' 말단을 갖는 적어도 2개의 부착된 단일 가닥 핵산 집단을 포함하는 단계, 및
상기 증폭 부위를 포함하는 표면을 각각이 개별 어댑터-주형-어댑터 분자로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하기에 적합한 조건 하에서 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제42항에 있어서, 상기 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자의 수가 상기 증폭 부위의 수를 초과하며, 상기 어댑터-주형-어댑터 분자가 상기 증폭 부위에 유체 접근할 수 있고, 상기 증폭 부위의 각각이 몇몇의 어댑터-주형-어댑터 분자에 대한 소정의 용량을 포함하는, 방법.
- 제42항에 있어서, 접촉시키는 단계가 (i) 상기 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 수송 속도로 상기 증폭 부위로 수송하는 것과, (ii) 상기 증폭 부위에 존재하는 상기 어댑터-주형-어댑터 분자를 평균 증폭 속도로 증폭시키는 것을 동시에 포함하며, 상기 평균 증폭 속도가 평균 수송 속도를 초과하는, 방법.
- 제1항의 어댑터-주형-어댑터 분자를 포함하는 조성물로서, 상기 범용 어댑터가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, 상기 제한 엔도뉴클레아제가 SapI, MlyI 또는 BpuEI인, 조성물.
- 제1항의 방법에 의해 생성되는 복수의 reDNA를 포함하는 조성물로서, 인공 생물학적 유체를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제47항에 있어서, 상기 인공 생물학적 유체가 인공 혈장을 포함하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체가 병원체 감염을 갖는 것으로 의심되는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 병원체가 박테리아 병원체 또는 바이러스 병원체인, 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 시료가 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함하는, 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 시료가 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함하는, 방법.
- 핵산 검출 검사에서의 대조군의 사용 방법으로서,
a. 제1항의 방법을 사용하여 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 제공하는 단계;
b. 검사 시료 상에서 그리고 단계 (a)에서 수득되는 reDNA 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계;
c. 상기 reDNA를 대조군으로서 사용하여 상기 핵산 검출 검사로부터의 결과를 분석하는 단계
를 포함하는, 핵산 검출 검사에서의 대조군의 사용 방법. - 제53항에 있어서, 상기 핵산 검출 검사가 서열결정을 포함하는, 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 핵산 검출 검사가 마이크로어레이 분석을 포함하는, 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 핵산 검출 검사가 효소적 과정을 포함하는, 방법.
- 제1항의 방법을 사용하여 수득되는 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA) 상에서 핵산 검출 검사를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 reDNA가 라이브러리 제조 방법의 품질을 위한 대조군인, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 reDNA가 시퀀싱 기기를 위한 교정 대조군인, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 reDNA가 어레이 기기를 위한 교정 대조군인, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 reDNA가 핵산 서열결정 검사를 위한 밸리데이션(validation) 대조군인, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 reDNA가 서열결정-기반의 비침습적 출생전 검사를 위한 밸리데이션 대조군인, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 reDNA가 서열결정-기반의 종양 검출 검사를 위한 밸리데이션 대조군인, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 reDNA가 서열결정-기반의 동반 진단 검사를 위한 밸리데이션 대조군인, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 동반 진단 검사가 시료 내의 유전적 변이체의 존재 또는 동일성을 결정하여, 치료적 처치가 치료 요법에서 적합할지 여부를 결정하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 유전 질환이 뉴클레오타이드 서열의 과소-표현(under-representation)을 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 대상체가 병원체 감염이 의심되는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 병원체가 박테리아 병원체 또는 바이러스 병원체인, 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 시료가 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 시료가 혈액, 소변, 가래 또는 대변을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 reDNA가 상기 시료에서 관찰된 크기와 유사하거나 동일한 크기의 주형 분자 집단을 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 각각의 reDNA가 상기 대상체로부터 얻은 시료에서 관찰된 크기와 유사하거나 동일한 크기의 주형 분자 집단을 포함하는 증폭된 주형인 방법.
- 하기를 포함하는 방법:
대상체로부터 얻은 시료로부터 유래하는 복수의 이중 가닥 주형 핵산을 제공하는 단계로서, 선택적으로 상기 대상체는 임신한 인간이고, 상기 이중 가닥 주형 핵산은 태아 및 모체 핵산의 혼합물을 포함하는, 상기 단계;
범용 어댑터를 상기 주형 핵산의 양 말단에 결찰하여 상기 범용 어댑터에 의해 플랭킹된 주형 핵산을 포함하는 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 형성하는 단계로서, 상기 범용 어댑터는 이중 가닥 핵산 영역을 포함하는, 상기 단계;
지수 증폭 반응(예: 중합효소 연쇄 반응(PCR)) 등에 의해 상기 복수의 어댑터-주형-어댑터 분자를 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머로 증폭하여 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자를 생성하는 단계;
상기 증폭된 어댑터-주형-어댑터 분자의 양 말단으로부터 상기 범용 어댑터의 적어도 일부를 제거하여, 제거된 범용 어댑터 및 복수의 재생된 주형 핵산(reDNA)을 생성하는 단계로서, 여기서 상기 reDNA는 상기 대상체의 시료에서 발견된 크기 분포와 유사하거나 동일한 크기 분포를 가지는 주형 분자 집단을 포함하는, 상기 단계.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20210630 Patent event code: PE09021S01D |
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