KR102203056B1

KR102203056B1 - 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화

Info

Publication number: KR102203056B1
Application number: KR1020207007316A
Authority: KR
Inventors: 알리레자 레자니아
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2021-01-14
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: US12215354B2; KR20200030133A; US9388386B2; US10358628B2; AR089426A1; KR102090751B1; BR112014015417A8; JP2023025204A; US20190292523A1; JP7702929B2; AU2021221411A1; CA2860107C; RU2705001C2; AU2021221411B2; US11377640B2; JP6441080B2; JP2021052789A; RU2668798C2; AU2012355698B2; US20150353895A1

Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 집단 내의 세포 중 10% 초과가 단일 호르몬 췌장 베타 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS INTO SINGLE HORMONAL INSULIN POSITIVE CELLS}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 가특허 출원 제61/579,351호 (출원일: 2011년 12월 22일)의 이익을 주장한다.

본 발명은 세포 분화 분야이다. 더 구체적으로, 본 발명은 단계식 분화의 각각의 단계에서 규정 조건을 이용하여 만능 줄기 세포로부터 분화된 단일 인슐린 호르몬 생성 세포를 제공한다. 집단 중의 분화된 인슐린 생성 세포 중 10% 초과는 단일 호르몬 췌장 베타 세포의 특징적인 마커를 발현한다.

제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.

척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 시기를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 시기는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.

낭배형성 마지막까지, 내배엽은 내배엽의 전방, 중간 및 후방 영역을 독특하게 표시하는 인자들의 패널의 발현에 의해 인식될 수 있는 전방-후방 도메인(anterior-posterior domain)으로 나누어진다. 예를 들어, Hhex, 및 Sox2는 전방 영역을 확인해 주는 반면, Cdx1, 2, 및 4는 후방의 절반의 내배엽을 확인해 준다.

내배엽 조직의 이주는, 내배엽이 상이한 중배엽 조직들과 아주 근접해지게 하며 이는 장관의 국지화를 돕는다. 이는 많은 분비형 인자들, 예를 들어 FGF, Wnt, TGF-B, 레틴산 (RA), 및 BMP 리간드(ligand) 및 그 길항제에 의해 달성된다. 예를 들어, FGF4 및 BMP는 추정 후장 내배엽에서의 Cdx2 발현을 촉진하며 후방 유전자 Hhex 및 SOX2의 발현을 억제한다 (문헌[Development 2000, 127:1563―1567]). 또한 WNT 신호전달(signaling)은 후장 발생을 촉진하고 전장 운명을 저해하도록 FGF 신호전달과 병행하여 작동하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Development 2007, 134:2207―2217]). 마지막으로, 중간엽에 의해 분비된 레틴산은 전장-후장 경계부를 조절한다 (문헌[Curr Biol 2002, 12:1215―1220]).

특정 전사 인자들의 발현 수준을 이용하여 조직의 아이덴티티(identity)를 표기할 수 있다. 완성 내배엽의 원시 장관으로의 형질전환 동안, 장관은 제한된 유전자 발현 패턴에 의해 분자 수준에서 관찰될 수 있는 넓은 도메인들 내로 국지화되게 된다. 예를 들어, 장관 내의 국지화된 췌장 도메인은 PDX-1의 매우 높은 발현 및 CDX2 및 SOX2의 매우 낮은 발현을 나타낸다. 이와 유사하게, 높은 수준의 Foxe1의 존재는 식도 조직을 나타내며; NKX2.1은 폐 조직에서 고도로 발현되며; SOX2/Odd1 (OSR1)은 위 조직에서 고도로 발현되며; PROX1/Hhex/AFP의 발현은 간 조직에서 높으며; SOX17은 담도 구조 조직에서 고도로 발현되며; PDX1, NKX6.1/PTf1a, 및 NKX2.2는 췌장 조직에서 고도로 발현되며; CDX2의 발현은 장 조직에서 높다. 상기 요약은 문헌[Dev Dyn 2009, 238:29―42] 및 문헌[Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251]으로부터 수정된다.

췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화에서 일어난다 (문헌[Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251]; 문헌[Dev Dyn 2009, 238:29-42]). 배측(dorsal) 및 복측(ventra) 췌장 도메인은 전장 상피에서 생긴다. 또한 전장은 식도, 기관, 폐, 갑상선, 위, 간, 췌장 및 담관계가 생기게 한다.

췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자 PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(bud) 및 배측 원기의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, PDX1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 표시한다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.

드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541]; 미국 특허 제7,704,738호). 생쥐의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 내배엽 조직의 특성을 갖는 더욱 성숙한 세포로 분화되었다 (미국 특허 제7,704,738호). 인간 배아 줄기 세포-유래된 완성 내배엽 세포는 FGF-10 및 레틴산의 첨가 후에 PDX1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 공개 제2005/0266554A1호). 면역 결함 생쥐의 신장 피막 하에 이들 췌장 전구 세포를 후속적으로 이식하면 3 내지 4개월의 성숙기 이후에 기능성 췌장 내분비 세포가 형성되었다 (미국 특허 제7,993,920호 및 미국 특허 제7,534,608호).

피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터의 췌도 세포의 생성 시스템을 보고한다 (미국 특허 제7,033,831호). 이 경우에, 분화 경로를 세 시기로 나누었다. 먼저 인간 배아 줄기 세포를 부티르산나트륨과 액티빈 A의 배합물을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다 (미국 특허 제7,326,572호). 이어서 당해 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 배합된 노긴(Noggin)과 같은 BMP 길항제를 이용하여 배양하여 PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.

또한 소분자형 저해제(inhibitor)는 췌장 내분비 전구 세포의 유도에 사용되었다. 예를 들어, TGF-B 수용체 및 BMP 수용체들의 소분자형 저해제 (문헌[Development 2011, 138:861-871]; 문헌[Diabetes 2011, 60:239-247])가 췌장 내분비 세포의 수를 유의하게 향상시키기 위하여 사용되었다. 게다가, 소분자형 활성화제가 완성 내배엽 세포 또는 췌장 전구 세포의 생성에 또한 사용되었다 (문헌[Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732]; 문헌[Nature Chem Biol 2009, 5:258-265]).

인간 배아 줄기 세포로부터 췌장 전구 세포를 유도하려는 이전의 시도는 췌장 내배엽의 올바른 확인에 있어서의 PDX-1 및 NKX6.1의 동시 발현의 중요성을 강조하였다. 그러나, 본 기술 분야에서 PDX-1 및 NKX6.1의 발현에 있어서 양성인 세포 집단은 CDX2 발현이 낮거나 또는 부재함이 확인된 반면, 이전의 보고들은 발생 중인 췌장 바로 전방에서의 마커들의 존재에 대하여 시험하지 못하였다. 전방 내배엽을 표시하는 SOX2는 성인 췌도에서 발현되지 않으며, 발생 중인 췌장에서 매우 낮은 수준으로 발현된다 (문헌[Diabetes 2005, 54:3402-4309]). 이와는 대조적으로, 이 출원의 실시예들 중 일부에서는 인간 배아 줄기 세포로부터 생성된 췌장 내배엽 세포 중 30% 이상이 PDX-1 및 NKX6.1의 발현에 대하여 양성이고 CDX2 및 SOX2의 발현에 대하여 음성인 세포 집단이 개시되어 있다.

기능성 췌장 베타 세포를 생성하려는 이전의 시도들 전부는 성숙 베타 세포의 특성을 갖는 세포의 획득에 미치지 못하였다. 성숙 베타 세포의 특질은 단일 인슐린 호르몬의 발현, 프로인슐린의 인슐린 및 C-펩티드로의 올바른 프로세싱(processing), PDX-1 및 NKX6.1의 강한 발현, 글루코스에 응답한 적절한 인슐린 방출, 글루코스 수송체의 발현, 및 글루코키나아제(glucokinase)의 높은 발현을 포함한다. 이전의 보고들 전부는 췌장 호르몬들 중 2가지 이상을 생성하는 내분비 세포로 이어졌다. 예를 들어, 드'아무르 등 (문헌[Nature Biotech 2006, 24:1392-1401])은 시냅토파이신(synaptophysin)에 의해 측정할 때 대략 10%의 인슐린 양성 세포 및 대략 20%의 내분비 세포를 포함하는 세포 집단의 생성을 보고하고 있다. 다른 이들 (문헌[Cell Res 2009, 19:429-438]; 문헌[Stem Cells 2007, 25:1940-1953]; 문헌[Diabetes Obes Metab 2008, 10:186-194])에 의한 유사한 보고도 만능 세포의 비기능성 인슐린 양성 세포로의 분화를 보여 주었다. 실제, 최근의 연구에 의하면, 중증 복합 면역 결핍(Severe Combined ImmunoDeficiency; SCID) 생쥐의 폴리호르몬 세포(polyhormonal cell)의 이식이 기능성 베타 세포의 생성으로 이어지지 않았음이 명백하게 확립되었다 (문헌[Diabetes 2011, 60:239-247]; 문헌[Nature Biotech 2011, 29:750-756]). 인간 태아 췌장에서 소정 분율 (대략 10 내지 20%)의 내분비 세포는 폴리호르몬 세포인 반면; 폴리호르몬 세포는 성인 췌장에서는 사라진다 (문헌[Histochem Cell Biol 1999, 112:147-153]; 문헌[J Histochem Cytochem 2009, 57:811-824]).

급증하고 있는 재생 의약 분야가 계속하여 성숙됨에 따라, 최종 분화된, 적절하게 조절된 췌장 내분비 세포의 형성 방법이 고도로 바람직하다. 본 발명에서 본 출원인은, 배양 조건의 적절한 그리고 규정된 조작에 의해, 그리고 다양한 경로의 활성화제/저해제의 정확한 첨가 타이밍(timing)에 의해, 인간 배아 줄기 세포가 시험관 내에서(in vitro) 기능성 췌장 베타 세포로 분화될 수 있음을 입증한다. 특히, 레틴산의 구배를 비타민 C의 사용과 함께 이용한 정확한 BMP 저해 타이밍은 단일 호르몬 췌장 내분비 세포의 생성에 있어서 효과적인 것으로 입증되었다.

본 발명은 만능 세포의 단계식 분화에 의해 시험관 내에서 수득된 췌장 내배엽 계통의 세포 집단을 제공한다. 각각의 분화 단계에서 사용되는 배지에는 글루코스가 보충된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 분화 단계에서 세포는 5 mM 내지 20 mM의 글루코스를 포함하는 배지에서 배양된다.

일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포의 분화는, 분화된 집단 중의 세포들 중 10% 초과가 단일 호르몬 췌장 베타 세포의 특징적인 마커를 발현하는 췌장 내배엽 세포 집단을 생성한다.

일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포의 분화는 분화된 집단의 30% 초과가 CDX2 및 SOX2의 발현에 대하여 음성이면서 PDX-1 및 NKX6.1의 발현에 대해서는 양성인 췌장 내배엽 세포 집단을 생성한다.

일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 TGF-B 리간드가 추가로 보충된 배지에서 미분화 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 WNT 활성화제가 추가로 보충된 배지에서 미분화 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 FGF 리간드가 추가로 보충된 배지에서 완성 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 shh 저해제, FGF 리간드, PKC 활성화제, TGF-B 리간드, 레티노이드 및 구배형의 BMP 저해제가 추가로 보충된 배지에서 장관 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 PKC 활성화제, shh 저해제, 레티노이드 및 BMP 저해제가 추가로 보충된 배지에서 후방 전장 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화는 아스코르브산이 추가로 보충된 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 만능 세포를 췌장 내배엽 계통 세포 집단으로 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법을 제공하며, 이는 5 mM 내지 20 mM의 글루코스를 포함하는 배지에서 각각의 분화 단계의 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 TGF-B 리간드 및 WNT 활성화제가 보충된 배지에서 만능 세포를 배양함으로써 만능 세포를 완성 내배엽 (DE) 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 FGF 리간드가 보충된 배지에서 DE 세포를 배양함으로써 DE 세포를 장관 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 shh 저해제, FGF 리간드, PKC 활성화제, TGF-B 리간드, 레티노이드 및 BMP 저해제가 보충된 배지에서 장관 세포를 배양함으로써 장관 세포를 후방 전장 내배엽(posterior foregut endoderm) 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 shh 저해제, FGF 리간드, PKC 활성화제, TGF-B 리간드, 레티노이드 및 BMP 저해제가 보충된 배지에서 장관 세포를 배양함으로써 장관 세포를 후방 전장 내배엽 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 PKC 활성화제, shh 저해제, 레티노이드 및 BMP 저해제가 보충된 배지에서 후방 전장 내배엽 세포를 배양함으로써 후방 전장 내배엽 세포를 췌장 전장 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 shh 저해제, TGF-B 저해제, 및 레티노이드가 보충된 배지에서 췌장 전장 세포를 배양함으로써 췌장 전장 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법은 췌장 내배엽 세포를 췌장 베타 세포 집단으로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다.

소정 실시 형태에서, 만능 세포를 단계식으로 분화시키는 시험관 내 방법의 하나 이상의 단계에서 배지에는 아스코르브산이 추가로 보충된다. 일부 실시 형태에서, 분화된 집단 중의 세포의 10% 초과는 단일 인슐린 호르몬 양성 세포이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 배양 중 췌장 내배엽 세포의 30% 초과는 PDX-1+, NKX6.1+, SOX2-, 및 CDX2-이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 베타 세포로 분화시키는 시험관 내 방법에 관한 것이며, 이는 a) 글루코스, TGF-B 리간드 및 WNT 활성화제가 보충된 배지에서 미분화 인간 배아 줄기 세포를 배양하여 완성 내배엽(DE) 세포 집단을 생성하는 단계; b) 글루코스 및 FGF 리간드가 보충된 배지에서 상기 DE 세포를 배양하여 장관 세포 집단을 생성하는 단계; c) 글루코스, shh 저해제, FGF 리간드, PKC 활성화제, TGF-B 리간드, 레티노이드 및 구배형의 BMP 저해제가 보충된 배지에서 상기 장관 세포를 배양하여 PDX-1 및 SOX2를 발현하는 후방 전장 내배엽 세포 집단을 생성하는 단계; d) 글루코스, PKC 활성화제, shh 저해제, 레티노이드 및 BMP 저해제가 보충된 배지에서 상기 후방 전장 세포를 배양하여, PDX-1 및 NKX6.1을 발현하고 상기 후방 전장 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 SOX2를 발현하는 췌장 전장 세포 집단을 생성하는 단계; e) 글루코스, shh 저해제, TGF-B 저해제 및 레티노이드가 보충된 배지에서 상기 췌장 전장 세포를 배양하여, PDX-1과, 상기 췌장 전장 세포와 비교하여 더 높은 수준의 NKX6.1 및 더 낮은 수준의 SOX2를 발현하는 췌장 내배엽 세포 집단을 수득하는 단계; 및 f) 상기 췌장 내배엽 세포를 췌장 베타 세포 집단으로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 베타 세포 집단은 PDX-1 +, NKX6.1+, SOX2-, 및 CDX2-이다. 일부 실시 형태에서, 단계식 분화 방법의 하나 이상의 단계에서의 배지에는 아스코르브산이 추가로 보충된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 췌장 베타 세포는 단일 인슐린 호르몬-생성 세포이며 이는 또한 NKX6.1+ 및 PDX-1+이다.

<도 1a 내지 도 1g>
도 1a 내지 도 1g는 실시예 1에 따라 분화된 세포의 S3 2일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 1a: 아이소타입(isotype) 대조군; 도 1b: 크로모그라닌(chromogranin); 도 1c: KI-67; 도 1d: NKX6.1; 도 1e: SOX2; 도 1f: CDX2; 도 1g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 2a 내지 도 2g>
도 2a 내지 도 2g는 실시예 1에 따라 분화되고 S4 2일에 수확된 세포에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로파일을 나타낸다: 도 2a: 아이소타입 대조군; 도 2b: 크로모그라닌; 도 2c: KI-67; 도 2d: NKX6.1; 도 2e: SOX2; 도 2f: CDX2; 도 2g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 3a 내지 도 3g>
도 3a 내지 도 3g는 실시예 1에 따라 분화되고 S5 2일에 수확된 세포에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다: 도 3a: 아이소타입 대조군; 도 3b: 크로모그라닌; 도 3c: KI-67; 도 3d: NKX6.1; 도 3e: SOX2; 도 3f: CDX2; 도 3g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 4a 내지 도 4g>
도 4a 내지 도 4g는 실시예 1에 따라 분화되고 S5 7일에 수확된 세포의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다: 도 4a: 아이소타입 대조군; 도 4b: 크로모그라닌; 도 4c: KI-67; 도 4d: NKX6.1; 도 4e: SOX2; 도 4f: CDX2; 도 4g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 5a 내지 도 5c>
도 5a 내지 도 5c는 실시예 1에 따라 분화되고 S5 2일에 수확된 세포에서 수확된 세포에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 도시한다: 도 5a: 크로모그라닌 (y축) 및 CDX2 (x축); 도 5b: 크로모그라닌 (y축) 및 SOX2 (x축); 도 5c: 크로모그라닌 (y축) 및 NKX6.1 (x축). 각각의 그래프에 있어서의 동시 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 6a 내지 도 6t>
도 6a 내지 도 6t는 실시예 1에 따라 분화되고 S2, S3, S4, 및 S5에서 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 6a: CDX2; 도 6b: CD142; 도 6c: FOXE1; 도 6d: HNF4-알파; 도 6e: NKX2.1; 도 6f: NKX2.2; 도 6g: NKX6.1; 도 6h: OSR1; 도 6i: PDX-1; 도 6j: PROX1; 도 6k: PTF1a; 도 6l: SOX17; 도 6m: SOX2; 도 6n: 인슐린; 도 6o: ZIC1; 도 6p: 크로모그라닌; 도 6q: 글루카곤; 도 6r: Ngn3; 도 6s: 뉴로D(NeuroD); 도 6t: 소마토스타틴(somatostatin).
<도 7a 내지 도 7g>
도 7a 내지 도 7g는 실시예 2에 따라 분화되고 S2, S3 또는 S4의 3일에 수확된 H1 세포주의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 7a: NKX6.1; 도 7b: PDX-1; 도 7c: 크로모그라닌; 도 7d: NGN3; 도 7e: CDX2; 도 7f: 알부민; 도 7g: SOX2.
<도 8a 내지 도 8g>
도 8a 내지 도 8g는 실시예 3에 따라 분화되고 S2, S3, S4 또는 S5에서 수확된 H1 세포에서의 하기 마커들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 8a: NKX6.1; 도 8b: PDX-1; 도 8c: NGN3; 도 8d: 뉴로D; 도 8e: 크로모그라닌; 도 8f: CDX2; 도 8g: SOX2.
<도 9a 내지 도 9h>
도 9a 내지 도 9h는 실시예 4에 따라 분화되고 S3 및 S4의 4일에 수확된 H1 세포에서의 하기 마커들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 9a: NKX6.1; 도 9b: PDX-1; 도 9c: 크로모그라닌; 도 9d: NGN3; 도 9e: 뉴로D; 도 9f: CDX2; 도 9g: 알부민; 도 9h: SOX2.
<도 10a 내지 도 10h>
도 10a 내지 도 10h는 실시예 5에 따라 분화되고 제4기에서 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 10a: NKX6.1; 도 10b: PDX-1; 도 10c: 크로모그라닌; 도 10d: NGN3; 도 10e: 뉴로D; 도 10f: CDX2; 도 10g: 알부민; 도 10h: SOX2.
<도 11a 내지 도 11h>
도 11a 내지 도 11h는 실시예 6에 따라 분화되고 S3 또는 S6의 3일에 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 11a: NKX6.1; 도 11b: PDX-1; 도 11c: 크로모그라닌; 도 11d: NGN3; 도 11e: 뉴로D; 도 11f: CDX2; 도 11g: 알부민; 도 11h: SOX2.
<도 12a 내지 도 12g>
도 12a 내지 도 12g는 실시예 7에 따라 분화되고 S3, S4, 또는 S5의 3일에 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 12a: NKX6.1; 도 12b: PDX-1; 도 12c: 크로모그라닌; 도 12d: NGN3; 도 12e: 뉴로D; 도 12f: CDX2; 도 12g: SOX2.
<도 13a 내지 도 13g>
도 13a 내지 도 13g는 실시예 8에 따라 분화되고 S3, S4, S5, 또는 S6에서 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 13a: NKX6.1; 도 13b: PDX-1; 도 13c: 크로모그라닌; 도 13d: NGN3; 도 13e: 뉴로D; 도 13f: CDX2; 도 13g: SOX2.
<도 14a 내지 도 14h>
도 14a 내지 도 14h는 실시예 9에 따라 분화된 세포의 S3 4일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 14a: 아이소타입 대조군; 도 14b: 크로모그라닌; 도 14c: KI-67; 도 14d: NKX6.1; 도 14e: SOX2; 도 14f: HNF3B; 도 14g: CDX2; 도 14h: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 15a 내지 도 15g>
도 15a 내지 도 15g는 실시예 9에 따라 분화된 세포의 S4 2일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 15a: 아이소타입 대조군; 도 15b: NKX6.1; 도 15c: KI-67; 도 15d: 크로모그라닌; 도 15e: SOX2; 도 15f: CDX2; 도 15g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 16a 내지 도 16f>
도 16a 내지 도 16f는 실시예 9에 따라 분화된 세포의 S4 4일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 16a: 아이소타입 대조군; 도 16b: NKX6.1; 도 16c: 크로모그라닌; 도 16d: SOX2; 도 16e: CDX2; 도 16f: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 17a 내지 도 17j>
도 17a 내지 도 17j는 실시예 9에 따라 분화되고 S1D3, S2D3, S3D4, S4D2, 및 S4D4에 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 17a: CDX2; 도 17b: HHex; 도 17c: FOXE1; 도 17d: IPF1 (PDX-1); 도 17e: NKX2.1; 도 17f: NKX2.2; 도 17g: NKX6.1; 도 17h: PROX1; 도 17i: SOX2; 도 17j: SOX9.
<도 18a 내지 도 18g>
도 18a 내지 도 18g는 실시예 10에 따라 분화된 세포의 S3 3일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 18a: 아이소타입 대조군; 도 18b: NKX6.1; 도 18c: 크로모그라닌; 도 18d: SOX2; 도 18e: CDX2; 도 18f: KI-67; 도 18g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 19a 내지 도 19g>
도 19a 내지 도 19g는 실시예 10에 따라 분화된 세포의 S4 5일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 19a: 아이소타입 대조군; 도 19b: NKX6.1; 도 19c: 크로모그라닌; 도 19d: SOX2; 도 19e: CDX2; 도 19f: KI-67; 도 19g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.
<도 20a 내지 도 20j>
도 20a 내지 도 20j는 실시예 11에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 도 20a: 소마토스타틴; 도 20b: PDX1; 도 20c: Pax6; 도 20d: Pax4; 도 e: NKX6.1; 도 20f: NGN3; 도 20g: 글루카곤; 도 20h: 뉴로D; 도 20i: 인슐린; 도 20j: 크로모그라닌.
<도 21a 내지 도 21j>
도 21a 내지 도 21j는 실시예 12에 따라 분화되고 S4 2일, S5 2일 및 S5 9일에 수확된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 21a: 소마토스타틴; 도 21b: PDX1; 도 21c: Pax6; 도 21d: Pax4; 도 21e: NKX6.1; 도 21f: NGN3; 도 21g: 뉴로D; 도 21h: 인슐린; 도 21i: 글루카곤; 도 21j: 크로모그라닌.
<도 22a 내지 도 22l>
도 22a 내지 도 22l은 실시예 13에 따라 분화되고 S5 3일에 수확된 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 22a: Pax4; 도 22b: Pax6; 도 22c: PDX1; 도 22d: PTF1a; 도 22e: 글루카곤; 도 22f: 인슐린; 도 22g: 뉴로D; 도 22h: ngn3; 도 22i: Zic1; 도 22j: CDX2; 도 22k: 알부민; 도 22l: NKX6.1.

개시 내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특색, 실시 형태 또는 출원을 기재 또는 예시하는 하기 하위부문(subsection)으로 나누어진다.

정의

줄기 세포는 단일 세포 수준에서 그의 자기-재생 및 분화 능력 둘 모두에 의해 규정되는 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 자기-재생 선구체, 비-재생 선구체, 및 최종 분화된 세포를 포함하는 자손 세포를 생성할 수 있다. 또한 줄기 세포는 시험관 내에서 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한 줄기 세포는 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며, 배반포 내로의 주입 이후, 비록 전부는 아니더라도, 사실상 대부분의 조직에 기여한다.

줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 선구체 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.

분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화-유도된 세포는 세포 계통 내에서 더욱 특화된 (결정된(committed)) 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화"(de-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출될 때 특정 마커에 "대하여 양성"이거나 또는 "양성"이다. 이와 유사하게, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출되지 않을 때 특정 마커에 "대하여 음성"이거나 또는 "음성"이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제1기" 및 "S1"은 완성 내배엽(DE)의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, CXCR4, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "장관"은 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는, 완성 내배엽으로부터 유래된 세포를 말한다: HNF3-베타, HNF1-베타, 또는 HNF4-알파. 장관 세포는 모든 내배엽 기관, 예를 들어 폐, 간, 췌장, 위 및 장이 생기게 할 수 있다.

원시 장관의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인해 주는 "제2기" 및 "S2"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

"전장 내배엽"은 식도, 폐, 위, 간, 췌장, 담낭, 및 일부분의 십이지장이 생기게 하는 내배엽 세포를 말한다.

"후방 전장"은 후방 위, 췌장, 간, 및 일부분의 십이지장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.

"중장 내배엽"(Mid-gut endoderm)은 장들, 십이지장, 맹장 및 상행 결장의 부분들이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.

"후장 내배엽"은 원위 1/3의 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장 및 직장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.

"제3기" 및 "S3" 둘 모두는 전장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2, 및 HNF4 알파.

췌장 전장 전구체의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하기 위하여 "제4기" 및 "S4"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "췌장 전장 전구체 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 및 HNF4 알파.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제5기" 및 "S5"는 췌장 내배엽 및 췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 CDX2 또는 SOX2를 사실상 발현하지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제6기" 및 "S6"은 췌장 내분비 세포가 풍부한 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬들 중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린(ghrelin), 및 췌장 폴리펩티드.

"췌장 내분비 전구 세포" 또는 "췌장 내분비 선구 세포"는 췌장 호르몬 발현 세포가 될 수 있는 췌장 내배엽 세포를 말한다. 이러한 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현할 수 있다: NGN3, NKX2.2, 뉴로D, ISL-1, Pax4, Pax6, 또는 ARX.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 췌장 베타 세포"는 글루코스 응답성일 수 있고 PDX-1 및 NKX6.1에 대하여 양성일 수 있는 단일 인슐린 호르몬 양성 세포를 말한다.

"d1", "d 1", 및 "1일"; "d2", "d 2", 및 "2일"; "d3", "d 3", 및 "3일" 등은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 수와 문자의 조합은 본 출원의 단계식 분화 프로토콜 동안 상이한 시기들에서의 인큐베이션 일수를 특정한다.

"아스코르브산" 및 "비타민 C"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 인간 및 다른 동물 종에 대한 필수 영양소를 말한다.

"글루코스" 및 "D-글루코스"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 자연에서 일반적으로 발견되는 당인 덱스트로스를 말한다.

특정 마커에 대하여 "양성"이거나 "+" 마커(즉, PDX-1+)인 세포는 그 특정 마커가 검출될 수 있는 세포이다. 특정 마커에 대하여 "음성"이거나 또는 "-" 마커(즉, NKX6.1-)인 세포는 그 마커가 본 명세서에 교시된 방법에 의해 검출되지 않는 세포이다.

본 출원에서 "크로모그라닌" 및 "CHGN"은 산성 분비형 당단백질 크로모그라닌을 코딩하는 유전자를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다.

췌장 내분비 선구 세포에서 발현되는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 확인하는 "뉴로D" 및 "뉴로D1"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

미국 캘리포니아주 소재의 스템젠트(Stemgent)로부터 입수가능한 BMP 수용체 저해제를 나타내기 위하여 "LDN" 및 "LDN-193189"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양

만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다(문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 손실로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조업자 (미국 캘리포니아주 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.

번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 SCID 생쥐 내에 주사하고, 형성된 기형종을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음에, 삼배엽층으로부터의 세포형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.

번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다. 만능 세포는 다양한 영양세포층을 이용하여 또는 매트릭스 단백질 코팅된 용기를 사용함으로써 배양 중 쉽게 확장될 수 있다. 대안적으로, mTesr™1 배지 (캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies))와 같은 규정 배지와 배합된 화학적 규정 표면이 세포의 일상적인 확장에 사용될 수 있다. 만능 세포는 효소적 방법, 기계적 방법 또는 다양한 칼슘 킬레이터, 예를 들어 EDTA (에틸렌다이아민테트라아세트산)의 사용을 이용하여 배양 플레이트로부터 쉽게 제거될 수 있다. 대안적으로, 만능 세포는 임의의 매트릭스 단백질 또는 영양세포층의 부재 하에서 현탁 중 확장될 수 있다.

만능 줄기 세포의 공급원

사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 확립된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 임의의 시점에, 전형적으로 대략 10 내지 12주의 임신 전에 (그러나 반드시 그러한 것은 아님) 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주들 H1, H7, 및 H9 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 와이셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute))와 같은 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 또는 인간 배아 생식 세포의 확립된 주가 있다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 다수의 만능성 관련 전사 인자들, 예를 들어 OCT4, Nanog, Sox2, KLF4, 및 ZFP42의 강제된 발현을 이용하여 성체 체세포로부터 유래될 수 있는 유도성 만능 세포(IPS) 또는 재프로그래밍된 만능 세포가 또한 적합하다 (문헌[Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165-185]). 본 발명의 방법에서 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 또한 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science, 1998, 282:1145]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92:7844]).

만능 줄기 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.

본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이며, 여기서 PDX-1 및 NKX6.1의 발현은 CDX2 및 SOX2의 발현보다 사실상 더 높다.

췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, 뉴로D, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, 및 PAX6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.

본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NKX2.2, NKX6.1, 뉴로D, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.

본 발명은 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로서 PDX-1 및 NKX6.1 양성이기도 한 세포를 생성할 수 있는 시험관 내 방법 및 세포 집단을 개시한다. 본 발명에서 사용된 방법은, 단계식으로, 하기 중간 단계를 통하여 인간 만능 세포의 단일 호르몬 세포로의 분화를 지시하는 일련의 단계들을 포함한다:

a) 글루코스, TGF-B 리간드 및 WNT 활성화제를 포함하는 배지에서 만능 세포를 배양하는 것을 포함하는, 미분화 인간 배아 줄기 세포로부터의 완성 내배엽(DE) 세포의 생성 단계;

b) 글루코스, 비타민 C, 및 FGF 리간드를 포함하는 배지에서 DE 세포를 배양하는 것을 포함하는, DE 세포의 장관 세포로의 분화 단계;

c) 장관 세포를, PDX-1 및 SOX2를 발현하는 후방 전장 내배엽 세포로 분화시키는 단계. 이 분화는 shh 저해제, BMP 저해제, TGF-B 리간드, FGF 리간드, 레틴산, 비타민 C 및 PKC 활성화제의 존재 하에 장관 세포를 배양함으로써 달성됨;

d) 후방 전장 세포를, PDX-1 및 NKX6.1을 발현하고 후방 전장 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 SOX2를 발현하는 췌장 전장 세포로 분화시키는 단계. 이 분화는 shh 저해제, BMP 저해제, 저용량의 레틴산, 비타민 C 및 PKC 활성화제의 존재 하에 후방 전장 세포를 배양함으로써 달성됨.

e) 췌장 전장 세포를, PDX-1, 췌장 전장 세포와 비교하여 더 높은 수준의 NKX6.1, 및 더 낮은 수준의 SOX2를 발현하는 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 단계. 상기 분화는 shh 저해제, TGF-B 저해제, 저용량의 레틴산, 및 비타민 C가 보충된 배지에서 췌장 전장 세포를 배양함으로써 달성됨; 및

f) 췌장 내배엽 세포를 췌장 내분비 전구 세포, 이어서 단일 호르몬 췌장 내분비 세포로 분화시키는 단계. 상기 분화는 shh 저해제, 저용량의 레틴산, 및 비타민 C가 보충된 배지에서 췌장 내배엽 세포를 배양함으로써 달성됨.

소정 실시 형태에서, 단계식 분화의 모든 단계에서의 세포는 25 mM 미만의 글루코스를 함유하는 배지 제형에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 글루코스 농도는 약 8 mM 내지 약 20 mM의 글루코스의 범위이다.

일부 실시 형태에서, 장관 단계 세포의 생성에 사용되는 배지 제형 및 모든 후속 단계는 아스코르브산 (비타민 C로도 공지됨)을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 아스코르브산의 농도는 약 0.01 mM 내지 약 1 mM이다. 소정 실시 형태에서, 아스코르브산의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM이다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예 1

소 태아 혈청의 부재 하에서의 세포주 H1의 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 전구 세포로의 분화 - BMP/TGF-B 경로의 조정은 췌장 내배엽 집단의 생성을 향상시키고 SOX2+ 집단의 백분율을 감소시킨다.

이 실시예는 CDX2 및 SOX2의 낮은 수준의 발현을 가지면서 PDX-1 및 NKX6.1의 매우 높은 발현 수준을 갖는 췌장 내배엽 배양물을 생성할 수 있음을 보여 주기 위하여 수행하였다.

인간 배아 줄기 세포주 H1 (hESC H1)의 세포를 다양한 계대 (계대 40 내지 계대 52)에서 수확하고, 10 μM의 Y27632 (Rock 저해제, 카탈로그 번호 Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마알드리치(SigmaAldrich))가 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지 (캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지즈) 중에 매트리겔(MATRIGEL)™ (1:30의 희석률; 미국 뉴저지주 소재의 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 코팅된 디쉬 상에 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 단일 세포로서 접종하였다. 접종한지 48시간 후에, 배양물을 불완전 PBS (Mg 또는 Ca를 포함하지 않는 인산염 완충 염수)에서 대략 30초 동안 세척 및 인큐베이션하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내분비 계통으로 분화시켰다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 3일): 세포를 하기의 제1기용 배지에서 1일 동안 배양하였다: 0.1%의 무지방산 BSA (카탈로그 번호 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트(Proliant)), 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호 S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마알드리치), 1X 글루타맥스(GlutaMax)™ (카탈로그 번호 35050-079, 인비트로겐), 5 mM의 D-글루코스 (카탈로그 번호 G8769, 미국 미주리주 소재의 시그마알드리치)가 보충된, 100 ng/mL의 GDF8 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈((R&D Systems)) 및 1 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제, 14-프로프-2엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로 [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온 (미국 특허 출원 제12/494,789호; 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)을 함유하는 MCDB-131 배지 (카탈로그 번호 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐(Invitrogen)). 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 100 nM의 MCX 화합물이 보충된 MCDB-131 배지에서 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8을 첨가한 MCDB-131 배지에서 1일 동안 세포를 배양하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D 글루코스, 및 25 ng/mL의 FGF7이 보충된 MCDB-131 배지를 이용하여 제1기 세포를 2일 동안 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 2일): 제2기 세포를 하기 제3기용 배지에서 1일 동안 배양하였다: 1:200으로 희석된 ITS-X (인비트로겐), 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 25 ng/mL의 FGF7, 10 ng/mL의 액티빈-A (알앤디 시스템즈), 0.25 μM의 SANT-1 (shh 저해제, 시그마알드리치), 1 μM의 레틴산 (RA) (시그마알드리치), 및 200 nM의 TPB (PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 미국 뉴저지주 소재의 이엠디(EMD))가 보충된, 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 미국 캘리포니아주 소재의 스템젠트)를 함유하는 MCDB-131 배지. 이어서, 10 nM의 LDN-193189가 보충된 제3기용 배지에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 2일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA, 200 nM의 TPB, 및 50 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB-131 배지에서 2일 동안 제3기 세포를 배양하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽, 2 내지 7일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 및 50 nM의 RA가 보충된 MCDB-131 배지에서 2 내지 7일 동안 제4기 세포를 배양하였다.

특정한 단계들에서, 샘플들을 수집하고, 실시간 PCR, 면역조직화학법, 또는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)으로 분석하였다.

FACS 분석에 있어서, hESC-유래된 세포들은 트립엘이 익스프레스(TrypLE Express) (카탈로그 번호 12604, 인비트로겐)에서 37℃에서 3 내지 5분 동안 인큐베이션함으로써 단일 세포 현탁물 내로 방출시켰다. 이어서 세포를 염색 완충제 (0.2% 무지방산 BSA를 함유하는 PBS) (카탈로그 번호 554657, 미국 뉴저지주 소재의 비디 바이오사이언시즈)에서 2회 세척하였다. 세포내 항체 염색에 있어서, 먼저 세포를 녹색 형광 라이브/데드(LIVE/DEAD) 세포 염료 (인비트로겐 카탈로그 번호 L23101)와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 분석 동안 생세포/사세포 구별을 허용하고, 이어서 냉 PBS에서 1회 세척하였다. 세포를 250 μl의 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 완충제 (비디 바이오사이언시즈 카탈로그 번호 554722)에서 4℃에서 20분 동안 고정하고, 이어서 비디 펌/와시(Perm/Wash) 완충액 (비디 바이오사이언시즈 카탈로그 번호 554723)에서 2회 세척하였다. (이차 항체의 적절한 종의) 2% 정상 혈청이 보충된 펌/와시 완충제로 이루어진 염색/차단 용액 100 μl에 세포를 재현탁시켰다. 이어서 세포를 경험적으로 예비 결정된 희석률의 일차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 펌/와시 완충제에서 2회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 적절한 이차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 펌/와시 완충제로 2회 세척한 후 비디 FACS 칸토(Canto) II에서 분석하였다.

하기와 같이 희석한 일차 항체를 사용하였다: 토끼 항-인슐린 (1:100; 카탈로그 번호 C27C9; 미국 매사추세츠주 소재의 셀 시그널링(Cell Signaling)), 생쥐 항-인슐린 (1:100; 카탈로그 번호 ab6999, 미국 매사추세츠주 소재의 압캄(Abcam)), 생쥐 항-글루카곤 (1:1250; 카탈로그 번호 G2654; 시그마-알드리치), 토끼 항-시냅토파이신 (1:100; 카탈로그 번호 A0010, 미국 캘리포니아주 소재의 다코(Dako)), 토끼 항-크로모그라닌 A (1:800; 다코), 생쥐 항-NKX6.1 (1:50; DSHB, 미국 아이오와주 소재의 유니버시티 오브 아이오와(University of Iowa)), 생쥐 항-CDX2 (1:250; 인비트로겐), 염소 항-뉴로D (1:500; 알앤디 시스템즈), 생쥐 항-SOX2 (미국 캘리포니아주 소재의 비디), 생쥐 항-NKX2.2 (DSHB), 생쥐 항-Pax6 (미국 캘리포니아주 소재의 비디), 생쥐 항-PDX-1 (미국 캘리포니아주 소재의 비디). 이차 항체를 하기 희석률로 사용하였다: 염소 항-생쥐 알렉사(Alexa) 647 (1:500; 인비트로겐), 염소 항-토끼 PE (1:200; 인비트로겐), 당나귀 항-염소 (1:800; 인비트로겐). 이차 항체의 첨가 후 샘플들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 펌/와시 완충제에서 최종 세척을 하였다. 세포를 비디 FACS 디바(Diva) 소프트웨어를 사용하여 비디 FACS 칸토 II에서 분석하였으며, 이때 30,000 이상의 이벤트(event)를 획득하였다.

도 1a 내지 도 1g는 실시예 1에 따라 분화시킨 그리고 S3 2일에 분석한 세포의 아이소타입 대조군 (도 1a), 크로모그라닌 (도 1b), KI-67 (도 1c), NKX6.1 (도 1d), SOX2 (도 1e), CDX2 (도 1f), PDX-1 (도 1g)의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 도시한다. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다. 제3기의 2일에, 세포의 95% 초과가 PDX-1의 발현에 대하여 양성이고 (도 1g), 집단 중 세포의 약 60%가 SOX2의 발현에 대하여 양성인 반면 (도 1e), 세포의 10% 미만이 CDX2 (도 1f) 또는 NKX6.1 (도 1d), 또는 크로모그라닌 (도 1b)의 발현에 대하여 양성이었다. 제3기 세포의 유의한 백분율이 활성 세포 주기 내에 있었으며, 이는 KI-67 양성 세포의 높은 백분율로 나타나는 바와 같았다 (도 1c).

도 2a 내지 도 2g는 FACS 염색에 의해 결정되는 바와 같이, 실시예 1에 따라 분화시키고 S4의 2일에 수확한 세포의 아이소타입 대조군 (도 2a), 크로모그라닌 (도 2b), KI-67 (도 2c), NKX6.1 (도 2d), SOX2 (도 2e), CDX2 (도 2f), PDX-1 (도 2g)의 발현 프로필을 도시한다. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다. 제3기와 유사하게, 세포의 95% 초과가 PDX-1 발현에 대하여 양성인 반면 (도 2g), 세포의 약 10%는 CDX2 발현에 대하여 양성이고 (도 2f), 세포의 약 40%는 NKX6.1 발현에 대하여 양성이었다 (도 2d). 세포의 약 45%는 SOX2 발현에 대하여 양성이며 (도 2e), 이는 S3에서의 60%로부터 강하된 것이었다. 크로모그라닌 발현은 대략 3%였다 (도 2b). 제4기 세포의 유의한 백분율이 활성 세포 주기 내에 있었으며, 이는 KI-67 양성 세포의 높은 백분율로 나타나는 바와 같았다 (도 2c).

도 3a 내지 도 3g는 이 실시예에서 약술한 분화 프로토콜에 따라 제5기의 2일에 수확한 세포의, FACS 분석에 의해 결정된 상대적인 발현 프로필을 도시한다. 도 3a: 아이소타입 대조군; 도 3b: 크로모그라닌; 도 3c: KI-67; 도 3d: NKX6.1; 도 3e: SOX2; 도 3f: CDX2; 도 3g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다. 제3기 및 제4기와 유사하게, 세포의 95% 초과가 PDX-1의 발현에 대하여 양성인 반면, 세포의 대략 10%가 CDX2 발현 발현에 대하여 양성이고, 세포의 67% 초과가 NKX6.1 발현에 대하여 양성이었다. 대략 50%가 SOX2를 발현하는 것은, 제3기와 비교할 때 더 낮지만, S4에서의 그의 발현과는 유사하였다.

도 4a 내지 도 4g는 이 실시예에서 약술한 프로토콜에 따라 분화의 제5기의 7일에 수확 및 분석한 세포의 FACS 염색에 의해 측정할 때의 PDX-1 (도 4g), NKX6.1 (도 4d), CDX2 (도 4f), SOX2 (도 4e), Ki-67 (증식 마커; 도 4c) 및 크로모그라닌 (범 내분비 마커; 도 4b)의 발현을 도시한다. 제3기 및 제4기와 유사하게, 세포의 >90%가 PDX-1의 발현에 대하여 양성인 반면, CDX2 발현은 10% 미만이었으며, NKX6.1 발현은 >70%까지 유의하게 증가하고 SOX2 발현은 약 2%로 극적으로 감소하였다.

더욱이, SOX2, CDX2, 및 NKX6.1을 발현하는 대다수의 세포는 크로모그라닌의 발현에 대하여 음성이었다 (도 5a 내지 도 5c 참조). 따라서, 이 실시예에서 약술한 프로토콜에 따라 제조한 S5 배양물은 세포의 50% 이상이 CDX-2, SOX2, 및 크로모그라닌에 대해서는 음성이면서 PDX-1 및 NKX6.1을 발현하는 세포의 집단을 생성한다. 표 I에는 S3 내지 S5에서의 다양한 내배엽 마커의 발현 백분율이 요약되어 있다.

[표 I]

도 6a 내지 도 6t는 이 실시예에서 약술한 프로토콜에 따라 분화시킨, 그리고 미분화 H1 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로서 보고한, S2, S3, S4, 및 S5 세포의 실시간 PCR에 의해 측정한 mRNA 발현 프로필을 도시한다. 제3기에서, 전방 전장 마커, 예를 들어 FOXe1 (도 6c) 및 NKX2.1 (도 6e)의 매우 낮은 발현이 있었다. 그러나, 제3기에서, 장관의 위 영역을 표시하는 SOX2 (도 6m) 및 OSR1 (도 6h)은 유의하게 상향조절되었으며, 이들의 발현은 S4 내지 S5에서 감소하였다. 췌장 내배엽 마커, 예를 들어 PTF1a (도 6k), NKX6.1 (도 6g), 및 PDX-1 (도 6i)은 S5 2일의 배양에서 최대 발현 수준에 도달하였다. PCR 데이터는 제3기에서 세포가 PDX-1+ SOX2+ 집단을 통하여 변이된 후 S4 내지 S5에서 PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- CDX2-로 됨을 나타낸다. (도 6i, 도 6g, 도 6m, 및 도 6a 참조.) 내분비 마커 (크로모그라닌, 인슐린, 글루카곤, 및 소마토스타틴)의 발현은 S5의 마지막에 최대 발현 수준에 도달하였다. 췌장 내분비 전구체 마커, NKX2.2, 뉴로D, 및 NGN3의 발현은 S4 내지 S5에서 최대 발현 수준에 도달하였다. 다른 계통 마커, 예를 들어 ZIC1 및 SOX17의 발현은 S4 내지 S5에서 낮게 남아 있었다.

마지막으로, 이 실시예에서 약술한 프로토콜에 따라 분화시킨 제5기 2일에서의 세포는 NKX6.1 및 PDX-1의 높은 발현 수준을 유지하면서 낮은 수준의 CDX2 및 SOX2를 발현한다. 시기적절한 BMP 저해, S4 내지 S5에서의 저용량의 RA의 사용, S1 내지 S2에서의 고 글루코스의 사용의 독특한 조합은 실시예 1에서 설명한 세포의 집단을 생성한다.

실시예 2

S3 내지 S4에서의 SOX2의 발현에 대한 BMP 저해 및 PKC 활성화의 영향

이 실시예에서 약술한 프로토콜을 실시하여 S3 내지 S4에서의 SOX2 발현에 대한 BMP 저해, FGF7의 첨가의 영향을 PKC 활성화의 영향과 함께 밝혀냈다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 다양한 계대 (계대 40 내지 계대 52)에서 수확하고, 10 μM의 Y27632가 보충된 mTesr™1 배지 중에 매트리겔™ (1:30의 희석률) 코팅된 디쉬 상에 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 단일 세포로 접종하였다. 접종한지 48시간 후에, 배양물을 하기와 같이 췌장 내분비 계통의 세포로 분화시켰다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 3일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 및 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 1.5μM MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 내지 세째 날 동안 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 3일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D- 글루코스, 및 50 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제1기 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 3일): 50 ng/mL의 FGF7, 50 nM 또는 200 nM의 LDN-193189, 및/또는 200 nM의 TPB의 존재 또는 부재 하에서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 20 ng/mL의 액티빈-A, 2 μM의 RA가 보충된 MCDB131 배지로 제2기 세포를 처리하였다. 하기 표 II에 열거된 배합물들을 이용하여 배지 중에서 3일 동안 세포를 인큐베이션하였다:

[표 II]

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 200 nM의 TPB, 400 nM의 LDN-193189, 2 μM의 ALk5 저해제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161]에 개시됨), 및 100 nM의 CYP26A 저해제 (N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민, 벨기에 소재의 얀센(Janssen))가 보충된 MCDB131 배지로 3일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

mRNA를 상기에 열거된 모든 조건에 대하여 S2 내지 S4에서 수집하고, 실시간 PCR을 이용하여 분석하였다. S3에서의 대조 조건은 FGF7, AA, SANT, RA, 및 200 nM의 LDN-193189를 상기 단계 c에 열거된 농도로 사용한 배양물을 말한다. 도 7a 내지 도 7g에 나타낸 PCR 데이터로 명백한 바와 같이, S3에서의 LDN-193189의 제거는 내분비 마커, 예를 들어 NGN3 (도 7d), 및 범-내분비 마커, 예를 들어 크로모그라닌 (도 7c 참조)의 유의한 감소로 이어졌다. S3에서의 PKC 활성화제의 첨가 및 LDN-193189의 제거는 NKX6.1의 발현을 향상시키면서 내분비 마커를 추가로 감소시켰다 (도 7a 내지 도 7g 참조). 더욱이, 50 nM의 LDN-193189의 첨가는 내분비 마커 (크로모그라닌 및 NGN3)의 유도에 있어서 200 nM의 LDN-193189만큼 효과적이었다. S3에서의 LDN-193189의 제거 및 TPB의 첨가는 SOX2 (도 7G) 발현을 억제하면서 CDX2 (도 7e) 및 알부민 (도 7f)의 발현을 향상시켰다. 게다가, FGF7 및 LDN-193189 둘 모두의 제거는 LDN-193189를 제거하고 FGF7 을 유지한 배양물과 비교하여 유의하게 SOX2의 발현을 향상시키고 (도 7g) 알부민의 발현을 감소시켰다 (도 7f). 이들 데이터는 BMP 저해, FGF 활성화, 및 PKC 활성화의 정확한 조정이 CDX2, SOX2, 및 알부민에 대해서는 낮으면서 PDX-1 및 NKX6.1은 풍부한 내배엽 도메인으로 이어질 수 있음을 입증한다. 마지막으로, S3 내지 S4에서의 BMP의 지속된 저해는 프로내분비(proendocrine) 유전자의 발현을 향상시키고, 이에 더하여 SOX2 발현을 상향조절한다. 이는, 췌장 발생에서는 부재하거나 또는 낮지만 전방 전장 내배엽 기관, 예를 들어 위에는 존재하는 SOX2의 발현은 상향조절하지 않으면서 췌장 내분비 유전자는 증가시키도록 BMP 저해를 정확하게 조정할 필요가 있다는 것을 강조한다.

실시예 3

전장기에서의 BMP의 초기 저해가 후속적인 내분비 마커 유도에 필요하다.

이 실시예는 S3에서의 BMP 신호전달의 초기 저해가 후속적인 내분비 마커 유도에 필요함을 나타낸다. 그러나, 제3기에서의 BMP의 지속적인 저해는 또한 SOX2의 강한 발현으로 이어진다. 고 발현의 내분비 마커를 저 발현의 SOX2 발현과 함께 수득하기 위하여, 구배형의 BMP 저해가 SXO2 및 CDX2의 저 발현을 가지면서 프로-췌장 내분비 마커를 유도하기 위하여 필요하였다.

다양한 계대 (계대 40 내지 계대 52)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 10 μM의 Y27632가 보충된 mTesr™1 배지 중에 매트리겔™ (1:30의 희석률) 코팅된 디쉬 상에 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 단일 세포로 접종하였다. 접종한지 48시간 후에, 배양물을 하기와 같이 췌장 내분비 계통의 세포로 분화시켰다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 세포를 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 S1 배지에서 인큐베이션하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 1.5 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안(2일 내지 4일) 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 3일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D 글루코스, 및 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 MCDB-131 배지를 이용하여 제1기 세포를 3일 동안 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 20 ng/mL의 액티빈-A, 2 μM의 RA, 50 ng/mL의 FGF7, 100 nM의 LDN-193189 (단지 1일에, 또는 제3기의 지속 기간 동안), 및 200 nM의 TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 제2기 세포를 처리하였다. 일부 배양물에서, LDN-193189를 제3기로부터 제거하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 100 nM의 TPB, 200 nM의 LDN-193189, 2 μM의 ALk5 저해제, 및 100 nM의 CYP26A 저해제가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽/내분비 - 4일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 200 nM의 LDN-193189, 및 2 μM의 ALk5가 보충된 MCDB-131 배지로 4일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

도 8a 내지 도 8g에 나타낸 PCR 결과로 명백한 바와 같이, 제3기로부터의 LDN-193189 (BMP 저해제)의 제거는 제4기 및 제5기에서 프로내분비 유전자 NGN3 (도 8c); 뉴로D (도 8d); 크로모그라닌 (도 8e)의 발현을 없앤다. 그러나, 제4기 내지 제5기에서 NGN3 및 뉴로D와 비교하여 PDX-1 (도 8b) 및 NKX6.1 (도 8a)의 발현은 유의하게 하향조절되지 않는다. 더욱이, 제3기에서의 LDN-193189의 완전한 제거는 CDX2 발현의 유의한 증가로 이어진다 (도 7f). 제3기의 첫 번째 날에 있어서의 LDN-193189의 첨가, 이어서 제3기의 2일 내지 3일에서의 그의 제거는 제4기에서 CDX2 및 SOX2 발현을 감소시키면서 NGN3 및 뉴로D의 발현을 유의하게 증가시켰다. LDN-193189를 제3기의 지속 기간 동안 유지한 배양물은 S3 내지 S4에서 SOX2의 매우 높은 발현을 나타냈다 (도 8g). 이 데이터는 제3기의 1일에서의 BMP 저해가 SOX2 및 CDX2 발현을 억제하면서 췌장 내분비 마커를 트리거링(trigger)하기에 충분함을 나타낸다.

요약하면, 제4기 내지 제5기에서 내분비 전구체 세포의 형성을 유도하고 PDX-1 및 NKX6.1의 발현을 유지하면서 SOX2 발현을 억제하기 위하여 제3기의 1일에 BMP 저해가 필요하다. 더욱이, 제3기에서의 PKC 활성화제의 첨가는 PDX-1 및 NKX6.1의 발현을 추가로 향상시켰다.

실시예 4

제3기의 1일에 BMP 신호전달을 저해하는 것은 제4기에 췌장 전구 세포를 생성하기에 충분한 반면, 제3기의 마지막 날에 BMP 신호전달을 저해하는 것은 내분비 마커의 유의하게 더 낮은 발현으로 이어진다.

이 실시예는 제3기에서의 BMP 신호전달의 초기 저해가 췌장 내분비 전구체 마커의 유도를 허용하는 반면, 제3기의 후기에서의 BMP 신호전달의 저해는 제4기에서의 내분비 전구체 마커의 발현 수준을 유의하게 낮춘다는 것을 나타낸다.

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8 및 1.5 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 3일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D 글루코스, 및 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 MCDB-131을 이용하여 제1기 세포를 3일 동안 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA 및 하기 표 III에 열거된 배합물들이 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제2기 세포를 처리하였다.

[표 III]

도 9a 내지 도 9h는 상기에 열거된 배양 조건들의 조합에 있어서 췌장 내배엽, 내분비 전구체, 및 전장 내배엽 마커의 유전자 발현 프로필을 도시한다. 이전의 실시예와 일치하여, 제3기의 첫 번째 날에 BMP 경로를 차단하는 것은 범-내분비 마커, 크로모그라닌의 발현에 의해 측정할 때 후속적인 내분비 프로그램 유도에 대단히 중요하다. (도 9c 참조.) 그러나, 제3기의 1일에 BMP 저해제를 첨가하는 것은 후속 시기에서 내분비 마커의 발현을 트리거링한다. 더욱이, 제3기의 1일에 BMP 저해제를 첨가하는 것은 제3기 내지 제4기에서 전장 마커, SOX2의 발현을 또한 감소시켰다 (도 9h). 그러나, 제3기의 마지막 날에만 BMP 저해제를 첨가하는 것은 제3기의 첫 번째 날에만 BMP 저해제로 처리된 세포와 비교하여 제3기의 마지막에 유의하게 더 높은 SOX2 발현을 나타낸다. 도 9a 내지 도 9h에 나타낸 발현 수준은 매우 높은 발현 수준의 SOX2를 갖는 미분화 H1 세포에서의 발현 수준에 대한 것이다. SOX2는 전방 전장의 마커인 것 외에, ES 세포의 만능성의 유지에 중요한 잘 알려진 전사 인자이다. 이 실시예는 BMP 신호전달의 지속 기간 및 동역학적 특성에 대한 제3기 배양물의 민감성 및 SOX2의 췌장 내분비 유도 및 발현에 대한 후속적인 영향을 강조하는 이전의 결과를 추가로 지지한다.

실시예 5

췌장 전장기 (제4기)에서의 BMP 저해의 최적 용량

이전의 실시예는 제3기에서의 BMP 저해의 최적 지속 기간을 설명하였다. 이 실시예는 S4 배지에서의 BMP 저해제의 최적 용량을 확인한다.

다양한 계대 (계대 40 내지 계대 52)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 mTesr™1 배지 및 10 μM의 Y27632 중에 매트리겔™ (1:30의 희석률) 코팅된 디쉬 상에 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 단일 세포로 접종하였다. 접종한지 48시간 후에, 배양물을 하기와 같이 췌장 내분비 계통으로 분화시켰다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 1 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 내지 네째 날 동안 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 4일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 100 nM의 LDN-193189, 및 100 nM의 TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 제2기 세포를 처리하였다. 이어서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 및 100 nM TPB가 보충된 MCDB-131 배지에서 3일 동안 세포를 배양하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 4일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 200 nM의 LDN-193189-193189, 2 μM의 ALk5 저해제, 100 nM의 CYP26A 저해제, 및 표 IV (하기)에 열거된 농도들의 LDN-193189가 보충된 MCDB-131 배지로 제4기의 첫째 날 내지 네째 날 동안 제3기 세포를 처리하였다:

[표 IV]

d. 제5기 (췌장 내배엽/내분비 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 50 nM의 LDN-193189, 및 1 μM의 ALk5 저해제가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

상기 처리 후 수확한 세포의 실시간 PCR 분석 결과를 표 10a 내지 표 10h에 나타낸다. 이 도면은 S4의 1일, 2일, 3일 또는 4일에 50 nM 또는 100 nM의 LDN-193189를 첨가하는 것이 S4 내지 S5에서 SOX2의 낮은 발현을 유지하면서 내분비 마커의 발현을 연장시킬 수 있음을 나타낸다. (도 10a 내지 도 10h 참조.)

실시예 6

전장기 (제3기)에서의 BMP 저해의 최적 용량

이 실시예는 제3기에서의 BMP 저해의 최적 용량 및 제6기에서의 내분비 마커에 대한 후속적인 영향을 확인한다.

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 1.5 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 내지 네째 날 동안 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 100 nM의 TPB, 및 10 내지 50 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 제3기 세포를 처리하였다. 이어서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 및 100 nM TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 20 nM의 LDN-193189; 2 μM의 ALk5 저해제; 100 nM의 CYP26 A 저해제, 및 100 nM의 TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽/내분비 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X; 2.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스™; 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; +/- 25 nM의 LDN-193189 및/또는 2 μM의 ALk5 저해제가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

f. 제6기 (췌장 내분비 호르몬 생성 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X; 2.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스™; 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 및 2%의 무지방산 BSA가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제5기 세포를 처리하였다.

도 11a 내지 도 11h는 제3기의 첫 번째 날에 BMP를 낮은 내지는 중간 정도로 저해하는 것이 SOX2의 낮은 발현을 유지하면서 내분비 마커의 발현을 트리거링하는 데 필요함을 나타낸다. 더욱이, 제5기에서 BMP를 저해하면서 내분비 마커를 향상시키는 것은 또한 SOX2 발현을 상향조절하였다.

이 실시예에서의 데이터는 이전의 실시예들에 제시된 결과를 추가로 확인해 준다. 이 데이터는 제3기 내지 제5기에서의 BMP 경로의 정확한 조정이 SOX2 발현을 억제하면서 췌장 내분비 마커의 유도를 트리거링하는 데 필요함을 확인해 준다.

실시예 7

S3 (전장기)에서의 BMP 저해에 있어서의 최적 윈도(window)

이 실시예는 이후의 시기에서의 내분비 유도를 보존하고 SOX2의 발현을 낮추면서 BMP 신호전달을 저해하기 위한 제3기에서의 최적 시간 윈도를 확인한다.

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8 및 1.5 μM의 MCX 화합물이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 내지 네째 날 동안 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 및 100 nM의 TPB가 보충된, 100 nM의 LDN-193189를 함유하는 MCDB-131 배지로 단지 제3기의 처음 2시간, 6시간, 또는 24시간 동안 제2기 세포를 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 25 nM의 LDN-193189, 2 μM의 ALk5 저해제, 100 nM의 CYP26 A 저해제, 및 100 nM의 TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽/내분비 전구체 - 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 및 2 μM의 ALk5 저해제가 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

도 12a 내지 도 12c는 이 실시예에서 모아진 데이터의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. BMP 저해제를 이용한 2시간 이상 동안의 제3기에서의 처리는 S4 내지 S5에서 SOX2의 매우 낮은 발현을 유지하면서 (도 12g) 프로-내분비 전사 인자, 예를 들어 Ngn3 (도 12d) 및 뉴로D (도 12e)의 발현을 트리거링할 수 있으며, NKX6.1 (도 12a) 및 PDX-1 (도 12b)의 발현을 유의하게 증가시킨다. 그러나, 제5기 3일에서, CDX2 발현은 BMP 저해제로 24시간 동안 처리한 세포에서보다 상기 저해제로 2시간 또는 6시간 동안 처리한 세포에서 더 높았다 (도 12f).

이 실시예로부터의 데이터는 BMP 경로의 24시간 저해가 낮은 수준의 CDX2 발현 및 SOX2 발현의 유지에 최적이며, 췌장 내배엽 마커의 높은 발현을 유지하면서 내분비 분화를 개시하는 데 최적임을 시사한다.

실시예 8

제3기 (전장기) 및 제4기 (췌장 전장 전구체기)의 최적 지속 기간

이 실시예는 췌장 내분비 계통의 세포 집단으로의 만능 세포의 단계식 분화에 있어서 S3 및 S4의 최적 지속 기간을 결정하기 위하여 수행하였다.

다양한 계대 (계대 40 내지 계대 52)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 10 μM의 Y27632가 보충된 mTesr™1 배지 중에 매트리겔™ (1:30의 희석률) 코팅된 디쉬 상에 100,000개의 세포/㎠의 밀도로 단일 세포로 접종하였다. 접종한지 48시간 후에, 배양물을 하기와 같이 췌장 내분비 계통으로 분화시켰다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 4일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™; 2.5 mM의 D- 글루코스; 100 ng/mL의 GDF8 및 1.5 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스™; 2.5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 내지 네째 날 동안 세포를 처리하였다. 그 다음에

b. 제2기 (원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 2.5 mM의 D- 글루코스, 및 50 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제1기 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 2 내지 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 100 nM의 TPB가 보충된, 그리고 100 nM의 LDN-193189를 함유하는 MCDB-131 배지로 1일 동안 제2기 세포를 처리하였다. 이어서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 ng/mL의 FGF7, 2 μM의 RA, 20 ng/mL의 액티빈-A, 및 100 nM TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 2 내지 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 25 nM의 LDN-193189, 100 nM의 CYP26 A 저해제, 및 100 nM의 TPB가 보충된 MCDB-131 배지로 2일 또는 3일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽/내분비 전구체 - 2일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 및 1 μM의 ALk5 저해제가 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

f. 제6기 (췌장 내분비 전구체/호르몬 - 2일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 및 2%의 무지방산 BSA가 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제5기 세포를 처리하였다.

제3기, 제4기, 제5기, 또는 제6기에서 수확된 샘플들의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도 13a 내지 도 13g에 나타낸다. 이 데이터는, 2일간의 S3 및 S4를 갖는 배양물과 비교할 때 S3 및 S4를 3일로 연장하는 것이 NKX6.1의 발현을 향상시킨다는 것을 나타낸다 (도 13a). 제3기에서 3일 동안 처리된 세포는 S3 및 S4의 지속 기간이 단지 2일인 배양물과 비교할 때 프로-내분비 마커의 발현의 하향 조절을 나타낸다 (도 13d 및 도 13e). 더욱이, 제4기를 3일로 연장하는 것은 SOX2의 발현을 유의하게 향상시켰다 (도 13g).

이 실시예에서 수득된 데이터는 연장된 BMP 저해가 전장을 고 SOX2 집단 쪽으로 편향시킴을 나타낸다는 점에서 이전의 실시예들에서 생성된 데이터와 일치한다. 이 실시예 및 이전의 실시예들로부터의 데이터를 기반으로 하면, 제3기 및 제4기의 최적 지속 기간은 2일이라는 결론을 내릴 수 있다. 이상적인 프로토콜은 높은 수준의 프로-내분비 마커의 발현, 고 NKX6.1, 저 CDX2 및 저 SOX2 발현을 갖는 분화된 세포를 생성할 것이다.

실시예 9

고 글루코스 및 B27 보충제의 존재 하에서의 BMP 저해에의 연장된 노출은 S3 및 S4에서 SOX2 발현을 유의하게 증가시킨다.

이 프로토콜은 만능 세포의 호르몬 생성 세포로의 단계식 분화 동안 S3 및 S4에서 SOX2 발현에 영향을 주는 인자들을 결정하기 위하여 실시하였다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔™ (1:30의 희석률)-코팅된 디쉬 상에서 배양하고, 대략 70%의 융합도가 될 때까지 mTesr™1 배지에서 배양하고, 하기와 같이 분화시켰다:

a. 0.2% FBS; 100 ng/mL의 액티빈 A; 20 ng/mL의 WNT-3a가 보충된 RPMI 배지 (인비트로겐)에서 1일 동안 미분화 세포를 배양하였다. 이어서, 0.5% FBS; 100 ng/mL의 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지로 추가로 2일 동안 세포를 처리하였다 (제1기).

b. 2% FBS; 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 DMEM/F12 배지로 3일 동안 제1기 세포를 처리하였다 (제2기).

c. 1% B27; 0.25 μM의 SANT-1; 2 μM의 RA; 100 ng/mL의 노긴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)이 보충된 DMEM-고 글루코스 배지에서 4일 동안 제2기 세포를 배양하였다 (제3기).

d. 1% B27; 100 ng/mL의 노긴; 1 μM의 ALK5 저해제 II (미국 캘리포니아주 소재의 악소라(Axxora)); 및 50 nM의 TPB가 보충된 DMEM-고 글루코스 배지로 4일 동안 제3기 세포를 처리하였다 (제4기).

도 14a 내지 도 14h는 하기 마커들에 대하여 수득된, 제3기 4일에 수확된 세포의 FACS 히스토그램을 도시한다: 아이소타입 대조군 (도 14a), 크로모그라닌 (도 14b), KI-67 (도 14c), NKX6.1 (도 14d), SOX2 (도 14e), HNF3B (도 14f), CDX2 (도 14g), PDX-1 (도 14h). 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다. 제3기의 대다수의 세포는 PDX-1 (도 14h), 및 HNF3B (도 14f)의 발현에 대하여 양성이고, NKX6.1 (도 14d)의 발현에 대하여 음성이며, 낮은 크로모그라닌 (도 14b), 및 CDX2 (도 14g) 발현을 나타냈다. 그러나, 90% 초과의 세포가 SOX2에 대하여 또한 강하게 양성이었다 (도 14e). 이것은 제3기에서 대다수의 세포가 PDX-1 및 SOX2에 대하여 양성이고 NKX6.1에 대하여 음성이었음을 나타내며, 이는 췌장의 PDX-1 도메인에 대하여 전방에 있는 전장 집단과 일치하는 내배엽 집단의 확립을 시사하는 것이다.

더욱이, 이 실시예에서 약술한 프로토콜을 이용하여 생성한 세포 집단 중의, 제3기에서 SOX2+인 세포의 백분율은 실시예 1에서 약술한 프로토콜을 사용하여 생성한 세포 집단 중의, SOX2+인 세포의 백분율보다 유의하게 더 높았다. 이러한 차이는 이 실시예의 제3기에서 BMP 길항제 노긴에의 연장된 노출, 배양 배지 중 FGF7 및 PKC 활성화제의 결여에 기인할 수 있다.

도 15a 내지 도 15g는 실시예 9에 따라 분화된 세포의 S4 2일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다: 도 15a: 아이소타입 대조군, 도 15b: NKX6.1, 도 15c: KI-67, 도 15d: 크로모그라닌, 도 15e: SOX2, 도 15f: CDX2, 도 15g: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.

도 16a 내지 도 16f는 실시예 9에 따라 분화된 세포의 S4 4일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 도 16a: 아이소타입 대조군, 도 16b: NKX6.1, 도 16c: 크로모그라닌, 도 16d: SOX2, 도 16e: CDX2, 도 16f: PDX-1. 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.

하기 표 V에는 이 실시예에서 약술한 프로토콜에 따라 분화된 세포에 있어서 S3 및 S4에서의 내배엽 마커들의 발현 %에 대하여 수득된 데이터가 요약되어 있다.

[표 V]

도 17a 내지 도 17j는 실시예 9에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석의 결과를 도시한다. 도 17a: CDX2, 도 17b: HHex, 도 17c: FOXE1, 도 17d: IPF1 (PDX-1), 도 17e: NKX2.1, 도 17f: NKX2.2, 도 17g: NKX6.1, 도 17h: PROX1, 도 17i: SOX2, 도 17j: SOX9.

도 14 내지 도 17에서 그리고 표 V에서 보는 바와 같이, 제4기의 2일 내지 4일에, PDX-1의 고 발현을 유지하면서 NKX6.1의 유의한 발현 증가가 있었다. SOX2의 발현이 제3기로부터 제4기까지 강하되었지만, 대략 75%의 세포는 여전히 SOX2+였다. 도 5에서와 동일하게, CDX2+ 세포, SOX2+ 세포, 및 NKX6.1+ 세포는 크로모그라닌 집단으로부터 상호 배타적이었다. 이는 실시예 9에서 약술한 프로토콜을 사용하여 생성한 제4기 4일 세포의 집단이 대략 50%의 NKX6.1+ SOX2+ PDX-1+ CDX2- 크로모그라닌 음성 분율을 가짐을 시사한다. 이는, S4 내지 S5에서 40 내지 70%의 PDX-1+ NKX6.1+ SOX2-, CDX2-, 크로모그라닌 음성 분율 및 2 내지 25%의 PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+를 갖는, 실시예 1에서 생성한 세포 집단과는 대조적인 것이다. 명확하게도, 실시예 1의 프로토콜을 사용하여 생성한 세포는 실시예 9에서 생성한 세포와 비교하여, SOX2 및 CDX2에 대하여 낮거나 또는 음성이면서 PDX-1+ 및 NXK6.1+인 집단으로 규정되는 췌장 내배엽의 백분율이 더욱 더 높았다.

이 실시예에서 수득된 데이터는 고 글루코스 및 B27 보충제의 존재 하에서의 BMP 저해에의 연장된 노출이 제3기 및 제4기의 분화에서 SOX2의 발현을 유의하게 증가시킨다는 지지를 제공한다.

실시예 10

이전에 공개된 프로토콜은 제3기 내지 제4기에서 상당한 수의 SOX2+ 집단의 형성으로 이어진다.

크룬(Kroon) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌장 내배엽 계통의 세포를 제조하는 프로토콜을 공개하였다 (문헌[Nature Biotech 2008, 26: 443-452]; 이하, "크룬"). 여기에 제공된 실시예에서, 인간 배아 줄기 세포를 크룬 프로토콜에 따라 분화시키고, 상이한 시기의 분화에 특징적인 마커의 발현에 대하여 분석하였다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔™ (1:30의 희석률)-코팅된 디쉬 상에 도말하고, 대략 70%의 융합도가 될 때까지 mTesr™1 배지에서 배양하고, 하기와 같이 크룬에 의해 이전에 공개된 프로토콜을 이용하여 분화시켰다:

a) 미분화 세포를 0.2% FBS, 100 ng/mL의 액티빈 A, 20 ng/mL의 WNT-3a가 보충된 RPMI 배지에 1일 동안 노출시키고, 이어서 0.5% FBS, 100 ng/mL의 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지로 추가로 2일 동안 처리하였다 (제1기).

b) 제1기 세포를 2% FBS, 50 ng/mL의 FGF7이 보충된 RPMI 배지에 3일 동안 노출시켰다 (제2기).

c) 1% B27, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM의 RA, 50 ng/mL의 노긴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)이 보충된 DMEM-고 글루코스 배지로 3일 동안 제2기 세포를 처리하였다 (제3기).

d) 제3기 세포를 1% B27이 보충된 DMEM-고 글루코스 배지에서 3일 동안 배양하였다 (제4기).

e) 제4기 세포를 웰로부터 긁어 내고, 1% B27이 보충된 DMEM-고 글루코스 배지 중에 2일 동안 클러스터(cluster)로서 재현탁시켰다.

도 18a 내지 도 18g는 실시예 10에 따라 분화된 세포의 S3 3일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다: 아이소타입 대조군 (도 18a), NKX6.1 (도 18b), 크로모그라닌 (도 18c), SOX2 (도 18d), CDX2 (도 18e), KI-67 (도 18f), PDX-1 (도 18g). 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.

도 19a 내지 도 19g는 실시예 10에 따라 분화된 세포의 S4 5일에서의 하기 마커들의 FACS 히스토그램 발현 프로필을 나타낸다. 아이소타입 대조군 (도 19a), NKX6.1 (도 19b), 크로모그라닌 (도 19c), SOX2 (도 19d), CDX2 (도 19e), KI-67 (도 19f), PDX-1 (도 19g). 각각의 마커의 발현 백분율을 각각의 히스토그램 상에 나타낸다.

도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 제4기 (5일)의 마지막에는 현탁 중 세포의 클러스터가 대략 20%의 NKX6.1+ PDX-1+ SOX2-이고 대략 20%의 PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+였다. 이들 결과는 NKX6.1+인, 실시예 10에 따라 생성된 제4기에서의 세포 집단의 상당한 분율이 또한 SOX2+였음을 나타낸다.

하기에 나타낸 표 VI에는 이 실시예에서 생성된 세포의 S3 내지 S4에서의 내배엽 마커의 백분율이 요약되어 있다.

[표 VI]

실시예 11

아스코르브산의 첨가는 폴리호르몬 세포의 수를 유의하게 감소시키고 이에 수반하여 단일 인슐린 호르몬 양성 세포의 수를 증가시킨다.

호르몬 생성 세포로의 만능 세포의 분화 동안 마커들의 발현에 대한 아스코르브산의 영향을 시험하였다. 하기와 같이, 세포는 매 분화 단계에서 글루코스가 보충된 그리고 제3기, 제4기 및 제5기의 형성에서 아스코르브산이 보충된 배지에서 배양하였다:

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 3일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 1 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 100 nM의 MCX 화합물이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 동안, 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지에서 추가로 1일 동안 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D- 글루코스, 및 25 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제1기 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 2일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, 1μM의 RA, 200 nM의 TPB (PKC 활성화제), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 저해제)가 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 제2기 세포를 처리하였다. 이어서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, 1μM의 RA, 200 nM의 TPB (PKC 활성화제), 10 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB-131 배지로 추가로 1일 동안 세포를 처리하였다. 0.25 mM의 아스코르브산 (카탈로그 번호 A4544, 미국 미주리주 소재의 시그마)으로 제3기의 지속 기간 동안 일부 배양물들을 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 2일): 0.25 mM의 아스코르브산을 포함하거나 또는 포함하지 않는, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA, 200 nM의 TPB, 50 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽, 2 내지 7일): 0.25 mM 아스코르브산을 포함하거나 또는 포함하지 않는, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA가 보충된 MCDB-131 배지로 2 내지 7일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

도 20a 내지 도 20j는 실시예 11에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 도시한다. 도 20a: 소마토스타틴, 도 20b: PDX1, 도 20c: Pax6, 도 20d: Pax4, 도 20e: NKX6.1, 도 20f: NGN3, 도 20g: 글루카곤, 도 20h: 뉴로D, 도 20i: 인슐린, 도 20j: 크로모그라닌. 이 도면은 제3기에서의 또는 제3기 및 제4기에서의 아스코르브산의 첨가가 제4기 내지 제5기에서 소마토스타틴 및 글루카곤의 발현을 유의하게 감소시키면서 인슐린의 발현을 증가시켰음을 나타낸다 (도 20a, 도 20g, 및 도 20i). 더욱이, 제4기 내지 제5기에서, 췌장 내배엽 마커, 예를 들어 PDX-1 및 NKX6.1의 발현이 0.25 mM의 아스코르브산의 첨가에 의해 유의하게 변경되지 않았다 (도 20b 및 도 20d 참조). 제4기 내지 제5기에서, Pax6 발현은 하향조절되고 Pax4 발현은 유지되었다 (도 20c 및 도 20d 참조). 제5기의 마지막에, S3 내지 S5에서 +/- 아스코르브산으로 처리된 배양물을 인슐린, 글루카곤, 및 소마토스타틴 호르몬에 대하여 면역 염색하였다. 표 VII에는 인슐린 양성 세포, 글루카곤 및 소마토스타틴 양성 세포, 및 폴리호르몬 세포 (하나의 세포에서의 2가지 더 많은 호르몬의 발현)의 평균 백분율이 요약되어 있다.

[표 VII]

실시예 12

제3기에서의 아스코르브산의 최적 용량

이 실시예는 단일 호르몬, PDX-1 양성, 및 NKX6.1 양성인 인슐린 양성 세포를 생성하기 위하여 사용할 아스코르브산의 최적 용량을 결정하기 위하여 수행하였다.

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 3일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8 + 1 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 글루코스, 100 ng/mL의 GDF8 + 100 nM의 MCX 화합물이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 동안, 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지에서 추가로 1일 동안 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D- 글루코스 (0.25 mM의 아스코르브산을 첨가하거나 또는 첨가하지 않음), 및 25 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 제1기 세포를 처리하였다.

c. 제3기 (전장 - 2일): 제2기 세포를, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, +/- 0.25 mM 아스코르브산, 1 μM의 RA, 200 nM의 TPB, 100 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB131 배지로 첫째 날 동안 처리하고, 이어서 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, +/- 0.25 mM의 아스코르브산, 1 μM의 RA, 200 nM의 TPB, 10 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB131 배지로 추가로 1일 동안 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 2일): 0.25 mM 내지 1 mM의 아스코르브산을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고서, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA, 200 nM의 TPB, 50 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB131 배지로 2일 동안 제3기 세포를 처리하였다.

e. 제5기 (췌장 내배엽, 2 내지 9일): 0.25 mM 아스코르브산을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA가 보충된 MCDB-131 배지로 2 내지 9일 동안 제4기 세포를 처리하였다.

도 21a 내지 도 21j는 실시예 12에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 하기 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 21a: 소마토스타틴, 도 21b: PDX1, 도 21c: Pax6, 도 21d: Pax4, 도 21e: NKX6.1, 도 21f: NGN3, 도 21g: 뉴로D, 도 21h: 인슐린, 도 21i: 글루카곤, 도 21j: 크로모그라닌. 실시예 10으로부터의 데이터와 일치하여, 제2기 내지 제4기에서의 아스코르브산의 첨가는 제5기에서 인슐린 및 Pax4의 발현을 유지하면서 소마토스타틴, 글루카곤, 및 Pax6의 발현을 유의하게 감소시켰다. 더욱이, 0.25 mM의 아스코르브산과 비교하여, S4에서 0.5 내지 1 mM의 아스코르브산을 사용함에 있어서 상당한 효과는 없었다. 마지막으로, 제2기에서의 아스코르브산의 첨가는 또한 S3기 내지 S5기에서 글루카곤 및 소마토스타틴의 발현을 감소시키면서 인슐린의 발현을 유지하는 데 있어서 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 아스코르브산은 시기-특이적 방식으로 작용하여 단일 호르몬 세포의 발현을 조절한다. 아스코르브산의 첨가는 분화 프로토콜의 초기 시기들에서 중요하며, 반면에 이후의 시기에서는 이것은 폴리호르몬 세포의 수의 감소에 있어서 효과적인 것으로 입증되지 않았다.

실시예 13

레틴산과 아스코르브산의 배합물이 단일 인슐린 호르몬 양성 세포의 생성에 필요하다.

이 실시예는 만능 세포의 분화 동안 단일 인슐린 호르몬 양성 세포를 생성하기 위한 요건을 밝혀내기 위하여 수행하였다.

a. 제1기 (완성 내배엽 (DE) - 3일): DE의 시작 이전에, 배양물을 세척하고, 불완전 PBS (Mg 또는 Ca이 없음)와 함께 30초 동안 인큐베이션하고, 이어서 제1기용 배지를 첨가하였다. 매트리겔™-코팅된 디쉬 상에서 단일 세포로서 배양된 인간 배아 줄기 세포를, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 1 μM의 MCX 화합물 (GSK3B 저해제)이 보충된 MCDB-131 배지로 1일 동안 처리하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스™, 추가의 5 mM의 글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 100 nM의 MCX 화합물이 보충된 MCDB-131 배지로 둘째 날 동안, 이어서 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 글루코스 및 100 ng/mL의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지에서 추가로 1일 동안 세포를 처리하였다.

b. 제2기 (원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스™, 5 mM의 D- 글루코스, 0.25 mM의 아스코르브산, 및 25 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다. 이어서

c. 제3기 (전장 - 2일): 세포를, 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 mM의 아스코르브산, 0.25 μM의 SANT-1, 1 μM의 RA, 200 nM의 TPB, 100 nM의 LDN-193189가 보충된 MCDB131로 첫째 날 동안 처리하고, 이어서 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 10 ng/mL의 액티빈 A, 25 ng/mL의 FGF7, 0.25 mM의 아스코르브산, 0.25 μM의 SANT-1, 1 μM의 RA, 200 nM의 TPB, 10 nM의 LDN-193189가 보충된 tMCDB131 배지로 추가로 1일 동안 처리하였다.

d. 제4기 (췌장 전장 전구체 - 2일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA, 0.25 μM의 SANT-1, 50 nM의 RA, 200 nM의 TPB, 50 nM의 LDN-193189, 0.1 mM의 아스크로브산이 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다. 이어서

e. 제5기 (췌장 내배엽, 3일): 1:200으로 희석된 ITS-X, 2.5 mM의 글루코스, 1X 글루타맥스™, 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨, 2%의 무지방산 BSA가 보충된 MCDB-131 배지를 이용하여 그리고 하기 배양 조건으로 3일 동안 세포를 처리하였다:

+0.1 mM 아스코르브산

0.1 mM 아스코르브산 + 50 nM RA

0.1 mM 아스코르브산 + 50 nM RA + 0.25 μM SANT-1

0.1 mM 아스코르브산 + 50 nM RA + 0.25 μM SANT-1+ 50 nM LDN-193189

0.1 mM 아스코르브산 + 50 nM RA + 0.25 μM SANT-1+ 1 μM Alk5 inh

0.1 mM 아스코르브산 + 50 nM RA + 0.25 μM SANT-1+ 1 μM Alk5 저해제 + 50 nM LDN-193189.

도 22a 내지 도 22l은 실시예 13에 따라 분화되고 S5 3일에 수확된 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 Pax4 (도 22a); Pax6 (도 22b); PDX1 (도 22c); PTF1a (도 22d); 글루카곤 (도 22e); 인슐린 (도 22f); 뉴로D (도 22g); ngn3 (도 22h); Zic1 (도 22i); CDX2 (도 22j); 알부민 (도 22k); NKX6.1 (도 22l)의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.

제5기의 마지막에, 상기에 열거된 조합들로 처리된 배양물들을 인슐린, 글루카곤, 및 소마토스타틴 호르몬에 대하여 면역 염색하였다. 표 VIII에는 인슐린 양성 세포, 글루카곤 및 소마토스타틴 양성 세포, 및 폴리호르몬 세포 (하나의 세포에서의 2가지 더 많은 호르몬의 발현)의 평균 백분율이 요약되어 있다.

하기 도 22 및 표 VIII에 나타낸 바와 같이, 제5기에서의 저용량의 레틴산 + 아스코르브산의 첨가는 S5에서 단지 비타민 C로 처리된 배양물과 비교하여 단일 인슐린 호르몬 양성 세포의 백분율을 증가시키면서 호르몬 양성 세포의 전체 수를 유의하게 감소시켰다. 더욱이, 레틴산, 아스코르브산, 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 저해제, 및 ALK5 저해제의 조합은 단지 아스코르브산 (비타민 C)으로 처리된 배양물과 비교하여 단일 인슐린 호르몬 양성 세포의 수를 추가로 증가시켰다. 이 데이터는 단일 인슐린 호르몬 양성 세포를 생성하기 위하여 인자들의 독특한 조합이 필요함을 나타낸다.

[표 VIII]

Claims

(a) 분화 배지 내 (b) 인간 췌장 전장 세포의 집단 및 (c) 10% 초과의 세포가 단일 인슐린 호르몬 양성 세포(single hormonal insulin positive cell)인 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단을 포함하는, 시험관내(in vitro) 배양물로서,
상기 분화 배지는 췌장 전장 세포를 10% 초과의 세포가 단일 인슐린 호르몬 양성 세포인 분화된 췌장 내배엽 세포의 집단으로 분화시키고,
상기 분화 배지는 하기 중 하나를 포함하며,
레티노이드, 아스코르브산 및 SANT-1;
레티노이드, 아스코르브산, SANT-1 및 ALK5 저해제; 또는
레티노이드, 아스코르브산, SANT-1, ALK5 저해제 및 LDN-193189,
상기 분화 배지 내 아스코르브산의 존재는 아스코르브산이 없는 분화 배지와 비교하여 인슐린 양성 세포의 수는 증가시키고, 글루카곤 양성 세포 및 소마토스타틴(somatostatin) 양성 세포의 수는 감소시키는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 인간 췌장 전장 세포가 액티빈 A로 보충된 배지에서 인간 배아 줄기세포의 단계식(stepwise) 분화에 의해 수득되는 것인, 시험관내 배양물.
제2항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 WNT 활성화제를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 인간 췌장 전장 세포가 FGF7로 보충된 배지에서 인간 완성 내배엽 세포의 단계식 분화에 의해 수득되는 것인, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화 배지가 TPB를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화 배지가 레티노이드, 아스코르브산 및 SANT-1을 포함하고, TPB를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제4항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 아스코르브산의 사용을 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제2항에 있어서, 인간 췌장 전장 세포가 액티빈 A로 보충된 배지에서 인간 만능 줄기세포의 단계식 분화에 의해 수득되는 것인, 시험관내 배양물.
제2항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 GDF-8을 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제9항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 GSK3β 저해제를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제10항에 있어서, GSK3β 저해제가 MCX 화합물인, 시험관내 배양물.
(a) 하기 중 하나로 보충된 분화 배지 내 (b) 인간 췌장 전장 세포를 포함하는 시험관내 배양물로서,
레티노이드, 아스코르브산 및 SANT-1;
레티노이드, 아스코르브산, SANT-1 및 ALK5 저해제; 또는
레티노이드, 아스코르브산, SANT-1, ALK5 저해제 및 LDN-193189,
상기 분화 배지는 인간 췌장 전장 세포를 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단으로 분화시키되, 상기 집단의 10% 초과의 세포는 단일 인슐린 호르몬 양성 세포이고,
상기 분화 배지 내 아스코르브산의 존재는 아스코르브산이 없는 분화 배지와 비교하여 인슐린 양성 세포의 수는 증가시키고, 글루카곤 양성 세포 및 소마토스타틴 양성 세포의 수는 감소시키는, 시험관내 배양물.
제12항에 있어서, 인간 췌장 전장 세포가 인간 만능 줄기세포의 단계식 분화로부터 수득되는 것인, 시험관내 배양물.
제13항에 있어서, 단계식 분화가 인간 만능 줄기세포를 GDF-8이 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 배양물.
제14항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 GSK3β 저해제를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제15항에 있어서, GSK3β 저해제가 MCX 화합물인, 시험관내 배양물.
(a) 레티노이드, 아스코르브산 및 SANT-1이 보충된 분화 배지 내 (b) 인간 췌장 전장 세포의 집단 및 (c) 10% 초과의 세포가 단일 인슐린 호르몬 양성 세포인 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단을 포함하는 시험관내 배양물로서,
상기 분화 배지는 췌장 전장 세포를 10% 초과의 세포가 단일 인슐린 호르몬 양성 세포인 분화된 췌장 내배엽 세포의 집단으로 분화시키고,
상기 분화 배지 내 아스코르브산의 존재는 아스코르브산이 없는 분화 배지와 비교하여 인슐린 양성 세포의 수는 증가시키고, 글루카곤 양성 세포 및 소마토스타틴 양성 세포의 수는 감소시키는, 시험관내 배양물.
제17항에 있어서, 인간 췌장 전장 세포가 인간 만능 줄기세포의 단계식 분화로부터 수득되는 것인, 시험관내 배양물.
제18항에 있어서, 단계식 분화가 인간 배아 줄기세포를 GDF-8이 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 배양물.
제19항에 있어서, 단계식 분화의 배지가 GSK3β 저해제를 추가로 포함하는, 시험관내 배양물.
제20항에 있어서, GSK3β 저해제가 MCX 화합물인, 시험관내 배양물.
제17항에 있어서, 분화 배지가 ALK5 저해제, LDN-193189, 또는 ALK5 저해제와 LDN-193189 양자 모두로 추가로 보충되는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단의 30% 초과의 세포가 PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- 및 CDX2-인, 시험관내 배양물.
제12항에 있어서, 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단의 30% 초과의 세포가 PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- 및 CDX2-인, 시험관내 배양물.
제17항에 있어서, 분화된 인간 췌장 내배엽 세포의 집단의 30% 초과의 세포가 PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- 및 CDX2-인, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화 배지가 레티노이드, 아스코르브산 및 SANT-1을 포함하는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화 배지가 레티노이드, 아스코르브산, SANT-1 및 ALK5 저해제를 포함하는, 시험관내 배양물.
제1항에 있어서, 분화 배지가 레티노이드, 아스코르브산, SANT-1, ALK5 저해제 및 LDN-193189를 포함하는, 시험관내 배양물.
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