JP2019065052A - 非肺標的細胞へのｍＲＮＡの経肺送達 - Google Patents

Abstract

【課題】非肺標的細胞へのｍＲＮＡの経肺送達の提供。【解決手段】非肺細胞または組織へのｍＲＮＡおよび／またはコードされたタンパク質の送達のための経肺投与および関連する方法のために製剤化されたｍＲＮＡを含む組成物。組成物および方法は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質に関連する疾患の症状を予防または改善するために使用され得る。本発明は非侵襲的な経肺投与を使用するｍＲＮＡ遺伝子治療薬の送達方法を提供する。とりわけ、本発明は疾患の治療および／または予防のための方法において使用可能なタンパク質をコードするｍＲＮＡ送達を提供する。【選択図】図１２

Description

関連出願
本出願は、２０１２年６月８日に出願された米国仮出願第６１／６５７，４５２号の利
益を主張するものであり、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

従来の遺伝子治療は、宿主細胞への望ましい遺伝情報の挿入のためのＤＮＡの使用を含
む。細胞導入されたＤＮＡは通常１つ以上の核酸導入された細胞のゲノムに統合され、宿
主で導入された遺伝物質の長期にわたる作用を可能にする。相当な利益がそのような持続
作用にあり得る一方で、外因性ＤＮＡの宿主ゲノムへの統合は多くの有害作用もまた有し
得る。例えば、導入されたＤＮＡを無損傷の遺伝子に挿入することが可能であるが、内因
性遺伝子の機能を妨げるか、または全く排除さえする突然変異をもたらす。このように、
ＤＮＡでの遺伝子治療は、例えば、必須酵素の除去または有害な減少した生産または細胞
増殖の調節のための重要な遺伝子の中断などの、治療を受けている宿主における不可欠な
遺伝子の機能の減退をもたらす場合があり、未制御またはガン性の細胞増殖をもたらす。
さらに、従来のＤＮＡに基づく遺伝子治療で、強いプロモーター配列を含むために望まし
い遺伝子産物の効果的発現が必要であり、また細胞内の通常の遺伝子発現の調節における
望ましくない変化に至るかもしれない。ＤＮＡに基づく遺伝物質は、望ましくない抗ＤＮ
Ａ抗体の誘発をもらたすことも可能性があり、順番に、致命的な免疫反応を引き起こし得
る。

ＤＮＡと対照的に、遺伝子治療剤としてのＲＮＡの使用は（１）ＲＮＡが、核酸導入さ
れた細胞のゲノムに安定して統合する危険を含まないため、導入された遺伝物質が必須遺
伝子の通常の機能を損なうか、有害または発癌性影響をもたらす突然変異を引き起こすと
いう懸念を取り除き、（２）無関係なプロモーター配列が、コードされたタンパク質の効
果的な翻訳のために必要とされず、起こり得る有害な副作用を避けられ、（３）プラスミ
ドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と対照的に、反ＲＮＡ抗体が発生しないように、メッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）が免疫原性ＣｐＧのモチーフが欠けており、（４）遺伝子治療に基づく
ｍＲＮＡから生じるどんな悪影響も、ＲＮＡの比較的短い半減期のために、限られた期間
であるため、実質的に安全である。さらに多くの適用において、細胞へのｍＲＮＡ移動の
一時的な性質は、すなわち、どんな治療効果の期間でも、細胞内のｍＲＮＡおよびタンパ
ク質生成物の寿命により制限され、ＤＮＡに基づく遺伝子治療を使用して得られる潜在的
により長い永続的な効果よりも、望ましい。さらに、ｍＲＮＡがその機能を実行するため
に核に入ることが必要ではなく、このようにＤＮＡに基づく遺伝子治療に対する大きな障
害を避ける。

過去にｍＲＮＡに基づく遺伝子治療がもっと使用されなかった１つの理由は、特にそれ
が細胞の細胞質に達して、酵素分解にさらされるとき、ｍＲＮＡはＤＮＡよりもはるかに
安定性に欠けることである。ｍＲＮＡの糖部分の第二炭素の水酸基の存在は、ｍＲＮＡが
ＤＮＡのより安定した二重らせん構造を形成することを防ぎ、このようにｍＲＮＡをより
加水分解劣化し易くする立体障害を引き起こす。その結果、最近まで、ｍＲＮＡが不安定
なため、核酸導入プロトコルに耐えられないと広く考えられてきた。

ＲＮＡ安定化修飾の進歩は、遺伝子治療においてプラスミドＤＮＡの代わりにｍＲＮＡ
の使用に対するより多くの関心を沸かせた。それでも、修飾ｍＲＮＡの増加した安定性に
もかかわらず、ｍＲＮＡのタンパク質生産の治療レベルを可能にする方法でのインビボ細
胞への送達は、特に全長タンパク質をコードするｍＲＮＡに対して、まだ課題である。ｍ
ＲＮＡを宿主に導入するためにウイルスベクターを使用することで若干の成功は収められ
たが、ウイルスベクターを使用するｍＲＮＡ核酸導入が逆免疫反応をもたらす可能性もあ
る。いくつかの状況では、ウイルスベクターは、宿主ゲノムにさえ統合されるかもしれな
い。さらに、臨床級ウイルスベクターの生産は、高価でもあり、時間もかかる。ウイルス
ベクターを使用する導入された遺伝物質の標的送達は、制御が難しくもあり得る。

ｍＲＮＡの非ウイルス送達はネイキッド核酸の注射、ポリプレックス、リポプレックス
、または、リポソーム封入ｍＲＮＡ、遺伝子ガンによるバイオリスティック送達、微粒子
担体媒介の送達、および電気穿孔を使用して得ることができる。非ウイルス核酸導入また
は送達媒体は、一般に毒性が少なく、より抗原性が低く、より容易で、ｍＲＮＡの送達の
ためのウイルスベクターより調製するのにより費用がかからない。カチオン性脂質または
ポリマー送達媒体などの特定の送達媒体は、核酸導入するｍＲＮＡを内在性ＲＮＡ分解酵
素から保護することも助け得る。

カプセル化されるプラスミドＤＮＡ、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮ
ＡおよびマイクロＲＮＡに基づく治療法の部位特異的送達の実施手段として、核酸のリポ
ソーム型送達は、用いられた。しかし、効率的で、治療上有効な、標的細胞および組織へ
のｍＲＮＡの送達、ならびにそのような標的細胞および組織のその後の核酸導入は、特に
全長タンパク質をコードするｍＲＮＡの送達にとって技術的な挑戦が残る。望ましい標的
細胞に達する十分な安定性および治療上有効なレベルで機能的なタンパク質の翻訳を可能
にするためにそのような標的細胞に効率的にそれらのカプセル化される物質を放出する能
力を提供するリポソーム型送達系を設計することは重要である。

治療上有効な量のカプセル化される製剤を送達するために使用されるとき、そのような
リポソーム系送達媒体を構築するために用いられる多くのカチオン性脂質は標的細胞に対
して有毒である。したがって、特にうまく治療上有効な量のｍＲＮＡを標的細胞に届ける
のに必要な量において、カチオン性脂質と関連した毒性は、非ウイルス送達媒体としての
それらの一般的な使用に対する大きな障害を意味する。

現在まで、特に翻訳の低水準が制限因子ではない場合、例えばｍＲＮＡコード抗原によ
る免疫化の場合、ｍＲＮＡ遺伝子治療を使用し著しい進歩が用途において見えてきた。ネ
イキッドまたはプロタミン複合型のｍＲＮＡの皮内注入によって腫瘍抗原に対する予防接
種を含む臨床試験は、実現可能性、毒性の不足および有望な結果を示した。Ｘ．Ｓｕ ｅ
ｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ８：７７４−７８７（２０１１）。し
かし、翻訳の低レベルは、長期間の生物学的または治療効果を働かせるためにタンパク質
をコードするｍＲＮＡの持続的安定性のより高いレベルが要求する他の適用で、ｍＲＮＡ
に基づく遺伝子治療の実施を制限することができる。

さらに、ｍＲＮＡ遺伝子治療の利点は繰り返される投与、および典型的には注射による
ＤＮＡに基づく遺伝子治療と比較して比較的一時的であるため、しばしば長期間の効果を
提供するよう要求される。このように、インビボのより効果的な核酸導入および非侵襲的
におよび／または粘膜サイトにｍＲＮＡを送達する能力は、ｍＲＮＡ遺伝子治療の成功し
た適用の見通しを改善する。

Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ８：７７４−７８７（２０１１）

本発明は、ｍＲＮＡのナノ粒子に基づく製剤が以下の経肺送達を転位することができる
という驚くべき発見、すなわち、肺から全身的血液供給への能動的または受動的な手段に
よる変化しない移動、続いて例えば、肝臓などの異なる非肺細胞または組織の中に沈着さ
れることを含む。例えば、β−ガラクトシダーゼなどの治療タンパク質をコードするｍＲ
ＮＡを含むナノ粒子のこの転位は、全身的に到達可能な非肺細胞または組織に機能的なタ
ンパク質の生産をもたらすために、肺の外の有効医薬成分の非侵襲的な全身的送達を構成
する。

このように、本発明は非侵襲的な経肺投与を使用するｍＲＮＡ遺伝子治療薬の送達方法
を提供する。とりわけ、本発明は疾患の治療および／または予防のための方法において使
用可能なタンパク質をコードするｍＲＮＡ送達を提供する。１つの特定の態様では、本発
明はタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与するこ
とを含む非肺細胞または組織へのにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達方法を提供
し、肺への投与は、非肺細胞または組織にｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の送達をも
たらす。

別の態様では、本発明は、治療タンパク質が非肺細胞または組織に送達されるように、
治療タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与するこ
とを含む被験者の非肺細胞または組織へ治療タンパク質の送達方法を提供する。

別の態様では、本発明は治療タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含
む組成物を肺に投与することを含む被験者の非肺細胞または組織内で治療タンパク質の生
産を誘発する方法を提供する。

別の態様では、本発明は治療タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含
む組成物を肺に投与することを含む疾患または障害の治療方法を提供し、肺への投与は、
疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織に治療タンパク質の送達をもたらす
。

別の態様では、本発明はタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含むメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の経肺送達のための組成物を提供し、一度肺に投与され
るように組成物が製剤化されると、非肺細胞または組織にｍＲＮＡおよび／またはタンパ
ク質の送達をもたらす。

いくつかの実施形態では、組成物はエアロゾル化によって肺に投与される。いくつかの
実施形態では、組成物は気管内のエアロゾル化によって肺に送達される。いくつかの実施
形態では、組成物は噴霧化によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は点滴
注入によって肺に投与される。いくつかの特定の実施形態では、組成物は定量吸入器、ジ
ェット噴霧器、超音波噴霧器、乾燥粉吸入器、噴射剤に基づく吸入器または注入器からな
る群から選択された装置を使用して被験者の肺に投与される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上のタンパク質をコードする複数のｍＲＮ
Ａ種を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは各々が異なるタンパク質をコードする
少なくとも２つのｍＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは全長タンパク
質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは自然発生の全長タンパク質の切断
されたバージョンをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは単一転写の１つ以
上のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキメラタンパク質を
コードし、その中で１つ以上のタンパク質配列は天然タンパク質とは自然に関連せず、発
現の間、結果として生じるキメラタンパク質でペプチド結合によって連鎖される。いくつ
かの実施形態では、本発明に適切なｍＲＮＡは約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２．
０ｋｂ、２．５ｋｂ、３．０ｋｂ、３．５ｋｂ、４．０ｋｂ、４．５ｋｂ、または５．０
ｋｂの長さまたはそれを超える長さを有する。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施
形態では、ｍＲＮＡは細胞質タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
Ａはアクチン細胞骨格と関連したタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍ
ＲＮＡは形質膜と関連したタンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、ｍ
ＲＮＡは膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、ｍＲＮＡはイ
オンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは核周囲タン
パク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは核タンパク質をコードする。
いくつかの特定の実施形態では、ｍＲＮＡは転写因子をコードする。いくつかの実施形態
では、ｍＲＮＡはシャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
Ａは細胞内酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞代謝、ＤＮＡ
修復、転写および／または翻訳を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では
、ｍＲＮＡは細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは細胞
外基質に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態ではｍＲＮＡは分泌性タ
ンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは表１、２、３または４に記載のタンパク質（すな
わち、治療タンパク質）をコードする。いくつかの特定の実施形態では、タンパク質は、
αガラクトシダーゼ、エリスロポエチン、α１−アンチトリプシン、カルボキシペプチダ
ーゼＮ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、リソソ
ーム酸性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Ａα−グルコサミニドアセチルトランスフ
ェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン
−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸塩スルファターゼ
、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランス
ルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモン、オ
ルニチントランスカルバミルラーゼ（ＯＴＣ）、カルバミルリン酸塩合成酵素−１（ＣＰ
Ｓ１）、アルギニノコハク酸合成酵素−１（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（
ＡＳＬ）、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（Ｃ
ＦＴＲ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ
およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、
タンパク質は、オルニチントランスカルバミルラーゼ（ＯＴＣ）、カルバミルリン酸塩合
成酵素−１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸合成酵素−１（ＡＳＳ１）、アルギニノコ
ハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜コンダクタ
ンス制御因子（ＣＦＴＲ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、細胞内
または膜貫通型タンパク質である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは表４に記載の疾患または障害（すなわち、適応症
）に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、方法において使用する
タンパク質は表４に記載の疾患または障害（すなわち、適応症）に罹患した被験者を予防
、治療および／または治癒する能力に基づいて選択される。特定の実施形態では、疾患ま
たは障害は、ＳＭＮ１関連脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｇ
ＡＬＴ関連ガラクトース血症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ＳＬＣ３Ａ１関連障害、シスチン
尿症、ＣＯＬ４Ａ５関連障害、アルポート症候群、ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症、Ｘ
連鎖副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、フリートライヒ失調症、ペリツェウ
ス−メルツバッハー病、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２関連結節性硬化症、Ｂ型サンフィリポ症
候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、ＣＴＮＳ関連シスチン症、ＦＭＲ１関連障害、脆弱Ｘ症候群
を含む、脆弱Ｘ関連振動／運動失調症候群、脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群、プラデル−ウィ
リ症候群、ファブリー病、遺伝出血性毛細管拡張症（ＡＴ）、ニーマンピック病Ｃ１型、
神経セロイドリポフスチン関連疾患、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、
若年性バッテン病、サンタヴォリハルティア病、ヤンスキービールショースキー病、ＰＴ
Ｔ−１欠乏症、ＴＰＰ１欠乏症、ＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２
Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連中枢神経系ミエリン形成不全／消滅白質による小児運動失
調、ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連発作性運動失調症２型、ＭＥＣＰ２関連障害
、古典的なレット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度の新生児脳症、ＰＰＭ−Ｘ症候群、ＣＤＫ
Ｌ５関連非定型レット症候群、ケネディ病（ＳＢＭＡ）、Ｎｏｔｃｈ−３関連皮質下梗塞
および白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈疾患（ＣＡＤＡＳＩＬ）、ＳＣＮ１ＡおよびＳ
ＣＮ１Ｂ関連発作疾患、ポリメラーゼＧ関連障害、アルパース−フッテンロッハー症候群
、ＰＯＬＧ関連感覚性失調性神経障害、構音障害、眼不全麻痺、ミトコンドリアＤＮＡ削
除による常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺、Ｘ連鎖副腎形成不全、Ｘ連鎖無ガン
マグロブリン血症、ウィルソン病および血液凝固障害からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、肺への送達に続いて、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質非
肺組織に送達される。いくつかの実施形態では、非肺組織は肺以外の体の任意の器官およ
び／または器官系統を含む。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は、心臓、肝臓、
脾臓、腎臓、骨格筋、リンパ節、脳皮膚、脳脊髄液、血漿およびそれらの組み合わせから
なる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は肝臓である。いくつ
かの特定の実施形態では、非肺組織は心臓である。いくつかの特定の実施形態では、非肺
組織は脾臓である。

いくつかの実施形態では、肺への送達に続いて、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質は
非肺細胞に送達される。いくつかの実施形態では、非肺細胞は、肝細胞、上皮細胞、造血
細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞
、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格の筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑液管壁細胞、卵巣
細胞、睾丸細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒白血球、腫瘍
細胞、マクロファージ、好中球、抗原提示細胞（樹状細胞）、線維芽細胞およびそれらの
組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、非肺細胞は肝細
胞である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質は非肺細胞および／また
は組織で、肺への投与後、少なくとも約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、
１８時間、２４時間、またはより長い間で検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍ
ＲＮＡおよび／またはタンパク質は非肺細胞および／または組織で、肺への投与後、少な
くとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間ま
たは１０日間で検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはタン
パク質は非肺細胞および／または組織で、肺への投与後、少なくとも約１週間、２週間、
３週間、４週間、５週間または６週間で検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲ
ＮＡは原位置ハイブリッド形成、ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット
法ヌクレアーゼプロテクションアッセイおよびそれらの組み合わせからなる群から選択さ
れる方法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、タンパク質はウエスタンブロ
ット法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ＢＣＡアッセイ、免疫組織化学法およびそれらの組み合
わせからなる群から選択される方法を使用して検出される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、投与量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇを超える（例
えば約１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３
．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ
／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇまたは１０．０ｍｇ／ｋｇを超える）（体
重）ｍＲＮＡの量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、投与量当たり約
０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．１〜９０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜８０ｍｇ／ｋｇ
、０．１〜７０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜６０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１
〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍ
ｇ／ｋｇ）（体重）の範囲のｍＲＮＡの量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲ
ＮＡは、投与量当たり約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３
０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７
０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ
、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、または
５００ｍｇ、またはそれらを超える量で送達される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは単一の脂質担体媒体でカプセル化される。いくつ
かの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の脂質担体媒体でカプセル化される。いくつかの
実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の脂質担体媒体でカプセル化され、それらの脂質組成
物、脂質成分のモル比、粒径、電荷（ゼータ電位）標的配位子およびそれらの組み合わせ
とは異なる。

いくつかの実施形態では、脂質担体媒体はリポソームである。いくつかの実施形態では
、リポソームは１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコ
レステロール系脂質および１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、
１つ以上のカチオン性脂質はイオン化脂質である。いくつかの実施形態では、１つ以上の
カチオン性脂質は切断可能な脂質である。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン
性脂質はコレステロール由来のカチオン性脂質である。いくつかの実施形態では、１つ以
上のカチオン性脂質はＣ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００
１、ＲＥ−１、ＲＥ−２、ＲＥ−３、ＩＣＥ、ＧＬ−６７、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、Ｄ
ＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡおよびそれらの組み合わせから
選択される。

いくつかの実施形態では、組成物はさらに肺表面活性物質を含む。いくつかの実施形態
では、組成物は呼吸域粒子として製剤化される。いくつかの実施形態では、呼吸域粒子は
約５００μｍ未満の粒径を有する（例えば約４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３０
０μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、または５０μｍ未満）。い
くつかの実施形態では、組成物は噴霧可能な脂質として製剤化される。いくつかの実施形
態では、組成物は乾燥粉末として製剤化される。

様々な実施形態では、本発明はまた非肺細胞または組織へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）の送達方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードする
ｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は被験者の肺に組成物を投
与するステップを含み、さらに肺への投与は、非肺細胞または組織にｍＲＮＡおよび／ま
たはタンパク質の送達をもたらす。

様々な実施形態では、本発明は非肺細胞または組織への治療タンパク質の送達のための
方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび
脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は被験者の肺に組成物を投与するステップ
を含む。

様々な実施形態では、本発明は非肺細胞または組織内のタンパク質の生産を誘発するた
めの方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするｍＲＮＡお
よび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は肺に組成物を投与するステップを含
む。

様々な実施形態では、本発明は疾患または障害を治療するための使用に対して本明細書
に記載のように、タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を提
供し、その方法は被験者の肺に組成物を投与するステップを含み、さらに肺への投与は、
疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織にｍＲＮＡおよび／またはタンパク
質の送達をもたらす。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与すること
を含む、非長細胞または組織へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達方法であって
、肺への前記投与が、前記ｍＲＮＡおよび／または前記タンパク質の非肺細胞または組織
への送達をもたらす、方法。
（項目２）
前記組成物がエアロゾル化、吸入、噴霧化、点滴注入によって前記肺に投与される、項
目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が気管内エアロゾル化によって前記肺に投与される、項目１または２に記載
の方法。
（項目４）
前記非肺細胞が、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、幹細胞
、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格の筋細胞
、β細胞、下垂体細胞、滑液管壁細胞、卵巣細胞、睾丸細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細
胞、網状赤血球、白血球、顆粒白血球、マクロファージ、好中球、抗原提示細胞（樹状細
胞）、線維芽細胞、腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項
目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記非肺細胞が肝細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記非肺組織が、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、リンパ節、皮膚、脳、脳脊髄液、
血漿、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１〜５のいずれか１項
に記載の組成物。
（項目７）
前記非肺細胞が肝臓である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記非肺細胞が心臓である、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記非肺細胞が脾臓である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記ｍＲＮＡが細胞質タンパク質をコードする、項目１〜９のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１１）
前記細胞質タンパク質が酵素、転写因子、シャペロン、およびそれらの組み合わせから
なる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ｍＲＮＡが分泌性タンパク質をコードする、項目１〜９のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１３）
前記ｍＲＮＡが治療タンパク質をコードする、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１４）
前記治療タンパク質が、αガラクトシダーゼ、エリスロポエチン、α１−アンチトリプ
シン、カルボキシペプチダーゼＮ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルフ
ァターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Ａα−グルコサ
ミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ
−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−
６−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレ
ブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダー
ゼ、ヒト成長ホルモン、オルニチントランスカルバミルラーゼ（ＯＴＣ）、カルバミルリ
ン酸塩合成酵素−１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸合成酵素−１（ＡＳＳ１）、アル
ギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜コ
ンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヘパ
ラン−Ｎ−スルファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目
１３に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質が、前記非肺細胞または組織で肺への前記投与後少なくとも約１日間検
出可能である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記タンパク質が、前記非肺細胞または組織で肺への前記投与後少なくとも約２日間検
出可能である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍＲＮＡが投与量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇを超えるｍＲＮＡの量で送達される、
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記脂質担体媒体がリポソームである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記リポソームが１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上
のコレステロール系脂質および１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目１８に記載の方法
。
（項目２０）
前記１つ以上のカチオン性脂質がＣ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、
ＨＧＴ５００１、ＩＣＥ、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ
ＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１９
に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が１つ以上の肺胞界面活性物質をさらに含む、項目１〜２０のいずれか１項
に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が呼吸域粒子として製剤化される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方
法。
（項目２３）
前記呼吸域粒子が約５００μｍ未満の粒径を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物が噴霧可能な脂質として製剤化される、項目１〜２１のいずれか１項に記載
の方法。
（項目２５）
前記組成物が乾燥粉末として製剤化される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法
。
（項目２６）
治療タンパク質が非肺細胞または組織に送達されるように、前記治療タンパク質をコー
ドするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む、被験者の非
肺細胞または組織への前記治療タンパク質を送達する方法。
（項目２７）
治療タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与する
ことを含む被験者の非肺細胞内で治療タンパク質の生産を誘発する方法。
（項目２８）
疾患または障害を治療する方法であって、
治療タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与する
ことと、
肺への前記投与が、疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織に治療タンパ
ク質の送達をもたらすことと、を含む方法。
（項目２９）
前記疾患または障害が表４から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および脂質
担体媒体の経肺送達のための組成物であって、一度肺に投与されるように組成物が製剤化
されると、非肺細胞または組織にｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の前記送達をもたら
す方法。
（項目３１）
タンパク質を生産するために非肺細胞を誘発可能な組成物であって、タンパク質をコー
ドするｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含み、前記組成物が経肺送達のために製剤化される
、組成物。
（項目３２）
前記脂質担体媒体がリポソームである、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記リポソームが１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上
のコレステロール系脂質および１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目３２に記載の組成
物。
（項目３４）
前記１つ以上のカチオン性脂質がＣ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、
ＨＧＴ５００１、ＩＣＥ、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ
ＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３３
に記載の組成物。
（項目３５）
前記組成物が１つ以上の肺胞界面活性物質をさらに含む、項目３０〜３４のうちのいず
れか１項に記載の組成物。
（項目３６）
前記組成物が呼吸域粒子として製剤化される、項目３０〜３４のうちのいずれか１項に
記載の組成物。
（項目３７）
前記呼吸域粒子が約５００μｍ未満の粒径を有する、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記組成物が噴霧可能な脂質として製剤化される、項目３０〜３４のうちのいずれか１
項に記載の組成物。
（項目３９）
前記組成物が吸入のための乾燥粉末として製剤化される、項目３０〜３４のいずれか１
項に記載の組成物。
（項目４０）
前記ｍＲＮＡが細胞質タンパク質をコードする、項目３０〜３９のいずれか１項に記載
の組成物。
（項目４１）
前記細胞質タンパク質が酵素、転写因子、シャペロン、およびそれらの組み合わせから
なる群から選択される、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記ｍＲＮＡが分泌性タンパク質をコードする、項目３０〜３９のいずれか１項に記載
の組成物。
（項目４３）
前記ｍＲＮＡが治療タンパク質をコードする、項目３０〜４２のいずれか１項に記載の
組成物。
（項目４４）
前記治療タンパク質が、αガラクトシダーゼ、エリスロポエチン、α１−アンチトリプ
シン、カルボキシペプチダーゼＮ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルフ
ァターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Ａα−グルコサ
ミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ
−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−
６−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレ
ブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダー
ゼ、ヒト成長ホルモン、オルニチントランスカルバミルラーゼ（ＯＴＣ）、カルバミルリ
ン酸塩合成酵素−１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸合成酵素−１（ＡＳＳ１）、アル
ギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜コ
ンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヘパ
ラン−Ｎ−スルファターゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４
３に記載の組成物。

本出願で使用されるように、「約」および「およそ」という用語は同義語として使用さ
れる。「約」／「およそ」が付く場合でもまたは付かない場合でも、本出願で使用される
任意の数字を当業者が理解するように任意の通常の変動を網羅することを意図する。

本発明の他の特徴、目的および利点は後に続く詳細な説明で明らかになる。しかし、詳
細な説明は本発明実施形態を示すものであるが、限定ではなく例示によってのみ表される
ことが理解されるべきである。本発明の範疇にある様々な変更および修正は、詳細な説明
から当業者に明らかになる。

気管内（ＩＴ）スプレー適用の６時間後のマウスの生物発光イメージング（ＢＬＩ）を示す。（Ａ）パネル１、２、３は、パネル４、５、６中のＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（４０：３０：２５：５）ナノ粒子（ＮＰ）中のＦＦＬ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおけるタンパク質生成と比較した、ネイキッドＦＦＬ ｍＲＮＡで治療されたマウスにおけるタンパク質生成を示す。（Ｂ）パネル３、４、５（Ｃ１２−２００系ＮＰ中の修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）と比較したパネル１、２（ネイキッド修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）。 ＢＬＩを使用した気管内スプレー適用の６時間後のＢＬＩを示す。パネル４、５、６（Ｃ１２−２００系ＮＰ中の修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）と比較したパネル１、２、３（Ｃ１２−２００系ＮＰ中のＦＦＬ ｍＲＮＡ）。 気管内スプレー適用後のマウスのＢＬＩイメージを示す。（Ａ）すべてのマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ）、６時間後のパネル４、５、６と比較した２４時間後のパネル１、２、３。（Ｂ）すべてのマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）、６時間後のパネル３、４、５と比較した２４時間後のパネル１、２。（Ｃ）２４時間後のパネル３、４、５（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）と比較したパネル１、２（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ）。 適用後２４時間でのネイキッドＦＦＬ ｍＲＮＡで治療されるマウスのＢＬＩイメージを示す。パネル１、２（第１の適用後２４時間）、パネル３、４（第２の適用後２４時間）、パネル５、６（第３の適用後２４時間）。 適用後２４時間でのネイキッド修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡで治療されるマウスのＢＬＩイメージを示す。パネル（第１の適用後２４時間）、パネル３、４（第２の適用後２４時間）、パネル５、６（第３の適用後２４時間）。 気管内スプレー適用後６時間でのマウスのＢＬＩイメージを示す。（Ａ）パネル１、２（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ（１０μｇ／マウス））、パネル３、４（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ（５μｇ／マウス）。（Ｂ）パネル１（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（１０μｇ／マウス））、パネル２、３（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（５μｇ／マウス）。 １０μｇ／マウスの投与量で気管内スプレー適用後６時間および２４時間でのマウスのＢＬＩイメージを示す。（Ａ）すべてのマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ）、パネル１、２（２４時間）、パネル３、４（６時間）。（Ｂ）すべてのマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）、パネル１（２４時間）、パネル２（６時間）。（Ｃ）気管内スプレー後２４時間でのパネル１、２（Ｃ１２−２００系ＮＰのＦＦＬ ｍＲＮＡ）とパネル３（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）の比較。 気管内スプレー後５または１０μｇ／マウスの投与量でのＦＦＬの生体内分布およびＣ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ。 気管内スプレー適用後６時間でのマウスのＢＬＩイメージを示す。パネル１、２、３（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）、パネル４、５（ＨＧＴ５００１系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ） １０μｇ／マウスの投与量でＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（４０：２０：３５：５）ナノ粒子の修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの気管内スプレー適用後６時間（パネル１、２）および２４時間（パネル３、４）でのマウスのＢＬＩイメージを示す。 気管内スプレー適用後２４時間でのマウスのＢＬＩイメージを示す。（Ａ）毛皮を取り除かれたマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）。（Ｂ）無傷の毛皮を持つマウス（Ｃ１２−２００系ＮＰの修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）。 ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子配合物、Ｃ１２−２００：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（４０：３０：２５：５）およびＨＧＴ５００１：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（４０：２０：３５：５）の単一の、静脈注射治療の後のマウスの肺、肝臓に検出されるＦＦＬ発光を示す。マウスは投与後６時間および２４時間で屠殺された。 ＰＥＩ系ＮＰで修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（パネル１、２）およびＦＦＬ ｍＲＮＡ（パネル３、４）で噴霧療法後６時間でのマウスのＢＬＩイメージを示す。

定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語を以下で最初に定義する。続く用語
および他の用語の追加の定義は明細書を通して説明する。

アミノ酸：本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」という用語は最も広義では、ポリ
ペプチド鎖に組み込み可能な任意の配合物および／または物質を意味する。いくつかの実
施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ_２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつか
の実施形態では、アミノ酸は自然発生のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミ
ノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はｄ−アミノ酸であり、
いくつかの実施形態では、アミノ酸はｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は自然発生
のペプチドに一般的に存在する２０種類のｌ−アミノ酸のいずれをも意味する。「非標準
アミノ酸」は合成的に調製されたかまたは天然ソースから得られたかに関係なく、標準ア
ミノ酸以外のアミノ酸のいずれをも意味する。本明細書で用いられる場合、「合成アミノ
酸」は化学修飾アミノ酸を含み、塩に限定されず、アミノ酸誘導体（アミドなど）、およ
び／または代用物を含む。ペプチド中のカルボキシおよび／またはアミノ末端アミノ酸を
含むアミノ酸は、ペプチドの循環する半減期を変えることができる他の化学基で、それら
の活動に悪影響を与えることなくメチル化、アミド化、アセチル化、保護基および／また
は代用物によって修飾可能である。アミノ酸はジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸
は１つ以上の化学物質との連携（例えば、メチレン基、アセテート基、アセチル基、リン
酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸塩基、ポリエチレングリコール部分、脂質
部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）の１つ以上の翻訳後修飾を含み得る。「アミノ
酸」という用語は「アミノ酸残基」と同一の意味で使用され、遊離アミノ酸および／また
はペプチドのアミノ酸残基を意味し得る。その用語が遊離アミノ酸またはペプチドの残基
を意味するのかどうかは文脈から明らかである。

動物：本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は動物界の任意のメンバーを意
味する。いくつかの実施形態では、「動物」は発育の任意の段階のヒトを意味する。いく
つかの実施形態では、「動物」は発育の任意の段階の非ヒト動物を意味する。特定の実施
形態では、非ヒト動物は哺乳類（例えば、げっ歯動物、マウス、ネズミ、ウサギ、サル、
イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類および／またはブタ）である。いくつかの実施形態で
は、動物は哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類および／または虫類を含むがこ
れらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は遺伝子導入動物、遺伝子改変動物
、および／またはクローンであり得る。

「およそ」または「約」：本明細書で用いられる場合、「およそ」または「約」という
用語は１つ以上の着目の値に適用され、定まった基準値と類似している値を意味する。特
定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特別に記載されるかまたは文
脈（そのような数値が所定の数値の１００％を超える場合を除き）から明白である場合を
除き、どちらかの方向（超えるかまたは未満）で記載の基準値の２５％、２０％、１９％
、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、
８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に収まる値の範囲を
指す。

投与計画：本明細書で用いられる「投与計画」（または「治療計画」）という用語は、
被験者に個々に投与される、典型的には期間に分離される、一組の単回投与（典型的に１
回を超える）である。いくつかの実施形態では、所与の治療薬は１つ以上の投与を含み得
る、推奨される投与計画を有する。いくつかの実施形態では、投与計画は同一の長さの期
間までに互いから分離される複数の投与を含み、いくつかの実施形態では、投与計画は複
数の投与および個々の投与を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。

発現：本明細書で用いられる場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベントの１つ以上
を意味する：（１）ＤＮＡ配列（例えば、転写によって）からのＲＮＡテンプレートの生
産、（２）ＲＮＡ転写の処理（例えば、組換え、編集、５′キャップ形成、および／また
は３′終点形成）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、および／ま
たは（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。本出願では、「発現」および「
生産」という用語、および文法上の同義語は同一の意味で使用される。

改良、増加または減少：本明細書で用いられる場合、「改良」、「増加」または「減少
」という用語、または文法上の同義語は、本明細書に記載の治療の開始より前の同一の個
体の測定、または本明細書に記載の無治療の１対照被験者（または複数の対照被験者）の
測定などの基線測定と比較して値を示す。「対照被験者」は被験者が治療される同一の病
気の形を患う被験者であり、その人は被験者が治療されるのとおよそ同一の年齢である。

インビトロ：本明細書で用いられる場合、「インビトロ」という用語は人工的な環境、
例えば、多細胞生物内でよりもむしろ、試験管または反応容器、細胞培養などで起こるイ
ベントを意味する。

インビボ：本明細書で用いられる場合、「インビボ」という用語はヒトおよび非ヒト動
物などの多細胞生物内で起こるイベントを意味する。細胞に基づくシステムの文脈では、
生きている細胞内（例えばインビトロ系とは対照的に、）で起こるイベントを意味するの
に、この用語は使用し得る。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で用いられる場合、「メッセンジャーＲ
ＮＡ （ｍＲＮＡ）」という用語は少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを意味する。ｍＲＮＡは本明細書で用いられる場合、修飾および非修飾ＲＮＡの
両方を含む。ｍＲＮＡは、１つ以上のコードおよび非コード領域を含み得る。

核酸：本明細書で用いられる場合、「核酸」という用語は最も広義では、ポリヌクレオ
チド鎖に組み込まれる、または組み込み可能な任意の配合物および／または物質を意味す
る。いくつかの実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合を介してポリヌクレオチド
鎖に組み込まれる、または組み込み可能な配合物および／または物質である。いくつかの
実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレ
オシド）を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基を含むポリヌ
クレオチド鎖を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡならびに一本およ
び／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」
、「ＲＮＡ」という用語、および／または類似の用語は核酸類似体、すなわち、リン酸ジ
エステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で周知であり、骨格のリン
酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明
の範囲内と考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は互
いの縮退したバージョンであるか、かつ／または同一のアミノ酸配列をコードするすべて
のヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲ
ＮＡはイントロンを含み得る。核酸は天然ソースからの精製、組換発現系を使用した生成
および任意の精製、化学的合成などが可能である。適切には、例えば化学的に合成した分
子の場合、核酸は化学修飾塩基または糖、骨格修飾などの類似体を有するヌクレオシド類
似体を含むことができる。核酸配列は、別様が指示されない限り、５′〜３′方向に提示
される。いくつかの実施形態では、核酸は天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チ
ミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デ
オキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミ
ノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシ
ン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、
２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨード
ウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシ
チジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オ
キソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシ
チジン）、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、層間塩基、修飾
糖質（例えば、２′−フルオロリボース、リボース、２′−デオキシリボース、アラビノ
ース、および六炭糖）、および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオネートおよ
び５′−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であるか、それらを含む。いくつかの実施形態では
、本発明は核酸（ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、例えば、ポリヌクレ
オチドおよび残基）が送達を促進するか、または達成するために、化学的に修飾されてい
ないことを意味する「非修飾核酸」を特に対象とする。

患者：本明細書で用いられる場合、「患者」または「被験者」という用語は、提供され
る組成物が例えば、実験的、診断的、予防的、美容的および／または、治療目的のために
投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者は動物（例えば、マウス、ネズミ、
ウサギ、非ヒト霊長類などの哺乳類、および／またはヒト）を含む。いくつかの実施形態
では、患者はヒトである。ヒトは出生前後の形態を含む。

薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いられる場
合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の
問題または合併症を伴わず、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切であり、
妥当な損益比に相応する物質を意味する。

ポリペプチド：本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」は、一般的に、ペプチド
結合によって互いに付着する少なくとも２つのアミノ酸の列である。いくつかの実施形態
では、ポリペプチドは、少なくとも３〜５のアミノ酸を含み得、それらの各々は少なくと
も１つのペプチド結合によって互いに付着する。当業者はポリペプチドが任意に、ポリペ
プチド鎖に統合可能であるにもかかわらず「非天然」アミノ酸または他の物質を含むこと
があることを理解するであろう。

タンパク質：本明細書で用いられる場合、「タンパク質」または「治療タンパク質」と
いう用語はポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連鎖する少なくとも２
つのアミノ酸の列）を意味する。タンパク質はアミノ酸（例えば、糖タンパク質、プロテ
オグリカン、など）以外の部分を含み得、かつ／またはそうでなければ処理または修正し
得る。当業者は「タンパク質」は細胞（単一配列を伴うかまたは伴わない）によって生成
される完全なポリペプチド鎖またはそれらの特徴的な部分であり得ることを理解するであ
ろう。当業者はタンパク質が、例えば１つ以上のジスルフィド結合に連鎖されるか、また
は他の手段で関連付けられる、１つを超えるポリペプチド鎖を含み得ることがあることを
理解するであろう。ポリペプチドはｌ−アミノ酸、ｄ−アミノ酸、または両方および当技
術分野で周知である任意の各種アミノ酸修飾または類似体を含み得る。有用な修飾は、例
えば、末端のアセチル化、アミド化、メチル化を含む。いくつかの実施形態では、タンパ
ク質は天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸およびそれらの組み合わせを含
み得る。「ペプチド」という用語は一般的に、約１００未満のアミノ酸、約５０未満のア
ミノ酸、２０未満のアミノ酸、または１０未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを
意味するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体、抗体断片、そ
れらの生物学的に活性な部分、および／またはそれらの特徴的な部分である。

被験者：本明細書で用いられる場合、「被験者」という用語はヒトまたは任意の非ヒト
動物（例えば、マウス、ネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは
霊長類）を意味する。ヒトは出生前後の形態を含む。多くの実施形態では、被験者はヒト
である。被験者は患者であり得、診断または疾患の治療のために医療提供者に現れている
ヒトを意味する。本明細書で用いられる「被験者」という用語は「個人」または「患者」
と同一の意味で使用される。被験者は疾患または障害を患っているか、感染し易い可能性
があるが、疾患または障害の徴候を示さないかもしれない。

治療上有効な量：本明細書で用いられる場合、治療薬の「治療上有効な量」という用語
は、疾患、障害、および／または状態の治療、診断、予防、および／または症状（複数可
）の発症を遅らせるために疾患、障害、および／または状態に悩まされているかまたは感
染し易い被験者に対して投与するときに、十分な量を意味する。当業者は治療上有効な量
は、典型的に少なくとも１回の投与単位を含む投与計画を介して投与されることを理解す
るであろう。

治療：本明細書で用いられる場合、「治療」（また「治療する」もしくは「治療してい
る」）という用語は、部分的にまたは完全に１つ以上の症状、症候、および／または特定
の疾患の原因、障害、および／または状態（例えば、インフルエンザ）を緩和し、回復さ
せ、蘇生させ、阻害し、発症を遅らせ、重症度を減少させ、かつ／または発生率を減少さ
せる任意の物質の投与（例えば、提供される組成物）を意味する。そのような治療は関連
する疾患、障害、および／または状態の徴候を示さない被験者および／または疾患、障害
、および／または状態の初期の徴候を示す被験者のためであり得る。あるいはまたはさら
に、そのような治療は関連する疾患、障害および／または状態の１つ以上の確立した徴候
を示す患者のためであり得る。いくつかの実施形態では、治療は関連する疾患、障害およ
び／または状態に悩まされていると診断される被験者のためであり得る。いくつかの実施
形態では、治療は関連する疾患、障害および／または状態の発生の増加する危険性が統計
学的に相関される１つ以上の感染性因子を有すると周知の被験者のためであり得る。

詳細な説明
本発明、とりわけ、経肺送達に基づいてｍＲＮＡおよび／またはそのタンパク質生成物
の全身的な送達のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明
は、非肺細胞および組織へのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の送達のために、被験者
の肺へのｍＲＮＡおよび脂質担体媒体を含む組成物の投与方法を提供する。いくつかの実
施形態では、単一のタンパク質をコードするｍＲＮＡが送達される。いくつかの実施形態
では、１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ種が送達される。いくつか
の実施形態では、ｍＲＮＡは単一の脂質担体媒体（例えばリポソームまたは脂質由来ナノ
粒子）を使用して送達される。いくつかの実施形態ではｍＲＮＡは１つ以上の脂質担体媒
体を使用して送達される。

本発明の様々な態様は後に続く節で詳細に説明される。節の使用は、本発明を制限する
ものではない。各節は本発明のどんな態様にも適用できる。本出願では、「または」の使
用は、明言されない限り「および／または」を意味する。
ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ合成物

本発明に従うｍＲＮＡは任意の各種周知の方法に従い合成され得る。例えば、本発明に
従うｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔に言えば、ＩＶＴ
は典型的にプロモーターを含む直鎖または環状ＤＮＡテンプレート、リボヌクレオチド三
リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得るバッファシステム、および
適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、
ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤で実施される。
正確な状態は、特定の適用に従い変化する。

いくつかの実施形態では、本発明に従うｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡテンプレート
はインビトロで転写される。適切なＤＮＡテンプレートは、典型的にはプロモーター、例
えば、インビトロで転写のためのＴ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを有し、望ましい
ｍＲＮＡおよび終結信号のための望ましいヌクレオチド配列がそれに続く。

本発明に従うｍＲＮＡ配列は、標準方法を使用してＤＮＡテンプレートに決定しかつ組
み込むことができる。例えば、望ましいアミノ酸配列から始まり、仮想逆翻訳は遺伝子コ
ードの縮退に基づいて実施される。最適化アルゴリズムは続いて、適切なコドンの選択の
ために使用できる。典型的に、Ｇ／Ｃ含量は一方で可能な限り高いＧ／Ｃ含量に達するよ
う最適化され、他方でコドン使用頻度に従ってｔＲＮＡの頻度を最大限考慮に入れる。最
適化されたＲＮＡ配列は、例えば、適切な表示装置を使用し、かつ第１の（野生型）配列
と比較して設置かつ表示可能である。第２の構造はまた、安定化または不安定化特性、ま
たはそれぞれＲＮＡの領域を計算するために分析可能である。

本発明に従うｍＲＮＡは、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成され得る。いくつかの
実施形態では、免疫原性を減らし、ならびにｍＲＮＡの安定性を改善するためにトール様
受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびレチノイド誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）で
ｍＲＮＡ相互作用を廃止するために、ｍＲＮＡは１つ以上の化学的または構造修飾を含み
得る。

例えば、特定の実施形態では、１つ以上のプソイドウリジン残基を含むために、米国特
許公報第２００９／０２８６８５２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載され
るように、ｍＲＮＡは修飾され得る。Ｋｏｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ２９（２）：１５４−１５７（２０１１）は、２−チオウリジンおよび５−
メチルシチジンでウリジンおよびシチジンの置換を記載し、ｍＲＮＡ結合を相乗効果的に
減少させ、認識受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＲＩＧ−Ｉをパターン化して
、ｍＲＮＡの安定性を増す。ＥＰ２４５９２３１を参照されたい。さらに他の実施形態で
は、欧州出願第ＥＰ１０７４２０８９号（参照により本明細書に組み込まれる）で記載さ
れる免疫原性を減らすために、ｍＲＮＡは修飾され得る。

他の実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含むこ
とができる。本発明に従う修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基
修飾をこのように含むことができる。いくつかの実施形態では、関心のタンパク質をコー
ドするｍＲＮＡは、自然発生のヌクレオチドやヌクレオチド類似物（修飾ヌクレオチド）
から合成され得、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはピリミジン（チミン（
Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、および例えば１−メチル−アデニン、２−メチ
ル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−ア
デニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン
、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチ
ル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グア
ニン、イノシン、１−メチル−イノシン、プソイドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ
−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメ
チル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フル
オロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル
、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ
酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシルアミノメチル
−２−チオ−ウラシル、５′−メトキシルカルボキシメチル−ウラシル、５−メトキシル
−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、１−メチル−プソイドウラシル、クエオシン、β−Ｄ−マンノシル−クエオシン、ワ
イブトキソシンなどの修飾ヌクレオチド類似体またはプリンおよびピリミジン誘導体、お
よびホスホロアミド酸、ホスホロチオネート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸
、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンを含むがこれに限定されな
い。そのような類似体の調製は当業者にとって、例えば、米国特許第４，３７３，０７１
号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４
，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７
号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５
，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０
号および第５，７００，６４２号から周知であり、参照によりその開示の全体が本明細書
に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇ．Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、Ｊ．
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５０：２３８−２４７（２０１１）およびＷ
Ｏ２０１０／０５３５７２を参照されたい。修飾ヌクレオシドの広範囲なリストを提供す
るＵＳ２００９／０２８６８５２の¶¶５５および６８−７５、およびｍＲＮＡの安定性
およびタンパク質生産を増やすために多数のｍＲＮＡの修飾を記述するＷＯ２００８／０
５２７７０（参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的に、骨格修飾
は、その中でＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾
である。代表的な骨格修飾は典型的に他のアニオン性、カチオン性、または中性塩基によ
ってリン酸ジエステル結合を置換することによって意味する、メチルホスホン酸、メチル
ホスホロアミド酸、ホスホロアミド酸、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５′−Ｏ
−（１−チオリン酸塩）、ボラノリン酸、正帯電グアニジウム基などからなる群からの修
飾を含むがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾はｍＲＮＡが
含むヌクレオチドの糖の化学的修飾であり、２′−デオキシ−２′−フルオロ−オリゴリ
ボヌクレオチド（２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン５′−三リン酸、２′−フル
オロ−２′−デオキシウリジン５′−三リン酸）、２′−デオキシ−２′−ジアミン−オ
リゴリボヌクレオチド（２′−アミノ−２′−デオキシシチジン５′−三リン酸、２′−
アミノ−２′−デオキシウリジン５′−三リン酸）、２′−Ｏ−アルキルオリゴリボヌク
レオチド、２′−デオキシ−２′−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２′−Ｏ−メ
チルシチジン５′−三リン酸、２′−メチルウリジン５′−三リン酸）、２′−Ｃ−アル
キルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２′−アラシチジン５′−三リン
酸、２′−アラウリジン５′−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２′−アジド−２′
−デオキシシチジン５′−三リン酸、２′−アジド−２′−デオキシウリジン５′−三リ
ン酸）からなる群から選択される糖修飾を含むがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得
る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。そのような
塩基修飾ヌクレオチドの例は、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５′−三リン酸、
２−アミノアデノシン５′−三リン酸、２−チオシチジン５′−三リン酸、２−チオウリ
ジン５′−三リン酸、４−チオウリジン５′−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５′
−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５′−三リン酸、５−ブロモシチジン５′−三リ
ン酸、５−ブロモウリジン５′−三リン酸、５−ヨードシチジン５′−三リン酸、５−ヨ
ードウリジン５′−三リン酸、５−メチルシチジン５′−三リン酸、５−メチルウリジン
５′−三リン酸、６−アザシチジン５′−三リン酸、６−アザウリジン５′−三リン酸、
６−クロロプリンリボシド５′−三リン酸、７−デアザアデノシン５′−三リン酸、７−
デアザグアノシン５′−三リン酸、８−アザアデノシン５′−三リン酸、８−アジドアデ
ノシン５′−三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド５′−三リン酸、Ｎ１−メチルアデ
ノシン５′−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５′−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシ
ン５′−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５′−三リン酸、プソイドウリジン５′−三
リン酸、プロマイシン５′−三リン酸またはキサントシン５′−三リン酸を含むがこれら
に限定されない。

特定の実施形態では、安定化修飾はｍＲＮＡの３′および５′末端の一方または両方に
作製され得、例えば、終点キャップ、ポリＡテール、不安定な非コード配列の置換（アデ
ニル酸ウリジル酸リッチ領域（ＡＲＥ）または追加または安定ｍＲＮＡの３′または５′
非翻訳配列（例えば、βグロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、ま
たはクエン酸回路酵素ｍＲＮＡなど）を含む。安定化修飾はまたｍＲＮＡ内で作製され得
、例えば、コドン最適化および／またはコザック配列の修飾および／または修飾ヌクレオ
シドの取り込み（例えば、ピロロ−ピリミジン、Ｃ５−ヨードウリジン、２−アミノアデ
ノシン、および２−チオチオチミジンなど）を含む。特定の実施形態では、方法で使用さ
れる修飾ｍＲＮＡおよび本発明の組成物はＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子からの５′非
翻訳配列：
ＸＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣ
ＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧ
ＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡ
ＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧを含み、式中Ｘ、現在がＧＧＡの場合（配列番号
１）、または少なくとも９０％または少なくとも９５％配列番号１と同一である配列、お
よび／またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）からの３′非翻訳配列：
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧ
ＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣ
ＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ（配列番号２）、またはヌクレアーゼ耐性を
改善しかつ／またはｍＲＮＡの半減期を改善するために少なくとも９０％または少なくと
も９５％配列番号２と同一である配列。ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列の増加した安定性
に加えて、驚くべきことにＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の非翻訳配列および／または
ｈＧＨ遺伝子からの非翻訳配列の包含はｍＲＮＡの翻訳をさらに強化することが発見され
た。

典型的に、ｍＲＮＡ合成物はＮ−末端（５′）終点に対する「キャップ」、およびＣ−
末端（３′）終点に対する「鎖」の追加を含む。キャップの存在は、大部分の真核細胞に
見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「鎖」の存在は、エキソヌク
レアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。

このように、いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは５′キャップ構造を含む。
５′キャップは典型的に次のように追加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼは５
′ヌクレオチドからの末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残し、グアノシ
ン三リン酸（ＧＴＰ）は続いてグアニリルトランスフェラーゼを通して末端リン酸に追加
され、５′５′５三リン酸結合を生成し、グアニンの７−窒素はメチルトランスフェラー
ゼによってメチル化される。キャップ構造の例はｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′（Ａ，Ｇ（
５′）ｐｐｐ（５′）ＡおよびＧ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇを含むがこれらに限定されな
い。

いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは３′ポリ（Ａ）鎖構造を含む。ｍＲＮＡ
の３′末端上のポリＡ鎖は典型的に約１０〜３００のアデノシンヌクレオチド（例えば、
約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０のアデノシンヌクレオチド、
約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０のアデノシンヌクレオチド、ま
たは約２０〜６０のアデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、本発明
のｍＲＮＡは３′ポリ（Ｃ）鎖構造を含む。ｍＲＮＡの３′末端上の適切なポリＣ鎖は典
型的に約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌク
レオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチ
ド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド
）を含む。ポリＣ鎖はポリＡ鎖に追加可能であるか、またはポリＡ鎖を置換し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは５′および／または３′非翻訳領域を含
む。いくつかの実施形態では、５′非翻訳領域はｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する
１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５′非翻訳領域
は約５０〜５００の間のヌクレオチドの長さであり得る。

いくつかの実施形態では、３′非翻訳領域はポリアデニル化シグナルの１つ以上、細胞
内での配置のｍＲＮＡの安定性に影響するタンパク質の１つの結合部位、マイクロＲＮＡ
の１つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３′非翻訳領域は５０〜５００
の間のヌクレオチドの長さまたはそれより長くあり得る。
ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質

本発明の組成物および方法で使用されるｍＲＮＡは、非肺組織および細胞への送達のた
めに全長、切断、天然または修飾タンパク質を発現するために使用され得る。いくつかの
実施形態では、ｍＲＮＡはタンパク質（すなわち、治療タンパク質）をコードする少なく
とも１つのｍＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の遺伝子産
物をコードする複数のｍＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、各々が
異なる遺伝子産物をコードする少なくとも２つのｍＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態
では、ｍＲＮＡは全長タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは自
然発生の全長タンパク質の切断されたバージョンをコードする。いくつかの実施形態では
、ｍＲＮＡは単一転写の異なる遺伝子産物からの１つ以上の切断タンパク質をコードする
。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキメラタンパク質をコードし、その中で１つ以上
のタンパク質配列は天然タンパク質とは自然に関連せず、発現の間、結果として生じるキ
メラタンパク質でペプチド結合によって連鎖される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ
は天然タンパク質以上のレベルの細胞活動を含む部分または全長タンパク質を発現するた
めに使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは天然タンパク質以下のレベルの
細胞活動で部分または全長タンパク質を発現するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施
形態では、ｍＲＮＡは細胞質タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
Ａはアクチン細胞骨格と関連したタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍ
ＲＮＡは形質膜と関連したタンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、ｍ
ＲＮＡは膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、ｍＲＮＡはイ
オンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは核周囲タン
パク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは核タンパク質をコードする。
いくつかの特定の実施形態では、ｍＲＮＡは転写因子をコードする。いくつかの実施形態
では、ｍＲＮＡはシャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
Ａ細胞内酵素（例えば、尿素回路またはリソソーム貯蔵代謝性障害に関連した酵素をコー
ドするｍＲＮＡ）をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞代謝、ＤＮ
Ａ修復、転写および／または翻訳を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態で
は、ｍＲＮＡは細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは細
胞外基質に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態ではｍＲＮＡは分泌性
タンパク質をコードする。特定の実施形態では、組成物で使用されるｍＲＮＡおよび本発
明の方法は、１つ以上の標的細胞によって、周囲の細胞外液（例えば、ホルモンおよび神
経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）に排出または分泌される機能的なタンパク質または酵
素を発現するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、分泌性タンパク質をコードす
るｍＲＮＡの送達を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、
表１に記載の１つ以上の分泌性タンパク質をコードするｍＲＮＡ送達を提供し、このよう
に、本発明の組成物は本明細書に規定の他の成分とともに、表１（またはそれらの相同体
、後述のように）に記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得、本発明の方法は本
明細書に規定の他の成分とともに、表１（またはそれらの相同体、後述のように）に記載
のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物を調製および／または投与することを含
み得る。

表１で説明されるユニプロットＩＤは、各々の記載されるタンパク質および配列がユニ
プロットデータベースから入手可能なヒトのバージョンを意味する。記載されたタンパク
質の配列は、一般に様々な哺乳類および様々な動物および獣医学の動物または産業的対象
を含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明
の組成物および方法は、表１に記載される分泌性タンパク質の獣医学の動物または産業的
対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする１
つ以上のｍＲＮＡの送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書に規定の他
の成分とともに表１に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類
の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得、本発明の
方法は本明細書に規定の他の成分とともに表１に記載されるタンパク質の獣医学の動物ま
たは産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするｍ
ＲＮＡを含む組成物を調製および／または投与することを含み得る。いくつかの実施形態
では、哺乳類の相同体は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウマ、ブタ、ウシ
、ラマ、アルパカ、ミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、またはラクダの相
同体から選択される。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的対象は上述の
哺乳類および／またはニワトリ、カモ、シチメンチョウ、サケ、ナマズ、またはティラピ
アから選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表２に記載の１つ以上の追加
の代表的なタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ送達を提供し、このように、本発
明の組成物は本明細書に規定の他の成分とともに、表２（またはそれらの相同体、後述の
ように）に記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得、本発明の方法は本明細書に
規定の他の成分とともに、表２（またはそれらの相同体、後述のように）に記載のタンパ
ク質から選択されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物を調製および／または
投与することを含み得る。

表２で説明されるユニプロットＩＤは、各々の記載される仮想タンパク質および配列が
ユニプロットデータベースから入手可能なヒトのバージョンを意味する。記載されたタン
パク質の配列は、様々な哺乳類および様々な動物および獣医学の動物または産業的対象を
含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の
組成物および方法は、表２に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から
哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡの
送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書に規定の他の成分とともに表２
に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同
体から選ばれるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得、本発明の方法は本明細書に規
定の他の成分とともに表２に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から
哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物
を調製および／または投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳類の相同
体は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウマ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカ、
ミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、またはラクダの相同体から選択される
。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的対象は上述の哺乳類および／また
はニワトリ、カモ、シチメンチョウ、サケ、ナマズ、またはティラピアから選択される。

実施形態では、本発明の組成物および方法は、表３から選択されるリソソームタンパク
質をコードするｍＲＮＡの送達を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物お
よび方法は、表３に記載の１つ以上のリソソームおよび／または関連するタンパク質をコ
ードする１つ以上のｍＲＮＡ送達を提供し、このように、本発明の組成物は本明細書に規
定の他の成分とともに、表３（またはそれらの相同体、後述のように）に記載のタンパク
質をコードするｍＲＮＡを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに、
表３（またはそれらの相同体、後述のように）に記載のタンパク質から選択されたタンパ
ク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物を調製および／または投与することを含み得る。

リソソームタンパク質に関する情報はＬｕｂｋｅら、“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｌｙｓｏｓｏｍｅ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００９
）１７９３：６２５-６３５から入手可能である。いくつかの実施形態では、表３に記載
され、本発明の組成物および方法においてｍＲＮＡでコードされたタンパク質はヒトタン
パク質である。記載されたタンパク質の配列は、様々な哺乳類および様々な動物および獣
医学の動物または産業的対象を含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いく
つかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表３に記載されるタンパク質の獣医
学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコ
ードする１つ以上のｍＲＮＡの送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書
に規定の他の成分とともに表３に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象
から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み得
、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに表Ｓ３に記載されるタンパク質の獣
医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質を
コードするｍＲＮＡを含む組成物を調製および／または投与することを含み得る。いくつ
かの実施形態では、哺乳類の相同体は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウマ
、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカ、ミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、また
はラクダの相同体から選択される。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的
対象は上述の哺乳類および／またはニワトリ、カモ、シチメンチョウ、サケ、ナマズ、ま
たはティラピアから選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表４に記載される治療タンパ
ク質（例えば、細胞質、膜貫通または分泌性）をコードするｍＲＮＡの送達を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表４に記載の疾患または障害（
すなわち、適応症）を治療するための有用な治療タンパク質をコードするｍＲＮＡ送達を
提供し、このように、本発明の組成物は、表４に記載の疾患または障害（すなわち、適応
症）を治療するための本明細書に規定の他の成分とともに、表４（またはそれらの相同体
、後述のように）に記載のまたは記載されない治療タンパク質をコードするｍＲＮＡを含
み得、本発明の方法は、表４に記載の疾患または障害の治療のために本明細書に規定の他
の成分とともに、そのようなタンパク質（またはそれらの相同体、後述のように）をコー
ドするｍＲＮＡを含む組成物を調製および／または投与することを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明の１つ以上の治療タンパク質は表１、２、３または４
から選択される。いくつかの特定の実施形態では、１つ以上の治療タンパク質は、αガラ
クトシダーゼ、エリスロポエチン、α１−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼＮ
、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、リソソーム酸
性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Ａα−グルコサミニドアセチルトランスフェラー
ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−
スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸塩スルファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファ
ミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモン、オルニチ
ントランスカルバミルラーゼ（ＯＴＣ）、カルバミルリン酸塩合成酵素−１（ＣＰＳ１）
、アルギニノコハク酸合成酵素−１（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ
）、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ
）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼおよび
それらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明は表１、２、３または４に記載のタンパク質で記載ま
たは関連付けられる疾患または障害に罹患した被験者を予防、治療および／または治癒す
るために使用される。本発明の組成物および方法が用いられ得る疾患または障害は、ＳＭ
Ｎ１関連脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＧＡＬＴ関連ガラク
トース血症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ＳＬＣ３Ａ１関連障害、シスチン尿症、ＣＯＬ４Ａ
５関連障害、アルポート症候群、ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症、Ｘ連鎖副腎脳白質ジ
ストロフィー、副腎脊髄神経障害、フリートライヒ失調症、ペリツェウス‐メルツバッハ
ー病、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２関連結節性硬化症、Ｂ型サンフィリポ症候群（ＭＰＳ Ｉ
ＩＩＢ）、ＣＴＮＳ関連シスチン症、ＦＭＲ１関連障害、脆弱Ｘ症候群を含む、脆弱Ｘ関
連振動／運動失調症候群、脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群、プラデル−ウィリ症候群、ファブ
リー病、遺伝出血性毛細管拡張症（ＡＴ）、ニーマンピック病Ｃ１型、神経セロイドリポ
フスチン関連疾患、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年性バッテン病
、サンタヴォリハルティア病、ヤンスキービールショースキー病、ＰＴＴ−１欠乏症、Ｔ
ＰＰ１欠乏症、ＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩ
Ｆ２Ｂ５関連中枢神経系ミエリン形成不全／消滅白質による小児運動失調、ＣＡＣＮＡ１
ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連発作性運動失調症２型、ＭＥＣＰ２関連障害、古典的なレット
症候群、ＭＥＣＰ２関連重度の新生児脳症、ＰＰＭ−Ｘ症候群、ＣＤＫＬ５関連非定型レ
ット症候群、ケネディ病（ＳＢＭＡ）、Ｎｏｔｃｈ−３関連皮質下梗塞および白質脳症を
伴う脳常染色体優性動脈疾患（ＣＡＤＡＳＩＬ）、ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連発作
疾患、ポリメラーゼＧ関連障害、アルパース−フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感
覚性失調性神経障害、構音障害、眼不全麻痺、ミトコンドリアＤＮＡ削除による常染色体
優性および劣性進行性外眼筋麻痺、Ｘ連鎖副腎形成不全、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症
、ウィルソン病および血液凝固障害などの障害を含むがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるｍＲＮＡは、抗体を
コードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つを超える遺伝子によってコードさ
れるサブユニットからなるタンパク質をコードする。例えば、タンパク質はヘテロ二量体
であり得、その各鎖またはサブユニットは別個の遺伝子によってコードされる。あるいは
、単一のｍＲＮＡは１つを超えるサブユニットをコードするために操作され得る。ある実
施形態において、ｍＲＮＡは被験者に免疫を与えるために、全長抗体（可変部および定常
部の重鎖および軽鎖の両方）または抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ））をコードし得る。

本明細書で用いられる場合、「重鎖」という用語は免疫グロブリンの異なるクラスのす
べての型の自然発生の重鎖を含み、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ
（α）、およびＩｇＥ（ε）、および生物学的に活性であるそれらの変異体を含むが、こ
れらに限定されない。典型的に、本発明に従う重鎖は抗原認識の役割を果たすＮ−末端可
変部を含み、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、４つのフレームワーク
部（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ２、およびＦＲ４）で分離される。典型的に、Ｎ−末端可変部
は約１００〜１１０またはそれらを超えるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本
発明に従う重鎖は定常部ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）の
１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖をコードするｍＲＮＡは０．３ｋ
ｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１．０ｋｂ、１．２５ｋｂ、１．５ｋｂ、１．７５ｋｂ
、２．０ｋｂ、２．５ｋｂ、３．０ｋｂ、３．５ｋｂ、４．０ｋｂ以上の長さである。

本明細書で用いられる場合、「軽鎖」という用語は免疫グロブリンの異なるクラスのす
べての型の自然発生の重鎖を含み、κまたはλアイソタイプおよび生物学的に活性である
それらの変異体を含むが、これらに限定されない。典型的に、本発明に従う軽鎖はＮ−末
端可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明に従う軽鎖はＣ−末端
定常部ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、抗
体の軽鎖をコードするｍＲＮＡは０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０
．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１．０ｋｂ、１．２５ｋ
ｂ、１．５ｋｂ、１．７５ｋｂ、２．０ｋｂ、２．５ｋｂ、または３．０ｋｂ以上の長さ
である。

本発明に従い、抗体の重鎖および軽鎖は単一ｍＲＮＡまたは分離ｍＲＮＡによってコー
ドされ、かつ送達され得る。十分に集められた機能的な抗体の生産を最適化するために様
々な比率でｍＲＮＡをコードする重鎖およびｍＲＮＡをコードする軽鎖を送達することが
有利な場合があると意図される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは付加的に１つの抗体、抗体断片（複数可）、また
は他のタンパク質（複数可）に操作可能に連鎖され、かつそれらの直接的な分泌である１
つ以上の分泌リーダー配列をコードし得る。適切な分泌リーダー配列は、例えば、ＵＳ２
００８／０２８６８３４Ａ１に記載される。本発明発明の一実施形態は被験者に免疫を与
えるために有用な方法および組成物に関するが（例えば、機能的な抗体をコードするｍＲ
ＮＡの翻訳を通して）、本明細書に開示され、ここに意図される発明は広く適用可能であ
る。他の実施形態では、本発明の組成物は被験者の機能的反応に一時的または慢性的に作
用するために使用され得る抗体をコードする。例えば、本発明のｍＲＮＡは、モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体をコードし得、標的細胞からの翻訳および分泌において生
物学的標的（例えば、腫瘍壊死因子受容体などの刺激性サイトカイン）を標的および／ま
たは不活性化するために使用され得る。
脂質担体媒体

標的細胞に核酸の送達を促進する脂質担体媒体の使用は本発明によって意図される。脂
質担体媒体（例えば、リポソームおよび脂質由来のナノ粒子）は、一般的に研究、産業、
および医学における様々な用途、特にインビボで診断または治療的配合物の移動媒体とし
てのそれらの使用において有用であり、（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）通常１つ以上の二分子層の膜による外部媒
体から隔離された内部の水スペースを有する微細な小胞として特徴付けられる。リポソー
ムの二分子層膜は、典型的に空間的に分離された親水的および疎水的ドメインを含む合成
脂質または天然物由来物などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二分
子層膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム、
など）によっても形成できる。

本発明の文脈では、脂質担体媒体は典型的にｍＲＮＡを標的細胞に移送する役割を果た
す。本発明の１つの予期しない、有利な特色は、脂質担体媒体内でカプセル化されるｍＲ
ＮＡの経肺投与が、非肺細胞および組織へのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の送達を
もたらすという観察であった。本発明の目的のために、リポソーム型移動媒体は望ましい
核酸を含むよう調製される。リポソームへの望ましい実体（例えば、核酸）の取り込み処
理はしばしば「積み込み」（Ｌａｓｉｃら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２
５８，１９９２）と言及される。リポソーム取り込み核酸はリポソームの内部スペースに
完全にまたは部分的に配置され得、リポソームの二分子層膜の内部、またはリポソーム膜
の外面に付着する。リポソームへの核酸の取り込みは本明細書で「カプセル化」として言
及され、核酸はリポソームの内部のスペースの中で、完全に含まれる。リポソームなどの
移動媒体にｍＲＮＡを取り込む目的は、しばしば核酸の急速な排出を引き起こす核酸およ
び／または系統または受容体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保
護することにある。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、選択された移動媒体
はそれに含まれるｍＲＮＡの安定性を増強することが可能である。リポソームは、カプセ
ル化されるｍＲＮＡが標的細胞に達することを可能にし、かつ／または優先的に、経肺送
達の後、カプセル化されるｍＲＮＡが非肺組織および細胞に達することを可能にする。

いくつかの実施形態では、適切な脂質担体媒体は脂質ナノ粒子として製剤化される。本
明細書で用いられる場合、「脂質ナノ粒子」および「脂質担体媒体」および「脂質由来ナ
ノ粒子」という句は、すべて同一の意味で使用され、１つ以上の脂質（例えば、カチオン
性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質およびＰＥＧ修飾脂質）を含む送達媒
体を意味する。意図される脂質ナノ粒子は１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質
、コレステロール系脂質およびＰＥＧ修飾脂質を用いて変化する比率の複数成分の脂質混
合物を含むことによって調製され得る。適切な脂質の例は、例えば、ホスファチジル配合
物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリ
オシド）を含む。

カチオン性リポソーム／ｍＲＮＡ複合体は、ｍＲＮＡを酵素的分解から保護し、負帯電
性細胞膜と相互作用することによって細胞内送達を促進できる。しかし、インビボでリポ
プレックスの半減期を減らすために役立つ負帯電性タンパク質で、これらのリポプレック
スのカチオン性表面も、強い相互作用を媒介する。カチオン性リポソーム／ｍＲＮＡ複合
体および負帯電性タンパク質の間の相互作用を減らすためにメカニズムの１つ以上を用い
ることによって、この影響は減らされるかもしれない。大部分の実施形態において、本発
明の組成物および方法で使用される送達媒体は、中性またはヘルパー脂質およびＰＥＧ修
飾脂質などの１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質組み合わせから構築されるナ
ノ粒子を含む。

脂質ナノ粒子

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体は脂質ナノ粒子として製剤化される。本発明
の脂質ナノ粒子は１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレス
テロール系脂質およびＰＥＧ修飾脂質）を含む。送達媒体としてのポリマーの使用も、単
独で、または他の送達媒体と組み合わせることが意図される。いくつかの実施形態では、
送達媒体は非肺組織に経肺送達および転位を促進するその能力に基づいて、選択される。

本明細書で用いられる場合、リポソーム型送達媒体、例えば脂質ナノ粒子は、通常１つ
以上の二分子層の膜による外部媒体から隔離された内部の水スペースを有する微細な小胞
として特徴付けられる。リポソームの二分子層膜は、典型的に空間的に分離された親水的
および疎水的ドメインを含む合成脂質または天然物由来物などの両親媒性分子によって形
成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１
，１９９８）。リポソームの二分子層膜は、両染性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、
ポリマーソーム、ニオソーム、など）によっても形成できる。本発明の文脈では、リポソ
ーム型送達媒体は典型的に望ましいｍＲＮＡを標的組織に移送する役割を果たす。リポソ
ームへの核酸の取り込みは本明細書で「カプセル化」として言及され、核酸はリポソーム
の内部のスペースの中で、完全に含まれる。リポソームなどの移動媒体にｍＲＮＡを取り
込む目的は、しばしば核酸の急速な排出を引き起こす核酸および／または系統または受容
体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保護することにある。したが
って、いくつかの実施形態では、適切な送達媒体はそれに含まれるｍＲＮＡの安定性を増
強することが可能であり、かつ／または標的細胞または組織へのｍＲＮＡの送達を促進す
る。

本発明の特定の実施形態では、担体は、担体として単独で、または他の担体と組み合わ
せてポリマーを使用して製剤化される。適切なポリマーは、例えば、ポリアクリレート、
ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマ
ー、ポリカプロラクトン、デクストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲ
ン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ
化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み得る。ＰＥＩが存在する場合、１０
から４０ｋＤＡにわたる分子量の分枝ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝ＰＥＩ（Ｓｉｇ
ｍａ＃４０８７２７）である場合がある。

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体はカチオン性脂質を含む。本明細書で用いら
れる場合、「カチオン性脂質」という句は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味正電
荷を有する任意の数の脂質種を意味する。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載され、
それらの多くは商業的に利用可能である。特に本発明の組成物および方法で使用する適切
なカチオン性脂質は国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２（および特に、［００２２
５］項に記載のＣＩ２−２００）およびＷＯ２０１２／１７０９３０に記載のそれらを含
み、それらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の
組成物および方法は２０１２年３月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／６１７，
４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−
ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９、１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコ
サ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、例えば（１５Ｚ，１８Ｚ）−
Ｎ、Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９、１２−ジエン−１−イル）
テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、および（１５
Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９、１２−ジエ
ン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）
などのイオン化カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いる。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プ
ロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物または「ＤＯＴＭＡ」が使用され
る。（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４
，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは単独で製剤
化されるかまたはリポソーム型移動媒体または脂質ナノ粒子に中性脂質、ジオレオイルホ
スファチジル−エタノールアミンまたは「ＤＯＰＥ」または他のカチオン性または非カチ
オン性脂質と組み合わせることが可能であり、そのようなリポソームは標的細胞に核酸の
送達を促進するよう使用できる。他の適切なカチオン性脂質は、例えば、５−カルボキシ
スペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキ
シ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロ
パンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．′ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米
国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−
プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−
プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」を含む。意図されるカチオン性脂質ははまたｌ，２−ジス
テアリ-ルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，
２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、
１，２−ジリノールイロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎ
ＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノールニロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは
「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物または「Ｄ
ＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物または「ＤＤ
ＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ
−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物または「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２
−（コレスト−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（ｃｉ ｓ，ｃｉ
ｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５
′−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３′−オキサペントキシ）−３−ジメチ
ル−ｌ−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９′、ｌ−２′−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは
「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンま
たは「ＲＥ−１」（ジ（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（４−（ジメチルアミノ
）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカネジオアート）または「ＲＥ−２」（６Ｚ，２５Ｚ）
−ジエチル１６−（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘントリアコンタ−６
，２５−ジエンエジオエート）または「ＲＥ−３」（９Ｚ，２８Ｚ）−ジメチル１９−（
４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタトリアコンタ−９，２８−ジエンエ
ジオエート）（ＵＳ２０１２／００２７８０３を参照、本明細書に参考として組み込まれ
る）または「ＧＬ−６７」（Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，９：２１３６−２１４５（２０１２）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．
、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒａｌ Ｌｅｖｅｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｎｏｎ−Ｖｒｉａｌ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＩｎＴｅｃｈ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１３：２９３−３
１８（２０１１）、それらの両方が本明細書に参考として組み込まれる）または「ＤＭＯ
ＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ′−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは
「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノールオイロキシ−Ν，Ν−ジメチルプロピルア
ミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ′−ジリノールイルカルバミル−３−ジ
メチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノールイルカル
バミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノール
イル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ− −Ｄ
ＭＡ」、２，２−ジリノールイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソラ
ン または「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（９Ｚ，１２
Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル
）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０
４２８７７を参照、Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１
７６（２０１０））、またはそれらの混合物を含む。（Ｈｅｙｅｓ、Ｊら、Ｊ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓ
ｅｙ、ＤＶら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２０
０５）、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。いくつかの実施形態では、カチ
オン性脂質は「ＧＬ−６７」ではない。

いくつかの実施形態では、そのような組成物に存在するカチオン性脂質の１つ以上は、
少なくともイミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の１つである。

いくつかの実施形態では、そのような組成物に存在するカチオン性脂質の１つ以上はＸ
ＴＣ（２，２−ジリノールイ１−４−ジメチルアミノエチ１−［１，３］−ジオキソラン
）、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１
−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（
３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ
−９，１２−ジエンイル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキ
ソール−５−アミン）、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オクソ−３−（ウン
デシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラ
アザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメ
チルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、参照によ
りその教示の全体が本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０、
参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（米国特許仮出
願第６１／６１７，４６８号、参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる）ま
たはＨＧＴ５００１（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）（米国特許仮出願第６１／６１７，４６
８号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に記載の、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−
トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３
−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅ
ｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌ
ｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”
Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−Ｄ
ＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ
Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，
Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−
ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ２０１０，１０７
，１８６４−１８６９）などのアミノアルコールリピドイドから選ばれる。

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体は１つ以上の非カチオン性脂質を含み、いく
つかの実施形態では、非カチオン性脂質は中性脂質、すなわち、組成物が製剤化されかつ
／または投与される状況下で、正味荷電を保有しない脂質である。そのような例示的な非
カチオン性およびはＤＳＰＣ（１，２−ジ脂肪酸−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）
、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ
（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１
，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１
，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１
，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１′−ｒａｃ−グリセロール）、
およびコレステロールから選択可能である。

コレステロール系カチオン性脂質の使用はまた本発明によって意図される。そのような
コレステロール系カチオン性脂質は、単独でまたは他のカチオン性または非カチオン性脂
質と組み合わせて使用可能である。適切なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、
ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキシアミドコレステロール）、ｌ
，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏ
ｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３，１３９（１９９７）、米国特許第
５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥを含む。

他の実施形態では、適切な脂質ナノ粒子は、米国仮出願第６１／４９４，７４５号にさ
らに記載のように、例えば、切断可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）官能基（例えば、ＨＧＴ
４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４およびＨＧＴ４００５）を
含む１つ以上のカチオン性脂質または配合物などの１つ以上の切断可能な脂質を含み、参
照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる。

さらに、いくつかの試薬は核酸導入有効性を促進するため商業的に利用可能である。適
切な例はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡ ＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、ＦＵＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮ
Ｅである。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は移動媒体に存在する全脂質の約１％〜約９
０％、約２％〜約７０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約４０％、または好適には移動
媒体に存在する全脂質の約２０％〜約７０％のモル比を含む。

Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［サクシニル（メトキシポリエチレングリコ
ール）−２０００］（Ｃ８ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、誘導体化セラルミド（Ｐ
ＥＧ−ＣＥＲ）などのなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導
体化脂質はまた、単独かまたは好適には移動媒体（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂
質とともに組み合わせて本発明によって意図される。意図されるＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６
−Ｃ２０長のアルキル鎖（複数可）で共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレング
リコール鎖を含むが、これに限定されない。そのような成分の追加は複合体の凝集を防ぎ
得、循環寿命および脂質核酸組成物の標的細胞への送達を増加させる手段を提供し得、（
Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）
：２３５−２３７）、またはそれらは、インビボで製剤から急速に交換するように選択さ
れ得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。

特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖を有するＰＥＧ−セラミドである（例
えば、Ｃ１４またはＣ１８）。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質はリポソ
ーム型移動媒体に存在する全脂質の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜
約１５％、約４％〜約１０％または約２％のモル比を含み得る。

本発明はまた非カチオン性脂質の使用を考察する。本明細書で用いられる場合、「非カ
チオン性脂質」という句は任意の中性、両性イオン性またはアニオン性の脂質を意味する
。本明細書で用いられる場合、「アニオン性脂質」という句は、生理的ｐＨなどの選択さ
れたＨで正味負電荷を保有する任意の数の脂質種を意味する。非カチオン性脂質は、ジス
テアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（Ｄ
ＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチ
ジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ
）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイ
ルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノ
ールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−マル）、ジパル
ミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノー
ルアミン（ＤＭＰＥ）、ジ脂肪酸−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１
６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−脂肪
酸−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、
またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は
、単独で使用され得るが、好適には他の賦形剤、例えばとカチオン性脂質と組み合わせて
使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用する場合、非カチオン性脂質は、移動媒
体に存在する全脂質の約５％〜約９０％、または好適には約１０％〜約７０％のモル比を
含む。

特定の実施形態では、適切な移動媒体（例えば、脂質ナノ粒子）は、複数の脂質および
／またはポリマー成分を結合することによって調製される。例えば、移動媒体は４０：３
０：２５：５のモル比でＣ１２−２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ま
たは１８：５６：２０：６のモル比でＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−
ＰＥＧ２Ｋ、または４０：２０：３５：５のモル比でＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏ
ｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、４０：２０：３５：５のモル比でＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、
ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを使用して調製され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性
脂質、非カチオン性脂質および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびに互いに対するそ
のような脂質の相対的なモル比は、選択される脂質（複数可）の特徴、意図された標的細
胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。さらなる考慮点は、例えば、選択される
脂質（複数可）のアルキル鎖の飽和、ならびに粒径、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性およ
び毒性を含む。このように、モル比は適宜調製され得る。例えば、ある実施形態では、脂
質ナノ粒子中のカチオン性脂質の割合は、１０％を超える、２０％を超える、３０％を超
える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、または７０％を超え得る。脂
質ナノ粒子中の非カチオン性脂質の割合は、５％を超える、１０％を超える、２０％を超
える、３０％を超える、または４０％を超え得る。脂質ナノ粒子中のコレステロールの割
合は、１０％を超える、２０％を超える、３０％を超える、または４０％を超え得る。脂
質ナノ粒子中のＰＥＧ修飾脂質の割合は、１％を超える、２％を超える、５％を超える、
１０％を超える、または２０％を超え得る。

特定の実施形態では、本発明の適切な脂質ナノ粒子は少なくとも次のカチオン性脂質の
うちの１つを含む：Ｃ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１
、ＲＥ−１、ＲＥ−２、ＲＥ３、ＧＬ−６７およびＩＣＥ。いくつかの特定の実施形態で
は、適切な脂質ナノ粒子はカチオン性脂質ＧＬ−６７を使用せずに製剤化される。いくつ
かの実施形態では、適切な移動媒体はコレステロールおよび／またはＰＥＧ修飾脂質を含
む。いくつかの実施形態では、適切な移動媒体はＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの
実施形態では、適切な移動媒体は次の脂質の組み合わせのうちの１つを含む：Ｃ１２−２
００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレス
テロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ：ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−
ＰＥＧ２Ｋ：ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ：ＸＴＣ
、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、Ｐ
ＥＧ−ＤＭＧ：およびＡＬＮＹ−１００、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＬｉｎＫＣ２−
ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡ ＰＥＧ−ＤＳＧ。

本発明の組成物で使用する脂質担体媒体は、現在当技術分野で周知の様々な技術によっ
て調製可能である。複層状小胞（ＭＬＶ）は、従来の技術、例えば適切な溶剤の脂質が溶
解することによって適切な器または容器の内壁面に選択された脂質が沈着し、次いで噴霧
乾燥によって器の内面に薄いフィルムが残るように蒸発させることにより調製し得る。次
いで、水相をＭＬＶの形成をもたらすボルテックス運動を容器に添加してもよい。単層状
小胞（ＵＬＶ）は、次いで、均質化、超音波処理または多層状小胞の押し出しによって形
成することができる。また、単層状小胞は、洗浄剤除去技術によって形成することができ
る。

本発明の特定の実施形態では、本発明の組成物は移動媒体を含み、ｍＲＮＡは、移動媒
体の表面の両方に関連し、同一の移動媒体内にカプセル化される。例えば、本発明の組成
物の調製中に、カチオン性リポソーム型移動媒体は、静電相互作用を通してｍＲＮＡと関
連付け得る。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソーム型移動媒体は、
静電相互作用を通してｍＲＮＡと関連付け得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は脂質担体媒体でカプセル化され
るｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ種は同一の脂質担体媒
体でカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ種は異なる脂質
担体媒体でカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の脂質担
体媒体でカプセル化され、それらの脂質組成物、脂質成分のモル比、粒径、電荷（ゼータ
電位）標的配位子および／またはそれらの組み合わせとは異なる。いくつかの実施形態で
は、１つ以上の脂質担体媒体は、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質および／ま
たはそれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上
の脂質担体媒体は、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロールおよび脂質担体媒体を生
成するために使用されるＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有し得る。
送達方法

本発明の方法において使用される送達経路は、本発明の治療用組成物の非侵襲的な自己
投与を可能にする。本発明の方法は、上述のように適切な核酸導入または脂質担体媒体中
に治療タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物のエアロゾル化、噴霧化、または点
滴注入による気管内または経肺投与を含む。

肺の局所細胞および組織は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の生産および分
泌のために、生物学的デポまたはリザーバーとして機能することができる潜在的な標的を
表しているが、出願人は、エアロゾル化、噴霧化または点滴注入を介した肺への本発明の
組成物の投与が肺細胞外の非分泌性タンパク質でさえも分布をもたらすことを発見した。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、肺気道血液関門を通して本発明
のパスのナノ粒子組成物は、例えば、心臓、肝臓、脾臓などの非肺細胞および組織に無傷
のナノ粒子の翻訳をもたらすことが意図されており、そこではこれらの非肺組織における
コードされたタンパク質生産をもたらす。従って、本発明の組成物および方法の有用性は
、肺の肺細胞および組織中の治療タンパク質の生産を超えて拡大し、非肺の標的細胞およ
び／または組織への送達のために使用することができる。それらは、多数の疾患の管理お
よび治療において、そして分泌性および非分泌性両方のタンパク質および／または酵素欠
損症（例えば、１つ以上のリソソーム貯蔵障害）から生じる特定の末梢性疾患において有
用である。特定の実施形態では、本発明の方法において使用される本発明の組成物は、肝
臓、脾臓、心臓、および／または他の非肺細胞におけるｍＲＮＡカプセル化されたナノ粒
子の分布およびコードされたタンパク質の生産をもたらす。例えば、肺へのエアロゾル化
、噴霧化または点滴注入によるβガラクトシダーゼ（非分泌性タンパク質）をコードする
化するｍＲＮＡを含むナノ粒子などの本発明の組成物の投与は、組成物自体を生じさせ、
そのタンパク質生成物（例えば、機能的βガラクトシダーゼタンパク質）は、非肺細胞へ
のｍＲＮＡおよび送達媒体の転位の結果として、肺の局所細胞および組織の両方において
、ならびに末梢標的細胞、組織および器官において検出可能であろう。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、特に末梢細胞または組織を標的とする本発明
の方法で用いることができる。経肺送達に続いて、本発明の組成物は、肺気道血液関門を
通過し、局所肺細胞以外の細胞に分布することが意図される。したがって、本明細書に開
示される組成物は、当業者に周知の様々な手法（例えば、吸入による）を用いて、投与の
経肺経路を介して被験者に投与され得、肺の局所標的細胞および組織の両方、ならびに末
梢非肺細胞および組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、骨格筋、リンパ節、脳、脳脊
髄液、および血漿の細胞）に分布され得る。結果として、肺の局所細胞および末梢非肺細
胞の両方は、１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる翻訳生成物を生産および
／または分泌することができる生物学的リザーバーまたはデポとして機能することができ
る。したがって、本発明は肺疾患または状態の治療に限定されるのではなく、むしろ全身
投与によって達成されるであろう末梢器官、組織および細胞（例えば、肝細胞）において
、ポリヌクレオチドの送達またはその結果コードされる酵素およびタンパク質の生産を促
進する非侵襲的手段として使用可能である。例示的な末梢非肺細胞は、肝細胞、上皮細胞
、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂
肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜細胞、卵巣
細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫
瘍細胞を含むが、これらに限定されない。

被験者への組成物の投与に続いて、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質生成物（例
えば、機能的なタンパク質または酵素）は、被験者への組成物の投与後少なくとも約１日
〜７日またはより長く、末梢標的組織において検出可能である。治療効果を達成するため
に必要なタンパク質生成物の量は、治療される状態、コードされたタンパク質、および患
者の状態に依存して変化する。例えば、タンパク質生成物は末梢標的組織において、少な
くとも０．０２５〜１．５μｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも０．０５０μｇ／ｍｌ、少な
くとも０．０７５μｇ／ｍｌ、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．２μｇ／ｍ
ｌ、少なくとも０．３μｇ／ｍｌ、少なくとも０．４μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ
／ｍｌ、少なくとも０．６μｇ／ｍｌ、少なくとも０．７μｇ／ｍｌ、少なくとも０．８
μｇ／ｍｌ、少なくとも０．９μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、少なくとも１
．１μｇ／ｍｌ、少なくとも１．２μｇ／ｍｌ、少なくとも１．３μｇ／ｍｌ、少なくと
も１．４μｇ／ｍｌ、または少なくとも１．５μｇ／ｍｌ）の濃度で（例えば、治療濃度
）、被験体への組成物の投与後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、
２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５日以上で検出され得る。

参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８０，０１４号に記載のように
、核酸は液体噴霧器または乾燥粉末装置を使用して生成されるエアロゾルミストの核酸組
成および吸入の液体懸濁液の気管内投与により肺に送達可能であることが実証されている
。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、それらがエアロゾル化、またはそうでな
ければ被験者への投与の前または投与の際に、粒子の液体、または固体として送達され得
るように製剤化され得る。そのような組成物は、被験者によって容易に呼吸可能または吸
入可能な粒子を生成するために固体または液体の粒子状組成物（例えば、エアロゾル化さ
れた水溶液または懸濁液など）を投与するための１つ以上の適切な装置の助けを借りて投
与され得る。いくつかの実施形態において、そのような装置（例えば、定量吸入器、ジェ
ット噴霧器、超音波噴霧器、乾燥粉吸入器、噴射剤に基づく吸入器および注入器）は、被
験者に組成物（例えば投与量当たりｍＲＮＡの約０．５ｍｇ／ｋｇ）の所定の質量、体積
または用量の投与を促進する。例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物は、組成物
および適切な噴射剤を含む懸濁液または溶液を含む定量吸入器を使用して被験体に投与さ
れる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、吸入のために意図された微粒子粉末（例
えば、呼吸用乾燥粒子）として製剤化することができる。特定の実施形態では、呼吸域粒
子として製剤化される本発明の組成物は、適宜それらが被験者に呼吸可能で、適切な装置
を使用して送達され得るような粒径にする（例えば約５００μｍ未満、４００μｍ、３０
０μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、７５μｍ、５０μｍ、２５
μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１２．５μＭ、１０μｍ、５μｍ、２．５μＭ、またはそれ
以下の平均Ｄ５０またはＤ９０の粒径）。さらに他の実施形態では、本発明の組成物は、
１つまたは複数の肺胞界面活性物質（例えば、層状体）を含むように製剤化される。いく
つかの実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０
．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくと
も２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４．０ｍｇ／ｋｇ、少な
くとも５．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７．０ｍｇ／ｋｇ、
少なくとも８．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ
、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、
少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少
なくとも４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５５ｍｇ／ｋｇ、少な
くとも６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ、少なく
とも７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８５ｍｇ／ｋｇ、少なくと
も９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１００ｍｇ／ｋｇの体
重の濃度で、単一の投与量投与されるように、被験者に投与される。いくつかの実施形態
では、本発明の組成物は、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１
．０ｍｇ、少なくとも２．０ｍｇ、少なくとも３．０ｍｇ、少なくとも４．０ｍｇ、少な
くとも５．０ｍｇ、少なくとも６．０ｍｇ、少なくとも７．０ｍｇ、少なくとも８．０ｍ
ｇ、少なくとも９．０ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０
ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０
ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも５５ｍｇ、少なくとも６０
ｍｇ、少なくとも６５ｍｇ、少なくとも７０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、少なくとも８０
ｍｇ、少なくとも８５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも９５ｍｇまたは少なくとも
１００ｍｇのｍＲＮＡの総量で１つまたは複数のの投与量投与されるように、被験者に投
与される。

実施例１：ネイキッド形態で、または気管内投与によるナノ粒子で非修飾および修飾ｍ
ＲＮＡの比較
概要：マウスは、気管内（ＩＴ）は、ネイキッド形態または単回投与のための脂質系ナ
ノ粒子（ＮＰ）にカプセル化されたどちらかをホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）に対して
コードする、非修飾または修飾ｍＲＮＡ（シチジン−５′−三リン酸およびウリジン−５
′−三リン酸の両方の２５％が５−メチルシチジン−５′−三リン酸および２−チオウリ
ジン−５′−三リン酸にそれぞれ置換された）のどちらかで気管内（ＩＴ）スプレーされ
た。ルシフェラーゼ生産は気管内スプレー後の異なる時点でのインビボ生物発光イメージ
ング（ＢＬＩ）によって測定された。２０μｇ／マウスに達する用量でＣ１２−２００系
ＮＰで処置したマウス由来の器官は、病理組織的分析のために調製された。気管内スプレ
ー後の複合体の生体内分布を評価するために、インビトロでのルシフェラーゼ生産は、マ
ウス当たり５および１０μｇのＣ１２−２００系ＮＰに対応する用量で処置し安楽死させ
たマウスから調製した器官で測定された。
Ａ．Ｃ１２−２００系ナノ粒子にネイキッドｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの気管内スプレー
−マウス当たり２０μｇ

脂質ナノ粒子製剤：Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥ
Ｇ２０００の５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液の培養は、４０：３０：２５：５のモル比で
それぞれ混合され、エタノールで３ｍＬの最終的な容量に希釈された。これとは別に、Ｆ
ＦＬの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）または修飾
ＦＦＬ ｍＲＮＡは１ｍｇ／ｍＬストックから調製された。脂質溶液は水性のｍＲＮＡ溶
液中に急速に注入し、２０％エタノール中の最終懸濁液を得るために振盪された。得られ
たナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルター（ｄｉａｆｉ
ｌｔｒａｔｅ）し、２〜８℃で濃縮し、格納した。

メッセンジャーＲＮＡは、所定の非翻訳領域でＦＦＬタンパク質をコードしたｃＤＮＡ
鋳型を使用してインビトロ転写処理を介して合成した。得られたＲＮＡ構築物はさらに５
′終点のキャップ１構造体および約２００アデノシン塩基のポリ−Ａテールの長さを組み
込んで処理された。

修飾メッセンジャーＲＮＡは、２−チオウリジン三リン酸で置換されるウリジン塩基の
２５％および５−メチルシチジン三リン酸で置換されるシチジン塩基の２５％で、上述の
ように、同様の方法で合成した。

雌のＢａｌｂ／ｃ系マウスをＥｌｅｖａｇｅ−Ｊａｎｖｉｅｒ、フランスから購入した
。マウスは、実験の開始時に１０週齢であった。マウスは、実験の開始に先立って計量さ
れ、次の４つの群（ｎ＝１群当たり６匹のマウス）の１つに割り当てられた：群Ｉ−ＦＦ
Ｌ ｍＲＮＡを含む気管内スプレー、群ＩＩ−修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡを含む気管内スプレ
ー、群ＩＩＩ−Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子でＦＦＬ−ｍＲＮＡを含む気管内スプレー
、群ＩＶ−Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子で修飾ＦＦＬ−ｍＲＮＡを含む気管内スプレー
。各マウスは、それぞれｍＲＮＡ／ＮＰの２０μｇでスプレーされた。群ごとのｍＲＮＡ
／ＮＰの必要量は、５０μｌ／マウスの総容積に対して、ＤＥＰＣ処置された（０．１％
）ＲＮａｓｅを含まない水（Ｓｅｒｖａ、カタログ番号：３９７９８、ロットＰ０６０３
８３）での適用の直前に懸濁された。ＮＰはまた、粒径およびゼータ電位測定によって特
徴付けられた。これらの測定は、水中で実施され、表５で示す表にする。

ルシフェラーゼ生産は適用後６時間でインビボＢＬＩによって測定された。外因性ｍＲ
ＮＡ由来のタンパク質のほんのわずかな量は、ネイキッドｍＲＮＡで検出することができ
たのに対し、ナノ粒子製剤は、修飾とは無関係に全体の胸部および上腹部（図１）におけ
るルシフェラーゼ生産の重要なレベルを示した。修飾ＦＦＬと比較して、非修飾ＦＦＬ
ｍＲＮＡは約６時間（図２）でおよそ２〜３倍のより高い発光が生じた。

（図１ＡおよびＢ）、非常に低い（背景に近い）レベルの発光は、ネイキッドｍＲＮＡ
で検出することができた。脂質ナノ粒子で処置したマウスでは、修飾とは無関係に６時間
の時点と比較して、増加したルシフェラーゼ生産（約２〜３倍）は、２４時間の処置後に
観察された（図３ＡおよびＢ）。ＦＦＬまたは修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（図３Ｃ）からのル
シフェラーゼ生産の間で著しい相違は観察されなかった。

ネイキッドｍＲＮＡで処置したマウスは、実験でさらに追跡し、毎週間隔で２回追加の
用量を適用した。ＢＬＩは、適用後の異なる時点で実施された。適用後２４時間のＢＬＩ
画像、最大発光の時点（図３）は、図４（ネイキッドＦＦＬ ｍＲＮＡ）および図５（ネ
イキッド修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）に示されている。若干の例外はあるものの、目立ったル
シフェラーゼ生産は、測定されたマウス（図３で図４および図５のスケールを比較）のい
ずれにも認められなかった。
Ｂ．Ｃ１２−２００系ナノ粒子でマウス当たり−５μｇおよびマウス当たり１０μｇの
ＦＦＬおよび修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの気管内スプレー

気管内スプレー実験は、５および１０μｇの／マウスの減少した用量をで実施した。Ｃ
１２−２００系ナノ粒子製剤は実施例１に記載された。

実験計画：雌のＢａｌｂ／ｃ系マウスをＥｌｅｖａｇｅ−Ｊａｎｖｉｅｒ、フランスか
ら購入した。マウスは、実験の開始時に１９週齢であった。マウスは、実験の開始に先立
って計量された。Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子は、５０μｌ／マウスの総容積に対して
、ＤＥＰＣ処置された（０．１％）ＲＮａｓｅを含まない水（Ｓｅｒｖａ、カタログ番号
：３９７９８、ロトＰ０６０３８３）での適用の直前に懸濁された。次の４つの群（ｎ＝
１群当たり５匹のマウス）が試験された：群Ｉ−Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子（５μｇ
／マウス）でＦＦＬ ｍＲＮＡを含む気管内スプレー、群ＩＩ−Ｃ１２−２００系脂質ナ
ノ粒子（１０μｇ／マウス）でＦＦＬ ｍＲＮＡを含む気管内スプレー、群ＩＩＩ−Ｃ１
２−２００系脂質ナノ粒子（５μｇ／マウス）でＦＦＬ ｍＲＮＡを含む気管内スプレー
、群ＩＶ−Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子（１０μｇ／マウス）で修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ
を含む気管内スプレー。気管内スプレー中に群ＩＩＩおよびＩＶからの１匹のマウスが死
亡した。このように、これらのグループの動物の残りの数は４であった。適用後６時間後
では、すべての動物は、立毛を示し、運動性が減少した。また、より高い用量群（群ＩＩ
およびＩＶ）のそれぞれから１匹のマウスが、この時点で死んでいた。ＢＬＩイメージン
グは適用後６時間後でマウスに実施された。

５μｇ／マウスの用量でのＦＦＬ ｍＲＮＡの使用は、ルシフェラーゼ生産の非常に低
いレベルをもたらした。１０μｇ／マウスの用量で、より大きな生産は、肝臓（図６Ａ）
に濃縮されたことが観察された。適用量の相違は、修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ群（図６Ｂ）で
はそれほど明白ではなかった。群ＩＶ（修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ）を持つ群ＩＩ（ＦＦＬ
ｍＲＮＡ）からマウスを比較すると、前の場合（図６Ｂのパネル１で図６Ａのパネル１、
２を比較）により高い発光を明らかにした。

２４時間でのルシフェラーゼ生産が、気管内スプレー後６時間と比較して著しく強化さ
れた（図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（図７Ｃ）と比較して、より
高い生産がＦＦＬ ｍＲＮＡを使用して観察された。実施例１では、同様の結果が２０μ
ｇ／マウスの用量で得られた。臓器（心臓、肝臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓）は、イン
ビトロのルシフェラーゼ測定のために液体窒素中で凍結された。

気管内スプレー後の体内分布：単離された器官は、乳鉢および乳棒を使用して、凍結状
態で均質化され、秤量され、溶解用緩衝液（２５ ｍＭ ＴＲＩＳ−Ｃｌ０、１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ ｘ−１００；ｐＨ７．４））および完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）
を含む溶液中で溶解した。肺と肝臓は４００μｌで溶解したのに対し、脾臓、心臓、腎臓
は、２５０μｌで溶解した。２０分間氷上でインキュベートした後、サンプルを、１０，
０００ｒｐｍで、１０分間、４℃で遠心分離した。ルシフェラーゼ活性は、１００μｌの
上澄部を使用して測定した。各サンプルを重複で測定し、重複からの平均値を分析に使用
した。腎臓以外のすべての臓器は、ルシフェラーゼ活性（図８）について陽性であった。
我々のＢＬＩデータに従って、最大発光は、肝臓および肺で観察された。ＦＦＬ−ｍＲＮ
Ａは修飾−ＦＦＬ−ｍＲＮＡに比べて高いタンパク質生産をもたらし、用量依存性は明ら
かであった。
Ｃ．ＨＧＴ５００１系ナノ粒子で修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの気管内スプレー−マウス当た
り２０μｇ

気管内スプレー実験はＨＧＴ５００１系ナノ粒子製剤で実施された。

脂質ナノ粒子製剤：ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥ
Ｇ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液の培養は、４０：２０：３５：５のモル比でそれ
ぞれ混合され、エタノールで３ｍＬの最終的な容量に希釈された。これとは別に、ＦＦＬ
の水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）または修飾ＦＦ
Ｌ ｍＲＮＡは１ｍｇ／ｍＬストックから調製された。脂質溶液は水性のｍＲＮＡ溶液中
に急速に注入し、２０％エタノール中の最終懸濁液を得るために振盪された。得られたナ
ノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔ
ｒａｔｅ）し、その後ＲＮａｓｅを含まない水で蒸留し、２〜８℃で濃縮し、格納した。

実験計画：雌のＢａｌｂ／ｃ系マウスをＥｌｅｖａｇｅ−Ｊａｎｖｉｅｒ、フランスか
ら購入した。マウスは、実験の開始時に１３週齢であった。マウスは、実験の開始に先立
って計量された。脂質ナノ粒子は、５０μｌ／マウスの総容積に対して、ＤＥＰＣ処置さ
れた（０．１％）ＲＮａｓｅを含まない水（Ｓｅｒｖａ、カタログ番号：３９７９８、ロ
ットＰ０６０３８３）での適用の直前に懸濁された。

気管内スプレーおよびＢＬＩ：各マウスは、５０μｌ／マウスの総容積のＨＧＴ５００
１系ナノ粒子製剤の２０μｇで気管内スプレーされた。ＢＬＩイメージングは適用の６時
間後にマウスに実施された。

Ｃ１２−２００系ナノ粒子で対応する時点を比較した場合、著しく低い蛍光値がＨＧＴ
５００１系ナノ粒子で観察され、観察された６〜２４時間（図９および図１０）のタンパ
ク質生産の増加はなかった。

Ｃ１２−２００とＨＧＴ５００１系ナノ粒子製剤を試験する独立した実験では、以下の
ＢＬＩイメージング（図１１）はて、マウスを安楽死させ、器官（心臓、肺、肝臓、脾臓
および腎臓）は組織学（図１２）によって評価された。ＦＦＬ生産はＣ１２−２００系Ｎ
ＰおよびＨＧＴ５０１１系ＮＰの両方のための肺と肝臓で確認された。

Ｄ．修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの気管内スプレー−−非ナノ粒子送達

ネイキッドｍＲＮＡは、パーフルオロカーボン治療なしで低い効率性に終わった。カプ
セル化されたｍＲＮＡの気管内エアロゾル化は、肺、肝臓、脾臓、および心臓でのタンパ
ク質生産に至る。ＦＦＬおよび修飾ＦＦＬはタンパク質生産に関して、用量反応と同じよ
うに効率的であった。

ポレチレニミン（ｐｏｌｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅｓ）（Ｌ−ＰＥＩ ２２ｋＤａ、ｂ
ｒ−ＰＥＩ ２５ ｋＤａ）オリゴのコポリマー（エチレングリコール）メチルエーテル
メタクリレート（ＯＥＧＭＡ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（Ｄ
ＭＡＥＭＡ）ＭＬＲＩ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、およびリポフェクタミ
ンを含む様々な送達媒体を試験し、非肺細胞での発光を示さなかった。対照的に、Ｃ１２
−２００およびＨＧＴ５００１系脂質ナノ粒子製剤は、経肺送達に続いて非肺細胞におけ
る著しいタンパク質生産をもたらした。

これらの観察は、ナノ粒子に基づく製剤だけが肺から全身的血液供給への能動的または
受動的な手段によって、そのまま転位可能であり、続いて肝臓などの異なる組織の中に沈
着される。細胞質タンパク質、ホタルルシフェラーゼをコードする無損傷のｍＲＮＡを含
むナノ粒子のこの転位は、全身的に到達可能な非肺細胞または組織に機能的なタンパク質
の生産をもたらすために、肺の外の有効医薬成分の非侵襲的な全身的送達を構成する。
Ｅ．ＰＥＩ系脂質ナノ粒子での修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの噴霧化

ＰＥＩ系ナノ粒子中の修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡを受けたマウスは、肺での発光を示した（
図１３）。ルシフェラーゼ生産は、非修飾ＦＦＬのｍＲＮＡ（パネル３、４）と比較して
修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡ（パネル１、２）でより大きかった。
実施例２：非肺の標的細胞の脂質を測定することによるナノ粒子の移行の評価

非肺組織で無損傷のナノ粒子の通過を識別するために、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、Ｃ
ｈｏｌでＤＭＧ−ＰＥＧ２０００および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）
の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液の培養は、４０：２９：２５：５：１のモル比でそれ
ぞれ混合され、エタノールで３ｍＬの最終的な容量に希釈された。これとは別に、β−ガ
ラクトシダーゼまたはＦＦＬ（修飾または非修飾）ｍＲＮＡなどの非分泌性タンパク質の
水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）は１ｍｇ／ｍＬス
トックから調製された。脂質溶液は水性のｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、２０％エタノ
ール中の最終懸濁液を得るために振盪される。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）し、２〜８℃で濃縮
し、格納する。

メッセンジャーＲＮＡは、所定の非翻訳領域でβ−ガラクトシダーゼまたはＦＦＬタン
パク質をコードしたｃＤＮＡ鋳型を使用してインビトロ転写処理を介して合成する。得ら
れたｍＲＮＡ構築物はさらに５′終点のキャップ１構造体および約２００アデノシン塩基
のポリ−Ａテールの長さを組み込んで処理される。

修飾メッセンジャーＲＮＡは、２−チオウリジン三リン酸で置換されるウリジン塩基の
２５％および５−メチルシチジン三リン酸で置換されるシチジン塩基の２５％で、上述の
ように、同様の方法で合成する。

雌のＢａｌｂ／ｃ系マウスをＥｌｅｖａｇｅ−Ｊａｎｖｉｅｒ、フランスから購入する
。マウスは、実験の開始時に１０週齢である。マウスは、実験の開始に先立って計量され
る。各マウスは、蛍光標識されたＣ１２−２００系脂質ナノ粒子の修飾および非修飾ｍＲ
ＮＡそれぞれのｍＲＮＡ／ＮＰの２０μｇでスプレーされる。ｍＲＮＡカプセル化される
脂質ナノ粒子は、５０μｌ／マウスの総容積に対して、ＤＥＰＣ処置された（０．１％）
ＲＮａｓｅを含まない水（Ｓｅｒｖａ、カタログ番号３９７９８、ロットＰ０６０３８３
）での適用の直前に懸濁される。処置後６時間でマウスは殺され、臓器が６μｍの凍結切
片上の蛍光顕微鏡によってＮＰ分布の組織学的検査のために切除される。

あるいは、ｍＲＮＡは、Ｃｏｍｍｅｒｆｏｒｄの方法に従い、Ｔｅｒｅｂｅｓｉらによ
って詳細にされるように、（Ｔｅｒｅｂｅｓｉ Ｊ，Ｋｗｏｋ ＫＹ，Ｒｉｃｅ ＫＧ．
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８ Ｏｃｔ １；２６３（１）：１２０−３）例えば
Ｉ^１２３放射線で標識される。標識混合物を、溶離液として水をＰＤ−１０ゲル濾過カラ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を使用して分離する。ヨウ素化されたｍＲＮＡは、標識されていないｍＲＮＡと混合
され、上述のように脂質で製剤化されるｍＲＮＡの望ましい量およびマウスの肺に気管内
エアロゾル化をもたらす。望ましい時点で、マウスを屠殺し、臓器の放射能を、ガンマカ
ウンターを使用して測定する。

上記の実施例は、ｍＲＮＡが本明細書に記載される方法および組成物を使用して経肺投
与を介して、非肺細胞または組織に効率的に送達可能であることを実証する。上記の代表
的な実施例では、ｍＲＮＡの送達は、修飾ｍＲＮＡのコドン最適化配列によってコードさ
れた蛍光ホタルルシフェラーゼレポータータンパク質を使用して評価された。しかし、そ
のような実施例は、単に本発明に従って送達することができるｍＲＮＡおよびタンパク質
の広い範囲の代表例に過ぎないことを、当業者は理解するであろう。特に、本発明の組成
物および方法は、関連する疾患、障害または状態の治療のために被験者内の非肺細胞また
は組織に様々な治療タンパク質をコードする送達ｍＲＮＡに使用され得ることが当業者に
は容易に明らかであろう。

上述の説明から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために、本
発明の様々な変更および修正を行うことができる。

出願において引用されるすべての参考文献、特許または出願、米国または諸外国は参照
することにより全体が記載されているかのように本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた
場合には、本明細書で開示された文字通りの資料が統制する。

Claims (1)

1. 図面に記載の発明。