ES2864878T3

ES2864878T3 - Administración pulmonar de ARN, a células objetivo no pulmonares

Info

Publication number: ES2864878T3
Application number: ES13800103T
Authority: ES
Inventors: Michael Heartlein; Braydon Charles Guild; Frank Derosa; Carsten Rudolph; Christian Plank
Original assignee: Ethris GmbH; Translate Bio Inc
Current assignee: Ethris GmbH; Translate Bio Inc
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: WO2013185069A1; EA201492055A1; MX2014015041A; CA2876155C; HK1208352A1; JP6561378B2; EP2858679B1; BR112014030677A2; JP2017206567A; CN104519915A; AU2018203310A1; JP6913699B2; JP2015520195A; HK1208618A1; EP2858679A1; EP2858679A4; EP2858679B2; US20220226236A1; ES2864878T5; CA2876155A1

Abstract

Una composición que comprende ARNm que codifica una proteína terapéutica y un vehículo portador lipídico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en una célula o tejido no pulmonar, en donde la composición se formula para la administración pulmonar y se administra al pulmón por aerosolización, inhalación, nebulización o instilación, en donde el vehículo portador lipídico es una nanopartícula lipídica en la forma de un liposoma y comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG.

Description

DESCRIPCIÓN

Administración pulmonar de ARN, a células objetivo no pulmonares

ANTECEDENTES

La terapia génica convencional implica el uso de ADN para la inserción de la información genética deseada en las células huésped. El ADN introducido en la célula habitualmente se integra en el genoma de una o más células transfectadas, permitiendo una acción duradera del material genético introducido en el huésped. Aunque puede haber beneficios sustanciales para dicha acción sostenida, la integración de ADN exógeno en el genoma del huésped también puede tener muchos efectos perjudiciales. Por ejemplo, es posible que el ADN introducido se inserte en un gen intacto, lo que da como resultado una mutación que impide o incluso elimina totalmente la función del gen endógeno. Por tanto, la terapia génica con ADN puede dar como resultado el deterioro de una función genética vital en el huésped tratado como, por ejemplo, la eliminación o la producción perjudicialmente reducida de una enzima esencial o la interrupción de un gen crítico para la regulación del crecimiento celular, lo que da como resultado una proliferación celular no regulada o cancerosa. Además, con la terapia génica basada en el ADN convencional es necesario que la expresión eficaz del producto génico deseado incluya una secuencia promotora fuerte, que de nuevo puede llevar a cambios no deseables en la regulación de la expresión génica normal en la célula. También es posible que el material genético basado en ADN dé como resultado a la inducción de anticuerpos anti-ADN no deseados, que a su vez, pueden activar una respuesta inmune posiblemente fatal.

Al contrario que el ADN, el uso del ARN como un agente de terapia génica es sustancialmente más seguro ya que (1) el ARN no implica el riesgo de ser integrado establemente en el genoma de la célula transfectada, eliminando por tanto la preocupación de que el material genético introducido altere el funcionamiento normal de un gen esencial, o provoque una mutación que dé como resultado efectos nocivos u oncogénicos; (2) no se requieren secuencias promotoras extrañas para la traducción eficaz de la proteína codificada, evitando de nuevo posibles efectos secundarios perjudiciales; (3) al contrario que el ADN plasmídico (ADNp), el ARN mensajero (ARNm) carece de motivos CpG inmunogénicos de tal manera que no se generan anticuerpos anti-ARN; y (4) cualquier efecto perjudicial que resulte del ARNm basado en la terapia génica sería de duración limitada debido a la vida media relativamente corta del ARN. Además, en muchas aplicaciones, la naturaleza transitoria de la transferencia de ARNm a las células, es decir, en donde la duración de cualquier efecto terapéutico está limitada por la vida útil del ARNm y el producto proteico en las células, es más deseable que el efecto potencialmente más duradero logrado usando terapia génica basada en ADN. Además, no es necesario que el ARNm se introduzca en el núcleo para realizar su función, evitando así una barrera importante para la terapia génica basada en ADN.

Una razón por la que la terapia génica basada en ARNm no se ha usado más en el pasado es que el ARNm es mucho menos estable que el ADN, especialmente cuando alcanza el citoplasma de una célula y se expone a enzimas degradantes. La presencia de un grupo hidroxilo en el segundo carbono de la fracción de azúcar en el ARNm provoca un impedimento estérico que evita que el ARNm forme la estructura de doble hélice más estable del ADN y, por tanto, hace que el ARNm sea más propenso a la degradación hidrolítica. Como resultado, hasta hace poco, se creía ampliamente que el ARNm era demasiado lábil para soportar los protocolos de transfección.

Los avances en las modificaciones estabilizadoras del ARN han despertado más interés en el uso de ARNm en lugar del ADN plasmídico en la terapia génica. Sin embargo, a pesar de la estabilidad aumentada del ARNm modificado, la administración de ARNm a las células in vivo de una manera que permita niveles terapéuticos de producción de proteínas sigue siendo un desafío, particularmente para el ARNm que codifica proteínas de longitud completa. Se ha logrado cierto éxito usando vectores virales para introducir ARNm en un huésped, sin embargo, la transfección de ARNm usando vectores virales puede resultar en una respuesta inmune adversa. En algunas circunstancias, el vector viral puede incluso integrarse en el genoma del huésped. Además, la producción de vectores virales de grado clínico también es cara y requiere mucho tiempo. También puede resultar difícil controlar la administración dirigida del material genético introducido usando vectores virales.

La administración no viral de ARNm puede lograrse usando la inyección de ácidos nucleicos desnudos, poliplexes, lipoplexes o ARNm atrapado en liposomas, administración biolística mediante pistola de genes, administración mediada por portadores particulados y electroporación. Los vehículos de transfección o administración no virales son generalmente menos tóxicos, menos inmunogénicos y más fáciles y menos costosos de preparar que los vectores virales para la administración de ARNm. Ciertos vehículos de administración, como los vehículos de administración de lípidos o polímeros catiónicos, también pueden ayudar a proteger el ARNm transfectado de las ARNasas endógenas.

La administración liposomal de ácidos nucleicos se ha empleado como un medio para efectuar la administración específica del sitio de terapias basadas en ADN plasmídico encapsulado, oligonucleótidos antisentido, ARN interferente corto y microARN. Sin embargo, la administración eficiente y terapéuticamente eficaz de ARNm a células y tejidos objetivo, así como la posterior transfección de dichas células y tejidos objetivo sigue siendo un desafío técnico, en particular para la administración de ARNm que codifican proteínas de longitud completa. Es importante diseñar sistemas de administración liposomal que proporcionen suficiente estabilidad para alcanzar las células objetivo deseadas y la capacidad de liberar eficazmente sus materiales encapsulados a dichas células objetivo para permitir la traducción de proteína funcional a niveles terapéuticamente eficaces.

Muchos lípidos catiónicos que se emplean para construir tales vehículos de administración basados en liposomas son tóxicos para las células objetivo cuando se usan para administrar cantidades terapéuticamente eficaces del agente encapsulado. Por consiguiente, la toxicidad asociada con los lípidos catiónicos representa un obstáculo significativo para su uso general como vehículos de administración no virales, particularmente en las cantidades necesarias para administrar con éxito cantidades terapéuticamente eficaces de ARNm a las células objetivo.

Hasta la fecha, se ha logrado un progreso significativo usando la terapia génica de ARNm en aplicaciones, particularmente para las que los niveles bajos de traducción no han sido un factor limitativo, como la inmunización con antígenos que codifican ARNm. Los ensayos clínicos que implican la vacunación contra antígenos tumorales mediante inyección intradérmica de ARNm desnudo o complejado con protamina han demostrado viabilidad, falta de toxicidad y resultados prometedores. X. Su et al., Mo/. Pharmaceutics 8:774-787 (2011). Sin embargo, los niveles bajos de traducción pueden restringir la explotación de la terapia génica basada en ARNm en otras aplicaciones que requieren niveles más altos de estabilidad sostenida de la proteína codificada por ARNm para ejercer un efecto biológico o terapéutico prolongado. La US 2009/0286852 describe modificaciones de pseudouridina de ácidos nucleicos, en particular ARNm, para su uso en terapia génica.

Además, debido a que los beneficios de la terapia génica de ARNm son relativamente transitorios en comparación con la terapia génica basada en ADN, a menudo se requiere la administración repetida, y típicamente mediante inyección, para proporcionar efectos a largo plazo. Por tanto, una transfección más eficaz in vivo y la capacidad de administrar ARNm de forma no invasiva y/o en sitios mucosos mejorarían las perspectivas de una aplicación satisfactoria de la terapia génica de ARNm.

SUMARIO

La presente invención abarca el sorprendente descubrimiento de que las formulaciones de ARNm basadas en nanopartículas pueden translocarse después de la administración pulmonar, es decir, moverse intactas o por medios activos o pasivos desde el pulmón al riego sanguíneo sistémico y posteriormente depositarse en diferentes células o tejidos no pulmonares, como, por ejemplo, el hígado. Esta translocación de la nanopartícula que comprende un ARNm que codifica una proteína terapéutica como, por ejemplo, beta-galactosidasa, constituye la administración sistémica no invasiva de un ingrediente farmacéutico activo más allá del pulmón para dar como resultado la producción de una proteína funcional que es accesible sistémicamente a células o tejidos no pulmonares.

Por tanto, la presente invención se refiere a métodos para la administración de agentes terapéuticos de genes de ARNm usando administraciones pulmonares no invasivas. Específicamente, la invención proporciona una composición que comprende ARNm que codifica una proteína terapéutica y un vehículo portador lipídico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en una célula o tejido no pulmonar, en donde la composición se formula para la administración pulmonar y se administra al pulmón por aerosolización, inhalación, nebulización o instilación, en donde el vehículo portador lipídico es una partícula lipídica en la forma de un liposoma y comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG. La administración de la composición al pulmón da como resultado la administración del ARNm y/o la proteína a una célula o tejido no pulmonar.

En algunas realizaciones, la composición se administra al pulmón mediante aerosolización. En algunas realizaciones, la composición se administra al pulmón mediante aerosolización intratraqueal. En algunas realizaciones, la composición se administra mediante nebulización. En algunas realizaciones, la composición se administra al pulmón mediante instilación. En algunas realizaciones específicas, la composición se administra al pulmón de un sujeto usando un dispositivo seleccionado del grupo que consiste de un inhalador de dosis medida, un nebulizador de chorro, un nebulizador ultrasónico, un inhalador de polvo seco, un inhalador a base de propelente o un insuflador.

En algunas realizaciones, el ARNm comprende una pluralidad de especies de ARNm, que codifican una o más proteínas. En algunas realizaciones, el ARNm comprende por lo menos dos especies de ARNm, cada una de las cuales codifica una proteína diferente. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína de longitud completa. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una versión truncada de una proteína de longitud completa de origen natural. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una o más proteínas en una única transcripción. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína quimérica, en la que una o más secuencias de proteínas que no están asociadas de manera natural con la proteína nativa están enlazadas por un enlace peptídico en la proteína quimérica resultante durante la expresión. En algunas realizaciones, un ARNm adecuado para la presente invención tiene una longitud de o de más de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2,0 kb, 2,5 kb, 3,0 kb, 3,5 kb, 4,0 kb, 4,5 kb, o 5,0 kb.

En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína intracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína citosólica. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con el citoesqueleto de actina. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con la membrana plasmática. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica una proteína transmembrana. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica una proteína del canal iónico. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína perinuclear. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína nuclear. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica un factor de transcripción. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína chaperona. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una enzima intracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína implicada en el metabolismo celular, reparación del ADN, transcripción y/o traducción. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína extracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con la matriz extracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína secretada.

En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína (es decir, proteína terapéutica), enumerada en la Tabla 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones específicas, la proteína se selecciona del grupo que consiste de alfa galactosidasa, eritropoyetina, a1-antitripsina, carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, lipasa ácida lisosomal, arilsulfatasa-A alfaglucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina 4-sulfatasa,beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, hormona del crecimiento humano, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa-1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa-1 (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL), arginasa-1 (ARG1), regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR), Factor VII, Factor VIII, Factor IX, heparán-N-sulfatasa y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones específicas, la proteína es una proteína intracelular o transmembrana seleccionada del grupo que consiste de ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa-1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa-1 (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL), arginasa- 1 (ARG1), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína que está asociada con una enfermedad o trastorno (es decir, una indicación) enumerada en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la proteína para su uso en el método se selecciona en base a su capacidad para prevenir, tratar y/o curar a un sujeto afectado con una enfermedad o trastorno (es decir, una indicación) enumerado en la Tabla 4. En realizaciones específicas, la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de atrofia muscular espinal (SMA) relacionada con SMN1, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), galactosemia relacionada con GALT, fibrosis quística (CF), trastornos relacionados con SLC3A1, cistinuria, trastornos relacionados con COL4A5, síndrome de Alport, deficiencias de galactocerebrosidasa, adrenoleucodistrofia ligada a X, adrenomieloneuropatía, ataxia de Friedreich, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, o esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 o TSC2, síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB), cistinosis relacionada con CTNS, trastornos relacionados con FMR1, incluyen síndrome de X frágil, síndrome de temblor/ataxia asociado a X frágil, síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil, síndrome de Prader-Willi, enfermedad de Fabry, telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT), enfermedad de Niemann-Pick de tipo C1, enfermedades relacionadas con lipofuscinosis ceroides neuronales, lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil (JNCL), enfermedad de Batten juvenil, enfermedad de Santavuori-Haltia, enfermedad de Jansky-Bielschowsky, deficiencia de PTT-1, deficiencia de TPP1, ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/desaparición de materia blanca, ataxia episódica tipo 2 relacionada con CACNA1A y CACNB4, trastornos relacionados con MECP2, síndrome de Rett clásico, encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2, síndrome de PPM-X, Síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5, enfermedad de Kennedy (SBMA), arteriopatía cerebral autosómica dominante relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), trastornos convulsivos relacionados con SCN1A y SCN1B, trastornos relacionados con la polimerasa G, síndrome de Alpers-Huttenlocher, neuropatía atáxica sensorial relacionada con POLG, disartria, oftalmoparesia, oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones del ADN mitocondrial, hipoplasia suprarrenal ligada a X, agammaglobulinemia ligada a X, enfermedad de Wilson y trastornos de la coagulación sanguínea.

En algunas realizaciones, después de la administración al pulmón, el ARNm y/o la proteína se administra a un tejido no pulmonar. En algunas realizaciones, el tejido no pulmonar comprende cualquier órgano y/o sistema de órganos del cuerpo, excluyendo los pulmones. En algunas realizaciones específicas, el tejido no pulmonar se selecciona del grupo que consiste del corazón, hígado, bazo, riñones, músculo esquelético, ganglios linfáticos, piel cerebral, líquido cefalorraquídeo, plasma y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones específicas, el tejido no pulmonar es el hígado. En algunas realizaciones específicas, el tejido no pulmonar es el corazón. En algunas realizaciones específicas, el tejido no pulmonar es el bazo.

En algunas realizaciones, después de la administración al pulmón, el ARNm y/o la proteína se administra a una célula no pulmonar. En algunas realizaciones, la célula no pulmonar se selecciona del grupo que consiste de hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos, células tumorales, macrófagos, neutrófilos, células presentadoras de antígenos (células dendríticas), fibroblastos y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones específicas, la célula no pulmonar es un hepatocito.

En algunas realizaciones, el ARNm y/o la proteína es detectable en la célula y/o tejido no pulmonar durante por lo menos aproximadamente 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas o más después la administración al pulmón. En algunas realizaciones, el ARNm y/o la proteína es detectable en la célula y/o tejido no pulmonar durante por lo menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días o 10 días después de la administración al pulmón. En algunas realizaciones, el ARNm y/o la proteína es detectable en la célula y/o tejido no pulmonar durante por lo menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas después de la administración al pulmón. En algunas realizaciones, el ARNm se detecta usando métodos seleccionados del grupo que consiste de hibridación in situ, RT-PCR, RT-PCR en tiempo real, transferencia Northern, ensayo de protección de nucleasas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína se detecta usando métodos seleccionados del grupo que consiste de transferencia Western, ELISA, inmunoprecipitación, ensayo BCA, inmunohistoquímica y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el ARNm se administra en una cantidad de más de aproximadamente 0,5 mg/kg (por ejemplo, de más de aproximadamente 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg o 10,0 mg/kg) de peso corporal de ARNm por dosis. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una cantidad que varía de aproximadamente 0,1-100 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 0,1-90 mg/kg, 0,1-80 mg/kg, 0,1-70 mg/kg, 0,1-60 mg/kg, 0,1-50 mg/kg, 0,1-40 mg/kg, 0,1-30 mg/kg, 0,1-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg) de peso corporal de ARNm por dosis. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una cantidad de aproximadamente 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, o 500 mg por dosis.

En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en un único vehículo portador de lípidos. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en uno o más vehículos portadores de lípidos. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en uno o más vehículos portadores de lípidos, que difieren en su composición lipídica, relación molar de componentes lipídicos, tamaño, carga (potencial Zeta), ligandos de dirección y combinaciones de los mismos.

El vehículo portador de lípidos es una nanopartícula lipídica en la forma de un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG. En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos es un lípido ionizable. En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos es un lípido escindible. En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos es un lípido catiónico derivado de colesterol. En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos se seleccionan de C12-200, HGT4003, HGT5000, HGT5001, RE-1, RE-2, RE-3, ICE, GL-67, DLinKC2-DMA, DODAP, DODMA, DLinDMA, CLinDMA y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición comprende además un surfactante pulmonar. En algunas realizaciones, la composición se formula como partículas respirables. En algunas realizaciones, las partículas respirables tienen un tamaño de menos de aproximadamente 500 pm (por ejemplo, menos de aproximadamente 450 pm, 400 pm, 350 pm, 300 pm, 250 pm, 200 pm, 150 pm, 100 pm o 50 pm). En algunas realizaciones, la composición se formula como un lípido nebulizable. En algunas realizaciones, la composición se formula como un polvo seco.

En varias realizaciones, la invención también proporciona una composición que comprende ARNm que codifica una proteína y un vehículo portador de lípidos como se describe en la presente para su uso en un método de administración de ARN mensajero (ARNm) a una célula o tejido no pulmonar, en donde el método comprende un paso de administrar la composición al pulmón de un sujeto y además en donde la administración al pulmón da como resultado la administración del ARNm y/o proteína a la célula o tejido no pulmonar.

Como se usa en esta solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Se pretende que cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente cubra cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante.

Debe entenderse que la descripción detallada indica realizaciones de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra imagenología de bioluminiscencia (BLI) de ratones a las 6 horas después de la aplicación de pulverización intratraqueal (IT). (A) Los paneles 1, 2, 3 muestran la producción de proteínas en ratones tratados con ARNm de FFL desnudo en comparación con la producción de proteínas en ratones tratados con ARNm de FFL en C12-200: DOPE: Colesterol: nanopartículas (NP) de DMG-PEG2000 (40:30:25:5) en los paneles 4, 5, 6. (B) Paneles 1, 2 (ARNm de FFL modificado desnudo) en comparación con los paneles 3, 4, 5 (ARNm de FFL modificado en NP a base de C12-200).

La Figura 2 muestra BLI a las 6 horas después de la aplicación de la pulverización IT usando BLI. Paneles 1, 2, 3 (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200) en comparación con los paneles 4, 5, 6 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200).

La Figura 3 muestra imágenes BLI de ratones después de la aplicación de la pulverización IT. (A) Todos los ratones (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200); paneles 1, 2, 3 después de 24 horas en comparación con los paneles 4, 5, 6 después de 6 horas. (B) Todos los ratones (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200); paneles 1,2 después de 24 horas en comparación con los paneles 3, 4, 5 después de 6 horas. (C) Paneles 1, 2, (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200) en comparación con los paneles 3, 4, 5 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200) después de 24 horas.

La Figura 4 muestra imágenes BLI de ratones tratados con ARNm de FFL desnudo a las 24 horas después de las aplicaciones. Paneles 1, 2 (24 horas después de la primera aplicación); paneles 3, 4 (24 horas después de la segunda aplicación); paneles 5, 6 (24 horas después de la tercera aplicación).

La Figura 5 muestra imágenes BLI de ratones tratados con ARNm de FFL modificado desnudo a las 24 horas después de la aplicación. Paneles (24 horas después de la primera aplicación); paneles 3, 4 (24 horas después de la segunda aplicación); paneles 5, 6 (24 horas después de la tercera aplicación).

La Figura 6 muestra imágenes BLI de ratones a las 6 horas después de la aplicación de la pulverización IT. (A) Paneles 1, 2 (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200 (10 pg/ratón)); paneles 3, 4 (ARNm de FFL en Np basadas en C12-200 (5 pg/ratón). (B) Panel 1 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200 (10 pg/ratón)); paneles 2, 3 (ARNm de f Fl modificado en NP basadas en C12-200 (5 pg/ratón).

La Figura 7 muestra imágenes BLI de ratones a las 6 horas y 24 después de la aplicación de la pulverización IT a dosis de 10 pg/ratón. (A) Todos los ratones (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200); paneles 1, 2 (24 horas); paneles 3, 4 (6 horas). (B) Todos los ratones (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200); panel 1 (24 horas); panel 2 (6 horas). (C) Comparación de los paneles 1, 2 (ARNm de FFL en NP basadas en C12-200) con el panel 3 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200) a las 24 horas después de la pulverización IT.

La Figura 8 muestra la biodistribución de ARNm de FFL y FFL modificado en NP basadas en C12-200 a dosis de 5 o 10 pg/ratón después de la pulverización de IT.

La Figura 9 muestra imágenes BLI de ratones a las 6 horas después de la aplicación de la pulverización IT. Paneles 1,2, 3 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200); paneles 4, 5 (ARNm de FFL modificado en NP basadas en HGT5001)

La Figura 10 muestra imágenes BLI de ratones a las 6 horas (paneles 1,2) y 24 horas (paneles 3, 4) después de la aplicación de la pulverización IT de ARNm de FFL modificado en nanopartículas HGT5001: DOPE: Colesterol: DMG-PEG2000 (40:20:35:5) a dosis de 10 pg/ratón.

La Figura 11 muestra la imagen BLI de ratones a las 24 horas después de la aplicación de la pulverización IT. (A) Ratones sin pelaje (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200). (B) Ratones con pelaje intacto (ARNm de FFL modificado en NP basadas en C12-200).

La Figura 12 muestra luminiscencia FFL detectada en pulmón, hígado de ratones después de un tratamiento de inyección intravenosa individual de formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm, C12-200: DOPE: Colesterol: DMG-PEG2000 (40:30:25:5) y HGT5001: DOPE: Colesterol: DMG-PEG2000 (40:20:35:5). Los ratones se sacrificaron a las 6 horas y 24 horas después de la administración.

La Figura 13 muestra imágenes BLI de ratones 6 horas después de la nebulización con ARNm de FFL modificado (paneles 1, 2) y ARNm de FFL (paneles 3, 4) en NP basadas en PEI.

DEFINICIONES

Para que se entienda más fácilmente la presente invención, se definen primero ciertos términos a continuación. Se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos a lo largo de la memoria descriptiva.

Aminoácido: como se usa en la presente, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse a una cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un 1-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte 1-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en la presente, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos modificados químicamente, que incluyen pero no se limitan a, sales, derivados de aminoácidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi y/o amino terminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones postraduccionales, como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, fracciones de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, fracciones de polietilenglicol, fracciones lipídicas, fracciones de carbohidratos, fracciones de biotina, etc.). El término "aminoácido" se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Animal: como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor de: como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda del 100% de un valor posible).

Régimen de dosificación: Un "régimen de dosificación" (o "régimen terapéutico"), como se usa ese término en la presente, es un conjunto de dosis unitarias (típicamente más de una) que se administran individualmente a un sujeto, típicamente separadas por períodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis, cada una de las cuales está separada entre sí por un período de tiempo de la misma duración; en algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y por lo menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.

Expresión: como se usa en la presente, "expresión" de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza 5' y/o formación de extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína. En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción", y equivalentes gramaticales, se usan indistintamente.

Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un sujeto de control (o un sujeto de control múltiple) en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que se está tratando.

In Vitro: como se usa en la presente, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que se producen dentro de una célula viva (en oposición a, por ejemplo, los sistemas in vitro).

ARN mensajero (ARNm): como se usa en la presente, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido. El ARNm, como se usa en la presente, abarca ARN tanto modificado como no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes.

Ácido nucleico: como se usa en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que sea o pueda incorporarse en una cadena de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleótidos que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o doble. Además, los términos "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen una estructura principal distinta del fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica, tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la estructura principal. El término "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o ARN pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, enlaces fosforotioatos y 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención se dirige específicamente a "ácidos nucleicos no modificados", lo que significa ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o lograr la administración.

Paciente: como se usa en la presente, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y postnatales.

Farmacéuticamente aceptable: el término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Polipéptido: como se usa en la presente, un "polipéptido", en términos generales, es una cadena de por lo menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir por lo menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a los otros por medio de por lo menos un enlace peptídico. Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos a veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que, no obstante, son capaces de integrarse en una cadena de polipéptidos, opcionalmente.

Proteína: como se usa en la presente, el término "proteína" de "proteína terapéutica" se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de por lo menos dos aminoácidos enlazados entre sí mediante enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir fracciones distintas de los aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) y/o pueden procesarse o modificarse de otro modo. Los expertos en la técnica apreciarán que una "proteína" puede ser una cadena de polipéptidos completa producida por una célula (con o sin una secuencia señal), o puede ser una parte característica de la misma. Los expertos en la técnica apreciarán que una proteína a veces puede incluir algunas veces más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo enlazada por uno o más enlaces disulfuro o asociada por otros medios. Los polipéptidos pueden contener 1-aminoácidos, d-aminoácidos, o ambos y puede contener cualquiera de una variedad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y combinaciones de los mismos. El término "péptido" se usa generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, porciones biológicamente activas de los mismos y/o porciones características de los mismos.

Sujeto: como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdo, oveja, caballo o primate). Un humano incluye formas prenatales y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa en la presente indistintamente con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede presentar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.

Cantidad terapéuticamente eficaz: como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente mediante un régimen de dosificación que comprende por lo menos una dosis unitaria.

Tratamiento: como se usa en la presente, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratando") se refiere a cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, composiciones proporcionadas) que alivia, mejora, revive, inhibe, retrasa la aparición, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo, gripe). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante y/o de un sujeto que muestra solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o afección. Alternativa o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que muestra uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están estadísticamente correlacionados con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para la administración sistémica de ARNm y/o su producto proteico basado en la administración pulmonar. Específicamente, la invención proporciona una composición que comprende ARNm que codifica una proteína terapéutica y un vehículo portador de lípidos para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en una célula o tejido no pulmonar, en donde la composición se formula para la administración pulmonar y se administra al pulmón por aerosolización, inhalación, nebulización o instilación, en donde el vehículo portador lipídico es una partícula lipídica en la forma de un liposoma y comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG. En algunas realizaciones, se administran ARNm que codifican una proteína individual. En algunas realizaciones se administran una o más especies de ARNm que codifican una o más proteínas. En algunas realizaciones, el ARNm se administra usando un único vehículo portador de lípidos (por ejemplo, una nanopartícula lipídica en forma de liposoma). En algunas realizaciones, el ARNm se administra usando uno o más vehículos portadores de lípidos.

En las siguientes secciones se describen con detalle varios aspectos de la invención. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

ARNm y síntesis de ARNm

Los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse mediante transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, una agrupación de ribonucleótidos trifosfatos, un sistema de tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio y una ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T3, T7 o SP6 ARN polimerasa), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán de acuerdo con la aplicación específica.

En algunas realizaciones, para la preparación de ARNm de acuerdo con la invención, se transcribe una plantilla de ADN in vitro. Una plantilla de ADN adecuada típicamente tiene un promotor, por ejemplo, un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripción in vitro, seguido de la secuencia de nucleótidos deseada para un ARNm deseado y una señal de terminación.

La secuencia de ARNm deseada de acuerdo con la invención puede determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN usando métodos estándar. Por ejemplo, partiendo de una secuencia de aminoácidos deseada, se lleva a cabo una traducción inversa virtual basada en el código genético degenerado. Luego, pueden usarse algoritmos de optimización para la selección de codones adecuados. Típicamente, puede optimizarse el contenido de G/C para lograr el contenido de G/C más alto posible por un lado, teniendo en cuenta la mejor frecuencia posible de los ARNt de acuerdo con el uso de codones por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y mostrarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). También puede analizarse una estructura secundaria para calcular las propiedades de estabilización y desestabilización o, respectivamente, las regiones del ARN.

El ARNm de acuerdo con la presente invención puede sintetizarse como ARNm modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el ARNm puede incluir una o más modificaciones químicas o estructurales para anular la interacción del ARNm con los receptores tipo toll TLR3, TLR7, TLR8 y el gen I inducible por retinoides (RIG-I) para reducir la inmunogenicidad y mejorar la estabilidad del ARNm.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el ARNm puede modificarse como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2009/0286852, para comprender uno o más residuos de pseudouridina. Kormann et al., Nature Biotechnology 29(2):154-157 (2011) describen el reemplazo de uridina y citidina con 2-tiouridina y 5-metilcitidina para disminuir sinérgicamente la unión del ARNm a los receptores de reconocimiento de patrones TLR3, TLR7, TLR8 y RIG- I y aumentar la estabilidad del ARNm. Ver la EP2459231. En otras realizaciones más, el ARNm puede modificarse para reducir la inmunogenicidad como se describe en la Solicitud Europea EP10742089.

En otras realizaciones, las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Por tanto, un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. En algunas realizaciones, los ARNm que codifican una proteína de interés pueden sintetizarse a partir de nucleótidos de origen natural y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)) y como nucleótidos modificados análogos o derivados de purinas y pirimidinas como, por ejemplo, 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, beta-D-manosil-queosina, wibutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, de la Patente de Estados Unidos N° 4.373.071, Patente de Estados Unidos N° 4.401.796, Patente de Estados Unidos N° 4.415.732, Patente de Estados Unidos N° 4.458.066, Patente de Estados Unidos N° 4.500.707, Patente de Estados Unidos N° 4.668.777, Patente de Estados Unidos N° 4.973.679, Patente de Estados Unidos N° 5.047.524, Patente de Estados Unidos N° 5.132.418, Patente de Estados Unidos N° 5.153.319, Patentes de Estados Unidos N° 5.262.530 y 5.700.642. Ver G. Tavernier et al., J. Controlled Release 150:238-247 (2011) y la WO 2010/053572. Ver también la US 2009/0286852 que proporciona una lista exhaustiva de nucleósidos modificados, en 55, y 68-75 y la WO 2008/052770 que describen numerosas modificaciones de ARNm para aumentar la estabilidad del ARNm y la producción de proteínas.

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de la estructura principal del ARN. Típicamente, una modificación de la estructura principal es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Los ejemplos de modificaciones de la estructura principal incluyen típicamente, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste de metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc. lo que significa reemplazar el enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de azúcar. Una modificación típica de azúcar es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene, incluyendo pero no limitado a, modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste de 2'-desoxi-2'-fluoro-oligoribonucleótido (2'-fluoro-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-deamina-oligorribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2' -amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligoribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligoribonucleótido e isómeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato) o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de bases). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de base también se denomina nucleótido de base modificada. Ejemplos de tales nucleótidos modificados en la base incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7-deazaadenosina 5'-trifosfato, 7-deazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, bencimidazol ribosido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.

En ciertas realizaciones, pueden realizarse modificaciones estabilizadoras en uno o ambos de los extremos 3' y 5' del ARNm e incluir, por ejemplo, cobertura de extremos, cola poliA, reemplazo de secuencias no codificantes inestables (como elementos ricos en adenilato uridilato (AREs ) o la adición de secuencias no traducidas 3' o 5' de ARNm estable (como, por ejemplo, p-globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o ARNm de enzima del ciclo del ácido cítrico). También pueden realizarse modificaciones estabilizadoras dentro del ARNm, e incluyen, por ejemplo, optimización de codones y/o modificación de la secuencia de Kozak, y/o incorporación de nucleósidos modificados (como, por ejemplo, pirrolopirimidina, C5-yodouridina, 2-amino adenosina y 2-tiotimidina). En ciertas realizaciones, el ARNm modificado usado en las composiciones de la invención incluye una secuencia no traducida 5' del gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV: XCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGA CACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCC CGUGCCAAGAGUG ACUCACCGUCCUUGACACG, en donde X, si está presente es GGA (SEQ ID NO: 1), o una secuencia que es por lo menos un 90% o por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, o una y/o una secuencia 3' no traducida del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH): CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUC CCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUG CAUC (SEQ ID NO:2), o una secuencia que es por lo menos un 90% o por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 2, para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la vida media del ARNm. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de polinucleótidos del ARNm, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de la secuencia no traducida del gen 1 temprano inmediato (IE1) de CMV y/o la secuencia no traducida del gen hGH mejora aún más la traducción del ARNm. .

Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas.

Por tanto, en algunas realizaciones, los ARNm de la presente invención incluyen una estructura de caperuza 5'. Típicamente, se añade una caperuza 5' de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego, se añade guanosina trifosfato (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, produciendo un enlace trifosfato 5'5'5; y el nitrógeno 7 de la guanina se metila luego mediante una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, los ARNm de la presente invención incluyen una estructura de cola poli(A) 3'. Una cola poli-A en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de adenosina, de aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de adenosina, de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de adenosina, de aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de adenosina, o de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm de la presente invención incluyen una estructura de cola poli(C) 3’. Una cola de poli-C adecuada en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citosina (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de citosina, de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citosina, de aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de citosina, de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de citosina nucleótidos, o de aproximadamente 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola poli-C puede añadirse a la cola poli-A o puede sustituir la cola poli-A.

En algunas realizaciones, los ARNm de la presente invención incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida 5’ incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida 5’ puede tener una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una región no traducida 3' incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de localización de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para ARNmi. En algunas realizaciones, una región no traducida 3’ puede tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.

Proteínas codificadas por ARNm

Los ARNm usados en las composiciones de la invención pueden usarse para expresar proteína de longitud completa, truncada, nativa o modificada para su administración a células y tejidos no pulmonares. En algunas realizaciones, el ARNm comprende por lo menos una especie de ARNm que codifica una proteína terapéutica. En algunas realizaciones, el ARNm comprende una pluralidad de especies de ARNm que codifican uno o más productos génicos. En algunas realizaciones, el ARNm comprende por lo menos dos especies de ARNm, cada una de las cuales codifica un producto génico diferente. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína de longitud completa. En algunas realizaciones, los ARNm codifican una versión truncada de la proteína de longitud completa de origen natural. En algunas realizaciones, los ARNm codifican una o más proteínas truncadas de diferentes productos génicos en una única transcripción. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína quimérica, en el que una o más secuencias de proteínas que no están asociadas de manera natural con la proteína nativa están enlazadas por un enlace peptídico en la proteína quimérica resultante durante la expresión. En algunas realizaciones, el ARNm puede usarse para expresar una proteína de longitud parcial o completa que comprende actividad celular a un nivel igual o mayor que el de la proteína nativa. En algunas realizaciones, el ARNm puede usarse para expresar una proteína de longitud completa o parcial con actividad celular a un nivel igual o menor que el de la proteína nativa.

En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína intracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína citosólica. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con el citoesqueleto de actina. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con la membrana plasmática. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica una proteína transmembrana. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica una proteína de canal iónico. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína perinuclear. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína nuclear. En algunas realizaciones específicas, el ARNm codifica un factor de transcripción. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína chaperona. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una enzima intracelular (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima asociada con trastornos metabólicos del ciclo de la urea o del almacenamiento lisosomal). En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína implicada en el metabolismo celular, reparación, transcripción y/o traducción del ADN. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína extracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína asociada con la matriz extracelular. En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína secretada. En realizaciones específicas, el ARNm usado en la composición de la invención puede usarse para expresar proteínas o enzimas funcionales que son excretadas o secretadas por una o más células objetivo en el fluido extracelular circundante (por ejemplo, ARNm que codifica hormonas y neurotransmisores).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de ARNm que codifica una proteína secretada. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de ARNm que codifica una o más proteínas secretadas enumeradas en la Tabla 1; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína enumerada en la Tabla 1 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención pueden comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína enumerada en la Tabla 1 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente.

Tabla 1: Proteínas Secretadas

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Las ID de Uniprot expuestas en la Tabla 1 se refieren a las versiones humanas de las proteínas enumeradas y las secuencias de cada una están disponibles en la base de datos de Uniprot. Las secuencias de las proteínas enumeradas también están generalmente disponibles para varios animales, incluyendo varios mamíferos y animales de interés veterinario o industrial. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de uno o más ARNm que codifican una o más proteínas elegidas entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de las proteínas secretadas enumeradas en la Tabla 1; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína elegida entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 1 junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención pueden comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína elegida de los homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 1 junto con otros componentes expuestos en la presente. En algunas realizaciones, los homólogos de mamíferos se eligen de homólogos de ratón, rata, hámster, jerbo, caballo, cerdo, vaca, llama, alpaca, visón, perro, gato, hurón, oveja, cabra o camello. En algunas realizaciones, el animal de interés veterinario o industrial se elige de los mamíferos enumerados anteriormente y/o pollo, pato, pavo, salmón, bagre o tilapia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de uno o más ARNm que codifican una o más proteínas ejemplares adicionales enumeradas en la Tabla 2; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína enumerada en la Tabla 2 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención puede comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína elegida entre las proteínas enumeradas en la Tabla 2 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente.

Tabla 2: Proteínas secretadas adicionales.

Las ID de Uniprot expuestas en la Tabla 2 se refieren a las versiones humanas de las proteínas supuestas enumeradas y las secuencias de cada una están disponibles en la base de datos de Uniprot. Las secuencias de las proteínas enumeradas también están disponibles para varios animales, incluyendo varios mamíferos y animales de interés veterinario o industrial. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de uno o más ARNm que codifican una proteína elegida entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 2; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína elegida de homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 2 junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención puede comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína elegida de homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 2 junto con otros componentes expuestos en la presente. En algunas realizaciones, los homólogos de mamíferos se eligen de homólogos de ratón, rata, hámster, jerbo, caballo, cerdo, vaca, llama, alpaca, visón, perro, gato, hurón, oveja, cabra o camello. En algunas realizaciones, el animal de interés veterinario o industrial se elige de los mamíferos enumerados anteriormente y/o pollo, pato, pavo, salmón, bagre o tilapia.

En realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de ARNm que codifica una proteína lisosomal elegida de la Tabla 3. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la dministración de uno o más ARNm que codifican uno o más lisosomas y/o proteínas relacionadas enumeradas en la Tabla 3; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína enumerada en la Tabla 3 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención pueden comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína elegida entre las proteínas enumeradas en la Tabla 3 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente.

Tabla 3: Proteínas lisosomales relacionadas.

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La información referente a las proteínas lisosomales está disponible de Lubke et al., "Proteomics of the Lysosome," Biochim Biophys Acta. (2009) 1793: 625-635. En algunas realizaciones, la proteína enumerada en la Tabla 3 y codificada por ARNm en las composiciones de la invención es una proteína humana. Las secuencias de las proteínas enumeradas también están disponibles para varios animales, incluyendo varios mamíferos y animales de interés veterinario o industrial. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones y los métodos de la invención proporcionan la administración de uno o más ARNm que codifican una proteína elegida entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 3; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína elegida entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla 3 junto con otros componentes expuestos en la presente, y la puesta en práctica de la invención puede comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína elegida entre homólogos de mamíferos u homólogos de un animal de interés veterinario o industrial de una proteína enumerada en la Tabla S3 junto con otros componentes expuestos en la presente. En algunas realizaciones, los homólogos de mamíferos se eligen entre homólogos de ratón, rata, hámster, jerbo, caballo, cerdo, vaca, llama, alpaca, visón, perro, gato, hurón, oveja, cabra o camello. En algunas realizaciones, el animal de interés veterinario o industrial se elige entre los mamíferos enumerados anteriormente y/o pollo, pato, pavo, salmón, bagre o tilapia.

Las composiciones de la invención proporcionan la administración de ARNm que codifica una proteína terapéutica (por ejemplo, citosólica, transmembrana o secretada) como las enumeradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención proporcionan la administración de un ARNm que codifica una proteína terapéutica útil en el tratamiento de una enfermedad o trastorno (es decir, una indicación) enumerados en la Tabla 4; por tanto, las composiciones de la invención pueden comprender un ARNm que codifica una proteína terapéutica enumerada o no enumerada en la Tabla 4 (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente para tratar una enfermedad o trastorno (es decir, una indicación) enumerado en la Tabla 4, y la puesta en práctica de la invención puede comprender preparar y/o administrar una composición que comprende un ARNm que codifica dicha proteína (o un homólogo de la misma, como se analiza a continuación) junto con otros componentes expuestos en la presente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerada en la Tabla 4.

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En algunas realizaciones, una o más proteínas terapéuticas de la presente invención se seleccionan de la Tabla 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones específicas, una o más proteínas terapéuticas se seleccionan del grupo que consiste de alfa galactosidasa, eritropoyetina, a1-antitripsina., carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, lipasa ácida lisosomal, arilsulfatasa-A alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, betaglucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, hormona del crecimiento humano, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa-1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa-1 (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL), arginasa-1 (ARG1), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), Factor VII, Factor VIII, Factor IX, heparan-N-sulfatasa y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente invención se usa para prevenir, tratar y/o curar a un sujeto afectado con una enfermedad o trastorno enumerado o asociado con las proteínas enumeradas en las Tablas 1, 2, 3 o 4. Las enfermedades o trastornos para los cuales pueden emplearse las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos como atrofia muscular espinal (AME) relacionada con SMN1, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), galactosemia relacionada con GALT, fibrosis quística (FQ), trastornos relacionados con SLC3A1, cistinuria, trastornos relacionados con COL4A5, síndrome de Alport, deficiencias de galactocerebrosidasa, adrenoleucodistrofia ligada a X, adrenomieloneuropatía, ataxia de Friedreich, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 o TSC2, síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB), cistinosis relacionada con CTNS, trastornos relacionados con FMR1, incluyendoel síndrome de X frágil, síndrome de temblor/ataxia asociado a X frágil, síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil, síndrome de Prader-Willi, enfermedad de Fabry, telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT), enfermedad de Niemann-Pick tipo C1, enfermedades relacionadas con lipofuscinosis ceroides neuronales, lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil (JNCL), enfermedad de Batten juvenil, enfermedad de Santavuori-Haltia, enfermedad de Jansky-Bielschowsky, deficiencia de PTT-1, deficiencia de TPP1, ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/desaparición de la materia blanca, ataxia episódica tipo 2 relacionada con CAC1A y CACNB4, los trastornos relacionados con MECP2, síndrome de Rett clásico, encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2, síndrome de PPM-X, síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5, enfermedad de Kennedy (SBMA), arteriopatía cerebral autosómica dominante relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), trastornos convulsivos relacionados con SCN1A y SCN1B, trastornos relacionados con la polimerasa G, síndrome de Alpers-Huttenlocher, neuropatía atáxica sensorial dominante relacionada con POLG, disartria, oftalmoparesia, oftalmoplejía externa progresiva recesiva y dominante autosómica con deleciones del ADN mitocondrial, hipoplasia suprarrenal ligada a X, agammaglobulinemia, enfermedad de Wilson y trastornos de la coagulación sanguínea.

En ciertas realizaciones, el ARNm usado en las composiciones de la invención puede codificar un anticuerpo. En algunas realizaciones, el ARNm puede codificar una proteína que está compuesta de subunidades codificadas por más de un gen. Por ejemplo, la proteína puede ser un heterodímero, en donde cada cadena o subunidad de la misma está codificada por un gen separado. Alternativamente, puede diseñarse un solo ARNm para que codifique más de una subunidad. En una realización, el ARNm puede codificar anticuerpos de longitud completa (tanto cadenas pesadas como ligeras de las regiones variable y constante) o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fv o un Fv de cadena sencilla (scFv) para conferir inmunidad a un sujeto.

Como se usa en la presente, el término "cadena pesada" abarca todos los tipos de cadenas pesadas de origen natural de diferentes clases de inmunoglobulinas, que incluyen pero no se limitan a, IgM(p), IgD(5), IgG(Y), IgA(a) e IgE(s), y variantes biológicamente activas de las mismas. Típicamente, una cadena pesada de acuerdo con la presente invención contiene la región variable N-terminal responsable del reconocimiento de antígenos, que incluye típicamente CDR 1, CDR 2 y CDR 3, separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4). Típicamente, la región variable N-terminal contiene aproximadamente de 100 a 110 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, una cadena pesada de acuerdo con la presente invención contiene uno o más dominios constantes (por ejemplo, C^h1, C^h2 y/o C^h3). En algunas realizaciones, un ARNm que codifica una cadena pesada de un anticuerpo es igual o superior a 0,3 kb, 0,5 kb, 0,75 kb, 1,0 kb, 1,25 kb, 1,5 kb, 1,75 kb, 2,0 kb, 2,5 kb, 3,0 kb, 3,5 kb, 4.0 kb de longitud.

Como se usa en la presente, el término "cadena ligera" abarca todos los tipos de cadenas ligeras de origen natural de diferentes clases de inmunoglobulinas, incluyendo pero no limitadas a, los isotipos ^ko A, y variantes biológicamente activas de los mismos. Típicamente, una cadena ligera de acuerdo con la presente invención comprende un dominio variable N-terminal (V^l). En algunas realizaciones, una cadena ligera de acuerdo con la presente invención contiene un dominio constante C-terminal (C^l). En algunas realizaciones, un ARNm que codifica una cadena ligera de un anticuerpo es igual o superior a 0,1 kb, 0,2 kb, 0,3 kb, 0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,8 kb, 0,9 kb, 1,0 kb, 1,25 kb, 1,5 kb, 1,75 kb, 2,0 kb, 2,5 kb o 3,0 kb de longitud.

De acuerdo con la presente invención, una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo pueden codificarse y administrarse mediante un único ARNm o ARNm separados. Se contempla que puede ser ventajoso administrar ARNm que codifica la cadena pesada y ARNm que codifica la cadena ligera en proporciones variables para optimizar la producción de anticuerpos funcionales completamente ensamblados.

En algunas realizaciones, el ARNm puede codificar adicionalmente una o más secuencias líder secretoras que están enlazadas operativamente y dirigen la secreción de un anticuerpo, fragmento(s) de anticuerpo u otra proteína(s). Las secuencias líder secretoras adecuadas se describen, por ejemplo, en la US 2008/0286834 A1. Aunque una realización de la presente invención se refiere a composiciones útiles para conferir inmunidad a un sujeto (por ejemplo, mediante la traducción de ARNm que codifica anticuerpos funcionales), las invenciones divulgadas en la presente y contempladas en la misma son ampliamente aplicables. En una realización alternativa, las composiciones de la presente invención codifican anticuerpos que pueden usarse para efectuar transitoria o crónicamente una respuesta funcional en sujetos. Por ejemplo, el ARNm de la presente invención puede codificar un anticuerpo monoclonal o policlonal funcional, que tras la traducción y la secreción de la célula objetivo puede ser útil para dirigirse y/o inactivas un objetivo biológico (por ejemplo, una citoquina estimuladora como el factor de necrosis tumoral).

Vehículos portadores de lípidos

La presente invención contempla usa nanopartículas lipídicas en la forma de liposomas como vehículos portadores de lípidos para facilitar la administración de ARNm a las células objetivo. Los vehículos portadores de lípidos son generalmente útiles en una variedad de aplicaciones en investigación, industria y medicina, particularmente para su uso como vehículos de transferencia de compuestos de diagnóstico o terapéuticos in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16:307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51:691-743, 1999) y se caracterizan habitualmente como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuático interior secuestrado de un medio externo por una membrana de uno o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas están formadas típicamente por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos espacialmente separados (Lasic, Trends Biotechnol., 16:307-321, 1998). Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfifílicos y surfactantes (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.).

En el contexto de la presente invención, un vehículo portador de lípidos sirve típicamente para transportar ARNm a una célula objetivo. Una característica inesperada y ventajosa de la presente invención fue la observación de que la administración pulmonar de ARNm, que está encapsulado dentro de un vehículo portador de lípidos, da como resultado la administración de ARNm y/o la proteína a células y tejidos no pulmonares. Para los propósitos de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomal se preparan para contener los ácidos nucleicos deseados. El proceso de incorporación de una entidad deseada (por ejemplo, un ácido nucleico) en un liposoma se denomina a menudo "carga" (Lasic, et al., FEBS Lett., 312:255-258, 1992). Los ácidos nucleicos incorporados al liposoma pueden estar localizados total o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. A la incorporación de un ácido nucleico en los liposomas también se hace referencia en la presente como "encapsulación", en donde el ácido nucleico está contenido por completo dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o agentes químicos que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente invención, el vehículo de transferencia seleccionado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo. El liposoma puede permitir que el ARNm encapsulado llegue a la célula objetivo y/o puede permitir preferentemente que el ARNm encapsulado alcance células y tejidos no pulmonares, tras la administración pulmonar.

Un vehículo portador de lípidos adecuado se formula como una nanopartícula lipídica. Como se usa en la presente, la frase "nanopartícula lipídica" y "vehículo portador de lípidos" y "nanopartícula derivada de lípidos" se usan todos indistintamente y se refieren a un vehículo de administración que comprende uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, lípidos a base de colesterol, y lípidos modificados con PEG). Las nanopartículas lipídicas contempladas pueden prepararse incluyendo mezclas de lípidos multicomponente de proporciones variables empleando uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, lípidos a base de colesterol y lípidos modificados con PEG. Los ejemplos de lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, los compuestos de fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos).

Los complejos catiónicos de liposoma/ARNm pueden ayudar a proteger el ARNm de la degradación enzimática y facilitar la administración intracelular al interactuar con la membrana celular cargada negativamente. Sin embargo, la superficie catiónica de estos lipoplejos también media en interacciones fuertes con proteínas cargadas negativamente que sirven para reducir la vida media de los lipoplejos in vivo. Este efecto puede reducirse empleando uno o más de un mecanismo para reducir la interacción entre el complejo catiónico de liposoma/ARNm y proteínas cargadas negativamente. En la mayoría de las realizaciones, los vehículos de administración usados en las composiciones de la invención comprenden nanopartículas construidas a partir de una combinación de uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, como lípidos neutrales o auxiliares, y lípidos modificados con PEG.

Nanopartículas lipídicas

Las nanopartículas lipídicas de la presente invención comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol, y uno o más lípidos modificados con PEG. En algunas realizaciones, el vehículo de administración se selecciona en base a su capacidad para facilitar la administración pulmonar y la translocación a tejido no pulmonar.

Como se usa en la presente, los vehículos de administración liposomal, se caracterizan habitualmente como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuoso interior secuestrado de un medio externo por una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de liposomas están formadas típicamente por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfifílicos y surfactantes (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.). En el contexto de la presente invención, un vehículo de administración liposomal sirve típicamente para transportar un ARNm deseado a un tejido objetivo. A la incorporación de un ácido nucleico en los liposomas también se hace referencia en la presente como "encapsulación", en donde el ácido nucleico está contenido por completo dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo proteger el ácido nucleico de un ambiente que puede contener enzimas o agentes químicos que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un vehículo de administración adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar la administración de ARNm a la célula o tejido objetivo.

Un vehículo de administración adecuado contiene un lípido catiónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como pH fisiológico. En la bibliografía se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos particularmente adecuados para su uso en las composiciones de la invención incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 (y particularmente, CI 2-200 descrito en el párrafo [00225]) y la WO 2012/170930. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención emplean nanopartículas lipídicas que comprenden un lípido catiónico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012 como, por ejemplo, 15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa- 15,18-dien- 1 -amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien- 1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001), y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, ^{1 2}-dien- ¹-il)tetracosa-5, 15 , 18-trien- ¹-amina (HGT5002).

En algunas realizaciones, se usa el lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxil)propil]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4.897.355). El DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o “DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal, y tales liposomas pueden usarse para mejorar la administración de ácidos nucleicos en las células objetivo. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxispermilglicinedioctadecilamida o “DOGS”, 2,3-dioleiloxi-“DOGS,” 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o“ DOSPA ”(Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci.

^{8 6}, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5.171.678; Patente de Estados Unidos N° 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano o "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3- aminopropano o "DODMA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1 -(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,2-dioleiloxibencilamina o “RE-1” (di((Z)-non-2-en-1-il)9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanedioato) o "RE-2" ((6Z,25Z)-dietil 16-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)hentriaconta-6,25-dienedioato) o "RE-3" ((9Z,28Z)-dimetil 19-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptatriaconta-9,28-dienedioato) (Ver, US2012/0027803) o "GL-67" (Andries et al., Molecular Pharmaceutics, 9: 2136-2145 (2012); Zhao et al., "Cationic Liposomes in Different Structural Levels for Gene Delivery", Non-Vrial Gene Therapy, InTech publishing, 13: 293-318 (2011)) o "DMOBA", ,2-N,N’-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarb-DAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N’-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropane o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin- -DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", y 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (Ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010), o mezclas del mismo (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de PCT WO2005/121348A1). En algunas realizaciones, el lípido catiónico no es "GL-67".

En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos presentes en dicha composición comprenden por lo menos uno de una fracción de imidazol, dialquilamino o guanidinio.

En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos presentes en dicha composición se eligen de XTC (2,2-Dilinolei1-4-dimetilaminoeti1-[1,3]-dioxolano), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato), ALNI^{- 1 0 0}((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] ^[1,3]dioxol-5-amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), ICE (WO 2011/068810), HGT5000 (Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/617,468) o HGT5001 (cis o trans) (Solicitud de Patente Provisional N° 61/617,468), lipidoides de aminoalcoholes como los divulgados en la WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenol-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "La saturación de lípidos catiónicos influye en la administración intracelular de ácidos nucleicos encapsulados" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869).

Un vehículo de administración adecuado contiene uno o más lípidos no catiónicos. En algunas realizaciones, un lípido no catiónico es un lípido neutro, es decir, un lípido que no lleva una carga neta en las condiciones en las que se formula y/o administra la composición. Tales lípidos no catiónicos o neutros ejemplares pueden elegirse de DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1 '-rac-glicerol)) y colesterol.

Los lípidos catiónicos a base de colesterol se usan en combinación con otros lípidos catiónicos, no catiónicos o modificados con PEG. Los lípidos catiónicos a base de colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.744.335), o ICE.

En otras realizaciones, nanopartículas lipídicas adecuadas que comprenden uno o más lípidos escindibles, como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro (S-S) escindible (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), como se describe adicionalmente en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/494,745.

Además, para mejorar la eficacia de la transfección están disponibles comercialmente varios reactivos. Los ejemplos adecuados incluyen LIPOFECTIN (DOTMA: DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, CA), LIPOFECTA INE (DOSPA: DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) y EFFECTENE. En algunas realizaciones, el lípido catiónico puede comprender una relación molar de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40% del lípido total presente en el vehículo de transferencia, o preferiblemente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.

En la presente invención se usan fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados como cerarmidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo la N-octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (ceramida C⁸PEG-2000) en combinación con otros lípidos juntos que comprenden el vehículo portador de lípidos. Los lípidos modificados con PEG pueden incluir, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena o cadenas de alquilo de longitud C6-C20. La adición de tales componentes puede prevenir la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar la administración de la composición de lípidos-ácidos nucleicos a la célula objetivo, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para intercambiar rápidamente la formulación in vivo (ver la Patente de Estados Unidos N° 5.885.613).

Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos derivatizados de la presente invención pueden comprender una relación molar de aproximadamente el ⁰% a aproximadamente el ^{2 0}%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, o de aproximadamente el 2% del lípido total presente en el vehículo de transferencia liposomal.

Como se usa en la presente, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwiteriónico o aniónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga negativa neta a un pH seleccionado, como pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOpG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), ^{1 6}-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. Tales lípidos no catiónicos pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. Cuando se usa en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar del 5% a aproximadamente el 90%, o preferiblemente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en el vehículo de transferencia.

En realizaciones particulares, un vehículo de transferencia adecuado (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) se prepara combinando múltiples componentes lipídicos y/o poliméricos. Por ejemplo, puede prepararse un vehículo de transferencia usando C12-200, Do PE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:30:25:5, o DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K a una relación molar de 18:56:20:6, o HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:20:35:5, o HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K en una relación molar de 40:20:35:5. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que comprenden la nanopartícula lipídica, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células objetivo pretendidas, las características del ARNm que se va a administrar. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena de alquilo, así como el tamaño, carga, pH, pKa, fusiogenicidad y toxicidad del lípido o lípidos seleccionados. Por tanto, las relaciones molares pueden ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, en las realizaciones, el porcentaje de lípido catiónico en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30%, mayor del 40%, mayor del 50%, mayor del 60% o mayor del 70%. El porcentaje de lípidos no catiónicos en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 5%, mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30% o mayor del 40%. El porcentaje de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30% o mayor del 40%. El porcentaje de lípido modificado con PEG en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 1%, mayor del 2%, mayor del 5%, mayor del 10% o mayor del 20%.

En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas adecuadas de la invención comprenden por lo menos uno de los siguientes lípidos catiónicos: C12-200, HGT4003, HGT5000, HGT5001, RE-1, RE-2, RE3, GL-67 e ICE.

En algunas realizaciones específicas, se formula una nanopartícula lipídica adecuada sin usar el lípido catiónico GL-67. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia adecuado comprende colesterol y/o un lípido modificado con PEG. En algunas realizaciones, los vehículos de transferencia adecuados comprenden DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el vehículo de transferencia adecuado comprende una de las siguientes combinaciones de lípidos: C12-200, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5001, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; XTC, DSPC, colesterol, PEG-DMG; MC3, DSPC, colesterol, PEG-DMG; y ALNY-100, DSPC, colesterol, DLinKC2-DMA, DODMA, DLinDMA, CLinDMA PEG-DSG.

Los vehículos portadores de lípidos para su uso en las composiciones de la invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Las vesículas multilaminares (MLV) pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un envase o recipiente adecuado, disolviendo el lípido en un disolvente apropiado y luego evaporando el disolvente para dejar una película delgada en el dentro del recipiente o mediante secado por pulverización. Luego puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de MLV. Las vesículas unilamelares (ULV) pueden formarse luego mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Además, pueden formarse vesículas unilaminares mediante técnicas de eliminación de detergente.

En ciertas realizaciones de esta invención, las composiciones de la presente invención comprenden un vehículo de transferencia en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del vehículo de transferencia como encapsulado dentro del mismo vehículo de transferencia. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomales catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los vehículos de transferencia liposomales catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden ARNm encapsulado en un vehículo portador de lípidos. En algunas realizaciones, la una o más especies de ARNm pueden encapsularse en el mismo vehículo portador de lípidos. En algunas realizaciones, la una o más especies de ARNm pueden encapsularse en diferentes vehículos portadores de lípidos. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en uno o más vehículos portadores de lípidos, que se diferencian en su composición lipídica, relación molar de componentes lipídicos, tamaño, carga (potencial Zeta), ligandos dirigidos y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más vehículos portadores de lípidos pueden tener una composición diferente de lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos modificados con PEG y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más vehículos portadores de lípidos pueden tener una relación molar diferente de lípidos catiónicos, lípidos neutros, colesterol y lípido modificado con PEG usados para crear el vehículo portador de lípidos.

Métodos de administración

La vía de administración usada en la administración de las composiciones de la invención permite la autoadministración no invasiva de las composiciones terapéuticas de la invención. Administrar las composiciones de la invención implica la administración pulmonar mediante aerosolización, nebulización o instilación de composiciones que comprenden ARNm que codifica una proteína terapéutica en vehículos de transfección o portadores de lípidos adecuados como se ha descrito anteriormente.

Aunque las células y tejidos locales del pulmón representan un objetivo potencial capaz de funcionar como depósito o reservorio biológico para la producción y secreción de la proteína codificada por el ARNm, los solicitantes han descubierto que la administración de las composiciones de la invención al pulmón mediante aerosolización, nebulización o instilación da como resultado la distribución de proteínas incluso no secretadas fuera de las células pulmonares. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se contempla que las composiciones de nanopartículas de la invención atraviesen la barrera sanguínea de las vías respiratorias pulmonares, dando como resultado la traslación de la nanopartícula intacta a células y tejidos no pulmonares como, por ejemplo, el corazón, hígado, bazo, donde da como resultado la producción de la proteína codificada en estos tejidos no pulmonares. Por tanto, la utilidad de las composiciones de la invención se extiende más allá de la producción de proteína terapéutica en células y tejidos pulmonares del pulmón y puede usarse para administrar a células y/o tejidos objetivo no pulmonares. Son útiles en el manejo y tratamiento de un gran número de enfermedades, y en particular enfermedades periféricas resultantes de deficiencias de proteínas y/o enzimas tanto secretadas como no secretadas (por ejemplo, uno o más trastornos de almacenamiento lisosomal). En ciertas realizaciones, la administración de las composiciones de la invención dan como resultado la distribución de las nanopartículas encapsuladas de ARNm y la producción de la proteína codificada en el hígado, el bazo, el corazón y/u otras células no pulmonares. Por ejemplo, la administración de las composiciones de la presente invención como, por ejemplo, una nanopartícula que comprende ARNm que codifica beta galactosidasa (una proteína no secretada), mediante aerosolización, nebulización o instilación al pulmón dará como resultado que la propia composición y su producto proteíco (por ejemplo, proteína beta galactosidasa funcional) sea detectable en tanto las células y tejidos locales del pulmón, como en las células, tejidos y órganos objetivo periféricos como resultado de la traslocación del ARNm y la administración del vehículo a células no pulmonares.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden emplearse para dirigirse específicamente a células o tejidos periféricos. Después de la administración pulmonar, se contempla que las composiciones de la invención atraviesen la barrera sanguínea de las vías respiratorias pulmonares y se distribuyan hacia células distintas de las células pulmonares locales. Por consiguiente, las composiciones divulgadas en la presente pueden administrarse a un sujeto mediante la vía de administración pulmonar, usando una variedad de enfoques conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, por inhalación), y distribuirse tanto a las células como a los tejidos objetivo locales del pulmón, así como en células y tejidos periféricos no pulmonares (por ejemplo, células del hígado, bazo, riñones, corazón, músculo esquelético, ganglios linfáticos, cerebro, líquido cefalorraquídeo y plasma). Como resultado, tanto las células locales del pulmón como las células periféricas no pulmonares pueden servir como reservorios o depósitos biológicos capaces de producir y/o secretar un producto de traducción codificado por uno o más polinucleótidos. Por consiguiente, las presentes invenciones no se limitan al tratamiento de enfermedades o afecciones pulmonares, sino que pueden usarse como un medio no invasivo para facilitar la liberación de polinucleótidos, o la producción de enzimas y proteínas codificadas por los mismos, en órganos, tejidos y células periféricos (por ejemplo, hepatocitos) que de otro modo se conseguirían sólo mediante administración sistémica. Las células no pulmonares periféricas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células de músculo liso vascular, cardiomiocitos, células de músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células de revestimiento sinovial, células del ovario, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.

Después de la administración de la composición al sujeto, el producto proteico codificado por el ARNm (por ejemplo, una proteína o enzima funcional) es detectable en los tejidos objetivo periféricos durante por lo menos aproximadamente de uno a siete días o más después de la administración de la composición al sujeto. La cantidad de producto proteico necesaria para lograr un efecto terapéutico variará dependiendo de la afección que se esté tratando, la proteína codificada y la afección del paciente. Por ejemplo, el producto proteico puede ser detectable en los tejidos objetivo periféricos a una concentración (por ejemplo, una concentración terapéutica) de por lo menos 0,025-1,5 gg/ml (por ejemplo, por lo menos 0,050 gg/ml, por lo menos 0,075 gg/ml, por lo menos 0,1 gg/ml, por lo menos 0,2 gg/ml, por lo menos 0,3 gg/ml, por lo menos 0,4 gg/ml, por lo menos 0,5 gg/ml, por lo menos 0,6 gg/ml, por lo menos 0,7 gg/ml, por lo menos 0,8 gg/ml, por lo menos 0,9 gg/ml, por lo menos 1,0 gg/ml, por lo menos 1,1 gg/ml, por lo menos 1,2 gg/ml, por lo menos 1,3 gg/ml, por lo menos 1,4 gg/ml, o por lo menos 1,5 gg/ml) durante por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 días o más después de la administración de la composición al sujeto.

Se ha demostrado que los ácidos nucleicos pueden administrarse a los pulmones mediante administración intratraqueal de una suspensión líquida de la composición de ácidos nucleicos y la inhalación de una niebla de aerosol producida por un nebulizador líquido o el uso de un aparato de polvo seco como el descrito en la Patente de Estados Unidos N° 5.780.014.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden formularse de tal manera que puedan aerosolizarse o administrarse de otro modo como un líquido o sólido particulado antes o después de la administración al sujeto. Tales composiciones pueden administrarse con la ayuda de uno o más dispositivos adecuados para administrar tales composiciones particuladas sólidas o líquidas (como, por ejemplo, una solución o suspensión acuosa aerosolizada) para generar partículas que sean fácilmente respirables o inhalables por el sujeto. En algunas realizaciones, tales dispositivos (por ejemplo, un inhalador de dosis medida, un nebulizador de chorro, un nebulizador ultrasónico, inhaladores de polvo seco, inhalador a base de propelente o un insuflador) facilitan la administración de una masa, volumen o dosis predeterminados de las composiciones (por ejemplo, aproximadamente 0,5 mg/kg de ARNm por dosis) al sujeto. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se administran a un sujeto usando un inhalador de dosis medida que contiene una suspensión o solución que comprende la composición y un propelente adecuado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden formularse como un polvo particulado (por ejemplo, partículas secas respirables) destinado a la inhalación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención formuladas como partículas respirables están dimensionadas apropiadamente de manera que pueden ser respirables por el sujeto o se administran usando un dispositivo adecuado (por ejemplo, un tamaño medio de partícula D50 o D90 menor de aproximadamente 500 gm, 400 gm, 300 gm, 250 gm, 200 gm, 150 gm, 100 gm, 75 gm, 50 gm, 25 gm, 20 gm, 15 gm, 12,5 gm, 10 gm, 5 gm, 2,5 gm o menor). En otras realizaciones más, las composiciones de la invención se formulan para incluir uno o más surfactantes pulmonares (por ejemplo, cuerpos lamelares). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran a un sujeto de tal manera que se administre una concentración de por lo menos 0,05 mg/kg, por lo menos 0,1 mg/kg, por lo menos 0,5 mg/kg, por lo menos 1,0 mg/kg, por lo menos 2,0 mg/kg, por lo menos 3,0 mg/kg, por lo menos 4,0 mg/kg, por lo menos 5,0 mg/kg, por lo menos 6,0 mg/kg, por lo menos 7,0 mg/kg, por lo menos 8,0 mg/kg, por lo menos 9,0 mg/kg, por lo menos 10 mg/kg, por lo menos 15 mg/kg, por lo menos 20 mg/kg, por lo menos 25 mg/kg, por lo menos 30 mg/kg, por lo menos 35 mg/kg, por lo menos 40 mg/kg, por lo menos 45 mg/kg, por lo menos 50 mg/kg, por lo menos 55 mg/kg, por lo menos 60 mg/kg, por lo menos 65 mg/kg, por lo menos 70 mg/kg, por lo menos 75 mg/kg, por lo menos 80 mg/kg, por lo menos 85 mg/kg, por lo menos 90 mg/kg, por lo menos 95 mg/kg, o por lo menos 100 mg/kg por peso corporal en una sola dosis, En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran a un sujeto de tal manera que se administre una cantidad total de por lo menos 0,1 mg, por lo menos 0,5 mg, por lo menos 1,0 mg, por lo menos 2,0 mg, por lo menos 3,0 mg, por lo menos 4,0 mg, por lo menos 5,0 mg, por lo menos ^{6 , 0}mg, por lo menos 7,0 mg, por lo menos ^{8 , 0}mg, por lo menos 9,0 mg, por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 20 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 30 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 40 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, por lo menos 55 mg, por lo menos 60 mg, por lo menos 65 mg, por lo menos 70 mg, por lo menos 75 mg, por lo menos 80 mg, por lo menos 85 mg, por lo menos 90 mg, por lo menos 95 mg o por lo menos 100 mg de ARNm en una o más dosis.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Comparación de ARNm no modificado y modificado en forma desnuda o en nanopartículas por administración intratraqueal

Descripción general: A los ratones se les pulverizó por vía intratraqueal (IT) con ARNm no modificado o modificado (el 25% de tanto citidina-5'-trifosfato como uridina-5'-trifosfato fueron reemplazados por 5-metilcitidina-5'-trifosfato y 2-tiouridina-5'-trifosfato, respectivamente) que codifica la luciferasa de luciérnaga (FFL) ya sea en forma desnuda o encapsulada en nanopartículas (NP) de base lipídica para administración de dosis individuales. La producción de luciferasa se midió mediante imagenología por bioluminiscencia (BLI) in vivo en diferentes puntos temporales después de la pulverización IT. Se prepararon órganos de ratones tratados con NP basadas en C12-200 a una dosis equivalente a 20 pg/ratón para análisis histopatológico. Para evaluar la biodistribución de complejos después de la pulverización IT, se midió la producción de luciferasa in vivo en los órganos preparados de los ratones sacrificados tratados con dosis correspondientes a 5 y 10pg de NP basadas en C12-200 por ratón.

A. Pulverización IT de ARNm desnudo y ARNm en nanopartículas basadas en C12-200 - 20 ug por ratón Formulación de nanopartículas lipídicas: se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2000 en una relación molar de 40:30:25:5, respectivamente, y se diluyeron con etanol hasta 3 ml de volumen final. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL o de FFL modificado a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C.

El ARN mensajero se sintetizó mediante un proceso de transcripción in vitro usando una plantilla de ADNc que codifica la proteína FFL con regiones no traducidas predeterminadas. El constructo de ARN resultante se procesó incorporando además una estructura de caperuza 1 en el extremo 5' y una longitud de cola poli-A de ~200 bases de adenosina.

Se sintetizó ARN mensajero modificado de una manera similar a la indicada anteriormente con el 25% de las bases de uridina sustituidas con 2-tiouridina trifosfato y el 25% de las bases de citidina sustituidas con 5-metilcitidina trifosfato.

Se adquirieron ratones hembra Balb/c de Elevage-Janvier, Francia. Los ratones tenían 10 semanas al comienzo del experimento. Los ratones se pesaron antes del comienzo del experimento y se asignaron a uno de los siguientes cuatro grupos (n^{= 6}ratones por grupo): grupo I - pulverización IT con ARNm de FFL; grupo II -pulverización IT con ARNm de FFL modificado; grupo III - pulverización IT con ARNm de FFL en nanopartículas lipídicas basadas en C12-200; grupo IV - pulverización IT con ARNm de FFL modificado en nanopartículas lipídicas basadas en C12-200. Cada ratón se pulverizó con 20 pg de los ARNm/NP respectivos. La cantidad requerida de ARNm/NP por grupo se suspendió justo antes de la aplicación en agua libre de ARNasa tratada con DEPC (0,1%) (Serva, Número de catálogo: 39798, Lote P060383), hasta un volumen total de 50 pl/ratón. Las NP también se caracterizaron por medidas de tamaño y potencial zeta. Estas mediciones se realizaron en agua y se tabulan como la Tabla 5.

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La producción de luciferasa se midió mediante BLI in vivo ⁶horas después de la aplicación. Mientras que pudo detectarse una cantidad casi insignificante de proteína derivada de ARNm exógeno con ARNm desnudo, las formulaciones de nanopartículas, independientemente de las modificaciones, mostraron niveles significativos de producción de luciferasa en toda la región torácica y el abdomen superior (Figura 1). En comparación con ARNm de FFL modificado, el de FFL no modificado resultó en aproximadamente 2-3 veces más luminiscencia a las ⁶horas (Figura 2).

(Figuras 1A y B), pudo detectarse un nivel de luminiscencia muy bajo (cercano al de fondo) con ARNm desnudo. En ratones tratados con nanopartículas lipídicas, independientemente de las modificaciones, se observó una producción de luciferasa aumentada (~2-3 veces), en comparación con el punto temporal de ⁶horas, 24 horas después del tratamiento (Figuras 3A y B). No se pudo observar una diferencia significativa entre la producción de luciferasa de ARNm de FFL o de FFL modificado (Figura 3C).

Los ratones tratados con ARNm desnudo se siguieron adicionalmente en el experimento y se aplicaron dos dosis adicionales a intervalos semanales. El BLI se realizó en diferentes puntos temporales después de la aplicación. Las imágenes BLI a las 24 horas después de la aplicación, el punto temporal de máxima luminiscencia (Figura 3), se muestran en la Figura 4 (ARNm de FFL desnudo) y la Figura 5 (ARNm de FFL desnudo modificado). Con unas pocas excepciones, no se observó producción de luciferasa perceptible en ninguno de los ratones medidos (comparar las escalas en las Figuras 4 y 5 con la Figura 3).

B. Pulverización IT de ARNm de FFL y FFL modificado en nanopartículas basadas en C12-200: 5 pg por ratón y 10 pg por ratón

Se realizaron experimentos de pulverización IT con dosis reducidas de 5 y 10 gg/ratón. La formulación de nanopartículas basada en C12-200 fue como se describe en el Ejemplo 1.

Diseño experimental: Se adquirieron ratones Balb/c hembra de Elevage-Janvier, Francia. Los ratones tenían 19 semanas al comienzo del experimento. Los ratones se pesaron antes del inicio del experimento. Las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 se suspendieron justo antes de la aplicación en agua libre de ARNasa tratada con DEPC (⁰,¹%) (Serva, Número de catálogo: 39798, Lote P060383), hasta un volumen total de 50 gl/ratón. Se probaron los siguientes cuatro grupos (n=5 ratones por grupo): grupo I - pulverización IT con ARNm de FFL en nanopartículas basadas en C12-200 (5 gg/ratón); grupo II - pulverización IT con ARNm de FFL en nanopartículas basadas en C12-200 (10 gg/ratón); grupo III - pulverización IT con ARNm de FFL modificado en nanopartículas basadas en C12-200 (5 gg/ratón); y grupo IV - pulverización IT con ARNm de FFL modificado en nanopartículas basadas en C12-200 (10 gg/ratón). Un ratón del grupo III y IV murió durante la pulverización IT. Por tanto, el número restante de animales para estos grupos fue de cuatro. A las ⁶horas después de la aplicación, todos los animales mostraron piloerección y motilidad reducida. Además, un ratón de cada uno de los grupos de dosis más altas (grupos II y IV) estaba muerto en este punto temporal. Se realizo imagenología BLI para los ratones ⁶horas después de la aplicación.

Usar ARNm de FFL a dosis de 5 gg/ratón dio como resultado niveles extremadamente bajos de producción de luciferasa. Con la dosis de 10 gg/ratón se observó una mayor producción que se concentró en el hígado (Figura ⁶A). La diferencia entre las dosis aplicadas no fue muy evidente en los grupos de ARNm de FFL modificado (Figura ⁶B). La comparación de los ratones del grupo II (ARNm de FFL) con el grupo IV (ARNm de FFL modificado) reveló una luminiscencia más alta en el primero (comparar la Figura ⁶A panel 1, 2 con el panel 1 en la Figura ⁶B).

La producción de luciferasa a las 24 horas mejoró significativamente en comparación con ⁶horas después de la pulverización IT (Figuras 7A y 7B). Además, se observó una producción más alta usando ARNm de FFL en comparación con ARNm de FFL modificado (Figura 7C). Se obtuvieron resultados similares en el Ejemplo 1 con la dosis de 20 gg/ratón. Los órganos internos (corazón, hígado, pulmones, hígado, bazo y riñón) se congelaron en nitrógeno líquido para las mediciones de luciferasa in vitro.

Biodistribución después de la pulverización IT: Los órganos aislados se homogeneizaron en estado congelado usando un mortero y un pestel, se pesaron y lisaron en una solución que contenía tampón de lisis (TRIS-Cl 25 mM Triton x-100 al 0,1%; pH 7,4) e inhibidor de proteasas completo (Roche). El bazo, el corazón y los riñones se lisaron en 250 gl, mientras que los pulmones y el hígado se lisaron en 400 gl. Después de la incubación en hielo durante 20 min, las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm, 4° C durante 10 min. La actividad de luciferasa se midió usando 100 gl del sobrenadante. Cada muestra se midió por duplicado y en el análisis se usaron los valores medios de los duplicados. Todos los órganos excepto los riñones fueron positivos para la actividad de luciferasa (Figura ⁸). De acuerdo con nuestros datos de BLI, la máxima luminiscencia se observó en el hígado y los pulmones. El ARNm de FFL dio como resultado una mayor producción de proteínas en comparación con el ARNm de FFL modificado y fue evidente una dependencia de la dosis.

C. Pulverización IT de ARNm de FFL modificado en nanopartículas basadas en HGT5001 - 20 pg por ratón

Se realizó un experimento de pulverización IT con una formulación de nanopartículas basada en HGT5001.

Formulación de nanopartículas lipídicas: Se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de HGT5001: DOPE: Colesterol: DMG-PEG2K en una proporción molar de 40:20:35:5, respectivamente, y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL o FFL modificado a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución de ARNm acuosa y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4) seguido de agua destilada libre de ARNasa, se concentró y se almacenó a 2-8° C.

Diseño experimental: Se adquirieron ratones Balb/c hembra de Elevage-Janvier, Francia. Los ratones tenían 13 semanas al comienzo del experimento. Los ratones se pesaron antes del inicio del experimento. Las nanopartículas de lípidos se suspendieron justo antes de la aplicación en agua libre de RNasa tratada con DEPC (0,1%) (Serva, Número de catálogo: 39798, Lote P060383), hasta un volumen total de 50 gl/ratón.

Pulverización IT y BLI: A cada ratón se le pulverizó IT con 20 gg de la formulación de nanopartículas a base de HGT5001 en un volumen total de 50 gl/ratón. Se realizó imagenología BLI para los ratones ⁶horas después de la aplicación.

Se observaron valores de luminiscencia significativamente más bajos con las nanopartículas basadas en HGT5001 en comparación con el punto temporal correspondiente con las nanopartículas basadas en C12-200 y no se observó ningún aumento en la producción de proteínas de ⁶a 24 horas (Figura 9 y Figura 10).

En un experimento independiente que probaron formulaciones de nanopartículas basadas en C12-200 y HGT5001, después de la imagenología BLI (FIG. 11), los ratones fueron sacrificados y los órganos (corazón, pulmones, hígado, bazo y riñón) se evaluaron mediante histología (Figura 12). La producción de FFL se confirmó en el pulmón y el hígado tanto para las NP basadas en C12-200 como para las NP basadas en HGT5011.

D. Pulverización IT de ARNm de FFL modificado - administración sin nanopartículas

El ARNm desnudo dio como resultado una baja eficiencia sin tratamiento con perfluorocarbono. La aerosolización IT de ARNm encapsulado lleva a la producción de proteínas en los pulmones, el hígado, el bazo y el corazón. La FFL y FFL modificada fueron igualmente eficientes con respecto a la producción de proteínas y con una respuesta a la dosis.

Se probaron varios vehículos de administración, incluyendo polietileniminas (L-PEI 22 kDa, br-PEI 25 kDa), copolímeros de oligo(etilenglicol)metil éter metacrilato (OEGMA) y N,N-dimetilaminoetil metacrilato (DMAEMA), MLRI:DOPE, DOTAP, DMRIE-C y Lipofectamina, y no mostró luminiscencia en células no pulmonares. Por el contrario, las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 y HGT5001 dieron como resultado una producción significativa de proteínas en células no pulmonares después de la administración pulmonar.

Estas observaciones indican que solo las formulaciones de nanopartículas fueron capaces de translocarse intactas, por medios activos o pasivos, desde el pulmón al riego sanguíneo sistémico y posteriormente depositarse en diferentes tejidos, como el hígado. Esta translocación de un ARNm intacto que codifica una proteína citosólica, luciferasa de luciérnaga, constituye la administración sistémica no invasiva de un ingrediente farmacéutico activo más allá del pulmón para dar como resultado la producción de una proteína funcional a tejidos accesibles sistémicamente.

E. Nebulización de ARNm de FFL modificado con nanopartículas lipídicas basadas en PEI

Los ratones que recibieron ARNm de FFL modificado en nanopartículas basadas en PEI mostraron luminiscencia en el pulmón (Figura 13). La producción de luciferasa fue mayor con el ARNm de FFL modificado (paneles 1, 2) en comparación con el ARNm de FFL sin modificar (paneles 3, 4).

Ejemplo 2: Evaluación de la migración de nanopartículas midiendo lípidos en células objetivo no pulmonares Para identificar el paso de nanopartículas intactas en tejidos no pulmonares, se mezclan alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, Chol, DMG-PEG2000 y 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (lisamina rodamina B sulfonilo) (sal de amonio) en una relación molar de 40:29:25:5:1, respectivamente, y se diluyen con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se prepara una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de proteína no secretada, como beta-galactosidasa o ARNm de FFL (modificado o no modificado) a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyecta rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agita para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtra, se diafiltra con 1x PBS (pH 7,4), se concentra y se almacena a 2-8° C.

El ARN mensajero se sintetiza mediante un proceso de transcripción in vitro usando una plantilla de ADNc

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende ARNm que codifica una proteína terapéutica y un vehículo portador lipídico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en una célula o tejido no pulmonar, en donde la composición se formula para la administración pulmonar y se administra al pulmón por aerosolización, inhalación, nebulización o instilación, en donde el vehículo portador lipídico es una nanopartícula lipídica en la forma de un liposoma y comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG.

2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición se administra al pulmón mediante aerosolización intratraqueal.

3. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la administración al pulmón da como resultado la administración del ARNm y/o la proteína terapéutica a una célula o tejido no pulmonar, opcionalmente en donde la célula no pulmonar se selecciona del grupo que consiste de hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos, macrófagos, neutrófilos, células presentadoras de antígenos (células dendríticas), fibroblastos células tumorales y combinaciones de las mismas, preferiblemente en donde la célula no pulmonar es un hepatocito.

4. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tejido no pulmonar se selecciona del grupo que consiste del corazón, hígado, bazo, riñones, músculo esquelético, ganglios linfáticos, piel, cerebro, líquido cefalorraquídeo, plasma y combinaciones de los mismos.

5. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína terapéutica codificada por el ARNm es una proteína citosólica, en donde opcionalmente la proteína citosólica se selecciona del grupo que consiste de enzimas, factores de transcripción, chaperonas y combinaciones de las mismas.

⁶. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína terapéutica codificada por el ARNm es una proteína secretada.

7. a composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste de alfa galactosidasa, eritropoyetina, a1-antitripsina, carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, lipasa ácida lisosomal, arilsulfatasa-A alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina ⁶-sulfatasa, N-acetilglucosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-⁶-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, hormona del crecimiento humano, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa-1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa-1 (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL), arginasa-1 (ARG1), regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR), Factor VII, Factor VIII, Factor IX, heparán-N-sulfatasa y combinaciones de los mismos.

⁸. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína terapéutica es detectable en la célula o tejido no pulmonar durante por lo menos aproximadamente ¹día después de la administración al pulmón, preferiblemente en donde la proteína terapéutica es detectable en la célula o tejido no pulmonar durante por lo menos aproximadamente ²días después de la administración al pulmón.

9. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm se administra a una cantidad mayor de aproximadamente 0,5 mg/kg de ARNm por dosis.

10. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más lípidos catiónicos se seleccionan del grupo que consiste de C12-200, HGT4003, HGT5000, HGT5001, ICE, DLinKC2-DMA, DODAP, DODMA, DLinDMA, CLinDMA,, y combinaciones de los mismos.

11. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición comprende además uno o más surfactantes pulmonares.

12. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición se formula como partículas respirables, opcionalmente en donde las partículas respirables tienen un tamaño de menos de 500 pm.

13. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la composición se formula como un lípido nebulizable o polvo seco.