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JP6620093B2 - メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法 - Google Patents

メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１３年７月２３日に出願された米国仮出願番号６１／８５７，５７３、及び２０１４年２月２４日に出願された米国仮出願番号６１／９４３，８５６からの優先権を主張する。これらの仮出願のそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトにおける病気のいくつかは、機能性タンパク質の、通常は存在し活性である細胞型における、欠乏または機能障害が原因となっている。機能性タンパク質は例えば、コード遺伝子の転写不活性により、またはタンパク質を完全に、もしくは部分的に非機能的にするコード遺伝子における変異が存在するために、完全に、または部分的に欠如する場合がある。
タンパク質の完全な、または部分的な不活性化に起因するヒト疾患の例としては、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）、及び副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）が挙げられる。Ｘ−ＳＣＩＤは、免疫系内でのＢ及びＴ細胞の成長及び成熟に関与する複数のインターロイキンに対する受容体の構成成分である、共通γ鎖タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の変異に起因する。Ｘ−ＡＬＤは、ＡＢＣＤ１と呼ばれるペルオキシソーム膜輸送タンパク質遺伝子における１つ以上の変異に起因する。Ｘ−ＡＬＤを罹患する個体は、全身の組織内で大変多くの量の長鎖脂肪酸を有しており、これは精神障害または死をもたらし得る種々の症状の原因となる。
機能性タンパク質の、通常は存在し活性である細胞型における、欠乏または機能障害に起因するいくつかの病気を治療するために遺伝子治療を用いる試みが行われてきている。遺伝子治療は通常、罹患タンパク質の機能的形態をコードする遺伝子を含むベクターを、病人に導入すること、及び機能性タンパク質を発現させて病気を治療することを伴う。これまで、遺伝子治療は限定的にしか成功していない。
したがって、機能性タンパク質の完全な、または部分的な欠如に起因する病気を患うヒトにおいて、タンパク質の機能的形態を発現させるための組成物及び方法に対する必要性が引き続き存在する。
前述に従い、本発明は、生細胞（例えばヒトの体内にある細胞）内で１つ以上のｍＲＮＡ分子を発現させるために使用可能な組成物及び方法を提供する。ｍＲＮＡ分子は、生細胞内に発現する１つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは罹患した生命体（例えばヒト等の哺乳類）内で発現し、ポリペプチドの発現により、病気の１つ以上の症状が緩和される。本発明の前記組成物は、人体内での機能性ポリペプチドの欠如、または量の低下に起因するヒト疾患の治療に対して特に有用である。
したがって、一態様では、本発明は、カチオン性脂質と非カチオン性脂質を含む脂質粒子、及び該脂質粒子内に封入されているｍＲＮＡ分子を提供する。
本発明はまた、それぞれ（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及びリン脂質を含む脂質粒子、並びに（ｂ）ｍＲＮＡ分子を含む核酸−脂質粒子を提供し、ｍＲＮＡ分子は脂質粒子内に封入されている。脂質粒子は所望により、コレステロールを含むことができる。ｍＲＮＡは脂質粒子内に完全に、または部分的に封入されることができる。いくつかの実施形態では、核酸−脂質粒子は、約９：１〜約２０：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、約１２：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する。ｍＲＮＡは、ウリジンに代えてプソイドウリジンを組み込むこと、及び／またはシチジンに代えて５−メチルシチジンを組み込むこと等により化学修飾することができる。本発明はまた、本発明の核酸−脂質粒子を含む医薬組成物を提供する。典型的には、医薬組成物は賦形剤を含む。
別の態様では、本発明は、タンパク質を細胞内にコードするｍＲＮＡを導入する方法を提供する。該方法はそれぞれ、条件下で、細胞を本発明の核酸−脂質粒子（通常は本発明の複数の核酸−脂質粒子）と接触させるステップを含み、これにより、ｍＲＮＡが細胞内に導入され、細胞内で発現してタンパク質を生成する。該方法はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。例えば、細胞は生体（例えば人体等の哺乳類の体）内に存在し、核酸−脂質粒子は注射により生体内に導入することができる。
更なる態様では、本発明は、ヒトにおけるタンパク質の発現障害に起因するヒトの病気に関係する１つ以上の症状の治療及び／または改善方法を提供する。本発明の本態様の方法は、治療上有効な量の本発明の核酸−脂質粒子（通常は本発明の複数の核酸−脂質粒子）をヒトに投与するステップを含み、核酸−脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡはタンパク質をコードする。コードされたタンパク質は人体内で発現され、それにより少なくとも１つの病気の症状を改善する。
一実施形態では、本発明の実践に用いる脂質粒子内での、脂質の薬剤に対する比は約１３：１である。
更なる態様において、本発明は構造式Ｃ
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ１
（式Ｃ）
を有する化合物またはその塩を提供し：式中：
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ２であり、
Ａは不在であるかＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及びＣ２−Ｃ６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−からなる群から選択され、
Ｚ１は３つまたは４つのＲｘ基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、式中、各ＲｘはＣ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基にて任意的に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各ＲｂはＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載される新規のカチオン性脂質、並びにカチオン性脂質を調製するのに有用な、本明細書に記載される合成中間体及び合成プロセスを提供する。
本発明の方法及び組成物は例えば、少なくとも部分的に、細胞、組織、及び／もしくは人体臓器における、ポリペプチドの欠如、もしくはポリペプチド量の低下、またはポリペプチドの非機能性（もしくは部分的に機能性、もしくは異常機能性）形態の発現に起因する任意の病気を治療するために使用することができる。
本発明の他の目的、特長及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、当業者に明らかとなるであろう。
脂質粒子の内部に封入されたｍＲＮＡを含む、本発明の核酸−脂質粒子の集まりのｃｒｙｏ ＴＥＭ画像を示す。粒子はそれぞれ、高電子密度の核を有する。 １つ以上の実施形態に従った粒子の断面図を示す。
本明細書に記載される核酸−脂質粒子、方法、及び薬物製剤は、ヒト等の哺乳類生命体におけるタンパク質の発現のための、著しく新規な組成物及び方法を提供する。本発明の実施形態は例えば、日に１回、週に１回、数週間に１回（例えば２、３、４、５、もしくは６週間に１回）、月に１回、または年に１回投与することができる。脂質粒子内でのｍＲＮＡの封入は、血流でのヌクレアーゼ分解からのｍＲＮＡの保護といった、１つ以上の利点をもたらし、標的組織内にｍＲＮＡを優先的に蓄積することを可能にし、コードされたタンパク質をｍＲＮＡが発現することができる細胞質内に、ｍＲＮＡを入れる手段を提供する。
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は別段定めがない限り、それらに与えられた意味を有する。
「有効量」または「治療上有効な量」の、ｍＲＮＡ等の治療用核酸とは、所望の効果、例えばｍＲＮＡの指令による、タンパク質が発現する生命体における、所望の生物学的効果を引き起こす量のタンパク質の発現を生み出すのに十分な量である。例えば、いくつかの実施形態では、発現したタンパク質は、体内の細胞型で通常発現するタンパク質の活性形態であり、治療上有効な量のｍＲＮＡは、健康な個体の細胞型で通常発現するタンパク質の量の少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）の量の、コードされたタンパク質を生成する量である。ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定するための好適なアッセイとしては、ドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、及び当業者に公知の表現型アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
ｍＲＮＡによる免疫反応が「低下する」、「低下すること」、「減少する」、または「減少すること」とは、所与のｍＲＮＡ（例えば修飾されたｍＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な低下を意味することを目的としている。修飾ｍＲＮＡによる免疫応答の減少量は、非修飾ｍＲＮＡの存在下における免疫応答量と比較して測定してよい。検出可能な低下は、非修飾ｍＲＮＡの存在下で検出した免疫応答よりも、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上低い場合がある。ｍＲＮＡに対する免疫応答の減少は通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、応答細胞によるサイトカイン産生（例えばＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−１２）の減少、またはｍＲＮＡの投与後の、哺乳類対象の血清におけるサイトカイン産生の減少により測定される。
「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列に、または参照配列の特定の領域にわたり特定のパーセント同一性を有する配列に対してハイブリダイズする配列を意味する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、核酸が、通常は核酸の複合体混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他のどの配列にもハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況では別のものとなる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての大規模な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ” （１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対して、熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）下における）温度である（標的配列が過剰に存在すれば、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占められている）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することによっても達成され得る。選択的、または特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは少なくとも２倍のバックグラウンド、好ましくは１０倍のバックグラウンドハイブリダイゼーションである。
代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようにすることができる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーションし、０．２倍ＳＳＣで洗浄し、０．１％ＳＤＳで６５℃にてインキュベーション。ＰＣＲには、約３６℃の温度が低ストリンジェンシー増幅に一般的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さに応じ、約３２℃〜約４８℃で変化してよい。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅には、約６２℃の温度が一般的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度はプライマーの長さ及び特異性に応じて、約５０℃〜約６５℃で変化することができる。高及び低ストリンジェンー増幅のための一般的なサイクル条件としては、３０秒〜２分の、９０℃〜９５℃での変性段階、３０秒〜２分にわたるアニーリング段階、及び１〜２分間の、約７２℃での伸長段階が挙げられる。低及び高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコール及びガイドラインは、例えばＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）で提供されている。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合に、依然として実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号により許可された最大のコドンの縮退を用いて、核酸のコピーが作製される際に生じる。かかる場合、核酸は通常、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にてハイブリダイズする。代表的な「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中での３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１倍のＳＳＣによる、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくとも２倍のバックグラウンドである。当業者は容易に、代わりのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して、類似のストリンジェンシーを有する条件を提供することができることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを測定するための更なるガイドラインは、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓといった多数の参考文献に提供される。
２つ以上の核酸の文脈における「実質的に同一な」または「実質的同一性」という用語は、比較窓での最大対応と比較、及び最大対応と並べた場合の、同一であるか、または同一である特定の割合（即ち、特定の領域に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性）のヌクレオチドを有する２つ以上の配列もしくは部分配列、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、もしくは手作業での配列及び目視により測定した指定領域を意味する。文脈が示す場合、本定義はまた、配列の補体に類似であることも意味する。好ましくは、実質的同一性は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチド長である領域にわたり存在する。
配列比較に関して、通常は１つの配列が、試験配列が比較される参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピュータに入れ、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いることができるか、または代わりのパラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書で使用する場合、「比較窓」は約５〜約６０、一般的には約１０〜約４５、更に一般的には約１５〜約３０からなる群から選択される、任意の多数の連続位置のセグメントへの言及を含み、配列は、２つの配列が最適に並べられた後の、同一数の連続位置の参照配列と比較されてよい。比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野において既知である。比較のための配列の最適アラインメントは例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化による実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＡＬＤＨＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＡＬＤＨＡＳＴＡ）により、または手作業でのアライメント及び目視検査（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５年増補）を参照）により、実施することができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を測定するのに好適なアルゴリズムの非限定例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２ （１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０ （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載されるパラメータと共に、本発明の核酸に対するパーセント配列同一性を測定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して一般に入手可能である。別の例は、タンパク質またはヌクレオチド（例えばＲＮＡ）配列を並べるためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム等の、パーセント配列同一性を測定するためのグローバルアラインメントアルゴリズムである。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１指標は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間での一致が偶然生じる確率を示す。例えば核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、かつ最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似していると考えられる。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本または二本鎖形態の、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、凝縮前のＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（例えばＰ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、合成、天然、及び非天然でありかつ参照核酸と類似した結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体または修飾された主鎖残基または連結を含有する、核酸が含まれる。かかる類似体の例としてはホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた、明示された配列だけではなく保存的に修飾されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を産生させることによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８（１９８５）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して一緒に連結している。「塩基」にはプリン及びピリミジンが含まれ、これらは更に、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、並びに、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びハロゲン化アルキル等に限定されない新規の反応性基を配置する修飾が挙げられるが、これらに限定されないプリン及びピリミジンの合成誘導体を含む。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの生成に必要な、部分長または完全長のコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を意味する。
本明細書で使用する場合、「遺伝子産物」は、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子産物を指す。
「脂質」という用語は非限定的に脂肪酸エステルを含み、水に不溶性であるが多数の有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。これらは通常、以下の少なくとも三つのクラスに分類される：（１）脂肪、油及びロウが含まれる「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質が含まれる「複合脂質」、並びに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
「脂質粒子」という用語は、治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）を対象の標的部位（例えば細胞、組織、臓器等）に送達するために使用可能な脂質製剤を含む。好ましい実施態様において、本発明の脂質粒子は核酸−脂質粒子であり、通常カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、粒子の凝集を防ぐ複合脂質（例えばＰＥＧ脂質）、及び所望により、コレステロールから形成される。通常、治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）は粒子の脂質部分に封入することで、酵素分解から保護することができる。
「高電子密度の核」という用語は、本発明の脂質粒子を示すために使用する場合、ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡（「ｃｒｙｏＴＥＭ」）を使用して可視化した場合の、脂質粒子内部の暗い様子を意味する。高電子密度の核を有する本発明の脂質粒子の例を、図１に示す。本発明の脂質粒子には、高電子密度の核及び脂質二層構造を有するものもある。本発明の脂質粒子には、高電子密度の核を有し、脂質二層構造を欠き、かつ逆六角形または逆立方相構造を有するものもある。理論に束縛されるものではないが、非二層の脂質の充填が、中に水と核酸を含む脂質シリンダーの３次元ネットワーク、すなわち実質的に、核酸を含有する水性チャネルが染み込んだ脂肪滴をもたらすと考えられている。
本明細書で使用する場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は安定した核酸−脂質粒子を意味する。ＳＮＡＬＰは脂質（例えばカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ複合脂質）から作製される粒子であり、核酸（例えばｍＲＮＡ）は脂質内に完全に封入されている。特定の場合において、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔離された部位）に蓄積することができ、かつこれらの遠位部位でのｍＲＮＡの発現を仲介できるため、ＳＮＡＬＰは全身投与に大変有用である。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／０３６８３（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に説明されているように、核酸は縮合剤と複合体を形成し、ＳＮＡＬＰ内に封入してよい。
本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、典型的には約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。加えて核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子及びそれらの調製方法は例えば、米国特許公報番号２００４０１４２０２５及び２００７００４２０３１（あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
本明細書で使用する場合、「封入脂質」とは、例えばｍＲＮＡが完全に封入された、部分的に封入された、またはこれら両方の治療用核酸を提供する脂質粒子を意味することができる。好ましい実施形態では、核酸（例えばｍＲＮＡ）は、（例えば、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸−脂質粒子を形成するために）脂質粒子に完全に封入される。
「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。そのような脂質コンジュゲートとしては、例えばジアルキルオキシプロピルとカップリングしたＰＥＧ（例えばＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールとカップリングしたＰＥＧ（例えばＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールとカップリングしたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンとカップリングしたＰＥＧ、及びセラミドと結合したＰＥＧ（例えば米国特許番号５，８８５，６１３を参照）などのＰＥＧ−脂質コンジュゲート、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質コンジュゲート、ポリアミドオリゴマー（例えばＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート）、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＯＺ−脂質コンジュゲートの更なる例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２０１０／００６２８２に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接結合させても、またはリンカー部位を介して脂質に連結させてもよい。例えばエステル非含有リンカー部位及びエステル含有リンカー部位を含有する、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー部位を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部位が使用される。上記特許文書のそれぞれの開示は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「両親媒性脂質」という用語は、部分的に、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に配向し、一方で親水性部分が水相に配向する、任意の適切な物質を指す。親水性の特徴は、炭水化物、リン酸、カルボキシル、スルフェート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル及び他の同等の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに一つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環式基により置換されたかかる基を非限定的に含む、無極性基の包含により付与することができる。両親媒性化合物の例には、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。
リン脂質の代表例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチド酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ−アシルオキシ酸などのリンを欠く他の化合物もまた、両親媒性脂質として指定された群の中に含まれる。更に両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含む他の脂質と混合することができる。
「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電形態または中性双性イオン形態のいずれかで存在する、任意の多数の脂質種を指す。生理的ｐＨで、そのような脂質としては例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。
「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、及び他の中性脂質またはアニオン性脂質を意味する。
「アニオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで負電荷を有する任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール類、カルジオリピン類、ジアシルホスファチジルセリン類、ジアシルホスファチジン酸類、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン類、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン類、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン類、リシルホスファチジルグリセロール類、パルミトイルオレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ）ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
「疎水性脂質」という用語は非限定的に、飽和及び不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基を含む無極性基を有する化合物を指し、そのような基は、一つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環式基により置換されていてもよい。好適な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
「カチオン性脂質」及び「アミノ脂質」という用語は、１、２、３本、またはそれ以上の脂肪酸鎖または脂肪族アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノ頭基（例えばアルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭基）を有する脂質及びその塩を含み、本明細書において互換的に使用される。カチオン性脂質は、典型的にはカチオン性脂質のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち陽性荷電し）、ｐＫａよりも高いｐＨで実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質と称される場合もある。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はプロトン化可能な３級アミン（例えばｐＨ滴定可能な）頭基；Ｃ１８アルキル鎖（各アルキル鎖は独立して０〜３（例えば０、１、２または３）個の二重結合を有する）、及び、頭基とアルキル鎖との間にエーテル、エステル、またはケタールを含む。かかるカチオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られている）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られている）、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られている）並びに（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ）（１−Ｂ１１としても知られている）が挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキルアミノ」という用語は、式−Ｎ（Ｈ）Ｒの基を含み、式中Ｒは本明細書で定義されるアルキルである。
「ジアルキルアミノ」という用語は、式−ＮＲ２の基を含み、式中、各Ｒは独立して、本明細書で定義されるアルキルである。
「塩」という用語は、カチオン性脂質と１種以上の陰イオンとの間で形成した複合体などの、任意の陰カチオン性複合体が含まれる。陰イオンの非限定的な例には、無機及び有機の陰イオン、例えば、ヒドリドイオン、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、シュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸（ｈｅｍｉｏｘａｌａｔｅ））イオン、リン酸イオン、ホスホン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、酸化物イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、窒化物イオン、亜硫酸水素イオン、硫化物イオン、亜硫酸イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、チオ硫酸イオン、硫酸水素イオン、ホウ酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、安息香酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、乳酸イオン、アクリル酸イオン、ポリアクリル酸イオン、フマル酸イオン、マレイン酸イオン、イタコン酸イオン、グリコール酸イオン、グルコン酸イオン、リンゴ酸イオン、マンデル酸イオン、チグリン酸イオン、アスコルビン酸イオン、サリチル酸イオン、ポリメタクリル酸イオン、過塩素酸イオン、塩素酸イオン、亜塩素酸イオン、次亜塩素酸イオン、臭素酸イオン、次亜臭素酸イオン、ヨウ素酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオン、ヒ酸イオン、亜ヒ酸イオン、クロム酸イオン、二クロム酸イオン、シアン化物イオン、シアン酸イオン、チオシアン酸イオン、水酸化物イオン、過酸化物イオン、過マンガン酸イオン、及びそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態において、本明細書において開示されたカチオン性脂質の塩は、結晶塩である。
「アルキル」という用語には、１〜２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐の非環状または環状飽和脂肪族炭化水素が含まれる。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、非限定的にメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が挙げられ、一方で飽和分岐アルキルとしては、非限定的にイソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとしては、非限定的にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられ、一方で、不飽和環状アルキルとしては、非限定的にシクロペンテニル、シクロヘキセニル等が挙げられる。
「アルケニル」という用語には、隣り合う炭素原子間に二重結合を少なくとも１個含有する上記のアルキルが含まれる。アルケニルには、シス及びトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖及び分岐アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキニル」という用語には、隣り合う炭素原子間に三重結合を更に少なくとも１個含有する、上記の任意のアルキルまたはアルケニルが含まれる。代表的な直鎖及び分岐アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等が含まれるが、これらに限定されない。
「アシル」という用語には、結合点の炭素が以下で定義するオキソ基で置換された任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルが含まれる。以下が、アシル基の非限定例である：−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び−Ｃ（＝Ｏ）アルキニル。
「複素環」という用語としては、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５〜７員環の単環式、または７〜１０員環の二環式複素環が挙げられ、窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されてもよく、かつ窒素へテロ原子は任意に四級化されてもよく、任意の上記複素環がベンゼン環に縮合した二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合することができる。複素環としては、以下で定義するヘテロアリール、並びにモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられる。
「任意に置換されたアルキル」、「任意に置換された環状アルキル」、「任意に置換されたアルケニル」、「任意に置換されたアルキニル」、「任意に置換されたアシル」、及び「任意に置換された複素環」という用語は、置換されると少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。これに関し、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられるが、これらに限定されず、式中、ｎは０、１、または２であり、Ｒｘ及びＲｙは同一であるかまたは異なり、かつ独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつ、アルキル及び複素環置換基はそれぞれ、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙの１つ以上で更に置換されてよい。「任意に置換された」という用語は、置換基の一覧の前で使用する場合、一覧の置換基のそれぞれが、本明細書に記載されるように任意に置換されてよいことを意味する。
「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。
「膜融合性」という用語は、ＳＮＡＬＰなどの脂質粒子が細胞の膜と融合する能力を意味する。膜は、原形質膜またはオルガネラ、例えばエンドソーム、核等を囲む膜のいずれかでありうる。
本明細書で使用する場合、「水溶液」という用語は、水を全体的または部分的に含む組成物を意味する。
本明細書で使用する場合、「有機脂質溶液」という用語は、脂質を有する有機溶媒を全体的または部分的に含む組成物を指す。
本明細書で使用される「遠位の部位」とは、隣接する毛細血管床に限定されない、生命体全体に広く分布する部位を含む、物理的に隔離された部位を指す。
ＳＮＡＬＰなどの核酸−脂質粒子に関係する「血清安定性」とは、遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解しうる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が著しく分解されないことを意味する。好適なアッセイとしては、例えば、標準的な血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「全身送達」とは、生命体内でのｍＲＮＡなどの活性剤の広範な生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を意味する。ある特定の作用物質の全身送達をもたらすことができる投与技術もあれば、もたらさない投与技術もある。全身送達は、有用な、好ましくは治療量の作用物質が身体の大部分に曝露されることを意味する。広い生体内分布を得るために、作用物質は一般に、投与部位から遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺等）または迅速な非特異的細胞結合などにより）、迅速な分解及びクリアランスを受けないような血中寿命を必要とする。脂質粒子の全身送達は、例えば静脈内、皮下、及び腹腔内を含めた、当技術分野で公知の任意の手段により行うことができる。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達による。
本明細書で使用する場合、「局所送達」は、ｍＲＮＡ等の活性剤を、生命体内の標的部位に直接送達することを指す。例えば作用物質は、病気の部位、他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の標的臓器への直接注射により局所的に送達することができる。
「哺乳類」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等などの任意の哺乳類種を指す。
脂質：ｍＲＮＡの比を記述するのに本明細書で使用する場合、「脂質」という用語は、粒子内の総脂質を意味する。
本明細書で別の記述がない限り、用語「約」は、値または値の範囲と共に用いられる場合、示した値または値の範囲の±５％を意味する。
実施例の記載
一態様では、本発明は、それぞれ（ａ）カチオン性脂質を含む脂質粒子、及び（ｂ）脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡ分子を含む核酸−脂質粒子を提供する。通常、ｍＲＮＡ分子の集団が脂質粒子内に封入されている。脂質粒子は通常、内部を規定する外層を含み、ｍＲＮＡ分子は該内部内に位置している。ｍＲＮＡ分子は通常、脂質粒子内に完全に封入されている。脂質粒子は球状であるか、または非球状であることができる。脂質粒子はｃｒｙｏＴＥＭを用いて可視化した場合に、高電子密度の核を有することができる。通常、高電子密度の核は主に脂質で構成されるが、水性物質が脂質の量未満の量で存在してよい。
一態様では、本発明は、ＰＥＧ脂質、非カチオン性脂質、トリアルキルカチオン性脂質及びテトラアルキルカチオン性脂質から選択されるカチオン性脂質、並びにｍＲＮＡを含む脂質粒子を提供し、脂質粒子は高電子密度の核を有し、ｍＲＮＡは高電子密度の核内に封入されている。
図２は、ｍＲＮＡ分子１２０をその中に有する高電子密度の核１１２を封入する脂質外層１１０を有する粒子１００を示す。粒子は哺乳類に送達され、ｍＲＮＡ分子を哺乳類の生細胞へと送達するために用いられる。
本発明のいくつかの実施形態では、脂質粒子は（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及びリン脂質を含む脂質粒子、並びに（ｂ）ｍＲＮＡ分子を含む。ｍＲＮＡ分子は脂質粒子内に封入されている。脂質粒子は所望により、コレステロールを含むことができる。ｍＲＮＡは脂質粒子内に完全に、または部分的に封入されることができる。
粒子１００の形成は、１つ以上の実施形態において、エタノール等の第１の流体内に脂質を配置すること、水性緩衝液等の第２の流体内にｍＲＮＡを配置すること、及び、前記第１及び第２の流体を制御された条件下で混合し粒子１００を形成することを含む。得られた粒子１００は、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡で見た場合に、脂質粒子内に高電子密度の核を含む。
ｍＲＮＡ
本発明の実践に有用なｍＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の、２’ＯＭｅヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを含んでよい。好ましくは、ｍＲＮＡ内のウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドが２’ＯＭｅヌクレオチドで修飾される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは更に、修飾（例えば２’ＯＭｅ修飾）アデノシン及び／または修飾（例えば２’ＯＭｅ修飾）シトシンヌクレオチドを含んでよい。
一態様では、本発明は、ｍＲＮＡを含む核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は通常、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ、カチオン性脂質、及び非カチオン性脂質を含む。特定の場合には、核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は更に、粒子の凝集を抑制する複合脂質を含む。好ましくは、核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質を含む。
いくつかの実施形態ではｍＲＮＡは核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）内に完全に封入される。ｍＲＮＡカクテルを含む製剤に関して、カクテル中に存在する異なる種類のｍＲＮＡ種（例えば、異なる配列を有するｍＲＮＡ）を同一の粒子内に共に封入してもよいし、または、カクテル中に存在する各種類のｍＲＮＡ種を別々の粒子内に封入してもよい。ｍＲＮＡカクテルは、同一、類似、または異なる濃度またはモル比で、（それぞれ特有の配列を有する）２つ以上の個々のｍＲＮＡの混合物を用いて、本明細書に記載される粒子内で配合してよい。一実施形態では、（異なる配列を有する複数のｍＲＮＡに対応する）ｍＲＮＡのカクテルは、同一、類似、または異なる濃度またはモル比の各ｍＲＮＡ種を用いて配合され、かつ、異なる種類のｍＲＮＡは同一粒子内に共に封入される。別の実施形態において、カクテル中に存在する各種類のｍＲＮＡは同一、類似、または異なるｍＲＮＡ濃度またはモル比で、異なる粒子内に封入されることにより、粒子が形成され（それぞれ、異なるｍＲＮＡのペイロードを含有する）、別々に（例えば、治療レジメンに従い異なる時間で）投与されるか、または組み合わせて単一の単位用量で（例えば製薬上許容できる担体と共に）投与される。本明細書に記載される粒子は血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解耐性があり、かつヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒である。
本発明の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）中のカチオン性脂質は、例えば本明細書に記載される式Ｉ−ＩＩＩの１種以上のカチオン性脂質、または任意の他のカチオン性脂質種を含んでよい。１つの特定の実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２、２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
本発明の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）内の非カチオン性脂質は、例えば１つ以上のアニオン性脂質及び／または中性脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は以下の中性脂質成分の１つを含む：（１）リン脂質及びコレステロールの混合物もしくはこれらの誘導体、（２）コレステロールもしくはその誘導体、または（３）リン脂質。ある特定の好ましい実施形態では、リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。特に好ましい実施形態において非カチオン性脂質はＤＰＰＣとコレステロールの混合物である。
本発明の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）内の脂質コンジュゲートは粒子の凝集を抑制し、かつ、例えば本明細書に記載される１つ以上の脂質コンジュゲートを含んでよい。１つの特定の実施形態において、脂質コンジュゲートはＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。ＰＥＧ−脂質コンジュゲートの例としては、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、脂質粒子内のＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲート、またはこれらの混合物を含んでよい。別の実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＯＺ−ＤＡＡコンジュゲート等のＰＯＺ−脂質コンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％を占める１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を抑制する１つ以上の複合脂質を含む核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。
本実施形態の一態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５２ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約３６ｍｏｌ％〜約４７ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールの混合物、またはその誘導体、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子の本実施形態は通常、本明細書において「１：５７」製剤と称する。１つの特定の実施形態では、１：５７製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約５７．１ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えばＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、及び約３４．３ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む４成分系である。
本実施形態の別の態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５６．５ｍｏｌ％〜約６６．５ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％〜約４２．５ｍｏｌ％を占める、コレステロールまたはその誘導体、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子の本実施形態は通常、本明細書において「１：６２」製剤と称する。１つの特定の実施形態では、１：６２製剤は、リン脂質を含まず、約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約６１．５ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えばＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、及び約３６．９ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む３成分系である。
１：５７及び１：６２製剤に関する更なる実施形態は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／１２７０６０、及び公開済み米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／００７１２０８Ａ１に記載されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、本発明は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を占める１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を抑制する１つ以上の複合脂質を含む核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。
本実施形態の位置態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約４７ｍｏｌ％〜約６９ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールの混合物、またはその誘導体、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子の本実施形態は通常、本明細書において「２：４０」製剤と称する。１つの特定の実施形態では、２：４０製剤は、約２ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、約４０ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えばＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約１０ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、及び約４８ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む４成分系である。
更なる実施形態では、本発明は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を占める１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を抑制する１つ以上の複合脂質を含む核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。
本実施形態の一態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールの混合物、またはその誘導体、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子の本実施形態は通常、本明細書において「７：５４」製剤と称する。ある特定の場合において、７：５４製剤中の非カチオン性脂質は、（ｉ）粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のリン脂質、及び（ｉｉ）粒子内に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む。１つの特定の実施形態では、７：５４製剤は、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５４ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えばＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、約７ｍｏｌ％のＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）、及び約３２ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む４成分系である。
本実施形態の別の態様において、核酸−脂質粒子は、（ａ）それぞれタンパク質をコードする、１つ以上の（例えばカクテル）ｍＲＮＡ分子、（ｂ）粒子内に存在する総脂質の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩、（ｃ）粒子内に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める、コレステロールまたはその誘導体、及び（ｄ）粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子の本実施形態は通常、本明細書において「７：５８」製剤と称する。１つの特定の実施形態では、７：５８製剤は、リン脂質を含まず、約７ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）、約５８ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えばＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩、及び約３５ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む３成分系である。
７：５４及び７：５８製剤に関する更なる実施形態は、公開済み米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／００７６３３５Ａ１に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明はまた、ＳＮＡＬＰ等の核酸−脂質粒子及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、１つ以上のタンパク質（完全長タンパク質、または完全長タンパク質の生物学的に活性な断片）を発現するｍＲＮＡの治療用送達に対して有用である。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質を発現するｍＲＮＡのカクテルは、同一のまたは異なる核酸−脂質粒子内に配合され、粒子は、かかる治療を必要とする哺乳類（例えばヒト）に投与される。特定の場合において、治療上有効な量の核酸−脂質粒子は哺乳類に投与することができる。
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ製剤）と細胞を接触させることにより、１つ以上のｍＲＮＡ分子を細胞内に導入する方法を提供する。１つの特定の実施形態では、細胞は細網内皮細胞（例えば単核細胞もしくはマクロファージ）、線維芽細胞、内皮細胞、または血小板細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、以下の投与経路の１つにより投与される：経口、経鼻、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、及び皮内。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば経腸または非経口の投与経路を介して、全身投与される。
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、ｍＲＮＡ等のペイロードを、他の組織と比較して肝臓に選択的に送達することができる。
ある特定の態様では、本発明はそれを必要とする哺乳類（例えばヒト）でタンパク質を発現させる方法であって、哺乳類でタンパク質を発現可能な条件下で、１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む、治療上有効な量の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ製剤）を哺乳類に投与する方法を提供する。例えば、通常健康な哺乳類対象で発現するタンパク質をｍＲＮＡがコードする実施形態において、ＳＮＡＬＰ内に封入されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現量は、健康な哺乳類対象で通常発現するタンパク質の量の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または１００％超である。
他の態様では本発明は、病気に関係する１つ以上の症状の治療すること、予防すること、進展のリスクまたは可能性を低下させること（例えば、罹患率を減少させる）、開始を遅らせること、及び／または緩和することを、それを必要とする、哺乳類（例えばヒト）において行う方法を提供し、病気は（少なくとも部分的には）タンパク質の発現低下または異常発現に起因する。該方法はそれぞれ、治療される対象に欠如する、または低量で存在するタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を含む、治療上有効な量の核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ製剤）を哺乳類に投与するステップを含む。
本発明において有用なｍＲＮＡ分子は、化学修飾されていても非修飾であってもよい。通常ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡが導入される細胞の先天性免疫応答の誘発能力を低下させるために、化学修飾されている。
ｍＲＮＡの修飾
本発明の実践に用いられるｍＲＮＡは１つ、２つ、または３つ以上のヌクレオシド修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、対応する非修飾ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入される細胞の分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、及び４−メトキシ−２チオ−プソイドウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチルシチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチルシチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンが挙げられる。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンが挙げられる。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは５’−０−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−０−（１−チオホスフェート）−シチジン、５’−０−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−０−（１−チオホスフェート）−ウリジン、または５’−０−（１−チオホスフェート）−プソイドウリジンである。αチオ置換されたホスフェート部位は、非天然のチオリン酸塩骨格の連結を介して、ＲＮＡポリマーに対する安定性を付与するために提供される。ホスホロチオネートＲＮＡは増加したヌクレアーゼ耐性、及び結果的に、細胞環境における一層長い半減期を有する。ホスホロチオネート結合した核酸は、細胞の先天性免疫分子の弱まった結合／活性化により、先天性免疫応答も低下させると予想されている。
ある特定の実施形態において、例えば、タンパク質産生の正確な時間調節が望ましい場合に、細胞内に導入された修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。したがって、本発明は、分解ドメインを含有する修飾核酸を提供し、これは細胞内で直接的に影響を及ぼされることができる。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチルグアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンが挙げられる。
修飾核酸の任意成分
更なる実施形態では、修飾核酸は他の任意成分を含んでもよく、これは、いくつかの実施形態において有用であることができる。これらの任意成分としては、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ及びポリＡ尾部が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲが提供されてよく、一方または両方は独立して、１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含んでよい。かかる実施形態では、ヌクレオシド修飾は翻訳可能領域に存在してもよい。コザック配列を含有する核酸もまた提供する。
更に、核酸から切除されることが可能な１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有する核酸も提供する。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンに続いて直ちに開始し、転写終結シグナルまで続く。核酸分子及び転写の安定性の観点においてＵＴＲが果たす制御の役割について、証拠の数が増加している。ＵＴＲの制御機能を本発明で使用するｍＲＮＡ中へ組み込み、分子の安定性を増加することができる。好ましくない臓器部位に向けられる場合、特定の機能も導入することにより、転写の下方制御を確実に行うことができる。
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は核輸送、ｍＲＮＡ安定性の増加に関与し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰがポリ（Ａ）結合タンパク質と会合し成熟環状ｍＲＮＡ種を形成することによって、細胞及び転写能のｍＲＮＡ安定性の原因となる。キャップは更に、ｍＲＮＡスプライシングの最中に５’に近接するイントロンの削除を補助する。
内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端がキャップされ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェートを作製してよい。この５’−グアニル酸キャップを次に、メチル化してＮ７−メチル−グアニル酸残基を作製してよい。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意に２’−０メチル化されてよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び開裂による５’−デキャッピングは、分解のためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的にしてよい。
ＩＲＥＳ配列
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するｍＲＮＡもまた、本発明の実践に有用である。ＩＲＥＳは単独のリボソーム結合部位として機能してよいか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能してよい。２つ以上のリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡは、リボソームにより独立して翻訳されたいくつかのペプチドまたはポリペプチド（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）をコードしてよい。ｍＲＮＡがＩＲＥＳと共に提供される場合、第２の翻訳可能領域が更に所望により提供される。本発明に従って使用可能なＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からのものが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリＡ尾部
ＲＮＡプロセシングの間、安定性を増加させるために、ｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡ尾部）を添加してよい。転写の直後に、転写の３’末端を切断して、３’ヒドロキシルを遊離してよい。次いで、ポリＡポリメラーゼが、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに加える。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００〜２５０残基長であることができるポリＡ尾部を加える。
一般に、ポリＡ尾部の長さは３０ヌクレオチド長以上である。別の実施形態において、ポリＡ尾部は３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドであるか、これらより長い）。
本文脈中、ポリＡ尾部は修飾ｍＲＮＡよりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％大きくてよい。ポリＡ尾部はまた、それが属する修飾核酸の一部分として設計されてもよい。本文脈中、ポリＡ尾部は、修飾ｍＲＮＡの全長、または修飾ｍＲＮＡからポリＡ尾部を差し引いた全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれ以上であってよい。
ｍＲＮＡ分子の作製
ＲＮＡの単離方法、ＲＮＡの合成方法、核酸のハイブリダイゼーション方法、ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング方法、並びにＰＣＲの実施方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９））；ａｓ ａｒｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ（ｓｅｅ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，６８３，１９５ ａｎｄ ４，６８３，２０２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照のこと）。発現ライブラリーもまた、当業者に公知である。本発明における一般的な使用方法を開示している更なる基本的なテキストとしては、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４が挙げられる。これらの参照の開示は本明細書において、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
脂質粒子
ある特定の態様では、本発明は脂質粒子内に封入された１つ以上の治療用ｍＲＮＡ分子を含む脂質粒子を提供する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質粒子内のｍＲＮＡが、水溶液中で耐ヌクレアーゼ分解性であるように脂質粒子の脂質部分内に完全に封入されている。他の実施形態では、本明細書に記載される脂質粒子は、ヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒である。本発明の脂質粒子は典型的には、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有する。本発明の脂質粒子はまた、典型的には、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約１０：１、約１０：１〜約１４：１、または約９：１〜約２０：１の脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）を有する。一実施形態では、本発明の脂質粒子は約１２：１、例えば１２：１の脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）を有する。別の実施形態において、本発明の脂質粒子は約１３：１、例えば１３：１の脂質：ｍＲＮＡ比（質量／質量比）を有する。
好ましい実施態様において、本発明の脂質粒子はｍＲＮＡ、カチオン性脂質（例えば、本明細書において説明する式ＩＩ〜ＩＩＩの１種以上の脂質またはそれらの塩）、リン脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質（例えば１種以上のＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む血清安定性核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。脂質粒子はまた、コレステロールを含んでもよい。ＳＮＡＬＰは、１つ以上のポリペプチドを発現する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の非修飾及び／または修飾ｍＲＮＡを含んでもよい。核酸−脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば米国特許番号５，７５３，６１３；５，７８５，９９２；５，７０５，３８５；５，９７６，５６７；５，９８１，５０１；６，１１０，７４５、及びＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９６／４０９６４に開示されており、これらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のためにそれら全体が本明細書に参照により組み込まれる。
本発明の核酸−脂質粒子において、ｍＲＮＡは粒子の脂質部分内に完全に封入されてよく、これにより核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。好ましい実施態様において、ｍＲＮＡを含むＳＮＡＬＰは粒子の脂肪部分内に完全に封入されており、これにより核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の場合において、粒子を３７℃で、少なくとも２０、３０、４５、または６０分間ヌクレアーゼに曝露した後、ＳＮＡＬＰ内のｍＲＮＡは実質的に分解されない。特定の他の例において、粒子を血清中で、少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間、３７℃でインキュベーションした後、ＳＮＡＬＰ内のｍＲＮＡは実質的に分解されない。他の実施形態では、ｍＲＮＡは粒子の脂質部分と複合体を形成する。本発明の製剤の利点の１つは、核酸−脂質粒子組成物が、ヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒であることである。
「完全に封入されている」という用語は、遊離ＲＮＡを著しく分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝露した後、核酸−脂質粒子内の核酸（ｍＲＮＡ）が著しく分解されないことを示す。完全に封入された系において、通常は遊離核酸の１００％を分解する処理において、粒子内の核酸の好ましくは２５％未満が分解され、より好ましくは粒子内の核酸の１０％未満、及び最も好ましくは５％未満が分解される。「完全に封入された」とはまた、核酸−脂質粒子が血清安定性である、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の際に、粒子がその構成成分に急速に分解しないことも示す。
核酸の文脈において、膜不透過性蛍光染料排除アッセイを実施することにより、完全封入を測定してよく、このアッセイは、核酸と結合した際に蛍光増感させる染料を用いる。ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が、プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、及び／または一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチドの定量のために利用可能である。封入は、染料をリポソーム製剤に添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加の際に観察された蛍光と比較することにより測定される。界面活性剤が仲立ちするリポソーム二重層の破壊により封入された核酸が放出され、核酸を膜不透過性染料と接触させる。核酸封入はＥ＝（Ｉｏ−Ｉ）／Ｉｏとして計算されてよく、式中、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤の添加前後の蛍光強度を意味する（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：２７１−２８１（１９９９）を参照）。
他の実施形態では、本発明は、複数個の核酸−脂質粒子を含む核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）組成物を提供する。
場合によっては、ＳＮＡＬＰ組成物は約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、もしくは少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（または任意のそれらの部分もしくはそれらの中の範囲）の粒子が、その中に封入されたｍＲＮＡを有するように、粒子の脂質部分内に完全に封入されたｍＲＮＡを含む。
本発明の脂質粒子の使用目的に応じて、成分割合は変更することができ、かつ特定の製剤の送達効果は例えばエンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて測定することができる。
カチオン性脂質
種々のカチオン性脂質またはそれらの塩をいずれも、単独で、または１種以上の他のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）に使用してよい。カチオン性脂質には、その（Ｒ）及び／または（Ｓ）光学異性体が含まれる。通常、カチオン性脂質は、不飽和及び／または飽和炭化水素鎖を含む部分（即ち、疎水部分）を含有する。
一態様において、以下の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質
またはその塩が、本発明において有用である：
式中：
Ｒ１及びＲ２は同一であるか、または異なるかのいずれかであり、独立して水素（Ｈ）、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、もしくはＣ２−Ｃ６アルキニルであるか、または、Ｒ１及びＲ２は結合して、任意に置換された４〜６個の炭素原子、並びに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びこれらの混合物からなる群から選択される１もしくは２個のヘテロ原子、並びにこれらの混合物の複素環を形成してよく、
Ｒ３は不在であるか、または水素（Ｈ）もしくは四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、
Ｒ４及びＲ５は同一であるか、または異なるかのいずれかであり、かつ独立して、任意に置換されたＣ１０−Ｃ２４アルキル、Ｃ１０−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１０−Ｃ２４アルキニル、またはＣ１０−Ｃ２４アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つは、少なくとも１つの不飽和部位を含み、かつ
ｎは０、１、２、３、または４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、またはＣ２−Ｃ４アルキニルである。一つの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にメチル基である。別の好ましい実施形態において、ｎは１または２である。他の実施形態では、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ以上である場合、Ｒ３は不存在であり、かつ、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ未満である場合、Ｒ３は水素であり、アミノ頭基がプロトン化される。これに代わる実施態様において、Ｒ３は任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、四級アミンをもたらす。更なる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は独立して任意に置換されたＣ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルキル、Ｃ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルケニル、 Ｃ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルキニル、またはＣ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つは少なくとも２つの不飽和部位を含む。
ある特定の実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、ドデカジエニル部位、テトラデカジエニル部位、ヘキサデカジエニル部位、オクタデカジエニル部位、イコサジエニル部位、ドデカトリエニル部位、テトラデカトリエニル（ｔｅｔｒａｄｅｃｔｒｉｅｎｙｌ）部位、ヘキサデカトリエニル部位、オクタデカトリエニル部位、イコサトリエニル部位、アラキドニル部位、及びドコサヘキサエノイル部位、並びにこれらのアシル誘導体（例えばリノレオイル、リノレノイル、γ−リノレノイル等）からなる群から独立して選択される。場合によっては、Ｒ４及びＲ５の１つは、分岐アルキル基（例えばフィタニル部位）またはそのアシル誘導体（例えばフィタノイル部位）を含む。ある特定の場合には、オクタデカジエニル部位はリノレイル部位である。ある特定の他の例において、オクタデカトリエニル部位はリノレニル部位またはγ−リノレニル部位である。ある特定の実施形態において、Ｒ４及びＲ５は共にリノレイル部位、リノレニル部位、またはγ−リノレニル部位である。特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＡＰ）またはこれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、好ましくは結晶塩である。
ＤＬｉｎＤＭＡ及びＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、並びに更なるカチオン性脂質の合成は米国特許広報番号２００６００８３７８０に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ及びＣ２−ＤＬｉｎＤＡＰ等のカチオン性脂質、並びに更なるカチオン性脂質の合成は国際特許出願番号ＷＯ２０１１／０００１０６に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他の態様においては、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質
が、本発明において有用である：
式中、Ｒ１及びＲ２は同一であるか、または異なるかのいずれかであり、独立して任意に置換されたＣ１２−Ｃ２４アルキル、Ｃ１２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１２−Ｃ２４アルキニル、またはＣ１２−Ｃ２４アシルであり、Ｒ３及びＲ４は同一であるか、もしくは異なるかのいずれかであり、独立して任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、もしくはＣ２−Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３及びＲ４は結合して、４〜６個の炭素原子及び窒素及び酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成してよい；Ｒ５は不在であるか、または水素（Ｈ）もしくは四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、ｍ、ｎ、及びｐは同一であるか、または異なるかのいずれかであり、ｍ、ｎ、及びｐが同時に０でないことを条件として、独立して０、１、または２のいずれかであり、ｑは０、１、２，３、または４であり、かつ、Ｙ及びＺは同一であるか、または異なるかのいずれかであり、独立してＯ、Ｓ、またはＮＨである。好ましい実施形態では、ｑは２である。
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルピペラジノ−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４，５−ビス（ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキソラン、２，２−ジリノレイル−４−メチルピペラジン−［１，３］−ジオキソラン、またはこれらの混合物である。好ましい実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソランである。
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、好ましくは結晶塩である。
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン等のカチオン性脂質、及び更なるカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／０８６５５８（その開示全体はあらゆる目的のために本発明において参照として組み込まれている）、及び「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（改良したアミノ脂質及び核酸の送達方法）」と題されるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１（その開示全体はあらゆる目的のために本発明において参照として組み込まれている）に記載されている。
更なる態様において、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質
またはその塩が本発明において有用である：
式中：Ｒ１及びＲ２は同一であるか、もしくは異なるかのいずれかであり、独立して任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、もしくはＣ２−Ｃ６アルキニルであるか、または、Ｒ１及びＲ２は、４〜６個の炭素原子、並びに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びこれらの混合物からなる群から選択される１もしくは２個のヘテロ原子の、任意に置換された複素環を形成してよく、Ｒ３は不在であるか、または水素（Ｈ）もしくは四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、Ｒ４及びＲ５は不存在であるかまたは存在し、存在する場合、同一であるか、または異なるかのいずれかであり、独立して任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルであり、かつ、ｎは０、１、２、３、または４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、またはＣ２−Ｃ４アルキニルである。好ましい実施形態ではＲ１及びＲ２は共にメチル基である。別の好ましい実施形態では、Ｒ４及びＲ５は共にブチル基である。更に別の好ましい実施形態では、ｎは１である。他の実施形態では、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ以上である場合、Ｒ３は不存在であり、かつ、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ未満である場合、Ｒ３は水素であり、アミノ頭基がプロトン化される。これに代わる実施態様において、Ｒ３は任意に置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、四級アミンをもたらす。更なる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は独立して、任意に置換されたＣ２−Ｃ６もしくはＣ２−Ｃ４アルキル、またはＣ２−Ｃ６もしくはＣ２−Ｃ４アルケニルである。
代替的実施態様において、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、アミノ頭基と、アルキル鎖の一方または両方との間にエステル結合を含む。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上のアニオンと塩（好ましくは結晶塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質はそのシュウ酸（例えばヘミシュウ酸）塩であり、好ましくは結晶塩である。
式ＩＩＩのアルキル鎖はそれぞれ、ｃｉｓ二重結合を６、９，及び１２位に有する（すなわち、ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ−Δ６、Δ９、Δ１２）が、代替的実施形態においては、一方または両方のアルキル鎖におけるこれらの二重結合の１、２、または３つは、ｔｒａｎｓ配置であってもよい。
一実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、以下の構造を有する。
γ−ＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、及び更なるカチオン性脂質の合成は国際特許出願ＷＯ２０１１／０００１０６に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、以下の構造を有するカチオン性脂質が本発明において有用である。
化合物７等のカチオン性脂質、及び更なるカチオン性脂質の合成は、米国特許第８，１５８，６０１号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０００７２３号に記載されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子に含んでよい他のカチオン性脂質またはそれらの塩の例としては、ＷＯ２０１１／０００１０６に記載されているもののようなカチオン性脂質（あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンゼンアミン（ＤＭＯＢＡ）、（１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイル−３−（２Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジオエイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジミリストレオイルｌ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオナート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ；ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡとしても知られている）等のカチオン性脂質並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の脂質粒子に含まれてよい更なるカチオン性脂質またはその塩は、米国特許公開番号２００９００２３６７３に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、トリアルキルカチオン性脂質を使用して、本明細書に記載される脂質粒子を調製することができる。かかるトリアルキルカチオン性脂質は通常、各鎖に６個以上の炭素を有する、３個の飽和または不飽和炭化水素鎖を含む。本明細書に記載される組成物中に組み込み可能なトリアルキルカチオン性脂質は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／１２６８０３に記載されているようにして調製可能である。
例えば、次式Ｂのトリアルキルカチオン性脂質
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ
（式Ｂ）
またはその塩を用いて、本発明の脂質粒子を作製することができる：式中：
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ２であり、
Ａは不在であるかＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及びＣ２−Ｃ６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−からなる群から選択され、
Ｚは３つの鎖を含む疎水性部位であり、鎖のそれぞれはＣ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、及びＣ８−Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、及びＣ８−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基で任意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつ
各ＲｂはＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
いくつかの実施形態では、式ＢのＺは以下の構造を有する：
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、またはＣ８−Ｃ１１アルキニルであり、Ｃ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、及びＣ８−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である。
別の実施形態では、次式Ｃを有するカチオン性脂質
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ１
（式Ｃ）
またはその塩を用いて、本発明の脂質粒子を作製する。
式中、
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ２であり、
Ａは不在であるかＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及びＣ２−Ｃ６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−からなる群から選択され、
Ｚ１は３つまたは４つのＲｘ基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、式中、各ＲｘはＣ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立し素環でて選択される１つ以上の基にて任意的に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつ
各ＲｂはＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
いくつかの実施形態では、式ＣのＺ１は以下の構造を有する：
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、またはＣ８−Ｃ１１アルキニルであり、Ｃ８−Ｃ１１アルキル、Ｃ８−Ｃ１１アルケニル、及びＣ８−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である。
いくつかの実施形態では、式ＣのＺ１は以下の構造を有する：
式中、Ｒ１ｚ及びＲ２ｚの１つは
からなる群から選択され、
Ｒ１ｚ及びＲ２ｚの他方は
からなる群から選択され、
式中、Ｒ３ｚ、Ｒ４ｚ、Ｒ５ｚ、Ｒ６ｚ及びＲ７ｚはそれぞれ、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である。
いくつかの実施形態では、式ＣのＺ１は以下の構造を有する：
式中、Ｒ３ｚ、Ｒ４ｚ、Ｒ５ｚ、及びＲ６ｚはそれぞれ、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６−Ｃ１１アルキル、Ｃ６−Ｃ１１アルケニル、及びＣ６−Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘ及びＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒｘ及びＲｙの任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、及び−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’及びＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は
及びこれらの塩からなる群から選択される。
ＣＬｉｎＤＭＡ等の脂質、及び更なるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開番号２００６０２４０５５４に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、及びＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、並びに更なるカチオン性脂質の合成はＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／０８６５５８に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、及び更なるカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（改良したアミノ脂質、及び核酸の送達方法）」と題されるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１に記載されており、あらゆる目的のため、その開示は全体が本発明において参照により組み込まれる。他の多数のカチオン性脂質及び関連類似体の合成は、米国特許番号５，２０８，０３６；５，２６４，６１８；５，２７９，８３３；５，２８３，１８５；５，７５３，６１３、及び５，７８５，９９２、並びにＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９６／１０３９０に開示されており、これらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のためにそれら全体が本明細書に参照により組み込まれる。更に、カチオン性脂質の多数の商用配合物、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含み、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含み、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、並びにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含み、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能である）等を使用することができる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、もしくは約５５ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％、もしくは６５ｍｏｌ％（またはこれらの任意の部分）を占める。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、もしくは約４０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の部分もしくはこれらの中の範囲）を占める。
本発明の脂質粒子に使用するにおいて好適なカチオン性脂質の更なる割合及び範囲は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２０１１／０００１０６、及び米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子中に存在するカチオン性脂質の割合は目標量であり、製剤内に存在するカチオン性脂質の実際の量は、例えば±５ｍｏｌ％変動し得ると理解されるべきである。例えば、１：５７脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤において、カチオン性脂質の目標量は５７．１ｍｏｌ％であるが、カチオン性脂質の実際の量は、目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、製剤の残りは、他の脂質成分で構成される（粒子内に存在する全脂質の最大１００ｍｏｌ％まで加えられる）。
非限定的例として、カチオン性脂質は以下の化合物を含む：
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−アミン（５）
２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（６）
（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（７）
３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（８）
（Ｚ）−１２−（（Ｚ）−１０−４−エニル）ドコサ−１６−エン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート（５３）
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−１０−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート（１１）
（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−１０−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート（１３）
１２−デシルドコサン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノート（１４）
非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）に用いられる非カチオン性脂質は、安定した複合体を作製可能な種々の中性非荷電、双性イオン、またはアニオン性脂質のいずれかとすることができる。
非カチオン性脂質の非限定例としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチド酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のリン脂質、及びこれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、Ｃ１０−Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えばラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルであることが好ましい。
非カチオン性脂質の更なる例としては、コレステロール及びその誘導体等のステロールが挙げられる。コレステロール誘導体の非限定的例としては、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、及び６−ケトコレスタノール等の極性類似体、５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、及びコレステリルデカノエート等の非極性類似体、並びにこれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体はコレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル等の極性類似体である。コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテルの合成はＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／１２７０６０に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１種以上のリン脂質、及びコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むかまたはそれらからなる。他の実施形態では、脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１種以上のリン脂質、例えばコレステロール非含有脂質粒子製剤を含むか、またはそれらからなる。更に他の実施形態では、脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えばリン脂質非含有脂質粒子製剤を含むかまたはそれらからなる。
本発明での使用に適した非カチオン性脂質の他の例としては、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルサルフェートアルキル−アリールスルフェートポリエチルオキシレート化脂肪酸アミド（ａｌｋｙｌ−ａｒｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘｙｌａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄａｍｉｄｅｓ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリン等の、リン非含有脂質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％〜約４２ｍｏｌ％、もしくは約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、もしくは４５ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。
脂質粒子がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体の混合物を含有する実施形態において、混合物は、粒子内に存在する総脂質の最大約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を占めてよい。
いくつかの実施形態では、混合物中で、リン脂質成分は、粒子内に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、もしくは約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占めてよい。ある特定の好ましい実施形態では、混合物中に、リン脂質成分は、粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、もしくは約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。非限定例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、例えば、コレステロールまたはコレステロール誘導体が、粒子内に存在する総脂質の約３４ｍｏｌ％（またはその任意の一部）である混合部中において、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を約７ｍｏｌ％（またはその任意の一部）で含んでよい。別の非限定例としては、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は、例えば、コレステロールまたはコレステロール誘導体が、粒子内に存在する総脂質の約３２ｍｏｌ％（またはその任意の一部）である混合部中において、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を約７ｍｏｌ％（またはその任意の一部）で含んでよい。
他の実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子内に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、もしくは約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占めてよい。ある特定の好ましい実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子内に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３３ｍｏｌ％、もしくは約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、もしくは３５ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。通常、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む１：５７脂質粒子製剤は、例えば、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質が、粒子内に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の一部）である混合部中において、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３４ｍｏｌ％（またはその任意の一部）含んでよい。通常、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む７：５４脂質粒子製剤は例えば、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質が、粒子内に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の一部）である混合部中において、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約３２ｍｏｌ％（またはその任意の一部）含んでよい。
脂質粒子がリン脂質非含有である実施形態において、コレステロールまたはその誘導体は、粒子内に存在する総脂質の最大約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を占めてよい。
いくつかの実施形態では、リン脂質非含有脂質粒子内において、コレステロールまたはその誘導体は、粒子内に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％〜約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、もしくは約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、もしくは４０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占めてよい。非限定例として、１：６２脂質粒子製剤は、粒子内に存在する総脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の一部）でコレステロールを含んでよい。別の非限定例としては、７：５８脂質粒子製剤はコレステロールを、粒子内に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の一部）で含んでよい。
他の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えばリン脂質のみ）、もしくは約６０ｍｏｌ％（例えばリン脂質と、コレステロールまたはその誘導体）（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を含む。
本発明の脂質粒子にて使用するのに好適な非カチオン性脂質の更なる割合及び範囲は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２０１１／０００１０６、及び米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質の割合（％）は目標量であり、製剤内に存在する非カチオン性脂質の実際の量は、例えば±５ｍｏｌ％変動し得ると理解されるべきである。例えば、１：５７脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤において、リン脂質の目標量は７．１ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３４．３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量はその目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、製剤の残りは、他の脂質成分で構成される（粒子内に存在する全脂質の最大１００ｍｏｌ％まで加えられる）。同様に、７：５４脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤において、リン脂質の目標量は６．７５ｍｏｌ％であり、コレステロールの目標量は３２．４３ｍｏｌ％であるが、リン脂質の実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、コレステロールの実際の量は、その目標量の±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、製剤の残りは、他の脂質成分で構成される（粒子内に存在する全脂質の最大１００ｍｏｌ％まで加えられる）。
脂質コンジュゲート
カチオン性及び非カチオン性脂質に加え、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は更に、脂質コンジュゲートを含んでよい。複合脂質は、粒子の凝集を防止するという点で有用である。好適な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、ＰＯＺ−脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー−脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、粒子は、ＣＰＬに加え、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートのいずれかを含む。
好ましい実施形態では脂質コンジュゲートはＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ脂質の例としては、例えばＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０５／０２６３７２に記載されている、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば米国特許公開番号２００３００７７８２９及び２００５００８６８９に記載されている、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、例えば米国特許番号５，８８５，６１３に記載されている、セラミドに結合したＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体に結合したＰＥＧ、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特許文書の開示は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明中で使用するのに好適な更なるＰＥＧ脂質としては、非限定的にｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が挙げられる。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成はＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／０８６５５８に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に別の好適なＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、１−［８'−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が挙げられるが、これに限定されない。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成は米国特許番号７，４０４，９６９に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有する、エチレンＰＥＧ反復単位の直鎖状水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、それらの分子量により分類される。例えば、ＰＥＧ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社及び他の企業から市販されており、以下を含むがこれらに限定されない：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−サクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−サクシニミジルサクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）、及び、末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含有する化合物（例えばＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２等）。米国特許番号６，７７４，１８０及び７，０５３，１５０に記載されているものといった、他のＰＥＧ（例えばｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）もまた、本発明の調製に有用である。これらの特許の開示は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は特に、例えばＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含むＰＥＧ−脂質コンジュゲートの調製に有用である。
本明細書に記載されるＰＥＧ−脂質コンジュゲートのＰＥＧ部位は、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含んでよい。ある特定の場合において、ＰＥＧ部位は、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部位は約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
ある特定の場合において、ＰＥＧはアルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基により任意に置換されることができる。ＰＥＧは脂質に直接結合することができるかまたは、リンカー部位を介して脂質に結合されてもよい。例えばエステル非含有リンカー部位及びエステル含有リンカー部位を含む、脂質へのＰＥＧの結合に好適な任意のリンカー部位を使用することができる。好ましい実施形態では、リンカー部位はエステル非含有リンカー部位である。本明細書で使用する場合、「エステル非含有リンカー部位」という用語とは、カルボキシルエステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含有しないリンカー部位を意味する。好適な非エステル含有リンカー部位としては、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、サクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、サクシンアミジル（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、エーテル、ジスルフィド、並びにこれらの組み合わせ（カルバメートリンカー部位及びアミドリンカー部位の両方を含有するリンカー等）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーを用いてＰＥＧを脂質に結合させる。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部位を用いてＰＥＧを脂質に結合させる。好適なエステル含有リンカー部位としては、例えば、カーボネート（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、サクシノイル、ホスフェートエステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホネートエステル、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
鎖長及び飽和度が異なる種々のアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧと結合し、脂質コンジュゲートを形成することができる。かかるホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、または当業者に既知の従来の技術を用いて単離もしくは合成することができる。Ｃ１０−Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する、飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。一価または二価不飽和脂肪酸、並びに飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を含むホスファチジルエタノールアミンもまた使用することができる。好適なホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、が挙げられるが、これらに限定されない。
「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」という用語には非限定的に、米国特許番号６，３２０，０１７及び６，５８６，５５９に記載されている化合物が挙げられ、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの化合物には、式
を有する化合物を含み、
式中、Ｒは水素、アルキル及びアシルからなる群から選択される部分であり、Ｒ１は水素及びアルキルからなる群から選択される部分であり、または所望により、Ｒ及びＲ１、およびそれらが結合する窒素がアジド部位を形成し、Ｒ２は水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、及びアミノ酸の側鎖から選択される群の成員であり、Ｒ３は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択される成員であり、式中、Ｒ４及びＲ５は独立して水素またはアルキルであり、ｎは４〜８０であり、ｍは２〜６であり、ｐは１〜４でり、かつ、ｑは０または１である。他のポリアミドが本発明の化合物にて使用可能であることが、当業者に明らかとなるであろう。
「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」という用語は、共に独立してエステル結合により、グリセロールの１位及び２位に結合した２〜３０個の炭素を有する、２つの脂肪族アシル鎖Ｒ１及びＲ２を含む化合物を含む。アシル基は飽和であることができるか、または様々な不飽和度を有することができる。好適なアシル基としては、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）及びイコソイル（ｉｃｏｓｏｙｌ）（Ｃ２０）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一である、即ち、Ｒ１及びＲ２は共にミリストイル（即ちジミリストイル）であり、Ｒ１及びＲ２は共にステアロイル（即ちジステアロイル）等である。ジアシルグリセロールは以下の一般式を有する：
「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」という用語は、共に独立して２〜３０個の炭素を有する２つのアルキル鎖Ｒ１及びＲ２を有する化合物を含む。アルキル基は飽和であることができるか、または様々な不飽和度を有することができる。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式を有する：
好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は以下の式
を有するＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートであり、
式中、Ｒ１及びＲ２は独立して選択され、約１０〜約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、かつ、Ｌは上述のエステル非含有リンカー部位またはエステル含有リンカー部位である。長鎖アルキル基は、飽和または不飽和であり得る。好適なアルキル基としては、デシル（Ｃ１０）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）及びイコシル（Ｃ２０）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、Ｒ１及びＲ２は同一である、即ち、Ｒ１及びＲ２は共にミリスチル（即ちジミリスチル）であり、Ｒ１及びＲ２は共にステアリル（即ちジステアリル）等である。
上記式ＶＩＩにおいて、ＰＥＧは約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。特定の場合において、ＰＥＧは、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはアルコキシ、アルコキシ、アシル、またはアリール基により任意に置換することができる。ある特定の実施形態において、末端ヒドロキシル基はメトキシまたはメチル基により置換されている。
好ましい実施形態では「Ｌ」はエステル非含有リンカー部位である。好適なエステル非含有リンカーとしては、アミドリンカー部位、アミノリンカー部位、カルボニルリンカー部位、カルバメートリンカー部位、尿素リンカー部位、エーテルリンカー部位、ジスルフィドリンカー部位、サクシンアミジルリンカー部位、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、エステル非含有リンカー部位はカルバメートリンカー部位（即ち、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＡＡコンジュゲート）である。別の好ましい実施形態では、エステル非含有リンカー部位はアミドリンカー部位（即ち、ＰＥＧ−Ａ−ＤＡＡコンジュゲート）である。更に別の好ましい実施形態において、エステル非含有リンカー部位はサクシンアミジルリンカー部位（即ち、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＡコンジュゲート）である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは
から選択される。
ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、当業者に既知の標準的な技術及び試薬を使用して合成することができる。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは種々のアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメート、及び尿素結合を含有することが理解されよう。当業者は、これらの結合を形成するための方法及び試薬は既知であり、容易に入手可能であることを理解するであろう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ １９９２）；Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ １９８９）、及びＦｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ １９８９）を参照のこと。更に、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートの合成において、存在する任意の官能基は、異なる箇所において保護及び脱保護が必要な場合があると理解されよう。当業者は、かかる技術は既知であることを理解するであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）を参照のこと。
好ましくは、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートはＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートである。これらの実施形態では、ＰＥＧは約７０５または約２，０００ダルトンの平均分子量を有することが好ましい。特に好ましい一実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含み、「２０００」はＰＥＧの平均分子量を意味し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部位を意味し、かつ「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを意味する。特に好ましい別の実施形態において、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡを含み、「７５０」はＰＥＧの平均分子量を意味し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部位を意味し、かつ「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを意味する。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基はメチル基で置換されている。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルを本発明のＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートにて使用可能であることを容易に理解するであろう。
前述に加え、当業者には、他の親水性ポリマーがＰＥＧの代わりに使用可能であることが容易に理解されるであろう。ＰＥＧの代わりに使用可能な好適なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、並びにヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース等の誘導体化セルロースが挙げられるが、これらに限定されない。
前述の化合物に加え、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は更に、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬ（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：４３３−４３７（２０００）；米国特許番号６，８５２，３３４；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／６２８１３を参照、これらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のためにそれら全体が本明細書に参照により組み込まれる）を含むことができる。
好適なＣＰＬとしては、式ＶＩＩＩの化合物
Ａ−Ｗ−Ｙ （ＶＩＩＩ）
が挙げられ、
式中、Ａ、Ｗ及びＹは以下に記載する通りである。
式ＶＩＩＩに関して、「Ａ」は脂質アンカーとして機能する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質等の脂質部位である。好適な脂質の例としては、ジアシルグリセロリル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｙｌｓ）、ジアルキルグリセロリル（ｄｉａｌｋｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｙｌｓ）、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
「Ｗ」は親水性ポリマーまたはオリゴマー等のポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは非免疫原性の、または低い先天性免疫原性を有する生体適合性ポリマーである。あるいは、親水性ポリマーは適切なアジュバントと共に使用される場合、わずかに抗原性であることができる。好適な非免疫原性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ポリマーは約２５０〜約７，０００ダルトンの分子量を有する。
「Ｙ」はポリカチオン性部位である。「ポリカチオン性部位」という用語は、選択したｐＨ、好ましくは生理的ｐＨにおいて正電荷、好ましくは少なくとも２の正電荷を有する化合物、誘導体、または官能基を指す。好適なポリカチオン性部位としては、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン及びヒスチジン等の塩基性アミノ酸及びそれらの誘導体等の塩基性アミノ酸及びそれらの誘導体、スペルミン；スペルミジン、カチオン性デンドリマー、ポリアミン、ポリアミン糖類、並びにアミノ多糖類が挙げられる。ポリカチオン性部位は、構造が直鎖テトラリジンなどの直鎖状、分岐状またはデンドリマー状であることができる。ポリカチオン性部位は、選択したｐＨ値において約２〜約１５の正電荷、好ましくは約２〜約１２の正電荷、及びより好ましくは約２〜約８の正電荷を有する。どのポリカチオン性部位を用いるかの選択は、所望の粒子用途の種類により決定してよい。
ポリカチオン性部位の電荷は、粒子部位全体にわたり分布するか、あるいは、例えば電荷スパイクのように、粒子部位のある特定の領域に電荷密度が不連続で集中しているかのいずれかとすることができる。電荷密度が粒子状で分布している場合、電荷密度は均一に分布するか、または不均一に分布することができる。ポリカチオン性部位のあらゆる種類の電荷分布が、本発明により包含される。
脂質「Ａ」及び非免疫原性ポリマー「Ｗ」は種々の方法、好ましくは共有結合により結合することができる。当業者に既知の方法を、「Ａ」と「Ｗ」との共有結合に使用することができる。好適な結合としては、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、エステル、及びヒドラゾン結合が挙げられるが、これらに限定されない。「Ａ」及び「Ｗ」は、結合をもたらす相補的な官能基を有しなければならないことが、当業者には明らかとなろう。一方が脂質にあり、他方がポリマーにあるこれらの２つの基の反応が、所望の結合を付与する。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、末端ヒドロキシルが例えばＮＨＳ及びＤＣＣにより活性化されて活性エステルを形成した後、ポリアミド等のアミノ基を含有するポリマーと反応させる場合（例えば米国特許番号６，３２０，０１７及び６，５８６，５５９を参照、それらの開示は、全ての目的についてその全体が本明細書に参照により組み入れられる）、２つの基の間にアミド結合が形成される。
ある特定の場合において、ポリカチオン性部位は、カルシウムの複合体化のための標的リガンドまたはキレート化部位等の、結合したリガンドを有することができる。好ましくは、リガンドが結合した後、カチオン性部位は正電荷を維持する。ある特定の場合には、結合するリガンドは正電荷を有する。好適なリガンドとしては、反応性官能基を有する化合物または装置が挙げられるが、これらに限定されず、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生物親和性化合物、生体材料、生体高分子、バイオメディカル機器、分析により検出可能な化合物、治療効果のある化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫促進剤、放射線標識、蛍光発生素、ビオチン、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロゾーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的部位、または毒素を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）は、粒子内に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％〜約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、もしくは約１．４ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。
他の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）は、粒子内に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、もしくは約２ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。
更なる実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）は、粒子内に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、もしくは約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）を占める。
本発明の脂質粒子の使用に好適な脂質コンジュゲートの更なる割合及び範囲は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２０１１／０００１０６、及び米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子中に存在する脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ脂質）の割合は目標量であり、製剤中に存在する脂質コンジュゲートの実際の量は、例えば±２ｍｏｌ％変化してよいと理解されるべきである。例えば、１：５７脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤において、脂質コンジュゲートの目標量は１．４ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際の量は、その目標量の±０．５ｍｏｌ％、±０．４ｍｏｌ％、±０．３ｍｏｌ％、±０．２ｍｏｌ％、±０．１ｍｏｌ％、または±０．０５ｍｏｌ％であってよい。同様に、７：５４脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤において、脂質コンジュゲートの目標量は６．７６ｍｏｌ％であるが、脂質コンジュゲートの実際の量は、その目標量の±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、製剤の残りは、他の脂質成分で構成される（粒子内に存在する全脂質の最大１００ｍｏｌ％まで加えられる）。
用いる脂質コンジュゲートに応じ、かつ脂質粒子が膜融合性に変化する速度に応じて、脂質コンジュゲートの濃度は変化し得ることを当業者は理解するであろう。
脂質コンジュゲートの組成及び濃度を調節することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子から交換する速度、及び、結果的に脂質粒子が膜融合性に変化する速度を調節することができる。例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして用いる場合、脂質粒子が膜融合性に変化する速度は、例えば脂質コンジュゲートの濃度を変化させることにより、ＰＥＧの分子量を変化させることにより、またはＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートのアルキル基の鎖長及び飽和度を変化させることにより変化させることができる。また、例えばｐＨ、温度、イオン強度等を含む他の変数を用いて、脂質粒子が膜融合性に変化する速度を変化及び／または調節することができる。脂質粒子が膜融合性に変化する速度を調節するために用いることができる他の方法は、本開示を読むと当業者に明らかとなるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成及び濃度を調節することで、脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）サイズを調節することができる。
脂質粒子の調製
ｍＲＮＡが粒子の脂質部分に閉じ込められ、分解から保護されている本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、非限定的に連続混合法、直接希釈プロセス、及びインライン希釈プロセスを含む、当該技術分野において既知の任意の方法により形成することができる。
ある特定の実施形態において、本発明は連続した混合法、例えば、核酸（例えばｍＲＮＡ）を含む水溶液を第１のリザーバに提供すること、有機脂質溶液を第２のリザーバに提供すること（該有機脂質層中に存在する脂質は、例えばエタノール等の低級アルカノールといった有機溶媒中に可溶化されている）、及び、脂質小胞（例えばリポソーム）であって、該脂質小胞内に核酸を封入している前記脂質小胞を実質的に即座に作製するように、前記有機脂質溶液が水溶液と混合するように前記水溶液を前記有機脂質溶液と混合することを含むプロセスにより作製した核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。このプロセス、及びこのプロセスを実施するための装置は米国特許公開番号２００４０１４２０２５に詳細に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
脂質及び緩衝液を混合チャンバ等の混合環境に連続的に添加することにより、脂質溶液が緩衝液と連続的に希釈され、これにより、混合の際に実質的に即座に脂質小胞を作製する。本明細書で使用する場合、「脂質溶液を緩衝液と連続的に希釈すること」表現（及び変形）は一般的に、脂質溶液が、小胞発生を行うのに十分な力で、水和プロセス中で十分速やかに希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することで、有機脂質溶液は緩衝液（即ち水溶液）の存在下で、段階的な連続希釈が行われ、核酸−脂質粒子を作製する。
連続混合法を用いて形成した核酸−脂質粒子は一般的に、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、もしくは８０ｎｍ未満、もしくは約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、所望により寸法を合わせて均一な粒子サイズを達成する。
別の実施形態において、本発明は、脂質小胞（例えばリポソーム）溶液を形成すること、及び速やかかつ直接に、量を調節した希釈緩衝液を含有する収集容器内に該脂質小胞溶液を入れることを含む直接希釈プロセスにより作製した核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。好ましい態様において、収集容器は、希釈を促進するために収集容器の内容物を攪拌するために配置された１つ以上の要素を含む。一態様では、収集容器内に存在する希釈緩衝液の量は、その中に入れられる脂質小胞溶液の体積に実質的に等しい。非限定例として、等体積の希釈緩衝液を含有する収集容器に入れた場合、４５％エタノールの脂質小胞溶液が、より小さい粒子を有利にもたらす。
更に他の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液を含有する第３のリザーバが第２の混合領域と流体的に連結している、インライン希釈プロセスにより作製した核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）を提供する。この実施形態では、第１の混合領域内で形成された脂質小胞（例えばリポソーム）溶液は、第２の混合領域内で直ちにかつ直接、希釈緩衝液と混合される。好ましい態様において、第２の混合領域は脂質小胞溶液と希釈緩衝液の流れが、対向した１８０°の流れで合流するように配置されたＴ字コネクタを含むが、例えば約２７°〜約１８０°（例えば約９０°）のより浅い角度を付与するコネクタを用いることができる。ポンプの仕組みが、第２の混合領域に調節可能な緩衝液の流れを送達する。一態様では、第２の混合領域に供給される希釈緩衝液の流速は、第１の混合領域からそこに入れられる脂質小胞溶液の流速に実質的に等しいように調節される。本実施形態は有利に、第２の混合領域内の脂質小胞溶液と混合する希釈緩衝液の流れを一層調節すること、及び、したがってまた第２の混合プロセスを通して、緩衝液中の脂質小胞の濃度を一層調節することを可能にする。希釈緩衝液の流速をこのように調節することは、低下した濃度で小さい粒子サイズの形成を有利に可能にする。
これらのプロセス、及びこれらの直接希釈及びインライン希釈プロセスを実施する装置は米国特許公開番号２００７００４２０３１に詳細に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
直接希釈及びインライン希釈プロセスを用いて形成される核酸−脂質粒子は通常、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、もしくは８０ｎｍ未満、もしくは約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲）のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、所望により寸法を合わせて均一な粒子サイズを達成する。
必要であれば、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、リポソームの寸法を合わせるのに利用可能な任意の方法により寸法を合わせてよい。所望のサイズ範囲、及び比較的狭い粒径分布を達成するために、寸法合わせを行ってよい。
粒子を所望のサイズに寸法合わせするために、いくつかの技術が利用可能である。リポソームに使用可能な、かつ本発明の粒子に同様に適用可能なある寸法合わせの方法は米国特許番号４，７３７，３２３に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。浴またはプローブ超波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理することで、粒子のサイズを約５０ｎｍ未満まで、積極的に縮小する。均質化は、より大きな粒子を小さな粒子に分解するための剪断力に依る別の方法である。典型的な均質化手順においては、粒子は選択した粒径、通常は約６０〜約８０ｎｍが観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーにより再循環される。両方の方法において、粒度分布は従来のレーザービーム粒径識別、またはＱＥＬＳにより監視することができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜による粒子の押出成形もまた、粒径を縮小させて比較的輪郭が明確なとした粒径分布にするための効果的な方法である。通常、所望の粒径分布が達成されるまで、懸濁液は膜を１度以上循環する。粒子を小孔膜から連続的に押し出して、サイズを徐々に縮小させてよい。
他の実施形態では、該方法は更に、本発明の組成物を用いた細胞のリポフェクションをもたらすのに有用な非脂質ポリカチオンを添加することを含んでよい。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、臭化ヘキサジメトリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから商標名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）で販売）またはヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の好適なポリカチオンとしては、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリアリルアミン及びポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の添加は、粒子が形成された後が好ましい。
いくつかの実施形態では、形成された核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）内の、核酸の脂質に対する割合（質量／質量比）は、約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約０．２、約０．０２〜約０．１、約０．０３〜約０．１、または約０．０１〜約０．０８で変動するであろう。出発物質（投入）の割合もまた、この範囲内である。他の実施形態では、粒子の調製には全脂質１０ｍｇに対して約４００μｇの核酸、または約０．０１〜約０．０８の、脂質に対する核酸の質量比、かつ、より好ましくは約０．０４を用い、この比は全脂質１．２５ｍｇに対して核酸５０μｇに対応する。別の好ましい実施形態では、粒子は約０．０８の核酸：脂質質量比を有する。
他の実施形態では、形成した核酸−脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）における脂質の核酸に対する割合（質量／質量比）は、約１（１：１）〜約１００（１００：１）、約５（５：１）〜約１００（１００：１）、約１（１：１）〜約５０（５０：１）、約２（２：１）〜約５０（５０：１）、約３（３：１）〜約５０（５０：１）、約４（４：１）〜約５０（５０：１）、約５（５：１）〜約５０（５０：１）、約１（１：１）〜約２５（２５：１）、約２（２：１）〜約２５（２５：１）、約３（３：１）〜約２５（２５：１）、約４（４：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２０（２０：１）、約５（５：１）〜約１５（１５：１）、約５（５：１）〜約１０（１０：１）、もしくは約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）、もしくは２５（２５：１）、またはこれらの任意の一部もしくはこれらの中の範囲で変化するであろう。出発物質（投入）の割合もまた、この範囲内である。
上で論じた通り、複合脂質は更にＣＰＬを含んでもよい。ＳＮＡＬＰ−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有ＳＮＡＬＰ）を作製するための種々の一般的な方法は本明細書で論じられている。２つの一般的な技術としては「後挿入」技術、即ち、ＣＰＬを例えば事前に形成したＳＮＡＬＰに挿入すること、及び、ＣＰＬが、例えばＳＮＡＬＰ形成ステップの間で脂質混合物中に含められる「標準」技術が挙げられる。後挿入技術はＳＮＡＬＰ二層膜の外面に主にＣＰＬを有するＳＮＡＬＰをもたらすが、標準技術は内面と外面の両方にＣＰＬを有するＳＮＡＬＰを提供する。該方法は特に、リン脂質（コレステロールを含有することができる）から作製される小胞、及びまた、ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ−ＤＡＡ及びＰＥＧ−ＤＡＧ等）を含有する小胞に対して有用である。ＳＮＡＬＰ−ＣＰＬの作製方法は例えば、米国特許番号５，７０５，３８５；６，５８６，４１０；５，９８１，５０１；６，５３４，４８４、及び６，８５２，３３４；米国特許公開番号２００２００７２１２１、並びにＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／６２８１３にて教示されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
脂質粒子の投与
一度形成されると、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、特に細胞内への核酸（例えばｍＲＮＡ）の導入に対して有用である。したがって、本発明はまた、細胞内への核酸（例えばｍＲＮＡ）の導入方法も提供する。特定の実施形態では、核酸（例えばｍＲＮＡ）は細網内皮細胞（例えばマクロファージ、単球等）といった感染細胞、並びに、線維芽細胞、内皮細胞（血管内面に並んだもの等）、及び／または血小板細胞を含む他の細胞型に導入される。該方法は、まず本明細書に記載した粒子を形成し、次いで、ｍＲＮＡの細胞への送達が発生するのに十分な時間、該粒子を細胞と接触させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施されてよい。
本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、それらが混合または接触される殆ど全ての細胞型に吸収されることができる。一度吸収されると、粒子は細胞の一部により取り込まれるか、細胞膜と脂質を交換するか、または細胞と融合するかのいずれかが可能となる。粒子の核酸（例えばｍＲＮＡ）部分の移動または組み込みは、これらの経路のいずれか１つを経由して発生することができる。特に、融合が行われる場合、粒子膜が細胞膜に取り込まれ一体化し、粒子の内容物が細胞内液と合わさって溶け合う。
本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、単独で、または投与経路及び標準的な薬務に従って選択される、製薬上許容できる担体（例えば生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合して投与することができる。一般に、通常の緩衝生理食塩水（例えば１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）を製薬上許容できる担体として用いてよい。他の好適な担体としては例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等を含み、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性が向上した糖タンパク質を含む。更なる好適な担体は、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書で使用する場合、「担体」は全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング材、希釈剤、抗菌及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。「製薬上許容できる」という表現は、ヒトに投与した際に、アレルギー性または類似の副作用を発生しない分子単位及び組成物を指す。
製薬上許容できる担体は通常、脂質粒子の形成後に添加される。従って、脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）が形成された後、通常の緩衝生理食塩水等の製薬上許容できる担体中に粒子を希釈させることができる。
薬物製剤中の粒子濃度は広い範囲、即ち約０．０５重量％未満から、通常は（少なくとも）約２〜５重量％、最大１０〜９０重量％までで変えることができ、選択される特定の投与方法に従い、主に液量、粘度等によって選択されるであろう。例えば、濃度を上げて、治療に関係する流体負荷を低下させてよい。これは特に、アテローム性動脈硬化症関連うっ血性心不全、または重度の高血圧を患う患者において望ましいものであり得る。あるいは、刺激性脂質で構成される粒子を希釈して低濃度にし、投与部位での炎症を減少させてよい。
本発明の医薬組成物を、従来の既知の滅菌技術により滅菌してよい。水溶液を使用のために詰めることができるか、または無菌状態下で濾過し、凍結乾燥することができ、凍結乾燥した配合物は、投与前に滅菌水溶液と混合される。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等の、生理学的条件に近づけるために必要な製薬上許容できる補助物質を含有することができる。更に粒子懸濁液は、保存に際して、フリーラジカル及び脂質の過酸化損傷から脂質を保護する、脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロール等の親油性フリーラジカルクエンチャー、及びフェリオキサミン等の水溶性鉄特異的キレート化剤が好適である。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、特に１つ以上のｍＲＮＡの治療用送達方法において有用である。
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与
Ｉｎ ｖｉｖｏ治療用の全身送達、例えば循環等の体の仕組みにより、末端標的細胞に治療用核酸を送達することは、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／００７１９６、ＷＯ０５／１２１３４８、ＷＯ０５／１２０１５２、及びＷＯ０４／００２４５３に記載されている核酸−脂質粒子を用いて達成されており、あらゆる目的のために、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明はまた、血清中でヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性であり、寸法が小さく、かつ反復投与に好適な、完全に封入された脂質粒子を提供する。
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与では、投与は例えば、注射、経口投与、吸入（例えば経鼻投与もしくは気管内投与）、経皮投与、または直腸投与による任意の既知の方法とすることができる。投与は一度のまたは分割した投与量で達成することができる。医薬組成物は非経口で、即ち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物はボーラス注射により静脈内または腹腔内投与される（例えば米国特許番号５，２８６，６３４を参照）。細胞内核酸送達はまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）；ａｎｄ Ｂｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）でも論じられている。脂質をベースにした治療の、更に他の投与方法は例えば、米国特許番号３，９９３，７５４、４，１４５，４１０、４，２３５，８７１、４，２２４，１７９、４，５２２，８０３、及び４，５８８，５７８に記載されている。脂質粒子は病気の部位への直接注射により、または、病気の部位から離れた部位への注射により投与することができる（例えばＣｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照）。上述の参考文献の開示は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）が静脈内投与される実施形態において、粒子の総注射量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％は、注射後約８、１２、２４、３６、または４８時間、血漿中に存在する。他の実施形態では、脂質粒子の総注射量の約２０％、３０％、４０％超、かつ最大約６０％、７０％、または８０％が注射後約８、１２、２４、３６、または４８時間、血漿中に存在する。ある特定の場合において、複数の粒子の約１０％超が、投与１時間後に哺乳類の血漿中に存在する。ある特定の他の例において、脂質粒子の存在は、粒子の投与後少なくとも約１時間で検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子等の治療用核酸の存在は細胞内で、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間で検出可能である。 別の実施形態において、本発明に従い生体内に導入されたｍＲＮＡによりコードされたポリペプチドの発現は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間で検出可能である。更なる実施形態では、投与部位に近い、または遠い部位での、細胞内のｍＲＮＡの存在または効果は、投与後約１２、２４、４８、７２、もしくは９６時間、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、もしくは２８日で検出可能である。更なる実施形態において、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は非経口または腹腔内投与される。
本発明の組成物は単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、エアゾール製剤を作製し（即ち、「噴霧」し）、吸入により投与（例えば経鼻投与または気管内投与）することができる（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照）。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧した適合噴射剤中に配置することができる。
ある特定の実施形態において、医薬組成物は鼻内噴霧、吸入、及び／または他のエアゾール送達ビヒクルにより送達されてよい。鼻エアロゾルスプレーにより肺に直接核酸組成物を送達する方法は、例えば米国特許番号５，７５６，３５３及び５，８０４，２１２に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂及びリゾホスファチジル−グリセリン化合物を用いた薬剤の送達（米国特許５，７２５，８７１）もまた、薬学技術では既知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許番号５７８００４５に記載されている。上記特許の開示は、それら全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
例えば関節内経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、及び皮下経路等による非経口的投与に好適な製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び目的のレシピエントの血液に対して等張性の配合を付与する溶質を含有することができる水性及び非水性の等張性滅菌注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施において、組成物は例えば静脈内注射、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与、または髄腔内投与されるのが好ましい。
一般に、静脈内投与される場合、脂質粒子製剤は好適な医薬担体と共に製剤される。多くの製薬上許容できる担体を、本発明の組成物及び方法に使用してよい。本発明にて使用する好適な製剤は例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等の種々の水性担体を使用してよく、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性向上のための糖タンパク質を含んでよい。一般に、通常の緩衝生理食塩水（１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）を製薬上許容できる担体として使用してよいが、他の好適な担体でも十分である。これらの組成物は、濾過等の従来のリポソーム滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリル酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等の、生理学的条件に近づけるために必要な製薬上許容できる補助物質を含有してよい。これらの組成物は、上で言及した技術を用いて滅菌することができるか、あるいは滅菌状態下にて作製することができる。得られた水溶液は使用のために詰めるか、または無菌条件下で濾過し、凍結乾燥してよく、凍結乾燥した配合物は、投与前に滅菌水溶液と混合される。
ある特定の用途においては、本明細書にて開示した脂質粒子は、経口投与により個体に送達されてよい。粒子は賦形剤と一体化してよく、体内摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、丸薬、ロゼンジ、エリキシル剤、マウスウォッシュ、懸濁液、経口スプレー、スプレー、ウエハース等の形態で使用してよい（例えば米国特許番号５，６４１，５１５、５，５８０，５７９及び５，７９２，４５１を参照のこと。それらの開示は、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により組み込まれる）。これらの経口投薬形態はまた、以下を含有してよい：結合剤、ゼラチン；賦形剤、滑沢剤、及び／または香料添加剤。単位投薬形態がカプセルである場合、上記材料に加え、液体担体を含有してよい。種々の他の材料が、コーティング材として、または別様に用量単位の物理的形状を変更するために存在してよい。もちろん、任意の単位投薬形態の調製に用いられる任意の材料は薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に無毒でなければならない。
通常は、これらの経口製剤は少なくとも０．１％以上の脂質粒子を含有してよいが、粒子の割合（％）はもちろん変化し、便宜的に全製剤の重量または体積の約１％または２％〜約６０％または７０％以上の間であってよい。当然、治療上有用な各組成物中の粒子の量は、好適な用量が、化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製される。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、生成物の貯蔵寿命等の要因、及び他の薬理学的考慮が、かかる薬物製剤を調製する当業者により企図され、したがって種々の用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００等の希釈剤中に懸濁した、詰められた有効量の治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）等の溶液、（ｂ）所定量の治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）を液体、固形分、顆粒、またはゼラチンとしてそれぞれ含有するカプセル、サッシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体の懸濁液、及び（ｄ）好適なエマルションを含有することができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、バレイショデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香料添加剤、染料、崩壊剤、並びに薬学的に適合性のある担体のうち１つ以上を含むことができる。ロゼンジ形態は、例えばスクロース等のフレーバー中の治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）、並びにゼラチン及びグリセリン等の不活性塩基中に治療用核酸を含むトローチ、または、治療用核酸に加えて当該技術分野における既知の担体を含有する、スクロース及びアカシアのエマルション、ゲル等を含むことができる。
脂質粒子は、それらの使用の他の例において、広範囲の局所投薬形態に組み込むことができる。例えば、ＳＮＡＬＰ等の核酸−脂質粒子を含有する懸濁液は、ゲル、オイル、エマルション、局所用クリーム、ペースト、軟膏、ローション、フォーム、ムース等として配合され投与することができる。
本発明の脂質粒子の医薬品を調製する場合、精製して中空粒子を減少もしくは除去した、ある量の粒子、または外面に関係する核酸等の治療薬を組み合わせた粒子を用いることが好ましい。
本発明の方法を種々の宿主で実践してよい。好ましい宿主としては、霊長類（例えばヒト及びチンパンジー、並びに他の非ヒト霊長類）等の哺乳類種、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えばラット及びマウス）、ウサギ、並びにブタが挙げられる。
投与される粒子の量は、治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）の脂質に対する割合、用いる特定の治療用核酸、治療する病気または患者の疾患、年齢、体重、及び状態、並びに臨床医の判断に依存するが、通常は体重１ｋｇあたり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇ、または投与（例えば注射）あたり約１０8〜１０１０個の粒子である。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途に対しては、治療用核酸（例えばｍＲＮＡ）の送達は、植物または動物由来であっても、脊椎動物であっても非脊椎動物であっても、及び任意の組織または型であっても、培養液中で増殖した任意の細胞に対して行うことができる。好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
細胞と脂質粒子との接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる際、生物学的に適合性のある培地にて行う。粒子の濃度は特定の用途に応じて広範に変化するが、通常は約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。脂質粒子との細胞の処理は通常、約１〜４８時間、好ましくは約２〜４時間、生理学的温度（約３７℃）で実施される。
好ましい実施態様のある群では、脂質粒子懸濁液は約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する、６０〜８０％コンフルエントで配置した細胞に添加される。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍＬであり、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌである。
細胞の組織培養が必要になる場合があることは、当該技術分野において既知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４），Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）、及びこの中で引用される参考文献は、細胞培養の一般的な手引きを提供している。培養した細胞系は多くの場合、単層細胞の形態であるが、細胞懸濁液もまた用いられる。
エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いることで、ＳＮＡＬＰまたは本発明の他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは米国特許公開番号２００３００７７８２９に詳細に記載されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。より詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、種々のカチオン性脂質、及びＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子のヘルパー脂質成分の効果を、これらのエンドソーム膜との結合／取りこみまたは融合／エンドソーム膜の不安定化の相対的な効果に基づいて区別することである。このアッセイにより、定量的にＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子の各成分が、どのように送達効果に影響を与えているかを測定することができるため、ＳＮＡＬＰまたは脂質粒子を最適化することができる。通常、ＥＲＰアッセイはレポータータンパク質（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定し、場合によっては、発現プラスミドに対して最適化されたＳＮＡＬＰ製剤もまた、ｍＲＮＡの封入に適するであろう。種々のＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子に対するＥＲＰを比較することによって、最適化した系、例えば細胞内で最大の取りこみを有するＳＮＡＬＰまたは他の脂質粒子を容易に測定することができる。
脂質粒子を送達する細胞
本発明は、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えばマウス、ラット、及びモルモット）、ウサギ、ブタ、並びに霊長類（例えばサル、チンパンジー、及びヒト）等の哺乳類を含む任意の脊椎動物由来の多種多様の細胞型で実施することができる。
脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は約１、２、３、４、５、６、７、８時間またはそれ以上で、対象内で検出可能である。別の実施形態において、本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は対象内で、粒子の投与後、約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは ９６時間、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、２８日で検出可能である。粒子の存在は、対象の細胞、組織、または他の生体試料で検出可能である。粒子は、例えば粒子の直接検出、及び／または脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡ配列の検出、及び／またはｍＲＮＡから発現したポリペプチドの検出により検出してよい。
粒子の検出
ＳＮＡＬＰ等の本発明の脂質粒子は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、当該技術分野において既知方法を使用して、標識を脂質粒子の成分に直接、または間接的に結合させることができる。必要な感受性、脂質粒子成分との結合の容易さ、安定性の必要条件、並びに利用可能な器具及び廃棄処置に応じて標識を選択することで、多種多様の標識を用いることができる。好適な標識としては、蛍光染料等のスペクトル標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）等のフルオレセイン及び誘導体；Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等のローダミン及び誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィリコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ（商標）等）、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ等の放射線標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、コロイド金もしくは有色ガラス等のスペクトル比色分析標識、またはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチックビーズが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知の任意の手段を用いて標識を検出することができる。
核酸の検出
本明細書では、核酸（例えばｍＲＮＡ）は、当業者に既知の、任意の多数の方法により検出及び定量化される。核酸の検出は、サザン解析、ノーザン解析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射線標識、シンチレーションカウンタ、及び親和性クロマトグラフィーにより進められてよい。分光測光法、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び超拡散クロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の、更なる生化学的分析方法もまた、使用してよい。
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は決定的に重要ではない。種々の核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に知られている。例えば、一般的な形式としてはサンドイッチアッセイ及び競合または置換アッセイが挙げられる。ハイブリダイゼーション一般には一般的に、例えば“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載されている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感受性は、検出される標的拡散を増やす拡散増幅システムの使用により高めてもよい。分子プローブとしての使用するための増幅技術、または後続のサブクローニング用核酸断片の作製に好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技術が知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼが仲立ちする技術（例えばＮＡＳＢＡ（商標））を含む、かかるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅により当業者を指示するのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、及び米国特許番号４，６８３，２０２、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，１９９０），Ｃ＆ＥＮ ３６；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）；Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）；Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）、及びＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅させた核酸の、向上したクローニング技術は米国特許番号５，４２６，０３９に記載されている。当該技術分野において記載されている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＱβ−レプリカーゼシステムである。これらのシステムは、変異を直接同定するのに使用することができ、選択した配列が存在する場合のみに、ＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが伸長または連結するように設計されている。あるいは、例えば非特異的ＰＣＲプライマー、及び変異を示す特異的な配列に対して後でプローブされる増幅標的部位を用いて、選択配列を一般的に増幅することができる。上述した参考文献の開示は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
例えば遺伝子プローブ、または阻害成分として使用するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法において、プローブとして使用する核酸は通常、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９ １８６２（１９８１）により記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載されている自動合成機を使用して、化学的に合成される。必要であれば、ポリヌクレオチドの精製は通常、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７ １４９（１９８３）に記載されているアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学分解法を使用して確認することができる。
転写レベルを測定する代わりの方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションである。Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に概要が記載されている。Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションでは、細胞が固体の支持体、典型的にはスライドガラスに固定される。ＤＮＡがプローブされるのであれば、細胞は熱またはアルカリで変性する。次いで、細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識された特異的プロ−ブをアニーリングすることができる。プローブは放射性同位体または蛍光性レポーターにより標識するのが好ましい。
本発明は、特定の実施例により更に詳細に記載される。以下の実施例は例証の目的のために提供されており、本発明をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。当業者は、変更または修正可能で、実質的な同一結果を得ることができる種々の重大でないパラメータを容易に理解するであろう。
実施例１
本実施例は、マウスでのルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現について記載する。ｍＲＮＡは、マウスに注入された核酸−脂質粒子（ＬＮＰと呼ばれる）の中に封入された。
ＬＮＰの調製
本実施例で報告された実験には、それぞれウリジンとシチジンを置換したプソイドウリジンと５−メチルシチジンで完全に修飾した、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを使用した。ｍＲＮＡはＬＮＰ中に、脂質対薬剤の比が１３：１で、脂質と共に配合された。これらの研究で用いたＬＮＰ製剤は以下の脂質組成物を有した：ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡまたはＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＳＡ）（１．６ ｍｏｌ％）、ジリノレイルメトキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１−Ｂ１１）（５４．６ｍｏｌ％）、コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）。Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３，３６２−３７２（２００５）から適合させた方法を用いて、ＬＮＰを３．５ｍｇ（ｍＲＮＡ）スケールで調製した。次いで、タンジェンシャル限外濾過（ＴＦＵ）により、緩衝液の交換を行った。ＬＮＰを約５ｍＬに濃縮した後、６０ｍＬのＰＢＳ（１２回の洗浄体積）に対して透析濾過した。ＬＮＰを、約３ｍＬまで更に濃縮して排出し、滅菌濾過した。ＬＮＰの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを使用して測定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して粒径及び多分散度を測定した。
Ｉｎ ｖｉｖｏプロトコール
本明細書で報告される実験では、２匹のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルを使用して、ＬＮＰの静脈内注射の後、組織でのルシフェラーゼの発現を示した。肝臓モデル（１．６：５５（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）ＬＮＰの分析用）には、ナイーブなメスＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。遠位の皮下腫瘍モデル（１．６：５５（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＳＡ）ＬＮＰの分析用）には、Ｈｅｐ３Ｂ細胞と共に後側腹部で接種したメスのスキッド／ベージュマウスを使用した。
肝臓モデルでは、ＬＮＰをナイーブＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。注射の６時間後、マウスを安楽死させて肝臓を取り出し、重さを量り、氷上の溶解マトリックスチューブ（セラミックビーズを１つ含有）上に配置した。
皮下腫瘍モデルでは、スキッドマウス（Ｎ＝４）を、後側腹部で３×１０６個のＨｅｐ３Ｂ細胞と皮下接種させた。約２０日後、ＬＮＰを１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。２、４、６、８、１６、２４、及び４８時間の時点でマウスを安楽死させ、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、及び腫瘍を取り出して重さを量り、氷上の溶解マトリックスチューブ（セラミックビーズを１つ含有）上に配置した。
両方のモデルにおいて、ルシフェラーゼアッセイにおいて組織のホモジェネ−トが原因となるルシフェラーゼ活性をクエンチするバックグラウンドレベルを測定するためにＰＢＳ処置群を含めた。収集後、これらのＰＢＳ処置した動物の組織に、１倍のＣＣＬＲ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）中のルシフェラーゼ溶液１００ｎｇ／ｍＬ（５０μＬ）をスパイクした。全ての場合において、ルシフェラーゼアッセイを実施するまで組織を−８０℃で保管した。
ルシフェラーゼアッセイの手順
サンプル処理手順は全て、氷上で実施した。組織を均質化し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管内で１０分間、４℃にて３０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。遠心分離後、２０μＬのホモジェネ−トを白色９６ウェルルミノメータープレート中に２つに分取した。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ホタルルシフェラーゼ蛍光をＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ上で分析した。ウェル内のルシフェラーゼ活性は、ホモジェネ−トに対して得られた相対発光量（ＲＬＵ）を、２０μＬのホタルルシフェラーゼから作製した検量線と比較することにより決定した。ホモジェネ−トからの自然クエンチを調節するために、クエンチ係数を各組織に付与した。これは、ルシフェラーゼをスパイクしたＰＢＳ処理したマウスの組織を用いて測定した。
結果
表１は、ルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰを注射した６時間後の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの種々の組織でのルシフェラーゼ活性を示す。発現は肝臓及び脾臓で最大であったことを、結果は示している。
表２及び３は、ルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰを注射してから種々の時間の後、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を接種したスキッドマウスの様々な組織におけるルシフェラーゼの発現を示す。結果は、最初、ルシフェラーゼの発現は肝臓、脾臓及びＨｅｐ３Ｂ腫瘍で最大であるが、４８時間後には、最大の発現はＨｅｐ３Ｂ腫瘍で見られたことを示している。
実施例２
一般的な手順
ＬＮＰの調製：
本実施例２に記載される実験では、それぞれウリジンとシチジンを置換したプソイドウリジンと５−メチルシチジンで完全に修飾した、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（「ｍＬｕｃ」）を使用した。これらの研究で使用したＬＮＰ製剤は、以下の一般的な脂質組成（モル比）を有する：ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）（１．６ｍｏｌ％）、適切なアミノ脂質（５４．６ｍｏｌ％）；コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）。脂質のストックは、エタノール中に溶解させた適切な脂質（１２．６ｍＭ）で調製した。ｍＬｕｃのストックは、４０ｍＭのＥＤＴＡ中で０．３６６ｍｇ／ｍＬとなるように、４０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中で作製した。２つのストックを、Ｊｅｆｆｓらの方法（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５），２２（３），３６２−３７２頁）を使用して組み合わせ、Ｔ字コネクタ内でブレンドし、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液に入れ希釈した。次いで、１０倍体積のＰＢＳに対して一晩バッグ透析により、緩衝液の交換を行った。透析後、ＬＮＰをＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＶｉｖａｓｐｉｎ−６またはＶｉｖａｓｐｉｎ−２０ユニット（ＭＷＣＯ １００ｋ）で遠心分離することにより濃縮した。次いで、ＬＮＰを滅菌濾過した（０．２μｍ膜）。ＬＮＰの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを使用して測定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して粒径及び多分散度を測定した。
Ｉｎ ｖｉｖｏプロトコール（ルシフェラーゼ肝臓モデル）
ルシフェラーゼｍＲＮＡペイロードを含有するＬＮＰを、ナイーブＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝３）に０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。注射の６時間後、マウスを安楽死させて肝臓を取り出し、重さを量って氷上の溶解マトリックスチューブ（セラミックビーズを１つ含有）上に配置した。ルシフェラーゼアッセイにおいて組織のホモジェネ−トが原因となる、ルシフェラーゼ活性をクエンチするバックグラウンドレベルを測定するために、ＰＢＳ処理群を含めた。収集後、これらのＰＢＳ処理した動物の組織に、１倍のＣＣＬＲ（細胞培養物溶解試薬）中のルシフェラーゼ溶液１００ｎｇ／ｍＬ（５０μＬ）をスパイクした。ルシフェラーゼアッセイを実施するまで、組織を−８０℃で保管した。
ルシフェラーゼアッセイの手順
試料処理手順は全て、氷上で実施した。組織を均質化し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管内で３０００ｒｐｍ、及び４℃で１０分間遠心分離にかけた。遠心分離後、２０μＬのホモジェネ−トを白色９６ウェルルミノメータープレート中に２つに分取した。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ホタルルシフェラーゼ蛍光をＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ上で分析した。ウェル内のルシフェラーゼ活性は、ホモジェネ−トに対して得られたＲＬＵを、２０μのホタルルシフェラーゼから作製した検量線と比較することにより測定した。ホモジェネ−トからの自然クエンチを調節するために、クエンチ係数を各組織に付与した。これは、ルシフェラーゼをスパイクしたＰＢＳ処理したマウスの組織を用いて測定した。
相対的な製剤可能性及び効力
製剤可能性
ｍＲＮＡ製剤における製剤可能性及び効力などのパラメータにおける、アミノ脂質の選択の効果を調査した。ベンチマークとして、ジリノレイル脂質５、６、７、及び８を選択した。これらの脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの肝臓への送達を仲立ちするのに大変効果的であることが示されている。これらの構造の共通した特徴は、これらは全て、疎水性ドメインとして２つのリノレイル鎖（２つのｃｉｓ二重結合を有する１８個の炭素）を有するということである。また，複数（３または４）個のアルキル鎖からなる疎水性ドメインを有する、様々な脂質；１０、９、１１、１３、１４、１７、及び１８も選択した。１２．６ｍＭのストックを使用し、上述の通り製剤を調製した。基本的な物理化学的性質決定データを表４に示す。表中、Ｚａｖｇは平均脂質粒径であり、ＰＤＩは、脂質粒径の分布を測定した多分散指数である（低いＰＤＩ値は、粒子が一層均一に集合していることを示す）、及び、封入割合（％）は脂質粒子内に封入されたＲＮＡの量を測定した、封入割合である（封入割合の値が高ければ、より多くのｍＲＮＡが封入されていることを示す）。
「複数のアルキル鎖」（即ち３個以上）のアミノ脂質（例えば１３）は、ベンチマークのリノレイル脂質（５、６、７、及び８）よりも大変良好なｍＲＮＡペイロードを配合することが見出されたことは、注目に値する。特に、短いアルキル鎖を有する複数アルキル鎖の脂質は、小さな粒径、良好な封入のいずれか、またはそれら両方を有する製剤を作り出した。
良好な封入は、様々な理由のために有利であり、すなわち一層効率的なプロセスは費用対効果が一層高く、ペイロードを更に完全に保護し、血液成分とペイロードの不必要な相互作用を避けることができ、一層均質／再現可能であり、そのため、薬剤製品としての使用にはるかに適切である。
小さな粒径は、いくつかの理由のためｉｎ ｖｉｖｏ用途に重要である。まず、ＬＮＰは多くの場合「向上した浸透及び保持」効果に依存するため、標的組織内での受動的な蓄積は、局部血管系の小孔を貫通する粒子により仲立ちされる。ヒトの肝臓での孔は１０７±１．５ｎｍであり、マウスでは１４１±１．５ｎｍであると報告されている。そのため、より小さい粒子の形成は肝臓での浸透及び蓄積を向上させ、最終的に一層効果的な製剤を作製するはずである。更に、より大きなリポソーム製剤は、血液から容易に取り除かれ、免疫を刺激する可能性を有することが知られている。
肝臓の活性結果
記載された種々の製剤はまた、マウス肝臓モデルでも効力を評価した。更なる対照として、市販されている送達試薬ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）の使用も、ｍＲＮＡの送達に関する文献で記載されている。ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ複合体の０．０５ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の通り調製した。ｍＬあたりｍＲＮＡが１ｍｇである溶液５０μｇに、８６０μＬのＤＭＥＭを添加し、この溶液にＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡキット（Ｍｉｒｕｓ）からの試薬を加えた。順番に、３５μＬのｍＲＮＡ Ｂｏｏｓｔ試薬、続いて５５μＬのＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ試薬を添加した。次いで、静脈内または腹腔内投与の前に、最終溶液を２〜５分間培養した。
全ての製剤を、全ｍＲＮＡが０．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。Ｋａｒｉｋｏらにより示されているように、ＴｒａｎｓＩＴ製剤を追加で腹腔内投与した。表５に示す通り、複数の短いアルキルドメインを有するアミノ脂質を含有する製剤（例えば１３−Ｂ４３）は、ベンチマークのリノレイルアルキルドメインを有するものよりも、はっきりと効果的であった。良好な封入、適切なｐＫａ（通常は６．１〜６．３）、及び疎水性ドメインにより多くの二重結合を有するものが、最も効果的な脂質であったことは注目に値した。
Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡
以下のＬＮＰ製剤を使用して、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭを使用して調査した核酸−脂質粒子を調製した：ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）（１．６ｍｏｌ％）、１３−Ｂ４３脂質（５４．６ｍｏｌ％）、コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）。上述の一般的な手順を用いて、０．９５ｍｇ（ｍＲＮＡ）スケールでＬＮＰを調製した。脂質のストックをエタノール（全脂質１２．６Ｍ）中で調製した。ｍＲＮＡのストックは４０ｍＭのＥＤＴＡ中で０．３６６ｍｇ／ｍＬで調製した。２つのストックを４．９ｍＬのＰＢＳ中で混合希釈した。次いで、１０倍体積のＰＢＳに対して一晩バッグ透析により、緩衝液の交換を行った。次いで、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＶｉｖａｓｐｉｎ−２０ユニット（ＭＷＣＯ １００ｋ）の遠心分離により、サンプル１ｍＬあたりのｍＲＮＡを約１ｍｇに濃縮した。次いで、ＬＮＰを滅菌濾過した。ＬＮＰの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを使用して測定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して粒径及び多分散度を測定した。
前述の段落での教示に従って調製した核酸−脂質粒子を、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）により可視化した。分析は、Ｚｅｉｓｓ ＥＭ ９０２Ａを使用してウプサラ大学（スウェーデン）で行った。使用の前に、サンプルを２０〜３０分間、人工気候室（２５℃、湿度９８％）でインキュベーションした。次いで、サンプル溶液（０．５μＬ）を銅グリッドに配置し、ブロッティングにより超過分を除去し、サンプルを液体エタン内でガラス状にした。合計倍率が１０万の画像を捕捉し、粒子の直径寸法を数平均により計算した。本特許出願の図１は、脂質粒子の典型的なＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示す。
脂質粒子製剤の再現性
２つのアミノ脂質を選択し、脂質粒子製剤の再現性を調査した。ベンチマークのジリノレイルアミノ脂質ＭＣ３を、短いトリアルキル脂質１３−Ｂ４３と比較した。
以下の組成（モル百分率として表示）を用いて、複数の製剤を作製した：ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）（１．６ｍｏｌ％）、アミノ脂質（５４．６ｍｏｌ％）、コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）。（上記一般的な手順に従う）。脂質のストックを、エタノール（全脂質の８．３〜１９．０ｍＭの範囲で変動）中で調製した。ｍＲＮＡのストックは４０ｍＭのＥＤＴＡ中で０．３６６ｍｇ／ｍＬで調製した。次いで、１０倍体積のＰＢＳに対して一晩バッグ透析により、緩衝液の交換を行った。次いで、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＶｉｖａｓｐｉｎ−２０ユニット（ＭＷＣＯ １００ｋ）の遠心分離により、サンプルを、１ｍＬあたりのｍＲＮＡ約１ｍｇに濃縮した。次いで、ＬＮＰを滅菌濾過した。ＬＮＰの濃度を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを使用して測定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して粒径及び多分散度を測定した。
表６及び７にて示すように、化合物１３の粒子（表６）は、化合物７で作製した粒子（表７）よりも一貫して小さく、良好な封入を示した。
本明細書で使用するＰＥＧ脂質、及びいくつかの更なるアミノ脂質の構造を以下に示す。
ＰＥＧ脂質
カチオン性脂質
（Ｚ）−９−ヘキシリコス−１４−エン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート１７
（４Ｚ，１４Ｚ）−８，１１−ジ（（Ｚ）−ヘプタ−３−エニル）オクタデカ−４，１４−ジエン−９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート１８
（６Ｚ，９Ｚ，２９Ｚ，３２Ｚ）−２０−ヒドロキシ−２０−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）オクタトリアコンタ−６，９，２９，３２−テトラエン−１９−イル５−（エチル（メチル）アミノ）ペンタノエート１０
実施例３ カチオン性脂質の調製（１１１）
（３Ｚ，１３Ｚ）−７−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）−１０−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ノナデカ−３，１３−ジエン−９−オル（１１０、７００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）を、５−ブロモ吉草酸（３９０ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４１３ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１０ｍｇ）で順次処理し、攪拌した（３０℃で１８時間）。溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄して乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮した。粗物質を、密閉した容器内のエタノール中のジメチルアミン（２Ｍ溶液として１０ｍＬ）に入れ、加熱した（８０℃で５時間）。終了すると、溶液を濃縮し、粗物質をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）に通して１１１（２９４ｍｇ、２２％）を淡黄色の油として得た。１ＨＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， δＨ） ５．５４−５．２８ （ｍ， ８ Ｈ）， ５．１５−５．０５ （ｍ，１ Ｈ）， ２．２７−２．２２ （ｍ， ４ Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ６ Ｈ）， ２．１０−１．９６ （ｍ， １６ Ｈ）， １．７１−１．４４ （ｍ， ９ Ｈ），１．４３−１．２５ （２３ Ｈ）， ０．９５ （ｔ， ６ Ｈ）， ０．８７ （ｔ， ６ Ｈ）。
中間体化合物（３Ｚ，１３Ｚ）−７−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）−１０−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ノナデカ−３，１３−ジエン−９−オール（１１０）を下記の通り調製した。
ａ．（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１０２）の合成
ｃｉｓ−３−ヘキセン−１−オール１０１（１２．９ｇ、１２９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３００ｍＬ）に、トリエチルアミン（５０ｍＬ）を添加した。溶液を０℃まで冷却し、メタンスルホニルクロリド（２０ｍＬ、２５８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１．５時間室温で攪拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで水層をジクロロメタンで逆抽出した。合一させた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して減圧下で濃縮し、乾燥させた。残留物をシリカパッド（ＤＣＭ１００％）に通して濾過し、（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１０２）を淡黄色の粗油（２２．６ｇ、９８％）として得た。Ｒｆ０．７（ＣＨ２Ｃｌ２）。
ｂ．（Ｚ）−１−ブロモヘキサ−３−エン（１０３）の合成
（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イルメタンスルホネート２（２２．６ｇ、１２７ｍｍｏｌ）の２−メチルテトラヒドロフラン溶液（３００ｍＬ）を８０℃まで加熱した後、テトラブチルアンモニウムブロミド（５３．１ｇ、１６５ｍｍｏｌ）で処理した。攪拌後（４０分）、混合物を２０℃まで冷却して氷水で洗浄した。水槽をＥｔＯＡｃで逆抽出し（３回）、合一させた有機物質をブラインで洗浄して乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮した。粗生成物をシリカパッドに通して濾過し、ヘキサンですすいだ後、濃縮して（Ｚ）−１−ブロモヘキサ−３−エン（１０３）（２０ｇ、９７％）を黄色油として得た。Ｒｆ（０．８、ヘキサン）。
ｃ．（３Ｚ，１０Ｚ）−トリデカ−３，１０−ジエン−７−オール（１０４）の合成
マグネシウムくず（１．８２ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン懸濁液（１０ｍＬ）を窒素下で、（Ｚ）−１−ブロモヘキサ−３−エン１０３（１１．４ｇ、６９．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５ｍＬ）で処理した。反応物を２時間、４５℃で反応させた。次いで、溶液を５〜１０℃まで冷却し、ギ酸エチル（５．８ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５ｍＬ）を滴加した。溶液を室温にて１５分間攪拌し、その後５℃まで冷却した後水（３０ｍＬ）でクエンチし、続いて６Ｍの塩酸（３０ｍＬ）をゆっくりと添加した。マグネシウムが全て溶解するまで、溶液を室温で攪拌した後、ヘキサン（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）で処理した。合一させたヘキサン抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮し、乾燥させた。残留物をエタノール（４５ｍＬ）中に溶解させた後、水酸化カリウム（３．５３ｇ、６２．９モル）の水溶液（１５ｍＬ）を添加した。溶液を室温で５分間激しく攪拌した後、減圧下で濃縮してエタノールを除去した。６ＭのＨＣｌ（４０ｍＬ）で溶液を酸性にし、水（４０ｍＬ）を添加してＫＣｌを溶解させた後、ヘキサンで抽出した。合一させたヘキサン抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮し、乾燥させた。生成物をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサンから、ヘキサン中の５％酢酸エチル）により精製し、（３Ｚ，１０Ｚ）−トリデカ−３，１０−ジエン−７−オール（１０４）を淡黄色の油（４．７５ｇ、６５％）として得た。Ｒｆ０．４（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
ｄ．（３Ｚ，１０Ｚ）−トリデカ−３，１０−ジエン−７−イルメタンスルホネート１０５の合成
トリエチルアミン（２０ｍＬ）を含む、アルコール１０４（４．７５ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）を０℃まで冷却し、メタンスルホニルクロリド（３．５ｍＬ、４５．３ｍｍｏｌ）で処理した。溶液を室温で１時間攪拌した後、飽和重炭酸ナトリウム及び水：ブライン（１：１）で洗浄した。次いで、有機物質を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）て濾過し、濃縮して乾燥させた。粗残留物をシリカパッド（ＣＨ２Ｃｌ２）に通して濾過し、（３Ｚ，１０Ｚ）−トリデカ−３，１０−ジエン−７−イルメタンスルホネート（１０５）（５．９５ｇ、９１％）を得た。Ｒｆ０．９（ＣＨ２Ｃｌ２）。
ｅ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エンニトリル（１０６）の合成
メシレート１０５（５．９５ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１２５ｍＬ）を、粉末状シアン化ナトリウム（２．５３ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）で処理し、６０℃で一晩攪拌した。反応混合物を２０℃まで冷却し、水で処理して過剰なＮａＣＮを溶解させ、３０分間攪拌した。次いで、ブライン及びＥｔＯＡｃを添加して、溶液を２層に分けた。水層をＥｔＯＡｃで逆抽出し、合一させた有機物質をブラインで洗浄し（３回）、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）て濾過し、濃縮した。粗残留物をシリカパッドに通して濾過し、ヘキサン：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）ですすいで、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エンニトリル（１０６）（３．１１ｇ、６９％）を得た。Ｒｆ０．５（１：１ヘキサン：ＣＨ２Ｃｌ２）。
ｆ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エン−１−オール（１０７）の合成
ニトリル１０６（３．１１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（８０ｍＬ）を−８℃まで冷却し、ＤＩＢＡＬ（２８．３ｍＬ、２８．３ｍｍｏｌ；ＣＨ２Ｃｌ２の１Ｍ溶液として）でゆっくりと処理した。攪拌後（２時間）、５％ＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加することで反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出して濃縮した。残留物をメタノール（８０ｍＬ）に入れて冷却し（０℃）、ＮａＢＨ４（１．０７ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）で処理した。攪拌後（３０分）、５％ＨＣｌを添加することにより反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機物質を水及びブラインで洗浄して乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮した。粗物質をクロマトグラフィー（ヘキサン→５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製し、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エン−１−オール（１０７）（２．８ｇ、８８％）を得た。Ｒｆ０．７５（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
ｇ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エン−１−イルメタンスルホネート（１０８）の合成
１０７（２．８ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）に、トリエチルアミン（５ｍＬ）を添加した。溶液を０℃まで冷却し、メタンスルホニルクロリド（１．９３ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１．５時間室温で攪拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで水層をジクロロメタンで逆抽出した。合一させた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して減圧下で濃縮し、乾燥させた。残留物をシリカパッド（ＤＣＭ１００％）に通して濾過し、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）オクト−５−エン−１−イルメタンスルホネート（１０８）を淡黄色の粗油（３．６ｇ、９５％）として得た。Ｒｆ０．７５（ＣＨ２Ｃｌ２）。
ｈ．（３Ｚ，１０Ｚ）−７−（ブロモメチル）トリデカ−３，１０−ジエン（１０９）の合成
１０８の２−メチルテトラヒドロフラン溶液（３０ｍＬ）を８０℃まで加熱し、次いでテトラブチルアンモニウムブロミド（５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）で処理した。攪拌後（４０分）、混合物を２０℃まで冷却して氷水で洗浄した。水槽をＥｔＯＡｃで逆抽出し（３回）、合一させた有機物質をブラインで洗浄して乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過して濃縮した。粗生成物をシリカパッドに通して濾過し、ヘキサンで洗い流した後、濃縮して（３Ｚ，１０Ｚ）−７−（ブロモメチル）トリデカ−３，１０−ジエン（１０９）（２．１３ｇ、６２％）を得た。Ｒｆ（０．８、ヘキサン）。
ｉ．（３Ｚ，１３Ｚ）−７−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）−１０−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ノナデカ−３，１３−ジエン−９−オール（１１０）の合成
マグネシウム（１９３ｍｇ、７．９４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）中の混合物を、ブロミド（１０９）（２．１３ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４ｍＬ）で処理し、加熱した（４５℃、４時間）。次いで、グリニャール試薬を冷却し（２０℃）、アルデヒド（１１８、４．６５ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）で処理した。攪拌後（２時間）、混合物を冷却し（５℃）、水（５ｍＬ）、次いで６ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）を添加してクエンチし、過剰のマグネシウムが消費されるまで攪拌し、その後ヘキサンと水で抽出した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）て濾過し、濃縮してクロマトグラフィー（ヘキサン→２％→５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製して、（３Ｚ，１３Ｚ）−７−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）−１０−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ノナデカ−３，１３−ジエン−９−オール（１１０）（７００ｍｇ、１９％）を得た。Ｒｆ０．６（１０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）。
中間体化合物（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エナール（１１８）を図示及び以下に示す通りに調製した。
ｊ．（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１１３）の合成。化合物１０２と同様の方法で、Ｚ−ノナ−３−エン−１−オール（６５．５ｇ、４６１ｍｍｏｌ）、メタンスルホニルクロリド（３９ｍＬ、５０７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（７８ｍＬ、５７６ｍｍｏｌ）から化合物１１３を調製した。
ｋ．（Ｚ）−１−ブロモノナ−３−エン（１１４）の合成。化合物１０３と同様の方法で、（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１０１ｇ、４５９ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＢ（１８３ｇ、５６９ｍｍｏｌ）から化合物１１４を調製した。１４の収率（９２ｇ、９７％）。
ｌ．（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−オール（１１５）の合成。化合物１０４と同様の方法で、（Ｚ）−１−ブロモノナ−３−エン（１４）（４５ｇ、２１９．５ｍｍｏｌ）、マグネシウム（５．９ｇ、２４１．５ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（１７．１ｇ、２３０．５ｍｍｏｌ）及び水酸化カリウム（１７．１ｇ、２３０．５ｍｍｏｌ）から化合物１１５を調製した。収率（１１．２ｇ、３７％）。
ｍ．（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−イルメタンスルホネート（１１６）の合成。化合物１０５と同様の方法で、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−オール（１１．２ｇ、４０ｍｍｏｌ）、メタンスルホニルクロリド（３．４ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（８．７ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）から化合物１１６を調製した。収率（１４．４ｇ、定量）。
ｎ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エンニトリル（１１７）の合成。化合物１０６と同様の方法で、（６Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−６，１３−ジエン−１０−イルメタンスルホネート（１４．４ｇ、４０ｍｍｏｌ）及びシアン化カリウム（６．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）から化合物１１６を調製した。収率（１０ｇ、８７）。
ｏ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ノナ−３−エン−１−イル）ウンデカ−５−エナール（１１８）の合成。ニトリル１１７（１０ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３５０ｍＬ）を−８℃まで冷却し、ＤＩＢＡＬ（８６．３ｍＬ、８６．３ｍｍｏｌ；ＣＨ２Ｃｌ２の１Ｍ溶液として）でゆっくりと処理した。攪拌後（２時間）、５％ＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加することで反応をクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出して濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（２％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）に通して、化合物１１８（５．１ｇ、５０％）を得た。
実施例４
（３Ｚ，１３Ｚ）−１０−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）−７−（（Ｚ）−ヘキサ−３−エン−１−イル）ヘプタデカ−３，１３−ジエン−９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート（１３０）の調製
化合物１１１と同様の方法で、（４Ｚ，１４Ｚ）−８，１１−ジ（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）オクタデカ−４，１４−ジエン−９−オール（１２９）（２２３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、５−ブロモ吉草酸（２６４ｍｇ、１４．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２７９ｍｇ、１４．６ｍｍｏｌ）、次いでジメチルアミンより、化合物１３０を調製した。化合物１３０の収率（１３８ｍｇ、５１％、２ステップ）。１ＨＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， δＨ） ５．４１−５．２９ （ｍ， ８ Ｈ）， ５．１３−５．０７（ｍ， １ Ｈ）， ２．３８−２．２４ ９Ｍ， ４ ｈ）， ２．２２ （ｓ， ６ Ｈ）， ２．１４−１．９３ （ｍ， １６ Ｈ）， １．６７−１．４５ （ｍ，６ Ｈ）， １．４５−１．２３ （ｍ， １９ Ｈ）， ０．９２ （ｔ， ６ Ｈ））。
中間体（４Ｚ，１４Ｚ）−８，１１−ジ（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）オクタデカ−４，１４−ジエン−９−オール（１２９）を以下に記載する通りに調製した。
ａ．（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１２０）の合成。化合物１０２と同様の方法で、Ｚ−３−ヘプテン−１−オール（５２ｇ、４５５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８０ｍＬ）及びメタンスルホニルクロリド（７０．５ｍＬ、９１１ｍｍｏｌ）から化合物１２０を調製した。収率（８７．４ｇ、定量）。
ｂ．（Ｚ）−１−ブロモヘプタ−３−エン（２１）の合成。化合物１０３と同様の方法で、（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イルメタンスルホネート（１２０）及びＴＢＡＢ（１９０．７ｇ、５９２ｍｍｏｌ）から化合物１２１を調製した。収率（６０．９ｇ、７６％）。
ｃ．（４Ｚ，１１Ｚ）−ペンタデカ−４，１１−ジエン−８−オール（１２２）の合成。化合物１０４と同様の方法で、（Ｚ）−１−ブロモヘプタ−３−エン（２２ｇ、１２４ｍｍｏｌ）、マグネシウム（３．２３ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（１０．３ｍＬ、１２８ｍｍｏｌ）及び水酸化カリウム（６．２８ｇ、１１２ｍｍｏｌ）から化合物１２２を調製した。化合物１２２の収率（１１．８３ｇ、８５％）。
ｄ．（４Ｚ，１１Ｚ）−ペンタデカ−４，１１−ジエン−８−イルメタンスルホネート（１２３）の合成。化合物１０５と同様の方法で、（４Ｚ，１１Ｚ）−ペンタデカ−４，１１−ジエン−８−オール（１１．８ｇ、５０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５ｍＬ）及びメタンスルホニルクロリド（７．７ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）から化合物１２３を調製した。化合物１２３の収率（１５．１ｇ、定量）。
ｅ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エンニトリル（１２４）の合成。化合物１０６と同様の方法で、（４Ｚ，１１Ｚ）−ペンタデカ−４，１１−ジエン−８−イルメタンスルホネート（１２３）（１５．１ｇ、５０ｍｍｏｌ）及びシアン化ナトリウム（６．４ｇ、１３０ｍｍｏｌ）から化合物１２４を調製した。化合物１２４の収率（９．８７ｇ、８５％）。
ｆ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エン−１−オール（１２５）の合成。化合物１０７と同様の方法で、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エンニトリル（１２４）（９．８７ｇ、４２ｍｍｏｌ）、ＤＩＢＡＬ（８５ｍＬ、８５ｍｍｏｌ）、またＮａＢＨ４（３．２ｇ、８５ｍｍｏｌ）から化合物１２５を調製した。化合物１２５の収率（６ｇ、６０％）。
ｇ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エン−１−イルメタンスルホネート（１２６）の合成。化合物１０８と同様の方法で、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エン−１−オール（１２５）（６ｇ、２５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０ｍＬ）及びメタンスルホニルクロリド（３．９ｍＬ、５０．３ｍｍｏｌ）から化合物１２６を調製した。化合物１２６の収率（７．８ｇ、９７％）。
ｈ．（４Ｚ，１１Ｚ）−８−（ブロモメチル）ペンタデカ−４，１１−ジエン（１２７）化合物の合成。１０９と同様の方法で、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エン−１−イルメタンスルホネート（１２６）（７．８ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＢ（１０．３ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）から化合物１２７を調製した。化合物１２７の収率（７ｇ、９５％）。
ｉ．（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エナール（１２８）の合成。化合物１１８と同様の方法で、（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エンニトリル（１２４）（８．６ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＢＡＬ（４４．２ｍＬ、４４．２ｍｍｏｌ）から化合物１２８を調製した。化合物１２８の収率（５．８ｇ、６７％）。
ｊ．（４Ｚ，１４Ｚ）−８，１１−ジ（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）オクタデカ−４，１４−ジエン−９−オール（１２９）の合成。化合物１１０と同様の方法で、（４Ｚ，１１Ｚ）−８−（ブロモメチル）ペンタデカ−４，１１−ジエンン（３．８ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）、マグネシウム及び（Ｚ）−２−（（Ｚ）−ヘプタ−３−エン−１−イル）ノナ−５−エナール（１２８）（６４２ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）から化合物１２９を調製した。化合物１２９の収率（２２３ｍｇ、１８％）。
実施例５
９，１３−ジヘキルヘニコサン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート（１３５）の調製
化合物１１１と同様の方法で、９，１３−ジヘキルヘニコサン−１１−オール（１３４）（１．６ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、５−ブロモ吉草酸（１．８１ｇ、９．９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１．９２ｇ、９．９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．７４ｍＬ、９．９ｍｍｏｌ）、次いでジメチルアミンのエタノール溶液（８ｍＬ）から、化合物１３５を調製した。収率（１．３ｇ、６５％）。１ＨＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， δＨ） ５．０８−５．００ （ｍ， １ Ｈ）， ２．３４−２．２３ （ｍ，４ Ｈ）， ２．２４ （ｓ， ６ Ｈ）， １．６８−１．５９ （ｍ， ４ Ｈ）， １．５４−１．４４ （ｍ， ４ Ｈ）， １．４０−１．１６ （ｍ， ５４ Ｈ），０．８７ （ｔ， １２ Ｈ）。
中間体９，１３−ジヘキルヘニコサン−１１−オール１３４は、以下の通りに調製した。
ａ．２−ヘキシルデシルメタンスルホネート（１３２）の合成化合物１０２と同様の方法で、２−ヘキシルデカン−１−オール（１０ｇ、４１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（６．４ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）、及びメタンスルホニルクロリド（６．３５ｍＬ、８２ｍｍｏｌ）から化合物１３２を調製した。収率（１３ｇ、定量）。
ｂ．７−（ブロモメチル）ペンタデカン（１３３）の合成。化合物１０３と同様の方法で、２−ヘキシルデシルメタンスルホネート（１３．１ｇ、４１ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＢ（１７．２ｇ、５３．３ｍｍｏｌ）から化合物１３３を調製した。収率（１１．９ｇ、９５％）。
ｃ．９，１３−ジヘキルヘニコサン−１１−オール（１３４）の合成。化合物１０４と同様の方法で、７−（ブロモメチル）ペンタデカン化合物（１３３）（１１．９ｇ、３９ｍｍｏｌ）、マグネシウム（１．０５ｇ、４３ｍｍｏｌ）、ギ酸エチル（３．３ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）及び水酸化カリウム（１．９８ｇ、３５ｍｍｏｌ）から、化合物１３４を調製した。収率（６．１ｇ、６７％）。
実施例６
９，１３−ジヘキシルヘニコサン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート（１３７）の調製
化合物１１１と同様の方法で、９，１３−ジヘキルヘニコサン−１１−オール（３４）（１．６ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、６−ブロモカプロン酸（１．９５ｇ、９．９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１．９２ｇ、９．９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．７４ｍＬ、９．９ｍｍｏｌ）、次いでジメチルアミンのエタノール溶液（８ｍＬ）から、１３７を調製した。収率（１．２ｇ、５９％）。１ＨＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， δＨ） ５．０８−５．００ （ｍ， １ Ｈ）， ２．３０−２．２３ （ｍ，４ Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ６ Ｈ）， １．６８−１．５９ （ｍ， ４ Ｈ）， １．５７−１．４３ （ｍ， ４ Ｈ）， １．３９−１．１５（ｍ， ５６ Ｈ）， ０．８７ （ｔ， １２ Ｈ）。
実施例７
（Ｚ）−７−ブチル−１０−（（Ｚ）−１０−４−エン−１−イル）イコサ−１４−エン−９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート（１４３）の調製
化合物１１１と同様の方法で、（Ｚ）−７−ブチル−１０−（（Ｚ）−１０−４−エン−１−イル）イコサ−１４−エン−９−オール（１４２、１３２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（１３６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１５５ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２００μＬ）から、化合物１４３を調製した。収率（１００ｍｇ、５８％）。
中間体（Ｚ）−７−ブチル−１０−（（Ｚ）−１０−４−エン−１−イル）イコサ−１４−エン−９−オール（１４２）を、以下に記載の通りに調製した。
ａ．２−ブチルオクチルメタンスルホネート（１３９）の合成。化合物１０２と同様の方法で、２−ブチルオクタン−１−オール（１３８）（３ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８ｍＬ）、メタンスルホニルクロリド（２．４９ｍＬ、３２．２ｍｍｏｌ）から化合物１３９を調製した。収率（４．２ｇ、９９％）。
ｂ．５−（ブロモメチル）ウンデカン（１４０）の合成。化合物１０３と同様の方法で、２−ブチルオクチルメタンスルホネート（１３９）（４．２ｇ、１６ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＢ（６．７５ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）から化合物１４０を調製した。収率（３．６７ｇ、９２％）。
ｃ．（Ｚ）−７−ブチル−１０−（（Ｚ）−１０−４−エン−１−イル）イコサ−１４−エン−９−オール（１４２）の合成化合物１１０と同様の方法で、５−（ブロモメチル）ウンデカン１４０（３．６７ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び（Ｚ）−２−（（Ｚ）−１０−４−エン−１−イル）ドデカ−６−エナール（１４１）（１．６ｇ、５ｍｍｏｌ）から化合物１４２を調製した。収率（１３２ｍｇ、５％）。
実施例８
表８のデータは、実施例１に記載したアッセイで利用した場合に、代表的なテトラアルキル脂質を含む粒子は、ジアルキル脂質化合物８を含む粒子よりも大きなルシフェラーゼ活性を付与することを示している。特に、テトラアルキル脂質は、表８に示す確立したベンチマークのジアルキル脂質８よりも向上した量のルシフェラーゼｍＲＮＡの、生細胞への送達を仲立ちした。
実施例９
本実施例は、トリアルキル脂質１３と共に配合された本発明の脂質粒子が、参照ジアルキル脂質８と共に配合された脂質粒子と比較して一層広範な脂質：ｍＲＮＡ比にわたり、より小さな平均粒径（Ｚａｖｇ）を有することを示す。より小さい粒径は典型的には、本発明の脂質粒子のｉｎ ｖｉｖｏ投与に際して望ましい。
脂質粒子は、実施例２に記載されている一般的な製剤手順を用いて作製した。薬剤（ｍＲＮＡ）に対する脂質の比が２０：１である製剤には、１２．６ｍＭの脂質ストックを用いた。薬剤に対する脂質の割合がより低い（１３：１、９：１、６：１）製剤には、適切に希釈した脂質ストックを用いた。エタノール濃度が希釈時点で１７％となるように、短鎖トリアルキル化合物１３を含む脂質粒子を多量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。表９に示す通り、化合物１３と共に配合し、様々な全脂質：ｍＲＮＡ比を使用した場合に、より小さな脂質粒子が容易に得られた。しかし、ジリノレイル脂質８を用いた場合には、より高濃度のエタノール（２５％）が必要であるため、初期の粒子はより少量のＰＢＳに希釈した。脂質の薬剤に対する比が低下するにつれ、粒径は大きくなった、これは、より大きな粒径は多くの場合望まれない毒性を伴うので、ｉｎ ｖｉｖｏ用途では望まれない特性である。短鎖トリアルキル脂質１３からは一貫して、長鎖ジリノレイル脂質８よりも小さな粒子を得た。化合物１３は、最低９：１の脂質−薬剤比に対して、１００ｎｍ未満のＺａｖｇを有する脂質粒子を作製した。
他の実施形態
１．脂質粒子であって、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び前記脂質粒子内に封入されているｍＲＮＡ分子を含む、脂質粒子。
２．前記非カチオン性脂質がＰＥＧ−脂質コンジュゲート及びリン脂質から選択される、実施形態１に記載の脂質粒子。
３．前記脂質粒子が更にコレステロールを含む、実施形態１または２に記載の脂質粒子。
４．前記カチオン性脂質が、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン、ジリノレイルメトキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート、及び（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、またはそれらの塩からなる群から選択される、実施形態１〜３のいずれかに記載の脂質粒子。
５．前記カチオン性脂質はジリノレイルメトキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンである、実施形態１〜３のいずれかに記載の脂質粒子。
６．前記リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む、実施形態２に記載の脂質粒子。
７．前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ−リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態２に記載の脂質粒子。
８．前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートである、実施形態２に記載の脂質粒子。
９．前記ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ １０ ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ １２ ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ １４ ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ １６ ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ １８ ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態７または８に記載の脂質粒子。
１０．前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＭＡである、実施形態２に記載の脂質粒子。
１１．前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＳＡである、実施形態２に記載の脂質粒子。
１２．前記ｍＲＮＡが前記粒子内に完全に封入されている、実施形態１〜１１のいずれかに記載の脂質粒子。
１３．前記粒子が、約９：１〜約２０：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する、実施形態１〜１２のいずれかに記載の脂質粒子。
１４．前記粒子が、約１２：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する、実施形態１〜１２のいずれかに記載の脂質粒子。
１５．前記粒子が、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの中位径を有する、実施形態１〜１４のいずれかに記載の脂質粒子。
１６．前記カチオン性脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を占める、実施形態１〜１５のいずれかに記載の脂質粒子。
１７．前記リン脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％を占める、実施形態２〜１６のいずれかに記載の脂質粒子。
１８．前記リン脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の約６ｍｏｌ％〜約１１ｍｏｌ％を占める、実施形態２〜１６のいずれかに記載の脂質粒子。
１９．前記コレステロールは、前記粒子内に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める、実施形態３〜５及び１２〜１８のいずれかに記載の脂質粒子。
２０．前記コレステロールは、前記粒子内に存在する総脂質の約３２ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％を占める、実施形態３〜５及び１２〜１８のいずれかに記載の脂質粒子。
２１．前記ＰＥＧ脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、実施形態２〜２０のいずれかに記載の脂質粒子。
２２．前記ＰＥＧ脂質がＰＥＧ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−ＤＳＡからなる群から選択され、前記カチオン性脂質が１−Ｂ１１である、実施形態２１に記載の脂質粒子。
２３．前記ＰＥＧ脂質が約１．６％の量で存在し、前記カチオン性脂質が約５４．６％の量で存在し、前記リン脂質が約１０．９％の量で存在し、かつ前記コレステロールが約３２．８％の量で存在する、実施形態２１に記載の脂質粒子。
２４．前記ｍＲＮＡが化学修飾されている、実施形態１〜２３のいずれかに記載の脂質粒子。
２５．前記脂質粒子がＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ（１．６ｍｏｌ％）、ジリノレイルメトキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１−Ｂ１１）（５４．６ｍｏｌ％）、コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）を含む、実施形態１に記載の脂質粒子。
２６．前記脂質粒子がＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＳＡ（１．６ｍｏｌ％）、ジリノレイルメトキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１−Ｂ１１）（５４．６ｍｏｌ％）、コレステロール（３２．８ｍｏｌ％）、及びＤＳＰＣ（１０．９ｍｏｌ％）を含む、実施形態１に記載の脂質粒子。
２７．前記脂質粒子が内部を規定する外層を含み、前記ｍＲＮＡ分子が前記内部に位置している、実施形態１に記載の脂質粒子。
２８．前記粒子は球状である、実施形態１〜２７のいずれかに記載の脂質粒子。
２９．前記脂質粒子は非球状である、実施形態１〜２７のいずれかに記載の脂質粒子。
３０．前記脂質粒子は高電子密度のコアを含み、前記ｍＲＮＡは前記高電子密度のコア内に位置している、実施形態１〜２９のいずれかに記載の脂質粒子。
３１．前記高電子密度のコアは水性組成分及び脂質成分を含み、前記水性成分の量は、前記脂質成分の量より少ない、実施形態３０に記載の脂質粒子。
３２．前記脂質粒子内に封入された複数のｍＲＮＡ分子を含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載の脂質粒子。
３３．前記カチオン性脂質はトリアルキル脂質である、実施形態１〜３２のいずれかに記載の脂質粒子。
３４．前記カチオン性脂質が式Ｂ
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ
（式Ｂ）
またはその塩を有し、
式中：
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ ２ であり、
Ａは不在であるかＣ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、またはＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルであり、Ｃ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、及びＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換されてもよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−からなる群から選択され、
Ｚは３つの鎖を含む疎水部位であり、鎖のそれぞれはＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基にて任意的に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつ
各Ｒ ｂ はＨまたはＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルである、実施形態１〜３２のいずれかに記載の脂質粒子。
３５．Ｚが式
を有し、
式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 及びＲ ３ はそれぞれ独立してＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルケニル、またはＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキニルであり、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ８ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ８ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である、実施形態３４に記載の脂質粒子。
３６．前記カチオン性脂質が
並びにそれらの塩からなる群から選択される、実施形態１に記載の脂質粒子。
３７．前記カチオン性脂質は構造式Ｃ
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ １
（式Ｃ）
またはその塩を有し、
式中：
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ ２ であり、
Ａは不在であるかＣ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、またはＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルであり、Ｃ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、及びＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−からなる群から選択され、
Ｚ １ は３つまたは４つのＲ ｘ 基で置換されたＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルであり、式中、各Ｒ ｘ はＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基にて任意的に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒ ｂ はＨまたはＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルである、実施形態１〜３２のいずれかに記載の脂質粒子。
３８．Ｚ １ は、構造
を有し、
式中、Ｒ １ｚ 及びＲ ２ｚ の１つは
からなる群から選択され、
Ｒ １ｚ 及びＲ ２ｚ の他方は
からなる群から選択され、
式中、Ｒ ３ｚ 、Ｒ ４ｚ 、Ｒ ５ｚ 、Ｒ ６ｚ 及びＲ ７ｚ はそれぞれ、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である、実施形態３７に記載の脂質粒子。
３９．Ｚ １ は、構造
を有し、
式中、Ｒ ３ｚ 、Ｒ ４ｚ 、Ｒ ５ｚ 、及びＲ ６ｚ はそれぞれ、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である、実施形態３７に記載の脂質粒子。
４０．前記カチオン性脂質が
並びにそれらの塩からなる群から選択される、実施形態１に記載の脂質粒子。
４１．実施形態１〜４０のいずれかに記載の脂質粒子及び製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
４２．タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内に導入する方法であって、前記細胞を、前記ｍＲＮＡが前記細胞内に導入され、その中で発現して前記タンパク質を生成する条件下で実施形態１〜４０のいずれかに記載の脂質粒子と接触させることを含む、前記方法。
４３．前記細胞は哺乳類の中にある、実施形態４２に記載の方法。
４４．前記細胞は、全身経路により前記粒子を前記哺乳類に投与することにより接触される、実施形態４２に記載の方法。
４５．前記哺乳類はヒトである、実施形態４３に記載の方法。
４６．ヒトにおいて、前記ヒトの中のタンパク質の発現障害に起因する病気に関係する１つ以上の症状の治療及び／または緩和方法であって、前記ヒトに、実施形態１〜４０のいずれかに記載の治療上有効な量の脂質粒子を投与することを含み、前記核酸−脂質粒子内に封入された前記ｍＲＮＡは前記タンパク質をコードする、方法。
４７．前記粒子は全身経路により投与される、実施形態４６に記載の方法。
４８．タンパク質をコードするｍＲＮＡを生細胞内に導入するための、実施形態１〜４０のいずれかに記載されている脂質粒子の使用。
４９．ヒトの中で、前記ヒトのタンパク質の発現障害に起因する病気に関係する１つ以上の症状を治療及び／または緩和するための、実施形態１〜４０のいずれかに記載されている脂質粒子の使用。
５０．脂質粒子を含む組成物であって、（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、リン脂質及びコレステロールを含む脂質粒子、並びに（ｂ）ｍＲＮＡ分子を含み、前記ｍＲＮＡ分子は前記脂質粒子内に封入されている、組成物。
５１．構造式Ｃ
Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ １
（式Ｃ）
を有する化合物またはその塩であって、
式中：
Ｘは−Ｎ（Ｈ）Ｒまたは−ＮＲ ２ であり、
Ａは不在であるかＣ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、またはＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルであり、Ｃ １ 〜Ｃ ６ アルキル、Ｃ ２ 〜Ｃ ６ アルケニル、及びＣ ２ 〜Ｃ ６ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の各アルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
Ｙは不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−、−Ｎ（Ｒ ｂ ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、及び−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ ｂ ）−からなる群から選択され、
Ｚ １ は３つまたは４つのＲ ｘ 基で置換されたＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルであり、式中、各ＲｘはＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、
各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基で任意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつ
各Ｒ ｂ はＨまたはＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルである、化合物またはその塩。
５２．Ｚ １ が構造
を有し、
式中、Ｒ １ｚ 及びＲ ２ｚ の１つは
からなる群から選択され、
Ｒ １ｚ 及びＲ ２ｚ の他方は
からなる群から選択され、
式中、Ｒ ３ｚ 、Ｒ ４ｚ 、Ｒ ５ｚ 、Ｒ ６ｚ 及びＲ ７ｚ はそれぞれ、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である、実施形態５１に記載の化合物。
５３．式中、Ｚ １ は、構造
を有し、
式中、Ｒ ３ｚ 、Ｒ ４ｚ 、Ｒ ５ｚ 、及びＲ ６ｚ はそれぞれ、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニル、及びＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ 、及び−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意に置換され、式中、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ 及びＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環であり、式中、Ｒ ｘ 及びＲ ｙ の任意のアルキル及び複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ 、及び−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されてよく、式中、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ 及びＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキル、または複素環である、実施形態５１に記載の化合物。
５４．下記からなる群から選択される、実施形態５１の化合物。
５５．（ａ）カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及びリン脂質を含む脂質粒子、並びに
（ｂ）ｍＲＮＡ分子前記
を含み、前記ｍＲＮＡ分子は前記脂質粒子内に封入されている、核酸−脂質粒子。

Claims (44)

  1. 下記構造式Ｃを有する化合物またはその塩：

    Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ１
    （式Ｃ）
    式中、
    Ｘは、−Ｎ（Ｈ）Ｒ、または−ＮＲ２であり、
    Ａは、不在であるか、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、またはＣ２〜Ｃ６アルキニルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルおよびＣ２〜Ｃ６アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意選択で置換されていてもよく、ここで、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、ＲｘおよびＲｙの各アルキルおよび複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’および−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されていてもよく、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’およびＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、
    Ｙは、不在、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、および−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−からなる群より選択され、
    Ｚ１は、４つのＲｘ”基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｒｘ”はＣ６〜Ｃ１１アルキル、Ｃ６〜Ｃ１１アルケニルおよびＣ６〜Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６〜Ｃ１１アルキル、Ｃ６〜Ｃ１１アルケニルおよびＣ６〜Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意選択で置換されていてもよく、ここで、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、ＲｘおよびＲｙのアルキルおよび複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’、および−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されていてもよく、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’およびＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、
    各Ｒは独立して、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意選択で置換されていてもよいアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ここで、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、ＲｘおよびＲｙのアルキルおよび複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’および−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されていてもよく、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’およびＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、かつ
    各Ｒｂは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
  2. Ｚ１は下記構造を有する、請求項１に記載の化合物：
    式中、Ｒ３ｚ、Ｒ４ｚ、Ｒ５ｚ、およびＲ６ｚはそれぞれ、Ｃ６〜Ｃ１１アルキル、Ｃ６〜Ｃ１１アルケニル、およびＣ６〜Ｃ１１アルキニルから独立して選択され、Ｃ６〜Ｃ１１アルキル、Ｃ６〜Ｃ１１アルケニルおよびＣ６〜Ｃ１１アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙから独立して選択される１つ以上の基により任意選択で置換されていてもよく、ここで、ｎは０、１、または２であり、かつＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、ＲｘおよびＲｙのアルキルおよび複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ’、複素環、−ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＮＲｘ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒｙ’、−ＮＲｘ’ＳＯ２Ｒｙ’、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ’、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘ’Ｒｙ’、−ＳＯｎ’Ｒｘ’および−ＳＯｎ’ＮＲｘ’Ｒｙ’から独立して選択される１つ以上の基により置換されていてもよく、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲｘ’およびＲｙ’はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環である。
  3. 下記からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
  4. 脂質粒子であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、非カチオン性脂質、および該脂質粒子内に封入されているｍＲＮＡ分子を含む、脂質粒子。
  5. 前記非カチオン性脂質が、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートおよびリン脂質から選択される、請求項４に記載の脂質粒子。
  6. コレステロールを更に含む、請求項４または５に記載の脂質粒子。
  7. 前記リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む、請求項５に記載の脂質粒子。
  8. 前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ−リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載の脂質粒子。
  9. 前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートである、請求項５に記載の脂質粒子。
  10. 前記ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項８または９に記載の脂質粒子。
  11. 前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＭＡである、請求項５に記載の脂質粒子。
  12. 前記ＰＥＧ−脂質コンジュゲートはＰＥＧ−ＤＳＡである、請求項５に記載の脂質粒子。
  13. 前記ｍＲＮＡが前記粒子内に完全に封入されている、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  14. ９：１〜２０：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  15. １２：１の脂質：ｍＲＮＡ質量比を有する、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  16. ３０ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径を有する、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  17. 前記請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物は、前記粒子内に存在する総脂質の５０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％を占める、請求項４〜１６のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  18. 前記非カチオン性脂質がリン脂質を含み、該リン脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の４ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％を占める、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  19. 前記リン脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の６ｍｏｌ％〜１１ｍｏｌ％を占める、請求項１８に記載の脂質粒子。
  20. 前記脂質粒子内に存在する総脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％の量でコレステロールをさらに含む、請求項４〜１９のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  21. 前記コレステロールは、前記粒子内に存在する総脂質の３２ｍｏｌ％〜３７ｍｏｌ％を占める、請求項２０に記載の脂質粒子。
  22. 前記非カチオン性脂質がＰＥＧ脂質を含み、該ＰＥＧ脂質は、前記粒子内に存在する総脂質の０．５ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を占める、請求項５〜２１のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  23. １．６ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質、５４．６ｍｏｌ％の請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、１０．９ｍｏｌ％のリン脂質、および３２．８ｍｏｌ％のコレステロールを含む、請求項６〜２２のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  24. 前記ｍＲＮＡが化学修飾されている、請求項４〜２３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  25. 内部を規定する外層を含み、前記ｍＲＮＡ分子が前記内部に位置している、請求項４に記載の脂質粒子。
  26. 球状である、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  27. 非球状である、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  28. 高電子密度のコアを含み、前記ｍＲＮＡは前記高電子密度のコア内に位置している、請求項４〜２７のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  29. 前記高電子密度のコアは水性成分および脂質成分を含み、前記水性成分の量は前記脂質成分の量より少ない、請求項２８に記載の脂質粒子。
  30. 前記脂質粒子内に封入された複数のｍＲＮＡ分子を含む、請求項４〜２９のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  31. 請求項４〜３０のいずれか一項に記載の脂質粒子および製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
  32. タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内に導入するための組成物であって、請求項４〜３０のいずれか一項に記載の脂質粒子を含み、細胞に前記脂質粒子を接触させることにより、前記ｍＲＮＡが前記細胞内に導入され、さらにその中で発現されて前記タンパク質を生成する、組成物。
  33. 前記細胞は哺乳類の中にある、請求項３２に記載の組成物。
  34. 全身経路により前記粒子を哺乳類に投与することにより、細胞に前記脂質粒子を接触させる、請求項３２に記載の組成物。
  35. 前記哺乳類はヒトである、請求項３３に記載の組成物。
  36. ヒトにおけるタンパク質の発現障害に起因する病気に関連する１つ以上の症状をヒトにおいて治療および／または緩和するための組成物であって、治療有効量の請求項４〜３０いずれか一項に記載の脂質粒子を含み、前記核酸−脂質粒子内に封入されたｍＲＮＡは前記タンパク質をコードする、組成物。
  37. 前記粒子は全身経路により投与される、請求項３６に記載の組成物。
  38. 脂質粒子を含む組成物であって、前記脂質粒子は、（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、ＰＥＧ脂質、リン脂質、およびコレステロールを含む脂質粒子と、（ｂ）該脂質粒子内に封入されているｍＲＮＡ分子とを含む、組成物。
  39. （ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、ＰＥＧ脂質、およびリン脂質を含む脂質粒子、並びに
    （ｂ）ｍＲＮＡ分子
    を含み、前記ｍＲＮＡ分子は前記脂質粒子内に封入されている、核酸−脂質粒子。
  40. 核酸−脂質粒子であって、
    （ａ）１つ以上のｍＲＮＡ分子；
    （ｂ）前記粒子内に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を占める、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物；
    （ｃ）前記粒子内に存在する総脂質の約４７ｍｏｌ％〜約６９ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物；および
    （ｄ）前記粒子内に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート；
    を含む、核酸−脂質粒子。
  41. である、請求項１に記載の化合物。
  42. 下記構造式Ｃを有する化合物またはその塩：

    Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ １
    （式Ｃ）
    式中、
    Ｘは−ＮＲ ２ であり、
    ＡはＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルであり、
    Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、
    Ｚ １ は、４つのＲ ｘ” 基で置換されたＣ １ 〜Ｃ ６ アルキルであり、ここで、各Ｒ ｘ” はＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニルおよびＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルから独立して選択され、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルキル、Ｃ ６ 〜Ｃ １１ アルケニルおよびＣ ６ 〜Ｃ １１ アルキニルは、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ ｘ 、−ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ 、−ＮＲ ｘ ＳＯ ２ Ｒ ｙ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ Ｒ ｙ 、−ＳＯ ｎ Ｒ ｘ および−ＳＯ ｎ ＮＲ ｘ Ｒ ｙ から独立して選択される１つ以上の基により任意選択で置換されていてもよく、ここで、ｎは０、１、または２であり、かつＲ ｘ およびＲ ｙ はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、Ｒ ｘ およびＲ ｙ のアルキルおよび複素環は更に、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ ｘ’ 、複素環、−ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｙ’ 、−ＮＲ ｘ’ ＳＯ ２ Ｒ ｙ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ｘ’ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ 、−ＳＯ ｎ’ Ｒ ｘ’ および−ＳＯ ｎ’ ＮＲ ｘ’ Ｒ ｙ’ から独立して選択される１つ以上の基により置換されていてもよく、ｎ’は０、１、または２であり、かつＲ ｘ’ およびＲ ｙ’ はそれぞれ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、
    各Ｒは独立してアルキルである。
  43. 前記Ａが、Ｃ ４ アルキル、Ｃ ５ アルキルまたはＣ ６ アルキルである、請求項４２に記載の化合物。
  44. 前記Ａが、Ｃ ４ アルキルまたはＣ ５ アルキルである、請求項４２に記載の化合物。
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