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ES2987057T3 - Lípidos escindibles - Google Patents

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ES2987057T3
ES2987057T3 ES20154173T ES20154173T ES2987057T3 ES 2987057 T3 ES2987057 T3 ES 2987057T3 ES 20154173 T ES20154173 T ES 20154173T ES 20154173 T ES20154173 T ES 20154173T ES 2987057 T3 ES2987057 T3 ES 2987057T3
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ES
Spain
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lipid
mrna
polynucleotides
compositions
lipid nanoparticles
Prior art date
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Active
Application number
ES20154173T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Heartlein
Braydon Charles Guild
Frank Derosa
Jerry Chi Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Translate Bio Inc
Original Assignee
Translate Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46317534&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2987057(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Translate Bio Inc filed Critical Translate Bio Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2987057T3 publication Critical patent/ES2987057T3/es
Active legal-status Critical Current
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Abstract

En el presente documento se describen nuevos compuestos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y métodos relacionados con su uso. Los compuestos descritos en el presente documento son útiles, por ejemplo, como vehículos de administración liposomal para facilitar la administración de polinucleótidos encapsulados a células diana y la posterior transfección de dichas células diana, y en ciertas realizaciones se caracterizan por tener una o más propiedades que proporcionan a dichos compuestos ventajas en relación con otros lípidos clasificados de manera similar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos escindibles
La administración liposomal de ácidos nucleicos se ha empleado para la administración específica del sitio de ADN plasmídico encapsulado, oligonucleótidos antisentido, ARN interferente corto y terapias basadas en microARN. Sin embargo, la administración eficaz de ácidos nucleicos a células y tejidos diana, así como la posterior transfección de dichas células y tejidos diana, sigue siendo un desafío técnico. A pesar de la disponibilidad de múltiples sistemas y vehículos basados en liposomas para facilitar la administración de agentes terapéuticos a células y tejidos diana, siguen existiendo muchos problemas tanto en aplicacionesin vivocomoin vitro.Por ejemplo, un inconveniente significativo de los sistemas de administración liposomal está relacionado con la construcción de liposomas que tengan suficiente estabilidad en cultivos celulares oin vivopara alcanzar las células y/o los compartimentos intracelulares diana deseados, y la capacidad de tales sistemas de administración liposomal para liberar eficazmente sus materiales encapsulados en dichas células diana. Además, muchos de los lípidos catiónicos que se emplean para construir dichos vehículos liposomales son generalmente tóxicos para las células diana y, por consiguiente, pueden ser de uso limitado, particularmente en las cantidades necesarias para administrar con éxito los materiales encapsulados en dichas células diana.
A pesar de las limitaciones anteriores, y como resultado de su capacidad para proteger y facilitar la administración de materiales encapsulados a una o más células diana, los vehículos liposomales se consideran un portador atractivo para los agentes terapéuticos y siguen siendo objeto de continuos esfuerzos de desarrollo. Aunque los vehículos liposomales que comprenden un componente lipídico catiónico han mostrado resultados prometedores con respecto a la encapsulación, estabilidad y localización, sigue habiendo una gran necesidad de mejorar los sistemas de administración liposomales. En particular, sigue habiendo una necesidad de lípidos catiónicos mejorados capaces de administrar macromoléculas como ácidos nucleicos a una amplia variedad de tipos de células y tejidos con mayor eficacia. También sigue habiendo una necesidad particular de lípidos novedosos que incorporen un enfoque multifuncional para la administración de ácidos nucleicos y polinucleótidos encapsulados.
Por tanto, en la presente se describen nuevos compuestos, composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos y métodos relacionados de su uso. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en la presente son útiles como composiciones liposomales o como componentes de composiciones liposomales para facilitar la administración y posterior transfección de una o más células diana. En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son lípidos catiónicos y/o ionizables. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se han diseñado basándose en características o propiedades deseadas, por ejemplo, para mejorar la eficacia de la transfección o para promover resultados biológicos específicos. Además, en ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente emplean una estrategia multifuncional para facilitar la administración de materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos) y la posterior transfección de una o más células diana. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se caracterizan por tener una o más de las propiedades fusogénicas, de alteración endosomal o lisosomal y/o liberables que proporcionan a dichos compuestos ventajas con respecto a otros lípidos clasificados de manera similar.
Los compuestos divulgados en la presente comprenden generalmente uno o más grupos funcionales escindibles (por ejemplo, escindibles enzimáticamente o por reducción, oxidación o hidrólisis) a los que están unidos (por ejemplo, unidos covalentemente) dos o más grupos o fracciones funcionales (por ejemplo, un grupo hidrófobo R<1>y un grupo hidrófilo R<2>). Por ejemplo, en la presente se divulgan compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro escindible (S-S). También se contemplan compuestos que comprenden cualquier grupo funcional que sea capaz de escindirse, por ejemplo, tras la exposición a condiciones biológicas, y que a efectos de la presente tales grupos pueden incluir, pero no se limitan a, ésteres y éteres. En ciertas realizaciones, los dos o más grupos funcionales (por ejemplo, un grupo de cabeza y un grupo de cola) que comprenden los compuestos hacen que dichos compuestos sean anfifílicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, por lo menos uno de los grupos funcionales es un grupo de cola no polar, lipófilo o hidrófobo (por ejemplo, un lípido de origen natural como el colesterol o un alquilo C<6>-C<20>). En ciertas realizaciones, por lo menos uno de los grupos funcionales es un grupo de cabeza polar o hidrófilo (por ejemplo, imidazol).
En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005) son lípidos catiónicos o ionizables que pueden usarse como componente de una composición liposomal para facilitar o mejorar la administración y la liberación de materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos) a una o más células diana (por ejemplo, permeando o fusionándose con las membranas lipídicas de dichas células diana). En ciertas realizaciones, el uno o más grupos funcionales escindibles (por ejemplo, un disulfuro) que comprenden tales compuestos permiten, por ejemplo, que un grupo funcional hidrófilo de cabeza se disocie (por ejemplo, tras la exposición a condiciones oxidativas, reductoras o ácidas) de un grupo funcional lipófilo de cola del compuesto, facilitando de este modo una transición de fase en la bicapa lipídica de la una o más células diana. Por ejemplo, cuando una composición liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) comprende uno o más de los compuestos divulgados en la presente, la transición de fase en la bicapa lipídica de la una o más células diana facilita la administración de los materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos terapéuticos encapsulados en una nanopartícula lipídica) a una o más células diana. De manera similar, el enriquecimiento de las composiciones liposomales con uno o más de los compuestos divulgados en la presente puede mejorar la fusogenicidad de dichas composiciones liposomales, aumentando de este modo la capacidad de dichos compuestos para administrar intracelularmente los materiales (por ejemplo, polinucleótidos) encapsulados en las mismas.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En la presente se enumeran ciertas realizaciones que pueden no caer en el alcance de las reivindicaciones y que pueden servir como realizaciones ilustrativas.
En ciertas realizaciones, los compuestos tienen la estructura de la fórmula (I),
en donde R<1>se selecciona del grupo que consiste en imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, un alquilamino opcionalmente sustituido (por ejemplo, un alquilamino como el dimetilamino) y piridilo; en donde R<2>se selecciona del grupo que consiste en la fórmula II y la fórmula III;
en donde R<3>y R<4>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un alquilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado y un acilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado; y en donde n es cero o cualquier número entero positivo (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más). En ciertas realizaciones, R<3>y R<4>son cada uno un alquilo C<18>poliinsaturado opcionalmente sustituido, mientras que en otras realizaciones R<3>y R<4>son cada uno un alquilo C<18>poliinsaturado no sustituido. En ciertas realizaciones, uno o más de R<3>y R<4>son (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien.
También se divulgan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de fórmula I, en donde R<1>se selecciona del grupo que consiste en imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, un alquilamino opcionalmente sustituido (por ejemplo, un alquilamino como dimetilamino) y piridilo; en donde R<2>es de fórmula II; y en donde n es cero o cualquier número entero positivo. En la presente se divulgan además composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de fórmula I, en donde R<1>se selecciona del grupo que consiste en imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, un alquilamino opcionalmente sustituido (por ejemplo, un alquilamino como dimetilamino) y piridilo; en donde R<2>es de fórmula III; en donde R<3>y R<4>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un alquilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado y un acilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado; y en donde n es cero o cualquier número entero positivo. En ciertas realizaciones, R<3>y R<4>son cada uno un alquilo C<18>poliinsaturado opcionalmente sustituido, mientras que en otras realizaciones R<3>y R<4>son cada uno un alquilo C<18>poliinsaturado no sustituido (por ejemplo, octadeca-9, 12-dieno).
En ciertas realizaciones, el grupo R<1>o grupo de cabeza es un grupo polar o hidrófilo (por ejemplo, uno o más de los grupos imidazol, guanidinio y amino) y está unido al grupo lipídico R<2>mediante el grupo conector escindible disulfuro (S-S), por ejemplo, como se representa en la fórmula I. Otros grupos conectores escindibles contemplados pueden incluir composiciones que comprenden uno o más grupos conectores disulfuro (S-S) unidos (por ejemplo, unidos covalentemente) a, por ejemplo, un grupo alquilo (por ejemplo, alquilo Ci a C<10>). En ciertas realizaciones, el grupo R<1>está unido covalentemente al grupo conector escindible mediante un grupo alquilo C<1>-C<20>(por ejemplo, donde n es de uno a veinte), o alternativamente puede estar unido directamente al grupo conector escindible (por ejemplo, donde n es cero). En ciertas realizaciones, el grupo conector disulfuro es escindiblein vitroy/oin vivo(por ejemplo, enzimáticamente escindible o escindible tras la exposición a condiciones ácidas o reductoras).
En la presente se describe el compuesto 5-(((10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)disulfanil)metil)-1H-imidazol, que tiene la estructura de la fórmula IV (denominado en la presente "HGT4001").
De acuerdo con la invención, en la presente se proporciona el compuesto -(2-(((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)disulfanil)etil)guanidina, que tiene la estructura de la fórmula V (denominado en la presente "HGT4002").
En ciertas realizaciones, en la presente se divulga el compuesto 2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina, que tiene la estructura de la fórmula VI (denominado en la presente "HGT4003").
En otras realizaciones, en la presente se divulga el compuesto 5-((2,3-bis((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)metil)-1H-imidazol que tiene la estructura de la fórmula VII (denominado en la presente "HGT4004").
En otras realizaciones más, en la presente se divulga el compuesto 1-(((2,3-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienl-iloxi)propil)disulfanil)metil)guanidina que tiene la estructura de Fórmula VIII (denominado en la presente "HGT4005").
En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente son lípidos catiónicos y/o ionizables, que pueden usarse como una composición liposomal o alternativamente como componente de una composición liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica). En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente se usan para enriquecer una composición liposomal (por ejemplo, nanopartículas lipídicas), confiriendo de este modo propiedades mejoradas a dicha composición liposomal enriquecida (por ejemplo, administración mejorada de polinucleótidos encapsulados a una o más células diana y/o toxicidadin vivoreducida de una composición liposomal). Por consiguiente, también se contemplan composiciones farmacéuticas, y en particular composiciones liposomales, que comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente. En ciertas realizaciones, tales composiciones farmacéuticas y liposomales comprenden uno o más de un lípido modificado con PEG, un lípido no catiónico y un lípido ayudante, como el colesterol. Por ejemplo, se contemplan composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) que comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005) y uno o más componentes lipídicos catiónicos, lipídicos no catiónicos, un lípido ayudante/colesterol y lipídicos modificados con PEG. También se contemplan composiciones farmacéuticas y liposomales que comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente y que comprenden además uno o más lípidos catiónicos adicionales. De manera similar, también se contemplan composiciones liposomales y composiciones farmacéuticas (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) que comprenden uno o más de los compuestos<h>G<t>4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005 y uno o más de C12-200, DLinDMA, DLinKC2-DMA, CHOL, DOPE, DMG-PEG-2000, ICE, DSPC, DODAP, DOTAP y C8-PEG-2000. En ciertas realizaciones, dichas composiciones farmacéuticas y composiciones liposomales se cargan o se encapsulan de otro modo con materiales, como, por ejemplo, uno o más polinucleótidos biológicamente activos.
En ciertas realizaciones, una o más de las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente y uno o más lípidos adicionales. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que comprenden o están enriquecidas de otro modo con uno o más de los compuestos divulgados en la presente pueden comprender además uno o más de DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, C12-200 e ICE. En una realización, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula lipídica que comprende HGT4001, DOPE y DMG-PEG2000. En otra realización, la composición farmacéutica comprende una nanopartícula lipídica que comprende HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2000.
En ciertas realizaciones, una o más de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden comprender uno o más lípidos modificados con PEG. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que comprenden o están enriquecidas de otro modo con uno o más de los compuestos divulgados en la presente pueden comprender además uno o más lípidos modificados con PEG que comprenden una cadena de poli(etilenglicol) de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende uno o más alquilos C<6>-C<20>.
De manera similar, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) pueden comprender o estar enriquecidas de otro modo con uno o más de los compuestos divulgados en la presente y pueden comprender además uno o más lípidos auxiliares que se seleccionan del grupo que consiste en DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina),<d>O<p>E (1,2-dioleil-snglicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)), DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DLPE (1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPS (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina), ceramidas, esfingomielinas y colesterol.
En ciertas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas y liposomales que comprenden dichos compuestos (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) comprenden uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN encapsulado). En otras realizaciones, el uno o más polinucleótidos comprenden por lo menos un ácido nucleico bloqueado (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, doce, quince, dieciséis, dieciocho, veinte o más residuos o monómeros de ácidos nucleicos bloqueados). Cuando los uno o más polinucleótidos encapsulados comprenden ARN, dicho ARN puede incluir, por ejemplo, ARNm, ARNip, ARNson, microARN y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados en las composiciones farmacéuticas y liposomales de los mismos comprenden ARNm que codifica, por ejemplo, un polipéptido, proteína o enzima funcional, y al ser expresado (es decir, traducido) por una o más células diana se produce un producto polipeptídico funcional (por ejemplo, una proteína o enzima), y en algunos casos es secretado por la célula diana a la circulación periférica de un sujeto. En ciertas realizaciones, uno o más de los polinucleótidos que comprenden (o están cargados o encapsulados de otro modo en) los compuestos y composiciones farmacéuticas y liposomales descritos en la presente codifican un ácido nucleico (por ejemplo, un polipéptido) que el sujeto expresa aberrantemente. En ciertas realizaciones, el uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden tales compuestos y composiciones liposomales o farmacéuticas (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) codifican una enzima funcional como una enzima del ciclo de la urea (por ejemplo, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamoil-fosfato sintetasa 1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL) o arginasa 1 (ARG1)). En ciertas realizaciones, el uno o más de los polinucleótidos encapsulados comprende ARNm que codifica una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, el polinucleótido encapsulado es ARNm que codifica una o más de las enzimas alfa galactosidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, beta-glucosidasa, galactocerebrosidasa y alfa ácida glucosidasa). En otras realizaciones en las que los ácidos nucleicos comprenden ARNm, dicho ARNm puede codificar una o más proteínas o enzimas, por ejemplo, proteínas o enzimas que pueden ser deficientes en un sujeto (por ejemplo, una enzima o proteína seleccionada del grupo de enzimas que consiste en regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), alfa-L-iduronidasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina<6>-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, galactosa-<6>-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa e hialuronidasa).
También se contemplan en la presente composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) que comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente y uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido), y en particular polinucleótidos que comprenden una o más modificaciones químicas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en las que el polinucleótido es ARNm, dichas modificaciones químicas hacen que el ARNm sea más estable y pueden comprender, por ejemplo, una modificación de bloqueo del extremo de una región 5' o 3' no traducida del ARNm. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV en la región 5' no traducida del ARNm, como, por ejemplo, la SEQ ID NO:1:
XCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGA CACCGGGACCGAUCCAGCCUC-CGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGC GGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG, en donde X, si está presente es GGA (SEQ ID NO:1);
En otras realizaciones, la modificación química comprende la inclusión de una cola poli A en la región 3' no traducida del ARNm. También se contemplan las modificaciones químicas que comprenden la inclusión de una estructura Cap1 en la región 5' no traducida del ARNm. En otras realizaciones más, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH) en la región 3' no traducida del ARNm. La secuencia hGH puede comprender, por ejemplo, la SEQ ID NO:2
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCllCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAA
GUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCA
UC (SEQ ID NO:2)
o una secuencia que es por lo menos un 90% o por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2.
Los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente pueden formularse para dirigirse específicamente y/o transfectar una o más células, tejidos y órganos diana. En ciertas realizaciones, tales compuestos y composiciones farmacéuticas facilitan la transfección de dichas células diana mediante uno o más mecanismos (por ejemplo, liberación basada en fusógeno y/o alteración mediada por esponja de protones de la membrana bicapa lipídica de las células diana). Las células diana contempladas incluyen, por ejemplo, una o más células seleccionadas del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células musculares lisas vasculares, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células de revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
En la presente se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración liposomal liofilizados y formulaciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) que son útiles para efectuar la administración de contenidos encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos) a una o más células, tejidos u órganos diana. En la presente también se describen métodos y procesos relacionados para preparar dichas composiciones farmacéuticas, así como métodos para tratar una o más enfermedades o afecciones administrando dichas composiciones farmacéuticas a un sujeto que las necesite. También se espera que las composiciones liofilizadas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) descritas en la presente tengan una estabilidad mejorada a largo plazo tras su almacenamiento en refrigeración o a temperatura ambiente (por ejemplo, temperatura ambiente).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden nanopartículas liofilizadas o vehículos de administración liposomal se caracterizan por ser estables (por ejemplo, tan estables como las composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos equivalentes no liofilizados). La estabilidad de los vehículos de administración liofilizados puede determinarse, por ejemplo, con referencia al tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas que comprenden dicha composición. En ciertas realizaciones, la liofilización de las nanopartículas lipídicas no cambia o altera apreciablemente el tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas tras la liofilización y/o reconstitución. Por ejemplo, en la presente se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados, en donde tras la reconstitución (por ejemplo, con agua purificada) las nanopartículas lipídicas no floculan ni se agregan, o alternativamente demuestran una floculación o agregación limitada o insignificante (por ejemplo, determinada por el tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas reconstituidas). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, tras la reconstitución de una nanopartícula lipídica liofilizada, las nanopartículas lipídicas tienen un Dv50 de menos de aproximadamente 500 nm (por ejemplo, menos de aproximadamente 300 nm, 200 nm, 150 nm, 125 nm, 120 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o menor). De manera similar, en ciertas realizaciones, tras la reconstitución de una nanopartícula lipídica liofilizada, las nanopartículas lipídicas tienen un Dv90 de menos de aproximadamente 750 nm (por ejemplo, menos de aproximadamente 700 nm, 500 nm, 300 nm, 200 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o menor).
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados se caracterizan por tener un índice de polidispersión de menos de aproximadamente<1>(por ejemplo, menos de 0,95, 0,9, 0,8, 0,75, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,25, 0,2, 0,1, 0,05, o menos). Aun así, en otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados muestran una tendencia reducida a flocular o agregarse de otro modo (por ejemplo, durante la liofilización o tras la reconstitución). Por ejemplo, tras la reconstitución, los vehículos de administración de lípidos pueden tener un tamaño medio de partícula (Zave) de menos de 500 nm (por ejemplo, de menos de aproximadamente 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o menor en una solución de PBS).
Los vehículos de administración de lípidos liofilizados estables (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) también se caracterizan por sus propiedades de almacenamiento mejoradas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los vehículos de administración de lípidos liofilizados pueden almacenarse bajo refrigeración y permanecer estables (por ejemplo, como se demuestra por pérdidas mínimas o nulas en su actividad farmacéutica o biológica prevista) durante periodos de tiempo prolongados (por ejemplo, estables durante por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 9, 12, 18, 24, 36 meses o más tras el almacenamiento a aproximadamente 4°C). En otras realizaciones, los vehículos de administración de lípidos liofilizados pueden almacenarse sin refrigeración y permanecer estables durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, estables durante por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 9, 12, 18, 24, 36 meses o más tras su almacenamiento a aproximadamente 25°C). En ciertas realizaciones, tras la reconstitución con un medio de rehidratación apropiado (por ejemplo, agua purificada, agua desionizada, dextrosa al 5% y/o solución salina normal), la composición reconstituida demuestra una actividad farmacológica o biológica comparable a la observada antes de la liofilización. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la actividad farmacológica o biológica de un polinucleótido encapsulado es equivalente a la observada antes de la liofilización de la composición, o alternativamente demuestra una reducción insignificante en la actividad farmacológica o biológica (por ejemplo, menos de aproximadamente el 1%, 2%, 2,5%, 4%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 18,5%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 50% de reducción en la actividad biológica o farmacológica de un polinucleótido encapsulado).
También se divulgan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados (por ejemplo, nanopartículas lipídicas liofilizadas) que comprenden además o se preparan alternativamente usando uno o más lioprotectores (por ejemplo, azúcares y/o hidratos de carbono). En ciertas realizaciones, la inclusión de uno o más lioprotectores en la nanopartícula del lípido puede mejorar o potenciar de otro modo la estabilidad de los vehículos de administración de lípidos liofilizados (por ejemplo, bajo condiciones normales del almacenamiento) y/o facilitar la reconstitución de los vehículos de administración de fármacos liofilizados usando un medio de rehidratación, preparando de este modo una formulación acuosa. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se preparan y, antes de la liofilización, el tampón presente en la formulación liposomal puede sustituirse (por ejemplo, mediante centrifugación) por un lioprotector como una solución o suspensión de sacarosa (por ejemplo, una solución acuosa que comprende entre aproximadamente un 1-50% o un 10-25% de sacarosa). Otros lioprotectores adecuados que pueden usarse para preparar las composiciones liofilizadas descritas en la presente incluyen, por ejemplo, trehalosa, dextrano (por ejemplo, 1.5kDa, 5kDa y/o 40kDa) e inulina (por ejemplo, 1.8kDa y/o 4kDa).
En algunas realizaciones, las composiciones liofilizadas divulgadas en la presente también son capaces de facilitar la liberación prolongada de los contenidos (por ejemplo, polinucleótidos) encapsulados en una o más nanopartículas lipídicas que comprenden dicha composición. Por ejemplo, se contemplan composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados, en donde la composición puede implantarse en un sujeto sin reconstitución (por ejemplo, implantarse subcutáneamente, por ejemplo, como una membrana o un disco). Tales composiciones liofilizadas implantadas pueden erosionarse o disgregarse de otro modo a una velocidad predeterminada, por ejemplo, al exponerse a uno o más fluidos biológicos (por ejemplo, suero, sangre, líquido cefalorraquídeo, mucosa, sudor, secreciones gástricas, orina y/o saliva). En ciertas realizaciones, dichas composiciones farmacéuticas implantadas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados liberan, por ejemplo, polinucleótidos encapsulados durante por lo menos 1, 2, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120 días o más. Alternativamente, tales composiciones implantadas que comprenden vehículos de liberación de lípidos liofilizados liberan, por ejemplo, polinucleótidos encapsulados durante por lo menos uno, dos, tres, seis, doce, dieciséis, veinticuatro, treinta y seis meses o más.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados proporcionados por la invención en la presente pueden reconstituirse antes de la administración a un sujeto (por ejemplo, un mamífero). Tras la reconstitución (por ejemplo, usando agua purificada o dextrosa al 5% como medio de rehidratación) la composición acuosa reconstituida puede administrarse a un sujeto por una o más de las siguientes vías de administración: intravenosa, oral, rectal, vaginal, transmucosal, sublingual, subdural, nasal, intramuscular, subcutánea, inyección intramedular, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, oftálmica y/o intraocular.
En la presente se divulgan métodos para tratar enfermedades (por ejemplo, una enfermedad asociada con la expresión aberrante de un gen o ácido nucleico) en un sujeto, en donde el método comprende administrar uno o más de los compuestos y/o composiciones farmacéuticas de la invención al sujeto. También se contemplan métodos de transfección de una o más células diana con uno o más polinucleótidos, en donde el método comprende poner en contacto la una o más células diana con los compuestos o la composición farmacéutica descritos en la presente de tal manera que la una o más células diana se transfecten con el uno o más polinucleótidos encapsulados.
En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento emplean las composiciones que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados o reconstituidos que son capaces de modular la expresión de ácidos nucleicos y polinucleótidos expresados aberrantemente en una o más células y tejidos diana. Por consiguiente, también se divulgan en la presente métodos de tratamiento de enfermedades en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración de lípidos liofilizados proporcionados por la invención a un sujeto (por ejemplo, después de la reconstitución con un medio rehidratante como agua estéril para inyección). En ciertas realizaciones, tales métodos pueden mejorar (por ejemplo, aumentar) la expresión de un polinucleótido y/o aumentar la producción y secreción de un producto polipeptídico funcional en una o más células y tejidos diana (por ejemplo, hepatocitos). En algunas realizaciones, las células o tejidos diana expresan de manera aberrante el polinucleótido encapsulado por uno o más de los vehículos de administración de lípidos liofilizados (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) de la invención.
En la presente también se describen métodos para aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) en una o más células, tejidos y órganos diana. Generalmente, tales métodos comprenden poner en contacto las células diana con uno o más compuestos y/o composiciones farmacéuticas o liposomales que comprenden o encapsulan de otro modo uno o más polinucleótidos. En algunas realizaciones, en la presente se describen métodos de transfección de una o más células con un polinucleótido (por ejemplo, que comprenden los pasos de rehidratar una composición liofilizada y poner en contacto dicha una o más células con la composición rehidratada).
Lo analizado anteriormente y muchas otras características y ventajas concomitantes de la divulgación se entenderán mejor por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención cuándo se toma junto con los ejemplos acompañantes. Las diversas realizaciones descritas en la presente son complementarias y pueden combinarse o usarse juntas de una manera entendida por los expertos en la técnica a la vista de las enseñanzas contenidas en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en el hígado y el bazo de ratones después de la administración intravenosa de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) basadas en HGT4003. Las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 administradas permiten un enriquecimiento del ARNm encapsulado en el hígado respecto al bazo. Los valores se representan como la mediana de unidades de luz relativas (RLU)/mg de proteína total cuatro horas después de la administración.
La FIG. 2 ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en los tejidos del cerebro y la médula espinal de ratones tras la administración intracerebrovascular (ICV) e intratecal (IT) de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) basadas en HGT4003. Las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 administradas permiten un enriquecimiento del ARNm encapsulado en el cerebro usando la vía de administración ICV en comparación con la vía de administración IT. Los valores se representan como la mediana de unidades de luz relativas (RLU)/mg de proteína total cuatro horas después de la administración.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES EJEMPLARES
Los compuestos como se describen en la presente son útiles, por ejemplo, como vehículos de administración liposomal o como componentes de vehículos de administración liposomal. En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente pueden emplearse como una composición liposomal o alternativamente como componente de una composición liposomal (por ejemplo, como nanopartícula lipídica). Los compuestos de la invención también pueden emplearse en composiciones farmacéuticas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) y métodos de administración de dichas composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección o para administrar una molécula terapéutica. En ciertas realizaciones, dichos compuestos y composiciones facilitan la administración de, por ejemplo, materiales encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos) a una o más células, tejidos y órganos diana.
Los compuestos divulgados en la presente generalmente comprenden uno o más grupos escindibles como, por ejemplo, uno o más grupos funcionales disulfuro (S-S) como se representa en la fórmula I a continuación. Los términos "escindir" y "escindible" se usan generalmente en la presente para indicar que uno o más enlaces químicos (por ejemplo, uno o más enlaces covalentes, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y/o interacciones iónicas) entre átomos en o adyacentes al grupo funcional en cuestión se rompen (por ejemplo, se hidrolizan) o son capaces de romperse tras la exposición a condiciones seleccionadas (por ejemplo, tras la exposición a condiciones enzimáticas). En ciertas realizaciones, el grupo escindible es un grupo funcional disulfuro, y en realizaciones particulares es un grupo disulfuro que es capaz de escindirse tras la exposición a condiciones biológicas seleccionadas (por ejemplo, condiciones intracelulares). En ciertas realizaciones, el grupo escindible es un grupo funcional éster que es capaz de escindirse tras la exposición a condiciones biológicas seleccionadas. Por ejemplo, los grupos disulfuro pueden escindirse enzimáticamente o mediante una reacción de hidrólisis, oxidación o reducción. Al escindirse de dicho grupo funcional disulfuro, pueden liberarse una o más fracciones o grupos funcionales (por ejemplo, uno o más de un grupo de cabeza y/o un grupo de cola) que están unidos al mismo. Los grupos escindibles ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, grupos disulfuro, grupos éster, grupos éter y cualquier derivado de los mismos (por ejemplo, ésteres de alquilo y arilo). En ciertas realizaciones, el grupo escindible no es un grupo éster ni un grupo éter.
Los grupos escindibles descritos en la presente están generalmente unidos (por ejemplo, por uno o más enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones iónicas y enlaces covalentes) a una o más fracciones o grupos funcionales (por ejemplo, por lo menos un grupo de cabeza y por lo menos un grupo de cola). En ciertas realizaciones, por lo menos una de las fracciones o grupos funcionales es hidrófilo (por ejemplo, un grupo de cabeza hidrófilo que comprende uno o más de imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, alquilamino opcionalmente sustituido y piridilo). Como se usa en la presente, el término "hidrófilo" se usa para indicar en términos cualitativos que un grupo funcional es preferente al agua, y típicamente tales grupos son solubles en agua. Por ejemplo, en la presente se divulgan compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro escindible (S-S) unido a uno o más grupos hidrófilos (por ejemplo, un grupo de cabeza hidrófilo), en donde dichos grupos hidrófilos comprenden o se seleccionan del grupo que consiste en imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, un alquilamino opcionalmente sustituido (por ejemplo, un alquilamino como dimetilamino) y piridilo.
En ciertas realizaciones, el grupo o la fracción funcional hidrófilo seleccionados pueden alterar o impartir de otro modo propiedades al compuesto o a la composición liposomal de la que dicho compuesto es un componente (por ejemplo, mejorando la eficacia de transfección de una nanopartícula lipídica de la que el compuesto es un componente). Por ejemplo, la incorporación de guanidinio como grupo de cabeza hidrófilo en los compuestos divulgados en la presente puede promover la fusogenicidad de dicho compuesto (o de la composición liposomal de la que dicho compuesto es un componente) con la membrana celular de una o más células diana, mejorando de este modo, por ejemplo, las eficiencias de transfección de dicho compuesto. Se ha planteado la hipótesis de que el nitrógeno de la fracción hidrófila de guanidinio forma un estado de transición de anillo de seis miembros que confiere estabilidad a la interacción y permite por tanto la captación celular de los materiales encapsulados. (Wender, et al., Adv. Drug Del. Rev. (2008) 60: 452-472). De manera similar, la incorporación de uno o más grupos o fracciones amino en los compuestos divulgados (por ejemplo, como grupo de cabeza) puede promover aún más la alteración de la membrana endosomal/lisosomal de la célula diana aprovechando la fusogenicidad de dichos grupos amino. Esto se basa no sólo en el pKa del grupo amino de la composición, sino también en la capacidad del grupo amino para experimentar una transición de fase hexagonal y fusionarse con el surfactante de la célula diana, es decir, la membrana vesicular. (Koltover, et al. Science (1998) 281: 78-81.) Se cree que el resultado promueve la alteración de la membrana de la vesícula y la liberación del contenido de la nanopartícula lipídica en la célula diana.
De manera similar, en ciertas realizaciones la incorporación de, por ejemplo, imidazol como grupo de cabeza hidrófilo en los compuestos divulgados en la presente puede servir para promover la liberación endosomal o lisosomal de, por ejemplo, contenidos que están encapsulados en una composición liposomal (por ejemplo, nanopartícula lipídica) de la invención. Dicha liberación mejorada puede lograrse mediante uno o ambos mecanismos de alteración mediada por esponja de protones y/o un mecanismo de fusogenicidad mejorado. El mecanismo de esponja de protones se basa en la capacidad de un compuesto, y en particular de una fracción o grupo funcional del compuesto, para tamponar la acidificación del endosoma. Esto puede manipularse o controlarse de otro modo mediante el pKa del compuesto o de uno o más de los grupos funcionales que componen dicho compuesto (por ejemplo, imidazol). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la fusogenicidad de, por ejemplo, los compuestos basados en imidazol divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4001 y HGT4004) está relacionada con las propiedades de alteración endosomal, facilitadas por dichos grupos imidazol, que tienen un pKa más bajo con respecto a otros lípidos catiónicos tradicionales. Dichas propiedades de alteración endosomal promueven a su vez la hinchazón osmótica y la alteración de la membrana liposomal, seguido de la transfección o liberación intracelular de los materiales polinucleotídicos cargados o encapsulados en la misma en la célula diana. Este fenómeno puede aplicarse a una variedad de compuestos con perfiles de pKa deseables además de una fracción de imidazol. Tales realizaciones también incluyen funcionalidades basadas en múltiples nitrógenos, como poliaminas, polipéptidos (histidina) y estructuras dendríticas basadas en nitrógeno.
Los compuestos, y en particular los compuestos basados en imidazol descritos en la presente (por ejemplo, HGT4001 y HGT4004), también se caracterizan por su toxicidad reducida, en particular con respecto a los lípidos tradicionales y los lípidos catiónicos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente comprenden uno o más compuestos lipídicos catiónicos basados en imidazol, de tal manera que la concentración relativa de otros lípidos catiónicos más tóxicos en dicha composición farmacéutica o liposomal puede reducirse o eliminarse de otro modo. Los compuestos o lípidos basados en imidazol (por ejemplo, HGT4001 y/o HGT4004) pueden usarse como el único lípido catiónico en una o más de las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas), o alternativamente pueden combinarse con lípidos catiónicos tradicionales (por ejemplo, LIPOFECTINA o LIPOFECTAMINA), lípidos no catiónicos, lípidos auxiliares/colesterol, y/o lípidos modificados con PEG. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente, o alternativamente el componente lipídico catiónico total de las composiciones farmacéuticas y liposomales, pueden comprender una relación molar de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40% del lípido total presente en dicha composición farmacéutica o liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica), o preferiblemente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en dicha composición farmacéutica o liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica).
En ciertas realizaciones, por lo menos uno de los grupos funcionales de las fracciones que componen los compuestos divulgados en la presente es de naturaleza hidrófoba (por ejemplo, un grupo de cola hidrófobo que comprende un lípido natural como el colesterol). Como se usa en la presente, el término "hidrófobo" se usa para indicar en términos cualitativos que un grupo funcional evita el agua, y típicamente dichos grupos no son solubles en agua. Por ejemplo, en la presente se divulgan compuestos que comprenden un grupo funcional escindible (por ejemplo, un grupo disulfuro (S-S)) unido a uno o más grupos hidrófobos, en donde dichos grupos hidrófobos comprenden uno o más lípidos de origen natural como el colesterol, y/o un alquilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado y/o un acilo C<6>-C<20>opcionalmente sustituido, variablemente saturado o insaturado.
En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente comprenden, por ejemplo, por lo menos un grupo de cabeza hidrófilo y por lo menos un grupo de cola hidrófobo, cada uno de ellos unido a por lo menos un grupo escindible, lo que hace que dichos compuestos sean anfifílicos. Como se usa en la presente para describir un compuesto o composición, el término "anfifílico" significa la capacidad de disolverse en entornos tanto polares (por ejemplo, agua) como no polares (por ejemplo, lípidos). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente comprenden por lo menos un grupo de cola lipófilo (por ejemplo, colesterol o un alquilo C6-C<20>) y por lo menos un grupo de cabeza hidrófilo (por ejemplo, imidazol), cada uno unido a un grupo escindible (por ejemplo, disulfuro).
Debe tenerse en cuenta que los términos "grupo de cabeza" y "grupo de cola" usados para describir los compuestos de la presente invención, y en particular los grupos funcionales que comprenden tales compuestos, se usan para facilitar la referencia para describir la orientación de uno o más grupos funcionales con respecto a otros grupos funcionales. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un grupo de cabeza hidrófilo (por ejemplo, guanidinio) está unido (por ejemplo, por uno o más enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones iónicas y enlaces covalentes) a un grupo funcional escindible (por ejemplo, un grupo disulfuro), que a su vez está unido a un grupo de cola hidrófobo (por ejemplo, colesterol).
Como se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a hidrocarburos C<1>-C<40>de cadena lineal y ramificada (por ejemplo, hidrocarburos C<6>-C<20>), e incluye hidrocarburos tanto saturados como insaturados. En ciertas realizaciones, el alquilo puede comprender uno o más alquilos cíclicos y/o uno o más heteroátomos como oxígeno, nitrógeno o azufre y puede estar opcionalmente sustituido con sustituyentes (por ejemplo, uno o más de alquilo, halo, alcoxilo, hidroxi, amino, arilo, éter, éster o amida). En ciertas realizaciones, un alquilo contemplado incluye (9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien. El uso de designaciones como, por ejemplo, "C<6>-C<20>" se pretende que se refieran a un alquilo (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada e incluya alquenos y alquilos) que tiene el intervalo de átomos de carbono enumerado.
Como se usa en la presente, el término "arilo" se refiere a grupos aromáticos (por ejemplo, estructuras monocíclicas, bicíclicas y tricíclicas) que contienen de seis a diez carbonos en la porción de anillo. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por átomos de carbono disponibles y, en ciertas realizaciones, pueden incluir uno o más heteroátomos, como oxígeno, nitrógeno o azufre.
Los compuestos y composiciones farmacéuticas divulgados en la presente pueden prepararse de tal manera que, tras la exposición a condiciones seleccionadas (por ejemplo, condiciones biológicas o enzimáticas adecuadas), el grupo conector escindible (por ejemplo, un grupo disulfuro) se escinde y, por lo tanto, provoca la disociación de uno o más de los grupos o fracciones funcionales (por ejemplo, un grupo cabeza y/o cola) unidos al mismo. La disociación de los grupos o fracciones funcionales puede provocar una transición de fase en la composición liposomal de la que uno o más de los compuestos divulgados en la presente es un componente que desestabiliza el liposoma y facilita la fusión con la membrana de una o más células diana.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona el compuesto 1-(2-((3S,10R,13R)-10,13-dimetil-17-((R)-6metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)disulfanil)etil) guanidina, con la estructura de la fórmula V (denominado en la presente "HGT4002").
Los compuestos descritos en la presente pueden usarse para construir composiciones liposomales que faciliten o mejoren la administración y la liberación de materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos terapéuticos) a una o más células diana (por ejemplo, permeando o fusionándose con las membranas lipídicas de dichas células diana). En ciertas realizaciones, el uno o más grupos funcionales escindibles que comprenden tales compuestos permiten, por ejemplo, que un grupo de cabeza funcional hidrófilo se disocie (por ejemplo, tras la exposición a condiciones reductoras o ácidas) de un grupo de cola funcional lipófilo del compuesto, facilitando de este modo una transición de fase en la bicapa lipídica de una o más células diana. Por ejemplo, cuando una composición liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) comprende o está enriquecida con uno o más de los compuestos divulgados en la presente, la transición de fase en la bicapa lipídica de una o más células diana facilita la administración de los materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos terapéuticos encapsulados en una nanopartícula lipídica) a una o más células diana.
En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se caracterizan por tener una o más propiedades que proporcionan a dichos compuestos ventajas con respecto a otros lípidos clasificados de manera similar. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente permiten controlar y adaptar las propiedades de las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) de las que son un componente. En particular, los compuestos divulgados en la presente pueden caracterizarse por una mayor eficacia de transfección y su capacidad para provocar resultados biológicos específicos. Tales resultados pueden incluir, por ejemplo, captación celular mejorada, capacidades de alteración endosomal/lisosomal y/o promover la liberación de materiales encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos) intracelularmente.
En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente (y las composiciones farmacéuticas y liposomales que comprenden dichos compuestos) emplean una estrategia multifuncional para facilitar la administración de materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos) a una o más células diana y su posterior transfección. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente (y las composiciones farmacéuticas y liposomales que comprenden dichos compuestos) se caracterizan por tener una o más de las siguientes propiedades: endocitosis mediada por receptor, endocitosis mediada por clatrina y caveola, fagocitosis y macropinocitosis, fusogenicidad, alteración endosomal o lisosomal y/o propiedades liberables que proporcionan a dichos compuestos ventajas con respecto a otros lípidos clasificados de manera similar.
En ciertas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas y liposomales de las que son un componente tales compuestos (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) presentan una capacidad mejorada (por ejemplo, aumentada) para transfectar una o más células diana. Por consiguiente, también se proporcionan en la presente métodos de transfección de una o más células diana. Tales métodos comprenden generalmente el paso de poner en contacto la una o más células diana con los compuestos y/o composiciones farmacéuticas divulgados en la presente (por ejemplo, una nanopartícula lipídica basada en HGT4003 que encapsula uno o más polinucleótidos) de tal manera que la una o más células diana se transfectan con los materiales encapsulados en la misma (por ejemplo, uno o más polinucleótidos). Como se usan en la presente, los términos "transfectar" o "transfección" se refieren a la introducción intracelular de uno o más materiales encapsulados (por ejemplo, ácidos nucleicos y/o polinucleótidos) en una célula, o preferiblemente en una célula diana. El polinucleótido introducido puede mantenerse de manera estable o transitoria en la célula diana. El término "eficacia de transfección" se refiere a la cantidad relativa de dicho material encapsulado (por ejemplo, polinucleótidos) absorbida, introducida y/o expresada por la célula diana sometida a transfección. En la práctica, la eficacia de la transfección se estima por la cantidad de un producto polinucleótido informador producido por las células diana tras la transfección. En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente demuestran una alta eficiencia de transfección, mejorando de este modo la probabilidad de que las dosificaciones apropiadas de los materiales encapsulados (por ejemplo, uno o más polinucleótidos) sean administradas al sitio de la patología y posteriormente expresadas, mientras que al mismo tiempo se minimizan los posibles efectos adversos sistémicos.
Pueden administrarse a las células diana una amplia variedad de materiales que pueden ejercer efectos farmacéuticos o terapéuticos usando los compuestos, composiciones y métodos de la presente invención. Por consiguiente, los compuestos y composiciones farmacéuticas y liposomales descritos en la presente pueden usarse para encapsular cualquier material adecuado para la administración intracelular. En ciertas realizaciones, dichos materiales encapsulados son capaces de conferir un beneficio terapéutico o diagnóstico a las células en las que se administran dichos materiales, y pueden incluir cualquier fármaco, producto biológico y/o diagnóstico. Los materiales pueden ser orgánicos o inorgánicos. Las moléculas orgánicas pueden ser péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, esteroles, ácidos nucleicos (incluyendo los ácidos nucleicos peptídicos) o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente pueden comprender o encapsular de otro modo más de un tipo de material, por ejemplo, dos o más secuencias de polinucleótidos diferentes que codifican una proteína, una enzima y/o un esteroide. En ciertas realizaciones, los materiales encapsulados son uno o más polinucleótidos y ácidos nucleicos.
Como se usan en la presente, los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se emplean indistintamente para referirse a material genético (por ejemplo, ADN o ARN), y cuando tales términos se usan con respecto a los compuestos y composiciones descritos en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se refieren en general al material genético encapsulado por tales compuestos y composiciones (por ejemplo, nanopartículas lipídicas). En algunas realizaciones, el polinucleótido es ARN. El ARN adecuado incluye ARNm, ARNip, ARNmi, ARNsn y ARNsno. Los polinucleótidos contemplados también incluyen ARN no codificante intergénico grande (lincARN), que generalmente no codifica proteínas, sino que funciona, por ejemplo, en la señalización inmunitaria, la biología de células madre y el desarrollo de enfermedades. (Consultar, por ejemplo, Guttman, et al., 458: 223-227 (2009); y Ng, et al., Nature Genetics 42: 1035-1036 (2010), cuyo contenido se incorpora en la presente por referencia). En realizaciones preferidas, el polinucleótido es ARNm. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la invención incluyen ARN o ARN estabilizado que codifica una proteína o enzima (por ejemplo, ARNm que codifica alfa galactosidasa). La presente invención contempla el uso de tales polinucleótidos (y en particular ARN o ARN estabilizado) como un agente terapéutico que es capaz de ser expresado por células diana para facilitar de este modo la producción (y en ciertos casos la excreción) de una enzima o proteína funcional por tales células diana como se divulga por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2010/058457 y en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/494,881, presentada el<8>de junio de 2011, cuyas enseñanzas se incorporan ambas en la presente por referencia en su totalidad. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, tras la expresión de uno o más polinucleótidos por células diana puede observarse la producción de una enzima o proteína funcional de la que un sujeto es deficiente (por ejemplo, una enzima del ciclo de la urea o una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal). El término "funcional", como se usa en la presente para calificar una proteína o enzima, significa que la proteína o enzima tiene actividad biológica, o alternativamente es capaz de realizar la misma función, o una función similar, que la proteína o enzima nativa o que funciona normalmente.
En el contexto de la presente invención, el término "expresión" se usa en su sentido más amplio para referirse a la transcripción de un gen o polinucleótido específico en por lo menos un transcrito de ARNm, o a la traducción de por lo menos un ARNm o polinucleótido en una proteína o enzima. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas o liposomales descritos en la presente comprenden un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica una proteína o enzima funcional. En el contexto de tales polinucleótidos de ARNm, el término expresión se refiere a la traducción de dicho ARNm (por ejemplo, por las células diana) para producir el polipéptido o proteína codificado por el mismo.
En ciertas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas proporcionados en la presente son capaces de modular la expresión de ácidos nucleicos y polinucleótidos expresados de forma aberrante en una o más células y tejidos diana. Por consiguiente, también se divulgan en la presente métodos de tratamiento de enfermedades en un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad eficaz de los compuestos y/o las composiciones farmacéuticas o liposomales descritas en la presente. En ciertas realizaciones, dichos métodos pueden mejorar (por ejemplo, aumentar) la expresión de un polinucleótido y/o aumentar la producción y secreción de un producto polipeptídico funcional en una o más células y tejidos diana (por ejemplo, hepatocitos). En algunas realizaciones, las células o tejidos diana expresan de forma aberrante el polinucleótido encapsulado por uno o más de los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) descritos en la presente. También se proporcionan en la presente métodos para aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) en una o más células, tejidos y órganos diana. Generalmente, dichos métodos comprenden poner en contacto las células diana con uno o más compuestos y/o composiciones farmacéuticas o liposomales que comprenden o encapsulan de otro modo uno o más polinucleótidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente pueden usarse como un liposoma o como un componente de un liposoma. Específicamente, en ciertas realizaciones los compuestos divulgados en la presente pueden usarse como un componente lipídico (por ejemplo, lípido catiónico) de una composición liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica). Dichos liposomas pueden usarse para encapsular materiales y facilitar la administración de dichos materiales a una o más células, tejidos y órganos diana. Como se usa en la presente, el término "liposoma" se refiere generalmente a una vesícula compuesta de lípidos (por ejemplo, lípidos anfifílicos) dispuestos en una o más bicapas o bicapas esféricas. En ciertas realizaciones, el liposoma es una nanopartícula lipídica (por ejemplo, una nanopartícula lipídica que comprende uno o más de los compuestos lipídicos catiónicos divulgados en la presente). Tales liposomas pueden ser vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso que contiene los materiales encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos) que se administrarán a una o más células, tejidos y órganos diana. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente comprenden una o más nanopartículas lipídicas. Los liposomas contemplados incluyen nanopartículas lipídicas. Ejemplos de lípidos adecuados (por ejemplo, lípidos catiónicos) que pueden usarse para formar los liposomas y nanopartículas lipídicas contemplados en la presente incluyen uno o más de los compuestos divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005). Tales liposomas y nanopartículas lipídicas también pueden comprender lípidos catiónicos adicionales como C12-200, DLin-KC2-DMA, y/o HGT5001, lípidos no catiónicos, lípidos ayudantes/basados en colesterol, lípidos modificados con PEG, así como los compuestos fosfatidil (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos) y combinaciones o mezclas de los anteriores.
En la bibliografía se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. En ciertas realizaciones, tales lípidos catiónicos se incluyen en las composiciones farmacéuticas o liposomales descritas en la presente además de uno o más de los compuestos o lípidos divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4003). En algunas realizaciones, se usa el lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4,897,355). La DOTMA puede formularse sola o puede combinarse con un lípido neutro, dioleoilfosfatidiletanolamina o "DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en una nanopartícula lipídica. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, lípidos catiónicos ionizables como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/617,468, presentada el 29 de marzo de 2012 (incorporada en la presente por referencia) como, por ejemplo, (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-diem-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (<h>G<t>5000), (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001), y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien-1-amina (HGT5002); C12-200 (WO 2010/053572), 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLinKC2-DMA)) (Consultar, WO 2010/042877; Semple et al., nature Biotech. 28:172-176 (2010)), 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina "DLin-KC2-DMA," (3S,10R,13R,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato "ICE," (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-1518-dien-1-amina "HGT5000," (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina "HGT5001", y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien-1-amina "HGT5002", 5-carboxispermilglicina-dioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci.<8 6>, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5,171,678; Patente de Estados Unidos N° 5,334,761), 1,2-Dioleoil-3-Dimetilamonio-Propano o "DODAP", 1,2-Dioleool-3-Trimetolamonio-Propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", N,N-distearil-N,N-dimetilamonio bromuro o "d Da B", N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil bromuro de amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de PCT WO2005/121348A1). La presente invención también contempla el uso de lípidos catiónicos basados en colesterol para formular las composiciones (por ejemplo, nanopartículas lipídicas). Tales lípidos catiónicos basados en colesterol pueden usarse solos o en combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos basados en colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Chol (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilaminopropil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.744.335).
También se contemplan lípidos catiónicos como los lípidos basados en dialquilamino, basados en imidazol y basados en guanidinio. Por ejemplo, también se contempla el uso del lípido catiónico (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptano-2-il)-2, 3, 4, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato o "ICE", según se divulga en la Solicitud Internacional N° PCT/US2010/058457.
En las composiciones liposomales y farmacéuticas descritas en la presente también se contempla el uso y la inclusión de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivados como ceramidas derivadas (PEG-CER), incluyendo N-octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (ceramida C<8>PEG-2000), preferiblemente en combinación con uno o más de los compuestos y lípidos descritos en la presente. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena o cadenas alquílicas de C<6>-C<20>de longitud. En algunas realizaciones, el lípido modificado con PEG empleado en las composiciones y métodos de la invención es 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol (2000 MW PEG) "DMG-PEG2000". La adición de lípidos modificados con PEG al vehículo de administración de lípidos puede evitar la agregación del complejo y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de circulación y aumentar la administración de la composición de lípidopolinucleótido a los tejidos diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para que se intercambien rápidamente fuera de la formulaciónin vivo(consultar la Patente de Estados Unidos N° 5.885.613). Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos derivados de la presente invención pueden comprender una proporción molar de aproximadamente el 0% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, o de aproximadamente el 2% del lípido total presente en una nanopartícula lipídica liposomal.
La presente invención también contempla el uso de lípidos no catiónicos en una o más de las composiciones farmacéuticas o liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas). Dichos lípidos no catiónicos se usan preferiblemente en combinación con uno o más de los compuestos y lípidos divulgados en la presente. Como se usa en la presente, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga neta negativa a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoilooilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina ( POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), DLPE (1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPS (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina), 16-O-monometil PE, 1<6>-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), ceramidas, esfingomielinas, colesterol o una mezcla de los mismos. Tales lípidos no catiónicos pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, uno o más de los compuestos lipídicos catiónicos divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005). Cuando se usa en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar del 5% a aproximadamente el 90%, o preferiblemente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en la nanopartícula lipídica.
También se contempla la inclusión de polímeros en las nanopartículas lipídicas que componen las composiciones farmacéuticas o liposomales descritas en la presente. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquilcianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactida-poliglicolida, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas y polietilenimina. Tales polímeros pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, uno o más de los compuestos lipídicos catiónicos divulgados en la presente (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y/o HGT4005).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se formulan basándose en parte en su capacidad para facilitar la transfección (por ejemplo, de un polinucleótido) de una célula diana. En otra realización, las composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) pueden seleccionarse y/o prepararse para optimizar la administración de polinucleótidos a una célula, tejido u órgano diana. Por ejemplo, si la célula diana es un hepatocito, las propiedades de las composiciones farmacéuticas y/o liposomales (por ejemplo, tamaño, carga y/o pH) pueden optimizarse para administrar eficazmente dicha composición (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) a la célula u órgano diana, reducir la depuración inmunitaria y/o promover la retención en ese órgano diana. Alternativamente, si el tejido diana es el sistema nervioso central, la selección y preparación de las composiciones farmacéuticas y liposomales deben considerar la penetración y retención dentro de la barrera hematoencefálica y/o el uso de medios alternativos para administrar directamente dichas composiciones (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) a dicho tejido diana (por ejemplo, mediante administración intracerebrovascular). En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o liposomales o sus nanopartículas lipídicas constituyentes pueden combinarse con agentes que facilitan la transferencia de los materiales encapsulados (por ejemplo, agentes que alteran o mejoran la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, potencian la transferencia de dichos polinucleótidos encapsulados a las células diana). Aunque las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) pueden facilitar la introducción de materiales encapsulados, como uno o más polinucleótidos, en las células diana, la adición de policationes (por ejemplo, poli L-lisina y protamina) a, por ejemplo, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas como un copolímero también puede facilitar, y en algunos casos mejorar notablemente la eficacia de transfección de varios tipos de liposomas catiónicos entre 2 y 28 veces en una serie de líneas celulares tantoin vitrocomoin vivo.(Consultar, N.J. Caplen, et al., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891.)
En ciertas realizaciones de la presente invención, las composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se preparan para encapsular uno o más materiales o agentes terapéuticos (por ejemplo, polinucleótidos). El proceso de Incorporación de un agente terapéutico deseado (por ejemplo, ARNm) en un liposoma o una nanopartícula lipídica se denomina en la presente "carga" o "encapsulación" (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). Los materiales cargados o encapsulados en nanopartículas lipídicas (por ejemplo, polinucleótidos) pueden estar situados total o parcialmente en el espacio interior de la nanopartícula lipídica, dentro de la membrana bicapa de la nanopartícula lipídica, o asociados a la superficie exterior de la nanopartícula lipídica.
Cargar o encapsular, por ejemplo, un polinucleótido en una nanopartícula lipídica puede servir para proteger el polinucleótido de un entorno que puede contener enzimas o sustancias químicas (por ejemplo, suero) que degradan dichos polinucleótidos y/o sistemas o receptores que provocan la excreción rápida de dichos polinucleótidos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones descritas en la presente son capaces de mejorar la estabilidad del polinucleótido o polinucleótidos encapsulados, en particular con respecto a los entornos a los que se expondrán dichos polinucleótidos. La encapsulación de materiales, como por ejemplo polinucleótidos, en una o más de las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) también facilita la administración de dichos polinucleótidos a las células y tejidos diana. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más de los compuestos lipídicos descritos en la presente pueden permitir que el polinucleótido encapsulado alcance la célula diana o pueden permitir preferiblemente que el polinucleótido encapsulado alcance las células u órganos diana de forma discriminatoria (por ejemplo, las nanopartículas lipídicas pueden concentrarse en el hígado o el bazo de un sujeto al que se administran dichas nanopartículas lipídicas). Alternativamente, las nanopartículas lipídicas pueden limitar la administración de polinucleótidos encapsulados a otras células u órganos no diana en los que la presencia de los polinucleótidos encapsulados puede ser indeseable o de utilidad limitada.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se preparan combinando múltiples componentes lipídicos (por ejemplo, uno o más de los compuestos divulgados en la presente) con uno o más componentes poliméricos. Por ejemplo, una nanopartícula lipídica puede prepararse usando HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG2000. Una nanopartícula lipídica puede estar compuesta de combinaciones lipídicas adicionales en varias proporciones, incluyendo, por ejemplo, HGT4001, DOPE y DMG-PEG2000. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que componen las nanopartículas lipídicas, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del lípido o lípidos seleccionados, la naturaleza de las células o tejidos diana previstos y las características de los materiales o polinucleótidos que van a ser administrados por la nanopartícula lipídica. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquílica, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la toxicidad del lípido o lípidos seleccionados.
La composición farmacéutica y liposomal (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) para su uso en la presente invención puede prepararse mediante varias técnicas actualmente conocidas en la técnica. Las vesículas multilamelares (MLV) pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un contenedor o recipiente adecuado, disolviendo el lípido en un solvente apropiado y evaporando a continuación el solvente para dejar una película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. A continuación, puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da lugar a la formación de MLV. A continuación, pueden formarse vesículas unilamelares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, pueden formarse vesículas unilamelares mediante técnicas de eliminación de detergentes.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención comprenden una nanopartícula lipídica en la que el polinucleótido encapsulado (por ejemplo, ARNm) está asociado tanto en la superficie de la nanopartícula lipídica como encapsulado dentro de la misma nanopartícula lipídica. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, uno o más de los compuestos lipídicos catiónicos descritos en la presente y que comprenden las nanopartículas lipídicas pueden asociarse con los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) a través de interacciones electrostáticas con tales polinucleótidos.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención pueden cargarse con radionúclidos de diagnóstico, materiales fluorescentes u otros materiales que son detectables tanto en aplicacionesin vitrocomoin vivo.Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados para su uso en la presente invención pueden incluir rodamina-dioleoilfosfatidiletanolamina (Rh-PE), ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa deRenillay ARNm de luciferasa de luciérnaga (S<e>Q ID NO: 1).
Durante la preparación de las composiciones liposomales descritas en la presente, los agentes portadores solubles en agua también pueden encapsularse en el interior acuoso incluyéndolos en la solución hidratante, y las moléculas lipófilas pueden incorporarse a la bicapa lipídica mediante su inclusión en la formulación lipídica. En el caso de ciertas moléculas (por ejemplo, polinucleótidos lipófilos catiónicos o aniónicos), la carga del polinucleótido en nanopartículas lipídicas o liposomas preformados puede lograrse, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Patente de Estados Unidos N° 4,946,683. Después de la encapsulación del polinucleótido, las nanopartículas lipídicas pueden procesarse para eliminar el ARNm no encapsulado mediante procesos como cromatografía en gel, diafiltración o ultrafiltración. Por ejemplo, si se desea eliminar el polinucleótido unido externamente de la superficie de las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) descritas en la presente, dichas nanopartículas lipídicas pueden someterse a una columna de dietilaminoetil SEPHACEL.
Además de los materiales encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos o uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico) pueden incluirse o encapsularse en la nanopartícula lipídica. Por ejemplo, tales agentes terapéuticos adicionales pueden asociarse a la superficie de la nanopartícula lipídica, pueden incorporarse a la bicapa lipídica de la nanopartícula lipídica mediante su inclusión en la formulación lipídica o su carga en nanopartículas lipídicas preformadas (Consultar, Patentes de Estados Unidos N° 5,194,654 y 5,223,263).
Existen varios métodos para reducir el tamaño, o "dimensionamiento", de las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) divulgadas en la presente, y cualquiera de estos métodos puede emplearse generalmente cuando se usa el dimensionamiento como parte de la invención. El método de extrusión es uno de los métodos de dimensionamiento de liposomas (Hope, M J et al. Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques. En: Liposome Technology (G. Gregoriadis, Ed.) Vol. 1. p 123 (1993)). El método consiste en extruir liposomas a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana cerámica asimétrica para reducir los tamaños de los liposomas a una distribución de tamaños relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión se cicla por la membrana una o más veces hasta conseguir la distribución de tamaños de liposomas deseada. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas con poros sucesivamente más pequeños para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas.
Hay una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica para dimensionar una población de nanopartículas lipídicas. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,737,323. La sonicación de una suspensión de liposomas o nanopartículas lipídicas, ya sea por sonicación en baño o por sonicación con sonda, produce una reducción progresiva del tamaño hasta pequeñas ULV de menos de aproximadamente 0,05 micras de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las ULV se hacen recircular a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre 0,1 y 0,5 micras aproximadamente. El tamaño de las nanopartículas lipídicas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasi-eléctrica (QELS), como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981), incorporado en la presente por referencia. El diámetro medio de las nanopartículas lipídicas puede reducirse por sonicación de las nanopartículas lipídicas formadas. Los ciclos de sonicación intermitentes pueden alternarse con la evaluación QELS para guiar la síntesis eficiente de liposomas.
La selección del tamaño adecuado de las composiciones liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) debe tener en cuenta el lugar de la célula o tejido diana y, en cierta medida, la aplicación para la que se fabrica la nanopartícula lipídica. Como se usa en la presente, la frase "célula diana" se refiere a las células a las que se dirigen una o más de las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente. En algunas realizaciones, las células diana comprenden un tejido u órgano particular. En algunas realizaciones, las células diana son deficientes en una proteína o enzima de interés. Por ejemplo, cuando se desea administrar un polinucleótido a un hepatocito, el hepatocito representa la célula diana. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o liposomales (y por ejemplo los materiales polinucleotídicos encapsulados en las mismas) de la presente invención transfectan las células diana de forma discriminatoria (es decir, no transfectan células no diana). Las composiciones y métodos de la presente invención pueden prepararse para que se dirijan preferiblemente a una variedad de células diana, que incluyen, pero no se limitan a, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales (por ejemplo, meninges, astrocitos, motoneuronas, células de los ganglios de la raíz dorsal y motoneuronas del asta anterior), células fotorreceptoras (por ejemplo, bastones y conos), células epiteliales pigmentadas retinianas, células secretoras, células cardíacas, adipocitos, células musculares lisas vasculares, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células de revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
Tras la transfección de una o más células diana por, por ejemplo, los polinucleótidos encapsulados en la una o más nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas o liposomales divulgadas en la presente, puede estimularse preferiblemente la producción del producto (por ejemplo, un polipéptido o proteína) codificado por dicho polinucleótido y se aumenta la capacidad de dichas células diana para que expresen el polinucleótido y producir, por ejemplo, un polipéptido o proteína de interés. Por ejemplo, la transfección de una célula diana por uno o más compuestos o composiciones farmacéuticas que encapsulan ARNm mejorará (es decir, aumentará) la producción de la proteína o enzima codificada por dicho ARNm.
En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección de los polinucleótidos a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, el hígado representa un órgano diana importante para las composiciones de la presente invención en parte debido a su papel central en el metabolismo y la producción de proteínas y, por consiguiente, las enfermedades que están provocadas por defectos en productos génicos específicos del hígado (por ejemplo, los trastornos del ciclo de la urea) pueden beneficiarse del direccionamiento específico de las células (por ejemplo, hepatocitos). Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la presente invención, las características estructurales del tejido diana pueden explotarse para dirigir la distribución de las composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención (por ejemplo, una nanopartícula lipídica basada en HGT4001) a dichos tejidos diana. Por ejemplo, para dirigirse a los hepatocitos, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas o liposomales descritas en la presente pueden dimensionarse de tal manera que sus dimensiones sean menores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; por consiguiente, la una o más de dichas nanopartículas lipídicas pueden penetrar fácilmente dichas fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana. Alternativamente, una nanopartícula lipídica puede dimensionarse de tal manera que las dimensiones del liposoma tengan un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en ciertas células o tejidos. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente pueden tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar de este modo la distribución de la nanopartícula lipídica liposomal a los hepatocitos. En tal realización, las composiciones liposomales grandes (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) no penetrarán fácilmente las fenestraciones endoteliales y, en su lugar, serán eliminadas por las células macrófagas de Kupffer que recubren los sinusoides hepáticos. El dimensionamiento de, por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica puede, por tanto, proporcionar una oportunidad para manipular más y controlar con precisión el grado en que puede mejorarse la expresión de los polinucleótidos encapsulados en una o más células diana. Generalmente, el tamaño de por lo menos una de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención está dentro del intervalo de aproximadamente<2 5>a<2 5 0>nm, preferiblemente menos de aproximadamente 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10 nm.
De manera similar, las composiciones de la presente invención pueden prepararse para que se distribuyan preferiblemente a otros tejidos, células u órganos diana, como el corazón, los pulmones, los riñones o el bazo. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas de la presente invención pueden prepararse para lograr una distribución mejorada a las células y tejidos diana. Por consiguiente, las composiciones de la presente invención pueden enriquecerse con lípidos catiónicos, no catiónicos y modificados con PEG adicionales para que se dirijan a tejidos o células adicionales.
En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas basadas en HGT4002) se distribuyen a las células y tejidos del hígado para potenciar la administración, transfección y posterior expresión de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) encapsulados en los mismos por las células y tejidos del hígado (por ejemplo, hepatocitos) y la producción correspondiente del polipéptido o proteína codificada por dicho polinucleótido. Aunque dichas composiciones pueden distribuirse preferiblemente en las células y tejidos del hígado, los efectos terapéuticos de los polinucleótidos expresados y la consiguiente producción de una proteína codificada por los mismos no tienen por qué limitarse a las células y tejidos diana. Por ejemplo, los hepatocitos diana pueden funcionar como un "reservorio" o "depósito" capaz de expresar o producir, y excretar sistémica o periféricamente una proteína o enzima funcional, como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2010/058457 y en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N° 61/494.881. Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la presente invención, la una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas basadas en HGT4005) pueden dirigirse a hepatocitos y/o distribuirse preferiblemente a las células y tejidos del hígado tras la administración. Después de la transfección de los hepatocitos diana por el polinucleótido encapsulado en una o más de tales nanopartículas lipídicas, tales polinucleótidos se expresan (por ejemplo, se traducen) y se excreta y distribuye sistémicamente un producto funcional (por ejemplo, un polipéptido o proteína), donde dicho producto funcional puede ejercer un efecto terapéutico deseado.
Los polinucleótidos encapsulados en uno o más de los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales divulgados en la presente pueden administrarse y/o transfectar células o tejidos diana. En algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados son capaces de ser expresados y de producir productos polipeptídicos funcionales (y en algunos casos excretados) por la célula diana, confiriendo de este modo una propiedad beneficiosa a, por ejemplo, las células o tejidos diana. Tales polinucleótidos encapsulados pueden codificar, por ejemplo, una hormona, enzima, receptor, polipéptido, péptido u otra proteína de interés. En ciertas realizaciones, tales polinucleótidos encapsulados pueden codificar también un a Rn interferente pequeño (ARNip) o un ARN antisentido con el propósito de modular o disminuir o eliminar de otro modo la expresión de un ácido nucleico o gen endógeno. En ciertas realizaciones, tales polinucleótidos encapsulados pueden ser de naturaleza natural o recombinante y pueden ejercer su actividad terapéutica usando mecanismos de acción en sentido o antisentido (por ejemplo, modulando la expresión de un gen o ácido nucleico diana).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína deficiente) pueden incluir opcionalmente modificaciones químicas o biológicas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad y/o la vida media de dicho polinucleótido o que mejoran o facilitan de otro modo la traducción de dicho polinucleótido.
También se contempla en la presente invención la coadministración de uno o más polinucleótidos únicos a células diana mediante los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales descritos en la presente, por ejemplo, combinando dos agentes terapéuticos o polinucleótidos únicos en una única nanopartícula lipídica. También se contempla la administración de uno o más polinucleótidos encapsulados a una o más células diana para tratar un único trastorno o deficiencia, en donde cada polinucleótido funciona mediante un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas o liposomales de la presente invención pueden comprender un primer polinucleótido que, por ejemplo, está encapsulado en una nanopartícula lipídica y destinado a corregir una deficiencia de proteína o enzima endógena, y un segundo polinucleótido destinado a desactivar o "inactivar" un polinucleótido endógeno que funciona mal y su proteína o producto enzimático. Tales polinucleótidos encapsulados pueden codificar, por ejemplo, ARNm y ARNip.
Mientras que los polinucleótidos transcritosin vitro(por ejemplo, ARNm) pueden transfectarse en células diana, dichos polinucleótidos pueden ser degradados fácil y eficazmente por la célulain vivo,lo que hace que dichos polinucleótidos sean ineficaces. Además, algunos polinucleótidos son inestables en los fluidos corporales (especialmente en el suero humano) y pueden degradarse o digerirse incluso antes de llegar a la célula diana. Además, dentro de una célula, un ARNm natural puede descomponerse con una semivida de entre 30 minutos y varios días. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados proporcionados en la presente, y en particular los polinucleótidos de ARNm proporcionados en la presente, retienen preferiblemente por lo menos cierta capacidad de ser expresados o traducidos, para producir de este modo una proteína o enzima funcional dentro de una o más células diana.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y liposomales comprenden uno o más de los compuestos lipídicos divulgados en la presente y una o más nanopartículas lipídicas que incluyen o encapsulan uno o más polinucleótidos estabilizados (por ejemplo, ARNm que se ha estabilizado contra la digestión o degradaciónin vivopor nucleasas) que modulan la expresión de un gen o que pueden expresarse o traducirse para producir un polipéptido o proteína funcional dentro de una o más células diana. En ciertas realizaciones, la actividad de dichos polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína o enzima funcional) se prolonga durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, la actividad de los polinucleótidos puede prolongarse de tal manera que las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un sujeto de forma quincenal o bisemanal, o más preferiblemente de forma mensual, bimensual, trimestral o anual. La actividad extendida o prolongada de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, y en particular del ARNm encapsulado, está directamente relacionada con la cantidad de proteína o enzima funcional traducida a partir de dicho ARNm. De manera similar, la actividad de las composiciones de la presente invención puede ampliarse o prolongarse aún más mediante modificaciones químicas realizadas para mejorar o potenciar aún más la traducción de los polinucleótidos de ARNm. Por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac desempeña un papel en el inicio de la traducción de proteínas, y la inclusión de dicha secuencia consenso de Kozac en los polinucleótidos de ARNm encapsulados puede ampliar o prolongar aún más la actividad de los polinucleótidos de ARNm. Además, la cantidad de proteína o enzima funcional producida por la célula diana está en función de la cantidad de polinucleótido (por ejemplo, ARNm) administrado a las células diana y de la estabilidad de dicho polinucleótido. En la medida en que la estabilidad de los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones de la presente invención pueda mejorarse o potenciarse, pueden ampliarse aún más la semivida, la actividad de la proteína o enzima traducida y la frecuencia de dosificación de la composición.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos pueden modificarse químicamente, por ejemplo, para conferir estabilidad (por ejemplo, estabilidad con respecto a la versión de tipo salvaje o natural del ARNm y/o la versión del ARNm endógeno natural a las células diana). Por consiguiente, en algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados proporcionados en la presente comprenden por lo menos una modificación química que confiere estabilidad aumentada o mejorada al polinucleótido, incluyendo, por ejemplo, resistencia mejorada a la digestión por nucleasasin vivo.Como se usan en la presente, las frases "modificaciones químicas" y "modificado químicamente", tal como se relacionan con los polinucleótidos proporcionados en la presente, incluyen por lo menos una alteración que preferiblemente potencia la estabilidad y hace que el polinucleótido sea más estable (por ejemplo, resistente a la digestión por nucleasas) que la versión de tipo salvaje o natural de ese polinucleótido. Los términos "estable" y "estabilidad" en relación con los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención, y en particular con respecto al ARNm, se refieren a una resistencia aumentada o potenciada a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dicho ARN. La estabilidad aumentada puede incluir, por ejemplo, menos sensibilidad a la hidrólisis u otra destrucción por enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) o condiciones dentro de la célula o tejido diana, aumentando o mejorando de este modo la residencia de dichos polinucleótidos en la célula, tejido, sujeto y/o citoplasma diana. Las moléculas de polinucleótidos estabilizados proporcionadas en la presente demuestran vidas medias más largas en relación con sus homólogos naturales no modificados (por ejemplo, la versión de tipo salvaje del polinucleótido).
También están contemplados por las frases "modificación química" y "modificado químicamente" como tales términos relacionados con los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención las alteraciones que mejoran o potencian la traducción de polinucleótidos de ARNm, incluyendo, por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en el inicio de la traducción de proteínas (por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)). La frase "modificaciones químicas", como se usa en la presente, también incluye modificaciones que introducen químicas que difieren de las observadas en polinucleótidos naturales, por ejemplo, modificaciones covalentes como la introducción de nucleótidos modificados (por ejemplo, análogos de nucleótidos, o la inclusión de grupos colgantes que no se encuentran de manera natural en dichas moléculas de polinucleótidos). En algunas realizaciones, los polinucleótidos han experimentado una modificación química o biológica para hacerlos más estables antes de su encapsulación en una o más nanopartículas lipídicas. Las modificaciones químicas ejemplares de un polinucleótido incluyen la eliminación de una base (por ejemplo, por supresión o por sustitución de un nucleótido por otro) o la modificación química de una base.
Además, las modificaciones adecuadas incluyen alteraciones en uno o más nucleótidos de un codón, de tal manera que el codón codifique el mismo aminoácido pero sea más estable que el codón que se encuentra en la versión de tipo salvaje del polinucleótido. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y un mayor número de residuos de citidinas (C) y/o uridinas (U), y se ha descubierto que el ARN desprovisto de residuos de C y U es estable a la mayoría de las RNasas (Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). En algunas realizaciones, se reduce el número de residuos C y/o U en una secuencia de ARNm. En otra realización, el número de residuos C y/o U se reduce mediante la sustitución de un codón que codifica un aminoácido particular por otro codón que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas de los polinucleótidos de ARNm encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de pseudouridinas en los polinucleótidos de ARNm encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención puede mejorar la estabilidad y la capacidad de traducción, así como disminuir la inmunogenicidadin vivo.(Consultar, por ejemplo, Karikó, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)). Las sustituciones y modificaciones de los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención pueden realizarse por métodos fácilmente conocidos por un experto en la técnica.
Las limitaciones para reducir el número de residuos de C y U en una secuencia serán probablemente mayores dentro de la región codificante de un ARNm, en comparación con una región no traducida (es decir, probablemente no será posible eliminar todos los residuos de C y U presentes en el mensaje mientras se mantiene la capacidad del mensaje para codificar la secuencia de aminoácidos deseada). Sin embargo, la degeneración del código genético ofrece la oportunidad de reducir el número de residuos de C y/o U presentes en la secuencia, manteniendo la misma capacidad de codificación (es decir, dependiendo del aminoácido codificado por un codón, pueden existir varias posibilidades de modificación de las secuencias de ARN). Por ejemplo, los codones para Gly pueden alterarse a GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.
El término modificación química también incluye, por ejemplo, la incorporación de enlaces no nucleotídicos o nucleótidos modificados en las secuencias de polinucleótidos de la presente invención (por ejemplo, modificaciones de bloqueo de los extremos 3' y 5' de una molécula de ARNm que codifica una proteína o enzima funcional). Tales modificaciones pueden incluir la adición de bases a una secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, la inclusión de una cola poli A o una cola poli A más larga), la alteración de la UTR 3' o la UTR 5', la formación de complejos del polinucleótido con un agente (por ejemplo, una proteína o una molécula polinucleotídica complementaria) y la inclusión de elementos que cambien la estructura de una molécula polinucleotídica (por ejemplo, que formen estructuras secundarias).
Se cree que la cola de poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN de sentido sintético. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede añadirse una cola larga de poli A a una molécula de ARNm, lo que hace que el ARN sea más estable. Las colas de poli A pueden añadirse usando una variedad de técnicas reconocidas. Por ejemplo, pueden añadirse colas largas de poli A al ARN sintético o transcritoin vitrousando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas de poli A largas. Además, las colas de poli A pueden añadirse por transcripción directamente de productos de PCR. La poli A también puede ligarse al extremo 3' de un ARN de sentido con ARN ligasa (consultar, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)). En ciertas realizaciones, la longitud de la cola poli A es de por lo menos aproximadamente 90, 200, 300, 400 por lo menos 500 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la longitud de la cola poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm de sentido modificada de la invención y, por tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, como la longitud de la cola de poli A puede influir en la semivida de una molécula de ARNm de sentido, la longitud de la cola de poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar de este modo el curso temporal de la expresión del polinucleótido y la producción de proteínas en una célula diana. En ciertas realizaciones, las moléculas de polinucleótidos estabilizadas son suficientemente resistentes a la degradaciónin vivo(por ejemplo, por nucleasas), de tal manera que pueden administrarse a la célula diana sin una nanopartícula lipídica.
En ciertas realizaciones, las modificaciones químicas son modificaciones de bloqueo del extremo de uno o más polinucleótidos que comprenden las composiciones farmacéuticas de la invención. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden modificarse mediante la incorporación de secuencias 3' y/o 5' no traducidas (UTR) que no se encuentran de manera natural en el polinucleótido de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, puede incorporarse la secuencia flanqueante 3' y/o 5' que flanquea de manera natural un ARNm y codifica una segunda proteína no relacionada a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm que codifica una proteína o funcional para modificarla. Por ejemplo, pueden incorporarse las secuencias 3' o 5' de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) a la región 3' y/o 5' de una molécula de polinucleótido de ARNm de sentido para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm de sentido.
También se contemplan en la presente invención las modificaciones de las secuencias de polinucleótidos realizadas en uno o ambos extremos 3' y 5' del polinucleótido. Por ejemplo, la presente invención contempla modificaciones en los extremos 3' y/o 5' de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) para incluir una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la semivida del polinucleótido (como, por ejemplo, SEQ ID NO:1). Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de polinucleótidos del ARNm, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV (por ejemplo, a una o más de la región no traducida 5' y la región no traducida 3' del ARNm) mejora aún más la traducción del ARNm. También se contempla la inclusión de una secuencia del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH), o un fragmento del mismo en uno o ambos extremos 3' y 5' del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar aún más el polinucleótido (como, por ejemplo, SEQ I D<n>O:2). En general, las modificaciones químicas contempladas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la semivida) del polinucleótido con respecto a sus homólogos no modificados, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de dichos polinucleótidos a la digestiónin vivopor nucleasas.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica, las dos o más nanopartículas lipídicas comprendidas en la misma o los polinucleótidos encapsulados por dichas nanopartículas lipídicas pueden comprender un reactivo estabilizador. Las composiciones pueden incluir uno o más reactivos de formulación que se unen directa o indirectamente y estabilizan el polinucleótido, aumentando de este modo el tiempo de residencia en el citoplasma de una célula diana. Tales reactivos llevan preferiblemente a una vida media mejorada de un polinucleótido en las células diana. Por ejemplo, la estabilidad de un ARNm y la eficiencia de la traducción pueden aumentarse mediante la incorporación de "reactivos estabilizadores" que forman complejos con los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que se encuentran de manera natural dentro de una célula (consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.677.124). La incorporación de un reactivo estabilizador puede lograrse, por ejemplo, combinando la poli A y una proteína con el ARNm a estabilizarin vitroantes de cargar o encapsular el ARNm dentro de una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica. Los reactivos estabilizadores ejemplares incluyen una o más proteínas, péptidos, aptámeros, proteínas accesorias de la traducción, proteínas de unión al ARNm y/o factores de inicio de la traducción.
La estabilización de las composiciones farmacéuticas y liposomales descritas en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) también puede mejorarse mediante el uso de fracciones inhibidoras de la opsonización, que son típicamente polímeros hidrófilos de gran tamaño que se unen química o físicamente o se incorporan de otro modo a la nanopartícula lipídica (por ejemplo, mediante la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la propia membrana, o uniéndose directamente a grupos activos de lípidos de membrana). Estos polímeros hidrófilos inhibidores de la opsonización forman una capa superficial protectora que disminuye significativamente la captación de los liposomas por el sistema macrófago-monocito y el sistema retículo-endotelial (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,920,016. Por ejemplo, los retrasos en la captación de nanopartículas lipídicas por el sistema reticuloendotelial pueden facilitarse mediante la adición de un recubrimiento superficial de polímero hidrófilo sobre o dentro de las nanopartículas lipídicas para enmascarar el reconocimiento y la captación de la nanopartícula lipídica basada en liposomas por el sistema reticuloendotelial. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente comprenden un polímero de polietilenglicol (PEG) o un lípido modificado con PEG para mejorar aún más la administración de dichas nanopartículas lipídicas a la célula y tejidos diana.
Cuando el ARN hibrida con una molécula de polinucleótido complementaria (por ejemplo, ADN o ARN) puede quedar protegido de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARNm hibridado se debe probablemente a la especificidad inherente de cadena sencilla de la mayoría de las RNasas. En algunas realizaciones, el reactivo estabilizador seleccionado para formar complejos con un polinucleótido es una proteína eucariota (por ejemplo, una proteína de mamífero). En otra realización más, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para su uso en terapia de sentido puede modificarse por hibridación con una segunda molécula de polinucleótido. Si toda una molécula de ARNm se hibrida con una molécula de polinucleótido complementaria, puede reducirse el inicio de la traducción. En algunas realizaciones, la región 5' no traducida y la región de inicio AUG de la molécula de ARNm pueden opcionalmente dejarse sin hibridar. Después del inicio de la traducción, la actividad de desenrollado del complejo ribosómico puede funcionar incluso en dúplex de alta afinidad, de tal manera que pueda continuar la traducción. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22.) Se entenderá que cualquiera de los métodos descritos anteriormente para aumentar la estabilidad de los polinucleótidos puede usarse solo o en combinación con uno o más de cualquiera de los otros métodos y/o composiciones descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención mejoran la administración de polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas a una o más células, tejidos u órganos diana. En algunas realizaciones, la administración mejorada a una o más células diana comprende aumentar la cantidad de polinucleótido que entra en contacto o se administra de otro modo a las células diana. En algunas realizaciones, la mejora de la administración a las células diana comprende la reducción de la cantidad de polinucleótido que entra en contacto con células no diana. En algunas realizaciones, mejorar la administración a las células diana comprende permitir la transfección de por lo menos algunas células diana con el polinucleótido encapsulado. En algunas realizaciones, se aumenta en las células diana el nivel de expresión del polinucleótido encapsulado por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas objeto de estudio y la correspondiente producción de la proteína o enzima funcional codificada por el mismo.
Los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención pueden combinarse opcionalmente con un gen informador (por ejemplo, en sentido ascendente o en sentido descendente de la región codificante del polinucleótido) que, por ejemplo, facilita la determinación de la administración del polinucleótido a las células o tejidos diana. Los genes informadores adecuados pueden incluir, por ejemplo, ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa deRenilla(ARNm de luciferasa), ARNm de luciferasa de luciérnaga (SEQ ID NO: 1), o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARNm de GFP puede fusionarse con un polinucleótido que codifique ARNm de OTC para facilitar la confirmación de la localización del ARNm en las células, tejidos u órganos diana.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una o más moléculas adicionales (por ejemplo, proteínas, péptidos, aptámeros u oliogonucleótidos) que facilitan la transferencia de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm, ARNmi, ARNsn y ARNsno) desde la nanopartícula lipídica hacia un compartimento intracelular de la célula diana. En algunas realizaciones, la molécula adicional facilita la administración de los polinucleótidos en, por ejemplo, el citosol, el lisosoma, la mitocondria, el núcleo, la nucleola o el proteasoma de una célula diana. También se incluyen agentes que facilitan el transporte de la proteína traducida de interés desde el citoplasma hasta su ubicación intercelular normal (por ejemplo, en la mitocondria) para tratar deficiencias en ese orgánulo. En algunas realizaciones, el agente se selecciona del grupo formado por una proteína, un péptido, un aptámero y un oligonucleótido.
En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención facilitan la producción endógena en un sujeto de una o más proteínas y/o enzimas funcionales, y en particular la producción de proteínas y/o enzimas que demuestran menor inmunogenicidad con respecto a sus homólogos preparados recombinantemente. En ciertas realizaciones de la presente invención, las nanopartículas lipídicas comprenden polinucleótidos que codifican ARNm de una proteína o enzima deficiente. Tras la distribución de dichas composiciones a los tejidos diana y la posterior transfección de dichas células diana, el ARNm exógeno cargado o encapsulado en las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones puede traducirsein vivopara producir una proteína o enzima funcional codificada por dicho ARNm encapsulado (por ejemplo, una proteína o enzima de la que el sujeto es deficiente). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención explotan la capacidad de un sujeto para traducir ARNm preparado exógenamente o recombinantemente para producir una proteína o enzima traducida endógenamente, y de ese modo producir (y en su caso excretar) una proteína o enzima funcional. Las proteínas o enzimas traducidas también pueden caracterizarse por la inclusiónin vivode modificaciones postraduccionales nativas que a menudo pueden estar ausentes en las proteínas o enzimas preparadas recombinantemente, reduciendo de este modo aún más la inmunogenicidad de la proteína o enzima traducida.
La encapsulación del ARNm en las nanopartículas lipídicas y la administración de las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas nanopartículas lipídicas evita la necesidad de administrar el ARNm a orgánulos específicos dentro de una célula diana (por ejemplo, mitocondrias). Más bien, tras la transfección de una célula diana y la administración del ARNm encapsulado al citoplasma de la célula diana, el contenido de ARNm de las nanopartículas lipídicas puede traducirse y producirse una proteína o enzima funcional.
La presente invención también contempla el direccionamiento discriminatorio de una o más células y tejidos diana por medios de direccionamiento tanto pasivos como activos. El fenómeno del direccionamiento pasivo explota los patrones de distribución naturales de las nanopartículas lipídicasin vivosin depender del uso de excipientes o medios adicionales para mejorar el reconocimiento de la nanopartícula lipídica por una o más células diana. Por ejemplo, es probable que las nanopartículas lipídicas que se someten a fagocitosis por las células del sistema reticuloendotelial se acumulen en el hígado o el bazo y, en consecuencia, pueden proporcionar medios para dirigir pasivamente la administración de las composiciones a dichas células diana.
Alternativamente, la presente invención contempla el direccionamiento activo, que implica el uso de excipientes adicionales, denominados en la presente "ligandos de direccionamiento", que pueden unirse (de manera covalente o no covalente) a la nanopartícula lipídica para fomentar la localización de dicha nanopartícula lipídica en determinadas células o tejidos diana. Por ejemplo, el direccionamiento puede estar mediado por la inclusión de uno o más ligandos de direccionamiento endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre la nanopartícula lipídica para fomentar la distribución a las células o tejidos diana. El reconocimiento del ligando de direccionamiento por los tejidos diana facilita activamente la distribución tisular y la captación celular de las nanopartículas lipídicas y/o su contenido por las células y tejidos diana. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica pueden comprender un ligando de direccionamiento de apolipoproteína-E en o sobre dichas nanopartículas lipídicas para facilitar o fomentar el reconocimiento y la unión de dicha nanopartícula lipídica a receptores endógenos de lipoproteína de baja densidad expresados, por ejemplo, por hepatocitos. Como se dispone en la presente, la composición puede comprender un ligando capaz de aumentar la afinidad de las composiciones a una o más células diana. Los ligandos de direccionamiento pueden unirse a la bicapa externa de la nanopartícula lipídica durante o después de la formulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender polímeros fusogénicos como PEAA, hemagluttinina, otros lipopéptidos (consultar las Solicitudes de Patente de Estados Unidos N° de Ser. 08/835,281, y 60/083,294, que se incorporan aquí por referencia) y otras características útiles para la administraciónin vivoy/o intracelular. En otras realizaciones, las composiciones de la presente invención demuestran eficacias de transfección mejoradas, y/o demuestran selectividad mejorada hacia células diana o tejidos de interés. Por lo tanto, se contemplan composiciones o nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) que son capaces de mejorar la afinidad de las composiciones o sus nanopartículas lipídicas constituyentes y sus contenidos polinucleotídicos a una o más células o tejidos diana. Los ligandos adecuados pueden unirse o enlazarse opcionalmente a la superficie de la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento puede abarcar la superficie de una nanopartícula lipídica o estar encapsulado dentro de la nanopartícula lipídica. Los ligandos adecuados se seleccionan en función de sus propiedades físicas, químicas o biológicas (por ejemplo, afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características de la superficie de la célula diana). Los sitios diana específicos de la célula y su correspondiente ligando de direccionamiento pueden variar ampliamente. Los ligandos de direccionamiento adecuados se seleccionan de forma que se aprovechen las características únicas de una célula diana, permitiendo de este modo que la composición discrimine entre células diana y no diana. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden llevar marcadores de superficie (por ejemplo, apolipoproteína-B o apolipoproteína-E) que mejoran selectivamente el reconocimiento de los hepatocitos o la afinidad con ellos (por ejemplo, mediante el reconocimiento mediado por receptores y la unión a dichos marcadores de superficie). Además, se esperaría que el uso de galactosa como ligando de direccionamiento dirigiera las composiciones de la presente invención a los hepatocitos parenquimatosos, o alternativamente se esperaría que el uso de residuos de azúcar que contienen manosa como ligando de direccionamiento dirigiera las composiciones de la presente invención a las células endoteliales hepáticas (por ejemplo, residuos de azúcar que contienen manosa que pueden unirse preferiblemente al receptor de asialoglicoproteína presente en los hepatocitos). (Consultar Hillery AM, et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.) La presentación de tales ligandos de direccionamiento que se han conjugado con elementos presentes en la nanopartícula lipídica facilita por tanto el reconocimiento y la captación de las composiciones liposomales de la presente invención por una o más células y tejidos diana. Entre los ejemplos de ligandos de direccionamiento adecuados se incluyen uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero no limitados a, humanos, primates no humanos, roedores y similares, a los que pueden administrarse los compuestos, las composiciones farmacéuticas o liposomales y los métodos de la presente invención. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en la presente en referencia a un sujeto humano.
La capacidad de los compuestos y composiciones farmacéuticas o liposomales descritos en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) para modular o mejorar la expresión de polinucleótidos encapsulados y la producción de un polipéptido o proteína proporciona medios novedosos y más eficientes de efectuar la producciónin vivode polipéptidos y proteínas para el tratamiento de una serie de enfermedades o afecciones patológicas. Tales composiciones de nanopartículas lipídicas son particularmente adecuadas para el tratamiento de enfermedades o condiciones patológicas asociadas con la expresión aberrante de ácidos nucleicos que codifican una proteína o enzima. Por ejemplo, puede usarse la administración con éxito de polinucleótidos como ARNm a órganos diana como el hígado y, en particular, a hepatocitos, para el tratamiento y la corrección de errores congénitos del metabolismo que se localizan en el hígado. Por consiguiente, los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los métodos relacionados descritos en la presente pueden emplearse para tratar una amplia variedad de enfermedades y condiciones patológicas, en particular aquellas enfermedades que se deben a deficiencias proteicas o enzimáticas. Los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales divulgados en la presente (por ejemplo, nanopartículas lipídicas basadas en HGT4004) pueden codificar un producto funcional (por ejemplo, una proteína, enzima, polipéptido, péptido, ARN funcional y/o molécula antisentido), y preferiblemente codifican un producto del que se desea la producciónin vivo.
Los compuestos, composiciones farmacéuticas y métodos relacionados de la presente descripción son ampliamente aplicables a la administración de agentes terapéuticos como polinucleótidos, y en particular ARNm, para tratar una serie de trastornos. En particular, tales compuestos, composiciones y métodos relacionados son adecuados para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas y/o enzimas. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas codifican proteínas o enzimas funcionales que son excretadas o secretadas por una o más células diana en el fluido extracelular circundante (por ejemplo, ARNm que codifica hormonas y neurotransmisores). Alternativamente, en otra realización, los polinucleótidos encapsulados por los compuestos o composiciones farmacéuticas y liposomales de la presente invención codifican proteínas o enzimas funcionales que permanecen en el citosol de una o más células diana (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima asociada con el ciclo de la urea o trastornos metabólicos de almacenamiento lisosomal). Otros trastornos para los que son útiles los compuestos, composiciones farmacéuticas y métodos relacionados de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos como la atrofia muscular espinal (AME) relacionada con SMN1; la esclerosis lateral amiotrófica (ELA); la galactosemia relacionada con GALT; Fibrosis quística (FQ); trastornos relacionados con SLC3A1, incluyendo la cistinuria; trastornos relacionados con COL4A5, incluido el síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; distrofias musculares (como, por ejemplo, Duchenne y Becker); enfermedades hemofílicas, como, por ejemplo, hemofilia B (FIX) y hemofilia A (FVIII); ataxia de Friedreich; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); cistinosis relacionada con CTNS; los trastornos relacionados con f MR1, que incluyen el síndrome del cromosoma X frágil, el síndrome de temblor/taxia asociado al cromosoma X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura del cromosoma X frágil; el síndrome de Prader-Willi; la enfermedad de Fabry; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); enfermedad de Niemann-Pick tipo C1; las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis neuronal ceroidea, incluyendo la lipofuscinosis neuronal ceroidea juvenil (JNCL), la enfermedad de Batten juvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPP1; Ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/desaparición de materia blanca; Ataxia episódica de tipo 2 relacionada con CACNA1A y CACNB4; trastornos relacionados con MECP2, como el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; enfermedad de Kennedy (SBMA); arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía relacionada con Notch-3 (CADASIL); los trastornos convulsivos relacionados con SCN1A y SCN1B; los trastornos relacionados con la polimerasa G, que incluyen el síndrome de Alpers-Huttenlocher, la neuropatía atáxica sensorial, la disartria y la oftalmoparesia relacionadas con POLG, y la oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones de ADN mitocondrial; la hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X; la enfermedad de Wilson; y la enfermedad de Fabry. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos, y en particular el ARNm, de la presente invención pueden codificar proteínas o enzimas funcionales. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden incluir ARNm que codifica agalsidasa alfa, eritropoyetina, al-antitripsina, carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina<6>-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosc-<6>-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa u hormona de crecimiento humano.
Los compuestos y composiciones farmacéuticas divulgados en la presente pueden administrarse a un sujeto. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan en combinación con uno o más polinucleótidos adicionales, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizadores u otros excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.
Los compuestos y las composiciones farmacéuticas y liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) de la presente invención pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta el estado clínico del sujeto, la naturaleza de los materiales encapsulados, el lugar y el método de administración, la programación de la administración, la edad, el sexo, el peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los practicantes clínicos con conocimientos ordinarios en la técnica. La "cantidad eficaz" a los efectos del presente documento puede determinarse mediante consideraciones pertinentes conocidas por los expertos en investigación clínica experimental, farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para lograr por lo menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores seleccionados como medidas apropiadas de progreso, regresión o mejora de la enfermedad por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan por lo menos una expresión transitoria de uno o más polinucleótidos en las células diana.
Las vías de administración adecuadas de los compuestos y composiciones farmacéuticas divulgados en la presente incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, vaginal, transmucosal o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones o infusiones intratecales, intracerebroventriculares, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. En ciertas realizaciones, la administración de los compuestos o composiciones (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) descritos en la presente a un sujeto facilita el contacto de dichos compuestos o composiciones con una o más células, tejidos u órganos diana.
Alternativamente, los compuestos y composiciones de la presente invención pueden administrarse de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección o infusión de las composiciones farmacéuticas directamente en un tejido diana, preferiblemente en una formulación de depósito o de liberación sostenida, de tal manera que se facilite aún más el contacto de las células diana con las nanopartículas lipídicas constituyentes. La administración local puede realizarse de varias maneras, dependiendo del tejido objetivo. Por ejemplo, pueden inhalarse aerosoles que contienen composiciones de la presente invención (para administración nasal, traqueal o bronquial); las composiciones de la presente invención pueden inyectarse en el lugar de la lesión, manifestación de la enfermedad o dolor, por ejemplo; las composiciones pueden suministrarse en pastillas para aplicación oral, traqueal o esofágica; pueden suministrarse en forma de líquido, comprimido o cápsula para administración en el estómago o los intestinos, pueden suministrarse en forma de supositorio para aplicación rectal o vaginal; o incluso pueden administrarse en el ojo mediante cremas, gotas o incluso inyección. Las formulaciones que contienen los compuestos de la presente invención formando complejos con moléculas o ligandos terapéuticos pueden incluso administrarse quirúrgicamente, por ejemplo, en asociación con un polímero u otra estructura o sustancia que pueda permitir que las composiciones se difundan desde el lugar de implantación a las células circundantes. Alternativamente, tales composiciones pueden aplicarse quirúrgicamente sin el uso de polímeros o soportes.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención están formuladas de tal manera que son adecuadas para la liberación prolongada de, por ejemplo, polinucleótidos o ácidos nucleicos encapsulados en las mismas. Dichas composiciones de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y nanopartículas lipídicas formuladas para administración de depósito (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intravítrea) para administrar o liberar un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) durante periodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones (por ejemplo, modificaciones químicas) introducidas en los polinucleótidos para mejorar la estabilidad.
Mientras que ciertos compuestos, composiciones y métodos de la presente invención se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar los compuestos de la invención y no se pretende que limiten la misma. Cada una de las publicaciones, materiales de referencia y similares a los que se hace referencia en la presente para describir los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles adicionales con respecto a su puesta en práctica se incorporan por referencia en su totalidad.
Vehículos de administración de lípidos liofilizados
En la presente se describen composiciones farmacéuticas que comprenden vehículos de administración liposomal liofilizados y formulaciones liposomales que son capaces de efectuar la administración de contenidos encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos) a una o más células, tejidos u órganos diana. Tras la administración de, por ejemplo, polinucleótidos encapsulados a una o más células diana, dichos polinucleótidos son capaces de modular la expresión (por ejemplo, aumentar la expresión) del polinucleótido o de un ácido nucleico en la célula diana. También se divulgan en la presente métodos y procesos relacionados para preparar tales composiciones farmacéuticas, así como métodos para tratar una o más enfermedades o afecciones mediante la administración de tales composiciones farmacéuticas a un sujeto que las necesite. También se espera que las composiciones liofilizadas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) descritas en la presente tengan una estabilidad mejorada a largo plazo tras su almacenamiento en refrigeración o a temperatura ambiente (por ejemplo, temperatura ambiente) (por ejemplo, por lo menos uno, dos, tres, seis, nueve, doce, dieciocho, veinticuatro, treinta meses o más).
Como se usan en la presente para referirse a las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas), los términos "liofilización" y "liofilizado" se refieren a un proceso por el cual tales composiciones liposomales se preparan en seco mediante congelación rápida y, en ciertos casos, uno o más pasos de secado (por ejemplo, tras la exposición a condiciones de vacío), reduciendo de este modo la concentración de agua en dichas composiciones liposomales para impedir o, alternativamente, limitar reacciones biológicas o químicas posteriores.
La liofilización de las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) puede realizarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, de acuerdo con los ciclos de liofilización proporcionados en los ejemplos. Tras la congelación rápida de las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas), las composiciones liposomales pueden secarse mediante uno o más métodos adecuados, como la exposición a condiciones de secado al vacío primario y secundario. En algunas realizaciones, las composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se secan a las temperaturas y condiciones de vacío proporcionadas en los ejemplos. Tras la exposición a las condiciones de liofilización descritas en la presente, las composiciones de nanopartículas lipídicas liofilizadas pueden rehidratarse usando, por ejemplo, un medio de rehidratación acuoso adecuado (por ejemplo, agua estéril, solución salina normal y/o dextrosa al 5%) y administrarse a un sujeto.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas liofilizadas descritas en la presente se caracterizan por ser estables (por ejemplo, en relación con las composiciones farmacéuticas no liofilizadas). Como se usa para describir las composiciones liposomales liofilizadas descritas en la presente, el término "estable" se refiere a la imposibilidad de que dichas composiciones liposomales (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) se agreguen o floculen (por ejemplo, tras la reconstitución). La estabilidad de dichas composiciones farmacéuticas liofilizadas puede determinarse con referencia a una serie de características físicas. Por ejemplo, la estabilidad puede determinarse con referencia al tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas que comprenden dicha composición. Preferiblemente, tras la rehidratación de las composiciones liofilizadas divulgadas en la presente, la distribución de tamaños y las características físicas de la composición reconstituida son idénticas o alternativamente comparables a las composiciones anteriores a la liofilización. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la liofilización de las nanopartículas lipídicas no cambia o altera apreciablemente el tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas tras la liofilización y/o la reconstitución. Por ejemplo, tras la reconstitución (por ejemplo, con agua purificada) las nanopartículas lipídicas que comprenden una composición farmacéutica liofilizada no floculan ni se agregan, o alternativamente demuestran una floculación o agregación limitada o insignificante (por ejemplo, determinada por el tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas reconstituidas).
En ciertas realizaciones, las composiciones liposomales reconstituidas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) de la invención presentan una capacidad mejorada (por ejemplo, aumentada) para transfectar una o más células diana. Por consiguiente, también se proporcionan en la presente métodos de transfección de una o más células diana. Dichos métodos comprenden generalmente el paso de poner en contacto la una o más células diana con, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas reconstituidas de la invención (por ejemplo, una nanopartícula lipídica liofilizada basada en HGT4003 que encapsula uno o más polinucleótidos) de tal manera que la una o más células diana se transfectan con los materiales encapsulados en la misma (por ejemplo, uno o más polinucleótidos).
En ciertas realizaciones, pueden usarse uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos) como un liposoma o alternativamente como un componente de un vehículo de administración de lípidos (por ejemplo, nanopartícula lipídica) usado en las composiciones de la invención. Como se ha descrito anteriormente, un vehículo de administración de lípidos adecuado es una nanopartícula lipídica que comprende un ácido nucleico, un lípido catiónico, como, por ejemplo, los lípidos catiónicos escindibles como, por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004, y HGT4005 descritos anteriormente, o seleccionados del grupo que consiste en C12-200, ICE, DOTMA, DOGS, DOSPA, DODAP, DOTAP, DSDMA, DODMA DLinDMA DLenDMA DDAB DMRIE CLinDMA CpLinDMA DMOBA DOcarbDAP DLinDAP DLincarbDAP DLinCDAP DLin-K-DMA DLin-K-XTC2-DMA, DLinKC2-DMA, HGT5000, HGT5001, HGT5002, o mezclas de los mismos.
Otros componentes adecuados de los vehículos de administración de lípidos incluyen lípidos no catiónicos, lípidos auxiliares, como, por ejemplo, colesterol, y lípidos modificados con PEG, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, puede prepararse una nanopartícula lipídica usando HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG2000. Una nanopartícula lipídica puede estar compuesta por combinaciones adicionales de lípidos en varias proporciones, incluyendo, por ejemplo, HGT4001, DOPE y DMG-PEG2000. La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que componen las nanopartículas lipídicas, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del lípido o lípidos seleccionados, la naturaleza de las células o tejidos diana previstos y las características de los materiales o polinucleótidos que van a ser administrados por la nanopartícula lipídica. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquílica, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la toxicidad del lípido o lípidos seleccionados.
En una realización, los vehículos de administración lipídica liofilizados comprenden además por lo menos un lioprotector. El término "lioprotector" se usa en la presente para referirse a uno o más compuestos que, cuando se combinan o se incluyen en la preparación de uno o más de los compuestos liposomales descritos en la presente, mejoran (por ejemplo, aumentan) la estabilidad química y/o física del compuesto liposomal (por ejemplo, una nanopartícula lipídica) durante la liofilización, almacenamiento o reconstitución de dicho compuesto liposomal. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la inclusión de uno o más lioprotectores en la nanopartícula lipídica puede mejorar o potenciar de otro modo la estabilidad de la composición liofilizada (por ejemplo, en condiciones normales de almacenamiento) y/o facilitar la reconstitución de la composición liofilizada usando un medio de rehidratación, preparando de este modo una formulación acuosa. En algunas realizaciones, se preparan las nanopartículas lipídicas y, antes de la liofilización, el tampón presente en la formulación liposomal puede sustituirse (por ejemplo, mediante centrifugación) por un lioprotector adecuado (por ejemplo, una solución acuosa de sacarosa que comprende entre un 1-50% o un 10-25% de sacarosa). En algunas realizaciones, el lioprotector se incluye como parte del tampón o medio en el que se preparan o liofilizan las formulaciones liposomales (por ejemplo, durante la hidratación, diafiltración y/o dilución). Ejemplos de lioprotectores adecuados que pueden usarse para preparar las composiciones liofilizadas descritas en la presente incluyen, por ejemplo, trehalosa, dextrano (por ejemplo, 1,5kDa, 5kDa y/o 40kDa), inulina (por ejemplo, 1,<8>kDa y/o 4kDa), y cualquier combinación de los mismos.
Se cree que la inclusión de un azúcar lioprotector durante la liofilización puede servir para estabilizar la composición liofilizada. (Consultar, Anchordoquy, et al., J. Pharm. Sci. (2000) 89: 289-296.) Una posible explicación de la estabilización observada puede incluir la hipótesis del aislamiento de partículas, que se refiere a la formación de una matriz de azúcar que actúa como barrera física entre las partículas liposomales.
El producto farmacéutico liofilizado y los liposomas que lo componen (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) para su uso en la presente invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Pueden prepararse vesículas multilamelares (MLV) mediante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un contenedor o recipiente adecuado, disolviendo el lípido en un solvente apropiado y evaporando a continuación el solvente para dejar una película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. A continuación, puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da lugar a la formación de MLV. A continuación, pueden formarse vesículas unilamelares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, pueden formarse vesículas unilamelares mediante técnicas de eliminación de detergentes.
Debe entenderse que los artículos "un" y "uno", como se usan en la presente en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes para un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. La divulgación incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es de otro modo relevante para un producto o proceso dado. La divulgación también incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otra manera relevantes para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la divulgación abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que se introducen una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación de base (o, en su caso, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto en la técnica que surgiría una contradicción o incoherencia. Cuando los elementos se presentan como listas (por ejemplo, en formato de grupo de Markush o similar) debe entenderse que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y que pueden eliminarse del grupo cualquier elemento o elementos. Debe entenderse que, en general, cuando la divulgación, o aspectos de la divulgación, hacen referencia a que comprenden elementos, características, etc. particulares, ciertas realizaciones de la divulgación o aspectos de la divulgación consisten, o consisten esencialmente, en tales elementos, características, etc. En aras de la simplicidad, dichas realizaciones no se han expuesto específicamente con tantas palabras en la presente.
EJEMPLOS
Referencia
Ejemplo 1 - Preparación de HGT4Q01
El compuesto5-(((10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)disulfanil)metil)-1H-imidazol (disulfuro de imidazol-colesterol)(denominado en la presente "HGT<4 0 0 1>") se preparó de acuerdo con el esquema sintético general que se muestra a continuación en la Reacción<1>.
El compuesto intermedio2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-d¡met¡l-17-((R)-6-met¡lheptano-2-¡l)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecah¡dro-1H-c¡clopenta[a]fenantren-3-¡l)d¡sulfan¡l)p¡r¡d¡na(disulfuro de piridilcolesterol) identificado como compuesto (3) se preparó de la siguienet manera. Se preparó una solución que comprendía 3,0 g (7,45 mmoles) del compuesto ( i) y 1,8 g (8,17 mmoles) del compuesto (2) en cloroformo (35 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante cuatro días. Se evaporó el solvente, se añadió metanol (50 ml) al residuo y se evaporó. El sólido resultante se suspendió en metanol (50 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El producto piridilcolesterol disulfuro (3) se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó a alto vacío. Rendimiento: 3,6 g (95%). 1H NMR (300 MHz, CDCla) 68.43 (m, 1H), 7.76 (m, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.05 (m, 1H), 5.32 (bd, J = 4 Hz, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.35 (d, J = 8 Hz, 2H), 2.05-1.7 (m, 5H), 1.7-1.2 (m, 8H), 1.2-0.8 (m, 25H), 0.65 (s, 3H). MS (APCI, Pos): 512 (M+1).
El compuesto intermedio4-((benc¡lt¡o)met¡l)-1H-¡m¡dazolidentificado como compuesto (6) en la Reacción 1 se preparó de la siguiente manera. Se preparó una solución que comprendía 12,15 g (123,9 mmoles) del compuesto (4) y 15,5 ml (132 mmoles) de (5) en ácido acético glacial (200 ml) y se calentó a reflujo durante 24 horas. La mezcla de la reacción se dejó enfriar durante la noche. El solvente se evaporó y el residuo se disolvió en cloroformo (800 ml). La solución resultante se lavó con amoníaco diluido (4:1 agua:amoníaco conc., 200 ml) y salmuera (200 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó el solvente. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 500 g; 5-7% de metanol en cloroformo) proporcionó 23 g del producto deseado4-((benc¡lt¡o)met¡l)-1H-¡m¡dazol(Compuesto (6)), que representaba un rendimiento del 91 %. La NMR mostró la presencia de una pequeña impureza (4 % en peso) que se identificó como un acetato y se identifica como compuesto (8) a continuación. El material del compuesto 6 se usó para producir HGT4001 sin purificación adicional. 1H NMR (300 MHz, CDCla) 67.60 (d, J = 1 Hz, 1H), 7.35-7.2 (m, 5H), 6.90 (d, J = 1 Hz, 1H), 3.67 (s, 2H), 3.62 (s, 2H). MS (APCI, Pos): 205 (M+1).
El compuesto intermedio(1H-imidazol-4-il)metanotiolidentificado como compuesto (7) en el Esquema 1 se preparó de la siguiente manera. Se condensó una solución de amoníaco líquido (200 ml) sobre una suspensión que comprendía 15 g del compuesto (6) (70,5 mmoles) en éter (30 ml). A esta solución amarilla resultante se le añadieron 5 g de sodio (217 mmoles) en pequeñas porciones hasta que la mezcla permaneció de color azul oscuro. A continuación, se agitó durante 40 minutos. Se añadieron aproximadamente 10-15 g de NH4Cl sólido hasta que desapareció el color y se evaporó el solvente usando una corriente de nitrógeno para proporcionar el compuesto bruto (7), que se usó sin purificación.
El HGT4001 se preparó añadiendo 3,6 g del compuesto (3) (7 mimóles) y 10 ml de trietilamina (71,8 mmoles) a cloroformo<( 2 0 0>ml), y la solución resultante se desgasificó usando vacío y nitrógeno y se añadió rápidamente al compuesto (7) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Después de 3 días se añadieron 200 ml de agua y la mezcla se extrajo con cloroformo (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron (Na2SÜ4), se filtraron y se evaporó el solvente. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 200 g, neutralizado usando trietilamina al 1% en cloroformo; etanol al 2-5 % en cloroformo) proporcionó 1,25 g de HGT4001 (35 % de rendimiento en dos pasos). 1H NMR (300 MHz, CDCla) ó 7.61 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 5.33 (d, 1H), 3.93 (s, 2H), 2.58-2.46 (m, 1H), 2.29 (d, 2H), 1.91 (m, 5H), 1.61-0.84 (m, 33H), 0.66 (s, 3H). 13CNMR (300 MHz, CDCla)ó141.6, 135.3, 134.3, 121.4, 118.1, 56.8, 56.2, 50.3, 50.2, 42.4, 39.8, 39.6, 39.1, 36.8, 36.2, 35.8, 31.9, 29.1, 28.3, 28.1, 24.4, 23.9, 22.9, 22.6, 21.0, 19.4, 18.8, 11.9. MS (APCI, Pos) 515 (M+1). Anal. Elem.: C<31>H<50>N<2>S<2>, C (72.32 calc.), encontrado 72.04; H (9.79 calc.), encontrado 9.84; N (5.44, calc.), encontrado 5.41.
Ejemplo 2 - Preparación de HGT4002
El compuesto1-(2-(((3S,20R,13R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)disulfanil)etil)guanidina(denominado en la presente "HGT4002") se preparó de acuerdo con el esquema sintético general que se muestra a continuación en la Reacción 2.
El compuesto intermedio(2-(piridin-2-ildisulfanil)etil)carbamato de terc-butiloidentificado como compuesto (10) en la Reacción 2 anterior se preparó añadiendo 5,0 g de compuesto (9) (28,2 mmoles) y 6,82 g de compuesto (2) (31 mmoles) a 100 ml de cloroformo (100 ml) y agitando a temperatura ambiente durante cuatro días para formar una solución. El solvente se evaporó y el sólido amarillo resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (SiO<2>, 50-100% de acetato de etilo en hexanos) para proporcionar 9,0 g de compuesto impuro (10). La NMR mostró la presencia del material deseado (56% en peso), junto con el material de partida compuesto (2) (24 %) y un compuesto disulfurado (11) (20%) identificado a continuación. La mezcla obtenida se usó en el paso siguiente sin purificación adicional. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)<6>8.55-8.45 (m, 1H), 7.9-7.8 (m, 2H), 7.3-7.2 (m, 1H), 7.07 (bt, J = 5 Hz, 1H), 3:25-3.15 (m, 2H), 2.87 (t, J = 7 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H). MS (APCI, Pos)287 (M+1), 231 (M+<1>-C4Hs).
El compuesto intermedio preparó añadiendo 2,0 g del compuesto (10) (56% puro, 3,9 mmoles) a diclorometano anhidro (12 ml) al que se añadió TFA<( 6>ml), y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El solvente se evaporó y el residuo se secó a vacío alto para obtener el compuesto(13) bruto (sal de TFA). La sal del compuesto(13)se disolvió en 25 ml de diclorometano anhidro, se añadió trietilamina en exceso (7 ml) seguido de la adición de 2,7 g de compuesto(12)(7,0 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche, seguido de dilución con cloroformo (175 ml) y lavado con agua (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). La solución orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó el solvente. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO<2>, 0-10% de metanol en cloroformo) para proporcionar 1,9 g de compuesto impuro(14).La NMR mostró la presencia del compuesto deseado (14)(73% en peso), junto con el compuesto disulfuro(15)(27% en peso) identificado a continuación. La mezcla se usó para el paso siguiente sin purificación adicional. 1H NMR (300<m>H<z>, CDCb) 511.48 (bs, 1H), 8.86 (bt, 1H), 8.55-8.5 (m, 1H), 7.65-7.6 (m, 2H), 7.25-7.15 (m, 1H), 3.8-3.65 (m, 2H), 2.99 (t, J = 6 Hz, 2H), 1.51 (s, 9H), 1.49 (s, 9H). MS (APCI, Pos): complejo, no (M+1) detectado.
El compuesto intermediosal de ácido trifluoroacético de 1-(2-(piridin-2-ildisulfanil)etil)guanidina,identificado como compuesto(16)en la Reacción 2 anterior se preparó añadiendo 1,6 g de compuesto(14)(73% puro, 2,8 mmoles) a diclorometano anhidro (33 ml), al que se añadió TFA (11 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El solvente se evaporó y el residuo se secó a vacío alto para obtener el compuesto bruto(16)(sal de TFA), que se usó posteriormente en el paso siguiente sin purificación.
El HGT4002 se preparó disolviendo la sal TFA del compuesto(16)en diclorometano anhidro (50 ml), seguido de la adición de trietilamina en exceso (5 ml). Se añadieron 1,13 g de tiocolesterol(1)(2,8 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche, seguido de dilución con cloroformo (200 ml) y lavado con agua (2 x 50 ml) y salmuera (100 ml). La solución orgánica resultante se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó el solvente. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO<2>, 0-30% de etanol en cloroformo) y trituración en acetona para proporcionar 80 mg de HGT4002. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 57.60-6.90 (broad s, 4H), 5.35 (d, 1H), 3.39 (t, 2H), 2.84 (t, 2H), 2.72 (m, 1H), 2.28 (m, 2H), 1.91 (m, 5H), 1.58-1.28 (m, 10H), 1.20-0.82 (m, 23H), 0.65 (s, 3H). ). 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5157.5, 141.5, 121.5, 56.7, 56.1, 50.1, 49.6, 42.4, 38.3, 36.7, 36.2, 35.7, 31.9, 29.0, 28.3, 27.9, 24.4, 23.7, 23.2, 22.9, 21.0, 19.5, 19.1, 12.2. MS (APCI, Pos): 520 (M+1). Anal. Elem.: C<30>H<53>N<3>S<2>-SiO<2>, C (62.13 calc.), encontrado 62.33; H (9.21 calc.), encontrado 9.08; N (7.25, calc.), encontrado 7.07; S (11.06, calc.), encontrado 10.83.
Ejemplo de Referencia 3 - Preparación de HGT4003
El compuesto2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina(denominado en la presente "HGT4003") se preparó de acuerdo con el esquema sintético general que se muestra a continuación en la Reacción 3.
El compuesto intermedio3-(benciltio)propano-1,2-diol,identificado como compuesto (19) en la Reacción 3 anterior se preparó añadiendo gota a gota 11,37 g de compuesto (18) (90,3 mmol) a una mezcla agitada de 9,73 g de compuesto (17) (90,3 mmol) y 18,64 g de K<2>CO<3>(135,1 mmol) en 60 ml de ACN. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante<2>horas y después de enfriar la mezcla de la reacción a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se filtró y el sólido se lavó con 20 ml de ACN. El filtrado se evaporó y el residuo líquido pálido se purificó por cromatografía en columna (eluyente: 10-100% de EtOAc en hexanos) para dar 17,03 g del compuesto (19) como líquido trasparente (95%).
El compuesto intermediobencilo(2,3-bis((9Z,12Z)-octodeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)sulfano,identificado como compuesto (21) en la Reacción 3 anterior se preparó añadiendo NaH (60% en aceite mineral, 0,82 g, 20.5 mmol) a una mezcla agitada de 1,56 g del compuesto (19) (7,88 mmol) y 6,91 g del compuesto (20) (21,00 mmol) en THF (200 ml) bajo N<2>. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 44 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se diluyó con Et<2>O (400 ml) y se lavó con agua (300 ml) y salmuera (300 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó, y el residuo líquido amarillo se purificó por cromatografía en columna (eluyente: 0-20% de EtOAc en hexanos) para dar el compuesto (21) como un líquido amarillo claro (2,04 g, 37,3%).
El compuesto intermedio2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propano-1-tiol,identificado como compuesto (22) en la Reacción 3 anterior se preparó añadiendo una solución de Et<2>O (30 ml) del compuesto (21) (0.7 g, 1,01 mmol) a NH<3>líquido (30 ml) y se condensó en un RBF de 2 bocas a -78°C bajo N<2>, seguido de la adición de pequeños trozos de Na (90 mg, 3,91 mmol). La mezcla resultante se agitó a -78°C durante 30 min cuando la TLC indicó la desaparición completa del compuesto (21) y se añadieron 340 mg de NH4Cl (6,34 mmol). El color azul intenso de la mezcla de la reacción se desvaneció a un color amarillo claro en<10>min y se retiró el baño de acetona con hielo seco. La mezcla de la reacción se purgó con N<2>mientras se calentaba gradualmente hasta temperatura ambiente. Después de que se hubiera purgado la mayor parte del NH<3>con N<2>(el volumen de la mezcla de la reacción se redujo a aproximadamente 20 ml) se añadió HCl acuoso (3N, 30 ml). Esta mezcla se extrajo con DCM (60 ml). El extracto de DCM se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó. El residuo líquido amarillo se purificó por cromatografía en columna (eluyente: 0-20% de EtOAc en hexanos) para dar 490 mg del compuesto (22) como un líquido amarillo claro (80%).
Se mezclaron el compuesto intermedioN,N-dimetil-2-(piridin-2-ildisulfanil)etanamina,identificado como compuesto (24) en la Reacción 3 anterior, 2,8 g de compuesto (2) (12,7 mmol) y 1,41 g de compuesto (23) (10 mmol) en DCM (30 ml). La mezcla se agitó mientras se purgaba con N<2>durante 10 minutos y se añadieron 1,5 ml de Et3N (11,2 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y se aplicó sobre una columna de gel de sílice de 230 g. La columna se eluyó con 40-100% de EtOAc/hexanos, seguido de 8-10% de MeOH/DCM para dar 0,72 g del compuesto (24) como un líquido amarillo (34%).
El HGT4003 se preparó combinando 487mg del compuesto (22) (0,81 mmol) y 180mg del compuesto (24) (0,84 mmol) en 2 ml de DCM, seguido de agitación a temperatura ambiente bajo N<2>durante 16 horas. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna tres veces (eluyente: 20-100% de EtOAc en hexanos) para dar 252mg de HGT4003 como un líquido amarillo claro (44%). También se obtuvieron de las purificaciones por cromatografía en columna 213 mg del compuesto (25) (37%), identificado en la Reacción 4 a continuación. 1H NMR (300 MHz, CDCla) 65.36-5.33 (m, 8H), 3.65 (m, 1H), 3.56-3.50 (m, 4H), 3.43 (td, 2H), 2.96-2.74 (m, 8H), 2.60 (t, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.04 (m, 8H), 1.62-1.50 (m, 5H), 1.39-1.22 (m, 32H), 0.88 (t, 6H). 13C NMR (300 MHz, CDCla) 6 130.3, 128.0, 71.8, 71.6, 70.6, 58.8, 45.5, 41.4, 36.9, 31.6, 30.1, 29.7, 29.5, 29.4, 27.3, 26.2, 25.7, 22.6, 14.2. MS (APCI, Pos): 709 (M+1). Anal. Elem.: C43H81NO2S2, C (72.92 calc.), encontrado 72.75; H (11.53 calc.), encontrado 11.50; N (1.98, calc.), encontrado 2.08; S (9.05, calc.), encontrado 8.95.
Reacción 4
En la Reacción 4 anterior se representa una ruta alternativa para la síntesis de HGT4003, empleando un producto intermediario bis(alquilo) de disulfuro de piridilo. El compuesto intermedio2-((2,3-bis((9Z,12Z)-ociadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)piridina,identificado como compuesto (25) en la Reacción 4 anterior se preparó combinando 1,35 g de compuesto (22) (2,24 mmol) y 0,54 g de compuesto (2) (2,45 mmol) en 10ml de CHCb y se agitó a temperatura ambiente bajo N<2>durante 16 horas. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna tres veces (eluyente: 0-20% de EtOAc en hexanos) para dar 1,1 g del compuesto (25) como un líquido amarillo claro (67%). A continuación, se añadieron 1,09 g del compuesto (23) (7,71 mmol) a la solución de CHCb (20ml) del compuesto (25) (1,1 g, 1,54 mmol) y Et3N (2,6 ml, 18,5 mmol) y se agitó bajo N<2>. La TLC después de 16 horas indicó la desaparición completa del compuesto (25). La solución de reacción se lavó con NaOH acuoso (IN, 20 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó. El residuo líquido amarillo se purificó por cromatografía en columna (eluyente: 5-100% de EtOAc en hexanos) para dar 0,37 g de HGT4003 como líquido amarillo claro (34%).
Ejemplo de Referencia 4
Las nanopartículas lipídicas que comprenden HGT4001, DOPE y DMG-PEG2000 y encapsulan ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado con codones (SEQ ID NO: 1) se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol. (Ponsa, et al., Int. J. Pharm. (1993) 95: 51-56.) Las soluciones madre etanólicas de los lípidos se prepararon con antelación a una concentración de 50 mg/ml y se almacenaron a -20°C.
El ARNm de la luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado con codón se sintetizó mediante transcripciónin vitroa partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, a la que siguió la adición de una estructura de caperuza 5' (Cap1) (Fechter, P. et al., J. Gen. Virology (2005) 86: 1239-1249) y una cola 3' poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, según se determinó mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm de FFL se representan como X e Y, respectivamente, en la SEQ ID NO: 4, como se indica a continuación.
ARNm de luciferasa de luciérnaga optimizado por codón (SEQ ID NO: 3)
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGA
CCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCC
UUUACCGACGCACAUAÜCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGÜACUUCGAGAUGAGCGUUCG
GCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGÜGCAGCG
AGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGÜGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCC
CCAGCÜAACGACAUCÜACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUC-GGCAUCAGCCAGCCCAC
CGÜCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGÜGCAAAAGAAGCDACCGA
u c a u a c a a a a g a u c a u c a u c a l j g g a u a g c a a g a c c g a c u a c c a g g g c u u c c a a a g c a u g u a c
ACCUUCGUGACUUCCCAUQUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGÜGCCCGAGAGCUU
c g a c c g g g a c a a a a c c a u c g c c c u g a u c a ü g a a c a g u a g u g g c a g u a c c g g a u u g c c c a a g g
GCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCÜÜGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCÜUC
GGCAACCAGAUCAUCCCCÜACACCGCUAÜCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGG
CAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCG
AGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGÜGCCC
ACACUAUUUAGCÜUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGÜACGACCUAAGCAACUUGCA
CGAGADCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCU
UCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCÜACGGCCUGACAGAAACÁACCAGCGCCAUUCUGAÜC
a c c c c c g a a g g g g a c g a c a a g c c u g g c g c a g u a g g c a a g g u g g u g c c c u u c u u c g a g g c u a a
GGUGGUGGACÜÜGGACACCGGUAAGACACÜGGGUGÜGAACCAGCGCGGCGAGCÜGUGCGÜCC
GUGGCCCCAÜGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGAC
AAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAU
CGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAñUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGG
' AGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGAC
GAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGüGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAA
GGAGAUCGUGGACÜAUGUGGCCAGCCAGGÜÜACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGÜGÜUG
UGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUÜGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAG
AUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAAY
X = GGGAUCCUACC(S E Q ID NO: 5)
Y = UUUGAAUU(S E Q ID NO: 6)
El ARNm del FFL se almacenó en agua a una concentración final de 1 mg/ml a - 80°C hasta el momento de su utilización. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación del ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de 0,1% de Triton-X 100. El tamaño de las partículas (dispersión dinámica de la luz [DLS]) y los potenciales zeta se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer en soluciones 1x PBS y 1mM KCl, respectivamente.
Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml del lípido catiónico a base de imidazol HGT4001, DOPE y DMG-PEG2000 y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,69 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zave = 70,3 nm (Dv(50) = 43,2 nm; Dv(90) = 80,3 nm).
Ejemplo de Referencia 5
El presente ejemplo ilustra que las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 proporcionan medios altamente eficaces para administrar constructos de polinucleótidos a una o más células, tejidos y órganos diana. Las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol. (Ponsa, et al., Int. J. Pharm. (1993) 95: 51-56.) Las soluciones madre etanólicas de los lípidos se prepararon con antelación a una concentración de 50 mg/ml y se almacenaron a -20°C.
El ARNm de la luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado por codón se sintetizó mediante transcripciónin vitroa partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, a la que siguió la adición de una estructura de caperuza 5' (Cap1) (Fechter, P. et al., J. Gen. Virology (2005) 86: 1239-1249) y una cola 3' de poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, según se determinó mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, en la SEQ ID NO: 4. El ARNm de FFL se almacenó en agua a una concentración final de 1 mg/ml a -80°C hasta el momento de su uso. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación del ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de 0,1% de Triton-X 100. El tamaño de las partículas (dispersión dinámica de la luz [DLS]) y los potenciales zeta se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer en soluciones 1x PBS y 1mM KCl, respectivamente.
Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml de HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2000 y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución acuosa tamponada (10 mM citrato/150 mM NaCl, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para obtener una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1,27 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zave = 60,9 nm (Dv(50) = 47,9 nm; Dv(90) = 75,3 nm).
Para determinar si las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 eran capaces de transportar constructos de polinucleótidos encapsulados a una o más células diana, se inyectó a ratones CD-1 una dosis única de la nanopartícula lipídica encapsuladora de ARNm de FFL basada en HGT4003 y se sacrificaron al cabo de cuatro horas. Como se explica más adelante, se administró a los animales una dosis única de la nanopartícula lipídica encapsuladora de ARNm FFL basada en HGT4003 por vía intravenosa (IV), intracerebroventricular (ICV) o intratecal (IT). La actividad de la proteína de luciferasa de luciérnaga producida en el hígado, el bazo, el cerebro y la médula espinal de los animales tras la expresión del ARNm de FFL se determinó en un ensayo de bioluminiscencia.
Brevemente, el ensayo de bioluminiscencia se llevó a cabo usando un sistema de ensayo de luciferasa Promega (Artículo N° E1500/E4500 Promega). La preparación del tejido se realizó de la siguiente manera: Se descongelaron porciones de la muestra de tejido deseada (congeladas al instante), se lavaron con agua RO/DI y se colocaron en un tubo de homogeneización de perlas cerámicas. El tejido se trató con tampón de lisis y se homogeneizó. Tras someterlo a cinco ciclos de congelación/descongelación seguidos de centrifugación a 4°C, el sobrenadante se transfirió a nuevos tubos de microcentrífuga. Repetir y almacenar los extractos de tejido a -80°C.
El reactivo de ensayo de luciferasa se preparó añadiendo 10 ml de tampón de ensayo de luciferasa al sustrato de ensayo de luciferasa y mezclando mediante vórtice. Se cargaron 20 pl de muestras homogeneizadas en una placa de 96 pocillos, seguido de 20 pl de control de placa para cada muestra. Por separado, se cargaron 120 pl de reactivo de ensayo de luciferasa en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano y se insertó cada placa en las cámaras apropiadas usando un instrumento Biotek Synergy 2 y se midió la luminiscencia en unidades relativas de luz (RLU).
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladoras de ARNm de FFL basadas en HGT4003 descritas en la presente se evaluaron administrando una única inyección intravenosa (IV) en bolo a los animales estudiados. Después de cuatro horas, se sacrificaron los animales y se recogió el hígado y el bazo de cada animal. Se detectó y analizó la luminiscencia a través de la proteína FFL producida a partir del mensaje FFL exógeno administrado. LaFIG . 1ilustra un ejemplo que usa un sistema de nanopartículas lipídicas basado en HGT4003 administrado por vía intravenosa, y demuestra un enriquecimiento de más de un orden de magnitud de la proteína FFL producida en el hígado en comparación con el bazo (2,34 x106 RLU/mg de proteína frente a 1,71 x 105 RLU/mg de proteína, respectivamente), lo que ilustra que el uso de las nanopartículas basadas en HGT4003 permite un enriquecimiento de los materiales encapsulados en el hígado con respecto al bazo.
Además, se evaluaron formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladoras de ARNm de FFL basadas en HGT4003 mediante la administración de una única inyección en bolo en el sistema nervioso central, ya fuera por vía de administración intracereboventricular (ICV) o intratecal (IT) a los animales estudiados. Al cabo de cuatro horas, se sacrificó a los animales y se recogieron el cerebro y la médula espinal de cada uno de ellos. Se detectó y analizó la luminiscencia a través de la proteína FFL producida a partir del mensaje FFL exógeno administrado. Como se ilustra en laFIG . 2, después de la administración de las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 la producción de proteína FFL se enriqueció en el cerebro siguiendo la vía de administración ICV en comparación con la vía de administración IT.
Se observó una señal luminiscente detectable por encima del valor de referencia en todos los animales a los que se administraron las formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de FFL basadas en HGT4003, independientemente de la vía de administración seleccionada. La presencia de una señal luminiscente sobre el fondo infiere la expresión del ARNm de FFL administrado exógenamente y la producción de la proteína luciferasa de luciérnaga a partir de dicho ARNm de FFL. La luminiscencia observada en el hígado de los animales fue mayor que las señales similares observadas en el bazo, lo que sugiere un enriquecimiento de las nanopartículas lipídicas en las células y tejidos del hígado. De manera similar, cuando las nanopartículas encapsuladas con ARNm de FFL basadas en HGT4003 se administraron por vía ICV, se enriqueció en el cerebro la producción de proteína FFL en comparación con la vía de administración IT. Por consiguiente, el presente ejemplo ilustra que las nanopartículas lipídicas basadas en HGT4003 proporcionan medios altamente eficaces para administrar constructos de polinucleótidos a una o más células, tejidos y órganos diana.
Ejemplo de Referencia 6 - formulaciones liposomales liofilizadas
Las nanopartículas lipídicas se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol (Ponsa, et al., Int. J. Pharm. (1993) 95: 51-56.) Se prepararon con antelación soluciones madre etanólicas de los lípidos a una concentración de 50 mg/ml y se almacenaron a -20°C. El ARNm de la luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado por codones (SEQ ID NO: 3) se almacenó en agua a una concentración final de 1 mg/ml a -80°C hasta el momento de su uso.
Todas las concentraciones de ARNm de FFL se determinaron mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación del ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de Triton-X 100 al 0,1%. El tamaño de las partículas (dispersión dinámica de la luz [DLS]) y el tamaño de las partículas se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer en soluciones 1x PBS y 1mM KCl, respectivamente. La actividadin vitrode las formulaciones de ARNm encapsuladas se evaluó usando células 293T, y se incubaron 10pg del equivalente de ARNm de la formulación seleccionada con las células 293T durante 8 horas a 37°C. La producción de luciferasa se midió usando el kit Perkin Elmer BriteLite Plus.
En general, la liofilización de las nanopartículas lipídicas se llevó a cabo congelando los liposomas preparados en una solución que comprende un lioprotector (sacarosa) y eliminando posteriormente cualquier resto de agua o humedad mediante sublimación al vacío. En particular, antes de la liofilización, el tampón presente en la formulación liposomal se sustituyó por sacarosa al 10% mediante centrifugación. A continuación, las soluciones de nanopartículas lipídicas resultantes se sometieron a un proceso de liofilización caracterizado por parámetros específicos para los pasos de congelación, secado primario y secado secundario, tal y como se identifica en la Tabla 1 a continuación. La torta liofilizada se reconstituyó con una cantidad adecuada de agua purificada antes de someterla a la caracterización física y los análisis bioquímicos que se describen a continuación.
T a b la 1
Ejemplo de Referencia 7
Se preparó una formulación de nanopartícula lipídica que comprendía ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) encapsulado en una nanopartícula lipídica C12-200:D0Pe :CH0L.:DMG-PEG2000 (40:30:20:10, N/P 2). A continuación, se liofilizó una parte del lote de la formulación de nanopartículas lipídicas preparada de acuerdo con el protocolo expuesto en la Tabla 1.
Las propiedades físicas observadas de las formulaciones de nanopartículas lipídicas recién preparadas (sin liofilizar) y liofilizadas se compararon de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente y resultaron coherentes. Como se ilustra en la Tabla 2 a continuación, el tamaño medio de las partículas (Zave) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas y liofilizadas fue de 103,8 nm y 117,0 nm, respectivamente. El índice de polidipersidad (PDI) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas fue de 0,236 frente a 0,247 para las nanopartículas lipídicas liofilizadas. La Dv50 y la Dv90 de las nanopartículas lipídicas recién preparadas fueron de 60,2 nm y 156 nm, respectivamente, frente a una Dv50 y una Dv90 de 49,0 nm y 176 nm para las nanopartículas lipídicas liofilizadas, respectivamente. Por consiguiente, las características físicas observadas también sugieren que tanto las nanopartículas lipídicas recién preparadas como las liofilizadas eran estables y, además, que los tamaños de las partículas seguían siendo relativamente comparables.
T a b la 2
Ejemplo de Referencia 8
Se preparó una formulación de nanopartícula lipídica que comprendía ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) encapsulado en una nanopartícula lipídica DLinKC2-DMA:DOPE:CHOL:DMG-PEG2000 (50:25:20:5, N/P 5). Se liofilizó un lote de la formulación de nanopartículas lipídicas preparada de acuerdo con el protocolo establecido en la Tabla 5 siguiente.
Los procesos de liofilización se llevaron a cabo congelando los liposomas preparados en una solución que contenía un lioprotector (sacarosa) y eliminando posteriormente cualquier resto de agua o humedad por sublimación al vacío. En particular, antes de la liofilización, el tampón de las formulaciones liposomales se sustituyó por sacarosa al 10% mediante centrifugación. A continuación, las soluciones liposomales resultantes se sometieron a un proceso de liofilización caracterizado por parámetros específicos para los pasos de congelación, secado primario y secado secundario identificados en la Tabla 3 a continuación. La torta liofilizada se reconstituyó con una cantidad adecuada de agua purificada antes de las caracterizaciones físicas y los análisis bioquímicos que se describen a continuación.
T a b la 3
Las formulaciones recién preparadas (sin liofilizar) y liofilizadas se utilizaron para administrar el ARNm FFL encapsulado a células 293T, y la luminiscencia se determinó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Como se ilustra en la Tabla 4 a continuación, se observó un valor de luminiscencia de 4,21 x 106 para las nanopartículas lipídicas recién preparadas antes de la liofilización en comparación con 2,65 x 106 observado tras la reconstitución de la formulación liofilizada.
El tamaño medio de las partículas (Zave) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas y liofilizadas fue de 89,11 nm y 96,41 nm, respectivamente. El índice de polidipersidad (PDI) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas fue de 0,205 en comparación con el 0,204 para las nanopartículas lipídicas liofilizadas. La Dv50 y la Dv90 de las nanopartículas lipídicas recién preparadas fueron de 63,8 nm y 117 nm, respectivamente, frente a una Dv50 y una Dv90 de 65,1 nm y 135 nm para las nanopartículas lipídicas liofilizadas, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 6, tanto el tamaño de partícula como la eficiencia de encapsulación se mantuvieron bien durante la liofilización. La eficiencia de encapsulación del ARNm de FFL fue del 93% y del 87% para las nanopartículas lipídicas recién preparadas y liofilizadas, respectivamente. Además, las características físicas observadas sugieren que tanto las nanopartículas lipídicas recién preparadas como las liofilizadas fueron estables y, además, que los tamaños de las partículas se mantuvieron relativamente comparables.
T a b la 4
Ejemplo de Referencia 9
Se preparó una formulación de nanopartícula lipídica que comprendía ARNm de eritropoyetina (EPO) (SEQ ID NO:4), flanqueado por la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:2 en los extremos 5' y 3' respectivamente y encapsulado en una nanopartícula lipídica DLinKC2-DMA:DOPE:CHOL:DMG-PEG2000 (50:25:20:5, N/P 5). Se liofilizó un lote de la formulación de nanopartículas lipídicas preparada de acuerdo con el protocolo expuesto en la Tabla 3.
ARNm de eritropoyetina (EPO) humana (SEQ TD NO:4)
AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCU
GGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGU
ACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGÜGCUGAACACUGCAGCÜUG
AAUGAGAAUAÜCACUGUCCCAGACACCAAAGOÜAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGÜ
CGGGCAGCAGGCCGUAGAAGCJCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGG
GCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAA
GCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCÜUCGGC-CUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGC
CAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCC
g c a a a c u c ü u c c g a g u c u a c u c c a a u u u c c u c c g g g g a a a g c u g a a g c o g u a c a c a g g g g a g
GC C ÜGCAGGACAGGGGñCAGAU GA .
Se compararon las propiedades físicas observadas de la formulación de nanopartículas lipídicas antes y después de la liofilización de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente y resultaron consistentes. Como se ilustra en la Tabla 5, el tamaño medio de las partículas (Zave) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas (sin liofilizar) y liofilizadas fue de 85,9 nm y 95,4 nm, respectivamente, lo que sugiere que tanto las nanopartículas lipídicas recién preparadas como las liofilizadas eran estables. El índice de polidipersidad (PDI) de las nanopartículas lipídicas recién preparadas fue de 0,188 en comparación con 0,231 para el lípido liofilizado de 112 nm, frente a una Dv50 y Dv90 de 67,2 nm y 134 nm para las nanopartículas lipídicas liofilizadas, respectivamente. La eficiencia de encapsulación del ARNm de la EPO fue del 94% y del 86% para las nanopartículas lipídicas recién preparadas y liofilizadas, respectivamente. Como también se muestra en la Tabla 7, tanto el tamaño de partícula como la eficiencia de encapsulación se mantuvieron bien durante la liofilización.
Por último, la proteína eritropoyetina producida por las células 293T se midió usando el kit ELISA IVD de EPO humana Quantikine de R&D Systems. Como se representa en la Tabla 5, la proteína de eritropoyetina producida tras la administración del ARNm de EPO a las células 293T para las formulaciones antes y después de la liofilización fue comparable, y no hubo diferencias significativas en la producción de proteína de eritropoyetina cuando se compararon las formulaciones de nanopartículas lipídicas antes y después de la liofilización.
T a b la 5.
Ejemplo de Referencia 10
Se realizó un estudio de estabilidad de seis meses de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de EPO liofolizado. Se determinaron la distribución del tamaño de las partículas, la eficacia de la encapsulación del ARNm y la expresión de la EPO en ratones CD-1.
La formulación lipídica comprendía ARNm de EPO encapsulado en KC2:DOPE:CHOL:DMGPEG2K (50:25:20:5) como se describe en el Ejemplo 9. La relación N/P (definida como la relación entre el número de nitrógeno en el lípido catiónico y el número de fosfato en el ácido nucleico) fue de 5.
Un vial se almacenó a 2-8 grados C. Otro vial se almacenó a temperatura ambiente. No se controló la humedad en ambas condiciones de almacenamiento.
inyección antes de la caracterización física y los estudios con animales.
El tamaño de partícula se obtuvo con Malvern Zetasizer Nano-ZS. La eficiencia de encapsulación del ARNm en partículas lipídicas se determinó usando el kit de ensayo RiboGreen de Invitrogen. El ARNm no encapsulado se detectó directamente. El ARNm total se midió tras la lisis de las nanopartículas lipídicas en presencia de 0,45% p/v de Triton X-100. La eficiencia de encapsulación se calculó como (ARNm total - ARNm no encapsulado) / ARNm total x 100%.
Se usaron ratones CD-1 de tipo salvaje para evaluar la expresión relativa de EPO tras una única administración IV de dos formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de hEPO. Los niveles de EPO en suero se midieron a las 6 horas de la administración de la dosis. Para este estudio se usaron cuatro ratones CD-1 (2 machos, 2 hembras) de 7 semanas de edad. A su llegada, los animales fueron distribuidos aleatoriamente en 2 grupos de tratamiento que contenían 2 animales por grupo (1 macho, 1 hembra por grupo). El día 1, se pesó a los animales y se registró su peso corporal. Cada ratón recibió una dosis IV única de 99 pg de ARNm/animal en un volumen de dosis de 300 pl/animal. A las 6 horas de la administración de la dosis, se practicó la eutanasia a los ratones mediante asfixia por CO<2>seguido de toracotomía y se recogieron y procesaron para suero los volúmenes máximos obtenibles de sangre. Todos los tratamientos administrados fueron bien tolerados en el ratón CD-1 después de una única administración IV. Los niveles séricos de hEPO se midieron mediante ELISA. Se observó la presencia de EPO en el suero de todos los animales del estudio que recibieron cualquiera de las formulaciones.
Los resultados de las pruebas se resumen en la Tabla 6. No se observó ningún cambio significativo en la distribución del tamaño de las partículas tras el almacenamiento de las nanopartículas lipídicas liofilizadas durante 6 meses, tanto a temperatura de refrigeración como a temperatura ambiente. Además, durante el almacenamiento la eficiencia de encapsulación del ARNm en las nanopartículas lipídicas permaneció esencialmente inalterada. Estos resultados sugieren que la integralidad de la partícula lipídica se mantuvo bien durante el almacenamiento en configuración liofilizada. La estabilidad de 6 meses en condiciones aceleradas de temperatura ambiente apoya una vida útil potencial de 2 años en condiciones de refrigeración. Además, se detectó la hEPO sérica en ratones CD-1 de tipo salvaje a las 6 h de la inyección intravenosa de la suspensión reconstituida de nanopartículas lipídicas liofilizadas tras su almacenamiento tanto en refrigeración como a temperatura ambiente. Estos resultados demuestran que la integralidad de la partícula lipídica se protegió eficazmente durante el almacenamiento en la configuración liofilizada.
T a b la 6.
Ejemplo de Referencia 11
Se realizaron estudios de liofilización de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm usando 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina como lioprotector. A modo de comparación, también se evaluó el lioprotector sacarosa.
El ARNm se encapsuló en partículas lipídicas C12-200:DOPE:CHOL:DMGPEG2K (40:30:25:5) por el método de dilución en etanol. La relación N/P fue de 20. El tampón de las formulaciones se sustituyó por una solución acuosa que contenía la cantidad adecuada de sacarosa o 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina mediante centrifugación antes de la liofilización. Las soluciones resultantes se sometieron a un proceso de liofilización caracterizado por parámetros específicos para los pasos de congelación, secado primario y secado secundario. La Tabla 7 describe un ciclo de liofilización para formulaciones que contienen sacarosa. La Tabla 8 describe un ciclo de liofilización para formulaciones que contienen 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina. La torta liofilizada se reconstituyó con la cantidad apropiada de agua purificada antes de la caracterización física y el análisis bioquímico. El tamaño de partícula se obtuvo con Malvern Zetasizer Nano-ZS. La eficiencia de encapsulación del ARNm en partículas lipídicas se determinó usando El ARNm total se midió tras la lisis de las nanopartículas lipídicas en presencia de 0,45% p/v de Triton X-100. La eficiencia de encapsulación se calculó como (ARNm total - ARNm no encapsulado) / ARNm total x 100%.
Se usaron ratones CD-1 de tipo salvaje para evaluar la expresión relativa de EPO en ratones tras una única administración IV de dos formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de EPO. Los niveles de EPO en suero se midieron a las 6 h de la administración de la dosis. En cada grupo se usaron tres ratones CD-1 macho de 7 semanas de edad. A su llegada, los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento con 3 animales por grupo. El día 1, se pesaron los animales y se registró su peso corporal. Cada ratón recibió una dosis IV única de 15 pg de ARNm/animal en un volumen de dosis de 50 pl/animal. A las 6 h de la administración de la dosis, se sacrificó a los ratones por asfixia con CO2 seguido de toracotomía y se recogieron los volúmenes máximos obtenibles de sangre, que se procesó para suero. Todos los tratamientos administrados fueron bien tolerados en el ratón CD-1 tras una única administración IV. Los niveles séricos de EPO se midieron mediante ELISA. Se observó EPO en el suero de todos los animales del estudio que recibieron cualquiera de las formulaciones.
T a b la 7
T a b la 8
Todos los resultados de las pruebas se resumen en la Tabla 9. Se observó un aumento del tamaño de las partículas durante la liofilización cuando se usó sacarosa como lioprotector en una proporción de peso de 6:1 con respecto a los lípidos totales. Sin embargo, el tamaño de las partículas se mantuvo bien cuando en su lugar se usó 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, incluso a una relación de peso relativamente baja de 5:1. La relación N/P fue de 20. Además, la eficacia de encapsulación del ARNm en nanopartículas lipídicas se mantuvo bien durante la liofilización. Estos resultados sugieren que la integralidad de la partícula lipídica se protegió eficazmente durante la liofilización. Además, los niveles séricos de hEPO en ratones CD-1 de tipo salvaje a las 6 horas de la administración de las nanopartículas son comparables antes y después de la liofilización. En resumen, la 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina es un lioprotector eficaz para las nanopartículas lipídicas encapsuladas de ARNm formuladas con lípido C12-200.
T a b la 9.
continuación
Los ejemplos anteriores ilustran que las formulaciones de nanopartículas lipídicas liofilizadas demostraron características físicas comparables o equivalentes con respecto a las nanopartículas lipídicas no liofilizadas que se prepararon, incluyendo estabilidad, tamaños de partícula de nanopartículas lipídicas y eficiencias de encapsulación comparables. Con respecto a los polinucleótidos de ARNm encapsulados, las nanopartículas lipídicas liofilizadas también demostraron una producción comparable de proteínas. Por ejemplo, varias de las composiciones de nanopartículas lipídicas liofilizadas evaluadas demostraron una producción comparable de proteína luciferasa de luciérnaga, determinada por la presencia de una señal luminiscente, y por tanto infiriendo la expresión y/o producción del ARNm encapsulado administrado exógenamente. Los resultados anteriores sugieren que las composiciones y formulaciones de nanopartículas lipídicas liofilizadas descritas en la presente son estables y capaces de minimizar la degradación de los compuestos encapsulados (por ejemplo, polinucleótidos). Se espera que dichas composiciones de nanopartículas lipídicas liofilizadas tengan una mayor vida útil tras el almacenamiento tanto en condiciones de almacenamiento refrigerado como a temperatura ambiente, presentando de este modo medios atractivos para mejorar la disponibilidad y los costes potenciales asociados con dichas composiciones farmacéuticas.

Claims (15)

  1. R E IV IN D IC A C IO N E S 1. Un compuesto que tiene la estructura:
    en donde R<1>es guanidinio; y en donde n es cero o cualquier número entero positivo.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde n es 1.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la estructura:
  4. 4. Una nanopartícula que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5. La nanopartícula de la reivindicación 4, que comprende además uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un lípido catiónico, un lípido modificado con PEG, un lípido no catiónico y un lípido ayudante.
  6. 6. La nanopartícula de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, que comprende además uno o más polinucleótidos, opcionalmente en donde (a) uno o más de los polinucleótidos comprende una modificación química, (b) el uno o más polinucleótidos se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, ARNip, miARN, ARNsn, ARNsno y combinaciones de los mismos, (c) el uno o más polinucleótidos comprende uno o más LNA, (d) los uno o más polinucleótidos comprenden ADN, o (e) los uno o más polinucleótidos comprenden ARN, opcionalmente en donde (e)(i) el ARN se selecciona del grupo que consiste en ARNm, ARNip, ARNsno, microARN, y combinaciones de los mismos, o (e)(ii) el ARN codifica una enzima, opcionalmente en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en agalsidasa alfa, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamoil-fosfato sintetasa 1 (CPS 1), argininosuccinato sintetasa (ASS 1), argininosuccinato liasa (ASL) y arginasa 1 (ARG1).
  7. 7. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6.
  8. 8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica al sujeto.
  9. 9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende una nanopartícula lipídica liofilizada, en donde la nanopartícula lipídica comprende ARNm, opcionalmente en donde el ARNm está modificado para mejorar la estabilidad.
  10. 10. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende una nanopartícula lipídica liofilizada, en donde la nanopartícula lipídica comprende ARNm, opcionalmente en donde (a) tras la reconstitución, las nanopartículas lipídicas no se agregan, (b) tras la reconstitución, las nanopartículas lipídicas tienen una Dv50 de menos de 150 nm, (c) tras la reconstitución, las nanopartículas lipídicas tienen una Dv90 inferior de menos de 200 nm, (d) tras la reconstitución, las nanopartículas lipídicas tienen un valor de índice de polidispersidad de menos de 0,25, o (e) tras la reconstitución, las nanopartículas lipídicas tienen un tamaño medio de partícula de menos de 125 nm en una solución de PBS.
  11. 11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde (a) la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, opcionalmente en donde el uno o más lípidos catiónicos se seleccionan del grupo que consiste en C12-200, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA, DLinKC2-DMA, HGT4003 (2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N dimetiletanamina), HGT5001 ((15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina), e ICE ((3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptano-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato), (b) la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos modificados con PEG, opcionalmente en donde el uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etileno)glicol de hasta 5kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende una o más cadenas alquílicas de C6-C20 de longitud, (c) la nanopartícula lipídica comprende C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG- 2000, o (d) la nanopartícula lipídica comprende DLinKC2-DMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2000.
  12. 12. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde la composición comprende además uno o más lioprotectores, opcionalmente en donde (a) el uno o más lioprotectores se seleccionan del grupo que consiste en un azúcar y un hidrato de carbono, (b) el lioprotector contiene un 10% de sacarosa, o (c) el uno o más lioprotectores se seleccionan del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, dextrano e inulina.
  13. 13. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde la composición es estable durante (a) por lo menos 1 mes tras su almacenamiento a aproximadamente 4°C, (b) por lo menos 6 meses tras su almacenamiento a aproximadamente 4°C, o (c) por lo menos 6 meses tras su almacenamiento a aproximadamente 25°C.
  14. 14. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde la actividad biológica del ARNm supera el 75% de la actividad biológica observada antes de la liofilización de la composición.
  15. 15. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde (a) la nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado con PEG, un lípido no catiónico y colesterol, (b) la composición se implanta en un sujeto, o (c) tras la reconstitución, la composición se administra a un sujeto mediante una o más de las siguientes vías de administración: intravenosa, oral, rectal, vaginal, transmucosal, sublingual, subdural, nasal, intramuscular, subcutánea, inyección intramedular, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, oftálmica e intraocular.
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