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CN111315359A - 制备脂质纳米颗粒的方法 - Google Patents

制备脂质纳米颗粒的方法 Download PDF

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CN111315359A
CN111315359A CN201880062774.3A CN201880062774A CN111315359A CN 111315359 A CN111315359 A CN 111315359A CN 201880062774 A CN201880062774 A CN 201880062774A CN 111315359 A CN111315359 A CN 111315359A
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J.沙里特
K.哈塞特
M.史密斯
O.阿尔马森
L.布里托
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Abstract

本公开的特征在于在前体核酸脂质纳米颗粒形成后采用改性剂产生核酸脂质纳米颗粒(LNP)组合物的新型方法，由其产生的组合物，以及涉及可用于将治疗剂和/或预防剂诸如核酸递送至哺乳动物细胞或器官例如以调节多肽、蛋白质或基因表达的所述核酸脂质纳米颗粒的方法。

Description

制备脂质纳米颗粒的方法
相关申请
本申请要求2017年11月22日提交的美国临时申请第62/590,193号；2017年8月31日提交的美国临时申请第62/553,088号；以及2017年8月31日提交的美国临时申请第62/553,085号的优先权和权益，其中的每个的整个内容均通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开提供了产生核酸脂质纳米颗粒(LNP)组合物的新型方法，由其产生的组合物，以及涉及所述核酸脂质纳米颗粒以递送一种或多种治疗剂和/或预防剂诸如核酸以和/或在哺乳动物细胞或器官中产生多肽的方法。
背景技术
有效地靶向递送生物活性物质，诸如小分子药物、蛋白质和核酸，代表了持续的医学挑战。具体而言，由于此类物质的相对不稳定性和低细胞渗透性，使得核酸向细胞的递送很困难。因此，需要开发促进将治疗剂和预防剂诸如核酸递送至细胞的方法和组合物。
含脂质的纳米颗粒或脂质纳米颗粒、脂质体和脂质复合物已经证实作为生物活性物质诸如小分子药物、蛋白质和核酸进入细胞和/或细胞内隔室的转运媒介物有效。尽管已经证明了多种此类含脂质的纳米颗粒，但仍缺乏安全性、功效和特异性方面的改进。
发明内容
在一些方面中，本公开提供了一种产生核酸脂质纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：i)混合包含可电离脂质的脂质溶液与包含核酸的溶液，从而形成前体核酸脂质纳米颗粒；ii)将包含改性剂的脂质纳米颗粒改性物添加到所述前体核酸脂质纳米颗粒中，从而形成改性的核酸脂质纳米颗粒；并且iii)加工所述前体核酸脂质纳米颗粒、所述改性的核酸脂质纳米颗粒或两者，从而形成所述核酸脂质纳米颗粒组合物。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前未经加工。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前经过加工。
在一些实施方案中，所述脂质溶液还包含第一PEG脂质。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含第一PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液不包含任何PEG脂质。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒不包含任何PEG脂质。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含磷脂。
在一些实施方案中，所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含结构脂质。
在一些实施方案中，所述改性剂是选自由第二PEG脂质和表面活性剂组成的组的至少一种药剂。
在一些实施方案中，所述改性剂为第二PEG脂质。
在一些实施方案中，所述改性剂为表面活性剂。
在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所公开的方法制备的前体核酸脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所公开的方法制备的核酸脂质纳米颗粒组合物。
在一些方面中，本公开提供了一种表征核酸脂质纳米颗粒组合物的方法，其包括使用离子交换(IEX)色谱测定产生包封在所述核酸脂质纳米颗粒组合物中的所述核酸的量的定量值。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是下面描述的是合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非旨在为限制性的。
从以下详细描述和权利要求中，本公开的其他特征和优势将显而易见。
附图说明
图1A-1B是显示后插入对LNP的mRNA包封的影响的图解。图1A显示了通过无后插入的工艺(在T-混合阶段添加0-3摩尔％的PEG脂质)制备的LNP的包封效率。图1B显示了通过有后插入的工艺(在T-混合阶段添加0-3摩尔％的PEG脂质，在后插入期间添加其余PED脂质)制备的LNP(含总量为3摩尔％的PEG脂质)的包封效率。
图2A-2C是显示后插入对LNP制剂稳定性的影响的图解。图2A显示了在切向流过滤(TFF)中LNP制剂(含总量为3摩尔％的PEG脂质；在T-混合阶段添加0-3摩尔％的PEG脂质，在后插入期间添加其余PED脂质)的粒度变化。图2B显示了在1-5个冻/融循环之前和之后LNP制剂(含总量为0.25-4摩尔％的PEG脂质；在T-混合阶段添加0.25摩尔％的PEG脂质，在后插入期间添加其余PED脂质)的粒度。图2C显示了在1-5个冻/融循环之前和之后LNP制剂(含总量为2摩尔％的PEG脂质；通过有和无后插入或加热的工艺制备)的粒度。
图3A-3B是显示后添加表面活性剂对LNP制剂稳定性的影响的图解。图3A显示了在3个冻/融循环之后LNP制剂(含0-1.5摩尔％的PEG-1；并且在后添加期间添加了0-0.1w/v％的Brij S20表面活性剂)的粒度。图3B显示了在3个冻/融循环之后LNP制剂(含0-1.5摩尔％的PEG-1；并且在后添加期间添加了0-0.1w/v％的Brij O20表面活性剂)的粒度。
图4A-4B是显示后添加表面活性剂对LNP制剂表达的影响的图解。图4A显示了6小时内LNP制剂(在后添加期间添加了不同量的Brij O20表面活性剂)的平均表达。图4B显示了24小时内LNP制剂(在后添加期间添加了不同量的Brij O20表面活性剂)的平均表达。
图5A-5B是显示在3个冻/融循环之后LNP制剂(含不同量的PEG-1，以w/v％和摩尔％表示)的粒度的图解。
图6A-6B是显示不同量的PEG脂质对LNP制剂的影响的图解。图6A显示了含0-2.5摩尔％的PEG-2或PEG-1的LNP制剂的mRNA包封效率。图6B显示了含0-2.5摩尔％的PEG-2或PEG-1的LNP制剂的粒度。
图7A-7C是显示PEG脂质对LNP制剂表达的影响的图解。图7A显示了含不同量的PEG-2的eGFP mRNA LNP制剂的表达。图7B显示了含不同量的PEG-2或PEG-1的ffLuc mRNALNP制剂的表达。图7C显示了图7A-7B所示数据的比较。
图8是显示在CD-1小鼠中使用含有可电离脂质和不同量的PEG脂质的LNP制剂进行的多剂量研究的总流量的图解。
图9是显示含有可电离脂质和不同量的P188泊洛沙姆或PEG脂质的hEPO mRNA LNP制剂的体外表达的图解。
图10是显示含不同量的PEG-1的LNP制剂的摄取量和eGFP mRNA表达的图解。
图11A-11B是显示含有可电离脂质和不同量的PEG-1的LNP制剂的mRNA包封的表格。
图12A-12B是一对说明PEG对于本公开的纳米颗粒(LNP)的效力和稳定性的重要性的图表。图12A汇总了病毒复合物中的五聚体特异性IgG的滴度。图片显示LNP中的PEG越少，产生的LNP免疫原性越强。图12B说明了含有可电离脂质的LNP随储存时间变化的尺寸对PEG的依赖性。
图13A-13B是一对汇总根据本文所述的工艺制备的纳米颗粒上的体外表达的图表。第1批是使用标准工艺制备的。第2批和第4批是通过后插入工艺制备的，第3批和第5批是通过后添加工艺制备的。图13A是第1-5批的脂质纳米颗粒的体外蛋白质表达的直方图。图13B是第1-5批的脂质纳米颗粒的几何平均值的直方图。
图14是说明在切向流过滤(TFF)期间通过本文所述的工艺制备的纳米颗粒的性能的图表。
图15是用Ribogreen测定的经由本文公开的工艺形成的脂质纳米颗粒的mRNA包封百分比的直方图。
图16和17是一对说明经由本文公开的工艺形成的脂质纳米颗粒的mRNA包封和粒度的直方图。第1批是使用标准工艺制备的。第2批和第4批是通过后插入工艺制备的，第3批和第5批是通过后添加工艺制备的。图16是显示通过离子交换色谱测定的mRNA包封百分比的直方图。图17是显微镜可见的颗粒(>0.8μm)的平均粒度的直方图。
图18是在冻融之前和长达5个冻融循环之后，通过动态光散射(DLS)测定的通过本公开的工艺制备的纳米颗粒的粒度的直方图。
图19是汇总通过本公开的工艺制备的纳米颗粒的纳米颗粒跟踪分析结果的图表。
图20是通过本公开的工艺制备的纳米颗粒的一系列低温电子显微镜图像。编号1-5是指第1-5批的纳米颗粒，其中第1批是使用标准工艺制备的，第2批和第4批是通过后插入工艺制备的，第3批和第5批是使用后添加工艺制备的。
图21是说明液体纳米颗粒与肝素琼脂糖柱的结合的直方图。
图22是显示经由本公开的工艺形成的脂质纳米颗粒的冻-融扩散排序谱分析(DOSY)的结果的直方图。第1批是使用标准工艺制备的，第2批和第4批是通过后插入工艺制备的，第3批和第5批是使用后添加工艺制备的。该图说明了具有更初始的PEG的样品更稳定。鉴于扩散的较小变化，不稳定性可能不显著。虽然第4批和第5批中的储存稳定性可能较低，但是较高的不稳定性可促成体内更多的RNA释放/表达。
图23是经由本公开的工艺形成的脂质纳米颗粒在小鼠体内的免疫原性(血清IgG滴度)的图表(在五聚体涂层板上测定的)。
图24是经由本公开的工艺形成的脂质纳米颗粒的体内免疫原性(血清IgG滴度)的图表(在gB涂层板上测定的)。
图25是通过循环激素蛋白水平评估的，在WKY大鼠中施用包含化合物18和PEG-1的制剂的蛋白质药代动力学的图表。
图26是显示通过有后插入的工艺制备的LNP(含总量为3摩尔％的PEG脂质)的包封效率的图解(在T-混合阶段添加的PED脂质与在后插入期间添加的PEG脂质的比率范围为0至1)。
图27A-27B是显示后添加PEG-1对LNP制剂(含不同总量的PEG脂质；并且在T-混合阶段添加了0.25摩尔％的PEG脂质)的影响的图解。
图28是显示制备LNP制剂中的不同条件的表格。
图29A-29B是显示后插入PEG脂质对LNP制剂的膜渗透性的影响的图解。
图30A-30B是显示后添加PEG脂质对LNP制剂的膜渗透性的影响的图解。
图31A-31B是显示后插入和后添加PEG-1对含有可电离脂质的LNP制剂的稳定性的影响的图解。图31A显示了通过有后插入的工艺制备的LNP制剂在1-10个冻/融循环之前和之后的粒度。图31B显示了通过有后添加的工艺制备的LNP制剂在1-10个冻/融循环之前和之后的粒度。
图32A-32B是显示后插入和后添加PEG-1对含有可电离脂质的LNP制剂的mRNA包封效率的影响的图解。
图33A-33C是显示添加NaCl、DTPA或乙醇对通过后添加PEG-1的工艺制备的含有可电离脂质的LNP制剂的mRNA包封效率的影响的图解。
图34A-34C是显示添加NaCl、DTPA或乙醇对通过后插入PEG-1的工艺制备的含有可电离脂质的LNP制剂的mRNA包封效率的影响的图解。
图35说明了不同缓冲液对纳米颗粒稳定性的影响。从冷冻制剂缓冲液中除去乙醇减轻了包封对冻/融应力的敏感性。
图36说明了不同缓冲液对纳米颗粒尺寸的影响。Tris-蔗糖-NaCl-乙醇-DTPA缓冲液赋予LNP直径针对冻/融应力的保护。Tris-蔗糖缓冲液显示出降低的直径稳定性。基于Tris-蔗糖的制剂通过PEG-1后添加得以稳定。
图37说明了不同缓冲液对纳米颗粒包封效率的影响。Tris-蔗糖-NaCl-乙醇-DTPA缓冲液引起对mRNA包封的敏感性。Tris-蔗糖显示出稳健的包封值。
图38说明了与后插入工艺相比，在后添加工艺中制备的颗粒在切向流过滤(TFF)中的流量。
图39汇总了与后插入工艺相比，在后添加工艺中制备的颗粒在切向流过滤(TFF)中的流量变化。
图40是汇总在本文所述的后添加工艺中用PEG-1制备的多批纳米颗粒组合物。
图41是描绘用不同量的PEG-脂质，通过标准加工制备的各种LNP在经受0-5轮冻/融(FT)事件时的LNP粒度(nm)变化的图表。
图42是依据降解速率描绘通过标准加工制备的含不同量的PEG-脂质的LNP的长期储存的图表。
图43是描绘用不同量的PEG-脂质，通过标准加工制备的各种LNP的mRNA截留％的图表。
图44是描绘依据人IgG检测(ng/mL)进行测量的，对AUC eGFP表达产生不利影响的PEG-脂质的图表。
图45是描绘SAXS衍射图的图表，其中用14摩尔％的PEG-DMG时层状结构缺乏秩序，并且其中在2摩尔％的PEG-DMG下，显著的衍射封指示有序的层状结构。
图46是描绘过程流量的图表，过程流量定义为每单位时间流过每单位面积的膜的体积。过程流量降低可指示生物物理变化，例如聚集或扩散率。后插入一致性地降低/消除了通过缓冲液交换的流量损失。
图47A和47B是比较经由标准加工制备的LNP，经由后插入PEG脂质制备的LNP和经由后添加表面活性剂制备的LNP的AUC eGFP表达的图表。
图48是描绘在冻/融应力事件后LNP直径的变化以及含不同总量的PEG脂质(PEG-1)的LNP组合物的AUC eGFP表达的变化的图表。
图49A和49B是一组描绘证明LNP在空隙中洗脱并且mRNA在梯度从低到高盐浓度变化时洗脱的分离结果的图表。图49A描绘基于mRNA制剂缓冲液条件改变的包封效率。图49B描绘基于mRNA制剂盐浓度改变的包封效率。
图50是显示柱上保留的％mRNA与样品的体外表达之间的相关性的图表。
图51是用Ribogreen和阴离子交换色谱测定的mRNA包封百分比对比体外表达的图表。
图52A-52F是一组显示经由本公开的工艺形成的脂质纳米颗粒的体内免疫原性(血清Ig滴度)的图表。图52A显示了第36天(在五聚体涂层板上测定的)的血清IgG滴度。图52B显示了第36天(在gB涂层板上测定的)的血清IgG滴度。图52C显示了第21天(在五聚体涂层板上测定的)的血清IgG滴度。图52D显示了第21天(在gB涂层板上测定的)的血清IgG滴度。图52E显示了第21天和第36天(在五聚体涂层板上测定的)的血清IgG滴度的比较。图52F显示了第21天和第36天(在gB涂层板上测定的)的血清IgG滴度的比较。
图53是通过阴离子交换色谱测定的mRNA包封百分比对比体外表达的图表。
图54是通过阴离子交换色谱测定的mRNA包封百分比对比体外表达的图表。
图55是通过阴离子交换色谱测定的mRNA包封百分比对比体外表达的图表。
图56是通过阴离子交换色谱测定的mRNA包封百分比对比体外表达的图表。
图57是用多种表面活性剂制备的包含1％PEG并且储存在20mM tris 8％蔗糖中的LNP制剂，在5个-20℃冷冻和室温下融化的循环之后的平均百分比尺寸变化(％)的图表。
图58A和58B是包含1％PEG(A)和1.5％PEG(B)，不含表面活性剂或添加了不同重量％的表面活性剂，以0.5mg/mL RNA在20mM tris 8％蔗糖中-20℃储存6个月时间的LNP制剂的尺寸(nm)的图表。
图59是肌内注射在含有1.5％PEG且掺有不同重量％的在20mM tris 8％蔗糖中的表面活性剂的LNP中的0.2μg mRNA，并且在注射6小时后放血的雌性CD-1小鼠(n＝5只小鼠/组)的体内EPO表达的图表，证明添加表面活性剂时的表达相当。
图60是对于在核中以0.5％PEG配制并经由后添加而添加1％PEG的LNP，在透析到20mM tris(pH 7.4)中之后，然后添加10重量％的蔗糖和不同重量％的表面活性剂，在0.2mg/mL的RNA下从冻干之前到冻干之后的尺寸变化(nm)的图表，证明许多表面活性剂会减少冻干期间的尺寸增长。
具体实施方式
本公开部分基于以下发现：生产脂质纳米颗粒的方法可以影响脂质纳米颗粒内某些组分的分布，并且这种分布可以影响和/或决定脂质纳米颗粒的物理性质(例如稳定性)和/或生物学性质(例如功效、细胞内递送、免疫原性)。
在一些实施方案中，本公开的方法产生包含具有有利的组分分布的脂质纳米颗粒的组合物。
在一些实施方案中，本公开的方法减少了所产生的脂质纳米颗粒(LNP)制剂不希望有的性质变化。
在一些实施方案中，不希望有的性质变化是由LNP制剂或其中的LNP上的应力引起的。在一些实施方案中，在生产、纯化、包装、储存、运输和/或使用LNP制剂期间诱导了应力。在一些实施方案中，应力是热、剪切、过度搅拌、膜浓差极化(电荷状态变化)、脱水、冷冻应力、干燥应力、冻/融应力和/或雾化应力。在一些实施方案中，在冷冻或冻干LNP制剂期间诱导了应力。
在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂的物理稳定性降低。在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂中杂质和/或显微镜可见的颗粒的量增加，或LNP的平均尺寸增加。
在一些实施方案中，与通过同等方法(例如，没有如本文所公开的步骤i)、ia)、ib)、ii)、iia)、iib)、iic)、iid)、iie)和iif)中的一个或多个的方法(例如，没有步骤ia)和/或步骤iia)的方法))产生的LNP制剂相比，本公开的方法减少了产生的LNP制剂的物理稳定性的降低(例如，LNP的平均尺寸的增加)。
在一些实施方案中，与通过同等方法(例如，没有如本文所公开的步骤中的一个或多个的方法)产生的LNP制剂的平均LNP直径相比，通过本公开的方法产生的LNP制剂的平均LNP直径为约99％或以下，约98％或以下，约97％或以下，约96％或以下，约95％或以下，90％或以下，约85％或以下，约80％或以下，约75％或以下，约70％或以下，约65％或以下，约60％或以下，约55％或以下，约50％或以下，约40％或以下，约30％或以下，约20％或以下，或约10％或以下。
在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂的化学稳定性降低。在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂中核酸(例如，RNA(例如，mRNA))的完整性降低。
在一些实施方案中，与通过同等方法(例如，没有如本文所公开的步骤中的一个或多个的方法)产生的LNP制剂相比，本公开的方法减少了所产生的LNP制剂的化学稳定性降低(例如，LNP制剂中核酸的完整性降低)
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的LNP完整性与用于产生LNP制剂的LNP完整性大约相同。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的LNP完整性比用于产生LNP制剂的LNP完整性低约50％或以下，约40％或以下，约30％或以下，约20％或以下，约15％或以下，约10％或以下，约8％或以下，约6％或以下，约4％或以下，约3％或以下，约2％或以下，或约1％或以下。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的LNP完整性高于通过同等方法(例如，没有如本文所公开的步骤i)、ia)、ib)、ii)、iia)、iib)、iic)、iid)、iie)和iif)中的一个或多个的方法(例如，没有如本文所公开的步骤中的一个或多个的方法))产生的LNP制剂的LNP完整性。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的LNP完整性比通过同等方法产生的LNP制剂的LNP完整性高约5％或以上，约10％或以上，约15％或以上，约20％或以上，约30％或以上，约40％或以上，约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，约90％或以上，约1倍或以上，约2倍或以上，约3倍或以上，约4倍或以上，约5倍或以上，约10倍或以上，约20倍或以上，约30倍或以上，约40倍或以上，约50倍或以上，约100倍或以上，约200倍或以上，约300倍或以上，约400倍或以上，约500倍或以上，约1000倍或以上，约2000倍或以上，约3000倍或以上，约4000倍或以上，约5000倍或以上，或约10000倍或以上。
在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂的生物学性质降低。在一些实施方案中，不希望有的性质变化是LNP制剂的功效、细胞内递送和/或免疫原性降低。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的功效、细胞内递送和/或免疫原性高于通过同等方法(例如，没有如本文所公开的步骤中的一个或多个的方法)产生的LNP制剂的功效、细胞内递送和/或免疫原性。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂的功效、细胞内递送和/或免疫原性高于通过同等方法产生的LNP制剂的功效、细胞内递送和/或免疫原性约5％或更高，约10％或以上，约15％或以上，约20％或以上，约30％或以上，约40％或以上，约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，约90％或以上，约1倍或以上，约2倍或以上，约3倍或以上，约4倍或以上，约5倍或以上，约10倍或以上，约20倍或以上，约30倍或以上，约40倍或以上，约50倍或以上，约100倍或以上，约200倍或以上，约300倍或以上，约400倍或以上，约500倍或以上，约1000倍或以上，约2000倍或以上，约3000倍或以上，约4000倍或以上，约5000倍或以上，或约10000倍或以上。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂表现出的核酸表达(例如mRNA表达)比通过同等方法产生的LNP制剂的核酸表达(例如mRNA表达)高。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的LNP制剂表现出的核酸表达(例如mRNA表达)比通过同等方法产生的LNP制剂的核酸表达(例如mRNA表达)高约5％或更高，约10％或以上，约15％或以上，约20％或以上，约30％或以上，约40％或以上，约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，约90％或以上，约1倍或以上，约2倍或以上，约3倍或以上，约4倍或以上，约5倍或以上，约10倍或以上，约20倍或以上，约30倍或以上，约40倍或以上，约50倍或以上，约100倍或以上，约200倍或以上，约300倍或以上，约400倍或以上，约500倍或以上，约1000倍或以上，约2000倍或以上，约3000倍或以上，约4000倍或以上，约5000倍或以上，或约10000倍或以上。
产生脂质纳米颗粒(LNP)组合物的方法及其产生的LNP组合物
本公开提供了一种产生核酸脂质纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：i)混合包含可电离脂质的脂质溶液与包含核酸的溶液，从而形成前体核酸脂质纳米颗粒；ii)将包含改性剂的脂质纳米颗粒改性物添加到所述前体核酸脂质纳米颗粒中，从而形成改性的核酸脂质纳米颗粒；并且iii)加工所述前体核酸脂质纳米颗粒、所述改性的核酸脂质纳米颗粒或两者，从而形成所述核酸脂质纳米颗粒组合物。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前未经加工。如本文所用，该实施方案可以称为“后插入”方法或工艺。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前经过加工。如本文所用，该实施方案可以称为“后添加”方法或工艺。
在一些实施方案中，脂质溶液还包含第一PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质溶液不包含任何PEG脂质。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒还包含第一PEG脂质。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒不包含任何PEG脂质。
在一些实施方案中，所述改性剂是选自由第二PEG脂质和表面活性剂组成的组的至少一种药剂。在一些实施方案中，所述改性剂为第二PEG脂质。在一些实施方案中，所述改性剂为表面活性剂。
在一些实施方案中，所述改性剂为第二PEG脂质。在一些实施方案中，第一PEG脂质和第二PEG脂质相同。在一些实施方案中，第一PEG脂质和第二PEG脂质不相同。
在一些实施方案中，第一PEG脂质与所述改性剂的摩尔比在约1:100至约1:1，优选约1:50至约1:1，优选约1:25至约1:1，优选约1:10至约1:1的范围内。在一些实施方案中，所述改性剂为第二PEG脂质并且第一PEG脂质与第二PEG脂质的摩尔比在约1:100至约1:1，优选约1:50至约1:1，优选约1:25至约1:1，优选约1:10至约1:1的范围内。在一些实施方案中，所述改性剂为表面活性剂并且第一PEG脂质与表面活性剂的摩尔比在约1:100至约1:1，优选约1:50至约1:1，优选约1:25至约1:1，优选约1:10至约1:1的范围内。
脂质混合物可溶解在水溶性有机溶剂，优选无水乙醇中。在一些实施方案中，有机溶剂以其可商购的形式使用。在一个示例性的实施方案中，脂质混合物是可电离脂质和第一PEG脂质共溶在有机溶剂中的混合物。在一些实施方案中，脂质混合物基本上由可电离脂质和PEG脂质以及任选地磷脂和/或结构脂质组成。优选的摩尔范围是30至60摩尔％的可电离脂质和0.01至10摩尔％的第一PEG脂质，优选0.01-5摩尔％，优选0.01-4摩尔％，优选0.01-3摩尔％，优选0.01-2摩尔％。优选0.01-1摩尔％，优选0.01-0.8摩尔％，优选为0.01-0.6摩尔％，优选为0.01-0.5摩尔％，优选0.01-0.25摩尔％的第一PEG脂质。脂质总浓度优选小于25mg/ml，优选小于5mg/ml。脂质混合物可通过膜，例如0.45或0.2μm的过滤器过滤。
根据本发明，脂质混合物可以与核酸溶液，优选以缓冲水溶液的形式组合。缓冲水溶液可以是其中缓冲液的pH小于脂质混合物中质子化脂质的pKa的溶液。合适的缓冲液的实例包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐和乙酸盐。特别优选的缓冲液是乙酸盐缓冲液。优选的缓冲液将在1-1000mM阴离子的浓度范围内，这取决于包封的核酸的化学性质，并且缓冲液浓度的优化对于实现高负载水平可能很重要。添加防冻剂和/或非离子溶质可能是合适的，例如，当透析颗粒以去除乙醇，提高pH或与药学上可接受的载体或稀释剂混合时，它们将平衡颗粒膜上的渗透势。缓冲液中核酸的量优选为约0.01至1.0mg/mL，优选为0.08至0.8mg/mL。
在添加脂质溶液(例如乙醇)时，核酸水溶液的温度为25至45℃，优选为30至40℃。在一些实施方案中，在升高的温度下短暂加热核酸水溶液可能是有用的，例如在65℃下加热1-2分钟。可以通过以窄流喷洒在空气-水界面上或通过浸没在核酸水溶液中的管递送的脂质溶液之间的液-液界面，将脂质溶液添加到水溶液中。
可以通过重力或通过泵以受控速率，优选以恒定速率将有机脂质溶液递送至核酸水溶液的方式添加有机脂质溶液。在一些实施方案中，有机脂质的递送是连续的(例如，通过泵在连续流下操作)。有机脂质溶液的递送可以在1分钟至6小时，1分钟至100分钟或1至25分钟内完成。可以通过单次喷雾或流，通过管或出口，或通过多出口系统添加有机脂质溶液。在将脂质有机溶液添加到核酸水溶液中的同时，可以通过搅拌、振荡或再循环将所得溶液混合。如本文所用，“混合”优选包括湍流混合(“T-混合”)、涡旋式混合(“V-混合”)、微流体混合或两者。添加/混合步骤导致最终浓度为10至45％的乙醇，优选11至30％的乙醇，更优选12.5至25％的乙醇。优选地，形成涉及溶液的湍流混合或微流体混合，以诱导有机相中的脂质与水相中的核酸沉淀，或将已经分相的核酸和脂质混合物通过膜挤出以产生LNP。
在所述工艺的一个步骤中，将包含第一PEG脂质的脂质溶液与包含核酸的溶液混合，从而形成前体核酸脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，提供了前体核酸。在另一方面，提供了前体脂质纳米颗粒。如本文所用，“前体脂质纳米颗粒”是指是本文所述的脂质纳米颗粒的前体的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，前体脂质纳米颗粒可以在颗粒配制过程中的一个或多个步骤期间形成和/或存在。在脂质纳米颗粒包含PEG分子的一些实施方案中，前体脂质纳米颗粒可以包含相对较低百分比的PEG分子(例如，至少约0.01摩尔％且小于或等于约1.0摩尔％，至少约0.05摩尔％，至少约0.1摩尔％，至少约0.2摩尔％，至少约0.3摩尔％，至少约0.4摩尔％，至少约0.5摩尔％，至少约0.6摩尔％，至少约0.7摩尔％或0.8摩尔％)。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒中的核酸全部与可电离脂质缔合。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒中约80％至约100％，约85％至约100％，或约90％至约100％的核酸与可电离脂质缔合，约95％至约100％，优选约98％至约100％，优选约99％至约100％。
在脂质纳米颗粒包含PEG分子的一些实施方案中，前体脂质纳米颗粒可具有与PEG分子相比更多的与可电离脂质缔合的核酸。例如，前体脂质纳米颗粒中至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％或至少约90％的核酸与可电离脂质缔合。在一些此类情况下，前体脂质纳米颗粒中小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％或小于约10％的核酸与PEG分子(例如，PEG脂质)缔合。在一些实施方案中，前体脂质纳米颗粒中与可电离脂质缔合的核酸与与PEG脂质缔合的核酸的比率为至少约2:1。在一些实施方案中，包含前体脂质纳米颗粒的组合物可以包含一种或多种有机溶剂(例如，乙醇)。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒组合物可富含前体脂质纳米颗粒。例如，核酸脂质纳米颗粒组合物中至少约50％的脂质纳米颗粒可以是前体脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和约0.01-10摩尔％的第一PEG脂质。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和约0.01-1摩尔％的第一PEG脂质。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约40-60摩尔％的可电离脂质；约5-15摩尔％的磷脂；约35-45摩尔％的结构脂质；和约0.01-10摩尔％的第一PEG脂质。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约40-60摩尔％的可电离脂质；优选地，所述脂质纳米颗粒包含约40-60摩尔％的可电离脂质；约5-15摩尔％的磷脂；约35-45摩尔％的结构脂质；和约0.01-1摩尔％的第一PEG脂质。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和约0.01-0.75摩尔％的第一PEG脂质。在一些实施方案中，前体核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和约0.01-0.5摩尔％的第一PEG脂质。
在一些实施方案中，所述加工可涉及通过透析或过滤，优选通过渗滤来处理以去除有机溶剂(即，乙醇)。如本文所用，“加工”包括纯化、pH调节、缓冲液交换和/或浓缩LNP的步骤。在一些实施方案中，所述加工包括过滤，诸如无菌过滤。在更优选的实施方案中，所述加工包括切向流过滤(TFF)。在去除乙醇的同时，将水溶液转化为在中性pH，pH 6.5至7.8，pH 6.8至pH 7.5，优选pH 7.0至pH 7.2缓冲的水溶液，例如磷酸盐或HEPES缓冲液。所得水溶液优选在储存或使用之前进行灭菌，例如通过0.22μm过滤器过滤进行灭菌。
在一些实施方案中，所述加工可以包括冷冻和/或冻干。冻干步骤可以在合适的玻璃容器中进行，优选在1ml至10ml(例如3ml)的圆柱形玻璃小瓶中进行。玻璃小瓶应承受在短时间内低于-40℃和高于室温的极端温度变化，并切成均匀的形状。将包含核酸脂质纳米颗粒的组合物优选以约0.1ml至约5ml，0.2ml至约3ml，0.3ml至约1ml或约0.4ml至约0.8ml(例如约0.5ml)的体积添加到小瓶中，并且优选脂质为约9mg/ml。冻干步骤可以包括在高于约-40℃，或例如低于约-30℃的温度下冷冻所述组合物，形成冷冻组合物；并干燥冷冻组合物以形成冻干组合物。冷冻步骤优选导致温度在约100至180分钟(例如，约130分钟)内线性降低至最终温度，优选以0.1至1℃/分钟(例如，约0.5℃/分钟)从20℃降至-40℃。更优选地，可以使用5-15％(例如8-12％)的蔗糖，并且干燥步骤是在约50-150mTorr下，首先在约-15℃至约-35℃的低温下，之后在室温至约25℃的较高温度下，在三至七天内完成。在本公开的另一个实施方案中，干燥步骤是在约50-100mTorr，首先在约-40℃至约-20℃的低温下，然后在较高温度下。
在一些实施方案中，所述方法还可包括包装核酸脂质纳米颗粒组合物。如本文所用，“储存”或“包装”可以指以最终状态储存药物产品或在将LNP放入最终包装之前LNP的过程中储存。储存和/或包装模式包括但不限于无菌袋冷藏，小瓶中的冷藏或冷冻制剂，小瓶和注射器中的冻干制剂等。
在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-40摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和总量约0.01-20摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和总量约0.5-3.0摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约40-60摩尔％的可电离脂质；约5-15摩尔％的磷脂；约35-45摩尔％的结构脂质；和总量约0.01-20摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约40-60摩尔％的可电离脂质；约5-15摩尔％的磷脂；约35-45摩尔％的结构脂质；和总量约0.5-3摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和总量约0.5-2.5摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。在一些实施方案中，核酸脂质纳米颗粒包含约30-60摩尔％的可电离脂质；约0-30摩尔％的磷脂；约15-50摩尔％的结构脂质；和总量约0.5-2.25摩尔％的第一PEG脂质和第二PEG脂质。
在一些实施方案中，核酸LNP制剂中非离子型表面活性剂的浓度范围为约0.00001％w/v至约1％w/v，例如约0.00005％w/v至约0.5％w/v，或约0.0001％w/v至约0.1％w/v。
在一些实施方案中，核酸LNP制剂中非离子型表面活性剂的浓度范围为约0.000001重量％至约1重量％，例如约0.000002重量％至约0.8重量％，或约0.000005重量％至约0.5重量％。
在一些实施方案中，稳定化LNP制剂中PEG脂质的浓度范围为约0.01摩尔％至约50摩尔％，例如约0.05摩尔％至约20摩尔％，约0.07摩尔％至约10摩尔％，约0.1摩尔％至约8摩尔％，约0.2摩尔％至约5摩尔％，或约0.25摩尔％至约3摩尔％。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中一种或多种组分的分布可以至少部分地由组装组分的工艺所决定。例如，在一些实施方案中，可以至少部分地通过配制工艺来控制脂质纳米颗粒内的核酸(例如，mRNA)的分布(例如，可及性、排列)。例如，配制工艺可以包括一个或多个允许定制mRNA分布的步骤，如下文更详细地描述。例如，该配制工艺可在颗粒形成步骤(例如，纳米沉淀反应)期间使用相对低重量百分比的某些组分(例如，PEG脂质)和/或在颗粒形成后添加某些脂质纳米颗粒组分。
在一些实施方案中，不管所用工艺如何，脂质纳米颗粒内一种或多种组分的分布可至少部分地受到脂质纳米颗粒中另一组分的分布影响。例如，脂质纳米颗粒内核酸的分布可以至少部分地由脂质纳米颗粒中另一组分的分布所决定，所述另一组分例如是包含聚乙二醇的分子(也称为“PEG分子”)。不受理论的束缚，据信PEG分子的某些分布促进了某些产生有益mRNA分布的缔合。不管包含PEG的分子(例如PEG脂质)的分布是否影响mRNA的分布，包含聚乙二醇的分子(例如PEG脂质)的某些分布都可以产生有益性质。
如本文所述，在一些实施方案中，具有某种分布的包含聚乙二醇的分子(例如，PEG脂质)的脂质纳米颗粒可以具有有利的物理和/或生物学性质。在一些实施方案中，包含聚乙二醇的分子(例如，PEG脂质)可以分布成使得相对较高百分比(例如，大部分)的包含聚乙二醇的分子(例如，PEG-脂质)从脂质纳米颗粒的表面可及。如本文所用，关于包含聚乙二醇的分子(例如，PEG-脂质)，术语“可及”(也称为“表面可及”)可以指定位在脂质纳米颗粒表面的PEG分子和/或在某些条件下(例如，生理条件下，在血清中，在缓冲液中)可以例如通过容易的重组容易地定位在脂质纳米颗粒表面的PEG分子。表面不可及性PEG分子可以称为“残留”PEG分子。在一些实施方案中，残留PEG分子可以位于脂质纳米颗粒的一个或多个内部区域中。在一些实施方案中，表面可及性PEG分子可以位于脂质纳米颗粒的外部区域内。
在一些实施方案中，可以通过一种或多种测定(例如，体外测定)确定PEG分子的表面可及性。通常，可以使用任何合适的体外测定。在一些实施方案中，如经由扩散排序谱(DOSY)NMR所评估的，PEG分子从脂质纳米颗粒的脱落可用于确定脂质纳米颗粒和/或组合物中表面可及的和残留的PEG分子的相对百分比。在通过引用整体并入的Wilson,S.C.；Baryza,J.L.；Reynolds,A.J.；Bowman,K.；Rajan,S.等人(2015).Real Time Measurementof PEG Shedding from Lipid Nanoparticles in Serum via NMRSpectroscopy.Molecular Pharmaceutics,12(2):386-92中进一步描述了PEG脱落和DOSYNMR。在一些实施方案中，表面可及性PEG分子的百分比对应于处于某些条件下(例如在25℃的小鼠血清中)一定时间段(例如6小时、24小时)之后脱落的PEG分子的百分比。
在一些实施方案中，PEG分子可以产生相对较短的半衰期的方式分布。如本文所用，包含聚乙二醇的分子的“半衰期”是通过DOSY NMR测定的，在某些条件下(例如，在25℃的小鼠血清中)，50％的包含聚乙二醇的分子从脂质纳米颗粒表面脱落所需的时间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以具有比某些对比脂质纳米颗粒更短的半衰期。
在一些实施方案中，PEG分子的表面可及性、排列和/或半衰期可与脂质纳米颗粒的一种或多种生物学和/或物理性质相关。例如，在一些实施方案中，PEG分子的表面可及性、排列和/或半衰期可与脂质纳米颗粒和/或组合物的免疫原性相关。例如，在一些实施方案中，相对较高百分比的表面可及性PEG分子和/或相对较短的半衰期可对应于低免疫原性或无免疫原性。某些本发明的组合物可以具有比对比组合物更低的免疫原性。
在一些实施方案中，PEG分子的表面可及性、排列和/或半衰期可与脂质纳米颗粒的一种或多种物理性质相关。例如，相对较高百分比的表面可及性PEG分子和/或相对较短的半衰期可对应于较高的核酸包封效率。作为另一个实例，PEG分子的表面可及性、排列和/或半衰期可与表面极化相关。例如，在一些实施方案中，具有相对较高百分比的表面可及性PEG分子和/或相对较短的半衰期的脂质纳米颗粒可具有相对较低的表面极化(例如，低表面极性)。
如本文所述，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以具有一种或多种组分的有益分布。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可具有两种或更多种组分(例如，三种或更多种组分，四种或更多种组分，五种或更多种组分)的有益分布。例如，脂质纳米颗粒可以具有有益的核酸分布和有益的PEG分子分布。在一些此类情况下，脂质纳米颗粒的至少一些(例如，全部)有利特性可以与每种组分的有益分布相关。
在一些实施方案中，提供了组合物。所述组合物可以包含本文所述的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物可包含相对较高百分比的本文所述的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可具有优于制剂中其他脂质纳米颗粒的一种或多种性质。此类具有优于制剂中另一脂质纳米颗粒的一种或多种性质的脂质纳米颗粒可以称为“增强型脂质纳米颗粒”。例如，与组合物中的另一脂质纳米颗粒(例如，所有其他脂质纳米颗粒)相比，增强型脂质纳米颗粒可具有更多不可及性mRNA。在一些情况下，增强型脂质纳米颗粒可具有比可及性mRNA更多的不可及性mRNA。在某些实施方案中，增强型脂质纳米颗粒可以具有相对较高百分比(例如，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％)的表面可及性PEG分子。在其中增强型脂质纳米颗粒占组合物中总脂质纳米颗粒的相对较高百分比(例如，至少约50％，约至少约60％，至少约70％，约至少约80％，至少约90％，至少约95％)的一些实施方案中，该组合物可称为富含增强型脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有少量的可及性核酸(例如，mRNA)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中核酸总量的小于或等于约50％，小于或等于约45％，小于或等于约40％，小于或等于约35％，小于或等于约30％，小于或等于约25％，小于或等于约20％，小于或等于约15％，小于或等于约10％，或小于或约5％是可及性核酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含可及性核酸。在一些此类实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含至少约0.01％，至少约0.05％，至少约0.1％，至少约0.5％，至少约1％或至少约2％的可及性核酸。上述参考范围的所有组合都是可能的(例如，至少约0.01％且小于或等于约50％)。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有有益量的不可及性核酸(例如，mRNA)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中核酸总量的至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，小于或等于约90％或至少约95％是不可及性核酸(例如，mRNA)。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有有益量的位于脂质纳米颗粒的一个或多个内部区域中的核酸(例如，mRNA)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中核酸总量的至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，小于或等于约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，小于或等于约90％或至少约95％位于脂质纳米颗粒的内部区域中。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有有益量的至少部分(例如，完全)被包封的核酸(例如，mRNA)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中核酸总量的至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，小于或等于约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，小于或等于约90％或至少约95％至少部分(例如，完全)被包封。在一些实施方案中，可以通过如本文所述的体外测定(例如，IEX)来确定至少部分(例如，完全)包封的核酸的百分比。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有有益量的表面可及性PEG分子(例如，PEG脂质)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中包含PEG的分子(例如，PEG脂质)总量的至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，小于或等于约90％或至少约95％是表面可及性PEG分子。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可具有有益量的包含PEG的残留分子(例如，PEG脂质)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中PEG分子(例如，PEG脂质)总量的小于或等于约50％，小于或等于约45％，小于或等于约40％，小于或等于约35％，小于或等于约30％，小于或等于约25％，小于或等于约20％，小于或等于约15％，小于或等于约10％，或小于或等于约5％是残留PEG分子。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含残留PEG分子。在一些此类实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含至少约0.01％，至少约0.05％，至少约0.1％，至少约0.5％，至少约1％或至少约2％的残留PEG分子。上述参考范围的所有组合都是可能的(例如，至少约0.01％且小于或等于约50％)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可以不包含残留PEG分子。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒和/或组合物可以具有有益量的位于脂质纳米颗粒的外部区域中的PEG分子(例如，PEG脂质)。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中PEG分子(例如，PEG脂质)总量的至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％处于至少约65％，小于或等于约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，小于或等于约90％或至少约95％位于脂质纳米颗粒的外部区域中。
在脂质纳米颗粒包含含有聚乙二醇的分子(例如，PEG-脂质)的一些实施方案中，包含聚乙二醇的分子的半衰期可以相对较短。例如，半衰期可以小于或等于约5小时，小于或等于约4.5小时，小于或等于约4小时，小于或等于约3小时，小于或等于约2.75小时，小于或等于约2.25小时，小于或等于约2.0小时，小于或等于约1.75小时，小于或等于约1.5小时，小于或等于约1.25小时，小于或等于约1.0小时，小于或等于约0.75小时，或小于或等于约0.5小时。在一些情况下，半衰期可为至少约0.01小时，至少约0.05小时，至少约0.1小时，至少约0.5小时。以上参考范围的所有组合都是可能的(例如，至少约0.01小时且小于或等于约5小时，至少约0.01小时且小于或等于约3小时，至少约0.5小时且小于小于或等于约3小时)。
在脂质纳米颗粒和/或组合物包含含有聚乙二醇的分子(例如，PEG-脂质)的一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中PEG分子的摩尔百分比可以相对较小。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中PEG分子的摩尔百分比小于或等于约5％，小于或等于约4.5％，小于或等于约4.0％，小于或等于约3.5％，小于或等于约3.0％，小于或等于约2.5％，小于或等于约2.0％，小于或等于约1.5％，小于或等于等于约1.0％，或小于或等于约0.5％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含PEG分子。在一些此类实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物可包含至少约0.01％，至少约0.05％，至少约0.1％，至少约0.5％，至少约1％或至少约2％摩尔百分比的PEG分子。上述参考范围的所有组合都是可能的(例如，至少约0.01％且小于或等于约5.0％)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和/或组合物中PEG分子(例如，PEG脂质)的摩尔百分比可以小于PEG分子(例如，PEG脂质)的临界胶束浓度。
在一些实施方案中，包含聚乙二醇的分子可以是PEG脂质。在一些此类实施方案中，PEG脂质可以包含一个或多个脂族基团。在一些情况下，PEG脂质可以包含两个或更多个脂族基团。应当理解，所述两个或更多个脂族基团是指不在相同脂族链内的脂族基团。例如，第一脂族基团的碳原子可以不与第二脂族基团的碳原子形成直接的碳-碳共价键。即，两个或更多个脂族基团可以彼此间接附接。
加工LNP溶液
如本文所用，术语“加工”包括一个或多个纯化、pH调节、缓冲液交换和/或浓缩LNP的步骤。
在一些实施方案中，加工LNP溶液的步骤包括：
a)过滤LNP溶液。
在一些实施方案中，过滤从LNP溶液中去除有机溶剂(例如，乙醇)。在一些实施方案中，所述加工包括过滤，诸如无菌过滤。在一些实施方案中，所述加工包括切向流过滤(TFF)。在一些实施方案中，在去除有机溶剂(例如，乙醇)后，将LNP溶液转化为在中性pH，pH6.5至7.8，pH 6.8至pH 7.5，优选pH 7.0至pH 7.2缓冲的溶液(例如，磷酸盐或HEPES缓冲液)。在一些实施方案中，优选在储存或使用之前，例如通过过滤(例如，通过0.22μm过滤器)对所得LNP溶液进行灭菌。
在一些实施方案中，加工LNP溶液的步骤还包括包装LNP溶液。
如本文所用，“包装”可以指以其最终状态储存药物产品或在将LNP放入最终包装之前LNP的过程中储存。储存和/或包装模式包括但不限于无菌袋冷藏，小瓶中的冷藏或冷冻制剂，小瓶和注射器中的冻干制剂等。
在一些实施方案中，包装LNP溶液的步骤包括以下步骤中的一个或多个：
b)向LNP溶液中添加防冻剂；并且
c)冻干LNP溶液，从而形成冻干的LNP组合物。
d)储存LNP溶液或冻干的LNP组合物；并且
向LNP溶液或冻干的LNP组合物中添加复溶溶液，从而形成LNP制剂。
在一些实施方案中，在冻干之前向LNP溶液中添加防冻剂。在一些实施方案中，该防冻剂包含一种或多种冷冻保护剂，并且所述一种或多种冷冻保护剂中的每一种独立地为多元醇(例如，二醇或三元醇，诸如丙二醇(即1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非洗涤剂磺基甜菜碱(例如，NDSB-201(3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐)、渗透剂(例如，L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如，聚乙二醇200(PEG 200)、PEG400、PEG 600、PEG 1000、PEG 3350、PEG4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000、聚乙二醇单甲醚550(mPEG 550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000、mPEG 5000、聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮K15)、季戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P 400)、有机溶剂(例如，二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如，D-(+)-蔗糖、D-山梨醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖一水合物、内赤藓醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-棉子糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖一水合物)或盐(例如，乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠，硫酸钠或其任何水合物)或其任何组合。在一些实施方案中，防冻剂包含蔗糖。
在一些实施方案中，冻干在合适的玻璃容器(例如2、3、5或10ml的圆柱形玻璃小瓶)中进行。玻璃容器优选承受在短时间内低于-40℃至高于室温的极端温度变化，和/或切割成均匀的形状。在一些实施方案中，冻干步骤包括在低于约-40℃的温度下冷冻LNP溶液，从而形成冷冻的LNP溶液；并且干燥冷冻的LNP溶液以形成冻干的LNP组合物。冷冻步骤优选导致温度在约100至180分钟(例如，约130分钟)内线性降低至最终温度，优选以0.1至1℃/分钟(例如，约0.5℃/分钟)从20℃降至-40℃。更优选地，可以使用5-15％(例如8-12％)的蔗糖，并且干燥步骤是在约50mTorr至约150mTorr范围的真空下进行的，优选地，首先在低于-10℃(例如，约-35℃至约-15℃)，低于-20℃，低于-30℃或低于-40℃的温度下，然后在室温至约25℃范围的较高温度下，优选地，在三至七天内完成干燥步骤。在一些实施方案中，干燥步骤是在约50mTorr至约100mTorr范围的真空下进行的，优选地，首先在低于约0℃，低于约-10℃，低于约-20℃，或低于约-30℃(例如，-35℃)的低温下，然后在较高温度下。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-40℃至约0℃，约-35℃至约-5℃，约-30℃至约-10℃，约-25℃至约-15℃，约-22℃至约-18℃，或约-21℃至约-19℃的温度下。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-20℃的温度下。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存在约-15℃至约25℃，约-10℃至约20℃，约-5℃至约15℃，约0℃至约10℃，约1℃至约9℃，或约2℃至约8℃的温度下。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存约30分钟，约1小时，约2小时，约4小时，约6小时，约12小时，约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约1周，约2周，约3周，约4周，约1个月，约2个月，约3个月，约4个月，约6个月，约9个月，约1年，约2年，约3年，约4年，约5年，约6年，约7年，约8年，约9年或约10年。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存的时间段范围为约1个月至约10年，约3个月至约8年，约6个月至约6年，约9个月至约4年，约1年至约3年，或约1.5年至约2.5年。
在一些实施方案中，在添加复溶溶液之前，将LNP溶液或冻干的LNP组合物储存约2年。
稳定LNP制剂的方法
本公开提供了产生核酸脂质纳米颗粒组合物的方法。
本公开提供了通过在施加应力之前或施加应力时或在其产生期间向LNP制剂中添加改性剂，而在施加应力后稳定脂质纳米颗粒(LNP)制剂的方法。
在一些实施方案中，应力包括在生产、纯化、包装、储存、运输和使用制剂时向制剂施加的任何应力，例如热、剪切、过度搅拌、膜浓差极化(电荷状态变化)、脱水、冷冻应力、干燥应力、冻/融应力、雾化应力等。例如，应力可对制剂产生一种或多种不希望有的性质变化，诸如杂质、显微镜可见的颗粒或两者的量增加，LNP尺寸增加，包封效率、疗效或两者降低，以及耐受性降低(例如，免疫原性增加)。
在一些实施方案中，施加的应力来自于产生LNP制剂，例如来自于将脂质组分混合在有机溶剂(例如，乙醇)中以产生有机相，来自于将mRNA混入酸性溶液中以产生水相，来自于调节水相的pH值，和/或来自于将有机相与水相混合以产生LNP制剂。例如，每个所述混合步骤可包括湍流混合或微流体混合。例如，在将有机物与水相混合之前，可以经由例如过滤(诸如切向流过滤或TFF)纯化各相。例如，施加的应力来自于此类纯化。
在一些实施方案中，施加的应力来自于LNP形成后加工LNP，例如通过切向流过滤(TFF)进行的下游纯化和浓缩。例如，在典型的TFF过程中，将LNP分散体暴露于各种疏水界面、剪切力和湍流。例如，在典型的TFF过程中，大于膜孔的分子(即，LNP)积聚在膜表面以形成凝胶或浓差极化层。例如，增加的LNP浓度会充当去稳定应力，促进可产生更大微粒物的分子间相互作用。
在一些实施方案中，施加的应力来自于LNP制剂的纯化。因此，本公开还特写了一种纯化脂质纳米颗粒(LNP)制剂的方法，其包括在两亲性聚合物的存在下过滤第一LNP制剂以获得第二LNP制剂。
在一些实施方案中，施加的应力来自于冷冻或冻干LNP制剂。因此，本公开还特写了一种冷冻或冻干脂质纳米颗粒(LNP)制剂的方法，其包括在改性剂的存在下冷冻或冻干第一LNP制剂。
例如，改性剂以约0.025％w/v至约1％w/v范围(例如，约0.025％w/v、约0.05％w/v、约0.1％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约0.025-0.5％w/v、约0.05-1％w/v、约0.1-1％w/v或约0.1-0.5％w/v)的浓度存在。例如，改性剂以约0.025％w/w至约1％w/w范围(例如，约0.025％w/w、约0.05％w/w、约0.1％w/w、约0.5％w/w、约1％w/w、约0.025-0.5％w/w、约0.05-1％w/w、约0.1-1％w/w或约0.1-0.5％w/w)的浓度存在。
例如，改性剂以约0.025％w/v至约1％w/v范围(例如，约0.025％w/v、约0.05％w/v、约0.1％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约0.025-0.5％w/v、约0.05-1％w/v、约0.1-1％w/v或约0.1-0.5％w/v)的浓度存在。例如，改性剂以约0.025％w/w至约1％w/w范围(例如，约0.025％w/w、约0.05％w/w、约0.1％w/w、约0.5％w/w、约1％w/w、约0.025-0.5％w/w、约0.05-1％w/w、约0.1-1％w/w或约0.1-0.5％w/w)的浓度存在。
例如，第三两亲性聚合物以约0.1％w/v至约3％w/v范围(例如，约0.1％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约2％w/v、约2.5％w/v、约0.1-2.5％w/v、约0.1-1％w/v、约0.1-0.5％w/v或约0.1-0.4％w/v)的浓度存在。例如，第三两亲性聚合物以约0.1％w/w至约3％w/w范围(例如，约0.1％w/w、约0.5％w/w、约1％w/w、约2％w/w、约2.5％w/w、约0.1-2.5％w/w、约0.1-1％w/w、约0.1-0.5％w/w或约0.1-0.4％w/w)的浓度存在。
例如，第四两亲性聚合物以约0.1％w/v至约3％w/v范围(例如，约0.1％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约2％w/v、约0.1-2.5％w/v、约0.1-1％w/v、约0.1-0.5％w/v或约0.1-0.4％w/v)的浓度存在。例如，第四两亲性聚合物以约0.1％w/w至约3％w/w范围(例如，约0.1％w/w、约0.5％w/w、约1％w/w、约2％w/w、约2.5％w/w、约0.1-2.5％w/w、约0.1-1％w/w、约0.1-0.5％w/w或约0.1-0.4％w/w)的浓度存在。
例如，改性剂与核酸之间的重量比为约0.025:1至约100:1。
例如，添加改性剂使得改性剂与LNP之间的重量比为约0.0004:1至约100:1(例如，或约0.001:1至约10:1，或约0.001:1至约5:1，或约0.001:1至约0.1:1，或约0.005至约0.4:1，或约0.5:1至约4:1，或约0.05:1至约5:1，或约0.1:1至约5:1或约0.05:1至约2.5:1，约1:1至约50:1，约2:1至约50:1或约1:1至约25:1)。
表征LNP组合物的方法
在一些实施方案中，可以通过一种或多种测定(例如，体外测定)来确定在包含LNP的LNP组合物中的核酸的可及性。一般而言，可以使用任何合适的体外测定。合适的测定能够区分核酸的不同包封状态和/或核酸与脂质纳米颗粒组分的缔合状态。例如，核酸的可及性可以通过离子交换色谱法(IEX)测定来确定。在某些实施方案中，如下文更详细地描述的，某些常规测定可能不适合确定核酸的可及性。例如，在一些实施方案中，Ribogreen测定不适合确定核酸(例如，mRNA)的可及性。在一些实施方案中，体外测定可用于生成脂质纳米颗粒或组合物中可及性或不可及性核酸(例如，mRNA)的量的定量值。例如，离子交换色谱法(IEX)测定可用于生成包含脂质纳米颗粒的组合物中的可及性或不可及性mRNA的量的定量值。一般而言，可以针对总组合物和/或组合物的一部分(例如，包含某些脂质纳米颗粒的部分)确定不可及性或可及性核酸的量。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒内核酸的可及性可与脂质纳米颗粒的一种或多种生物学性质相关。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒内核酸的可及性可与蛋白质表达水平和/或细胞内核酸递送的功效相关。例如，在一些实施方案中，相对较高百分比的不可及性核酸，以及因此相对较低百分比的可及性核酸，可以产生高水平的蛋白质表达(例如，体外、体内)。在此类情况下，具有较低可及性mRNA百分比的组合物可以具有比具有较高可及性mRNA百分比的对比组合物更高水平的mRNA表达。
在一些方面，本公开提供了使用色谱测定表征LNP组合物(例如，通过本公开的方法制备的LNP组合物)的方法。
在一些实施方案中，使用色谱测定测量包封在LNP组合物中的核酸(例如，mRNA)的量的定量值。
在一些实施方案中，色谱测定是离子交换(IEX)色谱测定。
在一些实施方案中，正如通过离子交换色谱法(IEX)测定所确定的，LNP组合物中至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约95％或至少约95％的LNP有mRNA包封在其中。
开发了一种离子交换(IEX)色谱法，以准确确定根据常规T-混合方法(实施例4)或V-混合方法产生的可电离脂质基LNP中包封的mRNA的包封效率。IEX色谱法可用于分离结合的mRNA与游离的mRNA。当存在从低到高的盐浓度的梯度变化时，IEX筛选方法可将游离的mRNA与LNP分离。LNP在空隙中洗脱(峰1)并且mRNA在梯度从低到高盐浓度变化时洗脱(峰2，称为“可及性mRNA”)。
不受理论的束缚，据信在LNP(例如，包封mRNA的LNP)的群体中，mRNA可以以多种不同的包封状态存在，包括例如完全包封、表面缔合、松散包封(或其他物理状态)。本领域公认的用于确定核酸包封效率的方法，尤其是常规使用的Ribogreen测定，无法辨别此类物理状态(例如，无法分辨结构特征和环境的重要差异)。为了举例说明本发明的IEX方法的效用，可以对LNP样品群体进行本领域认可的分离技术，例如尺寸排阻色谱法(SEC)。这会根据大小对颗粒进行分级分离。可以对级分进行例如生物学测定，例如体外蛋白质表达测定。同样可以根据本发明的IEX方法对级分进行包封效率的确定。
可电离脂质
本公开提供了可电离脂质，其优选包括中心胺部分和至少一个可生物降解的基团。本文所述的脂质可有利地用于脂质纳米颗粒中，以将治疗剂和/或预防剂，诸如核酸递送至哺乳动物细胞或器官。
在实施方案中，本公开的可电离脂质可以是式(IL-1)的化合物中的一种或多种：
Figure BDA0002426886470000341
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的子集包括式(IL-IA)的那些：
Figure BDA0002426886470000361
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的子集包括式(IL-IB)的那些：
Figure BDA0002426886470000362
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中所有变量如本文所定义。在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的子集包括式(IL-II)的那些：
Figure BDA0002426886470000371
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIa)：
Figure BDA0002426886470000372
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
在另一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIb)：
Figure BDA0002426886470000381
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
在另一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIc)或(IL-IIe)：
Figure BDA0002426886470000382
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
在另一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIf)：
Figure BDA0002426886470000383
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基和C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
在另一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IId)：
Figure BDA0002426886470000391
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R2至R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3中的每一个独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIg)：
Figure BDA0002426886470000392
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”为C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如，C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可电离脂质是美国申请号62/220,091、62/252,316、62/253,433、62/266,460、62/333,557、62/382,740、62/393,940、62/471,937、62/471,949、62/475,140和62/475,166，以及PCT申请号PCT/US2016/052352中描述的化合物中的一种或多种。
在一些实施方案中，可电离脂质选自美国申请号62/475,166中描述的化合物1-280。
在一些实施方案中，可电离脂质为
Figure BDA0002426886470000401
或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质为
Figure BDA0002426886470000402
或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质为
Figure BDA0002426886470000403
或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质为
Figure BDA0002426886470000404
或其盐。
在一些实施方案中，本公开的可电离脂质可以是式(IL-III)的化合物中的一种或多种：
Figure BDA0002426886470000405
或其盐或异构体，其中，
W为
Figure BDA0002426886470000411
环A为
Figure BDA0002426886470000412
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由以下组成的组：-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基；
M*为C1-C6烷基；
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由以下组成的组：键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n为1-6的整数；
其中当环A为
Figure BDA0002426886470000421
时，则
i)X1、X2和X3中的至少一个不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-R”MR’。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IL-IIIa1)-(IL-IIIa8)中的任一个：
Figure BDA0002426886470000431
Figure BDA0002426886470000441
在一些实施方案中，可电离脂质是美国申请号62/271,146、62/338,474、62/413,345和62/519,826以及PCT申请号PCT/US2016/068300中描述的化合物中的一种或多种。
在一些实施方案中，可电离脂质选自美国申请号62/519,826中描述的化合物1-156。
在一些实施方案中，可电离脂质选自美国申请号62/519,826中描述的化合物1-16、42-66、68-76和78-156。
在一些实施方案中，可电离脂质为
Figure BDA0002426886470000442
或其盐。
根据式(IL-1)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-IIΙ)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质的中心胺部分可以在生理pH下质子化。因此，脂质在生理pH下可以具有正电荷或部分正电荷。此类脂质可以称为阳离子或可电离(氨基)脂质。脂质也可以是两性离子的，即具有正电荷和负电荷两种的中性分子。
在一些实施方案中，可电离脂质选自由以下组成的组：
3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)，
N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)，
14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)，
1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLin-DMA)，
2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)，
4-(二甲氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-MC3-DMA)，
2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)，
1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)，
2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)，
(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))，和
(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
聚乙二醇(PEG)脂质
如本文所用，术语“PEG脂质”是指聚乙二醇(PEG)改性的脂质。PEG脂质的非限制性实例包括PEG-改性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-改性的二烷基胺和PEG-改性的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂醇甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻醇氧丙-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一些实施方案中，PEG脂质选自由PEG-改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰甘油、PEG改性的二烷基甘油及其混合物组成的组。
在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22，优选C14至约C16的那些脂质部分。在一些实施方案中，PEG部分，例如mPEG-NH2，大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含为非扩散性PEG的PEG脂质。非扩散性PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域已知的，诸如美国专利号8158601和国际公开号WO 2015/130584A2中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
一般而言，本文所述的具有各种化学式的其他脂质组分(例如，PEG脂质)中的一些，可以如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods for Delivery ofTherapeutic Agents”的国际专利申请号PCT/US2016/000129中所述进行合成，其通过引用整体并入。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一个或多个包含聚乙二醇的分子，例如PEG或PEG改性的脂质。此类物质可替代地称为聚乙二醇化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇改性的脂质。PEG脂质可以选自包括以下的非限制性组：PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油及其混合物。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是国际公开号WO2012099755中描述的PEG化脂质，其内容通过引用整体并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任何一种均可以改性为在PEG链上包含羟基。在一些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文通常所定义，“PEG-OH脂质”(本文也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)的PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在一些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性都代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PL-I)的化合物。本文提供了式(PL-I)的化合物：
Figure BDA0002426886470000471
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为介于1至100之间，包括1和100的整数；
L1为任选取代的C1-10亚烷基，其中所述任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式
Figure BDA0002426886470000481
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中所述任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、-OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、-OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或-N(RN)S(O)2O置换；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物为PEG-OH脂质(即，R3为-ORO，并且RO为氢)。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-OH)：
Figure BDA0002426886470000491
或其盐。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是PEG化脂肪酸。在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PL-II)的化合物。本文提供了式(PL-II)的化合物：
Figure BDA0002426886470000492
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为介于1至100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、-NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、-N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，式(PL-II)的化合物具有式(PL-II-OH)：
Figure BDA0002426886470000501
或其盐，其中：
r为介于1至100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、-NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、-NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、-N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，r为介于10至80之间，20至70之间，30至60之间，或40至50之间的整数。
在一些实施方案中，r为45。
在一些实施方案中，R5为C17烷基。
在一些实施方案中，式(PL-II)的化合物为：
Figure BDA0002426886470000511
或其盐。
在一些实施方案中，式(PL-II)的化合物为：
Figure BDA0002426886470000512
在一些方面，本文所述的药物组合物的脂质组合物不包含PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质是美国申请号62/520,530中描述的PEG脂质中的任一种。在一些实施方案中，PEG脂质是式(PL-III)的化合物：
Figure BDA0002426886470000513
或其盐或异构体，其中s是介于1至100之间的整数。
在一些实施方案中，PEG脂质是下式的化合物：
Figure BDA0002426886470000514
或其盐或异构体。
表面活性剂
在一些实施方案中，所述改性剂为表面活性剂。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为两亲性聚合物。
例如，所述两亲性聚合物为嵌段共聚物。
例如，所述两亲性聚合物为冻干保护剂。
例如，两亲性聚合物在冬季约30℃和大气压力下的临界胶束浓度(CMC)小于2x10- 4M。
例如，两亲性聚合物在冬季约30℃和大气压力下的临界胶束浓度(CMC)为约0.1x10-4M至约1.3x10-4M。
例如，制剂中两亲性聚合物的浓度，例如在冷冻或冻干之前，范围介于其CMC和CMC的约30倍之间(例如，高达其CMC的约25倍，约20倍，约15倍，约10倍，约5倍或约3倍)。
例如，两亲性聚合物选自泊洛沙姆
Figure BDA0002426886470000521
泊洛沙胺
Figure BDA0002426886470000522
聚氧乙烯乙二醇山梨醇烷基酯(聚山梨醇酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
例如，两亲性聚合物为泊洛沙姆。例如，两亲性聚合物具有以下结构：
Figure BDA0002426886470000523
其中a是介于10至150之间的整数，b是介于20至60之间的整数。例如，a为约12，b为约20，或a为约80，b为约27，或a为约64且b为约37，或a为约141且b为约44，或a为约101且b为约56。
例如，两亲性聚合物为P124、P188、P237、P338或P407。
例如，两亲性聚合物为P188(例如，泊洛沙姆188，CAS编号9003-11-6，也称为Kolliphor P188)。
例如，两亲性聚合物为泊洛沙胺，例如tetronic 304或tetronic 904。
例如，两亲性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，诸如分子量为3kDa、10kDa或29kDa的PVP。
例如，两亲性聚合物为聚山梨醇酯，诸如PS 20。
在一些实施方案中，表面活性剂为非离子型表面活性剂。
在一些实施方案中，LNP改性剂包括表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为两亲性聚合物。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
例如，所述非离子型表面活性剂选自由聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、脱水山梨醇及其衍生物组成的组。
例如，聚乙二醇醚是式(S-1)的化合物：
Figure BDA0002426886470000531
或其盐和/或异构体；其中
t为介于1至100之间的整数；
R1BRIJ独立地为C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R5PEG的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地为氢、C1-6烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，R1BRIJ为C18烷基。例如，聚乙二醇醚是式(S-1a)的化合物：
Figure BDA0002426886470000542
或其盐和/或异构体；其中s为介于1至100之间的整数。
在一些实施方案中，R1BRIJ为C18烷基。例如，聚乙二醇醚是式(S-1b)的化合物：
Figure BDA0002426886470000541
或其盐和/或异构体；其中s为介于1至100之间的整数。
在一些实施方案中，所述泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403和泊洛沙姆407。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为
Figure BDA0002426886470000551
20、
Figure BDA0002426886470000552
40、
Figure BDA0002426886470000553
60和
Figure BDA0002426886470000554
80。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为
Figure BDA0002426886470000555
20、
Figure BDA0002426886470000556
40、
Figure BDA0002426886470000557
60、
Figure BDA0002426886470000558
65、
Figure BDA0002426886470000559
80或
Figure BDA00024268864700005510
85。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为
Figure BDA00024268864700005511
C10、
Figure BDA00024268864700005512
S10、
Figure BDA00024268864700005513
58、
Figure BDA00024268864700005514
S100、
Figure BDA00024268864700005515
O10、
Figure BDA00024268864700005516
O20、
Figure BDA00024268864700005517
S20、
Figure BDA00024268864700005518
58、
Figure BDA00024268864700005519
93。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为PVP 10k或PVP 40k。
在一些实施方案中，核酸LNP组合物中非离子型表面活性剂的浓度范围为约0.00001％w/v至约1％w/v，例如约0.00005％w/v至约0.5％w/v，或约0.0001％w/v至约0.1％w/v。
在一些实施方案中，核酸LNP制剂中非离子型表面活性剂的浓度范围为约0.000001重量％至约1重量％，例如约0.000002重量％至约0.8重量％，或约0.000005重量％至约0.5重量％。
在一些实施方案中，核酸LNP制剂中PEG脂质的浓度范围为约0.01摩尔％至约50摩尔％，例如约0.05摩尔％至约20摩尔％，约0.07摩尔％至约10摩尔％，约0.1摩尔％至约8摩尔％，约0.2摩尔％至约5摩尔％，或约0.25摩尔％至约3摩尔％。
结构脂质
如本文所用，术语“结构脂质”是指甾醇，也指含甾醇部分的脂质。
在脂质纳米颗粒中掺入结构脂质可以帮助减少颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可以选自但不限于胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚、藿烷类、植物甾醇、类固醇及其混合物。在一些实施方案中，结构脂质是两种或更多种组分的混合物，每种组分独立地选自胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚、藿烷类、植物甾醇和类固醇。在一些实施方案中，结构脂质是固醇。在一些实施方案中，结构脂质是两种或更多种固醇的混合物。如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成的类固醇亚组。在一些实施方案中，结构脂质是类固醇。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可以是美国申请号62/520,530中描述的一种或多种结构脂质。
磷脂
磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般而言，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可以选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可以选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山俞酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
特定的磷脂可以促进与膜的融合。在一些实施方案中，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一个或多个带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许含脂质的组合物(例如LNP)的一种或多种要素(例如治疗剂)穿过该膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至靶组织。
也可以考虑非天然磷脂物质，包括具有修饰和取代(包括分支、氧化、环化和炔烃)的天然物质。在一些实施方案中，磷脂可以受一个或多个炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或交联。在适当的反应条件下，炔基可以在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成反应。此类反应可用于官能化纳米颗粒组合物的脂质双层以促进膜渗透或细胞识别，或可用于将纳米颗粒组合物缀合至有用的组分，诸如靶向或成像部分(例如，染料)。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂，例如神经鞘磷脂。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是DSPC的类似物或变体。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(PL-I)的化合物：
Figure BDA0002426886470000571
或其盐，其中：
每个R1独立地为任选取代的烷基；或任选地两个R1与插入原子连接在一起形成任选取得的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或任选地三个R1与插入原子连接在一起形成任选取得的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式
Figure BDA0002426886470000581
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中所述任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-置换；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2；
条件是所述化合物不具有下式：
Figure BDA0002426886470000591
其中R2的每个实例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
在一些实施方案中，所述磷脂可以是美国申请号62/520,530中描述的一种或多种磷脂。
在一些实施方案中，所述磷脂可以选自由以下组成的组：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)，1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)，1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)，1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)，1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和神经鞘磷脂。在一些实施方案中，LNP包括DSPC。在一些实施方案中，LNP包括DOPE。在一些实施方案中，LNP包括DSPC和DOPE两者。
i)磷脂头部修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含经修饰的磷脂头部(例如，经修饰的胆碱基团)。在一些实施方案中，具有经修饰的头部的磷脂是具有经修饰的季胺的DSPC或其类似物。在一些实施方案中，在式(PL-I)的实施方案中，至少一个R1不是甲基。在一些实施方案中，至少一个R1不是氢或甲基。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物是下式之一：
Figure BDA0002426886470000601
或其盐，其中：
每个t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个u独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
每个v独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-a)：
Figure BDA0002426886470000602
或其盐。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含代替甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，可用于本发明的磷脂是DSPC或其类似物，其具有代替甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-b)：
Figure BDA0002426886470000611
或其盐。
ii)磷脂尾部修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含经修饰的磷脂尾部。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是具有经修饰的尾部的DSPC或其类似物。如本文所述，“经修饰的尾部”可以是具有较短或较长脂肪链，引入分支的脂肪链，引入取代的脂肪链，其中一个或多个亚甲基被环状或杂原子基团置换的脂肪链或其任何组合的尾部。在一些实施方案中，在一些实施方案中，(PL-I)的化合物具有式(PL-I-a)或其盐，其中R2的至少一个实例为任选取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-c)：
Figure BDA0002426886470000612
或其盐，其中
每个x独立地为介于0-30之间，包括0和30的整数；并且
G的每个实例独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性都代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包括经修饰的磷酸胆碱部分，其中将季胺连接至磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不是2)。因此，在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(PL-I)的化合物，其中n为1、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有下式之一：
Figure BDA0002426886470000621
或其盐。
替代脂质
在一些实施方案中，使用替代脂质代替本公开的磷脂。此类替代脂质的非限制性实例包括以下：
Figure BDA0002426886470000631
佐剂
在一些实施方案中，包含一种或多种本文所述的脂质的LNP还可包含一种或多种佐剂，例如，吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡脱氧核苷酸(例如，A或B类)、聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。
治疗剂
脂质纳米颗粒可包含一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)。本公开特写向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)，在哺乳动物细胞中产生目标多肽，以及在有此需要的哺乳动物中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用和/或使哺乳动物细胞接触包含治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的LNP。
治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质，可替代性地称为“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可以是一种一旦递送至细胞或器官，就会在细胞、器官或其他身体组织或系统中引起所需变化的物质。此类物质可用于治疗一种或多种疾病、病症或病状。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病状的小分子药物。可用于脂质纳米颗粒中的药物的实例包括但不限于抗赘生物剂(例如长春新碱(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博来霉素(bleomycin)、环磷酰胺、甲氨蝶呤和链脲霉素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱(vinblastine)、阿糖胞苷、蒽环类、烷化剂、铂化合物、抗代谢物和核苷类似物，诸如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉药(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素能阻滞剂(例如，普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、降压药(例如可乐定(clonidine)和肼苯哒嗪(hydralazine))、抗抑郁药(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗转化剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺药(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、丁康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、萘替芬(naftifine)和两性霉素B(两性霉素B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼剂，维生素、麻醉剂和成像剂。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引发免疫响应的化合物和/或另一种治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何可能对细胞有害的药剂。实例包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾丸素、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(teracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登木素生物碱(例如美登醇(maytansinol))、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)及其类似物或同源物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够对一种或多种与感染性疾病(例如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、瘟疫、肝炎和结核病)相关的一种或多种病状提供免疫力，并且可以包含编码感染性疾病来源的抗原和/或表位的mRNA的化合物和制剂。疫苗还包括指导针对癌细胞的免疫响应，并且可以包含编码肿瘤细胞来源的抗原、表位和/或新表位的mRNA的化合物和制剂。引发免疫响应的化合物可以包括但不限于疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松(dexamethasone))和其他物质。
在其他实施方案中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质。可用于本公开中的纳米颗粒的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、丁胺卡那霉素(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、促黄体生成激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。在一些实施方案中，经由包括根据式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的化合物(例如化合物3、18、20、26或29)的组合物肌内施用疫苗和/或能够引发免疫响应的化合物。其他治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺、噻替派苯丁酸氮芥、拉奇霉素(CC-1065)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(原名道诺霉素(daunomycin))和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素D(原名放线菌素(actinomycin))、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉醇和美登木素生物碱)。
多核苷酸和核酸
在一些实施方案中，治疗剂为多核苷酸或核酸(例如，核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”在其广义上包括掺入或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本公开使用的示例性多核苷酸包括但不限于以下的一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)(包括信使RNA(mRNA))、其杂种、RNAi诱导剂、RNAi药剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂为RNA。可用于本文所述的组合物和方法中的RNA可以选自但不限于短聚物、拮抗物、反义、核酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。在一些实施方案中，所述RNA为mRNA。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂为mRNA。mRNA可以编码任何目标多肽，包括任何天然或非天然存在的或另外经修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任何大小，并且可以具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，由mRNA编码的多肽可以具有治疗作用。
在其他实施方案中，治疗剂和/或预防剂为siRNA。siRNA可能能够选择性地敲低或下调目标基因的表达。例如，向有此需要的受试者施用包含siRNA的LNP时，可以选择siRNA以沉默化与特定疾病、病症或病状相关的基因。siRNA可以包含与编码目标基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA可以是免疫调节性siRNA。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是shRNA或编码其的载体或质粒。将适当构建体递送至细胞核后，即可在靶细胞内部产生shRNA。与shRNA有关的构建体和机制在相关领域中是众所周知的。
可用于本公开的核酸和多核苷酸通常包括编码目标多肽的连接核苷的第一区域(例如，编码区)，位于第一区域的5'-端的第一侧翼区(例如，5'-UTR)，位于第一区域的3'-端的第二侧翼区(例如3'-UTR)，至少一个5'-帽区和3'稳定区。在一些实施方案中，核酸或多核苷酸还包括聚A区或Kozak序列(例如在5'-UTR中)。在一些情况下，多核苷酸可以含有一个或多个能够从多核苷酸中切除的内含子核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸或核酸(例如，mRNA)可以包括5’帽结构、链终止核苷酸、茎环、聚A序列和/或多聚腺苷酸化信号。核酸的任何一个区域都可以包括一种或多种替代组分(例如，替代核苷)。例如，3’-稳定区可包含替代核苷(诸如L-核苷、反向胸苷或2’-O-甲基核苷和/或编码区)，5；-UTR、3’-UTR或帽区可包括替代核苷，诸如5-取代的尿苷(例如，5-甲氧基尿苷)、1-取代的假尿苷(例如，1-甲基-假尿苷)和/或5-取代的胞苷(例如，5-甲基胞苷)。
通常，多核苷酸的最短长度可以是足以编码二肽的多核苷酸序列的长度。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码三肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码四肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码五肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码六肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码七肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码八肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码九肽。在另一个实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码十肽。
替代多核苷酸序列可以编码的二肽的实例包括但不限于肌肽和鹅肌肽。
在一些情况下，多核苷酸的长度大于30个核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸分子的长度大于35个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少40个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少45个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少50个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少55个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少80个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少90个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少100个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少120个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少140个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少160个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少180个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少200个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少250个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少300个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少350个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少400个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少450个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少600个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少700个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少800个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少900个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1100个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1200个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1300个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1400个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1600个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1800个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少2000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少2500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少3000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少4000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少5000个核苷酸，或大于5000个核苷酸。
核酸和多核苷酸可包括一种或多种天然存在的组分，包括规范性核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)中的任一种。在一些实施方案中，所有或基本上所有包含(a)5'-UTR，(b)开放阅读框(ORF)，(c)3'-UTR，(d)聚A尾，和(以上a、b、c或d)的任何组合的核苷酸包含天然存在的规范核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)。
核酸和多核苷酸可包含一种或多种如本文所述的替代组分，其赋予有用的特性，包括增加的稳定性和/或基本上不诱导向其中引入了该多核苷酸的细胞的先天免疫响应。例如，相对于相应的未改变的多核苷酸或核酸，替代多核苷酸或核酸在向其中引入了该多核苷酸或核酸的细胞中表现出降解降低。这些替代物质可以增强蛋白质生产的效率，多核苷酸在细胞内的保留和/或接触的细胞的活力，以及具有降低的免疫原性。
多核苷酸和核酸可以是天然的或非天然存在的。多核苷酸和核酸可以包括一个或多个经修饰的(例如，改变或替代的)核碱基、核苷、核苷酸或其组合。可用于LNP中的核酸和多核苷酸可包括任何有用的修饰或改变，诸如对核碱基、糖或核苷间键联(例如，对连接的磷酸酯，对磷酸二酯键联，对磷酸二酯主链)的修饰或改变。在一些实施方案中，在核碱基、糖和核苷间键联的每一个中均存在改变(例如，一个或多个改变)。根据本公开的改变可以是核糖核酸(RNA)改变为脱氧核糖核酸(DNA)(例如呋喃核糖基环的2’-OH取代为2’-H)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂种。本文描述了其他改变。
多核苷酸和核酸可以或可以不沿着分子的整个长度均匀地改变。例如，在多核苷酸或核酸中，或在其指定的预定序列区域中，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或全部)可以或可以不均匀地改变。在一些情况下，多核苷酸(或其指定序列区域中)的所有核苷酸X均改变，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任何一种或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+U+C的任何一种。
在多核苷酸的各个位置可以存在不同的糖改变和/或核苷间键联(例如，主链结构)。本领域的普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他改变可位于多核苷酸的任何位置，使得多核苷酸的功能基本上不降低。改变也可以是5'或3'-端改变。在一些实施方案中，多核苷酸包括3’-端的改变。所述多核苷酸可以含有约1％至约100％的替代核苷酸(相对于核苷酸总含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％，1％至25％，1％至50％，1％至60％，1％至70％，1％至80％，1％至90％，1％至95％，10％至20％，10％至25％，10％至50％，10％至60％，10％至70％，10％至80％，10％至90％，10％至95％，10％至100％，20％至25％，20％至50％，20％至60％，20％至70％，20％至80％，20％至90％，20％至95％，20％至100％，50％至60％，50％至70％，50％至80％，50％至90％，50％至95％，50％至100％，70％至80％，70％至90％，70％至95％，70％至100％，80％至90％，80％至95％，80％至100％，90％至95％，90％至100％，和95％至100％)。应当理解，规范核苷酸(例如，A、G、U或C)的存在占其余任何百分比。
多核苷酸可含有至少零个和最多100％的替代核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少5％的替代核苷酸，至少10％的替代核苷酸，至少25％的替代核苷酸，至少50％的替代核苷酸，至少80％的替代核苷酸或至少90％的替代核苷酸。例如，多核苷酸可含有替代嘧啶，诸如替代的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被替代尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。替代尿嘧啶可以被具有单个独特结构的化合物置换，或者可以被多种具有不同结构(例如2、3、4个或更多个独特结构)的化合物置换。在一些情况下，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被替代胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。替代胞嘧啶可以被具有单个独特结构的化合物置换，或者可以被多种具有不同结构(例如2、3、4个或更多个独特结构)的化合物置换。
在一些情况下，核酸基本上不会诱导向其中引入了多核苷酸(例如，mRNA)的细胞的先天免疫响应。诱导的先天免疫响应的特征包括1)促炎性细胞因子的表达增加，2)细胞内PRR(RIG-I、MDA5等)的激活，和/或3)蛋白质翻译的终止或减少。
核酸可任选地包括其他药剂(例如，RNAi诱导剂、RNAi药剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体)。在一些实施方案中，核酸可以包括具有一个或多个替代核苷或核苷酸(即，替代mRNA分子)的一种或多种信使RNA(mRNA)。
在一些实施方案中，核酸(例如，mRNA)分子、与之相关的分子式、组合物或方法包括一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含如WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述的特征，其全部通过引用并入本文。
核碱基替代物
替代核苷和核苷酸可包括替代核碱基。核酸的核碱基是有机碱基，诸如嘌呤或嘧啶或其衍生物。核碱基可以是规范碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)。可以改变或完全置换这些核碱基，以提供具有增强的特性，例如增加的稳定性(诸如对核酸酶的抗性)的多核苷酸分子。非规范或经修饰的碱基可包括，例如，一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤代、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环；氧化和/或还原。
替代核苷酸碱基配对不但涵盖标准的腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或替代核苷酸(包括非标准或替代碱基)之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键键合。此类非标准碱基配对的一个实例是替代核苷酸肌苷和腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。
在一些实施方案中，核碱基是替代尿嘧啶。示例性的核碱基和具有替代尿嘧啶的核苷酸包括但不限于假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s2U)、4-硫代-尿嘧啶(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤代-尿嘧啶(例如，5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基-尿嘧啶(m3U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-羟乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m5D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(inm5s2U)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫代-2'-O_甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨基甲酰基羟甲基)-尿嘧啶、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。
在一些实施方案中，核碱基是替代胞嘧啶。示例性的核碱基和具有替代胞嘧啶的核苷酸包括但不限于5-氮杂-胞嘧啶、6-氮杂-胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基-胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基-胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基-胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤代-胞嘧啶(例如，5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞嘧啶、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞嘧啶、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2C)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮乙基)-胞嘧啶。
在一些实施方案中，核碱基是替代腺嘌呤。示例性的核碱基和具有替代腺嘌呤的核苷酸包括但不限于2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤。
在一些实施方案中，核碱基是替代鸟嘌呤。示例性的核碱基和具有替代鸟嘌呤的核苷酸包括但不限于肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、溶解不良的羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(m1G)、N2-甲基-鸟嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、1-硫代-鸟嘌呤和O-6-甲基-鸟嘌呤。
核苷酸的替代核碱基可以独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，核碱基可以是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤的替代物。在另一个实施方案中，核碱基还可以包括，例如天然存在的和合成的碱基衍生物，包括但不限于吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代(例如，8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(尤其是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的)尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；或1,3,5三嗪。当使用简写A、G、C、T或U描绘核苷酸时，每个字母是指代表的碱基和/或其衍生物，例如A包括腺嘌呤或腺嘌呤类似物，例如7-脱氮腺嘌呤)。
糖的改变
核苷包括与核碱基组合的糖分子(例如，5-碳或6-碳糖，诸如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，而核苷酸是含有核苷和磷酸基团或替代基团(例如，硼烷磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、膦酸酯、烷基、酰胺化物和甘油)的核苷。核苷或核苷酸可以是规范种类，例如包括规范的核碱基、糖(并且在核苷酸的情况下，包括磷酸基团)的核苷或核苷酸，或者可以是包括一种或多种替代组分的替代核苷或核苷酸。例如，可以在核苷或核苷酸的糖上改变替代的核苷和核苷酸。在一些实施方案中，替代的核苷或核苷酸包括以下结构：
Figure BDA0002426886470000771
在式IV、V、VI和VII中的每一个中，
m和n各自独立地为0至5的整数，
U和U’各自独立地为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu为0至2的整数并且每个RU独立地为H、卤代或任选取代的烷基；
R1’、R2’、R1”、R2”、R1、R2、R3、R4和R5中的每一个，如果存在，则独立地为H、卤代、羟基、硫醇、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧基、任选取代的羟基烷氧基、任选取代的氨基、叠氮基、任选取代的芳基、任选取代的氨基烷基、任选取代的氨基烯基、任选取代的氨基炔基，或者不存在；其中R3与R1’、R1”、R2’、R2”或R5中的一个或多个的组合(例如，R1’与R3的组合，R1”与R3的组合，R2’与R3的组合，R2”与R3的组合，或R5与R3的组合)可以连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且和与它们附接的碳一起，提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；其中R5与R1’、R1”、R2’或R2”中的一个或多个的组合(例如，R1’与R5的组合，R1”与R5的组合，R2’与R5的组合，或R2”与R5的组合)可以连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且和与它们附接的碳一起，提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；并且其中R4与R1’、R1”、R2’、R2”、R3或R5中的一个或多个的组合可以连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且和与它们附接的碳一起，提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；m'和m"各自独立地为0至3的整数(例如，0至2，0至1，1至3，或1至2)；
Y1、Y2和Y3各自独立地为O、S、Se、—NRN1—、任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，其中RN1为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基或不存在；
每个Y4独立地为H、羟基、硫醇、硼烷基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧基或任选取代的氨基；
每个Y5独立地为O、S、Se、任选取代的亚烷基(例如，亚甲基)或任选取代的亚杂烷基；并且
B为经修饰或未修饰的核碱基。
在一些实施方案中，2'-羟基(OH)可以被许多不同的取代基修饰或置换。2'-位置的示例性取代基包括但不限于H、叠氮基、卤代(例如，氟)、任选取代的C1-6烷基(例如，甲基)；任选取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基或乙氧基)；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基；任选取代的C1-12(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)，-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R为H或任选取代的烷基，并且n为0至20的整数(例如，0至4，0至8，0至10，0至16，1至4，1至8，1至10，1至16，1至20，2至4，2至8，2至10，2至16，2至20，4至8，4至10，4至16和4至20)；“锁”核酸(LNA)，其中2'-羟基通过C1-6亚烷基或C1-6亚杂烷基桥连接至相同核糖的4'-碳，其中示例性的桥包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；如本文所定义的氨基烷基；如本文所定义的氨基烷氧基；如本文所定义的氨基；以及如本文所定义的氨基酸。
通常，RNA包括糖基核糖，其是具有氧的5-元环。示例性的非限制性替代核苷酸包括核糖中氧的置换(例如，用S、Se或亚烷基(诸如亚甲基或亚乙基)置换)；双键的加成(例如，用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，形成具有附加碳原子或杂原子的6元或7元环，诸如对于失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露糖醇、环己烷基、环己烯基和吗啉基(也具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如，三环和“解锁”形式，诸如乙二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖被附接于磷酸二酯键上的乙二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏呋喃糖基-(3'→2')置换)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链)。
在一些实施方案中，糖基含有一个或多个碳，其具有与核糖中相应的碳相反的立体化学构型。因此，多核苷酸分子可包括含有例如阿拉伯糖或L-核糖作为糖的核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸包括至少一个核苷，其中糖是L-核糖、2'-O-甲基-核糖、2'-氟-核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA。
核苷间键联的改变
替代核苷酸可在核苷间键联(例如，磷酸主链)上改变。在本文中，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基置换一个或多个氧原子来改变主链磷酸基团。
替代性核苷酸可包括用本文所述的另一种核苷间键联大规模置换未改变的磷酸部分。替代磷酸基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫置换。也可以通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)置换连接氧来改变磷酸接头。
替代核苷和核苷酸可包括用硼烷部分(BH3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置换一个或多个非桥接氧。作为非限制性实例，在相同位置(例如，alpha(α)、beta(β)或gamma(γ)位置)的两个非桥接氧可以被硫(硫代)和甲氧基置换。
提供了在磷酸部分的α位置(例如，α-硫代磷酸酯)的一个或多个氧原子的置换，以通过非天然硫代磷酸酯主链键联赋予RNA和DNA稳定性(诸如针对核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并且随后在细胞环境中具有更长的半衰期。
本文描述了可根据本公开使用的其他核苷间键联，包括不含磷原子的核苷间键联。
内部核糖体进入位点
多核苷酸可含有内部核糖体进入位点(IRES)。IRES可以充当唯一的核糖体结合位点，或者可以用作mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有一个以上功能性核糖体结合位点的多核苷酸可以编码由核糖体独立翻译的几个肽或多肽(例如，多顺反子mRNA)。当为多核苷酸提供有IRES时，还任选提供第二可翻译区。可以根据本公开使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小RNA病毒(例如，FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、典型猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。
5’-帽结构
多核苷酸(例如，mRNA)可以包括5'-帽结构。多核苷酸的5'-帽结构参与核输出和提高多核苷酸稳定性，并结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，该蛋白通过CBP与聚A结合蛋白缔合形成成熟的环状mRNA物质而负责细胞中多核苷酸的稳定性和翻译能力。帽进一步帮助在mRNA剪接期间去除5'-近端内含子。
内源多核苷酸分子可以5'-末端加帽，在多核苷酸的末端鸟苷帽残基与5'-端转录的有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键联。然后可以将该5'-鸟苷酸帽甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。多核苷酸5'-末端的末端和/或前末端转录的核苷酸的核糖也可以任选地被2'-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和切割进行的5'-脱帽可以靶向多核苷酸分子，例如mRNA分子，以进行降解。
多核苷酸的改变可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此而增加多核苷酸的半衰期。因为帽结构水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯键联，所以在加帽反应期间可以使用替代核苷酸。例如，可以根据制造商的说明，将来自于New England Biolabs(Ipswich,MA)的牛痘加帽酶与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸酯键联。可以使用其他替代的鸟苷核苷酸，诸如α-甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。
其他改变包括但不限于，在糖的2'-羟基上对多核苷酸(如上所述)的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化。可以使用多个不同的5'-帽结构生成多核苷酸(诸如mRNA分子)的5'-帽。
5'-帽结构包括国际专利公开号WO2008127688、WO 2008016473和WO 2011015347中描述的那些，其中每一个的帽结构均通过引用并入本文。
帽类似物(在本文中也称为合成帽类似物)、化学帽、化学帽类似物，或结构或功能帽类似物，与天然(即内源、野生型或生理学)5'-帽在化学结构上不同，但保留了帽的功能。帽类似物可以化学(即非酶促地)或酶促合成和/或连接至多核苷酸。
例如，抗-反向帽类似物(ARCA)帽含有由5’-5’-三磷酸基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7-甲基以及3’-O-甲基(即，N7,3’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷(m7G-3’mppp-G，其可以等同地命名为3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。另一个未改变的鸟嘌呤的3’-O原子与加帽多核苷酸(例如mRNA)的5’-端核苷酸连接。N7-和3’-O-甲基化鸟嘌呤提供加帽多核苷酸(例如mRNA)的末端部分。
另一个示例性的帽是mCAP，其类似于ARCA，但是在鸟苷上具有2'-O-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
帽可以是二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可以在不同的磷酸位置上被硼烷磷酸基团或硒代磷酸酸基团修饰，诸如美国专利号8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，其帽结构通过引用并入本文。
可替代地，帽类似物可以是本领域已知和/或本文描述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物(参见例如Kore等人Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中描述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；其帽结构通过引用并入本文)。在其他情况下，可用于本公开的多核苷酸中的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
虽然帽类似物允许多核苷酸在体外转录反应中同时加帽，但高达20％的转录物仍未加帽。这以及帽类似物与内源性细胞转录机制产生的多核苷酸的内源性5'-帽结构的结构差异，可导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。
还可以在转录后使用酶对替代多核苷酸进行加帽，以便产生更真实的5'-帽结构。如本文所用，短语“更真实”是指在结构或功能上紧密反映或模拟内源或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实”的特征更好地代表了内源性、野生型、天然或生理学细胞功能和/或结构，或者在一个或多个方面优于相应的内源性、野生型、天然或生理学特征。可用于本公开的多核苷酸中的更真实的5'-帽结构的非限制性实例是以下那些，其中那些与本领域已知的合成5'-帽结构(或与野生型、天然或生理学5'-帽结构)相比，帽结合蛋白的结合增强，半衰期增加，对5'-核酸内切酶的敏感性降低和/或5'-脱帽减少。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可以在多核苷酸的5'-端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生规范的5'-5'-三磷酸键联，其中帽鸟嘌呤含有N7-甲基化并且多核苷酸的5'-端核苷酸含有2'-O-甲基。此类结构称为Cap1结构。与例如本领域已知的其他5'帽类似物结构相比，该帽产生更高的翻译能力、细胞稳定性和减少的细胞促炎细胞因子的活化。其他示例性的帽结构包括7mG(5')ppp(5')N、pN2p(帽0)、7mG(5')ppp(5')N1mpNp(帽1)、7mG(5')-ppp(5')N1mpN2mp(帽2)和m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up(帽4)。
因为替代多核苷酸可以在转录后加帽，并且因为这个过程更有效，所以几乎100％的替代多核苷酸都可以加帽。这与在体外转录反应过程中将帽类似物连接至多核苷酸时的～80％形成对比。
5'-端帽可包括内源性帽或帽类似物。5'-端帽可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基鸟苷。
在一些情况下，多核苷酸含有经修饰的5'-帽。5'-帽上的修饰可以增加多核苷酸的稳定性，增加多核苷酸的半衰期，并且可以提高多核苷酸的翻译效率。经修饰的5'-帽可以包括但不限于以下修饰中的一种或多种：在加帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2'-和/或3'-位置的修饰，糖环氧(其产生碳环)被亚甲基部分(CH2)置换，帽结构的三磷酸桥部分的修饰，或核碱基(G)部分的修饰。
5’-UTR
5’-UTR可以作为多核苷酸(例如，mRNA)的侧翼区提供。5’-UTR可以与多核苷酸中发现的编码区同源或异源。在侧翼区中可以包括多个5'-UTR，并且可以是相同或不同的序列。侧翼区的任何部分(包括无任何部分)可以进行密码子优化并且在密码子优化之前和/或之后，任一部分都可以独立地含有一个或多个不同的结构或化学改变。
在通过引用并入本文的美国临时申请号61/775,509的表21中以及在美国临时申请号61/829,372的表21和表22中示出了替代多核苷酸(例如，mRNA)的起始和终止位点的列表。在表21中，每个5'-UTR(5'-UTR-005至5'-UTR 68511)按其起始和终止位点相对于其天然或野生型(同源)转录物(ENST；在ENSEMBL数据库中使用的标识符)进行标识。
为了改变多核苷酸(例如，mRNA)的一种或多种性质，可以工程改造与替代性多核苷酸(例如，mRNA)的编码区异源的5'-UTR。然后可以将多核苷酸(例如，mRNA)施用于细胞、组织或生物体，并且可以测量诸如蛋白质水平、定位和/或半衰期之类的结果，以评价异源5'-UTR可对替代多核苷酸(mRNA)产生的有益作用。可以利用5'-UTR的变体，其中末端添加或去除了一个或多个核苷酸，包括A、T、C或G。5'-UTR也可以进行密码子优化或以本文所述的任何方式改变。
5'-UTR、3'-UTR和翻译增强子元件(TEE)
多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR可以包括至少一个翻译增强子元件。术语“翻译增强子元件”是指增加由多核苷酸产生的多肽或蛋白质的量的序列。作为非限制性实例，TEE可以位于转录启动子和起始密码子之间。在5’-UTR中具有至少一个TEE的多核苷酸(例如，mRNA)可以在5’-UTR处包括帽。此外，至少一个TEE可以位于经历帽依赖性或帽非依赖性翻译的多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR中。
在一方面，TEE是UTR中的保守元件，其可以促进多核苷酸的翻译活性，例如但不限于帽依赖性或帽非依赖性翻译。Panek等人(Nucleic Acids Research,2013,1-10)先前已经在人类在内的14个物种中证实了这些序列的保守性。
在一个非限制性实例中，已知的TEE可以处于Gtx同源结构域蛋白的5'-前导序列中(Chappell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:9590-9594,2004，其TEE通过引用并入本文)。
在另一个非限制性实例中，在美国专利公开号2009/0226470和2013/0177581、国际专利公开号WO2009/075886、WO2012/009644和WO1999/024595、美国专利号6,310,197和6,849,405中公开了TEE，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
在又一个非限制性实例中，TEE可以是内部核糖体进入位点(IRES)、HCV-IRES或IRES元件，诸如但不限于美国专利号7,468,275、美国专利公开号2007/0048776和2011/0124100以及国际专利公开号WO2007/025008和WO2001/055369中描述的那些，其中每一个的IRES序列均通过引用并入本文。IRES元件可以包括但不限于Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)以及在美国专利公开号2007/0048776和2011/0124100和国际专利公开号WO2007/025008中描述的Gtx序列(例如，Gtx9-nt、Gtx8-nt、Gtx7-nt)，其中每一个的IRES序列均通过引用并入本文。
“翻译增强子多核苷酸”是包括一个或多个本文示例和/或本领域中公开的特定TEE的多核苷酸(参见，例如，美国专利号6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395，美国专利公开号20090/226470、2007/0048776、2011/0124100、2009/0093049、2013/0177581，国际专利公开号WO2009/075886、WO2007/025008、WO2012/009644、WO2001/055371、WO1999/024595和欧洲专利号2610341和2610340；其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文)或其变体、同源物或功能衍生物。多核苷酸(例如，mRNA)中可以存在特定TEE的一个或多个拷贝。翻译增强子多核苷酸中的TEE可以组织成一个或多个序列区段。序列区段可以隐匿一个或多个本文示例的特定TEE，每个TEE以一个或多个拷贝存在。当翻译增强子多核苷酸中存在多个序列区段时，它们可以是同源的或异源的。因此，翻译增强子多核苷酸中的多个序列区段可以在每个序列区段中隐匿本文示例的相同或不同类型的特定TEE，每个特定TEE的相同或不同拷贝数和/或相同或不同的TEE组织。
多核苷酸(例如，mRNA)可以包括至少一个TEE，在国际专利公开号WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、WO1999/024595，欧洲专利公开号2610341和2610340，美国专利号6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395和美国专利公开号2009/0226470、2011/0124100、2007/0048776、2009/0093049和2013/0177581中描述了所述TEE，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。TEE可以位于多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR中。
多核苷酸(例如，mRNA)可以包括至少一个TEE，该TEE与美国专利公开号2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100，国际专利公开号WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008，欧洲专利公开号2610341和2610340，美国专利号6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395中描述的TEE具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或多余60个TEE序列。多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE序列可以是相同或不同的TEE序列。TEE序列可以呈诸如ABABAB，AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体的模式，重复一次、两次或多于三次。在这些模式中，每个字母A、B或C在核苷酸水平代表不同的TEE序列。
在一些情况下，5’-UTR可以包括间隔两个TEE序列的间隔区。作为非限制性实例，间隔区可以是15个核苷酸的间隔区和/或本领域已知的其他间隔区。作为另一个非限制性示例，5’-UTR可以包括TEE序列-间隔区模块，该模块在5’-UTR中重复至少一次，至少两次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次或多于9次。
在其他情况下，间隔两个TEE序列的间隔区可以包括本领域已知的其他序列，这些序列可以调节本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的翻译，诸如但不限于miR序列(例如，miR结合位点和miR种子)。作为非限制性实例，用于间隔两个TEE序列的每个间隔区可以包括不同的miR序列或miR序列的组件(例如，miR种子序列)。
在一些情况下，多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可以包括美国专利公开号2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100，国际专利公开号WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008，欧洲专利公开号2610341和2610340，以及美国专利号6,310,197、6,849,405、7,456,273和7,183,395中公开的TEE序列的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或超过99％，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR中的TEE可以包括美国专利公开号2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100，国际专利公开号WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008，欧洲专利公开号2610341和2610340，以及美国专利号6,310,197、6,849,405、7,456,273和7,183,395中公开的TEE序列的5-30个核苷酸片段，5-25个核苷酸片段，5-20个核苷酸片段，5-15个核苷酸片段，5-10个核苷酸片段；其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
在某些情况下，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可以包括在Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)中，在Wellen siek等人(Genome-wide profiling of human cap-independent translatio n-enhancing elements,Nature Methods,2013；DOI:10.1038/NMETH.2522)公开的补充表1和补充表2中公开的TEE序列的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或超过99％；其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可以包括在Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)中，在We llensiek等人(Genome-wide profiling of human cap-independenttransl ation-enhancing elements,Nature Methods,2013；DOI:10.1038/NME TH.2522)公开的补充表1和补充表2中公开的TEE序列的5-30个核苷酸片段、5-25个核苷酸片段、5-20个核苷酸片段、5-15个核苷酸片段、5-10个核苷酸片段；其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
在一些情况下，用于多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR中的TEE是IRES序列，诸如但不限于美国专利号7,468,275和国际专利公开号WO2001/055369中描述的那些，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
在一些情况下，可以通过美国专利公开号2007/0048776和2011/0124100以及国际专利公开号WO2007/025008和WO2012/009644中描述的方法鉴定多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中使用的TEE，其中每一个的方法均通过引用并入本文。
在一些情况下，用于多核苷酸(例如，mRNA)的5’-UTR中的TEE可以是美国专利号7,456,273和7,183,395，美国专利公开号2009/0093049和国际公开号WO2001/055371中描述的转录调控元件，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。转录调控元件可以通过本领域已知的方法来鉴定，诸如但不限于美国专利号7,456,273和7,183,395，美国专利公开号2009/0093049和国际公开号WO2001/055371中描述的方法，其中每一个的方法均通过引用并入本文。
在其他情况下，用于多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE是如美国专利号7,456,273和7,183,395，美国专利公开号2009/0093049以及国际公开号WO2001/055371中描述的多核苷酸或其部分，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
可以将包含至少一个本文所述的TEE的5’-UTR并入单顺反子序列，诸如但不限于载体系统或多核苷酸载体中。作为非限制性实例，载体系统和多核苷酸载体可以包括在美国专利号7,456,273和7,183,395，美国专利公开号2007/0048776、2009/0093049和2011/0124100以及国际专利公开号WO2007/025008和WO2001/055371中描述的那些，其中每一个的TEE序列均通过引用并入本文。
本文所述的TEE可以位于多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR和/或3'-UTR中。位于3'-UTR中的TEE可以与位于5'-UTR中和/或描述用于并入5'-UTR中的TEE相同和/或不同。
在一些情况下个、多核苷酸(例如个、mRNA)的3'-UTR可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或多于60个TEE序列。本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的3’-UTR中的TEE序列可以是相同或不同的TEE序列。TEE序列可以呈诸如ABABAB、AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体的模式，重复一次、两次或多于三次。在这些模式中，每个字母A、B或C在核苷酸水平代表不同的TEE序列。
在一种情况下，3’-UTR可以包括间隔两个TEE序列的间隔区。作为非限制性实例，间隔区可以是15个核苷酸的间隔区和/或本领域已知的其他间隔区。作为另一个非限制性示例，3’-UTR可以包括TEE序列-间隔区模块，该模块在3’-UTR中重复至少一次，至少两次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次或多于9次。
在其他情况下，间隔两个TEE序列的间隔区可以包括本领域已知的其他序列，这些序列可以调节本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的翻译，诸如但不限于本文所述的miR序列(例如，miR结合位点和miR种子)。作为非限制性实例，用于间隔两个TEE序列的每个间隔区可以包括不同的miR序列或miR序列的组件(例如，miR种子序列)。
在一些实施方案中，本公开的多核糖核苷酸包含miR和/或TEE序列。在一些实施方案中，将miR序列和/或TEE序列并入本公开的多核糖核苷酸中可以改变茎环区的形状，这可以增加和/或减少翻译。参见，例如，Kedde等人，Nature Cell Biology 2010 12(10):1014-20，其通过引用整体并入本文)。
传感器序列和微RNA(miRNA)结合位点
传感器序列包括例如微RNA(miRNA)结合位点，转录因子结合位点，结构化的mRNA序列和/或基序，经工程改造以充当内源核酸结合分子的假受体的人工结合位点及其组合。传感器序列的非限制性实例在美国公开2014/0200261中有描述，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，包含编码多肽的开放阅读框(ORF)的本公开的多核糖核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))，还包含传感器序列。在一些实施方案中，传感器序列为miRNA结合位点。
miRNA是与多核糖核苷酸结合并通过降低多核糖核苷酸的稳定性或通过抑制多核糖核苷酸的翻译而下调基因表达的19-25个核苷酸长的非编码RNA。miRNA序列包含“种子”区，即成熟miRNA的位置2-8的区域中的序列。miRNA种子可以包含成熟miRNA的位置2-8或2-7。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点的侧面是与miRNA位置1相对的腺苷(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点的侧面是与miRNA位置1相对的腺苷(A)。参见，例如，Grimson A、Farh KK、Johnston WK、Garrett-Engele P、Lim LP、Bartel DP；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。可以进行靶细胞或组织的miRNA分析，以确定细胞或组织中是否存在miRNA。在一些实施方案中，本公开的多核糖核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))包含一个或多个微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子。此类序列可以对应于任何已知的微RNA，诸如在美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005中教导的那些，其中每一个的内容均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“微RNA(miRNA或miR)结合位点”是指多核糖核苷酸内，例如DNA或RNA转录物内，包括5'UTR和/或3'UTR内，与miRNA的全部或区域具有足够互补性，以与miRNA相互作用、缔合或结合的序列。在一些实施方案中，包含编码多肽的ORF的本公开的多核糖核苷酸还包含miRNA结合位点。在示例性实施方案中，多核糖核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))的5'UTR和/或3'UTR包含miRNA结合位点。
与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸调节，例如miRNA介导的多核苷酸翻译抑制或降解的互补程度。在本公开的示例性方面，与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸降解，例如miRNA引导的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的mRNA裂解的互补程度。miRNA结合位点可与例如19-25个核苷酸的miRNA序列、19-23个核苷酸的miRNA序列或22个核苷酸的miRNA序列具有互补性。miRNA结合位点可以仅与miRNA的一部分互补，例如与小于天然存在的miRNA序列的全长的1、2、3或4个核苷酸的部分互补。当所需调控为mRNA降解时，优选全部或完全互补(例如，在天然存在的miRNA的全部或大部分长度上全部互补或完全互补)。
在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA序列具有完全互补性，但是有1、2或3个核苷酸取代、末端添加和/或截短。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA长度相同。在其他实施方案中，miRNA结合位点在5'末端、3'末端或两端，比相应miRNA短一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个核苷酸。在其他实施方案中，微RNA结合位点在5'末端、3'末端或两端，比相应的微RNA短两个核苷酸。比相应的miRNA短的miRNA结合位点仍然能够降解并入了一个或多个miRNA结合位点的mRNA或阻止mRNA翻译。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应的成熟miRNA结合，所述成熟miRNA是含有活性RISC的Dicer的一部分。在另一个实施方案中，miRNA结合位点与RISC中的相应miRNA的结合降解了含有miRNA结合位点的mRNA或阻止了mRNA被翻译。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA具有足够互补性，使得包含miRNA的RISC复合物裂解包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸。在其他实施方案中，miRNA结合位点具有不完美的互补性，使得包含miRNA的RISC复合物在包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸中诱导不稳定性。在另一个实施方案中，miRNA结合位点具有不完美的互补性，使得包含miRNA的RISC复合物抑制包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸的转录。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个错配。
在一些实施方案中，miRNA结合位点有至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸与相应miRNA的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸分别互补。
通过将一个或多个miRNA结合位点工程改造到本公开的多核糖核苷酸中，可以靶向多核糖核苷酸进行降解或减少翻译，条件是所讨论的miRNA可用。这样可以减少多核糖核苷酸递送时的脱靶效应。例如，如果不打算将本公开的多核糖核苷酸递送至组织或细胞而是终止于此，则在将miRNA的一个或多个结合位点工程改造到多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR时，组织或细胞中富含的miRNA可以抑制目标基因的表达。
相反，miRNA结合位点可从它们天然存在的多核糖核苷酸序列中去除，以增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可以从多核糖核苷酸中去除特定miRNA的结合位点，以改善在含有该miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
在一些实施方案中，本公开的多核糖核苷酸可在5'UTR和/或3'UTR中包括至少一个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌细胞。在另一个实施方案中，本公开的多核糖核苷酸可以在5'-UTR和/或3'-UTR中包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌细胞。
可以通过引入或去除一个或多个miRNA结合位点来完成多个组织中的表达调节。可以基于miRNA表达模式和/或它们在疾病中的概况来决定是去除还是插入miRNA结合位点。已经报道了miRNA、miRNA结合位点及其表达模式的鉴定和在生物学中的作用(例如，Bonauer等人，Curr Drug Targets 2010 11:943-949；Anand和Cheresh Curr OpinHematol 2011 18:171-176；Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf等人，Cell,2007 129:1401-1414；Gentner和Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403及其中的所有参考文献；其各自通过引用整体并入本文)。
miRNA和miRNA结合位点可对应于任何已知序列，包括美国公开号2014/0200261、2005/0261218和2005/0059005中描述的非限制性实例，其各自通过引用整体并入本文。
已知miRNA可以调节mRNA，从而调节蛋白质表达的组织的实例，包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体地，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)，诸如抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等中差异性表达。免疫细胞特异性miRNA参与免疫原性、自身免疫性、对感染的免疫响应、炎症以及基因治疗和组织/器官移植后的有害免疫响应。免疫细胞特异性miRNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，在髓样树突细胞中尤其丰富。已经证明，可以通过向多核糖核苷酸的3'-UTR添加miR-142结合位点来关闭对多核糖核苷酸的免疫响应，从而能够在组织和细胞中进行更稳定的基因转移。miR-142有效降解抗原呈递细胞中的外源多核糖核苷酸并抑制转导细胞的细胞毒性消除(例如，Annoni A等人，blood,2009,114,5152-5161；Brown BD等人，Natmed.2006,12(5),585-591；Brown BD等人，blood,2007,110(13):4144-4152，其各自通过引用整体并入本文)。
抗原介导的免疫响应可以指由外来抗原触发的免疫响应，外来抗原在进入生物体时由抗原呈递细胞加工并展示在抗原呈递细胞的表面上。T细胞可以识别呈递的抗原，并诱导表达该抗原的细胞的细胞毒性消除。
将miR-142结合位点引入本公开的多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中可以通过miR-142介导的降解选择性地抑制抗原呈递细胞中的基因表达，从而限制抗原呈递细胞(例如，树突细胞)中的抗原呈递，因此防止在递送多核糖核苷酸后抗原介导的免疫响应。然后，多核糖核苷酸在靶组织或细胞中稳定表达而不触发细胞毒性消除。
在一些实施方案中，可以将已知会在免疫细胞、抗原呈递细胞中表达的miRNA结合位点工程改造到本公开的多核糖核苷酸，以通过miRNA介导的RNA降解来抑制多核糖核苷酸在抗原呈递细胞中的表达，使抗原介导的免疫响应缓和。在不表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中多核糖核苷酸的表达得以维持。例如，在一些实施方案中，为了防止针对肝脏特异性蛋白的免疫原性反应，可以去除任何miR-122结合位点，并且可以将miR-142(和/或mirR-146)结合位点工程改造到本公开的多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中。
为了进一步驱动APC和巨噬细胞中的选择性降解和抑制，本公开的多核糖核苷酸可以在5'UTR和/或3'UTR中单独地或与miR-142和/或miR-146结合位点组合地包含另一负调控元件。作为一个非限制性实例，另一负调控元件是组成型衰变元件(CDE)。
免疫细胞特异性miRNA包括但不限于hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-l-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p,miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p、miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p,、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。此外，可以通过微阵列杂交和切片机分析在免疫细胞中鉴定出新型miRNA(例如，JimaDD等人，Blood,2010,116:e118-e127；Vaz C等人，BMC Genomics,2010,11,288，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
已知在肝脏中表达的miRNA包括但不限于miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p和miR-939-5p。可将来自任何肝脏特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在肝脏中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造肝脏特异性miRNA结合位点。
已知在肺部中表达的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p和miR-381-5p。可将来自任何肺特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在肺部中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造肺特异性miRNA结合位点。
已知在心脏中表达的miRNA包括但不限于miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。可将来自任何心脏特异性微RNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在心脏中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造心脏特异性miRNA结合位点。
已知在神经系统中表达的miRNA包括但不限于miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p和miR-9-5p。神经系统中富含的miRNA还包括在神经元中特异性表达的那些miRNA，包括但不限于miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922以及在神经胶质细胞中特异性表达的那些miRNA，包括但不限于miR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p和miR-657。可以将来自任何CNS特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在神经系统中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造神经系统特异性miRNA结合位点。
已知在胰腺中表达的miRNA包括但不限于miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p和miR-944。可以将来自任何胰腺特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在胰腺中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造胰腺特异性miRNA结合位点。
已知在肾脏中表达的miRNA包括但不限于miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p和miR-562。可以将来自任何肾脏特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在肾脏中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造肾脏特异性miRNA结合位点。
已知在肌肉中表达的miRNA包括但不限于let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p和miR-25-5p。可以将来自任何肌肉特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在肌肉中的表达。在本公开的多核糖核苷酸中，可以单独地工程改造或与免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合进一步工程改造肌肉特异性miRNA结合位点。
miRNA在不同类型的细胞，诸如但不限于内皮细胞、上皮细胞和脂肪细胞中也差异性表达。
已知在内皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。通过深度测序分析在内皮细胞中发现了许多新型miRNA(例如，Voellenkle C等人，RNA,2012,18,472-484，通过引用整体并入本文)。可以将来自任何内皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在内皮细胞中的表达。
已知在上皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802和miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、呼吸道纤毛上皮细胞中特异性的miR-449b-5p、let-7家族、miR-133a、miR-133b、肺上皮细胞中特异性的miR-126、miR-382-3p、肾上皮细胞中特异性的miR-382-5p和角膜上皮细胞中特异性的miR-762。可以将来自任何上皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核糖核苷酸中或从中去除，以调节多核糖核苷酸在上皮细胞中的表达。
另外，胚胎干细胞中富含大量的miRNA，控制干细胞的自我更新以及各种细胞谱系(诸如神经细胞、心脏细胞、造血细胞、皮肤细胞、成骨细胞和肌肉细胞)的发育和/或分化(例如，Kuppusamy KT等人，Curr.Mol Med,2013,13(5),757-764；Vidigal JA和Ventura A,Semin Cancer Biol.2012,22(5-6),428-436；GoffLA等人，PLoS One,2009,4:e7192；MorinRD等人，Genome Res,2008,18,610-621；Yoo JK等人，Stem Cells Dev.2012,21(11),2049-2057，其各自通过引用整体并入本文)。胚胎干细胞中富含的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p、miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941,miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。通过深度测序在人类胚胎干细胞中发现了许多预测的新型miRNA(例如Morin RD等人，Genome Res,2008,18,610-621；GoffLA等人，PLoS One,2009,4:e7192；BarM等人，Stem cells,2008,26,2496-2505，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，可以将胚胎干细胞特异性miRNA的结合位点包括在本公开的多核糖核苷酸的3'UTR中或从中去除，以调节胚胎干细胞的发育和/或分化，抑制退行性条件(例如，退行性疾病)中干细胞的衰老，或刺激疾病条件下的干细胞(例如，癌症干细胞)的衰老和凋亡。
进行了许多miRNA表达研究，以分析miRNA在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些miRNA在某些癌细胞中异常过表达，而另一些则低表达。例如，miRNA在以下情况中差异性表达：癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺疾病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)；白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
作为非限制性实例，在某些癌细胞和/或肿瘤细胞中过表达的miRNA的miRNA结合位点可以从本公开的多核糖核苷酸的3'UTR中去除，恢复癌细胞中受过表达的miRNA抑制的表达，从而改善相应的生物学功能，例如转录刺激和/或抑制、细胞周期停滞、凋亡和细胞死亡。其中miRNA表达未上调的正常细胞和组织将不受影响。
MiRNA还可以调节复杂的生物过程，诸如血管生成(例如，miR-132)(Anand和Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18：171-176)。在本公开的多核糖核苷酸中，可以去除或引入参与此类过程的miRNA结合位点，以使多核糖核苷酸的表达适应生物学相关的细胞类型或相关的生物学过程。在这种情况下，将本公开的多核糖核苷酸定义为营养缺陷型多核糖核苷酸。
茎环
多核苷酸(例如，mRNA)可以包括茎环，诸如但不限于组蛋白茎环。茎环可以是长度为约25或约26个核苷酸的核苷酸序列，诸如但不限于如国际专利公开号WO2013/103659中所述的那些，该专利通过引用并入本文。组蛋白茎环可相对于编码区位于3'(例如，位于编码区的3'-端)。作为非限制性实例，茎环可位于本文所述的多核苷酸的3'-端。在一些情况下，多核苷酸(例如，mRNA)包括一个以上的茎环(例如，两个茎环)。茎环序列的实例在国际专利公开号WO2012/019780和WO201502667中有描述，其茎环序列通过引用并入本文。在一些情况下，多核苷酸包括茎环序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA(SEQ ID NO:1)。在其他情况下，多核苷酸包括茎环序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ ID NO:2)。
茎环可位于多核苷酸的第二末端区域。作为非限制性实例，茎环可以位于第二末端区域中的非翻译区(例如，3’-UTR)内。
在一些情况下，可以通过添加3'稳定区(例如，包括至少一个链终止核苷的3'稳定区)来稳定包括组蛋白茎环的多核苷酸，诸如但不限于mRNA。不希望受理论束缚，添加至少一个链终止核苷可以减缓多核苷酸的降解，因此可以增加多核苷酸的半衰期。
在其他情况下，包括组蛋白茎环的多核苷酸，诸如但不限于mRNA，可以通过改变多核苷酸的3'区得以稳定，这种改变可以预防和/或抑制寡核苷酸(U)的添加(参见例如，国际专利公开号WO2013/103659)。
在其他情况下，包括组蛋白茎环的多核苷酸，诸如但不限于mRNA，可以通过添加终止于3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知和/或本文描述的其他替代核苷的寡核苷酸得以稳定。
在一些情况下，本公开的多核苷酸可包括组蛋白茎环、聚A区和/或5'-帽结构。组蛋白茎环可以在聚A区之前和/或之后。包括组蛋白茎环和聚A区序列的多核苷酸可包括本文所述的链终止核苷。
在其他情况下，本公开的多核苷酸可包括组蛋白茎环和5'-帽结构。5'-帽结构可包括但不限于本文所述和/或本领域已知的那些。
在一些情况下，保守性茎环区可以包括本文所述的miR序列。作为非限制性实例，茎环区可包括本文所述的miR序列的种子序列。在另一个非限制性实例中，茎环区可以包括miR-122种子序列。
在某些情况下，保守性茎环区可以包括本文所述的miR序列，并且还可以包括TEE序列。
在一些情况下，miR序列和/或TEE序列的并入改变了茎环区的形状，其可以增加和/或减少翻译。(参见，例如，Kedde等人，A Pumilio-induced RNA structure switch inp27-3'UTR controls miR-221and miR-22accessibility.Nature Cell Biology.2010，其通过引用整体并入本文)。
多核苷酸可包括至少一个组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号。编码至少一个组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸序列的非限制性实例在国际专利公开号WO2013/120497、WO2013/120629、WO2013/120500、WO2013/120627、WO2013/120498、WO2013/120626、WO2013/120499和WO2013/120628中有描述，其各自的序列通过引用并入本文。在某些情况下，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码病原体抗原或其片段，诸如国际专利公开号WO2013/120499和WO2013/120628中描述的多核苷酸序列，两者的序列均通过引用并入本文。在其他情况下，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码治疗性蛋白质，诸如国际专利公开号WO2013/120497和WO2013/120629中描述的多核苷酸序列，两者的序列均通过引用并入本文。在一些情况下，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码肿瘤抗原或其片段，诸如国际专利公开号WO2013/120500和WO2013/120627中所述的多核苷酸序列，两者的序列均通过引用并入本文。在其他情况下，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码变应原性抗原或自身免疫自身抗原，诸如国际专利公开号WO2013/120498和WO2013/120626中描述的多核苷酸序列，两者的序列均通过引用并入本文。
聚A区
多核苷酸或核酸(例如，mRNA)可以包括聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。聚A序列可以全部或大部分由腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物组成。聚A序列可以是位于核酸的3'非翻译区附近的尾部。
在RNA加工期间，通常将长链的腺苷核苷酸(聚A区)添加到信使RNA(mRNA)分子，以提高分子的稳定性。转录后立即将转录物的3'-末端裂解以释放3'-羟基。然后，聚A聚合酶将一条腺苷核苷酸链添加到RNA。该过程，称为聚腺苷酸化，添加了长度为100至250个残基的聚A区。
独特的聚A区长度可以为本公开的替代多核苷酸提供某些优点。
通常，本公开的聚A区的长度为至少30个核苷酸。在另一个实施方案中，聚A区的长度为至少35个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少40个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少45个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少55个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少70个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少80个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少90个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少100个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少120个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少140个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少160个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少180个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少200个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少250个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少300个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少350个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少400个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少450个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少600个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少700个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少800个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少900个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1100个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1200个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1300个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1400个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1600个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1700个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1800个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少1900个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少2000个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少2500个核苷酸。在另一个实施方案中，长度为至少3000个核苷酸。
在一些情况下，在本文所述的替代性多核苷酸分子上，聚A区的长度可为80个核苷酸、120个核苷酸、160个核苷酸。
在其他情况下，在本文所述的替代多核苷酸分子上，聚A区的长度可为20、40、80、100、120、140或160个核苷酸。
在一些情况下，相对于整体替代多核苷酸的长度设计聚A区。该设计可以基于替代多核苷酸的编码区的长度，替代多核苷酸(诸如mRNA)的特定特征件或区域的长度，或者基于由替代多核苷酸表达的最终产物的长度。当相对于替代多核苷酸的任何特征件(例如，除了包括聚A区的mRNA部分之外)时，聚A区可以在长度上比附加特征件长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。聚A区也可以设计为其所属的替代多核苷酸的一部分。在这种情况下，聚A区可以是构建体总长度或构建体总长度减去聚A区的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。
在某些情况下，可以使用工程改造的结合位点和/或与聚A结合蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)的缀合来增强表达。工程改造的结合位点可以是传感器序列，其可以用作多核苷酸(例如，mRNA)局部微环境的配体的结合位点。作为非限制性实例，多核苷酸(例如，mRNA)可以包括至少一个工程改造的结合位点，以改变聚A结合蛋白(PABP)及其类似物的结合亲和力。并入至少一个工程改造的结合位点可以增加PABP及其类似物的结合亲和力。
另外，可以在聚A区的3'-端，使用替代核苷酸，通过3'-末端将多个不同的多核苷酸(例如，mRNA)一起连接至PABP(聚A结合蛋白)。可以在相关的细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和第7天通过ELISA测定蛋白质产量。作为非限制性实例，由于添加了至少一个工程改造的结合位点，转染实验可用于评价对PABP或其类似物结合亲和力的影响。
在某些情况下，聚A区可用于调节翻译起始。虽然不希望受理论束缚，但是聚A区募集了PABP，PABP又可以与翻译起始复合物相互作用，因此可能对于蛋白质合成是必不可少的。
在一些情况下，在本公开中也可以使用聚A区来防止3'-5'-核酸外切酶消化。
在一些情况下，多核苷酸(例如，mRNA)可以包括聚A-G四合体。G-四合体是四个鸟苷核苷酸的环状氢键阵列，该阵列可由DNA和RNA中的富G序列形成。在该实施方案中，将G-四合体并入聚A区的末端。可以测定所得多核苷酸(例如，mRNA)的稳定性、蛋白质产量和其他参数，包括在不同时间点的半衰期。已经发现，聚A-G四合体产生的蛋白质产量等于单独使用120个核苷酸的聚A区所观察到的蛋白质产量的至少75％。
在一些情况下，多核苷酸(例如，mRNA)可以包括聚A区，并且可以通过添加3'稳定区来稳定。具有聚A区的多核苷酸(例如，mRNA)还可包括5'-帽结构。
在其他情况下，多核苷酸(例如，mRNA)可以包括聚A-G四合体。具有聚A-G四合体的多核苷酸(例如，mRNA)还可包括5'-帽结构。
在一些情况下，可用于稳定包括聚A区或聚A-G四合体的多核苷酸(例如，mRNA)的3'稳定区可以是但不限于国际专利公开号WO2013/103659中描述的那些，其聚A区和聚A-G四合体通过引用并入本文。在其他情况下，可用于本公开的3'稳定区包括链终止核苷，诸如3'-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-二脱氧核苷(诸如2',3'-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧尿苷、2',3'-二脱氧胞嘧啶、2',3'-二脱氧鸟苷、2',3'-二脱氧胸腺嘧啶)、2'-脱氧核苷或O-甲基核苷。
在其他情况下，包括聚A区或聚A-G四合体的多核苷酸(诸如但不限于mRNA)可以通过改变多核苷酸的3'区得以稳定，这种改变可以预防和/或抑制寡核苷酸(U)的添加(参见例如，国际专利公开号WO2013/103659)。
在其他情况下，包括聚A区或聚A-G四合体的多核苷酸(诸如但不限于mRNA)可以通过添加终止于3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知和/或本文描述的其他替代核苷的寡核苷酸得以稳定。
链终止核苷
核酸可以包含链终止核苷。例如，链终止核苷可以包括在其糖基的2’和/或3’位置脱氧的那些核苷。此类物质可以包括3'-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-二脱氧核苷(诸如2',3'-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧尿苷、2',3'-二脱氧胞嘧啶、2',3'-二脱氧鸟苷和2',3'-二脱氧胸腺嘧啶)。
基因组编辑技术
在一些实施方案中，核酸适于基因组编辑技术。
在一些实施方案中，基因组编辑技术是规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)或转录激活物样效应核酸酶(TALEN)。
在一些实施方案中，核酸是选自由以下组成的组的适于基因组编辑技术的至少一种核酸：CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、单引导RNA(sgRNA)和DNA修复模板。
其它组分
除了前面部分中描述的组分外，LNP还可包括一种或多种组分。例如，LNP可包括一种或多种小的疏水分子，诸如维生素(例如，维生素A或维生素E)或固醇。
脂质纳米颗粒还可包含一种或多种渗透增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其他组分。渗透增强剂分子可以是例如美国专利申请公开号2005/0222064描述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。
可以包含和/或使用聚合物以包封或部分包封LNP。聚合物可以是生物可降解的和/或生物相容的。聚合物可以选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和多芳酯。例如，聚合物可以包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯基卤化物(诸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物)、聚二氧环己酮及其共聚物、聚羟基链烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆、泊洛沙胺、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)和聚甘油。
表面改变剂可包括但不限于阴离子蛋白(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，诸如二甲基二-十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、溶粘蛋白剂(例如，乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、clerodendrum、溴己新、羧甲半胱氨酸、依普拉酮(eprazinone)、巯乙磺酸钠、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺素β4、阿法链道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))，以及DNA酶(例如rhDNase)。可以将表面改变剂置于纳米颗粒内和/或LNP的表面(例如，通过包衣、吸附、共价连接或其他方法)。
LNP也可以包含一种或多种功能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基在适当的反应条件下暴露于叠氮化物时可以进行环加成反应。具体而言，可以用一种或多种可用于促进膜渗透、细胞识别或成像的基团以这种方式官能化脂质双层。LNP的表面也可以与一种或多种有用的抗体缀合。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和缀合物是本领域众所周知的。
除这些组分外，脂质纳米颗粒可包括药物组合物中有用的任何物质。例如，脂质纳米颗粒可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，诸如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、助悬剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒介物、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂和其他物质。也可以包括赋形剂，诸如蜡、黄油、着色剂、包衣剂、调味剂和芳香剂。药学上可接受的赋形剂是本领域众所周知的(参见例如Remington的The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
稀释剂的实例可包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉和/或其组合。造粒剂和分散剂可以选自由以下组成的非限制性列表：马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘果肉、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联的聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联的羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预糊化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝
Figure BDA0002426886470001131
月桂基硫酸钠、季铵化合物和/或其组合。
表面活性剂和/或乳化剂可以包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如，膨润土[硅酸铝]和
Figure BDA0002426886470001132
[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和单硬脂酸丙二醇酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如，羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、纤维素粉、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧化乙烯山梨醇酐单月桂酸酯[
Figure BDA0002426886470001134
20]、聚氧乙烯山梨糖醇酐[
Figure BDA0002426886470001133
60]、聚氧化乙烯山梨醇酐单油酸酯[
Figure BDA0002426886470001135
80]、山梨醇酐单棕榈酸酯[
Figure BDA0002426886470001136
40]、梨醇酐单硬脂酸酯[
Figure BDA0002426886470001137
60]、山梨醇酐三硬脂酸酯[
Figure BDA0002426886470001138
65]、单油酸甘油酯、山梨醇酐单油酸酯[
Figure BDA0002426886470001139
80])、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[
Figure BDA00024268864700011310
45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和
Figure BDA00024268864700011311
)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，
Figure BDA00024268864700011312
)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚[
Figure BDA00024268864700011313
30])、聚(乙烯基吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、
Figure BDA00024268864700011314
F 68、
Figure BDA00024268864700011315
188、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、多库酯钠和/或其组合。
粘合剂可以是淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、潘瓦尔胶、茄替胶、依莎贝果壳粘液(mucilage of isapol husk)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸镁铝
Figure BDA0002426886470001141
和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；及其组合，或任何其他合适的粘合剂。
防腐剂的实例可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇类防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。抗氧化剂的实例包括但不限于α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝丙二醇、西曲溴铵、氯化十六烷吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲(imidurea)、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇类防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯甲醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、醋酸生育酚，甲磺酸去氧肟酯、西曲溴铵、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT
Figure BDA0002426886470001151
Figure BDA0002426886470001152
对羟基苯甲酸甲酯、
Figure BDA0002426886470001153
115、
Figure BDA0002426886470001154
NEOLONETM、KATHONTM和/或
Figure BDA0002426886470001155
缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖醛酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氨基磺酸盐缓冲液(例如，HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇和/或其组合。润滑剂可以选自由以下组成的非限制性组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠及其组合。
油的实例包括但不限于扁桃仁油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、佛手柑油、黑穗醋栗籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、菜籽油、香菜油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴油油、夏威夷核果油、杂薰衣草油、薰衣草油、柠檬油、山苍子油、夏威夷果油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、大西洋胄胸鲷油(orange roughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油、皱叶甘蓝油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅酮油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿花油、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油以及硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲聚硅氧烷360、二甲基硅油、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇，硅酮油和/或其组合。
制剂
本公开的制剂包括至少一种脂质纳米颗粒组分。脂质纳米颗粒可以包括脂质组分和一种或多种附加组分，诸如治疗剂和/或预防剂，诸如核酸。LNP可以设计用于一种或多种特定应用或靶标。可以基于特定的应用或靶标和/或基于一种或多种要素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特征来选择LNP的要素。类似地，可以根据例如特定要素组合的功效和毒性为特定应用或靶标选择LNP的特定制剂。LNP制剂的功效和耐受性可受制剂稳定性的影响。
在一些实施方案中，改性剂与LNP之间的重量比为约0.0004:1至约100:1(例如，约0.001:1至约10:1，约0.001:1至约5:1，约0.001:1至约0.1:1，约0.005至约0.4:1，或约0.5:1至约4:1，约0.05:1至约5:1，约0.1:1至约5:1或约0.05:1至约2.5:1，约1:1至约50:1，约2:1至约50:1或约1:1至约25:1)。
LNP的脂质组分可包括，例如根据式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的脂质，磷脂(诸如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)，PEG脂质和结构脂质。LNP的脂质组分可包括例如根据式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的脂质，磷脂(诸如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)和结构脂质。脂质组分的要素可以特定的分数提供。
在一些实施方案中，LNP的脂质组分包括根据式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的脂质，磷脂，PEG脂质和结构脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的脂质组分包括约30摩尔％至约60摩尔％的式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的化合物，约0摩尔％至约30摩尔％的磷脂，约18.5摩尔％至约48.5摩尔％的结构脂质和约0摩尔％至约10摩尔％的PEG脂质，条件是总摩尔％不超过100％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的脂质组分包括约35摩尔％至约55摩尔％的式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的化合物，约5摩尔％至约25摩尔％的磷脂，约30摩尔％至约40摩尔％的结构脂质和约0摩尔％至约10摩尔％的PEG脂质。在一个特定实施方案中，脂质组分包括约50摩尔％的所述化合物，约10摩尔％的磷脂，约38.5摩尔％的结构脂质和约1.5摩尔％的PEG脂质。在另一个特定实施方案中，脂质组分包括约40摩尔％的所述化合物，约20摩尔％的磷脂，约38.5摩尔％的结构脂质和约1.5摩尔％的PEG脂质。在一些实施方案中，磷脂可以是DOPE或DSPC。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG-DMG和/或结构脂质可以是胆固醇。
脂质纳米颗粒可以设计用于一种或多种特定应用或靶标。例如，LNP可以设计成向哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统或其组递送治疗剂和/或预防剂，诸如RNA。脂质纳米颗粒的物理化学性质可以改变，以便增加对特定身体靶标的选择性。例如，可以基于不同器官的开窗大小来调节粒度。LNP中包括的治疗剂和/或预防剂也可以基于预期的一个或多个递送靶标进行选择。例如，可以针对特定适应症、病状、疾病或病症和/或针对向特定细胞、组织、器官或系统或其组递送(例如，局部或特异性递送)来选择治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，LNP可以包括编码能够在细胞内翻译的目标多肽的mRNA以产生目标多肽。可以将此类组合物设计成特异性递送至特定器官。在一些实施方案中，可以将组合物设计为特异性递送至哺乳动物肝脏。
LNP中治疗剂和/或预防剂的量可取决于脂质纳米颗粒的大小、组成、预期靶标和/或应用或其他性质以及治疗剂和/或预防剂的性质。例如，可用于LNP中的RNA的量可取决于RNA的大小、序列和其他特征。LNP中治疗剂和/或预防剂和其他要素(例如，脂质)的相对量也可以改变。在一些实施方案中，LNP中脂质组分与治疗剂和/或预防剂诸如核酸的重量/重量比可以为约5:1至约60:1，诸如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。例如，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的重量/重量比可以为约10:1至约40:1。在一些实施方案中，重量/重量比为约20:1。LNP中治疗剂和/或预防剂的量可以，例如使用吸收光谱法(例如，紫外线-可见光谱法)测量。
在一些实施方案中，LNP包括一种或多种RNA，并且可以选择所述一种或多种RNA、脂质及其量以提供特定的N:P比。组合物的N:P比率是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸基团数量的摩尔比。一般而言，优选较低的N:P比。可以选择所述一种或多种RNA、脂质及其量，以使N:P比为约2:1至约30:1，诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1。在一些实施方案中，N:P比为约2:1至约8:1。在其他实施方案中，N:P比可为约5:1至约8:1。例如，N:P比可以为约5.0:1，约5.5:1，约5.67:1，约6.0:1，6.5:1或约7.0:1。例如，N:P比可为约5.67:1。
在一些实施方案中，包含LNP的制剂还可包含盐，诸如氯盐。
在一些实施方案中，包含LNP的制剂还可包含糖，诸如二糖。在一些实施方案中，所述制剂还包含糖但不包含盐，诸如氯盐。
物理性质
LNP的特性可以取决于其组分。例如，包含胆固醇作为结构脂质的LNP可以具有与包含不同结构脂质的LNP不同的特征。类似地，LNP的特性可取决于其组分的绝对量或相对量。例如，包含较高摩尔分数的磷脂的LNP可以具有与包含较低摩尔分数的磷脂的LNP不同的特征。特征还可以根据脂质纳米颗粒的制备方法和条件而改变。
脂质纳米颗粒可以通过多种方法表征。例如，显微镜术(例如，透射电子显微镜术或扫描电子显微镜术)可用于检查LNP的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)可用于测量ζ电位。动态光散射也可以用于测定粒度。诸如ZetasizerNano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)等仪器也可用于测量LNP的多种特征，诸如粒度、多分散指数和ζ电位。
例如通过动态光散射(DLS)测量，LNP的平均尺寸可以介于数10nm至数100nm之间。例如，平均尺寸可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，LNP的平均尺寸可以为约50nm至约100nm，约50nm至约90nm，约50nm至约80nm，约50nm至约70nm，约50nm至约60nm，约60nm至约100nm，约60nm至约90nm，约60nm至约80nm，约60nm至约70nm，约70nm至约100nm，约70nm至约90nm，约70nm至约80nm，约80nm至约100nm，约80nm至约90nm，或约90nm至约100nm。在一些实施方案中，LNP的平均尺寸可以为约70nm至约100nm。在一个特定实施方案中，平均尺寸可以为约80nm。在其他实施方案中，平均尺寸可以为约100nm。
LNP可以是相对同质的。可以使用多分散指数来指示LNP的同质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如小于0.3)多分散指数通常指示窄的粒度分布。LNP可具有约0至约0.25的多分散指数，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，LNP的多分散指数可以为约0.10至约0.20。
LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。例如，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。通常期望具有相对较低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒，因为带更多电荷的物质可与人体的细胞、组织和其他要素发生不良相互作用。在一些实施方案中，LNP的ζ电位可以为约-10mV至约+20mV，约-10mV至约+15mV，约-10mV至约+10mV，约-10mV至约+5mV，约-10mV至约0mV，约-10mV至约-5mV，约-5mV至约+20mV，约-5mV至约+15mV，约-5mV至约+10mV，约-5mV至约+5mV，约-5mV至约0mV，约0mV至约+20mV，约0mV至约+15mV，约0mV至约+10mV，约0mV至约+5mV，约+5mV至约+20mV，约+5mV至约+15mV，或约+5mV至约+10mV。
治疗剂和/或预防剂诸如核酸的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后包封或与LNP缔合的治疗剂和/或预防剂的量。理想的是包封效率很高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂分解脂质纳米颗粒之前和之后在含有脂质纳米颗粒的溶液中的治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离的治疗剂和/或预防剂(例如，RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，治疗剂和/或预防剂的包封效率可以为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在一些实施方案中，包封效率可为至少90％。
LNP可以任选地包含一种或多种包衣。例如，可以将LNP配制成具有包衣的胶囊、膜剂或片剂。包括本文所述的组合物的胶囊、膜剂或片剂可具有任何有用的尺寸、抗张强度、硬度或密度。
药物组合物
包含脂质纳米颗粒的制剂可以全部或部分配制为药物组合物。药物组合物可以包括一种或多种脂质纳米颗粒。例如，药物组合物可以包括一种或多种脂质纳米颗粒，其包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，诸如本文所述的那些。配制和生产药物组合物和药剂的一般准则可在例如Remington的The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006中获得。常规的赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非任何常规的赋形剂或辅助成分可能与本公开制剂中LNP的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与组分或LNP的组合可产生任何不良的生物学作用或其他有害作用，则赋形剂或辅助成分与制剂的LNP组分不相容。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或辅助成分可以占包括LNP的药物组合物的总质量或总体积的50％以上。例如，一种或多种赋形剂或辅助成分可以占药学惯例的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，赋形剂是经批准用于人类和兽医使用的。在一些实施方案中，赋形剂是经美国食品和药物管理局批准的。在一些实施方案中，赋形剂为药物级。在一些实施方案中，赋形剂符合《美国药典》(USP)、《欧洲药典》(EP)、《英国药典》和/或《国际药典》的标准。
根据本公开，药物组合物中所述一种或多种脂质纳米颗粒、所述一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将根据所治受试者的特性、大小和状况改变，并且进一步根据施用组合物的途径而改变。举例来说，药物组合物可包含0.1％至100％(重量/重量)的一种或多种脂质纳米颗粒。作为另一个实例，药物组合物可包含0.1％至15％(重量/体积)的一种或多种两亲性聚合物(例如，0.5％、1％、2.5％、5％、10％或12.5％w/v)。
在一些实施方案中，将本公开的脂质纳米颗粒和/或药物组合物冷藏或冷冻进行储存和/或运输(例如，储存在4℃或更低的温度下，诸如约-150℃至约0℃或约-80℃至约-20℃之间的温度(例如，约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)。例如，包含一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物是溶液或固体(例如，经冻干)，将所述溶液或固体在例如约-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏进行储存和/或运输。在一些实施方案中，本公开还涉及增加脂质纳米颗粒的稳定性并将脂质纳米颗粒和/或其药物组合物储存在4℃或更低温度下的方法，所述温度诸如介于-150℃至0℃之间或介于约-80℃至约-20℃之间的温度，例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)。
可以将脂质纳米颗粒和/或包含一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物施用给任何患者或受试者，包括可以受益于通过将治疗剂和/或预防剂递送至一种或多种特定的细胞、组织、器官或系统或其组(诸如肾脏系统)而提供的治疗效果的那些患者或受试者。尽管本文提供的脂质纳米颗粒和包括脂质纳米颗粒的药物组合物的描述主要针对适于向人施用的组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适于向任何其他哺乳动物施用。为了使该组合物适于向各种动物施用而对适于向人施用的组合物进行改性是众所周知的，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通(如果有)的实验来设计和/或进行此类改性。考虑施用该组合物的受试者包括但不限于人、其他灵长类动物和其他哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包含一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物可以通过药理学领域中已知的或此后开发的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如果需要或必要，将产品分开、成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可以散装，作为单个单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如，脂质纳米颗粒)的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的方便分数，例如此类剂量的一半或三分之一。
药物组合物可以以多种适于各种施用途径和方法的形式制备。例如，药物组合物可以制备成液体剂型(例如，乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如，胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和粒剂)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如，软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴剂)、混悬剂、粉剂和其他形式。
用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含附加治疗剂和/或预防剂、附加药剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的一些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，诸如
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醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。
可以根据已知技术使用合适的分散剂、湿润剂和/或助悬剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质混悬剂。无菌注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液、混悬剂和/或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。通常采用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸诸如油酸可用于制备注射剂。
可注射制剂可以灭菌，例如，通过细菌保留过滤器过滤，和/或通过掺入无菌固体组合物形式，在使用之前可溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中的灭菌剂。
为了延长活性成分的作用，常常期望减缓来自于皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性较差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。可替代地，通过将药物溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在生物可降解的聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成药物的微囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库型可注射制剂。
用于直肠或阴道施用的组合物通常是栓剂，可以通过将组合物与合适的非刺激性赋形剂诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备栓剂，所述赋形剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、膜剂、粉剂和粒剂。在此类固体剂型中，活性成分与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合物：填充剂或增量剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如，甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠)、溶解延迟剂(例如，石蜡)、吸收促进剂(例如，季铵化合物)、润湿剂(例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)、吸收剂(例如，高岭土和膨润土、硅酸盐)和润滑剂(例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)及其混合物。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型可包含缓冲剂。
可以采用相似类型的固体组合物作为使用诸如乳糖或乳汁糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和粒剂的固体剂型可以用包衣和衣壳如肠溶衣和药物配制领域众所周知的其他包衣制备。它们可以任选地包含遮光剂，并且可以具有仅仅或优选在肠道的某一部分中，任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。可以采用相似类型的固体组合物作为使用诸如乳糖或乳汁糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
用于局部和/或透皮施用组合物的剂型可以包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。通常，将活性成分在无菌条件下与药学上可接受的赋形剂和/或可能需要的任何所需防腐剂和/或缓冲剂混合。另外，本公开考虑了透皮贴剂的使用，透皮贴剂常常具有提供化合物向身体的受控递送的附加优点。此类剂型可以例如通过将化合物溶解和/或分配在适当的介质中来制备。可替代地或另外，可以通过提供控速膜和/或通过将化合物分散在聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适装置包括短针装置，诸如在美国专利4,886,499；5,190,521；5,328,483；5,527,288；4,270,537；5,015,235；5,141,496和5,417,662中描述的那些。皮内组合物可以通过限制针头有效刺入皮肤的长度的装置来施用，诸如在PCT公开WO 99/34850及其功能等效案中描述的那些。经由液体喷射注射器和/或经由刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针头将液体组合物递送到真皮的喷射注射装置是合适的。喷射注射装置在例如美国专利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；和PCT公开WO 97/37705和WO 97/13537中有描述。使用压缩气体使粉末形式的疫苗加速通过皮肤外层到达真皮的弹道粉剂/颗粒递送装置是合适的。可替代地或另外，常规注射器可用于皮内施用的经典芒图法中。
适于局部施用的制剂包括但不限于液体和/或半液体制剂，诸如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液，诸如乳膏、软膏和/或糊剂，和/或溶液和/或混悬剂。可局部施用的制剂可以例如包含约1％至约10％(重量/重量)的活性成分，但是活性成分的浓度可以与活性成分在溶剂中的溶解度极限一样高。用于局部施用的制剂还可包含本文所述的一种或多种附加成分。
药物组合物可以适于经口腔进行肺部施用的制剂形式制备、包装和/或出售。此类制剂可以包含含有活性成分的干燥颗粒。此类组合物方便地呈干粉形式，用于使用包括干粉贮存器的装置和/或使用自推进溶剂/粉剂分配容器来施用，可将推进剂流引导至所述干粉贮存器以使粉剂分散，所述自推进溶剂/粉剂分配容器诸如包含溶解和/或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分。干粉组合物可以包括固体细粉稀释剂，诸如糖，并且方便地以单位剂型提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压下沸点低于65℉的液体推进剂。通常，推进剂可占组合物的50％至99.9％(重量/重量)，而活性成分可占组合物的0.1％至20％(重量/重量)。推进剂还可包含附加成分，诸如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂和/或固体稀释剂(其粒度可与包含活性成分的颗粒数量级相同)。
配制用于肺部递送的药物组合物可以呈溶液和/或混悬剂的液滴形式提供活性成分。此类制剂可以作为包含活性成分(任选地无菌)的水性和/或稀醇溶液和/或混悬剂制备、包装和/或出售，并且可以方便地使用任何喷雾和/或雾化装置进行施用。此类制剂还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于调味剂(诸如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(诸如羟基苯甲酸甲酯)。通过这种施用途径提供的液滴的平均直径可以在约1nm至约200nm的范围内。
本文描述为可用于肺部递送的制剂可用于鼻内递送药物组合物。适于鼻内施用的另一种制剂是包含活性成分并且具有约0.2μm至500μm的平均颗粒的粗粉。此类制剂以吸鼻烟的方式施用，即通过鼻道从保持靠近鼻部的粉剂容器快速吸入。
适于鼻部施用的制剂可以例如包含约少至0.1％(重量/重量)和多至100％(重量/重量)的活性成分，并且可以包含一种或多种本文所述的附加成分。药物组合物可以以适于颊部施用的制剂形式制备、包装和/或出售。此类制剂可以例如为使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式，并且可以例如包含0.1％至20％(重量/重量)的活性成分，余量包含口服可溶解的和/或可降解的组合物，以及任选地，本文所述的一种或多种附加成分。可替代地，适合经颊施用的制剂可包含含有活性成分的粉剂和/或雾状和/或雾化溶液和/或混悬剂。当分散时，此类粉状、雾状和/或雾状制剂可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均粒度和/或液滴尺寸，并且还可包含一种或多种本文所述的任何附加成分。
药物组合物可以适于眼科施用的制剂形式制备、包装和/或出售。此类制剂可以例如是滴眼剂的形式，包括例如活性成分在水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(重量/重量)溶液和/或混悬剂。此类滴剂还可包含缓冲剂、盐和/或一种或多种本文所述的任何附加成分。其他有用的眼科施用制剂包括那些包含微晶形式和/或脂质体制剂中的活性成分的制剂。滴耳剂和/或滴眼剂被认为在本公开的范围内。
在细胞中产生多肽的方法
本公开提供了在哺乳动物细胞中产生目标多肽的方法。产生多肽的方法涉及使细胞与包含LNP的本公开的制剂接触，所述LNP包含编码目标多肽的mRNA。细胞与脂质纳米颗粒接触后，mRNA可被吸收并在细胞中翻译以产生目标多肽。
一般而言，使哺乳动物细胞与包含编码目标多肽的mRNA的LNP接触的步骤可以在体内、离体、在培养中或体外进行。与细胞接触的脂质纳米颗粒的量和/或其中mRNA的量可取决于所接触的细胞或组织的类型，施用方式，脂质纳米颗粒和mRNA的物理化学特征(例如，大小、电荷和化学组成)以及其他因素。一般而言，有效量的脂质纳米颗粒将允许在细胞中有效的多肽产生。效率的度量标准可包括多肽翻译(由多肽表达指示)、mRNA降解水平和免疫响应指标。
使包含mRNA的LNP与细胞接触的步骤可涉及或引起转染。LNP脂质组分中包含的磷脂可以例如通过与细胞膜或细胞内膜相互作用和/或融合而促进转染和/或提高转染效率。转染可允许细胞内的mRNA翻译。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可在治疗上使用。例如，LNP中包含的mRNA可以编码治疗性多肽(例如，在可翻译区中)，并且在接触和/或进入(例如，转染)细胞后产生治疗性多肽。在其他实施方案中，LNP中包含的mRNA可以编码可以改善或增加受试者免疫力的多肽。例如，mRNA可以编码粒细胞集落刺激因子或曲妥珠单抗(trastuzumab)。
在一些实施方案中，LNP中包含的mRNA可以编码重组多肽，该重组多肽可以替代与脂质纳米颗粒接触的细胞中可能基本上不存在的一种或多种多肽。所述一种或多种基本上不存在的多肽可能是因编码基因的遗传突变或其调节途径而缺少。可替代地，通过mRNA翻译产生的重组多肽可以拮抗存在于细胞中，细胞表面上或从细胞分泌的内源性蛋白质的活性。可能需要拮抗性重组多肽以对抗由内源性蛋白质的活性引起的有害作用，诸如由突变引起的活性或定位改变。在另一个替代方案中，通过mRNA翻译产生的重组多肽可以间接或直接拮抗存在于细胞中，细胞表面上或从细胞分泌的生物部分的活性。受拮抗的生物部分可包括但不限于脂质(例如，胆固醇)、脂蛋白(例如，低密度脂蛋白)、核酸、碳水化合物和小分子毒素。通过mRNA翻译产生的重组多肽可经工程改造以定位在细胞内，例如在特定区室诸如细胞核内，或者可以经工程改造以从细胞分泌或易位至细胞质膜。
在一些实施方案中，使细胞与包含mRNA的LNP接触可以减少细胞对外源核酸的先天免疫响应。可以使细胞与包含第一量的第一外源mRNA的第一脂质纳米颗粒接触，所述第一外源mRNA包括可翻译区，并且可以测定细胞对第一外源mRNA的先天免疫响应水平。随后，可以使细胞与包含第二量的第一外源mRNA的第二组合物接触，第二量是与第一量相比较少的第一外源mRNA的量。可替代地，第二组合物可以包含第一量的不同于第一外源mRNA的第二外源mRNA。使细胞与第一和第二组合物接触的步骤可以重复一次或多次。另外，可以任选地测定细胞中多肽产生(例如，翻译)的效率，并且可以使细胞与第一和/或第二组合物反复再接触，直到达到目标蛋白质产生效率。
将治疗剂递送至细胞和器官的方法
本公开提供了将治疗剂和/或预防剂诸如核酸递送至哺乳动物细胞或器官的方法。将治疗剂和/或预防剂递送至细胞涉及向受试者施用包含LNP的本公开的制剂，所述LNP包含治疗剂和/或预防剂，诸如核酸，其中所述组合物的施用涉及使细胞与组合物接触。例如，可以将蛋白质、细胞毒性剂、放射性离子、化学治疗剂或核酸(诸如RNA，例如mRNA)递送至细胞或器官。在治疗剂和/或预防剂为mRNA的情况下，使细胞与脂质纳米颗粒接触后，可翻译的mRNA可在细胞中翻译以产生目标多肽。然而，基本上不可翻译的mRNA也可以递送至细胞。基本上不可翻译的mRNA可用作疫苗和/或可以隔绝细胞的翻译组分以减少其他物质在细胞中的表达。
在一些实施方案中，LNP可以靶向特定类型或类别的细胞(例如，特定器官或其系统的细胞)。例如，可以将包含目标治疗剂和/或预防剂的LNP特异性地递送至哺乳动物的肝脏、肾脏、脾脏、股骨或肺部。向特定类别的细胞、器官或系统或其组的特异性递送意味着例如，向哺乳动物施用LNP后，相对于其他终点，更高比例的包含治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒被递送至目标终点(例如，组织)。在一些实施方案中，特异性递送可导致每1g靶向终点的组织(例如，目标组织，诸如肝脏)的治疗剂和/或预防剂的量与另一终点(例如，脾脏)相比，增加大于2倍、5倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，目标组织选自由以下组成的组：肝脏、肾脏、肺部、脾脏、股骨、血管内皮(例如，冠状动脉内或股动脉内)或肾脏以及肿瘤组织(例如，经由肿瘤内注射)。
作为靶向或特异性递送的另一个实例，LNP中可包括可以在细胞表面上编码蛋白结合伴侣(例如，抗体或其功能片段、骨架蛋白或肽)或受体的mRNA。mRNA可以另外地或替代地用于指导脂质、碳水化合物或其他生物学部分的合成和细胞外定位。可替代地，LNP的其他治疗剂和/或预防剂或要素(例如，脂质或配体)可以基于它们对特定受体(例如，低密度脂蛋白受体)的亲和力来选择，使得LNP可以更容易地与靶细胞群体(包括受体)相互作用。例如，配体可以包括但不限于特异性结合对的成员、抗体、单克隆抗体、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单结构域抗体、骆驼化抗体及其片段、人源化抗体及其片段，及其多价型式；多价结合试剂，包括单或双特异性抗体，诸如二硫键稳定的Fv片段、scFv串联体、双链抗体、三链抗体或四链抗体；以及适体、受体和融合蛋白。
在一些实施方案中，配体可以是表面结合的抗体，其可以调谐细胞靶向特异性。这特别有用的，因为可以针对所需靶向位点的目标表位产生高特异性抗体。在一些实施方案中，在细胞表面上表达多种抗体，并且每种抗体对于所需靶标可以具有不同的特异性。此类方法可以增加靶向相互作用的亲合力和特异性。
可以例如由生物学领域的技术人员基于所需的细胞定位或功能来选择配体。例如，雌激素受体配体，诸如他莫昔芬(tamoxifen)，可以将细胞靶向于雌激素依赖性乳腺癌细胞，乳腺癌细胞在细胞表面上具有增加的雌激素受体数量。配体/受体相互作用的其他非限制性实例包括CCR1(例如，用于治疗类风湿性关节炎和/或多发性硬化症的发炎关节组织或脑部)、CCR7、CCR8(例如，靶向淋巴结组织)、CCR6、CCR9、CCR10(例如，靶向肠组织)、CCR4、CCR10(例如，靶向皮肤)、CXCR4(例如，用于一般增强的移行)、HCELL(例如，用于治疗炎症和炎症性病症，骨髓)、α4β7(例如，用于肠粘膜靶向)和VLA-4NCAM-1(例如，靶向内皮细胞)。一般而言，可以利用涉及靶向(例如，癌症转移)的任何受体用于本文所述的方法和组合物中。
靶向的细胞可以包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
在一些实施方案中，LNP可以靶向肝细胞。已正式载脂蛋白诸如载脂蛋白E(apoE)与体内含中性或接近中性的脂质的脂质纳米颗粒缔合，并且已知会与肝细胞表面发现的受体诸如低密度脂蛋白受体(LDLR)缔合。因此，施用于受试者的包含具有中性或接近中性的电荷的脂质组分的LNP可在受试者体内获得apoE，并且随后可将治疗剂和/或预防剂(例如，RNA)以靶向方式递送至包括LDLR的肝细胞。
治疗疾病和病症的方法
脂质纳米颗粒可用于治疗疾病、病症或病状。具体而言，此类组合物可用于治疗以蛋白质或多肽活性缺失或异常为特征的疾病、病症或病状。例如，可以将包含LNP的本公开的制剂施用或递送至细胞，所述LNP包括编码缺失的或异常的多肽的mRNA。mRNA的后续翻译可以产生多肽，从而减少或消除由于多肽不存在或由多肽引起的异常活性引起的问题。因为翻译可以快速发生，所以这些方法和组合物可用于治疗急性疾病、病症或病状诸如败血症、中风和心肌梗塞。LNP中包括的治疗剂和/或预防剂也可能能够改变给定物质的转录速率，从而影响基因表达。
以蛋白质或多肽功能障碍或活性异常为特征，可以对其施用组合物的疾病、病症和/或病状包括但不限于罕见疾病、感染性疾病(既作为疫苗又作为治疗剂)、癌症和增生性疾病、遗传性疾病(例如，囊性纤维化)、自身免疫性疾病、糖尿病、神经退行性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。多种疾病、病症和/或病状可以以蛋白质活性缺失(或显著降低，使得不存在适当的蛋白功能)为特征。此类蛋白质可能不存在，或者它们可能基本上无功能。功能障碍性蛋白的具体实例是囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)基因的错义突变变体，其产生CFTR蛋白的功能障碍性蛋白质变体，从而导致囊性纤维化。本公开提供了用于通过施用包含RNA和脂质组分的LNP治疗受试者中的此类疾病、病症和/或病状的方法，所述脂质组分包括根据式(I)的脂质、磷脂(任选地不饱和)、PEG脂质和结构脂质，其中RNA可以是编码拮抗或以其他方式克服受试者细胞中存在的异常蛋白质活性的多肽的mRNA。
本公开提供了涉及施用包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的脂质纳米颗粒的方法，以及包括该脂质纳米颗粒的药物组合物。关于本公开的特征和实施方案，术语治疗剂和预防剂在本文中可以互换使用。可以使用对疾病、病症和/或病状进行预防、治疗、诊断或成像和/或任何其他目的有效的任何合理的量和任何施用途径，向受试者施用治疗性组合物或其成像、诊断或预防性组合物。向给定受试者施用的具体量可以根据受试者的物种、年龄和总体状况；施用目的；特定组成；施用模式；等等而改变。为了便于施用和剂量均一匀，可以将根据本公开的组合物配制成剂量单位形式。然而，将理解，本公开的组合物的每日总使用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者而言，具体的治疗有效剂量水平、预防有效剂量水平或其他适当的剂量水平(例如，用于成像)将取决于多种因素，包括所治疗疾病的严重程度和特性(如果有)；采用的所述一种或多种治疗剂和/或预防剂；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和采用的特定药物组合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定药物组合物组合使用或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
可以通过任何途径施用包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的LNP。在一些实施方案中，组合物，包括包含本文所述的一种或多种脂质纳米颗粒的预防、诊断或成像组合物通过多种途径中的一种或多种施用，所述途径包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮或真皮内、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(例如，通过粉剂、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠、玻璃体内、肿瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口服喷雾剂和/或粉剂、鼻喷雾剂和/或气溶胶，和/或通过门静脉导管。在一些实施方案中，组合物可以经静脉内、肌内、皮内、动脉内、肿瘤内、皮下或通过吸入施用。然而，本公开涵盖通过考虑了药物递送科学中的可能进展的任何适当途径来递送或施用本文所述的组合物。一般而言，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括包含一种或多种治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒的性质(例如，其在各种身体环境(诸如血液和胃肠道)中的稳定性)，患者的状况(例如，患者是否能够耐受特定的施用途径)等。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物可以以下述剂量水平施用，所述剂量水平足以在给定剂量中递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg，约0.001mg/kg至约10mg/kg，约0.005mg/kg至约10mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.05mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约2mg/kg至约10mg/kg，约5mg/kg至约10mg/kg，约0.0001mg/kg至约5mg/kg，约0.001mg/kg至约5mg/kg，约0.005mg/kg至约5mg/kg，约0.01mg/kg至约5mg/kg，约0.05mg/kg至约5mg/kg，约0.1mg/kg至约5mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg，约2mg/kg至约5mg/kg，约0.0001mg/kg至约2.5mg/kg，约0.001mg/kg至约2.5mg/kg，约0.005mg/kg至约2.5mg/kg，约0.01mg/kg至约2.5mg/kg，约0.05mg/kg至约2.5mg/kg，约0.1mg/kg至约2.5mg/kg，约1mg/kg至约2.5mg/kg，约2mg/kg至约2.5mg/kg，约0.0001mg/kg至约1mg/kg，约0.001mg/kg至约1mg/kg，约0.005mg/kg至约1mg/kg，约0.01mg/kg至约1mg/kg，约0.05mg/kg至约1mg/kg，约0.1mg/kg至约1mg/kg，约0.0001mg/kg至约0.25mg/kg，约0.001mg/kg至约0.25mg/kg，约0.005mg/kg至约0.25mg/kg，约0.01mg/kg至约0.25mg/kg，约0.05mg/kg至约0.25mg/kg，或约0.1mg/kg至约0.25mg/kg的治疗和/或预防剂(例如，mRNA)，其中1mg/kg(mpk)的剂量为每1kg受试者体重提供1mg治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，可以施用LNP中约0.001mg/kg至约10mg/kg的治疗性和/或预防性(例如，mRNA)的剂量。在其他实施方案中，可以施用约0.005mg/kg至约2.5mg/kg的治疗剂和/或预防剂的剂量。在一些实施方案中，可以施用约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量。在其他实施方案中，可以施用约0.05mg/kg至约0.25mg/kg的剂量。可以每天以相同或不同的量施用一次或多次剂量，以获得所需水平的mRNA表达和/或治疗、诊断、预防或成像效果。所需剂量可以例如每天递送三次，每天两次，每天一次，隔日一次，每三天一次，每周一次，每两周一次，每三周一次或每四周一次。在一些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需剂量。在一些实施方案中，可以例如在外科手术之前或之后或在急性疾病、病症或病状的情况下施用单个剂量。
包含一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的脂质纳米颗粒可以与一种或多种其他治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与……组合”并不意在暗示所述药剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，但是这些递送方法在本公开的范围内。例如，可以组合施用一种或多种包含一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒。组合物可以与一种或多种其他所需治疗剂或医学程序同时施用，在其之前或之后施用。一般而言，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表来施用。在一些实施方案中，本公开涵盖组合物，或其成像、诊断或预防组合物与改善其生物利用率，减少和/或改变其代谢，抑制其排泄和/或改变其在体内的分布的药剂的组合递送。
将进一步认识到，组合使用的治疗、预防、诊断或成像活性剂可以一起以单一组合物施用或以不同的组合物单独施用。一般而言，期望组合使用的药剂的使用水平不超过其单独使用的水平。在一些实施例中，组合使用的水平可以低于单独使用的水平。
在联合方案中采用的疗法(治疗剂或方法)的特定组合将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及要达到的所需治疗效果。还应当理解，所采用的疗法可以针对相同的病症达到所需效果(例如，可用于治疗癌症的组合物可以与化学治疗剂同时施用)，或者它们可以达到不同的效果(例如，控制任何副作用，例如输注有关的反应)。
LNP可以与药剂组合使用以增加组合物的有效性和/或治疗窗口。此类药剂可以是，例如抗炎化合物、类固醇(例如，皮质类固醇)、他汀类、雌二醇、BTK抑制剂、S1P1激动剂、糖皮质激素受体调节剂(GRM)或抗组胺。在一些实施方案中，LNP可以与地塞米松、甲氨蝶呤、醋胺酚、H1受体阻滞剂或H2受体阻滞剂组合使用。在一些实施方案中，一种治疗有需要的受试者或向受试者(例如，哺乳动物)递送治疗剂和/或预防剂的方法可涉及在施用LNP之前用一种或多种药剂对受试者进行预处理。例如，可以用有用量(例如10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg或任何其他有用量)的地塞米松、甲氨蝶呤、醋胺酚、H1受体阻滞剂或H2受体阻滞剂对受试者进行预处理。预处理可以在施用脂质纳米颗粒前24小时或更短时间(例如，24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟)进行并且可以例如以递增剂量进行一次、两次或更多次。
本领域技术人员仅使用常规实验，就将认识到或能够确定根据本文所述的公开内容的特定实施方案的许多等同方案。并非旨在将本公开的范围限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。
定义
如本文所用，术语“烷基”或“烷基基团”意指包括一个或多个碳原子(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个碳原子)，经任选取代的直链或支链饱和烃。符号“C1-14烷基”意指包括1-14个碳原子的任选取代的直链或支链饱和烃。除非另有说明，否则本文所述的烷基是指未取代的和经取代的烷基。
如本文所用，术语“烯基”或“烯基基团”意指包括两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个碳原子)和至少一个双键，经任选取代的直链或支链烃。符号“C2-14烯基”意指包括2-14个碳原子和至少一个碳-碳双键的任选取代的直链或支链烃。烯基基团可包括一个、两个、三个、四个或更多个碳-碳双键。例如，C18烯基可包括一个或多个双键。包括两个双键的C18烯基可以是亚油醇基。除非另有说明，否则本文所述的烯基是指未取代的和经取代的烯基。
如本文所用，术语“炔基”或“炔基基团”意指包括两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个碳-碳三键，经任选取代的直链或支链烃。术语“C2-14炔基”意指包括2-14个碳原子和至少一个碳-碳三键的任选取代的直链或支链烃。炔基可包括一个、两个、三个、四个或更多个碳-碳三键。例如，C18炔基可包括一个或多个碳-碳三键。除非另有说明，否则本文所述的炔基是指未取代的和经取代的炔基。
如本文所用，术语“碳环”或“碳环基团”意指包括一个或多个碳原子环的任选取代的单环或多环体系。环可以是三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元、十四元、十五元、十六元、十七元、十八元、十九元或二十元环。符号“C3-6碳环”意指包括具有3-6个碳原子的单环的碳环。碳环可以包括一个或多个碳-碳双键或三键，并且可以是非芳香族或芳香族的(例如，环烷基或芳基基团)。碳环的实例包括环丙基、环戊基、环己基、苯基、萘基和1,2-二氢萘基。如本文所用，术语“环烷基”意指非芳香族碳环，并且可以包括或可以不包括任何双键或三键。除非另有说明，否则本文所述的碳环是指未取代的和经取代的碳环基团，即任选取代的碳环。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基团”意指包括一个或多个环的任选取代的单环或多环体系，其中至少一个环包括至少一个杂原子。杂原子可以是例如氮、氧或硫原子。环可以是三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元或十四元环。杂环可以包括一个或多个双键或三键，并且可以是非芳香族或芳香族的(例如，杂环烷基或杂芳基)。杂环的实例包括咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。如本文所用，术语“杂环烷基”意指非芳香族杂环并且可以包括或可以不包括任何双键或三键。除非另有说明，否则本文所述的杂环是指未取代的和经取代的杂环基团，即任选取代的杂环。
如本文所用，“可生物降解的基团”是可以促进哺乳动物实体中的脂质更快代谢的基团。可生物降解的基团可以选自但不限于-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基和杂芳基。如本文所用，“芳基基团”是包括一个或多个芳环的任选取代的碳环基团。芳基基团的实例包括苯基和萘基基团。如本文所用，“杂芳基基团”是包括一个或多个芳环的任选取代的杂环基团。杂芳基基团的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基基团均可以任选取代。例如，M和M’可以选自由任选取代的苯基、噁唑和噻唑组成的非限制性组。在本文的式中，M和M’可以独立地选自上述可生物降解的基团的列表。除非另有说明，否则本文所述的芳基或杂芳基基团是指未取代的和经取代的基团，即任选取代的芳基或杂芳基基团。
除非另有说明，否则烷基、烯基和环基(例如，碳环基和杂环基)可任选取代。任选的取代基可以选自但不限于卤素原子(例如，氯、溴、氟或碘基)、羧酸(例如，-C(O)OH)、醇(例如，羟基、-OH)、酯(例如，-C(O)OR或-OC(O)R)、醛(例如，-C(O)H)、羰基(例如，-C(O)R，可替代地用C＝O表示)、酰卤(例如，-C(O)X，其中X是选自溴化物、氟化物、氯化物和碘化物的卤化物)、碳酸根(例如，-OC(O)OR)、烷氧基(例如，-OR)、缩醛(例如-C(OR)2R””，其中每个OR是可以相同或不同的烷氧基基团，R””是烷基或烯基基团)、磷酸根(例如，P(O)4 3-)、硫醇(例如，-SH)、亚砜(例如，-S(O)R)、亚磺酸(例如，-S(O)OH)、磺酸(例如-S(O)2OH)、硫醛(例如，-C(S)H)、硫酸根(例如，S(O)4 2-)、磺酰基(例如，-S(O)2-)、酰胺(例如，-C(O)NR2或-N(R)C(O)R)、叠氮基(例如，-N3)、硝基(例如，-NO2)、氰基(例如，-CN)、异氰基(例如，-NC)、酰氧基(例如，-OC(O)R)、氨基(例如，-NR2、-NRH或-NH2)、氨基甲酰基(例如，-OC(O)NR2、-OC(O)NRH或-OC(O)NH2)、磺酰胺(例如，-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H或-N(H)S(O)2H)、烷基基团、烯基基团和环基(例如，碳环基或杂环基)基团。在前述任一项中，R是如本文所定义的烷基或烯基基团。在一些实施方案中，取代基基团本身还可被例如一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所定义的取代基取代。例如，C1-6烷基还可被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所定义的取代基取代。
约、大约：如本文所用，术语“大约”和“约”，应用于一个或多个目标值时，是指类似于规定参考值的值。在一些实施方案中，除非另有说明或从上下文中可以明显看出，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向上(大于或小于)，落入规定参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的范围内的值(除非此类数字将会超过可能的值的100％)。例如，当在LNP的脂质组分中给定化合物的量的情况下使用时，“约”可以意指所述值的+/-10％。例如，包括具有约40％给定化合物的脂质组分的LNP可以包括30-50％的化合物。
如本文所用，术语“化合物”意在包括所描绘的结构的所有异构体和同位素。“同位素”是指具有相同原子序数但由于原子核中的中子数不同而导致质量数不同的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。此外，可以通过常规方法与溶剂或水分子组合制备本公开的化合物、盐或配合物以形成溶剂化物和水合物。
如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与LNP接触意指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。在体内和离体使细胞与外部实体接触的方法在生物学领域是众所周知的。例如，可以通过不同的施用途径(例如，静脉内、肌内、皮内和皮下)来进行LNP与处于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触，并且可以涉及不同量的脂质纳米颗粒。而且，LNP可以接触不止一种哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“递送”意指将实体提供至终点。例如，向受试者递送治疗剂和/或预防剂可以涉及向受试者施用包括治疗剂和/或预防剂的LNP(例如，通过静脉内、肌内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用LNP可以涉及使一种或多种细胞与脂质纳米颗粒接触。
如本文所用，术语“增强递送”意指与通过对照纳米颗粒向目标靶组织(例如，MC3、KC2或DLinDMA)递送的治疗剂和/或预防剂的水平相比，通过纳米颗粒向目标靶组织递送更多(例如，多至少1.5倍，多至少2倍，多至少3倍，多至少4倍，多至少5倍，多至少6倍，多至少7倍，多至少8倍，多至少9倍，多至少10倍)的治疗剂和/或预防剂。可通过将组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量进行比较，将组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织的重量进行比较，将组织中产生的蛋白质的量与所述组织中总蛋白质的量进行比较，或者将组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织中总治疗剂和/或预防剂的量进行比较来测量纳米颗粒向特定组织的递送水平。将理解的是，不需要在治疗的受试者中确定纳米颗粒向靶组织的增强递送，可以在诸如动物模型(例如，大鼠模型)的替代物中确定。
如本文所用，术语“特异性递送”或“特异性地递送”意指与非靶组织(例如，哺乳动物的脾脏)相比，通过纳米颗粒向目标靶组织(例如，哺乳动物的肝脏)递送更多(例如，多至少1.5倍，多至少2倍，多至少3倍，多至少4倍，多至少5倍，多至少6倍，多至少7倍，多至少8倍，多至少9倍，多至少10倍)的治疗剂和/或预防剂。可通过将组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量进行比较，将组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织的重量进行比较，将组织中产生的蛋白质的量与所述组织中总蛋白质的量进行比较，或者将组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织中总治疗剂和/或预防剂的量进行比较来测量纳米颗粒向特定组织的递送水平。例如，对于肾血管靶向，如果在全身性施用治疗剂和/或预防剂后，与递送至肝脏和脾脏的相比，每1g组织多1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍或20倍的治疗剂和/或预防剂递送至肾脏，则是为哺乳动物肾脏特异性提供治疗剂和/或预防剂。将理解的是，不需要在治疗的受试者中确定纳米颗粒特异性递送至靶组织的能力，可以在诸如动物模型(例如，大鼠模型)的替代物中确定。
如本文所用，“包封效率”是指相对于用于制备LNP的治疗剂和/或预防剂的初始总量，成为LNP的一部分的治疗剂和/或预防剂的量。例如，如果在最初提供给组合物的总共100mg的治疗剂和/或预防剂中，97mg的治疗剂和/或预防剂包封在LNP中，则包封效率可以表示为97％。如本文所用，“包封”可以指完全、基本上或部分包围、限制、围绕或包裹。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中，例如在试管或反应器中，在细胞培养中，在培养皿中等，而不是在生物(例如，动物、植物或微生物)体内发生的事件。
如本文所用，术语“体内”是指在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
如本文所用，术语“离体”是指在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)外部发生的事件。离体事件可以在与自然(例如，体内)环境相比有最小变化的环境中发生。
如本文所用，术语“异构体”意指化合物的任何几何异构体、互变异构体、两性离子、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。化合物可以包括一个或多个手性中心和/或双键，因此可以作为立体异构体，诸如双键异构体(即，E/Z几何异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即(+)或(-))或顺/反异构体)存在。本公开涵盖本文所述化合物的任何和所有异构体，包括立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)及对映异构体和立体异构混合物，例如外消旋物。化合物的对映异构体和立体异构体混合物以及将其分解成其对映异构体或立体异构体组分的方法是众所周知的。
如本文所用，“脂质组分”是脂质纳米颗粒的包括一种或多种脂质的组分。例如，脂质组分可包括一种或多种阳离子/可电离、聚乙二醇化、结构脂质或其他脂质，诸如磷脂。
如本文所用，“接头”是连接两个部分的部分，例如，帽物质的两个核苷之间的连接。接头可包括一个或多个基团，包括但不限于磷酸基团(例如，磷酸酯、硼烷磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯和膦酸酯)、烷基基团、酰胺基团或甘油基团。例如，帽类似物的两个核苷可以在其5'位置通过三磷酸基团或通过包含两个磷酸部分和一个硼烷磷酸酯部分的链连接。
如本文所用，“施用方法”可包括静脉内、肌内、皮内、皮下或其他将组合物递送至受试者的方法。可以选择施用方法以靶向递送(例如，特异性递送)至身体的特定区域或系统。
如本文所用，“经修饰的”意指非天然的。例如，RNA可以是经修饰的RNA。即，RNA可以包括一个或多个非天然存在的核碱基、核苷、核苷酸或接头。“经修饰的”物质在本文中也可以称为“改变的”物质。可以在化学，结构或功能上对物质进行修饰或改变。例如，经修饰的核碱基物质可包括一个或多个非天然存在的取代。
如本文所用，“N:P比率”是脂质中的可电离(在生理pH范围内)的氮原子与RNA(例如在包括脂质成分和RNA的LNP中)的磷酸基团的摩尔比。
如本文所用，“脂质纳米颗粒”是包含一种或多种脂质的组合物。脂质纳米颗粒的大小通常为微米级或更小，并且可以包括脂质双层。除非另有说明，否则如本文所用的脂质纳米颗粒涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。例如，LNP可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。
如本文所用，“天然存在”意指在没人工辅助的情况下存在于自然界中。
如本文所用，“患者”是指可能寻求治疗或对治疗有需要，需要治疗，正在接受治疗，将要接受治疗的受试者，或在受过训练的专业人员针对特定疾病或病状的护理下的受试者。
如本文所用，“PEG脂质”或“PEG化脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用，没有过度毒性、刺激性、过敏响应或其他问题或并发症，符合合理的收益/风险比的那些化合物材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物以外，并且具有在患者中基本上无毒且非炎性的性质的任何成分(例如，能够悬浮、复合或溶解活性化合物的媒介物)。赋形剂可包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂及水合水。示例性的赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E(α-生育酚)、维生素C、木糖醇和本文公开的其他物质。
组合物还可包含一种或多种化合物的盐。盐可以是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱式盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸酯、新戊酸酯、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成本公开的药学上可接受的盐。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表可在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahland C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008，以及Berge等人，Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)中找到，其各自通过引用整体并入本文。
如本文所用，“磷脂”是包括磷酸酯部分和一条或多条碳链(诸如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可包括一个或多个多重(例如双或三)键(例如，一个或多个不饱和键)。磷脂或其类似物或衍生物可以包括胆碱。磷脂或其类似物或衍生物可以不包括胆碱。特定磷脂可以促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一个或多个带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质的组合物中的一种或多种要素穿过膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至细胞。
如本文所用，“多分散指数”是描述体系的粒度分布的均一性的比率。较小的值，例如小于0.3，指示窄的粒度分布。
如本文所用，两亲性“聚合物”是包含低聚物或聚合物的两亲性化合物。例如，两亲性聚合物可以包含低聚物片段，诸如两个或更多个PEG单体单元。例如，本文所述的两亲性聚合物可以是PS 20。
如本文所用，术语“多肽”或“目标多肽”是指可以天然产生(例如，分离或纯化)或合成产生的，通常通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。
如本文所用，“RNA”是指可以天然存在或非天然存在的核糖核酸。例如，RNA可以包括经修饰的和/或非天然存在的组分，诸如一个或多个核碱基、核苷、核苷酸或接头。RNA可以包括帽结构、链终止核苷、茎环、聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。RNA可以具有编码目标多肽的核苷酸序列。例如，RNA可以是信使RNA(mRNA)。编码特定多肽的mRNA的翻译，例如，mRNA在哺乳动物细胞内部的体内翻译，可以产生编码的多肽。RNA可以选自由以下组成的非限制组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、mRNA、长编码RNA(lncRNA)及其混合物。
如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/一次/单途径/单接触点，即单次施用事件施用的任何治疗剂的剂量。
如本文所用，“分次剂量”是将单一单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量。
如本文所用，“每日总剂量”是24小时内给予或规定的量。它可以作为单一单位剂量施用。
如本文所用，在脂质纳米颗粒的情况下，“大小”或“平均大小”意指LNP的平均直径。
如本文所用，术语“受试者”是指例如为了实验、诊断、预防和/或治疗目的向其施用根据本公开的组合物或制剂的任何生物。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人)和/或植物。
如本文所用，“靶向细胞”是指任何一种或多种目标细胞。可以在体外、体内、原位或生物的组织或器官中发现所述细胞。所述生物可以是动物，优选为哺乳动物，更优选为人且最优选为患者。
如本文所用，“靶组织”是指任何一种或多种目标组织类型，其中治疗剂和/或预防剂的递送将产生所需的生物学和/或药理作用。目标靶组织的实例包括特定的组织、器官和系统或其组。在特定应用中，靶组织可以是肾脏、肺部、脾脏、血管(例如，冠状动脉内或股动脉内)中的血管内皮，或肿瘤组织(例如，经由肿瘤内注射)。“非靶组织”是指其中编码的蛋白质的表达不会产生所需的生物学和/或药理作用的任何一种或多种组织类型。在特定应用中，非靶组织可以包括肝脏和脾脏。
术语“治疗剂”或“预防剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需的生物学和/或药理作用的任何药剂。治疗剂也称为“活性物质”或“活性剂”。此类试剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送的药剂(例如，核酸、药物、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)在施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时，足以治疗所述感染、疾病、病症和/或病状，改善其症状，对其进行诊断、预防，和/或延迟其发作的量。
如本文所用，“转染”是指将物质(例如，RNA)引入细胞。转染可以例如在体外，离体或在体内进行。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓和、改善、缓解、改良、解除特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度和/或减小其发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。为了降低发展与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险，可以向未表现出疾病、病症和/或病状的体征的受试者和/或向仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者施用治疗。
如本文所用，“ζ电位”是例如颗粒组合物中的脂质的电动电位。
在权利要求中，除非指出相反或从上下文中明显看出，否则冠词诸如“一”、“一个(种)”和“所述(该)”可以意指一个或一个以上。除非指出相反或从上下文中明显看出，否则如果组成员中的一个或一个以上或全部存在、用于给定的产品或过程中或在其他方面与给定的产品或过程相关，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是令人满意的。本公开包括其中确切地该组的一个成员存在、用于给定的产品或过程中或在其他方面与给定的产品或过程相关的实施方案。本公开包括其中组成员中的一个以上或全部存在、用于给定的产品或过程中或在其他方面与给定的产品或过程相关的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在为开放的，并容许但不要求包括附加要素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，因此也涵盖和公开了术语“基本上由......组成”和“由......组成”。在整个说明书中，在将组合物描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，考虑到组合物也基本上由所列举的组分组成或由所列举的组分组成。类似地，在将方法或过程描述为具有、包括或包含特定过程步骤的情况下，所述过程也基本上由所列举的处理步骤组成或由所列举的处理步骤组成。此外，应当理解，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序就无关紧要。而且，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
在给定范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指出或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则在本公开的不同实施方案中，以范围表示的值可以采用规定范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确指出，否则达到所述范围下限单位的十分之一。
另外，应当理解，可以从任何一项或多项权利要求中明确排除落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案。由于将此类实施方案认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使本文未明确地提出排除，也可以将它们排除。
引用的所有来源，例如参考文献、公开、专利申请、数据库、数据库条目和本文引用的技术，即使在引用中没有明确说明，也都通过引用并入本申请中。如果引用的来源与本申请的声明存在冲突，则以本申请中的声明为准。
实施例
实施例1：改变向脂质纳米颗粒添加PEG的方式
为了评价本公开的制造工艺对脂质纳米颗粒的效力和稳定性的影响，制备了五批纳米颗粒，如表1所汇总。
表1.脂质纳米颗粒批次汇总
Figure BDA0002426886470001481
研究了通过三种不同方法形成的LNP。LNP仅在颗粒形成工艺上有显著差异。在该实施例中，LNP包含50摩尔％的阳离子脂质、10摩尔％的DSPC、38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的PEG-DMG。所有LNP都是使用T型混合器，经由纳米沉淀反应形成的。然而，在纳米沉淀反应之后，使用了三种不同的程序(即，标准、后插入、后添加)。标准程序包括(i)溶于乙醇中的脂质与水溶液中的mRNA之间的纳米沉淀反应，(ii)切向流过滤，以及(iii)最终过滤步骤。对于标准程序，用于纳米沉淀反应的PEG-DMG的摩尔％为1.5摩尔％。
后插入程序包括(i)溶于乙醇中的脂质与水溶液中的mRNA之间的纳米沉淀反应，(ii)将所得颗粒暴露于包含一定重量百分比的PEG-DMG的溶液，(iii)切向流过滤，以及(iv)最终过滤步骤。纳米沉淀反应中使用的PEG-DMG的摩尔％根据颗粒形成后暴露步骤中使用的PEG-DMG的量而改变。当所得颗粒暴露于1.0摩尔％的PEG-DMG时，使用0.5摩尔％的PEG-DMG。当所得颗粒暴露于0.5摩尔％的PEG-DMG时，用于纳米沉淀反应中的PEG-DMG的摩尔％为1.0摩尔％。
后添加程序包括(i)溶于乙醇中的脂质与水溶液中的mRNA之间的纳米沉淀反应，(ii)切向流过滤，(iii)将过滤后的颗粒暴露于包含一定重量百分比的PEG-DMG的溶液，以及(iv)最终过滤步骤。纳米沉淀反应中使用的PEG-DMG的摩尔％根据过滤后暴露步骤中使用的PEG-DMG的量而改变。当过滤后的颗粒暴露于1.0摩尔％的PEG-DMG时，用于纳米沉淀反应中的PEG-DMG的摩尔％为0.5摩尔％。当过滤后的颗粒暴露于0.5摩尔％的PEG-DMG时，用于纳米沉淀反应中的PEG-DMG的摩尔％为1.0摩尔％。下表中显示了每种程序添加的PEG的量。
纳米颗粒包含最终摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DSPC:Chol:PEG-2。在t-混合期间添加1.5摩尔％的核(对照)；1.0摩尔％的核；或0.5摩尔％的核PEG。在经由后插入工艺制备的纳米颗粒中，在切向流过滤(TFF)之前，将PEG水平调节至1.5摩尔％。在经由后添加工艺制备的纳米颗粒中，在无菌过滤之前将PEG水平调节至1.5摩尔％。将100mMTris pH 7.4用作渗滤缓冲液，并将93mM tris 7.0w％PG+1mM DTPApH 7.4用作最终缓冲液。最终脂质组成汇总于表2中。
表2.最终脂质的定量组成
Figure BDA0002426886470001501
体内研究
对于体内研究，如表3所汇总的那样，为雌性Balb/C小鼠给药。并通过gB ELISA和五聚物ELISA进行分析。
表3.体内实验参数
Figure BDA0002426886470001502
粒度评价
以各种方式，例如动态光散射或经由纳米颗粒跟踪分析来研究添加PEG对粒度的影响。参见图17和18。还经由小角度X射线散射(SAXS)对脂质进行评价。基于散射曲线发现没有样品显示出明显的核-壳结构。对于不同的工艺而言，LNP大小不同：第1批～第2批<第3批～第4批<第5批，这也从距离分布函数中显示出来。第1批和第2批的直径估计为约35nm，第3批和第4批的直径为约40nm，并且第5批的直径为约52nm。SAXS光谱显示出球形结构。测定所有批次的内毒素水平，并发现均较低(表4)。
表4.第1-5批纳米颗粒中的内毒素水平
批次 内毒素(EU/mL)
1 1.4
2 1.2
3 0
4 0
5 0
实施例2：激素蛋白的药代动力学研究
评价表5中汇总的工艺对包含可电离脂质和PEG-1的纳米颗粒组合物中的mRNA的体内表达的影响。汇总的研究设计：静脉推注，单剂量，0.5mpk，N＝4只大鼠/组，用于蛋白PK的日血液收集(给药前作为阴性对照)。激素蛋白是分泌蛋白，因此通过血浆中的激素蛋白定量来测试mRNA表达。结果示于图37中。
表5.制备包含可电离脂质和PEG-1的组合物的生产工艺的概述
Figure BDA0002426886470001511
实施例3：后插入和后添加对mRNA LNP制剂的效力和稳定性的影响
为了评价本公开的制造工艺对脂质纳米颗粒的效力和稳定性的影响，用不同的后插入和/或后添加条件制备另外的LNP制剂。测试了这些LNP制剂的膜渗透性、稳定性、更新和/或体外或体内表达。参见，例如图1A-1C、2A-2C、3A-3B、4A-4B、5A-5B、6A-6G、7A-7C、8-10、11A-11B、12A-12B、13A-13B、14-26、27A-27B、28、29A-29B、30A-30B、31A-31B、32A-32B、33A-33C、34A-34C、35-39、40、41-46、47A-47B、48、52A-52F和57-59。
实施例4：用于测定包封效率的离子交换色谱
开发了IEX方法以分离游离mRNA对比LNP包封的mRNA。使用示例性方法，LNP在空隙中洗脱并且mRNA在梯度从低到高盐浓度变化时洗脱。图49A-49B中描绘了代表性的分离。图49A描述了基于mRNA制剂缓冲液条件改变的包封效率。图49B描述了基于mRNA制剂盐浓度改变的包封效率。
使用以下方法条件将编码感染性疾病抗原的包封mRNA与游离mRNA分离。
缓冲液A 25mM NaOH/甘氨酸
缓冲液B 25mM NaOH/甘氨酸(含750mM NaCl)
柱 Proswift WAX-1S
流速 0.7mL/分钟
运行时间 4分钟
梯度如下：
Figure BDA0002426886470001521
Figure BDA0002426886470001531
实施例5：如通过IEX测定的包封效率与生物活性的相关性
根据SEC对包封mRNA疫苗组合物的LNP进行分级分离，然后进行二维分析(SEC级分的生理化学分析)。根据动态光散射测定粒度。根据以下测定SEC上整个峰的mRNA质量％：mRNA的质量％＝级分的浓度*收集的级分体积/收率。
对级分进行体外表达测定和包封效率测定。图50中的数据显示可及性或保留在IEX柱上的mRNA％与体外蛋白质表达(负)相关。
实施例6：mRNA的包封百分比
使用4.6x 50mm Proswift WAX-1S弱阴离子交换柱，在25mM氢氧化钠和甘氨酸缓冲液中，使用氯化钠盐梯度洗脱可及性RNA，测定脂质纳米颗粒中mRNA的包封％。使用10mMTRIS-HCL 1mM EDTA缓冲液将样品稀释至0.1mg/mL RNA的目标浓度，并且用外部参考标准品定量可及性RNA峰。方法如表中所示。
Figure BDA0002426886470001532
Figure BDA0002426886470001541
计算：
Figure BDA0002426886470001542
Figure BDA0002426886470001543
Figure BDA0002426886470001544
Figure BDA0002426886470001545
可及性RNA-这是在非变性条件下稀释制剂并根据方法条件进行测定时可定量的RNA浓度。这种RNA代表游离的或与脂质松散缔合的mRNA的组合。
总RNA-这是在变性条件下稀释制剂时可定量的RNA浓度。这种RNA代表包封的、松散缔合的和游离的RNA。
未保留的LNP-这是在柱的空隙中洗脱的未保留的材料。可能由处于包封状态的mRNA组成，其牢固缔合并且缺乏用于保留显著表面电荷。
Ribogreen测定不能区分原型制剂，并显示它们处于相同的包封状态，如图51中的体外表达图和图52中的体内免疫原性图所示。可能Ribogreen只能检测真正的游离RNA，而不能区分松散的或结构不良的包封状态。通过弱阴离子交换色谱测定的包封效率可以区分制剂，并与下面所示的体外表达数据相当好地关联。下表示出了图51中组合物使用Ribogreen和使用AEX测定的包封百分比。
Figure BDA0002426886470001551
通过阴离子交换色谱和体外表达，评估具有不同包封效率的示例性制剂SEC级分。使用尺寸排阻色谱将两个批次分级分离，并表征生理化学特征和生物活性。SEC级分的包封状态通过弱离子交换色谱改变，并且与体外表达良好相关，如图53和54所示。
通过阴离子交换色谱和体外表达，评估具有不同包封效率的示例性细胞因子原型制剂。数据示于图55中(x轴＝以pg/ml计的细胞因子表达)。
通过阴离子交换色谱和体外表达，评估具有不同包封效率的示例性的编码细胞因子的RNA制剂-SEC级分。
使用尺寸排阻色谱分级分离细胞因子RNA批次，并表征其生理化学特性和生物活性。SEC级分的包封状态通过弱离子交换色谱改变，并与体外表达良好相关。数据示于图56中(x轴＝以pg/ml计的细胞因子表达)。
等效方案
应当理解，虽然已经结合本公开的详细描述对本公开进行了描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变在以下权利要求的范围内。

Claims (95)

1.一种产生核酸脂质纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：
混合包含可电离脂质的脂质溶液与包含核酸的溶液，从而形成前体核酸脂质纳米颗粒；
将包含改性剂的脂质纳米颗粒改性物添加到所述前体核酸脂质纳米颗粒，从而形成改性的核酸脂质纳米颗粒；并且
加工所述前体核酸脂质纳米颗粒、所述改性的核酸脂质纳米颗粒或两者，从而形成所述核酸脂质纳米颗粒组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前未经加工。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒在添加所述脂质纳米颗粒改性物之前经过加工。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质溶液还包含第一PEG脂质。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含第一PEG脂质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质溶液不包含任何PEG脂质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒不包含任何PEG脂质。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含磷脂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒还包含结构脂质。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性剂是选自由第二PEG脂质和表面活性剂组成的组的至少一种剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性剂为第二PEG脂质。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性剂为表面活性剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质与所述改性剂的摩尔比在约1:100至约1:1，约1:50至约1:1，约1:25至约1:1或约1:10至约1:1的范围内。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合包括湍流混合和/或微流体混合。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加工包括过滤；任选地，其中所述加工包括切向流过滤。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加工包括冷冻和/或冻干。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括包装所述核酸脂质纳米颗粒组合物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质相同。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质不相同。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二PEG脂质与所述第一PEG脂质的摩尔比在约1:1至约100:1或1:1至约10:1的范围内。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒包含：
约30-60摩尔％的可电离脂质；
约0-30摩尔％的磷脂；
约15-50摩尔％的结构脂质；和
约0.01-10摩尔％的所述第一PEG脂质。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒包含：
约30-60摩尔％的可电离脂质；
约0-30摩尔％的磷脂；
约15-50摩尔％的结构脂质；和
约0.01-1摩尔％的所述第一PEG脂质。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物包含：
约30-60摩尔％的可电离脂质；
约0-30摩尔％的磷脂；
约15-50摩尔％的结构脂质；和
总量约0.01-20摩尔％的所述第一PEG脂质和第二PEG脂质。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物包含：
约40-60摩尔％的可电离脂质；
约5-15摩尔％的磷脂；
约35-45摩尔％的结构脂质；
总量约0.5-3.0摩尔％的所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒中约90％至约100％，约95％至约100％，或约98％至约100％的所述核酸与所述可电离脂质缔合。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体核酸脂质纳米颗粒中的所述核酸全部与所述可电离脂质缔合。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物中约90％至约100％，约95％至约100％，或约98％至约100％的所述核酸与所述可电离脂质缔合。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物中的所述核酸全部与所述可电离脂质缔合。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物包含包封所述核酸的改性脂质纳米颗粒。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性的核酸脂质纳米颗粒包含包封所述核酸的改性脂质纳米颗粒。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性的核酸脂质纳米颗粒包含与所述改性剂缔合的改性脂质纳米颗粒。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物包含与所述改性剂缔合的改性脂质纳米颗粒。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性脂质纳米颗粒经由一个或多个共价键与所述改性剂缔合。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性脂质纳米颗粒经由一种或多种非共价相互作用与所述改性剂缔合。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述改性脂质纳米颗粒与所述核酸的重量/重量比在约10:1至约60:1的范围内。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为选自由以下组成的组的至少一种PEG脂质：PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰甘油和PEG改性的二烷基甘油。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-I)的化合物：
Figure FDA0002426886460000051
或其盐，其中：
R3为-OR°；
R°为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为介于1至100之间，包括1和100的整数；
L1为任选取代的C1-10亚烷基，其中所述任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式
Figure FDA0002426886460000061
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中所述任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、-OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、-OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或-N(RN)S(O)2O置换；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-I-OH)的化合物：
Figure FDA0002426886460000071
或其盐。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-II)的化合物：
Figure FDA0002426886460000072
或其盐，其中：
R3为-OR°；
R°为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为介于1至100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基基团被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、-NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、-N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-II-OH)的化合物：
Figure FDA0002426886460000081
或其盐，其中：
r为介于1至100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基基团被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、-NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、-NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、-N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中r为介于40至50之间的整数。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中r为45。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R5为C17烷基。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-II)的化合物：
Figure FDA0002426886460000091
或其盐。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-II)的化合物：
Figure FDA0002426886460000092
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为式(PL-III)的化合物：
Figure FDA0002426886460000093
或其盐或异构体，其中s是介于1至100之间的整数。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一PEG脂质和所述第二PEG脂质各自独立地为下式的化合物：
Figure FDA0002426886460000094
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂为两亲性聚合物。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是选自由聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、脱水山梨醇及其衍生物组成的组的至少一种表面活性剂。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇醚为式(S-1)的化合物：
Figure FDA0002426886460000101
或其盐和/或异构体；其中
t为介于1至100之间的整数；并且
R1BRIJ为C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且
任选地，R5PEG的一个或多个亚甲基基团独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(0)N(RN)-、-C(O)O、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
其中RN的每个实例独立地为氢、C1-6烷基或氮保护基。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R1BRIJ为C18烷基。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇醚为式(S-1a)的化合物：
Figure FDA0002426886460000111
或其盐和/或异构体；其中s为介于1至100之间的整数。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R1BRIJ为C18烯基。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇醚为式(S-1b)的化合物：
Figure FDA0002426886460000112
或其盐和/或异构体；其中s为介于1至100之间的整数。
56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆是选自由以下组成的组的至少一种泊洛沙姆：泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403和泊洛沙姆407。
57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚山梨醇酯是选自由以下组成的组的至少一种聚山梨醇酯：
Figure FDA0002426886460000113
20、
Figure FDA0002426886460000114
40、
Figure FDA0002426886460000115
60和
Figure FDA0002426886460000116
80。
58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱水山梨醇是选自由以下组成的组的至少一种脱水山梨醇：
Figure FDA0002426886460000121
20、
Figure FDA0002426886460000122
60、
Figure FDA0002426886460000123
65、
Figure FDA0002426886460000124
80和
Figure FDA0002426886460000125
85。
59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是选自由以下组成的组的至少一种脂质：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其衍生物。
60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磷脂是选自由以下组成的组的至少一种脂质：
1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)，
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，
1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)，
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)，
1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)，
1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)，
1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)，
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)，
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，
1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)，
神经鞘磷脂及其衍生物。
61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质包含可电离氨基脂质。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-1)的化合物：
Figure FDA0002426886460000131
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IA)的化合物：
Figure FDA0002426886460000151
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IB)的化合物：
Figure FDA0002426886460000161
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中所有变量如本文所定义。在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-II)的化合物：
Figure FDA0002426886460000162
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIa)的化合物：
Figure FDA0002426886460000171
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIb)的化合物：
Figure FDA0002426886460000172
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
68.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIc)或(IL-IIe)的化合物：
Figure FDA0002426886460000173
或
Figure FDA0002426886460000181
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中R4如本文所定义。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIf)的化合物：
Figure FDA0002426886460000182
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基和C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IId)的化合物：
Figure FDA0002426886460000183
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R2至R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3中的每一个可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIg)的化合物：
Figure FDA0002426886460000191
或其N-氧化物，或盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”为C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如，C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质为
Figure FDA0002426886460000192
或其盐。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质为
Figure FDA0002426886460000193
或其盐。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质为
Figure FDA0002426886460000194
或其盐。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质为
Figure FDA0002426886460000201
或其盐。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-III)的化合物：
Figure FDA0002426886460000202
或其盐或异构体，其中，
W为
Figure FDA0002426886460000203
环A为
Figure FDA0002426886460000204
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由以下组成的组：-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基基团和杂芳基基团；
M*为C1-6烷基；
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由以下组成的组：键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n为1-6的整数；
其中当环A为
Figure FDA0002426886460000211
时，则
i)X1、X2和X3中的至少一个不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-R”MR’。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是式(IL-IIIa1)-(IL-IIIa8)中任一个的化合物：
Figure FDA0002426886460000221
Figure FDA0002426886460000231
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是
Figure FDA0002426886460000232
或其盐。
79.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是选自由以下组成的组的至少一种脂质：
3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)，
N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)，14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)，
1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLin-DMA)，
2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)，
4-(二甲氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-MC3-DMA)，
2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)，
1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)，
2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)，
(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))，和
(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸是选自由以下组成的组的至少一种核糖核酸：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长的非编码RNA(lncRNA)。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括选自由以下组成的组的至少一个基序：茎环、链终止核苷、聚A序列、多腺苷酸化信号和5’帽结构。
84.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸适于基因组编辑技术。
85.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑技术是规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)或转录激活物样效应核酸酶(TALEN)。
86.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是选自由以下组成的组的适于基因组编辑技术的至少一种核酸：CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、单引导RNA(sgRNA)和DNA修复模板。
87.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA长度为至少30个核苷酸。
88.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA长度为至少300个核苷酸。
89.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物的包封效率为至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％。
90.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸脂质纳米颗粒组合物的平均尺寸在约50nm至约150nm的范围内。
91.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用离子交换(IEX)色谱测定产生包封在所述核酸脂质纳米颗粒组合物中的所述核酸的量的定量值。
92.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的前体核酸脂质纳米颗粒。
93.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的核酸脂质纳米颗粒组合物。
94.根据前述权利要求中任一项所述的核酸脂质纳米颗粒组合物，其中正如通过离子交换色谱(IEX)测定所确定的，所述LNP组合物中至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约95％或至少约95％的LNP有mRNA包封在其中。
95.一种表征核酸脂质纳米颗粒组合物的方法，其包括使用离子交换(IEX)色谱测定产生包封在所述核酸脂质纳米颗粒组合物中的所述核酸的量的定量值。
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