FR2833840A1

FR2833840A1 - Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires

Info

Publication number: FR2833840A1
Application number: FR0208606A
Authority: FR
Inventors: Lionel Bueno
Original assignee: Rytek Sarl
Current assignee: Rytek Sarl
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2003-06-27
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: US20050019314A1; TW200305447A; AR038042A1; AU2002364679A8; EP1455767A2; US20030125321A1; AU2002364679A1; FR2833840B1; PA8562701A1; SV2003001439A; PE20030853A1; WO2003053422A3; UY27589A1; WO2003053422A2; CA2470442A1

Abstract

La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires, notamment des entérocytes. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notamment les humains.

Description

METHODES ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE
PATHOLOGIES RESPIRATOIRES La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires, notamment des entérocytes. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notamment les humains.

L'épithélium pulmonaire est le centre d'échanges très importants entre le milieu extérieur et l'organisme. Ces échanges peuvent s'effectuer soit à travers les cellules de l'épithélium, soit par des réseaux parallèles. Ainsi, le transport d'eau ou d'électrolytes, ou encore l'absorption de petites molécules (poids moléculaire généralement inférieur à 1000 Da environ) au niveau de la muqueuse gastrique, intestinale ou colique, s'effectue par voie transcellulaire, à travers les cellules épithéliales ou entérocytes. Par contre, l'absorption de grosses molécules et le passage de toxines ou de cellules immunitaires se fait principalement par voie paracellulaire, au niveau de jonctions serrées , qui sont disposées entre les cellules épithéliales.

Les jonctions serrées épithéliales (ou tight junction , TJ ) sont des structures de liaison entre les cellules bordant les épithéliums muqueux (tube digestif, poumons). Ces structures assurent et contrôlent le transport trans-épithélial paracellulaire, de l'extérieur vers la sous-muqueuse, de macromolécules variées (irritants, microorganismes). Ces structures permettent également la migration de cellules immunitaires (e.g., immunocytes) vers l'extérieur. Les jonctions serrées

sont des structures souples constituées d'un assemblage complexe de protéines transmembranaires (occludines, claudines) et de protéines cytoplasmiques (protéines zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3, protéines AF7, cinguline ou 7H6, etc. ), qui sont associées à des éléments du cytosquelette (filaments de myosine, d'actine, etc. ).

Dans des conditions physiologiques, le degré d'ouverture partielle de ces jonctions serrées permet au système immunitaire local d'être renseigné sur la nature ou sur la qualité du contenu des voies aériennes.

Si l'épithélium intestinal et la structure des jonctions serrées de celui-ci ont été étudiés dans l'art antérieur, il existe aujourd'hui moins d'informations concernant l'épithélium pulmonaire et le fonctionnement des jonctions serrées.

Le processus de sensibilisation aux allergènes est un facteur de risque très important dans le développement des allergies et de l'asthme. Toutefois, les mécanismes par lesquels des allergènes sont capables d'initier le phénomène de sensibilisation ne sont pas clairement documentés in vivo. Lorsque des allergènes sont inhalés, ils entrent en contact avec la paroi épithéliale pulmonaire qui empêche leur introduction dans l'organisme et leur mise en contact avec les cellules de l'immunité. Toutefois, pour qu'une sensibilité se développe, cela implique que certains allergènes sont capables de traverser cet épithélium pour interagir avec les cellules immunitaires. Les conditions dans lesquelles ce transfert est possible demeurent peu documentées in vivo. Ainsi, bien que certains rapports suggèrent, sur des cultures de cellules in vitro, un rôle des jonctions serrées dans ce processus, aucune démonstration n'a été apportée de l'implication de ces jonctions in vivo dans le développement d'une sensibilisation. De même, si Gordon et al (Exp. Lung Res. 24 (1998) 659) suggèrent un effet protecteur de la taurine sur les onctions serrées, aucun résultat présenté n' établit de corrélation

entre les jonctions serrées et un processus de sensibilisation ou de transfert d'allergènes à travers l'épithélium pulmonaire.

Une corrélation entre l'état d'ouverture des jonctions serrées et la réponse à des allergènes d' origine aérienne a été suggérée au travers d'études expérimentales (WAK et al. 1999) et par la mise en évidence chez le sujet asthmatique d'une corrélation entre la largeur des espaces extracellulaires et le seuil de réponse respiratoire à l'inhalation d'acétylcholine (OHASHI et al. 1990). Cependant, ces observations préliminaires n'ont pas été confirmées ou n'ont pas donné lieu à de nouvelles approches thérapeutiques.

La présente demande résulte de la mise en évidence d'un rôle in vivo des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire dans le processus de sensibilisation aux allergènes. La présente demande découle également de la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de pathologies respiratoires, basées sur une modulation de la perméabilité para-cellulaire de l'épithélium pulmonaire. En particulier, la présente demande propose, pour la première fois, une approche thérapeutique des pathologies respiratoires basée sur l'emploi de composés ou conditions permettant de moduler la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. Cette approche permet notamment de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium.

Cette stratégie permet de réguler la perméabilité de l'épithélium pulmonaire de manière spécifique, fine et réactive, et ainsi d'agir sur le transfert d'allergènes vers les cellules de l'immunité. Cette stratégie est particulièrement adaptée à l'obtention d'un effet biologique rapide et contrôlable dans le temps (réversible).

A cet égard, les résultats présentés dans la demande montrent qu'une substance susceptible de relâcher les jonctions serrées épithéliales (peptide activateur du

récepteur PAR-2) favorise l'accumulation alvéolaire de neutrophiles et éosinophiles, comme cela est observé dans les maladies broncho-pulmonaires telles que l'asthme. Les résultats obtenus montrent également qu'une substance chimique capable de réduire la perméabilité des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire empêche l'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles. Ces résultats apportent la preuve que des molécules, agents, conditions ou procédés susceptibles de réduire ou supprimer l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium alvéolaire ou bronchique pulmonaire offrent un intérêt dans le traitement des affections pulmonaires, notamment celles caractérisées par l'accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, en particulier l'asthme.

Un premier objet de l'invention réside donc plus particulièrement dans l'utilisation d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires.

Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires.

L'invention repose ainsi sur l'utilisation de composés modulant la tension et l'état de contraction du cytosquelette des cellules de l'épithélium pulmonaire. Comme indiqué plus avant, cette approche permet de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium.

Les protéines composant les jonctions serrées sont associées au cytosquelette des cellules qu'elles relient. Il est proposé dans le cadre de l'invention que la tension du cytosquelette puisse être modulée chez des sujets atteints de maladies ou désordres respiratoires pour agir de manière non destructrice et transitoire sur la perméabilité de leur épithélium pulmonaire. Ainsi, la contraction du cytosquelette doit favoriser l'ouverture des jonctions serrées, tandis qu'un relâchement du cytosquelette (ou qu'une inhibition de la contraction) doit favoriser la fermeture des jonctions.

On utilise donc préférentiellement dans le cadre de l'invention des composés (ou conditions) qui modulent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires (notamment humaines). Selon la condition à traiter, on utilise des composés qui inhibent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, ou qui activent ou favorisent celle-ci.

L'activité du composé sur la tension du cytosquelette peut être directe ou indirecte, c'est-à-dire dirigée sur les constituants mêmes du cytosquelette ou sur des régulateurs de sa tension. Bien que non limitatif, on préfère les composés agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette. En outre, on préfère également des composés présentant une activité sélective sur la tension du cytosquelette, c'est-à-dire typiquement des composés qui n'affectent pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées.

Un composé est considéré comme modulant la tension du cytosquelette lorsqu'il module l'ouverture des jonctions serrées. Un effet inhibiteur de la contraction ne doit pas nécessairement être complet ou total, mais il suffit qu'il diminue la contraction suffisamment pour réduire l'ouverture des jonctions serrées correspondant à une diminution minimale d'environ 30% de la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, préférentiellement d'environ 40%, de façon plus préférée d'environ 50%.

Différents types de composés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente demande. Ainsi, au sens de l'invention, le terme composé doit être pris dans un sens large, c'est-à-dire comme désignant tout agent, substance, composition, condition, traitement ou procédé permettant de moduler la tension du cytosquelette. Il s'agit avantageusement d'un agent (e. g., d'une molécule) ou d'une combinaison ou association de molécules.

Selon un premier mode de réalisation préféré, on utilise des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la dégradation de l'actine.

Un mode particulièrement préféré de mise en #uvre de l' invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de la contraction de la chaîne légère de la myosine ou de la dégradation de l'actine.

Des exemples de tels composés sont notamment des inhibiteurs de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCK). Il est à noter que les travaux rapportés dans l'art antérieur portent plutôt sur l'utilisation de composés destinés à ouvrir les jonctions serrées au niveau intestinal, pour favoriser le passage de grosses molécules, alors que la présente invention vise plus préférentiellement à exercer une activité opposée, destinée à diminuer la perméabilité des jonctions.

Un exemple particulier d'inhibiteurs sélectif de MLCK est le composé ML-7 {1-

(5-iodonaphtalène-l-sulfonyl)-lH-hexahydro-l,4-diazepine} (Makishima M. et al. FEBS Lett. 1991 ; D'autres exemples de tels inhibiteurs sont notamment le composé ML-9 (Wilson DP.et al. J Biol Chem. 2001;13: 165) ou d'autres non sélectifs: Wortmannin (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93), H- 7 (Piao Zf et al. Mol Cell Biol Res Commun 2001;4: 307-12) et KT 7692 (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93).

D'autres cibles agissant sur la tension du cytosquelette sont notamment les protéines de liaison à la myosine, telles que par exemple la cinguline, ou les molécules de jonction, telles que la cadherine-E, la catenine-a ou les desmosomes. La modulation de l'activité ou de l'expression de ces protéines permet de réguler la tension du cytosquelette, dans le cadre de la présente invention.

Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un modulateur (notamment d'un inhibiteur) de l'activité ou de la structure ou de l'expression des molécules du cytosquelette. Le composé peut être par exemple un acide nucléique antisens, une molécule synthétique, un fragment d'anticorps, etc.

Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des composés inhibiteurs de la synthèse de protéines ou autres molécules assurant la liaison entre les protéines du cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. Parmi les protéines des jonctions serrées, on peut citer notamment les protéines occludines, claudines, ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF7 et 7H6. Un moyen selon l'invention de moduler l'ouverture ou la fermeture des jonctions serrées réside donc dans la régulation de la synthèse des protéines de liaison entre le cytosquelette et les protéines des j onctions serrées. En stimulant cette synthèse, il est attendu un renforcement des liaisons entre lesonctions serrées et le cytosquelette, conduisant à une plus faible perméabilité de l'épithélium.

D'autres composés utilisables dans le cadre de l'invention sont par exemple des inhibiteurs de kinases activées par les mitogènes (MAPKK), notamment de la kinase MEK1 ou de la kinase-PI3, tels que les composés PD098,059 {2-(Amino- 3-methoxyphenyl)-4H-l-benzopyran-4-one}(Alessi et al. J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) ou LY294002 {2-(4-Morpholinyl)-8phenil-l(4H)-benzopyran-4-one} (Vlahos et al.J.Biol.Chem 1994 ;269: 5241).

D'autres molécules utilisables pour réguler, de manière indirecte, la tension du cytosquelette, sont des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance hépatique (HGF), le facteur de croissance endothélial (EGF) ou certaines cytokines susceptibles d'être libérées par les immunocytes, telles que les interleukines-1, -4,-13, ou les facteurs tels que IGF-1ou l'interféron gamma.

Une autre approche permettant de réguler de manière indirecte la tension du cytosquelette repose sur l'utilisation de la taurine ou du peptide GLP2 ( glucagon-like peptide 2 ) ou encore des dérivés de ces dernier, qui peuvent permettre d'altérer la perméabilité de l'épithélium pulmonaire par un effet indirect sur la contraction du cytosquelette. De même, certaines molécules agissant sur des récepteurs situés au pôle apical des cellules épithéliales (ex: récepteurs aux protéinases; PAR-2) peuvent agir indirectement sur le cytosquelette.

Un mode préféré de mise en #uvre de l'invention comprend l'utilisation d'agents agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette, notamment de molécules inhibitrices de la contraction du cytosquelette, en particulier de molécules inhibitrices de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou inhibitrices de la dégradation de l'actine.

Comme indiqué ci-avant, les composés utilisés sont avantageusement des molécules, qui peuvent être sous forme isolée ou sous forme de combinaison, d'extraits biologiques, etc. Ces molécules peuvent être synthétiques, semisynthétiques ou biologiques, notamment d'origine animale, virale, végétale ou bactérienne.

La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de pathologies ou désordres du système respiratoire, notamment de l'asthme, des

allergies, des pathologies obstructives (bronchites, bronchiolites, emphysème, etc), notamment lorsque ces pathologies ont un caractère chronique ou sévère.

Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif de l'asthme ou de diverses allergies (poussières, pollens, pollution, etc. ) ainsi qu'au traitement local d'inflammations pulmonaires. Elle est utilisable de manière préventive chez des sujets présentant des prédispositions ou une sensibilité à ce type de désordres, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des périodes plus longues. Les compositions et méthodes de l'invention permettent de réduire la souffrance ou les difficultés respiratoires des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.

Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler, notamment à réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithelium pulmonaire chez des sujets atteints de maladies respiratoires, notamment d'affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d' éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires, notamment aux affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire, notamment d'une

affection pulmonaire caractérisée par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.

L'invention est également relative à des méthodes de traitement des conditions indiquées ci-dessus, comprenant l'administration à un sujet atteint d'une pathologie respiratoire ou sensible aux pathologies respiratoires, d'un composé ou traitement tel que défini ci-avant. De préférence, le composé ou traitement est administré dans une dose efficace pour réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithelium pulmonaire et/ou pour réduire la sensibilisation aux allergènes et/ou pour réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon.

Le composé peut être administré par différentes voies et sous différentes formes. Ainsi, le composé peut être sous forme liquide, solide ou en aérosol, typiquement sous forme de comprimé, gélule, aérosol, ampoule ou soluté buvable, solution injectable, etc. On préfère des composés formulés sous une forme administrable par voie locale (e. g., dans les voies aériennes (e.g., respiratoires)) ou par voie orale (solutés buvables, comprimés, ampoules, sirops, sprays, etc. ). Le conditionnement en aérosol est particulièrement préféré, lorsque cela est possible.

Bien entendu, d'autres formes d'administration sont possibles, comme des injections (intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, etc. ), des pâtes, gels, suppositoires, etc.

Les composés peuvent être utilisés seuls ou en combinaisons et/ou en association avec d'autres agents actifs, comme par exemple d'autres substances actives utilisées dans le traitement des maladies respiratoires. On peut citer par exemple les agonistes-(32 et les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes, les antileukotrienes, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.

Un autre objet de l'invention réside dans un produit ou une association pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-(32, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotriènes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.

Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée préférentiellement pour une administration par voie orale ou aérienne. De préférence, la composition est sous forme d'aérosol et comporte un gaz porteur, ou sous forme de solution buvable.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

LEGENDE DES FIGURES : Figure 1 : du ML-7 sur l'augmentation de la perméabilité paracellulaire pulmonaire de la sérum albumine humaine marquée à l' I125 induite par la perfusion intra-trachéale de LPS de Pseudomonas aeruginosa. Le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des LBAs alors que, comparés aux témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons.

Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un prétraitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité tant au niveau des LBAs que des poumons ont été mesurées chez ces animaux.

EXEMPLES : Exemple 1 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par la taurine L'épithélium bronchique et alvéolaire possède des structures de liaison des cellules épithéliales qui assurent un passage contrôlé des immunocytes dans les voies aériennes. Cet exemple montre que certaines molécules connues pour leur effet d'augmentation de la perméabilité paracellulaire au niveau intestinal tel que le SLIGRL favorisent l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes (neutrophiles, macrophage) et que cet effet peut être prévenu (e. g., inhibé, réduit) par un traitement oral par la taurine.

Pour ce faire, quatre lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu pendant 10 jours une eau de boisson contenant (lots 1 et 2) ou ne contenant pas (lots 3 et 4) de la taurine (5 %).

Au temps t = 10 j, les 4 lots d'animaux sont soumis à l'instillation intranasale lente de 200 l de sérum physiologique contenant (lots 2 et 4) ou ne contenant (lots 1 et 3) 0,2 mg de SLIGRL.

Au temps t = 3 h après l'instillation intra-nasale, les animaux ont été anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.

Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 1 ci-après.

Ces résultats montrent que l'instillation intranasale du SLIGRL entraîne, à t = 3 h., l'accumulation d'éosinophiles et de neutrophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL) chez les animaux contrôles mais pas chez ceux ayant reçu la taurine (tableau 1). Ces résultats confirment in vivo l'implication des j onctions serrées dans la perméabilité aux immunocytes de l'épithélium pulmonaire.

Tableau 1 : Influence de la Taurine sur le niveau d'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intrasanale de SLIGRL chez le rat (moyennes SD ; n = 10)

<tb>
<tb> PAR <SEP> 2 <SEP> (0,2 <SEP> mg/kg <SEP> IN <SEP> Taurine <SEP> 10 <SEP> % <SEP> + <SEP> PAR
<tb> (mean <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 0,9 <SEP> % <SEP> PAR <SEP> 2 <SEP> NaCl <SEP> 0,9 <SEP> % <SEP> PAR <SEP> 2
<tb> SEM
<tb> Tot.
<tb>

Leucocytes <SEP> 960 <SEP> 112 <SEP> 6464 <SEP> 99 <SEP> + <SEP> 1728 <SEP> 111 <SEP> 2086 <SEP> ~ <SEP> 134 <SEP> *
<tb> (mm3)
<tb> Macrophages <SEP> 945 <SEP> ~ <SEP> 25 <SEP> 5559 <SEP> ~ <SEP> 63+ <SEP> 1651 <SEP> ~ <SEP> 72 <SEP> 1967 <SEP> ~ <SEP> 103*
<tb> (mm3)
<tb> Neutrophiles <SEP> 4 <SEP> :!:: <SEP> 656 <SEP> + <SEP> 34 <SEP> :!:: <SEP> *
<tb> 4 <SEP> ~ <SEP> 0,3 <SEP> 656 <SEP> ~ <SEP> 41+ <SEP> 34 <SEP> ~ <SEP> 3 <SEP> 34 <SEP> ~ <SEP> 3*
<tb> Eosinophiles
<tb> 0,2 <SEP> ~ <SEP> 0,7 <SEP> 32 <SEP> ~ <SEP> 2+ <SEP> 17 <SEP> ~ <SEP> 1 <SEP> 17 <SEP> ~ <SEP> 1*
<tb> (mm3) <SEP> z0,7 <SEP> 32+2 <SEP> 17+ <SEP> 17+
<tb> Lymphocytes144 <SEP> 297 <SEP> 22 <SEP> 22
<tb> 144 <SEP> ~ <SEP> 11 <SEP> 297 <SEP> ~ <SEP> 28 <SEP> 22 <SEP> ~ <SEP> 8 <SEP> 22 <SEP> ~ <SEP> 8
<tb> (mm3)
<tb>
* p < 0,05 from PAR 2 values ; : p < 0,05 from NaCl values ; IN : in intranasal

Exemple 2 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le ML-7 Cet exemple montre que le ML-7 réduit l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes observée après perfusion intratrachéale de taurocholate associée à l'ouverture desonctions serrées.

Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le ML-7 par voie IP à la dose de 1 mg/kg/12h pendant 36 heures soit son solvant. Une heure après la dernière injection, une instillation intratrachéale lente de 200 l de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 50 mM de taurocholate.

Au temps t = 2 h après l'instillation intratrachéale, les animaux ont été anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.

Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-après. Ils montrent que le composé ML-7 permet de réduire de manière significative l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes.

Tableau 2 : du ML-7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytesdans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intratrachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes SD ; n = 8)

<tb>
<tb> Témoin <SEP> Taurocholate <SEP> ML-7 <SEP> +
<tb> Taurocholate
<tb> Leucocytes <SEP> 4032 <SEP> 919 <SEP> 35200 <SEP> 12708* <SEP> 4160 <SEP> 573 <SEP>
<tb> Macrophages <SEP> 3419 <SEP> 762 <SEP> 33288 <SEP> 15531* <SEP> 3585 <SEP> 398 <SEP>
<tb> Lymphocytes <SEP> 166 <SEP> 68 <SEP> 3654 <SEP> 2443* <SEP> 101 <SEP> 44 <SEP>
<tb> Neutrophiles <SEP> 445 <SEP> 113 <SEP> 5732 <SEP> 2279 <SEP> * <SEP> 473 <SEP> 216
<tb>
Témoin : eau stérile perfusée 20 min par voie trachéale ; 5 mM perfusé par voie trachéale; ML7 (1 mg/kg/12 h, 36 h IP) + Taurocholate * p< 0.001significativement différent des valeurs temoins Exemple 3 : de la réponse inflammatoire bronchique par le PD- 98059 Cet exemple montre que le PD-98059 (inhibiteur de la kinase MEK1), réduit l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes associée à l'ouverture des jonctions serrées, observée après la perfusion intra-trachéale de taurocholate (Tableau 3).

Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le PD- 98059 par voie IP (1 mg/kg/12 h, 36 h) soit son solvant (DMSO). Une heure après la dernière administration, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 200 l de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 5 mM/rat de taurocholate est réalisée.

Les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés 2 heures après la perfusion intra-trachéale de taurocholate ou de son solvant.

Tableau 3 : du PD-98059 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induit par la perfusion intra-trachéale

de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes SEM ;n=8). Résultat exprimé en nombre de cellules/ mm3 de LBA.

Témoin <SEP> Taurocholate <SEP> PD-98059 <SEP> +
<tb> taurocholate
<tb>

Leucocytes 5040 628 56637 9791 * 21424 3164*#

<tb>
<tb> Macrophages <SEP> 4582 <SEP> ~ <SEP> 586 <SEP> 40234 <SEP> 5799* <SEP> 17956 <SEP> 2465*#
<tb> Lymphocytes <SEP> 136 <SEP> 31 <SEP> 4251 <SEP> 940* <SEP> 774 <SEP> ~ <SEP> 183*#
<tb> Neutrophiles <SEP> 320 <SEP> ~ <SEP> 62 <SEP> 11769 <SEP> 5787* <SEP> 2652 <SEP> 600*# <SEP>
<tb> (Eosinophiles) <SEP> 0 <SEP> 602 <SEP> 173 <SEP> 27 <SEP> 27*# <SEP>
<tb>
Témoin : NaCl 0. 9% stérile perfusée 20 min par voie intra-trachéale ; taurocholate 5mM : rat perfusé par voie trachéale ; PD-98059 (1 mg/kg/12 h, 36 h) + taurocholate.

* p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.

# p< 0. 05 significativement différentes des valeurs taurocholates.

Exemple 4 : Inhibition par le ML7 de l'augmentation de la perméabilité pulmonaire induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.

Cet exemple montre que le ML7 (inhibiteur de la kinase de la chaîne légère de la myosine, MLCK) bloque de façon significative l'augmentation de la perméabilité pulmonaire liée à la perfusion intra-trachéale de lipopolysaccharide (LPS ) de Pseudomonas aeruginosa.

La perméabilité pulmonaire a été mesurée à l'aide d'un traceur, la sérum albumine humaine marquée à 1'I125, lequel, après perfusion intra-trachéale, est mesuré dans les urines, le plasma, le tissu pulmonaire et les lavages bronchoalvéolaires.

Pour ce faire, trois lots de 6 rats mâles Wistar (200-225 g) ont reçu soit un prétraitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière

administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 150 l d'une solution iso-osmolaire (5% albumine bovine + PBS) additionnée du traceur contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 g/rat de LPS, a été réalisée.

4 heures après la perfusion intra-trachéale, les urines, le sang, les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les poumons ont été collectés puis la radioactivité 1125 a été mesurée sur chacun de ces prélèvements.

Les résultats obtenus montrent que le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des LBAs alors que, parallèlement, comparés à ceux des témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons.

Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un prétraitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité, tant au niveau des LBAs que des poumons, ont été mesurées chez ces animaux (figure 1).

Chez les trois lots d'animaux testés, aucune différence dans les taux de radioactivité mesurés au niveau plasmatique n'a été observée. De plus aucune trace de radioactivité n' a été retrouvée dans les urines.

En conclusion, cet exemple montre que le LPS de Pseudomonas aeruginosa augmente la perméabilité paracellulaire au niveau pulmonaire favorisant l'accumulation d'immunocytes au niveau pulmonaire et que cet effet peut être prévenu par un traitement impliquant un bloqueur de la MLCK.

Exemple 5 : Réduction par le ML-7 de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.

Cet exemple complète l'exemple précédent et illustre la réduction, par le ML7, de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas Aeruginosa administré par perfusion intra-trachéale. Le ML-7 réduit ainsi l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes.

Pour ce faire, trois lots de 7 rats mâles Wistar (200 - 225 g) ont été utilisés. Les animaux ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg, 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 150 (il d'une solution isoosmolaire (5% albumine bovine + PBS) contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 g/rat de LPS a été réalisée. 4 heures après la perfusion intratrachéale, les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés.

Les résultats obtenus montrent que le LPS augmente les taux d'immunocytes présents au niveau des LBAs et plus particulièrement des polynucléaires neutrophiles. Cette augmentation de la neutrophilie est réduite par un prétraitement des animaux au ML7 (Tableau 4).

Tableau 4 : du ML7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induite par la perfusion intra-trachéale de LPS (1 g/rat) chez le rat (moyennes SEM ; n=7). Résultats exprimés en nombre de cellules/ mm3 de LBA.

Témoin <SEP> LPS <SEP> ML-7 <SEP> +
<tb> LPS
<tb> Leucocytes <SEP> 5883 <SEP> 961 <SEP> 37968 <SEP> 6912 <SEP> * <SEP> 17243 <SEP> 2956 <SEP> * <SEP> # <SEP>
<tb> Macrophages <SEP> 4760 <SEP> 738 <SEP> 16670 <SEP> 3060 <SEP> * <SEP> 10708 <SEP> 1713 <SEP> *
<tb> Lymphocytes <SEP> 188 <SEP> 70 <SEP> 2253 <SEP> 905 <SEP> * <SEP> 902 <SEP> 375
<tb> Neutrophiles <SEP> 934 <SEP> t <SEP> 707 <SEP> 19045 <SEP> t <SEP> 4892 <SEP> * <SEP> 6587 <SEP> t <SEP> 1749 <SEP> * <SEP> #
<tb>
Témoin : Solution à 5% albumine bovine + PBS perfusée 20 min par voie intratrachéale ; LPS 1 g/rat perfusé par voie trachéale ; ML-7 (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois parjour pendant 48h IP) + LPS * p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.

# p< 0. 05 significativement différentes des valeurs LPS.

Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé module la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le composé inhibe la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé n'affecte pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de la contraction de la chaîne légère de la myosine ou un inhibiteur de la dégradation de l' actine.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de MLCK.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de l'activité ou de l'expression des protéines de liaison à la myosine ou des molécules de jonction.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler la perméabilité paracellulaire de l'épithelium pulmonaire chez des sujets atteints de maladies respiratoires.

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9. Utilisation selon la revendication 8, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithelium pulmonaire chez des sujets atteints de maladies respiratoires.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des allergies, de l'asthme ou des maladies obstructives.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est administré par voie orale ou aérienne.
14. Produit pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-p2, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotrienes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
15. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et un excipient

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acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée pour une administration par voie orale ou aérienne.