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KR102236805B1 - Hc-ha/ptx3 복합체를 함유하는 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Hc-ha/ptx3 복합체를 함유하는 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR102236805B1
KR102236805B1 KR1020157003180A KR20157003180A KR102236805B1 KR 102236805 B1 KR102236805 B1 KR 102236805B1 KR 1020157003180 A KR1020157003180 A KR 1020157003180A KR 20157003180 A KR20157003180 A KR 20157003180A KR 102236805 B1 KR102236805 B1 KR 102236805B1
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후아 헤
션 타이
수젠 쟝
잉-티엥 주
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티슈테크, 인코포레이티드
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Abstract

본원은 펜트락신-3(PTX3) 및 인터 알파 억제제(IαI)의 중쇄 1(HC1)을 함유하는 천연 하이알루로난(HA) 복합체 및 재구성된 HA 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 복합체를 함유하는 조성물 및 상기 복합체를 사용하는 치료 방법도 제공한다. 상기 방법을 실시하는 데에 사용되는 조합물 및 키트도 제공한다.

Description

HC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 조성물 및 이의 사용 방법{COMPOSITIONS CONTAINING HC-HA/PTX3 COMPLEXES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원의 상호참조
본원은 2012년 7월 11일자로 출원된 미국 특허출원 제61/670,571호(온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)의 이익을 주장한다.
연방정부에 의해 지원된 연구 또는 개발에 대한 선언
본원에 기재된 연구를 위한 자금은 국립 보건원의 국립 안연구소(미국 메릴랜드주 베쎄스다 소재)로부터 연방 연구 승인 RO1 EY06819, R44 EY017497 및 R43 EY021045에 의해 부분적으로 제공되었다.
EFS-웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열목록의 참고도입
본원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 컴퓨터 판독가능한 텍스트 파일로서 제출되었고 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되는 서열목록을 함유한다. 2013년 7월 8일자로 생성된 상기 텍스트 파일은 34157-732-601SEQ.txt로 명명되고 그의 크기는 462 KB이다.
양막(AM)은 태아를 둘러싸는 양수로 충전된 무혈관 막성 주머니이다. 태반처럼 AM은 수정란의 발생 동안 형성된 배반엽상층으로부터 유래된다. AM은 양막강에서 태아를 둘러싸는 가장 안쪽 막을 형성한다. 태반 포유동물에서, 탯줄(즉, 제대)은 발생하는 태아를 태반에 연결한다. 탯줄은 양막(UCAM) 및 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 구성된다. 양막은 탯줄의 외층을 형성한다. UCAM은 UC 내의 유체 압력을 조절하는 기능을 한다. 와튼 젤리는 주로 점액다당류(하이알루론산 및 콘드로이틴 설페이트)로 구성된, 탯줄 내의 젤라틴성 물질이다. 이 물질은 일부 섬유아세포 및 대식세포도 함유한다. 탯줄은 와튼 젤리 내에 묻혀 있는, 2개의 동맥(제동맥) 및 1개의 정맥(제정맥)도 포함한다.
특허문헌 1: 국제공개공보 제WO2010/124296호 (공개일: 2010. 10. 28) 특허문헌 2: 국제공개공보 제WO2007/038686호 (공개일: 2007. 04. 05)
태아 조직, 예컨대, 양막 및 탯줄에서 HC-HA/PTX3 복합체를 확인하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 또한, 태아 조직, 예컨대, 양막 및 탯줄로부터 천연 HC-HA/PTX3 복합체를 단리하는 방법도 본원에 기재되어 있다. 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 제조하는 방법도 본원에 기재되어 있다. 본원에서 제공된 천연 HC-HA/PTX3 복합체 및 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체의 사용 방법도 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서 HC-HA/PTX3 복합체를 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조직 또는 세포로부터 제조된 추출물로부터 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체를 발생시키는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 양막 조직, 예컨대, 탯줄 또는 양막으로부터 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체를 단리하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 단리된 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 배양된 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 조직, 예컨대, 탯줄 또는 양막으로부터 제조된 추출물의 수용성 분획으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 수용성 분획은 등장성 염 용액으로 추출된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 조직, 예컨대, 탯줄 또는 양막으로부터 제조된 추출물의 수불용성 분획으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 불용성 분획은 GnHCl로 추출된다.
특정 실시양태에서, 시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체를 제조하는 방법으로서, (a) (i) 고체 지지체에 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 (ii) 펜트락신 3(PTX3) 단백질과 접촉시켜 PTX3 및 HMW HA(고정화된 PTX3/HA)의 고정화된 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 고정화된 PTX3/HA를, 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)과 접촉시켜 고정화된 rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 순서대로 순차적으로 수행된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3) 단백질, 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)과 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, TSG-6은 IαI HC1과 HA의 공유연결을 촉매작용한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (a) 후에 및 단계 (b)의 수행 전에 비결합된 PTX3 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (b) 후에 비결합된 TSG-6을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 세포로부터 단리된 천연 PTX3 단백질이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄로부터의 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질(간질)(stromal) 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 서열번호 32 내지 45 중 임의의 서열번호에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 동종다량체(즉, 2개 이상의 동일한 성분으로 구성된 다량체 단백질)이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 변경된 다량체화 도메인 또는 이종 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 TSG-6 단백질은 세포로부터 단리된 천연 TSG-6 단백질이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄로부터의 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, TSG-6 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, TSG-6 단백질은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 TSG-6 단백질은 서열번호 1 내지 31 중 임의의 서열번호에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 HC1은 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 HC1의 공급원으로서 사용된 인터-α-억제제(IαI) 단백질은 콘드로이틴 설페이트 쇄에 의해 연결된 HC2 및 비쿠닌(bikunin)도 포함한다. 일부 실시양태에서, HC1은 서열번호 46 또는 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, HC2는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 HC2는 서열번호 48 또는 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비쿠닌은 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 비쿠닌은 서열번호 52 또는 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 종 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 IαI 단백질은 혈액, 혈청, 혈장, 양막, 융모막, 양수 또는 이들의 조합물로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 IαI 단백질은 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 IαI 단백질은 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 IαI 단백질은 포유동물 세포에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄로부터의 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, IαI와 TSG-6 단백질은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 또는 20:1의 몰비로 접촉된다. 일부 실시양태에서, IαI와 TSG-6 단백질은 3:1의 몰비로 접촉된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1400 kDa 내지 약 3,500 kDa이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 3,000 kDa이다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 직접적인 연결에 의해 고정화된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 간접적인 연결에 의해 고정화된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 공유부착에 의해 고정화된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 비-공유부착에 의해 고정화된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, HMW HA는 절단가능한 연결제(linker)를 통해 고체 지지체에 연결에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, 연결제는 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 연결제이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (b) 후에 고체 지지체로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리는 절단가능한 연결제의 절단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체의 정제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제는 친화성 정제, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, PTX3, IαI HC1 또는 TSG-6 폴리펩티드는 친화성 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 헤마글루티닌 태그, 폴리-히스티딘 태그, myc 태그, FLAG 태그 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 HMW HA를 중간 폴리펩티드에 결합시킴으로써 고정화된다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 고체 지지체에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, HMW HA와 중간 폴리펩티드의 결합은 비-공유결합이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HA 결합 단백질(HABP)이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸(aggrecan), 베르시칸(versican), 뉴로칸(neurocan), 브레비칸(brevican), 포스파칸(phosphacan), TSG-6, CD44, 스타빌린(stabilin)-1 및 스타빌린-2로부터 선택된 HABP, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1, 또는 스타빌린-2의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 서열번호에 기재된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 폴리펩티드 연결제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결제는 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (b) 후 중간 폴리펩티드로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계는 상기 복합체를 해리제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리제는 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 우레아이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 약 4 M 내지 약 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드 또는 연결제는 단백질분해성(proteolytic) 절단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 해리는 단백질분해성 절단 서열에서 중간 폴리펩티드 또는 연결제를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단은 단백질분해성 절단 서열을 단백질분해효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질분해효소는 푸린, 3C 단백질분해효소, 캐스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 TEV 단백질분해효소로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체를 제조하는 방법으로서, 고체 지지체에 고정화된 PTX3/HA 복합체를 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 TSG-6과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체는 PTX3과 HMW HA의 복합체(PTX3/HA)를 형성하기에 효과적인 조건 하에서 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3) 단백질과 접촉시킴으로써 제조되고, 이때 HMW HA는 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 PTX3/HA 복합체를 IαI 및 TSG-6과 접촉시키기 전에 비결합된 PTX3 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비결합된 TSG-6을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 동종다량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3은 변경된 다량체화 도메인 또는 이종 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, HC1은 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 HC2도 포함한다. 일부 실시양태에서, HC2는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 비쿠닌도 포함한다. 일부 실시양태에서, 비쿠닌은 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 콘드로이틴 설페이트 쇄도 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 혈액, 혈장, 혈청, 양막, 융모막, 양수 또는 이들의 조합물로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI 단백질은 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI와 TSG-6 단백질은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 또는 20:1의 몰비로 접촉된다. 일부 실시양태에서, IαI와 TSG-6 단백질은 3:1의 몰비로 접촉된다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1400 kDa 내지 약 3,500 kDa이다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 3,000 kDa이다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 직접적인 연결에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 간접적인 연결에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 공유부착에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체에 비-공유부착에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 고체 지지체로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체의 정제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제는 친화성 정제, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, PTX3, IαI HC1 또는 TSG-6 폴리펩티드는 친화성 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 헤마글루티닌 태그, 폴리-히스티딘 태그, myc 태그, FLAG 태그 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 HMW HA를 중간 폴리펩티드에 결합시킴으로써 고정화된다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 고체 지지체에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, HMW HA와 중간 폴리펩티드의 결합은 비-공유결합이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HA 결합 단백질(HABP)이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1 및 스타빌린-2로부터 선택된 HABP, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1 또는 스타빌린-2의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 서열번호에 기재된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 폴리펩티드 연결제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결제는 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 중간 폴리펩티드로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계는 상기 복합체를 해리제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리제는 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 우레아이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 약 4 M 내지 약 8 M의 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드 또는 연결제는 단백질분해성 절단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 해리는 단백질분해성 절단 서열에서 중간 폴리펩티드 또는 연결제를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단은 단백질분해성 절단 서열을 단백질분해효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질분해효소는 푸린, 3C 단백질분해효소, 캐스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 TEV 단백질분해효소로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체를 발생시키기 위해 본원에서 제공된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조된 재구성된 HC-HA(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대식세포의 M2 분극화(polarization)를 촉진한다. 특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX 복합체는 대식세포의 M2 분극화를 촉진한다. 특정 실시양태에서, 대식세포를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대식세포의 M2 분극화를 유도하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-12p40의 발현을 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p40의 수준은 LPS-자극된 대식세포가 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p40의 수준에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-12p40의 발현의 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p40의 수준은 LPS-자극된 대식세포가 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p40의 수준에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p40의 수준을 감소시키는 방법으로서, LPS-자극된 대식세포를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-12p40 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-12p70 단백질의 발현을 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p70 단백질의 양은 LPS-자극된 대식세포가 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p70 단백질의 양에 비해 더 낮다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-12p70 단백질의 발현을 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p70 단백질의 양은 LPS-자극된 대식세포가 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p70 단백질의 양에 비해 더 낮다.
특정 실시양태에서, LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-12p70 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, LPS-자극된 대식세포를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-23의 발현을 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-23의 수준은 LPS-자극된 대식세포가 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-23의 수준에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서, IL-23 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-23 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 상기 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-23의 발현을 감소시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-23의 수준은 LPS-자극된 대식세포가 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-23의 수준에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서, IL-23 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-23 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-23의 수준을 감소시키는 방법으로서, LPS-자극된 대식세포를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, IL-23 mRNA의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-23 단백질의 수준이 감소된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포에서의 IL-10의 발현을 증가시키고, 이때 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-10의 수준은 LPS-자극된 대식세포가 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-10의 수준에 비해 더 높다. 일부 실시양태에서, IL-10 mRNA의 수준이 증가된다. 일부 실시양태에서, IL-10 단백질의 수준이 증가된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 상기 복합체는 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에서의 IL-10의 발현을 증가시키고, 이때 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-10의 양은 LPS-자극된 대식세포가 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-10의 양에 비해 더 높다. 일부 실시양태에서, IL-10 mRNA의 수준이 증가된다. 일부 실시양태에서, IL-10 단백질의 수준이 증가된다.
특정 실시양태에서, LPS-자극된 대식세포에 의해 발현된 IL-10의 수준을 증가시키는 방법으로서, LPS-자극된 대식세포를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, IL-10 mRNA의 수준이 증가된다. 일부 실시양태에서, IL-10 단백질의 수준이 증가된다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 호중구의 아폽토시스를 촉진하나 휴지기(resting) 호중구의 아폽토시스를 촉진하지 않는다. 일부 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체는 LPS-자극된 호중구의 아폽토시스를 촉진하고, 이때 LPS-자극된 호중구 샘플에서 아폽토시스성을 나타내는 LPS-자극된 호중구의 수는 상기 샘플이 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 아폽토시스성을 나타내는 LPS-자극된 호중구의 수에 비해 더 높다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 호중구의 아폽토시스를 촉진하나 휴지기 호중구의 아폽토시스를 촉진하지 않는다. 일부 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 nHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 호중구의 아폽토시스를 촉진하고, 이때 LPS-자극된 호중구 샘플에서 아폽토시스성을 나타내는 LPS-자극된 호중구의 수는 상기 샘플이 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 아폽토시스성을 나타내는 LPS-자극된 호중구의 수에 비해 더 높다.
특정 실시양태에서, LPS-자극된 호중구의 아폽토시스를 유도하는 방법으로서, LPS-자극된 호중구를 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 촉진하고, 이때 아폽토시스성 호중구 및 LPS-자극된 대식세포로 구성된 샘플에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 포식되는(phagocytosed) 아폽토시스성 호중구의 수는 상기 샘플이 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 포식되는 호중구의 수에 비해 더 높다. 특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 상기 복합체는 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 촉진하고, 이때 아폽토시스성 호중구 및 휴지기 대식세포로 구성된 샘플에서 휴지기 대식세포에 의해 포식되는 아폽토시스성 호중구의 수는 상기 샘플이 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 휴지기 대식세포에 의해 포식되는 호중구의 수에 비해 더 높다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 복합체는 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 촉진히고, 이때 아폽토시스성 호중구 및 LPS-자극된 대식세포로 구성된 샘플에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 포식되는 아폽토시스성 호중구의 수는 상기 샘플이 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 LPS-자극된 대식세포에 의해 포식되는 호중구의 수에 비해 더 높다. 특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 복합체는 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 촉진하고, 이때 아폽토시스성 호중구 및 LPS-자극된 대식세포로 구성된 샘플에서 휴지기 대식세포에 의해 포식되는 아폽토시스성 호중구의 수는 상기 샘플이 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉할 때 nHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 상기 샘플에서 휴지기 대식세포에 의해 포식되는 호중구의 수에 비해 더 높다.
특정 실시양태에서, 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 유도하는 방법으로서, 아폽토시스성 호중구 및 LPS-자극된 또는 휴지기 대식세포를 함유하는 샘플을 rcHC-HA/PTX3 또는 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 고분자량 하이알루로난(HMW HA), PTX3 및 IαI HC1을 포함하는 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체가 본원에 기재되어 있고, 이때 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포의 부착을 인간 탯줄 또는 인간 양막으로부터 단리된 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체, 또는 인간 탯줄 및 인간 양막 둘다로부터 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체들의 조합물과 적어도 동일한 수준까지 촉진하고, 이때 부착은 LPS-자극된 대식세포를 고체 지지체에 고정화된 rcHC-HA/PTX3 또는 nHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 인간 탯줄로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 인간 양막으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 인간 탯줄 및 인간 양막 둘다로부터 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체들의 조합물로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1400 kDa 내지 약 3,500 kDa이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 3,000 kDa이다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 HC1은 HA에 공유연결된다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 PTX3 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 PTX3은 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법들에서 사용된 PTX3 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법들에서 사용된 PTX3 단백질은 동종다량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 삼량체, 사량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 팔량체이다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 IαI HC1은 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 IαI HC1은 재조합 단백질이다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 TSG-6을 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, TSG-6 단백질은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 PTX3, IαI HC1 또는 TSG-6 폴리펩티드는 친화성 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그는 헤마글루티닌 태그, 폴리-히스티딘 태그, myc 태그, FLAG 태그 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 용액, 현탁물(제), 산제(분말), 연고, 정제, 캡슐제 또는 에어로졸의 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 고체, 가교형 겔 또는 리포좀의 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 가교형 하이알루로난 하이드로겔의 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 천연 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 천연 중합체는 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 하이알루론산, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 소염제, 흉터형성방지제, 항-신생물제, 화학치료제, 면역억제제, 세포독성제, 항-미생물제 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 약제의 제조를 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, (a) 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체; 및 (b) 소염제, 흉터형성방지제, 항-신생물제, 화학치료제, 면역억제제, 세포독성제, 항-미생물제 또는 이들의 조합물을 포함하는 조합물이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 조직에서 흉터형성 또는 섬유증을 예방하거나 역전시키는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이러한 예방 또는 역전이 필요한 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조직을 유효량의 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 흉터는 피부염 흉터, 켈로이드 흉터, 구축성 흉터, 비후성 흉터, 또는 여드름으로부터 발생된 흉터이다. 특정 실시양태에서, 흉터형성을 감소시키거나 예방하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 조직에서 TGF-β 신호전달을 감소시키거나 억제함으로써 흉터형성 또는 섬유증을 감소시키거나 예방한다.
특정 실시양태에서, 염증의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 염증을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 염증이 생긴 조직을 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증은 급성 염증 또는 만성 염증이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 염증성 장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 대식세포-매개된 염증성 장애, Th-17-매개된 면역 장애 또는 T-세포-매개된 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 장애, 알레르기, 백혈구 결함, 감염, 이식편대 숙주질환, 조직 이식 거부, 또는 이들의 조합물을 갖는다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 류마티스성 관절염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 눈의 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 결막염, 각막염, 안검염, 안검결막염, 공막염, 상공막염, 포도막염, 망막염 또는 맥락막염이다. 일부 실시양태에서, 급성 염증은 심근경색, 뇌졸중, 내독소 쇼크 또는 패혈증에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 죽상경화증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 종양의 염증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 추가 소염제와 함께 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 추가 소염제는 항-TGF-β 항체, 항-TGF-β 수용체 차단 항체, 항-TNF 항체, 항-TNF 수용체 차단 항체, 항-IL1β 항체, 항-IL1β 수용체 차단 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-2 수용체 차단 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-6 수용체 차단 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL-12 수용체 차단 항체, 항-IL-17 항체, 항-IL-17 수용체 차단 항체, 항-IL-23 항체 및 항-IL-23 수용체 차단 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1형 인터페론은 IFN-α 또는 IFN-β이다. 특정 실시양태에서, 염증을 감소시키거나 예방하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 피부 상처 또는 궤양의 치료가 필요한 대상체에서 피부 상처 또는 궤양을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 피부 상처 또는 궤양을 유효량의 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 피부 상처 또는 궤양을 치료하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 피부 상처 또는 궤양은 비-치유 궤양이다.
특정 실시양태에서, 골형성의 촉진 또는 유도를 필요로 하는 대상체에서 골형성을 촉진하거나 유도하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체 또는 nHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 골형성을 촉진하거나 유도하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 비정상적인 혈관신생의 예방 또는 감소가 필요한 대상체에서 비정상적인 혈관신생을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 습성 연령관련 황반변성(wARMD) 또는 당뇨병성 증식성 망막병증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항암 치료와 함께 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 항암 치료는 항-신생물제, 세포독성제, 항-혈관신생제, 화학치료제, 또는 방사선치료의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암 치료는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 함께 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 혈관신생을 감소시키거나 예방하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 이식물 수용자에서 이식물 거부를 예방하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이식물 수용자에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이식물을 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 이식 절차 전에, 이식 절차 후에, 또는 이식 절차 동안에 투여된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 면역억제제와 함께 투여된다. 특정 실시양태에서, 이식물 수용자에서 이식물 거부를 예방하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 이식물은 각막 이식물이다.
특정 실시양태에서, 줄기 세포 확장(expansion)의 유도를 필요로 하는 대상체에서 줄기 세포 확장을 유도하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 줄기 세포를 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포 확장을 유도하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 TGF-β 신호전달의 억제 및/또는 BMP 신호전달 경로의 상향조절로 줄기 세포 확장을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 분화된 세포를 줄기 세포(또는 유도된 전구세포, iPSC)로 재프로그래밍함으로써 줄기 세포 확장을 유도한다.
특정 실시양태에서, 세포 치료를 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 세포 치료를 필요로 하는 대상체에서 세포 치료를 수행하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 치료 세포와 함께 유효량으로 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료 세포 및 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 손상된 조직에 국소적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 세포 및 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 전신 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 치료는 줄기 세포의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 유도된 전구 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 치료는 분화된 세포의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 인슐린 생성 세포이다. 일부 실시양태에서, 인슐린 생성 세포는 섬세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1형 진성 당뇨병을 갖는다.
특정 실시양태에서, 세포 치료를 필요로 하는 대상체에서 세포 치료를 수행하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 세포 전달 장치에 함유된 세포와 함께 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 마이크로캡슐에 함유된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐에 부착된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 손상된 조직에 국소 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 세포 및 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체가 전신 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 치료는 줄기 세포의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 유도된 전구 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 치료는 분화된 세포의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 인슐린 생성 세포이다. 일부 실시양태에서, 인슐린 생성 세포는 섬세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1형 진성 당뇨병을 갖는다.
특정 실시양태에서, 통증의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 통증을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 이때 통증은 화학적 화상, 심각한 세균성 각막염, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 또는 안 종양의 방사선조사에 의해 야기된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 통증을 감소시키기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있고, 이때 통증은 화학적 화상, 심각한 세균성 각막염, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 또는 안 종양의 방사선조사에 의해 야기된다.
특정 실시양태에서, 조직 재생의 유도 또는 촉진을 필요로 하는 대상체에서 조직 재생을 유도하거나 촉진하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 손상된 조직을 유효량의 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 골 또는 잇몸, 각막 조직 또는 결막 조직이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 치료 세포, 다수의 치료 세포 또는 조직 이식물과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 조직 이식물은 동종이식물 또는 자가이식물이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 기초 치료와 함께 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 조직 재생을 유도하거나 촉진하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 흉터형성을 억제하거나 예방한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 섬유증을 치료하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 비만 또는 인슐린 내성의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비만 또는 인슐린 내성을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 M1 지방 조직 대식세포의 양을 억제하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, M1 지방 조직 대식세포의 양의 억제 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 M1 지방 조직 대식세포의 양을 억제하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비만 또는 인슐린 내성으로 진단받았다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 비만 또는 인슐린 내성을 치료하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 결막이완증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 결막이완증을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 상기 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 결막을 유효량의 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 결막이완증을 치료하기 위한, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 세포 배양에 적합한 기재(substrate), 및 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 rcHA/PTX3 복합체 또는 nHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 세포 배양물이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, rcHA/PTX3 복합체 또는 nHC-HA/PTX3 복합체는 상기 기재에 고정화된다.
특정 실시양태에서, 치료 방법이 본원에 기재되어 있고, 이때 대상체는 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 추가 치료제와 함께 유효량으로 투여받는다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 인터페론, 항-종양 괴사제, 인터류킨-1(IL-1) 수용체 길항제, 인터류킨-2(IL-2) 수용체 길항제, 인터류킨-6(IL-6) 수용체 길항제, 인터류킨-12(IL-12) 수용체 길항제, 인터류킨-17(IL-17) 수용체 길항제, 인터류킨-23(IL-23) 수용체 길항제, 세포독성제, 항-미생물제, 인터류킨, 면역조절제, 항생제, T-세포 보조자극 차단제, 장애 개선 항-류마티스제, 면역억제제, 항-림프구 항체, 항-혈관신생제, 화학치료제, 항-신생물제, 항-대사물질, Akt 억제제, IGF-I 억제제, 안지오텐신 II 길항제, 사이클로옥시게나제 억제제, 헤파라나제 억제제, 림포카인 억제제, 사이토카인 억제제, IKK 억제제, P38MAPK 억제제, 항-아폽토시스 경로 억제제, 아폽토시스 경로 작용제, PPAR 작용제, Ras의 억제제, 텔로머라제 억제제, 단백질분해효소 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 아미노펩티다제 억제제, SHIP 활성화제 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-미생물제는 항바이러스제, 항균제 또는 항진균제이다.
특정 실시양태에서, 치료 방법이 본원에 기재되어 있고, 이때 대상체는 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 유효량으로 투여받고, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료 방법이 본원에 기재되어 있고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태에서, 고체 표면은 나노입자, 비드, 마이크로캡슐 또는 이식가능한 의료 장치의 표면 또는 이의 부분이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된 기재를 포함하는 의료 장치가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 기재는 스텐트, 관절, 나사, 막대, 핀, 플레이트, 스테이플, 션트, 클램프, 클립, 봉합사, 봉합 나사, 전극, 카테터, 리드, 이식물, 드레싱, 심장박동기, 심장박동기 하우징, 심장율동전환기, 심장율동전환기 하우징, 제세동기, 제세동기 하우징, 보철, 귀 배액관, 안과용 임플란트, 정형장치, 척추 디스크, 골 대체물, 문합 장치, 혈관주위 랩, 인공항문(colostomy) 주머니 부착 장치, 지혈용 차단막(hemostatic barrier), 혈관 임플란트, 혈관 지지체, 조직 접착제, 조직 실런트, 조직 스캐폴드 및 관내 장치 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표면 상에 고정화된, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 장치가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 실리카, 금속성 또는 중합체성 표면이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐에 부착된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 나노입자에 부착된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 비드, 칩, 유리 슬라이드 또는 필터에 부착된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 컨택트 렌즈에 부착된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 외과용 임플란트 또는 보철에 부착된다. 일부 실시양태에서, 임플란트 또는 보철은 인공 관절, 골 임플란트, 봉합사 또는 스텐트이다. 일부 실시양태에서, 인공 관절은 인공 고관절, 인공 무릎, 인공 상완 관절 또는 인공 발목이다. 일부 실시양태에서, 스텐트는 관상 스텐트, 요관 스텐트, 요도 스텐트, 전립선 스텐트, 식도 스텐트 또는 골 스텐트이다.
특정 실시양태에서, 환자 내로의 이식을 위해 개조된 구조물을 포함하는 의료 장치가 본원에 기재되어 있고, 이때 상기 구조물의 표면 또는 표면의 부분은 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하도록 부착된다. 일부 실시양태에서, 부착은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 구조물의 표면 또는 표면의 부분의 공유부착 또는 비-공유부착을 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착은 구조물의 표면 또는 표면의 부분을, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 조성물로 코팅하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조물은 혈관 스텐트, 인공 관절, 봉합사 또는 마이크로캡슐이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 세균 생물막의 형성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 치료 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다.
특정 실시양태에서, M1 표현형에서 M2 표현형으로 대식세포를 분극화함에 있어서 IL-12 또는 IL-23의 발현을 감소시키거나 억제하되 IL-10의 발현을 촉진하기에 충분한 양으로 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 대식세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대식세포 활성을 조절하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 호염증성(pro-inflammatory) 매개자로 자극되어 있다. 일부 실시양태에서, 호염증성 매개자는 지질다당류(LPS), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터페론-감마(IFNγ) 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체에서 생체내 대식세포와 접촉한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 대식세포 활성을 조절하는 방법에 의해 조절된 대식세포의 투여를 포함하는 치료 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재되어 있거나 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 조성물, 이 조성물의 투여를 위한 장치, 및 임의적으로 투여에 대한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, (a) HMW HA(PTX3/HA)에 미리 결합된 PTX3의 복합체; (b) 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질; 및 (c) TSG-6을 포함하는 조합물 또는 혼합물이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, (a) HC-HA에 미리 결합된 TSG-6의 복합체; 및 (b) PTX3을 포함하는 조합물 또는 혼합물이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체를 제조하는 방법으로서, (a) (i) 고체 지지체에 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA), (ii) 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 (iii) TSG-6을 접촉시켜 TSG-6에 미리 결합된 rcHC-HA 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) TSG-6에 미리 결합된 rcHC-HA 복합체를 펜트락신 3(PTX3) 단백질과 접촉시켜 rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체를 제조하는 방법으로서, (i) 고체 지지체에 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA), (ii) 펜트락신 3(PTX3) 단백질, (iii) 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 (iv) 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)을 접촉시켜 고정화된 rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, PTX3에 결합된 고정화된 HA를 포함하는 복합체가 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 시험관내에서 PTX3에 결합된 고정화된 HA를 포함하는 복합체를 제조하는 방법으로서, PTX3과 HMW HA의 복합체(PTX3/HA)를 형성하기에 효과적인 조건 하에서 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 PTX3 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 이때 HMW HA는 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 세포로부터 단리된 천연 PTX3 단백질이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 탯줄로부터의 양막 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 PTX3 단백질은 동종다량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 삼량체, 사량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3은 변경된 다량체화 도메인 또는 이종 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 고정은 고체 지지체에의 비-공유부착을 포함한다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 고정은 HMW HA와 중간 폴리펩티드의 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 고체 지지체에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, HMW HA와 중간 폴리펩티드의 결합은 비-공유결합이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HA 결합 단백질(HABP)이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1 및 스타빌린-2로부터 선택된 HABP, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸이다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1 또는 스타빌린-2의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 베르시칸의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간 폴리펩티드는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 서열번호에 기재된 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전술된 방법에 의해 제조된 PTX3/HA 복합체가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 전술된 방법에 의해 제조된 PTX3/HA 복합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 약제의 제조를 위한 PTX3/HA 복합체의 용도가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 흉터형성, 염증, 혈관신생, 암, 당뇨병, 비만 또는 섬유증의 예방 또는 억제를 위해 PTX3/HA 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 세포에서 전분화능(pluripotency)을 유도하거나 유지하는 방법으로서, 세포를 nHC-HA/PTX3 복합체 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 함께 배양하여 세포에서 전분화능을 유도하거나 유지하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 Sox2, myc, Oct4 및 KLF4로부터 선택된 단백질을 이종적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 Sox2, myc, Oct4 및 KLF4로부터 선택된 1종, 2종 또는 3종의 단백질을 이종적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 고정화된다. 일부 실시양태에서, 세포는 성체 분화된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 섬유아세포(섬유모세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 각막 섬유아세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 또는 유도만능(induced pluripotent) 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 윤부 상피 전구세포, 윤부 기질 니치(niche) 세포, 탯줄 줄기 세포, 양막 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 양막 nHC-HA/PTX3 복합체이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 nHC-HA/PTX3 복합체이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 양막 추출물에 대한 초원심분리(ultracentrifugation)를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 nHC-HA/PTX3 추출물(즉, 가용성 nHC-HA/PTX3)을 생성하도록 PBS 완충제에서 제조된 양막 추출물에 대한 초원심분리를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 nHC-HA/PTX3 추출물(즉, 가용성 nHC-HA/PTX3)을 생성하도록 GnHCl 완충제에서 제조된 양막 추출물에 대한 초원심분리를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 탯줄 추출물에 대한 초원심분리를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 탯줄 추출물은 탯줄 양막, 탯줄 기질, 와튼 젤리 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 nHC-HA/PTX3 추출물(즉, 가용성 nHC-HA/PTX3)을 생성하도록 PBS 완충제에서 제조된 탯출 추출물에 대한 초원심분리를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 nHC-HA/PTX3 추출물(즉, 가용성 nHC-HA/PTX3)을 생성하도록 GnHCl 완충제에서 제조된 탯줄 추출물에 대한 초원심분리를 수행함으로써 nHC-HA/PTX3 복합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 2회, 3회 또는 4회의 초원심분리를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 4회의 초원심분리를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 PTX3을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 작은 류신 풍부(rich) 프로테오글리칸(SLRP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 PTX3 및 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 데코린(decorin), 비글리칸(biglycan), 피브로모듈린(fibromodulin), 루미칸(lumican), PRELP(프롤린 아르기닌 풍부 말단 류신 풍부 단백질), 케라토칸(keratocan), 오스테오어드헤린(osteoadherin), 에피파이칸(epipycan) 및 오스테오글리신(osteoglycin)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 글리코스아미노글리칸에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, 글리코스아미노글리칸은 케라탄 설페이트이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적 및 설명적이고 특허청구된 임의의 보호대상을 한정하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 양막 추출물(AME)로부터의 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체의 정제, 및 단백질 조성 및 HA 크기의 분석을 예시한다. (A-B) CsCl/4 M 구아니딘 HCl 초원심분리에 의해 수득된 분획 중의 총 단백질 및 HA 농도. (C) 0.5% 아가로스 겔에서 스테인스-올(Stains-all) 염료에 의해 염색된 HA. (D-J) HC1(D 및 F), PTX3(E 및 G), HC2(H), HC3(I), 비쿠닌(J), TSG-6(K) 또는 TSP-1(L)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의한 nHC-HA/PTX3에 존재하는 단백질의 분석. NaOH 또는 N = 25℃에서 1시간 동안 0.05 N NaOH를 사용한 처리. HAase 또는 H = 60℃에서 2시간 동안 20 유닛/㎖ HAase를 사용한 처리(F-K). IGFBP 1-3, PF4 또는 TIMP-1을 포함하는 다양한 항원들에 대한 항체를 사용한 도트 분석에 의해 확인된 상대적인 단백질 양(M)의 막대 그래프.
도 2는 CD44 및 TLR4 수용체가 LPS-자극된 대식세포와 고정화된 nHC-HA/PTX3의 부착을 매개한다는 것을 예시한다. (A) 세포 부착. RAW264.7 세포(100 ㎕의 2.5 x 105개 세포/㎖)를 고정화된 HA(2 ㎍/웰) 또는 nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰)(n=3)에 시딩하고 LPS(1 ㎍/㎖)로 자극하였다. 90분 동안 항온처리한 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포를 사이퀀트(CyQuant) 분석으로 카운팅하였다. 축적 막대는 100 ㎛를 나타낸다. 별표시(*)는 p 값 < 0.05(HA 또는 nHC-HA/PTX3 대 PBS 대조군 또는 nHC-HA/PTX3 대 HA)를 표시한다. (B) 세포 생존력. LPS-자극된 RAW264.7 세포를 24시간 동안 고정화된 PBS 대조군, HA 또는 nHC-HA/PTX3 상에서 항온처리하였다(n=3). 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다. 이들 고정화된 기재 상에서 세포들 사이의 세포 생존력에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(모든 p 값 > 0.05). (C) CD44 및 TLR4 수용체는 LPS-자극된 대식세포와 고정화된 nHC-HA/PTX3의 부착을 책임진다. RAW264.7 세포(2.5 x 105/㎖)를 30분 동안 얼음 상에서 동종형 대조군 항체 또는 RGD 대조군 펩티드와 함께 CD44, TLR2, TLR4, 인테그린 αv, β1, β2 또는 β3, 또는 RGD 펩티드에 대한 차단 항체로 미리 항온처리하였다(n=3). LPS(1 ㎍/㎖)를 첨가한 후, 세포를 90분 동안 항온처리하고 세포 부착 분석을 A에 기재된 방식과 동일한 방식으로 수행하였다. 별표시(*)는 p 값 < 0.05를 표시한다.
도 3은 고정화된 nHC-HA/PTX3에 의한 M2 표현형을 향한 LPS-자극된 대식세포의 분극화를 예시한다. (A) 정량 PCR에 의해 측정되었을 때 PBS 대조군 또는 고정화된 HA 또는 nHC-HA/PTX3에 결합된 대식세포에서 M1(TNF-α, IL-12p40) 또는 M2(IL-10, Arg-1, LIGHT 및 SPHK1) 마커의 상대적인 mRNA 발현. (B) ELISA에 의해 측정된 상대적인 TNF-α 단백질 양. (C) PBS 대조군 또는 고정화된 nHC-HA/PTX3에 결합된 대식세포에서 M1 마커인 IRF5의 웨스턴 블롯(좌측) 및 면역형광 염색에 의한 세포편재화(cytolocalization)(우측). (D) 고정화된 nHC-HA/PTX3과 함께 항온처리한 후 휴지기 호중구, fMLP-자극된 호중구 또는 LPS-자극된 호중구의 아폽토시스. 별표시(*)는 p 값 < 0.05를 표시한다. (E) 휴지기 대식세포 또는 LPS-자극된 대식세포에 의한 아폽토시스성 호중구의 식세포작용. 별표시(*)는 p 값 < 0.05를 표시한다.
도 4는 고정화된 nHC-HA/PTX3 상에서 M2 대식세포 분극화를 유지하는 데에 있어서 CD44의 역할을 예시한다. (A) qPCR에 의해 측정되었을 때 PBS, 또는 CD44, TLR4 또는 CD44/TLR4에 대한 차단 항체와 함께 미리 항온처리된 대식세포와 nHC-HA/PTX3의 결합 후 M1(IL-12p40) 및 M2(IL-10, LIGHT 및 SPHK1) 대식세포 마커의 상대적인 mRNA 발현. 별표시(*)는 동일한 군에서 항체 처리 부재(부재)에 비해 p 값 < 0.05를 표시한다. (B) ELISA에 의해 측정된 IL-12 및 IL-10 단백질 양. 별표시(*)는 동일한 군에서 항체 처리 부재(부재)에 비해 p 값 < 0.05를 표시한다.
도 5는 nHC-HA/PTX3(제4)이 세포 응집을 촉진하나 nHC-HA/PTX3(제2) 및 nHC-HA/PTX3(제4) 둘다가 고정화된 기재(대조군으로서 PBS) 상에서 배양되고 4시간(A) 또는 24시간(B 및 C) 동안 IFN-γ/LPS로 자극된 IFN-γ/LPS-자극된 대식세포 RAW264.7 세포(2.5 x 105/㎖)에서 IL-12p40 및 IL-23 단백질의 생성을 억제한다는 것을 보여준다. (A) 시딩 후 4시간에서 세포 형태. 대안적으로, 세포를 24시간 동안 LPS로 자극하고 세포 배양 상청액에서 IL-10 및 IL-12p70의 단백질을 각각의 ELISA로 측정하였다(B 및 C). p 값은 B 및 C에 표시되어 있다.
도 6은 96웰 코바링크(CovaLink)™ 플레이트의 표면에의 HMW HA 및 nHC-HA/PTX3의 용량 의존적 공유커플링을 예시한다. (A) 비결합된 HMW HA 및 nHC-HA/PTX3의 제거 후 결합된 HMW HA 및 nHC-HA/PTX3의 HA ELISA. (B) HMW HA 및 nHC-HA/PTX3으로부터 결합된 HA 및 비결합된 HA의 HA ELISA.
도 7은 TSG-6과 고정화된 HA(iHA)의 용량 의존적 결합, 및 다양한 해리제 및 환원제에 대한 내성을 예시한다. (A) TSG-6 ELISA에 의해 측정된, iHA에 결합된 TSG-6. (B) 6 M 구아니딘 HCl, 8 M 구아니딘 HCl, 2% SDS, 100 mM DTT 또는 25 mM NaOH를 사용한 처리 후 TSG-6 ELISA에 의해 측정된, iHA에 결합된 TSG-6.
도 8은 PTX3과 고정화된 HA(iHA)의 용량 의존적 결합, 및 다양한 해리제 및 환원제에 대한 내성을 예시한다. (A) PTX3 ELISA에 의해 측정된, iHA에 결합된 PTX3. 6 M 구아니딘 HCl, 8 M 구아니딘 HCl, 2% SDS, 100 mM DTT 또는 25 mM NaOH를 사용한 처리 후 PTX3 ELISA에 의해 측정된, iHA에 결합된 PTX3.
도 9는 iHA와의 결합에 대한 TSG-6과 PTX3 사이의 경쟁 또는 상승작용의 결여를 예시한다. ELISA에 의해 측정된 상대적인 흡광도는 각각의 인자와 iHA의 단독 항온처리 동안 또는 iHA와의 조합 항온처리 동안 결합된 TSG-6 또는 PTX3에 대해 제시되어 있다. iHA에 결합하는 TSG-6 또는 PTX3에 대한 단독 항온처리와 조합 항온처리 사이의 통계적 유의성은 발견되지 않는다(p > 0.05).
도 10은 TSG-6에 미리 결합된 iHA에 결합하는 PTX3의 부분적 억제, 및 PTX3에 미리 결합된 iHA에 결합하는 TSG-6의 억제의 결여를 예시한다. 이 도면은 미리 결합된 TSG-6/iHA(A) 또는 미리 결합된 PTX3/iHA(B)에 대한 TSG-6 또는 PTX3의 후속 결합의 TSG-6 및 PTX3 ELISA 결과를 보여준다. P 값은 (A)에 표시되어 있고, (B)에서 군들 사이에 통계적 유의성은 발견되지 않았다.
도 11은 LPS-자극된 RAW264.7 대식세포와 PBS(대조군), HA(iHA), nHC-HA/PTX3, TSG-6/iHA 또는 PTX3/iHA의 부착을 예시한다. 세포를 항온처리로부터 24시간 후에 사진촬영하였다.
도 12는 PBS(대조군), HA(iHA), nHC-HA/PTX3, TSG-6/iHA 또는 PTX3/iHA 상에서의 항온처리 후 RAW264.7 대식세포에서의 상대적인 유전자 발현을 예시한다. 총 RNA를 단리하고 IL-12p40(A) 및 IL-10(D)의 mRNA 발현을 정량 PCR로 측정하였다. 대안적으로, 세포를 24시간 동안 LPS(B 및 E) 또는 IFN-γ/LPS(C)로 자극하고, 세포 배양 배지에서 IL-12p70(B), IL-23(C) 및 IL-10(E)의 단백질 발현을 각각의 ELISA를 이용하여 측정하였다. 별표시(*)는 대조군에 비해 p < 0.05를 표시한다.
도 13은 HC1 및 HC2를 IαI로부터 iHA로 전달하는 데에 있어서 용액 중의 자유 TSG-6 대 결합된 TSG-6의 효율을 예시한다. (A, B) 각각의 ELISA에 의해 측정되었을 때 TSG-6 및 IαI를 iHA에 동시에 또는 순차적으로 첨가한 후 상대적인 결합된 HC1(A) 또는 IαI(B). 별표시(*)는 동시에 및 순차적으로 첨가되었을 때 동일한 TSG-6 농도에서 p < 0.05를 표시한다. (C) 하이알루로니다제(HAase)에 의해 분해되고 항-TSG-6 항체에 의해 분석된 A로부터의 샘플의 웨스턴 블롯. (D) ELISA에 의해 측정되었을 때 PTX3 및 IαI와 iHA의 동시적인 항온처리 후 iHA에 결합된 상대적인 HC1 및 PTX3.
도 14는 PTX3의 존재 또는 부재 하에서 IαI 및 TSG-6의 동시적인 항온처리 후 용액에서 형성된 복합체를 예시한다. (A-D) HC1(A), HC2(B), TSG-6(C) 또는 비쿠닌(D)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯. HAase = 하이알루로니다제를 사용한 처리. (E) TSG-6과 IαI의 상호작용의 예시. (F) PTX3에 의한 HC2·TSG-6 형성의 억제의 예시. (G) IαI에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯.
도 15는 PTX3의 존재 또는 부재 하에서 IαI 및 TSG-6의 동시적인 항온처리 후 iHA 상에서 형성된 복합체를 예시한다. 8 M GnHCl 및 PBS를 사용한 세척 후, 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 ELISA로 측정하였다(A, D, F). 별표시(*)는 1 ㎍/㎖에서 PTX3에 비해 p < 0.05를 표시한다. 복합체를 8 M GnHCl 및 PBS로 다시 세척하고, 결합된 성분을 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 분해된 샘플을 HC1(B), HC2(C), TSG-6(E) 및 PTX3(G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 16은 IαI를 TSG-6에 이어서 PTX3과 함께 순차적으로 첨가한 후 iHA 상에서 형성된 복합체를 예시한다. 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 ELISA로 측정하였다(A, D, F). 복합체를 8 M GnHCl 및 PBS로 다시 세척하고, 결합된 성분을 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 분해된 샘플을 HC1(B), HC2(C), TSG-6(E) 및 PTX3(G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 17은 PTX3에 이어서 IαI를 TSG-6과 함께 순차적으로 첨가한 후 iHA 상에서 형성된 복합체를 예시한다. 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 ELISA로 측정하였다(A, C, E). 복합체를 8 M GnHCl 및 PBS로 다시 세척하고, 결합된 성분을 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 분해된 샘플을 PTX3(B), TSG-6(D), HC1(F) 및 HC2(G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 18은 LPS-자극된 RAW264.7 대식세포와 PBS(대조군), HA(iHA), nHC-HA/PTX3, (IαI/TSG-6/PTX3)/iHA(IαI, TSG-6 또는 PTX3은 iHA에 동시에 결합됨), (IαI/TSG-6)/PTX3/iHA(IαI 및 TSG-6과 함께 미리 항온처리된 iHA에의 PTX3의 순차적 첨가), 또는 (PTX3)/IαI/TSG-6/iHA(PTX3과 함께 미리 항온처리된 iHA에의 IαI 및 TSG-6의 순차적 첨가)의 부착을 예시한다. 세포를 항온처리로부터 24시간 후에 사진촬영하였다.
도 19는 고정화된 기재 상에서 배양되고 LPS로 자극된 RAW264.7 대식세포에서의 유전자 발현을 예시한다. 총 RNA를 단리하고 IL-10 및 IL-12p40 mRNA의 발현을 정량 PCR로 측정하였다(A 및 C). 세포 배양 상청액 중의 IL-10 및 IL-12p70 단백질을 각각의 ELISA로 측정하였다(B 및 D). (E) IL-23 ELISA에 의해 측정되었을 때, 휴지기 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액 중의 IL-23 단백질(부재), 또는 24시간 동안 IFN-γ(200 유닛/㎖), LPS(1 ㎍/㎖), IFN-γ/LPS, 면역 복합체를 갖는 LPS(LPS/IC), 또는 IL-4(10 ng/㎖)로 자극된 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액 중의 IL-23 단백질. (F) IL-23 ELISA에 의해 측정되었을 때, 고정화된 기재 상에서 배양되고 24시간 동안 IFN-γ/LPS로 자극된 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액 중의 IL-23. 별표시(*)는 p 값 < 0.05를 표시한다.
도 20은 인간 탯줄(A) 또는 양막(B)에서 HA, PTX3, TSG-6, HC들 및 비쿠닌의 면역염색을 예시한다. 인간 탯줄의 동결된 절편을 HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 바이오티닐화된 HABP; 및 PTX3 및 TSG-6에 대한 항체, 및 표시된 IαI 및 PαI 성분에 대한 쇄 특이적 항체로 프로빙하였다. 핵을 헥스트(Hoechst) 33342(청색)로 반대염색하였다. Epi, 상피. 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 21은 AM, CH 및 UC로부터의 순차적인 PBS 및 GnHCl 추출물에서 PTX3 수준의 비교를 예시한다. A, 각각의 레인은 레인 2 및 3에서 2 ㎍ HA를 함유하고, 레인 4 내지 11에서 20 ㎍의 총 단백질을 함유한다. B, 각각의 레인은 레인 3 내지 10에서 40 ㎍의 총 단백질을 함유한다.
도 22는 AM, CH 및 UC로부터의 순차적인 PBS 및 GnHCl 추출물에서 HC1, 비쿠닌 및 IαI의 비교를 예시한다. 각각의 레인은 A 및 C에서 20 ㎍의 총 단백질을 함유하고 양성 대조군을 제외한 B 및 D 내지 F에서 40 ㎍의 총 단백질을 함유한다.
도 23은 AM 및 UC GnHCl 추출물에서 TSG-6의 비교를 예시한다. 양성 TSG-6 대조군을 제외한 각각의 레인은 40 ㎍의 총 단백질을 함유한다.
도 24는 제1 내지 제4 AM HC·HA 복합체에서 PTX3(A), HC1(B), HC2(C) 및 TSG-6(D)의 웨스턴 블롯 분석을 예시한다. 양성 대조군을 제외한 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 25는 AME, AM GnHCl 및 제1 내지 제4 HC-HA 복합체에서 TSP-1의 웨스턴 블롯 분석을 예시한다. 레인 3, 4, 10 및 11의 경우 각각의 레인은 30 ㎍의 총 단백질을 함유한다. 레인 5 내지 8 및 12 내지 15의 경우 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 26은 제4 UC HC-HA 복합체에서 PTX3(A), HC1(B), HC2(C), HC3(D) 및 TSG-6(E)의 웨스턴 블롯 분석을 예시한다. 양성 대조군을 제외한 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 27은 PBS 및 GnHCl 추출물로부터의 제4 HC·HA 복합체에서 HC1(A)과 PTX3(B)의 비교를 예시한다. 양성 대조군을 제외한 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 28은 아가로스 겔에서 PBS 및 GnHCl로부터의 제4 HC-HA 복합체의 비교를 예시한다. 양성 HA 대조군을 제외한 각각의 레인은 15 ㎍의 HA를 함유한다.
도 29는 GnHCl HC-HA 및 PBS HC-HA의 SDS-PAGE 겔에 대한 쿠마시 블루 염색을 예시한다. A. AM PBS 및 GnHCl HC-HA. B. UC PBS 및 GnHCl HC-HA. 각각의 레인은 30 ㎍의 HA를 함유한다.
도 30은 케라탄 설페이트 및 오스테오어드헤린이 AM GnHCl HC-HA에 존재하였으나 PBS HC-HA에는 존재하지 않았다는 것을 예시한다. A. 쿠마시 블루 염색. 각각의 레인은 30 ㎍의 HA를 함유한다. B 및 C. 케라탄 설페이트(B) 및 오스테오어드헤린(C)에 대한 웨스턴 블롯. 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다. D. AM에서 케라틴 설페이트에 대한 면역염색.
도 31은 (쿠마시 블루) CB 염색 또는 웨스턴 블롯과 함께 SDS-PAGE에 의한 AM GnHCl HC-HA의 탈글리코실화 및 분석을 예시한다. A. 쿠마시 블루 염색. 5 ㎍의 HA를 함유하는 레인 6을 제외한 각각의 레인은 30 ㎍의 HA를 함유한다. B-H. 오스테오어드헤린(B), 데코린(C, D), 비글리칸(E, F), 케라탄 설페이트(G) 및 PTX3(H)에 대한 웨스턴 블롯. H: 하이알루로니다제; C: 콘드로이티나제(Cabc); K: 케라티나제(케라탄 설페이트 엔도-β-갈락토시다제); T: TFMSA(트리플루오로메탄설폰산). 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 32는 데코린 및 비글리칸이 UC GnHCl HC-HA에는 풍부하게 존재하였으나 PBS HC-HA에는 존재하지 않았다는 것을 예시한다. 케라탄 설페이트, 오스테오어드헤린 및 비쿠닌도 UC GnHCl HC-HA에 존재하였으나, 케라탄 설페이트를 제외한 오스테오어드헤린 및 비쿠닌은 PBS HC-HA에 존재하지 않았다. A. 쿠마시 블루 염색. 5 ㎍의 HA를 함유하는 레인 6을 제외한 각각의 레인은 30 ㎍의 HA를 함유한다. B-H. 데코린(B), 비글리칸(C), 비쿠닌(D), PTX3(E), 케라탄 설페이트(F) 및 오스테오어드헤린(G)에 대한 웨스턴 블롯. H: 하이알루로니다제; C: 콘드로이티나제(Cabc); K: 케라티나제(케라탄 설페이트 엔도-β-갈락토시다제). 각각의 레인은 4 ㎍의 HA를 함유한다.
도 33은 인간 AM에서의 PTX3의 면역편재화(immunolocalization)를 예시한다. 인간 태아 막의 동결된 절편을 항-PTX3, HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 바이오티닐화된 HABP, 및 IαI 성분에 대한 쇄 특이적 항체로 프로빙하였다. 핵을 헥스트 33342(청색)로 반대염색하였다. AM, 양막; Epi, 상피; CH, 융모막. 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 34는 AM 가용성 추출물 및 정제된 HC-HA 복합체에서의 PTX3의 존재를 예시한다. 정제된 PTX3, AM 추출물(AME) 및 AM HC-HA 복합체를 25℃에서 1시간 동안 50 mM NaOH, 또는 37℃에서 1시간 동안 하이알루로니다제(HAase)로 처리하거나 처리하지 않은 후, 항-PTX3(A) 및 항-HC1(B) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅하고 0.5% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석한 후, 스테인스-올 염료(C)로 염색하였다. PTX3 종 및 이의 다량체 형태가 AM 가용성 추출물 및 정제된 HC-HA 복합체에서 발견되었다. M, 단백질 래더(ladder) 마커.
도 35는 AMEC 및 AMSC에 의한 PTX3 mRNA 및 단백질의 발현을 예시한다. RNA 및 단백질을 인간 피부 섬유아세포(피부 섬유아세포), 및 AMEC 및 AMSC 둘다로부터 추출하였다. 상청액 및 세포 용해물에서 PTX3 mRNA(A) 및 단백질(B)의 발현을 비교하였다. PTX3 siRNA 형질감염을 수행하여 AMEC 및 AMSC에서의 PTX3의 발현을 입증하였다(C).
도 36은 아가로스 적층(overlay) 후 인간 피부 섬유아세포(HSF, A), AMSC(B) 및 AMEC(C)의 형태적 변화를 예시한다. HSF, AMSC 및 AMEC를 5일 동안 3% 아가로스 적층을 갖거나 갖지 않는 무혈청 조건 및 혈청 함유 조건 둘다에서 배양하고 세포 형태를 사진촬영하였다. 축적 막대, 50 ㎛.
도 37은 아가로스 적층이 HSF, AMSC 및 AMEC 배양에 의한 배양 배지 내로의 HA의 방출을 감소시켰다는 것을 예시한다. 무혈청 조건 및 혈청 함유 조건 둘다에서 아가로스 적층을 갖거나 갖지 않는 HSF, AMSC 및 AMEC로부터의 배양 배지에서 ELISA 분석으로 HA 농도를 측정하였다.
도 38은 아가로스 적층을 갖는 세포 배양물에서 PTX3, HA 및 HC1의 면역편재화를 예시한다. HSF, AMSC 및 AMEC를 TNF로 처리되거나 처리되지 않은 아가로스 적층으로 배양하고 하이알루로난(적색), PTX3(녹색, A-F; 적색, J-L) 및 HC1(녹색)로 프로빙하였다(핵은 청색이다). HC1과 HA의 공편재화(Colocalization)가 모든 배양물에서 발견되었으나, PTX3과 HA 또는 HC1의 공편재화는 AMSC 및 AMEC에서만 발견되었다. 축적 막대, 50 ㎛.
도 39는 아가로스 적층 하에서 HC-HA/PTX3이 AMSC에는 존재하였으나 HSF에는 존재하지 않았다는 것을 예시한다. 아가로스 적층을 갖는 HSF 및 AMSC 배양물로부터의 세포 층의 GnHCl 추출물을 NaOH로 처리하거나 처리하지 않으면서 PTX3에 대해 웨스턴 블롯팅하였다. M, 단백질 래더 마커.
도 40은 시험관내에서 고정화된 HA 상에서의 HC-HA/PTX3 복합체의 재구성을 예시한다. iHA(약 14 ㎍/㎖), IαI(5 ㎍/㎖) 및 TSG-6(12 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 PTX3(1, 5 또는 20 ㎍/㎖)의 부재 또는 존재 하에서 동시에 항온처리하였다. 순차적으로, iHA(약 14 ㎍/㎖), IαI(12 ㎍/㎖) 및 TSG-6(12 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 반응 완충제에서 항온처리한 후, PTX3(1, 5 또는 20 ㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 8 M GnHCl 및 PBS로 세척한 후, 결합된 성분을 갖는 iHA를 60℃에서 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 샘플을 IαI(A), TSG-6(B) 및 PTX3(C)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 41은 2일 동안 DMEM/10% FBS 상에서(A) 또는 2일 동안 DMEM/10% FBS ± 3일 동안 TGF-β1 상에서(B) 배양된 인간 각막 섬유아세포의 3일째 날까지 세포 형태를 예시한다.
도 42는 가용성 HC-HA(PBS)가 TGF-β1을 억제하나 TGF-β3 신호전달을 활성화시키는 반면, 불용성 HC-HA(GnHCl)가 무혈청 조건 하에서 TGF-β1 및 TGF-β3 신호전달 둘다를 활성화시키고 TGF-β1 자극에 의해 더 향상된다는 것을 예시한다.
도 43은 가용성 HC-HA(PBS) 및 불용성 HC-HA(GnHCl) 둘다가 TGF-β1의 챌린지 하에서 TGF-βR2 및 TGF-βR3 발현을 억제한다는 것을 예시한다. A, TGF-βR mRNA 발현. B, TGF-βR 단백질 발현.
도 44는 TGF-β1 신호전달의 HC-HA 억제에 의한 pSMAD2/3 신호전달의 핵 전위의 억제를 예시한다.
도 45는 알파 평활근 액틴 형성의 HC-HA 억제를 예시한다.
도 46은 BMP6 전사체가 HA 및 가용성/불용성 HC-HA에 의해 활성화되었다는 것을 예시한다. TGF-β1의 첨가는 플라스틱 상에서의 BMP6의 전사체 발현을 활성화시키지만, HA 및 가용성 및 불용성 HC-HA 상에서 HCF에서의 BMP4/6의 mRNA 발현을 급격히 활성화시킨다.
도 47은 HC-HA가 TGF-β1로 챌린지된 HCF에서 BMPR1A의 전사체 발현을 활성화시키나 HA는 그러하지 못하는 반면, 추가 TGF-β1이 HCF에서 BMPR1B 및 BMPR2의 mRNA 발현을 비특이적으로 활성화시킨다는 것을 예시한다.
도 48은 가용성 HC-HA(PBS) 및 불용성 HC-HA(GnHCl) 둘다가 pSMAD1/5/8을 통해 BMP4/6 신호전달을 활성화시킨다는 것을 예시한다.
도 49는 SMAD/1/5/8의 활성화가 BMP 신호전달의 하류 표적인 DNA 결합 1, 3 및 4(ID1, ID3 및 ID4)의 억제제인 그의 하류 유전자의 상향조절을 초래하였다는 것을 예시한다.
도 50은 HC-HA(PBS) 및 HC-HA(GnHCl)가 추가 TGF-β1에 의해 유의하게 하향조절된 케라토칸 mRNA 발현을 각각 14배 및 16배 촉진한다는 것을 예시한다.
도 51은 HC-HA(PBS) 및 HC-HA(GnHCl)가 케라토칸 단백질 발현을 촉진한다는 것을 예시한다.
도 52는 세포가 TGF-β1의 첨가로 챌린지되었을 때 HCF가 플라스틱 상에서보다 4X HC-HA(PBS) 및 불용성 HC-HA(GnHCl) 상에서 더 많은 ESC 마커를 발현한다는 것을 예시한다.
도 53은 MTT에 의해 측정되었을 때 MC3T3-E1 세포의 세포 생존력을 예시한다.
도 54는 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색에 의해 측정되었을 때 MC3T3-E1 세포의 광물화를 예시한다.
도 55는 유도의 13일째 날 HC-HA(A) 또는 AMP(B)로 처리된 MC3T3-E1 세포의 형태를 예시한다.
도 56은 유도의 13일째 날 HC-HA(A) 또는 AMP(B)로 처리된 MC3T3-E1 세포의 알리자린 레드 염색을 예시한다.
도 57은 유도의 13일째 날 HC-HA(A) 또는 AMP(B)로 처리된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색의 정량 분석을 예시한다.
도 58은 유도의 13일째 날 HC-HA(A) 또는 AMP(B)로 처리된 세포의 ALP 활성(IU/ℓ)을 예시한다.
도 59는 3일째 날부터 유도 후 MC3T3-E1 세포에서의 형태적 변화의 위상차 현미경관찰을 예시한다. (A) 비유도된 세포를 7일 동안 10% FBS 함유 αMEM에서 배양하였다. (B) MC3T3-E1 세포를 시딩 다음날(0일째 날) 평저 96웰 플레이트에서 전면생장률(confluence)까지 배양하였다. 그 다음, 세포를 아스코르브산 및 β-글리세로포스페이트로 유도하였다.
도 60은 1일째 날부터 7일째 날까지 HC-HA(A) 또는 AMP(B)로 처리된 유도된 MC3T3-E1 세포에서 형태적 변화의 위상차 현미경관찰을 예시한다.
도 61은 유도의 3일째 날부터 유도된 MC3T3-E1 세포에서 방추 고리 형성의 위상차 현미경관찰을 예시한다.
도 62는 HC-HA(A) 및 AMP(B)로 처리된 유도된 MC3T3-E1 세포에서 방추 고리 형성의 위상차 현미경관찰을 예시한다(0일째 날부터 6일째 날까지).
도 63은 HC-HA 및 AMP로 처리된 유도된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색 및 GnHCl을 사용한 추출을 예시한다.
도 64는 아세트산 및 10% 수산화암모늄을 사용한 MC3T3-E1 세포의 ARS 추출 및 정량을 예시한다. 아세트산 처리를 통해 수득한 ARS 추출물을 10% 수산화암모늄으로 중화시킨 후, 분광측정기(B) 상에서의 판독을 위해 96웰 투명 바닥 분석 플레이트(A)에 첨가하였다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 65는 GnHCl을 사용한 MC3T3-E1 세포의 ARS 추출 및 정량을 예시한다. GnHCl 처리를 통해 수득된 ARS 추출물을 분광측정기(B) 상에서의 판독을 위해 96웰 투명 바닥 분석 플레이트(A)에 첨가하였다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 66은 19일째 날(유도의 18일째 날) HC-HA로 처리된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색(A) 및 정량(B)을 예시한다. ARS 염색을 배양의 19일째 날(유도의 18일째 날)에 수행하였다.
도 67은 AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색(A) 및 정량(B)을 예시한다. ARS 염색을 배양의 19일째 날(유도의 18일째 날)에 수행하였다.
도 68은 유도의 14일째 날 유도된 MC3T3-E1 세포에서 관찰된 방추-유사 고리를 예시한다.
도 69는 트랜스웰 없이 배양되었거나(A) 트랜스웰로 배양되었고(B) 14일의 유도 후 AMP로 처리된 유도된 MC3T3-E1 세포의 세포 형태의 위상차 현미경관찰을 예시한다.
도 70은 유도의 14일째 날 유도된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색을 예시한다.
도 71은 유도의 14일째 날 유도된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색의 정량을 예시한다.
도 72는 AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포의 ARS 염색 및 정량을 예시한다. (A) 배양의 21일째 날(유도의 20일째 날) 촬영된 MC3T3-E1 세포의 위상차 사진 및 ARS 염색 사진. (B) 배양의 21일째 날(유도의 20일째 날) ARS 염색을 정량하였다. * 부호는 p < 0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 73은 조골세포로의 상이한 전구체 분화의 맵을 예시하는데, 이때 배양 배지에 첨가된 공통된 인자들이 표시되어 있다.
도 74는 MC3T3-E1 세포에서 ARS 염색 및 정량을 예시한다. (A) 4일째 날부터 21일째 날까지 HUVEC, hBMMSC 및 hAM 기질 줄기 세포의 ARS 염색을 갖거나 갖지 않는 위상차 현미경사진. (B) ARS 염색의 정량. * 부호는 음성 대조군과 비교될 때 p <0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 75는 MC3T3-E1 세포에서의 골형성의 시각표를 예시한다.
도 76은 MC3T3-E1 세포에서의 ARS 염색 및 정량을 예시한다. (A) AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포의 세포 형태 및 ARS 염색(1일째 날, 2일째 날, 7일째 날 및 10일째 날). (B) AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포의 ARS 정량(1일째 날, 2일째 날, 7일째 날 및 10일째 날). *는 p <0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 77은 MTT 분석을 통해 세포 생존력 및 증식의 시각표를 예시한다. (A) 1일째 날, 2일째 날 및 4일째 날 MC3T3-E1 세포 생존력 및 대사 활성의 MTT 분석. *는 1일째 날부터 p < 0.05의 통계적 유의성을 나타낸다. (B) 1일째 날, 2일째 날 및 16일째 날 MC3T3-E1 세포 증식의 BrdU 분석. *는 1일째 날부터 p < 0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 78은 AMP로 처리하거나 처리하지 않으면서 분화를 유도한 후 시험된 다양한 유전자들에 대한 QPCR에 의한 mRNA 발현을 예시한다. (a) hMSC 및 (b) MC3T3-E1 세포 발현.
도 79는 ARS 분석의 위상 현미경관찰 및 정량을 예시한다. MC3T3-E1 세포는 실험 지속기간인 8일 동안 광물화를 침착시켰다. 그 다음, ARS를 정성 분석에 사용하였다. (A) PBS, HA 및 HC-HA가 고정화된 코바링크-NH 96웰 플레이트. (B) 음성 대조군 및 AGM(유도제), 및 양성 대조군으로서의 AMP를 갖는 통상적인 96웰 플레이트. (C) ARS 분석의 정량. *는 1일째 날부터 p < 0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 80은 HC-HA/PTX3로 처리하거나 처리하지 않으면서 분화를 유도한 후 시험된 다양한 유전자들에 대한 QPCR에 의한 mRNA 발현을 예시한다. (A) 21일째 날, 7일째 날 및 14일째 날 골형성 및 연골형성에 대한 마스터 전사 인자 Runx2 및 Sox9. (B) 14일째 날 골 형태형성 단백질(BMP) 발현. (C) 7일째 날 및 14일째 날 발현된 연골형성 마커 콜라겐 2(COL2) 및 골형성 마커 알칼리성 포스파타제(ALPL). (D) 14일째 날 발현된 비대 마커 콜라겐 10(COL10) 및 MMP13. (E) 14일째 날 골형성 마커 콜라겐 1(COL1), 오스테릭스(Osterix)(OSX) 및 골 시알로단백질(BSP).
도 81은 14일째 날 (가용성 또는 불용성) HC-HA/PTX3로 처리하거나 처리하지 않으면서 분화를 유도한 후 ARS 분석의 위상 현미경관찰(A) 및 정량(B)을 예시한다.
도 82는 CD4+ T-세포 활성화 및 분화를 예시한다. 상이한 자극 하에서 무자극(Naive) CD4+ T 헬퍼 세포(Th)는 Th1, Th2, Th17 또는 Treg로 분화하고 상이한 사이토카인을 분비한다. Th1형 사이토카인(예를 들면, IFN-γ 및 IL-2)은 호염증 반응을 생성하는 경향을 나타낸다.
도 83은 세포 증식 및 사이토카인 생성을 측정하는 절차를 예시한다. 오브알부민(OVA)에 대해 특이적인 형질전환 TCR을 발현하는 OT-II 마우스로부터 비장세포를 단리하여 최대 4일 동안 OVA로 자극하였다. 세포 증식을 BrdU 표지부착으로 측정하였고, 사이토카인(IFN-γ 및 IL-2)의 발현을 각각의 ELISA로 측정하였다.
도 84는 CD4+ T-세포 증식의 nHC-HA/PTX3 억제를 예시한다. Ova T-세포 수용체 형질전환 마우스로부터 단리된 비장세포를 4일 동안 OVA(0 내지 10 μM)로 자극하였다. AM 추출물(AME, 25 ㎍/㎖) 및 nHC-HA/PTX3(25 ㎍/㎖)은 증가하는 OVA 농도에 의해 유도된 활성화된 T-세포의 클론 생장을 억제하였다(상부). HA, AME 또는 nHC-HA/PTX3으로 처리하고 4일 동안 CFSE로 표지된 비장세포의 증식을 유동 세포측정으로 측정하였다. AME 및 nHC-HA/PTX3 둘다가 세포 증식을 용량 의존적으로 억제하였다(중간). 25 ㎍/㎖의 nHC-HA/PTX3이 BrdU로 표지된 CD4+ T-세포의 증식을 억제하였다(하부)(*, 대조군에 비해 p < 0.05).
도 85는 Th1형 사이토카인 IFN-γ 및 IL-2의 nHC-HA/PTX3 억제를 예시한다. PBS, 25 ㎍/㎖ HA, 25 ㎍/㎖ AME 또는 25 ㎍/㎖ nHC-HA/PTX3으로 처리된 비장세포를 4일 동안 10 μM OVA로 자극하였다. 배양 상청액 중의 IFN-γ 및 IL-2를 각각의 ELISA로 측정하였다. AME 및 nHC-HA/PTX3 둘다가 IFN-γ 및 IL-2의 생성을 억제하였다(*, 대조군에 비해 p < 0.05).
도 86은 (증강된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP로 표지된) 대식세포 유입의 nHC-HA/PTX3 감소를 예시한다. LPS(2 ㎕의 2 ㎍/㎖)를 마피아(Mafia) 마우스의 각막 기질(stroma) 내로 주사하였다. 즉시, 5 ㎕의 PBS 또는 nHC-HA/PTX3(1 mg/㎖)을 결막하 조직을 통해 동일한 마우스로부터의 한 각막의 각각의 사분원 내로 주사하였다. LPS 처리 후 1일째 날, 2일째 날, 3일째 날 및 6일째 날 생체내 생체현미경관찰을 이용하여 EGFP+ 대식세포의 유입을 모니터링한다(상부). 대안적으로, 마우스 각막을 LPS와 동시에 PBS 또는 nHC-HA/PTX3으로 처리하였다(전처리(-) 또는 LPS 처리 전 3일(전처리(+)). LPS 처리 후 4일째 날, 각막의 세포를 콜라게나제 분해로 단리하고 FACS로 EGFP- 또는 EGFP+(대식세포)로 분류하였다(* 및 **, 각각 대조군에 비해 p < 0.05 및 p < 0.01).
도 87은 M2 표현형을 향한 대식세포의 nHC-HA/PTX3 분극화를 예시한다. LPS-유발된 뮤린 각막으로 침윤된 대식세포(EGFP+)에서 M2 마커(Arg-1 및 IL-10) 및 M1 마커(IL-12p40 및 IL-12p35)의 mRNA 발현을 qPCR로 정량하였다(* 및 **, 각각 대조군에 비해 p < 0.05 및 p < 0.01).
도 88은 각막 동종이식물 생존의 nHC-HA/PTX3 개선을 예시한다. 뮤린 각막 동종이식물의 생존은 1개의 사분원 결막하 부위에서 nHC-HA/PTX3의 주사에 의해 유의하게 개선되었으나(10 ㎍/회, 2회/주, 상부 좌측), 4개의 사분원 결막하 부위에서 nHC-HA/PTX3의 주사에 의해 훨씬 현저히 더 우수하게 개선되었다(20 ㎍/회, 2회/주, 상부 우측). 각막 동종이식물에서 PBS(수술 후 21일째 날, 좌측) 또는 nHC-HA/PTX3 처리(수술 후 40일째 날, 우측)의 사진(하부).
도 89는 Th1 및 Th17 림프구를 활성화시켜 많은 만성 염증성 질환들을 야기하는 고수준의 호염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α, IL-12, 및 IL-23)을 발현하기 위한 (예를 들면, IFN-γ 및/또는 TLR 리간드, 예컨대, LPS에 의해 유도된) 대식세포 고전적 M1 활성화를 예시한다.
도 90은 PBS(대조군), HC-HA/PTX3 또는 AMP의 처리 시 뮤린 각막으로의 LPS-유발된 대식세포 침윤을 예시한다. 양 눈에 LPS 기질내 주사(5 ㎍)를 제공받은 마피아 마우스(대식세포는 EGFP+이다). OS를 PBS로 처리하고, OD를 HC-HA(2개의 주사 부위)(A), HC-HA(4개의 주사 부위)(B), AMP(2개의 주사 부위)(C), 또는 AMP(4개의 주사 부위)(D)로 처리하였고, 이때 각각의 주사는 5 ㎕이었다. 처리는 LPS 주사 직후 1회이었다. 1일째 날, 2일째 날, 3일째 날 및 6일째 날 이미지를 촬영하였다. 녹색 형광의 강도를 기초로 세포를 카운팅하였다.
도 91은 PBS(대조군), nHC-HA/PTX3 또는 AMP로 처리하거나 전처리하였을 때 뮤린 각막 및 이들의 아류형(M1 및 M2)으로의 LPS-유발된 대식세포 침윤을 예시한다. 마피아 마우스의 전처리 및 처리는 도 86에 기재된 바와 동일하다. 4일째 날, 각막 버튼을 절단하고 2시간 동안 37℃에서 콜라게나제로 분해한다. EGFP-양성/음성 세포를 FACS로 분류한다. EGFP-양성 대식세포 대 EGFP-음성 세포의 비를 계산하고 대식세포 침윤의 정도를 측정하는 데에 임의 유닛(arbitrary unit)으로서 사용한다(A). 분류된 EGFP-양성 대식세포로부터 총 RNA를 추출하여 cDNA로 전환시켰다. Arg-1, IL-10, IL-12p40 및 IL-12p35의 발현을 정량 PCR로 측정한다(B).
도 92는 주사 부위의 도표를 보여준다. 주사 위치는 원개(fornix)에 가까운 결막하에 있을 것이고, nHC-HA/PTX3 또는 AMP는 뮤린 실험 안건조증 모델에서 DS-유도된 ALKC를 감소시킬 수 있다.
도 93은 혈관신생을 촉진하기 위한 IGF1-HIF1α-VEGF 신호전달의 HC-HA 활성화를 예시한다. HC-HA는 세포가 휴지기 상태에 있을 때 IGF1 mRNA의 2배 내지 6배 증가 및 VEGF mRNA의 2배 증가를 유도한다. HC-HA는 세포가 TGF-β(10 ng/㎖)에 의해 챌린지될 때 IGF1 mRNA의 5배 내지 12배 증가 및 VEGF mRNA의 5배 내지 9배 증가를 유도한다. n=4, *p<0.05, **p<0.01. IGF1, 인슐린 유사 성장인자 1; HIF1α, 저산소증 유도성 인자 1-알파; VEGF, 혈관 내피 성장인자.
특정 용어
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 특허청구된 보호대상이 속하는 분야에서 숙련된 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 달리 언급되어 있지 않은 한, 본원의 전체 개시내용에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공개문헌, 진뱅크 서열, 웹사이트 및 다른 공개된 자료는 온전히 그대로 참고로 도입된다. 본원에서 용어에 대한 다수의 정의가 존재하는 경우, 이 단락에 기재된 정의가 우선할 것이다. URL 또는 다른 이러한 식별자 또는 주소가 언급되는 경우, 이러한 식별자는 변할 수 있고, 인터넷 상의 구체적인 정보는 변천될 수 있으나, 동등한 정보가 공지되어 있고 예컨대, 인터넷 및/또는 적절한 데이터베이스의 검색에 의해 용이하게 접근될 수 있다는 것이 이해된다. 이에 대한 언급은 이러한 정보의 입수가능성 및 공개적 유포를 입증한다.
본원에서 사용될 때, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 정확한 양도 포함한다. 따라서, "약 5 ㎍"은 "약 5 ㎍"뿐만 아니라 "5 ㎍"도 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있을 것으로 예상되는 양을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체는 시험관내에서 복합체의 성분 분자들의 조립에 의해 형성되는 HC-HA/PTX3 복합체이다. rcHC-HA/PTX3을 조립하는 과정은 생물학적 공급원으로부터 정제된 천연 단백질 또는 분자를 사용한 재구성, 재조합 방법에 의해 발생된 재조합 단백질, 또는 시험관내 합성에 의한 분자의 합성을 포함한다. 일부 경우, rcHC-HA/PTX3의 조립에 사용되는 정제된 천연 단백질은 다른 단백질과의 복합체(즉, 다량체, 다중쇄 단백질 또는 다른 복합체)로 존재하는 단백질이다. 일부 경우, PTX3은 세포로부터 다량체(예를 들면, 동종다량체)로서 정제되고 rcHC-HA/PTX3 복합체의 조립에 사용된다.
본원에서 사용될 때, 정제된 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체는 생물학적 공급원, 예컨대, 세포, 조직 또는 생물학적 유체로부터 정제된 HC-HA/PTX3 복합체를 지칭한다. 이러한 복합체는 일반적으로 대상체의 생체내에서 조립되거나, 인간 또는 다른 동물을 포함하는 대상체의 생체외 세포, 조직 또는 생물학적 유체에서 조립된다.
본원에서 사용될 때, PTX3/HA 복합체는 PTX3을 고정화된 HA와 접촉시킴으로써 형성되는 중간체 복합체를 지칭한다. 본원에서 제공된 방법에서, PTX3/HA 복합체는 HC1을 HA에 첨가하기 전에 발생된다.
본원에서 사용될 때, "하이알루로난", "하이알루론산" 또는 "하이알루로네이트"(HA)는 D-글루쿠론산 및 N-아세틸글루코스아민으로 구성된 반복 이당류 유닛(D-글루쿠로노실-N-아세틸글루코스아민)을 갖는 실질적으로 비-설페이트화된 선형 글리코스아미노글리칸(GAG)을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용될 때, 고분자량 하이알루로난(HMW HA)에서와 같이 용어 "고분자량" 또는 "HMW"는 약 500 킬로달톤(kDa) 초과, 예를 들면, 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1400 kDa 내지 약 3,500 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 HA를 지칭하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 3000 kDa 이상의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 3000 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 약 3000 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 힐론(Healon)®이다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 약 3,000 kDa의 분자량을 갖는다.
본원에서 사용될 때, 저분자량 하이알루로난(LMW HA)에서와 같이 용어 "저분자량" 또는 "LMW"는 500 kDa 미만, 예컨대, 약 400 kDa 미만, 약 300 kDa 미만, 약 200 kDa 미만, 약 200 내지 300 kDa, 또는 약 1 내지 300 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 HA를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용될 때, 펜트락신 3 또는 PTX3 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합적으로 제조된 단백질, 합성적으로 제조된 단백질, 천연 PTX3 단백질, 및 세포 또는 조직으로부터 추출된 PTX3 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 PTX3 단백질을 지칭한다. PTX3은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 팔량체, 및 천연적으로 또는 인위적으로 제조된 다른 다량체 형태를 포함하나 이들로 한정되지 않는 PTX3의 다량체 형태(예를 들면, 동종다량체)를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 종양 괴사 인자-자극된 유전자-6(TSG-6)은 재조합적으로 제조된 단백질, 합성적으로 제조된 단백질, 천연 TSG-6 단백질, 및 세포 또는 조직으로부터 추출된 TSG-6 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 TSG-6 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 인터-α-억제제(IαI)는 콘드로이틴 설페이트 쇄에 의해 공유연결된 경쇄(즉, 비쿠닌) 및 HC1 또는 HC2 유형의 1개 또는 2개의 중쇄로 구성된 IαI 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IαI의 공급원은 혈청으로부터 유래되거나, 호염증성 사이토카인, 예컨대, IL-1 또는 TNF-α에 의한 항시적 모드 자극 하에서 IαI를 생성하는 세포, 예를 들면, 간세포, 양막 상피 또는 기질 세포, 또는 탯줄 상피 또는 기질 세포로부터 유래된다.
본원에서 사용될 때, "하이알루로난 결합 단백질", "HA 결합 단백질" 또는 "HABP"는 HA에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "연결 모듈"은 하이알루로난 결합 도메인을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "생물학적 활성"은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 생체내 활성; 또는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체, 또는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 조성물 또는 혼합물의 생체내 투여 시 발생되는 생리학적 반응을 지칭한다. 따라서, 생물학적 활성은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체, 및 이들의 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약리 활성을 포괄한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들 중 어느 용어도 의학 전문가(예를 들면, 의사, 간호사, 의사 보조자, 병원 잡역부, 호스피스 근로자)의 감독을 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본원에서 사용될 때, 대상체는 포유동물(예를 들면, 인간 또는 비인간 동물) 및 비-포유동물을 포함하는 임의의 동물이다. 본원에서 제공된 방법 및 조성물의 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료" 및 다른 문법적 균등물은 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 경감시키거나 호전시키는 것, 질환 또는 질병의 하나 이상의 추가 증상의 외관, 중증도 또는 빈도를 호전시키거나, 예방하거나 감소시키는 것, 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상의 근본적인 대사적 원인을 호전시키거나 예방하는 것, 질환 또는 질병을 억제하는 것, 예를 들면, 질환 또는 질병의 발달을 정지시키는 것, 질환 또는 질병을 완화시키는 것, 질환 또는 질병의 퇴행을 야기하는 것, 질환 또는 질병에 의해 야기된 상태를 완화시키는 것, 또는 질환 또는 질병의 증상을 예방적으로 및/또는 치료적으로 억제하는 것을 포함한다. 비-한정적 예에서, 예방 이익을 위해, 본원에 개시된 rcHC-HA/PTX3 복합체 또는 조성물은 특정 장애를 발생시킬 위험에 있는 개체, 특정 장애를 발생시키는 성향이 있는 개체, 또는 장애의 생리학적 증상들 중 하나 이상을 보고하는 개체에게 투여된다.
본원에서 사용될 때, "태반"은 모체 혈액 공급을 통한 영양분 섭취, 폐기물 제거 및 기체 교환을 허용하도록 발생 태아를 모체 자궁벽에 연결하는 장기를 지칭한다. 태반은 3개의 층으로 구성된다. 태아를 둘러싸는 가장 안쪽 태반 층은 양막으로서 지칭된다. 요막은 (배아 후장으로부터 유래된) 태반의 중간층이고, 혈관이 이 막을 횡단하여 배꼽으로부터 발생된다. 태반의 가장 바깥쪽 층인 융모막은 자궁내막과 접촉한다. 융모막과 요막은 융합하여 융모요막을 형성한다.
본원에서 사용될 때, "융모막"은 배아외중배엽 및 2개 층의 영양막에 의해 형성된 막을 지칭한다. 융모막은 2개의 층으로 구성되고: 영양막에 의해 형성된 외부, 및 체세포 중배엽에 의해 형성된 내부; 양막은 체세포 중배엽과 접촉한다. 영양막은 입방형 또는 각기둥형 세포로 구성된 내층, 랑게르한스의 세포영양막 또는 층, 및 세포 경계를 결여하는 풍부한 핵을 갖는 원형질의 외층인 융합영양막으로 구성된다. 무혈관 양막은 융모막의 내층에 부착된다.
본원에서 사용될 때, "양막-융모막"은 양막 및 융모막을 포함하는 생성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 양막과 융모막은 분리되어 있지 않다(즉, 양막은 융모막의 내층에 천연적으로 부착된다). 일부 실시양태에서, 양막은 먼저 융모막으로부터 분리되고 나중에 프로세싱 동안 융모막과 조합된다.
본원에서 사용될 때, "탯줄"은 발생 태아를 태반에 연결하는 장기를 지칭한다. 탯줄은 주로 점액다당류로 만들어진 젤라틴성 물질인 와튼 젤리로 구성된다. 탯줄은 산소 및 영양분이 풍부한 혈액을 태아에게 운반하는 1개의 정맥, 및 산소 및 영양분이 고갈된 혈액을 운반하는 2개의 동맥을 함유한다.
본원에서 사용될 때, "태반 양막"(PAM)은 태반으로부터 유래된 양막을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PAM은 실질적으로 단리된다.
본원에서 사용될 때, "탯줄 양막"(UCAM)은 탯줄로부터 유래된 양막을 의미한다. UCAM은 반투명한 막이다. UCAM은 다수의 층을 갖는다: 기저막인 상피 층; 치밀한 층; 섬유아세포 층; 및 스폰지 층. UCAM은 혈관 또는 직접적인 혈액 공급을 결여한다. 일부 실시양태에서, UCAM은 와튼 젤리를 포함한다. 일부 실시양태에서, UCAM은 혈관 및/또는 동맥을 포함한다. 일부 실시양태에서, UCAM은 와튼 젤리 및 혈관 및/또는 동맥을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "정제된" 및 "단리된"은 그의 천연 상태에서 정상적으로 그에 동반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 갖지 않는 물질(예를 들면, nHC-HA/PTX3 복합체)을 의미한다. 일부 실시양태에서, "정제된" 및 "단리된"은 물질(예를 들면, nHC-HA/PTX3 복합체)이 그의 천연 상태에서 정상적으로 그에 동반되는 성분을 약 50% 이상 갖지 않는다는 것, 예를 들면, 그의 천연 상태에서 정상적으로 그에 동반되는 성분을 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 갖지 않는다는 것을 의미한다.
개요: nHC-HA/PTX3 및 rcHC-HA/PTX3 복합체
하이알루로난(HA)은 GlcUA-β1,3-GlcNAc-β1,4-연결을 통해 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코스아민의 반복 이당류 서브유닛으로 구성된 실질적으로 비-설페이트화된 선형 글리코스아미노글리칸(GAG)이다. HA는 HA 합성효소(예를 들면, HAS1, HAS2 및 HAS3)에 의해 합성되고 세포외 매트릭스 내로 침착되고, 여기서 조직의 구조적 통합성에 기여하고 세포 표면 수용체를 포함하는 단백질과의 상호작용을 통해 많은 세포 과정도 조절한다. HA의 분자량은 크기에 있어서 전형적으로 약 200 내지 약 10,000 kDa이다. HA의 정상 수준은 HAS 효소에 의한 생합성과 하이알루로니다제, 예컨대, Hyal1에 의한 이화작용의 균형을 통해 조직에서 유지된다.
전형적으로 500 kDa 초과의 고분자량 HA(HMW HA)는 세포 무활동, 및 연골 및 눈의 유리체(체액)와 같은 조직의 구조적 통합성을 촉진하고, 흉터 없는 태아 상처 치유와 관련되어 있다. 일부 경우, HMW HA는 호염증성 매개자의 유전자 발현 및 혈관신생을 억제한다.
특정 병원성 조건에서, HMW HA는 (예를 들면, 하이알루로니다제 또는 자유 라디칼 산화를 통해) 보다 작은 단편 및 올리고당류로 분해된다. LMW HA 단편은 호염증성 매개자 및 혈관신생유발(pro-angiogenic) 매개자의 유전자 발현을 촉진함으로써 래트 피부, 심근경색 및 냉동손상된 피부 이식물 모델에서 혈관 내피 세포 증식, 이동, 콜라겐 합성, 발아 형성 및 혈관신생을 자극한다.
HA의 생물학적 기능은 하이알어드헤린(hyaladherin)으로서도 지칭되는 HA 결합 단백질(HABP)과 HA의 상호작용을 통해 매개된다. 이러한 단백질은 종양 괴사 인자-α-자극된 유전자 6(TSG-6), 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, LYVE-1, CD44, 및 인터-α-억제제(IαI)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 경우, HABP는 HA에 결합하는 연결 모듈 도메인을 포함한다. TSG-6, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, LYVE-1 및 CD44는 연결 모듈을 함유하는 예시적인 HABP이다.
IαI는 경쇄(즉, 비쿠닌)에 부착되는 콘드로이틴 설페이트 쇄에 에스테르 결합을 통해 연결되는 2개의 중쇄(HC1 및 HC2)를 포함한다. 일부 경우, HA는 IαI 중쇄와의 공유연결에 의해 IαI의 HC들 중 하나 또는 둘다와 함께 공유 복합체(이하, "HC-HA")를 형성한다. 일부 경우, IαI는 혈청에서 발견되고/되거나, 호염증성 사이토카인, 예컨대, IL-1 또는 TNF-α에 의한 항시적 모드 자극 하에서 IαI를 생성하는 세포, 예를 들면, 간세포, 양막 상피 또는 기질 세포, 또는 탯줄 상피 또는 기질 세포로부터 수득된다.
일부 경우, TSG-6은 IαI의 HC1 및 HC2를 HA로 전달하는 것을 용이하게 하고/하거나, 이러한 전달을 촉매작용하고/하거나, 이러한 전달을 수행한다. TSG-6은 고정화된 HA와 안정한 복합체(TSG-6·HA)를 형성하여 HC1 및 HC2를 HA로 전달함으로써 HC-HA 복합체를 형성하고 이 복합체로부터 TSG-6을 방출시킨다. TSG-6의 발현은 염증-유사 과정, 예컨대, 배란 및 자궁경부 성숙 동안 염증 매개자, 예컨대, TNF-α 및 인터류킨-1에 의해 종종 유도된다.
양막(AM)은 성체 상처 치유를 조절하고 조직 재생을 용이하게 한다. 일부 경우, AM은 기질 염증, 혈관신생 및 흉터형성을 억제하면서 상피화를 촉진한다. AM은 각막 및 결막 표면 재구성을 필요로 하는 안과 질병(지속적인 상피 결함, 깊은 각막 궤양, 감염성 각막염, 유증상 수포각막병증, 급성 스티븐스 존슨 증후군/독성 표피 괴사용해(SJS/TEN), 윤부 줄기 세포 결핍, 익상편, 결막황반, 결막이완증, 검구유착, 원개 재구성 및 결막 종양을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 치료를 위한 외과용 이식물 또는 임시적인 생물학적 패치로서 성공적으로 사용되어 왔다.
AM의 무혈관 기질 매트릭스는 다량의 HA를 함유하고 IαI를 항시적으로 발현한다(Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(15):12433-44). AM에서 HMW HA는 nHC-HA 복합체를 형성한다(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284(30):20136-20146). 본원에서 제공된 실시예에서 입증된 바와 같이, 이 nHC-HA 복합체는 펜트락신 3(PTX3)도 함유하므로(도 1), 본원에서 "nHC-HA/PTX3 복합체"로서 지칭된다. AM으로부터 추출된 천연 HC-HA/PTX3 복합체는 TGF-β 프로모터 활성의 억제, 대식세포 세포 사멸의 촉진 및 혈관 발생의 억제를 나타낸다. 따라서, AM의 nHC-HA/PTX3 복합체는 AM의 소염, 흉터형성방지 및 항-혈관신생 작용에 있어서 능동적인 역할을 수행한다.
본원에 기재된 바와 같이, nHC-HA/PTX3 복합체는 탯줄(UC)에서도 발견된다. UC HC-HA/PTX3 복합체는 HA 함량, 및 복합체의 다양한 성분들(프로테오글리칸, 예컨대, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)을 포함함)의 존재 및/또는 상대적 존재량에 대한 그들의 생화학적 조성에서 상이하다. 일부 실시양태에서, SLRP는 데코린, 비글리칸 및/또는 오스테오어드헤린이다. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 복합체는 특정 설페이트화된 글리코스아미노글리칸, 예컨대, 케라탄 설페이트의 존재에 대한 함량에서도 상이한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 상이한 추출 방법(예를 들면, PBS 대 GnHCl 추출)을 이용하여 AM 또는 UC로부터 단리한 복합체는 상이한 생화학적 조성 및 생물학적 성질을 갖는 복합체를 발생시켰다. 일부 경우, 탯줄 조직으로부터의 GnHCl 추출에 의해 불용성 분획으로부터 단리된 복합체는 개선된 성질을 나타낸다는 것이 발견되었다.
PTX3은 TSG-6 및 IαI HC와 직접적으로 상호작용하는 것으로 밝혀진 다량체 단백질이다. PTX3은 염증 조절제에 반응하여 상향조절되고 난모세포 성숙 동안 난구의 세포외 매트릭스에서 HA의 조직화에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀져 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, PTX3은 양막 및 탯줄의 nHC-HA 복합체(즉, nHC-HA/PTX3) 내에서도 발견되고, M2 대식세포 분극화에 있어서 결정적인 역할을 수행한다.
M1 대식세포 또는 고전적으로 활성화된 호염증성 대식세포는 단독으로 또는 지질다당류(LPS) 또는 종양 괴사 인자(TNF) α와 함께 사용된 인터페론(IFN)에 의해 유도된다. M1 대식세포는 전형적으로 인터류킨-12(IL-12) 및 IL-23의 높은 발현 및 낮은 수준의 IL-10을 특징으로 한다. 대조적으로, M2 대식세포 또는 "대안적으로 활성화된" 대식세포는 상처 치유 및 조직 재생 성질을 나타내고 낮은 IL-12/IL-23 및 높은 IL-10 또는 거의 동일한 비의 IL-12 대 IL-10을 특징으로 한다. 일부 경우, M2 대식세포는 TGF-β의 높은 발현도 갖는다.
본원에서 제공된 실시예는 해리제에 대한 내성에 의해 입증된 바와 같이 PTX3이 고정화된 HA에 직접적으로 결합한다는 것을 입증한다. PTX3에 결합된 HA의 시험관내 재구성된 복합체가 TSG-6에 결합된 HA의 시험관내 재구성된 복합체에 비해 상이한 성질을 나타낸다는 것이 본원에서 입증된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체는 응집 없이 LPS-자극된 대식세포의 부착을 촉진하고 LPS-자극된 대식세포에서 IL-10의 발현을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 PTX3/HA 복합체는 PTX3/HA 복합체의 부재 하에서의 IL-10 발현에 비해 LPS-자극된 대식세포에서 IL-10의 발현을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 증가시킨다. 대조적으로, 일부 실시양태에서, TSG-6/HA 복합체는 세포 부착을 감소시키고 LPS-자극된 대식세포의 응집을 촉진하고 LPS-자극된 대식세포에서 IL-10의 발현을 유도하지 않는다. 추가로, 일부 실시양태에서, HA에 미리 결합된 TSG-6은 PTX3과 복합체의 후속 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, TSG-6/HA 복합체 및 PTX3/HA 복합체 둘다가 LPS-자극된 대식세포에서 IL-12의 발현을 감소시켰다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 PTX3/HA 복합체 또는 TSG-6/HA 복합체는 PTX3/HA 복합체 또는 TSG-6/HA 복합체의 부재 하에서의 IL-12 발현에 비해 LPS-자극된 대식세포에서 IL-12의 발현을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, TSG-6/HA 복합체 및 PTX3/HA 복합체 둘다가 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에서 IL-23의 발현을 증가시켰다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 PTX3/HA 복합체 또는 TSG-6/HA 복합체는 PTX3/HA 복합체 또는 TSG-6/HA 복합체의 부재 하에서의 IL-23 발현에 비해 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에서 IL-23의 발현을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시키거나 억제한다.
추가로, 시험관내 재구성된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 IαI의 존재 하에서 HA를 TSG-6에 미리 결합시킨 후 PTX3을 첨가함으로써 rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하는지 아니면 HA를 PTX3에 미리 결합시킨 후 IαI와 함께 TSG-6을 첨가함으로써 rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하는지에 따라 상이한 생물학적 활성을 보유한다는 것이 본원에서 입증된다. TSG-6에 미리 결합된 HA 또는 PTX3에 미리 결합된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체의 예시적인 재구성 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, TSG-6에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 LPS-자극된 대식세포의 응집을 초래한다. 일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 응집 없이 LPS-자극된 대식세포의 부착을 촉진한다.
일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 M1 대식세포 마커, 예컨대, IL-12 및 IL-23의 발현을 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서의 IL-12 발현에 비해 LPS-자극된 대식세포에서 IL-12의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서의 IL-12 발현에 비해 LPS-자극된 대식세포에서 IL-12의 발현을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서의 IL-12 발현에 비해 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에서 IL-23의 발현을 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서의 IL-23 발현에 비해 LPS/IFNγ-자극된 대식세포에서 IL-23의 발현을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 양막으로부터 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체의 활성을 재현한다.
일부 실시양태에서, TSG-6에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 M1 대식세포 마커, 예컨대, IL-12의 발현을 감소시키거나 억제하지만, IL-23의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, TSG-6에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 IL-12의 발현을 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, TSG-6에 미리 결합된 고정화된 HA로 형성된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 IL-23의 발현을 증가시킨다.
PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA를 사용하여 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 제조하는 방법 및 이의 용도가 본원에서 제공된다. PTX3에 미리 결합된 고정화된 HA의 복합체 및 이의 용도도 본원에서 제공된다. 또한, TSG-6에 미리 결합된 고정화된 HA를 사용하여 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 제조하는 방법 및 이의 용도가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 염증; 자가면역 또는 면역 거부를 이끌어내는 면역 반응; 접착; 흉터형성; 혈관신생; 세포 또는 조직 재생을 요구하는 질병; 심근경색 및 뇌졸중을 비롯한 허혈로 인한 조직 재관류 손상; 및 이들에 의해 야기된 증상의 치료, 예컨대, 억제, 감소, 예방 또는 위험의 저하를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 매우 다양한 질환 또는 질병을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 염증을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 흉터형성을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 혈관신생을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 자가면역 또는 면역 거부를 이끌어내는 면역 반응을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 세포 접착의 억제를 요구하는 질병을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체는 세포 또는 조직 재생을 요구하는 질병을 치료하기 위해 투여된다.
또한, 본원에서 제공된 실시예는 미분화된 상태에서 줄기 세포를 유지하는 HC-HA/PTX3 복합체의 능력뿐만 아니라 인간 각막 섬유아세포 모델에서 성체 분화된 섬유아세포를 보다 어린 전구세포로 유도하는 능력을 입증한다. 인간 각막 섬유아세포는 각막세포로부터 분화되고, 외생성 TGF-β1의 첨가 시 흉터형성 근섬유아세포로 더 분화된다. 본원에서 제공된 데이터는 HC-HA의 존재 하에서의 세포 배양이 TGF-β1 자극 하에서 세포가 근섬유아세포로 분화하는 것을 방지한다는 것을 입증한다. TGF-β1의 부재 하에서, HC-HA/PTX3 복합체는 인간 각막 섬유아세포를, 케라토칸 및 CD34를 발현하는 각막세포로 복귀시킨다. TGF-β1의 존재 하에서, 인간 각막 섬유아세포는 케라토칸 발현을 결여하되 다수의 신경 능선 세포 마커, 예컨대, Osr2, FGF10 및 Sox9, 및 배아 줄기 세포 마커, 예컨대, c-myc, KLF4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, Sox-2 및 SSEA-4를 발현하는 보다 어린 전구세포로 더 재프로그래밍된다.
전사 인자 Sox2, Oct4, c-Myc 및 KLF4는 성체 분화된 세포로부터 전구 줄기 세포(iPSC)를 유도함에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 HC-HA/PTX3 복합체는 성체 분화된 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, Sox2, Oct4, c-Myc 및 KLF4 중 하나 이상과 함께 HC-HA/PTX3 복합체를 사용하여 iPSC를 유도하는 것은 HC-HA/PTX3 없이 이들 4종의 전사 인자들을 사용하는 통상적인 방법보다 훨씬 더 높은 효율로 수행된다. 일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체의 첨가는 TGF-β 신호전달을 꺼서 분화를 방지하고 BMP 신호전달을 켜서 어린 전구세포, 예컨대, iPSC로의 재프로그래밍을 용이하게 함으로써 줄기 세포 유도를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체의 첨가는 세포를 보다 어린 전구세포로 재프로그래밍하고 줄기 세포 마커를 유도함으로써 줄기 세포 유도를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체의 첨가는 생체외 증폭 동안 줄기 세포 특성을 유지하는 데에 도움을 줌으로써 뮤린 배아 섬유아세포로 만들어진 영양세포층을 사용할 필요성을 제거한다. 따라서, 일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체는 상기 줄기 세포 치료의 효능을 촉진하기 위해 생체외에서 증폭된 줄기 세포를 인간 환자 내로 전달하는 데에 도움을 주는 담체 또는 스캐폴드로서 사용된다.
단리된 nHC-HA/PTX3 복합체의 제조 방법
단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)를 발생시키는 방법이 본원에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체는 양막 조직으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체는 양막 또는 탯줄로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 nHC-HA/PTX3 복합체는 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 태반 양막(PAM), 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 탯줄 양막(UCAM), 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 태반, 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 탯줄, 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 융모막, 신선한, 동결된 또는 미리 동결된 양막-융모막, 또는 이들의 조합물로부터 단리된다. 이러한 조직들은 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간, 비-인간 영장류, 소 또는 돼지(그러나, 이들로 한정되지 않음)로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 임의의 적합한 방법에 의해 정제된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 원심분리(예를 들면, 초원심분리, 구배 원심분리), 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과 또는 상이한 가용성, 에탄올 침전, 또는 임의의 다른 이용가능한 단백질 정제 기법에 의해 정제된다(예를 들면, 모두 참고로 본원에 도입되는 문헌(Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987); 문헌(Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999); 및 문헌(Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997) 참조).
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3은 추출물로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 추출물은 양막 추출물로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 추출물은 탯줄 추출물로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 탯줄 추출물은 탯줄 기질 및/또는 와튼 젤리를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 초원심분리에 의해 제조된 추출물에 함유된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 CsCl/4 내지 6 M 구아니딘 HCl 구배를 이용하는 초원심분리에 의해 제조된 추출물에 함유된다. 일부 실시양태에서, 추출물은 2회 이상의 초원심분리에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 추출물은 2회 초과의 초원심분리에 의해 제조된다(즉, nHC-HA/PTX3 제2). 일부 실시양태에서, 추출물은 4회 이상의 초원심분리에 의해 제조된다(즉, nHC-HA/PTX3 제4). 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 HC1, HA, PTX3 및/또는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다.
일부 실시양태에서, 초원심분리는 등장성 용액에서의 추출에 의해 제조된 추출물에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 등장성 용액은 PBS이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 조직은 균질화된 샘플을 생성하기 위해 PBS에서 균질화된다. 그 다음, 균질화된 샘플은 원심분리에 의해 가용성 부분과 불용성 부분으로 분리된다. 일부 실시양태에서, 초원심분리는 PBS-추출된 조직의 가용성 부분에 대해 수행된다. 이러한 실시양태에서, PBS-추출된 조직의 초원심분리에 의해 정제된 nHC-HA/PTX3은 nHC-HA/PTX3 가용성 복합체로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA 가용성 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 가용성 복합체는 HC1, HA, PTX3 및/또는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다.
일부 실시양태에서, 초원심분리는 양막 및/또는 탯줄 조직의 직접적인 구아니딘 HCl 추출(예를 들면, 4 내지 6 M GnHCl)에 의해 제조된 추출물에 대해 수행된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, GnHCl 추출물 조직은 GnHCl 가용성 부분 및 GnHCl 불용성 부분을 생성하도록 원심분리된다. 일부 실시양태에서, 초원심분리는 GnHCl 가용성 부분에 대해 수행된다. 이러한 실시양태에서, 구아니딘 HCl-추출된 조직의 초원심분리에 의해 정제된 nHC-HA/PTX3은 nHC-HA/PTX3 불용성 복합체로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA 불용성 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 불용성 복합체는 HC1, HA, PTX3 및/또는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다.
일부 실시양태에서, 초원심분리는 PBS-추출된 조직의 불용성 부분의 추가 구아니딘 HCl 추출에 의해 제조된 추출물에 대해 수행된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 조직은 균질화된 샘플을 생성하기 위해 PBS에서 균질화된다. 그 다음, 균질화된 샘플은 원심분리에 의해 가용성 부분과 불용성 부분으로 분리된다. 그 다음, 불용성 부분은 구아니딘 HCl(예를 들면, 4 내지 6 M GnHCl)로 더 추출되고, 구아니딘 HCl 가용성 부분 및 불용성 부분을 생성하기 위해 원심분리된다. 일부 실시양태에서, 초원심분리는 구아니딘 HCl 가용성 부분에 대해 수행된다. 이러한 실시양태에서, 구아니딘 HCl-추출된 조직의 초원심분리에 의해 정제된 nHC-HA/PTX3은 nHC-HA/PTX3 불용성 복합체로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA 불용성 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 불용성 복합체는 HC1, HA, PTX3 및/또는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 nHC-HA/PTX3 추출물을 정제하는 방법은 (a) (예를 들면, 본원에 기재된 가용성 또는 불용성 방법에 의해 제조된) 단리된 추출물을 1.35 g/㎖의 초기 밀도로 CsCl/4 내지 6 M 구아니딘 HCl에 용해시켜 CsCl 혼합물을 발생시키는 단계, (b) 15℃에서 48시간 동안 CsCl 혼합물을 125,000 x g에서 원심분리하여 제1 정제된 추출물을 발생시키는 단계, (c) 제1 정제된 추출물을 추출하고 증류수에 대해 투석하여 CsCl 및 구아니딘 HCl을 제거함으로써 투석물을 발생시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 추출물을 정제하는 방법은 (d) 1시간 동안 0℃에서 투석물을, 1.3%(중량/부피) 아세트산칼륨을 함유하는 3 부피의 95%(부피/부피) 에탄올과 혼합하여 제1 투석물/에탄올 혼합물을 발생시키는 단계, (e) 제1 투석물/에탄올 혼합물을 15,000 x g에서 원심분리하여 제2 정제된 추출물을 발생시키는 단계, 및 (f) 제2 정제된 추출물을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 추출물을 정제하는 방법은 (g) 제2 정제된 추출물을 에탄올(예를 들면, 70% 에탄올)로 세척하여 제2 정제된 추출물/에탄올 혼합물을 발생시키는 단계; (h) 제2 정제된 추출물/에탄올 혼합물을 원심분리하여 제3 정제된 추출물을 발생시키는 단계; 및 (i) 제3 정제된 추출물을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 추출물을 정제하는 방법은 (j) 제3 정제된 추출물을 에탄올(예를 들면, 70% 에탄올)로 세척하여 제3 정제된 추출물/에탄올 혼합물을 발생시키는 단계; (k) 제3 정제된 추출물/에탄올 혼합물을 원심분리하여 제4 정제된 추출물을 발생시키는 단계; 및 (l) 제4 정제된 추출물을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제된 추출물은 nHC-HA/PTX3 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 실시양태에서, 항-HC1 항체, 항-HC2 항체 또는 이들 둘다가 발생되어 정지 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비정제된 HC-HA 복합체(즉, 이동상)는 상기 지지체 상을 통과한다. 일부 경우, HC-HA 복합체는 (예를 들면, (a) 항-HC1 항체와 HC1의 상호작용, (b) 항-HC2 항체와 HC2의 상호작용, (c) 항-PTX 항체와 PTX3의 상호작용, (d) 항-SLRP 항체와 SLRP의 상호작용, 또는 (e) 이들의 임의의 조합을 통해) 항체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 지지체는 임의의 비결합된 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 (예를 들면, PBS로) 세척된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 지지체는 지지체로부터 nHC-HA/PTX3 복합체를 용출할 수 있게 하는 용액(예를 들면, 1% SDS, 6 M 구아니딘-HCl 또는 8 M 우레아)으로 세척된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 실시양태에서, HABP는 발생되어 정지 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비정제된 nHC-HA/PTX3 복합체(즉, 이동상)는 상기 지지체 상을 통과한다. 일부 경우, nHC-HA/PTX3 복합체는 HABP에 결합한다. 일부 실시양태에서, 지지체는 임의의 비결합된 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 (예를 들면, PBS로) 세척된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 지지체는 지지체로부터 HC-HA 복합체를 용출할 수 있게 하는 용액으로 세척된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 HABP 친화성 크로마토그래피와, 항-HC1 항체, 항-HC2 항체, 항-PTX3 항체, SLRP 또는 SLRP들의 조합물에 대한 항체, 또는 이들 항체들의 임의의 조합물을 사용하는 면역친화성 크로마토그래피의 병용에 의해 정제된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 하나 이상의 항체를 사용함으로써 본원에 기재된 불용성 분획으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 항-SLRP 항체를 사용함으로써 본원에 기재된 불용성 분획으로부터 정제된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 본원에 기재된 가용성 분획으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 항-PTX3 항체를 사용함으로써 본원에 기재된 가용성 분획으로부터 정제된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체는 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III SLRP를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 I SLRP들, 예컨대, 데코린 및 비글리칸으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 II SLRP들, 예컨대, 피브로모듈린, 루미칸, PRELP(프롤린 아르기닌 풍부 말단 류신 풍부 단백질), 케라토칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 III SLRP들, 예컨대, 에피파이칸 및 오스테오글리신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 비쿠닌, 데코린, 비글리칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 단백질은 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 케라탄 설페이트를 포함한다.
rcHC-HA/PTX3 복합체의 제조 방법
SLRP를 갖거나 갖지 않는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)를 발생시키는 방법이 본원에 개시되어 있다. 이러한 방법에 의해 발생된 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 성분들의 중간체 조합물도 본원에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 발생시키는 방법은 (a) PTX3/HA 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시키는 단계, 및 (b) PTX3/HA 복합체를 IαI 및 종양 괴사 인자-자극된 유전자-6(TSG-6)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 인터-α-억제제(IαI)의 중쇄 1(HC1)을 HA에 전달하는 것을 촉매작용한다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 HA와 공유연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 순서대로 순차적으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 발생시키는 방법은 PTX3/HA 복합체를 IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 인터-α-억제제(IαI)의 중쇄 1(HC1)을 HA에 전달하는 것을 촉매작용한다. 이러한 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 HA와 공유연결을 형성한다.
일부 실시양태에서, PTX3에 결합된 HA의 복합체를 발생시키는 방법은 PTX3/HA 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 의해 제조된 PTX3/HA 복합체가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 발생시키는 방법은 (a) 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 IαI 및 TSG-6과 접촉시켜 TSG-6에 미리 결합된 HC-HA 복합체를 형성하는 단계, 및 (b) rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 HC-HA 복합체를 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 HA와 공유연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 TSG-6에 미리 결합된 HC-HA 복합체를 PTX3과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 먼저 PTX3/HA 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시킨 후, PTX3/HA 복합체를 IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, IαI 단백질 및 TSG-6 단백질은 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1 또는 20:1(IαI:TSG-6)의 몰비로 복합체와 접촉한다. 일부 실시양태에서, IαI:TSG-6의 비는 약 1:1 내지 약 20:1, 예컨대, 약 1:1 내지 약 10:1, 예컨대, 약 1:1 내지 약 5:1, 예컨대, 약 1:1 내지 약 3:1이다. 일부 실시양태에서, IαI:TSG-6의 비는 3:1 이상이다. 일부 실시양태에서, IαI:TSG-6의 비는 3:1이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 PTX3/HA 복합체를 IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 경우, TSG-6은 IαI와 상호작용하고 IαI의 HC1 및 HC2와 공유 복합체(즉, HC1·TSG-6 및 HC2·TSG-6)를 형성한다. 일부 경우, HA의 존재 하에서 HC들은 HA에 전달되어 rcHC-HA를 형성한다. 일부 실시양태에서, TSG-6·HC1 복합체는 미리 결합된 PTX3/HA 복합체에 첨가되어 HA로의 HC1의 전달을 촉매작용한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 먼저 PTX3/HA 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시킨 후, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, HC1·TSG-6 복합체와 HC2·TSG-6 복합체의 조합물이 PTX3/HA 복합체에 첨가된다.
일부 실시양태에서, PTX3을 고정화된 HMW HA와 접촉시키는 단계는 10분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3을 고정화된 HMW HA와 접촉시키는 단계는 2시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3을 고정화된 HMW HA와 접촉시키는 단계는 2시간 이상 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3을 고정화된 HMW HA와 접촉시키는 단계는 37℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3을 고정화된 HMW HA와 접촉시키는 단계는 PBS 중의 5 mM MgCl2에서 일어난다.
일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 10분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체 및/또는 HC2·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계는 10분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체 및/또는 HC2·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계는 2시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체 및/또는 HC2·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계는 2시간 이상 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체 및/또는 HC1·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계는 37℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, PTX3/HA 복합체를 HC1·TSG-6 복합체 및/또는 HC1·TSG-6 복합체와 접촉시키는 단계는 PBS 중의 5 mM MgCl2에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 HC-HA/PTX3 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3) 단백질, 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)과 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 10분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 37℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 PBS 중의 5 mM MgCl2에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 HC-HA/PTX3 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3) 단백질, 중쇄 1(HC1)을 포함하는 인터-α-억제제(IαI) 단백질 및 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)과 임의의 순서로 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 10분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상 또는 이보다 긴 시간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 37℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, HMW HA를 PTX3, IαI 및 TSG-6과 접촉시키는 단계는 PBS 중의 5 mM MgCl2에서 일어난다.
일부 실시양태에서, cHC-HA/PTX3 복합체를 제조하는 방법은 하나 이상의 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP들)을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 발생시키는 방법은 (a) PTX3/HA 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시키는 단계, (b) PTX3/HA 복합체를 IαI 및 종양 괴사 인자-자극된 유전자-6(TSG-6)과 접촉시키는 단계, 및 (c) PTX3/HA 복합체를 하나 이상의 SLRP와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 인터-α-억제제(IαI)의 중쇄 1(HC1)을 HA에 전달하는 것을 촉매작용한다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 HA와 공유연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a), (b) 및 (c)는 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a), (b) 및 (c)는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a)가 수행된 후, 상기 방법의 단계 (b) 및 (c)가 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a)가 수행된 후, 상기 방법의 단계 (b) 및 (c)가 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체를 발생시키는 방법은 (a) 고정화된 고분자량 하이알루로난(HMW HA)을 IαI 및 TSG-6과 접촉시켜 TSG-6에 미리 결합된 HC-HA 복합체를 형성하는 단계, (b) HC-HA 복합체를 펜트락신 3(PTX3)과 접촉시키는 단계, 및 (c) rcHC-HA/PTX3 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 HC-HA 복합체를 하나 이상의 SLRP와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 의해 제조된 rcHC-HA/PTX3 복합체가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 HA와 공유연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 TSG-6에 미리 결합된 HC-HA 복합체를 PTX3과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a), (b) 및 (c)는 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a), (b) 및 (c)는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a)가 수행된 후, 상기 방법의 단계 (b) 및 (c)가 순서대로 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (a)가 수행된 후, 상기 방법의 단계 (b) 및 (c)가 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III SLRP들로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 I SLRP들, 예컨대, 데코린 및 비글리칸으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 II SLRP들, 예컨대, 피브로모듈린, 루미칸, PRELP(프롤린 아르기닌 풍부 말단 류신 풍부 단백질), 케라토칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 III SLRP들, 예컨대, 에피파이칸 및 오스테오글리신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 비쿠닌, 데코린, 비글리칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 단백질은 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 케라탄 설페이트를 포함한다.
PTX3
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 세포 또는 다수의 세포들(예를 들면, 조직 추출물)로부터 단리된다. PTX3의 발현에 적합한 예시적인 세포는 포유동물 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 곤충 세포, 세균 및 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는 동물 세포, 및 해조류, 속씨식물, 겉씨식물, 양치류 및 선태류를 포함하나 이들로 한정되지 않는 식물 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 인간 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 양막 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 탯줄로부터의 양막 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 탯줄 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 탯줄 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 양막 상피 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 탯줄 상피 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 양막 상피 세포 또는 탯줄 상피 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 양막 기질 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 탯줄 기질 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 양막 기질 세포 또는 탯줄 기질 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3은 세포로부터 단리된 천연 PTX3 단백질이다. 일부 실시양태에서, 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, PTX3은 재조합 기술에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, PTX3은 재조합 발현 벡터로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, PTX3을 코딩하는 핵산은 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, PTX3을 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, PTX3은 형질전환 동물에서 발현된다. 일부 실시양태에서, PTX3은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PTX3은 세포로부터 단리된 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PTX3은 세포 무함유 추출물에서 생성된 재조합 단백질이다.
일부 실시양태에서, PTX3은 양막, 탯줄, 탯줄 양막, 융모막, 양수, 또는 이들의 조합물로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, PTX3은 양막 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 PTX3 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, PTX3은 세포 또는 다수의 세포들(예를 들면, 조직 추출물)로부터 단리되지 않는다.
일부 실시양태에서, PTX3은 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 33에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 예시적인 변이체는 예를 들면, 종 변이체, 대립형질 변이체, 및 보존적 아미노산 돌연변이 및 비보존적 아미노산 돌연변이를 함유하는 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PTX3은 HA에 결합하여 rcHC-HA/PTX3 복합체의 형성을 용이하게 하기에 충분한 PTX3의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, PTX3은 인간 PTX3의 Glu18부터 Ser277까지 포함한다. 제공된 방법에서 사용되는 PTX3의 변이체는 아미노산 교체(치환), 결실 또는 삽입인 아미노산 변경을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변경은 PTX3 폴리펩티드의 하나 이상의 성질, 예컨대, rcHC-HA/PTX3 복합체의 하나 이상의 치료 성질(예를 들면, 소염, 항-면역, 항-혈관신생, 흉터형성방지, 항-접착, 재생, 또는 본원에 기재된 다른 치료 활성)을 개선한다.
일부 실시양태에서, PTX3 단백질은 상업적 공급원으로부터 수득된다. PTX3에 대한 예시적인 상업적 공급원은 PTX3(카탈로그 번호 1826-TS; 알앤드디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)이나 이것으로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 PTX3 단백질은 동종다량체이다. 일부 실시양태에서, 동종다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 육량체, 오량체 또는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 삼량체, 사량체 또는 팔량체이다. 특정 실시양태에서, PTX3 동종다량체는 팔량체이다. 일부 실시양태에서, 다량체화 도메인은 PTX3 단백질의 다량체화를 개선하도록 변경된다. 일부 실시양태에서, 다량체화 도메인은 PTX3에 융합될 때 PTX3의 다량체화를 개선하는 이종 다량체화 도메인(예를 들면, Fc 다량체화 도메인 또는 류신 지퍼)으로 교체된다.
TSG-6
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 세포 또는 다수의 세포들(예를 들면, 조직 추출물)로부터 단리된다. TSG-6의 발현에 적합한 예시적인 세포는 포유동물 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 곤충 세포, 세균 및 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는 동물 세포, 및 해조류, 속씨식물, 겉씨식물, 양치류 및 선태류를 포함하나 이들로 한정되지 않는 식물 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 인간 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 양막 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 탯줄로부터의 양막 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 양막 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 탯줄 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 탯줄 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 양막 상피 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 탯줄 상피 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 양막 상피 세포 또는 탯줄 상피 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 양막 기질 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 탯줄 기질 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된 양막 기질 세포 또는 탯줄 기질 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 TSG-6은 세포로부터 단리된 천연 TSG-6 단백질이다. 일부 실시양태에서, 세포는 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, TSG-6은 재조합 기술에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 재조합 발현 벡터로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, TSG-6을 코딩하는 핵산은 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, TSG-6을 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 형질전환 동물에서 발현된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 세포로부터 단리된 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 세포 무함유 추출물에서 생성된 재조합 단백질이다.
일부 실시양태에서, TSG-6은 양막, 융모막, 양수, 또는 이들의 조합물로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, PTX3은 양막 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 상피 세포는 탯줄 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 양막 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 탯줄 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 양막 세포는 TSG-6 발현을 상향조절하기 위해 하나 이상의 호염증성 사이토카인으로 자극된다. 일부 실시양태에서, 호염증성 사이토카인은 IL-1 또는 TNF-α이다.
일부 실시양태에서, TSG-6은 세포 또는 다수의 세포들(예를 들면, 조직 추출물)로부터 단리되지 않는다.
일부 실시양태에서, TSG-6은 IαI의 HC1을 HA에 전달하는 것을 용이하게 하거나 촉매작용하기에 충분한 TSG-6의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 TSG-6의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 TSG-6의 아미노산 Trp18부터 Leu277까지 포함한다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 예시적인 변이체는 예를 들면, 종 변이체, 대립형질 변이체, 및 보존적 아미노산 돌연변이 및 비보존적 아미노산 돌연변이를 함유하는 변이체를 포함한다. 인간 TSG-6의 천연 대립형질 변이체는 예를 들면, 아미노산 치환 Q144R을 함유하는 TSG-6을 포함한다. 제공된 방법에서 사용되는 TSG-6 또는 이의 HA 결합 단편의 변이체는 아미노산 교체(치환), 결실 또는 삽입인 아미노산 변경을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변경은 TSG-6 폴리펩티드의 하나 이상의 성질, 예컨대, IαI의 HC1을 HA에 전달하는 성질, 또는 IαI의 HC1을 HA에 전달한 후 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 TSG-6 폴리펩티드를 방출시키는 성질을 개선한다.
일부 실시양태에서, TSG-6은 친화성 태그를 포함한다. 예시적인 친화성 태그는 헤마글루티닌 태그, 폴리-히스티딘 태그, myc 태그, FLAG 태그, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 정제에서 사용되는 이러한 친화성 태그는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 친화성 태그는 융합 단백질로서 또는 화학적 연결제를 통해 TSG-6 폴리펩티드 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, TSG-6은 친화성 태그를 포함하고, 비결합된 TSG-6은 친화성 정제에 의해 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 제거된다.
일부 실시양태에서, TSG-6 단백질은 상업적 공급원으로부터 입수된다. TSG-6에 대한 예시적인 상업적 공급원은 TSG-6(카탈로그 번호 2104-TS, 알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)이나 이것으로 한정되지 않는다.
IαI
일부 실시양태에서, IαI는 HC1 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 HC1 및 HC2 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 HC1 및 비쿠닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 HC1 및 HC2 쇄 및 비쿠닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 콘드로이틴 설페이트 쇄에 의해 연결된 HC1 및 HC2 쇄 및 비쿠닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, IαI는 생물학적 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물로부터의 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 간, 양막, 융모막 또는 양수 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, IαI는 인간 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI는 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI는 혈청으로부터 단리되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 양막 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 탯줄 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 탯줄로부터의 양막 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 양막 상피 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 탯줄 상피 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 양막 기질 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 탯줄 기질 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 IαI는 간세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, IαI는 재조합 기술에 의해 제조된다.
일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 생물학적 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물로부터의 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 포유동물인 인간이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 간, 양막, 융모막 또는 양수 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 인간 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI는 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 혈청으로부터 정제되지 않는다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 재조합 기술에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 간세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 양막 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 양막 상피 세포 또는 탯줄 상피 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC1은 양막 기질 세포 또는 탯줄 기질 세포로부터 정제된다.
일부 실시양태에서, HC1은 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 47에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 생물학적 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물로부터의 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 간, 양막, 융모막 또는 양수 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 인간 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 인간 혈청으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 혈액 혈청으로부터 단리되지 않는다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 재조합 기술에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 간세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 양막 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 양막 상피 세포 또는 탯줄 상피 세포로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC2는 양막 기질 세포 또는 탯줄 기질 세포로부터 정제된다.
일부 실시양태에서, HC2는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 49에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, IαI는 비쿠닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비쿠닌은 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 53에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, IαI는 콘드로이틴 설페이트 쇄를 포함한다.
HA
일부 실시양태에서, HA는 세포, 조직 또는 유체 샘플로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, HA는 상업적 공급회사(예를 들면, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 또는 어드밴스드 메디칼 옵틱스(Advanced Medical Optics)(미국 캘리포니아주 어바인 소재)(예를 들면, 힐론(Healon)))로부터 입수된다. 일부 실시양태에서, HA는 분말로서 상업적 공급회사로부터 입수된다. 일부 실시양태에서, HA는 세포에서 발현된다. HA의 발현에 적합한 예시적인 세포는 포유동물 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 곤충 세포, 세균 및 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는 동물 세포, 및 해조류, 속씨식물, 겉씨식물, 양치류 및 선태류를 포함하나 이들로 한정되지 않는 식물 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, HA는 인간 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, HA는 형질전환 동물에서 발현된다. 일부 실시양태에서, HA는 하이알루로난 합성효소(예를 들면, HAS1, HAS2 및 HAS3)를 발현하는 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포는 HA 합성효소를 발현하는 재조합 발현 벡터를 함유한다. 일부 경우, HA 합성효소는 신생 다당류가 세포막을 통해 세포외 공간 내로 압출될 때 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코스아민을 반복적으로 추가함으로써 하이알루로난을 연장시킨다.
상기 방법에서 사용되는 HA는 전형적으로 고분자량(HMW) HA이다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 500 킬로달톤(kDa) 초과, 예를 들면, 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa, 약 800 kDa 내지 약 8,500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1400 kDa 내지 약 3,500 kDa이다. 일부 실시양태에서, HMW HA의 중량 평균 분자량은 약 3000 kDa이다.
추가 성분
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 성분이 추가되어 rcHC-HA/PTX3 복합체를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)이 추가되어 rcHC-HA/PTX3 복합체를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III SLRP이다. 일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 I SLRP들, 예컨대, 데코린 및 비글리칸으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 II SLRP들, 예컨대, 피브로모듈린, 루미칸, PRELP(프롤린 아르기닌 풍부 말단 류신 풍부 단백질), 케라토칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, SLRP는 클래스 III SLRP들, 예컨대, 에피파이칸 및 오스테오글리신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, SLRP는 비쿠닌, 데코린, 비글리칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, SLRP는 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, SLRP는 케라탄 설페이트를 포함한다.
HA 고정화
일부 실시양태에서, HMW HA는 임의의 적합한 방법에 의해 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체, 예컨대, 배양 접시, 비드, 컬럼 또는 다른 적합한 표면, 예를 들면, 이식가능한 의료 장치 또는 이의 부분의 표면, 또는 본원에 기재된 바와 같이 이식가능한 의료 장치와 후속적으로 연결되거나 조합되는 표면에 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 예컨대, 화학적 연결에 의해 고체 지지체에 직접적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 연결제 또는 중간 단백질을 통해 고체 지지체에 간접적으로 부착된다. 아미노 기와 티올 기 사이의 공유결합을 형성하고 티올 기를 단백질 내로 도입하는 데에 사용되는 다수의 이종이작용성 가교연결 시약들이 당업자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체와의 가교연결을 통해 고체 지지체에 직접적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 고체 지지체와의 가교연결 없이 고체 지지체에 직접적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 코팅제로서 고체 지지체에 직접적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 코바링크™-NH 표면에 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 코팅제로서 고체 지지체에 직접적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, HMW HA는 4℃에서 약 16시간 동안 코바링크™-NH 표면에 고정화된다.
일부 실시양태에서, 방법은 고체 지지체와의 직접적인 연결을 통해(즉, 중간 단백질 없이) HMW HA를 고체 표면에 고정화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 고정화된 HA를 PTX3과 접촉시키기 전에 비결합된 HMW HA를 제거하기 위해 세척된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 고정화된 HA를 PTX3과 접촉시키기 전에 비결합된 HMW HA를 제거하기 위해 8 M GnHCl 및 PBS의 세척으로 세척된다.
일부 실시양태에서, 방법은 중간 단백질 또는 연결제를 통해 HA를 고체 표면에 고정화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결제는 펩티드 연결제이다. 일부 실시양태에서, 중간 단백질은 HA 결합 단백질(HABP)이다. 일부 실시양태에서, HABP는 먼저 (예를 들면, 가교연결, 화학적 연결, 또는 화학적 연결제를 통해) 고체 지지체에 부착된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, HABP를 포함하는 고체 지지체는 HA(예를 들면, HMW HA)와 접촉하여 HABP와 HA의 결합을 통해 HA를 고체 지지체에 고정화시킨다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 고정화된 HMW HA를 PTX3과 접촉시키기 전에 비결합된 HMW HA를 제거하기 위해 세척된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 고정화된 HA를 PTX3과 접촉시키기 전에 비결합된 HMW HA를 제거하기 위해 8 M GnHCl 및 PBS의 세척으로 세척된다.
일부 실시양태에서, 방법은 펩티드 연결제와 고체 지지체의 부착 및 HA와 펩티드 연결제의 부착을 통해 HA를 고체 표면에 고정화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 연결제는 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 절단가능한 화학적 연결제, 예컨대, 이황화 화학적 연결제(그러나, 이것으로 한정되지 않음)의 부착을 통해 HA를 고체 표면에 고정화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법에서 사용되기 위해 선택된 HABP는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 형성 후 HA로부터 해리되는 HABP이다. 일부 실시양태에서, HABP는 HA에 비-공유결합한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 해리제를 사용하여 HABP로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 비-공유 상호작용의 파괴를 위한 해리제(예를 들면, 구아니딘 하이드로클로라이드, 우레아 및 다양한 세제, 예를 들면, SDS)는 당분야에서 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 해리제는 우레아이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 약 4 M 내지 약 8 M 구아니딘-HCl이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 약 4 M, 약 5 M, 약 6 M, 약 7 M 또는 약 8 M 구아니딘-HCl이다. 일부 실시양태에서, 해리제는 pH 7.5의 PBS 중의 약 4 M 내지 약 8 M 구아니딘-HCl이다.
일부 실시양태에서, 이러한 해리제는 중간 HABP로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 해리시키는 데에 사용된다. 방법에서 사용되는 HABP는 전형적으로 HA에 대한 결합 친화성이 rcHC-HA/PTX3 복합체의 조립을 허용할 정도로 충분히 강하되 적합한 해리제에 의해 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 해리되도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 해리제는 구아니딘 하이드로클로라이드이다.
본원에서 제공된 방법에서 사용되는 예시적인 HABP는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1, 스타빌린-2, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이들의 부분(예를 들면, 이들의 연결 모듈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, HABP는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 서열번호에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 서열번호에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, HABP는 베르시칸이다. 일부 실시양태에서, HABP는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, HABP는 재조합 포유동물 단백질이다. 일부 실시양태에서, HABP는 재조합 인간 단백질이다. 일부 실시양태에서, HABP는 재조합 베르시칸 단백질, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, HABP는 재조합 아그레칸 단백질, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, HABP는 천연 HABP, 또는 HA에 결합하기에 충분한 이의 부분이다. 일부 실시양태에서, 천연 HABP는 포유동물 조직 또는 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, HABP는 소 코 연골로부터 단리된다(예를 들면, 아그레칸의 HA 결합 도메인 및 연결 단백질을 함유하는 세이카가쿠(Seikagaku)로부터의 HABP).
일부 실시양태에서, HABP는 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, 아그레칸, 베르시칸, 뉴로칸, 브레비칸, 포스파칸, TSG-6, CD44, 스타빌린-1 또는 스타빌린-2의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 모듈을 포함하는 HABP는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 연결 도메인에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 54 내지 99 중 임의의 연결 도메인에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, HABP는 베르시칸의 연결 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 모듈을 포함하는 HABP는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 베르시칸의 연결 모듈을 포함하는 HABP는 재조합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 중간 단백질, 예컨대, HABP는 부위 특이적 단백질분해효소, 예컨대, 푸린, 3C 단백질분해효소, 캐스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 또는 TEV 단백질분해효소에 의해 인식되어 가수분해되는 단백질분해성 절단 서열을 함유한다. 이러한 실시양태에서, 조립된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 고정화된 복합체를 특이적 절단 서열을 절단하는 단백질분해효소와 접촉시킴으로써 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 정제된다. 일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 임의의 적합한 방법 또는 방법들의 병용에 의해 정제된다. 이하에 기재된 실시양태들은 배제하기 위한 것이 아니고 단지 예시하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리(예를 들면, 구배 원심분리) 또는 상이한 가용성, 에탄올 침전, 또는 임의의 다른 이용가능한 단백질 정제 기법에 의해 정제된다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 실시양태에서, 항체는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 성분에 대해 발생되고(예를 들면, 항-HC1, 항-PTX, rcHC-HA/PTX3 복합체의 하나 이상의 SLRP에 대한 항체, 예를 들면, 항-비쿠닌, 항-데코린, 항-비글리칸 또는 항-오스테오어드헤린), 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비정제된 rcHC-HA/PTX3 복합체(즉, 이동상)는 지지체 상을 통과한다. 일부 경우, rcHC-HA/PTX3 복합체는 항체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 지지체는 임의의 비결합된 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 (예를 들면, PBS로) 세척된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 지지체는 지지체로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 용출할 수 있게 하는 용액(예를 들면, 1% SDS, 6 M 구아니딘-HCl, 또는 8 M 우레아)으로 세척된다. 일부 실시양태에서, 해리제는 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 해리제는 이온 교환 크로마토그래피, 투석, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과 또는 정용여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 제거된다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 실시양태에서, HABP는 복합체의 정제를 위해 rcHC-HA/PTX3 복합체에 결합하는 데에 사용되고 정지 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비정제된 rcHC-HA/PTX3 복합체(즉, 이동상)는 지지체 상을 통과한다. 일부 경우, rcHC-HA/PTX3 복합체는 HABP에 결합한다. 일부 실시양태에서, 지지체는 임의의 비결합된 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 (예를 들면, PBS로) 세척된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 지지체는 지지체로부터 rcHC-HA/PTX3 복합체를 용출할 수 있게 하는 용액(예를 들면, 해리제)으로 세척된다. 일부 실시양태에서, 해리제는 이온 교환 크로마토그래피, 투석, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과 또는 정용여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 제거된다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체는 HABP 친화성 크로마토그래피와, rcHC-HA/PTX3 복합체의 하나 이상의 성분에 대한 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피의 병용에 의해 정제된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 rcHC-HA/PTX3 복합체의 하나 이상의 성분은 친화성 태그를 포함한다(예를 들면, PTX3 또는 HC1과 친화성 태그의 융합 단백질). 일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 하나 이상의 성분 내로 도입되는 예시적인 친화성 태그는 헤마글루티닌 태그, 폴리-히스티딘, myc 태그, FLAG 태그 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 친화성 태그를 위한 리간드는 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비정제된 rcHC-HA/PTX3 복합체는 지지체 상을 통과한다. 일부 경우, rcHC-HA/PTX3 복합체는 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 지지체는 임의의 비결합된 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 (예를 들면, PBS로) 세척된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 지지체는 지지체로부터 본원에 개시된 rcHC-HA/PTX3 복합체를 용출할 수 있게 하는 용액으로 세척된다. 일부 실시양태에서, 용출제는 이온 교환 크로마토그래피, 투석, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과 또는 정용여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 해리된 rcHC-HA/PTX3 복합체로부터 제거된다.
일부 실시양태에서, PTX3, TSG-6 및/또는 HC1은 표지에 접합된다. "표지"는 표지가 부착된 폴리펩티드를 발생시키도록 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나(예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우 검출될 수 있는 기질 화합물 조성물의 화학적 변경을 촉매작용한다. 표지의 비-한정적 예로는 형광발생 모이어티, 염료, 형광 태그, 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제가 있다.
nHC-HA/PTX3 및 rcHC-HA/PTX3 복합체의 활성을 평가하는 방법
본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 및 rcHC-HA/PTX3 복합체의 성질은 시험관내 방법 및 생체내 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 평가된다. 예시적인 시험관내 방법이 본원에서 제공되고, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체가 대식세포와 고정화된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부착을 촉진하는 능력, 대식세포의 응집을 억제하거나 감소시키는 능력, 및 호중구의 아폽토시스, 아폽토시스성 호중구의 대식세포 식세포작용 및 자극된 대식세포의 M2 분극화를 촉진하는 능력을 평가하는 세포 배양 방법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 분석에서 사용되는 대식세포는 예컨대, LPS 또는 IFN-γ에의 노출에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, 자극된 대식세포에서의 유전자 또는 단백질 발현은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와의 접촉 후 평가된다. nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 활성을 평가하는 이러한 방법에서, 비교를 위해 적합한 대조군이 사용된다. 일부 실시양태에서, 대조군은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 사용한 처리의 부재(즉, 음성 대조군)이다.
일부 실시양태에서, rcHC-HA/PTX3 복합체의 활성은 천연 HC-HA/PTX3 복합체의 활성과 비교된다. 일부 실시양태에서, 천연 HC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, 처리된 대식세포에서의 유전자 발현은 PCR, RT-PCR, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, 면역조직화학, 크로마토그래피, 또는 다른 적합한 단백질 또는 핵산 검출 방법에 의해 평가된다. 일부 실시양태에서, IL-10, IL-12, IL-23, LIGHT 및 SPHK1의 발현 수준이 평가된다.
본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 활성을 평가하는 예시적인 시험관내 방법은 다양한 질환 또는 질병의 동물 모델들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 허혈 재관류 손상, 1형 및 2형 당뇨병, 염증성 질환, 콜라겐-유도된 관절염, 류마티스성 관절염, 항원-유도된 자가면역 질환, 예컨대, 콜라겐-유도된 관절염 및 미엘린 펩티드-유도된 실험 알레르기성 뇌척수염, 염증성 장 질환(IBD)/궤양성 결장염, 다발성 경화증, 수술에 의해 유도된 골관절염 및 신염, 건선, 염증성 피부 질환, LPS-유도된 내독소 쇼크, LPS-유도된 폐 손상, 알레르기성 비염, 간 손상, 만성 스트레스 및 천식을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 염증성 및 자가면역 질환들 및 장애들에 대한 동물 모델(예를 들면, 설치류 및 영장류 모델), 및 다양한 암들에 대한 이종이식 및 동종이식 모델을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 질환들 및 질병들을 위한 다양한 동물 모델들이 당분야에서 입수가능하고 잘 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 동물 모델은 염증, 예컨대, 만성 이식물-대-숙주 질환(cGVHD), HSV1-유도된 괴사 기질 각막염 또는 고위험 각막 이식의 설치류 모델이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 치료에 의한 염증의 감소는 T-세포의 증식 및 활성화, 및 면역 사이토카인, 예컨대, IL-1α, IL-2, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 생성을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 흉터형성, 예컨대, 엑시머 레이저-보조된 광굴절성 각막절제술(PRK)의 설치류 모델이다. 이러한 동물 모델의 예시적인 사용 방법은 본원에서 제공된 실시예에서 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 동물 모델은 질환 또는 장애를 야기하는 하나 이상의 유전적 변경을 함유하는 염증성 및 자가면역 질환 및 장애의 유전적 모델이다. 일부 실시양태에서, 이러한 모델은 상업적 공급회사로부터 입수된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 특정 질환 또는 질병의 동물 모델에게 투여되고, 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 억제하거나 감소시키는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 능력이 평가된다.
약학 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 개시되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 약학 용도에 적합한 제제로 프로세싱하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 비롯한 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 약학 조성물을 제제화한다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존한다. 임의의 잘 공지된 기법, 담체 및 부형제가 당분야에서 이해되는 바와 같이 적절하게 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 보조제, 부형제, 보존제, 흡수 지연제, 충전제, 결합제, 흡착제, 완충제 및/또는 가용화제를 추가로 포함한다. 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하도록 제제화되는 예시적인 약학 조성물은 용액, 현탁물, 유액, 시럽, 과립제, 산제, 연고, 정제, 캡슐제, 환제 또는 에어로졸을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
제형
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 수성 현탁액으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 물, 링거 용액 및/또는 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 희석제인 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 또는 이들의 조합물과 함께 감미제 또는 풍미제, 착색 물질 또는 염료, 및 원하는 경우 유화제 또는 현탁화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 현탁제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸쓰 및/또는 검 아카시아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 분산제 또는 습윤화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 천연 발생 포스파타이드, 예를 들면, 레시틴, 또는 알킬렌 산화물과 지방산의 축합 생성물, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 산화물과 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들면, 헵타데카에틸렌-옥시세탄올, 또는 에틸렌 산화물과 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분적 에스테르의 축합 생성물, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 산화물과 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분적 에스테르의 축합 생성물, 예를 들면, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 감미제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액은 수크로스, 사카린 또는 아스파르탐을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 유성 현탁액으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 유성 현탁액은 활성 성분을 식물유(예를 들면, 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유) 또는 광물유(예를 들면, 액체 파라핀)에 현탁함으로써 제제화된다. 일부 실시양태에서, 유성 현탁액은 증점제(예를 들면, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유성 현탁액은 감미제(예를 들면, 전술된 감미제들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유성 현탁액은 항산화제(예를 들면, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 알파-토코페롤)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 (예를 들면, 동맥내, 심장내, 피내, 십이지장내, 수질내, 근육내, 골내, 복강내, 경막내, 혈관내, 정맥내, 유리체내, 경막외 및/또는 피하를 포함하는 주사 또는 관주를 통한) 비경구 주사용으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 멸균 용액, 현탁액 또는 유액으로서 투여된다.
일부 실시양태에서, 비경구 투여용 제제는 일부 실시양태에서 항산화제, 완충제, 정균제, 및/또는 제제가 의도된 수용자의 혈액에 대한 등장성을 나타내게 만드는 용질을 함유하는, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 수성 및/또는 비-수성(유성) 멸균 주사 용액; 및/또는 일부 실시양태에서 현탁제 및/또는 증점제를 포함하는 수성 및/또는 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여용 제제는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 물질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 활성 성분이 유성상에 용해되어 있는 수중유 미세유액으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 지방유(예를 들면, 참깨유), 또는 합성 지방산 에스테르(예를 들면, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드), 또는 리포좀에 용해된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대두유 및/또는 레시틴의 혼합물에 용해된다. 일부 실시양태에서, 오일 용액은 물과 글리세롤의 혼합물에 도입되고 가공되어 미세유액을 형성한다.
일부 실시양태에서, 비경구 투여용으로 제제화된 조성물은 단회 볼루스 샷(bolus shot)으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여용으로 제제화된 조성물은 연속 정맥내 전달 장치(예를 들면, 델텍(Deltec) CADD-PLUS™ 모델 5400 정맥내 펌프)를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 주사용 제제는 첨부된 보존제를 갖는 유닛 제형, 예를 들면, 앰플 또는 다회-용량 용기로 제공된다. 일부 실시양태에서, 주사용 제제는 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면, 식염수 또는 멸균 발열원 무함유 물의 첨가만을 요구하는 분말 형태 또는 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 저장된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 국소 투여용으로 제제화된다. 국소 제제는 연고, 크림, 로션, 용액, 페이스트, 겔, 필름, 스틱, 리포좀 및 나노입자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 국소 제제는 패치, 붕대 또는 상처 드레싱의 사용에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 고체, 가교형 겔 또는 리포좀 형태의 조성물로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 불용성 가교형 하이드로겔로서 제제화된다.
일부 실시양태에서, 국소 제제는 겔화제(또는 증점제)를 포함한다. 적합한 겔화제는 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 셀룰로스 에테르(예를 들면, 카복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스), 구아 검, 잔탄 검, 로커스트 콩 검, 알기네이트(예를 들면, 알긴산), 실리케이트, 전분, 트라가칸쓰, 카복시비닐 중합체, 카라기난, 파라핀, 바셀린, 아카시아(아라비아 검), 한천, 규산마그네슘알루미늄, 알긴산나트륨, 스테아르산나트륨, 블래더랙(bladderwrack), 벤토나이트, 카보머, 카라기난, 카보폴, 잔탄, 셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스(MCC), 세라토니아, 진두발, 덱스트로스, 푸르셀라란, 젤라틴, 가티 검, 구아 검, 헥토라이트, 락토스, 수크로스, 말토덱스트린, 만니톨, 소르비톨, 꿀, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 벽오동과 검, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, PEG 200-4500), 검 트라가칸쓰, 에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트), 옥시폴리젤라틴, 펙틴, 폴리겔린, 포비돈, 프로필렌 카보네이트, 메틸 비닐 에테르/말레산 무수물 공중합체(PVM/MA), 폴리(메톡시에틸 메타크릴레이트), 폴리(메톡시에톡시에틸 메타크릴레이트), 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스(HPMC), 나트륨 카복시메틸-셀룰로스(CMC), 이산화규소, 폴리비닐피롤리돈(PVP: 포비돈), 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 국소 제제는 연화제를 포함한다. 연화제는 피마자유 에스테르, 코코아 버터 에스테르, 해바라기유 에스테르, 면실유 에스테르, 옥수수유 에스테르, 올리브유 에스테르, 대구 간유 에스테르, 알몬드유 에스테르, 아보카도유 에스테르, 팜유 에스테르, 참깨유 에스테르, 스쿠알렌 에스테르, 키쿠이유 에스테르, 대두유 에스테르, 아세틸화된 모노글리세라이드, 에톡실화된 글리세릴 모노스테아레이트, 헥실 라우레이트, 이소헥실 라우레이트, 이소헥실 팔미테이트, 이소프로필 팔미테이트, 메틸 팔미테이트, 데실올레에이트, 이소데실 올레에이트, 헥사데실 스테아레이트 데실 스테아레이트, 이소프로필 이소스테아레이트, 메틸 이소스테아레이트, 디이소프로필 아디페이트, 디이소헥실 아디페이트, 디헥실데실 아디페이트, 디이소프로필 세바케이트, 라우릴 락테이트, 미리스틸 락테이트 및 세틸 락테이트, 올레일 미리스테이트, 올레일 스테아레이트 및 올레일 올레에이트, 펠라곤산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 이소스테아르산, 하이드록시스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리시놀레산, 아라키드산, 베헨산, 에룩산, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 세틸 알코올, 헥사데실 알코올, 스테아릴 알코올, 이소스테아릴 알코올, 하이드록시스테아릴 알코올, 올레일 알코올, 리시놀레일 알코올, 베헤닐 알코올, 에루실 알코올, 2-옥틸 도데카닐 알코올, 라놀린 및 라놀린 유도체, 밀랍, 경랍, 미리스틸 미리스테이트, 스테아릴 스테아레이트, 카나우바 왁스, 칸델릴라 왁스, 레시틴 및 콜레스테롤을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 하나 이상의 천연 중합체로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 하이알루론산, 헤파란 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트인 천연 중합체로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 천연 중합체로부터 제제화된 중합체 겔로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 천연 중합체, 예컨대, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 하이알루론산, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 이들의 조합물(그러나, 이들로 한정되지 않음)로 제제화된 중합체 겔로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 가교형 중합체로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 비-가교형 중합체로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 비-가교형 중합체 및 가교형 중합체로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 가교형 하이알루로난 겔로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 불용성 가교형 HA 하이드로겔로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 비-가교형 하이알루로난 겔로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 콜라겐 매트릭스로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 피브린 매트릭스로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 피브린/콜라겐 매트릭스로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 눈 또는 이와 관련된 조직으로 투여되도록 제제화된다. 눈에 투여되기에 적합한 제제는 용액, 현탁액(예를 들면, 수성 현탁액), 연고, 겔, 크림, 리포좀, 니오좀, 파마코좀, 나노입자 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 눈에 국소 투여되기 위한 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분무제, 세척제 또는 이들의 조합물로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 주사가능한 데포 제제를 통해 눈에 투여된다.
본원에서 사용될 때, "데포(depot) 제제"는 눈 또는 이와 관련된 조직(예를 들면, 공막)에 (예를 들면, 피하로, 근육내로, 유리체내로 또는 결막하 내부에) 이식되는 조절 방출 제제이다. 일부 실시양태에서, 데포 제제는 생체분해가능한 중합체 중에 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 마이크로캡슐화된 매트릭스(마이크로캡슐화된 매트릭스로서도 공지되어 있음)를 형성함으로써 제제화된다. 일부 실시양태에서, 데포 제제는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 리포좀 또는 미세유액으로 포획함으로써 제제화된다.
눈에 투여될 제제는 안과적으로 허용가능한 긴장성을 갖는다. 일부 경우, 눈물은 0.9%의 염화나트륨 용액의 등장성 값과 동등한 등장성 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 0.6% 내지 약 1.8% 염화나트륨 등가의 등장성 값은 눈에의 국소 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 눈에 투여될 제제는 약 200 내지 약 600 mOsm/ℓ의 삼투성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 눈에 투여될 제제는 저긴장성을 가지므로 적절한 긴장성 범위를 달성하기에 적합한 임의의 물질의 첨가를 요구한다. 긴장성을 조절하는 안과적으로 허용가능한 물질은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 및 황산암모늄을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
눈에 투여될 제제는 안과적으로 허용가능한 투명성을 갖는다. 안과적으로 허용가능한 청정제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합물이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 눈에 투여될 제제는 안과적으로 허용가능한 점도 향상제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 점도 향상제는 본원에 개시된 제제가 눈에 남아있는 시간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제제가 눈에 남아있는 시간의 증가는 보다 큰 약물 흡수 및 효과를 가능하게 한다. 점막접착제 중합체의 비-한정적 예로는 카복시메틸셀룰로스, 카보머(아크릴산 중합체), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리아크릴아미드, 폴리카보필, 아크릴산/부틸 아크릴레이트 공중합체, 알긴산나트륨 및 덱스트란이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 눈에 투여될 제제는 눈의 전방부(예를 들면, 망막, 맥락막, 유리체 및 시신경)에 투여되거나 전달된다. 일부 실시양태에서, 눈의 전방부에 전달될, 본원에 개시된 눈에 투여될 국소 제제는 가용화제, 예를 들면, 글루칸 설페이트 및/또는 사이클로덱스트린을 포함한다. 일부 실시양태에서 사용되는 글루칸 설페이트는 덱스트란 설페이트; 사이클로덱스트린 설페이트 및 β-1,3-글루칸 설페이트(이들의 천연 물질 및 유도체 둘다); 또는 섬유아세포 성장인자(FGF)를 함유하는 조직에 일시적으로 결합하고 이 조직에서 보유되고/되거나, 약물의 안정성 및/또는 가용성을 개선하고/하거나 본원에 개시된 눈에 투여될 국소 제제의 침투 및 눈 흡수를 개선하는 임의의 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서 가용화제로서 사용되는 사이클로덱스트린 유도체는 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 하이드록시에틸 β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 γ-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 설페이트화된 α-사이클로덱스트린, 설페이트화된 β-사이클로덱스트린, 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 직장 또는 질 투여용으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 좌약제로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 직장 투여에 적합한 조성물은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를, 실온에서 고체이나 직장 온도에서 액체이므로 직장에서 용융되어 약물을 방출할 적합한 비-자극성 부형제와 혼합함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 직장 투여에 적합한 조성물은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 코코아 버터, 글리세린화된 젤라틴, 수소첨가된 식물유, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물 또는 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르와 혼합함으로써 제조된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 임의적으로 조절 방출 입자, 액체 복합체, 리포좀, 나노입자, 마이크로스피어, 미세입자, 나노캡슐, 또는 피부로의 국소 전달을 향상시키거나 용이하게 하는 다른 물질 내로 도입된다. 약학 제제의 통상적인 마이크로캡슐화 공정의 예는 이러한 개시내용에 대해 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제3,737,337호에 기재되어 있다.
용량
투여되는 약학 조성물의 양은 치료되는 개체에 부분적으로 의존한다. 약학 조성물이 인간 대상체에게 투여되는 경우, 1일 용량은 통상적으로 처방 의사에 의해 결정될 것이고, 이때 상기 용량은 일반적으로 개체의 연령, 성별, 식습관, 체중, 일반적인 건강 및 반응, 개체의 증상의 중증도, 치료되는 정확한 질환 또는 질병, 치료되는 질환 또는 질병의 중증도, 투여 시간, 투여 경로, 조성물의 성향, 배출 속도, 약물 조합 및 처방 의사의 재량에 따라 달라진다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용량은 약 0.001 내지 약 1000 mg/kg(체중)/일이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.5 내지 약 50 mg/kg/일의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.001 내지 약 7 g/일이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.01 내지 약 7 g/일이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.02 내지 약 5 g/일이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.05 내지 약 2.5 g/일이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 약 0.1 내지 약 1 g/일이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 질환 또는 질병의 발생 전에, 동안에 또는 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료는 질환 또는 질병의 발생 전에, 동안에 또는 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 질환 또는 질병의 발생 전에, 동안에 또는 후에 조합 치료와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3을 함유하는 조성물의 투여 시간은 상이하다. 따라서, 일부 예에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 예방제로서 사용되고, 질환 또는 질병의 발생을 예방하기 위해 질병 또는 질환을 발생시킬 성향을 갖는 대상체에게 연속적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 증상의 발병 동안에 또는 증상의 발병 후 가능한 신속히 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 증상 발병의 처음 48시간 이내, 바람직하게는 증상 발병의 처음 48시간 이내, 보다 바람직하게는 증상 발병의 처음 6시간 이내, 가장 바람직하게는 증상 발병의 3시간 이내에 시작된다. 일부 실시양태에서, 초기 투여는 임의의 실용적 경로, 예를 들면, 정맥내 주사, 볼루스 주사, 5분 내지 약 5시간에 걸친 관주, 환제, 캡슐제, 경피 패치, 협측 전달, 또는 이들의 조합 경로를 통해 달성된다. 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 바람직하게는 질환 또는 질병의 발병이 검출되거나 의심되는 후 가능한 신속히 질환의 치료에 필요한 시간 동안, 예를 들면, 약 1개월 내지 약 3개월 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 기간은 대상체마다 상이하고, 이 기간은 공지된 기준을 이용함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체, 또는 복합체를 함유하는 제제는 2주 이상, 바람직하게는 약 1개월 내지 약 5년, 보다 바람직하게는 약 1개월 내지 약 3년 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 1회 단회 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 1회 초과의 다회 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 3회 투여된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 4회 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 1일 4회 초과의 빈도로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 예방 및/또는 치유 치료를 위해 투여된다. 치유 적용에서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 질환 또는 질병의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 질환 또는 질병을 이미 앓고 있는 개체에게 투여된다. 이 용도에 효과적인 양은 질환 또는 질병의 중증도 및 경과, 선행 치료, 개체의 건강 상태, 체중 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 의존할 것이다.
예방 적용에서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 구체적인 장애의 위험에 있는 개체에게 투여된다. 이러한 양은 "예방 유효량 또는 유효 용량"인 것으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 개체의 건강 상태, 체중 및 개체의 다른 신체적 파라미터에도 의존한다.
개체의 상태가 개선되지 않는 경우, 의사의 재량에 따라 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 개체의 질환 또는 질병의 증상을 호전시키거나 다른 방식으로 조절하거나 제한하기 위해 만성적으로, 즉 개체의 수명 지속기간 전체를 포함하는 연장된 기간 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 개체의 상태가 개선되는 경우, 의사의 재량에 따라 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 연속적으로 투여되거나, 투여되는 약물의 용량이 특정 기간(즉, "휴약기") 동안 일시적으로 감소되거나 일시적으로 중단된다. 일부 실시양태에서, 휴약기는 예를 들면, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일을 포함하는 2일 내지 1년이다. 일부 실시양태에서, 휴약기 동안 용량 감소는 예를 들면, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 포함하는 10% 내지 100%이다.
일단 개체의 상태가 개선되면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 그 후, 일부 실시양태에서, 투여 용량 또는 빈도, 또는 이들 둘다가 개선된 질환, 장애 또는 질병을 유지하는 수준까지 증상의 함수로서 감소된다. 일부 실시양태에서, 개체는 증상의 임의의 재발 시 장기간에 기초한 간헐적 치료를 요구한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 정확한 용량의 단회 투여에 적합한 유닛 제형으로 존재한다. 유닛 제형에서, 제제는 적정량의 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 유닛 용량으로 나누어진다. 일부 실시양태에서, 유닛 제형은 상이한 양의 제제를 함유하는 포장물의 형태로 존재한다. 비-한정적 예는 포장된 정제 또는 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 내의 산제이다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁액 조성물은 단회 용량의 재밀폐불가능한 용기 내에 포장된다. 일부 실시양태에서, 다회 용량의 재밀폐가능한 용기가 사용되고, 이 경우 보존제를 조성물에 포함시키는 것이 전형적이다. 일부 실시양태에서, 비경구 주사용 제제는 첨부된 보존제를 갖는 유닛 제형(앰플을 포함하나 이것으로 한정되지 않음) 또는 다회 용량 용기 내에 제공된다.
본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체에 적절한 1일 용량은 예를 들면, 체중 당 약 0.01 내지 2.5 mg/kg이다. 인간을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 보다 큰 포유동물에서 표시된 1일 용량은 분할된 용량(1일 최대 4회를 포함하나 이것으로 한정되지 않음) 또는 연장된 방출 제형으로 편리하게 투여되는 약 0.5 mg 내지 약 100 mg의 범위 내에 있다. 경구 투여에 적합한 유닛 제형은 약 1 내지 50 mg의 활성 성분을 포함한다. 개체 치료 요법에 대한 변수의 수가 크고 이들 권장된 값으로부터의 상당한 이탈이 드물지 않기 때문에 상기 범위는 단지 암시적인 범위이다. 일부 실시양태에서, 용량은 사용되는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 활성, 치료되는 질환 또는 질병, 투여 방식, 개체 대상체의 요구, 치료되는 질환 또는 질병의 중증도 및 의사의 판단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 변수에 따라 변경된다.
일부 실시양태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 측정을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, LD50과 ED50 사이의 비로서 표현된다. 높은 치료 지수를 나타내는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체가 바람직하다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용될 용량 범위를 제제화하는 데에 사용된다. 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용량은 바람직하게는 최소 독성을 갖는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 사용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위에서 달라진다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 약학 조성물은 포장재, 질환 또는 질병의 예방 및/또는 치료에 효과적인 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물이 질환 또는 질병의 치료를 위해 사용된다는 것을 표시하는 표지를 함유하는 제품으로서 포장된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 단회 용량 또는 다회 용량을 위한 양의 약학 조성물을 함유하는 유닛 제형으로 포장된다. 일부 실시양태에서, 포장된 조성물은 투여 전에 (예를 들면, 물 또는 식염수로) 재구성되는 약학 조성물의 동결건조된 분말을 함유한다.
의료 장치 및 생체재료 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 이식가능한 의료 장치의 표면 상에서 직접적으로 조립되거나 이식가능한 의료 장치를 위한 코팅제로서 제제화된다. 하이알루로난을 표면, 예컨대, 금속, 중합체, 세라믹, 실리카 및 합성재 표면에 공유부착시키는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 일부 실시양태에서 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이러한 표면 상에서 조립하기 위해 본원에서 제공된 방법과 함께 사용된다(예를 들면, 미국 특허 제5,356,433호, 제5,336,518호, 제4,613,665호, 제4,810,784호, 제5,037,677호 및 제8,093,365호 참조). 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 이식가능한 의료 장치 또는 이의 부분의 표면 상에서 직접적으로 조립된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 발생된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 정제된 후 이식가능한 의료 장치 또는 이의 부분의 표면 상에 직접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 발생된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 정제된 후 의료 장치 또는 이의 부분에 부착되기 위한 코팅제로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 코팅제는 표면에 직접적으로 도포되거나, 전처리 또는 코팅이 코팅제와 기재의 접착을 보조하기 위해 고안되는 경우 전처리된 또는 코팅된 표면에 도포된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 발생된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 정제된 후, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부착을 촉진하는 물질로 코팅되어 있는 의료 장치 또는 이의 부분에 부착된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 의료 장치 또는 이의 부분은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 하이알루로난의 공유부착을 위한 작용기를 그의 표면 상에 제공하는 접착제 중합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 커플링제, 예컨대, 카보디이미드(그러나, 이것으로 한정되지 않음)를 사용하여 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 중합체 코팅제에 부착시킨다. 일부 실시양태에서, 광고정을 이용하여 본원에서 제공된 방법에 따라 발생된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 의료 장치 또는 이의 부분에 공유부착시킨다. 일부 실시양태에서, 광화학적 또는 열화학적 반응성 기를 포함하는 스페이서 분자를 사용하여 본원에서 제공된 방법에 따라 발생된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 의료 장치 또는 이의 부분에 부착시킨다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 코팅 제제를 예를 들면, 딥(dip) 코팅으로 기재에 도포한다. 다른 도포 방법은 분무, 세척, 증착, 브러시, 롤러, 커튼, 스핀 코팅 및 당분야에서 공지된 다른 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
예시적인 이식가능한 의료 장치는 인공 관절, 정형장치, 골 임플란트, 콘택트 렌즈, 봉합사, 외과용 스테이플, 외과용 클립, 카테터, 혈관성형술 풍선, 센서, 외과용 기구, 전극, 바늘, 주사기, 상처 배출관, 션트(shunt), 요도 삽입물, 금속 또는 플라스틱 임플란트, 심장 밸브, 인공 장기, 랩 밴드(lap band), 고리성형술 고리, 유도 와이어, K-와이어 또는 덴함(Denham) 핀, 스텐트, 스텐트 이식물, 혈관 이식물, 심장박동기, 펠렛, 웨이퍼, 의료 튜빙, 관주 슬리브, 이식가능한 제세동기, 신경자극제, 당 센서, 뇌척수액 션트, 이식가능한 약물 펌프, 척수 케이지, 인공 디스크, 안구 임플란트, 인공와우, 가슴 임플란트, 속질핵에 대한 교체 장치, 귀 튜브, 안내 렌즈, 약물 전달 시스템, 미세입자, 나노입자 및 마이크로캡슐을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 이식가능한 의료 장치는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 임플란트 또는 보철이다. 특정 실시양태에서, 보철은 인공 관절이다. 일부 실시양태에서, 보철은 인공 고관절, 인공 무릎, 인공 상완관절 또는 인공 발목이다.
특정 실시양태에서, 임플란트는 스텐트이다. 특정 실시양태에서, 임플란트는 관상 스텐트, 요관 스텐트, 요도 스텐트, 전립선 스텐트, 골 스텐트 또는 식도 스텐트이다. 특정 실시양태에서, 임플란트는 골 임플란트, 예컨대, 골유착된 임플란트, 또는 두개안면 보철(예를 들면, 인공 귀, 눈 보철, 코 보철)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 대상체에게 전달하기 위해 미세입자 또는 나노입자 상에서 직접적으로 조립된다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 03/015755호 및 미국 특허출원 공보 제2004/0241248호 참조).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 임의의 이러한 이식가능한 의료 장치의 표면 또는 이의 부분 상에 부착되거나, 이러한 표면 또는 이의 부분 상에서 조립되거나, 이러한 표면 또는 이의 부분 상의 코팅제로서 제공된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 이식 후 코팅제로부터 주변 조직 내로 용출된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 생체재료, 예컨대, 줄기 세포 또는 인슐린 생성 세포의 전달을 위해 사용된 스캐폴드, 미세입자, 마이크로캡슐 또는 미세담체 상에서 직접적으로 조립된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐에 부착되거나 마이크로캡슐 상에서 직접적으로 조립된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐을 형성하는 데에 사용되는 물질과 조합되고, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 마이크로캡슐이 발생된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐의 내면을 코팅하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐의 외면을 코팅하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐의 내면 및 외면을 코팅하는 데에 사용된다.
세포를 캡슐화하기 위한 예시적인 물질은 열경화성 하이드로겔, 예컨대, 아가로스, 알기네이트 및 인공 중합체, 예컨대, 폴리(NiPAAm-co-AAC), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 PEG 유도체, 예컨대, PEG 디아크릴레이트 및 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)) 푸메레이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 줄기 세포의 배양 및 마이크로캡슐화 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 일부 실시양태에서 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 마이크로캡슐을 발생시키는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 세포, 다수의 세포 또는 다른 생물학적 물질을 함유한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포들은 줄기 세포, 예컨대, 중간엽 줄기 세포(그러나, 이것으로 한정되지 않음)이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포들은 분화된 세포, 예컨대, 인슐린 생성 세포(그러나, 이것으로 한정되지 않음)이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포들은 자가 세포(즉, 세포의 수용자로부터의 세포 또는 세포의 수용자로부터 유래된 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포들은 동종이계 세포(즉, 세포의 수용자로부터의 세포 또는 세포의 수용자로부터 유래된 세포가 아닌 세포)이다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 세포, 다수의 세포 또는 다른 생물학적 물질을 함유하고, 마이크로캡슐의 내면은 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 세포, 다수의 세포 또는 다른 생물학적 물질을 함유하고, 마이크로캡슐의 외면은 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 세포, 다수의 세포 또는 다른 생물학적 물질을 함유하고, 마이크로캡슐의 내면 및 외면은 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 질환 또는 질병을 치료하기 위해 투여된다. 마이크로캡슐이 투여될 수 있는 예시적인 질환 및 질병, 및 치료 방법은 본원의 임의의 부분에 기재되어 있고 염증 관련 질환 및 면역 관련 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
치료 방법
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 하기 실시양태들은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여를 포함하는 치료 방법의 비-한정적 예이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 하기 상태들 중 하나 이상을 억제하는 데에 사용된다: 흉터형성, 염증, 자가면역 또는 면역 거부를 초래하는 면역 반응, 접착, 혈관신생, 및 세포 또는 조직 재생을 필요로 하는 질병. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 상처 치유를 촉진하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포 확장을 촉진하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 재생을 촉진하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 치료가 필요한 개체에게 임의의 적합한 방법으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 치료가 필요한 개체에게 임의의 적합한 투여 경로로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 적합한 투여 방법은 치료되는 질환 또는 질병에 의존할 것이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 치료 부위에 국소 투여된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 전신 투여된다. 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 예시적인 투여 방법은 비경구, 장, 피하, 피부경유, 경피, 피내, 정맥내, 국소, 흡입 또는 이식을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
흉터형성
특정 실시양태에서, 흉터형성의 예방, 감소 또는 역전을 필요로 하는 대상체에서 흉터형성을 예방하거나, 감소시키거나 역전시키는 방법으로서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
본원에서 사용될 때, "흉터형성"은 흉터의 형성을 의미한다. 한 양태에서, 흉터는 비후성 흉터, 켈로이드 흉터, 또는 여드름으로부터 발생된 흉터이다. 본원에서 사용될 때, "흉터"는 콜라겐의 과다생성으로부터 발생되는 섬유 조직의 영역이다. 일부 경우, 상처 치유는 섬유아세포를 손상 부위로 이동시키는 것을 포함한다. 일부 경우, 섬유아세포는 콜라겐을 침착시킨다. 일부 경우, 섬유아세포는 상처 부위에서 과량의 콜라겐을 침착시켜 흉터를 발생시킨다.
일부 경우, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 TGF-β 신호전달을 예방하거나 억제한다. 일부 경우, TGF-β는 섬유증식 및 콜라겐 침착을 자극하고 (단백질분해효소 억제제의 합성을 상향조절하여) 세포외 매트릭스 분해를 억제함으로써 세포외 매트릭스를 조절한다. 일부 경우, TGF-β의 발현의 예방 또는 억제는 흉터를 예방하거나 흉터의 강도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 흉터형성을 예방하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 근섬유아세포로 분화하는 섬유아세포의 능력을 억제하거나 방해한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 근섬유아세포를 섬유아세포로 복귀시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 흉터의 형성을 예방하거나, 감소시키거나 역전시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를, 흉터형성(예를 들면, 피부염 흉터, 켈로이드 흉터, 구축성 흉터, 비후성 흉터, 또는 여드름으로부터 발생된 흉터)을 초래하는 장애를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 외상 전 또는 후에 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 수술 전 또는 후에 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 눈 또는 주변 조직 상에서 흉터의 형성을 예방하거나 감소시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를, 눈 또는 주변 조직의 흉터형성을 초래하는 장애(예를 들면, 미숙아의 망막병증)를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 눈 또는 주변 조직에의 외상 전 또는 후에 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 눈 또는 주변 조직의 수술 전 또는 후에 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
염증
특정 실시양태에서, 염증의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 염증을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에서 사용될 때, "염증"은 혈장 및/또는 백혈구(예를 들면, 림프구, 대식세포, 과립구 및 호중구)가 감염 또는 외상(예를 들면, 둔기에 의한 외상, 침투 외상 또는 수술) 부위로 이동함으로써 발생되는 생리학적 반응을 의미한다.
일부 경우, 백혈구는 항원과의 접촉 후 사이토카인을 분비한다. 본원에서 사용될 때, "사이토카인"은 신호전달 단백질 또는 당단백질이다. 일부 경우, 사이토카인은 세포 표면 수용체에 결합한다. 일부 경우, 사이토카인은 감염 부위로의 백혈구의 화학주성을 유도한다. 일부 경우, 백혈구 상의 세포 표면 수용체는 사이토카인의 화학적 구배를 검출한다. 일부 경우, 백혈구는 감염 부위까지 구배를 추적한다. 일부 경우, 사이토카인과 세포 표면 수용체의 결합은 특정 유전자들 및 이들의 전사 인자들의 상향조절 또는 하향조절을 발생시킨다. 일부 경우, 유전자 발현의 변화는 사이토카인의 생성, 사이토카인의 생성의 증가, 또는 세포 표면 수용체의 제시의 증가를 야기한다.
비-한정적으로 예를 들면, 사이토카인은 인터류킨 IL-1, IL-6, IL-8, MCP-1(CCL2로서도 공지되어 있음), 및 TNF-α를 포함한다. 인터류킨 1은 2종의 동종형들로 체내에 존재한다: IL-1α 및 IL-1β. 일부 경우, IL-1의 존재는 내피 세포 상에서의 부착 인자의 발현을 증가시킨다. 이것은 백혈구가 감염 부위로 횡단이동할 수 있게 한다. 일부 경우, IL-8은 백혈구의 화학주성을 유도한다. 일부 경우, TNF-α는 백혈구의 화학주성을 유도한다. 일부 경우, MCP-1은 백혈구를 조직 손상 및 감염의 부위로 동원한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 사이토카인의 생성 및/또는 활성을 억제한다. 일부 경우, 사이토카인 농도의 감소는 백혈구의 수, 및/또는 백혈구가 손상 부위로 이동하는 속도를 감소시킴으로써 염증을 감소시키거나 예방한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 백혈구(예를 들면, 대식세포, 호중구 또는 림프구)의 아폽토시스를 유도한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 활성화된 백혈구의 수, 또는 백혈구가 활성화되는 속도를 감소시킨다. 일부 경우, 백혈구의 농도의 감소는 손상 부위로 이동하는 세포의 수를 감소시킴으로써(예를 들면, 아폽토시스를 통한 이러한 세포의 사멸을 촉진함으로써) 염증을 감소시키거나 예방한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 염증 표현형(즉, M1 표현형)으로의 대식세포의 분극화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 자극된 대식세포에서 IL-12 또는 IL-23의 발현을 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조절 또는 상처 치유 M2 표현형으로의 자극된 대식세포의 분극화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체에서 염증을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체에서 염증 반응에 의해 야기된 조직 손상을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체에서 염증을 유도하는 질병 또는 질환에 의해 야기된 조직 손상을 억제하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 급성 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 만성 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 염증성 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 대식세포-매개된 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 T-세포-매개된 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 Th-17-매개된 면역 장애이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 급성 염증 반응을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 급성 염증 반응은 예를 들면, 알레르기, 패혈증, 내독소 쇼크 또는 허혈, 예컨대, 심근경색 및 뇌졸중(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 급성 염증 반응은 세균 감염, 원생동물 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 또는 이들의 조합의 결과이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 급성 염증을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 급성 염증에 의해 야기된 조직 손상을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 심근경색 및 뇌졸중을 비롯한 허혈로 인한 조직 재관류 손상을 억제하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 적응 면역을 통한 림프구의 활성화와 관련되어 있는 만성 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 Th1 반응을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, Th1 반응은 생물학적 이식의 면역 거부를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이식은 동종이식물 이식이다. 일부 실시양태에서, 이식은 자가 이식이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 이식편대 숙주질환 또는 조직 이식 거부이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체에서 만성 염증을 억제하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 염증성 장애와 관련된 Th17 면역 반응과 관련된 만성 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 자가면역 장애 또는 백혈구 결함이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 급성 파종 뇌척수염; 애디슨병; 강직척추염; 항인지질 항체 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 자가면역 간염; 자가면역 내이 질환; 수포성 유천포창; 샤가스병; 만성 폐쇄성 폐 질환; 복강 질환; 피부근염; 1형 진성 당뇨병; 2형 진성 당뇨병; 자궁내막증; 굿파스처 증후군; 그레이브스병; 귈랑-바레 증후군; 하시모토병; 특발성 저혈소판자반색반; 간질성 낭염; 전신홍반루푸스(SLE); 대사 증후군; 다발성 경화증; 중증근무력증; 심근염; 기면증; 비만; 심상성 천포창; 악성 빈혈; 다발근염; 일차 담관 간경화증; 류마티스성 관절염; 정신분열증; 피부경화증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 백반증; 베게너 육아종증; 알레르기성 비염; 전립선암; 비-소세포 폐암종; 난소암; 유방암; 흑색종; 위암; 대장암; 뇌암; 전이성 골 장애; 췌장암; 림프종; 코 폴립; 위장암; 궤양성 결장염; 크론병; 콜라겐성 결장염; 림프구성 결장염; 허혈성 결장염; 분열 결장염; 베체트 증후군; 감염성 결장염; 부정형 결장염; 염증성 간 장애; 허혈; 심근경색; 뇌졸중; 내독소 쇼크; 패혈증 쇼크; 류마티스성 척추염; 강직척추염; 통풍 관절염; 류마티스성 다발근육통; 알쯔하이머병; 파킨슨병; 간질; AIDS 치매; 천식; 성인 호흡 곤란 증후군; 기관지염; 낭성 섬유증; 급성 백혈구-매개된 폐 손상; 원위 직장염; 베게너 육아종증; 섬유근육통; 포도막염; 결막염; 건선; 습진; 피부염; 평활근 증식 장애; 수막염; 대상포진; 뇌염; 신염; 결핵; 망막염; 아토피성 피부염; 췌장염; 치주 잇몸염; 응고 괴사; 액화 괴사; 피브리노이드 괴사; 신생내막 과다형성; 또는 이들의 조합인 염증성 장애를 갖는 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 염증성 장애는 눈 또는 주변 조직의 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 결막염이다. 일부 경우, 결막염은 알레르겐에의 노출로부터 발생된다. 일부 경우, 결막염은 세균 감염으로부터 발생된다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 각막염이다. 본원에서 사용될 때, "각막염"은 각막의 염증을 특징으로 하는 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 각막결막염(즉, 결막염과 각막염(즉, 각막 염증)의 조합)이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 안검염이다. 본원에서 사용될 때, "안검염"은 눈꺼풀 주변의 염증을 특징으로 하는 안 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 안검결막염(즉, 결막염과 안검염(즉, 눈꺼풀의 염증)의 조합)이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 공막염이다. 본원에서 사용될 때, "공막염"은 공막의 염증을 특징으로 하는 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 상공막염이다. 본원에서 사용될 때, "상공막염"은 충혈 및 결막부종을 특징으로 하는 상공막의 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 포도막염이다. 본원에서 사용될 때, "포도막염"은 포도막의 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 망막염이다. 본원에서 사용될 때, "망막염"은 망막의 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 맥락막염이다. 본원에서 사용될 때, "맥락막염"은 포도막, 섬모체 및 맥락막의 염증성 장애이다.
비정상적인 혈관신생
특정 실시양태에서, 혈관신생의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈관신생을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 본원에서 사용될 때, "혈관신생"은 신생 혈관의 형성을 의미한다. 일부 경우, 혈관신생은 종양의 성장 및 전이를 용이하게 한다. 추가로, 일부 경우, 비정상적인 혈관신생은 습성 연령관련 황반변성(wARMD) 및 당뇨병성 증식성 망막병증의 기초이다. 일부 경우, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 혈관신생을 예방하거나 감소시킨다.
일부 경우, 리간드와 VEGF 수용체-2(VEGFR-2)의 결합은 혈관 투과성(eNOS, NO 생성), 증식/생존(bFGF), 이동(ICAM들/VCAM들/MMP들) 및 최종적으로 성숙 혈관으로의 분화를 다양하게 자극하는 인자들의 생성을 자극하는 티로신 키나제 신호전달 캐스케이드를 시작한다. 일부 경우, VEGFR-2와 그의 리간드의 결합 후, 내피 세포는 모세관과 유사한 관 구조물을 형성한다.
본원에서 사용될 때, "습성 연령관련 황반변성", "wARMD" 또는 "습성 ARMD"는 맥락막으로부터의 혈관의 증식을 특징으로 하는 눈의 장애를 의미한다. 일부 경우, 습성 ARMD는 황반 아래로의 혈액 및 단백질 누출로 인해 시력 상실을 야기한다. 일부 경우, 이들 혈관들로부터의 출혈, 누출 및 흉터형성은 치료되지 않은 상태로 방치되는 경우 광수용체에 대한 비가역적 손상 및 신속한 시력 상실을 야기한다.
본원에서 사용될 때, "당뇨병성 증식성 망막병증"은 혈관벽의 부전을 특징으로 하는 눈의 장애를 의미한다. 일부 경우, 망막에서의 산소의 결핍은 망막을 따라 및 유리체액에서 혈관신생을 초래한다. 일부 경우, 신생 혈관은 출혈시키고 시력을 흐리게 하고 망막을 파괴한다.
일부 경우, 모세관의 증식은 영양분을 종양에게 공급하여 종양이 증폭되게 한다. 일부 경우, 모세관의 증식은 종양 성장을 가능하게 하는 세포 폐기물의 신속한 제거를 가능하게 한다. 일부 경우, 혈관신생은 전이를 용이하게 한다. 일부 경우, 모세관의 증식은 암세포가 혈관으로 들어가 새로운 부위에서 새로운 종양을 확립할 수 있는 기회를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용을 통해 치료되는 예시적인 암 종류는 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 항문암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 카시노이드 종양, 암종, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 대장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 성선외 생식 세포 종양, 안암, 안내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위장 카시노이드 종양, 위장 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양(두개외), 생식 세포 종양(성선외), 생식 세포 종양(난소), 임신 영양막 종양, 신경아교종, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 시상하부 및 시각경로 신경아교종, 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장(신장 세포)암, 후두암, 백혈병(급성 림프모구성), 백혈병(급성 골수성), 백혈병(만성 림프구성), 백혈병(만성 골수성), 입술 및 구강암, 간암, 폐암(비-소세포), 폐암(소세포), 림프종(피부 T-세포), 림프종(비-호지킨), 골의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 수질모세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠복 일차 종양을 갖는 전이성 편평 목암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 균상식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식성 질환, 골수형성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 구강암, 구인두암, 골육종/골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 난소 저악성력 종양, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 크롬친화세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽종양, 뇌하수체 종양, 혈장 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종(카포시), 육종(자궁), 세자리 증후군, 피부암(비-흑색종), 피부암(흑색종), 피부 암종(메르켈 세포), 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 복부(위)암, T-세포 림프종, 정소암, 흉선종, 갑상선암, 임신 영양막 종양, 요도암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁 육종, 질암, 시각경로 및 시상하부 신경아교종, 음문암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 윌름스 종양을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
상처 복구 및 조직 재생
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 덮개로서 사용되거나 상처 복구를 촉진하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 조직은 손상(예를 들면, 화상; 수술 절개; 감염, 외상 또는 독소로부터 발생되는 괴사의 영역; 열상)으로 인해 손상되었거나, 훼손되었거나 상실되었다. 일부 실시양태에서, 조직은 화상으로 인해 손상되었거나, 훼손되었거나 상실되었다. 일부 실시양태에서, 조직은 상처(예를 들면, 절개, 열상, 마모)로 인해 손상되었거나, 훼손되었거나 상실되었다. 일부 실시양태에서, 조직은 괴사로 인해 손상되었거나, 훼손되었거나 상실되었다. 일부 실시양태에서, 조직은 궤양형성으로 인해 손상되었거나, 훼손되었거나 상실되었다.
화상
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 화상에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 1도 화상에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 2도 화상에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 3도 화상에 적용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 화상 위에 배치되기 전에 기재에 적용된다.
상처
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 피부의 상처(예를 들면, 절개, 열상, 마모, 궤양, 천공, 침투)에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상처는 허혈성 상처이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처를 치료한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 장기(예를 들면, 피부, 뇌, 위, 신장, 간, 장, 폐, 방광, 기관, 식도, 질, 요관 및 혈관벽)에서의 절개에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 수술 절개에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 결장 절제 부위에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 위절제술 부위에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 유방 수술(예를 들면, 유방 축소 수술, 유방 확대 수술 및 유방절제술)의 부위에 적용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 피부의 절개(예를 들면, 표피, 진피 및/또는 피하조직에 대한 절개) 상의 덮개로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 치질 수술 후 피부를 복구시키거나 보충하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처를 치료한다.
괴사
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 감염으로부터의) 괴사 조직 영역 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 괴사 피부 영역 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 괴사 조직 영역 상에 배치된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 괴사 조직 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 괴사 조직을 치료한다.
궤양
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양 상의 보호 덮개로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양을 치료한다. 일부 실시양태에서, 궤양은 당뇨병성 궤양, 예컨대, 당뇨병성 발 또는 다리 궤양이다. 일부 실시양태에서, 궤양은 허혈성 상처이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양을 치료한다. 일부 실시양태에서, 궤양은 비-치유 궤양이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 비-치유 궤양은 치유 없이 약 3주 내지 4주의 지속기간 동안 존재한 피부 상의 상처 또는 궤양이다.
일부 실시양태에서, 궤양은 발 궤양(예를 들면, 당뇨병성 발 궤양 또는 동맥 불충분 궤양)이다. 일부 실시양태에서, 발 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); 및 (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계; 및 (c) 상기 약학 조성물을 보호 차단막(예를 들면, 은전지 드레싱, 메티펠(metipel), 거즈 또는 붕대)로 덮는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양을 치료한다.
일부 실시양태에서, 궤양은 정맥 정체(VS) 궤양이다. 일부 실시양태에서, VS 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); 및 (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, VS 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계; 및 (c) 상기 약학 조성물을 보호 차단막(예를 들면, 상처 연막, 항미생물 드레싱, 거즈 또는 붕대)으로 덮는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양을 치료한다.
일부 실시양태에서, 궤양은 각막 궤양(즉, 궤양성 각막염)이다. 일부 실시양태에서, 각막 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); 및 (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각막 궤양의 치료는 (a) 상처를 준비하는 단계(예를 들면, 상처의 괴사 조직을 제거하는 단계); (b) 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 상처 상에 배치하는 단계; 및 (c) 상기 약학 조성물을 보호 차단막(예를 들면, 콘택트 렌즈 또는 붕대)으로 덮는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상처 상에 배치되기 전에 기재에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 궤양을 치료한다.
치료 세포 요법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 세포 치료와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 치료 세포와 함께 투여된다. 치료 세포는 질환 또는 질병의 치료를 위한 치료 성질을 나타내는 임의의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 하나 이상의 치료 유전자 생성물을 이종 발현하는 재조합 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 이식된 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 치료 세포는 하나 이상의 줄기 세포 마커(예를 들면, Oct-3/4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 발현하는 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포 치료는 줄기 세포 이식이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 이식 줄기 세포의 증폭 및 조직 재생을 촉진하기 위해 투여된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포 이식에 의해 야기된 염증, 흉터형성 및 비정상적인 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 영양세포층을 치환시킴으로써 생체외 증폭 동안 줄기 세포 특성을 유지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포를 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 대상체 내로의 후속 이식을 위해 줄기 세포를 시험관내에서 증폭시키고 배양하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포 치료는 배아 줄기 세포 치료이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 치료는 성체 줄기 세포 치료이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 치료는 중간엽 줄기 세포 치료이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 치료는 질환 또는 질병, 예컨대, 심혈관 질환, 암, 당뇨병, 척수 손상, 신경퇴행성 질환, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 뒤센 근육퇴행위축증, 근육 손상 또는 퇴행위축증, 뇌졸중, 화상, 폐 질환, 망막 질환, 신장 질환, 골관절염 및 류마티스성 관절염(그러나, 이들로 한정되지 않음)의 치료를 위해 투여된다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포는 진성 당뇨병의 치료에 사용된다. 1형 당뇨병은 췌장의 랑게르한스섬 내의 인슐린 분비 β 세포의 자가면역-매개된 파괴로부터 발생된다. 2형 당뇨병은 전신 인슐린 내성 및 췌장 β 세포에 의한 감소된 인슐린 분비로부터 발생된다. 줄기 세포는 시험관내에서 인슐린 생성 세포로 분화된다는 것이 밝혀졌다(예를 들면, 문헌(Schuldiner et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:11307-11312) 및 문헌(Guo et al., (2009) Endocr Rev 30:214-227) 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, ESC 및 ASC, 및 이들의 유도체, 예컨대, 부분적으로 분화된 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포는 췌장 β 세포의 재생을 위한 줄기 세포 치료에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 치료를 위해 사용되는 줄기 세포 또는 분화된 세포는 마이크로캡슐 장치 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 마이크로캡슐의 표면, 예컨대, 내면 또는 외면, 또는 둘다 상에서 조립된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 마이크로캡슐을 코팅하도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 세포에 대한 영양분을 마이크로캡슐 내로 전달하고/하거나 분비된 단백질 및 분자(예를 들면, 인슐린)가 캡슐화된 세포에 의해 마이크로캡슐의 외부로 유출되게 하기 위해 공극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 먼저 미세담체, 예컨대, 매트리겔®로 코팅된 비드 상에 고정화된 후 마이크로캡슐 내에 캡슐화된다. 세포, 예컨대, 줄기 세포를 캡슐화하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Serra et al. (2011) PLoS ONE 6(8):e23212)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 캡슐화하는 임의의 방법이 본원에서 제공된 방법과 함께 이용된다.
일부 실시양태에서, 동종이계 치료 줄기 세포(예를 들면, 인슐린 생성 섬세포)는 인슐린의 생성을 위한 마이크로캡슐 장치 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포의 증폭을 촉진한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 진성 당뇨병의 치료를 위해 사용된 줄기 세포를 함유하는 마이크로캡슐에 대한 염증 반응을 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 마이크로캡슐은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포를 함유하는 마이크로캡슐에 대한 염증 반응을 억제하거나 감소시킨다.
연조직 용도
특정 실시양태에서, 수용자의 손상된, 훼손된 또는 상실 연조직(예를 들면, 힘줄)을 복구시키거나, 재구축하거나, 교체하거나 보충하기 위한 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 용도가 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 상기 조직에 직접적으로 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 세포 또는 조직 기초 치료와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 세포, 다수의 세포 또는 조직과 혼합되고 조직 기초 치료의 일부로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 세포, 다수의 세포 또는 조직을 코팅하는 데에 사용되고 조직 기초 치료의 일부로서 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 연조직의 절개 상의 덮개로서 사용된다(예를 들면, 눈꺼풀은 연조직의 상이한 층들 사이에 조직 평면을 형성한다). 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용된 후, 연조직의 절개 상의 덮개로서 사용된다(예를 들면, 눈꺼풀은 연조직의 상이한 층들 사이에 조직 평면을 형성한다).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 연조직을 위한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 또는 힘줄 복구에 있어서 접착을 방지한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 힘줄 또는 관절의 복구(예컨대, 회전근개 복구, 손 힘줄 복구)에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 힘줄 또는 관절을 강화시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 치유 힘줄과 주변 조직, 힘줄 또는 관절의 접착을 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 힘줄 상에서의 흉터 조직의 형성을 방지하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고, 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 뒤정강근 힘줄, 종아리 힘줄, 굴곡근 및 신전근 힘줄, 및 측면 발목 복합체의 인대를 비롯한 발 및 발목의 보다 작은 힘줄 및 인대를 증강시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 무릎 주변의 사두 및 슬개 힘줄의 일차 복구를 강화시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 관절 교체에 있어서 골 임플란트를 위한 골막 패치로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 전체 관절 교정 수술 후 둔부 및 무릎 피막 조직을 증강시키는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 파열된 회전근개의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 회전근개 근육 또는 힘줄(예를 들면, 가시위오목 힘줄) 상의 패치로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 회전근개 근육 또는 힘줄(예를 들면, 가시위오목 힘줄)을 재구축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 회전근개 근육 또는 힘줄(예를 들면, 가시위오목 힘줄)을 증강시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 회전근개 근육 또는 힘줄(예를 들면, 가시위오목 힘줄)을 강화시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 연조직과 회전근개 근육 또는 힘줄(예를 들면, 가시위오목 힘줄)의 접착을 방지하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 잇몸의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 잇몸 퇴축의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 잇몸 상의 패치로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 노출된 치근 표면 상의 패치로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 잇몸을 재구축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 잇몸을 증강시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 잇몸을 강화시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 연조직과 잇몸의 접착을 방지하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 근막의 절개 또는 인열 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 근막의 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 근막에 대한 교체물 또는 보충물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 탈출의 복구(예를 들면, 근막의 복구)에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 서혜부 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 대퇴부 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 제대 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 절개 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 횡경막 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 쿠퍼 탈출, 명치 탈출, 열공 탈출, 리트레 탈출, 허리 탈출, 메이들 탈출, 폐쇄근 탈출, 판탈롱 탈출, 식도곁 탈출, 배꼽옆 탈출, 회음 탈출, 복막앞 탈출, 리히터 탈출, 활주 탈출, 좌골 탈출, 스피겔 탈출, 운동 탈출, 벨포 탈출 또는 아미안드 탈출의 복구에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 척추 디스크 탈출의 복구에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 척추 디스크의 절개 또는 인열 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 섬유테의 절개 또는 인열 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 척추 디스크의 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 섬유테의 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 척추 디스크에 대한 교체물 또는 보충물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 척추 디스크의 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 섬유테에 대한 교체물 또는 보충물로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 뇌 또는 1개의 (또는 모든) 수막(즉, 경막, 연막 및/또는 뇌거미막)의 절개 상에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 1개의 (또는 모든) 수막(즉, 경막, 연막 및/또는 뇌거미막)에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 1개의 (또는 모든) 수막(즉, 경막, 연막 및/또는 뇌거미막)에 대한 교체물로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 폐 또는 흉막의 절개 상에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 흉막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 흉막에 대한 교체물로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 고막의 절개 상에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 고막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 고막에 대한 교체물로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심장 또는 심낭막의 절개 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심낭막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심낭막에 대한 교체물로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 복막의 절개 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 복막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 복막에 대한 교체물로서 사용된다.
안과 용도
특정 실시양태에서, 수용자의 손상된, 훼손된 또는 상실 안 조직을 복구시키거나, 재구축하거나, 교체하거나 보충하기 위한 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다.
녹내장의 치료
본원에서 사용될 때, "녹내장"은 시신경에서의 망막 신경절 세포의 상실을 특징으로 하는 장애를 의미한다. 일부 경우, 녹내장은 부분적으로 또는 전체적으로 전방(AC)에서의 안내압의 증가로부터 발생된다. 안내압은 눈의 섬모 과정에 의한 액체 수성 체액의 생성 및 잔기둥 그물을 통한 수성 체액의 배출에 따라 달라진다.
녹내장 배출 장치(GDD)는 수성 체액을 배출시킬 대안적 경로를 제공함으로써 안내압을 경감시키기 위해 눈 내로 이식되는 의료 장치이다. 덮여지지 않은 상태로 방치되는 경우, GDD 관은 부식될 것이고 눈을 안내 감염에 민감하게 방치할 것이다. 따라서, GDD 관은 덮여질 필요가 있다. 현재, GDD 관을 덮는 데에 사용되는 패치는 심낭막, 공막 및 각막으로부터 만들어진다. 이들 패치는 약 400 내지 550 마이크론의 두께를 갖는다. 이들 패치들의 얇은 두께는 2년 이내에 25%까지 그들의 용융을 초래하여 잠재적으로 션트 관을 다시 노출된 상태로 남겨둔다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 GDD 관을 덮는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 기재/nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 300 내지 600 마이크론의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 2년 이내에 25%까지 용융되지 않는다.
눈 궤양의 치료
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 눈의 지속적인 상피 결함 및/또는 궤양을 덮는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 궤양 기저부의 죽은 조직을 외과용 스폰지로 제거하고, 궤양의 가장자리에 인접한 약하게 부착된 상피를 (예를 들면, 상피가 꽤 부착성을 갖게 되는 눈의 구획까지) 제거한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 수용자의 눈에 전달된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용된 후, 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 봉합사(예를 들면, 단절된 10-0 나일론 봉합사 또는 연속된 10-0 나일론 봉합사)에 의해 눈에 고착되고, 이때 봉합사 매듭은 묻혀진다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 피브린 아교의 사용에 의해 눈에 고착된다. 일부 실시양태에서, 보호층은 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체 또는 전체 눈(예를 들면, 콘택트 렌즈) 상에 적용된다. 일부 실시양태에서, 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 항생제(예를 들면, 네오마이신, 폴리믹신 b 설페이트 및 덱사메타손)를 추가로 포함한다.
결막, 공막, 눈꺼풀 및 안와연 표면 재구축
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 결막, 공막, 눈꺼풀 및 안와연 표면 재구축에 사용된다. 일부 실시양태에서, 결막 표면에의 손상은 검구유착 용해; 종양, 병변 및/또는 흉터 조직의 수술적 제거; 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술 및 치료 각막절제술; 또는 이들의 조합으로부터 발생된다.
관상동맥(Coronary) 용도
특정 실시양태에서, 수용자의 손상된, 훼손된 또는 상실 관상 조직을 복구시키거나, 재구축하거나, 교체하거나 보충하기 위한 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다.
허혈 재관류 손상의 예방
허혈, 예컨대, 심근경색 또는 뇌졸중에 의해 야기된 급성 염증으로부터 발생된 조직 손상의 억제 또는 감소를 위한 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 허혈 상태, 예컨대, 심근경색 또는 뇌졸중(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 갖는 대상체에게 투여된다.
관상 동맥 우회술
관상 동맥 우회술에 있어서 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 죽상경화증을 특징으로 하는 동맥의 구획을 우회하기 위해 관상 동맥 상으로 이식된다.
심장 판막
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심장 판막 상에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심장 판막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 심장 판막에 대한 교체물로서 사용된다.
정맥 및 동맥
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 정맥 또는 동맥에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 정맥 또는 동맥에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다.
신경 용도
특정 실시양태에서, 수용자의 손상된, 훼손된 또는 상실 신경 조직을 복구시키거나, 재구축하거나, 교체하거나 보충하기 위한 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 신경(예를 들면, 말초 신경) 상의 덮개로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 신경 이식물, 신경 전달제 또는 복구된 신경 상의 덮개로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 신경(예를 들면, 말초 신경)의 절개 상의 덮개로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 신경(예를 들면, 말초 신경)에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 신경 복구에 있어서 접착을 방지한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 손상된 신경에 대한 비-수축 포위물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 흉터형성, 캡슐화, 만성 압박, 신경의 결박, 및 신경 포획을 방지하거나 최소화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 신경종 형성을 방지하거나 최소화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 신경 복구 동안 존재하는 내생성 성장인자(즉, 신경 성장인자)의 이동을 방지하거나 최소화한다.
척추(Spinal) 용도
특정 실시양태에서, 척추 수술 동안 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추후궁절제술 동안 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 경막외 섬유증 및/또는 흉터 접착을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 경막과 위에 놓인 조직 사이에 이식된다. 일부 실시양태에서, 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 경막과 위에 놓인 조직 사이에 이식하는 것은 경막으로의 섬유아세포의 이동 및 경막 상에서의 콜라겐 침착을 감소시키거나 방지한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 증식성 흉터형성의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 수술 후(예를 들면, 척추후궁절제술 후) 경막외/경막주위/신경주위 흉터의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 증식성 흉터형성의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추후궁절제술 후 막의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 경막외 압박 또는 경막 결박의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 결박된 신경근의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 수술(예를 들면, 척추후궁절제술) 후 지주막염의 발생을 감소시키거나 방지하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 분쇄된 골 조직을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 분쇄된 골 조직을 포함하는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 척추 융합 절차 동안 사용된다. 일부 실시양태에서, 분쇄된 골 조직을 포함하는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 인접 추골들 사이에 이식된다. 일부 실시양태에서, 분쇄된 골 조직을 포함하는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물을 2개의 인접 추골들 사이에 이식하는 것은 추골들의 융합을 촉진한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 경막의 절개 상의 보호 이식물로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 경막에 대한 구조적(수복적) 지지체로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 기재에 적용되고 기재/nHC-HA/PTX3 또는 기재/rcHC-HA/PTX3 복합체는 경막에 대한 교체물로서 사용된다.
nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 기타 용도
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 패치 또는 상처 드레싱에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 피부 충전제로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 피하 안면 조직 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 안면의 주름 및 노화 선(예를 들면, 코입술 주름, 입가 주름, "눈가 주름" 및 이마 주름) 아래에 주입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 입술 확대를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 입술 내로 주입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절염(예를 들면, 골관절염, 류마티스성 관절염, 패혈증 관절염, 강직척추염, 척추증)의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절염 관절(예를 들면, 무릎) 내로 주입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 발의 관절염을 치료하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 제1 발허리발가락(MTP) 관절의 관절염(예를 들면, 엄지발가락굽음)을 치료하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 등 골연절제술 후 MTP 관절에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물의 투여는 엄지발가락굽음 또는 등 골연절제술 절차와 관련된 하나 이상의 불리한 증상(예를 들면, 흉터형성, 관절 강직, 팽윤, 염증 및 통증)을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 돌기와 관련된 하나 이상의 증상(예를 들면, 흉터형성, 관절 강직, 팽윤, 염증 및 통증)을 치료하는 데에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 재흡수의 억제를 필요로 하는 개체에서 골 재흡수를 억제하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 상처 드레싱 또는 붕대의 사용에 의해) 골과 접촉된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 스텐트, 골 임플란트 또는 골 보철(예를 들면, 골유착된 임플란트)을 코팅한다. 본원에서 사용될 때, "골유착된 임플란트"는 조골세포 및 지지 결합 조직이 이동하는 공극을 함유하는 3차원적 임플란트를 의미한다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골의 수질내 공간 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 족근동 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 무릎 또는 관절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골 골절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 확장가능하거나 수축가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골형성의 촉진 또는 유도를 필요로 하는 개체에서 골형성을 촉진하거나 유도하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 상처 드레싱 또는 붕대의 사용에 의해) 골과 접촉된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 스텐트, 골 임플란트 또는 골 보철(예를 들면, 골유착된 임플란트)을 코팅한다. 본원에서 사용될 때, "골유착된 임플란트"는 조골세포 및 지지 결합 조직이 이동하는 공극을 함유하는 3차원적 임플란트를 의미한다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골의 수질내 공간 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 족근동 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 무릎 또는 관절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골 골절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 확장가능하거나 수축가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 파골세포 분해를 억제하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 상처 드레싱 또는 붕대의 사용에 의해) 골과 접촉된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 스텐트, 골 임플란트 또는 골 보철(예를 들면, 골유착된 임플란트)을 코팅한다. 본원에서 사용될 때, "골유착된 임플란트"는 조골세포 및 지지 결합 조직이 이동하는 공극을 함유하는 3차원적 임플란트를 의미한다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골의 수질내 공간 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 족근동 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 무릎 또는 관절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골 골절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 확장가능하거나 수축가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 조골세포에 의한 광물화의 촉진을 필요로 하는 개체에서 조골세포에 의한 광물화를 촉진하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 상처 드레싱 또는 붕대의 사용에 의해) 골과 접촉된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 스텐트, 골 임플란트 또는 골 보철(예를 들면, 골유착된 임플란트)을 코팅한다. 본원에서 사용될 때, "골유착된 임플란트"는 조골세포 및 지지 결합 조직이 이동하는 공극을 함유하는 3차원적 임플란트를 의미한다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골의 수질내 공간 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 족근동 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 무릎 또는 관절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골 골절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 확장가능하거나 수축가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 재흡수와 골형성의 균형을 필요로 하는 개체에서 골 재흡수와 골형성의 균형을 달성하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염, 골다공증, 치조골 분해, 파제트병 또는 골 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 관절 내로 주입된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 (예를 들면, 상처 드레싱 또는 붕대의 사용에 의해) 골과 접촉된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 골 스텐트, 골 임플란트 또는 골 보철(예를 들면, 골유착된 이식물)을 코팅한다. 본원에서 사용될 때, "골유착된 임플란트"는 조골세포 및 지지 결합 조직이 이동하는 공극을 함유하는 3차원적 임플란트를 의미한다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골의 수질내 공간 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 족근동 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 무릎 또는 관절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 골 골절 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 골 스텐트는 확장가능하거나 수축가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 치아교정 또는 치주 질병을 치료하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 치주 질병은 잇몸염, 잇몸 퇴축 및 치주염으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 소염제로서 사용되거나 골유착 또는 치유를 촉진하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 임플란트 골유착, 소염 및 치유를 촉진하기 위해 치아 임플란트와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 쉰소리 또는 음성 장애를 치료하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 성대를 복구시키기 위한 주입 후두성형술에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 약학 조성물은 의료 임플란트(예를 들면, 스텐트) 상에 코팅된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 의료 임플란트/nHC-HA/PTX3 또는 임플란트/rcHC-HA/PTX3 복합체는 이를 필요로 하는 개체 내로 이식되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 부분적으로 또는 전체적으로 개체 내로 방출된다. 일부 실시양태에서, 의료 임플란트는 스텐트(예를 들면, 골 스텐트 또는 관상 스텐트)이다. 일부 실시양태에서, 의료 임플란트는 골 스텐트이다. 일부 실시양태에서, 의료 임플란트는 관상 스텐트이다.
조합
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 제2 치료제와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 2종 이상의 치료제와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 1종 이상의 치료제와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 또는 10종 이상의 치료제와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 제2 치료제는 동일한 제형으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 제2 치료제는 별개의 제형으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 제2 치료제는 동시에(예를 들면, 동시적으로, 본질적으로 동시적으로 또는 동일한 치료 프로토콜 내에서) 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 제2 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 제2 치료제 전 또는 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여와 제2 활성 물질의 투여 사이의 시간은 각각의 약제의 성질, 예컨대, 약제의 효능, 가용성, 생체이용성, 혈장 반감기 및 동력학적 프로파일에 따라 수분 내지 수시간이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자 농도의 일주기 편차는 최적 용량 간격을 결정한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여와 제2 활성 물질의 투여 사이의 시간은 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월 또는 이보다 긴 시간이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 동시투여는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체에 대한 요구된 용량을 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX 복합체 단독을 투여할 때 요구된 용량보다 더 낮춘다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제의 동시투여는 제2 치료제에 대한 요구된 용량을 제2 치료제를 단독으로 투여할 때 요구된 용량보다 더 낮춘다. 조합 치료 요법에서 사용될 약물 및 다른 물질의 치료 유효 용량을 실험적으로 결정하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 기재되어 있다. 예를 들면, 기계적으로 규칙적인 투약의 이용, 즉 독성 부작용을 최소화하기 위한 보다 빈번한 보다 낮은 용량의 제공은 당분야에서 광범위하게 기재되어 있다. 조합 치료는 개체의 임상 관리를 보조하기 위해 다양한 시간에서 시작하고 중단하는 주기적 치료도 포함한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 하나 이상의 추가 치료제의 조합 치료는 변경된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료는 변경되므로, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 제2 치료제의 양에 비해 상대적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료는 변경되므로, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양은 제2 치료제의 양에 비해 상대적으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료는 변경되므로, 제2 치료제의 양은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양에 비해 상대적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료는 변경되므로, 제2 치료제의 양은 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 양에 비해 상대적으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 세포독성제, 항-미생물제, 항-혈관신생제, 화학치료제, 항-신생물제 및 방사선치료로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항-대사물질, 에피도필로독소, 항-신생물성 효소, 토포이소머라제 억제제, 프로카바진, 미톡산트론, 백금 배위 착물, 생물학적 반응 변경제 및 성장 억제제, 호르몬/항-호르몬 치료제, 조혈 성장인자, 아로마타제 억제제, 항-에스트로겐, 항-안드로겐, 코르티코스테로이드, 고나도렐린 작용제, 마이크로튜불 활성 물질, 니트로소우레아, 지질 또는 단백질 키나제 표적화제, 면역조절 약물(IMiD), 단백질 또는 지질 포스파타제 표적화제, 항-혈관신생제, Akt 억제제, IGF-I 억제제, FGF3 조절제, mTOR 억제제, Smac 미메틱, HDAC 억제제, 세포 분화를 유도하는 물질, 브라디키닌(bradykinin) 1 수용체 길항제, 안지오텐신 II 길항제, 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 억제제, 헤파라나제(heparanase) 억제제, 림포카인 억제제, 사이토카인 억제제, IKK 억제제, P38MAPK 억제제, HSP90 억제제, 멀티키나제(multikinase) 억제제, 비스포스포네이트, 라파마이신 유도체, 항-아폽토시스 경로 억제제, 아폽토시스 경로 작용제, PPAR 작용제, RAR 작용제, Ras 동형체의 억제제, 텔로머라제(telomerase) 억제제, 단백질분해효소 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 아미도펩티다제 억제제, SHIP 활성화제 - AQX-MN100, 휴맥스(Humax)-CD20(오파투무맙), CD20 길항제, IL2-디프테리아 독소 융합체, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-미생물제는 항바이러스, 항균제 또는 항진균제이다. 비-한정적 예시적인 항균제(들)는 아미노글리코사이드, 베타 락탐, 퀴놀론 또는 플루오로퀴놀론, 마크롤라이드, 설폰아미드, 설파메탁소졸, 테트라사이클린, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논(예컨대, 리네졸리드), 클린다마이신, 린코마이신, 리파마이신, 당펩티드, 폴리믹신 및 지질펩티드 항생제로서 분류된 항균제뿐만 아니라, 이들의 약리학적으로 허용가능한 나트륨 염, 약리학적으로 허용가능한 칼슘 염, 약리학적으로 허용가능한 칼륨 염, 지질 제제, 유도체 및/또는 유사체도 포함한다. 항진균제의 비-한정적 예시적인 클래스는 이미다졸 또는 트리아졸, 예컨대, 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 에코나졸, 부토코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 터코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 보리코나졸(UK 109,496), 포사코나졸, 라부코나졸 또는 플루트리마졸; 폴리엔 항진균제, 예컨대, 암포테리신 B, 리포좀 암포테레신 B, 나타마이신, 나이스타틴 및 나이스타틴 지질 제제; 에키노칸딘, 예컨대, 카스포펀진, 미카펀진, 아니둘펀진 및 실로펀진을 비롯한 세포벽 활성 환형 지질펩티드 항진균제; LY121019; LY303366; 및 알킬아민 군의 항진균제, 예컨대, 터비나프메(terbinafme)를 포함한다. 항진균제의 다른 비-한정적 예로는 나프티핀, 톨나프테이트, 메디오시딘, 칸디시딘, 트리코마이신, 하마이신, 아우레펀진, 아스코신, 아이파틴, 아자콜루틴, 트리코마이신, 레보린, 헵타마이신, 칸디마이신, 그리세오풀빈, BF-796, MTCH 24, BTG-137586, 프라디미신(MNS 18184), 베나노미신, 암비솜, 니코마이신 Z, 플루사이토신 또는 페리마이신이 있다. 항바이러스제의 비-한정적 예로는 시도포비르, 아만타딘, 리만타딘, 아사이클로비르, 강사이클로비르, 펜사이클로비르, 팜시클로비르, 포스카멧, 리바비린 또는 발사이클로비르가 있다. 일부 실시양태에서, 항-미생물제는 선천성 면역 펩티드 또는 단백질이다. 선천성 펩티드 또는 단백질의 일부 예시적인 클래스는 트랜스페린, 락토페린, 데펜신, 포스포리파제, 라이소자임, 카텔리시딘, 서프로시딘, 살균 투과성 증가 단백질, 양친매성 알파 나선형 펩티드 및 다른 합성 항미생물 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항-미생물제는 방부제이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 ARRY-797, 다카바진(DTIC), 악티노마이신 C2, C3, D 및 F1, 사이클로포스프아미드, 멜팔란, 에스트라무스틴, 메이탄시놀, 리파마이신, 스트렙토바리신, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에소루비신, 미톡산트론, 블레오마이신 A, A2 및 B, 캄프토테신, 이리노테칸, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, 9-니트로캄프토테신, 보르테조밉, 테모졸로마이드, TAS103, NPI0052, 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 A-2, 콤브레타스타틴 A-4, 칼리케아미신, 네오카시노스타틴, 에포틸론 A, B, C 및 반합성 변이체, 헤르셉틴, 리툭산, CD40 항체, 아스파라기나제, 인터류킨, 인터페론, 류프롤라이드 및 페가스파르가제, 5-플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, 토라푸르(ptorafur), 5'-데옥시플루오로우리딘, UFT, MITC, S-1 카페시타빈, 디에틸스틸베스트롤, 타목시펜, 토레메핀, 톨무덱스, 타이미택, 플루타마이드, 플루옥시메스테론, 비칼루타마이드, 피나스테라이드, 에스트라디올, 트리옥시펜, 덱사메타손, 류프로엘린 아세테이트, 에스트라무스틴, 드롤록시펜, 메드록시프로게스테론, 메게스테롤 아세테이트, 아미노글루테티마이드, 테스토락톤, 테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤, 하이드록시프로게스테론, 미토마이신 A, B 및 C, 포피로마이신, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 테트라플라틴, 백금-DACH, 오르마플라틴, 탈리도마이드, 레날리도마이드, CI-973, 텔로메스타틴, CHIR258, Rad 001, SAHA, 투바신, 17-AAG, 소라페닙, JM-216, 포도필로톡신, 에피포도필로톡신, 에토포사이드, 테니포사이드, 타세바, 이레사, 이마티닙, 밀테포신, 페리포신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로-메토트렉세이트, 6-머캡토푸린, 티오구아닌, 아자투오프린, 알로푸리놀, 클라드리빈, 플루다라빈, 펜토스타틴, 2-클로로아데노신, 데옥시사이티딘, 사이토신 아라비노사이드, 사이타라빈, 아자시티딘, 5-아자사이토신, 겐시타빈, 5-아자사이토신-아라비노사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 류로신, 류로시딘 및 빈데신, 파클리탁셀, 탁소테레 및/또는 도세탁셀로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 활성 물질은 니아신, 피브레이트, 스타틴, Apo-A1 미메틱 폴리펩티드(예를 들면, DF-4, 노바티스), apoA-I 전사 상향조절제, ACAT 억제제, CETP 조절제, 당단백질(G) IIb/IIIa 수용체 길항제, P2Y12 수용체 길항제, Lp-PLA2-억제제, 항-종양 괴사 인자(TNF) 물질, 인터류킨-1(IL-1) 수용체 길항제, 인터류킨-2(IL-2) 수용체 길항제, 인터류킨-6(IL-6) 수용체 길항제, 인터류킨-12(IL-12) 수용체 길항제, 인터류킨-17(IL-17) 수용체 길항제, 인터류킨-23(IL-23) 수용체 길항제, 세포독성제, 항-미생물제, 면역조절제, 항생제, T-세포 보조자극 차단제, 장애 개선 항-류마티스제, B 세포 고갈제, 면역억제제, 항-림프구 항체, 알킬화제, 항-대사물질, 식물 알칼로이드, 테르페노이드, 토포이소머라제 억제제, 항-종양 항생제, 단일클론 항체, 호르몬 치료(예를 들면, 아로마타제 억제제), 또는 이들의 조합물이다.
일부 실시양태에서, 제2 활성 물질은 항-TGF-β 항체, 항-TGF-β 수용체 차단 항체, 항-TNF 항체, 항-TNF 수용체 차단 항체, 항-IL1β 항체, 항-IL1β 수용체 차단 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-2 수용체 차단 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-6 수용체 차단 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL-12 수용체 차단 항체, 항-IL-17 항체, 항-IL-17 수용체 차단 항체, 항-IL-23 항체, 또는 항-IL-23 수용체 차단 항체이다.
일부 실시양태에서, 제2 활성 물질은 다음과 같은 물질들이다: 니아신; 벤자피브레이트; 시프로피브레이트; 클로피브레이트; 겜피브로질; 페노피브레이트; DF4(Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2); DF5; RVX-208(레스버로직스(Resverlogix)); 아바시미베; 팍티미베 설페이트(CS-505); CI-1011(2,6-디이소프로필페닐[(2,4,6-트리이소프로필페닐)아세틸]설파메이트); CI-976(2,2-디메틸-N-(2,4,6-트리메톡시페닐)도데칸아미드); VULM1457(1-(2,6-디이소프로필페닐)-3-[4-(4'-니트로페닐티오)페닐]우레아); CI-976(2,2-디메틸-N-(2,4,6-트리메톡시페닐)도데칸아미드); E-5324(n-부틸-N'-(2-(3-(5-에틸-4-페닐-1H-이미다졸-1-일)프로폭시)-6-메틸페닐)우레아); HL-004(N-(2,6-디이소프로필페닐)테트라데실티오아세트아미드); KY-455(N-(4,6-디메틸-1-펜틸인돌린-7-일)-2,2-디메틸프로판아미드); FY-087(N-[2-[N'-펜틸-(6,6-디메틸-2,4-헵타디이닐)아미노]에틸]-(2-메틸-1-나프틸-티오)아세트아미드); MCC-147(미쯔비시 파마(Mitsubishi Pharma)); F 12511((S)-2',3',5'-트리메틸-4'-하이드록시-알파-도데실티오아세트아닐라이드); SMP-500(스미토모 파마슈티칼스(Sumitomo Pharmaceuticals)); CL 277082(2,4-디플루오로-페닐-N[[4-(2,2-디메틸프로필)페닐]메틸]-N-(헵틸)우레아); F-1394((1s,2s)-2-[3-(2,2-디메틸프로필)-3-노닐우레이도]아미노사이클로헥산-1-일 3-[N-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카보닐)아미노]프로피오네이트); CP-113818(N-(2,4-비스(메틸티오)-6-메틸피리딘-3-일)-2-(헥실티오)데칸산 아미드); YM-750; 토르세트라핍; 아나세트라피드; JTT-705(저팬 토바코/로슈(Japan Tobacco/Roche)); 아브식시맙; 엡티피바타이드; 티로피반; 록시피반; 바리아빌린; XV 459(N(3)-(2-(3-(4-포름아미디노페닐)이속사졸린-5-일)아세틸)-N(2)-(1-부틸옥시카보닐)-2,3-디아미노프로피오네이트); SR 121566A(3-[N-{4-[4-(아미노이미노메틸)페닐]-1,3-티아졸-2-일}-N-(1-카복시메틸피페리드-4-일)아미놀 프로피온산, 삼염화물); FK419((S)-2-아세틸아미노-3-[(R)-[1-[3-(피페리딘-4-일)프로피오닐]피페리딘-3-일카보닐]아미노]프로피온산 삼수화물); 클로피도그렐; 프라수그렐; 칸그렐로르; AZD6140(아스트라제네카(AstraZeneca)); MRS 2395(2,2-디메틸-프로피온산 3-(2-클로로-6-메틸아미노푸린-9-일)-2-(2,2-디메틸-프로피오닐옥시메틸)-프로필 에스테르); BX 667(버렉스 바이오사이언시스(Berlex Biosciences)); BX 048(버렉스 바이오사이언시스); 다라플라딥(SB 480848); SB-435495(글락소스미쓰클라인(GlaxoSmithKline)); SB-222657(글락소스미쓰클라인); SB-253514(글락소스미쓰클라인); 알레파셉트; 에팔리주맙; 메토트렉세이트; 아시트레틴; 이소트레티노인; 하이드록시우레아; 마이코페놀레이트 모페틸; 설파살라진; 6-티오구아닌; 도보넥스; 타클로넥스; 베타메타손; 타자로텐; 하이드록시클로로퀸; 설파살라진; 에타네르셉트; 아달리무맙; 인플릭시맙; 아바타셉트; 리툭시맙; 트라스투주맙; 항-CD45 단일클론 항체 AHN-12(NCI); 요오드-131 항-B1 항체(코릭사 코포레이션(Corixa Corp.)); 항-CD66 단일클론 항체 BW 250/183(NCI, 사우쓰앰프톤 종합 병원); 항-CD45 단일클론 항체(NCI, 베일러 의과대학); 항체 항-anb3 인테그린(NCI); BIW-8962(바이오와 인코포레이티드(BioWa Inc.)); 항체 BC8(NCI); 항체 muJ591(NCI); 인듐 In 111 단일클론 항체 MN-14(NCI); 이트륨 Y 90 단일클론 항체 MN-14(NCI); F105 단일클론 항체(NIAID); 단일클론 항체 RAV12(라벤 바이오테크놀로지스(Raven Biotechnologies)); CAT-192(인간 항-TGF-베타1 단일클론 항체, 젠자임(Genzyme)); 항체 3F8(NCI); 177Lu-J591(코넬 대학의 웨일 의과대학); TB-403(바이오인벤트 인터내셔날 에이비(BioInvent International AB)); 아나킨라; 아자티오프린; 사이클로포스프아미드; 사이클로스포린 A; 레플루노마이드; d-페니실아민; 아미트립틸린 또는 노르트립틸린; 클로람부실; 질소 머스타드; 프라스테론; LJP 394(아베티무스 나트륨); LJP 1082(라 졸라 파마슈티칼(La Jolla Pharmaceutical)); 에쿨리주맙; 벨리부맙; rhuCD40L(NIAID); 에프라투주맙; 시롤리무스; 타크롤리무스; 피메크롤리무스; 탈리도마이드; 항-흉선세포 글로불린-말(아트감(Atgam), 파마샤 업존(Pharmacia Upjohn)); 항-흉선세포 글로불린-토끼(타이모글로불린(Thymoglobulin), 젠자임(Genzyme)); 뮤로모납-CD3(FDA의 희귀 제품 개발국); 바실릭시맙; 다클리주맙; 릴루졸; 클라드리빈; 나탈리주맙; 인터페론 베타-1b; 인터페론 베타-1a; 티자니딘; 바클로펜; 메살라진; 아사콜; 펜타사; 메살라민; 발살라자이드; 올살라진; 6-머캡토푸린; AIN457(항-IL-17 단일클론 항체, 노바티스); 테오필린; D2E7(크놀 파마슈티칼스(Knoll Pharmaceuticals)의 인간 항-TNF mAb); 메폴리주맙(항-IL-5 항체, SB 240563); 카나키누맙(항-IL-1 베타 항체, NIAMS); 항-IL-2 수용체 항체(다클리주맙, NHLBI); CNTO 328(항-IL-6 단일클론 항체; 센토코르(Centocor)); ACZ885(전체 인간 항-인터류킨-1베타 단일클론 항체, 노바티스); CNTO 1275(전체 인간 항-IL-12 단일클론 항체, 센토코르); (3S)-N-하이드록시-4-({4-[(4-하이드록시-2-부티닐)옥시]페닐}설포닐)-2,2-디메틸-3-티오모르폴린 카복스아미드(아프라타스타트); 골리무맙(CNTO 148); 오너셉트; BG9924(바이오겐 아이덱(Biogen Idec)); 세르톨리주맙 페골(CDP870; UCB 파마); AZD9056(아스트라제네카)(AstraZeneca); AZD5069(아스트라제네카); AZD9668(아스트라제네카); AZD7928(아스트라제네카); AZD2914(아스트라제네카); AZD6067(아스트라제네카); AZD3342(아스트라제네카); AZD8309(아스트라제네카); [(1R)-3-메틸-1-({(2S)-3-페닐-2-[(피라진-2-일카보닐)아미노]프로파노일}아미노)부틸]보론산(보르테조밉); AMG-714(항-IL-15 인간 단일클론 항체, 암젠(Amgen)); ABT-874(항-IL-12 단일클론 항체, 애보트 랩스(Abbott Labs)); MRA(토실리주맙, 항-IL-6 수용체 단일클론 항체, 추가이 파마슈티칼(Chugai Pharmaceutical)); CAT-354(인간 항-인터류킨-13 단일클론 항체, 캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology), 메디뮨(MedImmune)); 아스피린; 살리실산; 겐티스산; 콜린 마그네슘 살리실레이트; 콜린 살리실레이트; 마그네슘 살리실레이트; 나트륨 살리실레이트; 디플루니살; 카프로펜; 페노프로펜; 페노프로펜 칼슘; 플루로비프로펜; 이부프로펜; 케토프로펜; 나부톤; 케톨로락; 케토롤락 트로메타민; 나프록센; 옥사프로진; 디클로페낙; 에토돌락; 인도메타신; 설린닥; 톨메틴; 메클로페나메이트; 메클로페나메이트 나트륨; 메페남산; 피록시캄; 멜록시캄; 셀레콕십; 로페콕십; 발데콕십; 파레콕십; 에토리콕십; 루미라콕십; CS-502(산쿄(Sankyo)); JTE-522(저팬 토바코 인코포레이티드(Japan Tobacco Inc.)); L-745,337(알미랄(Almirall)); NS398(시그마(Sigma)); 베타메타손(셀레스톤(Celestone)); 프레드니손(델타손(Deltasone)); 알클로메타손; 알도스테론; 암시노나이드; 베클로메타손; 베타메타손; 부데소나이드; 시클레소나이드; 클로베타솔; 클로베타손; 클로코르톨론; 클로프레드놀; 코르티손; 코티바졸; 데플라자코르트; 데옥시코르티코스테론; 데소나이드; 데속시메타손; 데속시코르톤; 덱사메타손; 디플로라손; 디플루코르톨론; 디플루프레드네이트; 플루클로롤론; 플루드로코르티손; 플루드록시코르타이드; 플루메타손; 플루니솔라이드; 플루오시놀론 아세토나이드; 플루오시노나이드; 플루오코르틴; 플루오코르톨론; 플루오로메톨론; 플루퍼롤론; 플루프레드니덴; 플루티카손; 포르모코르탈; 포르모테롤; 할시노나이드; 할로메타손; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 아세포네이트; 하이드로코르티손 부테프레이트; 하이드로코르티손 부티레이트; 로테프레드놀; 메드리손; 메프레드니손; 메틸프레드니솔론; 메틸프레드니솔론 아세포네이트; 모메타손 푸로에이트; 파라메타손; 프레드니카베이트; 프레드니손; 리멕솔론; 틱소코르톨; 트리암시놀론; 울로베타솔; 시스플라틴; 카보플라틴; 옥살리플라틴; 메클로레타민; 사이클로포스프아미드; 클로람부실; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 비노렐빈; 빈데신; 아자티오프린; 머캡토푸린; 플루다라빈; 펜토스타틴; 클라드리빈; 5-플루오로우라실(5FU); 플록수리딘(FUDR); 사이토신 아라비노사이드; 메토트렉세이트; 트리메토프림; 피리메타민; 페메트렉세드; 파클리탁셀; 도세탁셀; 에토포사이드; 테니포사이드; 이리노테칸; 토포테칸; 암사크린; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 테니포사이드; 닥티노마이신; 독소루비신; 다우노루비신; 발루비신; 이다루비신; 에피루비신; 블레오마이신; 플리카마이신; 미토마이신; 트라스투주맙; 세툭시맙; 리툭시맙; 베바시주맙; 피나스테라이드; 고세렐린; 아미노글루테티마이드; 아나스트로졸; 레트로졸; 보로졸; 엑세메스탄; 4-안드로스텐-3,6,17-트리온("6-OXO"); 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온(ATD); 포르메스탄; 테스톨락톤; 파드로졸; 또는 이들의 조합.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항생제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항균제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 파로모마이신, 겔단마이신, 허비마이신, 로라카베프, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴, 실라스타틴, 메로페넴, 세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴, 세팔렉신, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 데프프로질, 세푸록심, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세페핌, 세프토비프롤, 테이코플라닌, 반코마이신, 아지쓰로마이신, 클라리쓰로마이신, 디리쓰로마이신, 에리쓰로마이신, 록시쓰로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리쓰로마이신, 스펙티노마이신, 아즈트레오남, 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 카베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 피페라실린, 티카실란, 박시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로브플록사신, 마페나이드, 프론토실, 설파세트아미드, 설파메티졸, 설파니밀리마이드, 설프살라진, 설프시옥사졸, 트리메토프림, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥스테트라사이클린, 테트라사이클린, 아스펜아민, 클로람페니콜, 클린다마이신, 린코마이신, 에탐부톨, 포스포마이신, 푸시드산, 푸라졸리돈, 이소니아지드, 리네졸리드, 메트로니다졸, 무피로신, 니트로푸란토인, 플라텐시마이신, 피라진아미드, 퀴누스프리스틴/달포프리스틴, 리팜핀, 티니다졸 및 이들의 조합물이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항바이러스제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아사이클로비르, 팜시클로비르, 발라사이클로비르, 아바카비르, 아시클로비르, 애드포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 아르비돌, 아타자나비르, 아르티플라, 브리부딘, 시도포비르, 콤비비르, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르타이드, 엔테카비르, 폼비르센, 포삼프레나비르, 포스카넷, 포스포넷, 간시클로비르, 가다실, 이바시타빈, 이뮤노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론(I형 인터페론(예를 들면, IFNα 및 IFNβ), II형 인터페론 및 III형 인터페론을 포함함), 라미부딘, 로피나비르, 로비라이드, MK-0518, 마라비록, 모록시딘, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 뉴클레오사이드 유사체, 오셀타미비르, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로독소, 단백질분해효소 억제제, 역전사효소 억제제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 스타부딘, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로맘타딘, 트루바다, 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비르, 지도부딘 및 이들의 조합물이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항진균제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 암롤핀, 우테나핀, 나프티핀, 터비나핀, 플루사이토신, 플루코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸, 포사코나졸, 라부코나졸, 보리코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 미코나졸, 옥시코나졸, 설코나졸, 터코나졸, 티오코나졸, 닉코마이신 Z, 카스포펀진, 미카펀진, 아닐둘라펀진, 암포테리신 B, 리포좀 나이스타스틴, 피마리신, 그리세오풀빈, 시클로피록스 올라민, 할로프로긴, 톨나프테이트, 운데실레네이트, 클리오퀴놀 및 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-기생충제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아미트라즈, 아모스카네이트, 아버멕틴, 카바독스, 디에틸카바미진, 디메트리다졸, 디미나젠, 이버멕틴, 마크로필라리사이드, 말라티온, 미타반, 옥삼니퀸, 퍼메트린, 프라지쿠안텔, 프란텔 파모에이트, 셀라멕틴, 나트륨 스티보글루코네이트, 티아벤다졸 및 이들의 조합물이다.
세포 및 조직과의 조합
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 세포, 다수의 세포 또는 조직과 함께 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 치료 세포와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 이식물과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포 이식물과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 장기 이식물과 함께 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 이식물과 동시에(예를 들면, 동시적으로, 본질적으로 동시적으로 또는 동일한 치료 프로토콜 내에서) 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 이식물 전 또는 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여와 조직 이식물의 투여 사이의 시간은 각각의 약제의 성질, 예컨대, 약제의 효능, 가용성, 생체이용성, 혈장 반감기 및 동력학적 프로파일에 따라 수분 내지 수시간이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자 농도의 일주기 편차는 최적 용량 간격을 결정한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여와 제2 활성 물질의 투여 사이의 시간은 약 1시간 미만, 1일 미만, 1주 미만 또는 1개월 미만이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 이식물 및 면역억제제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 조직 이식물 및 칼시뉴린 억제제(예를 들면, 사이클로스포린 또는 타크롤리무스); mTOR 억제제(시롤리무스; 에버롤리무스); 항-증식제(아자티오프린 또는 마이코페놀산); 코르티코스테로이드(예를 들면, 프레드니솔론 또는 하이드로코르티손); 단일클론 항-IL-2Rα 수용체 항체(예를 들면, 바실릭시맙 또는 다클리주맙); 다중클론 항-T-세포 항체(예를 들면, 항-흉선세포 글로불린(ATG) 또는 항-림프구 글로불린(ALG)); 또는 이들의 조합물과 함께 투여된다.
일부 실시양태에서, 조직이 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 다수의 줄기 세포가 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 장기가 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 사용한 조직의 코팅은 숙주 면역 시스템이 조직에 작용하는 것을 방해한다.
일부 실시양태에서, 장기, 조직 또는 다수의 줄기 세포는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 장기, 조직 또는 다수의 줄기 세포는 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 7.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 7.4의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 칼륨, 마그네슘 및 라피노스를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아데노신, 글루타티온, 알로푸리놀 및 하이드록시에틸 전분 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체로 보충된 UW 용액이다.
일부 실시양태에서, 장기, 조직 또는 다수의 줄기 세포는 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간 또는 약 48시간 동안 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 접촉은 조직 및 혈관 컨디셔닝을 보호하는 온도(예를 들면, 주위 온도 미만의 온도)에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 접촉은 4℃에서 일어난다.
의료 장치 조합
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 의료 장치와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 의료 장치 또는 이의 부분은 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 본원의 임의의 부분에 기재된 의료 장치 또는 이의 부분을 코팅하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 의료 장치와 함께 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 이식된 의료 장치에 대한 염증 반응을 감소시키거나, 억제하거나 방지한다. 일부 실시양태에서, 의료 장치와 함께 본원에 개시된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 투여는 이식된 의료 장치 상에서의 미생물 생장에 의해 생성되는 감염성 생물막의 형성(즉, 만성 생물막 감염)을 감소시키거나, 억제하거나 방지한다. 이러한 생물막의 예는 세균, 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(그러나, 이것으로 한정되지 않음)에 의해 생성된 생물막이다.
제품 및 키트
본원에서 제공된 제품은 포장재를 함유한다. 약품의 포장에 사용되는 포장재는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약품 포장재의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기(예를 들면, 가압된 계량 용량 흡입기(MDI), 건조 분말 흡입기(DPI), 분사기(예를 들면, 제트 또는 초음파 분사기) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템), 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 경로 및 치료에 적합한 임의의 포장재가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 의료 장치, 예컨대, 임플란트, 카테터, 인공 관절, 스텐트, 밸브, 나노입자 또는 마이크로캡슐 내로 도입되거나, 이러한 의료 장치에 도포되거나 이러한 의료 장치 상에 코팅된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 약학 조성물 또는 조합물은 키트로서 제공된다. 키트는 임의적으로 하나 이상의 구성요소, 예컨대, 사용설명서, 장치 및 추가 시약(예를 들면, 조성물의 희석 및/또는 동결건조된 단백질의 재구성을 위한 멸균된 물 또는 식염수 용액), 및 방법의 실시를 위한 구성요소, 예컨대, 튜브, 용기 및 주사기를 포함한다. 예시적인 키트는 본원에서 제공된 약학 조성물 또는 조합물을 포함하고, 임의적으로 사용설명서, 약학 조성물 또는 조합물을 대상체에게 투여하기 위한 장치, 대상체에서 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 검출하기 위한 장치, 대상체로부터 수득된 샘플에서 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 검출하기 위한 장치, 및 추가 치료제를 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함한다.
키트는 임의적으로 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 전형적으로 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 및 임의적으로 키트에 포함된 다른 구성요소, 및 투여 방법(nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 투여하기 위한 대상체의 적절한 상태, 적절한 용량, 투약 요법 및 적절한 투여 방법을 결정하는 방법을 포함함)을 기술하는 유형의 표현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설명서는 치료 지속시간에 걸쳐 대상체를 모니터링하기 위한 지침을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 약학 조성물 및 진단을 위한 물품을 포함한다. 예를 들면, 이러한 키트는 대상체에서 선택된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 물품을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 키트는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약물을 대상체에게 투여하기 위한 당분야에서 공지된 다양한 장치들 중 임의의 장치가 본원에서 제공된 키트에 포함된다. 예시적인 장치는 흡입기(예를 들면, 가압된 계량 용량 흡입기(MDI), 건조 분말 흡입기(DPI), 분사기(예를 들면, 제트 또는 초음파 분사기) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템), 피하 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 및 액체 분배기, 예컨대, 점안기를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전형적으로, 키트의 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 투여하기 위한 장치는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 원하는 투여 방법과 상용가능할 것이다.
줄기 세포 배양물의 확장
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 단리된 줄기 세포를 증폭시키는 방법이 본원에 개시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, HC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포의 응집을 촉진하고, 세포의 분화를 방지하고 줄기 세포 마커의 발현을 보존한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 복합체 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체 상에서의 증폭은 배아 줄기 세포(ESC) 마커(예를 들면, Oct4, Nanog, Sox2(SRY(성별 결정 영역 Y)-box 2), Rex1(Zfp42), SSEA4(단계 특이적 배아 항원-4), MYC/c-Myc 및 KLF4, 주연세포 마커(예를 들면, NG2(신경-아교 항원 2/콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4)), PDGFR-β(혈소판 유래의 성장인자 수용체 B), 및 α-SMA(α-평활근 액틴)), 및 혈관신생 마커(예를 들면, CD133/2, FLK-1(VEGF-R2, Ly-73), vWF(본 빌레브란트 인자), CD34, CD31(PECAM-1) 및 CD146) 중 하나 이상의 마커의 발현을 보존한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 마커의 발현은 통상적인 방법, 예를 들면, 단백질 발현 분석(예를 들면, 웨스턴 블롯팅, 면역형광, 면역조직화학, 형광 활성화된 세포 분류) 또는 mRNA 분석(예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 노던)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 배양된 세포에서 TGF-β 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 배양된 줄기 세포에서 TGF-β 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, TGF-β 신호전달의 억제는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재에 비해 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 존재 하에서 세포 내의 TGF-β 세포 신호전달 경로, 예컨대, pSMAD 2/3 신호전달 또는 α 평활근 형성에서 하나 이상의 단백질 또는 마커의 활성 또는 발현의 감소를 지칭한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 배양된 세포에서 BMP 신호전달을 유도한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 배양된 줄기 세포에서 BMP 신호전달을 유도한다. 일부 실시양태에서, TGF-β 신호전달의 억제는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재에 비해 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 존재 하에서 세포 내의 BMP 신호전달 경로, 예컨대, BMP-2, BMP-4, BMP-6 및 pSMAD1/5/8에서 하나 이상의 단백질의 활성 또는 발현의 증가를 지칭한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 성체 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 태아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 유도만능/전구 줄기 세포(iPSC)이다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 지방 줄기 세포(ASC)이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 탯줄 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 양막 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 윤부 세포, 예컨대, 윤부 니치 세포 또는 윤부 상피 전구세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 내피 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 단리된 줄기 세포는 골수 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 신경 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 내피 전구세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 골격근 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 유선 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 장 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 유도만능/전구 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 성체 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포로부터 유래된 유도만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 섬유아세포로부터 유래된 유도만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 인간 각막 섬유아세포로부터 유래된 유도만능 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 태아 조직, 예컨대, 태반 조직 또는 탯줄 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 양막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 지방 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 윤부 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 골수로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 내피 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 윤부 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 신경 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 윤부 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 골격근으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 피부로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 소화 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 췌장으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 간으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 후각 점막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 생식 세포 집단으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 혈액으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 상에서 배양된 단리된 줄기 세포는 탯줄 혈액으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체는 양막 또는 탯줄로부터 단리된 nHC-HA/PTX3이다. 일부 실시양태에서, HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA 복합체이다. 일부 실시양태에서, HA는 HC에 공유연결된다. 일부 실시양태에서, IαI의 HC는 중쇄 1(HC1)이다. 일부 실시양태에서, HC-HA 복합체는 펜트락신 3(PTX3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III SLRP를 포함한다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 PTX3 및 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 I SLRP들, 예컨대, 데코린 및 비글리칸으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 II SLRP들, 예컨대, 피브로모듈린, 루미칸, PRELP(프롤린 아르기닌 풍부 말단 류신 풍부 단백질), 케라토칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 클래스 III SLRP들, 예컨대, 에피파이칸 및 오스테오글리신으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 단리된 줄기 세포는 고정화된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3을 포함하는 기재 상에서 증폭된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 하나 이상의 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, SLRP는 비쿠닌, 데코린, 비글리칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 단백질은 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 케라탄 설페이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 줄기 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 배양 배지에서 증폭된다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3은 하나 이상의 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, SLRP는 비쿠닌, 데코린, 비글리칸 및 오스테오어드헤린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 단백질은 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸은 케라탄 설페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 배아 줄기 세포 배지, 변경된 배아 줄기 세포 배지, 보충된 호르몬 상피 배지 및/또는 이들의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 배지는 하나 이상의 성장인자로 보충된다. 일부 실시양태에서, 배지는 EGF, bFGF 및/또는 LIF로 보충된다. 일부 실시양태에서, 배지는 Rho 관련 키나제의 억제제(ROCK 억제제)로 보충된다.
전분화능의 유도 및 유지
특정 실시양태에서, 세포에서 전분화능을 유도하거나 HC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 줄기 세포의 전분화능을 유지하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, HC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포 마커 발현의 유지를 보조하고 줄기 세포 집단의 연속 계대배양에 걸쳐 세포의 분화를 방지한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, HC-HA/PTX3 복합체는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포 집단에서 줄기 세포 성질의 유도를 촉진한다.
특정 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능을 촉진하거나 유도한다. 특정 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 배양된 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포에 비해 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능을 촉진하거나 유도한다. 예시적인 방법에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양됨으로써, 전분화능이 상기 세포에서 유도된다.
특정 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 줄기 세포의 전분화능을 더 촉진하거나 유도한다. 특정 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 배양된 줄기 세포에 비해 줄기 세포의 전분화능을 더 촉진하거나 유도한다. 예시적인 방법에서, 줄기 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양됨으로써, 전분화능이 상기 줄기 세포에서 유지된다. 예시적인 방법에서, 줄기 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양됨으로써, 전분화능이 상기 줄기 세포에서 더 유도된다.
단백질 전사 인자를 사용한 유전적 재프로그래밍을 이용함으로써 배아 줄기 세포와 동등한 전분화능 줄기 세포를 성인 피부 조직으로부터 유도하였다. iPSC 세포는 전형적으로 특정 줄기 세포 관련 유전자를 비-전분화능 세포, 예컨대, 성체 섬유아세포 내로 형질감염시킴으로써 유도된다. 형질감염은 전형적으로 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스를 통해 달성되고, 이때 전분화능 유전자는 유전자 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 전분화능 줄기 세포의 생성에 필수적인 4종의 핵심 전분화능 유전자들은 Oct-3/4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및 Klf4이다. 다른 유전자는 유도 효율을 향상시킬 수 있다. 일부 연구에서, Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28이 전분화능을 유도하는 데에 사용되어 왔다. 일부 경우, 3주 내지 4주 후, 소수의 형질감염된 세포가 전분화능 줄기 세포와 형태적으로 및 생화학적으로 유사하게 되기 시작하고, 전형적으로 형태적 선별, 배가 시간, 또는 레포터 유전자 및 항생제 선별을 통해 단리된다.
일부 실시양태에서, 4종의 필수 전사 인자 Oct-3/4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및 Klf4보다 더 적은 수의 필수 전사 인자의 이종 발현을 이용하여 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포에서 전분화능을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 Oct-3/4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및/또는 Klf4 중 1종 이상을 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 Oct-3/4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및/또는 Klf4로부터 선택된 1종, 2종 또는 3종의 인자를 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 Oct-3/4(Pou5f1)를 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 Sox2를 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 c-Myc를 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 전분화능을 유도하는 방법이 제공되고, 이때 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 사용은 이종 유전자 전달에 의해 Klf4를 발현하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 전분화능의 유도를 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4 중 1종 이상을 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4 중 1종 이상을 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4 중 1종, 2종 또는 3종의 인자를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1)를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 SOX2를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 c-Myc를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Klf4를 발현하도록 형질도입되고; 형질도입된 세포는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 기재 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1종 이상의 추가 유전자, 예를 들면, Nanog, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1 및 β-카테닌을 발현하도록 형질도입된다.
일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4 중 1종 이상을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 함유하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포는 Oct-3/4(Pou5f1), SOX2, c-Myc 및 Klf4 중 1종 이상을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 함유하는 2개 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된다.
줄기 세포 마커의 평가 및 상이한 세포 계통의 유도를 포함하는, 유도만능 줄기 세포를 유도하고 배양하고 유지하고 유도된 줄기 세포의 전분화능을 평가하는 다양한 방법들이 당분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제7,682,828호, 제8,048,999호, 제8,211,697호 및 제7,951,592호, 및 미국 특허출원 공보 제2009/0191159호 및 제2010/000375호에 기재된 방법들을 포함한다.
일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 배양된 형질도입된 세포에 비해 형질도입된 세포에서 전분화능의 유도 시간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체의 부재 하에서 배양된 형질도입된 세포에 비해 형질도입된 세포 집단에서 전분화능 세포로 유도된 형질도입된 세포의 백분율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 형질도입된 세포에서 전분화능의 수준을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 형질도입된 세포에서 전분화능의 유도를 위해 요구되는 이종 전사 인자의 수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 TGF-β1 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 SMAD2 또는 SMAD3의 핵 전위를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 알파 평활근 액틴 형성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 BMP4 신호전달을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 BMP6 신호전달을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 배아 세포 마커의 발현을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 nHC-HA/PTX3 또는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 분화된 세포, 줄기 세포 또는 iPSC에서 c-myc, KLF-4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, Sox-2 및 SSEA-4의 발현을 유도한다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시 목적을 위해 포함되고, 특허청구된 보호대상의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1. 인간 양막 추출물(AME)로부터 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체의 정제
양막 추출물(AME) 및 AM 분말(AMP)의 제조
바이오-티슈(Bio-tissue)(미국 플로리다주 마이애미 소재)로부터 입수된 동결된 인간 AM을 PBS로 2회 또는 3회 세척하여 저장 배지를 제거하였다. AME를 제조하기 위해, AM을 멸균 50 ㎖ 원심분리 튜브로 옮기고 5000xg에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 여분의 유체를 제거하였다. AM의 중량을 측정하고(약 10 mg/cm2) AM을 100 mm 또는 150 mm 멸균 페트리 접시로 옮기고 20분 동안 액체 질소 용기의 공기층에서 동결시킨 후, 일회용 작은 칼을 이용하여 작은 조각으로 슬라이싱하고 PBS에서 티슈-테어로르(Tissue-Tearor)(바이오스펙 프로덕츠 인코포레이티드(Biospec Products, Inc.), 미국 오클라호마주 바틀스빌 소재)로 균질화하였다. 균질화물을 30분 동안 4℃에서 혼합하고 30분 동안 48,000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 AME로서 명명하고 nHC-HA/PTX3 정제를 위해 사용하거나 -80℃에서 저장하였다.
동결건조된 AM 분말(AMP)을 제조하기 위해, -80℃ 냉동고에서 동결된 AM을 벤치 탑 동결건조기(프리존(Freezone) 4.5, 랩코노(Labconco), 미국 미조리주 칸사스 시티 소재)로 옮겨고 16시간 동안 상기 동결건조기에서 동결건조하였다. 그 다음, 동결건조된 AM을 믹서 밀(Mixer Mill)(레취(Retsch), 미국 펜실베니아주 뉴톤 소재)로 그의 매트릭스 형태(AMP)로 미분화하였다. 추가 분석을 위해 AMP를 -20℃ 미만의 온도에서 저장하였다.
천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체의 정제
AME를 1.35 g/㎖의 초기 밀도로 CsCl/4 M 구아니딘 HCl 혼합물에 용해시키고 15℃에서 48시간 동안 125,000xg에서 원심분리하였다. 총 15개의 분획들(0.8 ㎖/분획)을 각각의 튜브의 상부부터 하부까지 수집하였다. 각각의 분획에 대한 총 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트로 측정하였다. 각각의 분획에 대한 하이알루로난(HA) 농도를 코제닉스(Corgenix)(미국 콜로라도주 웨스트민스터 소재)의 ELISA-기초 HA 정량 시험 키트로 측정하였다(도 1A). HA를 함유하되 검출가능한 단백질을 함유하지 않는 분획 #8-15를 풀링하여 제2 초원심분리에 사용하였다. 풀링된 분획의 샘플(제1 AM으로서 명명됨)을 분석을 위해 남겨두었다. 풀링된 분획을 1.40 g/㎖의 초기 밀도에서 CsCl/4 M 구아니딘 HCl로 조절하고 원심분리하고 전술된 바와 동일한 방식으로 분획화하였다(도 1B). HA를 함유하되 검출가능한 단백질을 함유하지 않는 분획 #3-15를 풀링하고(제2 AM으로서 명명됨) 증류수에 대해 투석하여 CsCl 및 구아니딘 HCl을 제거하였다. 투석물을 전술된 AMP에 대한 방식과 동일한 방식으로 동결건조하였다. 대안적으로, 투석물을 1시간 동안 0℃에서 1.3%(중량/부피) 아세트산칼륨을 함유하는 3 부피의 95%(부피/부피) 에탄올과 혼합하였다. 15,000xg에서 원심분리한 후, 펠렛을 70%(부피/부피) 에탄올로 세척하고 다시 원심분리하였다. 펠렛을 공기로 짧게 건조하고 -80℃에서 저장하였다. 분말 및 펠렛을 nHC-HA/PTX3 복합체로서 명명하였다.
일부 경우, 풀링된 샘플을 3회 또는 4회 초원심분리하였다. 이들 초원심분리에서, 분획 #7-12만을 풀링하였고, CsCl/4 M 구아니딘 HCl의 초기 밀도는 1.42 g/㎖이다. 제3 또는 제4 초원심분리 후, 풀링된 분획 #7-12를 nHC-HA/PTX3(제3) 또는 nHC-HA/PTX3(제4)로서 명명한다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 초원심분리 후 AME 풀링된 분획을 1시간 동안 25℃에서 0.05 N NaOH로 처리하였거나 처리하지 않았다. 또한, 제1, 제2, 제3 또는 제4 초원심분리로부터 풀링된 분획을 2시간 동안 60℃에서 20 유닛/㎖의 하이알루로니다제(HAase)(세이카가쿠 바이오비즈니스 코포레이션(Seikagaku Biobusiness Corporation), 일본 도쿄 소재)로 분해하였다.
그 다음, 풀링된 분획으로부터의 샘플, 및 NaOH 및 HAase 처리된 샘플을 0.5% 아가로스 겔 상에서 런닝시키고 스테인스-올 염료를 사용한 염색(도 1C), 또는 IαI 중쇄 1(HC1)(도 1D 및 1F), 펜트락신 3(PTX3)(도 1E 및 1G), IαI 중쇄 2(HC2)(도 1H), IαI 중쇄 3(HC)(도 1I), 비쿠닌(도 1J), TNF-자극된 유전자 6(TSG-6)(도 1K), 트롬보스폰딘-1(TSP-1)(도 1L) 또는 IGFBP 1-3 및 PF4(도 1M)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였는데, 이들 중 후자 2개(IGFBP 1-3 및 PF4)는 인간 혈관신생 어레이(각각의 어레이는 56개의 상이한 혈관신생 단백질들을 함유함, 알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하는 단백질 도트 분석에 의해 분석되었다. 요약하건대, 1.5 ㎖의 인간 AM 추출물(25 ㎍/㎖ HA) 및 정제된 nHC-HA/PTX3(제2)(25 ㎍/㎖ HA)을 4℃에서 하룻밤 동안 막 상에 미리 코팅된 검출 항체와 함께 별도로 항온처리한 후, 이차 항체와 함께 항온처리하였다. 신호를 x-선 필름에 노출된 화학발광 광으로 검출하였다. 필름을 투과 모드 스캐너 상에서 스캐닝함으로써 현상된 x-선 필름 상의 어레이 데이터를 정량하고, 어레이 이미지 파일을 이미지J1.46 소프트웨어(국립 보건원, 미국 메릴랜드주 베테스다 소재)로 분석하였다.
생화학적 특징규명은 nHC-HA/PTX3이 IαI의 중쇄 1(HC1) 및 PTX3에 공유연결된 고분자량 HA(HMW HA)로 구성되어 있다는 것을 보여주었다(도 1C). nHC-HA/PTX3에서 HC1 및 PTX3 둘다가 하이알루로니다제(HAase) 또는 NaOH의 처리 후에만 방출되는데(도 1D 내지 1G), 이것은 HC1이 보고된 바와 같이 에스테르 결합에 의해 HA에 연결되어 있다는 것을 입증한다.
대조적으로, nHC-HA/PTX3은 HC2(도 1H), HC3(도 1I, NaOH 처리 후에만 검출된 약 12 kDa에서의 밴드는 비특이적일 가능성이 있음), 비쿠닌(도 1J), TSG-6(도 1K) 및 TSP-1(도 1L)을 함유하지 않는다. 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-1-3(IGFBP1-3) 및 혈소판 인자 4(PF4)는 nHC-HA/PTX3(제2)에서 단백질 도트 분석(ELISA와 유사함)에 의해 검출되고(도 1J); 이들이 nHC-HA/PTX3(제4)에 여전히 존재하는지는 불명확한 상태로 남아있다.
실시예 2. 공유연결에 의한 고정화된 HA(iHA)의 제조
HMW HA(힐론, 어드밴스드 메디칼 옵틱스, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재) 또는 nHC-HA/PTX3(제2)로부터의 일련의 하이알루로난(HA) 양(0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10 및 25 ㎍/웰)을, 설포-NHS(0.184 mg/㎖) 및 EDAC(0.123 mg/㎖)(둘다가 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수됨)를 함유하는 커플링 용액에 첨가하고 4℃에서 16시간 동안 코바링크™-NH 96웰 플레이트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에서 항온처리하였다. 8 M 구아니딘-HCl(GnHCl)로 3회 세척한 후 PBS로 세척한 다음, HMW HA 또는 nHC-HA/PTX3으로부터의 커플링된 HA를 제조자의 프로토콜에 따라 코제닉스(미국 콜로라도주 웨스트민스터 소재)의 HA ELISA로 정량적으로 측정하였다(도 6A). AM으로부터 정제된 HMW HA 및 nHC-HA/PTX3을 용량 의존적으로 및 공유적으로 코바링크-NH 96웰의 표면에 커플링시켰다. 발생된 iHA 또는 고정화된 nHC-HA/PTX3은 8 M 구아니딘 HCl에 의한 세척에 대한 저항성을 나타낸다. HMW HA 또는 nHC-HA/PTX3의 HA를 2 ㎍/웰 HA 당량 투입물 수준에서 최대로 커플링시켰다(도 6A).
커플링 효율을 측정하기 위해, HMW HA 또는 nHC-HA/PTX3으로부터의 HA를 96웰 플레이트의 웰 당 코바링크™-NH에 커플링시키고, HMW HA 또는 nHC-HA/PTX3으로부터의 비결합된 HA 및 결합된 HA를 HA ELISA로 측정하였다(도 6B). HMW HA 또는 nHC-HA/PTX3으로부터의 2 ㎍ HA를, H2O 중에 설포-NHS(0.184 mg/㎖) 및 EDAC(0.123 mg/㎖)[1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드]를 함유하는 커플링 용액에 첨가하고, 4℃에서 16시간 동안 코바링크™-NH 96웰 플레이트(써모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재)에서 항온처리하였다. 웰에 커플링된 HA 및 (풀링된) 세척된 용액 중의 비결합된 HA 둘다를 제조자의 프로토콜에 따라 코제닉스(미국 콜로라도주 웨스트민스터 소재)의 HA ELISA로 측정하였다. 각각의 웰에서 커플링된 또는 비결합된 HA의 총량을 투입물 HA 양(2 ㎍/웰)으로 나누어 커플링 효율 또는 비결합 백분율을 계산하였다. 평균 커플링 효율은 HMW HA의 경우 70.5 ± 13.4%이고 nHC-HA/PTX3의 경우 69.0 ± 5.7%인 것으로 측정되었다(도 6B). 따라서, 2 ㎍/웰 투입물 HA는 대략 1.4 ㎍ iHA를 발생시킨다.
실시예 3. 정제된 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3) 복합체의 활성
LPS-자극된 대식세포의 고정화된 nHC-HA/PTX3로의 부착
DMEM/10% FBS(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 중의 RAW264.7 세포(100 ㎕의 2.5 x 105개 세포/㎖)[어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 미국 버지니아주 마나사스 소재]를, 고정화된 HA(어드밴스드 메디칼 옵틱스, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재, 2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군을 함유하는 96웰 플레이트에 시딩하고 지질다당류(LPS)(1 ㎍/㎖)(n=3)[LPS-EB 울트라퓨어(Ultrapure), 인비보겐(InvivoGen), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]로 자극하였다. 코바링크-NH 96웰의 표면 상에의 HA 및 nHC-HA/PTX3의 고정화를 전술된 바와 유사하게 수행하였다. 요약하건대, 코바링크-NH 96웰 플레이트를 2시간 동안 70% 알코올로 멸균하고, 증류수로 3회 세척하고, 96웰 플레이트 당 20 ㎍/㎖ HA 또는 nHC-HA/PTX3을 함유하는 증류수 중의 100 ㎕의 0.184 mg/㎖ 설포-NHS(써모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재) 및 0.123 mg/㎖ EDAC(써모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 첨가하였다(PBS 대조군 웰은 HA 및 nHC-HA/PTX3을 제외한 모든 시약들을 함유한다). 플레이트를 하룻밤 동안 4℃에서 또는 2시간 동안 25℃에서 항온처리한 후, 커플링 용액을 제거하고, 2 M NaCl 및 50 mM MgSO4를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, PBS로 3회 세척하였다. 90분 동안 항온처리한 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 부착된 세포를 사진촬영하고 사이퀀트 분석으로 카운팅하였다(도 2A). LPS-자극된 대식세포의 부착에 있어서 3배 초과의 증가가 대조군 웰에 비해 고정화된 nHC-HA/PTX3을 함유하는 웰에서 관찰되었다. 고정화된 HA를 함유하는 웰은 LPS-자극된 대식세포의 부착을 억제하였다.
그 다음, 부착된 LPS-자극된 대식세포의 세포 생존력을 조사하였다. LPS-자극된 RAW264.7 세포(100 ㎕의 2.5 x 105개 세포/㎖)를 전술된 바와 같이 고정화된 PBS 대조군, HA 또는 nHC-HA/PTX3 상에서 DMEM/10% FBS에서 24시간 동안 항온처리하였다(n=3). 항온처리 후, 부착된 대식세포의 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다. 이들 고정화된 기재 상의 세포들 사이에 세포 생존력의 유의한 차이(모든 p 값 > 0.05)가 관찰되지 않았다(도 2B).
그 다음, LPS-자극된 대식세포와 고정화된 nHC-HA/PTX3의 부착을 억제하는 차단 항체 및 펩티드의 능력을 조사하였다. 30분 동안 얼음 상의 DMEM/10% FBS에서 동종형 대조군 항체[래트 IgG(10 ㎍/㎖), 마우스 IgG(10 ㎍/㎖) 또는 아르메니아 햄스터 IgG(20 ㎍/㎖)] 또는 RGD 대조군 펩티드(1 mg/㎖)와 함께 CD44(10 ㎍/㎖), TLR2(10 ㎍/㎖), TLR4(10 ㎍/㎖), 인테그린 αv(20 ㎍/㎖), β1(20 ㎍/㎖), β2(20 ㎍/㎖) 또는 β3(20 ㎍/㎖)에 대한 차단 항체, 또는 RGD 펩티드(SDGRG, RGDS 및 GRGDS, 모두 1 mg/㎖)로 RAW264.7 세포(2.5 x 105개 세포/㎖의 농도)를 미리 항온처리하였다(n=3). (CD44 및 래트 IgG에 대한 항체들은 비디 파밍겐(BD Pharmingen)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로부터 입수하였고; TLR2, TLR4 및 마우스 IgG에 대한 항체들은 인비보겐(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로부터 입수하였고; 인테그린 αv, β1, β2 및 β3에 대한 항체, 및 아르메니아 햄스터 IgG는 바이오레전드(BioLegend)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수하였고; RGD 펩티드는 시그마-알드리치(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다). LPS(1 ㎍/㎖)의 첨가 후, 세포를 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군을 함유하는 플레이트 내에 시딩하고 90분 동안 항온처리하였다(n=3). 항온처리 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포를 사진촬영하고 사이퀀트 분석으로 카운팅하였다(도 2C). 결과는 CD44 및 TLR4에 대한 항체들이 LPS-자극된 대식세포의 부착을 유의하게 억제하였다는 것을 보여주었는데, 이것은 이들 수용체들이 LPS-자극된 대식세포와 고정화된 nHC-HA/PTX3의 부착에 관여한다는 것을 입증한다.
LPS-자극된 대식세포의 분극화
RNA 및 단백질 분석으로 M1 및 M2 마커들을 코딩하는 유전자들의 발현을 측정함으로써 고정화된 nHC-HA/PTX3에 의한 M1 또는 M2 표현형을 향한 LPS-자극된 대식세포의 분극화를 조사하였다.
DMEM/10% FBS 중의 RAW264.7 세포(100 ㎕의 2.5 x 105개 세포/㎖)를, 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군을 함유하는 96웰 플레이트 내에 시딩하고 4시간 동안 LPS(1 ㎍/㎖)로 자극하였다(n=3). 항온처리 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 부착된 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. M1 마커(종양 괴사 인자 알파(TNF-α)(Mm00443258_m1) 및 인터류킨 12 서브유닛 p40(IL-12p40)(Mm00434165_m1)) 및 M2 마커(인터류킨-10(IL-10)(Mm00439614_m1), 아르기나제-1(Arg-1)(Mm00475988_m1), LIGHT/TNSF14(Mm00444567_m1) 및 스핑고신 키나제-1(SPHK1)(Mm0044884_g1))의 mRNA 발현을, 내생성 대조군으로서 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)(Mm99999915_g1)를 사용하는 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 상기 실시간 PCR을 7300 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 상에서 수행하였다. 증폭 프로그램은 95℃에서의 10분 초기 활성화에 이어서, 95℃에서의 15초 변성 및 60℃에서의 1분 어닐링 및 연장으로 구성된 40 주기로 구성되었다. 상대적인 유전자 발현 데이터를 비교 CT 방법(ΔΔCT)으로 분석하였다. 모든 분석들을 3회 반복하여 수행하였고; 결과를 내부 대조군으로서 사용된 GAPDH로 표준화하였다. 모든 프라이머들은 어플라이드 바이오시스템스로부터 입수되었다. 대조군에 비해 M2 마커 IL-10, Arg-1, LIGHT 및 SPHK1의 상당한 발현 유도가 고정화된 nHC-HA/PTX3에 부착된 세포에서 관찰되었으나 HA에 부착된 세포에서는 관찰되지 않았다(도 3A). 추가로, 두 M1 마커들, 즉 TNF-α 및 IL-12p40의 발현이 감소되었다.
전술된 바와 같이 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군을 함유하는 플레이트 상에서 4시간 동안 DMEM/10% FBS에서 LPS(1 ㎍/㎖) 자극으로 처리된 세포의 배양 상청액에서 분비된 TNF-α 단백질의 양을 측정하였다(n=3). TNF-α의 양을 제조자의 프로토콜(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 따라 ELISA로 측정하였다.
PBS 대조군에 비해 고정화된 nHC-HA/PTX3을 함유하는 플레이트 상에서 배양된 세포의 세포 배양 상청액에서 감소된 양의 TNF-α가 관찰되었다(도 3B). 고정화된 HA 플레이트 상에서는 TNF-α 양의 변화가 관찰되지 않았다.
IRF-5의 높은 발현은 M1 대식세포의 특징이다. IRF-5는 IL-12p40, IL-12p35 및 IL-23p19를 코딩하는 유전자들의 전사를 직접적으로 활성화시키고 IL-10을 코딩하는 유전자를 억제한다. IRF-5 단백질의 발현 및 고정화된 nHC-HA/PTX3 상에서의 그의 세포편재화를 조사하였다. 고정화된 대조군 또는 nHC-HA/PTX3 상에 시딩된 세포를 DMEM/10% FBS에서 4시간 또는 24시간 동안 LPS(1 ㎍/㎖)로 자극하였다. 세포 용해물에서의 IRF-5 단백질의 발현(24시간 동안 LPS 자극)을 웨스턴 블롯(도 3C, 좌측)(일차 항체: 애브캄, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재; 이차 항체, 다코(DAKO), 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재)으로 검출하였다. 병행된 실험에서, 세포(4시간 동안 LPS 자극)를 고정시키고 항-IRF-5 항체로 면역염색하였다. IRF-5의 세포편재화를 공초점 면역형광 현미경관찰(LSM 700 공초점 현미경, 제이스(Zeiss), 독일 오버코첸 소재)로 조사하였다(도 3C, 우측). 고정화된 nHC-HA/PTX3은 IRF-5의 발현을 감소시키고 IRF-5의 핵 편재화를 방해하였다. 이들 결과들은 고정화된 nHC-HA/PTX3에 의한 M1 표현형의 억제와 일치한다.
활성화된 호중구의 아폽토시스 및 아폽토시스성 호중구의 대식세포 식세포작용
제조자의 설명서에 따라 덱스트란 밀도(림프구 폴리(R), 세달란 유에스에이(Cedarlane USA), 미국 노쓰캐롤라이나주 버링톤 소재) 원심분리를 이용하여 정상 인간 말초 혈액으로부터 호중구를 단리하였다. 단리된 호중구를 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군 상에서 IMDM(이스코브 변경된 둘베코 배지, 라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 내에 2 x 106개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고, 24시간 동안 PBS(휴지기), N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)(1 μM)(시그마-알드리치, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) 또는 LPS(1 ㎍/㎖)로 처리하였다(n=3). 호중구의 아폽토시스를 제조자의 프로토콜에 따라 세포 용해물에서 세포 사멸 검출 ELISA(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로 측정하였다. 고정화된 nHC-HA/PTX3은 휴지기 호중구를 제외한 fMLP-활성화된 또는 LPS-활성화된 호중구의 아폽토시스를 촉진하나 HA는 이러한 아폽토시스를 촉진하지 않는다(도 3D).
그 다음, 휴지기 또는 LPS-자극된 대식세포에 의한 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 조사하였다. LPS(1 ㎍/㎖) 자극을 이용하거나 이용하지 않으면서 6일 동안 RAW264.7 세포(1 x 105개 세포/㎖)를 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군 상에서 DMEM/10% FBS에서 배양하였다(n=3). 그 다음, 세포 배양 배지를 제거하고, (단리된 휴지기 인간 호중구를 로스코비틴(20 μM)(시그마-알드리치, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재)으로 8시간 동안 처리함으로써 제조된) IMDM 중의 100 ㎕의 2 x 106개 세포/㎖ 아폽토시스성 호중구를, 휴지기 또는 LPS-자극된 대식세포를 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후, 각각의 웰을 냉각된 PBS로 3회 세척하고, 세포 용해물(대식세포 및 식세포작용에 의해 삼켜진 호중구를 포함함)을 모아 ELISA 분석으로 인간 미엘로퍼록시다제(MPO) 활성을 측정함으로써 대식세포의 식세포작용에 의해 삼켜진 호중구를 측정하였다. 세포 용해물을 모아 제조자의 프로토콜에 따라 인간 미엘로퍼록시다제(MPO) ELISA 분석(n=4)(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)으로 분석하였다. 그 다음, MPO를 각각의 세포 용해물에서 BCA 단백질 분석(써모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재)에 의해 측정된 총 단백질로 표준화하고 식균작용 지수로서 표현하였다. LPS로 자극되지 않은(-LPS) 휴지기 세포의 식세포작용 지수를 이 실험에서 100%로서 정의하였다. 고정화된 nHC-HA/PTX3은 휴지기 또는 LPS-처리된 대식세포에 의한 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 촉진하였으나, HA는 이러한 식세포작용을 촉진하지 않았다(도 3E).
이들 결과들은 고정화된 nHC-HA/PTX3(제2)이 활성화된 호중구의 아폽토시스 및 대식세포에 의한 아폽토시스성 호중구의 식세포작용을 향상시킨다는 것을 입증한다.
고정화된 nHC-HA/PTX3에 의한 M2 대식세포의 분극화에 관여하는 수용체의 분석
M2 대식세포 분극화에서 특정 수용체의 관련성을 확인하기 위해, 수용체 차단 항체의 존재 또는 부재 하에서 M1 및 M2 대식세포 마커의 정량 mRNA 발현을 수행하였다. 얼음 상에서 30분 동안 DMEM/10% FBS 중의 RAW264.7 세포(2.5 x 105개 세포/㎖)를 PBS(대조군), 또는 CD44(10 ㎍/㎖), TLR4(10 ㎍/㎖) 또는 CD44/TLR4(각각 10 ㎍/㎖)에 대한 차단 항체와 함께 미리 항온처리하였다(n=3). 그 다음, 세포를 LPS(1 ㎍/㎖)로 자극하고 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군 상에서 4시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 총 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. M1 마커(IL-12p40) 및 M2 마커(IL-10, LIGHT 및 SPHK1)의 상대적인 mRNA 발현을, 전술된 바와 같이 내생성 대조군으로서 GAPDH를 사용하는 정량 PCR로 측정하였다(도 4A). IL-12p40의 발현은 없어졌지만, IL-10, LIGHT 및 SPHK1의 발현은 고정화된 nHC-HA/PTX3에 의해 촉진되었으나, HA에 의해서는 촉진되지 않았다. 이 발현 패턴은 TLR4 차단 항체보다는 CD44 차단 항체에 의해 더 많이 억제되었다. 대조적으로, 고정화된 HA에 의한 IL-12p40 및 IL-10 전사체의 발현은 CD44에 대한 차단 항체보다는 TLR4에 대한 차단 항체에 의해 더 많이 영향받았다.
IL-12 및 IL-10의 단백질 발현도 측정하였다. 전술된 바와 같이 처리된 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군 상에서 (4시간 대신에) 24시간 동안 배양된 세포로부터 세포 배양 상청액을 모았다(n=3). 세포 배양 상청액 중의 IL-12 또는 IL-10 단백질의 양을 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 측정하였다(도 4B). IL-12 단백질의 발현은 없어지는 반면, IL-10 단백질의 발현은 고정화된 nHC-HA/PTX3에 의해 현저히 촉진된다. 이 발현 패턴은 CD44에 대한 차단 항체에 의해 억제된다. 대조적으로, IL-12 단백질의 발현은 고정화된 HA에 의해 촉진되는 반면, IL-10의 발현은 고정화된 HA에 의해 억제되고, 발현 패턴은 TLR4에 대한 차단 항체에 의해 더 많이 영향받았다.
nHC-HA/PTX3(제2) 복합체와 nHC-HA/PTX3(제4) 복합체의 비교
nHC-HA/PTX3(제2) 복합체 및 nHC-HA/PTX3(제4) 복합체 각각이 대식세포의 세포 응집을 유도하고/하거나(약한 세포 부착을 표시함) M2 대식세포 분극화를 촉진하는 능력을 조사함으로써 이들 복합체들을 비교하였다. RAW264.7 세포(2.5 x 105개 세포/㎖)를 고정화된 HA(2 ㎍/웰), nHC-HA/PTX3(2 ㎍/웰) 또는 PBS 대조군 상에서 DMEM/10% FBS에서 배양하고 200 유닛/㎖ IFN-γ/1 ㎍/㎖ LPS(둘다가 인비보겐(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로부터 입수됨)로 4시간 또는 24시간 동안 자극하였다(n=3). 4시간 후, 세포 응집을 광학 현미경관찰로 조사하고 사진촬영하였다(도 5A). 고정화된 nHC-HA/PTX3(제4)는 대식세포의 세포 응집을 촉진하나 nHC-HA/PTX3(제2)은 이러한 세포 응집을 촉진하지 않는데, 이것은 nHC-HA/PTX3(제4)이 플레이트에의 세포 부착을 촉진하지 않는 반면, nHC-HA/PTX3(제2)은 플레이트에의 세포 부착을 촉진한다는 것을 시사한다.
24시간 후, 샘플을 세포 배양 상청액으로부터 수득하고 IL-12p40 단백질 및 IL-23 단백질 농도를 제조자의 프로토콜에 따라 각각의 ELISA(바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 측정하였다(도 5B 및 5C). nHC-HA/PTX3(제2) 및 nHC-HA/PTX3(제4) 둘다가 IFN-γ/LPS-자극된 대식세포에서 IL-12p40 및 IL-23 단백질의 생성을 억제한다.
실시예 4: IαI의 부재 하에서 TSG-6 및 PTX3과 고정화된 HA(iHA)의 시험관내 결합
TSG-6과 iHA의 결합
고정화된 HA(2 ㎍/웰 투입물)를 전술된 바와 같이 제조하였다. 일련의 농도(0, 0.24, 1.2, 6, 12 및 24 ㎍/㎖, 웰 당 100 ㎕ 부피)의 인간 TSG-6(C-말단 10 His 태그와 함께 인간 TSG-6의 Trp18부터 Leu277까지 갖는 마우스 골수종 세포주 NS0에서의 과다발현, 등록 # P98066; 알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 카탈로그 번호 2104-TS)을 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 37℃에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 TSG-6을 8 M 구아니딘-HCl 및 PBS로 세척하여 제거하였다. 결합된 TSG-6을 변경된 TSG-6 ELISA(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로 측정하였다. TSG-6이 웰에서 커플링된 iHA에 이미 결합되었기 때문에, 샘플을 미리 코팅된 TSG-6 항체와 함께 항온처리하는 단계를 생략하였다. 후속 단계를 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다(도 7A). TSG-6은 iHA에 용량 의존적으로 결합하였고 iHA가 약 1.4 ㎍(약 70%의 커플링 효율을 기초로 웰 당 2 ㎍ HA)일 때 약 6 ㎍/㎖(또는 0.1 ㎖ 반응 용액 중의 0.6 ㎍)에서 그의 최대 결합 용량에 도달하였다. TSG-6이 35 kDa이고 HA가 약 3,000 kDa이라는 점에 기초할 때, TSG-6 대 HA의 몰비는 약 37:1이었다.
그 후, TSG-6/iHA 복합체가 해리에 저항하는 능력을 조사하였다. iHA(2 ㎍/웰 투입물)를 전술된 바와 같이 제조하였다. TSG-6(100 ㎕ 중의 6 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 TSG-6을 PBS(대조군) 또는 하기 상이한 해리제 또는 환원제로 세척하여 제거하였다: 6 M 구아니딘 HCl/PBS, 8 M 구아니딘 HCl/PBS, 2% SDS/PBS, 100 mM DTT/PBS 및 25 mM NaOH/H2O. 결합된 TSG-6을 전술된 바와 같이 변경된 TSG-6 ELISA로 측정하였다(도 7B). 형성된 TSG-6/iHA 복합체는 안정하였고 다양한 해리제 및/또는 환원제를 사용한 처리에 대한 저항성을 나타내었다. 모든 군들 사이에 통계적 유의성은 인지되지 않았다.
PTX3과 iHA의 결합
고정화된 HA(2 ㎍/웰 투입물)를 전술된 바와 같이 제조하였다. 일련의 농도(0, 0.04, 0.2, 1, 5 및 25 ㎍/㎖, 웰 당 100 ㎕ 부피)의 PTX3(C-말단 6 His 태그와 함께 인간 PTX3의 Glu18부터 Ser277까지 갖는 마우스 골수종 세포주 NS0에서의 과다발현, 등록 # P26022; 알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 37℃에서 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 PTX3을 8 M GnHCl 및 PBS로 세척하여 제거하였다. 결합된 PTX3을 변경된 PTX3 ELISA(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로 측정하였다. PTX3이 웰에서 커플링된 iHA에 이미 결합되었기 때문에, 샘플을 미리 코팅된 PTX3 항체와 함께 항온처리하는 단계를 생략하였다. 후속 단계를 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다(도 8A). PTX3은 iHA에 용량 의존적으로 결합하였고 iHA가 약 1.4 ㎍(70%의 커플링 효율을 기초로 웰 당 2 ㎍ HA)일 때 약 5 ㎍/㎖(또는 0.1 ㎖ 반응 용액 중의 0.5 ㎍)에서 최대 결합 용량에 도달하였다. PTX3이 45 kDa이고 HA가 약 3,000 kDa이라는 점에 기초할 때, PTX3 대 HA의 몰비는 약 24:1이었다.
그 후, PTX3/iHA 복합체가 해리에 저항하는 능력을 조사하였다. iHA(2 ㎍/웰 투입물)를 전술된 바와 같이 제조하였다. PTX3(100 ㎕ 중의 5 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 PTX3을 PBS(대조군) 또는 하기 상이한 해리제 또는 환원제로 세척하여 제거하였다: 6 M 구아니딘 HCl/PBS, 8 M 구아니딘 HCl/PBS, 2% SDS/PBS, 100 mM DTT/PBS 및 25 mM NaOH/H2O. 결합된 PTX3을 전술된 바와 같이 변경된 PTX3 ELISA로 측정하였다(도 8B). 형성된 PTX3/iHA 복합체는 안정하였고 다양한 해리제 및/또는 환원제를 사용한 처리에 대한 저항성을 나타내었다. 모든 군들 사이에 통계적 유의성은 인지되지 않았다.
TSG-6 및 PTX3과 iHA의 동시적인 결합
iHA(2 ㎍/웰 투입물)를 전술된 바와 같이 제조하였다. 6 ㎍/㎖의 TSG-6 및 5 ㎍/㎖의 PTX3(전술된 바와 같은 최대 결합을 위한 농도)을 단독으로 또는 조합된 상태로 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 iHA와 함께 항온처리하였다. 결합된 TSG-6 또는 PTX3을 전술된 바와 같이 각각의 변경된 ELISA로 측정하였다. TSG-6 또는 PTX3이 단독으로 첨가되었을 때에 비해 두 단백질들이 동시적으로 iHA와 함께 항온처리되었을 때 TSG-6 또는 PTX3과 iHA의 결합에 대한 경쟁 또는 상승작용은 없었다(p > 0.05). 이들 데이터는 TSG-6 및 PTX3에 대한 iHA 상의 결합 부위가 상이하고 중첩되지 않는다는 것을 시사하였다(도 9).
TSG-6 및 PTX3과 iHA의 순차적인 결합
미리 결합된 TSG-6 또는 PTX3이 다른 단백질과 iHA의 결합을 억제할 것인지를 확인하기 위해 iHA에의 TSG-6 및 PTX3의 순차적인 첨가를 조사하였다. 6 ㎍/㎖의 TSG-6 또는 5 ㎍/㎖의 PTX3을 전술된 바와 같이 제조된 iHA에 미리 결합시켰다. 8 M GnHCl 및 PBS를 사용한 세척 후, 일련의 농도의 PTX3(0, 5 또는 5 ㎍/㎖) 또는 TSG-6(0, 1.2 또는 6 ㎍/㎖)을 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 각각 미리 결합된 TSG-6/iHA 또는 미리 결합된 PTX3/iHA와 함께 후속적으로 항온처리하였다. 후속적으로 결합된 TSG-6 및 PTX3을 각각의 변경된 ELISA로 측정하였다.
미리 결합된 TSG-6(6 ㎍/㎖)은 후속 PTX3이 iHA에 결합하는 것을 부분적으로 방해하였다(도 10A)(후속 PTX3이 1 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖로 첨가되었을 때 각각 p = 0.05 및 0.01)(도 5A). 미리 결합된 PTX3(5 ㎍/㎖)은 후속 TSG-6과 iHA의 결합을 방해하지 않았다(후속 TSG-6이 1.2 ㎍/㎖ 및 6 ㎍/㎖로 첨가되었을 때 각각 p = 0.56 및 0.74)(도 10B). 이들 데이터는 iHA가 후속 PTX3 결합을 방해하도록 TSG-6 결합 후 구조적으로 변경된다는 것을 시사한다.
실시예 5: LPS-자극된 대식세포와 고정화된 TSG-6/iHA 및 PTX3/iHA 복합체의 부착
코바링크-NH 95웰을 전술된 바와 같이 PBS(대조군), HA(iHA) 또는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)과 공유커플링시켰다. 그 다음, TSG-6(6 ㎍/㎖) 또는 PTX3(5 ㎍/㎖)을 첨가하여 iHA에 결합시켰다. DMEM/10% FBS 중의 RAW264.7 대식세포(100 ㎕의 1 x 105개 세포/㎖)를 각각의 커플링된 웰 내로 시딩하고 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 24시간 동안 항온처리한 후, 세포 형태를 사진촬영하였다.
대식세포는 플라스틱 대조군에 비해 iHA에 약하게 부착하였다(즉, 보다 많은 응집된 세포를 발생시킨다). 이러한 부착은 TSG-6/iHA에 의해 더 방해되어, 높은 수의 보다 큰 세포 응집을 발생시켰다. 대조적으로, PTX3/iHA는 세포 부착을 촉진하여 고정화된 nHC-HA/PTX3 상에서 나타난 패턴과 유사한 패턴을 발생시켰다(도 11).
실시예 6: TSG-6/iHA 및 PTX3/iHA 복합체에 의한 M1 및 M2 마커의 조절
RAW264.7 세포를 실시예 5에서와 같이 배양하고 PBS(대조군), 고정화된 HA(iHA), TSG-6/iHA, PTX3/iHA 또는 nHC-HA/PTX3 상에서 4시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 총 RNA를 세포로부터 단리하고 M2 마커 IL-10 및 M1 마커 IL-12p40의 mRNA 발현을 전술된 바와 같이 정량 PCR로 측정하였다(도 12A 및 12D). 대안적으로, 세포를 24시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS(도 12B 및 12E) 또는 IFN-γ/LPS(도 12C)로 자극하고, IL-10, IL-12p70 및 IL-23의 단백질 발현을 각각의 ELISA를 이용하여 세포 배양 배지에서 측정하였다.
IL-12p40 mRNA(IL-12p70의 2개 서브유닛들 중 하나)의 발현은 대조군(Ctrl)에 비해 iHA(부재) 상에서 유의하게 변화하지 않았다(p > 0.05)(도 12A). 대조적으로, IL-12p40 mRNA는 TSG-6/iHA 상에서 유의하게 상향조절되었으나(p < 0.01), PTX3/iHA 및 nHC-HA/PTX3 상에서는 유의하게 하향조절되었다(p < 0.05)(도 12A). 그러나, IL-12p70 단백질의 발현만이 대조군 또는 iHA 단독 상에서 임의의 유의한 차이 없이(p > 0.05) 검출될 수 있었으나, TSG-6/iHA, PTX3/iHA 및 nHC-HA/PTX3 상에서는 검출될 수 없었다(도 12B). IL-12p40은 IL-23의 서브유닛으로서도 작용한다. IL-23 단백질의 발현이 TSG-6/iHA 및 PTX3/iHA 상에서 유의하게 상향조절되었으나(p < 0.01) nHC-HA/PTX3 상에서는 검출될 수 없었다는(p < 0.05) 것이 관찰되었다(도 12C). 이들 데이터는 TSG-6/iHA 및 PTX3/iHA 둘다가 IL-12를 억제하는 데에 있어서 효과적이었지만 IL-23을 억제하는 데에 있어서는 효과적이지 않았다는 것을 시사한다.
RAW264.7 세포에 의한 IL-10 mRNA의 발현은 대조군에 비해 iHA 단독 상에서 유의하게 변화하지 않았으나(p >0.05), TSG-6/iHA, PTX3/iHA 및 nHC-HA/PTX3 상에서는 유의하게 상향조절되었다(p < 0.05)(도 12D). 그러나, IL-10 단백질의 발현만이 고정화된 nHC-HA/PTX3의 양성 대조군과 유사하게 PTX3/iHA 상에서 유의하게 상향조절된다(p < 0.05)(도 12E). 이들 데이터는 상이한 패턴의 세포 부착(실시예 5) 후 부착된 세포가 상이한 기능을 나타내고 PTX3/iHA가 IL-10의 상향조절에 있어서 TSG-6/iHA보다 더 효과적이라는 것을 암시한다.
실시예 7: IαI로부터 고정화된 HA로의 HC1 및 HC2의 시험관내 전달
코바링크-NH 96웰을 전술된 바와 같이 PBS(대조군), HA(iHA) 또는 천연 HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)과 공유커플링시켰다. 일련의 농도(100 ㎕ 중의 0, 0.24, 1.2, 6 또는 12 ㎍/㎖)의 TSG-6을 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 iHA와 함께 개별적으로 항온처리하였다. 인간 IαI(5 ㎍/㎖)(문헌(Blom et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 298-304)에 따라 인간 혈장으로부터 제조됨)를 TSG-6과 동시에 또는 순차적으로(2시간 후) 첨가하였다. 결합된 HC1, HC2(HC1 및 HC2에 대한 항체는 애브캄(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)으로부터 입수되었음) 또는 IαI(다코, 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재)를 전술된 TSG-6 및 PTX3 ELISA와 유사한 각각의 변경된 ELISA로 측정하였다.
데이터는 TSG-6 및 IαI가 동시적으로 첨가되었을 때보다 TSG-6이 iHA에 미리 결합된 후 IαI가 첨가되었을 때 iHA에 결합된 HC1(도 13A) 또는 IαI(도 13B)의 양이 보다 높은 TSG-6 농도(6 및 12 ㎍/㎖)에서 더 낮다는 것을 보여준다. HC2는 샘플에서 검출되지 않았다(데이터는 제시되어 있지 않음). 웰을 하이알루로니다제와 함께 항온처리하여 결합된 HA를 분해하고 HA로부터 결합된 단백질을 방출시키고, 이들 샘플들을 항-TSG-6 항체(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였고; iHA에 결합된 TSG-6의 양은 IαI가 후속적으로(즉, TSG-6이 iHA에 결합된 후) 첨가되었을 때보다 IαI가 TSG-6과 동시에 첨가되었을 때 더 낮았다(도 13C). 5 ㎍/㎖의 PTX3 및 5 ㎍/㎖의 IαI가 동시에 A와 함께 항온처리되었을 때, PTX3은 iHA에 결합되었으나 IαI는 결합되지 않았다(도 13D).
이들 데이터는 용액 중에서 자유로운 TSG-6이 HC1을 IαI로부터 iHA 상으로 전달하는 데에 있어서 iHA에 결합된 TSG-6보다 더 효율적이라는 것을 시사한다(도 13A 및 13B). TSG-6 및 IαI가 동시에 iHA와 함께 항온처리될 때보다 TSG-6이 iHA에 단독으로 미리 결합되어 있을 때 보다 많은 TSG-6이 iHA에 결합하는데(도 13C), 이것은 IαI가 TSG-6과 동시에 첨가되는 경우 TSG-6과 iHA의 결합을 방해하고 TSG-6이 iHA와의 결합보다 IαI와의 결합에 있어서 더 높은 친화성을 가질 것임을 시사한다. 추가로, 용액 중의 자유로운 또는 iHA에 결합된 PTX3은 HC를 IαI로부터 iHA로 옮기지 않는다(도 13D).
실시예 8: HC1·TSG-6 및 HC2·TSG-6 복합체의 형성에 대한 PTX3의 효과
PTX3(20 ㎍/㎖ 또는 120 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 IαI(40 ㎍/㎖) 및 TSG-6(6 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 항온처리하였다. 반응 샘플을 HC1(도 14A), HC2(도 14B), TSG-6(도 14C), 비쿠닌(애브캄, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)(도 14D) 및 PTX3(데이터는 제시되어 있지 않음)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. HMW HA를 갖지 않는 용액에서 TSG-6은 HC1·TSG-6 및 HC2·TSG-6 복합체를 형성하고 HMW IαI를 발생시킨다(도 14A 및 14B). HMW IαI의 형성은 도 14E에 예시되어 있다. 이 데이터는 HC1 및 HC2 둘다가 용액에서 TSG-6에 의해 HMW HA로 전달된다는 것을 시사한다.
PTX3의 동시적인 첨가는 HC2·TSG-6의 형성을 용량 의존적으로 억제하나, HC1·TSG-6의 형성을 억제하지는 않는다(도 14A 및 14B). 대조적으로, HC2를 함유하는 HMW IαI는 증가하는 반면, HC1을 함유하는 HMW IαI는 감소한다(도 14A 및 14B). TSG-6은 PTX3과 함께 또는 PTX3 없이 HMW HA를 갖지 않는 용액에 첨가될 때 이량체를 형성한다(도 14C). 이들 발견들은 1) IαI에서 HC1 및 HC2 둘다가 TSG-6의 작용을 통해 TSG-6 또는 HMW IαI와 함께 복합체를 형성하고; 2) PTX3이 TSG-6에 의한 HC1 및 HC2의 전달에 대해 상이하게 상기 과정을 방해한다는 것을 시사한다. HC1 또는 HC2의 절두된 형태는 없다. PTX3에 의한 HC2·TSG-6의 억제는 도 14F에 예시되어 있다.
비쿠닌의 글리코실화된 형태 및 글리코실화되고 콘드로이틴 설페이트-접합된 형태(각각 약 40 kDa 및 45 kDa)는 각각 TSG-6 및 PTX3에 의해 방출되었다(도 14D). 이 데이터는 TSG-6 및 PTX3 둘다가 IαI와 상호작용한다는 것을 보여주는 공개된 데이터와 일치하고, TSG-6 및 PTX3이 IαI와 상이하게 상호작용하여 비쿠닌의 상이한 결과를 발생시킨다는 것도 암시한다.
별도의 실험에서, 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5) 중의 PTX3(1, 2.5 및 5 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 37℃에서 HMW HA(250 ㎍/㎖), IαI(40 ㎍/㎖), 및 TSG-6(6 ㎍/㎖)을 24시간 동안 용액에서 항온처리하였다. 반응 샘플을 IαI에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 14G). HMW HA를 갖되 PTX3을 갖지 않는 용액에서 HC가 TSG-6에 의해 IαI로부터 HMW HA로 완전히 전달되었다. PTX3의 존재 하에서 TSG-6-매개된 HC 전달은 용량 의존적으로 억제되어 LMW 중간체(약 130 kDa이고 아마도 HC1-TSG-6으로 구성됨) 또는 프로세싱되지 않은 전구-IαI(약 130 kDa), 프로세싱되지 않은 IαI(220 kDa), 및 HMW IαI(적재 웰에 보유됨)를 축적시켰다(도 14G). 이들 데이터는 PTX3이 HC2-TSG-6의 형성을 특이적으로 방해하여 HC2 전달 및 가능한 HC1 전달을 억제한다는 발견과 일치한다.
실시예 9: TSG-6, PTX3 및 IαI의 동시적인 첨가에 의한 고정화된 HA로부터 시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체의 형성
고정화된 HA(각각의 웰에서 약 14 ㎍/㎖ 또는 100 ㎕ 중의 1.4 ㎍)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. PTX3(1, 5 또는 20 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 IαI(5 ㎍/㎖) 및 TSG-6(12 ㎍/㎖)을 37℃에서 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 2시간 동안 iHA 상에서 동시적으로 항온처리하였다. 8 M GnHCl 및 PBS를 사용한 세척 후, 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 변경된 ELISA로 측정하였다(각각 도 15A, 15D 및 15F). 웰을 8 M GnHCl 및 PBS로 다시 세척하고, 75 mM NaCl를 갖는 10 mM 아세테이트 완충제(pH 6.0)에서 60℃에서 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제를 사용하여 결합된 성분을 갖는 iHA를 분해하였다. 샘플을 HC1(도 15B), HC2(도 15C), TSG-6(도 15E) 및 PTX3(도 15G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
iHA에의 TSG-6, PTX3 및 IαI의 동시적인 첨가는 HMW HC1을 함유하는 rcHC-HA/PTX3 복합체를 발생시켰으나, HC2, 및 절두된 HC1 및 HC2를 함유하는 rcHC-HA/PTX3 복합체는 발생되지 않았다(도 15A 내지 15C). PTX3은 상기 복합체에서 HMW HC1의 양을 용량 의존적으로 감소시켰다. 상기 데이터는 PTX3이 TSG-6에 의한 iHA로의 HC1 및 HC2의 전달을 용량 의존적으로 방해하여 보다 적은 HC1/절두된 HC1 및 절두된 HC2를 발생시켰다는 것을 보여준다(도 15B 및 15C). TSG-6 단량체는 감소되었지만, HMW TSG-6(PTX3 및/또는 HC들과 다량체 또는 복합체를 형성함)은 변화하지 않았다(도 15D 및 15E).
상기 데이터는 PTX3이 IαI의 존재 또는 부재 하에서 iHA에 결합된 TSG-6을 방해하지 않는다는 것도 시사한다. 공개된 데이터는 보다 작은 MW HA가 시험될 때 TSG-6이 iHA와 함께 이량체를 형성한다는 것을 암시한다(Baranova et al. (2011) J Biol Chem. 286(29):25675-86). 본원에서 제공된 데이터는 TSG-6이 IαI의 존재 하에서 HMW HC-HA/PTX3 복합체와 함께 복합체를 형성한다는 것을 시사한다. 자유 TSG-6이 용량 의존적 방식으로 PTX3에 의해 감소되기 때문에, 이것도 PTX3이 IαI의 존재 하에서 TSG-6과 HC-HA/PTX3 복합체의 결합을 촉진한다는 것을 시사한다. 이 상황 하에서 PTX3의 대다수는 nHC-HA/PTX3에서 관찰된 것과 유사하게 감소되는 양의 단량체, 이량체 또는 삼량체를 갖는 HC-HA/PTX3 복합체에서 다량체 형태로서 존재한다(도 15F 및 15G).
실시예 10: 고정화된 HA 상에서 TSG-6 및 IαI로 시험관내에서 형성된 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체에의 PTX3의 순차적인 첨가의 효과
고정화된 HA(약 14 ㎍/㎖)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. IαI(5 ㎍/㎖) 및 TSG-6(12 ㎍/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 iHA 상에서 항온처리하였다. 비결합된 IαI 및 TSG-6을 제거한 후, PTX3(1, 5 또는 20 ㎍/㎖)을 갖거나 갖지 않는 반응 완충제를 37℃에서 2시간 동안 미리 결합된 HC들 및 TSG-6과 함께 항온처리하였다. 8 M GnHCl 및 PBS를 사용한 세척 후, 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 ELISA로 측정하였다(각각 도 16A, 16D 및 16F). 그 다음, 웰을 8 M GnHCl로 다시 세척하였다. 그 후, PBS 대조군 및 결합된 성분을 갖는 iHA를 60℃에서 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 샘플을 HC1(도 16B), HC2(도 16C), TSG-6(도 16E) 및 PTX3(도 16G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
TSG-6 및 HC들이 iHA에 미리 결합된 후 PTX3을 첨가할 때, PTX3은 HMW 복합체로의 HC1 전달을 용량 의존적으로 감소시키지만(온전한 HC1 및 절두된 HC1 둘다가 감소됨), 상기 복합체에서 절두된 HC2의 양을 증가시킨다. 실시예 7에 제시된 데이터와 일치하여, 결합된 TSG-6은 HC들을 iHA로 전달하는 데에 있어서 자유 TSG-6보다 덜 효율적이다.
실시예 8에 제시된 데이터와 유사하게, PTX3은 HMW TSG-6 및 단량체 TSG-6(도 16D 및 16E)도 용량 의존적으로 감소시켰는데, 이것은 PTX3의 후속 첨가가 미리 결합된 TSG-6을 연속적으로 고갈시킨다는 것을 시사한다. 그러나, PTX3은 TSG-6/HC-HA 복합체 내로 더 이상 도입될 수 없다(도 16F 및 16G). iHA에서 미리 결합된 TSG-6도 PTX3이 iHA에 결합하는 것을 부분적으로 방해하기 때문에(실시예 4 참조), 이 발견은 TSG-6 및 IαI에 의한 rcHC-HA/PTX3 복합체의 형성이 iHA에 결합하는 PTX3을 완전히 배제할 정도로 TSG-6/iHA와 구조적으로 상이하다는 것을 시사한다.
실시예 11: 고정화된 HA 상에서 미리 결합된 PTX3으로 시험관내에서 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체의 형성, 및 TSG-6 및 IαI의 순차적인 첨가
고정화된 HA(약 14 ㎍/㎖)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. PTX3(5 ㎍/㎖) 및 iHA를 37℃에서 2시간 동안 반응 완충제(PBS 중의 5 mM MgCl2, pH 7.5)에서 항온처리하였다. 비결합된 PTX3을 제거한 후, TSG-6(6 ㎍/㎖) 및 IαI(5, 25 및 125 ㎍/㎖)를 함유하는 반응 완충제를 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 8 M GnHCl 및 PBS로 세척한 후, 결합된 HC1, TSG-6 및 PTX3을 각각의 ELISA로 측정하였다(각각 도 17A, 17C 및 17E). 그 다음, 웰을 8 M GnHCl로 다시 세척하였다. PBS 또는 결합된 성분을 갖는 iHA를, 75 mM NaCl을 갖는 10 mM 아세테이트 완충제(pH 6.0)에서 60℃에서 2시간 동안 1 유닛/㎖의 하이알루로니다제로 분해하였다. 샘플을 PTX3(도 17B), TSG-6(도 17D), HC1(도 17F) 및 HC2(도 17G)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
IαI 및 TSG-6의 존재 하에서, 미리 결합된 PTX3은 PTX3에 대한 ELISA 면역반응성 및 다량체 PTX3의 양을 용량 의존적으로 증가시켰으나, HC-HA/PTX3 복합체에서 단량체 PTX3의 양을 감소시켰다(도 17A 및 17B). 이 데이터는 다량체 PTX3이 이 항체에 의한 면역반응성을 촉진한다는 것을 시사한다.
미리 결합된 PTX3은 rcHC-HA/PTX3 복합체에서 TSG-6을 감소시키면서 단량체 TSG-6을 용량 의존적으로 배제하였다(도 17C 및 17D). IαI 대 TSG-6의 몰비가 3:1일 때, 결합된 TSG-6(단량체 및 HMW 형태 둘다)의 유의한 감소가 검출되고, 이때 결합된 다량체 PTX3도 최대화된다.
HC1 ELISA 데이터에 기초할 때 결합된 HC1에서의 유의한 변화는 없었다(도 17E). HC2의 전달은 증가하는 IαI 농도에 의해 용량 의존적으로 증가되었다.
실시예 12: 고정화된 HA 상에서 미리 결합된 TSG-6에 의해 시험관내에서 형성된 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체와 미리 결합된 PTX3에 의해 시험관내에서 형성된 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체 사이의 대식세포 부착 활성의 비교
코바링크-NH 96웰을 실시예 3에 기재된 바와 같이 PBS(대조군), HA(iHA) 또는 nHC-HA/PTX3과 공유커플링시켰다. IαI(5 ㎍/㎖), TSG-6(6 ㎍/㎖) 또는 PTX3(5 ㎍/㎖)을 다음과 같이 iHA에 동시적으로 또는 순차적으로 결합시켰다: (1) (IαI/TSG-6/PTX3)/iHA: IαI, TSG-6 및 PTX3을 동시적으로 37℃에서 반응 완충제에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였고; (2) (IαI/TSG-6)/PTX3/iHA: IαI 및 TSG-6을 먼저 37℃에서 반응 완충제에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 IαI/TSG-6을 제거하고 8 M GnHCl 및 PBS로 세척한 후, PTX3을 첨가하고 37℃에서 반응 완충제에서 2시간 동안 항온처리하였고; (3) (PTX3)/IαI/TSG-6/iHA: PTX3을 먼저 37℃에서 반응 완충제에서 2시간 동안 iHA와 함께 항온처리하였다. 비결합된 PTX3을 제거하고 8 M GnHCl 및 PBS로 세척한 후, IαI/TSG-6을 첨가하고 37℃에서 반응 완충제에서 2시간 동안 항온처리하였다. 복합체의 형성 후, 100 ㎕의 RAW264.7 세포(1 x 105개 세포/㎖)를 각각의 커플링된 웰 내로 시딩하고 1 ㎍/㎖ LPS로 처리하였다. 24시간 동안 항온처리한 후, 세포 형태를 사진촬영하였다.
대식세포는 대조군으로서 iHA에 약하게 부착된다. IαI의 존재 하에서, iHA에 동시적으로 또는 미리 결합된 TSG-6((IαI/TSG-6/PTX3)/iHA 또는 (IαI/TSG-6)/PTX3/iHA)은 IαI를 갖지 않는 조건과 유사하게(실시예 5 참조) 세포 부착을 억제하고 세포 응집을 촉진한다(도 18). 대조적으로, iHA에 미리 결합된 PTX3[(PTX3)/IαI/TSG-6/iHA]은 실시예 5에 나타낸 바와 같이 IαI를 갖지 않는 미리 결합된 PTX3과 유사하게 세포 부착을 촉진한다. 후자는 nHC-HA/PTX3의 양성 대조군과 유사하다(도 18).
실시예 13: 고정화된 HA 상에서 미리 결합된 TSG-6에 의해 시험관내에서 형성된 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체와 미리 결합된 PTX3에 의해 시험관내에서 형성된 재구성된 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3) 복합체 사이의 M1 및 M2 마커 발현의 조절 비교
rcHC-HA/PTX3 복합체 상에서 배양된 대식세포에서 IL-10 및 IL-12p40의 발현
RAW264.7 세포를 고정화된 기재 상에서 DMEM/10% FBS에서 배양하고 실시예 12에 기재된 바와 같이 4시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 총 RNA를 단리하고 IL-10 및 IL-12p40 mRNA의 발현을 전술된 바와 같이 정량 PCR로 측정하였다(도 19A 및 19C). 대안적으로, 세포를 24시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하고 세포 배양 상청액 중의 IL-10 및 IL-12p70 단백질을 각각의 ELISA로 측정하였다(도 19B 및 19D).
PBS 대조군에 비해 IL-10 mRNA의 발현은 iHA에 의해 유의하게 변화하지 않았지만(p = 0.56), iHA에의 TSG-6, IαI 및 PTX3의 동시적인 첨가에 의해 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(a)) 상에서 유의하게 상향조절되었다(p = 0.0008). 유사하게, IL-10 mRNA의 발현은 TSG-6을 iHA에 미리 결합시킨 후 IαI 및 PTX3을 첨가함으로써 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(b))(p = 0.04) 및 양성 대조군 nHC-HA/PTX3(p = 0.008) 상에서 유의하게 상향조절되었다. IL-10 mRNA의 발현은 IαI/TSG-6/PTX3(a)보다 nHC-HA/PTX3 상에서 유의하게 더 높았지만(p = 0.04), IαI/TSG-6/PTX3(b) 상에서의 발현보다 유의하게 더 높지는 않았다(p = 0.55). 대조적으로, IL-10 mRNA의 발현은 PTX3을 iHA에 미리 결합시킴으로써 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(c))에 의해 유의하게 상향조절되지 않았다(p = 0.74)(도 19A). IL-10 단백질의 발현은 ELISA에 의해 측정되었을 때 nHC-HA/PTX3에 의해서만 유의하게 상향조절되었다(p = 0.03)(도 19B).
대조군에 비해, IL-12p40(IL-12p40은 IL-12p70의 2개 서브유닛들 중 하나이고, 나머지 서브유닛은 IL-12p35임) mRNA의 발현은 iHA에 의해 유의하게 변화하지 않았다(p = 0.1). 대조적으로, IL-12p40 mRNA의 발현은 TSG-6, IαI 및 PTX3을 iHA에 동시적으로 첨가함으로써 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(a))(p = 0.05) 및 TSG-6을 iHA에 미리 결합시킴으로써 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(b))(p = 0.04) 상에서 유의하게 상향조절되었다. 대조적으로, IL-12p40 mRNA의 발현은 미리 결합된 PTX3에 의해 형성된 복합체(도 19에서 IαI/TSG-6/PTX3(c)) 상에서 완전히 없어졌고 nHC-HA/PTX3에 의해 유의하게 하향조절되었다(p = 0.01). 후자 2개 조건들 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하였다(p = 0.04)(도 19C). 대조군에 비해, IL-12p70 단백질의 발현은 iHA에 의해 유의하게 변화하지 않았으나(p = 0.32), 미리 결합된 PTX3에 의해 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(c))에 의해 형성된 복합체 상에서 유의하게 하향조절되었다(p = 0.03)(도 19D). 대조적으로, IL-12p70 단백질의 발현은 TSG-6, IαI 및 PTX3을 iHA에 동시적으로 첨가함으로써 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(a)), 미리 결합된 PTX3에 의해 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(c)) 및 nHC-HA/PTX3 상에서 없어졌다(각각 p = 0.05, 0.02 및 0.01).
다양한 자극의 존재 하에서 배양된 대식세포에서 IL-23의 발현
별도의 실험에서, 24시간 동안 DMEM/10% FBS에서 휴지기 RAW264.7 세포(자극 부재)의 세포 배양 상청액, 또는 IFN-γ(200 유닛/㎖), LPS(1 ㎍/㎖), IFN-γ/LPS, 면역복합체 또는 IC를 갖는 LPS(LPS/IC)(1 ㎍/㎖)[IC는 150 ㎍/㎖ IgG-옵소닌화된 OVA(IgG-OVA)를 함유하였고, 25℃에서 30분 동안 10배 몰 과량의 토끼 항-OVA IgG(카펠(Cappel), 미국 노쓰캐롤라이나주 던햄 소재)를 OVA(워싱톤 바이오케미칼 코포레이션(Worthington Biochemical Corp.), 미국 뉴저지주 레이크우드 소재)와 혼합함으로써 제조되었음] 또는 IL-4(10 ng/㎖)(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로 자극된 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액 중의 IL-23 단백질을 측정하였다. 상기 세포 배양 상청액들 중의 IL-23 단백질을 제조자의 프로토콜에 따라 IL-23 ELISA(바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 측정하였다(도 19E). IL-23 단백질은 휴지기 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액, 및 LPS(1 ㎍/㎖), 면역복합체를 갖는 LPS(LPS/IC) 또는 IL-4(10 ng/㎖)에 의해 24시간 동안 자극된 세포의 세포 배양 상청액에서 검출될 수 없었으나, IFN-γ(200 유닛/㎖) 및 IFN-γ/LPS에 의해 24시간 동안 자극되었을 때 검출될 수 있게 되었다(도 19E).
rcHC-HA/PTX3 복합체 상에서 배양된 대식세포에서 IL-23의 발현
별도의 실험에서, RAW264.7 세포를 전술된 바와 같이 고정화된 기재 상에서 배양하고 24시간 동안 IFN-γ/LPS로 자극하였다. 세포 배양 상청액 중의 IL-23을 전술된 바와 같이 IL-23 ELISA로 측정하였다(도 19F).
대조군에 비해, 24시간 동안 200 유닛/㎖ IFN-γ/1 ㎍/㎖ LPS로 자극받은 RAW264.7 세포의 세포 배양 상청액 중의 IL-23 단백질은 iHA에 의해 유의하게 영향받지 않았으나(p = 0.02), TSG-6, IαI 및 PTX3을 iHA에 동시적으로 첨가함으로써 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(a))(p = 0.002) 및 iHA에 미리 결합된 TSG-6에 의해 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(b))(p = 0.0005) 상에서 유의하게 상향조절되었다. 대조적으로, IL-23 단백질은 nHC-HA/PTX3(p = 0.05)과 유사하게 미리 결합된 PTX3에 의해 형성된 복합체(IαI/TSG-6/PTX3(c))(p = 0.05) 상에서 완전히 없어진다(도 19F).
실시예 14: 만성 이식편대 숙주질환의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
동종이계 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)은 혈액 악성 종양에 대한 잠재적 치유 치료이다. 그러나, 만성 이식편대 숙주질환(cGVHD)이 주요 합병증으로 남아있다. GVHD는 45% 내지 60%에서 여러 눈 증상을 야기하고, 이들 중 안건조증은 동종이계 HSCT 수용자의 거의 50%에서 발생하는 가장 흔한 합병증이다. 사실상, 안건조증은 cGVHD의 진단을 위한 구별되는 징후 및 증상이다. cGVHD를 갖는 환자는 cGVHD와 관련된 초기 단계 경미한 안건조증 질환 또는 NIH 합의 회의 분류에 따른 소위 'cGVHD의 구별되는 특징'을 나타낸다. HSCT 후 2종의 안건조증이 인지되었는데, 1종은 안건조증의 발병 직후에 일어나는 감소된 반사적 눈물흘림과 함께 심각한 안구 표면 및 눈물 기능 손상을 갖는 반면, 나머지 1종은 정상적인 반사적 눈물흘림을 가지면서 경미하다. 안건조증은 전형적으로 이식 후 6개월에서 일어나고, 심각성은 cGVHD 및 눈꺼풀판샘 질환의 존재와 상호관련되어 있는 것으로 보고되어 있다. cGVHD와 관련된 심각한 안건조증의 발병은 경미한 안건조증의 발병보다 더 빠르다. 예를 들면, 심각한 안건조증은 HSCT 후 6.8 ± 2.5개월에서 일어나는 반면, 경미한 안건조증은 HSCT 후 13.2 ± 9.1개월에서 일어난다. HSCT 후 25명의 환자들의 50개 눈과 14명의 연령-일치된 건강한 대조군의 28개 눈의 비교 연구는 MG 파괴, 감소된 각막 민감성, 향상된 눈물 증발 속도, 감소된 결막 GCD, 증가된 결막 편평상피화생 및 염증 세포가 정상 대조군 및 HSCT 후 안건조증을 갖지 않는 대상체보다 cGVHD 관련 안건조증에서 더 많이 인지되었다는 것을 보여주었다. 나아가, 결막 염증 세포는 경미한 안건조증에 비해 심각한 안건조증에서 유의하게 더 높았다(p < 0.03). 뿐만 아니라, 대다수의 심각한 안건조증 환자들은 전신 cGVHD를 갖는 반면, 경미한 안건조증 군에서 소수의 환자들만이 전신 cGVHD를 가졌다. 이들 발견은 cGVHD 관련 심각한 안건조증 및 경미한 안건조증 질환에서의 상이한 병리학적 과정을 시사하였다. 포괄적인 안구 표면 변경이 HSCT 후 환자들에서 인지되었기 때문에, 이들이 cGVHD 관련 안건조증을 가졌는지 아니면 갖지 않았는지와 관계없이 이들의 결과는 어느 정도의 염증 과정이 cGVHD 관련 안건조증이라는 결과에 있어서 중추적인 역할을 갖는 듯하다는 것을 암시한다. 결막 브러시 세포진 표본은 정상 대조군 및 HSCT 후 안건조증을 갖지 않는 대상체에 비해 cGVHD 관련 심각한 안건조증 및 경미한 안건조증 환자들 둘다에서 상당히 증가된 염증 세포 수를 보여주었다. 뿐만 아니라, 심각한 안건조증 표본에서 염증 세포의 수는 경미한 안건조증 표본에서의 염증 세포의 수보다 유의하게 더 높았다. 나아가, cGVHD 관련 안건조증 환자로부터의 결막 및 눈물샘의 생검 샘플들에서 발현된 많은 염증 마커들은 염증이 cGVHD 관련 안건조증의 발병기전에 관여한다는 것을 확인시켜준다.
cGVHD에서 다수의 흉터형성 합병증을 발생시키는 한 가능한 원인은 사이토카인이 침윤 공여자 림프구 때문에 만성 염증에 의해 방출된 결과로서 발생하는 결막 기저 상피 및 눈물샘 근상피의 EMT이다. 종래, 염증 및 과도한 섬유증은 만성 이식편대 숙주질환(cGVHD)의 뚜렷한 조직학적 특징이라고 인식되었지만, 이들 변화들의 근원적인 기작은 공지되어 있지 않은 상태로 남아있다. cGVHD는 피부 병변에서 뚜렷한 섬유증을 나타내는 피부경화증, 폐 섬유증 및 만성 면역결핍과 유사한 특징을 나타낸다. 눈 cGVHD의 임상 특징은 건조한, 껄끄러운 또는 아픈 눈, 결막하 섬유혈관 조직 형성을 비롯한 흉터 결막염, 및 결막 섬유증의 특징적인 특징인 공막 단축의 발생을 포함한다. 피부 병변에서의 경화 특징 이외에, 구강 내의 점막 위축증, 식도의 상부부터 중간 3분의 1까지 좁아짐 또는 협착, 경화증으로 인한 관절 경직 또는 구축, 및 폐에서의 폐쇄성 기관지염은 함께 전신 GVHD-매개된 섬유증의 특징적인 특징을 표시한다. 영향받은 외분비선 및 점막에서의 주요 조직학적 소견은 기질의 현저한 섬유증, 및 경미한 림프구 침윤을 동반하는 섬유아세포 수의 현저한 증가이다. 임상적으로, 안건조증의 심각성은 림프구 침윤의 양보다 오히려 섬유증 변화의 정도와 상관관계를 갖는데, 이것은 과도한 세포외 매트릭스 축적이 일차적으로 외분비 기능장애에 기여한다는 것을 시사한다. 기질에서의 섬유아세포는 림프구에 부착하고 인간 백혈구 항원 클래스 II 및 보조자극 분자를 발현함으로써 염증에 있어서 일정한 역할도 수행한다. 이들 발견은 섬유아세포가 cGVHD의 발병기전에 있어서 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 cGVHD 환자의 눈물샘에서 축적된 섬유아세포가 키메라 상태를 갖는다는 것을 발견하였다. 따라서, 순환하는 공여자 유래의 전구체로부터 유래된 섬유아세포 및 수용자 유래의 섬유아세포는 T-세포와 상호작용함으로써 cGVHD를 갖는 환자에서 과도한 섬유증에 참여할 수 있다. T-세포 침윤을 억제함으로써 염증을 조절하는 것이 cGVHD에서 흉터 합병증을 감소시킬지는 공지되어 있지 않은 상태로 남아있다.
종래, 공여자 유래의 섬유아세포는 인간 cGVHD 조직 샘플에서 면역조직화학과 Y-염색체 형광 제자리 혼성화(FISH) 방법을 병용함으로써 검출되었다. 문헌(Zhang et al., (2002) J. Immunol. 168: 3088-3098)에 의해 확립된 cGVHD의 뮤린 모델을 사용함으로써 상기 발견을 재현할 수 있다. 이 모델에서, 눈물 부피는 이식 후 3주에서 감소하기 시작한다. 눈물샘관 주변의 초기 섬유증 및 진행성 섬유증은 이식 후 3주만큼 빠른 시기에 검출되고, 인간 샘플과 유사한 방식으로 최대 8주 동안 점진적으로 진행한다. 본 발명자들은 GVHD 군 및 대조군 둘다를 성공적으로 생성하기 위해 20회에 걸쳐 이 실험을 수행함으로써, 눈물샘 조직 샘플 및 눈물 부피의 분석을 기초로 70% 내지 80%의 전체 재현율을 발생시켰다.
전형적인 이식 실험에서, 첨가된 비장 세포를 성숙 T-세포의 공급원으로서 사용하면서 7주령 내지 8주령의 수컷 및 암컷 B10.D2(H-2d) 및 BALB/c(H-2d, 산쿄 라보라토리 리미티드(Sankyo Laboratory, Ltd)) 마우스를 각각 공여자 및 수용자로서 사용한다. 요약하건대, 암컷 수용자 마우스를 감마셀(Gammacel) 137Cs 공급원(제이. 엘. 쉐퍼드 앤드 어소시에이트(J. L.Shepherd & Associates), 미국 캘리포니아주 산 페르난도 소재)으로부터의 700 cGy로 치사적으로 방사선조사하였다. 대략 6시간 후, RPMI 1640(바이오위타커(BioWhittaker), 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에 현탁된 수컷 공여자 골수(1 x 106/마우스) 및 비장(2 x 106/마우스) 세포를 이들 마우스들에게 꼬리 정맥으로 주사하였다. 대조군(동종이계 BMT)은 동일한 수의 수컷 BALB/c 비장 및 골수 세포를 제공받는 암컷 BALB/c 수용자 마우스로 구성된다(Zhang et al. (2002) J Immunol. 168:3088-3098). HC-HA/PTX3 처리를 위해, HC-HA/PTX3 복합체를 골수 이식 후 예정된 시간, 예컨대, 골수 이식 후 7일, 14일, 21일 및 28일에 결막하 주사를 통해 투여한다.
말로리 염색을 이용한 눈물샘 섬유증의 측정; 콜라겐 특이적 분자 샤페론인 HSP47을 활성화된 섬유아세포의 마커로서 사용하는, 시야 당 활성화된 섬유아세포의 수 측정; 필로카핀 자극 하에서 면실 시험을 이용하는 눈물샘 눈물 생성의 측정; 및 RT-PCR을 이용하는 섬유형성 사이토카인, 예컨대, HSP47, IL-4, IL-6 및 TGF-베타 수준의 측정을 포함하나 이들로 한정되지 않는 분석을 이용하여 치료 효과를 평가한다.
HC-HA/PTX3 복합체를 사용한 치료는 마우스 모델에서 눈물샘 섬유증의 감소를 일으킬 것으로 예상된다. 그 후, HC-HA/PTX3 복합체는 cGVHD에 의해 야기된 안건조증의 치료를 위해 임상 셋팅에서 결막하 주사를 통해 인간 대상체에게 투여된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 15: 마우스 모델에서 염증의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 소염 효능을 HSV-1 괴사 각막 기질 각막염의 뮤린 모델에서 시험한다. 찰스 리버 위가(Charles River Wiga)(독일 슐츠펠트 소재)로부터 입수된 총 240마리의 암컷 BALB/c 마우스(6주령 내지 8주령)를 2 mg 케타민 HCl 및 400 ng 메피바케인 HCl의 복강내 주사로 마취하였다. 그 다음, 각각의 마우스에 대해, 외과용 현미경 하에서 27-게이지 바늘을 이용하여 8개의 수평 스크래치 및 8개의 수직 스크래치로 열십자 패턴으로 한 눈의 중심 각막을 스크래칭한다. 베로(Vero) 세포 상에서 상용적으로 증식되고 -80℃에서 저장되고 표준 플라크 분석에 의해 정량되는 1 x 105 플라크 형성 유닛의 HSV-1 바이러스(KOS 변종)를 함유하는 5 ㎕ 현탁액을 각각의 손상된 각막에 도포한다. HSV-1 접종 후 14일째 날, 심각한 궤양형성 기질 각막염을 발생시킨 마우스 각막을 연구를 위해 포함시키고(약 50% 수율) 각각 40개의 각막들(임상 검사를 위해 n=6, 조직학적 검사를 위해 n=5, 면역염색을 위해 n=5, 사이토카인 ELISA를 위해 n=6, TUNEL을 위해 n=5, 유동세포측정을 위해 n=10, 및 소모/백업을 위해 n=3)로 구성된 3개의 군들로 세분한다. 감염되지 않은 동료 눈을 음성 대조군으로서 사용한다. 양성 대조군은 눈꺼풀을 감기기 위해 2개의 10-O 나일론 봉합사를 사용한 눈꺼풀봉합술을 제공받는다. 실험 HC-HA/PTX3 군은 양성 대조군과 동일한 눈꺼풀봉합술, 및 정제된 HC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 조성물의 1일 4회 국소 도포를 제공받는다. 실험 HA 군은 동일한 눈꺼풀봉합술을 제공받되 HA 단독 조성물의 1일 4회 국소 도포를 제공받는다. 2일 후, 눈꺼풀봉합술은 모든 3개의 군에서 제거된다. 외과용 현미경(제이스, 독일 소재)을 이용하여 각각의 각막의 기질 염증의 심각성을 0 내지 4+의 점수로 평가하는데, 이때 1+는 각막 신생혈관형성, 부종 및 얇아짐과 함께 25% 미만의 각막 불투명도를 갖고, 2+는 각막 신생혈관형성, 부종 및 얇아짐과 함께 50% 미만의 각막 불투명도를 갖고, 3+는 각막 신생혈관형성, 부종 및 얇아짐과 함께 75% 미만의 각막 불투명도를 갖고, 4+는 각막 신생혈관형성, 부종 및 얇아짐과 함께 75% 내지 100%의 각막 불투명도를 갖는다. CO2 챔버에 이어서 경부 탈위에 의한 안락사 후, 각각의 군으로부터의 5개 각막을 동결 절편화하고 CD11b(호중구 및 대식세포), F4/80(대식세포), Gr-1(PMN들) 및 CD3(T-세포)에 대한 일차 항체를 사용하여 면역염색하고(방법 참조), 각각의 군으로부터의 또 다른 5개 각막을 헤마톡실린-에오신 및 TUNEL로 염색한다. 추가로, 각각의 군으로부터의 6개 각막으로부터 제조된 각막 균질화물에서 IL-1α, IL-2, IL-6, IFN-γ 및 TNFα 수준을 ELISA로 측정한다. MTT 분석으로 생존 세포를 정량하고 아넥신 V-PE 아폽토시스 검출 키트(비디-파밍겐(BD-Pharmingen), 독일 하이델베르그 소재)로 아폽토시스 세포를 정량하기 위한 유동세포측정을 위해 각각의 군의 10개 각막으로부터 콜라게나제에 의해 방출된 세포를 준비한다.
50%의 마우스 HSV-1-감염된 각막은 연구에 포함되기 위한 접종 후 2주 이내에 심각한 각막 기질 각막염(염증), 부종 및 궤양형성을 발생시킬 것으로 예상된다. 2일 후, 비-감염된 각막은 정상 상태로 남아있을 것이지만, 대조군에서 감염된 각막은 눈꺼풀봉합술이 제거될 때 유사한 심각한 염증을 유지할 것이다. 대조군과 유사하게, 실험 HA 군에서 각막은 유사한 심각한 염증을 나타낼 것이다. 대조적으로, 실험 HC-HA/PTX3 군의 각막은 염증의 감소를 보일 것이고, 이러한 염증의 감소는 양성 대조군과 실험 HA 군과 비교될 때 CD11b, F4/80, Gr-1 및 CD3에 대한 조직학적 분석 및 면역염색에 기초한 염증(PMN/대식세포) 및 면역(T-세포) 침윤의 유의한 감소; ELISA에 기초한 염증 및 면역 사이토카인, 예컨대, IL-1α, IL-2, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 유의한 감소; 및 각막 조직에서의 TUNEL 양성 세포의 유의한 증가 및 콜라게나제에 의해 각막으로부터 방출된 사멸된 세포(MTT) 및 아폽토시스 세포(아넥신-V/7-AAD를 사용한 유동세포측정)의 유의한 증가와 상관관계를 가질 것이고 이러한 결과들에 의해 입증될 것이다. 종합하건대, 이들 데이터는 HC-HA/PTX3 복합체가 이 뮤린 HSV-1 모델에서 임상적 소염 효능을 발휘한다는 개념을 뒷받침한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 16: 토끼 모델에서 흉터형성의 억제를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 흉터형성방지 효능을 엑시머 레이저-보조된 광굴절 각막절제술(PRK)의 토끼 모델에서 시험한다. 2.5 내지 3.0 kg의 체중(BW)을 갖는 총 30마리의 수컷 또는 암컷 뉴질랜드 백색 알비노 토끼를 사용하고 3개의 군(각각 n=10)으로 세분한다: 비-PRK 대조군, PRK HA 군, 및 PRK HC-HA/PTX3 군. PRK 전에 모든 CMTF 검사를 위해, 토끼를 5 mg/kg BW 자일라진 및 30 mg/kg BW 케타민의 근육내 주사 및 0.5% 테트라케인 HCl 안용액(오르토픽스 라보라토리스 코포레이션(Ortopics Laboratories Corp.), 미국 뉴저지주 페어톤 소재)의 국부 투여로 마취한다. 2개의 PRK 군들의 경우, 절제 영역보다 더 큰 영역에서 블런트 스패출라로 약하게 스크래핑함으로써 각각의 동물의 한쪽 눈의 각막 상피를 수동으로 제거하고, 벗겨진 기질을 정상 식염수로 세척하고, 여분의 유체를 셀룰로스 스폰지로 부드럽게 제거한다. 래다비전(LaddarVision) 엑시머 레이저(알콘(Alcon), 미국 텍사스주 포트 워쓰 소재)를 이용하여 표준 6 mm 직경 9.0 D PRK 근시 교정 PRK를 수행하여 118 ㎛의 예측된 이론상 기질 절제 깊이를 달성한다. PRK 직후, HC-HA/PTX3 복합체를 함유하는 조성물을 총 3주 동안 1일 4회 PRK HC-HA/PTX3 군에 적용하는 반면, HA만을 함유하는 조성물을 총 3주 동안 1일 4회 PRK HA 군에 적용한다. 추가로, 국소 0.1% 나트륨 디클로페낙(PRK 직후 한 방울) 및 0.3% 젠타미신 설페이트(3일 동안 1일 3회)를 모든 PRK-처리된 눈에 주입한다.
24X 표면-접촉 대물렌즈를 갖는 변경된 탠덤 스캐닝 공초점 현미경(탠덤 스캐닝 코포레이션(Tandem Scanning Corporation), 미국 버지니아주 레스톤 소재)을 이용하여 PRK 전, 및 PRK 후 1주, 2주, 3주 및 4주, 2개월 및 4개월에 생체내 CMTF를 모든 수술된 눈들(각각의 군으로부터 n=6)에 대해 수행한다. 각막 형태의 표준 공초점 검사 후, 비디오 카메라 셋팅(음량조정, 킬로볼트, 흑색 수준)을 수동으로 전환하고 모든 스캔들의 직접적인 비교를 가능하게 하기 위해 연구 동안 일정하게 유지한다. CMTF를 전체 각막을 통해 연속 z-축 스캔으로서 수행한다. 모든 영역들을 커버하는 면적에서 10회 연속 CMTF-스캔을 수행함으로써 중심 3 mm 대역 내에서 각막, 상피 및 기질 두께를 맵핑한다. 광절제 프로파일의 중심에 상응하는 가장 얇은 기질 영역으로부터 수득된 데이터만을 후속 계산을 위해 사용한다. 이미지 강도 깊이에 기초한 CMTF-프로파일을 CMTF 비디오기록으로부터 발생시킨다. 각막 광 반사성을 CMTF-프로파일로 측정하고 각막 혼탁도의 추정치로서 ㎛*화소 강도로서 정의된 임의 단위(U)로 표현한다.
기질 섬유증 조직의 존재를 확인하고 측정하기 위해, 각각의 군(대조군 및 처리군)으로부터의 3마리 PRK-처리된 동물을 종래 보고된 바와 같이 0.2 M 중탄산나트륨에 용해된 0.5% 5-(4,6-디클로로트리아지닐)아미노플루오레세인(DTAF)으로 확실히 염색한다. 2분 염색 후, 국소 항생제의 투여 전에 눈을 철저히 린싱하여 여분의 염료를 제거한다. PRK 후 4개월에서 동물들을 나트륨 펜토바르비탈(120 mg/kg BW)의 정맥내 주사로 마취한다. 마취 후, 모든 각막들을 3분 동안 PBS(pH 7.2) 중의 2% 파라포름알데하이드의 전방 관주로 제자리에서 고정시키고 절개하고 새로운 고정제 내에 넣고 4℃에서 저장한다. 그 다음, 조직을 OCT에 포매하고 액체 질소에서 급속 동결하고 냉동절편기를 이용하여 절편화한다. 조직을 연속적으로 계단모양으로 절편화하여 광절제의 가장 깊은 중심 부분을 확인하고 케라토칸, CD3434, FITC-접합된 팔로이딘, ED-A 피브로넥틴, S-100A4 및 α-평활근 액틴(α-SMA)에 대한 항체를 사용하여 면역염색함으로써 (CMTF 광 반사성에 의한) 각막 혼탁도의 변화를 각막세포로부터 섬유아세포 또는 근섬유아세포로의 표현형 변화와 상호관련시킨다. 추가로, DTAF로 염색된 눈에서 기저 상피 세포와 원래의 손상되지 않은 각막 기질을 대표하는 DTAF 염색된 각막 조직 사이의 거리를 측정함으로써 침착된 섬유증 조직의 두께를 측정한다.
생체내 공초점 현미경관찰은 생체내 CMTF-프로파일이 PRK를 제공받은 각막뿐만 아니라 비-PRK 대조군의 각막에 대해서도 분석될 때 시간의 경과에 따라 강도 및 위치에서 변화하는 잘 정의된 피크와 잘 상호관련되어 있을 특징적인 상피, 기저판, 기질 및 내피 특성을 보여줄 것으로 예상된다. 공개된 데이터에 따르면, PRK-처리된 각막은 PRK 후 1주에서 표면 상피, 광절제된 기질 표면, 방추형 섬유아세포의 층 및 내피로부터 유래된 4개의 피크들을 나타낼 것인 반면, 비-PRK 대조군의 각막은 표면 상피, 기저판 및 내피로부터 유래된 3개의 피크를 나타낼 것이다. PRK 후 1주에서 상기 2개의 실험군들 사이에 더 큰 차이는 없을 것으로 예상된다. PRK 후 2주에서 실험 PRK HA 군은 방추형 섬유아세포의 계속되는 세포 이동으로 인해 광절제된 기질 표면에 가까운 증가하는 강도의 피크를 보일 것이다. 그러나, 재증식하는 섬유아세포의 강도(피크의 높이)는 실험 PRK HC-HA/PTX3 군에서 훨씬 더 감소될 것으로 예상된다. PRK 후 3주 내지 4개월 동안, 방추형 섬유아세포의 층에 상응하는 피크는 실험 PRK HA 군에서 무세포 전방 기질의 재증식의 완결 때문에 광절제된 기질 표면으로부터 유래된 피크와 합쳐질 것이고, 광절제된 기질 표면에 상응하는 피크의 반사성의 급격한 증가를 발생시킬 것이다. 대조적으로, 실험 PRK HC-HA/PTX3 군에서는 반사성의 이러한 급격한 증가가 없을 것이다. 광 반사성의 이러한 차이는 특정 각막내 구조물로부터 유래된 CMTF-피크의 면적을 계산함으로써 정량될 수도 있다. 실험 PRK HA 군은 PRK 후 처음 2주 내지 3주 이내에 반사성 강도의 실질적인 선형 증가를 나타낼 것이고 그 후 반사성의 느린 선형 감소를 나타낼 것으로 예상된다. 대조적으로, 두 기간 동안 실험 PRK HC-HA/PTX3 군에서 반사성의 유의한 감소가 있을 것으로 예상된다. 종합하건대, 이들 CMTF 데이터는 HC-HA/PTX3 복합체가 무세포 전방 기질의 재증식 동안 각막세포 활성화, 이동 및 세포 동원의 억제 효과를 발휘한다는 것을 뒷받침하는데, 이것은 각막 광 산란(혼탁)이 종래 보고된 항-TGF-β 항체와 유사하게 감소되는 이유를 설명한다. 결과적으로, 활성화된 이동하는 기질내 상처 치유 각막세포의 세포성 및 반사성이 보다 낮고, 신규 기질 세포외 매트릭스의 침착이 보다 적고, 전방 기질에서 정상 휴지기 각막세포 집단의 확립이 보다 빠르다. 이 결론은 PRK 후 2주 내지 3주의 기간 동안 실험 PRK HA 군과 비교될 때 실험 PRK HC-HA/PTX3 군에서 활성화된 각막세포(케라토칸 발현 세포에서의 F-액틴), 섬유아세포(S-100A4의 세포질 염색 및 ED-A 피브로넥틴의 막 발현) 및 근섬유아세포(S-100A4의 핵 발현 및 α-SMA의 세포질 발현)의 유의한 감소에 의해 확증될 것이다. PRK HA 군과 비교될 때 PRK HC-HA/PTX3 군에서 기저 상피 세포와 DTAF 염색된 각막 조직 사이의 거리의 유의한 감소(유의하게 더 적은 섬유증 조직을 표시함)도 있을 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 17: 죽상경화증의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 죽상경화증의 치료를 위해 투여된다.
죽상경화증은 염증 세포 집단, 특히 대식세포의 관여를 포함한다. 대식세포 표현형 전환은 질환 진행 동안 관찰된다. 죽상경화증에서, 순환하는 단핵세포는 CCR2 및 내피 부착-매개된 기작을 통해 혈관 내막 및 내막하 내부에서 지방 침착물 축적 부위로 동원된다. 도착 시 이들 세포는 활성화되고 대식세포로 분화된다. 그 다음, 지방 침착물은 염증 세포 및 평활근 세포의 연속된 동원 및 세포외 매트릭스의 생성에 의해 플라크로 성숙하기 시작한다. 초기 죽상경화증에서 초기 침윤 대식세포 집단은 이종성을 나타내지만 주로 M2-유사 표현형을 보유한다. 병변 진행 및 확장과 함께 주로 M1 표현형으로의 전환이 관찰된다. 이 표현형 전환은 포말 세포 대식세포의 발생을 초래하는, 대식세포에 의한 플라크 내부에서의 과량의 산화된 저밀도 지단백질(LDL)의 식세포작용 및 국소 Th1 세포에 의한 IFN-γ의 생성에 기인할 수 있다. 포말 세포 대식세포는 플라크를 불안정화시켜 잠재적으로 혈전색전증을 유발하는 호염증성 매개자 및 MMP의 생성으로 이어지는 고도로 활성화된 표현형을 나타낸다. M2로부터 M1로의 전환을 방해하거나 M1 대식세포를 선택적으로 고갈시키는 치료는 죽상경화증 플라크의 안정화에 임상적으로 유용하다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 죽상경화증을 갖는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합는 예를 들면, 염증 부위에서 또는 염증 부위 근처에서 이식될 이식가능한 의료 장치, 예컨대, 스텐트를 코팅하는 데에 사용된다. HC-HA/PTX3 복합체를 사용한 죽상경화증의 치료는 염증을 감소시키고 혈전색전증을 예방할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 18: 비만 및 인슐린 내성의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 비만 및 인슐린 내성의 치료를 위해 투여된다.
지방 조직 대식세포(ATM)는 마른 상태 및 비만 상태 둘다에서 지방 조직의 세포 성분의 상당한 비율을 차지한다. 정상 인간에서, ATM은 조직의 세포 성분의 10%만큼 많은 비율을 차지한다. 비교하건대, 비만 대상체에서 상기 수치는 40%만큼 많은 수준까지 상승한다. 정상 비-비만 대상체에서, ATM은 증가된 기준 STAT6 및 PPAR-γ 발현을 특징으로 하는 분극화된 M2 표현형을 갖는다. 이들 세포들은 영양분 대사에 있어서 중요하고 유리한 역할을 수행한다. PPAR-γ의 결핍은 손상된 M2 대식세포 기능, 및 식습관에 의해 유도된 염증 및 인슐린 내성에 대한 민감성을 초래한다. 대조적으로, 비만 동안 지방 조직에서 축적되는 ATM은 강하게 분극화된 호염증성 M1 표현형을 갖는다. 이들 세포들은 높은 수준의 TNFα, IL-6 및 IL-1β(이들 모두 인슐린 내성 개체의 지방 조직에서도 높은 수준으로 관찰됨)를 생성한다. 높은 수준의 호염증성 매개자는 내재하는 인슐린 프로세싱 세포의 기능을 국소적으로 손상시킨다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 비만 또는 인슐린 내성을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 치료를 위해 겔 용액으로서 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체를 사용한 치료는 지방 조직 대식세포(ATM)가 호염증성 M1 표현형으로부터 M2 표현형으로 표현형적으로 전환되는 것을 촉진할 것이고 정상 인슐린 프로세싱을 복구시킬 것이라고 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 19: 1형 당뇨병의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 1형 당뇨병의 치료를 위해 투여된다.
1형 진성 당뇨병(1형 당뇨병, T1DM, IDDM 또는 종전에 소아 당뇨병)은 췌장의 인슐린 생성 베타 세포의 자가면역 파괴로부터 발생되는 진성 당뇨병의 한 형태이다. 인슐린의 후속 결핍은 증가된 혈액 및 소변 당을 유발한다. 고전적인 증상은 다뇨증(빈번한 배뇨), 조갈증(증가된 갈증), 다식증(증가된 굶주림) 및 체중 손실이다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 HC-HA/PTX3 복합체로 코팅된 자가 또는 동종이계 인슐린 생성 세포를 함유하는 마이크로캡슐의 형태로 1형 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 마이크로캡슐은 예를 들면, 주사에 의해 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3로 코팅된 마이크로캡슐을 사용한 치료는 대상체에서 방출되는 인슐린의 생성을 가능하게 하고 세포 치료 또는 마이크로캡슐에 대한 염증 반응을 예방하거나 감소시킴으로써 1형 당뇨병 및 이의 증상을 완화시킬 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 20: 섬유증의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 섬유증 또는 섬유증 장애의 치료를 위해 투여된다.
진행성 섬유증 질환, 예컨대, 특발성 폐 섬유증(IPF), 간 섬유증 및 전신 경화증은 대식세포에 의해 철저히 조절된다. "전구-섬유증(Pro-fibrotic)" 대식세포는 M1 성질을 나타내고, ECM 침착을 조절하는 섬유아세포 및 근섬유아세포를 직접적으로 활성화시키는 TGF-β1, PDGF 및 인슐린 유사 성장인자 1을 비롯한 다양한 매개자들을 생성한다. 전구-섬유증 대식세포는 MMP, TIMP 및 IL-1β도 생성한다. IL-1β는 IPF의 특징과 유사한 특징을 갖는 섬유증 장애인 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 중요한 유도제인 IL-17을 생성하도록 TH17 세포를 자극한다. M2-유사 대식세포에 의한 IL-10, RELMα 및 ARG1의 생성은 섬유증을 억제한다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 섬유증 또는 섬유증 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 용액으로서, 겔로서, 또는 이식가능한 의료 장치 상의 코팅제로서 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체를 사용한 치료는 M1 대식세포, 및 섬유아세포 및 근섬유아세포의 활성화를 감소시키고 대상체에서 영향받은 부위(들)에 존재하는 M2 대식세포의 양을 증가시킴으로써 섬유증 또는 이의 증상, 예컨대, 흉터형성을 억제할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 21: 만성 염증의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 만성 염증성 질병, 예컨대, 류마티스성 관절염의 치료를 위해 투여된다.
류마티스성 관절염을 비롯한 많은 자가면역 질환들은 Fc 수용체를 활성화시켜 비만 세포 및 대식세포 활성화, 및 호중구 침습을 유발하는 자가항체에 대한 면역 반응을 수반한다. 이것은 집중된 국소 염증 반응을 유발하고, 해소되지 않는 경우 복구 및 파괴의 주기를 가지면서 시간의 경과에 따라 조직 손상을 유발한다. 류마티스성 관절염에서, CSF1은 활액 섬유아세포에 의해 항시적으로 생성되고 조직 침윤 단핵세포 및 대식세포를 동원한다. 추가로, 국소적으로 생성된 CSF1은 RANK1과 함께 골 손실을 유발하는 파골세포로의 단핵세포의 분화를 유도한다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 만성 염증성 질병, 예컨대, 류마티스성 관절염을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 용액으로서, 겔로서, 또는 이식가능한 의료 장치 상의 코팅제로서 투여된다. HC-HA/PTX3을 사용한 치료는 M1 호염증성 대식세포를 억제하고 호중구 아폽토시스를 유도하고 파골세포 분화를 억제함으로써 염증성 질병 및 이의 증상을 치료할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 22: 급성 염증 반응의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 심근경색, 뇌졸중 또는 패혈증과 같은 질병에 의해 야기된 급성 염증 반응의 치료를 위해 투여된다. 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 심근경색, 뇌졸중 또는 패혈증과 같은 질병에 의해 야기된 급성 염증 반응을 갖는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 정맥내 관주에 의해 용액으로서 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 M1 염증 대식세포를 억제함으로써 급성 염증에 의해 야기된 손상을 감소시키거나 예방할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 23: 암의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 암의 치료를 위해 투여된다.
종양 발생 및 진행에 있어서 다수의 염증 세포들의 참여가 관찰되었고 통상적으로 "스몰더링(smoldering) 염증"으로서 기재된다. 이들 관찰결과는 염증 세포, 특히 대식세포와 암 사이의 잘 확립된 관련성을 이끌어내었다. 처음에, 발암유전자의 발생은 형질전환된 세포가 조직 발생을 촉진하고 아폽토시스를 방해할 뿐만 아니라 세포독성 면역 반응도 억제하는 사이토카인 및 케모카인을 분비하는 암의 특징적인 미세환경("내인성 경로"로서 지칭됨)을 발생시킨다고 생각되었다. 현재, 종양발생을 유발하는 또 다른 경로가 존재한다는 것이 인식되어 있다. 이 "외인성 경로"는 처음에 지속적인 미생물 감염, 자가면역 질환, 또는 기원이 공지되어 있지 않은 다른 병인으로부터 발생되는 만성 호염증성 환경을 특징으로 한다. 이들 경우들에서 다량의 염증 매개자들의 만성 생성은 발암유전자의 발현 및 면역 억제 사이토카인의 생성을 초래하면서 종양 세포 증식 및 생존, 또는 정상 세포에서의 유전적 불안정성의 유도를 유발할 수 있다. 따라서, 많은 경우 초기 종양 발생은 분극화된 염증성 M1-유사 대식세포 환경을 특징으로 한다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 암, 예컨대, 고형 종양 암을 갖는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 국소, 주사 또는 이식 적용을 위해 용액으로서, 겔로서, 또는 이식가능한 의료 장치 상의 코팅제로서 투여된다. HC-HA/PTX3이 M1 대식세포 분극화를 억제할 수 있기 때문에, HC-HA/PTX3을 사용한 치료는 암, 또는 후기 표현형으로의 그의 진행을 억제하거나 예방할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 24: 비-치유 피부 상처 또는 궤양의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 피부 상의 비-치유 상처 또는 궤양의 치료를 위해 투여된다.
치유되지 않으면서 약 3주 내지 4주 동안 존재하는 피부 상의 비-치유 상처 또는 궤양은 비-치유 궤양으로서 지칭된다. 통상적으로 비-치유 궤양을 야기하는 질환은 혈관 질환, 당뇨병, 피부 암 및 일부 감염이다.
본원에 기재된 방법에 의해 발생된 HC-HA/PTX3 복합체는 피부 상의 비-치유 상처 또는 궤양을 갖는 대상체에게 투여된다. HC-HA/PTX3 복합체는 예를 들면, 상처 또는 궤양의 부위에서 치료를 위해 국소적으로 또는 피하로 용액 또는 겔로서 투여된다. HC-HA/PTX3을 사용한 치료는 상처 치유 및 조직 재생 대식세포의 M2 표현형을 촉진함으로써 상처 또는 궤양의 치유를 촉진할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 25: 고위험 각막 이식물의 치료를 위한 HC-HA/PTX3의 용도
이 실시예에서, HC-HA/PTX3은 고위험 각막 이식물의 치료를 위해 투여된다. EGFP+ 대식세포를 LPS(눈 당 5 ㎍)와 함께 마피아 마우스의 양 눈에 기질내로 주사한다. LPS 주사 직후에 각각의 눈에서 OS(좌안; 좌측 눈)를 PBS(2개 또는 4개 주사 부위)로 처리하고, OD(우안; 우측 눈)를 HC-HA/PTX3(2개 또는 4개 주사 부위; 주사 부위 당 HC-HA/PTX3을 함유하는 5 ㎕의 1 mg/㎖ HA 조성물)으로 1회 처리한다. 1일째 날, 2일째 날, 3일째 날, 4일째 날, 5일째 날, 6일째 날 및 7일째 날에 생체내 생체현미경관찰로 전체 각막의 이미지를 촬영한다. EGFP 침윤의 수준을 측정하기 위해 녹색 형광의 강도를 기초로 EGFP-양성 세포를 카운팅한다. 마우스 각막 이식 모델에서, 결막하 부위 내로의 HC-HA/PTX3의 주사는 PBS 비히클 대조군과 비교될 때 염증(즉, 대식세포의 침윤)을 감소시키고 이식된 각막의 생존율을 개선할 것으로 예상된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 단리된 천연 HC-HA/PTX3 복합체(nHC-HA/PTX3)이다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 탯줄 조직으로부터 단리된다. 일부 예에서, nHC-HA/PTX3은 양막으로부터 단리된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용되는 HC-HA/PTX3 복합체는 재구성된 HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)이다.
실시예 26: 탯줄(UC)에서 HA, PTX3, TSG-6, HC1, HC2, HC3 및 비쿠닌의 분포
이 실시예에서, HA, PTX3, TSG-6, HC1, HC2, HC3 및 비쿠닌의 생체내 분포를 면역염색으로 탯줄(UC)에서 검출하였다. UC 조직 동결된 절편을 HA, PTX3, TSG-6, 및 IαI의 다양한 성분들(HC 및 비쿠닌을 포함함)에 대해 면역염색하였다. UC는 상피 층; 및 양막하 층, 및 3개의 혈관(즉, 1개의 정맥 및 2개의 동맥)(도 20a, 1개의 동맥 혈관이 표시됨, 위상)을 함유하는 와튼 젤리로 구성된 기질로 구성된다. 강한 양성 HA 염색이 UC 상피, 양막하 층 및 와튼 젤리에서 관찰되었고, 약한 HA 염색이 혈관벽에서 관찰되었다(도 20a, HA). HAase 분해를 이용하였을 때, 상기 HA 염색은 사라졌는데(도 20a, HA(+ HAase)), 이것은 HA에 대한 특이적 염색을 확인시켜준다.
PTX3의 강한 양성 면역염색은 와튼 젤리에 존재하였고, 약한 PTX3 염색은 양막하 층 및 상피에 존재하였다(도 20a, PTX3). HAase 분해는 양막하 층 및 상피에서 PTX3 염색을 향상시키지 않았는데(데이터는 제시되어 있지 않음), 이것은 약한 PTX3 염색이 HA에 의한 차단 효과에 기인하지 않았다는 것을 암시한다. 양성 PTX3 염색은 혈관의 내피에서도 관찰되었으나(데이터는 제시되어 있지 않음), 동맥 및 정맥의 혈관벽에서는 관찰되지 않았다.
TSG-6 및 비쿠닌 둘다가 전체 UC에 존재하였고, 이때 TSG-6은 주로 세포 및 세포 주변에 존재하였고, 보다 많은 TSG-6이 와튼 젤리에 비해 상피 및 양막하에 존재하였다. HC1은 상피 및 혈관벽이 희미한 HC1 염색을 가졌다는 점을 제외하고 HA와 유사한 편재화를 가졌다. UC의 기질이 아니라 상피에서 약한 HC2 및 HC3 염색이 약하게 존재하였거나 전혀 존재하지 않았다. 이들 결과는 UC가 풍부한 HA, PTX3, TSG-6, HC1 및 비쿠닌을 생성하였고 AM과 비교될 때 HC2 및 HC3을 불균형적으로 덜 생성하였다는 것을 보여주었다. UC가 상기 단백질들, 및 HC-HA/PTX3 복합체를 항시적으로 발현하였다는 것을 확인하였다.
나아가, PTX3은 AM에서 보고된 분포 패턴과 상이한 분포 패턴으로 UC에 존재하였다. 보다 많은 PTX3이 UC 와튼 젤리에 존재하였고, 상피 및 양막하에는 덜 존재하였다. 대조적으로, 보다 많은 PTX3이 AM의 상피 및 기질 치밀 층에 존재하였다. UC는 하기 마커들에서 AM과 유사한 패턴을 가졌다: 보다 많은 HA가 UC의 전체 기질에 존재하였고 UC의 상피에는 거의 존재하지 않았다. 이것은 AM에서의 HA의 분포 패턴과 유사하였다. TSG-6은 UC의 상피 및 양막하 세포에 주로 위치하였고, 비쿠닌은 전체 UC에서 발견되었다.
실시예 27: AM 및 UC로부터 순차적으로 수득된 PBS 및 GnE의 추출물의 비교
이 실시예는 AM으로부터의 PBS 추출 후 불용성 부분이 HC-HA/PTX3 복합체뿐만 아니라 임의의 PTX3, TSG-6 및 IαI도 여전히 함유하는지를 확인하였다. PTX3, TSG-6 및 IαI가 존재하는지를 알아보기 위해 PBS 추출 후 4 M GnHCl로 AM의 불용성 부분으로부터 단백질을 추출하였다. 추가로, PBS를 갖는 UC도 4 M GnHCl로 순차적으로 추출하여 이들 2개의 상이한 추출에서 PTX3, TSG-6, HC들 및 비쿠닌을 검출하였다.
문헌(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:20136-20146)에 기재된 방법에 따라, AM, CH 및 UC를 AM의 경우 1:1(g/㎖) 또는 UC의 경우 1:1.5(g/㎖)의 비로 냉각된 PBS에서 블렌더로 균질화하고 4℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 30분 동안 48,000g에서 원심분리하였다. PBS 추출물의 상청액을 각각 AME, CHE 및 UCE로서 명명하였다. 또한, UC로부터의 와튼 젤리 혼합물도 PBS로 추출하였고, 이러한 추출물을 UJE로서 명명하였다. PBS 추출 후 AM, CH, UC 및 UC 젤리 혼합물의 불용성 펠렛을 4℃에서 24시간 동안 4 M GnHCl 완충제(100 mM 아세트산나트륨, pH 5.8, 4 M GnHCl, 10 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100)로 더 추출하였다. 4℃에서 30분 동안 48,000g에서 원심분리한 후, 상청액을 수집하고 각각 AMGnE, CHGnE, UCGnE 및 UJGnE로 명명하였다. 각각의 추출에서 HA 및 단백질 농도를 각각 HA ELISA 및 BCA 분석으로 검출하였다.
GnHCl은 PBS 추출 후 불용성 펠렛으로부터 풍부한 HA 및 단백질을 더 추출하였다.
순차적인 PBS 및 GnHCl 추출물에서의 HA 및 단백질 농도는 표 1에 요약되어 있고, 이때 2개의 추출물들 사이에 HA/단백질 비도 비교하였다. 일반적으로, 4 M GnHCl은 PBS 추출 후 AM, CH, UC 및 UC 젤리 혼합물의 불용성 펠렛으로부터 풍부한 단백질 및 HA를 더 추출하였다. PBS보다 GnHCl 완충제가 불용성 펠렛으로부터 더 많은 단백질을 추출하였으나 더 적은 HA를 추출하였다. 그러나, UCGnE는 AME 및 CHE와 유사한 양의 단백질 및 HA를 여전히 함유하였다. 즉, UC는 PBS 추출물 및 GnHCl 추출물 둘다에서 AM 및 CH보다 더 많은 HA를 함유하였다.
Figure 112015012524150-pct00001
단량체, 이량체 및 HMW PTX3은 AM 세포에 비해 UC 세포의 PBS 추출에서 보다 많은 양으로 존재하였다. 그러나, HMW PTX3은 AM 세포의 GnHCl 추출에서 보다 많은 양으로 존재하였다.
항-PTX3 항체를 사용한 AME의 분석은 천연 PTX3 단량체의 크기에 상응하는 약 45 kDa의 밴드, 및 적재 웰의 하부에 있는 HMW 밴드를 보여주었다(도 21A, 레인 4). NaOH 처리는 상기 45 kDa 밴드에 영향을 미치지 않았으나 상기 HMW 밴드를 완전히 제거함으로써, NaOH로 처리된 HC-HA 복합체에서 PTX3의 주목할만한 특징인 PTX3의 HMW 퍼진 밴드(smear)를 발생시켰는데(도 21A, 레인 5), 이때 NaOH를 처리를 이용하거나 이용하지 않았을 때 단량체 PTX3은 검출되지 않았으나 90 kD 이량체는 검출되었다(도 21A, 레인 2 및 3). PTX3의 HMW 퍼진 밴드는 PTX3과 HC-HA 사이에 형성된 복합체를 나타내었다. CHE는 PTX3 밴드의 동일한 패턴을 가졌으나, NaOH 처리 후 퍼진 밴드는 더 적었는데, 이것은 면역염색 결과와 일치하였다. 태반 추출물은 CHE와 동일한 결과를 가졌다. 특히, PTX3은 UCE에서 단량체 이외에 이량체 및 HMW 퍼진 밴드로 더 많이 존재하였고, 이들의 강도는 NaOH 처리 후 더 증가하였다. AME와 유사하게, UCE도 HMW 퍼진 밴드 패턴을 발생시켰고 이러한 패턴을 AME보다 더 많은 수준으로 발생시켰다. 이들 결과는 UCE가 AME보다 더 많은 PTX3을 함유하는 반면, CHE 및 태반 추출물이 PTX3을 거의 함유하지 않는다는 것을 보여주었다.
AME(도 21A)와 비교할 때, AMGnE는 강한 HMW PTX3 퍼진 밴드, 약한 이량체 및 단량체 수준의 PTX3을 보였고, HMW PTX3 퍼진 밴드의 강도는 NaOH 처리 후 더 증가하였는데(도 21B, 레인 3 및 4), 이것은 AMGnE가 AME보다 더 많은 HMW PTX3을 함유하였다는 것을 보여주었다. 보다 많은 PTX3이 AM의 수불용성 부분에 존재하였다. CHGnE만이 NaOH를 사용하거나 사용하지 않는 처리와 관계없이 적재 웰에서 HMW 밴드를 갖되 HMW PTX3 퍼진 밴드를 갖지 않았다. PTX3 퍼진 밴드의 강도가 AMGnE에서보다 약간 더 약하였다는 점을 제외하고 UCGnE 및 UJGnE는 NaOH 처리의 존재 또는 부재 하에서 AMGnE와 동일한 PTX3 패턴을 가졌다(도 21B, 레인 3 및 4). UCGnE에서의 PTX3 퍼진 밴드의 강도도 UCE에서의 PTX3 퍼진 밴드의 강도보다 더 낮았는데, 이것은 UCGnE가 UCE보다 더 적은 HMW PTX3을 함유하였다는 것, 즉 보다 많은 PTX3이 UC의 수용성 부분에 존재하였다는 것을 보여주었다.
상기 결과는 AM 및 UC 둘다가 HMW PTX3을 함유하였다는 것을 보여주었다. AM에서 보다 많은 HMW PTX3이 수불용성을 나타내었고 PBS 추출 후 GnHCl에 의해 추출될 수 있었지만, UC에서는 보다 많은 HMW PTX3이 수용성을 나타내었으므로 주로 PBS에 의해 추출될 수 있었다.
IαI 및 HC1 둘다가 주로 AM PBS 추출물에 존재하였으나, UC에서는 대부분의 IαI가 PBS 추출물에 존재하였고 HC1은 GnHCl에 존재한 반면, UCE보다 UCGnE에 더 많은 비쿠닌이 존재하였는데, 이때 2개의 추출물 사이에 다른 차이는 없었다.
도 22는 80 kDa HC1 밴드가 UCE를 제외한 모든 PBS 추출물 및 AMGnE를 제외한 모든 GnE 추출물에 존재하였다는 것을 보여준다. 이 밴드는 모든 PBS 추출물에서 NaOH에 의해 증가하였으나 GnE에서는 증가하지 않았는데, 이것은 AM이 문헌(Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444)에 기재된 바와 같이 NaOH에 의해 방출된 자유 수용성 HC1 및 결합된 수용성 HC1(즉, HC-HA에서 HA에 결합되고 IαI에서 비쿠닌에 결합된 에스테르) 둘다를 함유하였다는 것을 보여준다. UC는 NaOH에 의해 방출된 수용성 결합된 HC1을 함유하였고, SDS 및 2-ME에 의해 해리되었으나 NaOH에 의해 영향받지 않은 수불용성 세포외 성분에 결합된 수불용성 자유 HC1도 함유하였다. 이것은 UC에서의 강한 양성 HC1 염색과 일치하였다. HMW HC1 밴드는 적재 웰에서 모든 PBS 및 GnHCl 추출물에 존재하였고 NaOH에 의해 감소되었는데, 이것은 상기 밴드가 HC-HA 복합체이었다는 것을 보여준다. HMW HC1 밴드는 UCJGnE에서보다 UCGnE에서 더 약하였는데, 이것은 와튼 젤리가 보다 많은 수불용성 HC-HA 복합체를 함유하였다는 것을 보여준다. 자유 IαI는 모든 PBS 추출물에서 발견되었으나 모든 GnE 추출물에서는 발견되지 않았는데, 이것은 상기 자유 IαI가 수용성을 나타낸다는 것을 암시한다. 그러나, 자유 PαI는 모든 PBS 및 GnHCl 추출물에서 발견되었는데, 이것은 PαI가 IαI와 상이한 상호작용을 가졌다는 것을 암시한다. 보다 많은 비쿠닌이 UCE에서보다 UCGnE에서 발견되었고, 이때 2개의 추출물들에서 다른 차이는 없었는데, 이 결과는 대부분의 비쿠닌이 UC에서 다른 수불용성 분자에 결합되었고 이것이 독특한 기능을 표시한다는 것을 강조한다.
TSG-6은 AM의 HMW 복합체에 존재하였으나 UC GnHCl 추출물에는 존재하지 않았다.
도 23은 AME에서 보고된 35 kDa TSG-6(Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444)이 AMGnE에 존재하였으나 모든 다른 추출물들에는 존재하지 않았다는 것을 보여주었는데, 이것은 TSG-6이 UC의 GnE에 존재하지 않았다는 것을 보여준다. 이 밴드는 NaOH에 의해 영향을 받지 않았는데, 이것은 TSG-6이 NaOH에 의해 절단될 수 있는 HMW 종에 결합되지 않았다는 것을 확인시켜준다. 그러나, HMW TSG-6 밴드는 AMGnE 및 CHGnE에서 발견되었으나 UCGnE 및 UJGnE에서는 발견되지 않았다. 게다가, 이 밴드는 NaOH에 의해 변화되지 않았는데, 이것은 TSG-6이 HMW 종에 강하게 결합되었다는 것을 보여준다. TSG-6은 GnE로부터 4회 초원심분리에 의해 정제된 HC-HA에서 검출되지 않았는데, 이것은 TSG-6이 불용성 매트릭스에 여전히 결합되어 있더라도 초원심분리 동안 GnHCl에 의해 분리될 수 있다는 것을 암시한다.
요약하건대, GnHCl은 PBS 추출 후 AM 및 UC의 불용성 부분으로부터 풍부한 HA 및 단백질을 더 추출하였다. UC는 PBS 추출물 및 GnHCl 추출물 둘다에서 AM 및 CH보다 더 많은 HA를 함유하였다. HMW PTX3은 AM GnHCl 추출물에서 보다 높은 수준으로 존재하였고 UC PBS 추출물에서 보다 높은 수준으로 존재하였다. PBS 추출 후 불용성 부분에는 보다 많은 HMW PTX3이 보유되었다. HC1은 주로 AM PBS 추출물에 존재하였으나 UC GnHCl 추출물에는 존재하지 않았다. HMW TSG-6은 AMGnE에 존재하였으나 UCGnE 및 UJGnE에는 존재하지 않았는데, 이것은 TSG-6이 불용성 매트릭스에 여전히 결합되어 있으나 초원심분리 동안 GnHCl에 의해 분리될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 28: AM 및 UC PBS 추출 후 4회 연속 초원심분리에 의한 HC-HA 복합체의 정제, 및 HC-HA 복합체에서 PTX3, HC들, 비쿠닌 및 TSG-6의 존재의 검출
이 실시예에서, HC-HA 복합체를 AME 및 UCE로부터 4회 연속 초원심분리로 정제하였고 HC들, 비쿠닌 및 TSG-6의 존재뿐만 아니라 PTX3의 존재도 웨스턴 블롯으로 AM 및 UC HC-HA 복합체에서 검출하였다.
제4 AM HC-HA 복합체는 제2 및 제3 HC-HA 복합체보다 더 많은 HMW PTX3 및 HC1을 함유하였고 더 순수하였다.
항-PTX3 항체를 사용하였을 때, 제1 내지 제4 AM HC-HA의 웨스턴 블롯 분석은 PBS 추출물에서 발견된 단량체에 비해 90 kDa 밴드(이량체)를 보여주었다. 이것은 이량체 상태가 제1, 제2, 제3 및 제4 HC-HA 복합체에서 겔 상부에서 HMW 밴드를 보여주는, 초원심분리를 통한 4 M GnHCl에서의 추가 추출에 의해 해상되었다는 것을 보여주었다(도 24a). 정제된 PTX3 대조군과 비교할 때, 90 kDa 밴드는 PTX3 이량체이었고, 고분자량 밴드는 PTX3 함유 HC-HA 복합체이었다. HAase 처리 후, 90 kDa 밴드는 모든 HC-HA 복합체들에서 변화하지 않았으나, HMW 퍼진 밴드는 제3 분획 및 제4 분획에서 희미하게 검출되었다. 즉, 제1 분획부터 제4 분획까지 HMW 밴드는 점진적으로 사라졌고 퍼진 밴드는 점진적으로 나타나 제4 HC-HA 복합체에서 더 강해졌다. 모든 HC-HA 복합체들에서 45 kDa PTX3 단량체 밴드는 존재하지 않았다. 이 결과는 HC-HA 복합체가 HC-HA에 결합할 수 있는 다량체 형태의 PTX3을 함유하였고 초원심분리의 횟수가 증가함에 따라 PTX3 함유 HC-HA 복합체가 더 많이 정제되었다는 것을 보여주었다. HAase의 존재 또는 부재 하에서 90 kDa PTX3 이량체가 HC-HA 복합체에 존재한다는 것은 1) HC-HA에 존재하는 PTX3 이량체가 SDS 및 2-ME에 의해 해리되었고, 2) HMW PTX3이 SDS 및 2-ME에 대한 내성을 나타내었다는 것을 보여주었다. PTX3 이량체가 2-ME로 인한 생성물이라는 것은 이하에서 더 확인된다(도 24a).
항-HC1 항체를 사용하였을 때, 80 kDa HC1 밴드는 모든 4개의 HC-HA 복합체로부터의 초기 제1 분획 및 제2 분획에서만 검출되었다(도 24b). HAase 처리 후, HC1 밴드는 강해졌고, 여러 보다 작은 밴드들도 제1 내지 제3 HC-HA 복합체들에서 나타났다. 이 결과는 정제된 HC-HA 복합체가 자유 HC를 함유하지 않았고 HC-HA가 HC1로 만들어졌다는 것을 보여주었다. 상기 PTX3 웨스턴 블롯 결과와 마찬가지로, 초원심분리의 횟수가 증가함에 따라 HC-HA 복합체는 더 많이 정제되었다. HC2(도 24c), HC3 및 TSG-6(도 24d)은 모든 HC-HA 복합체들에서 발견되지 않았다.
TSP-1은 AM GnHCl 추출물에만 존재하였고 PBS 추출물 및 제1 내지 제4 HC-HA 복합체에는 존재하지 않았다.
트롬보스포딘-1(TSP-1)은 AM GnHCl 추출물에서만 삼량체로서 검출되었고 PBS 추출물 및 제1 내지 제4 HC-HA 복합체에서는 검출되지 않았다(도 25). HAase 처리 후, 상기 물질은 퍼진 밴드로서 나타났는데, 이것은 TSP-1이 수불용성을 나타내었고 HC-HA에 강하게 결합되었다는 것을 보여준다. 그러나, 불용성 매트릭스와 HC-HA의 이러한 결합은 GnHCl 및 CsCl에 의해 해리될 수 있다.
제4 AM HC-HA 복합체처럼 제4 UC HC-HA 복합체는 PTX3 및 HC1을 함유하였으나 HC2, HC3, 비쿠닌 및 TSG-6을 함유하지는 않았고, 2-ME의 결여는 PTX3 이량체를 발생시키지 않았으나 HC1을 발생시켰다.
항-PTX3 항체를 사용하였을 때, HAase 처리의 존재 또는 부재 하에서 제4 UC HC-HA의 웨스턴 블롯 분석은 제4 UC HC-HA 복합체(도 26a, 레인 5 및 6)에서 제4 AM HC-HA 복합체(도 26a, 레인 3 및 4)와 유사한 PTX3 밴드 패턴을 보여주었다. 샘플 완충제가 2-ME를 함유하지 않았을 때, 90 kDa PTX3 이량체는 HAase의 존재 또는 부재 하에서 UC HC-HA 복합체에서 사라졌는데(도 26a, 레인 7 및 8), 이것은 HC-HA 복합체에서의 90 kDa PTX3 이량체의 출현이 샘플 완충제에서 2-ME에 의한 HC-HA에 결합된 PTX3의 환원에 기인한다는 것을 보여주었다. 항-HC1 항체를 사용하였을 때, 제4 AM HC-HA 복합체(도 26b, 레인 4)와 유사하게 고분자량 HC-HA 밴드만이 제4 UC HC-HA 복합체(도 26b, 레인 6)에서 검출되었다. HAase 처리 후, HC-HA 밴드는 사라졌고 HC1 밴드는 제4 AM HC-HA 복합체(레인 5)처럼 증가하였지만(레인 7), 그의 강도는 제4 AM HC-HA에서의 강도보다 약간 더 약하였다. 이것은 HC1이 PTX3과 함께 S-S를 갖는 복합체를 형성하였다는 것을 보여주었다. 일반적인 HC1보다 약간 더 높은 MW를 갖는 보다 강한 밴드는 샘플 완충제가 2-ME를 함유하지 않았을 때 나타났는데, 이것은 HC1이 S-S를 통해 PTX3에 연결되었다는 것을 보여준다. HC2, HC3(도 26c), 비쿠닌(도 26d) 및 TSG-6(도 26e)은 제4 AM 및 UC HC-HA 복합체에서 검출되지 않았다.
실시예 29: 4회 연속 초원심분리에 의한 총 AM 및 UC GnHCl 추출물로부터의 HC-HA 복합체의 정제, 및 PBS 추출과의 비교
이 실시예는 AM 및 UC로부터 보다 많은 HC-HA 복합체가 수득될 수 있었고 HC-HA 복합체가 PTX3 및 HC-HA의 보다 적절한 구성을 가졌고 임상에서 보다 효과적인 치료 역할을 수행하였다는 것을 확인하였다. AM 및 UC는 6 M GnHCl 완충제(200 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 6 M GnHCl, 10 mM EDTA, 10 mM 아미노카프로산, 10 mM N-에틸말레이미드, 2 mM PMSF)에 의해 추출되었다: 6 M GnHCl 완충제를 1:4(g/㎖)의 비로 AM 및 UC 분말에 첨가함으로써 AM 및 UC로부터의 GnHCl 추출을 수행하였다. 샘플을 4℃에서 하룻밤 동안 혼합하고 4℃에서 30분 동안 48,000g에서 원심분리하였다. 상청액은 GnHCl 추출물이었다. PBS 추출물로부터의 제4 HC-HA 정제를 위한 절차와 동일한 절차를 이용하여 AM 및 UC GnHCl 추출물로부터 제4 HC-HA 복합체를 정제하였다. HC-HA 복합체의 특징규명을 웨스턴 블롯팅으로 수행하여 PTX3, HC들, 비쿠닌, TSG-6 및 가능하게는 다른 단백질을 조사하였다. HC-HA의 아가로스 겔을 런닝시켜 HA 함량 및 분자량을 확인하였다.
PBS보다 GnHCl이 AM 및 UC로부터 더 많은 HC-HA 복합체를 추출하였다.
AM 및 UC로부터의 GnHCl 추출물은 AMEG 및 UCEG로서 명명되었고, 이들의 HA 및 단백질 함량을 각각 BCA 분석 및 HA ELISA로 검출하였다. GnHCl 추출물로부터 제4 HC-HA 복합체를 정제하였고, 이의 HA 및 단백질 함량을 유사하게 검출하였다. 표 2는 PBS 및 GnHCl 추출물 및 이들의 제4 HC-HA 복합체 둘다에서 단백질 및 HA의 함량을 요약한다. 결과는 AM 및 UC GnHCl 추출물들이 보다 많은 HA를 함유하였고 상대적인 PBS 추출물에 비해 보다 높은 HA/단백질 비를 갖는다는 것을 보여주었다. 나아가, 보다 많은 HC-HA 복합체가 GnHCl 추출물로부터 정제되었다.
Figure 112015012524150-pct00002
AM 제4 GnHCl HC-HA 복합체는 HAase 또는 NaOH 처리의 존재 또는 부재 하에서 보다 많은 HC1 및 HMW PTX3을 함유하였으나, PBS HC-HA보다 적은 HC1 및 HMW PTX3을 함유하였고, PBS HC-HA 및 GnHCl HC-HA 둘다가 TSP-1을 함유하지 않았다.
항-HC1 항체를 사용하였을 때, PBS HC-HA뿐만 아니라 GnHCl HC-HA도 적재 웰에서 HMW 밴드를 보여주었지만, HAase 분해는 보다 약한 HC1만을 방출하였다(도 27a, 레인 6 및 7). NaOH 처리도 HAase에 의해 방출된 HC1 밴드의 MW보다 약간 더 높은 MW를 갖는 보다 약한 HC1 밴드를 방출하였는데(도 27a, 레인 8), 이것은 NaOH 처리 후 PBS HC-HA에서 관찰되지 않았다. 이들 결과는 GnHCl HC-HA가 HC1을 함유하였으나 그 양이 PBS HC-HA보다 더 적었다는 것을 보여주었다. 유사하게, PBS HC-HA와 달리, 항-PTX3 항체를 사용하였을 때, GnHCl HC-HA만이 HAase 분해의 존재 또는 부재 하에서 이량체 PTX3을 보였으나 뚜렷한 HMW PTX3 퍼진 밴드를 보이지는 않았다(도 27b, 레인 6 및 7). NaOH도 HMW 및 이량체 PTX3을 출현시켰다. 이들 결과는 GnHCl HC-HA가 PBS HC-HA보다 더 적은 HMW PTX3을 함유하였다는 것을 보여주었다.
HC1 블롯과 유사하게, PTX3의 보다 높은 MW 이량체는 GnHCl HC-HA에서 HAase 처리보다 NaOH 처리 후에 발생되었다. 이들 결과는 종합적으로 NaOH가 HC1을 HA에 연결하는 에스테르 결합을 방출하였고 PTX3과 회합될 수 있다는 것을 시사하였다. GnHCl HC-HA가 PBS HC-HA보다 더 많은 HA 함량을 가졌기 때문에, GnHCl HC-HA 복합체는 PTX3 또는 HC1에 의해 비결합된 HA를 함유하여 정제된 생성물에서 실제 HC-HA/PTX3 복합체 함량을 감소시켰고 그 자신이 보다 적은 HC1 및 HMW PTX3을 가졌다. TSP-1은 항-TSP-1에 의해 PBS HC-HA에서 검출되지 않았다. TSP-1도 GnHCl HC-HA에서 검출되지 않았다는 것을 주목해야 한다. GnHCl 추출물이 TSP-1을 함유하기 때문에, 이들 결과는 TSP-1이 초원심분리에 의해 해리되어 GnHCl HC-HA에 존재하지 않았다는 것을 보여주었다.
아가로스 겔은 GnHCl HC-HA에서 풍부한 HA를 보여주었다.
PBS HC-HA는 아가로스 겔의 상부 적재 웰부터 하부까지 "연속적인" HA 퍼진 밴드를 보였고, HAase는 HA 퍼진 밴드를 완전히 제거하였다(도 28, 레인 3 및 4). GnHCl HC-HA는 적재 웰에서 밴드를 보였고 아가로스 겔의 4,570 kDa 위치부터 시작하여 하부까지 이어지는 HA 퍼진 밴드도 보였다(도 28, 레인 5). GnHCl HC-HA에서의 HA는 적재 웰과 HA 퍼진 밴드의 시작 부분 사이에서 단절을 가졌지만, 그의 강도는 PBS HC-HA에서보다 더 강하였다. 나아가, HAase는 GnHCl HC-HA에서 HA 퍼진 밴드 및 HMW HA 밴드를 완전히 제거하지 않았다(도 28, 레인 6). 4번째 초원심분리 후 GnHCl 추출물로부터의 상부 분획(1개 내지 6개 분획)도 GnHCl HC-HA의 "하부 분획"과 동일한 HA 퍼진 밴드 패턴을 보였다(도 28, 레인 7 및 8). 이들 결과는 GnHCl HC-HA가 보다 많은 HMW HA(PBS HC-HA보다 더 적은 MW를 가짐)를 함유하였으나, GnHCl HC-HA의 웨스턴 블롯에서 HMW PTX3 퍼진 밴드의 결여에 상응하는 HMW HA 퍼진 밴드 부분을 결여하였다는 것을 보여주었다. 이것은 PBS HC-HA에 존재하였던 HMW HA 퍼진 밴드의 상실이 적어도 부분적으로 PTX3과 HC-HA의 가교연결에 의해 발생되었고 GnHCl HC-HA의 적재 웰에서의 HMW HA가 PTX3 이외의 성분과 복합체를 형성하였다는 것을 시사하였다.
GnHCl HC-HA는 쿠마시 블루 염색에 의해 PBS HC-HA에서 발견되지 않은 일부 단백질을 함유하였다.
도 29A는 상부 적재 웰의 밴드(주된 140 kDa 및 일부 소수 70 kDa, 이중 55 kDa 및 20 kDa 밴드)가 AM GnHCl HC-HA 및 GnHCl HC-HA의 상부 분획에 존재하였으나 모든 다른 PBS HC-HA에는 존재하지 않았다는 것을 보여준다. 이것은 AM GnHCl HC-HA가 PBS HC-HA에 존재하지 않은 일부 단백질들을 함유하였다는 것을 보여주었다. 또한, 90 kDa 및 25 kDa 밴드도 GnHCl HC-HA 상부 분획에서 가시화되었다. 웨스턴 블롯이 PBS HC-HA에서 HC1을 검출하였기 때문에, HC1은 쿠마시 블루 염색에 의해 검출되었을 때에도 PBS HC-HA에 존재해야 한다. 이것이 PBS HC-HA에 존재하지 않는 이유는 적재된 HC-HA가 과다적재로 인해 겔 내로 들어가지 못하였다는 사실 때문이었다. 140 kDa은 넓은 밴드로서 보여졌는데, 이것은 이 밴드가 당 모이어티를 함유하였다는 것을 암시한다. 추가로, HAase는 이들 밴드들에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 이들 종들이 SDS 및 2-ME에 의해 해리되었다는 것을 보여준다.
AM GnHCl HC-HA와 비교될 때, UC GnHCl HC-HA는 상부 적재 웰에서 밴드들(90 kDa, 70 kDa, 이중 55 kDa, 35 kDa 및 20 kDa 밴드들)을 보였다(도 29B, 레인 4 및 5). 희미한 140 kDa 밴드도 상기 상부 적재 웰에 존재하였다. 이들 밴드들은 HAase에 의해 영향을 받지 않았다. 추가로, GnHCl HC-HA의 상부 분획은 상부 웰부터 200 kDa 부위까지 이어지는 퍼진 밴드도 보였는데, 이 퍼진 밴드는 HAase 처리 후 감소되었다. 모든 밴드들이 UC PBS HC-HA에 존재하지 않았다. 이들 결과는 UC GnHCl HC-HA가 PBS HC-HA에 존재하지 않은 일부 단백질도 함유하였고 UC GnHCl HC-HA가 이들에 함유된 단백질 밴드 면에서 AM GnHCl HC-HA와 상이하였다는 것을 보여주었다.
상기 결과는 AM 및 UC 둘다로부터의 GnHCl HC-HA가 하기 관점에서 PBS HC-HA와 상이하였다는 것을 보여주었다: (1) GnHCl HC-HA는 PBS HC-HA보다 더 적은 HC1 및 HMW PTX3을 함유하였지만(웨스턴 블롯), PBS HC-HA처럼 TSG-6, HC2 및 HC3도 GnHCl HC-HA에 존재하지 않았다. (2) GnHCl HC-HA는 보다 많은 HMW HA를 함유하였으나 웨스턴 블롯팅에서 PBS HC-HA에 의해 나타난 HMW PTX3 퍼진 밴드에 상응하는 HMW HA의 조각을 결여하였다(아가로스 겔). (3) GnHCl HC-HA는 PBS HC-HA에서 발견되지 않은 MW 140 kDa을 주로 갖는 일부 단백질들을 함유하였다(쿠마시 블루 염색 겔).
요약하건대, GnHCl은 AM 및 UC 조직으로부터 보다 많은 HA 및 단백질을 추출하여 PBS 추출물에 비해 더 높은 HA/단백질 비를 발생시켰다. (HA 함량에 따라) 보다 많은 HC-HA 복합체가 AM 및 UC 둘다에 대한 GnHCl 추출물로부터 정제되었다. GnHCl HC-HA는 AM 및 UC 둘다에 대해 PBS HC-HA보다 훨씬 더 적은 양으로 HC1 및 HMW PTX3을 함유하였다. GnHCl HC-HA는 웨스턴 블롯팅에서 PBS HC-HA에 의해 나타난 HMW PTX3 퍼진 밴드에 상응하는 일종의 HMW HA 퍼진 밴드를 아가로스 겔에서 결여하였다. GnHCl HC-HA는 PBS HC-HA에서 발견되지 않는 일부 단백질들을 함유하였다.
실시예 30: AM 및 UC로부터 정제된 GnHCl HC-HA 복합체에서 공지되지 않은 단백질 밴드의 본질의 확인
이 실시예는 탈글리코실화되었거나 탈글리코실화되지 않은 AM 및 UC로부터의 GnHCl HC-HA를 SDS-PAGE 겔에서 런닝시킨 후 CB로 염색하거나 웨스턴 블롯으로 분석함으로써 GnHCl HC-HA에서 공지되지 않은 밴드의 본질을 확인하였다. 샘플은 PBS 추출물 및 GnHCl 추출물 둘다로부터의 동결건조된 AM 및 UC 4x HC-HA(30 ㎍의 HA를 함유함)이었다. 동결건조된 HC-HA를 얼음 상에서 3시간 동안 50 ㎕ TFMS 및 20 ㎕ 아니솔과 함께 항온처리하고 125 ㎕ N-에틸모르폴린을 갖는 TFMS로 중화시켰다. 샘플을 -20℃에서 하룻밤 동안 또는 -80℃에서 1시간 동안 5배 내지 10배 부피의 아세톤으로 침전시켰다. 샘플을 원심분리하고 건조된 펠렛을 전기영동용 SDS 샘플 완충제에 용해시켰다. 케라티나제(엔도-β-갈락토시다제)를 사용한 효소적 탈글리코실화를 수행하여 케라탄 설페이트 쇄 및 N-연결된 올리고사카라이드를 제거하였고 콘드로이티나제(Cabc)를 사용한 효소적 탈글리코실화를 수행하여 콘드로이틴 설페이트 쇄를 제거하였다. HC-HA(30 ㎍의 HA를 함유함)를 37℃에서 2시간 동안 50 mM 아세트산나트륨(pH 5.8)에서 0.1 U/㎖ 케라티나제와 함께 항온처리하였거나 37℃에서 2시간 동안 PBS에서 5 U/㎖ Cabc와 함께 항온처리하였다. SDS-PAGE 겔을 런닝시켜 CB 염색에 대해 시험한 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
케라탄 설페이트 및 오스테오어드헤린은 AM GnHCl HC-HA에 존재하였으나 PBS HC-HA에는 존재하지 않았다.
웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 결과는 도 30B 및 30C에 제시되어 있다. 항-케라탄 설페이트 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 AM GnHCl HC-HA에서 넓은 70 kDa(60 내지 80 kDa) 밴드를 보여주었으나(도 30B, 레인 6 내지 8) PBS HC-HA에서는 이러한 밴드를 보여주지 않았는데, 이것은 이 약 70 kD 케라틴 설페이트 프로테오글리칸이 도 30D에 나타낸 양성 면역염색의 원인이었다는 것을 보여주었다. 이 70 kD 밴드는 쿠마시 블루 염색된 겔에 나타난, HAase로 처리되었거나 처리되지 않은 GnHCl HC-HA에서 인지된 동일한 밴드에 상응하였다(도 30A).
이 70 kD 케라틴 설페이트 프로테오글리칸이 SLRP인지를 더 확인하기 위해 항-루미칸, 항-피브로모듈린 및 항-오스테오어드헤린 항체를 웨스턴 블롯에서 사용하였다. 항-오스테오어드헤린 항체는 HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 GnHCl HC-HA에서 60 kD 밴드를 인식하되 70 kD 밴드를 인식하지 못하였으나, PBS HC-HA에서는 그러하지 않았다. 케라틴 설페이트 쇄를 갖는 오스테오어드헤린은 약 80 kD의 분자량을 갖는 반면, 그의 비-케라틴 설페이트 단백질은 약 60 kD을 갖는다. 60 kD 크기의 케라틴 설페이트 밴드가 70 kD의 넓은 크기로만 검출되었는데, 이것은 항-오스테오어드헤린에 의해 검출된 60 kD 밴드가 비-케라탄 설페이트 오스테오어드헤린이었다는 것을 보여주었다. AM GnHCl HC-HA는 HC-HA와 단단히 회합되어 있고 6 M GnHCl 및 염화세슘의 존재 하에서 4회 초원심분리를 견디는 비-케라탄 설페이트 오스테오어드헤린을 함유하였다. 그러나, 이것은 샘플 완충제에서 SDS 및 2-ME에 의해 방출되었다. 상기 결과도 70 kD 케라틴 설페이트 프로테오글리칸이 오스테오어드헤린이 아니었다는 것을 보여주었다. GnHCl HC-HA에서 검출된 루미칸 및 피브로모듈린은 없었는데, 이것은 80 kD 프로테오글리칸이 루미칸 또는 피브로모듈린이 아니라는 것을 보여주었다.
AM GnHCl HC-HA의 탈글리코실화 및 분석
AM GnHCl HC-HA에서 140 kD 및 약 80 kD 밴드에 대한 임의의 변화가 있는지를 알아보고 약 80 kD 케라틴 설페이트 프로테오글리칸이 케라토칸, PRELP 또는 오스테오글리칸인지를 추가로 확인하기 위해 케라티나제 및 콘드로이티나제를 사용하여 특이적 글리칸을 제거하면서 HC-HA를 TFMSA로 탈글리코실화하여 모든 글리칸을 제거하였다. 상기 탈글리코실화의 효과를 확인하는 제1 단계로서 쿠마시 블루 염색을 수행하였다.
도 31A의 쿠마시 블루(CB) 염색된 겔에서, AM GnHCl HC-HA(도 31A, 레인 2)는 겔의 상부에서 HMW 밴드뿐만 아니라 동일한 밴드들, 즉 주된 140 kDa, 70 kDa, 이중 50 kDa, 20 kDa 및 약한 35 kDa 밴드들도 보였다. K/C/H는 주된 80 kDa, 약한 100 kDa 및 30 kDa 밴드 출현을 발생시킨다는 점을 제외하고 이들 밴드들에 크게 영향을 미치지 않았다(도 31A, 레인 3). 이 패턴은 C/K/H 하에서 AM GnHCl HC-HA의 상부 분획으로부터 유래된 패턴과 유사하였다(도 31A, 레인 6). 이들 결과는 140 kDa, 70 kDa 및 55 kDa 밴드들이 케라탄 설페이트화되어 있지 않았고/않았거나 콘드로이틴 설페이트화되어 있지 않았고, C/K/H 후 GnHCl HC-HA에서 주요 80 kDa 종으로서 방출된 다른 케라탄 설페이트화되어 있고/있거나 콘드로이틴 설페이트화되어 있는 단백질이 존재하였다는 것을 보여주었다. TFMSA 처리는 20 kDa 밴드를 제외한 상기 모든 밴드들을 사라지게 하였고, 명확한 새로운 50 kDa 밴드 및 HMW 퍼진 밴드를 발생시켰다(도 31A, 레인 4). TFMSA/H는 퍼진 밴드를 사라지게 하여 새로운 25 kDa 밴드를 발생시켰으나 50 kDa 밴드를 변화시키지 않았다(도 31A, 레인 5). 이 결과는 140 kDa, 70 kDa, 55 kDa 및 80 kDa 밴드가 상이한 양의 글리칸 쇄를 갖는 동일한 종의 50 kDa 밴드이었다는 것을 보여주었다.
50 kDa 밴드가 60 kDa 오스테오어드헤린으로부터 유래되었는지를 확인하기 위해, 항-오스테오어드헤린 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 결과는 AM GnHCl HC-HA에서 60 kDa 종을 보여주었는데(도 31B, 레인 4), 이것은 도 31C에 나타낸 발견과 일치하였다. C/K/H는 상기 종의 분자 질량을 변화시키지 않았으나(도 31B, 레인 5 및 6), TFMSA 및 HAase(T/H) 처리 또는 TFMSA 처리는 상기 종을 보다 낮은 강도를 갖는 55 kDa 종으로 완전히 변화시켰다(도 31, 레인 7 및 8). T/H의 존재 하에서 AM GnHCl HC-HA의 상부 분획은 T/H의 부재 하에서와 비교될 때 보다 강한 밴드를 보였으나 강도 변화 없이 보다 작은 MW를 보였다(도 31B, 레인 9 및 10). 이들 결과는 AM GnHCl HC-HA가 케라탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 갖지 않는 오스테오어드헤린을 함유하였다는 것을 더 확인시켜주었다. 오스테오어드헤린 밴드의 강도가 TFMSA 처리 후 감소되는 이유는 (1) 상기 단백질이 TFMSA에 의해 분해되었고; (2) 상기 단백질이 TFMSA 처리 후 마찬가지로 방출된 동일한 MW를 갖는 다른 다량의 단백질들에 의해 차단되었기 때문이다. 오스테오어드헤린은 임의의 처리 없이 PBS HC-HA에서 검출될 수 없었으나 60 kDa의 이중 밴드가 TFMSA/HAase 처리 후 나타났는데, 이것은 PBS HC-HA가 HA에 강하게 결합된 미량의 오스테오어드헤린을 함유하였다는 것을 보여준다.
항-데코린 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 AM GnHCl HC-HA에서는 매우 강한 넓은 140 kDa 종(80 내지 160 kDa) 및 약한 이중 50 kDa 종을 보여주었으나(도 31C, 레인 4; 도 31D, 레인 4 및 5) PBS HC-HA에서는 이러한 종들을 보여주지 않았다(도 31C, 레인 2; 도 31D, 레인 2 및 3). 넓은 140 kDa 종은 1개의 콘드로이틴 설페이트 또는 데르마탄 설페이트 쇄 및 상이한 수의 글리칸을 갖는 데코린에 상응한 반면, 이중 50 kDa 종은 아마도 덜 글리코실화된 데코린에 상응하였다. HAase는 데코린 종에 영향을 미치지 않았기 때문에 이들 종이 SDS 및 2-ME에 의해 방출될 수 있다는 것을 보여주었다. 상기 개념은 70 kDa 종을 증가시킨 C/H(도 31C, 레인 5), 및 동일한 결과를 제공한 C/H/K(도 31B, 레인 6)에 의해 확인되었다. 따라서, 70 kDa 종은 콘드로이틴 무함유 데코린이었다. 주된 넓은 140 kDa 종이 C/H 또는 C/H/K에 의해 크게 변화되지 않았기 때문에 이 70 kDa 종은 소수의 성분이었다. TFMSA 처리는 넓은 140 kDa 종을 완전히 결실시킨 한편, 탈글리코실화된 데코린 코어 단백질에 상응하는 주된 43 kDa 종, 및 소수의 95 kDa, 80 kDa 및 약한 30 kDa 종을 발생시켰다(도 31C, 레인 7). TFMSA/H 처리는 이들 종들 모두의 강도가 향상되었다는 점을 제외하고 TFMSA 단독 처리와 동일한 종 패턴을 보여주었는데, 이것은 데코린이 HA에 강하게 결합되었다는 것을 보여준다. 또한, TFMSA/H는 PBS HC-HA로부터 희미한 43 kDa 종을 방출시켰는데, 이것은 AM PBS HC-HA도 HA에 강하게 결합된 데코린을 미량으로 함유하였다는 것을 보여준다. TFMSA/H의 존재 또는 부재 하에서 AM GnHCl HC-HA의 상부 분획은 하부 분획보다 더 강한 강도로 하부 분획과 동일한 패턴을 보였는데(도 31C, 레인 9 및 10), 이것은 상부 분획도 풍부한 데코린을 함유하였다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 CB 염색 겔에서 주된 140 kDa, 70 kDa 및 이중 50 kDa 종이 CS, 및 주로 비-CS 및 비-KS를 통해 데코린에 의해 형성된다는 것을 보여주었다.
데코린과 달리, 항-비글리칸 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase의 존재 또는 부재 하에서 AM GnHCl HC-HA에서 400 kDa의 강한 1개 영역을 갖는 HMW 퍼진 밴드 및 약한 45 kDa 종을 보여주었지만(도 31E, 레인 4; 도 31F, 레인 4 및 5), PBS HC-HA에서는 이러한 밴드 및 종을 보여주지 않았다(도 31D, 레인 2; 31F, 레인 2 및 3). 45 kDa 종은 비클리칸 코어 단백질에 상응한 반면, HMW 퍼진 밴드는 2개의 콘드로이틴 설페이트 또는 데르마탄 설페이트 쇄를 갖는 글리코실화된 비글리칸이었다. HAase는 400 kDa 초과의 HMW 퍼진 밴드를 덜 갖는 400 kDa 영역을 강화시켰는데, 이것은 일부 비글리칸이 HC-HA에도 결합하였다는 것을 보여주었다. C/H 또는 C/K/H는 HMW 퍼진 밴드 및 45 kDa 종을 크게 변화시키지 않았지만, 콘드로이틴 무함유 비글리칸일 가능성이 있는 70 kDa 종을 증가시켰다(도 31E, 레인 5 및 6). 70 kDa 종의 양이 매우 작고 주된 HMW 퍼진 밴드가 상기 처리에 의해 크게 변화되지 않았기 때문에, AM GnHCl HC-HA에서 대부분의 비글리칸은 CS 또는 KS와 회합되어 있지 않았다. TFMSA 처리는 HMW 퍼진 밴드를 완전히 결실시켰고 탈글리코실화된 데코린 코어 단백질에 상응하는 주된 45 kDa 종, 및 약한 95 kDa, 80 kDa 및 30 kDa 종을 발생시켰는데(도 31E, 레인 7), 이것은 AM GnHCl HC-HA에서의 비글리칸의 존재를 암시하였다. 95 kDa 및 80 kDa 종이 부분적으로 탈글리코실화된 비글리칸이었지만, 30 kDa 종은 분해된 비글리칸이었다. HAase와 함께 TFMSA 처리는 모든 이들 종들의 강도가 향상되었다는 점을 제외하고 TFMSA 단독 처리와 동일한 종 패턴을 보였는데, 이것은 비글리칸도 HA에 강하게 결합하였다는 것을 암시하였다. TFMSA/HAase의 존재 또는 부재 하에서 AM GnHCl HC-HA의 상부 분획은 하부 분획보다 더 강한 강도로 하부 분획과 동일한 종 패턴을 보였는데(도 31E, 레인 9 및 10), 이것은 상부 분획도 풍부한 비글리칸을 함유하였다는 것을 보여주었다. 항-케라탄 설페이트 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 케라티나제 또는 콘드로이티나제로 처리되었거나 처리되지 않은 AM GnHCl HC-HA에서 분자 크기를 변동시키지 않으면서 70 kDa 케라탄 설페이트화된 단백질의 존재를 보여주었는데(도 31G), 이것은 케라티나제가 케라탄 설페이트를 완전히 제거하지 않았거나 KS의 양이 이 종에서 미량이었다는 것을 암시하였다. 항-PTX3 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase만으로 분해되었거나 분해되지 않은 경우(도 31G, 레인 4 및 5)에 비해 K 및 심지어 K/H로 처리된 AM GnHCl HC-HA에서 나타난 증가된 HMW PTX3 퍼진 밴드를 보여주었다(도 31H, 레인 6 및 8). 콘드로이티나제는 이러한 효과를 갖지 않았는데, 이것은 일부 KS 함유 종이 GnHCl HC-HA에서 PTX3에 결합되었다는 것을 시사하였다. 동일한 결과가 케라티나제로 분해되었거나 분해되지 않은 UC GnHCl HC-HA의 웨스턴 블롯 분석으로부터 수득되었다(하기 도 32G 참조). 웨스턴 블롯은 비쿠닌뿐만 아니라 피브로모듈린, 루미칸, 케라토칸, PRELP, 오스테오글리신, 에피파이칸, 페리오스틴 및 TSG-6도 AM GnHCl HC-HA에 존재하지 않았다는 것을 확인시켜주었다.
요약하건대, AM GnHCl HC-HA는 HC-HA에 결합된 풍부한 데코린 및 비글리칸을 함유하였으나, PBS HC-HA는 희미한 데코린만을 함유하였고 비글리칸을 함유하지 않았다. AM GnHCl HC-HA는 오스테오어드헤린 및 케라탄 설페이트 함유 종을 함유한 반면, PBS HC-HA는 이러한 종을 함유하지 않았다. AM GnHCl HC-HA에서 극소량의 데코린 및 비글리칸은 콘드로이틴 설페이트 쇄를 함유하였다.
UC GnHCl HC-HA의 탈글리코실화 및 분석은 UC GnHCl HC-HA에서 데코린 및 비글리칸의 풍부한 존재를 보여주었으나 PBS HC-HA에서는 이를 보여주지 않았다. 케라탄 설페이트, 오스테오어드헤린 및 비쿠닌도 UC GnHCl HC-HA에 존재하였다.
CB 염색(도 32A)은 UC GnHCl HC-HA에서 상부 적재 웰에서 동일한 밴드들, 즉 160 kDa, 90 kDa, 70 kDa, 이중 50 kDa, 35 kDa 및 20 kDa 밴드들을 보여주었다(도 32A, 레인 4). C/H 또는 C/H/K는 주된 80 kDa 및 약한 30 kDa 밴드를 출현시켰다는 점을 제외하고 이들 밴드들에 크게 영향을 미치지 않았다(도 32A, 레인 5 및 6). TFMSA 처리는 20 kDa 밴드를 제외하고 모든 상기 밴드들을 감소시켰으나 주된 50 kDa 밴드, 소수의 80 kDa 밴드 및 HMW 퍼진 밴드를 증가시켰다(도 32A, 레인 7). TFMSA/H는 퍼진 밴드 및 80 kDa 밴드가 사라지게 하였으나 약한 25 kDa 밴드를 출현시켰고 새로 형성된 50 kDa 밴드의 강도를 감소시켰다(도 32A, 레인 8). 이들 결과는 AM GnHCl HC-HA로부터 수득된 결과(도 31A)와 유사한데, 이것은 UC GnHCl HC-HA가 AM GnHCl HC-HA와 유사한 구성을 가졌다는 것을 보여준다. TFMSA/H의 존재 또는 부재 하에서 UC GnHCl HC-HA의 상부 분획은 하부 분획과 동일한 패턴을 보였는데(도 32A, 레인 9 및 10), 이것은 상기 상부 분획이 하부 분획과 동일한 성분을 가졌다는 것을 시사한다. 탈글리코실화되지 않은 UC PBS HC-HA는 20 kDa 밴드뿐만 아니라 적재 웰 및 그 아래에서 HMW 밴드도 보여주었다. TFMSA/H는 HMW 밴드를 결실시켰으나 약한 80 kDa 및 25 kDa 밴드 이외에 50 kDa 밴드를 주로 증가시켰는데, 이것은 UC PBS HC-HA가 완전한 탈글리코실화 및 HA 분해에 의해서만 방출된 일부 글리코실화된 단백질을 함유하였다는 것을 암시한다.
항-데코린 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 HAase의 존재 또는 부재 하에서 UC GnHCl HC-HA에서 넓은 160 kDa 종을 보여주었으나(도 32B, 레인 4 및 5) PBS HC-HA에서는 이러한 종을 보여주지 않았는데(도 32B, 레인 2 및 3), 이것은 AM GnHCl HC-HA처럼 UC GnHCl HC-HA도 데코린을 함유하였다는 것을 시사한다. 그의 분자 질량은 글리코실화의 상이한 수준으로 인해 AM GnHCl HC-HA에서의 분자 질량과 상이하였다. HAase는 160 kDa 종을 크게 감소시켰는데, 이것은 상기 종이 HC-HA에 결합되었다는 것을 보여준다. HAase의 존재 또는 부재 하에서 케라티나제도 160 kDa 종의 강도를 감소시켰는데, 이것은 상기 종이 일부 KS도 함유하였다는 것을 시사한다. 특히, HAase 분해를 사용하거나 사용하지 않는 경우 C는 160 kDa 종 및 상부 웰 종이 사라지게 하였으나 HMW 퍼진 밴드뿐만 아니라 강한 50 kDa 및 90 kDa 종도 발생시켰는데, 이것은 UC GnHCl HC-HA에서의 데코린이 AM GnHCl HC-HA에서의 데코린(콘드로이틴 설페이트 쇄를 덜 함유함)에 비해 주로 콘드로이틴 설페이트이었다는 것을 보여준다. 이들 결과는 UC GnHCl HC-HA가 데코린을 함유하고 UC의 데코린이 (1) 글리코실화, (2) 부착되는 글리코스아미노글리칸의 종류 및 (3) 총량에 있어서 AM의 데코린과 상이하였다는 것을 추가로 확인시켜주었다.
항-비글리칸 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase의 존재 또는 부재 하에서 UC GnHCl HC-HA에서는 상부 웰에서의 강한 HMW 종, 400 kDa 영역 및 140 kDa 영역에서의 HMW 퍼진 밴드, 및 45 kDa 종을 보였으나(도 31C, 레인 4 및 5) PBS HC-HA에서는 이러한 종 및 밴드를 보이지 않았다(도 31C, 레인 2 및 3). HAase는 웰에서 HMW 종에 양향을 미치지 않으면서 400 kDa 영역을 강화시켰는데, 이것은 일부 종들이 HA에 강하게 결합되었다는 것을 암시한다. HAase의 존재 또는 부재 하에서 케라티나제는 45 kDa 종을 감소시킨다는 점을 제외하고 상기 종들을 크게 변화시키지 않았는데(도 32C, 레인 6 및 8), 이것은 45 kDa 종이 KS를 함유하였으나 대부분의 나머지 종들은 함유하지 않는다는 것을 암시한다. 콘드로이티나제만이 상부 웰에서 HMW 종을 제거하였고 400 kDa 영역의 강도를 감소시켰으나, 강한 넓은 50 kDa 종, 100 kDa 종 및 28 kDa 종(이들 사이에 퍼진 밴드를 가짐)을 증가시켰다(도 32C, 레인 7). 콘드로이티나제 및 HAase는 전체 퍼진 밴드가 보다 더 강화되었고 28 kDa 종이 사라졌다는 동일한 결과를 가졌다(도 32C, 레인 9). 이들 결과는 UC GnHCl HC-HA에서 비글리칸이 데코린과 유사하게 주로 콘드로이틴 설페이트 쇄를 가져온다는 것을 암시하였다. 이 발견은 보다 덜 콘드로이틴 설페이트화되어 있는 AM HC-HA에서의 발견과 상이하다. 또한, 대부분의 비글리칸은 HC-HA에서 HMW 복합체를 형성하고, 이때 일부는 HC-HA에 결합되었다.
항-비쿠닌 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 UC GnHCl HC-HA에서 넓은 35 kDa 밴드를 보여주었으나 PBS HC-HA에서는 이러한 밴드를 보여주지 않았다(도 32D, 레인 4 및 5). 35 kDa 밴드는 천연 비쿠닌의 MW에 상응한다. HAase의 존재 또는 부재 하에서 케라티나제는 이 35 kDa 밴드를 날카롭게 만들었으나 그의 MW를 변화시키지 않은 반면(도 32D, 레인 6 및 8), HAase의 존재 또는 부재 하에서 콘드로이티나제 분해는 35 kDa 비쿠닌을 25 kDa 코어 비쿠닌으로 변화시켰고(도 32D, 레인 7 및 9)(UC GnHCl HC-HA에서의 비쿠닌의 존재를 추가로 확인시켜줌) 보고된 바와 같이 CS를 함유하였다. HMW 퍼진 밴드도 콘드로이티나제 처리 후 형성되었기 때문에 이것은 비쿠닌이 CS를 통해 HC-HA에 강하게 결합된다는 것을 암시하였다. 이들 결과는 비쿠닌을 함유하지 않은 AM GnHCl HC-HA의 결과와 상이하였다.
항-PTX3 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 HAase 분해만을 이용하거나 이용하지 않은 경우(도 32E, 레인 4 및 5)에 비해 H, K 및 C 처리, 특히 K/H 처리 후 UC GnHCl HC-HA에서 증가된 HMW PTX3 퍼진 밴드를 보여주었다(도 32E, 레인 6 및 8). 이들 결과는 UC GnHCl HC-HA에서의 HMW PTX3의 존재 및 GnHCl HC-HA에서의 그의 강한 결합을 확인시켜주었다. 나아가, 이러한 강한 결합은 KS 함유 종(이의 본질은 불명확한 상태로 남아있음)의 존재에 의해 더 도움을 받았다. 이것은 본 발명자들의 이전 데이터(효소적 분해를 이용하지 않는 경우)가 UC GnHCl HC-HA에서 HMW PTX3의 양을 과소평가하였을 것이라는 것도 설명하였다.
항-케라탄 설페이트 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 UC PBS HC-HA에서 웰에서의 HMW 종 및 희미한 55 kD 밴드를 보여주었다. HAase는 이 밴드를 변화시키지 않았으나 60 kDa 밴드를 더 뚜렷하게 만들었다(도 32F, 레인 2 및 3). 그러나, 140 kDa 밴드는 HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 UC GnHCl HC-HA에서 항-케라탄 설페이트 항체에 의해 인식되었다(도 32F, 레인 4 및 5). HAase의 존재 또는 부재 하에서 케라티나제 처리는 140 kDa 밴드를 결실시키지 않았으나 주로 35 kDa 밴드, 및 이들 사이의 여러 다른 밴드들(PBS HC-HA에서 관찰된 60 kDa 및 55 kDa 밴드를 포함함)을 증가시켰다(도 32F, 레인 6 및 8).
HAase의 존재 또는 부재 하에서 콘드로이티나제 처리도 140 kDa 밴드를 결실시키지 않았으나 PBS HC-HA에서 관찰된 60 kDa 및 55 kDa 밴드뿐만 아니라 90 kDa 밴드도 증가시켰다(도 32F, 레인 7 및 9). 콘드로이티나제 처리는 HAase 처리 후 감소된 HMW 퍼진 밴드도 출현시켰는데, 이것은 UC GnHCl HC-HA가 케라탄 설페이트화된 단백질 이외에 풍부한 콘드로이틴 설페이트화된 단백질을 함유하였다는 것을 암시한다. UC GnHCl HC-HA에서 케라탄 설페이트화된 단백질(140 kDa)은 AM GnHCl HC-HA에서의 케라탄 설페이트화된 단백질(약 80 kDa)과 상이한 MW를 가졌다는 것은 분명하고, 아마도 이것은 쇄 내의 상이한 양의 글리칸에 기인하였을 것이다.
항-오스테오어드헤린 항체를 사용하였을 때, 주요 60 kDa 밴드 및 약한 80 kDa 밴드가 UC GnHCl HC-HA에서 검출되었고(도 32G, 레인 4) PBS HC-HA에서는 검출되지 않았다. 이들 2개의 밴드들은 케라티나제, 콘드로이티나제 또는 HAase에 의해 명확히 영향을 받지는 않았다. 80 kD은 케라틴 설페이트화된 오스테오어드헤린일 것인 반면, 약 60 kD은 비-케라틴 설페이트화된 오스테오어드헤린일 것이다. 결과는 UC GnHCl HC-HA가 케라틴 설페이트화된 오스테오어드헤린 및 비-케라틴 설페이트화된 오스테오어드헤린 둘다를 함유하였다는 것을 암시하였다.
요약하건대, 피브로모듈린, 루미칸, 케라토칸, PRELP, 오스테오글리신, 에피파이칸, 페리오스틴 및 TSG-6은 UC GnHCl HC-HA에서 검출되지 않았다. UC GnHCl HC-HA는 데코린, 비글리칸, 오스테오어드헤린, 케라탄 설페이트 및 비쿠닌을 함유하였다. 비글리칸 및 데코린은 UC GnHCl HC-HA 내에 풍부하였지만, PBS HC-HA는 이들 종들을 풍부하게 함유하지 않았다.
요약
본 발명자들은 4회 초원심분리로 AM 및 UC의 PBS 추출물 및 GnHCl 추출물 둘다로부터 HC-HA 복합체를 정제하였다. GnE로부터 정제된 HC-HA는 수율 및 화학적 조성 면에서 PBS 추출물로부터 정제된 HC-HA와 매우 상이하였다(표 1 참조). 양 면에서, GnE로부터 정제된 HC-HA는 PBS로부터 정제된 HC-HA보다 더 많은 HA를 함유하였다. 화학적 조성 면에서, GnHCl HC-HA는 보다 많은 HMW HA를 함유하였으나(PBS HC-HA보다 약간 더 작은 MW를 가짐), 웨스턴 블롯팅에서 PBS HC-HA에 의해 나타난 HMW PTX3 퍼진 밴드에 상응하는 HMW HA의 조각을 결여하였다(아가로스 겔로부터 확인됨). HAase로 분해되었거나 분해되지 않은 GnHCl HC-HA는 PBS HC-HA보다 더 적은 HC1 및 HMW PTX3을 함유하였으나, 케라티나제 및 HAase 분해 후 보다 많은 PTX3이 검출되었는데(웨스턴 블롯으로부터 확인됨), 이것은 HMW PTX3이 GnHCl HC-HA에서 케라탄 설페이트화된 단백질에 강하게 결합되었다는 것을 암시한다. PBS HC-HA 및 GnHCl HC-HA 중 어느 것도 TSG-6, HC2 및 HC3을 함유하지 않았다. 비쿠닌은 UC GnHCl HC-HA에는 존재하였으나, UC PBS HC-HA뿐만 아니라 AM PBS HC-HA 및 GnHCl HC-HA 둘다에도 존재하지 않았다. AM GnHCl HC-HA는 UC GnHCl HC-HA보다 상대적으로 더 많은 풍부한 데코린을 함유하였다. AM 및 UC PBS HC-HA 둘다가 미량의 데코린을 함유하였다. AM 및 UC GnHCl HC-HA, 특히 UC GnHCl HC-HA는 풍부한 비글리칸을 함유하였다. PBS HC-HA에는 비글리칸이 존재하지 않았다. AM 및 UC GnHCl HC-HA는 오스테오어드헤린을 함유하였다. AM 및 UC PBS HC-HA는 비글리칸, 케라탄 설페이트 함유 종, 피브로모듈린, 루미칸, 케라토칸, PRELP, 오스테오글리신, 에피파이칸, 페리오스틴, 오스테오폰딘 및 TSP-1을 함유하지 않았다. AM 및 UC GnHCl HC-HA에는 피브로모듈린, 루미칸, 케라토칸, PRELP, 오스테오글리신, 에피파이칸, 페리오스틴, 오스테오폰딘, TSP-1 및 아스포린이 존재하지 않았다. GnHCl HC-HA는 PBS HC-HA에서 발견되지 않은 주로 MW 200 kDa, 80 kDa 및 60 kDa을 갖는 가시적인 단백질 밴드를 함유하였다(쿠마시 블루 염색 겔로부터 확인됨).
Figure 112015012524150-pct00003
Figure 112015012524150-pct00004
실시예 31: 인간 양막 기질 세포에 의한 PTX3의 항시적 발현이 HC-HA/PTX3 복합체 형성을 유발한다.
이 실시예에서, AM으로부터 정제된 HC-HA에서의 PTX3 발현, 및 AM에서 HC-HA/PTX3 복합체 형성에 대한 그의 효과를 조사하였다.
실험 절차
1. 재료
구아니딘 하이드로클로라이드, 염화세슘, EDTA, 무수 알코올, 아세트산칼륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, 트리스 베이스, 트리톤 X-100, 3-(N,N-디메틸 팔미틸 암모니오)프로판설포네이트(쯔비터전트3-16), 단백질분해효소 억제제 혼합물(4-(2-아미노에틸)-벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드, 아프로티닌, 베스타틴 하이드로클로라이드, E-64, 류펩틴 및 펩스타틴 A를 포함함), 및 페닐메탄설포닐 플루오라이드를 시그마-알드리치(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 스트렙토마이세스 하이알루로니다제(HAase) 및 바이오티닐화된 HA 결합 단백질(HABP)을 세이카가쿠 바이오비즈니스 코포레이션(일본 도쿄 소재)으로부터 입수하였다. 둘베코 변경 이글 배지, 햄 F12 영양분 혼합물, 태아 소 혈청, 행크 균형 염 용액, 젠타미신, 암포테리신 B 및 RIPA 완충제를 인비트로겐(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)으로부터 구입하였다. 슬라이드-A-라이저 투석 카세트(3.5K MWCO)를 피셔 사이언티픽(미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)으로부터 구입하였다. BCA 단백질 분석 키트를 피어스(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 구입하였다. HA 정량 시험 키트를 코제닉스(미국 콜로라도주 웨스트민스터 소재)로부터 구입하였다. 4% 내지 15% 구배 아크릴아미드 준비 겔 및 니트로셀룰로스 막을 바이오-라드(미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로부터 구입하였다. IαI를 본 발명자들의 실험실에서 공개된 방법(1,38)에 따라 인간 혈장으로부터 제조하였다. PTX3 mAb(MNB4) 및 pAb를 엔조 라이프 사이언시스 인코포레이티드(Enzo Life Sciences, Inc.)(미국 펜실배니아주 플라이마우스 소재)로부터 구입하였다. 재조합 인간 TNF, 재조합 인간 펜트락신 3/TSG-14 및 인간/마우스 TSG-6 MAb(MAB2104)를 알앤드디 시스템스(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 구입하였다. 전체 길이 ITIH1에 대한 마우스 항-인간 ITIH1 다중클론 항체 및 아미노산 124-321에 대한 토끼 항-인간 ITIH2 다중클론 항체를 애브캄 인코포레이티드(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터 구입하였다. HiPerFect 형질감염 시약 및 RNeasy 미니 RNA 단리 키트를 퀴아젠(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)으로부터 구입하였다. 내생성 인간 PTX3을 표적화하기 위한 작은 간섭 RNA(siRNA) 올리고뉴클레오티드(ACACUUGAGACUAAUGAAAGAGAGA) 및 비-표적화 siRNA 대조군 올리고뉴클레오티드(뒤섞인(scrambled) RNA) siRNA를 오리진 테크놀로지스 인코포레이티드(미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 구입하였다. 웨스턴 라이팅(Western Lighting)™ 화학발광 시약을 퍼킨엘머 인코포레이티드(미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)로부터 구입하였다. 초원심분리기(LM8 모델, SW41 로터)를 벡크만 코울터 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 풀러톤 소재)로부터 구입하였다.
2. 세포 배양 및 아가로스 적층
인간 조직을 헬싱키 선언에 따라 취급하였다. 밥티스트 헬쓰 사우쓰 플로리다(Baptist Health South Florida) 임상시험심사위원회에 의한 승인(프로토콜 번호 03-028)을 통해 밥티스트 병원(미국 플로리다주 마이애미 소재)에서 선택적 제왕절개 전달 후 건강한 모체로부터 신선한 인간 태반을 수득하였다. 일차 인간 AM 상피 및 기질 세포(각각 AMEC 및 AMSC로서 명명됨)를 이전에 기재된 바와 같이(Chen et al. (2007) Stem Cells. 25: 1995-2005; Li et at. (2008) J. Cell. Physiol. 215:657-664) 신선한 태반으로부터 단리하고, 37℃에서 5% CO2의 습한 대기 하에서 보충 호르몬 상피 배지(DMEM/F12(1:1, 부피/부피), 5%(부피/부피) FBS, 0.5%(부피/부피) 디메틸 설폭사이드, 2 ng/㎖ EGF, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 5 ㎍/㎖ 트랜스페린, 5 ng/㎖ 아셀렌산나트륨, 0.5 ㎍/㎖ 하이드로코르티손, 0.1 nM 콜레라 독소, 50 ㎍/㎖ 젠타미신 및 1.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B로 구성된 SHEM)(Chen et al. (2007) Stem Cells 25:1995-2005; Chen et al. (2011) Tissue Eng Part C Methods 17:537-548)에서 배양하였다. 배양 배지를 2일마다 교체하였다. 80% 전면생장률에서 세포를 0.5% FBS 함유 DMEM/F12로 옮기고 48시간 동안 항온처리하여 세포가 휴지기 상태에 놓이게 한 후, 4시간 또는 24시간 동안 20 ng/㎖ TNF 또는 20 ng/㎖ IL-1β로 처리한 다음, RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 아가로스 적층 배양을 위해, AMEC, AMSC 및 HSF를 SHEM 중의 2 x 104/cm2의 밀도로 12웰(1 x 105개 세포/웰) 및 6웰(2 x 105개 세포/웰) 플레이트에 시딩하였다. 1일째 날에 배지를, 5% 녹아웃(KnockOut) 혈청 대체물 및 1 mM 2-포스포-L-아스코르브산을 함유하는 무혈청 SHEM으로 교체하고 2일 동안 항온처리하였다. 배지를 제거한 후, 1 mM 2-포스포-L-아스코르브산을 갖는 DMEM/F12 중의 3% 아가로스(저융점-유형, VII형, 시그마, A9045)를 1 ㎖ 또는 0.5 ㎖로 적층하여 5분 내지 10분 동안 실온에서 1 mm 두께의 겔 층을 달성한 후, 5 ng/㎖ TNF를 갖거나 갖지 않는 무혈청 SHEM 배지를 6웰 또는 12웰 플레이트 당 각각 3 ㎖ 또는 1.5 ㎖씩 첨가하였다. 5일째 날에 중간 배지 교체 없이 세포를 수거하였다.
3. siRNA 형질감염
AMEC 및 AMSC를 80% 전면생장률까지 6웰 플레이트 내의 SHEM에서 배양하였다. 세포를 0.5% FBS 함유 DMEM/F12로 옮기고 48시간 동안 항온처리하고, 100 nM의 PTX3 siRNA 또는 뒤섞인(sc) RNA와 함께 펩뮤트(PepMut)™ siRNA 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수거하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
4. 초원심분리에 의한 AM 및 무혈청 배양물로부터의 HC-HA 복합체의 정제
HC-HA 복합체를 이전에 기재된 바와 같이(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284: 20136-20146; Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247-5257; He et al. (2008) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49:4468-447532) AM 및 세포 배양물로부터 정제하였다. 요약하건대, 바이오-티슈 인코포레이티드(미국 플로리다주 마이애미 소재)로부터 입수된 냉동보존된 인간 AM을 작은 조각으로 절개하고 액체 질소에서 동결하고 바이오풀버라이저(BioPulverizer)로 미세한 분말로 분쇄하였다. 상기 분말을 냉각된 인산염 완충 식염수(PBS) 완충제와 1:1(g/㎖)로 혼합하였다. 혼합물을 약하게 교반하면서 4℃에서 1시간 동안 유지한 후, 4℃에서 30분 동안 48,000g에서 원심분리하였다. 그 다음, 상청액(AM 추출물로서 명명됨)을, 10 mM EDTA, 10 mM 아미노카프로산, 10 mM N-에틸말레이미드 및 2 mM PMSF를 함유하는 8 M 구아니딘 HCl/PBS 용액(1:1 부피/부피 비)과 혼합하고 염화세슘으로 각각 1.35 g/㎖(AM 추출물) 또는 1.40 g/㎖(세포 추출물)의 밀도로 조절하고, 15℃에서 48시간 동안 35,000 rpm에서 등밀도 원심분리하였다. 발생된 밀도 구배를 12개의 튜브로 분획화하였고(1 ㎖/튜브), 이때 HA 및 단백질의 함량을 각각 HA 정량 시험 키트 및 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 대부분의 HA를 함유하는 분획을 제1 초원심분리로부터 모으고 CsCl을 첨가하여 1.40 g/㎖의 밀도로 조절하고 초원심분리하고 전술된 방식과 동일한 방식으로 분획화하였다. HA를 함유하되 검출가능한 단백질을 함유하지 않은 분획을 제2 초원심분리로부터 모으고 CsCl을 첨가하여 1.42 g/㎖의 밀도에서 제3 초원심분리 및 제4 초원심분리를 계속 수행하였다. 제2 초원심분리 및 제4 초원심분리로부터의 분획들을 증류수에서 투석한 후, 0℃에서 1시간 동안 1.3%(중량/부피) 아세트산칼륨을 함유하는 3배 부피의 95%(부피/부피) 에탄올로 2회 침전시켰다. 15,000g에서 원심분리한 후, 펠렛을 공기로 짧게 건조하고 -80℃에서 저장하고 각각 AM 제2 HC-HA 및 제4 HC-HA로서 명명하였다.
5. 면역염색
아가로스 적층을 갖거나 갖지 않는 세포 배양물뿐만 아니라 AM 및 융모막 절편을 함유하는 인간 태아 막도 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 20분 동안 PBS 중의 0.2%(부피/부피) 트리톤 X-100으로 투과가능한 상태로 만들었다. 1시간 동안 PBS에서 0.2%(중량/부피) 소 혈청 알부민으로 차단한 후, 절편을 4℃에서 습한 챔버 내에서 하룻밤 동안 바이오티닐화된 HABP(HA의 경우, 5 ㎍/㎖), 항-PTX3, 항-HC1 또는 항-HC2 항체(모두 차단 용액에 의해 1:200으로 희석됨)와 함께 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 이들을 실온에서 1시간 동안 알렉사 플루오르 488 스트렙타비딘(HA의 경우, 1:100으로 희석됨) 또는 각각의 이차 항체(즉, 알렉사 플루오르 488 항-마우스 IgG, 또는 알렉사 플루오르 555-접합된 항-래트 IgG)와 함께 항온처리하였다. 동종형-일치된 비특이적 IgG 항체를 대조군으로서 사용하였다. 대안적으로, 절편을 고정시키기 전에 4시간 동안 37℃에서 50 U/㎖ 스트렙토마이세스 HAase로 처리하였다. 핵을 헥스트(Hoechst) 33342로 염색하고 제이스 LSM700 공초점 레이저 스캐닝 현미경(제이스, 독일 소재)을 이용하여 이미지를 수득하였다.
6. 실시간 PCR
RNeasy 미니 RNA 단리 키트를 사용하여 총 RNA를 세포 배양물로부터 추출하였다. 클로닝된 AMW 제1 가닥 cDNA 합성 키트를 올리고(dT) 프라이머와 함께 사용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 역전사하였다. 앰플리택 골드 패스트(Ampli Taq Gold Fast) PCR 마스터 혼합물 및 특이적 PTX3 프라이머(46-48)를 사용하여 qPCR로 제1 가닥 cDNA를 증폭하였다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 유전자 발현을 이용하여 증폭된 생성물의 양을 표준화하였다.
7. 웨스턴 블롯
배양 상청액을 수집하고, 세포를 냉각된 PBS로 6회 세척한 후 약하게 교반하면서 4℃에서 1시간 동안 RIPA 완충제에서 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 14,000g에서 원심분리함으로써 세포 용해물을 수득하였다. 배양 상청액 및 세포 용해물 중의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트로 정량하였다. 샘플들을 25℃에서 1시간 동안 50 mM NaOH에서 항온처리하였거나, 0.1 M 아세트산나트륨 완충제(pH 6.0)에 용해시키고 20 유닛/㎖의 스트렙토마이세스 HAase의 존재 또는 부재 하에서 60℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 상기 샘플들을 변성 조건 및 환원 조건 하에서 4% 내지 15%(중량/부피) 구배 아크릴아미드 준비 겔 상에서 SDS-PAGE로 해상하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 그 다음, 상기 막을 150 mM NaCl 및 0.05%(부피/부피) 트윈-20을 함유하는 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충제에서 5%(중량/부피) 탈지유로 차단한 후, 상이한 일차 항체들에 이어서 이들 각각의 HRP-접합된 이차 항체들과 함께 순차적으로 항온처리하였다. 면역반응성 단백질을 웨스턴 라이팅™ 화학발광 시약으로 가시화하였다.
결과
AM 상피 및 치밀한 기질(stroma)에서 양성 PTX3 염색
상피 층 및 무혈관 기질(치밀한 층 및 스펀지 같은 층으로 더 세분될 수 있음), 및 아래에 위치한 세포 풍부 융모막으로 구성된 신선한 인간 태아 막의 횡단 절편에 대해 항-인간 PTX3 항체를 사용한 면역형광 염색을 수행하였다(도 33, 위상). 양성 PTX3 염색이 상피 및 치밀한 기질의 정점 표면에서 발견되었다. 대조적으로, PTX3 염색은 스폰지 같은 기질 및 융모막에서 현저히 약화되었다(도 33, PTX3). HAase 분해는 융모막에서 PTX3 염색을 향상시키지 않았는데, 이것은 이들 두 영역들에서 약한 PTX3 염색이 차폐 효과에 기인하지 않았다는 것을 암시한다. 바이오티닐화된 HABP를 사용하였을 때 강한 양성 HA 면역염색이 AM 기질에서 발견되었고 상대적으로 약한 염색이 AM 상피에서 발견된 반면(도 33, HA), HA의 약한 염색이 AM 기질의 아래에 위치한 융모막의 상층에서 인지되었으나 강한 염색이 융모막의 하층에서 인지되었다. 이 염색은 조직 절편이 HAase에 의해 미리 분해되었을 때 사라졌는데(도 33, HA(+HAase)), 이것은 HA 염색이 특이적이라는 것을 암시한다. 개별 HC의 면역염색도 AM 상피, 기질 세포 및 매트릭스, 및 융모막에서 양성 염색을 보여주었다(도 33, HC1 및 HC2). 이들 결과는 AM, 특히 치밀한 기질 및 상피에서 PTX3이 존재한다는 것을 암시하였다.
AM 가용성 추출물 및 정제된 HC-HA 복합체에서 PTX3의 존재
AM에서의 PTX3의 존재를 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 에스테르 결합을 절단하기 위한 50 mM NaOH 처리 전 및 후에 등장성 염 완충제에 의해 수득된 AM 추출물의 웨스턴 블롯팅 분석을 먼저 수행하였다. 재조합 PTX3은 45 kDa, 90 kDa, 180 kDa 및 HMW 종으로서 나타났다(도 34, 레인 2). 가용성 AM 추출물은 적재 웰의 하부에서 45 kDa 및 HMW 종(대부분 겔로 들어가지 않음)을 보여주었다(도 34, 레인 3). NaOH 처리는 45 kDa 종에 영향을 미치지 않았으나 HMW 종을 완전히 제거하여 PTX3의 HMW 퍼진 밴드를 발생시켰다(도 34, 레인 4). 이들 결과는 PTX3이 AME에서 단량체 및 HMW 복합체로서 존재한다는 것을 암시하였다. HMW 복합체는 HC-HA 사이의 에스테르 공유연결을 절단할 수 있는 NaOH에 의해 HMW 퍼진 밴드로 해리될 수 있었기 때문에, 적재 웰에서 HMW PTX3 함유 종은 HC-HA와 회합되어 있을 것이다.
PTX3이 AM HC-HA 복합체와 회합되어 있는지를 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 이전에 보고된 바와 같이(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:20136-20146; Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444) AM 가용성 추출물로부터 2회 및 4회 연속 초원심분리로 HC-HA 복합체를 정제하고 HAase로 분해하거나 분해하지 않으면서 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 가용성 AME에서 발견된 단량체와 대조적으로, 적재 웰의 하부에 존재하는 HMW 밴드 이외에 천연 PTX3 이량체의 크기에 상응하는 90 kDa 종이 AM 제2 및 제4 HC-HA 복합체에서 나타났다(도 34, 레인 5 및 7). 추가로, HMW 퍼진 밴드도 제2 HC-HA에서 약하게 관찰되었고 제4 HC-HA 복합체에서 강하게 관찰되었다. HAase 처리 후, 90 kDa 이량체는 상기 두 HC-HA 복합체들에서 유지되었으나, HMW 퍼진 밴드는 제4 HC-HA에서 강화되었고 제2 HC-HC에서 증가하였고, 이때 HMW 밴드는 겔 상부에서 사라졌는데(도 34, 레인 6 및 8), 이 결과는 AME에서 관찰된 결과와 유사하다. HAase의 존재 또는 부재 하에서 90 kDa PTX3 이량체가 HC-HA 복합체에 존재한다는 것은 2-ME에 의해 야기된 HC-HA로부터의 해리에 의해 야기된 것으로 발견되었는데, 이는 2-ME의 제거가 이 90 kDa 종의 부재를 초래하였기 때문이다(데이터는 제시되어 있지 않음). 이들 결과는 HC-HA 복합체가 4회 초원심분리에도 불구하고 HC-HA에 결합하여 HC-HA/PTX3 복합체를 형성하는 PTX3을 함유하였다는 것을 암시하였다.
항-HC1 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 HAase 분해 시 사라진 HMW 종으로서의 HC-HA 복합체가 적재 웰의 하부에 존재한다는 것(도 34, 레인 10 내지 13), 및 HAase 분해 후 HC-HA 복합체로부터 방출된 HC1이 HC-HA 복합체에 존재한다는 것(도 34, 레인 11 및 13)을 보여주었다. 본 발명자들은 HC2 및 TSG-6 중 어느 것도 검출하지 못하였다(데이터는 제시되어 있지 않음). 이들 결과는 AM으로부터 정제된 HC-HA만이 HC1을 함유한다는 것을 종합적으로 확인시켜주었다. 본 발명자들은 제2 HC-HA 복합체와 제4 HC-HA 복합체 사이의 주요 차이, 즉 자유 80 kDa HC1 밴드가 제2 HC-HA 복합체에서만 검출되었고(도 34, 레인 11) 제4 HC-HA 복합체에서는 검출되지 않았다는 것도 인지하였는데, 이것은 제4 HC-HA 복합체가 자유 HC1을 함유하지 않았다는 것을 암시한다. 제4 HC-HA에서의 HA의 존재는 겔의 상부 적재 웰부터 하부까지 연속적인 HA 퍼진 밴드로서 표시하는 아가로스 겔 전기영동에 의해 입증되었고, 이러한 퍼짐 현상은 HAase 분해에 의해 해소되었다.
AMEC 및 AMSC에 의한 PTX3 mRNA 및 단백질의 발현
본 발명자들은 PTX3이 AM 상피 및 기질 세포 배양에 의해 합성되었다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 보고된 바와 같이(Chen et al. (2007) Stem Cells 25(8):1995-2005; Li et al. (2008) J Cell Physiol. 215(3):657-64; Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444) 이들 세포들을 배양하고 RT-PCR을 위해 총 RNA를 추출하였고 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 추출하였으며, 이들을 인간 피부 섬유아세포(HCF)(호염증성 사이토카인, 예컨대, TNF 및 IL-1의 자극 하에서만 PTX3 mRNA 및 단백질을 발현한다고 보고됨)와 비교하였다. 예상된 바와 같이, qRT-PCR 결과는 PTX3 전사체의 발현이 휴지기 HSF에서 낮았지만 TNF 및 IL-1β에 의해 상향조절되었다는 것을 보여주었다(도 35A). 휴지기 AMEC 및 AMSC에서의 PTX3 전사체의 발현도 낮았지만, TNF 또는 IL-1β에 의해 현저히 상승되었다(도 35A). 웨스턴 블롯팅 분석은 PTX3 단백질이 용해물에서 낮았고(45 kDa) 휴지기 HSF의 배지에서 검출불가능하였지만(도 35B, 레인 2) 24시간 동안 TNF 또는 IL-1β의 첨가 후 용해물에서 검출되었으나 배지에서는 검출되지 않았다는 것을 확인시켜주었다. 대조적으로, PTX3 단백질은 휴지기 AMEC에서 검출가능하였고 용해물(45 kDa) 및 배지(45 kDa 및 90 kDa) 둘다에서 TNF 또는 IL-1β에 의해 현저히 증가되었고(도 35B, 레인 5, 6 및 7), 이때 TNF는 IL-1β보다 더 효과적이었다. 동일한 발견이 AMSC에서 인지되었다(도 34B, 레인 8, 9 및 10). 모든 세포들로부터 용해물에서의 75 kDa 및 135 kDa 밴드 및 배지에서의 50 kDa 밴드가 TNF 또는 IL-1β 하에서 변화하지 않았기 때문에 비특이적이라는 것을 입증하기 위해, PTX3 siRNA 형질감염을 수행하였고 실제로 용해물에서의 45 kDa 종, 및 45 kDa 및 90 kDa 종 둘다가 하향조절되었으나, 이들 비특이적 밴드들은 하향조절되지 않았다(도 35C). 이들 결과는 종합적으로 PTX3이 휴지기 AM 세포에 의해 실제로 합성되어 분비되었고 호염증성 자극에 의해 더 상향조절되었다는 것을 암시하였다.
AM 기질 세포에 의한 HC-HA/PTX3 복합체의 생성
종래 연구는 HC-HA(즉, SHAP-HA) 복합체가 FBS로 보충된 배지에서 배양된 마우스 피부 섬유아세포의 세포 층으로부터 단리될 수 있고 단리된 HC-HA가 FBS로부터 유래된 IαI의 HC1 및 HC2 둘다를 함유한다는 것을 보여주었다(Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247-5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725-26730). 그러나, 본 발명자들은 AM 세포의 내생적으로 발생된 IαI를 사용함으로써 AM 세포가 HC-HA를 생성한다는 것을 보고하였다(Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444). AM 세포가 TNF 및 IL-1에 의해 더 증가되는 PTX3 단백질을 합성하였기 때문에, 본 발명자들의 목적은 이들 세포가 PTX3도 함유하는 HC-HA를 생성하는지를 확인하는 것이었다. 본 발명자들은 혈청 함유 조건에서 호염증성 자극, 예를 들면, TNF 및 IL-1 하에서만 PTX3을 발현하는 HSF를 대조군으로서 사용하였고(Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247-5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725-26730)(도 35), TNF의 존재 또는 부재 하에서 무혈청 조건 및 혈청 함유 조건 둘다에서 배양된 AMEC 및 AMSC와 비교하였다. 또한, 본 발명자들은 세포 단일층 상에 3% 아가로스를 적층하였는데, 이는 이 방법이 각막세포 배양 시 분비된 전구-콜라겐을 배지보다는 오히려 세포 표면에서 또는 세포 표면 근처에서 포획하는 것으로 발견되었기 때문이다(Hassell et al. (2008) Experimental Eye Resarch. 87:604-611; Etheredge et al. (2010) Matrix Boil. 29:519-524). 5일의 적층 후, HSF, AMSC 및 AMEC는 특히 혈청 함유 조건에서 더욱 치밀해졌다(도 36). 상피 형태는 AMEC에서 더 뚜렷해졌다.
그 다음, 본 발명자들은 HA ELISA 분석으로 배양 배지 중의 HA 농도를 측정함으로써 3% 아가로스 적층이 분비된 HA를 포획하는 데에도 효과적인지를 확인하였다. 아가로스 적층이 없는 경우, HA 수준은 AMSC 및 AMEC 둘다의 무혈청 배지에서 용이하게 검출될 수 있었으나 HSF의 무혈청 배지에서는 검출될 수 없었다. TNF는 모든 3개의 세포 배양물들의 HA 수준을 유의하게 증가시켰다(도 37). 상기 패턴은 혈청 함유 배지에서 더 촉진되었다. 아가로스 적층은 모든 3개의 세포 배양물들 중에서 무혈청 조건 및 혈청 함유 조건 둘다에서 HA 수준을 50% 초과의 수준까지 감소시켰다. 이들 결과는 아가로스 적층이 실제로 배양 배지 내의 HA 수준을 감소시켰다는 것을 암시하였다.
분비된 HA가 아가로스 적층 후 세포외 매트릭스에서 실제로 포획되는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 HC1 및 HC2에 대한 특이적 항체인 바이오틴-표지된 HABP 및 2개의 상이한 항-PTX3 항체(즉, 각각 MNB4 및 바이오틴-표지된 pAb)를 사용하여 PTX3/HA, HC1/HA 및 HC1/PTX3에 대한 이중 면역염색을 수행하였다. 무혈청 조건에서, 양성 HA 염색은 HSF에서 세포주변 영역에서 인지되었지만, PTX3 염색은 음성이었다(도 38A). TNF 자극을 이용하였을 경우, 양성 PTX3 염색이 세포질에서 관찰되었는데(도 38B), 이것은 HSF에서 TNF에 의한 PTX3의 유도적 발현을 확인시켜준다. TNF는 HA 염색 강도를 크게 증가시키지 않았으나, 배양된 신장 근위 세뇨관 상피 세포에서 보고된 케이블-유사 구조(Selbi et al. (2006) Kidney International. 70: 1287-1295)와 유사한 케이블-유사 구조를 유도하였다(도 38G). PTX3과 HA의 공편재화는 관찰되지 않았는데, 이것은 PTX3이 TNF 자극 후 HSF에서 HA와 회합되지 않았다는 것을 암시한다. 대조적으로, 양성 HA 염색은 세포외 매트릭스에서 HA와 공편재화되었기 때문에 세포 표면 및 세포외 매트릭스 상의 원섬유 네트워크로서 휴지기 AMSC에서 검출되었다(도 38C 및 6K). TNF는 PTX3 염색 강도 및 HA 원섬유의 양도 증가시켰다(도 38D 및 38K).
휴지기 AMEC에서, 양성 HA 염색은 약간의 원섬유 외관을 갖는 세포외 공간뿐만 아니라 세포가 치밀한 상태로서 존재하지 않는 산발적 영역에서도 발견되었다(도 38E 및 38L). PTX3과 HA의 공편재화도 AMEC에서 관찰되었다. TNF 처리는 PTX3 염색 강도 및 HA 원섬유의 양을 더 증가시켰다(도 38F). 이들 결과는 PTX3이 AMSC 및 AMEC에 의해 항시적으로 발현되었고 그의 발현이 TNF에 의해 더 증가될 수 있다는 것도 확인시켜주었다. 약한 양성 HC1 염색은 TNF로 처리되었거나(도 38G 및 38J) 처리되지 않은(데이터는 제시되어 있지 않음) 일부 HSF에서만 관찰되었고, 특히 HA 케이블-유사 구조로 HA와 공편재화되었다(도 38G). 그러나, 본 발명자들은 HC1과 PTX3의 공편재화를 인지하지 못하였다(도 38J). 대조적으로, 강한 양성 HC1 염색은 AMSC에서 인지되었고 세포막 상에서 HA와 공편재화되었고(도 38H) 세포질에서 PTX3과 공편재화되었다(도 38K). AMEC는 세포막에서 강한 양성 HC1 염색 및 HA와의 공편재화를 보였고(도 38I), 세포질 및 세포막에서 PTX3과의 공편재화를 보였다(도 38L). 종합하건대, 이들 결과는 HA-풍부 매트릭스가 AMSC, AMEC 및 HSF에서 아가로스 적층에 의해 효과적으로 포획되었고 무혈청 조건에서 AMSC 및 AMEC에서만 HC1 및 PTX3 둘다를 함유하였다는 것을 암시하였는데, 이것은 이러한 HC-HA/PTX3 복합체가 내생성 IαI에 의해 합성되었다는 것을 더 확인시켜준다.
아가로스 적층 하에서의 HC-HA/PTX3 복합체의 형성을 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 6 M GnHCl로 세포층을 추출하였고 NaOH로 처리하거나 처리하지 않으면서 무혈청 조건 및 혈청 함유 조건 하에서 AMSC 및 HSF 배양물에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 무혈청 HSF는 TNF 자극 및 NaOH 처리의 존재 또는 부재 하에서 170 kDa 및 140 kDa 종을 보였으나 대조군 PTX3에 상응하는 45 kDa 종을 보이지 않았는데, 이것은 이들 2개의 밴드들이 특이적인 밴드들이 아니라는 것을 암시한다(도 38D, 레인 2 내지 5). TNF를 갖는 혈청 함유 HSF는 무혈청 HSF에서 관찰된 종들과 유사한 희미한 140 kDa 종 및 일부 작은 MW 종들을 보였다(도 39, 레인 11 및 12). 대조적으로, 무혈청 AMSC는 약한 HMW PTX3 퍼진 밴드, 90 kDa 종 및 45 kDa 종을 보였는데(도 39, 레인 6), 이들 중 90 kDa 종 및 45 kDa 종은 각각 PTX3 이량체 및 단량체에 상응하였다(도 39, 레인 2). 이들 결과는 AME에서 관찰된 결과와 유사하였다(도 34). 무혈청 HSF에서 관찰된 것과 동일한 비특이적 170 kDa 종 및 일부 작은 분자 종도 관찰되었다. NaOH 처리는 HMW PTX3 퍼진 밴드를 증가시켰으나 PTX3 단량체 및 이량체(도 39, 레인 7) 및 다른 종들에는 영향을 미치지 않았다. TNF는 HMW PTX3 퍼진 밴드, PTX3 이량체 및 단량체, 및 다른 종들을 증가시켰다(도 39, 레인 8 및 9). TNF를 갖는 혈청 함유 AMSC는 강한 HMW PTX3 퍼진 밴드, 90 kDa PTX3 이량체 및 45 kDa PTX3 단량체를 보였다(도 39, 레인 13). NaOH 처리는 HMW PTX3 퍼진 밴드, 및 60 kDa 및 50 kDa에서의 2개의 종들을 크게 증가시켰다(도 39, 레인 14). NaOH가 HC와 HA 사이의 에스테르 결합을 절단하여 HC-HA의 용해를 유발하기 때문에, 이들 결과는 HMW PTX3이 HC-HA 복합체로부터 방출되었다는 것을 암시하였다. 종합하건대, 상기 결과는 AMSC가 PTX3을 함유하는 HC-HA 복합체를 생성하였으나 HSF는 이러한 복합체를 생성하지 않았다는 것을 암시하였다.
HC-HA/PTX3 복합체(rcHC-HA/PTX3)의 시험관내 재구성
HC-HA/PTX3 복합체가 어떻게 발생될 수 있었는지를 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 시험관내에서 HA, TSG-6, IαI 및 PTX3으로 HC-HA/PTX3 복합체를 재구성하고자 하였다. 먼저, 본 발명자들은 HA를 플라스틱 상에 고정시키고 재조합 TSG-6, 정제된 IαI 또는 혈청을 IαI의 공급원으로서 성공적으로 첨가하였다. TSG-6은 고체 표면 상에 고정화되는 HA에 결합함으로써 안정한 TST-6/HA 복합체를 형성할 수 있고(Wisniewski et al. (2005) J Biol Chem. 280:14476-84), 자유 TSG-6 및 HA-결합된 TSG-6 둘다가 HC를 IαI로부터 고정화된 HA로 전달하여 HC-HA를 형성할 수 있다는 것(Colon (2009) J Biol Chem. 284:2320-31)이 보고되었다. 항-IαI 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 예상된 바와 같이 대조군 iHA 단독에서만 어떠한 종도 검출하지 못하였다(도 40A, 레인 2). IαI 및 TSG-6이 iHA에 동시적으로 첨가되었을 때, 약한 220 kDa IαI, 85 kDa HC2, 강한 약 80 kDa HC1 및 50 kDa 종들이 검출되었는데(도 40A, 레인 3), 이것은 HC1 및 HC2 둘다가 TSG-6의 존재 하에서 iHA로 전달되어 HC-HA를 형성하였다는 것을 암시한다. HC1의 밴드 강도와 HC2의 밴드 강도의 비교는 HC2보다 더 많은 HC1이 TSG-6에 의해 iHA로 전달되어 절두된 50 kDa 종을 발생시켰다는 것을 암시하였다. PTX3이 IαI 및 TSG-6과 함께 iHA에 동시적으로 첨가되었을 때, IαI 종의 강도는 감소되었으나 HC1 강도는 PTX3 용량 의존적 방식으로 증가한 반면(도 40A, 레인 4 내지 6), HC2는 검출될 수 없었는데, 이것은 PTX3이 고정화된 HA로의 HC1의 전달(TSG-6이 촉매로서 작용하는 전달)을 주로 촉진하였으나 HC2의 전달을 촉진하지 않았다는 것을 암시한다. PTX3이 IαI 및 TSG-6의 동시적인 첨가 후 첨가되었을 때, HC1은 검출되었으나 IαI 또는 HC2는 검출되지 않았고, HC1 강도도 PTX3 용량 의존적 방식으로 증가하였는데(도 40A, 레인 7 내지 9), 이것은 PTX3이 고정화된 HA로의 HC1의 전달을 촉진하였으나 HC2의 전달을 촉진하지 않았다는 것을 확인시켜준다. 이들 결과는 PTX3이 독특하게 고정화된 HA로의 HC1의 전달을 주로 촉진함으로써 동시적으로 첨가되었든 아니면 순차적으로 첨가되었든 관계없이 HC1-HA 복합체를 형성하였다는 것을 암시하였다. 항-TSG-6 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 35 kDa TSG-6 단량체 및 75 kDa 이량체 둘다가 PTX3을 iHA 상의 IαI와 TSG-6 사이에 동시적으로 또는 순차적으로 첨가함으로써 형성된 rcHC-HA에서 검출되었다는 것을 보여주었다. TSG-6 밴드의 강도가 PTX3 용량 의존적으로 감소되었기 때문에, 이것은 고정화된 HA에 결합된 TSG-6이 PTX3과 경쟁할 수 있다는 것을 암시하였다(도 40B). 항-PTX3 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 PTX3이 IαI 및 TSG-6과 동시에 첨가되었을 때 희미한 사량체 및 이량체 밴드와 함께 적재 웰에서 뚜렷한 HMW PTX3 퍼진 밴드를 보여주었고 이들의 강도는 PTX3 용량 의존적 방식으로 증가되었다(도 40C, 레인 4 내지 6). 이 발견은 PTX3이 주로 강하게 rcHC-HA 복합체에 결합되었고, 이때 상기 결합이 8 M GnHCl 세척에 대한 저항성을 나타내었다는 것을 암시하였다. 대조적으로, PTX3이 IαI 및 TSG-6의 첨가 후 순차적으로 첨가되었을 때, 본 발명자들은 HMW PTX3, 및 사량체 및 이량체 종들을 검출하지 못하였는데(도 40C, 레인 7 내지 9), 이것은 PTX3과 먼저 형성된 rcHC-HA PTX3 사이의 결합이 8 M GnHCl 세척을 견딜만큼 강하지 않았다는 것을 암시한다. 따라서, 이들 시험관내 재구성 실험은 HC-HA/PTX3을 형성하기 위해서는 PTX3이 생체내에서 HA, IαI 및 TSG-6과 동시에 생성되어야 한다는 것을 암시하였다. 이 해석은 AMSC에 의해 형성된 세포외 매트릭스뿐만 아니라 생체내 조직 절편에서의 HA, HC 및 PTX3의 면역공편재화(immunocolocalization)에 의해 뒷받침되었다.
실시예 33: TGF-β1 신호전달에 대한 HC-HA 복합체의 효과
고정화된 HC-HA는 TGF-β1의 발현을 하향조절하되 TGF-β3 신호전달을 상향조절함으로써 TGF-β1 신호전달을 억제한다. TGF-β1 신호전달의 이러한 억제는 TGF-βRII 및 TGF-βRIII의 추가 억제 때문에 혈청 또는 외생성 TGF-β1의 첨가에 의한 챌린지를 견딜 수 있다. 결과적으로, 고정화된 HC-HA는 알파 평활근 형성의 SMAD2/3 신호전달 및 발현을 억제함으로써 각막 섬유아세포가 근섬유아세포로 분화하는 것을 방해한다. 이 작용은 각막 섬유아세포를 각막세포로 복귀시킬 정도로 충분히 강하다. HC-HA(불용성(I))는 추가 작은 류신 풍부 단백질(SLRP)로 구성된다는 점에서 HC-HA(가용성(S))와 상이하고, BMP들 및 이들의 수용체의 발현을 상향조절하여 TGF-β1 및 BMP 신호전달의 발현을 활성화시킴으로써 pSMAD1/5/8을 활성화시키고, 이들 작용들은 함께 응집의 형성을 더 촉진한다. 이들 작용들은 각막 섬유아세포를 신경 능선 전구체로 더 탈분화시킬 수 있다.
이 실시예에서, 외생성 TGF-β1 챌린지의 존재 또는 부재 하에서 인간 각막 섬유아세포에서 TGF-β 신호전달에 대한 고정화된 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA의 효과를 조사하였다. SMAD2/3 신호전달 및 αSMA 발현의 억제에 대한 HC-HA 복합체의 효과를 시험하였다.
실험 및 임상 연구는 냉동보존된 양막(AM)에 의한 흉터형성방지 치료 작용을 뒷받침한다. 본 발명자들의 연구는 중쇄-하이알루로난 복합체(HC-HA)가 독특하게 AM에 의해 생성되고 AM으로부터 정제될 수 있고 인간 각막 섬유아세포에서 TGF-β1 프로모터 활성을 억제한다는 것을 입증하였다. HC-HA가 TGF-β1 mRNA 및 단백질 발현을 억제하고 TGF-β1 신호전달을 방해하는 것으로 공지된 TGF-β3 mRNA 및 단백질 발현을 촉진하는지, 및 그렇다면 HC-HA에 의한 TGF-β 신호전달의 이러한 억제가 pSMAD2/3의 핵 전위의 억제로 해석되는지는 불명확하다.
마우스 각막세포는 AM 상에서 배양되는 경우 플라스틱 상의 무혈청 DMEM/ITS에서 또는 DMEM/10% FBS에서 미분화된 상태(케라토칸을 발현함)를 유지할 수 있다. 10% 혈청 또는 10 ng/㎖ TGF-β1을 사용한 무혈청 DMEM/ITS 중의 각막세포의 처리는 Smad2/3 인산화 및 핵 편재화(3시간), 및 α-SMA 발현(5일)을 유도한다. AM 상의 각막세포에서 혈청 또는 TGF-β1 처리에 의한 Smad2/3 및 α-SMA의 활성화는 억제된다(Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):27085-92). 본 발명자들의 연구는 HC-HA가 인간 각막 섬유아세포에서 TGF-β1 프로모터 활성을 억제한다는 것을 입증하였다. pSmad2/3 신호전달 및 α-SMA 형성은 HC-HA에 의해 억제될 것으로 예상되었다.
인간 각막 섬유아세포(또는 윤부 니치 세포, p3)를 전술된 바와 같이 48시간 동안 고정화된 HA, 가용성 HC-HA(PBS)(2X 또는 4X) 또는 불용성 HC-HA(GnHCl)(2X 또는 4X)를 갖거나 갖지 않는 플라스틱 접시 상에 접종하였다. 그 다음, 세포를 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않은 후 mRNA 정량 및 SMAD2/3 신호전달의 측정을 위해 수거하였다. TGF-β 수용체의 단백질을 측정하기 위해, 발현된 mRNA로부터 단백질이 발현될 시간을 허용하도록 단백질 샘플 채취 전에 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. TGF-β1 ELISA를 위해, 세포를 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않은 후, 24시간 (및 48시간) 동안 새로운 배지에서 배양하였다. 상청액을 TGF-β1 ELISA를 위해 채취하였다. TGF-β2 및 TGF-β3 ELISA를 위해, 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. TGF-β2 및 TGF-β3 ELISA를 위해 상청액을 채취하였다. 다양한 배양물에 대한 위상차 이미지를 72시간까지 촬영하였다.
하기 실험을 수행하였다:
1. 실시간 PCR에 의한 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 및 이들의 수용체들에 대한 mRNA 반정량: TGF-β 패밀리 및 이들의 수용체들의 mRNA 전사체 발현의 평가를 위해 이용되었다. 실시간 RT-PCR 프로파일은 95℃에서 10분의 초기 활성화에 이어서, 95℃에서의 15초 변성 및 60℃에서의 1분 어닐링 및 연장으로 구성된 40 주기로 구성되었다.
2. 면역염색에 의한 α-평활근 형성 및 SMAD2/3 신호전달의 측정: 표준 면역염색 절차를 이용하여 α-평활근 형성 및 SMAD2/3 신호전달을 모니터링하기 위해 수행되었다.
실험 1 및 2에 대한 실험군은 다음과 같았다:
Figure 112015012524150-pct00005
3. 웨스턴 블롯팅에 의한 TGF-βR의 정량: TGF-βRI, TGF-βRII 및TGF-βRIII의 단백질 농도를 이들의 상응하는 항체들(알앤드디 시스템스)를 사용하여 정량하는 데에 이용되었다. 적재 순서는 다음과 같았다:
Figure 112015012524150-pct00006
4. 배지 중의 TGF-β의 정량을 위한 ELISA: 알앤드디 시스템스의 콴티카인(Quantikine) 인간 TGF-β1 및 TGF-β2 ELISA 키트, 및 노르부스 바이올로지칼스(Norvus Biologicals)의 TGF-β3 ELISA 키트는 산에 의해 활성화된 세포 배양 상청액, 혈청, 혈장 및 소변에서 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β13을 측정하기 위해 고안된 고체상 ELISA들이다. 이들은 재조합 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 함유하고 재조합 인자를 정확하게 정량하는 것으로 밝혀졌다. 천연 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 사용하여 수득한 결과는 재조합 키트 표준물을 사용하여 수득한 표준 곡선과 평행한 선형 곡선을 보여주었다. 이들 키트들은 배지에서 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 측정하는 데에 사용되었다. 실험 4에 대한 실험군은 다음과 같았다:
Figure 112015012524150-pct00007
결과
DMEM/10%FBS에 시딩된 HCF는 불용성 HC-HA 상에서만 72시간까지 응집체를 형성하였다(도 41). 이러한 응집은 DMEM/ITS(인슐린/트랜스페린/셀레늄) 배지에서 24시간 혈청 결핍 후 지속되었다. 그 다음, 세포를 하기 3종의 상이한 배양 배지에서 배양하였다: A - 48시간 동안 DMEM/ITS; B - 24시간 동안 DMEM/ITS, 24시간 동안 DMEM/10% FBS; C - 24시간 동안 DMEM/ITS, 24시간 동안 10 ng/㎖ TGF-β1을 갖는 DMEM/ITS. HC-HA에서 배양된 세포는 4X HC-HA(Gn) 상에서 작은 응집체를 형성하나, 다른 배양 조건에서는 이러한 응집체를 형성하지 않는다(도 41). 그러나, 고정화된 기재 상의 DMEM/10% FBS에서 2시간 동안 시딩한 후, 대조군 상의 HCF만이 잘 부착되었다. HA 및 HC-HA[HC-HA(4X, PBS) 및 4X, GnHCl] 상의 세포들은 모두 둥근 형태를 가졌는데, 이것은 이들이 잘 부착되지 않았다는 것을 암시한다. 그러나, 72시간 동안 항온처리한 후, 모든 세포들이 잘 부착되었고 고정화된 HC-HA 상에서 훨씬 더 적은 세포가 존재하였다. 이들 기재들 상에서의 세포의 수는 HC-HA(4X, GnHCl)보다 HC-HA(4X, PBS) 상에서 더 컸다. HCF는 24시간의 배양 후 HC-HA(Gn) 상에서 응집체를 형성하기 시작하였고 72시간의 배양 후 보다 큰 응집체로 응축되었다. TGF-β1의 자극 후, 본 발명자들은 HC-HA(4X, PBS; 4X, Gn) 상에서 배양된 HCF의 응집을 관찰하였다.
요약하건대, HC-HA(Gn)는 TGF-β1의 챌린지의 존재 또는 부재 하에서 HCF의 응집을 촉진한 반면, HC-HA(PBS)는 TGF-β1의 챌린지 하에서 HCF의 응집을 촉진한다. 응집의 중요성은 공지되어 있지 않다.
DMEM/ITS에서 TGF-β1 및 TGF-β3 전사체의 발현은 HC-HA(Gn)에 의해 상승되었으나 TGF-β3 전사체의 발현은 HC-HA(PBS)에 의해 상승되었다(도 42). 자가유도에서 예상된 바와 같이, TGF-β1 및 TGF-β3 mRNA는 플라스틱 상에서 배양된 HCF에서 TGF-β1 챌린지에 의해 각각 4배 및 2배 증가되었는데, 이때 TGF-β1 단백질은 60 pg/㎖에서 105 pg/㎖로 상응하게 증가하였다(TGF-β3 단백질은 실험 오차로 인해 실험에서 검출되지 않았다). 무혈청 조건 하에서, 가용성 4X HC-HA는 TGF-β1 단백질 발현을 감소시켰다. 불용성 HC-HA도 TGF-β1 mRNA 발현의 촉진에도 불구하고 분비된 TGF-β1을 감소시켰지만, 분비된 TGF-β1은 DMEM/ITS에서 배양된 대조군보다 여전히 더 높았다. 추가로, 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA에 의한 TGF-βRII 및 TGF-βRIII의 현저한 억제가 관찰되었다. 결과적으로, 가용성 또는 불용성 HC-HA 상에서 배양된 HCF에서 자가분비 TGF-β 신호전달은 억제되었으나, 불용성 HC-HA 상에서 배양된 HCF에서 측분비 TGF-β 신호전달은 보존된다. 나아가, 가용성 4X HC-HA 및 불용성 4X HC-HA는 TGF-β1 자극이 없는 무혈청 조건 하에서 TGF-β3(TGF-β1 신호전달을 방해하는 것으로 공지되어 있음) mRNA 발현을 3배까지 상향조절하였다. TGF-β1에 의한 자극 하에서, TGF-β3 mRNA 발현은 HCF가 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA 상에서 배양되었을 때 각각 5배 및 8배까지 증가하는데, 이것은 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA가 TGF-β3 전사체 발현을 강하게 촉진한다는 것을 시사한다. 이들 결과도 AM으로부터 정제된 HC-HA가 TGF-β1 신호전달의 억제뿐만 아니라 TGF-β3 발현의 현저한 상향조절에 의해서도 AM의 흉터형성방지 작용을 촉진한다는 것을 시사한다. 본 발명자들의 결과로부터, HC-HA(PBS 및 Gn)가 mRNA 수준 및 단백질 수준 둘다에서 TGF-β2 발현에 영향을 미치지 않는 듯하다. 요약하건대, HC-HA(PBS)는 TGF-β1을 억제하나 TGF-β1로 챌린지된 HCF에서 TGF-β3 신호전달을 활성화시키는 반면, HC-HA(Gn)는 TGF-β1 및 TGF-β3 신호전달 둘다를 활성화시킨다.
플라스틱 대조군에서, TGF-βRII mRNA는 TGF-β 챌린지 하에서 8배까지 상향조절되었다(도 43). TGF-βII 및 TGF-βIII 수용체 mRNA는 무혈청 조건에서 HC-HA(PBS 및 Gn)에 의해 각각 2배 내지 8배까지 상향조절되었으나, TGF-β1 챌린지 하에서 완전히 억제되었다. HA의 경우에도 동일한 결과가 인지되었다. TGF-βRII 및 TGF-βRIII의 상응하는 단백질 발현은 HC-HA(각각 PBS 및 Gn) 상에서 배양된 HCF가 TGF-β에 의해 챌린지되었을 때 각각 3배 및 3배, 및 2배 및 3배까지 하향조절되었다. 이 상황 하에서, 이들 단백질 발현은 HA에 의해 변화되지 않았다. 이러한 하향조절은 AM에 의한 소염 및 흉터형성방지 효과의 기작을 부분적으로 설명할 수 있다. 요약하건대, TGF-βR2 및 TGF-βR3의 mRNA 발현은 HCF가 HA 및 HC-HA(PBS 및 Gn) 상에서 배양되었을 때 증가되었다.
면역염색은 HC-HA(PBS 및 Gn)가 TGF-β1로 챌린지되었거나 챌린지되지 않은 DMEM/ITS에서 pSMAD2/3 핵 전위를 억제하였다는 것을 시사하였다(도 44). 이러한 효과는 TGF-β를 사용한 경우 더 분명하였다. 이 발견은 TGF-β1, TGF-βRII 및 TGF-βRIII의 억제가 SMAD-매개된 신호전달의 억제로 해석되었다는 것을 더 확인시켜주었다.
추가로, 면역염색 결과는 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA 둘다가 TGF-β1의 챌린지 후 α-SMA 형성을 억제하였다는 것을 시사하는데, 이것은 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA에 의한 TGF-β1 신호전달의 이러한 억제가 TGF-β1을 첨가하였거나 첨가하지 않은 경우 근섬유아세포로의 HCF의 분화를 억제한다는 것을 더 뒷받침한다(도 45).
요약하건대, 가용성 HC-HA는 TGF-β1을 하향조절하되 TGF-β3 발현을 상향조절한 반면, 불용성 HC-HA는 무혈청 및 TGF-β1 챌린지 조건 하에서 HCF에서 TGF-β1 및 TGF-β3 발현 둘다를 상향조절한다. 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA가 TGF-βRII 및 TGF-βRIII 둘다의 발현을 하향조절하였기 때문에, 이들 변화는 pSMAD2/3의 핵 전위 및 알파 평활근 형성의 억제의 결여에 의해 입증된 바와 같이 TGF-β 신호전달의 억제를 초래하였다.
실시예 34: BMP 신호전달에 대한 HC-HA 복합체의 효과
이 실시예에서, BMP 신호전달에 대한 추가 TGF-β1을 갖는 고정화된 HC-HA의 효과를 조사하였다. pSMAD1/5/8의 활성화를 통한 BMP 신호전달의 활성화도 확인되었다.
BMP1-3, BMP3b, BMP4-7, BMP8a, BMP8b 및 BMP9-15를 비롯한 BMP들은 TGF-β 수퍼패밀리의 하위군을 구성한다. BMP는 I형 수용체를 활성화시켜 Smad1, Smad5 및 Smad8을 인산화시킴으로써 pSmad1/5/8의 핵 전위를 발생시키는 II형 수용체(ALK2, ALK3 또는 ALK6)에 결합한다(문헌(Massague 2000; Herpin, 2007)에서 검토됨). 어떤 특이적 BMP들 및 BMP 수용체들이 HCF에 존재하는지, 존재하는 경우 TGF-β 신호전달이 억제될 때 BMP 신호전달이 HC-HA(PBS 및 Gn) 및 추가 TGF-β1에 의해 활성화될 수 있는지, 활성화되는 경우 BMP들 및 BMP 수용체들 중 어떤 형태가 BMP 신호전달의 조절에 있어서 주된 역할을 수행하는지, 및 BMP 신호전달의 이러한 활성화가 pSMAD1/5/8을 통해 달성되는지는 명확하지 않았다.
인간 각막 섬유아세포를 48시간 동안 고정화된 HA 또는 HC-HA PBS(4X) 또는 HC-HA Gn(4X)을 갖거나 갖지 않는 플라스틱 상에 시딩한 후, 전술된 바와 같이 mRNA 정량 및 pSMAD1/5/8의 측정을 위해 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. BMP 수용체의 단백질을 측정하기 위해, 단백질 발현을 허용하도록 단백질 샘플의 채취 전에 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. BMP ELISA를 위해, 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. BMP ELISA를 위해 상청액을 채취하였다. 다양한 배양물들에 대한 위상차 이미지를 72시간까지 촬영하였다.
배양물에 대해 하기 실험들을 수행하였다:
1. 실시간 PCR에 의한 BMP들 및 이들의 수용체들에 대한 mRNA 반정량: BMP 패밀리 및 이들의 수용체들의 mRNA 전사체 발현의 평가를 위해 이용되었다.
2. 면역염색에 의한 α-평활근 형성 및 SMAD1/5/8 신호전달의 측정: α-평활근 형성 및 SMAD2/3 신호전달을 면역염색으로 모니터링하기 위해 수행되었다.
실험 1 및 2에 대한 실험군은 다음과 같다:
Figure 112015012524150-pct00008
3. BMPR1A, BMPR1B 및 BMPR2 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 BMPR의 정량: BMPR1A, BMPR1B 및 BMPR2 각각의 단백질 농도를 정량하는 데에 이용되었다. 적재 순서는 다음과 같았다:
Figure 112015012524150-pct00009
4. 배지 중의 BMP들의 정량을 위한 ELISA: 본 발명자들은 배지 중의 BMP들을 측정하기 위해 BMP ELISA 키트(알앤드디 시스템스)를 사용하였다. 실험 4에 대한 실험군은 다음과 같다:
Figure 112015012524150-pct00010
결과
휴지기 상태 하에서 HA, HC-HA(PBS) 및 HC-HA(Gn)는 BMP6의 전사체 발현을 각각 7배 및 4배까지 활성화시킨다(도 46). TGF-β1의 존재 하에서 HA, HC-HA(PBS) 및 HC-HA(Gn)는 HCF에서 BMP4의 전사체 발현을 각각 6배, 11배 및 6배까지 활성화시키고 BMP6의 mRNA 발현을 각각 30배, 37배 및 46배까지 활성화시키는데, 이것은 HA, 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA가 BMP4/6 발현을 상향조절할 수 있지만, 추가 TGF-β1이 BMP4 및 BMP6 신호전달을 더 현저히 상향조절한다는 것을 시사한다. BMP7 및 BMP9는 검출되지 않았다.
TGF-β1 자체가 BMPR1A의 전사체 발현을 활성화시키지 않았지만, HC-HA(PBS) 및 HC-HA(Gn) 둘다가 TGF-β1의 존재 하에서 BMPR1A의 전사체 발현을 각각 7배 및 3배까지 활성화시키나 HA는 이처럼 활성화시키지 않는데, 이것은 BMPR1A가 HC-HA+TGF-β1에 의해 활성화된 BMP 신호전달에 있어서 주된 역할을 수행할 수 있다는 것을 시사한다(도 47). 추가로, TGF-β1은 BMPR1B를 3배까지 활성화시키고 BMPR2를 3배까지 활성화시키는데(그러나, HA, HC-HA(PBS) 및 HC-HA(Gn)를 갖거나 갖지 않는 플라스틱 상에서는 4배까지 활성화시킴), 이것은 TGF-β1 자체가 BMPR1B 및 BMPR2의 mRNA 발현을 비특이적으로 활성화시킨다는 것을 시사한다. HC-HA(PBS) 또는 HC-HA(Gn)는 BMPR2의 전사체 발현을 4배까지 향상시킨다. BMP-BMPR1A는 SMAD1/5/8 신호전달을 활성화시킬 것으로 예상되는 반면, BMP-BMPRII는 비-SMAD 신호전달을 활성화시킨다.
면역형광 결과는 TGF-β1 자체가 사용된 기재에도 불구하고 HCF에서 pSMAD1/5/8의 핵 전위를 적절하게 활성화시킨다는 것을 시사한다(도 48). HC-HA(PBS 및 Gn)는 pSMAD1/5/8을 갖는 보다 많은 핵 및 pSMAD1/5/8의 보다 더 강한 핵 염색에 의해 입증된 바와 같이 pSMAD1/5/8의 핵 전위를 통한 BMP4/6 신호전달의 활성화를 강력히 촉진한다.
ID1은 SMAD1/5/8 신호전달에 의해 조절되는 공지된 다운스트림 유전자인 전사 인자의 염기성 HLH 패밀리의 구성원과 이종이량체를 형성할 수 있는 나선-루프-나선(HLH) 단백질이다. 본 발명자들의 결과는 HCF가 HC-HA(PBS) 및 HC-HA(Gn) 상에서 배양되었을 때 SMAD1/5/8의 활성화가 ID1 mRNA를 각각 4배 및 8배까지 상향조절하였다는 것을 입증하였는데, 이것은 HCF에서의 SMAD1/5/8 신호전달이 실제로 HC-HA + TGF-β에 의해 활성화된다는 것을 시사한다(도 49). ID1이 DNA 결합 활성을 갖지 않으므로 그와 상호작용하는 염기성 HLH 단백질의 DNA 결합 및 전사 활성화 능력을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 ID1이 세포 생장, 노화 및 분화에 있어서 중요한 역할을 수행할 것으로 예상한다.
실시예 35: 근섬유아세포 분화, 및 각막세포 또는 보다 어린 전구세포로의 인간 각막 섬유아세포의 복귀에 대한 HC-HA 복합체의 효과
각막 기질에 묻혀있는 신경 능선 유래의 독특한 세포 집단인 각막세포는 각막 특이적 케라토칸을 비롯한 케라탄 설페이트 함유 프로테오글리칸을 발현한다. 케라토칸(Kera)은 성체 척추동물 눈 내의 각막 특이적 케라탄 설페이트 프로테오글리칸(KSPG)이다. 케라토칸은 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP) 유전자 패밀리에 속하고 척추동물 각막 기질에서 세포외 KSPG의 주요 성분들 중 하나이다. 각막 KSPG는 각막 투명성에 대한 책임이 있는 매트릭스 조립에 있어서 중추적인 역할을 수행한다. 루미칸은 각막 KSPG의 약 절반을 차지한다. 남은 각막 케라탄 설페이트의 대부분은 케라토칸을 변경시킨다. 성체 조직에서, 케라토칸은 각막 기질로 한정되고, 케라토칸 발현은 각막세포에 대한 표현형 마커인 것으로 간주된다(Liu et al.(2003) J. Biol Chem. 278(24):21672-7; Carlson et al. (2005) J Biol Chem. 280(27):25541-7). 플라스틱 접시 상에서 인간, 소 및 토끼 각막세포들은 혈청 함유 배지에서 배양되었을 때 그들의 특징적인 수지상 형태 및 케라토칸 발현을 상실한다(Espana et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12): 5136-41; Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985-91). 이들 노출된 세포들은 케라탄 설페이트 함유 프로테오글리칸, 케라토칸 및 CD34의 발현을 하향조절하고, 콘드로이틴-데르마탄 설페이트 함유 프로테오글리칸 및 α-SMA의 발현을 상향조절하는데, 이것은 이들 세포들이 더 분화되게 된다는 것을 시사한다.
종래 연구는 인간(Espana et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12): 5136-41; Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985-91) 및 뮤린(Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):27085-92) 각막세포가 Smad 신호전달 경로의 하향조절로 인해 TGF-β를 혈청 함유 배지에 첨가할 때조차도 AM 기질 표면 상에서 배양될 때 α-SMA 발현 근섬유아세포로 분화되지 않으면서 그들의 표현형을 유지할 수 있다는 것을 보여주었다. 양막 기질은 배양물에서 발현되는 케라토칸을 유지할 수 있고 각막세포가 근섬유아세포로 분화하는 것을 방해한다(Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):27085-92). 각막세포는 수지상 형태를 유지하였고 적어도 5회 계대배양(1:2 분할에서) 동안 각막 기질 특이적 케라토칸을 계속 발현하였고, 혈청 함유 조건 또는 TGF-β1의 첨가 하에서 α-SMA를 발현하지 않았다(Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985-91). 뮤린 각막세포도 그들의 정상적인 표현형을 상실하지 않으면서 적어도 8회 계대배양 동안 AM 상에서 증폭될 수 있고, Smad-매개된 TGF-β 신호전달 경로의 억제는 케라토칸 발현 표현형을 유지하는 데에 있어서 중추적이다(Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):27085-92). 이 실시예에서 고정화된 HC-HA가 동일한 작용을 수행할 수 있는지, 및 수행할 수 있다면 추가 TGF-β1이 그들의 결과에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하였다.
결과
HA는 케라토칸 mRNA 발현을 4배까지 상향조절하였다(도 50). 인간 각막 섬유아세포를 48시간 동안 고정화된 HA를 갖거나 갖지 않는 플라스틱 상에 시딩하고, 24시간 동안 혈청을 제공하지 않은 후, 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않은 다음, mRNA 정량 및 SMAD2/3 신호전달의 측정을 위해 수거하였다. TGF-β 수용체의 단백질을 측정하기 위해, 단백질 발현이 mRNA 발현보다 뒤처지기 때문에 단백질 샘플의 채취 전에 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. TGF-β1 ELISA를 위해, 세포를 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않은 후, 24시간 (및 48시간) 동안 새로운 배지에서 배양하였다. TGF-β1 ELISA를 위해 상청액을 채취하였다. TGF-β2 및 TGF-β3 ELISA를 위해, 세포를 48시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않았다. TGF-β2 및 TGF-β3 ELISA를 위해 상청액을 채취하였다, 예상된 바와 같이, 고정화된 HC-HA는 케라토칸의 mRNA 발현을 14배 및 16배까지 촉진하였는데, 이것은 HCF가 TGF-β1 없이 HC-HA 상에서 배양되었을 때 훨씬 더 어리다는 것을 시사한다. TGF-β1 챌린지 후, 케라토칸의 mRNA 발현은 플라스틱 및 HA 상에서 급격히 하향조절되었다. 그러나, 케라토칸 발현은 HC-HA(가용성, PBS) 상에서 3배 수준으로 여전히 유지되었다. 케라토칸의 발현은 HC-HA(불용성, Gn) 상에서 존재하지 않았다. 본 발명자들은 HC-HA(I) 상에서의 생성된 표현형이 각막세포보다 훨씬 더 어릴 것이라고 예상한다.
상응하게, 고정화된 HC-HA(I/S)는 케라토칸의 단백질 수준을 8배 및 10배까지 촉진하였는데, 이것은 HCF가 HC-HA(S/I) 상에서 배양되었을 때 실제로 각막세포로 복귀되었다는 것을 시사한다(도 51). 본 발명자들은 HA(케라토칸 mRNA의 4배 증가) 및 4X HC-HA(PBS)(케라토칸 mRNA의 3배 증가)를 비롯한 시험된 다른 처리에 의한 임의의 상응하는 케라토칸 단백질 발현을 관찰하지 못하였는데, 이것은 케라토칸 mRNA의 이러한 적절한 증가가 케라토칸의 상응하는 단백질 발현을 촉진하기에 충분하지 않았다는 것을 시사한다.
실시예 36: HCF에서 ESC 마커 발현에 대한 HC-HA 복합체의 효과
실시예 35는 HCF가 외생성 TGF-β1에 의한 챌린지 하에서 근섬유아세포로 분화되는 것을 방해받았을 뿐만 아니라 외생성 TGF-β1의 존재 또는 부재 하에서 케라토칸의 발현을 갖는 각막세포로 다시 복귀하였다는 것도 입증하는 충분한 증거를 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은 HCF가 특히 고정화된 HC-HA(불용성, GnHCl) 상에 시딩되었을 때 TGF-β 신호전달을 억제하고 BMP 신호전달을 촉진하지만 케라토칸 발현을 차단하는 것으로 밝혀진 외생성 TGF-β1에 의해 보다 어린 전구세포로 더 재프로그래밍될 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 최근에 다수의 마커들이 혈관신생 전구세포에서 발견된다고 보고하였기 때문에 ESC 및 내피 전구세포 및 주연세포에서 다수의 마커의 발현이 발견되는지를 조사하였다. HC-HA에 의해 조절된 이들 조건들 하에서 HCF의 잠재적인 재프로그래밍을 더 알아보기 위해, 본 발명자들은 성체 분화된 섬유아세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 핵심 역할을 수행하는 것으로 보고된 4종의 핵심 전사 인자, 즉 Sox2, Oct4, c-Myc 및 KLF4의 발현도 조사하였다.
결과
유전자 발현 검사를 상기 실시예 35에 기재된 HCF 배양물에 대해 수행하였다. 결과는 HCF가 플라스틱 대조군과 비교될 때 4X HC-HA 상에서 보다 많은(2배 내지 6배) ESC 마커, 예컨대, cMYC, KLF-4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, SOX-2 및 SSEA-4를 발현하였고 HCF가 외생성 TGF-β1에 의해 챌린지되었을 때조차도 2배 내지 4배 더 많은 ESC 마커를 발현하였다는 것을 시사하였다(p<0.05, n=3)(도 52). 이들 결과는 HC-HA, 특히 HC-HA(불용성)가 HCF를 보다 어린 전구세포로 재프로그래밍할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 37: 용액 중의 HC-HA는 MC3T3-E1 세포 생존력 및 분화에 영향을 미침으로써 골형성을 억제한다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 미분화된 MC3T3-E1 세포의 생존력 및 분화에 대한 용액 중의 HC-HA(가용성 분획) 및 HA의 효과를 평가하였다. MC3T3-E1은 C57BL/6 마우스로부터 확립된 조골세포성 세포주이다. MC3T3-E1 세포는 조골세포 및 파골세포로 분화하는 능력을 갖고 시험관내에서 석회화된 골 조직을 형성하는 것으로 입증되었다.
다양한 농도의 HA(1, 5, 25 및 100 ㎍/㎖) 또는 HC-HA(1, 5 및 25 ㎍/㎖)를 갖거나 비히클 대조군으로서 PBS를 갖는 완전 배지(α-MEM, 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 MC3T3-E1 세포를 배양하고 플라스틱 세포 배양물로 처리된 96웰에 1.6 x 104개 세포/㎖의 밀도로 시딩하였다. 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다. 결과는 550 nm에서의 흡광도가 25 ㎍/㎖ HC-HA를 제외한 모든 조건들에서 24시간부터 48시간까지 증가하였다는 것을 보여주었는데, 이것은 세포 증식이 대조군, 1 내지 100 ㎍/㎖의 HA, 및 1 내지 5 ㎍/㎖의 HC-HA에서 정상적으로 진행한다는 것을 암시한다(도 53).
다음으로, 조골세포로의 MC3T3-E1의 분화에 대한 HC-HA 또는 HA의 영향을 조사하였다. MC3T3-E1 세포를 비-유도 배지에 재현탁하고(1.6 x 105/㎖) 96웰에 시딩하고 전면생장률까지 항온처리하였다. 비-유도 배지를 제거하고 유도 배지 1(0.2 mM 아스코르브산 2-포스페이트 및 10 mM 글리세롤 2-포스페이트를 갖는 완전 배지, 시험관내 골형성 분석 키트에 대한 제조자의 설명서, 카탈로그 번호 ECM810, 밀리포어)을 첨가하였다. 12일의 분화 후, 알리자린 레드 염색을 사용하여 조골세포 광물화를 측정하고 정량하였다. 결과는 AR이 실제로 대조군에서 유도 배지에 의해 촉진되었다는 것을 보여주었다. 종래 보고(Kawano (2011) Biochemical and Biophysical Research Communications. 405: 575-580)와 일치하여, 100 ㎍/㎖ HA는 대조군과 비교될 때 AR 염색을 더 촉진하였으나 25 ㎍/㎖ HA는 촉진하지 못하였다. 대조적으로, AR 염색은 5 ㎍/㎖ HC-HA(p=0.11)에 의해 감소되지 않았으나 25 ㎍/㎖ HC-HA(p=0.00002)에 의해서는 유의하게 감소되었다(도 54). 이들 결과는 유도 동안 HC-HA 농도의 증가도 골형성을 감소시켰다는 것을 암시하였다.
실시예 38: MC3T3-E1 모델 시스템을 사용한 조골세포 분화에 대한 HC-HA 및 AMP에 대한 용량 의존적 반응
종래 발견은 HC-HA 및 AMP가 RANKL에 의해 유도된 RAW264.7 세포로부터의 파골세포 분화를 용량 의존적으로 억제한다는 것을 보여주었다(국제 PCT 공보 제WO 2012/149486호 참조). AMP(양막 분말)는 양막의 동결건조된 후 분쇄된 형태이다. 이 실시예에서, 골형성에 대한 HC-HA 및 AMP의 IC50을 측정하고 파골세포형성에 대한 IC50과 비교하였다.
알칼리성 포스파타제(ALP) 분석 및 알리자린 레드 염색(AR-S)은 MC3T3-E1 세포의 분화를 측정하기 위해 사용되는 2종의 분석이다. ALP는 조골세포에 의해 배출되고 오랫동안 조골세포 활성에 대한 널리 인식된 생화학적 마커이었으므로(Sabokbar (1994) Bone Miner. 27(1):57-67) 골형성에 대한 초기 마커로서 사용된다. 알리자린 레드(AR) 염료는 칼슘과 함께 킬레이트를 형성하므로, AR-S는 광물화를 가시화하는 데에 사용된다. ARS 염료는 용이하게 추출될 수 있기 때문에 광물화의 정량으로 전환될 수도 있다(Gregory et al. (2005) Analytical Biochemistry 329: 77-84).
파트 A
실험 디자인:
MC3T3-E1 배양
10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM(인비트로겐, 카탈로그 번호 ICM810)의 기초 배지로 구성된 밀리포어 시험관내 골형성 키트로부터의 MC3T3-E1 세포의 모델 시스템을 사용하였다. 세포를 50,000개 세포/cm2로 시딩하고 37.0℃에서 100 ㎖ 세포 배양 접시에서 95% 공기 및 5% CO2 하에서 배양하고 전면생장 전에 계대배양하였다. 일단 충분한 세포 수가 수득되면, 세포를 웰(52개 웰) 당 100 ㎕ 부피의 기초 배지를 갖는 96웰 배양 접시에서 1.6 x 105개 세포/㎖의 밀도로 시딩하였다. 각각의 농축을 4개 웰(ALP 분석을 위해 2개 웰 및 AR-S 염색을 위해 2개 웰)에서 수행하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 습한 공기 하에서 배양하고 배지를 전면생장까지 48시간 내지 72시간마다 교체하였다.
연구될 용량 범위를 조골세포 분화에서 수행된 예비 데이터(상기 참조) 및 파골세포 분화에 대한 HC-HA 및 AMP에 대한 용량 반응 곡선으로부터 유도하였다. 25 ㎍/㎖의 HC-HA가 MC3T3-E1 세포 증식 및 조골세포로의 분화를 유의하게 억제하였고 RAW264.7 세포로부터의 파골세포 분화를 완전히 억제하였기 때문에(국제 PCT 공보 제WO 2012/149486호 참조), 상기 농도를 가장 높은 농도로서 선택하였다. 5 ㎍/㎖의 HC-HA가 50% 미만의 억제를 보였기 때문에(이것은 조골세포 분화에 대한 HC-HA의 IC50이 P-214에서의 IC50보다 더 높을 것임을 암시함), 0.1, 0.5, 1, 5, 10 및 25 ㎍/㎖ 범위 내의 HC-HA 농도를 선택하였다. HC-HA에 대한 예비 데이터를 기초로 하기 농도의 AMP를 선택하였다: 1, 5, 25, 125 및 250 ㎍/㎖. ALP 활성은 MC3T3-E1 세포에서 분화의 12일째 날에 정점에 도달하기 때문에(Maeda (2004) Journal of Cellular Biochemistry 92:458-471;Wang, (2008) J Dent Res. 87(7):650-654), 본 발명자들은 유도 후 12일째 날에 골형성을 연구하기로 선택하였다.
전면생장 시, 각각의 웰로부터의 배지를 100 ㎕의 골형성 유도 배지 #1로 교체하였다. 골형성 유도 배지는 0.2 mM 아스코르브산 2-포스페이트 및 10 mM β-글리세롤포스페이트를 함유한다(시험관내 골형성 분석 키트, 카탈로그 번호 ECM810, 밀리포어). 10 ㎕의 AMA 및 HC-HA 작업 용액을 유도 배지 #1에 첨가하였다(AMP의 저장 용액(AMP-4; 로트 번호 CB102971, 국제 PCT 공보 제WO 2012/149486호 참조)(5 mg/㎖) 및 HC-HA(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284(30): 20136-20146)(250 ㎍/㎖)를 PBS에서 제조하고 각각의 실험 농도(HC-HA의 경우 0.1, 0.5, 1, 5, 10 및 25 ㎍/㎖; 및 AMP의 경우 1, 5, 25, 125 및 250 ㎍/㎖)를 위해 적절한 배양 배지(골형성 유도 배지 #1)로 희석하였다. 배지를 3일마다 교체하였다.
분화 6일째 날, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌을 함유하는 100 ㎕의 새로운 골형성 유도 배지 #2로 배지를 교체한다. 10 ㎕의 AMP 및 HC-HA 작업 용액을 100 ㎕의 골형성 유도 배지 #2(0.2 mM 아스코르브산 2-포스페이트, 10 mM 글리셀롤 2-포스페이트 및 50 nM 멜라토닌 용액, 시험관내 골형성 분석 키트에 대한 제조자의 설명서, 카탈로그 번호 ECM810, 밀리포어)에 첨가하여 배양 웰에서 최종 실험 농도를 만들었다. 배지를 2일 내지 3일마다 교체하였다. 그 다음, 샘플을 제조자의 설명서(시험관내 골형성 분석 키트, 카탈로그 번호 ECM810)에 따라 ALP 분석(H-156) 및 ARS 염색 분석으로 분석하였다.
알리자린 레드 S 염색
세포를 교란시키지 않으면서 각각의 웰로부터의 배양 배지를 흡입하였다. 세포를 200 ㎕ PBS로 1회 세척하였다. 100 ㎕의 70% 에탄올을 첨가하고 실온에서 15분 동안 항온처리함으로써 세포를 고정시켰다. 그 다음, 고정제를 제거하고, 세포 단일층을 교란시키지 않으면서 세포를 과량의 증류수로 3회(매회 5분) 린싱하였다. 물을 제거하고 100 ㎕/웰의 알리자린 레드 염색 용액을 첨가하였다. 웰을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 과량의 염료를 제거하고 세포를 (세척할 때마다 5분 동안 약하게 흔들면서) 탈이온수로 4회 세척하였다. 0.1 내지 0.15 ㎖의 물을 각각의 웰에 첨가하여 세포가 건조되지 않게 하였다. 염색된 세포를 현미경 하에서 사진촬영하였다.
그 다음, 과량의 물을 각각의 웰로부터 제거하였다. 100 ㎕의 10% 아세트산을 각각의 웰에 첨가하고 30분 동안 진탕하면서 항온처리하였다. 느슨하게 부착된 단일층을 세포 스크래퍼로 조심스럽게 제거하고 세포 및 아세트산을 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 30분 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 샘플을 10분 동안 85℃까지 가열한 후 5분 동안 얼음으로 옮겨 튜브를 냉각시켰다. 튜브 내의 슬러리를 20,000xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 400 ㎕의 상청액을 제거하고 새로운 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 150 ㎕의 10% 수산화암모늄을 사용하여 pH를 4.1 내지 4.5 범위 내로 중화시켰다. 150 ㎕의 각각의 샘플을 투명 바닥 96웰 플레이트에 첨가하고 OD405에서 판독하였다. 알리자린 레드 농도 대 OD405의 도표를 작도하였다.
ALP 분석(바이오분석 시스템: 콴티크롬(QuantiChrom) ALP 분석 키트, 카탈로그 번호 DALP-250)
각각의 웰(96웰 플레이트) 내의 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 20분 동안 진탕함으로써 증류수 중의 100 ㎕ 0.2% 트리톤 X-100에서 용해시켰다. 200 ㎕의 증류수 및 200 ㎕의 보정제 용액(키트에 의해 공급됨)을 대조군을 위한 별도의 웰 내로 옮겼다. 50 ㎕ 샘플을 별도의 웰 내로 옮겼다. 150 ㎕의 작업 용액(200 ㎕ 분석 완충제, 5 ㎕ 아세트산마그네슘(5 mM), 2 ㎕ pNPP 액체 기질(10 mM))을 샘플 웰에 첨가하였다(최종 반응 부피는 200 ㎕이었다). 플레이트를 짧게 톡톡쳐서 혼합하였다. OD405를 플레이트 판독기 상에서 0분 및 4분에 판독하였다.
결과
위상차 현미경관찰
음성 대조군은 13일의 유도 기간 전체에서 육각형을 유지하였다(도 55). 단일층은 양성 대조군보다 더 매끄러웠는데, 이것은 보다 많은 세포 또는 보다 많은 세포층이 후자에서 발생하였다는 것을 암시한다. 양성 대조군에서의 세포는 유도 시작 후 형태 면에서 방추형이 되었다. 시간이 경과함에 따라, 방추-유사 고리가 대략 유도 4일째 날에 플라스틱 배양물의 가장자리(약 2 내지 3 mm 떨어져 있음)를 따라 발생하였다.
0.1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 HC-HA에서 세포 단일층은 양성 대조군과 상이하지 않았는데, 이것은 이들 농도들에서의 HC-HA가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다(도 55A). 양성 대조군과 마찬가지로, 세포도 방추형 형태를 발생시켰고, 단일층은 방추-유사 고리를 발생시켰다. 그러나, 25 ㎍/㎖에서 세포 밀도의 급격한 감소 및 세포 형태의 변화가 유도 13일째 날에 관찰되었다.
25 ㎍/㎖ 초과의 농도에서, AMP는 단일층 상에 침전되는 입자를 침착시켰다(도 55B). AMP 농도가 각각의 배지 교체 후 보충되었기 때문에, 단일층 상부 상의 AMP 침착물은 유도 기간 전체에서 증가하였다. 125 ㎍/㎖ 미만의 AMP를 사용한 처리는 세포가 마찬가지로 방추 고리를 갖는 방추형 형태를 발생시켰기 때문에 세포 형태에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 AMP가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다. 125 ㎍/㎖ 초과의 농도에서 AMP 입자 밀도는 방추 고리 형성의 가시적 관찰을 방해할 정도까지 증가하였다. 그러나, 세포 밀도 및 형태는 양성 대조군의 세포 밀도 및 형태로부터 변화되지 않은 상태로 유지되었는데, 이것도 AMP가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 확인시켜준다.
알리자린 레드 염색
음성 대조군은 밝은 분홍색을 보이는 단일층의 일부와 함께 청회색 배경색을 발생시켰다. 대조적으로, 양성 대조군은 장밋빛 분홍색 배경을 발생시켰다(도 56).
0.1 ㎍/㎖ HC-HA는 적갈색으로 염색되는 가시적 방추 고리와 함께 녹빛 적색(rust red)을 발생시켰는데, 이것은 양성 대조군과 현저히 상이하였다(도 56A). 이 경향은 0.5 ㎍/㎖부터 1 ㎍/㎖까지 계속되었고 10 ㎍/㎖에서 색채가 약간 밝아졌는데, 이것은 광물화가 0.1 ㎍/㎖부터 5 ㎍/㎖까지 유지되었고 0 내지 0.1 ㎍/㎖에서 용량 의존적 관계가 있을 것임을 암시한다. 25 ㎍/㎖ HC-HA에서, 녹빛 적색 배경은 사라졌고 세포 연접부 사이의 두드러진 백색 갭을 가지면서 밝은 자주-분홍색으로 되돌아갔다.
1 ㎍/㎖ 내지 125 ㎍/㎖의 AMP는 보다 밝은 녹빛 갈색(rust brown)(1 ㎍/㎖)(이 색채는 0.1 ㎍/㎖ HC-HA보다 더 밝은 듯함)으로부터의 용량 의존적 색채 변화를 발생시켰는데, 이것은 용량 반응이 녹빛 적색 배경(5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖) 및 적갈색(125 ㎍/㎖)까지 보다 점진적이었고 250 ㎍/㎖에서 어두운 적갈색까지 급격히 증가하였다는 것을 암시한다(도 56B). AMP 입자는 5 ㎍/㎖ 초과의 AMP로 처리된 세포 단일층의 상부 상에서 발견되었고 입자 크기는 세포 자체보다 더 작았고 염색된 배경의 색채와 일치하는 듯하였다는 것을 주목한다.
OD 값의 정량 분석에 의해 측정되었을 때, 0.1 ㎍/㎖ HC-HA의 처리 시 ARS 염색이 통계적 유의성(p < 0.05)을 가지면서 양성 대조군으로부터 3배 증가하였다(도 57A). 작은 샘플 크기(N=2)에 기인할 수 있는, 농도 0.1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖에서의 일부 편차가 관찰되었다. 25 ㎍/㎖ HC-HA 처리에서 급격한 OD 값 감소가 관찰되었다. AMP의 경우, 125 ㎍/㎖ 초과의 AMP를 사용한 처리는 양성 대조군으로부터의 광물화의 양을 2배로 증가시켰고 통계적으로 유의하였다(p < 0.05)(도 57B). 양성 대조군으로부터의 작은 OD 값 감소는 1 ㎍/㎖ AMP에서 관찰되었고, 1 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖에서 OD 값의 작은 용량 의존적 증가가 존재하였다. OD405는 125 ㎍/㎖에 비해 250 ㎍/㎖ AMP에서 감소하였다. 일부 편차는 작은 샘플 크기(N=2)에 기인할 수 있다.
ALP 염색
두 AM 유도체들 군에서, 음성 대조군은 양성 대조군보다 5배 더 많은 ALP 활성을 보였는데, 이것은 샘플 크기를 감소시키는 음성 대조군에서의 샘플의 손실로부터 발생되었을 수 있다(도 58). 표준 편차 값에 기여한 보다 작은 샘플 크기는 양성 대조군보다 음성 대조군의 경우 8배 더 높고, 이 훨씬 더 큰 편차는 증가에 기여할 수 있다.
임의의 양의 HC-HA를 사용한 유도된 MC3T3-E1의 처리는 양성 대조군 및 음성 대조군에 비해 ALP 활성을 감소시켰다(도 58A). ALP 활성은 ALP 활성이 유의하게 떨어지는 25 ㎍/㎖까지 상이한 농도 군들 사이에 상이하였다. 각각의 실험군 및 양성 대조군에서 평균으로부터의 편차는 거의 없었다는 것을 주목할 가치가 있다.
1 ㎍/㎖에서, ALP 활성은 양성 대조군보다 거의 4배 더 높았다(도 58B). 이 현상은 5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖에서 차단되었고, 이때 ALP 활성은 양성 대조군으로부터 거의 3배 감소하였다. 125 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖까지의 농도 증가는 ALP 활성을 1 ㎍/㎖에 가까운 수준까지 회복시켰다. 따라서, ALP 활성은 광물화의 양과 일치하지 않는 것처럼 보였다.
결과 요약
음성 대조군에 비해 양성 대조군은 보다 많은 방추형 세포 및 플라스틱 웰의 가장자리 주변에서 형성된 "고리"(도 55A), 알리자린 염색에 의한 색채의 변화(도 56A), 및 검출가능하지만 유의하지 않은 OD405의 변화(도 57A)를 나타내었다. 종래, 35 mm 플라스틱 접시 당 5 x 104개 세포의 밀도로 시딩된 MC3T3-E1 세포는 4일째 날 후 적층된 콜라겐 원섬유의 형성, 18일째 날까지 적층된 원섬유 및 유도 21일째 날까지 결절 영역의 형성도 나타내었다(Sudo (1983) J. Cell. Biol. 96: 191-198). 이 종래 연구는 본 발명자들이 관찰한 고리 형성과 동일한 고리 형성을 인지하지 못하였다. [대안적으로, 이들은 고리를 적층된 콜라겐 원섬유로서 해석할 수 있다. 이것이 사실인 경우, 고리 영역은 광물화되기 쉬울 것이다.]
알리자린 레드 염색은 문헌에서 광물화를 표시하기 위한 크림슨 적색으로서 기재되어 있다. 광물화 및 조골세포 결절은 진한 적색으로 염색되고 색채의 강도는 광물화에 따라 증가한다고 기재되었다(Wang, (2006) Biotechnol. Prog. 22(6):1697-701; Zhao, 2007). ARS 염색은 가시광선 스펙트럼에서 보라색에 상응하는 405 nm에서 판독된다. 본 발명자들의 결과와 달리, 공개된 데이터로부터의 MC3T3-E1 광물화의 ARS 염색의 색채 사진은 단일층에서 녹빛 적색 또는 적갈색을 보이지 않았다. 본 발명자들의 결과에서 보다 어두운 색채는 보다 많은 ARS 염색을 표시하므로 공개된 결과에 비해 보다 많은 골형성을 표시한다. ARS 염색 및 정량에서 OD 변화의 양은 배양 조건 및 세포 종류에 따라 상이하였다. 30일 동안 6웰(10 cm2/웰)에서 배양된 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 0.5의 OD405부터 4의 OD405까지의 증가를 달성하였다(Gregory et al. (2005) Analytical Biochemistry 329: 77-84). 28일 동안 24웰 플레이트에서 배양된(α-MEM, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트) MC3T3-E1 세포는 0.6의 OD를 달성하였다. 그러나, 16일째 날 및 26일째 날 OD는 각각 0.05 및 0.2 미만으로 28일째 날보다 훨씬 더 낮았다(Burkhardt (2006) University of Basel, Master Thesis). 양성 대조군에서의 급격한 색채 변화의 결여는 ALP를 위해서는 최적 시간일지라도 ARS를 위해서는 너무 짧은 시간인 13일이라는 시간에 기인할 것이다.
0.1 ㎍/㎖ HC-HA도 양성 대조군에 비해 "고리 변화"(도 55A), 색채의 명확한 증가(도 56A) 및 3배 더 높은 OD 값을 유도하였는데(p < 0.05)(도 57A), 이것은 보다 낮은 용량의 HC-HA가 광물화를 촉진하고 용량 반응 곡선이 0 내지 0.1 ㎍/㎖에서 존재한다는 것을 암시한다.
0.5 내지 10 ㎍/㎖의 HC-HA도 "고리"를 보였고(도 55A), 0.1 ㎍/㎖와 동일한 색채를 유지하였고(도 56A), 통계적 유의성 없는 OD405를 발생시켰다. 25 ㎍/㎖의 HC-HA는 세포 밀도를 감소시켰고, 세포 형태를 변화시켰고, "고리"를 상실시켰고(도 55A), 임의의 색채 변화를 발생시키지 못하였고(음성 대조군과 유사함)(도 56A) 무시할만한 OD405를 발생시켰다(음성 대조군과 유사함).
25 ㎍/㎖부터 AMP는 입자를 남겼고(도 55B), 1 ㎍/㎖부터 양성 용량 반응 관계를 가지면서 색채를 증가시켰으나(도 56B), OD405는 125 ㎍/㎖ AMP일 때까지 통계적으로 유의하지 않은 증가를 보인 후(p < 0.05) 250 ㎍/㎖에서 감소하였는데, 이것은 색채 변화와 일치하지 않았다. HC-HA와 달리 보다 높은 용량에서 AMP는 세포 형태에 임의의 불리한 영향을 야기하지 않았다.
파트 B
그 후, 샘플 크기를 증가시키고 인간 MSC의 알리자린 염색에 이용되는 방법(Gregory et al. ((2005) Analytical Biochemistry 329: 77-84) 및 당분야에서 공지되어 있는 다른 방법을 도입함으로써 알리자린 레드 염색 방법을 개선하였다. 상기 문헌(Gregory et al)의 방법, 전술된 본 발명자들의 종래 방법 및 이 실시예에 요약된 신규 방법의 비교는 하기 표에서 제공되어 있다. 종래 연구는 유도 하에서 MC3T3-E1 분화가 3개의 단계, 즉 증식(1일째 날부터 9일째 날까지), ECM 형성(9일째 날부터 16일째 날까지) 및 광물화(형성된 ECM에서 침착 광물)(16+일째 날)로 세분될 수 있다(Quarles et al. (1992) Bone Miner Res. 7(6):683-92; Hong et al. (2010) Exp Cell Res. 316(14):2291-300). 따라서, 상이한 군들로부터의 연구들을 비교하기 위해 0일째 날인 전면생장일부터 출발하여 사건의 시간을 맞추는 것이 중요하였다.
Figure 112015012524150-pct00011
실험 디자인:
파트 A 및 표 5에 기재된 바와 같이 세포를 분화 배지에서 배양하고 자극하였다. 분화 배지를 18일 동안 3일마다 교체하였다. 분석을 위해 0.1 ㎍/㎖ HC-HA 및 125 ㎍/㎖ AMP를 사용하였다. 표 5에 언급된 바와 같이 변화시키면서 ARS 분석을 파트 A에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
세포 형태 및 고리 형성
비-유도된 세포는 시딩 후 평평한 입방형 형태를 달성하였다(도 59A). 세포 경계는 가장자리가 융기되는 4일째 날에 더 명확해졌고, 일부 세포들은 6일째 날에 방추형 형태를 발생시켰다. 방추 세포 또는 다중층은 발생되지 않았다.
1일째 날부터 3일째 날까지, 세포는 입방형 형태를 유지하였고 단일층은 평평한 상태로 남아있었다(도 59B). 3일째 날까지, 세포 경계는 더 명확해졌고 세포 가장자리는 융기되었다. 추가로, 작은 둥근 세포-유사 구조물이 단일층 상에서 가시화되었다(흑색 원으로 표시됨). 세포 형태는 방추형 형태의 세포 및 다중층으로 조직화된 세포의 출현과 함께 4일째 날까지 변화하였다. 작은 둥근 세포-유사 구조물의 출현은 6일째 날 내지 7일째 날까지 계속 증가하였다.
HC-HA로 처리된 유도된 세포에서 세포 형태 변화는 양성 대조군 변화를 반영하였다(도 60A). HC-HA는 AMP처럼 단일층 상에 입자를 남기지 않았다. 양성 대조군처럼 작은 둥근 세포-유사 구조물(흑색 원으로 표시됨)은 3일째 날에 출현하여 7일째 날까지 계속 증가하였다.
AMP 입자(흑색 화살표로 표시됨)는 단일층의 상부 상에서 침전되어 단일층 아래의 관찰을 방해하였다(도 60B). 0일째 날 및 1일째 날에 AMP 입자를 결여하는 영역은 둥근 형태 및 입방형 형태를 보였다. 2일째 날, 일부 방추형 형태의 세포가 단일층 상에서 나타났다. 작은 둥근 세포-유사 구조물을 보다 작은 AMP 입자로부터 확인하고 구별하는 것은 어려웠고 이들 구조물의 발생은 공지되지 않은 상태로 남아있다. 5일째 날, 방추형 형태는 연신되어 방추-유사 세포를 형성하였다. 6일째 날, 긴 방추 세포는 AMP 입자(흑색 원으로 표시됨)와 함께 웹-유사 상호작용을 형성하였다.
3일째 날, 방추형 형태의 세포가 웰의 가장자리 근처(가장자리로부터 1 내지 2 mm)에서 발생하였다(도 61A). 방추 세포 및 고리 형성은 4일째 날부터는 발생하지 않았다. 세포는 가장자리에서 서로 중첩되고 방추형 형태로 생장하는 듯하였다. 0일째 날부터 2일째 날까지, 웰 가장자리를 따라 방추-유사 세포는 없었다(도 61B). 3일째 날, 고리 구조로 적층된 유사한 방추형 세포가 가장자리에서 인지되었다. 5일째 날부터, 이들 세포는 가장자리로부터 약 2 mm 떨어진 부위에서 두드러진 고리로서 농축되었다. 6일째 날, 단일층은 가장자리 근처의 특정 영역을 따라 플라스틱 표면으로부터의 탈착을 보인다(백색 →로 표시됨).
세포는 2일째 날까지 가장자리를 따라 매끄러운 입방형으로 남아있었다(도 62A). 방추형 형태의 세포는 2일째 날에 가장자리 근처에서 발생하였다. 일부 작은 둥근 세포-유사 구조물도 특정 시간에 가장자리 근처에서 가시화되었다. 방추-유사 세포는 3일째 날에 발생하여 5일째 날까지 웰 가장자리 주변에서 고리 형태로 계속 두꺼워진다. 플라스틱 웰로부터의 단일층 탈착은 가장자리 근처의 영역에서 6일째 날에 관찰되었다(백색 화살표로 표시됨). 방추형 형태의 세포는 2일째 날에 웰 가장자리 근처에서 나타났다(도 62B). 방추-유사 세포는 3일째 날에 가장자리로부터 (약 1 내지 2 mm 떨어져) 발생되었고, 방추-유사 세포의 고리는 5일째 날까지 형성되었다. 플라스틱 웰로부터의 단일층 탈착은 가장자리 근처의 일부 영역에서 5일째 날에 관찰되었다. 탈착은 6일째 날에도 계속되었지만, 단일층은 HC-HA 처리된 세포 및 양성 대조군 세포만큼 많이 탈착되지 않았다.
ARS 염색 및 정량화
음성 대조군 단일층은 일부 영역에서 밝은 분홍색으로 염색되었다(도 63). 양성 대조군은 중심에서 밝은 분홍색으로 염색되었으나 방추 고리 영역에서 밝은 크림슨 적색을 보였는데, 이것은 MC3T3-E1 세포가 단일층의 나머지보다 오히려 고리에서 광물화를 더 많이 침착시킨다는 것을 시사한다. 0.1 ㎍/㎖ HC-HA와 양성 대조군 사이에 중심 단일층 및 방추 고리에서 염색의 강도 및 색채 둘다가 동일하였다. 세포의 상부 상의 AMP 입자는 적갈색으로 염색되었다. 세포 아래의 가시적 관찰은 염색된 입자에 의해 방해되었으나, 개방부는 음성 대조군과 유사한 밝은 분홍색으로 염색되는 일부 희박한 세포를 가지면서 두드러진 세포 단일층의 결여를 보였다. AMP 처리된 세포가 가시적 방추 고리를 보이지 않았기 때문에, ARS는 양성 대조군과 유사하게 가장자리 근처에서 크림슨 적색으로 염색되지 않았다.
GnHCl 처리는 양성 대조군 및 HC-HA 처리된 세포 둘다에서 단일층을 온전한 상태로 남기면서 세포 매트릭스를 가용화시켰고 크림슨 적색 ARS 염료를 제거하였다. GnHCl은 세포외 매트릭스를 남기면서 세포 단백질을 분해하고 변성시켰다. AMP 실험군에서, AMP 입자 밀도는 감소되었으나, 대다수의 입자들은 웰의 하부 상에 여전히 남아있었다. 긴 배양 시간을 이용하였을 때, AMP 입자는 GnHCl에 의해 용해되지 않은 ECM 매트릭스와 밀접한 상호작용을 형성할 수 있다. 일단 밝은 적갈색으로 염색된 입자는 AMP가 천연적으로 나타내는 색채와 유사한 밝은 갈색을 보였다. 그러나, 구별되는 단일층 구조물은 관찰되지 않았는데, 이것은 AMP 사이의 갭에서의 세포 단일층의 관찰을 뒷받침하였다. 세포는 단일층으로부터 AMP 입자 내로 이동하여 분화 및 광물화를 위한 스캐폴드로서 사용되었을 수 있다.
ARS 표준물은 2 mM부터 31.3 μM까지의 연속 희석을 통해 크림슨 적색으로부터 크림 분홍색으로의 진행을 보였다(도 64A). HC-HA 처리된 샘플과 AMP 처리된 샘플 사이에 현저한 색채 변화가 있었다. HC-HA 처리된 세포 추출물은 투명한 크림색을 보인 반면, AMP 처리된 세포 추출물은 밝은 크림 분홍색을 보였다. 양성 대조군도 HC-HA 처리된 세포와 동일한 색채 및 색채 강도 수준을 보인 반면, 음성 대조군은 보다 밝은 색채를 보였고 블랭크와 유사하였다(데이터는 제시되어 있지 않음). OD405 값은 이전 실시예로부터의 값과 동일한 범위 내에서 유지되었다(도 64B). 음성 대조군에 비해, 양성 대조군은 OD에서 통계적으로 유의한 2배 감소를 보였다. HC-HA 처리된(0.1 ㎍/㎖) 세포는 양성 대조군보다 약간의 OD 증가를 보였으나, 차이는 통계적으로 유의하지 않다. AMP(125 ㎍/㎖) 처리는 양성 대조군에 비해 OD 값을 약간 감소시켰으나, 이 감소는 통계적으로 유의하지 않았다.
ARS 표준물은 2 mM부터 31.3 μM까지의 연속 희석을 통해 크림슨 적색으로부터 크림 분홍색으로의 진행을 보였다(도 65A). 음성 대조군 추출물은 블랭크보다 약간 더 어두운 밝은 크림색을 보였다(데이터는 제시되어 있지 않음). 양성 대조군은 밝은 금색을 보였고, 색채는 음성 대조군보다 가시적으로 더 어두웠다. HC-HA도 양성 대조군과 동일한 강도로 밝은 금색을 보였다. AMP 처리된 추출물은 양성 대조군 및 HC-HA 추출물 군보다 더 어두운 황금색을 보였다. OD405 값은 동일한 범위 내에서 유지되되, 이때 약 0.25에서 가장 높았다(도 65B). 음성 대조군은 0에 가까운 무시할만한 OD 값을 보였다. 양성 대조군 및 HC-HA(0.1 ㎍/㎖) 처리된 추출물은 0.05에 가까운 평균 OD 값을 보였다. AMP 처리된(125 ㎍/㎖) 추출물은 양성 대조군 및 HC-HA 처리군 둘다보다 OD의 통계적으로 유의한 5배 증가를 보였다(P = 0.039).
요약
세포 형태
10% FBS를 갖는 αMEM에서 배양된 MC3T3-E1 세포는 전면생장률까지 생장하여 입방형 형태를 발생시켰다. Aim #1 및 #2에서의 발견과 유사하게, 세포는 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌의 첨가 없이 분화되지 않았다. 유도 배지를 사용하지 않은 경우, 방추 세포 및 방추 고리는 형성되지 않았다(도 59). 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌을 사용하여 MC3T3-E1 세포의 분화를 유도하였다. 시딩 후, 매끄러운 단일층은 입방형 형태의 세포로 형성되었다. 3일의 유도 후, 세포는 방추형 형태를 달성하였다. 5일째 날까지, 세포는 연신되었고 방추-유사 형태가 되었다.
이 실시예에서, 방추 고리는 유도 3일째 날에 발생하였고, 이때 방추-유사 세포는 웰벽으로부터 1 내지 2 mm 떨어져 형성되었다. 6일째 날, 웰 가장자리 및 플라스틱 바닥으로부터의 단일층의 탈착이 관찰되었다(도 60). 작은 둥근 세포-유사 구조물이 2일째 날부터 시작하여 단일층 상에서 발생되었고 6일째 날까지 그의 수가 증가하였다(도 59). 이들은 배양 배지에서 부유하지 않았고 주로 세포 경계 사이에 존재하면서 단일층으로 단단히 부착되었다. 이들 구조물은 연골 및 골에서의 초기 석회화 부위에 위치하는 세포외 막-포위된 입자인 매트릭스 소포(MV)를 나타낼 수 있다. 매트릭스 소포 합성은 소포가 분화하는 성장판 연골세포 및 조골세포의 외부 원형질막의 특정 영역으로부터 출아되고 떨어져 나옴으로써 일어난다(Anderson et al. (2003) Curr Rheumatol Rep. 5(3):222-6).
HC-HA를 사용한 처리는 분화를 통한 MC3T3-E1 세포 형태 변화를 변경시키지 않았다(도 60). 방추형 형태의 세포, 방추-유사 세포 및 방추 고리의 형성(도 61)은 양성 대조군의 보고된 시간 과정을 따랐다. AMP 입자는 이전 발견과 유사하게 세포 단일층의 상부 상에 침전되었다(도 60). 이것은 세포 단일층 및 유도를 통한 세포 형태 변화의 전체적인 관찰을 방해하였다. 그러나, 일부 관찰은 AMP 입자가 침전되지 않은 개구부를 통해 달성되었다. HC-HA와 달리, AMP 처리는 세포 형태 변화를 가속화시켰고 일부 방추형 세포는 유도 2일째 날보다 더 빠른 날에 가시화될 수 있었다. AMP 처리된 세포는 HC-HA 처리된 세포 및 양성 대조군과 유사하게 방추 고리를 형성하였다(도 62). 그러나, 단일층은 다른 2개의 실험군보다 더 일찍(6일째 날 대신에 5일째 날) 탈착되었다(도 62).
ARS 염색 및 정량화
ARS 염색은 종래 보고된 색채와 현저히 상이한 색채를 보였다(도 66). ARS는 음성 대조군 세포 단일층에서 청회색 대신에 밝은 분홍색을 염색하였다. 또한, ARS 염색은 양성 대조군 및 HC-HA 처리된 세포에서 종래 결과로부터의 녹빛 갈색 대신에 방추 고리에 집중된 밝은 크림슨 적색을 보였다. AMP 입자는 어두운 갈색 대신에 적갈색으로 염색되었고, 새포 아래는 녹빛 갈색 대신에 밝은 분홍색으로 염색되었다. ARS 용액의 분해는 색채 변화에 기여하였을 수 있다.
아세트산 추출 후, 단일층은 여전히 상당한 양의 염색된 색채를 남겨두는 듯하였다. 아세트산은 단일층으로부터 ARS 염색을 완전히 제거하는 데에 효과적이지 않다. 아세트산 추출을 이용하였을 경우, 양성 대조군의 OD 값과 음성 대조군의 OD 값 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하였는데(도 68), 이것은 양성 대조군에서 보다 많은 ARS 염색의 가시적 관찰과 일치하였다(도 66). 그러나, 아세트산 추출은 다른 2개의 군보다 분석 추출물에서 더 많은 색채를 갖는 AMP 군의 가시적 관찰에도 불구하고(도 67) 양성 대조군 및 HC-HA 군에 비해 AMP의 OD의 통계적으로 유의한 증가를 보이는 데에 있어서 효과적이지 않았다(도 66). AMP 입자 침착물은 AMP 군으로부터 ARS를 제거하는 것을 더 어렵게 만들었을 수 있다. 광물화된 매트릭스 및 세포는 ARS의 아세트산 추출을 방해하는 AMP 입자와 상호작용을 가졌을 수도 있다.
GnHCl은 아세트산 처리보다 더 완전하게 세포 단일층으로부터 ARS를 제거하였다(도 69). 추가로, 색채는 단일층을 제거하기 위한 세포 스크래퍼의 사용 없이 GnHCl 용액에서 가용화되었다. 두 방법들은 육안으로 볼 수 없고 원심분리에 의해 영향을 받지 않는 입자를 남기는 듯하다. GnHCl의 경우, 이것은 미세한 입자를 형성하는 칼슘 및 용해된 매트릭스일 수 있다. 이것은 각각의 샘플에서 중복실험 사이에 편차를 야기하였다. 입자를 제거하기 위한 670 nm에서의 판독은 GnHCl 추출 방법에 대한 이 문제를 해결하였다.
GnHCl 추출은 ARS 염색의 가시적 관찰을 일치시키기 위해 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 정량가능한 통계적 유의성을 확립할 수 없었다(도 71). GnHCl 추출은 0.1 ㎍/㎖ HC-HA가 MC3T3-E1 세포의 분화에 있어서 보다 많은 광물화를 촉진하지 못하였다는 것도 보여주었고(도 71), 이것은 아세트산 추출의 결과와 일치하였다. 96웰에서 분석 추출물 색채를 살펴보았을 때, 양성 대조군 웰과 HC-HA 웰은 색채 또는 강도 면에서 차이를 보이지 않았다(도 70).
GnHCl 추출은 125 ㎍/㎖ AMP가 MC3T3-E1 세포의 분화에 있어서 양성 대조군보다 더 많은 광물화를 촉진하였다는 것을 보여주었다(도 71). 이것은 단일층의 ARS 염색(도 66) 및 96웰 분석 플레이트에서의 추출물의 가시적 관찰(도 70)과 일치하였는데, 이때 AMP는 HC-HA 또는 양성 대조군보다 훨씬 더 진한 황금색을 보였다.
이들 결과로부터 GnHCl은 단일층으로부터 ARS 염색을 보다 완전하게 제거하고 단일층을 온전하게 남기기 때문에 보다 우수한 추출 방법이고; 단일층을 웰로부터 긁어낼 필요가 없기 때문에 실험 오차가 더 적다. 추출물 색채는 분광측정기 판독을 통해 정량될 수 있다.
파트 C
상기 예비 연구는 작은 샘플 크기 및 ARS 분석의 불완전한 개발로 인해 조골세포 분화에 대한 HC-HA 및 AMP에 대한 용량 반응 곡선에 대한 통계적으로 유의한 결과를 나타내지 않았다. 이것은 0.1 ㎍/㎖ HC-HA가 광물화를 향상시킬 수 있다는 것을 암시하였다. 나아가, 10 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖의 HC-HA는 세포 생존력에 영향을 미칠 것이고 광물화를 감소시킬 것이다. HC-HA에 대한 용량 곡선은 10 ㎍/㎖ 초과의 농도뿐만 아니라 0.1 ㎍/㎖ 미만의 보다 낮은 농도도 포함할 것이다. HC-HA와 달리, 5 ㎍/㎖ 내지 125 ㎍/㎖의 AMP는 광물화를 촉진할 수 있다. 이 실험에서, HC-HA 및 AMP의 용량 반응을 파트 B의 방법을 이용하여 재시험하였다. 이 실험에서, 15일째 날에 ARS 염색을 분석에 이용하였고, 염색하고 정량하기 위해 10% 아세트산을 사용하는 수정된 프로토콜을 이용하였다.
실험 디자인
3 x 104개 세포/cm2/웰의 세포를, 10% FBS 함유 αMEM 배지를 함유하는 96웰 플레이트에 시딩함으로써 3T3-E1 세포에 기초한 파트 B에 나타낸 모델 시스템과 동일한 모델 시스템을 사용하였다. 전면생장 시, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌 유도 배지를 첨가하여 세포의 분화를 유도하였다. 각각의 조건 당 N=3을 시험하였다. 전면생장(0일째 날 = 시딩) 후, 0.02 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖의 HC-HA를 첨가한 반면, 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 125 ㎍/㎖의 AMP를 첨가하였다. ARS 염색을 위해, 파트 B의 변경된 방법을 이용하였다.
결과
음성 대조군 MC3T3-E1 세포는 배양 전체에 걸쳐 방추-유사 형태 또는 방추 고리를 발생시키지 않았다(도 66A). 단일층 중심 및 주변은 베이지색으로 염색되었다. 양성 대조군 세포는 방추형 및 방추-유사 세포를 발생시켰고, 이때 방추 고리는 대략 배양 5일째 날(유도 4일째 날)에 나타났다. ARS 염색은 중심에서 밝은 고동색을 보였고 어두운 크림슨색을 갖는 방추 고리에 주로 집중되었다. 1.25 ㎍/㎖까지의 HC-HA 농도의 증가는 세포 형태 또는 ARS 염색 강도 및 패턴에 영향을 미치지 않았다. 2.5 ㎍/㎖에서, MC3T3-E1 세포의 방추 고리는 분해되기 시작하였고 ARS 색채는 크림슨색에서 적갈색으로 변화하였다. 20 ㎍/㎖까지 세포는 그들의 방추형 및 방추 형태를 상실하였고; 세포 가장자리도 덜 명확하고 덜 융기되었다. 세포 밀도는 감소되었고, 단일층은 이전처럼 융기된 것처럼 보이지 않았다. GnHCl은 ARS 염료를 성공적으로 추출하였고, OD450 값의 변동 계수는 5% 내지 19%이었다. 양성 대조군은 통계적으로 유의한 증가된 OD 값을 보였다(도 66B).
음성 대조군 MC3T3-E1 세포는 배양 전체에 걸쳐 방추-유사 형태 또는 방추 고리를 발생시키지 않았다(도 67A). 단일층 중심 및 주변은 베이지색으로 염색되었다. 양성 대조군 세포는 방추형 및 방추-유사 세포를 발생시켰고, 이때 방추 고리는 대략 배양 5일째 날(유도 4일째 날)에 나타났다. ARS 염색은 단일층의 중심에서 밝은 고동색을 보였다. AMP 처리는 세포 단일층의 상부에 침전된 AMP 입자를 남겨 62.5 ㎍/㎖의 농도부터 단일층의 관찰을 방해하였다. AMP로만 처리되었고 유도되지 않은 MC3T3-E1 세포는 가장자리를 따라 방추 고리를 보이지 않았고, ARS 염색은 밝은 분홍색 배경과 함께 어두운 크림슨색을 보였다. 7.8 ㎍/㎖ 내지 31.25 ㎍/㎖에서 AMP 입자는 단일층을 완전히 덮지 못하였고, 세포는 방추형 및 방추 형태를 보였다. 가장자리를 따라 방추 고리가 관찰될 수 있었다. ARS 염색은 밝은 고동색으로 염색되는 중심 단일층을 보였고, 염료는 양성 대조군과 유사하게 어두운 크림슨색까지 방추 고리를 따라 농축되어 있었다. GnHCl은 ARS 염료를 성공적으로 추출하였고 OD450 값의 변동 계수는 3% 내지 10%이었다(도 67B).
결과 요약
세포 형태/ARS 염색
이전 결과와 유사하게, MC3T3-E1 분화는 입방형 형태에서 방추형 및 방추 형태로 변화하는 세포로부터 진행한다. 유도 시간이 증가함에 따라, 방추 고리가 웰 가장자리(약 2 mm 떨어진 위치)를 따라 형성되고 시간에 따라 단일층을 수축시킨다. 양성 대조군과 달리, 음성 대조군은 방추-유사 세포 또는 방추 고리를 결코 발생시키지 않았다. 음성 대조군 단일층이 균일한 베이지색으로 염색된 반면, 양성 대조군은 중심에서 밝은 고동색/분홍색을 보였고 방추 고리에서 진한 어두운 크림슨색을 보였다.
10 ㎍/㎖ HC-HA에서 세포 형태는 보다 낮은 농도부터 변화하였고, 이때 보다 적은 세포가 방추형 및 방추 형태를 보였다. 세포 밀도는 감소하였고, 단일층은 덜 융기된 것으로 보였다. 20 ㎍/㎖ HC-HA에서 세포 밀도는 급격히 감소하였고, 소수의 세포들이 방추 형태를 가졌다. 단일층은 음성 대조군과 유사하게 매끄러운 것처럼 보였다. 두 농도에서 이들 변화는 배양 및 유도의 5일째 날부터 시작되는 것으로 인지되었다. 두 농도에서 방추 고리는 약하게 형성되었거나 존재하지 않았다. 증가하는 HC-HA 농도는 2.5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 방추 고리의 붕해를 야기하였다.
모든 AMP 처리된 세포들에서 AMP 입자가 침전된 부위 주변 영역은 어두운 크림슨색으로 염색되었다. 웰의 가장자리 주변에서는 단일층이 AMP 입자의 개구부를 통해 관찰될 수 없었다. 125 ㎍/㎖ AMP로 처리된 비-유도된 MC3T3-E1은 125 ㎍/㎖ AMP로 처리된 유도된 MC3T3-E1과 유사한 염색을 보였다. 침전된 AMP를 갖는 세포는 패치에서 어두운 크림슨색으로 염색되었고, 이때 염색된 단일층 아래는 관찰되지 않았다. 7.8 ㎍/㎖ 내지 15.6 ㎍/㎖ AMP에서 세포 형태는 가시화될 수 있었다. 세포는 웰의 가장자리를 따라 형성된 방추 고리를 갖는 방추형 및 방추 형태를 보였다. ARS 염색은 중심에서 밝은 고동색을 갖고 방추 고리 영역에서 어두운 크림슨색을 갖는 양성 대조군과 유사하였다.
GnHCl 처리는 염색된 단일층으로부터 ARS 염료를 추출하는 데에 있어서 성공적이었다. 추출은 음성 대조군부터 양성 대조군까지 0D450의 통계적으로 유의한(p < 0.01) 2배 증가를 보였다. HC-HA 처리된 세포는 HC-HA 농도의 증가에 따라 광물화를 감소시키는 경향을 보였다. 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖ HC-HA에서, 양성 대조군으로부터 광물화의 통계적으로 유의한(p < 0.05) 감소가 있었다. AMP는 분화하는 MC3T3-E1 세포의 광물화를 용량 의존적으로 증가시켰다.
AMP로 처리된 비-유도된 세포도 광물화를 보였고, AMP가 양성 대조군보다 더 많이 광물화를 유도하고 촉진하는 듯하였다(p < 0.01). 또한, 125 ㎍/㎖ AMP에서 비-유도된 세포에 대한 처리는 유도 배지에서 배양된 세포보다 더 많은 광물화를 보였다(p < 0.05).
실시예 39: 조골세포 분화에 대한 AMP의 효과
ARS 염색이 AMP에 의한 염색의 명확한 용량 의존적 증가를 보였고 125 ㎍/㎖에서 광물화의 통계적으로 유의한 증가를 나타내었지만, 이러한 변화가 ARS와 AMP의 비특이적 결합에 의해 야기되는지는 불명확하였다. AMP가 특히 고용량에서 HC-HA와 상이하게 작용하였기 때문에, 즉 광물화를 촉진하고 이를 억제하지 않았기 때문에, AMP의 작용이 세포와 AMP의 직접적인 접촉에 의존하는지를 확인하는 것이 중요하였다. 이 질문은 HC-HA가 통과하기에 충분하나 AMP 입자를 배제할 정도로 충분히 작은 3 ㎛ 공극 크기를 갖는 트랜스웰의 사용에 의해 해결되었다. 이 공극 크기를 갖는 이용가능한 트랜스웰 플레이트가 24웰 플레이트에 꼭 맞기 때문에, 그에 따라 분석의 배양 조건을 변경시켰다. 분석을 위해 125 ㎍/㎖ AMP의 농도를 사용하였다.
실험 디자인:
MC3T3-E1 세포(P2의 세포; ATCC, 카탈로그 번호 CRL-2593™)를 1 x 105개 세포/㎖의 밀도로 12웰 평면 투명 바닥 웰 상에 시딩하였다. 앞서 사용된 AMP 저장 용액과 동일한 AMP 저장 용액(AMP-4; 로트 번호 CB102971)을 PBS 중의 5 mg/㎖로서 제조하였다. 트랜스웰을 갖지 않는 웰의 경우, 17.5 ㎕의 AMP 저장 용액을 0.7 ㎖의 배양 배지(기초 또는 유도 배지)에 첨가하여 10% FBS 함유 α-MEM(유도 부재) 또는 유도 배지 #1에 이어서 #2(유도 존재) 중의 125 ㎍/㎖ AMP 농도를 달성하였다. 트랜스웰을 갖는 웰의 경우, 17.5 ㎕의 AMP 저장 용액을 전술된 방식과 동일한 방식으로 트랜스웰 막의 중심에 직접적으로 첨가하였다. 배양 배지(10% FBS 함유 α-MEM; 전술된 바와 같은 유도 배지 #1 및 #2)를 유도 0일째 날 후 3일마다 교체하였다. 세포 단일층을 70% 에탄올 대신에 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 1시간 대신에 2시간 동안 염색하였다는 것을 제외하고 ARS 염색 및 정량 절차를 전술된 바와 같이 수행하였다.
결과
모든 유도 세포들은 유도 4일째 날에 고리 형성을 발생시켰다(도 68). 고리는 플라스틱 웰의 가장자리 근처(약 2 내지 3 mm 떨어진 부위)에서 세포들의 층으로 구성되었다. 이 고리는 층으로 성장하였고 동그랗게 말린 후, 다수의 웰에서 단일층이 플라스틱으로부터 탈착되었다. 유도의 부재 하에서 세포는 배양 기간의 증가에 따라 일부 방추형 형태를 가지면서 주로 육각형 형태를 유지하였고, 단일층은 유도된 세포에 비해 매끄러운 상태로 남아있었다(도 69). 유도는 세포가 방추형 형태를 갖게 하였고, 단일층은 융기되었고, 세포들 사이의 경계는 보다 명확해졌다. 유도의 존재 하에서 4일째 날까지 배양 플레이트의 가장자리를 따라 발생하는 방추-유사 고리가 관찰되었다. AMP를 사용한 처리는 세포 생존력에 영향을 미치지 않았고 고리 형성에도 영향을 미치지 않았는데, 이것은 AMP가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다. 트랜스웰의 첨가는 세포 생장 또는 형태에 영향을 미치지 않았다.
트랜스웰의 부재 하에서 125 ㎍/㎖의 AMP는 세포 단일층 상에 침전된 입자를 남겼다(도 69A). 유도의 부재 하에서 AMP 자체는 세포가 방추 형태를 발생시키는 것을 야기하지 않았고, 고리를 발생시키지 않았으므로, 이것은 AMP 단독이 음성 대조군과 유사하게 유도를 야기하기에 충분하지 않았다는 것을 암시한다. 유도의 존재 하에서 125 ㎍/㎖의 AMP는 양성 대조군처럼 세포 형태 변화를 야기하였는데, 이것은 AMP 자체가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다. 125 ㎍/㎖의 AMP는 트랜스웰을 통해 세포 단일층 상에 무시할만한 입자를 남겼다(도 69B). 유도의 부재 하에서 AMP는 세포가 분화하도록 유도하기에 충분하지 않았고, 세포는 음성 대조군과 유사하였다. 유도 및 125 ㎍/㎖의 AMP의 존재 하에서 세포는 방추형 및 방추-유사 형태를 발생시켰고 14일째 날까지 양성 대조군과 유사하였는데, 이것도 AMP가 유도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다.
음성 대조군은 이전 실험에서의 음성 대조군의 청회색과 상이한 밝은 분홍색의 패치를 갖는 회갈색 배경색을 단일층에서 발생시켰다(도 70). 유도의 부재 및 트랜스웰의 존재 하에서 단일층은 AMP로 처리되었을 때조차도 음성 대조군과 유사한 회갈색 배경으로 염색되었는데, 이것은 AMP 자체가 유도를 야기하지 않았다는 것을 암시한다. 트랜스웰의 부재 하에서 음성 대조군에 비해 배경색의 현저한 감소를 나타내는 대역이 존재하였고(이것은 단일층 상에 침전된 AMP 입자가 색채(**로 표시됨)를 차단하였을 것임을 암시함), AMP 자체는 광물화를 암시하는 양성 색채를 발생시키지 않았다.
양성 대조군은 이전 실험에서의 양성 대조군으로부터의 장밋빛 적색보다 더 어두운 녹빛 적색으로 염색된 고리와 함께 장밋빛 분홍색을 발생시켰다. 트랜스웰의 첨가는 양성 대조군의 색채에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 트랜스웰 자체가 유도에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인시켜준다. AMP의 존재 및 트랜스웰의 부재 하에서 단일층은 양성 대조군보다 더 강한 녹빛 적색을 발생시켰고, 이때 고리는 더 어둡게 염색되었는데, 이것은 AMP가 추가 양성 유도를 발휘하였다는 것을 암시한다. 대조적으로, 트랜스웰의 존재 하에서 배경색의 강도는 양성 대조군의 수준까지 감소된 반면, 고리는 동일한 색채를 유지하였는데, 이것은 트랜스웰이 유도에 대한 AMP의 효과에 부정적인 영향을 발휘하였다는 것을 암시한다.
정량 결과는 통계적 유의성을 제공하는 데에 있어서 적절하지 않았고 ARS 염색의 가시적 분석과 일치하지 않았다(도 71). 그러나, 전체적인 경향은 양성 대조군이 음성 대조군보다 더 많은 광물화를 보였다는 것을 암시하였다. 나아가, 트랜스웰이 AMP 및 유도의 존재 하에서 포함되었을 때 보다 적은 OD405를 암시하는 경향이 있었다.
결과 요약
고리 형성(도 69A)은 아마도 접시의 크기가 보다 더 컸기 때문에 관찰하기 용이하였다. 그러나, 아마도 고정제의 변화로 인해, 음성 대조군에 대한 배경색은 이전 실험과 상이하였다. 나아가, 특히 고리 영역에서 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 보다 더 현저한 색채 변화가 있었다(도 70). 양성 대조군에서 트랜스웰의 도입은 세포 형태(도 69B) 또는 ARS 염색 색채(도 70)에 영향을 미치지 않았다.
유도의 부재 하에서, AMP는 트랜스웰의 부재 하에서 양성 ARS 염색을 명확히 차단하였고(도 70), AMP는 트랜스웰의 존재 하에서 음성 대조군과 동일한 색채를 보였다. AMP 자체는 비특이적 ARS를 야기하지 않고 임의의 유도를 야기하지 않는다. 유도의 존재 하에서, AMP는 트랜스웰의 부재 하에서 양성 대조군보다 더 많은 색채를 야기하였다. 대조적으로, AMP는 트랜스웰의 존재 하에서 양성 대조군과 동일한 색채를 발생시키는 것으로 보였다.
이전 ARS 정량 결과는 125 ㎍/㎖ AMP가 양성 대조군보다 3배 더 많은 광물화를 촉진한다는 것을 보여주었으나(p < 0.05)(도 67), 도 71에서는 그러하지 않다.
AMP로 직접적으로 처리된 세포와 트랜스웰을 통해 AMP로 처리된 세포 사이에 세포 형태의 차이가 없었다(도 69A 및 69B). 두 세포 군들은 고리 형성을 발생시켰고, 가시적 관찰은 고리 구조물들 사이의 인지가능한 차이를 보이지 않았다. ARS 염색은 2개의 실험군들 사이에 배경색의 무시할만한 차이를 보였다. 그러나, AMP로 직접적으로 처리된 세포는 AMP 입자로부터의 산란 효과일 수 있는 보다 확산된 고리 형성을 보였다(도 70).
AMP는 광물화에 영향을 미치기 위해 MC3T3-E1 세포와 직접적으로 접촉할 필요가 없다. AMP가 광물화를 촉진한다는 것은 이 실험으로부터 명확하지 않았지만, AMP는 세포 형태 또는 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 보여졌다(도 69).
파트 B
본 발명자들의 결과는 125 ㎍/㎖ AMP가 생장 및 분화의 15일째 날에 양성 대조군과 비교될 때 MC3T3-E1 세포의 광물화를 유의하게 증가시켰다는 것을 보여주었다(도 65). AMP는 배양 배지에서 직접적으로 전달되었고 AMP 입자는 세포 단일층의 상부 상에 침전되었으므로; Aim 1B에서 AMP의 효과는 직접적인 접촉을 필요로 하였다.
파트 A에서, 본 발명자들은 AMP의 효과가 분화하는 MC3T3-E1 세포를 위한 스캐폴드로서 작용함으로써 발휘되는지 또는 인자가 입자로부터 방출되어 광물화를 촉진하는지를 조사하고자 하였다. 그러나, 10% 아세트산을 사용한 ARS 염색 추출에서 작은 샘플 크기 및 기술적 오차가 데이터에 영향을 미쳤고 통계적 유의성은 발견되지 않았다. ARS 염색 및 실시예 38에서 개발된 4 M 구아니딘 HCl을 사용한 추출의 개선된 기술적 방법을 이용하여 실험을 반복하였다.
실험 디자인:
MC3T3-E1 세포를, 전술된 바와 같이 αMEM 배지 및 10% FBS를 함유하는 24웰에 3 x 104개 세포/cm2/웰의 밀도로 시딩하였다. 전면생장 시, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌을 첨가하여 세포의 분화를 유도하였다. 각각의 조건에 대해 N=3을 시험하였다. 0일째 날을 세포 시딩의 날로서 카운팅하고 세포 전면생장 후 유도를 수행하였다. 총 유도 시간은 15일이었다. 2개의 실험군들이 있었다: 유도 배지에 직접적으로 첨가된 AMP 및 트랜스웰을 통해 전달된 AMP. AMP 농도를 125 ㎍/㎖에서 전술된 바와 동일하게 유지하였다. AMP의 존재 또는 부재 및 삽입물의 부재 하에서 음성 대조군(유도 부재)을 첨가하였다. 유도의 15일째 날에 ARS 염색 및 정량을 전술된 바와 같이 수행하였다.
결과
유도 배지의 부재 하에서 음성 대조군 세포는 일부 방추형 형태를 가지면서 육각형 형태를 유지하였다(도 72A). 방추-유사 형태는 관찰되지 않았고 방추 고리는 주변을 따라 형성되지 않았다. ARS는 단일층을 밝은 분홍색으로 염색하였다. 유도의 존재 하에서 양성 대조군 세포는 방추-유사 형태를 달성하였다. 세포 경계는 보다 더 두드러졌고 융기되었으며; 방추 고리는 웰 가장자리 근처의 주변을 따라 형성되었다. 단일층 중심은 고동색으로 염색되었고, ARS 염료는 진한 크림슨 적색을 갖는 방추 고리에서 농축되어 있었다. AMP를 사용한 처리는 직접적으로 AMP 입자가 단일층 상에 침전되게 하여 세포의 형태 관찰을 방해하였다. 그러나, 배양 웰 가장자리 근처에서 AMP 입자들 사이의 갭이 두 군들에서 두드러진 단일층 아래의 결여를 보였다. AMP만을 처리하였을 때와 유도의 존재 하에서 AMP를 처리하였을 때 사이에 세포 형태의 차이는 없었다. 가시화된 세포는 형태에 있어서 방추와 유사하였다. 양성 대조군처럼 방추 고리는 관찰되지 않았다. ARS 염색은 주변을 따라 존재하는 적갈색 염색과 함께 중심에 존재하는 크림슨 적색 염색을 보였다. 염색 색채 및 패턴은 유도 군과 비-유도 군 사이에 식별불가능하였다. 트랜스웰을 통한 AMP로의 처리는 단일층 상에서의 AMP 입자 침전을 발생시키지 않았다. 세포는 연신된 방추-유사 세포이었고, 이때 방추 고리는 웰 가장자리를 따라 형성되었다. 양성 대조군처럼 단일층 중심은 고동색으로 염색되었고, ARS 염료는 진한 크림슨 적색을 갖는 방추 고리에서 농축되어 있었다. GnHCl은 ARS 염료를 성공적으로 추출하였고, OD450 값의 변동 계수는 2% 내지 15%이었다(도 72B).
결과 요약
형태/ARS 염색
21일 동안 10% FBS 함유 α-MEM에서 배양된 음성 대조군은 가장자리를 따라 방추-유사 세포 또는 방추 고리를 발생시키지 않았다. AA, β-글리세로포스페이트 및 멜라토닌을 사용한 20일의 유도 후 양성 대조군인 MC3T3-E1 세포는 방추-유사 세포를 발생시켰고 웰의 가장자리 근처에서 방추 고리를 발생시켰다(도 72). 세포 단일층의 ARS 색채 및 염색 패턴은 음성 대조군과 양성 대조군 사이에 상이하였다. 음성 대조군 단일층은 양성 대조군만큼 많은 염료를 모으지 못하였고 균일한 밝은 분홍색을 보였다. 양성 대조군 단일층 중심은 고동색으로 염색되었고 ARS 염료는 방추 고리에서 농축되어 진한 크림슨색을 보였다(도 72).
배양 배지에서 직접적으로 AMP를 사용한 처리는 AMP 입자의 침전으로 인해 AMP만으로 처리된 군 및 유도의 존재 하에서 AMP로 처리된 군에서 세포 단일층의 관찰을 방해하였다. 그러나, 웰 가장자리를 따라 방추 고리가 관찰되지 않았고, 가장자리를 따라 일부 세포들은 방추-유사 형태를 보였다. AMP 입자를 통한 개구부는 단일층 아래의 결여를 보였다. ARS 염색은 AMP만으로 처리된 군 및 유도의 존재 하에서 AMP로 처리된 군 사이에 색채 또는 패턴의 차이를 보이지 않았다.
트랜스웰을 통한 AMP의 처리는 단일층의 상부 상에서 AMP 입자를 생성하지 않았다. 세포 형태는 양성 대조군과 유사하였고, 이때 방추-유사 세포 및 방추 고리가 형성되었다. ARS 염색 색채 및 패턴도 양성 대조군과 유사하였고, 이때 배경 단일층은 고동색으로 염색되었고 ARS 염료는 크림슨 적색으로 방추 고리에서 농축되어 있었다.
ARS 정량화
GnHCl은 단일층으로부터 ARS 염색을 추출하는 데에 필요하고 충분하다. 대조군들을 비교할 때, 음성 대조군부터 양성 대조군까지 0D450의 통계적으로 유의한 2배 증가가 있었다(p < 0.01). 또한, 음성/양성 대조군 및 AMP+ 유도로부터 OD의 약 6배 증가가 있었다. 96웰부터 24웰까지 표면적의 6.5배 증가가 있었고, 이것은 OD 증가의 원인일 수 있다. 본 발명자들은 배양 20일째 날에 ARS 염색 및 정량도 수행하였는데, 이것은 배양 기간을 2일 증가시켰고 광물화도 증가시켰을 수 있다.
AMP 단독은 음성 대조군 및 양성 대조군으로부터 각각 0D450의 통계적으로 유의한 10배(p < 0.01) 및 3배(p < 0.01) 증가를 유도하였다. 따라서, AMP 단독은 분화의 유도 및 촉진에 충분하였다. 유도의 존재 하에서 AMP는 AMP 단독으로부터의 OD450을 약간 감소시켰으나(p < 0.05), 양성 대조군으로부터 OD의 3배 증가를 보였다(p < 0.01). 유도 배지는 분화 및 광물화를 방해하였다.
유도의 존재 하에서 트랜스웰을 통해 전달된 AMP는 유도의 존재 하에서 직접적으로 전달된 AMP보다 3배 더 낮은 OD를 보였고(p < 0.01), 양성 대조군보다 약간 더 낮은 OD를 보였다(p < 0.05). AMP는 분화를 촉진하기 위해 직접적인 접촉을 요구한다. 직접적인 접촉 없이 AMP는 MC3T3-E1 광물화를 억제한다.
실시예 40: MSC에서 골형성의 유도에 대한 AMP의 효과
본 발명자들의 결과는 AMP가 전구-조골세포와 접촉할 때 MC3T3-E1 분화를 촉진한다는 것을 보여주었다. 그러나, AMP가 덜분화되고 덜 위탁된 세포주를 조골세포 계통, 예컨대, 중간엽 줄기 세포(MSC)로 생장시키고 분화시키는 데에 어떻게 영향을 미치는지는 불명확하다.
MC3T3-E1 세포는 단분화능 전구-조골세포이므로 조골세포를 향한 그의 분화를 촉진하기 위해 보충제만을 요구한다. 다른 전구세포주, 예컨대, 배아 줄기 세포(ESC) 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)는 덜 분화되어 있고 각각 소분화능 및 전분화능을 가졌다. 따라서, 본 발명자들은 인체의 상이한 영역으로부터 유래된 MSC에 대한 AMP의 효과를 연구함으로써 조골세포 분화 프로그래밍에 있어서 AMP의 역할 및 관련된 인자를 더 잘 이해할 수 있다. 이 연구는 본 발명자들로 하여금 AMP가 어떤 종류의 세포에 영향을 미칠 수 있는지 및 AMP가 상이한 전구세포에서 골형성의 유도에 어떤 효과를 나타내는지를 이해할 수 있게 할 것이다.
실험 디자인
하기 세포주들을 사용하였다: MC3T3-E1(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재), 인간 골수 세포로부터 유래된 중간엽 줄기 세포(론자(Lonza), 미국 메릴랜드주 월커필드 소재), 윤부 니치 세포(티슈 테크, 미국 플로리다주 마이애미 소재), 인간 양막(hAM) 기질 세포(티슈 테크, 미국 플로리다주 마이애미 소재), 및 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재).
세포를 96웰 플라스틱 배양 플레이트 내의 αMEM 배지 및 10% FBS에 3 x 104개 세포/cm2/웰의 밀도로 시딩하였다. 전면생장 시, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌(AGM)을 첨가함으로써 세포가 조골세포로 분화하도록 유도하였다. 각각의 조건에 대해 N=5를 시험하였다. 총 유도 시간은 20일이었다. 0일째 날을 세포 시딩 날로서 카운팅하고 세포 전면생장 후 유도를 수행하였다. 각각의 종류의 세포는 3개의 실험군을 가졌다: 음성 대조군, 양성 대조군 및 AMP 처리 단독 군. AMP 처리의 경우, 125 ㎍/㎖의 AMP 농도를 사용하였다. 20일의 배양 기간 동안 배지(100 ㎕)를 3일마다 교체하였다. (유도 또는 세포 없이) AMP를 갖는 음성 대조군을 첨가하였다. ARS 염색 및 정량을 20일째 날에 전술된 바와 같이 수행하였다. 그 다음, 추출물을 450 nm에서 판독하였다.
결과
HUVEC 세포는 4일째 날까지 세포 생장의 그물-유사 패턴을 형성하였다(도 74A). 그러나, 21일째 날까지 세포의 네트워크의 상부 상에 침전된 사멸된 세포와 함께 유의한 세포 사멸이 있었다. 대다수의 HUVEC 세포는 10% 파라포름알데하이드로 고정될 수 없었고, ARS로 염색된 소수의 세포가 어두운 갈색을 보였다. AMP가 HUVEC 세포의 상부 상에 침전되었고 세포의 네트워크를 덮었지만, AMP 입자는 ARS 염색 시 세포와 함께 플라스틱 웰로부터 탈착되었고, 극소수의 잔존 AMP 입자도 어두운 갈색으로 염색되었다.
유도의 부재 하에서 hBM MSC는 긴 섬유아세포 형태를 유지하였다(도 74A). 유도의 존재 하에서 MSC는 4일째 날까지 보다 더 융기된 세포 가장자리를 가지면서 연신되었다. 10일째 날까지, 유도된 MSC는 방추-유사 세포를 발생시켰고, 세포는 단일층 상에서 서로 중첩되는 층으로 생장하였다. 17일째 날, 중첩되는 방추 세포는 벽의 중심으로부터 약 5 mm 떨어진 위치에서 조밀한 고리를 형성하였다. ARS 염색은 비-유도된 MSC 단일층이 크림색으로 염색되었고 방추 고리가 적황색으로 염색되었다는 것을 보여주었다. AMP로 처리된 MSC는 단일층을 덮는 AMP 입자를 함유하였다. 시간의 경과에 따라 단일층은 AMP 입자의 농축된 영역 주변에서 축소되었다. ARS 염색은 진한 적갈색을 보여주었다.
유도의 부재 하에서 hAM 기질 줄기 세포는 직사각형 형태를 유지하였다(도 74A). 4일째 날까지, 유도의 존재 하에서 세포 형태는 변화하였고 세포는 일부 발달하는 방추형 형태를 가지면서 연신되었다. AMP 입자는 침전되었고 AMP로 처리된 기질 세포에서 4일째 날까지 단일층의 일부를 덮었다. 4일째 날까지 AMP 입자에 의해 덮여지지 않은 세포는 형태에 있어서 직사각형이었다. 17일째 날까지 AMP 입자에 의해 덮여지지 않은 세포는 양성 대조군의 유도된 세포와 유사하게 연신되었다. 21일째 날까지 AMP 입자는 웰을 덮었고 세포 형태는 관찰될 수 없었다. ARS 염색은 크림색으로 염색되는 비-유도된 세포를 보여준 반면, 유도된 세포는 밝은 분홍색으로 염색되었다. AMP로 처리된 세포는 AMP로 처리된 hBM MSC와 유사한 진한 적갈색으로 염색되었다.
4 M GnHCl을 사용한 추출은 2% 내지 15%의 OD450 값의 변동 계수를 발생시켰다(도 74B).
결과 요약
결과는 유도제 또는 AMP를 갖는 HUVEC의 음성 대조군에서 광물화가 인지되지 않았다는 것을 시사하였다. hBM MSC 및 hAM 기질 줄기 세포 둘다의 경우, AMP에 의해 촉진된 광물화보다 더 적은 광물화가 유도제에 의해 촉진되었다.
실시예 41: MC3T3-E1 분화 동안 광물화(mineralization) 및 세포 증식에 대한 AMP의 효과
MC3T3-E1 세포는 성숙 조골세포가 되기 전에 3개의 주요 단계를 거친다: 증식, 매트릭스 침착/성숙 및 광물화(도 75). 본 발명자들의 결과는 AMP가 MC3T3-E1 세포에서 광물화를 촉진한다는 것을 보여주었다. ARS 염색을 관찰할 때, ARS 염색은 AMP로 처리된 세포가 양성 대조군 및 음성 대조군보다 더 어둡고 더 조밀하게 염색되었다는 것을 보여준다(도 72). 추가로, AMP 입자가 단일층을 덮었을 때 AMP 입자 아래에 단일층의 결여가 있었다(도 77). 한 가능성은 AMP가 MC3T3-E1 세포에 대한 스캐폴드로서 작용하고 3D 매트릭스에서 이 상호작용이 세포로 하여금 생장하고 광물화하게 하였다는 것이었다. 따라서, AMP는 MC3T3-E1 세포의 증식을 증가시킴으로써 광물화를 촉진할 수 있다.
실험 디자인
MC3T3-E1 세포를, 전술된 바와 같이 αMEM 배지 및 10% FBS를 함유하는 24웰에 3 x 104개 세포/cm2/웰의 밀도로 시딩하였다. 전면생장 시, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌을 첨가함으로써 세포의 분화를 유도하였다. 각각의 조건에 대해 N=3을 시험하였다. 1일째 날을 세포 시딩 날로서 카운팅하고 세포 전면생장 후 유도를 수행하였다. 총 유도 시간은 20일이었다. 6개의 시점에서 샘플링하였다: 1일째 날, 2일째 날, 7일째 날, 10일째 날, 13일째 날 및 20일째 날. 각각의 시점은 4개의 군을 가졌다: 음성 대조군, 양성 대조군, AMP 단독 처리, AMP+(유도 존재). 사용된 AMP 농도는 125 ㎍/㎖이었다.
MTT 분석에 의해 측정된 증식 분석의 경우, 증식을 위한 배양 기간은 9일이었다. 4개의 시점에서 샘플링하였다: 1일째 날, 2일째 날, 4일째 날 및 9일째 날. 각각의 시점은 3개의 군을 가졌다: 세포 단독, AMP 단독, AMP+ 세포. 사용된 AMP 농도는 125 ㎍/㎖이었다.
결과
광물화
1일째 날, 세포를 24시간 동안 시딩하고 유도 배지 또는 AMP로 처리하지 않았다(도 76). 세포는 둥글었고 단일층 상에서 보다 더 융기되어 있는 듯하였다. ARS 염색은 광물화를 거의 또는 전혀 보이지 않으면서 밝은 베이지색을 보였다. 2일째 날, 유도의 부재 하에서 음성 대조군 세포는 육각형이 되었다. ARS는 단일층을 밝은 복숭아색으로 염색하였다. 유도의 존재 하에서 양성 대조군 세포는 광물화를 거의 갖지 않으면서 음성 대조군과 동일하게 보였고 ASR 염색은 밝은 복숭아색을 보였다. AMP를 사용한 처리는 MC3T3-E1 세포 형태의 변화를 야기하였고, 방추형 형태 세포 및 방추 세포가 관찰되었다. ARS 염색은 1일째 날부터 광물화의 증가를 보였고 단일층은 밝은 분홍색으로 염색되었다. 그러나, AMP 입자가 침전되는 영역은 적갈색으로 염색되었다. 유도의 존재 하에서 AMP 처리도 일부 세포 형태를 변화시켰다. 방추형 형태의 세포가 존재하였고, 단일층도 적갈색으로 염색된 AMP 입자 주변 영역을 가지면서 밝은 분홍색으로 염색되었다. 7일째 날, 음성 대조군 세포는 보다 더 육각형으로 보였고, 세포 경계는 보다 더 뚜렷하였다. 광물화의 증가가 있고, 단일층은 밝은 베이지색으로 염색되었다. 유도의 존재 하에서 양성 대조군은 방추형 형태의 세포 및 방추 고리를 발생시켰다. ARS도 보다 많은 광물화를 갖는 진한 분홍색을 염색하였다. AMP를 사용한 처리 및 유도의 존재 하에서 AMP를 사용한 처리는 AMP 입자의 침전을 야기하였고 세포 형태는 관찰될 수 없었다. 개별 세포를 갖는 세포 단일층은 관찰될 수 없었다. ARS는 적갈색으로 염색된 AMP 입자 주변 영역 및 밝은 분홍색으로 염색된 단일층을 보였다. GnHCl은 ARS 염료를 성공적으로 추출하였고 OD450 값의 변동 계수는 6% 내지 16%이었다.
결과 요약
음성 대조군 MC3T3-E1 세포는 2일 후 세포 배양 기간의 증가에 따라 ARS 염색의 증가 및 이에 따른 광물화의 증가를 보인다(도 76). 이전 결과와 유사하게, 유도 배지로 배양된 양성 대조군 MC3T3-E1 세포는 세포 형태 변화를 겪었고 7일째 날까지 방추형 형태의 세포 및 방추 고리를 발생시켰다(도 76). AMP 처리의 1일 후(2일째 날), 유도의 존재 또는 부재 하에서 세포 형태의 변화가 관찰될 수 있었다. 세포는 방추 및 심지어 섬유아세포 형태의 세포가 되었다(도 76A). 이 변화는 음성 대조군 또는 양성 대조군에서 관찰되지 않았다. 추가로, 이 변화는 적어도 4일의 배양 후 유도된 MC3T3-E1 세포에서 관찰되었다(도 76A).
AMP로 처리된 세포 및 유도의 존재 하에서 AMP로 처리된 세포는 ARS 정량을 통해 나타낸 바와 같이 2일째 날까지 양성 대조군으로부터 광물화의 통계적으로 유의한 증가를 보였다(도 76B). 단일층은 밝은 분홍색으로 염색되었으나, AMP 입자가 침전된 작은 영역은 증가된 광물화를 보였고 진한 적갈색으로 염색되었다(도 76A). 광물화의 이 증가는 배양 기간 전체에 걸쳐 계속되었다.
유도의 존재 하에서의 AMP 처리와 비교될 때 AMP 단독 처리 시 광물화 촉진의 증가는 없었다.
증식
AMP가 세포 증식 촉진을 통해 광물화를 촉진하였는지를 확인하기 위해, MC3T3-E1 세포를, αMEM 배지 및 10% FBS를 함유하는 96웰에 3 x 104개 세포/cm2/웰의 밀도로 시딩하였다. 전면생장 시, AMP 군을 3일마다 배양 배지에 첨가된 새로운 125 ㎍/㎖ AMP로 처리하였다. MTT 분석을 1일째 날, 2일째 날 및 4일째 날에 수행한 반면, BrdU 분석을 1일째 날, 2일째 날 및 16일째 날에 수행하였다.
비처리된 MC3T3-E1 세포에서 세포 생존력은 1일째 날부터 4일째 날까지 증가한다(도 77A). AMP로 처리된 세포에서 세포 생존력은 세포 단독 군의 경향을 따라 2일째 날에 감소한 후 4일째 날에 2배 초과의 수준이 되었다. BrdU 분석은 세포 단독 군 및 AMP로 처리된 세포 군 둘다에서 1일째 날 후 세포 증식의 감소를 보였다(도 77B). 세포 단독 군에서 세포 증식은 2일째 날까지 절반 초과의 수준만큼 감소하였고 16일째 날까지 계속 감소하였다. AMP로 처리된 세포에서 세포 증식은 16일째 날까지만 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 이들 발견은 AMP가 16일의 배양 기간 동안 증식을 촉진하지 않았다는 것을 암시한다.
결과 요약
MC3T3-E1 세포에서 세포 생존력은 MTT 분석을 통해 입증된 바와 같이 1일째 날부터 4일째 날까지 증가하였다. AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포는 1일째 날부터 2일째 날까지 세포 생존력의 감소를 보였지만, 비처리된 세포와 유사한 상향하는 경향을 따랐다. 그러나, AMP로 처리된 세포에서 4일째 날 세포 생존력은 비처리된 MC3T3-E1 세포의 대략 절반이었다. BrdU를 통해 측정된 세포 증식은 1일째 날부터 16일째 날까지 줄곧 감소하였다. AMP로 처리된 세포와 달리, 비처리된 MC3T3-E1 세포에서 세포 증식은 2일째 날까지 절반 초과의 수준만큼 감소하였다. 16일째 날까지, AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포 및 비처리된 MC3T3-E1 세포는 동일한 수준의 세포 증식을 나타내었다.
실시예 42: AMP로 처리된 MC3T3-E1 및 hBM MSC에서 골형성의 초기 단계 동안 발현된 유전자의 확인
인간 골수 중간엽 줄기 세포(hBM MSC)는 전분화능을 나타내고 다수의 종류의 조직, 예컨대, 조골세포, 연골세포 및 지방세포로 분화할 수 있다(Born, 2012 J Cell Biochem. 113(1):313-21). 이 세포는 생체내에 이식되었을 때 새로운 골을 형성할 수 있고, 시험관내에서 hBM MSC는 β-글리세로포스페이트, 아스코르브산, 비타민 D3 및 저용량의 덱사메타손에서 배양됨으로써 골을 형성할 수 있다. hBM MSC에 대한 골형성은 특이적 전사 인자, 부착 분자 및 ECM의 단백질을 비롯한 조골세포 관련 유전자의 발현에 의해 조절된다(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313-21;Vater (2011) Acta Biomater. 7(2):463-77). 성숙 조골세포로의 진행은 MC3T3-E1의 진행을 반영하고 세포 증폭 능력의 상실, 골형성 마커 발현의 증가 및 ECM의 광물화와 함께 일어난다(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313-21). 먼저, 세포는 콜라겐 I(Col I)의 발현과 함께 ECM의 합성을 개시한다. 동시에, 골 특이적 알칼리성 포스파타제(bALP) 발현은 증가하고, 4일째 날까지 대조군의 유도된 세포(6 x 104개 세포/60 mm 배양 접시)에서 ALP 수준의 유의한 증가가 관찰될 수 있었다(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313-21; Jaiswal (1997) J Cell Biochem. 64:295-312). 분화가 계속됨에 따라, 세포는 단백질, 예컨대, 골 시알로 단백질(BSP), 오스테오폰틴, 오스테오넥틴 및 오스테오칼신을 생성한다. 마지막으로, MC3T3-E1 세포에서의 골형성과 매우 유사한 ECM의 광물화는 성숙 조골세포를 표시한다.
이 실시예에서, 3종의 세포주, 즉 MC3T3-E1 세포 및 hBM MSC 세포에서 골형성의 초기 단계에서 발현된 유전자 및 전사 인자를 확인하였다. 본 발명자들의 결과는 2일째 날(처리 1일째 날)까지 양성 대조군에 비해 AMP로 처리된 MC3T3-E1 세포에서 광물화의 통계적으로 유의한 증가가 관찰될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 실험은 처리 후 특정 유전자에 대한 AMP의 효과를 확인하기 위해 골형성의 초기 단계에 초점을 맞추었다.
실험 디자인
MC3T3-E1 또는 인간 골수 MSC 세포를, 전술된 바와 같이 αMEM 배지 및 10% FBS를 함유하는 24웰 플레이트에 3 x 104개 세포/cm2/웰의 밀도로 시딩하였다. 전면생장 시, 아스코르브산 및 β-글리세롤포스페이트를 첨가하여 세포의 분화를 유도하였다. 각각의 시점에서의 각각의 분석을 위해, N=2를 시험하였다. 5개의 시점에서 샘플링하였다: 0일째 날(전면생장 후 유도/처리 전), 1일째 날, 2일째 날, 4일째 날 및 6일째 날. 각각의 시점은 3개의 군을 가졌다: 음성 대조군, 양성 대조군, AMP 단독 처리. 사용된 AMP 농도는 125 ㎍/㎖이었다.
결과
hMSC 발현
AMP는 배양 24시간 이내에 BMP2 및 BMP6 전사체의 강한 내생성 발현을 유도한다(각각 60배 및 5배)(도 78a). BMP2는 1일째 날에 그의 정점에 도달하였고(120배) 감소를 보이기 전에 4일째 날까지 높은 수준(60배 내지 10배)을 유지하였다. 대조적으로, BMP6은 4시간에서 정점에 도달한 후 1일째 날부터 점진적인 감소를 보였다. 비교하건대, AMP는 BMP4, BMP7 및 BMP9의 발현 수준을 변화시키지 않았다. 그럼에도 불구하고, AG는 4일째 날에만 BMP2 및 BMP6의 약한 상향조절(1배 내지 2배)을 유도하였고 1일째 날 후 BMP4의 현저한 상향조절(4배 내지 10배)을 유도하였다. 비교하건대, AGM은 BMP7 및 BMP9 중 어느 것의 발현도 변화시키지 않았다.
Runx2는 AMP의 경우 1일째 날에 정점에 도달하였으나 AGM의 경우 2일째 날에 정점에 도달하였다(도 78a). 그 다음, 두 군들은 점진적인 감소를 가진 후 6일째 날에 또 다른 정점에 도달하였다. Runx2는 미성숙 골의 형성을 유도하는 미성숙 조골세포로의 전분화능 중간엽 세포의 분화를 유도한다. 나아가, Runx2는 조골세포 분화의 초기 단계 동안 주된 골 매트릭스 유전자의 발현을 유발하나, Runx2는 성숙 조골세포에서 이들 유전자 발현의 유지를 위해 필수적이지 않다(Komori (2010) Adv Exp Med Biol. 658:43-9).
ALP 및 Sox9 둘다가 4일째 날에 정점에 도달하였고, 이때 AMP에 의해 상향조절된 수준은 AGM보다 더 낮았다(도 78a). 이 경향은 ALP 및 Sox9가 Runx2의 하류에 위치한다는 견해와 일치한다. ALP는 골형성의 초기에서 발현되고 칼슘이 용액으로부터 석출되어 결정화되게 하는 알칼리성 환경을 생성한다.
AMP는 4시간 및 4일째 날에 정점에 도달한 VEGF를 상향조절하였으나, AGM은 4일째 날에만 VEGF를 상향조절하였다(도 78a). AMP는 1일째 날에 CXCR4를 상향조절한 반면 AGM은 SDF1을 상향조절하였는데, 이때 전자에 대해서는 빠른 감소가 있었으나 후자에 대해서는 보다 느린 감소가 있었다. 문헌(Kortesidis et al., (2005) Blood. 105(10):3793-801)은 SDF-1이 SDF-1/CXCR4 상호작용을 파괴하도록 작용할 수 있는 환경적 자극에 반응하여 증식하고 분화하는 데에 요구될 때까지 원시 비위탁된 BMSSC 집단을 그들의 혈관주위 적소 내에 위치시키는 작용을 할 수 있다는 것을 암시한다. 7개의 프리컨디셔닝 MSC 실험에서, CXCR4의 발현은 통상적으로 약 2배 내지 4배 증가하나(Cencioni et al., (2012) Cardiovasc Res. 94(3):400-7), AMP를 사용한 본 발명자들의 결과는 1일째 날 후 60배 증가를 보여주었다.
SDF-1 발현은 도 78a에서와 같이 높지는 않은 듯하지만 MSC의 모든 군들에서 매우 높았다. SDF-1은 대략 20 주기에서 관찰된 반면, GAPDH는 대략 17 주기에서 관찰되었다. 문헌으로부터, 기질 세포 유래의 인자-1이 전구세포 상의 부착 분자를 활성화시키고 SDF-1에 대한 mAb가 조혈 전구세포의 내피 횡단 이동을 억제한다는 것이 공지되어 있다(Imai et al. (1999) Blood 93(1):149-56). SDF-1은 CXCR4+/CD34+ 세포를 활성화시키고 이 세포의 부착 및 내피 횡단 이동을 유발한다(Bhakta et al. (2006) Cardiovasc Revasc Med. 7:19-24). GAPDH 발현은 2일째 날부터 6일째 날까지 AMP 군에서 증가하였으므로 증식을 추정할 수 있다. 이 경향은 다른 샘플들에서 관찰되지 않았다. 나아가, BMP9는 (40 주기 후) 검출가능하지 않았고, CXCR4는 대략 33 주기에서 검출되었고, VEGF는 대략 19 주기에서 검출되었고, SOX-9는 대략 27 주기에서 검출되었다. BMP4는 대략 28 주기에서 검출되었고, BMP7은 (40 주기 후) 검출되지 않았고, BMP2는 대략 20 주기에서 검출되었고, Runx2는 대략 25 주기에서 검출되었고, BMP6은 대략 27 주기에서 검출되었고, ALPL은 대략 24 주기에서 검출되었다.
MC3T3-E1 발현
MSC는 골전구체가 이미 계통 경로로부터 멀리 밀려나 있고 골형성만을 발생시킬 것이기 때문에 전분화능을 나타낸다는 것이 이미 공지되어 있다. 예상된 것과 대조적으로, BMP2 발현은 인간 MSC에 비해 특히 마우스 세포에서 거의 발현되지 않았다(도 79). BMP는 인간에서 골형성을 촉진하는 데에 불충분한 것으로 밝혀져 있으나 아직 마우스 세포에서는 충분히 촉진할 수 있다(Osyzka et al. (2004) Cells Tissues Organs. 176(1-3):109-19., Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res. 52(5):408-14). BMP-2의 발현은 유전자 어레이에 의해 표시된 바와 같이 MC3T3 세포에서 현저하지 않다(Beck et al. (2001) Cell Growth & Differentiation 12: 61-83). 인간 세포와 설치류 세포 사이에서 관찰된 차이는 인간 세포의 Smad1과 달리 설치류 Smad1이 골형성 동안 ERK 연결제 인산화를 받지 않는다는 것을 시사할 수 있다. 대안적으로, 설치류 세포에서의 Smad1 활성은 ERK-매개된 연결제 인산화에 의해 억제될 수 없다(Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res. 52(5):408-14). 약하게 반응하는 인간 MSC에서의 BMP-유도된 골형성은 ERK 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3-K) 경로의 조절(억제)을 요구하고; 인슐린/IGF-I-활성화된 PI3-K/AKT 경로의 억제는 인간 MSC의 무혈청 배양물에서 BMP-유도된 알칼리성 포스파타제 및 오스테오폰틴 발현을 감소시키나, Smad의 BMP 활성화를 증가시킨다(Osyzka et al. (2005) Endocrinology. 2005 (8):3428-37).
Runx2도 hMSC에 비해 MC3T3 세포에서 상이한 것으로 밝혀졌다. MC3T3 세포에서 유전자의 상향조절을 야기하는 사건이 2일째 날에 분명히 존재한다. AGM 군은 Pi3K 및 MAPK 경로와 관련될 수 있는, AMP 군의 반대 효과를 갖는 듯하였다. 골 시알단백질(BSP)로서도 공지되어 있는 Ibsp는 2일째 날에 AMP에서 상향조절되나 다른 시간에서는 발현되지 않는다. 양성 군에서 BSP는 2일째 날 후 고도로 발현된다.
오스테오칼신(OCN)으로서도 공지되어 있는 Bglap-rs1도 2일째 날에 AMP에서 상향조절되나 다른 시간에서는 발현되지 않는다. BSP와 마찬가지로 OC는 양성 군에서 2일째 날 후에 고도로 발현된다. 이들 결과의 분석을 통해, BSP 및 OCN이 성숙 조골세포에 의해 발현되는 것으로 공지되어 있기 때문에 상향조절될 필요가 있다고 생각할 것이다. Runx2는 MC3T3에서 Col1, BSP 및 OCN의 발현을 조절하는데, 이것은 본 발명자들의 결과와 일치한다. Runx2는 BSP 및 OCN과 마찬가지로 2일째 날에 증가하고 다른 시간에서는 발현되지 않는다. 요약하건대, AMP는 골형성 유전자 발현을 하향조절하나 광물화를 촉진한다.
실시예 43: MC3T3-E1 모델 시스템을 사용한 광물화에 대한 AM으로부터 정제된 nHC-HA/PTX3의 효과
이전 실험은 유도제, 예컨대, 아스코르브산, β-글리세롤포스페이트 및 멜라토닌(AGM)과 무관하게 광물화를 촉진하는 AMP의 독특한 성질을 명확히 입증하였다. 이들 실험에서, AMP를 AGM의 존재 또는 부재 하에서 뮤린 조골세포 전구세포주(MC3T3)에 첨가하여 AMP의 효능을 측정하였다. GnHCl 추출 방법과 함께 알리자린 레드 염색도 추가 정량을 위해 다양한 시점에서 사용하였다. AMP가 AGM과 무관하게 광물화를 향상시켰을 뿐만 아니라 보다 빠른 속도로 광물화를 향상시켰다는 결론을 도출하였다. AMP의 추가 연구는 AMP에 의해 나타난 골유도 효과가 직접적인 세포 접촉을 요구한다는 것을 보여주었다. 즉, AMP와의 직접적인 접촉 하에서 세포는 AGM의 도입 없이 광물화를 가속화하고 향상시켰을 것이다.
종래 연구는 유도 하에서 MC3T3-E1 분화가 3개의 단계, 즉 증식(1일째 날부터 9일째 날까지), ECM 형성(9일째 날부터 16일째 날까지) 및 광물화(형성된 ECM에서 침착 광물)(16+일째 날)로 세분될 수 있다는 것을 보여주었다(Quarles et al. (1992) J Bone Miner Res. 7(6):683-92.; Hong et al. (2010) Exp Cell Res. 316(14):2291-300). 그러나, 본 발명자들의 이전 Aim 4는 AMP를 사용하여 7일 내지 10일 이내에 광물화를 용이하게 검출할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은 AM으로부터 정제된 nHC-HA/PTXS가 광물화 촉진을 책임지는지를 확인하기 위해 8일째 날에 본 발명자들의 ARS 분석을 수행할 것이다. Aim 4에서 관찰된 바와 같이 결과가 두드러질 것이기 때문에 8일째 날을 선택하였고, 0일째 날, 3일째 날 및 6일째 날에 배지만을 교체해야 할 것이다.
nHC-HA/PTX3이 양막의 공지된 소염, 항-혈관신생 및 흉터형성방지 치료 작용을 책임진다는 것은 이미 공지되어 있다. 고정화된 HC-HA/PTX3이 광물화의 촉진에 대한 AMP의 효과를 책임진다는 것이 본 발명자들의 가설이다. nHC-HA/PTX3도 HA를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 추정되는 효과가 HA에 존재하는 것이 아니라 독특하게 nHC-HA/PTX3에 존재하는지를 알아보기 위해 nHC-HA/PTX3을 HA와 비교할 것이다. 하이알루로난(HA)은 단일 반복 이당류 유닛으로 구성된 비-설페이트화된 글리코스아미노글리칸이다. HA는 매트릭스 조립 및 조직 수화를 촉진하는 결합 조직 내의 중요한 성분이다. 루벤(Luben et al)은 HA가 효소를 재흡수 부위로부터 멀리 확산시키거나 파골세포의 이동성을 조절하는 차단막으로서 작용하는 칼슘 결합제로서 작용한다고 생각하였다. 스턴(Stern)과 라이즈(Raisz)는 "하이알루론산이 골 재흡수와 명확히 관련되어 있기 때문에 연구하기에 가장 적절할 것으로 보인다"고 진술하였다. HA는 그의 흡습성 때문에 그 자신의 부피의 10,000배를 점유할 수 있다. 따라서, HA는 증식 세포가 억제 접촉을 피할 수 있게 한다. 하이알루론산 합성은 유사분열에 앞서고 분열하는 세포를 그의 하층으로부터 해리시켜 세포 이동을 허용한다(Balazs (2001) Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 280: R466-R472).
실험 디자인 :
뮤린 MC3T3-E1 세포(C-136)를 액체 질소 동결기로부터 꺼내고 80% 전면생장률(약 1.5 x 106개 세포)[4*(3.1 x 104)*9= 1,116,000개 세포]까지 3일마다 교체된 10% FBS 함유 αMEM 배지(100 mm 접시 당 10 ㎖)를 함유하는 100 mm 접시(5개 접시) 상에서 생장시켰다. 그 다음, 세포를 3.1 x 104개 세포/cm2/96 플라스틱 웰의 밀도로 시딩하였다. 배지(96웰 당 100 ㎕)를 2일 내지 3일마다, 즉 0일째 날(수요일), 2일째 날(금요일) 및 5일째 날(월요일)에 교체하고 배양을 8일째 날에 종결하였다. 조건 당 N=4를 시험하였다.
군의 요약은 다음과 같았다:
대조군:
음성 대조군: 통상적인 96웰 플레이트 상에서 아무것도 존재하지 않는다.
양성 대조군 1: 통상적인 96웰 플레이트 상의 AGM
양성 대조군 2: 통상적인 96웰 플레이트 상에 3일마다 첨가된 125 ㎍/㎖의 AMP
실험군:
음성 대조군: 코바링크-NH 96웰 플레이트
실험군 1: 코바링크-NH 96웰 플레이트에 3일마다 첨가된 AGM
실험군 2: 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 HA
실험군 3: 3일마다 첨가된 AGM을 갖는 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 HA(H-124)
실험군 4: 코바링크-NH 96웰 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 nHC-HC/PTX3
실험군 5: 3일마다 첨가된 AGM을 갖는 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 nHC-HC/PTX3
AGM 군의 경우: 0일째 날 및 3일째 날, 골형성 유도 배지 #1(아스코르브산, β-글리세롤포스페이트)로 교체하였다. 6일째 날, 골형성 유도 배지 #2(아스코르브산, β-글리세롤포스페이트, 멜라토닌)로 교체하였다. 0일째 날, 0.2 ㎖의 10X 유도 배지를 제조하였다. 3일째 날 및 6일째 날, 10 ㎖의 골형성 유도 배지를 새로 제조하였다. 유도 배지에 대한 설명서는 시험관내 골형성 분석 키트(밀리포어)로부터 입수되었다.
유도 배지 #1: 9.88 ㎖의 αMEM 배지 + 10%, 20 ㎕ 아스코르브산 2-포스페이트 500X(밀리포어, 파트 2004011), 100 ㎕ 글리세롤 2-포스페이트 100X(밀리포어, 파트 2004011).
유도 배지 #2: 9.87 ㎖의 αMEM 배지 + 10%, 20 ㎕ 아스코르브산 2-포스페이트 500X(밀리포어, 파트 2004011), 100 ㎕ 글리세롤 2-포스페이트 100X(밀리포어, 파트 2004011), 10 ㎕ 멜라토닌 50 μM(밀리포어, 파트 2004011). 500 ㎕의 dH20을 공급된 6 ㎍의 멜라토닌에 첨가한다.
ARS 염색 및 정량을 전술된 바와 같이 수행하였다. 니콘 이클립스 CFI60을 이용하여 사진을 10배율로 촬영하였다.
결과
MC3T3-E1 세포를 8일 동안 상이한 웰 플레이트 상에서 배양하였다. 8일째 날, 웰의 위상차 사진을 촬영하였고 이 사진은 하기에서 확인할 수 있다(도 79A 및 79B). 음성 대조군 웰은 둥근 세포를 보여주었고, ARS는 매우 밝은 분홍색을 염색하였다. 유도 배지를 갖는 웰은 훨씬 더 밝은 적색을 보여주었고, 방추 세포는 웰의 주변에서 관찰되었다. ARS 염색은 외부 주변 고리에서 더 풍부하게 관찰되었다. AMP를 사용한 처리는 ARS 처리 후 크림슨 적색을 보여주었고, 세포들은 AMP가 이들 세포의 상부 상에 침전되었기 때문에 알아보기 다소 어려웠다. (비록 응집이 고정화된 HC-HA 상에서 다른 종류의 세포의 사용 시 관찰되었을지라도) 실험 동안 응집은 관찰되지 않았다. 현미경관찰 사진을 6일째 날, 7일째 날 및 8일째 날에 촬영하였다.
구아니딘 하이드로클로라이드 추출 방법을 8일째 날에 사용하였고, 웰 플레이트를 하룻밤 동안 항온처리하였다. GnHCl은 육안으로 알아보기 어려웠지만 ARS 염료를 추출할 수 있었고; 모든 웰은 동일한 밝은 분홍색/적색을 갖는 듯하였다. 플레이트 판독기가 490 nm 또는 보다 더 가까운 파장에서 판독하는 능력을 갖지 않았기 때문에 ARS 추출을 450 nm에서 정량하였다. 결과는 도 79C에서 확인될 수 있다. * 부호는 p < 0.05의 통계적 유의성을 표시한다(+는 AGM의 존재를 표시하고, -는 AGM의 부재를 표시한다).
이전 결과와 마찬가지로, AMP는 유도제를 필요로 하지 않으면서 광물화를 성공적으로 촉진할 수 있었다. 이 실험은 8일 동안만 지속되었으므로, 결과는 20일 동안 지속된 Aim 4에서만큼 두드러지지 않다. AGM으로 처리된 모든 조건들은 그들의 음성 대조군 대응물에 비해 광물화의 증가를 보였다. 본 발명자들의 결과는 고정화된 nHC-HA/PTXS가 AMP에서 광물화의 촉진을 책임지지 않는다는 것도 보여준다. 따라서, 광물화를 촉진하는 AMP의 또 다른 활성 성분이 존재해야 한다.
실시예 44: 연골네 골화에 대한 HC-HA/PTX3(PBS) 및 HC-HA/PTX3(Gn)의 효과
골형성 및 연골형성을 위한 마스터 전사 인자들(각각 Runx2 및 Sox9)은 14일의 배양 기간에 걸쳐 두 HC-HA 조건들에서 세포에 의해 발현되었다. 가용성 HC-HA/PTX3 및 불용성 HC-HA/PTX3 둘다가 상업적으로 제공된(하기 참조) 골유도제 AGM(즉, 아스코르브산, 글리세롤포스페이트, 멜라토닌) 없이 BMP2의 발현 및 BMP6의 어느 정도의 발현을 촉진할 수 있었다.
연골형성 마커 콜라겐 2는 AGM을 필요로 하지 않으면서 HC-HA/PTX3(PBS)에 의해 고도로 발현되었다. AGM의 첨가 시 HC-HA/PTX3(Gn)도 콜라겐 2를 상향조절할 수 있었다. 골형성 마커(BSP, ALPL, Osx)는 14일째 날에 HC-HA 조건에 의해 상향조절되었고, 이로써 연골로부터 골 유전형으로의 전이를 확인시켜주었다.
실험 디자인 :
배양 조건: 론자(스위스 바젤 소재)로부터 구입된 인간 골수 유래의 중간엽 줄기 세포를 액체 질소 동결기로부터 꺼내고 80% 전면생장률까지 3일마다 교체된 동일한 배지를 함유하는 100 mm 접시 상에서 생장시켰다. 세포 배양 배지는 10% 태아 소 혈청 및 항생제를 함유하는 αMEM이었다. 배양 배지(100 mm 접시 당 10 ㎖)를 3일마다 교체하였고, 세포들이 상기 원하는 세포 수에 도달할 때까지 80% 전면생장률에서 하위계대배양하였다. 실험을 위해, 골유도제인 아스코르브산 2-포스페이트, 글리세롤 2-포스페이트 및 멜라토닌(AGM)의 존재 또는 부재 하에서 세포를 고정화된 HA, HC-HA(PBS) 또는 HC-HA(Gn) 상에서 3.1 x 104개 세포/96 플라스틱 웰의 밀도로 시딩하였다. 첨가된 AGM의 최종 농도는 각각 0.2 mM, 10 mM 및 50 nM이었다. 세포가 시딩되었을 때(0일째 날) AGM을 동시에 첨가하였고, mRNA를 1일째 날, 7일째 날 및 14일째 날에 추출하였다. 유전자 발현을 정량하기 위해, qPCR을 수행하였다. 배양 배지(96웰 당 100 ㎕)를 3일마다 교체하였다.
실험군의 요약은 다음과 같았다:
음성 대조군: 코바링크-NH 96웰 플레이트
실험군 1: 코바링크-NH 96웰 플레이트에 3일마다 첨가된 AGM
실험군 2: 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 HA
실험군 3: 3일마다 첨가된 AGM을 갖는 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 HA
실험군 4: 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 4X nHC-HC/PTX3
실험군 5: 3일마다 첨가된 AGM을 갖는 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 4X nHC-HC/PTX3
실험군 6: 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 4X nHC-HC/PTX3(GuHCl 추출)
실험군 7: 3일마다 첨가된 AGM을 갖는 코바링크-NH 96웰 플레이트 상에 고정화된 20 ㎍/㎖의 4X nHC-HC/PTX3(GuHCl 추출)
AGM 유도 군의 경우: 0일째 날 및 3일째 날, 골형성 유도 배지 #1(아스코르브산, 글리세롤포스페이트)로 배지를 교체하였다. 6일째 날, 골형성 유도 배지 #2(아스코르브산, 글리세롤포스페이트, 멜라토닌)로 배지를 교체하였다. 0일째 날, 10X 유도 배지를 제조하였다. 3일째 날 및 6일째 날, 10 ㎖의 골형성 유도 배지를 새로 제조하였다. 유도 배지의 제조에 대한 설명서는 시험관내 골형성 분석 키트(밀리포어)로부터 입수되었다.
유도 배지 #1: 9.88 ㎖의 αMEM 배지 + 10%, 20 ㎕ 아스코르브산 2-포스페이트 500X(밀리포어, 파트 2004011), 100 ㎕ 글리세롤 2-포스페이트 100X(밀리포어, 파트 2004011).
유도 배지 #2: 9.87 ㎖의 αMEM 배지 + 10%, 20 ㎕ 아스코르브산 2-포스페이트 500X(밀리포어, 파트 2004011), 100 ㎕ 글리세롤 2-포스페이트 100X(밀리포어, 파트 2004011), 10 ㎕ 멜라토닌 50 μM(밀리포어, 파트 2004011). 500 ㎕의 dH20을 공급된 6 ㎍의 멜라토닌에 첨가한다.
mRNA를 1일째 날, 7일째 날 및 14일째 날에 세포로부터 추출하고 유전자 발현을 QPCR로 측정하였다(도 80A 내지 80E). 하기 유전자들을 분석하였다: 골형성 마커 Runx2, 알칼리성 포스파타제(ALPL), 마커 콜라겐 1(COL1), 오스테릭스(OSX) 및 골 시알로단백질(BSP) 및 연골형성 마커 Sox9 및 콜라겐 2(COL2), 비대 마커 콜라겐 10(COL10) 및 MMP13. ARS 염색 및 정량을 전술된 바와 같이 14일째 날 배양물에 대해 수행하였다(도 81A 및 81B).
AGM은 플라스틱 상에서 BMP4를 상향조절하였다. HA는 BMP4(초기)를 상향조절하였으나 BMP6(후기)을 하향조절하였고, BMP2에 영향을 미치지 않았다(도 80B). 어떠한 문헌 데이터도 HA 자체가 BMP를 상향조절한다는 것을 암시하지 않는다. 그러나, AGM의 첨가는 BMP2 및 BMP6을 상향조절하였다.
4X 가용성 HC-HA는 초기에 BMP4를 상향조절하였으나 후기에 BMP4를 하향조절하였고(HA와 유사함), BMP2를 현저히 상향조절하였다(AMP와 유사하나, 일시적인 BMP6이 없음)(도 80B). 대조적으로, AGM의 첨가는 BMP의 발현 패턴을 변화시키지 않았다.
4X 불용성 HC-HA는 초기에 BMP4를 상향조절하였으나 BMP4를 하향조절하였고(후기)(HA와 유사함), BMP2를 현저히 상향조절하였다(가용성 HCHA와 유사함)(도 80B). [가용성과 동일함] 유사하게, AGM의 첨가는 발현 패턴을 변화시키지 않았다.
본 발명자들의 결과는 가용성 HC-HA 및 불용성 HC-HA가 연골내 기작을 통해 골 분화 및 광물화를 형성할 수 있었다는 것을 보여준다. 연골세포 마커(Col2) 및 비대 마커(Col10, MMP13)의 발현이 있었을 때 골 마커(Col1, Osx, ALP 및 BSP)의 발현은 뚜렷하였다(도 80A 내지 80E). 이들 HC-HA 조건들 사이의 차이는 불용성 HC-HA가 (AGM의 부재 하에서 조차도) 보다 큰 크기의 유전자 발현 및 보다 현저한 골 결절을 촉진할 수 있었으나, 가용성 HC-HA는 AGM을 요구한다는(데이터는 제시되어 있지 않음) 것이었다. 따라서, 가용성 HC-HA/PTX3 및 불용성 HC-HA/PTX3은 골유도제 AGM 없이 BMP2의 발현을 촉진할 수 있었다.
AGM의 부재 하에서 HA는 연골형성 마커(COL2)도 보였을 뿐만 아니라, ARS 정의된 광물화 및 ALP 및 OC의 약간의 증가와 함께 골형성의 징후도 보였다. 그러나, HC-HA/PTX3(PBS)은 HA보다 더 높은 연골형성 발현 및 더 높은 골 마커 ALP, Osx 및 BSP 발현을 가졌다. 이들 조건들 중 어느 조건도 유의한 비대 마커를 발현시키지 않았다. HC-HA/PTX3(Gn)은 상기 두 전술된 조건보다 ALP, OSX 및 BSP의 훨씬 더 높은 발현을 발생시켰다. 연골형성 마커 COL2의 약간의 발현이 있었을 때 비대 마커 MMP13도 발현되었다.
HA 및 AGM은 BMP2, ALP, Osx, BSP 및 OC 발현을 증가시키면서 골형성을 촉진하고 비대 마커 COL10 및 MMP13을 나타낸다. 그러나, HA는 HC-HA 군보다 더 적은 골 특이적 mRNA 발현 및 골 결절 형성을 발생시켰다. 또 다른 핵심 차이는 HA가 SOX9를 하향조절하였으나 후기에 BMP6 발현을 증가시켰다는 것이었다.
모든 종래 데이터는 가용성 HCHA가 가장 강력한 골 유도제이고 보다 중요하게는 연골내 기작을 유도한다는 것을 시사한다.
실시예 45: nHC-HA/PTX3은 염증 및 면역 반응을 억제하고 뮤린 각막 동종이식물 생존을 개선한다.
실험 및 임상 연구는 양막(AM), AM 추출물 및 nHC-HA/PTX3[상호-α-트립신 억제제(IαI)의 중쇄(HC) 및 하이알루로난(HA)에 의해 형성된 공유 복합체]이 호염증 반응을 억제한다는 것을 보여주었다. 이 실시예는 nHC-HA/PTX3/PTX3이 T-세포 반응을 조절할 수 있고 뮤린 각막 동종이식물 거부를 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다.
T-세포 활성화는 다양한 사이토카인의 증식 및 생성에 의해 평가될 수 있다(도 82). 이 경우, 오브알부민(OVA)에 대해 특이적인 형질전환 TCR을 발현하는 OC-II 마우스로부터 비장세포를 단리하였고 최대 4일까지 OVA로 자극하였다(도 83). 세포 증식을 BrdU 표지부착으로 측정하였고 사이토카인(IFN-γ 및 IL-2)의 발현을 각각의 ELISA로 측정하였다. 1 mg/㎖의 nHC-HA/PTX3은 2일째 날 및 4일째 날에 OVA 펩티드와 함께 비장세포에서 증식(도 84), 및 IFN-γ 및 IL-2의 생성(도 85)을 유의하게 억제하였으나 HA는 이러한 증식 및 생성을 억제하지 못하였다(모두 p < 0.05). 나아가, 각막 T-세포는 LPS 주사에 의해 생체내에서 활성화되었다.
LPS의 각막내 주사 전에 또는 동안에 nHC-HA/PTX3의 주사 부위, 부피 및 빈도의 최적화는 마피아 마우스의 각막 내로의 EGFP 양성 대식세포의 유입에 의해 결정되었다. 주사 요법은 주사할 때마다 5 ㎕을 결막하와 원개 사이의 모든 4개 사분원에 제공함으로써 더 최적화되었다. nHC-HA/PTX3 처리 후 4일째 날, 각막을 37℃에서 1시간 동안 820 유닛/㎖의 콜라게나제로 분해하였다. EGFP- 및 EGFP+ 세포를 FACS로 단리하였다. LPS 주사 3일 전에 nHC-HA/PTX3의 전처리는 LPS-자극된 각막 내로의 EGFP+ 대식세포의 유입을 유의하게 억제하였다(9.1 ± 0.3 대 12.3 ± 0.4, nHC-HA/PTX3 대 PBS, p =0.02)(도 86). 중요하게는, EGFP+ 대식세포가 각막 내로 이동하였을지라도, 이들 중 일부는 Arg-1 및 IL-10의 유의한 상향조절 및 IL-12의 하향조절에 의해 암시된 바와 같이 M2 표현형으로 분극화되었다(p < 0.05)(도 87). Arg-1, IL-10 및 IL-12의 mRNA 발현을 qPCR로 측정하였다. 마지막으로, 야생형 BALB/c 마우스를 수용자로서 사용하고 C57BL/6 마우스를 공여자로서 사용하여 동종이계 각막 이식을 수행하였고, 슬릿 램프 생체현미경관찰을 이용하여 주 당 2회 측정된 이식물 투명도로 이식의 결과를 점수화하였다. 소실 없이 3 이상의 점수를 2회 연속하여 받은 이식물은 거부된 이식물로서 간주되었다. PBS 대조군과 비교될 때, 동종이식물 거부는 10 ㎕ nHC-HA/PTX3을 주 당 2회 1개의 사분원에 주사함으로써 유의하게 억제되었고(p < 0.05), 5 ㎕를 주 당 2회 4개의 사분원에 주사함으로써 더 감소되었다(p < 0.002)(도 88).
이들 실험은 nHC-HA/PTX3이 뮤린 각막 동종이식물 거부를 유의하게 억제한다는 것을 입증한다. 이 작용의 기작은 호염증성 대식세포를 하향조절하고 T-세포 면역 반응을 억제하는 nHC-HA/PTX3의 능력에 의해 기여될 수 있다.
실시예 46: 건조 스트레스에 의해 야기된 마우스 안건조증의 nHC-HA/PTX3 및 AMP에 의한 치료
기능장애성 눈물 증후군으로서도 공지되어 있는 안건조증은 전세계적으로 높은 유병률 및 상당한 이환율을 갖는 흔한 눈 표면 질환이다. 이 질환은 만성 자가반응성 T-세포-매개된 염증 및 눈물샘 기능 유닛(LFU; 각막, 결막, 눈물샘 및 눈꺼풀판샘)의 기능장애를 특징으로 하는 자가면역-기초 염증성 질환이다. 쇼그렌 증후군(SS)은 실질 조직의 이차 파괴를 야기하는, 단핵세포에 의한 타액선 및 눈물샘의 침윤을 특징으로 하는 우세한 만성 자가면역 장애이다.
SS에서 건성 각막결막염(KCS)은 IL-17 및 인터페론(IFN)-γ를 생성하는 침윤 CD4+ T-세포를 특징으로 하는, 잠재적으로 시력을 위협하는 중증 눈 표면 상피 질환이다. T-세포 활성화를 억제하는 화합물(예를 들면, 사이클로스포린 A)은 동물 및 인간 둘다에서 안건조증 질환을 약화시킨다. 대식세포는 (예를 들면, IFN-γ 및/또는 TLR 리간드, 예컨대, LPS에 의한) 고전적인 M1 활성화를 받아, Th1 및 Th17 림프구를 활성화시키는 높은 수준의 호염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α, IL-12 및 IL-23)을 발현시킴으로써(도 89) 많은 만성 염증성 질환들을 유발할 수 있다. 이 실시예는 nHC-HA/PTX3 및 AMP 투여가 이러한 질병의 치료에 유용할 수 있다는 것을 입증한다.
각막 내로의 대식세포의 침윤은 각각의 눈에 대한 4개의 주사 부위로 억제된다.
마피아 마우스는 대식세포가 EGFP로 표지되어 있을 때 대식세포 유입의 생체내 추적을 허용한다. 이들 마우스를 사용하여 nHC-HA/PTX3 또는 AMP가 각막 내로의 LPS-유도된 대식세포 유입(각막염에 대한 모델)을 방해하는지를 확인하였다. LPS를 각각의 주사 부위에서 5 ㎕ 이하의 적절한 부피로 결막하와 원개 사이에 주사하였다. 마피아 마우스의 눈(대식세포는 EGFP+를 나타냄)을 LPS(눈 당 5 ㎍)로 기질내 주사하였다. 각각의 눈에서, OS를 PBS(2회 또는 4회 주사 부위)로 처리한 반면, OD를 nHC-HA/PTX3(2회 또는 4회 주사 부위; 주사 부위 당 5 ㎕의 nHC-HA/PTX3 중의 1 mg/㎖ HA) 또는 AMP(2회 또는 4회 주사 부위; 주사 부위 당 5 ㎕의 AMP 중의 10 mg/㎖ 단백질)로 1회 처리하였다. 이 처리를 LPS 주사 직후에 수행하였다. 1일째 날, 2일째 날, 3일째 날 및 6일째 날에 전체 각막의 이미지를 생체내 생체현미경관찰로 촬영하였다. EGFP 양성 세포를 녹색 형광의 강도를 기초로 카운팅하였다.
1일째 날, EGFP 양성 대식세포는 PBS 처리와 함께 LPS 주사를 수행한 후 대부분의 각막 주변 영역에서 검출된다. nHC-HA/PTX3 또는 AMP를 사용한 처리는 각막에서 대식세포를 유의하게 증가시키거나 감소시키지 않았다.
2일째 날, PBS로 처리된 각막에서 대식세포는 nHC-HA/PTX3(2개 및 4개 주사 부위, p < 0.05) 및 AMP(2개 및 4개 주사 부위, p < 0.05)를 사용한 처리에서와 마찬가지로 1일째 날부터 유의하게 증가하였다(p < 0.05). 구체적으로, PBS로 처리된 각막보다 nHC-HA/PTX3의 2회 주사로 처리된 각막에서 더 많은 대식세포가 침윤되었으나(p > 0.05), nHC-HA/PTX3의 4회 주사로 처리된 각막에서는 덜 침윤되었다(p > 0.05). AMP 처리의 경우, 2회 주사는 유의한 효과를 나타내지 않았지만, 4회 주사는 대식세포의 침윤을 약간 감소시켰는데, 이것은 대식세포의 침윤을 감소시키는 데에 효과를 미치기 위해서는 각각의 눈에 대한 nHC-HA/PTX3 또는 AMP의 4회 주사가 필요하다는 것을 암시한다.
3일째 날, 대식세포의 침윤은 PBS, nHC-HA/PTX3 및 AMP의 처리 시 계속되었다.
nHC-HA/PTX3의 2회 주사 또는 4회 주사, 또는 AMP의 2회 주사로 처리하였을 때 침윤의 억제는 없었다. 억제를 보이는 유일한 처리는 AMP의 4회 주사이다(p < 0.05).
6일째 날, 대식세포의 침윤은 감소하였다. 그러나, HC-HA/PTX3 또는 AMP의 처리는 대조군에 비해 유의한 억제 효과를 나타내지 않았다.
이들 데이터는 EGFP 양성 대식세포가 1일째 날부터 3일째 날까지 LPS-주입된 각막 내로 계속 침윤하고 4일째 날 또는 5일째 날에 정점에 도달한 후, 6일째 날에 감소한다는 것을 보여주었다. 이것은 이전에 보고된 데이터와 일치한다(도 90). 대식세포의 침윤은 2일째 날 눈 당 nHC-HA/PTX3의 4회 주사 또는 2일째 날 및 3일째 날 AMP의 4회 주사를 사용한 처리에 의해 약간 억제되었다. 이것은 AMP가 LPS에 의해 유발된 대식세포의 유입을 차단하는 데에 있어서 nHC-HA/PTX3보다 더 우수한 효능을 갖는다는 것을 암시한다.
AMP를 사용한 전처리는 nHC-HA/PTX3 또는 AMP의 후속 주사가 뒤따르는 경우 추가 주사로 인한 손상에 의해 유발된 대식세포 침윤을 유의하게 억제한다.
각각의 마피아 마우스의 좌측 눈(OS)을 상기 정의된 바와 같이 결막하/원개의 4개 부위에서 PBS(5 ㎕) 또는 AMP(5 ㎕의 10 mg/㎖ 단백질)로 전처리하였다. 각각의 마우스의 우측 눈(OD)을 처리되지 않은 상태로 남겨두었다. 3일 후, 각각의 눈의 각막에 LPS(5 ㎍)를 주사한 직후에 4개 부위에서 PBS(5 ㎕), HC-HA/PTX3(5 ㎕의 1 mg/㎖ HA) 또는 AMP(5 ㎕의 10 mg/㎖ 단백질)로 처리하였다. 생체내 생체현미경관찰을 이용하여 EGFP+ 대식세포의 침윤을 카운팅하였는데, 이것은 마우스 각막 내로의 대식세포 유입을 감소시키는 데에 있어서 임의의 유의성을 보여주지 않았다(p > 0.05)(데이터는 제시되어 있지 않음). 그 다음, 본 발명자들은 생체내 형광 현미경관찰로 이 정량 방법의 정확성을 조사하였다.
침윤된 대식세포를 더 정확히 측정하고 발생된 대식세포 표현형(예를 들면, M1 대 M2)을 조사하기 위해, 본 발명자들은 4일째 날에 제거된 각막을 콜라게나제로 분해하고 FACS를 수행함으로써 EGFP 양성 대식세포를 정량하기로 결심하였다. 그 다음, 대식세포 침윤 정도를 평가하기 위해 EGFP 음성 세포를 사용하여 EGFP 양성 대식세포를 비로서 표준화하였다. 전처리되지 않은 군에서, LPS 주사는 PBS 대조군에서 대식세포 침윤을 야기하였다(도 91A, 청색 막대). 이 침윤은 nHC-HA/PTX3(9.1 ± 0.3 대 12.3 ± 0.4, p=0.02) 또는 AMP(2.1 ± 0.1 대 12.3 ± 0.4, p=0.02)에 의해 유의하게 억제되었다. AMP 처리는 대식세포 침윤의 억제에 있어서 nHC-HA/PTX3 처리보다 더 우수하였다(p=0.02).
전처리된 군에서, LPS 주사는 전처리 부재의 경우에 비해 PBS 대조군에서 유의한 대식세포 침윤을 야기하였다(37.2 ± 1.3 대 12.3 ± 0.4, p=0.01)(도 91A, 적색 막대). 이 차이는 전처리 동안 수행된 4회 결막하 주사가 추후에 LPS로 처리되는 각막 내로의 대식세포 유입을 증강시키는 염증을 유발하는 손상을 야기하였을 때 예상되었다. 그럼에도 불구하고, 이 현저히 증가된 침윤은 AMP 전처리 후 nHC-HA/PTX3(8.2 ± 0.3 대 37.2 ± 1.3, p=0.02) 또는 AMP 처리(2.3 ± 0.1 대 37.2 ± 1.3, p=0.02)에 의해 완전히 억제되었다. 마찬가지로, AMP 전처리 후 AMP 처리는 대식세포 침윤의 억제에 있어서 AMP 전처리 후 nHC-HA/PTX3 처리보다 더 우수하였다(2.3 ± 0.1 대 8.2 ± 0.3, p=0.02). 그러나, nHC-HA/PTX3 또는 AMP에 대한 비전처리 군과 AMP 전처리 군 사이에 억제의 유의한 차이는 없었다(p > 0.05). qPCR 데이터(도 91B)는 nHC-HA/PTX3의 전처리가 M1 마커(IL-12p40 및 IL-12p35인 경우)를 감소시키는 반면, M2 마커인 Arg-1을 증가시킨다는 것을 보여준다. AMP 처리 및 전처리는 IL-12p40 및 IL-12p35를 유의하게 감소시키지만 Arg-1 및 IL-10을 크게 증가시킨다. 종합하건대, AMP 전처리는 전처리 동안 추가 손상에 의해 유발된 대식세포 침윤을 완전히 제거할 수 있다. 이러한 효과는 LPS 주사와 동시에 nHC-HA/PTX3 또는 AMP의 후속 주사에 의해 지속된다. 이 이익은 4일 후 인지되고, AMP는 nHC-HA/PTX3보다 더 강력하다.
nHC-HA/PTX3 또는 AMP는 뮤린 실험 안건조증 모델에서 DS에 의해 유도된 ALKC를 감소시킬 수 있다.
디자인
종: C57BL/6 마우스
종점: 각막 상피 차단막 기능(OGD 염색)
샘플 크기: 군 당 15마리의 마우스
군: 2개의 대조군 및 3개의 처리군(PBS, nHC-HA/PTX3 및 AMP): 1) 건조하지 않은 눈, 비처리된 대조군(UT) - 별도의 사육실에서 사육됨; 2) 실험 안건조증, 비처리된 대조군(EDE); 3) PBS; 4) nHA-HC/PTX; 5) AMP.
건조 스트레스(DS)
눈물 분비를 약리학적 콜린작용제로 차단하고 5일(월요일부터 금요일까지) 동안 환경적으로 조절된 방에서 공기 통풍 및 낮은 습도에 노출시킴으로써 건조 스트레스 모델을 생성한다. 사육장을 통과하는 기류를 허용하기 위해 와이어 메쉬로 교체된 측면을 갖는 표준 마우스 사육장으로 구성된 특별히 고안된 천공된 사육장 내에 마우스를 넣어둔다. 각각의 사육장을 일정한 기류(전기 환기구) 앞에 놓아둔다. 스코폴아민(0.2 ㎖ 중의 0.5 mg, 시그마-알드리치)을 5일 동안 1일 4회(오전 8시 30분, 오전 11시 30분, 오후 1시 30분 및 오후 4시 30분) 피하 투여하여 눈물샘 분비를 억제한다. 환경적으로 조절된 방 내의 습도를 25% 내지 30% 상대습도에서 유지하는데, 이것은 4개의 휴대용 제습기 및 천정 내의 제습기 설비에 의해 달성된다.
처리 절차(5일 프로토콜)
각각의 실험 동안 3개의 대조군이 포함된다:
비처리된 대조군은 40% 내지 70%의 상대습도 하에서 사육장 내에서 사육되는 마우스 군으로 구성된다. 이들 마우스들은 DS에 결코 노출되지 않고 임의의 국소 치료도 제공받지 않는다.
안건조증 대조군은 환경적 안건조증 챔버 내에 배치되나 처리를 제공받지 않는 마우스 군으로 구성된다.
비히클 대조군은 DS에 노출되되 PBS를 제공받은 마우스 군으로 구성된다.
추가로, 2개의 실험군들이 포함된다: nHA-HC/PTX3 및 AMP.
주사를 위해, 본 발명자들은 비히클 대조군으로서 PBS와 함께 (1 mg/㎖ HMW HA를 함유하는) nHC-HA/PTX3 및 (10 mg/㎖ 총 단백질을 함유하는) AMP를 사용하였다. 모든 용액들(PBS, nHC-HA/PTX3 및 AMP)을 30G를 갖는 튜버쿨린 주사기 내로 뽑아내었다. 주사 위치는 원개에 가까운 결막하이다(도 92). 3시, 6시, 9시 및 12시 정각에 주사 부위 당 5 ㎕를 사용한 4회 주사를 투여하였다. 확산된 용액은 결막의 전체 주변을 완전히 덮었고, 눈감음을 방해하는 최소한의 결막 또는 안구 울혈/팽윤(존재하는 경우 15분 이내에 사라질 것임) 및 각막 표면 분해 또는 염증을 야기하였다. 주사를 (모든 시약에 대해) 1일째 날 및 3일째 날에 총 2회 투여하였다. 이 주사 프로토콜은 표 6에 요약되어 있다.
Figure 112015012524150-pct00012
각막 염색의 측정
5일째 날 아침, 마우스는 눈물 부피의 측정을 위해 스코폴아민의 1회 피하 용량을 제공받았다. 상기 스코폴아민 용량을 제공받은지 2시간 후, 70 kDa 분자 크기의 접합된 형광 염료인 오레곤 그린 덱스트란(OGD-488)(몰레큘라 프로브스)을 사용하여 각막 염색을 수행하였다. 절차는 안락사 1분 전에 유리 모세관 피펫을 이용하여 0.5 ㎕의 OGD를 각막에 주입하는 것으로 구성되었다. 이소플루란 마취 가스를 흡입시킨 후 경부 탈위를 수행하여 마우스를 안락사시켰다. 그 다음, 눈을 2 ㎖의 BSS로 린싱하였다. 각막을 건드리지 않으면서 필터 종이를 사용하여 안구 표면으로부터 여분의 액체를 조심스럽게 블롯팅하였다. 쿨스냅(CoolSnap) HQ2 냉각 CCD 카메라를 갖는 니콘 SMZ-1500 입체현미경을 이용하여 470 nm 여기 및 488 nm 방출 파장 길이 하에서 양 눈의 디지털 이미지를 포착하였다(이때, 노출 시간은 1초임). 각각의 동물의 양 눈을 평가하였다. 니콘 엘리먼츠(Elements) 소프트웨어를 이용하여 3개의 디지털 이미지에서 중심 각막 내의 원하는 고정화된 영역(1 mm 직경 원)의 형광 강도를 측정하고 데이터를 데이터베이스(엑셀, 마이크로소프트)에 저장하였다. 결과를 평균 ± 회색도의 표준 편차로서 제공하였다. 군의 통계적 비교를 위해 3개의 별도의 실험으로부터 수득된 결과의 평균을 산출하였다.
T 헬퍼 세포 경로 매개자의 수준에 대한 nHC-HA/PTX3 및 동결건조된 양막 분말(AMP)의 효과를 5일 동안 C57BL/6 마우스에서 생성된 실험 안건조증(EDE) 모델에서 비교하였다. Th1(IL-12, IFN-γ 및 T-Bet), Th-17(IL-23, IL-17, ROR-γt, IL-6, TGF-β1, MMP-3 및 MMP-9) 및 Th2(IL-4, IL-13 및 GATA3) 관련 인자의 발현을 실시간 PCR로 하기 군들의 각막 상피 및 결막에서 측정하였다.
통계적 분석
그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어(그래프패드 인코포레이티드(GraphPad Inc.))를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 변량의 일원 분석(ANOVA)을 이용하여 군들 사이의 전체 차이를 측정한 후 사후 검정(터키 사후 검정)을 수행하였다. 비대응 t-검정을 이용하여 2개의 실험군들 사이의 통계적 차이를 평가하였다.
실시예 47: HC-HA는 인간 각막 섬유아세포에서 TGF-β1의 첨가에 의해 더 촉진되는 혈관신생을 촉진하도록 IGF1-HIF1α-VEGF 신호전달을 활성화시킨다 .
이 실시예에서, 인간 각막 섬유아세포에서 혈관신생 마커의 유도에 대한 HC-HA 복합체의 효과를 조사하였다.
전술된 바와 같이, 고정화된 HA, 가용성 HC-HA(PBS)(4X) 또는 불용성 HC-HA(GnHCl)(4X)를 갖거나 갖지 않는 플라스틱 접시 상에 인간 각막 섬유아세포(96웰 플레이트에서 3000개 세포/웰)를 48시간 동안 시딩하였다. 그 다음, 세포를 24시간 동안 TGF-β1로 처리하였거나 처리하지 않은 후, IGF1, HIF1α 및 VEGF의 mRNA 정량을 위해 수거하였다. 실험군은 다음과 같았다:
Figure 112015012524150-pct00013
RNeasy 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 총 RNA를 추출하고 고성능 역전사 키트(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 역전사하였다. 각각의 세포 성분의 cDNA를, 7000 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템스)에서 특이적 프라이머-프로브 혼합물 및 DNA 중합효소를 사용하는 실시간 RT-PCR로 증폭하였다. 실시간 RT-PCR 프로파일은 95℃에서의 10분 초기 활성화에 이어서, 95℃에서의 15초 변성, 및 60℃에서의 1분 어닐링 및 연장으로 구성된 40 주기로 구성되었다. EC3 이미지화 시스템(바이오이미징 시스템(BioImaging System))에 따라 2% 아가로스 겔에 이어서 PCR 마커와 함께 에티듐 브로마이드 염색을 이용하여 크기를 측정함으로써 각각의 PCR 생성물(IGF1, HIF1α 및 VEGF)의 본질을 확인하였다.
세포가 휴지기 상태에 있었을 때 HC-HA는 IGF1 mRNA의 2배 내지 6배 증가 및 VEGF mRNA의 2배 증가를 유도하였다(도 92). 대조적으로, 세포가 TGF-β(10 ng/㎖)에 의해 챌린지되었을 때 HC-HA는 IGF1 mRNA의 5배 내지 12배 증가 및 VEGF mRNA의 5배 내지 9배 증가를 유도하였다. VEGF는 주어진 네트워크에서 모세혈관의 수를 증가시키는 혈관신생에 대한 주요 기여자인 것으로 입증되었다. VEGF 활성화는 상류 조절제, 예컨대, IGF1 및 HIF1α에 의해 조절된다. 본 발명자들의 결과는 HC-HA가 IGF1-HIF1α-VEGF 네트워크를 활성화시켜 혈관신생을 촉진하고, 이 혈관신생이 인간 각막 섬유아세포에서 TGF-β1의 첨가에 의해 더 촉진된다는 것을 입증한다.
바람직한 실시양태들이 본원에 제시되어 있고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태들이 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 다수의 변경, 변화 및 치환이 일어날 수 있다. 본원에 기재된 실시양태들에 대한 다양한 대체물들이 기재된 방법을 실시하는 데에 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하기 특허청구범위는 상기 실시양태들의 범위를 정의하고 이 특허청구범위 내의 방법 및 구조, 및 이들의 균등물은 하기 특허청구범위에 의해 커버된다.
SEQUENCE LISTING <110> TISSUETECH, INC. <120> COMPOSITIONS CONTAINING HC-HA/PTX3 COMPLEXES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 34157-732.601 <150> 61/670,571 <151> 2012-07-11 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp 100 105 110 Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr 115 120 125 Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile 145 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<213> Mus musculus <400> 6 Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ala Gly Arg Tyr Lys Leu Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly Arg Leu Ala Thr 20 25 30 Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val Cys Ala 35 40 45 Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val Lys Pro 50 55 60 Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn 85 90 <210> 7 <211> 276 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Val Leu Val Trp Glu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asn Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Gln Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly Arg 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Ser Asn Cys Gly Phe 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11 <211> 263 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 11 Trp Gly Phe Lys Asn Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Gln 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu 20 25 30 Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Tyr Glu Gly Gly His Leu 35 40 45 Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val 50 55 60 Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val 65 70 75 80 Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr 85 90 95 Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn 100 105 110 Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg Ile 115 120 125 Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Asp Asp Asn Gln Ile Cys 130 135 140 Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe 145 150 155 160 Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Ala Cys Leu Ala Asp Tyr Val 165 170 175 Glu Val Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr 180 185 190 Cys Gly Asp Glu Leu Pro Glu Asp Ile Ile Ser Thr 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Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ser Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp 100 105 110 Tyr Gly Val Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr 115 120 125 Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Ser Lys Gly 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile 145 150 155 160 Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln His Ile His Leu Ser 165 170 175 Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr 180 185 190 Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg 195 200 205 Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp 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<400> 17 Trp Gly Phe Lys Asn Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Gln 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Tyr Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu 20 25 30 Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Tyr Glu Gly Gly Arg Leu 35 40 45 Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val 50 55 60 Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val 65 70 75 80 Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr 85 90 95 Gly Val Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn 100 105 110 Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg Ile 115 120 125 Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Asp Asp Asn Gln Ile Cys 130 135 140 Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Val Ser Phe 145 150 155 160 Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Ala Cys Leu Ala Asp Tyr Val 165 170 175 Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr 180 185 190 Cys Gly Ala Glu Leu Pro Glu Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met 195 200 205 Thr Leu Lys 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Gly Ile Asp 1865 1870 1875 Cys Leu Leu Ile Asp Pro Thr Leu Gly Gly Arg Cys Asp Thr Phe 1880 1885 1890 Thr Thr Phe Asp Ala Ser Gly Glu Cys Gly Ser Cys Val Asn Thr 1895 1900 1905 Pro Ser Cys Pro Arg Trp Ser Lys Pro Lys Gly Val Lys Gln Lys 1910 1915 1920 Cys Leu Tyr Asn Leu Pro Phe Lys Arg Asn Leu Glu Gly Cys Arg 1925 1930 1935 Glu Arg Cys Ser Leu Val Ile Gln Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly 1940 1945 1950 Tyr Phe Gly Arg Asp Cys Gln Ala Cys Pro Gly Gly Pro Asp Ala 1955 1960 1965 Pro Cys Asn Asn Arg Gly Val Cys Leu Asp Gln Tyr Ser Ala Thr 1970 1975 1980 Gly Glu Cys Lys Cys Asn Thr Gly Phe Asn Gly Thr Ala Cys Glu 1985 1990 1995 Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu Pro Cys Gly 2000 2005 2010 Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly Ser Gly 2015 2020 2025 Gln Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Thr 2030 2035 2040 Gln Ala Val Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His 2045 2050 2055 Ala Thr Cys Lys Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr 2060 2065 2070 Glu Gly Asp Gly Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln 2075 2080 2085 Asp Asn Gly Gly Cys Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly 2090 2095 2100 Thr Lys Val Ser Cys Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly 2105 2110 2115 His Ser Cys Thr Glu Ile Asp Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly 2120 2125 2130 Gly Cys His Glu His Ala Thr Cys Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys 2135 2140 2145 His Lys Cys Glu Cys Lys Ser His Tyr Val Gly Asp Gly Leu Asn 2150 2155 2160 Cys Glu Pro Glu Gln Leu Pro Ile Asp Arg Cys Leu Gln Asp Asn 2165 2170 2175 Gly Gln Cys His Ala Asp Ala Lys Cys Val Asp Leu His Phe Gln 2180 2185 2190 Asp Thr Thr Val Gly Val Phe His Leu Arg Ser Pro Leu Gly Gln 2195 2200 2205 Tyr Lys Leu Thr Phe Asp Lys Ala Arg Glu Ala Cys Ala Asn Glu 2210 2215 2220 Ala Ala Thr Met Ala Thr Tyr Asn Gln Leu Ser Tyr Ala Gln Lys 2225 2230 2235 Ala Lys Tyr His Leu Cys Ser Ala Gly Trp Leu Glu Thr Gly Arg 2240 2245 2250 Val Ala Tyr Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gln Asn Cys Gly Ser Gly 2255 2260 2265 Val Val Gly Ile Val Asp Tyr Gly Pro Arg Pro Asn Lys Ser Glu 2270 2275 2280 Met Trp Asp Val Phe Cys Tyr Arg Met Lys Asp Val Asn Cys Thr 2285 2290 2295 Cys Lys Val Gly Tyr Val Gly Asp Gly Phe Ser Cys Ser Gly Asn 2300 2305 2310 Leu Leu Gln Val Leu Met Ser Phe Pro Ser Leu Thr Asn Phe Leu 2315 2320 2325 Thr Glu Val Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Arg Gly Arg Ala 2330 2335 2340 Phe Leu Glu His Leu Thr Asp Leu Ser Ile Arg Gly Thr Leu Phe 2345 2350 2355 Val Pro Gln Asn Ser Gly Leu Gly Glu Asn Glu Thr Leu Ser Gly 2360 2365 2370 Arg Asp Ile Glu His His Leu Ala Asn Val Ser Met Phe Phe Tyr 2375 2380 2385 Asn Asp Leu Val Asn Gly Thr Thr Leu Gln Thr Arg Leu Gly Ser 2390 2395 2400 Lys Leu Leu Ile Thr Ala Ser Gln Asp Pro Leu Gln Pro Thr Glu 2405 2410 2415 Thr Arg Phe Val Asp Gly Arg Ala Ile Leu Gln Trp Asp Ile Phe 2420 2425 2430 Ala Ser Asn Gly Ile Ile His Val Ile Ser Arg Pro Leu Lys Ala 2435 2440 2445 Pro Pro Ala Pro Val Thr Leu Thr His Thr Gly Leu Gly Ala Gly 2450 2455 2460 Ile Phe Phe Ala Ile Ile Leu Val Thr Gly Ala Val Ala Leu Ala 2465 2470 2475 Ala Tyr Ser Tyr Phe Arg Ile Asn Arg Arg Thr Ile Gly Phe Gln 2480 2485 2490 His Phe Glu Ser Glu Glu Asp Ile Asn Val Ala Ala Leu Gly Lys 2495 2500 2505 Gln Gln Pro Glu Asn Ile Ser Asn Pro Leu Tyr Glu Ser Thr Thr 2510 2515 2520 Ser Ala Pro Pro Glu Pro Ser Tyr Asp Pro Phe Thr Asp Ser Glu 2525 2530 2535 Glu Arg Gln Leu Glu Gly Asn Asp Pro Leu Arg Thr Leu 2540 2545 2550 <210> 98 <211> 2532 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Ser Pro Ala Glu Thr Thr Gly Gln Ala Arg Arg Cys Asp Arg Lys Ser 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ile Arg Thr Glu Cys Arg Ser Cys Ala Leu Asn Leu Gly 20 25 30 Val Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Met Ile Thr Ser Gly Ser Val Gly 35 40 45 Val Arg Asp Cys Arg Tyr Thr Phe Glu Val Arg Thr Tyr Ser Leu Ser 50 55 60 Leu Pro Gly Cys Arg His Ile Cys Arg Lys Asp Tyr Leu Gln Pro Arg 65 70 75 80 Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys Pro Gly Gly 85 90 95 Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu Gly Met Glu 100 105 110 Gly Asn Gly Thr Cys Ser 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Thr Glu Cys Ile Cys Gln Lys Gly Tyr Val 325 330 335 Gly Asp Gly Leu Thr Cys Tyr Gly Asn Ile Met Glu Arg Leu Arg Glu 340 345 350 Leu Asn Thr Glu Pro Arg Gly Lys Trp Gln Gly Arg Leu Thr Ser Phe 355 360 365 Ile Ser Leu Leu Asp Lys Ala Tyr Ala Trp Pro Leu Ser Lys Leu Gly 370 375 380 Pro Phe Thr Val Leu Leu Pro Thr Asp Lys Gly Leu Lys Gly Phe Asn 385 390 395 400 Val Asn Glu Leu Leu Val Asp Asn Lys Ala Ala Gln Tyr Phe Val Lys 405 410 415 Leu His Ile Ile Ala Gly Gln Met Asn Ile Glu Tyr Met Asn Asn Thr 420 425 430 Asp Met Phe Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Ser Gly Glu Ile Phe Asn Ser 435 440 445 Asp Lys Asp Asn Gln Ile Lys Leu Lys Leu His Gly Gly Lys Lys Lys 450 455 460 Val Lys Ile Ile Gln Gly Asp Ile Ile Ala Ser Asn Gly Leu Leu His 465 470 475 480 Ile Leu Asp Arg Ala Met Asp Lys Leu Glu Pro Thr Phe Glu Ser Asn 485 490 495 Asn Glu Gln Thr Ile Met Thr Met Leu Gln Pro Arg Tyr Ser Lys Phe 500 505 510 Arg Ser Leu Leu Glu Glu Thr Asn Leu Gly His Ala Leu Asp Glu Asp 515 520 525 Gly Val Gly Gly Pro Tyr Thr Ile Phe Val Pro Asn Asn Glu Ala Leu 530 535 540 Asn Asn Met Lys Asp Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Gly 545 550 555 560 Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Val Arg Tyr His Ile Val Pro Phe Thr 565 570 575 Gln Leu Glu Val Ala Thr Leu Ile Ser Thr Pro His Ile Arg Ser Met 580 585 590 Ala Asn Gln Leu Ile Gln Phe Asn Thr Thr Asp Asn Gly Gln Ile Leu 595 600 605 Ala Asn Asp Val Ala Met Glu Glu Ile Glu Ile Thr Ala Lys Asn Gly 610 615 620 Arg Ile Tyr Thr Leu Thr Gly Val Leu Ile Pro Pro Ser Ile Val Pro 625 630 635 640 Ile Leu Pro His Arg Cys Asp Glu Thr Lys Arg Glu Met Lys Leu Gly 645 650 655 Thr Cys Val Ser Cys Ser Leu Val Tyr Trp Ser Arg Cys Pro Ala Asn 660 665 670 Ser Glu Pro Thr Ala Leu Phe Thr His Arg Cys Val Tyr Ser Gly Arg 675 680 685 Phe Gly Ser Leu Lys Ser Gly Cys Ala Arg Tyr Cys Asn Ala Thr Val 690 695 700 Lys Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn Gln 705 710 715 720 Cys Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Ala 725 730 735 Asp Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe Gln 740 745 750 Gly Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg 755 760 765 Cys Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile 770 775 780 Asp Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala 785 790 795 800 Gly Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln 805 810 815 Phe Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser 820 825 830 Cys Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser Glu 835 840 845 Met Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ala 850 855 860 Glu Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln Gln 865 870 875 880 Gly Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn Asn Cys Leu 885 890 895 Leu Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys Leu Tyr Val 900 905 910 Gly Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe Arg Gly Asn 915 920 925 Gly Ile Asp Cys Glu Pro Ile Thr Ser Cys Leu Glu Gln Thr Gly Lys 930 935 940 Cys His Pro Leu Ala Ser Cys Gln Ser Thr Ser Ser Gly Val Trp Ser 945 950 955 960 Cys Val Cys Gln Glu Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Phe Leu Cys Tyr Gly 965 970 975 Asn Ala Ala Val Glu Leu Ser Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ile Phe Asn 980 985 990 Arg Trp Ile Asn Asn Ala Ser Leu Gln Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ser 995 1000 1005 Asn Leu Thr Val Leu Val Pro Ser Gln Gln Ala Thr Glu Asp Met 1010 1015 1020 Asp Gln Asp Glu Lys Ser Phe Trp Leu Ser Gln Ser Asn Ile Pro 1025 1030 1035 Ala Leu Ile Lys Tyr His Met Leu Leu Gly Thr Tyr Arg Val Ala 1040 1045 1050 Asp Leu Gln Thr Leu Ser Ser Ser Asp Met Leu Ala Thr Ser Leu 1055 1060 1065 Gln Gly Asn Phe Leu His Leu Ala Lys Val Asp Gly Asn Ile Thr 1070 1075 1080 Ile Glu Gly Ala Ser Ile Val Asp Gly Asp Asn Ala Ala Thr Asn 1085 1090 1095 Gly Val Ile His Ile Ile Asn Lys Val Leu Val Pro Gln Arg Arg 1100 1105 1110 Leu Thr Gly Ser Leu Pro Asn Leu Leu Met Arg Leu Glu Gln Met 1115 1120 1125 Pro Asp Tyr Ser Ile Phe Arg Gly Tyr Ile Ile Gln Tyr Asn Leu 1130 1135 1140 Ala Asn Ala Ile Glu Ala Ala Asp Ala Tyr Thr Val Phe Ala Pro 1145 1150 1155 Asn Asn Asn Ala Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Glu Lys Lys Val Leu 1160 1165 1170 Ser Leu Glu Glu Asp Val Leu Arg Tyr His Val Val Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Leu Leu Lys Asn Asp Leu His Asn Gly Met His Arg Glu Thr 1190 1195 1200 Met Leu Gly Phe Ser Tyr Phe Leu Ser Phe Phe Leu His Asn Asp 1205 1210 1215 Gln Leu Tyr Val Asn Glu Ala Pro Ile Asn Tyr Thr Asn Val Ala 1220 1225 1230 Thr Asp Lys Gly Val Ile His Gly Leu Gly Lys Val Leu Glu Ile 1235 1240 1245 Gln Lys Asn Arg Cys Asp Asn Asn Asp Thr Thr Ile Ile Arg Gly 1250 1255 1260 Arg Cys Arg Thr Cys Ser Ser Glu Leu Thr Cys Pro Phe Gly Thr 1265 1270 1275 Lys Ser Leu Gly Asn Glu Lys Arg Arg Cys Ile Tyr Thr Ser Tyr 1280 1285 1290 Phe Met Gly Arg Arg Thr Leu Phe Ile Gly Cys Gln Pro Lys Cys 1295 1300 1305 Val Arg Thr Val Ile Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly 1310 1315 1320 Pro Gln Cys Gln Pro Cys Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe 1325 1330 1335 Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys 1340 1345 1350 Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly Thr Ala Cys Glu Thr Cys Thr 1355 1360 1365 Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp Gln Ala Cys Ser Cys Val 1370 1375 1380 His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly Asp Gly Ser Cys Asp 1385 1390 1395 Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp Asn Ala Thr Thr 1400 1405 1410 Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala Asn Cys Leu 1415 1420 1425 Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala Gly Phe 1430 1435 1440 Gln Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile 1445 1450 1455 Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr 1460 1465 1470 Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp 1475 1480 1485 Gly Ile Val Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly 1490 1495 1500 Gly Cys Asp Lys Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln 1505 1510 1515 Ala Ala Cys Asn Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val 1520 1525 1530 Cys Thr Leu Ile Asn Val Cys Leu Thr Lys Asn Gly Gly Cys Ser 1535 1540 1545 Glu Phe Ala Ile Cys Asn His Thr Gly Gln Val Glu Arg Thr Cys 1550 1555 1560 Thr Cys Lys Pro Asn Tyr Ile Gly Asp Gly Phe Thr Cys Arg Gly 1565 1570 1575 Ser Ile Tyr Gln Glu Leu Pro Lys Asn Pro Lys Thr Ser Gln Tyr 1580 1585 1590 Phe Phe Gln Leu Gln Glu His Phe Val Lys Asp Leu Val Gly Pro 1595 1600 1605 Gly Pro Phe Thr Val Phe Ala Pro Leu Ser Ala Ala Phe Asp Glu 1610 1615 1620 Glu Ala Arg Val Lys Asp Trp Asp Lys Tyr Gly Leu Met Pro Gln 1625 1630 1635 Val Leu Arg Tyr His Val Val Ala Cys His Gln Leu Leu Leu Glu 1640 1645 1650 Asn Leu Lys Leu Ile Ser Asn Ala Thr Ser Leu Gln Gly Glu Pro 1655 1660 1665 Ile Val Ile Ser Val Ser Gln Ser Thr Val Tyr Ile Asn Asn Lys 1670 1675 1680 Ala Lys Ile Ile Ser Ser Asp Ile Ile Ser Thr Asn Gly Ile Val 1685 1690 1695 His Ile Ile Asp Lys Leu Leu Ser Pro Lys Asn Leu Leu Ile Thr 1700 1705 1710 Pro Lys Asp Asn Ser Gly Arg Ile Leu Gln Asn Leu Thr Thr Leu 1715 1720 1725 Ala Thr Asn Asn Gly Tyr Ile Lys Phe Ser Asn Leu Ile Gln Asp 1730 1735 1740 Ser Gly Leu Leu Ser Val Ile Thr Asp Pro Ile His Thr Pro Val 1745 1750 1755 Thr Leu Phe Trp Pro Thr Asp Gln Ala Leu His Ala Leu Pro Ala 1760 1765 1770 Glu Gln Gln Asp Phe Leu Phe Asn Gln Asp Asn Lys Asp Lys Leu 1775 1780 1785 Lys Glu Tyr Leu Lys Phe His Val Ile Arg Asp Ala Lys Val Leu 1790 1795 1800 Ala Val Asp Leu Pro Thr Ser Thr Ala Trp Lys Thr Leu Gln Gly 1805 1810 1815 Ser Glu Leu Ser Val Lys Cys Gly Ala Gly Arg Asp Ile Gly Asp 1820 1825 1830 Leu Phe Leu Asn Gly Gln Thr Cys Arg Ile Val Gln Arg Glu Leu 1835 1840 1845 Leu Phe Asp Leu Gly Val Ala Tyr Gly Ile Asp Cys Leu Leu Ile 1850 1855 1860 Asp Pro Thr Leu Gly Gly Arg Cys Asp Thr Phe Thr Thr Phe Asp 1865 1870 1875 Ala Ser Gly Glu Cys Gly Ser Cys Val Asn Thr Pro Ser Cys Pro 1880 1885 1890 Arg Trp Ser Lys Pro Lys Gly Val Lys Gln Lys Cys Leu Tyr Asn 1895 1900 1905 Leu Pro Phe Lys Arg Asn Leu Glu Gly Cys Arg Glu Arg Cys Ser 1910 1915 1920 Leu Val Ile Gln Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly Tyr Phe Gly Arg 1925 1930 1935 Asp Cys Gln Ala Cys Pro Gly Gly Pro Asp Ala Pro Cys Asn Asn 1940 1945 1950 Arg Gly Val Cys Leu Asp Gln Tyr Ser Ala Thr Gly Glu Cys Lys 1955 1960 1965 Cys Asn Thr Gly Phe Asn Gly Thr Ala Cys Glu Met Cys Trp Pro 1970 1975 1980 Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu Pro Cys Gly Cys Ser Asp His 1985 1990 1995 Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gln Cys Leu Cys 2000 2005 2010 Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Thr Gln Ala Val Leu 2015 2020 2025 Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His Ala Thr Cys Lys 2030 2035 2040 Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Gly 2045 2050 2055 Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln Asp Asn Gly Gly 2060 2065 2070 Cys Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr Lys Val Ser 2075 2080 2085 Cys Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser Cys Thr 2090 2095 2100 Glu Ile Asp Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly Gly Cys His Glu 2105 2110 2115 His Ala Thr Cys Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys His Lys Cys Glu 2120 2125 2130 Cys Lys Ser His Tyr Val Gly Asp Gly Leu Asn Cys Glu Pro Glu 2135 2140 2145 Gln Leu Pro Ile Asp Arg Cys Leu Gln Asp Asn Gly Gln Cys His 2150 2155 2160 Ala Asp Ala Lys Cys Val Asp Leu His Phe Gln Asp Thr Thr Val 2165 2170 2175 Gly Val Phe His Leu Arg Ser Pro Leu Gly Gln Tyr Lys Leu Thr 2180 2185 2190 Phe Asp Lys Ala Arg Glu Ala Cys Ala Asn Glu Ala Ala Thr Met 2195 2200 2205 Ala Thr Tyr Asn Gln Leu Ser Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Tyr His 2210 2215 2220 Leu Cys Ser Ala Gly Trp Leu Glu Thr Gly Arg Val Ala Tyr Pro 2225 2230 2235 Thr Ala Phe Ala Ser Gln Asn Cys Gly Ser Gly Val Val Gly Ile 2240 2245 2250 Val Asp Tyr Gly Pro Arg Pro Asn Lys Ser Glu Met Trp Asp Val 2255 2260 2265 Phe Cys Tyr Arg Met Lys Asp Val Asn Cys Thr Cys Lys Val Gly 2270 2275 2280 Tyr Val Gly Asp Gly Phe Ser Cys Ser Gly Asn Leu Leu Gln Val 2285 2290 2295 Leu Met Ser Phe Pro Ser Leu Thr Asn Phe Leu Thr Glu Val Leu 2300 2305 2310 Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Arg Gly Arg Ala Phe Leu Glu His 2315 2320 2325 Leu Thr Asp Leu Ser Ile Arg Gly Thr Leu Phe Val Pro Gln Asn 2330 2335 2340 Ser Gly Leu Gly Glu Asn Glu Thr Leu Ser Gly Arg Asp Ile Glu 2345 2350 2355 His His Leu Ala Asn Val Ser Met Phe Phe Tyr Asn Asp Leu Val 2360 2365 2370 Asn Gly Thr Thr Leu Gln Thr Arg Leu Gly Ser Lys Leu Leu Ile 2375 2380 2385 Thr Ala Ser Gln Asp Pro Leu Gln Pro Thr Glu Thr Arg Phe Val 2390 2395 2400 Asp Gly Arg Ala Ile Leu Gln Trp Asp Ile Phe Ala Ser Asn Gly 2405 2410 2415 Ile Ile His Val Ile Ser Arg Pro Leu Lys Ala Pro Pro Ala Pro 2420 2425 2430 Val Thr Leu Thr His Thr Gly Leu Gly Ala Gly Ile Phe Phe Ala 2435 2440 2445 Ile Ile Leu Val Thr Gly Ala Val Ala Leu Ala Ala Tyr Ser Tyr 2450 2455 2460 Phe Arg Ile Asn Arg Arg Thr Ile Gly Phe Gln His Phe Glu Ser 2465 2470 2475 Glu Glu Asp Ile Asn Val Ala Ala Leu Gly Lys Gln Gln Pro Glu 2480 2485 2490 Asn Ile Ser Asn Pro Leu Tyr Glu Ser Thr Thr Ser Ala Pro Pro 2495 2500 2505 Glu Pro Ser Tyr Asp Pro Phe Thr Asp Ser Glu Glu Arg Gln Leu 2510 2515 2520 Glu Gly Asn Asp Pro Leu Arg Thr Leu 2525 2530 <210> 99 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Gly Val Phe His Leu Arg Ser Pro Leu Gly Gln Tyr Lys Leu Thr Phe 1 5 10 15 Asp Lys Ala Arg Glu Ala Cys Ala Asn Glu Ala Ala Thr Met Ala Thr 20 25 30 Tyr Asn Gln Leu Ser Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Tyr His Leu Cys Ser 35 40 45 Ala Gly Trp Leu Glu Thr Gly Arg Val Ala Tyr Pro Thr Ala Phe Ala 50 55 60 Ser Gln Asn Cys Gly Ser Gly Val Val Gly Ile Val Asp Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Arg Pro Asn Lys Ser Glu Met Trp Asp Val Phe Cys Tyr Arg 85 90

Claims (148)

  1. (i) 고분자량 하이알루로난(HMW HA), (ii) 펜트락신 3(PTX3) 단백질, 및 (iii) 인터(inter)-α-억제제(IαI)의 중쇄 1(HC1) 및 중쇄 2(HC2)를 포함하는 재구성된 중쇄-하이알루로난/펜트락신 3(rcHC-HA/PTX3) 복합체로서, 상기 복합체는 3:1 이상의 IαI 대 종양 괴사 인자 α-자극된 유전자 6(TSG-6)의 몰비를 사용하여 재구성함으로써 얻을 수 있는 것인 rcHC-HA/PTX3 복합체.
  2. 제1항에 있어서, (i) HMW HA, HC1, HC2, 및 PTX3, 또는 (ii) HMW HA, HC1, HC2, PTX3, 및 TSG-6으로 이루어진 rcHC-HA/PTX3 복합체.
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  8. 필요로 하는 대상체에서 염증의 예방 또는 감소를 위한, 제1항의 rcHC-HA/PTX3 복합체를 포함하는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 염증이 급성 염증 또는 만성 염증인 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 염증이 자가면역 장애, 알레르기, 백혈구 결함(leukocyte defect), 감염, 이식편대 숙주질환, 조직 이식 거부, 또는 이들의 조합과 관련되어 있는 것인 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 염증이 관절염, 류마티스성 관절염, 결막염, 각막염, 안검염, 안검결막염, 공막염, 상공막염, 포도막염, 망막염, 맥락막염, 심근경색, 뇌졸중, 내독소 쇼크, 패혈증, 또는 죽상경화증과 관련되어 있는 것인 약학 조성물.
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  19. 시험관내에서 줄기 세포를 제1항의 rcHC-HA/PTX3 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포 확장을 유도하는 방법.
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