FI78119B - Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. - Google Patents

Description

7811 9

Menetelmä ihmisen insuliinin tai sen B-30-estereiden valmis tamiseksi - Förfarande för framställning av mänskligt insu lin eller B-30-estrar därav Tämä keksintö koskee uutta menetelmää ihmisen insuliinin tai sen B-30-esterin valmistamiseksi.

Useita vuosia on erilaisia insuliineja käytetty insuliini-riippuvaisen sokeritaudin hoidossa. Olisi luonnollista hoitaa ihmisiä ihmisen insuliinilla, mikä ei kuitenkaan ole mahdollista vallitsevan tarpeen vuoksi. Käytännön syistä käytetään tämän vuoksi naudan ja sian insuliinia. Nämä insuliinit kuitenkin aiheuttavat suuremmassa tai pienemmässä määrin vasta-aineiden muodostumista ihmisen kehossa, mikä mm. vähentää jälkeenpäin seuraavan insuliinihoidon tehokkuutta .

Tämän epäkohdan oletetaan johtuvan osittain naudan/sian insuliinissa olevista "epäpuhtauksista", osittain niiden vieraasta luonteesta. Viimemainittu ilmenee siinä että ihmisen insuliinimolekyyli eroaa muista eläininsuliinimolekyyleistä joidenkin aminohappokomponenttien koostumuksen suhteen.

Suuria parannuksia on saavutettu insuliinivalmisteiden suhteen uusimpien puhdistusmenetelmien käyttöönoton jälkeen, mutta vasta-aineiden muodostusta ihmisen kehossa saattaa vieläkin esiintyä. Otaksutaan että tämä voidaan poistaa käyttämällä ihmisen insuliinia muiden eläininsuliinien asemesta.

Ihmisen insuliinin kemiallinen valmistus on tunnettu, vrt. US-patenttijulkaisua 3,903,068 ja Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 759-767 (1976).

Nämä menetelmät käsittävät desoktapeptidi-(B23-30) sian insuliinin käsittelemisen synteettisellä oktapeptidillä, joka 2 78119 vastaa ihmisen insuliinin asemia B23-30. Ensimmäisessä menetelmässä suoritetaan kuitenkin alkalinen hydrolyysi, johon liittyy epäedullisia sivureaktioita. Toinen menetelmä käsittää ei-spesifisen reaktion, joka aiheuttaa useita sivureaktioita ja joka edellyttää hankalia puhdistustoimenpiteitä. Näin ollen nämä menetelmät eivät ole sopivia käytettäviksi teollisessa mittakaavassa.

Edelleen on US-patenttijulkaisussa 3,276,961 kuvattu menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi muista eläininsu-liineista entsyymin avulla, esim. karboksipeptidaasin tai trypsiinin avulla, treoniinin läsnäollessa. Ei ole kuitenkaan osoittautunut mahdolliseksi valmistaa ihmisen insuliinia missään suuremmassa määrin tällä tunnetulla menetelmällä. Tämä johtuu ilmeisesti siitä, että trypsiini ja karbok-sipeptidaasi A hydrolysoivat ei ainoastaan lysyyli-alanlini-peptidi-sidoksen (B29-B30) vaan myös muita asemia insuliinissa työskentelyolosuhteissa. Trypsiini hydrolysoi mieluummin arginyyli-glysiini-peptidisidoksen (B22-B23) kuin lysyy-li-alaniini-sidoksen (B29-B30). Karboksipeptidaasi A ei kuitenkaan pysty lohkaisemaan pelkästään alaniinia B-ketjun C-pääteasemassa lohkaisematta samanaikaisesti myös asparagii-nia A-ketjun C-pääteasemassa. On myöhemmin osoittautunut että tietty ehto, nimittäin reaktion suorittaminen ammonium-bikarbonaattipuskuri-liuoksessa, on välttämätön asparagiinin vapautumisen estämiseksi, vrt. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 359, 799-802 (1978). Lisäksi, mitään huomattavaa pep-tidimuodostusta tuskin esiintyy, koska hydrolyysireaktion nopeus on suurempi kuin peptidisynteesin nopeus työskentelyolosuhteissa.

Myöhemmin on ilmennyt että orgaanisen liuottimen lisääminen reaktioseokseen entsymaattisesti katalysoidussa menetelmässä huomattavasti kiihdyttää peptidisidossynteesiä ja alentaa hydrolyysinopeutta, vrt. Ingalls et ai. (1975), Biotechn. Bioeng. 17, 1627, ja Homandberg et ai., Biochemistry 12, 78119 5220 (1978). Reaktioseoksessa olevan liuottimen konsentraa-tion tulisi olla suuri, ja jälkimmäisessä kirjallisuusviitteessä mainitaan, että käytettäessä 1,4-butaanidiolia liuottimena parhaimmat tulokset saadaan käyttämällä mainittua liuotinta 80 %:n konsentraationa.

Tämän oivalluksen jälkeen desoktapeptidi-(B23-B30)-insuliinia (DOI) kytkettiin menestyksellisesti trypsiinikatalyysil-lä synteettiseen oktapeptidiin, joka vastaa ihmisen insuliinin asemia B23-B30 käyttämällä ylimäärin (10:1) viimemainittua reaktiokomponenttia ja orgaanista liuotinta (DMF) yli 50 %:n konsentraationa, vrt. J. Am. Chem. Soc. 101, 751-752 (1979). Kytkentä etenee kohtuullisella saannolla, mutta kaikki seikat huomioonottaen tämä menetelmä on edelleen kallis ja työläs, koska se edellyttää sian insuliinin trypsii-nikatalysoidun hajottamisen DOI:n muodostamiseksi, ja edelleen tarvittava oktapeptidi on valmistettava monimutkaisella synteesillä.

Lisäksi on julkaisuissa Nature 280, 412-413 (1979) ja Biochem. Biophys. Res. Corn. 92 No. 2, 396-402 (1980) kuvattu menetelmä ihmisen insuliinin puolisynteettiseksi valmistamiseksi, jossa menetelmässä ala-B30 sian insuliinissa korvataan treo-niinilla käyttäen katalysaattorina trypsiiniä tai achromo-bakter-proteaasia. Tässä menetelmässä hydrolysoidaan insuliini ensin karboksipeptidaasilla tai achromobakter-proteaa-silla NH4HC03:n läsnäollessa desalaniini-B30-insuliinin (DAI) valmistamiseksi. DAI:n trypsiini- tai achromobakterkataly-soitu kytkentä suoritetaan käyttämällä suurta ylimäärää suojattua treoniinijohdannaista, kuten treoniini-butyyli-este-riä (Thr-OBu^) suhteessa 50:1 - 100:1 ja korkeata konsent-raatiota orgaanista liuotinta, noin 60 % dimetyyliformamidin ja etanolin seosta. Tällaisissa olosuhteissa Arg(B22)-Gly(B23)-sidoksen lohkaisu vähenee huomattavasti.

Edellä mainituista viitteistä on ilmeistä, että US-patentti-julkaisusta 3,276,961 tunnettuun menetelmään liittyviä epä- 4 78119 kohtia on parannettu suorittamalla reaktio käyttämällä korkeita konsentraatioita orgaanisia liuottimia ja on osoittautunut että saannon lisäys on verrannollinen suureen määrään orgaanista liuotinta. Kuitenkin on tärkeä seikka edelleen se, että käytetään suurta ylimäärää toista reaktiokomponent-tia. Epäillään kuitenkin, että monet ehdotetuista sopivista liuottimista ovat mutageenisia, ja koska ne voivat olla vaikeita poistaa täysin insuliinituotteesta, tällaisten liuotinten käyttöä tulisi välttää mahdollisimman pitkälle.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä eläininsuliinin, erityisesti sian insuliinin tai sen desalaniini-B30-johdannaisen muuttamiseksi ihmisen insuliiniksi suurella saannolla ja käyttämättä haitallisia orgaanisia liuottimia.

On yllättävästi todettu, että treoniinin liittäminen insuliinin B30-asemaan käyttäen trypsiiniä tai trypsiininkal-taista entsyymiä katalysaattorina tapahtuu tasaisesti vesipitoisessa liuoksessa, kun treoniinijohdannaisen molaarinen konsentraatio reaktioseoksessa pidetään tietyn korkean arvon yläpuolella.

Niinpä keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen insuliinin tai sen B-30 esterin valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan karboksyyli- ja mahdollisesti hydrok-syylisuojattu L-treoniinijohdannainen saatetaan reagoimaan insuliinijohdannaisen kanssa, jonka kaava on (l-T-A-x-21) (I)

(l-l-B-1-29)-R

jossa R on hydroksyyli tai aminohapporadikaali, joka on muu kuin treoniiniryhmä, ja -A- ja -B- tarkoittavat A- ja B-ketjuja, joissa on sama aminohapposekvenssi kuin ihmisen insuliinissa, trypsiinin tai trypsiininkaltaisen entsyymin I; 5 78119 läsnäollessa vedessä pH-arvossa 5-9 ja alle 50°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen haluttaessa poistetaan läsnäolevat suo-jaryhmät, ja keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että L-treoniinijohdannainen on läsnä reaktioseoksessa 2 -noin 6 molaarisena konsentraationa. Yläraja riippuu yksittäisestä treoniinij ohdannaisesta.

Treoniinijohdannaisen konsentraation merkitystä reaktioseoksessa ei ole oivallettu aikaisemmin. Otaksuttiin, että tryp-siinikatalysoitu hydrolyysi ja siten sivutuotteiden muodostus vesipitoisessa liuoksessa olivat välttämättömiä ja että hydrolyysiä voitiin vaimentaa vain käyttämällä liuosta, joka sisältää 50-90 % veden kanssa sekoittuvaa orgaanista liuotinta .

Aikaisemmin on ehdotettu käytettäväksi suurta molaarista suhdetta L-treoniinijohdannaisen ja insuliiniyhdisteen välillä, esim. 5:1 - 500:1, menetelmää ohjaavana tekijänä.

Nyt on todettu, erityisesti vesipitoisten reaktioiden yhteydessä, että L-treoniinijohdannaisen suuren molaarisen konsentraation käyttämisellä reaktioseoksessa on ratkaiseva merkitys, kun taas L-treoniinijohdannaisen ja insuliinin välisellä suurella molaarisella suhteella on vähäisempi merkitys, melkein riippumatta insuliinin konsentraatiosta.

L-treoniinijohdannaisen molaarinen konsentraatio, joka on 2 tai suurempi, aikaansaa aminohapon spesifisen reaktion insuliinin kanssa B29-B30-asemassa, kun taas hydrolyysi B22-B23-asemassa on vaimennettu. Lisäksi se aikaansaa myös insuliinin erittäin suuren liukoisuuden.

Kun reaktioseoksessa on läsnä L-treoniinijohdannaista edellä mainitussa suuressa molaarisessa konsentraatiossa, ei saavuteta mitään erityisiä etuja lisäämällä edelleen pienempiä määriä veden kanssa sekoittuvaa orgaanista liuotinta reaktio- 6 78119 seokseen. Mikäli lisätään orgaanista liuotinta, tulisi lisäyksen olla alle noin 30 % (til./til.), jotta vältyttäisiin reaktionopeuden hidastumiselta. Keksinnön mukaisessa menetelmässä on edullista käyttää L-treoniinijohdannaista reak-tioseoksessa molaarisessa konsentraatiossa, joka on 3-5. Mo-laarinen konsentraatio, joka on yli 5, aikaansaa reaktioseok-sen viskositeetin huomattavan kasvun. L-treoniinijohdannaisen konsentraatio, joka on oleellisesti alle 2, aikaansaa sivutuotteiden muodostumisen lisääntymisen, insuliinin huonomman liukoisuuden ja vastaavasti pienemmät saannot.

Insuliini-reaktiokomponentti voi olla sian insuliinia tai mitä tahansa sen johdannaista, jolla on edellä mainittu kaava (I). Voidaan esimerkiksi käyttää sian insuliinista saatua desalaniini-B(30)-insuliinia.

L-treoniini-reaktiokomponentti on mieluimmin suojattu L-treoniinijohdannainen, jolla on kaava

Thr-(R1)(R2) (II) jossa Thr on L-treoniiniryhmä, R1 on vety tai hydroksyyli-suojaryhmä ja R2 on karboksyylisuojaryhmä. Edullinen L-treoniinijohdannainen on alkyyliesteri, esim. metyyli-, .. . etyyli- tai t-butyyliesteri.

L-treoniinijohdannaisen mahdollista neutralointia ja pH:n säätämistä varten voidaan käyttää mineraalihappoja tai alempia karboksyylihappoja, esim. etikkahappoa tai propionihap-poa. Proteolyyttisen entsyymin tulisi olla spesifinen lysii-nikarbonyylisidosten pilkkomisen suhteen peptideissä, ja se voi esim. olla eri lähteistä saatu trypsiini, erilaisia trypsiinijohdannaisia tai achromobacter-proteaasi.

Reaktiolämpötila voi olla välillä 0 ja 50°C, esim. välillä 5 ja 20°C.

7 781 1 9

Koska käytetään suojattua L-treoniinia reaktiokomponenttina, tulee insuliinituote sisältämään suojaryhmän (-iä) ja mainittu (-ut) ryhmä(t) voidaan poistaa tunnetulla tavalla.

Keksinnön mukaista menetelmää havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1 200 mg sian insuliinia liuotettiin 1 ml:aan L-treoniini-etyyliesteri-propionaatin 3,7 M vesipitoista liuosta. Tähän seokseen lisättiin liuos, jossa oli 4 mg sian trypsiiniä 40 /Ulitrassa 0,02 M kalsiumasetaattia, ja pH säädettiin uudestaan arvoon 6,3 propionihapolla. Sen jälkeen liuoksen annettiin seistä 20°C:ssa 5 tuntia, minkä jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 9 ml vettä ja säätämällä pH arvoon 3 5 N kloorivetyhapolla.

Korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi muuttumisas-teeksi 75 %.

Reaktioseos geelisuodatettiin pylväässä, jossa oli Sephadex® G-50 Superfine (2,6 x 90 cm) 1 M etikkahapossa. Ihmisen in-suliiniesteriä ja reagoimatonta sian insuliinia sisältävä fraktio jäädytyskuivattiin. Saanto: 180 mg tuoteseosta.

Sen jälkeen tuotteelle suoritettiin ioninvaihto 4°C:ssa DEAE-selluloosapylväässä (Whatmann DE-52) (5 x 2 cm), joka oli tasapainotettu 75 ml:lla/tunti puskuria, joka sisälsi 0,02 M TRIS ja 7 M ureaa, säädetty pH-arvoon 8,1 kloorivetyhapolla. Tuotteen panostamisen jälkeen pylväs eluoitiin 2,5 tuntia edellä mainitulla puskuriliuoksella, sen jälkeen 2 tuntia edellä mainitulla puskurilla sekoitettuna 0,0045 moolin kanssa natriumkloridia litraa kohti ja lopuksi 12 tuntia edellä mainitulla puskurilla sekoitettuna 0,011 moolin kanssa natriumkloridia litraa kohti.

8 781 1 9

Eluaatti sisälsi kaksi proteiinipitoista fraktiota. Ensin eluoitu fraktio identifioitiin korkeapainenestekromatografi-alla ihmisen insuliiniesteriksi ja sen jälkeen eluoitu fraktio reagoimattomaksi sian insuliiniksi.

Ensin eluoidusta pääfraktiosta poistettiin suolat pylväässä, jossa oli Sephadex® G-25 0,1 M etikkahapossa ja jäädytyskui-vattiin, jolloin saatiin 120 mg ihmisen insuliini-etyylies-teriä.

Eristetty ihmisen insuliinietyyliesteri liuotettiin 50 ml:aan vettä, pH säädettiin arvoon 9,5 0,1 M natriumhydroksidilla. Liuoksen annettiin olla 25°C:ssa 72 tuntia samalla tarkistaen pH-arvo, minkä jälken insuliini kiteytettiin sinänsä tunnetulla tavalla. Näin saatiin 110 mg ihmisen insuliinia, joka identifioitiin aminohappoanalyysillä ja korkeapainenestekro-matografiällä.

Esimerkki 2 1 g L-treoniini-metyyliesteriä liuotettiin 1 ml:aan vettä, minkä jälkeen lisättiin 100 mg sian insuliinia, ja seosta hämmennettiin kunnes insuliini oli liuennut. Siihen liuotettiin 10 mg trypsiiniä ja seoksen annettiin olla huoneen lämmössä 30 minuuttia. Sen jälkeen reaktio keskeytettiin säätämällä pH-arvoon 3 IN kloorivetyhapolla.

Analyysi korkeapainenestekromatografialla antoi saannoksi 24 % ihmisen insuliini-metyyliesteriä.

: Esimerkki 3

1 g L-treoniini-metyyliesteriä liuotettiin 1 ml:aan vettä. Lisättiin 100 mg sian insuliinia ja saatettiin se liukenemaan hämmentämällä vähän aikaa. Tähän seokseen liuotettiin 10 mg trypsiiniä, ja viiden minuutin kuluttua liuoksen pH

tl 9 781 1 9 säädettiin arvoon 6,3 lisäämällä 450 ^ulitraa jääetikkaa.

Sen jälkeen annettiin seoksen olla huoneen lämmössä ja 2 tunnin kuluttua reaktio keskeytettiin säätämällä pH-arvoon 3 1 N kloorivetyhapolla.

Analyysi korkeapainenestekromatografialla antoi saannoksi 31 % ihmisen insuliinin metyyliesteriä.

Esimerkki 4 500 mg sian insuliinia liuotettiin 2,50 mitään 4M L-treonii-ni-metyyliesteri-hydrokloridia, pH-arvo 6,5. pHtn säätämisen jälkeen arvoon 6,3 300 /ulitralla 5 N kloorivetyhappoa lisättiin liuos, jossa oli 10 mg trypsiiniä 100 /ulitrassa 0,02 M kalsiumasetaattia, ja reaktioseoksen annettiin olla 8°C:ssa 65 tuntia. Sen jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 25 ml vettä ja säätämällä pH-arvoon 3 5 N kloorivetyhapolla .

Reaktioseoksen korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi muuttumisasteeksi 43 %.

Esimerkki 5

Valmistettiin 1,5 ml L-treoniini-metyyliesteri-asetaatin 5 M liuos, jossa oli 200 mg sian insuliinia, liuottamalla 200 mg sian insuliinia 750 /ulitraan 10 M etikkahappoa ja lisäämällä 1 g L-treoniini-metyyliesteriä. Lisättiin 2 mg sian trypsiiniä ja kirkkaan reaktioseoksen, jonka pH-arvo oli 6,3, annettiin seistä 20°C:ssa. Reaktio keskeytettiin 90 tunnin jälkeen lisäämällä 15 ml vettä ja säätämällä pH-arvoon 3 5N kloorivetyhapolla.

Reaktioseoksen korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi muuttumisasteeksi 85 %.

781 1 9 10

Esimerkki 6 2 g sinkkivapaata sian insuliinia liuotettiin 200 ml:aan 0,2 M ammoniumbikarbonaattia, joka oli säädetty pH-arvoon 8,4 ammoniakkivedellä. Liuotettiin 20 mg karboksipeptidaasia A 4 ml:aan vettä muutaman kiinteän TRIS-rakeen avulla ja lisättiin insuliiniliuokseen, jonka sen jälkeen annettiin olla 20°C:ssa 2,5 tuntia. Liuos linko-jäädytettiin ja jäädytys-kuivattiin.

Jäädytyskuivattu jauhe liuotettiin 80 ml:aan IM etikkahappoa ja geelisuodatettiin pylväässä, joka oli täytetty Sephadex® G-50 Superfine111a (5 x 90 cm) samassa liuoksessa. Insuliinia sisältävä fraktio jäädytyskuivattiin. Näin saatiin 1800 mg des-(B30-alaniini)-sian insuliinia.

Esimerkki 7

Valmistettiin liuos, jossa oli 100 mg des-(B30-alaniini) sian insuliinia 475 /ulitrassa 3,2 M L-treoniini-metyyliesteri-asetaattia, liuottamalla 100 mg des-(B30-alaniini)-sian insuliinia, joka oli valmistettu esimerkin 6 mukaisesti, seokseen, jossa oli 200 /ulitraa vettä ja 75 /ulitraa jääetikkaa ja sen jälkeen lisättiin 200 mg L-treoniini-metyyliesteriä. pH:n säätämisen jälkeen arvoon 6,5 jääetikalla, lisättiin 1 mg sian trypsiiniä. Seoksen annettiin olla huoneen lämmössä 2 tuntia, minkä jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 5 ml vettä ja säätämällä pH arvoon 3 5N kloorivetyhapolla.

Korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi muuttumisas-teeksi 78 %.

Puhtaan ihmisen insuliini-metyyliesterin edelleenkäsittely ja sen muuttaminen ihmisen insuliiniksi voi tapahtua seuraamalla esimerkissä 1 annettuja ohjeita.

t! 78119

Esimerkki 8 1 g L-treoniini-metyyliesteriä liuotettiin 1 ml:aan vettä, ja tähän liuokseen lisättiin 200 mg desalaniini(B-30) sian insuliinia, joka oli valmistettu esimerkin 6 mukaisesti. Liuoksen pH säädettiin arvoon 6,3 450 /ulitralla jääetikkaa. Lisättiin 10 mg trypsiiniä ja liuoksen annettiin olla huoneen lämmössä. 20 minuutin kuluttua reaktio keskeytettiin säätämällä pH arvoon 3 IN kloorivetyhapolla.

Korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi ihmisen in-suliini-metyyliesterin saannoksi 73 %.

Esimerkki 9 2 g L-treoniini-metyyliesteriä liuotettiin 2 ml:aan vettä ja tähän liuokseen lisättiin 400 mg desalaniini (B-30) sian insuliinia, joka oli valmistettu esimerkin 6 mukaisesti. Liuoksen pH säädettiin arvoon 6,2 900 /ulitralla jääetikkaa. Lisättiin 20 mg formyloitua trypsiiniä, ja liuoksen annettiin olla huoneen lämmössä 2 tuntia. Sen jälkeen reaktio keskeytettiin säätämällä pH-arvoon 3 IN kloorivetyhapolla.

Korkeapainenestekromatograafinen analyysi antoi ihmisen in-suliini-metyyliesterin saannoksi 69 %.

Esimerkki 10

Reaktioseos, joka sisälsi 200 mg des-(B-30)-alaniini-sian insuliinia 1400 /ulitrassa 2,5 M L-treoniini-metyyliesteri-asetaattia, valmistettiin liuottamalla 200 mg des(B-30 ala-niini) -sian insuliinia, joka oli valmistettu esimerkin 6 mukaisesti, seokseen, jossa oli 400 /ulitraa vettä ja 180 /ulitraa jääetikkaa, ja sen jälkeen lisättiin 460 mg L-treoniini-metyyliesteriä. Kirkkaaseen liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 2 mg sian trypsiiniä 300 /ulitrassa vettä.

Claims (6)

1. Menetelmä ihmisen insuliinin tai sen B-30 esterin valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan karboksyylisuojattu ja mahdollisesti hydroksyylisuojattu L-treoniini-johdannainen saatetaan reagoimaan insuliinijohdannaisen kanssa, jonka kaava on i: i3 781 1 9 (l-r-A-r-21) (I) jossa R on hydroksyyli tai aminohapporadikaali, joka on muu kuin treoniini, ja -A- ja -B- tarkoittavat A- ja B-ketjuja, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ihmisen insuliinissa, trypsiininkaltaisen proteolyyttisen entsyymin läsnäollessa vedessä, pH-arvossa 5-9 ja alle 50 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen läsnäolevat suojaryhmät haluttaessa poistetaan, tunnettu siitä, että L-treoniini-johdannainen on läsnä reaktioseoksessa konsentraationa, joka on 2 - 6 moolia/1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-treoniini-johdannainen on läsnä reaktioseoksessa konsentraationa, joka on 3 - 5 moolia/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty insuliinijohdannainen on sian insuliinista saatua desalaniini-B30-insuliinia (DAI).

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukaisena insuliinijohdannaisena käytetään sian insuliinia, jolloin R on alaniini.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-treoniini-johdannainen on L-treonii-nin metyyli- tai etyyliesteri.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteolyyttinen entsyymi on trypsiini. 14 781 1 9