FI118126B - Keuhkopintaproteiinin SP-C synteettiset peptidianalogit - Google Patents

Description

1 118126

Keuhkopintaproteiinin SP-C synteettiset peptidianalogit -Syntetiska peptidanaloger av lungytproteiner SP-C

5 Tekniikan ala

Keksintö kohdistuu keuhkopinta-aktiivisiin polypeptideihin, · menetelmään niiden valmistamiseksi ja niitä sisältäviin -i , ' , terapeuttisiin koostumuksiin.

10 Tekniikan taso

Kaikkien selkärankaisten keuhkot sisältävät substanssiseos-ta, jota nimitetään "keuhkopinta-aktiiviseksi aineeksi". ;

Siinä on pinta-aktiivisia ominaisuuksia ja se alentaa pin- | tajännitystä keuhkojen rakkula-alueella niin paljon, että ‘ 15 uloshengitettäessä vältetään lopullisen hengitystiealueen kokoonpainuminen. Tämä substanssiseos säätää pintajännitystä dynaamisesti siten, että pintajännityksen vastaava sovittaminen välttää Laplacen lain mukaisesti odotettavissa olevan · suurempien keuhkorakkuloiden hyötynä olevan pienten keuhko-20 rakkuloiden kokoonpainumisen. Tuloksena syntyy hyvin tasapa- ^ inottunut, histologisesti ja fysiologisesti stabiili keuhko-rakenne.

, Lamellikappaleiden (lamellar bodies) muodossa olevat tyypin • · *··’ 25 IX keuhkorakkulapneumosyytit erittävät keuhkopinta-aktii- ·.:.1 vista ainetta. Ne ovat kompakteja yksikköjä, joissa on fos- £ ·· .1 • '·· folipidikaksoiskerroksia (bilayern) , joissa on suuri osuus Φ dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia (DPPC) ja fosfatidyyliko-i liinia (PG) . Muina olennaisina komponentteina keuhkopinta- 1 30 -aktiiviset aineet sisältävät proteiineja, joista nimitetään

* . ;J

SP-A:ksi, SP-B:ksi ja SP-C:ksi. SP-A on suurmolekyylinen , glykoproteiini, jolla on erityksen säätämisessä merkitsevä ί * · « I". rooli.

• · 1 **·; “·”· 35 Proteenit SP-C ja vähäisemmässä määrin SP-B toimivat yksi- •f" molekyylisen pintakalvon (ahtaammassa merkityksessä pinta- aktiivinen aine) muodostuksessa "termodymaanisina kataly- f • · 1 I . saattoreina". Näiden proteiinien läsnäolo kiihdyttää vai- i « · • t · 1 tavasti levittymiskinetiikkaa. Siten on pinta-aktiivisen 2 118126 koostumuksen hidastumaton sovittaminen kulloisiinkin pin-tajännitysvaatimuksiin mahdollinen. Nämä ominaisuudet kuvastuvat proteiinien, erityisesti SP-C:n, äärimmäisen hydrofobisessa luonteessa.

5

Uuttamalla keuhkokudosta tai huuhtomalla eläinten keuhkoja on voitu saada talteen pinta-aktiivisen aineen valmisteita, joilla on seka fysikaaliskemiallisilla mittauslaitteistoissa, kuten eläinmalleissa, että kliinisessä käytössä kykyä 10 korvata pinta-aktiivisen aineen puutosta ja siten ne sopivat esimerkiksi lasten hengenahdistusoireyhtymän (IRDS) hoitoon. Näissä eläinpreparaateissa on kuitenkin pahoja heikkouksia: > 15 Fosfolipidien koostumus on vahvasti eläinlajista ja eläimen ravitsemustilasta riippuvainen ja voidaan sovittaa vain rajoitetusti sekoittamalla siihen määrättyjä komponentteja. Pinta-aktiivisten proteiinien SP-B/SP-C-suhde on epävarma samoista syistä. Lisäksi terapeuttisesti käytetty seos si-20 sältää proteiinien mahdollisia hajoamistuotteita tai modi-fioituneita johdannaisia (esim. metioniinin hapettuminen). Käytettäessä pitkäaikaisesti tai suurempia määriä pinta-ak- ; tiivistä ainetta, kuten esim. aikuisten hengenahdistusoire-, yhtymässä (shokkikeuhko (ADRS) tai muilla käyttöaloilla, • j 'φ *·*·* 25 kuten esim. käytettäessä pinta-aktiivista ainetta muiden ^ *.ί.* aineiden "kuljettimena" keuhkoihin vietäessä, jos se olisi i ·· : • *·· tarpeellista, on kysymys substanssin täydentämisestä avoin.

« • · · ....

* ····· • ^ Tämän ongelman ratkaisemiseen tarjotaan proteiinien valmis- 30 tamista geeniteknisin keinoin. Koska rekombinanttiset pro- teiinit, erityisesti käytettäessä bakteeri-ilmennysjärjes- . .*. telmiä, ovat valmistettavissa rajoittamattomissa määrin ja • · * koska nykyaikaisten analyysimenetelmien ja laadunvalvonnan • · · käyttö on mahdollista, voidaan synteettisiä fosfolipidejä • * 35 käyttämällä valmistaa pinta-aktiivinen aine, jonka koostu- "·**· mus on tarkasti määritetty. Se voidaan sovittaa terapeut- tisiin vaatimuksiin optimaalisesti.

• · • · * • ·· · • 3 118126

Ihmisen proteiini SP-C (katso kaavio 1, A - H tai Phe, B -Cys ja C - Met), joka on erityisen tärkeä levittyrniskine-tiikan osalta, koostuu keskiosasta, joka koostuu yksinomaan alifaattisista, hyvin hydrofobisista aminohapoista, kuten „ 5 väliini, leusiin ja isoleusiini. Tämän keskiosan pituus (aminohapot 12-34) mahdollistaa peptidin integroitumisen yksimolekyyliseen fosfoiipidikä1voon. Sekvenssissä Pro-Cys-Pro (asema 3-6) ovat molemmat Cys-tähteet palmitii- i nihapon SH-ryhmiksi tioesteröimiä. Palmitiinihappo lisää 10 kokonaisproteiinin hydrofobista piirrettä ja sulkee kyste-iinin kummatkin SH-ryhmät ja suojelee niitä hapettumiselta ja disulfidisillan muodostumiselta. Keskialue (aminohapot 13-34) muodostaa transmembraaniheliksin. Tätä aluetta suo- ; jaa sivulta N-terminaalissa polaarinen sekvenssi, joka si-15 sältäa positiivisesti varautuneita aminohappoja (Lys, 10?

Arg,11).

WO-91/18015:ssä kuvataan rekombinanttisen SP-C:n ja SP-C:n mutanttien valmistaminen. Siinä ehdotetaan muun muassa, 20 että asemissa 4 ja 5 olevat kysteiinit korvataan kahdella seriinilla. Silloin valmistuksessa on etuna, että erittäin hydrofobisen proteiinin eristämisen jälkeen kummankin kys-teiinin teknisesti kallis palmitoyloiminen jää pois.

*··* 25 Keksinnön kuvaus

• · * e M

*·ί·* Nyt havaittiin yllättäen, että SP-C-mutanteissa, jotka * · : ** eroavat ihmisen SP-C:stä siten, että molemmat kysteiinit on korvattu asemassa 4 ja 5 fenyylialaniilla tai tryptofaa- *,·#ϊ nilla ja metioniini on korvattu asemassa 32 isoleusiinilla, 30 leusiinilla tai seriinillä, ei esiinny minkäänlaisia toi- mintakatoja verrattaessa luontaiseen SP-C:hen ja ne ovat . stabiiliutensa puolesta jopa parempia. Geeniteknologinen » * · ,·;·. valmistaminen on merkittävästi yksinkertaisempaa ja antaa " • · · suurempia saantoja. Uusia polypeptidejä, joissa on keuhko-' 35 pinta-aktiivista vaikutusta, voidaan valmistaa erittäin "·"· puhtaina.

··· .

♦ · * • * · .·. : Näin ollen esillä olevan keksinnön kohteena on polypepti- • ·· • · 118126 4 ' ' \ dit, joissa on keuhkopinta-aktiivista vaikutusta ja joissa on yleisen kaavan I mukainen aminohapposekvenssi: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5 (A) Gly Ile Pro B B Pro Vai His Leu Lys 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 |

Arg Leu Leu Ile Vai Vai Vai Vai Vai Vai (I) 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Leu Ile Vai Vai Vai Ile Vai Gly Ala Leu 10 31 32 33 34 f

Leu C Gly Leu jossa A on H tai Phe, ί B on Phe tai Trp ja 15 C on Ile, Leu tai Ser.

Keksinnön edullinen kohde ovat yleisen kaavan I mukaiset polypeptidit, joissa A on H tai Phe, B on Phe ja C on Ile, jolloin merkitykset A = H, B = Phe ja C = Ile ovat erityisen 20 edullisia.

Keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset koostumukset, f: joille on tunnusomaista se, että ne sisältävät yhtä tai useampaa keksinnön mukaista keuhkopinta-aktiivista polypep-25 tidiä ryhmästä SP-A ja edullisesti SP-B.

• · · * t · • · i *.. Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan valmistaa joko tufi- ··· netuilla kiintofaasipolypeptidisynteesimenetelmillä tai

HH

. .'· vastaavien rekombinanttisten vektorien avulla isäntäsoluis- • · · ♦ · * 30 sa. Tekniikat vektorien konstruoimiseksi, solujen transfor- • · * moimiseksi, proteiinien ilmentämiseen transformoiduissa sol-uissa vaikuttamiseksi ja ilmennettyjen proteiinien erott-"·* amiseksi ovat alan ammattimiehen sinänsä tuntemia (esim.

*·) ' Wo-86/03408, WO-87/06588 ja W0 91/18015).

*!"i 35 •j··· Menetelmät vektorien valmistamiseksi SP-C:n ilmentämiseksi bakteeri järjestelmissä perustuvat konventionaalisiin rekom- f ♦ · · ] binantti-DNA-teknologian menetelmiin.

» * · • ·· • · 5 118126

Hydrofobisten SP-C-proteiinien ilmentäminen bakteereissa suurina määrinä ja vahingoittamatta isäntäsolua on mahdollista vain sopivan fuusioproteiinin muodossa, kuten yhdessä kloramfenikoliasetyylitransferaasin (CAT) kanssa. Esim. jos 5 vektori pTrpAmpCATI52 koodaa CAT:n N-terminaalista aluetta ja tarjoaa SP-C:tä koodaavien DNA-fragmenttien "in frame"- ! -kloonaukseen (5'-)EcoR1- ja (3'-)Pst1-pilkontakohdan, CAT SP-C sitoutuvat proteiinitasolla toisiinsa hydroksyyli- » amiiniherkän fuusiokohdan (AsnGly) kautta. Tällaiset vek- ΐ 10 torit, kuten pTrpAmpCATI52::SPC, sallivat vastaavien fuu-sioproteiinien kontrolloidun ilmentymisen tuotantomittakaa-vassa (fermentointi). Fuusioproteiinien ilmentäminen vaikuttaa inkluusiokappaleiden muodostumiseen isäntäsoluun.

Tällöin voi CAT-osuuden pituus muuttua fuusioproteiinissa 15 siten, että saadaan suuria inkluusiokappaleiden saantoja ς SP-C-osuuden ollessa suuri.

Ilmentäminen voidaan suorittaa bakteerien lisäksi monissa isäntäjärjestelmissä, kuten esim. nisäkäs-, hiiva- ja hyön-20 teissoluissa. Erilaisiin isäntäsoluihin sopivat DNA-raken-teet syntetoidaan tunnettujen menetelmien mukaisesti ja rakennetaan tavanomaisella tavalla vastaavien ohjaussek- ,, venssien kanssa isäntäsolujen genomiin.

* 25 Kaksi DNA-oligonukleotidiä voidaan syntetoida konventionaa- ψ »t»ti lisen f osf oamidiittimenetelmän mukaisesti Mill iGen/Bio- !**.« search Cyclone Synthetizerissä.

*4·· . Ensimmäinen DNA-oligonukleotidi muodostaa merkityksellisen 30 DNA-juosteen, jonka pituus on 118 nukleotidiä. Se koodaa » · * (5'->3'-suunnassa) EcoR1-spesifistä 5'-päätä myöhempää sub-kloonausta varten, Asn/Gly-hydroksyyliamiinipilkontakohtaa • · · ja ihmisen SP-C:tä, joka alkaa ihmisen SP-C-esisekvenssin • « · **] Gly-25:llä ja päättyy Leu-58:lla vastaten Gly-1:tä vast.

Φ *:**: 35 Leu-34:äa kaavassa I. Tällöin ihmisen SP-C-proteiinin tun- *:♦*: nettu aminohapposekvenssi translatoitui geneettisen koodin mukaisesti DNA:ksi. Sekvenssi modifioidaan kuitenkin sei- • t * • · 1 . laisella tavalla, että SP-C-esisekvenssin asemassa 28 ja 29

* ♦ * . J

’* *· olevat kysteiinit korvataan fenyylialaniinilla tai trypto- 6 118126 1 fäänillä ja esiproteiinisekvenssin asemassa 56 oleva meti- ' oniini korvataan isoleusiinilla, leusiinilla tai seriinil-lä. Lisaksi voidaan tällä tavalla ottaa huomioon myös isän-täsolujen kodoninkäyttötiheydet. Muutettua SP-C-sekvenssiä, 5 joka sisältää asemissa 4 ja 5 fenyylialaniinin ja asemassa 32 isoleusiinin (numerointi kaavan I mukainen), nimitetään näille aminohapoille tavanomaista yksikirjaimista koodia vastaavasti SPC34(FF/I):ksi. Lisäksi merkityksellinen DNA--juoste sisältää TAA-lopetuskodonin ribomaalisen transkrip- f 10 tion päättämiseksi sekä Pst1 -spesifisen 3’ -pään. Toinen DNA-oligonukleotidi on komplementaarinen, ei-koodaava (merkityksetön) juoste, joka koostuu 110 nukleotidistä.

Synteettisesti valmistettu SP-C-DNA-fragmentti kloonataan 15 sopivaan ilmennysvektoriin, kuten esim. pTrpAmpCATI52. Tämä vektori koostuu pKK233:sta (Pharmacia), joka sisältää am-pisilliiniresistenssigeenin, ja pBR322:n johdannaisesta, trc-promoottori voidaan korvata trp-promoottorilla, kuten pTrAmpCATl52. Samaten voidaan käyttää muita indusoitavia f 20 promoottoreita.

SP-C-fragmentin subkloonaamiseksi hybridoidaan seuraavaksi komplemetaarisia DNA-oligonukleot idej ä toisiinsa. Siitä saadussa DNA-kaksoisjuosteessa on ulkonevia yksijuosteisia « 25 päitä (EcoRl/Pst1 ).

» ta» · ν-ϊ • · « • 1 · 1'·» Vektori-DNA:hän vieminen tapahtuu tavanomaisella tavalla *;· hajottamalla vektori-DNA EcoR1/Pstl :llä, puhdistamalla toi- ' «. 1 1· • ·1· votut vektori-DNA-fragmentit agaroosigeelielektroforeesilla ,’j1. 30 ja hybridoimalla SP-C-DNA ja vektorifragmentit kohesiivis- ten päiden kautta. Lopuksi kummatkin fragmentit liitetään 4 toisiin kovalenttisesti ligatoimalla tunnettujen menetel- * · · *” mien mukaisesti.

• 1 1 • 1 r « * :"ϊ 35 DNA:n vahventamiseksi ja plasmidien eristämiseksi transfor- *:"ϊ moidaan saatavissa olevien protokollien mukaisesti kalsium- f1«», kloridikompetenteissa E. coli MM294-soluissa ja päällyste- t 9 · i , tään solujen, joissa on plasmidia, valikoimiseksi LB-agar- M t 1 I If · levyille ampisilliinin kanssa. Saaduista Amp-resistenteis- 7 118126 tä pesäkkeistä eristetään plasmidi-DNAt ja ne analysoidaan sopivilla restriktioentsyymiyhdistelmillä. Valitaan klooni, jonka restriktiofragmenttimalli on odotettu. Sekvensoimalla r" täydellisesti plasmidisekvenssi vahvistetaan oikein tapah- ! 5 tunut SPC34(FF/I)-sekvenssin insertio.

Näin saadut plasmidivektorit mahdollistavat fuusioproteii-nin CAT::SPC ilmentymisen Trp-promoottorin (tai muiden promoottorien) ohjauksen alaisena. Rekombinanttinen fuusiopro-10 teiini on isäntäsoluissa induktion jälkeen inkluusiokappa-leiden muodossa.

Fuusioproteiinin CAT152::SPC34(FF/1) aminohapposekvenssi on seuraa yksikirjainkoodisekvenssi: 15 : 10 20 30 40 50

MEKKI TGYTT VDISQ WHRKE HFEAF QSVAQ CTYNQ TVQLD ITAFL KTVKK

60 70 80 90 100

NKHKF YPAFI HILAR LMNAH PEFRM AMKDG ELVIW DSVHP CYTVF HEQTE

20 110 120 130 140 150

TFSSL WSEYH DDFRQ FLHIY SQDVA CYGEN LAYFP KGFIE NMFFV SANPE

160 170 180 186 FNGIP FFPVH LKRLL IVVVV VVLIV VVIVG ALLIG L . 1 10 20 30 34 • *· 25 ···“** • · · - " * * • · • · * .:. SP-C(FF/l):n 34 aminohappoa fuusioproteiinin asemissa ·. 1 53-1 86 on alleviivattu ja tunnistettu antamalla asemat ::: 1-34.

• · · ♦ · · ·%.

30 , Myöhempi hydroksyyliamiinilla pilkkominen CAT:n ja SP-C:n • · · *···’ erottamiseksi tapahtuu Asn-152:n ja Gly-153:n välissä (vas- • · · • · · *·* ‘ taa 1. aminohappoa SP-C-peptidissä). SP-C-peptidin erotta- ·;··· minen ja puhdistaminen tapahtuu proteiinikemian mukaisesti ....: 35 tavanomaisilla menetelmillä.

• · • · · • « · *** Keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan käyttää yksinään y.

t · · *· " tai yhdistettynä farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka on sovitettu hengitysteiden hoitoon. Koostumukset sopivat kes- 8 118126 kosten ja aikuisten hengenahdistusoireyhtymän hoidon lisäksi keuhkokuumeen ja keuhkoputkentulehduksen hoitoon. Lisäksi keksinnön mukaiset polypeptidit sopivat kuljetusaineiksi hengityksen mukana annettaville lääkkeille.

Koostumukset sisältävät polypeptidien lisäksi fosfolipide-jä, edullisesti sellaisia fosfolipidejä, joita sisältyy luontaisiin keuhkopinta-aktiivisiin koostumuksiin, kuten edullisesti dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia (DPPC), pal-10 mitoyylioleyylifosfatidyyliglyserolia (POPG) ja/tai fosfa-tidyyliglyserolia (PG). Sopivan viskositeetin säätämiseksi koostumukset sisältävät kalsium- ja magnesiumioneja sekä natriumkloridia. Ammattimies orientoituu koostumusten yksittäisten aineosien lajin ja määrän mittaamiseen luontais-15 ten keuhkopinta-aktiivisten aineiden tunnettujen koostumusten ja tekniikan tason mukaisten lukuisten ehdotusten, kuten esim. EP-A-0 1 1 9 056 ja EP-A-0 406 732, mukaan.

Edulliset keksinnön mukaiset koostumukset sisältävät 80-95 20 paino-% fosfolipidejä, 0,5-3,0 paino-% polypeptideja, 4-7 paino-% rasvahappoa, edullisesti palmitiinihappoa, ja 1-3 paino-% kalsiumkloridia.

. Valmistusesimerkki • * · : 25 1. Tuotantokanta ' * · · |*.t> Käytetty tuotantokanta E. coli 199 on johdettu E. coli K12 -kannasta MM294, joka voidaan saada tallennusnumerolla 5208 5 • · · · ,·. Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen I * ·

GmbH:sta (DSM, Braunschweig). ΐ i : : * 30

Fuusioproteiinin CAT152::SPC34(FF/I) geenin sisältävä il- • * · *·:·* mennysvektori pTrpAmpCATI 52 ::SPC34(FF/1) johdettiin DNA- • * *.* * sekvenssistä pBR322 ColEl-johdannaisesta [E. Weber (toim.) ·;··· (1 988), Biologische Sicherheit, Bundesministerium fiir For- 35 schung und Technologie, Bonn]. Pharmaciasta saatavasta • · plasmidista pKK233-2 leikattiin pois Trc-promoottori * · · *·* * EcoR1/Hind3 :11a ja korvattiin synteettisellä promoottorilla *i (pTrp233). Se koostuu promoottorialueesta (RNA-polymeraasin sitoutumiskohta), operaattorialueesta (Trp-repressorin si- , /¾ 118126 9 toutumiskohta), Shine/Dalgarno-(S/D)-sekvenssistä sekä re-striktiokohdista kloonausta varten. Trp-promoottorin taakse insertoitiln bakteeriperäisen kloramfenikoli-asetyyli-transferaasin 5'-pään 152 aminohappoa koodaava geeni 5 (CAT152). CAT152-DNA-osasekvenssiin fuusioitiin synteetti nen geenifragmentti, joka koodaa ihmisen proteiinin kaltaisen SPC(FF/l):n 34 aminohappoa. Funktionaalinen CAT::SPC-(FF/l)-transkriptioyksikkö suljetaan bakteeriperäisellä rnnB-transkription terminaattorisekvenssillä T1T2. Saatu 10 rakenne nimettiin pTrpAmpCATI52::SPC34(FF/l):ksi. j

Vektorissa pTrpAmpCATI52::SPC34(FF/l) on seuraavat toimin-taelementit: CAT1 52 : : SPC34(FF/1)-geeni, jota ohjaa Trp-promoottori ja 15 T1T2-transkription terminaattori,

ori-alue ja sen naapurialue, jotka ohjaavat plasmidin ko- T

piolukua, . AmpR-geeni 20 Plasmidin isäntäsoluun viemisen jälkeen ohjaa se Trp-pro- moottorilla ohjatun CAT::SPC(FF/I)-geenin korkeaa kopiolu-kua. Trp-repressori välittyy isäntäsolusta itsestään.

rCAT::SPC:n fermentatiivista talteenottoa ohjataan väliai- ; 25 neessa olevan tryptofäänin konsentraatiolla vast, lisäämäl- • · · :*.>t lä B-IAA:ta (fi-indolyylihappoa). ' ' \ • · · . 2. Eräfermentointi i : : "I Working Cell Bankin koeputkella (glyseriiniviljelmä) ino- i : : * 30 kuloidaan tärypullossa oleva viljelyväliaine (koostumus, katso jäljempänä) (esi- tai aloitusviljelmä 1 1) ja sitä • · · *·ϊ·* inkuboidaan 37 °C:ssa ravistamalla voimakkaassa ampisillii- » · · *.* * ni-valikointipaineessa. Kasvua seurataan optisella tihey- * dellä 578 nm:ssä. Kun E. coli 199 -aloitusvil j elmä saavut- ....: 35 taa optisen tiheyden yli 3, inokuloidaan viljelmä 10 l:n • · '•t fermentteriin ja bakteerien kasvu vähäisessä ampisilliini- • · · *·* * valikointipaineessa jatkuu. Heti kun optinen tiheys on saa- ♦ · *. *: vuttanut arvon 5-6, siirretään 10 l:n viljelmä 100 l:n fer mentteriin ja sitä inkuboidaan edelleen samoissa olosuh- : : 10 118126 teissä. Riittävän kasvun jälkeen indusoidaan lisäämällä esimerkiksi 40 mg/1 B-AAA Trp-promoottorilla ohjattu CAT: : SPC (FF/I)-transkriptioyksikkö. Indusoinnin jälkeen fermentoidaan solujen keräämiseen saakka vielä 4-5 tuntia.

5

Fermentoinnin aikana luetaan ja säädetään fermentteriliemen hapenosapaine (pC>2), pH-arvo ja lämpötila on-line. pH-arvo pidetään natronlipeällä vakiona, hapenosapainetta (pC>2) säädetään hapen viennillä ja sekoituskiertonopeudella. Op-10 tinen tiheys 578 nm:ssä ja C-lähteen konsentraatio väliaineessa määritetään off-line. Vaahdonmuodostusta tutkitaan vaahtosensorilla ja tarvittaessa vaahtoamisen estämiseksi '1 annostellaan vaahtoamisenestoainetta.

15 Viljelyliemen alikvootit otetaan eri ajankohtina. Bakteerien liukenemisen jälkeen erotetaan ilmentymisen verrokiksi E. coli -proteiinit polyakryyliamidigeelille ja värjätään.

E. coli -kokonaisproteiinissa olevien (vallitsevien) proteiinien prosenttiosuus määritetään densitometrisesti. Vähän 20 jälkeen rekombinanttigeenin indusoimisen ilmestyy uusi vallitseva proteiinikaista (rCAT::SPC) -j

Viljelyväliaineen koostumus on seuraava:

Soijapeptoni 20,7 g/1, hiiva-autolysaatti KAV 14,0 g/1, i :'l 25 NaCl 5,0 g/1, K2HPO4 x 3 H2O 6,0 g/1, KH2PO4 3,0 g/1, MgS04 x 7 ^20 0,5 g/1, glyseriini (99,5-%: inen) 30,0 g/1, vaah- ··· toamisenestoaine J673 (Struktol Comp.) 0,2 ml/1, L-trypto- 1·« , .·. faani 80,0 mg/1 ja ampisilliini 20 mg/1 1 :een esiviljelmään • » · ja 5 mg/ml 2:een esiviljelmään ja 100 l:n fermentteriin.

I · 1 30 . Ennen kompleksisen ravintoväliaineen autoklavoimista ja « « » ;** sterilisointia pH säädetään 2 N NaOHrlla. 10 1:n fermentte- • 1 · *·, 1 rissä olevaan esiviljelmään käytetään sekoitusnopeutta 750 *:1" upm ja ilmansyöttöä 10 1/min 37 °C:ssa ja 100 l:n ferment- ...·· 35 terissä olevaan pääviljelmään käytetään sekoitusnopeutta 400 upm ja ilmansyöttöä 70 1/min 37 °C:ssa. Vaahtoamisenes- * 1 « * , toainetta lisätään tarpeen mukaan väliseinän kautta kerta- • i · 1♦ ruiskutuksena.

118126 11

Noin 4 tuntia indusoinnin jälkeen solut erotetaan suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla. Kostea solumassa kerätään jaloterässäiliöon ja siihen sekoitetaan 10 1 liuotuspusku- 1 ria (pH 8,0) yön ajan viileässä huoneessa (16 tuntia, 4 5 °C). Sekoitettu solususpensio suljetaan korkeapainehomoge- nisaattoriin (>_ 700 baaria) (huoneenlämpötila) ja kerätään uudelleen steriiliin jaloterässäiliöon. Inkluusiokappaleet .¾ otetaan seuraavaksi heti talteen suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla (Sorvall-sentrifugi RC2-B, 27000 g) 4 °C:ssa, 10 ne suspendoidaan uudelleen puskuriin (noin 1 1) ja siirretään esimerkiksi noin 350 ml:n osuuksina 1 l:n pyöreään pulloon ja lyofilisoidaan noin 96 tuntia. 100 l:n fermen-taatiosta saadaan noin 200 g kuivia inkluusiokappaleita, joiden fuusioproteiinipitoisuus on yli 20 paino-%. Lyofili- / 15 soituja inkluusiokappaleita voidaan varastoida -20 °C:ssa : kuukausia.

3. Fuusioproteiinin pilkkominen ja lipofUlisen peptidin SP-C(FF/l) puhdistaminen 20 1 00 g kuivia inkluusiokappaleita liuotetaan 1,6 litraan 8-moolista guanidiinihydrokloridiliuosta (917,1 g) lämmittäen hieman. Liukenemattomat jäännökset suodatetaan poimu- - · -S* suodattimena. Fuusioproteiinin pilkkomiseksi Asn-Gly-pilk-. komiskohdassa liuokseen lisätään 167 g hydroksyyliammonium- ;

• M

. 25 kloridia ja liuoksen pH säädetään 2 N NaOH:lla 9,6:een.

• · ·

Pilkkomisliuoksen annetaan sitten seisoa 3-4 päivää huo- • ·· neenlämpötilassa sekoittaen. Reaktioajan lopussa SP-C(FF/I) « saostetaan lisäämällä 6,4 1 Tris-puskuria (pH 8,0) ja saos- .

I" tetaan sentrifugilla (Sorvallsentrifugi RSC2-B, 20000 g).

I * * * 30 Supernatantti dekantoidaan, SPC-pelletti lietetään uudel leen 400-500 ml:aan Tris-puskuria ja sitä sentrifugoidaan # ♦ · samoissa olosuhteissa uudelleen 30 minuuttia.

• · · • ♦ · • · * ....: SP-C-pelletti otetaan 3,5 l:aan kloroformi/metanoliseosta ....: 35 (1 ,75 1 CHCI3 + 1,75 1 CH3OH + noin 30 ml 2 N HC1). Tämä • raaka-SP-C-1iuos puhdistetaan edelleen valmistavalla • * * * • · a *.* * HPLCjllä C8-käänteisfaasimateriaalilla. Kloroformi/metano- • · r :, *· liuute laimennetaan ennen valmistavalle HPLC-pylväälle viemistä 90-%:isella metanolilla suhteessa non 1:2. Tästä liu- 1; 12 118126 oksesta panostuu esim. pylväs (läpimitta 5 cm) noin 400 mg:llä SP-C(FF/I):tä (esim. -2 1 laimennettua raakauutet-ta). SP-C(FF/l) eluoidaan happamissa olosuhteissa (pH 2-3) vesi/i-propanoli-gradienteilla (katso erotusolosuhteet) . 5 Noin 30 minuutin kromatografoinnin jälkeen alueella, jolla SP-C eluoituu (UV-havainnointi 220 nm:ssä), kerätään 4-6 200 ml:n fraktiota. Fraktiot tutkitaan analyyttisellä HPLC:llä ja yhdistetään vastaavasti. Jos kokeita on varastoitava, ne pakastetaan juoksevassa typessa ja niitä säi-10 lytetäan pakastimessa -80 °C:ssa. SP-C(FF/l) saadaan 98,5-99,5-%,: isesti puhtaana.

Erotusolosuhteet: 15 Pylväs Kromasil C8 100 A 16 μπι 300 mm + 50 mm I.D.

Eluentti A. HPLC-vesi Millipore-laitteesta B: i-PrOH-gradienttilineaari C: 60 mmoll HC1 (laimennus savuavasta suolahaposta) 20

Gradi- Aika %A %B %C Virtaus entti: [ml/min] 0 45 50 5 100 . 10 45 50 5 100 ·· » ; 25 55 0 95 5 100 65 0 95 5 1 00 • ·* 75 45 50 5 100 *'**. 85 45 50 5 1 00 i : : ::: 90 45 50 5 0,2 * · * 1 · « 30 4. SP-C(FF/l):n rakentaminen fosfolipidimatriisiin t

Lipofiilinen peptidi SP-C(FF/I) sullotaan i-propanoliliuok- • · · 1 *.* * seen fosfolipidimatriisin komponenttien kanssa ja soaste- ....: taan sumutttamalla laimenettuun keittosuolaliuokseen • · ....: 35 (0,065 % paino/paino NaCl) huoneenlämpötilassa sekoittamal- • · . la homogeeniesti fosfolipidimatriisin komponentteihin.

* · · *.* * Keuhkopinta-aktiivisen aineen suspensiosta erotaan LSF kau- • · *,*·· hasentrifugilla, se suspendoidaan uudelleen elektrolyytti- liuokseen (NaCl, CaC122) ja pH-arvo säädetään 0,1 N NaOH:l- 13 118126 la pH 6,5;een. Tämä vesisuspensio pannaan 2 0 ml:n pulloihin ja lyofilisoidaan. Seuraavassa valmistusesimerkissä annetut paino- ja tilavuustiedot perustuvat 10 g:n keuhkopinta-ak-tiivista ainetta sisältävän valmisteen valmistamiseen: 5 · 7,00 g dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia (DPPC), 3,08 g palmitoyylioleyy1 ifosfatidyyliglyseroli-am:'oniumsuolaa (POPG x NH24) ja 0,25 g palmitiinihappoa liuotetaan 40 ΐ °C:ssa 200 ml:aan 90-^:ista i-propanolia ja jäähdytetään 10 sitten huoneenlämpötilaan. Saatu fosfolipidiliuos puhdistetaan 1 1:11a HPLC-puhdistuksesta saatua, 200 mg puhdistettua SP-C(PF/l) sisältävää liuosta. Saatu "suihkutusliu-os" säädetään sekoittamalla siihen bikarbonaattiliuosta (noin 5 ml 5 % NaHC02-liuos) pH:hon 4,5.

15 "Suihkutusliuos" viedään huoneenlämpötilassa suihkutusno-peudella 25 ml/min yksivaihesuuttimen kautta 9,6 l:aan laimennettua NaCl-liuosta (0,056 ¾ paino/paino) sekoittamalla voimakkaasti. Muodostuu opalisoiva liuos, josta saostetaan 20 kaksituntisen 4-8 °C:ssa varastoinnin jälkeen keuhkopinta- -aktiivinen ainevalmiste sumuttamalla elektrolyyttiliuosta t (3,0 g CaCl2 x 2 H2O ja 61,3 g NaCl 300 ml:ssa H2O). Keuh-kopinta-aktiivisen aineen suspensiota (kokonaistilavuus ♦ 10,8-11,0 1) varastoidaan yön ajan 4 °C:ssa ja sitten sitä : :*· 25 sentrifugoidaan Sorvall-kauhasentrifugissa (RC2-B) 16000 ·*· g:ssä kulloinkin 30 minuuttia. Sentrifugointikakku suspen- f * .:. doidaan kulloinkin puoleen tilavuuteen 0,65-%:ista keitto- • · · · .·, suolaliuosta uudelleen kiinni takertuneen jäljelle jääneen • 1» i-propanolin poistamiseksi ja sentrif ugoidaan uudelleen.

I * » 30 Tämä menettely toistetaan 3-4 kertaa. Viimeisestä sentri-, fugoinnista oleva kakku otetaan 400 mlraan 0,65-%:ista J * ·

NaCl-liuosta, säädetään pH:hon 6,5 0,1 N NaOH:lla ja jae-

Iti *·' ’ taan 6,2 g;n annoksina 20 ml:n pulloihin. Pullojen sisältö *;·*; lyof ilisoidaan seuraavasti: pakastaminen yli 6 tuntia -45 ·;·*· 35 °C:ssa ja normaalipaineessa, pakastekuivaaminen 54 tuntia .

0,16 mbaarissa ja -20 °C:ssa, sen jälkeen vielä voimakas • » · *·* kuivaaminen 5 tuntia -20 °C:ssa ja 0,02 mbaarissa.

* * J • * · • · · • « 14 118126

Saadaan 65-66 pulloa, jotka sisältävät 0,150 g keuhkopin-ta-aktiivista ainetta (laskettu ilman NaCl).

Kuivattuja keuhkopinta-aktiivisen aineen näytteitä varas- 1 5 toidaan jääkaapissa 4 °C:ssa ja ne on suspendoitava uudelleen lisäämällä vetttä tai fysiologista keittosuolaliuosta (suspensiokonsentraatio 25 mg/ml).

Yksi pullo sisältää: 10 96,5 mg dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia 42,1 mg palmitoyylioleyylifosfatidyyliglyserolia (ammoniumsuola) 2,7 mg SP-C(FF/l) 15 6,8 mg palmitiinihappoa 2,9 mg kalsiumkloridia (vedetön) • · 1 • · • · · • · 1 * · · • · · ··♦ ·· e#'.·-· • ·· · · • 1·· »· · ' Ä • · .i~ • · · - ' --¾.

« ·· f · 1 Λ * t f ♦ · *····.' • · » • · ♦ i ···.

• · » * ···1·'. .

·· ····♦-.

• · • · 1 • · · ...

f ··· • ·· * ·

Claims (11)

15 118126

1. Polypeptidit, joissa on keuhkopinta-aktiivista aktiviteettia ja joilla on yleinen kaava I: 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (A) Gly Ile Pro B B Pro Vai His Leu Lys 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Arg Leu Leu Ile Vai Vai Vai Vai Vai Vai (I) 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

10 Leu Ile Vai Vai Vai Ile Vai Gly Ala Leu 31 32 33 34 Leu C Gly Leu jossa A on H tai Phe, 15. on Phe tai Trp ja C on Ile, Leu tai Ser.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset polypeptidit, tunnetut siitä, että 20. on H tai Phe, B on Phe ja C on Ile. m * · · * * · ···'., ϊ . 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, t u n - • » t ;·, 25 n e t t u siitä, että • · · . A on Phe, • · · **·; B on Phe ja > • Φ · *···' C on Ile. • · · • * · * · ·

4. Nisäkkäiden hengityshäiriöoireyhtymien (RDS) hoitami- • · • *·· seen tarkoitettu farmaseuttinen koostumus, tunnet- t u siitä, että se sisältää patenttivaatimusten 1-3 mu- ,·] · kaista keuhkopinta-aktiivista polypeptidiä. • · · • · • · · * · ·;· 35 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostu- mus, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhtä muuta keuhkopinta-aktiivista polypeptidiä ryhmästä * * ^ "4 SP-A ja SP-B. 1C 118126 X o

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että se sisältää SP-B:tä.

7. Patenttivaatimuksen 4 ja 5 mukainen koostumus, 5 tunnettu siitä, että se sisältää fosfolipidejä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että se sisältää dipalmitoyylifosfatidyy-likoliinia (DPPC), palmitoyylioleyylifosfatidyyliglyserolia 10 (POPG) ja/tai fosfatidyyliglyserolia (PG).

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että se sisältää palmitiinihappoa ja elektrolyyttejä. 15

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että se sisältää elektrolyytteinä kalsium- ja/tai natriumsuoloja.

20 Patentkrav